第三章 基因工程载体

第一节 克隆载体第二节 表达载体第三节 特殊用途载体

DNA ： 　 1 ）独立的一个包括启动子（ promoter) 、编码区（ encoding region) 和终止子（ terminator) 的基因，or 组成基因的某个元件，一般是不可以进入受体细胞的；

　 2 ）采用理化方法进入细胞后，也不容易在受体细胞内维持。所以，通过不同途径能将承载的外源 DNA 片段带入受体细胞，并在其中得以维持的 DNA 分子称为基因工程载体。

载体 （ Vectors ）

定义：在基因工程操作中，把能携带外源 DNA 进入受体细胞的 DNA 分子叫载体。

载体 （ Vectors ）

多克隆位点多克隆位点 (multiple cloning (multiple cloning site)site)

ororii

复制起始点复制起始点遗传标记遗传标记pUCpUC

MCSMCS

AmpAmprr

运送外源基因高效转入受体细胞

为外源基因提供复制能力或整合能力

为外源基因的扩增或表达提供必要的条件

载体的功能　

目的基因能否有效转入受体细胞，并在其中维持高效表达，在很大程度上决定于载体 。

（ 1 ）在宿主细胞内能独立复制， ori。　

（ 3 ）多克隆位点：外源基因插入的单一限制酶位点。

基因工程对载体的要求

（ 7 ）具有较好的安全性，不能任意转移。　

（ 2 ）有选择性标记　 Ampr、 Tetr、 Kanr 等。

（ 4 ）分子量小，可容纳较大的外源基因片段。（ 5 ）拷贝数多，方便外源基因在细胞内大量扩增。（ 6 ）具有对受体细胞的可转移性。

pBR322

BamHI

Sal I

Hi ndI I I

Pst I

ScaI Ampr

ori

( 4. 36　 kb)

大肠杆菌质粒载体 pBR322 结构图

复制起点

遗传标记基因

克隆位点

克隆位点

载体 的种类

• 按功能分类 　克隆载体　克隆一个基因或 DNA 片断 　表达载体　用于一个基因的蛋白表达 　整合载体　把一个基因插入到染色体组中 • 按来源分类 　质粒载体 　噬菌体载体 　柯斯质粒载体 　人工染色体载体

载体的种类和特征

质粒 *受体细胞 结构 插入片断 举例　

E.coli 环状 ＜　 8kb pUC18/19 , T- 载体等　

λ 噬菌体 E.coli 线状 9 - 24kb EMBL 系列，　 λ gt 系列

丝状噬菌体及噬菌粒 E.coli 环状 ＜　 10 kb M13mp 系列

粘粒载体 E.coli 环状 35- 45kbpJB8,c2RB, pcoslEMBL,

pWE15/16, pCV

BAC (Bacterial Artificial Chromosome)

E.coli 环状 ≈300 kb Pel oBAC 系列

YAC (Yeast Artificial chromosome )

酵母细胞 线性染色体　 100 - 2000 kb

MAC (Mammalian Artificial Chromosome)

哺乳类细胞 线性染色体 ＞　 1000 kb

病毒载体 动物细胞 环状 SV40 载体，昆虫　杆状病毒载体

穿梭载体 动物细胞　和细菌 环状 pSVK3 质粒， PBV, Ti 质粒

第一节 克隆载体

1. 质粒载体（ plasimid vectors ）

2. 噬菌体载体（ phage vectors ）

3. 柯斯质粒载体（ cosmid vectors ）

4. 人工染色体载体（ B/Y/HAC ）

　　质粒是一种广泛从在于细菌细胞中染色体以外的能自主的复制

的裸露的环状双链 DNA分子，比病毒更简单。

并不是寄主生长所必需的，但可以赋予寄主某些抵御外界环境因素不利影响的能力（带有抗性基因等） 。

质粒的生物学特性（ 1 ）质粒的概念

　　　　差异很大，最小的只有 1kb, 只能编码中等大小的 2-3 种蛋白质分子，最大的达到 200kb 。

质粒的生存在寄主细胞中“友好”地“借居”，它可以赋予寄主一些非染色体控制的遗传性状，以利于寄主的生存。比如，对抗菌素的抗性，对重金属的抗性等。

（ 2 ）质粒的大小

（ 3 ）质粒的生存

　　　　质粒能利用寄主细胞的 DNA 复制系统进行自主复制。质粒 DNA 上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系。根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：• 严紧型复制控制的质粒（ stringent plasmid ）　( 拷贝数少，为 1-5个 )

• 松弛型复制控制的质粒（ relaxed ）　 ( 拷贝数多，可达 10-200 个拷贝 )

（ 4 ）质粒的自主复制性

因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。

　　　　两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性。具有不相容性的质粒组成的群体称为不相容群，一般具有相同的复制子。

（ 5 ）质粒的不相容性

（ 6 ）质粒的可转移性

在天然条件下，很多天然质粒都可通过细菌接合作在天然条件下，很多天然质粒都可通过细菌接合作用从一种宿主细胞内转移到另外一种宿主内，这种转移用从一种宿主细胞内转移到另外一种宿主内，这种转移依赖于质粒上的依赖于质粒上的 tratra 基因产物基因产物。。

Conjugative plasmid Conjugative plasmid 接合型质粒（自我转接合型质粒（自我转移的移的质粒）：质粒）：质粒可从一个细胞自发转移到另一个细胞。质粒可从一个细胞自发转移到另一个细胞。 Non Conjugative plasmid Non Conjugative plasmid 非接合型质粒非接合型质粒（不能自我转移的质粒）：（不能自我转移的质粒）：由于失去控制细菌配对由于失去控制细菌配对和自我转移的基因，质粒不能从一个细胞自发的转和自我转移的基因，质粒不能从一个细胞自发的转移到另一个细胞。移到另一个细胞。

基因工程一般只能利用非接接合型质粒，保证分子操作过程中质粒在细胞中的稳定性。

Tra protein from conjugative plasmid

bom site Mob gene

mob mRNA

Mob protein

open

recipient cell

helper plasmid

　　　　即 mob 基因的产物可打开非接合质粒的 bom 位点 (oriT位点 ) ，借助接合质粒 tra 基因的产物，使非接合质粒被动迁移到受体细胞中，这种现象称为迁移作用 (mobilization) 。

大肠杆菌接合（ conjunction ）

质粒 DNA的 tra 基因

　 E.Coli产生菌毛

　宿主与受体细胞结合

　遗传物在细胞之间转移

（指令）

（迁移）

（ 7 ）携带特殊的遗传标记

　　　　野生型的质粒 DNA 上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：

物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物

物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱

　

　这些标记基因对 DNA 重组分子的筛选具有重要意义

　　　　　定义 : 在基因工程中使用与选择重组体 DNA 转化细胞的基因

1. 指示外源 DNA 分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞

2. 指示外源 DNA 分子是否插入载体分子形成了重组子

遗传标记基因

标记基因的作用

1. 抗性标记基因（可直接用于选择转化子） a.  抗生素抗性基因 : Apr ， Tcr ， Cmr， Kanr， G418r， Hygr ， Neor

b. 重金属抗性基因 : Cur ， Znr ， Cdr

c. 代谢抗性基因 : TK ，抗除草剂基因 2. 营养标记基因（可直接用于选择转化子） 主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶类的

基因， 这类基因在酵母转化中使用最频繁，如TRP1， URA3， LEU2， HIS4 等。

3. 生化标记基因 其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如 lacZ ， GUS， CAT

4. 噬菌斑

标记基因的种类

　　　　质粒的存在形式有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种。

双螺旋共价闭合环（超螺旋）

开环双螺旋（一个裂口）

线状双螺旋（两个裂口）

（ 8 ）质粒的存在形式

质粒空间构型与电泳速率

　　　　　　同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：

scDNA 最快、 l DNA次之、 ocDNA 最慢。

SC

OCL

天然质粒的局限性

• 天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。

人工组建的质粒

人工组建的质粒的第一个字母是质粒英文名字（ plasmid ）的第一个字符 p ，用小写。 p 后有 2 个字母是大写，表示质粒的作者和实验室名称，再其后为质粒的编号。如 pBR322 ，字母 p 代表质粒， BR 是构建该质粒的研究人员的姓名， 322代表…构建的一系质粒的编号。

质粒载体的命名原则

　　　　第一阶段（ 1977年前）　天然质粒和重组质粒的利用，如 pSC101, ColE1, pCR, pBR313和pBR322 。

第二阶段　增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如 pUC 系列载体。

第三阶段　完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如 M13mp 系列载体，含 T3， T7， sp6

启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。

质粒载体的发展概况

质粒载体的构建

5. 根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件

质粒构建基本策略质粒构建基本策略

11.. 加入合适的选择标记基因加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于选，如两个以上，易于选择转化体择转化体22.. 增加或减少合适的酶切位点增加或减少合适的酶切位点，便于重组，便于重组

33.. 缩短长度缩短长度，提高导入效率，增加装载量，提高导入效率，增加装载量

44.. 改变复制子改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝

7 、达到预期目的前提下，构建过程应力求简单

11 、选择合适的、选择合适的出发质粒出发质粒 : Ori: Ori 、选择标、选择标记、记、 MCSMCS22 、正确获得构建、正确获得构建质粒载体的元件：酶切、质粒载体的元件：酶切、 PCRPCR

33 、组装合适的、组装合适的选择标记基因选择标记基因44 、选择、选择合适的启动子合适的启动子55 、提高、提高外源外源 DNADNA 的容量的容量

66 、需要、需要灭活灭活初始质粒上的某些初始质粒上的某些编码基因编码基因

质粒构建原则质粒构建原则

质粒载体：作为基因工程载体，质粒至少应该具备复制的起始区、选择标记基因区、多克隆位点等部分。

　　　　　人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类： 　　高拷贝质粒 突变拷贝数控制基因 拷贝数 1000-3000 　 扩增基因 　　低拷贝质粒 来自 pSC101 拷贝数小于 10 　表达某些毒性基因 　　温敏质粒 在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质 　　测序质粒 含有测序通用引物互补序列和多酶接头 polylinker

　　整合质粒 装有整合促进基因及位点 　便于外源基因的整合 　　穿梭质粒 装有针对两种不同受体的复制子 　便于基因克隆 　　表达质粒 装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件 　　探针质粒 装有报告基因 　便于启动子等元件的克隆筛选

质粒载体的分类

（ 1 ）高拷贝数的质粒载体

ColE1、 pMB1 、 pMB9 松弛型质粒。

具有低分子量、高拷贝数的优点。具有氯霉素扩增效应：每个细胞的拷贝数1000－ 3000 个！

用途：适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的基因产物。

质粒载体的分类

（ 2 ）低拷贝数的质粒载体由 pSC101派生来的载体。特点是拷贝数低。 pLG338、 pLG339 等适合于克隆含量过高对寄主代谢有害的基因。减少蛋白质产物对寄主细胞的毒害。（ 3 ）温控的质粒载体

一些低拷贝基因是温度敏感型，如 pBEU1、 pBEU2

温度低（ <37 oC ），拷贝数很少；　温度增加（ >40 oC ），拷贝数很快增加到 >1000个。

（ 4 ） 插入失活型质粒载体　　　　　载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。外源 DNA 片段插入会导致选择记号基因（如tetr、 ampr、 cmr 等）失活。

如 pDF41、 pDF42、 pBR322 。

抗生素抗性

外源 DNA

无抗生素抗性

（ 5 ）正选择的质粒载体　　　

可大大降低需要筛选的转化子的数量，从而可大大降低需要筛选的转化子的数量，从而减轻实验的工作量，提高了选择的敏感性。减轻实验的工作量，提高了选择的敏感性。

　　　　　　质粒载体具有质粒载体具有直接选择记号直接选择记号并赋予寄主细并赋予寄主细胞胞相应的表型相应的表型。只有。只有带有选择标记基因带有选择标记基因的转的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。 化菌细胞才能在选择培养基上生长。

经典的大肠杆菌质粒载体 pSC101pSC101 质粒载体质粒载体

天然质粒，属严紧型低拷贝质粒。 9.09 kb 。四环素抗性 Tetr 。

ColE1

天然质粒，属松弛型、高拷贝质粒， 6.6Kb 。有氯霉素扩增效应，每个细胞 1000-3000拷贝

选择标记

大肠杆菌素（ colicin） E1 和对 E1免疫的基因（ immE1 ）

colicin E1 能杀死不含 ColE1 质粒的菌，形成噬菌斑。

① colicin E1 基因的结构

cea imm kil

结构基因 免疫基因 溶菌基因② 杀死不含有 ColE1 细菌的原因

cea + kil 基因产物

③ 不被其他细菌的 colicin E1 所杀死的原因

imm 基因

EcoR I 位于 E1 内部，插入外源 DNA导致E1失活，使受体菌不能合成 E （ ColE1- ），但仍表现出对 E1免疫型（ ImmE1+ ）。

EcoR I 唯一的克隆位点

Colicin E1

外源 DNA

无 Colicin

用对外源 colicin E1 的免疫性和自身不能合成 colicin E1 作选择，操作非常繁杂。

pBR322 ：

p: 质粒；BR ：质粒两位主要构建者姓氏的第一个字母；322 ：实验编号

人工构建载体

三个亲本质粒：pMB1:出发质粒(ColE1)pSF2124: Ampr

pSC101: Tetr

pSF2124

pMB1

pSC101

氨苄青霉素和四环素抗性24 个单一克隆位点。

9 个导致 Tetr 基因失活3 个会导致 Ampr 基因失活

pBR322 的优点

①　双抗生素抗性选择标记 抗生素抗性基因的插入失活效应是检测重组体质粒的有效方法，分两次先后选择：

没有获得载体的寄主细胞　在 Amp或 Tet 中都死亡。

获得重组载体的寄主细胞　在 Amp或 Tet 其中之一中死亡。

DNA重组Ampr Tcs

DNA提取 电泳

Ampr Ampr

Ampr

AmprTcr

Tcr

Tc

Ampr Tcs

Tcs

转化

无菌落 阳性菌落筛选重组子

2) DNA重组

DNA无 插入 DNA有 插入

DNA外源

1)限制酶切

AmAmpp

AmpAmp＋＋TetTet

不含质粒载体不含质粒载体

含有空质粒载体含有空质粒载体 含有重组质粒载体含有重组质粒载体

pBR322 重组克隆的筛选 重组克隆的 “插入失活”筛选方法 　　 pBR322—→ 插入在 Tetr 中，基因型为 Tets 、 Ampr

——→ 在含有氨卞青霉素培养基上可生长，在含有四环素培养基上不生长；

　　 pBR322—→ 插入在 Ampr 中，基因型为 Tetr 、 Amps、——→在含有氨卞青霉素培养基上不生长，在含有四环素培养基可生长；

　而在两种抗生素培养基上都生长的是非重组型。这种在一个基因位点中插入外源 DNA 片段，从而使该基因活性丧失的现象叫插入失活。

氯霉素扩增之后，每个细胞可 1000~3000copies④　安全失去了转移蛋白基因 mob（ mobilization ）。不能通过接合转移。

③ 高拷贝数

②　分子小，克隆能力大长度 4363bp ，易于纯化，可以携带 6-8Kb 的外源 DNA 片段。

⑤具有较多的单一酶切位点（ 24种）

保留了转移蛋白（ mob ）的作用位点。

pBR322 的缺点

能够被 ColK 质粒编码的 mob 蛋白识别，如果再有 F 质粒的参与，就有可能转移！

①　删除mob识别位点

（如质粒 pBR327、 pAT153 等）。

pAT153 ：

从 pBR322 上切去 HaeII 片断，既除去了 mob识别位点，又增加质粒的拷贝数。

PBR322 的改进

pBR325 ：

在 pBR322 位点上接入一段来自噬菌体 PICm的 HaeII 酶切片断（带有氯霉素抗性基因 cmlr ）。 cmlr 上也带一个 EcoRI 位点。

使 EcoRI 也成为插入失活型位点。

② 改造 EcoR I 位点

pUC 系列载体 在 pBR322 的基础上改造而成。属正选择载体。pUC7、 pUC8、 pUC9、 pUC10、 pUC11、 pUC18、 pUC19

（ 1 ）元件来源

c. lacz’ 基因：大肠杆菌 lac 操纵子 DNA 区段，编码 β-半乳糖苷酶 - 肽链，是 LacZ氨基端的一个片段 . 载体用于可编码半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主细胞。d. MCS 多克隆位点。

a .ori 来自 pBR322 质粒的复制起点b. 标记基因（ ampr） :pBR322的 Ampr 基因　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

（ 2 ）克隆位点

具有 MCS （多克隆位点）区段：位于 lacZ’ 基因的 5’端。 10 个连续的单一限制酶切位点，但它不破坏该基因功能。

IPTG ：异丙基 -β-D-硫代半乳糖苷，乳糖类似物，又称为安慰诱导物，可代替乳糖诱导乳糖操纵子结构基因的表达，即可诱导lacz’ 所编码的半乳糖苷酶氨基末端片段（ α－肽）的合成。

x-gal： 5-溴 -4-氯 -3-吲哚 -β-D-半乳糖苷，为生色底物，半乳糖苷酶 + x-gal

　　　　　　　蓝色

菌落蓝白选择的原理：菌落蓝白选择的原理：

α-互补： pUC 类载体带有 lacz’ 基因，编码半乳糖苷酶氨基端片段（ α-肽），此片段与宿主细胞所编码的羧基端半乳糖苷酶实现基因内互补，形成有功能的半乳糖苷酶，称 α-互补。

菌落蓝白斑选择的原理：菌落蓝白斑选择的原理：在基因克隆时，细菌在含有在基因克隆时，细菌在含有 IPTGIPTG和和 xx －－ galgal 的的培养基中进行培养。 培养基中进行培养。 IPTGIPTG诱导质粒的诱导质粒的 lacz’lacz’ 基基因产生因产生 α-肽，同时诱导细菌产生半乳糖苷酶的羧基端片段。两种片段形成有功能的半乳糖苷酶，从而使 x － gal水解，产生蓝色物质，使非重组菌落呈现蓝色。

当外源基因插到质粒的多克隆位点后，使当外源基因插到质粒的多克隆位点后，使 lacz’lacz’

失活，不能表达失活，不能表达 α-肽，破坏了互补作用破坏了互补作用，细胞内无，细胞内无有活性半乳糖苷酶，使带有重组质粒的细菌将产生有活性半乳糖苷酶，使带有重组质粒的细菌将产生白色菌落。白色菌落。

互补显色反应

PUC载体的优点：

a 具有更小的相对分子质量和更高的拷贝数，平均每个细胞可达 500-700个拷贝

b 具有 MCS 片段，可把具有两种不同粘性末端的外源 DNA 片段直接克隆到 pUC 类载体上。c 可以用组织化学方法检测重组体（蓝白斑筛选） .

pGEM 载体

• 总长度为 2743bp• 含有一个氨卞青霉素抗性编码基因和一个 lacZ’

编码基因• 一段含有 EcoR I、 Sat I、 Kpn I、 Ava I 、 Sma I、 BamH I 、 XbaI、 Sall、 AccI、 Hinc I、 Pst II、 Sph I和 Hind II 等识别序列的多克隆位点。

• 此序列结构几乎与 pUC18 克隆载体的完全一样。

pGEM系列与 pUC系列之间的主要差别• pGEM具有两个来自噬菌体的启动子，即 T7启动子和 SP6启动子，它们为 RNA聚合酶的附着作用提供了特异性的识别位点。

• 由于这两个启动子分别位于 Lac z’基因中多克隆位点区的两侧，故若在反应体系中加入纯化的识别 T7或 SP6启动子的 RNA聚合酶，便可将已克隆的外源基因在体外转录出相应的 mRNA。

• 质粒载体 pGEM-3Z和 pGEM-4Z在结构上基本相似，两者之间的差别仅仅在于 SP6和 T7这两个启动子的位置互换、方向相反而已。

pGEM-3Z

：

pGEM-3Z

：多拷贝多拷贝

装有两个噬菌体的强启动子装有两个噬菌体的强启动子

装有多克隆位点（ MCS

）

装有多克隆位点（ MCS

）正选择颜色标记 lacZ’正选择颜色标记 lacZ’

用于外源基因的高效表达 用于外源基因的高效表达

注意： T7和 SP6 启动子特异性地由噬菌体 DNA 编码的 RNA聚合注意： T7和 SP6 启动子特异性地由噬菌体 DNA 编码的 RNA聚合酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体 RNA聚合酶，如

：酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体 RNA聚合酶，如

：E.coli BL21（ DE3 ）等E.coli BL21（ DE3 ）等

　　这种质粒分子上含有两个亲缘关系不同的复制子结构以及相应的选择性标记基因，因此能在两种不同种属的受体细胞中复制并检测，例如既能在原核生物中复制 , 又能在真核生物中复制的载体。

这类载体既具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因 , 还有真核生物的自主复制序列 (ARS) 以及选择标记性状

通常穿梭载体在细菌中用于克隆 , 扩增克隆的基因 , 在酵母菌中用于基因表达分析 .

穿梭质粒载体

用 Taq 酶的 PCR 产物 3’端加上了一个 A 。根据这一特点研制出一种线性质粒，其 5’端突出的 T ，它们之间可以连接，即 TA 克隆。

再生 TA 克隆载体的方法：

①克隆载体的线性化②克隆载体末端补平③克隆载体末端加 T

TA 载体

pMD-T 载体