烏骨鶏のミトコンドリア全長塩基配列について

和田康彦１，２ , 山田義之１ , 上平熊亘１ ,西堀正英３ , 西堀奈穂子３ , 都築政起３ ,安江　博４

１佐賀大学農学部、　２ BIRD, 科学技術振興事業団３広島大大学院生物圏科学 , 　４生物資源研ゲノム研究

要旨【目的】烏骨鶏は鶏の１品種であるが、その形態は他の品種とは大きく異なっているとともに、中国ではその肉が漢方薬として珍重されてきた。近年、わが国においても烏骨鶏の卵と肉は健康食品としての需要が高まってきているが、烏骨鶏の起源や他の鶏種との系統関係は明らかではない。そこで、烏骨鶏のミトコンドリア DNA の全長塩基配列を決定し、分子系統学的な解析を行った。 【方法】広島大学で維持されている烏骨鶏 1 羽の全血から DNA の抽出を行い、LA-PCR を用いて全長に近い長さのミトコンドリア DNA を増幅し、 LA-PCR産物を用いてアガロース電気泳動を行い、ミトコンドリア DNA の位置のバンドを切り出して、 DNA の精製を行った。精製したミトコンドリア DNA を鋳型にして 24 組の PCR を行い、 PCR ダイレクトシーケンス法を用いて烏骨鶏のミトコンドリア DNA の全長塩基配列を求めた。烏骨鶏、白色レグホーン、白色プリマスロック、ラオス在来鶏、日本ウズラのミトコンドリア DNA の D-loop領域の塩基配列から近隣結合法により分子系統樹を作成した。さらに、キジ科に属する 6 種 7 個体のＣ ytbおよび ND2遺伝子の塩基配列を対比較して、サイト当たりの非同義置換数 (dN) と同義置換数 (dS) を推定した。 【結果】烏骨鶏のミトコンドリア DNA の全塩基数は 16,784 塩基で白色レグホーンより 9 塩基多い結果となった。ミトコンドリア全塩基配列における烏骨鶏と白色レグホーンの間の相同性は 99.8% であった。近隣結合法により作成した分子系統樹において、今回シーケンスした烏骨鶏の D-loop領域の塩基配列は白色レグホーンときわめて近縁であることが示された。キジ科鳥類間の dN/dS 比は cytb 、 ND2 ともに 0.1 未満と小さく、シーケンス間の遺伝距離の増加とともにわずかに増加する傾向が認められた。

方法

• 烏骨鶏の血液から DNA を抽出　　　　　　　　　 • ２組のプライマーペアでＬＡ - ＰＣＲ　　　　　　　　　 • ミトコンドリアＤＮＡのバンドを切り出し　　　　　　　　　 • ミトコンドリアＤＮＡを鋳型に２４組のＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ　　　　　　　　　• 確認されたＰＣＲ産物の精製とＰＣＲダイレクトシーケンス反応　　　　　　　　　

　　　　　　　　　　 • 精製したＰＣＲ産物の塩基配列の決定　　　　　　　　　 • 各ＰＣＲ産物の塩基配列のアセンブル　　　　　　　　　• Ｄ‐ loop の塩基配列のデータを用いた分子系統樹の作成　　　　　　　　　• ＣｙｔｂおよびＮＤ２の塩基配列データを用いたｄＮ／ｄＳ比の推定　　　　　　　　　

分子系統樹の作成方法

　　　近隣結合法、ブートストラップ１０００回

ＤＮＡサイト当たりの非同義置換数と同義置換数の推定

　　　アミノ酸配列のアライメント

　　　　　　　　　　　

　　　アミノ酸配列にもとづく塩基配列のアライメント

　　　　　　　　　　　

　　　対比較による推定

　　　　 (PAML3.13 　 codeml )

烏骨鶏のミトコンドリアＤＮＡの遺伝子構造とプライマー

D‐loop　領域の塩基配列による分子系統樹（近隣結合法、ブートストラップ１０００回）

日本ウズラ

白色プリマスロック

ラオス在来鶏

烏骨鶏

白色レグホーン

995

949

サイト当たり非同義置換数と同義置換数の割合（ｄＮ／ｄ

Ｓ）（ＮＤ２遺伝子領域、対比較）

ＭＬ法　　　　　　　　　　　　　　　　

ＮＧ法

白色レグホン 烏骨鶏 ＮＡ ＮＡ

コジュケイ 0.026 0.072

ヨーロッパヤマウズラ 0.061 0.114

コウライキジ 0.034 0.073

日本ウズラ 0.040 0.105

アメリカホシハジロ 0.003 0.136

烏骨鶏 コジュケイ 0.025 0.072

ヨーロッパヤマウズラ 0.060 0.113

コウライキジ 0.033 0.073

日本ウズラ 0.039 0.105

アメリカホシハジロ 0.003 0.137

コジュケイ ヨーロッパヤマウズラ 0.049 0.111

コウライキジ 0.041 0.099

日本ウズラ 0.029 0.081

アメリカホシハジロ 0.003 0.145

ヨーロッパヤマウズラ コウライキジ 0.059 0.092

日本ウズラ 0.061 0.122

アメリカホシハジロ 0.018 0.147

コウライキジ 日本ウズラ 0.058 0.103

アメリカホシハジロ 0.057 0.148

日本ウズラ アメリカホシハジロ 0.018 0.150

遺伝距離と dN/dS 比との散布図（ＮＤ２）

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

0 0.05 0.1 0.15 0.2

２配列間の遺伝距離

dN/d

S (M

L)

法

遺伝距離と dN/dS 比との散布図（Ｃｙｔｂ）

0

0.005

0.01

0.015

0.02

0.025

0.03

0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16 0.18 0.2

２配列間の遺伝距離

dN/d

S (M

L)

法

0.021

0.011

0.008

0.042

0.050

0.014

0.005

0.005

系統樹の枝ごとのｄ N/ ｄ S 比の推定値（ Cytb)

0.031

アメリカホシハジロ

日本ウズラ

コジュケイ

白色レグホン

烏骨鶏

ヨーロッパヤマウズラコウライキジ

系統樹の枝ごとのｄ N/ ｄ S 比の推定値（ ND2)

0.036

0.038

0.056

0.035

0.025

0.078

0.046

0.077

0.211

アメリカホシハジロ

日本ウズラ

コジュケイ

白色レグホン

烏骨鶏

ヨーロッパヤマウズラ

コウライキジ