ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΝΑΤΟΜΙΚΗΣ – ΙΣΤΟΛΟΓΙΑΣ – ΕΜΒΡΥΟΛΟΓΙΑΣ

ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ

ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΚΛΗΡΟΝΟΜΟΣΙΑΤΡΟΣΕΙΔΙΚΕΥΟΜΕΝΟΣ ΝΕΥΡΟΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΗΣΕΠΙΒΛΕΠΩΝ: καθηγητής κ. ΙΩΑΝΝΗΣ ΒΑΡΑΚΗΣΠΑΤΡΑ 2009ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΝΑΤΟΜΙΚΗΣ – ΙΣΤΟΛΟΓΙΑΣ – ΕΜΒΡΥΟΛΟΓΙΑΣΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗΘέμα:ΜΕΛΕΤΗ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΜΗΧΑΝΙΣΜΩΝ ΤΗΣ ΔΙΗΘΗΤΙΚΗΣΙΚΑΝΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ ΠΡΩΤΟΠΑΘΩΝ ΟΓΚΩΝ ΤΟΥ Κ.Ν.Σ.ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΚΛΗΡΟΝΟΜΟΣΙΑΤΡΟΣΕΙΔΙΚΕΥΟΜΕΝΟΣ ΝΕΥΡΟΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΗΣΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ1. Βαράκης Ιωάννης Επιβλέπων Καθηγητής2. Παπαδάκη Ελένη Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Ανατομικής3. Γκατζούνης Γεώργιος Επίκουρος Καθηγητής Νευροχειρουργικής1ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ:1.Βαράκης Ιωάννης Επιβλέπων Καθηγητής2.Παπαδάκη Ελένη Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Ανατομικής3.Γκατζούνης Γεώργιος Επίκουρος Καθηγητής Νευροχειρουργικής4.Mαραζιώτης Θεόδωρος Καθηγητής Νευροχειρουργικής5.Κωστόπουλος Γεώργιος Καθηγητής Φυσιολογίας-Νευροφυσιολογίας6.Σωτηροπούλου-ΜπονίκουΓεωργία . Αν. Καθηγήτρια Ανατομικής7.Ασημακοπούλου Μάρθα Αν. Καθηγήτρια ΑνατομικήςΠΡΟΛΟΓΟΣΜε την ευκαιρία της ολοκλήρωσης της διδακτορικής μου διατριβήςθα ήθελα να εκφράσω τις ευχαριστίες μου σε όλους όσους με βοήθησαν και μου συμπαραστάθηκαν στην προσπάθειά μου αυτή.Ευχαριστώ θερμά τον επιβλέποντα καθηγητή και δάσκαλό μου

κύριο Ιωάννη Βαράκη για τις πολυτιμότατες συμβουλές του και τηνεμπιστοσύνη που μου έδειξε. Θεωρώ τον εαυτό μου ιδιαίτερα τυχερό,διότι από νωρίς στα φοιτητικά μου χρόνια γνώρισα τον καθηγητή κ.Βαράκη και η συνεργασία μαζί του όλο αυτό το διάστημα επηρέασεβαθιά τη μέχρι τώρα πορεία μου.Εκφράζω τις ατελείωτες ευχαριστίες μου προς τη διευθύντρια τουΕργαστηρίου Ανατομικής – Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κυρία ΕλένηΠαπαδάκη, για την αμέριστη και ακούραστη στήριξή της και τιςπολύτιμες συμβουλές της οποιαδήποτε στιγμή συνάντησα δυσκολία.Χωρίς την βοήθειά της θα ήταν δύσκολη η ολοκλήρωση της διατριβήςμου.Ευχαριστώ το δάσκαλό μου στη Νευροχειρουργική επίκουρο καθηγητήκύριο Γεώργιο Γκατζούνη για την υπομονετική και καθημερινή στήριξηκαι κατανόησή του στην εκπαίδευσή μου στη Νευροχειρουργική.Θέλω θερμά να ευχαριστήσω τον διευθυντή μου και καθηγητήΝευροχειρουργικής κ. Μαραζιώτη Θεόδωρο για την κατανόησή του, καιτις πολύτιμες συμβουλές του όλο αυτό το διάστημα της εκπαίδευσής μου.Τέλος θέλω να ευχαριστήσω το προσωπικό του Εργαστηρίου τηςΑνατομίας για την στήριξη που μου παρείχε αυτό το διάστημα.Γεώργιος ΚληρονόμοςΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑΣελ.Εισαγωγή ...................................................................................................... 2Γενικό ΜέροςΚεφάλαιο 11.1 Στοιχεία Ιστολογίας. Νευρικού ιστού ........................................ 51.2 Στοιχεία Εμβρυϊκής ανάπτυξης του νευρικού συστήματος ....... 91.3 Aρχέγονα νευρικά κύτταρα στον πλήρως ανεπτυγμένοεγκέφαλο..................................................................................131.4 Νεοπλάσματα του Νευρικού συστήματος...............................15ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2Παθογενετικοί μηχανισμοί στην ανάπτυξη των γλοιωμάτων. ................... 252.1 Κυτταρική προέλευση των γλοιωμάτων………………………252.2 Η θεωρία των brain tumor stem cells..........................................272.3 Mοριακοί και γενετικοί μηχανισμοί στην ανάπτυξη τωναστροκυττωμάτων……………………………………………31ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

3.1 Διηθητική ικανότητα των γλοιωμάτων .................................... 573.2 Ρύθμιση της διηθητικής ικανότητας των αστροκυττωμάτων…593.3 Ένζυμα που συμμετέχουν στην διάσπαση της εξωκυττάριαςουσίας ........................................................................................ 653.4 Ο ρόλος του NF-κB στη διηθητική ικανότητα τωνΑστροκυττωμάτων.................................................................... 73ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4Η ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη ING-4 και ο ρόλος τηςστη διηθητική ικανότητα των αστροκυττωμάτων. ................... 764.1Κύρια χαραχτηριστικά της οικογένειας των ING πρωτεϊνών. ... 764.2 Πρωτεΐνες της οικογένειας ING συμμετέχουν σε πολλέςκυτταρικές λειτουργίες ............................................................. 7914.3 Λειτουργίες της ING-4 ............................................................... 82Ρόλος της ING-4 στην αγγειογένεση και την κυτταρικήμετανάστευση.............................................................................824.4 Ο ρόλος του ING-4 στο μονοπάτι του NF-κB...........................834.5 Ο ρόλος του ING-4 στο μονοπάτι του HIF-1α..........................854.6 ο ρόλος του ING-4 στην αναδιάταξη της χρωματίνης............. 85Ειδικό μέροςΣκοπός της μελέτης .......................................................................... 88Υλικό – Μέθοδοι ............................................................................. 89Γενικά για τις ανοσοιστοχημικές μεθόδους………………………92Αξιολόγηση ανοσοιστοχημικής χρώσεως ..................................... 102Αποτελέσματα…………………………………………………….105Συζήτηση των αποτελεσμάτων ...................................................... 127Βιβλιογραφία ................................................................................. 1322

ΕΙΣΑΓΩΓΗΤα αστροκυττώματα ______________αποτελούν τη συχνότερη ομάδα νεοπλασμάτων τουκεντρικού νευρικού συστήματος. Συνιστούν μία ετερογενή ομάδα σε ότι αφορά τηβιολογική τους συμπεριφορά και την πρόγνωσή τους και παρά την πρόοδο που έχεισημειωθεί στην κατανόηση των παθογενετικών μηχανισμών τους, συνεχίζουν νααποτελούν μια από τις επιθετικότερες μορφές καρκίνου.Ένα από τα βασικότερα χαρακτηριστικά των αστροκυττωμάτων είναι η διηθητική

τους ικανότητα δηλαδή η κυτταρική μετακίνηση ( cell locomotion) και η αποδόμηση στοιχείων της εξωκυττάριας ουσίας (extracellular matrix degradation) που είναι απαραίτητη για να επιτευχθεί η διήθηση. Η ιδιότητα της κυτταρικής διήθησης καθιστά τα νεοπλάσματα αυτά ιδιαιτέρως καταστροφικά για το νευρικό ιστό και επιπλέον δυσχεραίνει τη θεραπεία τους. Τόσο η χειρουργική αντιμετώπιση όσο και ηακτινοθεραπεία καθίστανται μη επαρκείς για την ριζική αντιμετώπιση των όγκων αυτών.Η παρούσα μελέτη έχει ως σκοπό την μοριακή μελέτη του φαινομένου της κυτταρικής διήθησης και εντοπίζεται κυρίως στους μηχανισμούς διάσπασης της εξωκυττάριας ουσίας. Είναι γεγονός ότι τα τελευταία χρόνια μεγάλη ερευνητική προσπάθεια συντελείται προς την κατεύθυνση αυτή και πολλοί από τους μοριακούς μηχανισμούς που εμπλέκονται στη διαδικασία αποδόμησης της εξωκυττάριας ουσίαςαρχίζουν να αποσαφινίζονται. Όμως καθώς η έρευνα προχωρά όλο και περισσότερα δεδομένα αναδεικνύονται γεγονός που υποδηλώνει την πολυπλοκότητα του φαινομένου. Ένα σχετικά πρόσφατα ταυτοποιημένο μόριο η ογκοκατασταλτική πρωτείνη ING-4 ( Inhibition of growth) πιστεύεται ότι είναι πιθανόν να εμπλέκεταιστον έλεγχο της αποδόμησης στοιχείων της εξωκυττάριας ουσίας. Πρόσφατες μελέτες υποδεικνύουν τον ρυθμιστικό ρόλο του ING-4 στο μεταγραφικό παράγοντα NF-κB ο οποίος είναι γνωστό ότι αποτελεί κύριο ρυθμιστή της έκφρασης των ενζύμων διάσπασης της εξωκυττάριας ουσίας MMP-2, MMP-9 (matrix metalloproteases 2,9) και του ενεργοποιητή του πλασμινογόνου τύπου ουροκινάσηςu-PA (urokinase-type plasminogen activator). Στη μελέτη αυτή γίνεται εκτίμηση των 3 επιπέδων έκφρασης της πρωτείνης ING-4 της p65 υπομονάδας του NF-κB και των ενζύμων MMP-2, MMP-9 και του u-PA με τη χρήση της ανοσοιστοχημικής τεχνικής σε τομές παραφίνης ληφθείσες από 101 περιστατικά αστροκυττωμάτων τουανθρώπου όλων των βαθμίδων διαφοποίησης. Η γνώση του επιπέδου έκφρασης των μορίων αυτών στα αστροκυττώματα καθώς και η μεταξύ τους συσχέτιση αφενώς μεν θα συμβάλει στην κατανόηση των μηχανισμών που ελέγχουν την κυτταρική διήθηση, αφετέρου πιθανόν να αποτελέσει χρήσιμη γνώση για μελλοντικό σχεδιασμό θεραπειών περιορισμού του φαινομένου αυτού.

ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣΚΕΦΑΛΑΙΟ 11.1 Στοιχεία ιστολογίας του νευρικού ιστού.Τα κυτταρικά στοιχεία που συνιστούν το νευρικό ιστό προέρχονταιεμβρυολογικά από το νευροεξώδερμα και διακρίνονται στα νευρικά κύτταρα ή νευρώνες και τα κύτταρα της γλοίας (αστροκύτταρα, ολιγοδενδροκύτταρα, επενδυτικά κύτταρα). Τα μικρογλοιακά κύτταρα ανήκουν στο σύστημα μονοπυρήνων μακροφάγων και προερχόμενα από το μυελό των οστών αποικίζουν το νευρικό ιστό κατά τα τελικά στάδια της κυήσεως. Οι νευρώνες ποικίλουν σε όtι αφορά το μέγεθος, τη μορφολογία τους και τα λειτουργικά τους χαρακτηριστικά. Ένας τυπικός νευρώνας αποτελείται από το κυτταρικό σώμα, το οποίο είναι και το τροφικό του κέντρο και τις αποφυάδες. Ο νευράξονας, η μακρύτερη αποφυάδα, ονομάζεται αλλιώς νευρική ίνα και είναι υπεύθυνος για την μετάδοση των νευρικών ώσεων από το κυτταρικό σώμα προς το μετασυναπτικό νευρώνα ενώ οι δενδρίτες, μικρότεροι σε μέγεθος και διακλαδούμενοιαποτελούν μαζί με το κυτταρικό σώμα την υποδεκτική περιοχή του νευρώνα. Τα σώματα των νευρώνων διατάσσονται σε ομάδες, στήλες ή στοιβάδες διατηρώντας αυστηρή σωματοτοπία καθ’ όλα τα επίπεδα του κεντρικού νευρικού συστήματος και συνιστούν τη φαιά ουσία. Οι νευράξονες ομαδοποιούνται σχηματίζοντας δεμάτια δηλαδή σύνολα νευραξόνων με κοινή αρχή και τέλος και κοινή λειτουργία τα οποίασυνιστούν τη λευκή ουσία του κεντρικού νευρικού συστήματος.Οι ποικίλοι τρόποι αντίδρασης των νευρώνων σε καταστάσεις βλάβης του νευρικού ιστού αντανακλούν τον υψηλό βαθμό μεταβολικής και λειτουργικής πολυπλοκότητάς τους. Έτσι σε καταστάσεις βλάβης του άξονα εμφανίζεται κεντρική χρωματόλυση (διάσπαση των σωματίων του Nissl) στο περικάρυο, διόγκωση του κύτταρου και απώθηση του πυρήνα προς την περιφέρεια, ενώ σε πλήρη διατομή το περιφερικό τμήμα εμφανίζει μείωση της διαμέτρου και απώλεια μυελίνης αλλοιώσεις γνωστές ως βαλλεριανή εκφύλιση (Wallerian degeneration). Άλλοι χαρακτηριστικοίτρόποι αντίδρασης του νευρικού κυττάρου αφορούν στην συσσώρευση λιπιδίων στο κυτταρόπλασμα και σε διαταραχές της οργάνωσης του κυτταροσκελετού σε εκφυλιστικές καταστάσεις.Τα αστροκύτταρα αποτελούν τα μεγαλύτερα από τα κύτταρα της γλοίας. Έχουν σφαιρικό κεντρικά τοποθετημένο πυρήνα και πολλές αποφυάδες. Διακρίνονται σε πρωτοπλασματικά αστροκύτταρα που

εντοπίζονται στη φαιά ουσία και ινώδη που εντοπίζονται στη λευκή ουσία. Οι αποφυάδες των αστροκυττάρων έρχονται σε άμεσηεπαφή με το αγγειακό τοίχωμα συμβάλλοντας έτσι στη δημιουργία τουαιματοεγκεφαλικού φραγμού ενώ δημιουργούν ένα αφοριστικό πέταλο στην επιφάνεια του εγκεφάλου κάτω από την χοριοειδή μήνιγγα. Ο ρόλος τους είναι κυρίως στηρικτικός και τροφικός ενώ τα τελευταία χρόνια διαφαίνεται ολοένα και περισσότερο η συμβολή τους στην ομοιόσταση του ιοντικού νευρωνικού περιβάλλοντος και στη συναπτική διαβίβαση. Σε καταστάσεις βλάβης τα αστροκύτταρα υπερτρέφονται και σε κάποιο βαθμό υπερπλάσονται δημιουργώντας τηγλοίωση αναπληρώνοντας έτσι το έλλειμμα που άφησε η βλάβη.Τα ολιγοδενδροκύτταρα είναι μικρότερα σε μέγεθος από τα αστροκύτταρα και έχουν βραχύτερες και λιγότερες αποφυάδες από αυτά. Βρίσκονται τόσο στη φαιά ουσία κοντά στο σώμα του νευρικού κυττάρου όσο και στη λευκή ουσία κατά μήκος της πορείας και μεταξύ των αξόνων των νευρικών κυττάρων. Είναι υπεύθυνα για τηδημιουργία του ελύτρου της μυελίνης δημιουργώντας έτσι μια συμβιωτική σχέση με τους νευρώνες. Κάθε ολιγοδενδροκύτταρο είναι υπεύθυνο για τη μυελίνωση περισσοτέρων του ενός νευραξόνων.Τα επενδυματικά κύτταρα καλύπτουν την κοιλιακή επιφάνεια του νευρικού συστήματος διατηρώντας την επιθηλιακή τους διάταξη. Τα περισσότερα διαθέτουν κροσσούς βοηθώντας έτσι στη διακίνηση του εγκεφαλονωτιαίου υγρού ενώ η έλλειψη αποφρακτικών ζωνών επιτρέπει στις ουσίες του ΕΝΥ να διέρχονται στον υποκείμενονευρικό ιστό. Ένας ιδιαίτερος τύπος επενδυτικού κυττάρου το τανυκύτταρο που βρίσκεται στο έδαφος της τρίτης κοιλιάς και χαρακτηρίζεται από μια μακριά αποφυάδα που εκτείνεται στον παρακείμενο νευρικό ιστό, πιστεύεται πως παίζει ρόλο στη μεταφορά χημικών σωμάτων από το ΕΝΥ προς περιοχές κάτωθεν τουεπενδύματος.Τέλος, τα μικρογλοιακά κύτταρα προερχόμενα από το σύστημα τωνμονοπυρήνων μακροφάγων εμφανίζουν επίμηκες σχήμα με αποφυάδες και επιμήκη πυρήνα. Διαθέτουν φαγοκυτταρικές ιδιότητες ενώ ενεργοποιούνται σε καταστάσεις βλάβης του νευρικού ιστού απομακρύνοντας τα κατεστραμμένα κυτταρικά στοιχεία.Βρίσκονται τόσο στη φαιά όσο και στη λευκή ουσία.Τα τελευταία χρόνια γίνεται πολύς λόγος για την εξωκυττάρια ουσία του νευρικού συστήματος. Ενώ μέχρι πρόσφατα θεωρείτο ότι η εξωκυττάρια ουσία στον εγκέφαλο ήταν ελάχιστη και περιοριζόμενη κυρίως γύρω από τα αγγεία σήμερα πιστεύεται ότι αποτελεί έως και το

20% του όγκου του εγκεφάλου. Η κατανομή της δεν είναι ομοιόμορφη και διακρίνονται διαφορές τόσο στη ποσότητα όσο και στη σύσταση της εξωκυττάριας ουσίας. Στον παρακάτω πίνακα (1.1.1) παρουσιάζονται οικυριότερες περιοχές εντόπισης της εξωκυττάριας ουσίας και η σύσταση τους.Πίνακας 1.1.1Περιοχές εντόπισης εξωκυττάριαςουσίαςΚύρια συστατικά• Περιαγγειακός Χώρος(Βασική μεμβράνη)Κολλαγόνο IV, λαμινίνη, ινοδονεκτίνη,βιντρονεκτίνη• Κάτωθεν της χοριοειδούς Μήνιγγας(subpial)Κολλαγόνο Ι, ΙΙΙ, ΙV, λαμινίνη,ινοδονεκτίνη, πρωτεογλυκάνες• Κάτωθεν του επενδύματος και τωνΧορειοδών πλεγμάτωνΚολλαγόνο Ι, ΙΙΙ, ΙV, λαμινίνη,ινοδονεκτίνη, πρωτεογλυκάνες• Εγκεφαλικό παρέγχυμα Υαλουρονικό οξύ, θειική χονδροιτίνη,θειική ηπαράνη, θειική κερατάνη8Η εξωκυττάρια ουσία πιστεύεται ότι διαδραματίζει σημαντικό ρόλο κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη του εγκεφάλου στις διεργασίες μετανάστευσης των αρχέγονων κυττάρων και στον καθορισμό της πορείας του αναπτυσσόμενου νευράξονα κατά τη δημιουργία των συνδέσεων (axon pathfinding).Ο ρόλος της όμως είναι σημαντικός και στον ώριμο εγκέφαλο τόσο σε φυσιολογικές διεργασίες όπως η μνήμη (εγκατάσταση του Long term pontensiation) όσο και σε παθολογικές καταστάσεις (εκφυλιστικές, απομυελινωτικές νόσους). Ιδιαίτερη σημασία δε φαίνεται να λαμβάνει στις διεργασίες μετανάστευσης και διήθησης των νεοπλασματικών κυττάρων των όγκων του εγκέφαλου.1.2 Στοιχεία εμβρυϊκής ανάπτυξης του νευρικού συστήματοςΕίναι γνωστό ότι το νευρικό σύστημα προέρχεται από τη νευρική πλάκα, μιακεντρική περιοχή του εξωδέρματος, η οποία στα περιφερικά όριά της λόγω της έντονης πολλαπλασιαστικής δραστηριότητας των κυττάρων «πτυχώνεται» δημιουργώντας τη νευρική αύλακα. Καθώς τα χείλη της νευρικής αύλακας διογκώνονται και συμπλησιάζουν στη μέση γραμμή αρχίζει να δημιουργείται ο νευρικός σωλήνας. Ο νευρικός

σωλήνας παραμένει ανοιχτός στο κεφαλικό και ουραίο άκρο του στα αρχικά στάδια της ανάπτυξής του τα οποία και ονομάζονταιαντίστοιχα πρόσθιος και οπίσθιος νευροπόρος και η σύγκλεισή του ολοκληρώνεται την 27η περίπου ημέρα με το κλείσιμο του οπισθίου νευροπόρου.Σχήμα 1.2.1 Καθώς τα χείλη της νευρικής αύλακας συμπλησιάζουν προς τη μέση γραμμή ξεχωρίζει μια ομάδα κυττάρων και «αποκόπτεται» από το νευρικό σωλήνα. Αυτή η ομάδα κυττάρων του νευροεξωδέρματος συνιστά τη νευρική ακρολοφία από την οποία θα προέλθει το περιφερικό νευρικό σύστημα.Το κεντρικό νευρικό σύστημα προέρχεται από τη διαφοροποίηση τμημάτων του νευρικού σωλήνα, μια διαδικασία που συντελείται σε δύο άξονες: τον κεφαλοουραίο και τον κοιλιακό–ραχιαίο άξονα. Η διαφοροποίηση κατά μήκος του κεφαλοουραίου άξονα είναι υπεύθυνη για την ανάπτυξη του προσθίου, του μέσου του οπισθίου εγκεφάλου και του νωτιαίου μυελού ενώ η διαφοροποίηση κατά μήκος του10 κοιλιοραχιαίου άξονα θα οδηγήσει στη δημιουργία της εδαφιαίας και οροφιαίας περιοχής του νευρικού σωλήνα.Η θέση την οποία κατέχει ένα συγκεκριμένο κύτταρο στο σύστημα των δύο αξόνων πιστεύεται ότι είναι καθοριστική για την περαιτέρω πορεία του στις διαδικασίες της διαφοροποίησης. Αυτό συμβαίνει διότι η θέση του κυττάρου καθορίζει την έκθεσή του σε συγκεκριμένους διαλυτούς παράγοντες που εκκρίνονται είτε από καθορισμένες περιοχές του αναπτυσσόμενου νευρικού σωλήνα, είτε από περιοχές του παρακείμενου μεσοδέρματος. Οι κυριότεροι παράγοντες που είναιυπεύθυνοι για τη διαφοροποίηση κατά τον κοιλιακό–ραχιαίο άξονα ανήκουν στις οικογένειες των Hedgehog και Bone Morphogenetic Protein (BMP) και ευθύνονται για τη διαμόρφωση της κοιλιακής και οροφιαίας περιοχής του νευρικού σωλήνα αντίστοιχα. Στον κεφαλοουραίο άξονα διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο οι FGF,Wnt, sonic hedgehog και τα ρετινοειδή ενώ οι σημαντικότερες περιοχές έκκρισης αυτών είναι ο ισθμός (μια σηαντική περιοχή μεταξύ μέσου και οπισθίου εγκεφάλου), η zona limitans intrathalamica και το παρακείμενο μεσόδερμα (σχήμα1.2.2). Η έκθεση μιας περιοχής του νευρικού σωλήνα μια δεδομένη χρονική στιγμή σε συγκεκριμένο συνδυασμό και συγκέντρωση των παραγόντων αυτών έχει ωςαποτέλεσμα την ενεργοποίηση συγκεκριμένων κατηγοριών μεταγραφικών παραγόντων (ομοιοτικοί παράγοντες) που με τη σειρά τους επάγουν την μεταγραφή καθοριστικών για τη διαφοροποίηση γονιδίων. Η περιοχή αμέσως γύρω από το κοιλιακό σύστημα του αναπτυσσόμενου νευρικού σωλήνα (subventricular zone–υποκοιλιακή ζώνη) είναι η περιοχή που εμφανίζεται κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη

του Κ.Ν.Σ. έντονη μιτωτική δραστηριότητα. Κύτταρα από την περιοχή αυτή μεταναστεύουν προς περιφερικότερα τμήματα του νευρικού σωλήνα είτε ακτινωτά, υποβοηθούμενα από τα radial glial cells, είτε εφαπτομενικά (tangential migration) δημιουργώντας το φλοιό, τα βασικά γάγγλια , τον οσφρητικό βολβό, τα οπτικά νεύρα κ.α. περιοχές του εγκεφάλου.11Σχήμα 1.2.2:α) Στον κοιλιοραχιαίο άξονα ο shh εκκρινόμενος από τη νωτιαία χορδή και ο ΒΜΡ από την οροφιαία πλάκα και το μεσόδερμα εγκαθιστούν συγκεκριμένο pattern έκφρασης μεταγραφικών παραγόντων (Pax3, Pax7, Dbx2, Nkx6.1, Nkx2) της οικογένειας bHLH που ρυθμίζουν την έκφραση γονιδίων καθοριστικών για τη διαφοροποίηση κινητικών (κοιλιακά) και αισθητικών (ραχιαία) νευρώνων.β) Καθορισμένες ομάδες κυττάρων στην περιοχή του ισθμού και της zona limitan intrathalamica εκκρίνουν διαλυτούς παράγοντες (FGF, Wnt, shh) σημαντικούς για τη διαφοροποίηση κατά τον κεφαλοουραίο άξονα.Κατά τη διάρκεια της μετανάστευσής τους υφίστανται τις διαδικασίεςδιαφοροποίησης προς τις διάφορες γλοιακές σειρές και τη νευρωνική σειρά (σχ.1.2.3.). Πολύπλοκες μοριακές αλλά και κυτταρικές αλληλεπιδράσεις ευθύνονται για την ρύθμιση των διαδικασιών πολλαπλασιασμού μετανάστευσηςκαι διαφοροποίησης των αρχέγονων κυττάρων (σχήμα 1.2.4.)2

12Σχήμα 1.2.3 Ο Ψ άξονας παριστάνει το πάχος του νευρικού σωλήνα και ο Χ άξονας την πρόοδο τουχρόνου έως τη γέννηση. Αρχέγονα κύτταρα υπό την επίδραση αυξητικών παραγόντων (FGF, EGF, κ.α.) πολλαπλασιάζονται, μεταναστεύουν και σταδιακά διαφοροποιούνται προς τις διάφορες γλοιακές σειρές και τη νευρωνική σειρά εκφράζοντας συγκεκριμένους μεμβρανικούς δείκτες για συγκεκριμένα χρονικάδιαστήματα.Σχήμα 1.2.4. Στο σχήμα αυτό παρουσιάζεται μία εγκάρσια διατομή του αναπτυσσόμενου νευρικούσωλήνα και φαίνεται η περιοχή της υποκοιλιακής ζώνης στην οποία κατά την εμβρυική ζωή παρατηρείται αυξημένος αριθμός κυτταρικών διαιρέσεων. Τα αρχέγονα νευρικά κύτταρα και ταπρόδρομα κύτταρα των νευρικών σειρών υπό την επίδραση του μικροπεριβάλλοντος αλλά και διαλυτώνπαραγόντων υφίσταται τις διαδικασίες διαφοροποίησης προς τις διάφορες σειρές νευρικών και γλοιακώνκυττάρων.13

1.3 Αρχέγονα νευρικά κύτταρα στον πλήρως ανεπτυγμένο εγκέφαλο.Στον εγκέφαλο του ενήλικου οργανισμού στην υποκοιλιακή ζώνη ιδίως τηςτρίτης κοιλίας και των πλαγίων κοιλιών καθώς και στην οδοντωτή έλικα τουιπποκάμπου εντοπίζονται τα πολυδύναμα νευρικά κύτταρα (Multipotent neuronalstem cells) (σχήμα 1.3.1). Τα αρχέγονα αυτά κύτταρα διατηρούν τηνπολλαπλασιαστική τους ικανότητα και πιστεύεται πως συμμετέχουν σε διαδικασίεςαναγέννησης στον εγκέφαλο μεταναστεύοντας προς την

περιοχή της βλάβης. Στο σχήμα 1.3.2. παρουσιάζονται τα στάδια διαφοροποίησης καθώς και οι σηματικότεροι μοριακοί μηχανισμοί ελέγχου της διαφοροποίησης και του πολλαπλασιασμού τωναρχέγονων νευρικών κυττάρων3.Τα τελευταία χρόνια ισχυροποιείται συνεχώς η άποψη ότι τα πολυδύναμα νευρικά κύτταρα είναι ο στόχος της κακοήθους εξαλλαγής που οδηγεί στην ανάπτυξη γλοιωμάτων, ενώ διαταραχές στους μοριακούς και γενετικούς μηχανισμούς που ρυθμίζουν τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση και τη μετανάστευση τους έχουνβρεθεί στους όγκους αυτούς.4, 5

Σχήμα 1.3.1. Στα τοιχώματα της τρίτης κοιλίας, στα πλάγια τοιχώματα των πλαγίων κοιλιών καθώςκαι στην οδοντωτή έλικα του ιπποκάμπου ΄΄παραμένουν΄΄ στον ώριμο εγκέφαλο αρχέγονα κύτταρατου νευρικού ιστού τα οποία πιστεύεται ότι αποτελούν στόχο της κακοήθους εξαλλαγής6.14Σχήμα 1.3.2 Στο παραπάνω διάγραμμα παρουσιάζονται οι οδοί διαφοροποίησης των αρχέγονωννευρικών κυττάρων προς τους ώριμους κυτταρικούς τύπους του νευρικού ιστού. Εμφανίζονται τασημαντικότερα μοριακά μονοπάτια που διαδραματίζουν καθοριστικό ρόλο στις διεργασίεςπολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης.15

1.4 Νεοπλάσματα του Κεντρικού Νευρικού συστήματοςΤα νεοπλάσματα του κεντρικού νευρικού συστήματος διακρίνονται σεπρωτοπαθή και δευτεροπαθή ή μεταστατικά νεοπλάσματα, τα οποία είναι καισυχνότερα. Τα πρωτοπαθή νεοπλάσματα συνιστούν μια ευρεία ομάδα με μεγάληποικιλία ως προς την ηλικία και θέση εμφάνισης, τη βιολογική συμπεριφορά, τηνπρόγνωση και τη θεραπεία. Προέρχονται από κακοήθη εξαλλαγή κυττάρων τουνευρικού ιστού, των αγγείων, ή των περιβλημάτων (μηνίγγων) του εγκεφάλου.Επιδημιολογικά στοιχεία:Με βάση τα τελευταία δεδομένα του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας (2007)7τα πρωτοπαθή νεοπλάσματα του Κ.Ν.Σ. εμφανίζονται με συχνότητα 18–20 ανά100.000 πληθυσμού και αποτελούν το 10% του συνόλου των νεοπλασιών. Το 10–20% των νεοπλασμάτων αυτών εμφανίζονται στα παιδιά αποτελώντας τον πρώτο σεσυχνότητα συμπαγή όγκο της παιδικής ηλικίας και το δεύτερο όλων των νεοπλασιώνμετά τις λευχαιμίες. Στο 70% των περιπτώσεων οι όγκοι της παιδικής ηλικίας εντοπίζονται κάτωθεν του σκηνιδίου της παρεγκεφαλίδας, ενώ αντιθέτως το 70% των όγκων των ενηλίκων εντοπίζονται στο υπερσκηνίδιο επίπεδο.Η συχνότητα εμφάνισης των όγκων του εγκεφάλου κορυφώνεται στη μέσηηλικία ενώ παρουσιάζει μείωση τις τελευταίες 10/ετίες. Έως τη

μέση ηλικία το 25%των όγκων είναι καλοήθεις ενώ το ποσοστό αυτό ανέρχεται στο 50% τις τελευταίες10/ετίες της ζωής εξαιτίας της συχνότερης ανάπτυξης του μηνιγγιώματος και τουσβανώματος. Πολύ μικρή υπεροχή στη συχνότητα ανάπτυξης ενδοκρανιακούπρωτοπαθούς όγκου εμφανίζουν οι άνδρες (55%) έναντι των γυναικών, η εμφάνισηόμως μηνιγγιώματος και σβανώματος είναι συχνότερη στις γυναίκες.Ταξινόμηση των νεοπλασμάτων του Κ.Ν.Σ.:Με βάση την τελευταία ταξινόμηση του παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας ταπρωτοπαθή νεοπλάσματα του Κ.Ν.Σ. ταξινομούνται στις κατηγορίες πουαναγράφονται στον πίνακα 1.4.1. Η ταξινόμηση αυτή βασίζεται εξ’ ολοκλήρου σταιστολογικά χαρακτηριστικά των όγκων.Πίνακας 1.4.1 Ταξινόμηση των όγκων του Νευρικού συστήματος κατά W.H.O. 2007Από τους πρωτοπαθείς όγκους του κεντρικού νευρικού συστήματος οι όγκοι νευρο-επιθηλιακής αρχής αποτελούν τους πλέον συχνότερους σε ποσοστό 50 – 60%.Μεταξύ αυτών τα γλοιώματα είναι τα συχνότερα.Γλοιώματα είναι οι όγκοι με χαρακτηριστικά διαφοροποίησης αστροκυττάρων,ολιγοδενδροκυττάρων, επενδυματικών κυττάρων ή προδρόμων κυτταρικών μορφώντους. Τα αστροκυττώματα, τα ολιγοδενδρογλοιώματα και τα επενδυμώματα καθώςκαι μικτές μορφές συνιστούν την ομάδα των γλοιωμάτων. Τα αστροκυττώματα είναιτα συνηθέστερα 8.Σύμφωνα με το σύστημα ταξινόμησης του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας τααστροκυττώματα ταξινομούνται σε τέσσερις βαθμίδες διαφοροποίησης με βάση ταιστολογικά χαρακτηριστικά:κυτταροβριθεια, κυτταρικός πλειομορφισμός, πυρηνική ατυπία, αριθμός μιτώσεων, παρουσία νέκρωσης και μικροαγγειακό πολλαπλασιασμό. Έτσι τα grade IIαστροκυττώματα ή διάχυτα αστροκυττώματα στα οποία συγκαταλέγονται τα ινώδηαστροκυττώματα, τα πρωτοπλασματικά αστροκυττώματα, και τα γεμιστοκυτταρικάαστροκυττώματα χαρακτηρίζονται από χαμηλή κυτταροβρίθεια και πυρηνική ατυπίαενώ δεν εμφανίζουν τα άλλα χαρακτηριστικά. Τα grade IIΙ (αναπλαστικάαστροκυττώματα) εκτός από την εντονότερη κυτταροβρίθεια και πυρηνική ατυπίαεμφανίζουν και αυξημένο αριθμό μιτώσεων και τέλος στα grade IV (πολύμορφαγλοιοβλαστώματα) επιπροστίθεται η παρουσία νέκρωσης ή/και μικροαγγειακού πολλαπλασιασμού ως χαρακτηριστικό και διαγνωστικό ιστολογικό τους γνώρισμα 9.Στην ομάδα των grade I αστροκυττωμάτων ή πιλοκυτταρικών συγκαταλέγονται τα

πολυμυξοειδικά αστροκυττώματα, το πλειομορφικό ανθοαστροκύττωμα και τουποεπενδυματικό γιγαντοκυτταρικό αστροκύττωμα. Τα νεοπλάσματα αυτά είναιιδιαίτερα σπάνια και χαρακτηρίζονται από ιδιαίτερη βιολογική συμπεριφορά, ευνοϊκήπρόγνωση συνιστώντας ιδιαίτερη ομάδα10.Ξεχωριστή κατηγορία κατάταξης αποτελεί στην τελευταία ταξινόμηση τουW.H.O. η εγκεφαλική γλοιωμάτωση (gliomatosis cerebri) η οποία αποτελεί ιδιαίτερακακοήθη κατάσταση με υψηλό ποσοστό εμφάνισης γλοιώματος και δυσμενήπρόγνωση.Τα grade I και ΙΙ αστροκυττώματα χαρακτηρίζονται ως low grade νεοπλάσματακαλής διαφοροποίησης με καλύτερη πρόγνωση εν συγκρίσει με τα αναπλαστικάαστροκυττώματα (grade III) και τα πλέον αδιαφοροποίητα, επιθετικά πολύμορφαγλοιοβλαστώματα.(grade IV).Η ηλικία στην οποία εμφανίζονται συχνότερα τα grade ΙΙ αστροκυττώματα είναιη τρίτη δεκαετία της ζωής ενώ για τα αναπλαστικά αστροκυττώματα η 4η δεκαετία.Το πολύμορφο γλοιοβλάστωμα εμφανίζεται σε μεγαλύτερες ηλικίες.Κύριο χαρακτηριστικό των αστροκυττωμάτων είναι η εξέλιξή τους απόνεοπλάσματα καλής διαφοροποίησης σε περισσότερο κακοήθης μορφές όπως τοαναπλαστικό αστροκύττωμα και το πολύμορφο γλοιοβλάστωμα με μια διαδικασίαπου λαμβάνει χώρα σε διάστημα έως και 10 ετών. Η διεργασία αυτή που είναι γνωστήως tumor progression είναι χαρακτηριστική για τα αστροκυττώματα και οφείλεταιστη συσσώρευση όλο και περισσότερων γενετικών βλαβών, που οδηγούν στηναπόκτηση κακοήθων χαρακτηριστικών αποδιαφοροποίηση, αύξηση κυτταρικού πολλαπλασιασμού διηθητική ικανότητα).Είναι δυνατόν όμως να έχουμε την ανάπτυξη εξ αρχής (de novo) πολύμορφουγλοιοβλαστώματος χωρίς να αποτελεί εξέλιξη νεοπλάσματος χαμηλότερης βαθμίδαςδιαφοροποπίησης. Το νεόπλασμα αυτό (πρωτοπαθές πολύμορφο γλοιοβλάστωμα εναντιθέσει με το δευτεροπαθές) αναπτύσσεται σε άτομα μεγαλύτερης ηλικίας και είναισυχνότερο11. Ιστολογικά δεν είναι δυνατόν να γίνει διάκρισή του από τοδευτεροπαθές, διαφέρουν όμως στις γενετικές και επιγενετικές αλλοιώσεις. Από τηστιγμή που θα εγκατασταθεί το δευτεροπαθές γλοιοβλάστωμα η κλινική του πορείαείναι το ίδιο δραματική με το πρωτοπαθές.Ένα επίσης χαρακτηριστικό των αστροκυττωμάτων είναι η ικανότητα τους ναδιηθούν το γειτονικό φυσιολογικό εγκεφαλικό ιστό γεγονός20Σχήμα 1.4.1 Δύο διαφορετικές οδοί δημιουργίας πολύμορφου γλοιοβλαστώματος

το οποίο οδηγεί στην διασπορά καρκινικών κυττάρων σε απομακρυσμένες περιοχέςαπό το σημείο δημιουργίας του όγκου. Η διήθηση του φυσιολογικού νευρικού ιστούσυμβαίνει διαμέσου συγκεκριμένων ανατομικών δομών όπως περιγράφεταιλεπτομερώς στο σχετικό κεφάλαιο. Η διηθητική ανάπτυξη είναι ιδιαίτεραεμφανής στα κακής διαφοροποίησης νεοπλάσματα χωρίς να απουσιάζει όμως και απότα low grade και λόγω αυτού του αρακτηριστικού τους ονομάζονται διάχυτααστροκυττώματα (diffuse astrocytomas) 12.Λόγω του διηθητικού τρόπου ανάπτυξης τους τα αστροκυττώματα είναι ανθεκτικάστη χειρουργική θεραπεία και ακτινοθεραπεία ενώ η ανθεκτικότητά τους σταχημειοθεραπευτικά τα κατατάσσει στα πλέον χειρότερης πρόγνωσης νεοπλάσματα.Έτσι η μέση επιβίωση ασθενών με grade II αστροκύττωμα είναι 10 έτη, μεαναπλαστικό αστροκύττωμα 2-3 έτη ενώ αυτών με πολύμορφο γλοιοβλάστωμασπάνια ξεπερνά τους 9-12 μήνες.21Σχήμα 1.4.2 Mακροσκοπική εμφάνιση πολύμορφου γλοιοβλαστώματος και low gradeastrocytomas. Εμφανής είναι έντονη διηθητική ανάπτυξη η παρουσία νεκρώσεων και αιμορραγιώνστο πολύμορφο γλοιοβλάστωμα.α (low grade) β.(high grade)Σχήμα 1.4.3 Απεικόνιση στην MRI: Είναι χαρακτηριστική η απεικόνιση του καλήςδιαφοροποίησης γλοιώματος α. και του πολύμορφου γλοιοβλαστώματος β. Στην περίπτωση τουγλοιοβλαστώματος χαρακτηριστική είναι η παρουσία οιδήματος λόγω αυξημένης διατερατότηταςτων νεόπλαστων αγγείων και η παρουσία νέκρωσης.22Σχήμα 1.4.4 Ιστολογική εμφάνιση πιλοκυτταρικού αστρκυττώματος (αριστερά) και πολύμορφουγλοιοβλαστώματος (δεξιά). Είναι εμφανείς οι περιοχές νεκρώσεως στο πολύμορφο γλοιοβλάστωμακαι η χαρακτηριστική διάταξη των κυττάρων του όγκου γύρω από αυτές.

Προγνωστικοί παράγοντες για την εξέλιξη της νόσουΟ κυριότερος προγνωστικός παράγοντας για την πορεία της νόσου είναι ηβαθμίδα ιστολογικής διαφοροποίησης (grade). Η πληροφορία αυτή αποτελείσημαντικό προγνωστικό στοιχείο και λαμβάνεται σοβαρά υπόψιν στον καθορισμό τουθεραπευτικού σχεδιασμού. Ευνοϊκοί προγνωστικοί παράγοντες αποτελούν η μικρήηλικία, η καλή κατάσταση του ασθενούς, η απουσία νευρολογικών εκδηλώσεων, ηθέση του όγκου και η μακροσκοπικά πλήρης εξαίρεση του όγκου.Η μεγάλη πρόοδος που έχει σημειωθεί τα τελευταία χρόνια προς την κατεύθυνση

της κατανόησης των μοριακών, γενετικών και επιγενετικών μηχανισμών ανάπτυξηςτων γλοιωμάτων οδηγεί σταδιακά σε νέες μεθόδους ταξινόμησης των όγκων αυτώνκαι στην εισαγωγή νέων προγνωστικών παραγόντων (βλέπε επόμενο κεφάλαιο). Είναιγεγονός ότι η έρευνα στους μοριακούς μηχανισμούς της ανάπτυξης τωναστροκυττωμάτων εκτός του ότι εισάγει σταδιακά νέους και ακριβέστερους τρόπουςδιάγνωσης, ανοίγει νέες θεραπευτικές προοπτικές για την αντιμετώπιση των όγκωναυτών.23

Θεραπευτική αντιμετώπισηΗ θεραπεία των αστροκυττωμάτων περιλαμβάνει την χειρουργική εξαίρεση τουόγκου, την ακτινοθεραπεία και την χημειοθεραπεία 13. Η χειρουργική εξαίρεση τουνεοπλάσματος αποτελεί τον ακρογωνιαίο λίθο στη θεραπεία των γλοιωμάτων. Πολλέςφορές είναι αδύνατη η μακροσκοπικά πλήρης αφαίρεση του όγκου λόγω του ότιμπορεί να διηθεί σημαντικές δομές του εγκεφάλου, βλάβη στις οποίες επηρεάζειαρνητικά την νευρολογική έκβαση του ασθενούς και την ποιότητα ζωής του. Ηχειρουργική θεραπεία έχει διπλό ρόλο στην αντιμετώπιση των ασθενών αυτών:πρώτον ανακουφίζει τον εγκέφαλο από τα πιεστικά φαινόμενα που προκαλεί η μάζατου όγκου και βελτιώνει την νευρολογική εικόνα του ασθενούς και δεύτερον ημακροσκοπικά πλήρης εξαίρεση του όγκου καθιστά αποτελεσματικότερες τηνακτινοθεραπεία και τη χημειοθεραπεία. Έχει αποδειχθεί ότι η χειρουργική εξαίρεσηεπί υγιών ορίων αυξάνει την επιβίωση του ασθενούς.Η ακτινοθεραπεία έχει θέση στην αντιμετώπιση των αστροκυττωμάτων και ηαποτελεσματικότητά της αυξάνεται μετά την μακροσκοπικά πλήρη αφαίρεση τουόγκου. Η ακτινοθεραπεία μπορεί να είναι στερεοτακτικά εντοπισμένη στην περιοχήτου όγκου ή καθολική.Παράλληλα με την ακτινοθεραπεία ή συμπληρωματικά χορηγούνται σήμερα καιχημειοθεραπευτικά σκευάσματα. Στο παρακάτω διάγραμμα εμφανίζεται το σχήμαχορήγησης χήμειο- και ακτινοθεραπείας.24Σχήμα 1.4.5. Στο παραπάνω διάγραμμα φαίνεται η τρέχουσα θεραπευτική προσέγγιση τωνγλοιωμάτων. Gliadel:carmustine, TMZ: temozolamide25

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2ΠΑΘΟΓΕΝΕΤΙΚΟΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΣΤΗΝ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΤΩΝΓΛΟΙΩΜΑΤΩΝ2.1 Κυτταρική προέλευση των γλοιωμάτων.

Σύμφωνα με το περισσότερο διαδεδομένο σήμερα σύστημα ταξινόμησης τωνόγκων του Κ.Ν.Σ., αλλά και με παλαιότερα συστήματα, η ταξινόμηση τωνγλοιωμάτων βασίζεται πρωτίστως στα χαρακτηριστικά διαφοροποίησης τωνκυττάρων του όγκου. Έτσι διακρίνονται τα αστροκυττώματα, ολιγοδενδρογλοιώματα,επενδυμώματα καθώς και μικτοί όγκοι με βάση τα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά τωννεοπλασματικών κυττάρων. Το ερώτημα όμως που παραμένει αναπάντητο έωςσήμερα αφορά στην κυτταρική προέλευση των όγκων αυτών σε ποιο κύτταρο δηλαδήσυμβαίνει η κακοήθης εξαλλαγή.Τα τελευταία χρόνια έχει αποκαλυφθεί η παρουσία αρχέγονων κυττάρων (neuralstem cells) καθώς και προδρομικών κυττάρων (glial progenitor cells) στον εγκέφαλοτου ενηλίκου οργανισμού. Τα αρχέγονα νευρικά κύτταρα εντοπίζονται στηνυποκοιλιακή ζώνη της τρίτης κοιλίας και των πλαγίων κοιλιών και στην οδοντωτήέλικα του ιπποκάμπου, ενώ τα προδρομικά γλοιακά κύτταρα είναι διάσπαρτα κυρίωςστη λευκή αλλά και στη φαιά ουσία (σχήμα2.1.1). Τα αρχέγονα νευρικά κύτταραείναι πολυδύναμα (multipotent) και έχουν τη δυνατότητα αυτοαναπαραγωγής καιδιαφοροποίησης προς κύτταρα νευρικών και γλοιακών σειρών12. Τα προδρομικάγλοιακά κύτταρα προέρχονται από τα αρχέγονα κύτταρα, διατηρούν την ικανότητααυτοαναπαραγωγής και βρίσκονται στην οδό διαφοροποίησης προς κύτταραγλοιακών σειρών (αστροκύτταρα, ολιγοδενδροκύτταρα). Κατά τη διαδικασία τηςδιααφοροποίησής τους αποκτούν συγκεκριμένους μοριακούς φαινότυπουςεκφράζοντας χαρακτηριστικούς μοριακούς δείκτες επιφανείας. Τα τελευταία χρόνιαέχουν αποκαλυφθεί οι μοριακοί μηχανισμοί που ελέγχουν τον πολλαπλασιασμό καιρυθμίζουν την διαφοροποίηση των αρχέγονων και των προδρομικών κυττάρων. Έχειδιαπιστωθεί ότι αυτοί οι μοριακοί μηχανισμοί βρίσκονται ιαταραγμένοι σταγλοιώματα13.Το γεγονός αυτό οδήγησε στην υπόθεση ότι τα αρχέγονα κύτταρα τηςυποκοιλιακής ζώνης ή τα προδρομικά γλοιακά κύτταρα θα μπορούσαν να αποτελούνστόχο κακοήθους εξαλλαγής λόγω του ολλαπλασιαστικού δυναμικού που έχουν. Ηθεωρία αυτή παγιώνεται σήμερα όλο και περισσότερο λόγω της δυνατότητας πουυπάρχει για απομόνωση και μελέτη in vitro των αρχέγονων και προδρομικώνκυττάρων. Η κακοήθης εξαλαγή των αρχέγονων η προδρομικών γλοιακών κυττάρωνκινητοποιεί μια ακολουθία κυτταρικών και μοριακών γεγονότων που καθιστά τακυτταρα αυτά ευάλωτα στη συσσώρευση όλο και περισσοτέρων γενετικών βλαβώνκαι τελικά στην πλήρη αποδιαφοροποίηση του κυττάρου14. Η διαδικασία αυτή

κινητοποιεί προγράμματα κυτταρικής μετανάστευσης, διήθησης και νεοαγγείωσηςχαραχτηρισικά τα οποία είναιεμφανή στα γλοιώματα 15.Neural Stem Cells Glial progenitorsGFAP+/Nestin+/CD133+ PDGFR+/NG2+/olig2+/A2B5+• multipontential oligodendrocyte lineage• self renewing • Phenotypic plasticity• relatively few can revert• located in S.V.Z. • Capacity for self-renewal• confined to a niche • Abundant• Widely distributedPotentially migratoryΣχήμα 2.1.1 Στηνυποκοιλιακή ζώνη τωνπλαγίων κοιλίων και στηνοδοντωτή έλικα τουιπποκάμπου έχει πιστοποιηθείστον ώριμο εγκέφαλο ηυπάρξη αρχέγονων νευρικώνκυττάρων (neural stem cells).Στα δεμάτια της λευκής ουσίαςέχουν απομονωθεί πρόδρομαγλοιακά κύτταρα (glialprogenitors) τα οποίααποτελούν το 4% τουκυτταρικού πλυθησμού ενώμικρότερος αριθμός έχειπιστοποιηθεί στη φαιά ουσία.Σχήμα 2.1.2 Τα κύτταρα της υποκοιλιακής ζώνης είναι πολυδύναμα (multipotent) και έχουν τηδυνατότητα διαφοροποίησης προς νευρώνες όλων των ειδών και προς όλες τις σειρές των γλοιακώνκυττάρων. Τα πρόδρομα γλοιακά κύτταρα διαφοροποιούνται προς αστροκύτταρα καιολιγοδενροκύτταρα ακολουθώντας διαφορετικές οδούς διαφοροποίησης. Στη διαδικασία επιλογήςτης οδού διαφοποποίησης σημαντικό ρόλο διαδραματίζουν το μικροπεριβάλλον, διαλυτοίπαράγοντες και η ενεργοποίηση εσωτερικών προγραμμάτων διαφοροποίησης.

2.2H θεωρία των brain tumor stem cells.Τα τελευταία χρόνια υποστηρίζεται η άποψη της ύπαρξης των tumor stemcells σε πολλά νεοπλάσματα του ανθρώπου μεταξύ των οποίων και σταγλοιώματα. Τα glioma stem cells διαθέτουν ένα συνολο ιδιοτήτων που τουςεπιτρέπουν να διαιρούνται συνεχώς και να αναπαράγουν όλα τα κυτταρικάστοιχεία του όγκου. Τελευταίες επιστημονικές έρευνες υποστηρίζουν την ύπαρξηtumor stem cells μεταξύ των νεοπλασματικών κυττάρων στα γλοιώματα μειδιότητες που προσομοιάζουν στα αρχέγονα νευρικά κύτταρα (brain tumor stem-likecells) ή στα προδρομικά γλοιακά κύτταρα (brain tumor progenitor like cells)16. Στοπαρακάτω διάγραμμα (σχήμα 2.2.1) παρουσιάζονται συνοπτικά οι ιδιότητες τωνκυττάρων αυτών 17. Τα brain tumor stem cells έχουν διαταραγμένους τουςμηχανισμούς ελέγχου του κυτταρικού κύκλου και της διαφοροποίησης μεαποτέλεσμα να συντελούν στη δημιουργία μιας άναρχα δομημένης μάζαςκυττάρων που συνιστά τον νεοπλασματικό ιστό (σχήμα 2.2.2) 18,19.• Brain Tumor “Stem-Like” Brain tumor ‘’progenitor-like’’ cellsCells Migratory• Non-migratory Non confined to “niche”

• Confined to “niche” More rapidly cycling• Slowly cycling Numerous relative to “stem cells”• Rare relative to Self renewing“Progenitor” cells Symmetric or asymmetric division• Self-renewing Express markers of immature glia• Symmetric or Asymmetric Plasic phenotypeDivision• Capable of recapitulating allelements of tumorΣχήμα 2.2.1 Στο διπλανό διάγραμμα παρουσιάζεται ηκατανομή και οι χαραχτηριστικές ιδιότητες των gliomastem like cells και των glioma progenitor-like cellsΣχήμα 2.2.2 Στο παραπάνω διάγραμμα εμφανίζονται οι διαδικασίες ιαφοροποίησης καιπολλαπλασιασμού των αρχέγονων νευρικών κυττάρων (α) και οι διεργασίες κακοήθουςεξαλλαγής και δημιουργίας του όγκου (b). Τα brain tumor stem cells έχουν απωλέσει τουςμηχανισμούς ελέγχου του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της διαφοροποίησης μεαποτέλεσμα να δημιουργουν μια άναρχα δομημένη μάζα κυττάρων που συνιστά τηννεοπλασματική χωροεξεργασία.Η παρουσία των glioma stem cell (CD 133+) καθιστά τη θεραπεία των γλοιωμάτωνδύσκολη και την πλήρη χειρουργική εξαίρεσή τους αδύνατη (σχήμα 2.2.3) 20. Σήμεραείναι δυνατή η απομόνωση των glioma stem cells και η μελέτη τους in vitro και σεζωικά μοντέλα. Το γεγονός αυτό αφήνει ελπίδες για την εξεύρεση στοχευμένηςθεραπείας για την εκρίζωση των γλοιωμάτων.30Σχήμα 2.2.3. Η χειρουργική θεραπεία αλλά και οι μέχρι σήμερα εφαρμοζόμενη ακτινιθεραπεία καιχημειοθεραπεία οδηγούν σε μακροσκοπικά πλήρη αφαίρεση της χωροεξεργασίας. Παραμένουνόμως κάποια glioma stem cells είτε στην περικοιλιακή ζώνη, είτε σε εν τω βάθει περιοχές τηςλευκής ουσίας, είτε σε μικροεστίες (φωλιές) γύρω από τα αγγεία τα οποία ανθίσταται στιςσυμβατικές θεραπευτικές τεχνικές και ειναι υπεύθυνα για την επανεμφάνιση του όγκου. Ηεκτενέστερη μελέτη της συμπεριφοράς και της μοριακής βιολογίας των tumor stem cells πιστεύεταιότι θα οδηγήσει στην επινόηση περισσότερο στοχευμένων θεραπευτικών προσεγγίσεων η εφαρμογήτων οποίων μετά την μακροσκοπικά πλήρη χειρουργική εξαίρεση του όγκου θα οδηγήσει στηνεκλεκτική εκρίζωση των κυττάρων αυτών και κατ’ επέκταση του όγκου.31

2.3 Μοριακοί και γενετικοί μηχανισμοί στην ανάπτυξη τωναστροκυττωμάτων.Παρότι εμφάνιση αστροκυττωμάτων έχει περιγραφεί στα πλαίσια κληρονομικώνσυνδρόμων τα νεοπλάσματα αυτά στην πλειονότητά τους είναι σποραδικά. Τατελευταία χρόνια με την πρόοδο των μοριακών τεχνικών έχουν περιγραφεί πολλέςμοριακές και γενετικές διαταραχές

που εμπλέκονται στη δημιουργία και στη πρόοδοτων αστροκυττωμάτων. Η πλειοψηφία των διαταραχών που έχουν έως σήμεραντοπιστεί στα αστροκυττώματα αφορά μεταλλάξεις σε γονίδια που κωδικοποιούνρυθμιστικές πρωτεΐνες του κυτταρικού κύκλου ή της απόπτωσης καθώς και μόρια πουεμπλέκονται στην μεταναστευτική ικανότητα των γλοιακών κυττάρων. Πολλές επίσηςαπό τις γενετικές βλάβες που απαντώνται στα αστροκυττώματα αφορούνμηχανισμούς που εμπλέκονται στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού και τηςδιαφοροποίησης των αρχέγονων κυττάρων του νευρικού ιστού.21

Σύνδρομο Χρωμόσωμα Γονίδιο Όγκοι Κ.Ν.Σ. Άλλοι όγκοιLi Fraumeni 17p13 P53 αστροκυττώματα αδενοκαρκίνωμαμαστού, μαλακώνμορίωνΝευρινωμάτωσητύπου Ι17p11 NF1 γλοιώματα οπτικούνεύρου-νευροΐνώματαΦαιοχρωμοκύττωμα,Λευχαιμίασύνδρομο Turcotτύπου ΙΙ3p21, 7p22 HMLH1,HPSM2

Αστροκυττώματα πολύποδες π. εντέρου /αδενοκαρκίνωμαοζώδηςσκλήρυνση9q34, 16p13 TSC1 TSC2 ΥποεπενδυματικάγλοιώματαΔερματικό αγγειοίνωμα,αμάρτωμα νεφρού.Σχήμα 2.3.1 Σύνδρομα που περιλαμβάνουν νεοπλάσματα Κ.Ν.Σ.Σύγχρονες μελέτες υποδεικνύουν ότι για την κακοήθη εξαλλαγή των γλοιακώνκυττάρων δεν επαρκεί μία μόνο γενετική βλάβη αλλά απαιτείται η παρουσίασυσσωρευμένων γενετικών βλαβών. Από τις πιο πρώιμες βλάβες στη διαδικασία γλοιοματογένεσης εναι η απώλεια ογκοκατασταλτικών γονιδίων-ρυθμιστών τουκυτταρικού κύκλου ή των μονοπατιών μεταγωγής μιτογόνων σημάτων. Πολύ συχνέςείναι επίσης και οι διαταραχές στους μεμβρανικούς υποδοχείς με δραστηριότητακινάσης της τυροσίνης.Παρακάτω γίνεται μια σύντομη αναφορά στις κυριότερες μοριακές, γονιδιακές καιχρωμοσωμικές βλάβες που απαντώνται στα αστροκυττώματα 22.Μεμβρανικοί υποδοχείς με δραστηριότητα κινάσης της τυροσίνηςκαι ο ρόλος τους στα γλοιώματα.

Η οικογένεια των μεμβρανικών υποδοχέων με δραστηριότητα κινάσης τηςτυροσίνης αριθμεί πάνω από είκοσι μέλη πολλά από τα γονίδια των οποίωνεμφανίζονται ως ογκογονίδια σε πληθώρα νεοπλασμάτων. Σε ότι αφορά τανεοπλάσματα του Κ.Ν.Σ. δύο από τους υποδοχείς αυτούς ο υποδοχέας του PDGF(PDGFRα και PDGFRβ) και ο υποδοχέας του EGF (EGFR) εμπλέκονται στουςπαθογενετικούς μηχανισμούς της ογκογένεσης. Και οι δύο αυτοί αυξητικοίπαράγοντες έχουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του εγκεφάλου. Ο ΕGF ενέχεταιστην ρύθμιση του πολλαπλασιασμού και της επιβίωσης των αρχέγονων νευρικώνκυττάρων ενώ ο PDGF στη διαφοροποίηση των πρόδρομων γλοιακών κυττάρων. Ηυπερέκφραση του PDGFR και του PDGF στα χαμηλού βαθμού κακοήθειαςγλοιώματα καθώς και του EGFR και EGF στα γλοιοβλαστώματα υποδηλώνει ότι ταμονοπάτια σηματοδότησης των υποδοχέων αυτών είναι κριτικής σημασίας στουςαστροκυτταρικούς όγκους. Το αποτέλεσμα της πρόσδεσης του αυξητικού παράγονταστον υποδοχέα οδηγεί σε διμερισμό και αυτοφοσφωρυλίωση του τελευταίου, αύξησητης δραστηριότητας κινάσης της τυροσίνης και δημιουργία θέσεων πρόσδεσης γιαρυθμιστικές πρωτεΐνες με SH2 περιοχές. Έτσι ξεκινά η ενεργοποίηση ενδοκυτταρίωνβραχιόνων μεταγωγής σήματος όπως ο μονοπάτι Ras/MAPK (MAP Kinase) τομονοπάτι της ΡΙ3-k/Αkt, η ενεργοποίηση της PLC-γ και η μεταγωγή μέσω JAK –STAT δρόμου που έχουν ως αποτέλεσμα ενεργοποίηση του πολλαπλασιασμού καιαύξηση της μεταναστευτικής ικανότητας των γλοιακών κυττάρων.23

• PDGF/ PDGFRΟ ρόλος του PDGF φαίνεται πως είναι σημαντικός κατά την εμβρυϊκήζωή για την ανάπτυξη του Κ.Ν.Σ. Κατά την διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης PDGFπαράγεται από τα νευρικά κύτταρα και τα αστροκύτταρα ενώ ο PDGFRα εκφράζεταιστα πρόδρομα γλοιακά και στα νευρικά κύτταρα. Στον εγκέφαλο του ενήλικαοργανισμού η έκφραση του PDGFRα περιορίζεται στα πολυδύναμα κύτταρα στηνκοιλιακή ζώνη των πλαγίων, ενώ η έκφραση του PDGF είναι διάχυτη στους νευρώνεςκαι τα αστροκύτταρα. Η έκφραση του PDGFRα στην υποκοιλιακή ζώνη υποδηλώνειτο σημαντικό ρόλο του PDGF στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού και τηςδιαφοροποίησης καθώς και της μετανάστευσης των αρχέγονων κυττάρων τόσο κατάτη διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης, όσο και στον ενήλικα εγκέφαλο σεκαταστάσεις αναγέννησης (μετά από τραύμα, ισχαιμία) όπου παρατηρείταιμετανάστευση PDGFR(+) κυττάρων στην λευκή ουσία.

Επιπλέον αναγνωρίζεταισήμερα ο ρόλος του PDGFRα στην μετανάστευση και διαφοροποίηση αρχέγονωνκυττάρων σε νευρικά κύτταρα του οσφρητικού βολβού.Μελέτες σε καλώς διαφοροποιούμενα αστροκυττώματα έδειξαν αυξημένηέκφραση του PDGF/ PDGFR σε συνδυασμό με απώλεια της λειτουργίας της p53. Ηταυτόχρονη έκφραση του υποδοχέα και του προσδέτη δημιουργεί αυτοκρινή αγκύληδιέγερσης του ολλαπλασιασμού και της μετανάστευσης των καρκινικών κττάρων ηοποία σε συνδυασμό με την απώλεια λειτουργίας του p53 οδηγεί σε αυξημένηεπιβίωσή τους.Η υπερέκφραση του PDGF και PDGFR στα χαμηλού βαθμού διαφοροποίησηςαστροκυττώματα υποδηλώνει ότι τα μιτογόνα ερεθίσματα από τον PDGFR πιθανόναποτελούν το εναρκτήριο γεγονός στη διαδικασία κακοήθους εξαλλαγής τωναστροκυττωμάτων. Η συσσώρευση εν συνεχεία επιπρόσθετων γενετικών βλαβώνοδηγεί στην πρόοδο των καλώς διαφοροποιημένων αστροκυττωμάτων σεπερισσότερο κακοήθεις όγκους όπως το αναπλαστικό αστροκύττωμα και τολάστωμα.• EGF / EGFRΤο γονίδιο του EGFR εμφανίζεται σε πολλά αντίγραφα (gene amplification) στογονιδίωμα των νεοπλασματικών κυττάρων στο 50% των πρωτοπαθώνγλοιοβλαστωμάτων και σε μικρό ποσοστό στα αναπλαστικά αστροκυττώματα. Ημικρή συχνότητα διαταραχών του EGF που παρατηρείται στα αναπλαστικάαστροκυττώματα υποδηλώνει ότι η ενεργοποίηση του EGFR μπορεί να είναικαθοριστική για την καθοδήγηση της νεοπλαστικής διεργασίας προς τον πλέοναδιαφοροποίητο όγκο, το πολύμορφο γλοιοβλάστωμα. Εκτός από τη γονιδιακήενίσχυση του EGFR, στο 40% των πρωτοπαθών γλοιοβλαστωμάτων εκφράζεται ημεταλλαγμένη του μορφή EGFRvΙΙΙ η οποία λόγω του ότι παρουσιάζει έλλειψη σε έναεξωκυττάριο τμήμα του, δεν απαιτεί την παρουσία του προσδέτη και είναι μονίμωςενεργοποιημένος. Επιπλέον ο ρυθμός ενδοκύττωσης και αποδόμησης του EGFRvΙΙΙείναι μειωμένος γεγονός που οδηγεί σε παράταση της δράσης του. Η παρουσία τουEGFRvΙΙΙ αποτελεί ανεξάρτητο παράγοντα δυσμενούς πρόγνωσης όπως υποστηρίζουνπρόσφατες μελέτες. Eκτός από τoν EGFR τα κύτταρα των γλοιοβλαστωμάτωνεκφράζουν και τους προσδέτες EGR και TGF-α δημιουργώντας έτσι μια αυτοκρινήκαι παρακρινή διέγερση των κυττάρων του όγκου.Ο ρόλος του EGF και του EGFR στην εμβρυογένεση φαίνεται σημαντικός. Τοpeak της έκφρασης του FGFR συμπίπτει με το peak της

γλοιογένεσης στην εμβρυϊκήκαι περιγεννητική περίοδο. Μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι η κύρια δράση του ΕGFείναι η επίταση του πολλαπλασιασμού και επιβίωση των αρχέγονων κυττάρων καιπιθανόν η διαφοροποίηση προς την αστροκυτταρική σειρά. Έχοντας τόσο σημαντικήλειτουργία ο ΕGF δεν είναι παράλογο που διαταραχές στην σηματοδότησή τουοδηγούν σε κακοήθη εξαλλαγή.24

Τα ενδοκυττάρια μονοπάτια μεταγωγής σήματος κατόπιν ενεργοποίησης τωνυποδοχέων κινάσης της τυροσίνης (RTK).Σχήμα 2.3.2 Μονοπάτι των ΜΑΡ κινασών.Σχήμα 2.3.3 Μονοπάτι της ΡΙ3-k/Akt GSK: glucogen synthase kinase FKHR: forkhead/ wingedhelixprotein PDK pyravate dehydrogenase kinase.36Σχήμα 2.3.4Ενεργοποίηση της PLC-γ CαΜΚ:Cαt2/calmodulin dependent protein kinase DAG: Diacylglycerol,IP3: Inositol 1,4,5 triphashate.Σχήμα 2.3.5Ενεργοποίηση του STAT δρόμου από τους RTKs Jak: Janns Kinase.37Σχήμα 2.3.6 Διμερισμός και ενεργοποίηση των RTKs μετά την πρόσδεση του κατάλληλουπροσδέτη οδηγεί σε φοσφωρυλίωση του κυτταροπλασματικού τμήματος του RTK και αύξηση τηςδραστικότητας κινάσης Τyr. Η δημιουργία θέσεων πρόσθεσης προσαρμοστικών ρυθμιστικώνπρωτεϊνών έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση πληθώρας σηματοδοτικών μορίων και ενζύμωνπου οδηγούν στην ενεργοποίηση των μονοπατιών μεταγωγής σήματος που φαίνονται στο σχήμα μετελικό αποτέλεσμα αύξηση του πολλαπλασιασμού, επιβίωσης, διηθήσης και αγγειογέννεσης.

Η ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη p53 και ο ρόλος της στηγλοιωματογένεση.Μεταλλάξεις στο γονίδιο της p53 καθώς και απώλεια του ρωμοσώματος 17p13(όπου εδράζεται το γονίδιο αυτό) παρατηρούνται με τηνίδια συχνότητα σε καλής διαφοροποίησηςαστροκυττώματα, σε αναπλαστικά αστροκυττώματα καισε δευτεροπαθή γλοιοβλαστώματα. Το γεγονός αυτόυποδηλώνει ότι η διαταραχή του p53 αποτελεί ένα από ταπρώιμα γεγονότα στη γλοιωματογένεση. Είναι γνωστό ότιτο γονίδιο p53 είναι ογκοκατασταλτικό γονίδιο και ηπρωτεΐνη που κωδικοποιεί είναι σημαντική για τον έλεγχοτης ακεραιότητας του γενετικού υλικού ρυθμίζοντας την πρόοδο του κυτταρικούκύκλου στο σημείο G1-S. Σε καταστάσεις βλάβης του DNA η μεταγραφή του p53αυξάνει μπλοκάροντας έτσι τον κυτταρικό κύκλο προκειμένου να δοθεί η δυνατότηταστους επιδιορθωτικούς μηχανισμούς να λειτουργήσουν, ενώ σε ακραίες περιπτώσεις

οδηγεί το κύτταρο σε απόπτωση. Η λειτουργία της p53 επιτυγχάνεται με τη δράση τηςως μεταγραφικός παράγοντας γονιδίων που σχετίζονται με τον έλεγχο στο G1-Sσημείο, όπως είναι το γονίδιο της p21Cip1 (ένας δυνητικός CDK-inhibitor) καιγονιδίων με προαπτωτική δράση όπως το γονίδιο Bax. Η λειτουργία της p53ρυθμίζεται από ένα σύνολο ρυθμιστικών πρωτεϊνών οι σημαντικότερες είναι η MDM-2 και η p14ARF. Η MDM-2 μειώνει την μεταγραφική δράση της p53 δεσμευόμενη στοΝΗ2 τελικό άκρο της και επίσης αυξάνει την αποδόμησή της από το σύστημα τηςουβικουιτίνης. Έτσι, αύξηση της δραστηριότητας της MDM-2 οδηγεί σε σχετικήέλλειψη της λειτουργίας της p53.Η πρωτεΐνη p14ARF διαντιδρά με την MDM-2 και διευκολύνει την αποδόμηση της.Άρα απώλεια της p14ARF οδηγεί σε αυξημένη δράση της MDM-2 και σχετική έλλειψητης λειτουργίας της p53.Το γεγονός ότι μεταλλάξεις ή ελλείψεις στο p53 γονίδιο παρατηρούνται απόπολύ νωρίς στην διαδικασία της ογκογένεσης στο ΚΝΣ υποδηλώνει ότι η χαλάρωσητων μηχανισμών ελέγχου στο G1 – S που επέρχεται μετά την απώλεια του p53,επιτρέπει τη συσσώρευση όλο και περισότερων γενετικών βλαβών, οι οποίεςοδηγούν σε περαιτέρω απορύθμιση του κυτταρικού κύκλου και αποδιαφοροποίηση μεαποτέλεσμα την πρόοδο του όγκου σε πιο κακοήθης μορφές αστροκυττωμάτων. Τοποσοστό των μεταλλάξεων στο p53 και ελλείψεων στο 17p στα πρωτοπαθήγλοιοβλαστώματα είναι μικρότερο (10%) σε σχέση με αυτό στα δευτεροπαθή (>65%).Τα πρωτοπαθή γλοιοβλαστώματα παρουσιάζουν υψηλό ποσοστό (50%) γονιδιακήςενίσχυσης για το γονίδιο MDM-2 και υψηλό ποσοστό (70%) βλαβών στο γονίδιοp14ARF. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι οι δύο ιστοπαθολογικά μη διακριτέςοντότητες το πρωτοπαθές και το δευτεροπαθές γλοιοβλάστωμα ενώ παρουσιάζουνδιαφορές στη συχνότητα μεταλλάξεων σε συγκεκριμένα γονίδια ουσιαστικά οι βλάβεςαφορούν μονοπάτια που ελέγχουν τις ίδιες κυτταρικές λειτουργίες. (π.χ. ρύθμισηκυτταρικού κύκλου).25

Το μονοπάτι του Rb και ο ρόλος του στα γεγονότα της γλοιωματογένεσηςΗ μετάβαση από τα καλώς διαφοροποιημένα αστροκυττώματα προς τααναπλαστικά αστροκυττώματα χαρακτηρίζεται από αύξηση του αριθμού τωνμιτώσεων και σε καρυοτυπικό επίπεδο από απώλεια του χρωμοσώματος 9p και 13q

και πολλές φορές ενίσχυση του 12q. Σήμερα είναι πλέον γνωστό πως στις περιοχέςαυτές εδράζονται γονίδια-κλειδιά για το μονοπάτι του Rb.Το γονίδιο του ρετινοβλαστώματος (RΒ) βρίσκεται στο 13q14 χρωμόσωμα καικωδικοποιεί την πρωτεΐνη του ρετινοβλαστώματος (pRB 107-KD) με ρόλο κλειδί στηρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. Η pRB σε ηρεμούντα κύτταρα βρίσκεται σεκατάσταση υποφωσφορυλίωσης και δεσμεύει τον μεταγραφικό παράγοντα Ε2F,εμποδίζοντας έτσι τη μεταγραφή γονιδίων που είναι σημαντικά για την μίτωσησταματώντας τον κυτταρικό κύκλο στο όριο G1/S. Όαν η pRb φωσφορυλιωθείαποδεσμεύει τον Ε2F ώστε αυτός να δράσει ως μεταγραφικός παράγοντας και τοκύτταρο εισέρχεται στη φάση S. Η φωσφορυλίωση του pRb επιτυγχάνεται από τηδράση του συμπλέγματος cyclin D1,2.3/CDKs 2,4,6 καθώς και από την cyclin E/CDK2.Ανασταλτική δράση στη φωσφορυλίωση του pRb γίνεται με την δράση των CDKInhibitors (CKIs) όπως G1CDK4 και CDK6. Μιτογόνα ερεθίσματα τα οποία φθάνουνμέσω του δρόμου των ΜΑΡ κινασών οδηγούν σε αύξηση της μεταγραφής τηςκυκλίνης D1 και επακολουθεί είσοδο του κύτταρου στη φάση S. Είναι αντιληπτό ότιμεταλλάξεις στην pRb που την απενεργοποιούν, μεταλλάξεις που απενεργοποιούντους CKI ή επιγενετικοί μηχανισμοί που μειώνουν τα επίπεδα των CKIs, καθώς καιυπερέκφραση ή γονιδιακή ενίσχυση των D κυκλινών ή των CDK4, 6, οδηγούν σε μηελεγχόμενη είσοδο του κυττάρου στην φάση S. Όλες οι παραπάνω διαταραχές έχουνπαρατηρηθεί στα γλοιώματα.40Σε ότι αφορά το γονίδιο RB, μεταλλάξεις του έχουν περιγραφεί σε ποσοστό έωςκαι 40% σε χαμηλής διαφοροποίησης αστροκυττώματα και οδηγούν σεαπενεργοποίησή του. Το δεύτερο συστατικό του μονοπατιού του RB τα μέλη τηςοικογένειας των cyclin dependent kinase CDK 4 και 6 βρίσκονται διαταραγμένα σεποσοστό έως και 15% στα κακοήθη γλοιώματα. Συγκεκριμένα το γονίδιο της CDK4βρίσκεται στο 12q χρωμόσωμα και παρουσιάζεται ενισχυμένο 10 έως 100 φορές. Τογονίδιο της CDK6 βρίσκεται στο χρωμόσωμα 7q και σε μικρό αριθμό περιπτώσεωνόγκοι που δεν έχουν μεταλλάξεις στο Rb ή γονιδιακή ενίσχυση στο CDK4παρουσιάζουν ενισχυμένο το γονίδιο CDK6, υποδηλώνοντας ότι τα τρία αυτά γονίδιαδρουν ισότιμα λειτουργικά στην διεργασία της ογκογέννεσης.Δύο άλλα γονίδια που σχετίζεται με το μονοπάτι του Rb βρίσκεται στοχρωμόσωμα 9q και στον γενετικό τόπο ΙΝΚ4α που συχνά απουσιάζει στααναπλαστικά αστροκυττώματα. Στην θέση αυτή υπάρχουν τα γονίδια ΙΝΚ4α και

ΙΝΚ4b που κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες p16ΙΝΚ4b και p14ARF αντίστοιχα. To μόριop16ΙΝΚ4b λειτουργεί ως CDKI αναστέλλοντας τη σύνδεση της ενεργοποιημένηςκυκλίνης D1 στην CDK4/6. Το αποτέλεσμα της δράσης του είναι η μειωμένηφοσφωρυλίωση του pRb και έτσι η αναστολή της εισόδου του κυττάρου στη φάση S.Απώλεια της πρωτεΐνης αυτής οδηγεί σε υπερφωσφορυλίωση της pRb αύξηση τηςδραστηριότητας του Ε2F και η μη ελεγχόμενη είσοδο του κυττάρου στην φάση S.Μεταλλάξεις στη γαμετική σειρά της ΙΝΚ/4α προδιαθέτει στην ανάπτυξημελανώματος και αδενοκαρκινώματος του παγκρέατος όχι όμως σε γλοιώματα.Ωστόσο απενεργοποίηση της p16ΙΝΚ4b έχει βρεθεί σε ποσοστό 50 – 70%αναπλαστικών αστροκυττωμάτων και περίπου στο 90% των γλοιοβλαστωμάτωνσποραδικών περιπτώσεων. Η απενεργοποίηση της p16ΙΝΚ/4b συμβαίνει είτε λόγωομόζυγης απώλειας του 9p χρωμοσώματος είτε λόγω σημειακών μεταλλάξεων ήυπερμεθυλίωσης στην κωδικοποιήσα περιοχή του γονιδίου ΙΝΚ/4α.Η περιοχή του 9p χρωμοσώματος είναι σημαντική και για ακόμη έναν λόγο. Απότο γονίδιο ΙΝΚ4α χρησιμοποιώντας διαφορετικό πλαίσιο ανάγνωσης προέρχεται ηπρωτεΐνη p14ARF (από το Alternate Reading Frame). Η πρωτεΐνη ατή όπως περιγράφεται στην προηγούμενη ενότητα είναι σημαντική στο μονοπάτι της p53 διότιδεσμεύεται στην MDM2 πρωτεΐνη και έτσι παρεμποδίζει την αποδόμηση της p53 καιεπιπλέον συμβάλει στην προαγωγή της απόπτωσης διευκολύνοντας τη λειτουργία τηςp53. Απώλεια λοιπόν του 9p χρωμοσώματος εκτός από δυσλειτουργία του Rbμονοπατιού οδηγεί και σε μείωση της λειτουργικότητας του p53 με τελικό κοινόαποτέλεσμα μείωση του ελέγχου γενετικής σταθερότητας στο σημείο G1/S γεγονόςπου οδηγεί σε αύξηση πιθανότητας κακοήθους εξαλλαγής. Τελευταία έχει αναφερθείμια περίπτωση ογκογενούς συνδρόμου που χαρακτηρίζεται από ανάπτυξημελανώματος και όγκων του ΚΝΣ στο οποίο ανιχνεύθηκε απώλεια αποκλειστικά τηςp14ARF πρωτεΐνης.Λαμβάνοντας υπόψιν τα παραπάνω μπορούμε να πούμε ότι η αύξηση στηνμετωπική δραστηριότητα που παρατηρείται στη μετάβαση από τα καλώς στα κακώςδιαφοροποιημένα αστροκυττώματα οφείλεται κατά μεγάλο μέρος στην απορύθμισητου μονοπατιού του Rb. Το γεγονός αυτό πιστεύεται ότι θα μπορούσε να αποτελέσειθεραπευτικό στόχο στο μέλλον με σκοπό την ανάπτυξη του ρυθμούπολλαπλασιασμού των αστροκυττάρων.Σχήμα 2.3.7 Το γονίδιο ΙΝΚ4α καιο ρόλος του στο μονοπάτι του Rbκαι του p53.42

Σχήμα 2.3.8 Rb pathway. Στο σχήμα απεικονίζεται σύνδεση των βραχιόνων μεταγωγής μιτογόνωνσημάτων με την ρυθμιστική μηχανή του κυτταρικού κύκλου. Κεντρικό ρόλο κατέχουν τα μονοπάτιαRb και p53

Το ογκοκατασταλτικό γονίδιο PTEN στα γλοιώματα.Ένα κυτταρογενετικό εύρημα στα κακής διαφοροποίηση γλοιώματα είναι ηαπώλεια του χρωμοσώματος 10q σε ποσοστό 75% – 90%. Στη περιοχή αυτή τουγενετικού υλικού μεταξύ άλλων εδράζεται το γνωστό ογκοκατασταλτικό γονίδιοPTEN (Phosphatase and tensin homology) γνωστό επίσης ως MMAC1 (Mutated inmultiple advanced cansers) και ως TEP-1 (TGF-β regulated and epithelial cell –enriched phosphatare). Το γονίδιο αυτό βρίσκεται μεταλλαγμένο σε πολλούςπροχωρημένους καρκίνους (μελάνωμα, καρκίνωμα του προστάτη, καρκίνωμα τουενδομητρίου, καρκίνωμα του νεφρού και του πνεύμονα) ενώ ένα ποσοστό έως 30 –45% των πρωτοπαθών γλοιοβλαστωμάτων παρουσιάζουν σημειακές μεταλλάξεις τουPTEN. Μεταλλάξεις του PTEN στη γαμετική σειρά απαντώνται σε ένα σύνολοκληρονομικών συνδρόμων όπως η νόσος το Cowden, το σύνδρομο Bannocyan –Zonana και στην νεανική πολυποδίαση του εντέρου κύριο χαρακτηριστικό τωνοποίων είναι η παρουσία αμαρτωμάτων σε όλους τους ιστούς, ενώ η παρουσία αυτώντων μεταλλάξεων προδιαθέτει στην ανάπτυξη νεοπλασίας με επικρατούντααυτοσωμικό μηχανισμό. Μελέτες που έχουν γίνει σε knock out μοντέλα αναδεικνύουντο σημαντικό ρόλο του PTEN στον αναπτυσσόμενο εγκέφαλο αποδίδοντάς τουιδιαίτερη σημασία στους μηχανισμούς της νευρωνικής διαφοροποίησης, τηςμετανάστευσης και της απόπτωσης. Μεταλλάξεις στο γονίδιο αυτό συνοδεύονται απόδιαταραχές της αρχιτεκτονικής του εγκεφάλου (νευρωνικές ετεροτοπίες, μεγάλομέγεθος νευρώνων) διαταραχές στη στοιβάδωση του φλοιού και στηνπαρεγκεφαλίτιδα.Σχήμα 2.3.9. Λειτουργία του ογκοκατασταλτικού γονιδίου PTEN.Δομή και λειτουργία του PTEN: Το πρωτεϊνικό προϊόν του γονιδίου PTEN περιέχειμια κεντρική περιοχή με ομολογία πρωτεϊνικής φωσφατάσης και μια ΝΗ2 τελικήπεριοχή με ομολογία ως προς την tensin και auxilin, δύο κυτταροπλασμικώνπρωτεϊνών σημαντικών για την αλληλεπίδραση με τα νημάτια ακτίνης στις Focaladhesion περιοχές (βλέπε επόμενο κεφάλαιο). Η PTEN πρωτεΐνη παρουσιάζειενζυμική δραστηριότητα πρωτεϊνικής φωσφατάσης και φωσφατάσης της 3phosphoinositol. Η δραστηριότητά της ως πρωτεϊνική φωσφατάση ενέχεται στηρύθμιση της μεταναστευτικής ικανότητας του κυττάρου διότι είναι σημαντική για τηναποφωσφορυλίωση και απενεργοποίησή της Focal adhesion Kinase (FAK) που έχεισημαντικό ρόλο στην κυτταρική κινητικότητα. Η δραστηριότητα της ως φωσφατάση

της 3 phosphoinositol είναι η ακριβώς αντίθετη από αυτήν της PIK-3αποσφωσφορυλιώνοντας την τριφωσφορική φωσφατιδυλοινοσιτόλη. (PtdIns 3,4,5). ΗPtdIns 3,4,5 ως δεύτερος μηνύτορας είναι απαραίτητος για την φωσφορυλίωση καιενεργοποίηση της Akt από την PDK1 (phospholipid depended kinase). Ηενεργοποιημένη Akt εν συνεχεία τροποποιεί τη δραστικότητα μιας μεγάλης ποικιλίαςπρωτεϊνών-στόχων που σχετίζονται με σημαντικές κυτταρικές λειτουργίες όπωςπολλαπλασιασμό, απόπτωση, μετανάστευση. Έτσι λοιπόν πενεργοποίηση τουγονιδίου PTEN οδηγεί σε αυξημένη δραστηριότητα της Akt και επακόλουθηανθεκτικότητα στην απόπτωση και την αύξηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού,ενώ η αναστολή της αποφοσφωρυλίωσης της FAK οδηγεί σε αύξηση της κυτταρικήςμετανάστευσης. Ο αυξημένος κυτταρικός πολλαπλασιασμός και η αυξημένημεταναστευτική ικανότητα των καρκινικών κυττάρων είναι στοιχεία πουχαρακτηρίζουν τα κακής διαφοροποίησης γλοιώματα στα οποία το PTENπαρουσιάζει υψηλό ποσοστό μεταλλάξεων και ελλείψεων. Για τους λόγους αυτούςμεταλλάξεις στο γονίδιο PTEN είναι κακό προγνωστικό στοιχείο σε ότι αφορά τηνεπιβίωση με γλοιοβλάστωμα.26

Στο 10q χρωμόσωμα εδράζονται και δύο άλλα ογκοκατασταλτικά γονίδια: τοMix1 και το DMBT1. Και τα δύο έχουν βρεθεί διαταραγμένα σε κακήςδιαφοροποίησης γλοιώματα και υπάρχουν σοβαρές ενδείξεις για την πιθανήσυμμετοχή τους στην πρόοδο του όγκου. Χρειάζεται όμως περισσότερη μελέτη για ναεξακριβωθεί ο πλήρης ρόλος τους.45Σχήμα 2.3.10 Η δράση της PTEN πρωτεΐνης σε μόρια των Focal adhesion περιοχών καθώς καιστην PtdIns 3,4,5 την καθιστά σημαντικό μόριο στην ρύθμιση λειτουργιών όπως η κυτταρικήμετανάστευση, η απόπτωση, η κυτταρική ανάπτυξη ή αγγειογένεση. Το γεγονός αυτό υποδηλώνειτην καθοριστική σημασία των μεταλλάξεων ή ελλείψεων του ΡΤΕΝ στα κακής διαφοροποίησηςασυροκυττώματα.Σχήμα 2.3.11 Συγκεντρωτικό διάγραμμα που παρουσιάζει τα σημαντικότερα μόρια-κλειδιά πουενέχονται στην παθογένεια των αστροκυττωμάτων και τις λειτουργίες που ελέγχουν.

Διαταραχές σε μοριακά μονοπάτια που ελέγχουν των πολλαπλασιασμόκαι τη διαφοροποίηση των αρχέγονων νευρικών κυττάρων.Sonic hedgehog μονοπάτιΣτα ανώτερα θηλαστικά έχουν ταυτοποιηθεί τρεις διαλυτοί προσδέτες (SonicHedgehog, Shh; Indian Hedgehog και Desert Hedgehog, Dhh) του υποδοχέα Patched

(Ptch). Τα μοριακά στοιχεία του μονοπατιού φαίνονται στο παρακάτω σχήμα Σχήμα2.3.12 . Η πρόσδεση του προσδέτη με τον υποδοχέα οδηγεί σε ενεργοποίηση τηςδραστηριότητας της μεμβρανικής πρωτείνης Smo η ενεργοποίηση της οποίαςκινητοποιεί έναν ενδοκυττάριο σηματοδοτικό καταράχτη που οδηγεί στηναπελευθέρωση του μεταγραφικού παράγοντα Gli και στον είσοδό του στον πυρήνα.Εκεί ο μεταγραφικός παράγων Gli αυξάνει την έκφραση πολλών γονιδίων μεταξύ τωνοποίων και ρυθμιστών του κυτταρικού κύκλου όπως cyclin D1/E ,Myc, N-myc καθώςκαι μεταγραφικούς παράγοντες και υποδοχείς τους όπως PDGF/PDGFR, EGF/EGFR.Σχήμα 2.3.12. Το μοριακό μονοπάτι του Shh27.47Ο ρόλος του Shh-Gli μοριακού μονοπατιού είναι γνωστός κατά την διάρκεια τηςεμβρυικής ανάπτυξης διότι ενεργοποιείται στην κοιλιακή περιοχή του νευρικούσωλήνα υπό την επίδραση της νωτιαίας χορδής που εκκρίνει τον Shh. Ηενεργοποίησή του οδηγεί στην διαφοροποίηση της περιοχής αυτής σε κινητικήπεριοχή διαδικασία γνωστή ως ventral induction. Πρόσφατες μελέτες αναδεικνύουντο ρόλο του Shh-Gli μονοπατιού στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού και της διαφοροποίησης των αρχέγονων νευρικών κυττάρων στη υποκοιλιακή ζώνη κατά τηδιάρκεια της εμβρυικής ανάπτυξης αλλά και μετά τη γέννηση. Ιδιαίτερο ενδιαφέρονπαρουσιάζει το γεγονός ότι το μοριακό αυτό μονοπάτι διαδραματίοζει σημαντικόρόλο στην ανάπτυξη των γλοιωμάτων καθώς και για στον πολλαπλασιασμό των braintumor stem cells. Πρόσφατη μελέτη υποδεικνύει συνεργατική δράση του Shh με τομονοπάτι του EGF στην υποκοιλιακή ζώνη η οποία αυξάνει τον ρυθμό τουπολλαπλασιασμού των αρχέγονων νευρικών κυττάρων στη περιοχή αυτή 19.Το μονοπάτι του Notch.Το μοριακό αυτό μονοπάτι εμπλέκεται στην διατήρηση του πληθυσμού τωναρχέγονων νευρικών κυττάρων στον αναπτυσσόμενο και στον ώριμο εγκέφαλοκαθώς και στη διαφοροποίηση των κυττάρων αυτών. Τα μοριακά στοιχεία του Notchμονοπατιού παρουσιάζονται στο παρακάτω σχήμα (Σχήμα 2.3.13).Η σηματοδότηση μέσου του μονοπατιού αρχίζει με αλληλεπιδράσεις μεταξύγειτονικών κυττάρων που εκφράζουν τον προσδέτη (Delta–like-1, Delta–like-5) καιτον υποδοχέα (Notch-1 - Notch-5) και είναι απαραίτητη για την επιβίωση τωναρχέγονων νευρικών κυττάρων. Τελευταίες μελέτες υποδεικνύουν ότι ταυτόχρονηνεργοποίηση του Notch και του FGF-2 αυξάνουν την αναλογία των αρχέγονωνκυττάρων στην υποκοιλιακή ζώνη 19.

48Ενεργοποίηση του μονοπατιού έχει παρατηρηθεί στα γλοιώματα και στουςεμβρυικούς όγκους του Κ.Ν.Σ. και πιστεύεται ότι η κυτταρική αυτή οδός είναισημαντική για την διατήρηση των brain tumor stem cells.Σχήμα 2.3.13 Μετά την πρόσδεση του υποδοχέα Notch με τον προσδέτη του Delta πυροδοτείταιμια σειρά πρωτεολυτικών διεργασιών που αποδεσμεύουν το κυτταροπλασματικό τμήμα του ΝotchNICD. H μετακίνηση του NICD στον πυρήνα έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της μεταγραφήςπολλών γονιδίων μεταξύ των οποίων του p21, Myc κ.α. που έχουν σημαντικό ρόλο στονπολαπλασιασμό και την διαφοροποίηση.Το μονοπάτι Wnt.Το μονοπάτι Wnt πιστεύεται ότι διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στον έλεγχο τουπολλαπλασιασμού των αρχέγονων κυττάρων, στις διεργασίες της νευρογένεσηςκαθώς και στην δημιουργία όγκων του νευρικού ιστού όπως τα γλοιώματα και τομυελοβλάστωμα. Στο παρακάτω διάγραμμα εμφανίζονται τα κυριότερα μέλη τηςσηματοδοτικής αυτής οδού.Στα σπονδυλωτά έχουν ταυτοποιηθεί 24 διαλυτές γλυκοπρωτεΐνες μέλη τηςοικογένειας Wnt. H δέσμευση του διαλυτού προσδέτη στον υποδοχέα του κινητοποιείμια σειρά ενδοκυττάριων γεγονότων που έχουν ως αποτέλεσμα τη διάσπαση τουσυμπλέγματος GSK3, CK-1, axin και APC το οποίο είναι υπεύθυνο για τηκαθοδήγηση της β-catenin προς αποδόμηση από το σύστημα της ubiquitin. Tογεγονός αυτό έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της συγκέντρωσης της β-catenin στοκυτταρόπλασμα και είσοδό της στον πυρήνα όπου δεσμεύεται με την οικογένειαμεταγραφικών παραγόντων TCF/LEF. Η ενεργοποίηση των παραγόντων αυτώνοδηγεί στην αύξηση της έκφρασης γονιδίων που σχετίζονται με τον κυτταρικόπολλαπλασιασμό, και την επιβίωση των κυττάρων όπως το c-myc, cyclin D1…Πρόσφατες μελέτες 19 έχουν δείξει ότι σημαντικά στοιχεία του μονοπατιού του wntόπως η β-catenin το APC βρίσκονται μεταλλαγμένα σε όγκους του Κ.Ν.Σ. ενώαναστολή του μονοπατιού αυτού επάγει τον πολλαπλασιασμό σε σειρές κυττάρωνγλοιοβλαστώματος.Σχήμα 2.3.14 Το μονοπάτι wnt και τα μόρια που το συγκροτούν.50Όπως έχει ήδη αναφερθεί, ένα σημαντικό χαρακτηριστικό των αστροκυττωμάτωνείναι η προαγωγή τους από καλής διαφοροποίησης νεοπλάσματα προοδευτικά σε πιοαδιαφοροποίητα.Η διεργασία αυτή καθοδηγείται από τη συσσώρευση γενετικών βλαβών σε γονίδιατα οποία είναι σημαντικά για την κυτταρική βιολογία και ρυθμίζουν λειτουργίες όπωςη διαφοροποίηση, ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός, η απόπτωση και η κυτταρικήμετανάστευση. Τελευταία με την πρόοδο της έρευνας στα αρχέγονα κύτταρα του

νευρικού ιστού διαφαίνεται ολοένα και περισσότερο πως πολλά από τα γονίδια πουεμπλέκονται στη διεργασία προαγωγής του όγκου διαδραματίζουν καθοριστικό ρόλοστην εμβρυϊκή ανάπτυξη του εγκεφάλου όσο και στην ρύθμιση της βιολογικήςσυμπεριφοράς των αρχέγονων κυττάρων στον ενήλικα εγκέφαλο. Στο παρακάτωδιάγραμμα παρουσιάζεται η συσχέτιση ιστολογικών παραμέτρων με τιςσημαντικότερες γενετικές βλάβες στα αστροκυττώματα.Σχήμα 2.3.15 Συσχέτιση μεταξύ κλινικών ιστοπαθολογικών και γενετικών διαταραχών στααστροκυττώματα.51Μεταλλάξεις στο γονίδιο p53 και υπερέκφρση PDGFR αποτελούν τα εναρκτήριαγεγονότα στην καρκινογένεση των αστροκυττωμάτων. Η συνεχής διέγερση τουκυτταρικού κύκλου από την σηματοδότηση του PDGF και η χαλάρωση τωνμηχανισμών ελέγχου λόγω μεταλλάξεων στο p53 επιτρέπουν τη συσσώρευσηκαινούριων γενετικών βλαβών που διαταράσσουν περισσότερο θεμελιώδειςβιολογικές λειτουργίες και προάγουν τον όγκο σε πιο κακοήθεις μορφές.Στα αναπλαστικά αστροκυττώματα συναντάμε κυρίως βλάβες σε βασικάσυστατικά του Rb μονοπατιού, κύριου ρυθμιστή του κυτταρικού κύκλου, ενώ προς τατελικά στάδια της διεργασίας της κακοήθους εξαλλαγής συμβαίνει απώλεια τουPTEN ογκοκατασταλτικού γονιδίου και EGFR ενίσχυση (αν και σπάνια σταδευτεροπαθή γλοιοβλαστώματα).Στα πρωτοπαθή γλοιοβλαστώματα η συχνότητα βλαβών σε επιμέρους γονίδιαείναι διαφορετική από αυτήν των δευτεροπαθών παρόλα αυτά όμως τα μοριακάμονοπάτια και οι ρυθμιστικοί μηχανισμοί που αλλοιώνονται είναι οι ίδιοι. Έτσι ενώ οιμεταλλάξεις και οι απώλειες στο p53 είναι σπάνιες, στα πρωτοπαθήγλοιοβλαστώματα βλάπτονται συχνά αλλά ρυθμιστικά γονίδια του μονοπατιού αυτούόπως το MDM-2 και το p14ARF. Επίσης συχνότερες είναι οι μεταλλάξεις του PTENκαι η ενίσχυση του EGFR γονιδίου.Συμπερασματικά ενώ το πρωτοπαθές γλοιοβλάστωμα δεν παρουσιάζει διαφορέςιστοπαθολογικά και κλινικά από το δευτεροπαθές (από την στιγμή που θα ότι αποτελεί με ξεχωριστή οντότητα γενετικά σε ότι αφοράτον τρόπο δημιουργίας του. Πολλοί δε πιστεύουν ότι το κύτταρο προέλευσης τουπρωτοπαθούς γλοιοβλαστώματος είναι διαφορετικό και είναι πιο αρχέγονο από αυτόπου δίνει γένεση στα καλής διαφοροποίησης γλοιώματα28.

52Σχήμα 2.3.16 Δύο διαφορετικά μονοπάτια ανάπτυξης πολύμορφου γλοιοβλαστώματος.

2.4 Νεότερες θεραπευτικές προσεγγίσεις που βασίζονται στην μοριακήπαθογένεια των αστροκυττωμάτων.Είναι γεγονός ότι, παρά την σημαντική πρόοδο στην κατανόηση της κυτταρικήςπροέλευσης και της μοριακής παθογένειας των αστροκυττωμάτων, οι υπάρχουσεςμέχρι σήμερα θεραπευτικές προσεγγίσεις (βλέπε προηγούμενο κεφάλαιο) πολύ λίγοσυνεισφέρουν στην παράταση της ζωής ασθενών με τα νεοπλάσματα αυτά. Παρά τογεγονός ότι η χειρουργική θεραπεία αποτελεί και θα αποτελεί για χρόνια ακόμη τονακρογωνιαίο λίθο στην αντιμετώπιση των γλοιωμάτων, η συστηματική μελέτη τηςμοριακής βάσης της παθογένειας των όγκων αυτών ανοίγει νέους δρόμους τόσο γιαην ταξινόμηση και την πρόγνωσή τους όσο και για την θεραπευτική προσέγγισήτους.Με την πρόοδο των μοριακών τεχνικών και την ανάδειξη ολοένα και περισσοτέρωνγενετικών και επιγενετικών δαταραχών που συμβάλουν στην ογκογένεση,αναδεικνύεται η πολυπλοκότητα της γλοιωματογένεσης καθώς και η τεράστιαιστοπαθολογική και γενετική ποικολομορφία των όγκων αυτών. Επιπλέον πολλέςμελέτες συσχετίζουν μοριακές διαταραχές που παρατηρούνται στα γλοιώματα με τηνπρόγνωση της νόσου, την ανταπόκριση στην θεραπεία και την επιβίωση τωνασθενών. Για παράδειγμα η απώλεια του ογκοκατασταλτικού γονιδίου PTEN πουπαρατηρείται στα γλοιοβλαστώματα έχει συσχετισθεί με δυσμενή πρόγνωση τηςνόσου, όπως επίσης και η παρουσία του μεταλλαγμένου υποδοχέα EGFRvIII πουαποτελεί ανεξάρτητο παράγοντα δυσμενούς εξέλιξης.Οι εξελίξεις αυτές πιστεύεται ότι θα οδηγήσουν μελλοντικά σε καινούριασυστήματα ταξινόμησης των γλοιωμάτων τα οποία θα στηρίζονται στις μοριακέςδιαταραχές του όγκου και θα επιτρέπουν εξατομικευμένη προσέγγιση των ασθενώντόσο σε ότι αφορά την πρόγνωση όσο και στην θεραπευτική αντιμετώπισή τους 29. Ηεξακρίβωση του «μοριακού προφίλ» του νεοπλάσματος θα επιτρέπει μιαακριβέστερη θεραπευτική προσέγγιση του ασθενούς με καλύτερα αποτελέσματα καιλιγότερες παρενέργειες. Η πρόοδος στην κατανόηση της μοριακής παθογένειας τωνγλοιωμάτων έχει οδηγήσει στην ανάδειξη καίριων γενετικών βλαβών καθώς καιμονοπατιών μεταγωγής σήματος με ρόλο κλειδί στην ογκογένεση που αποτελούν

θεραπευτικούς στόχους στην αντιμετώπισή τους 30-32. Η σύγχρονη φαρμακοτεχνικήέχει επιτύχει την σχεδίαση αντισωμάτων ή φαρμακευτικών παραγόντων-αναστολέωνμεμβρανικών υποδοχέων, κινασών ή άλλων μορίων με στρατηγικό ρόλο στα δίκτυαμεταγωγής σήματος που υπόσχονται ενθαρρυντικά αποτελέσματα στο μέλλον. Στοπαρακάτω διάγραμμα παρουσιάζονται οι σημαντικότερες οδοί μεταγωγής σήματοςστα γλοιακά και στα ενδοθηλιακά κύτταρα καθώς και οι σημαντικότεροι αναστολείςαυτών, η μελέτη των οποίων βρίσκεται σε εξέλιξη33.54Σχήμα 2.4.1 Στο σχήμα αυτό παρουσιάζονται τα σημαντικότερα μοριακά μονοπάτια τα οποίαδιαδραματίζουν καθοριστικό ρόλο στις διεργασίες ανάπτυξης, προαγωγής και αντοχής στηνχημειοθεραπεία των αστροκυττωμάτων. Παράλληλα αναγράφονται μόρια-αναστολείς σημαντικώνστοιχείων των μονοπατιών αυτών η μελέτη των οποίων ως χημειοθεραπευτικοί παράγοντεςβρίσκεται σε εξέλιξη.Σημαντικό ρόλο στις διεργασίες της ογκογένεσης , της προαγωγής και της υποτροπήςτων αστροκυττωμάτων διαδραματίζει η αγγειογένεση. Το φαινόμενο τηςαγγειογένεσης είναι ιδιαίτερα εμφανές στα χαμηλής διαφοροποίησης γλοιώματα καικυρίως στα γλοιοβλαστώματα. Σύγχρονες ερευνητικές προσπάθειες έχουν αναδείξεισε μεγάλο βαθμό την μοριακή ρύθμιση της αγγειογένεσης ενώ έχουν σχεδιαστείαναστολείς του φαινομένου αυτού30. Ένας τέτοιος αναστολέας της αγγειογένεσηςείναι το μόριο Bevacizumab (Αvastin) το οποίο είναι μονοκλωνικό αντίσωμα για τονπαράγοντα VEGF και χρησιμοποιείται σήμερα στην κλινική πράξη προσφέρονταςμικρή παράταση στη ζωή ασθενών με πλειόμορφο γλοιοβλάστωμα. Σε εξέλιξηβρίσκονται μελέτες για την μελέτη άλλων μορίων αναστολέων της οδού τηςαγγειογένεσης.55Ιδιαίτερη σημασία λαμβάνουν σήμερα τα brain tumor stem cells τα οποία, όπως έχειήδη αναφερθεί, είναι τα υπεύθυνα κύτταρα για την υποτροπή του όγκου μετά τηνμακροσκοπική «εκρίζωσή» του με την χειρουργική θεραπεία, την χημειοθεραπεία καιτην ακτινοθεραπεία. Τα brain tumor stem cells πιστεύεται ότι παραμένουν γύρω απότα αγγεία σε θέσεις «φωλιές» και διαθέτουν μηχανισμούς αντίστασης στην κλασικήχημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία. Για τους λόγους αυτούς βρίσκονται σήμερα στοεπίκεντρο των ερευνών που στόχο έχουν την αποσαφήνιση της μοριακής τουςβιολογίας και την δημιουργία στρατηγικών εκρίζωσής τους.Παράλληλα με την προσπάθεια που γίνεται σήμερα για την ανάδειξη των

καταλληλότερων μονοπατιών στόχων και για τον σχεδιασμό των αντίστοιχωνφαρμακευτικών παραγόντων, σημαντικές μελέτες πραγματοποιούνται προς τηνκατεύθυνση της εξεύρεσης του καταλληλότερου τρόπου χορήγησης, και υπερπήδησηςτου αιματοεγκεφαλικού φραγμού. Η επιλογή των σωστών στόχων, ο καταλληλότεροςσυνδυασμός φαρμακευτικών παραγόντων και στρατηγικών, ο ορθός τρόποςχορήγησης είναι από τους βασικούς πυλώνες της σύγχρονης θεραπευτικής τακτικήςπου σκοπό έχει την βέλτιστη ανταπόκριση και την ελαχιστοποίηση των παρενεργειών.Σχήμα 2.4.2. Αλγόριθμος για την επινόηση νέων φαρμακευτικών παραγόντων για τη θεραπείατων γλοιωμάτων.56Σχήμα 2.4.3. Στον πίνακα απεικονίζονται σύγχρονες φαρμακευτικές ουσίες ,η φάση ελέγχου στηνοποία βρίσκονται και τα έως τώρα αποτελέσματα από τη χρήση τους57

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 33.1 Διηθητική ικανότητα των γλοιωμάτωνΌπως έχει ήδη αναφερθεί, ένα από τα σημαντικότερα ιστοπαθολογικάχαρακτηριστικά των γλοιωμάτων είναι η διηθητική τάση ανάπτυξής τους προς τογειτονικό φυσιολογικό νευρικό ιστό. Ήδη από το 1888 ο Bramwell στο πρώτο βιβλίοτου αφιερωμένο στους όγκους του εγκεφάλου τονίζει:…… η τάση να διηθούν το νευρικό ιστό είναι το περισσότερο χαρακτηριστικόγνώρισμα των γλοιωμάτων. Ο νεοπλασματικός ιστός ποτέ δενπεριορίζεται από σχηματισμένη κάψα, δεν είναι δυνατόν ναεκτιμήσουμε χωρίς μικροσκοπική εξέταση που σταματάει και πούαρχίζει ο φυσιολογικός νευρικός ιστός ……Εξαιτίας της έντονης διηθητικής τους ικανότητας και της διασποράς των καρκινικώνκυττάρων στο φυσιολογικό νευρικό παρέγχυμα, οι συμβατικές θεραπείες, όπως ηχειρουργική εξαίρεση και η ακτινοθεραπεία, αποτυγχάνουν να εκριζώσουν τη νόσο,ενώ η διηθήση των καρκινικών κυττάρων πέρα από τα όρια εκτομής του όγκου(κύτταρα αντάρτες-guerilla cells) αποτελεί συχνή αιτία επανεμφάνισής της. Έτσιπαρότι τα γλοιώματα πολύ σπάνια μεθίστανται εκτός του νευρικού συστήματοςχαρακτηρίζονται από φτωχή πρόγνωση. Η διηθητική τους ικανότητα αυξάνεται καθώςαυξάνεται ο βαθμός κακοήθειας του νεοπλάσματος έτσι ώστε τα grade IIαστροκυττώματα χαρακτηρίζονται από τη μικρότερη ενώ τα γλοιοβλαστώματα απότην μεγαλύτερη έκταση διήθησης του νευρικού ιστού. Το πιλοκυτταρικά

αστροκυττώματα (grade I) ιδίως αυτά του νεανικού τύπου παρουσιάζουν ελάχιστεςτάσεις διήθησης.Η διεργασία της διήθησης των καρκινικών κυττάρων φαίνεται ότι συμβαίνειδιαμέσου συγκεκριμένων «ανατομικών δρόμων» του εγκεφάλου. Η πλέον συχνήοδός διήθησης και διασποράς των κυττάρων του όγκου είναι διαμέσου δεματίωνλευκής ουσίας (intrafascicular spread) όπως είνα το μεσολόβιο και ο ακτινωτόςστέφανος. Είναι αρκετά συχνή η επέκταση γλοιοβλαστωμάτων διαμέσου τουμεσολόβιου στο ετερόπλευρο ημισφαίριο δίνοντας μακροσκοπικά τη μορφήπεταλούδας (butterfly glioma). Ο περιαγγειακός χώρος επίσης αποτελεί συχνή οδόεπέκτασης των διηθητικών γλοιωμάτων. Η οδός αυτή είναι σημαντική για τηνδιασπορά του όγκου στον υπαραχνοειδή χώρο διαμέσου του χώρου Virchow – Robin.Ήδη από την δεκαετία του 1940 ο πρωτοπόρος στη μελέτη των όγκων του εγκεφάλουHans – Joachim Scherer 34 περιέγραψε τις διατάξεις των καρκινικών κυττάρων σεσχέση με φυσιολογικές ανατομικές δομές του νευρικού ιστού που από τότε είναιγνωστές ως δευτεροταγείς δομές του Scherer. Οι δομές αυτές είναι: περινευρωνικήδιάταξη καρκινικών κυττάρων (perineuronal satellitosis), συσσώρευση καρκινικώνκυττάρων κάτω από τη χοριοειδή μήνιγγα (subpial accumulation) και κάτω από τοεπένδυμα (subependymal assumulation), περιαγγειακή διάταξη των καρκινικώνκυττάρων (perivascular satellitosis) και τέλος διασπορά καρκινικών κυττάρων μέσαστα δεμάτια λευκής ουσίας (intrafascicular spread)35. Οι διατάξεις αυτές τωνκαρκινικών κυττάρων ερμηνεύθηκαν από τον Scherer ως το αποτέλεσμα τηςμετανάστευσής τους κατά μήκος νευραξόνων ή αγγείων. Παρατηρούνται κυρίως σεκακής διαφοροποίησης γλοιώματα ενώ η νεύρεσή τους υποδηλώνει την ύπαρξη τουνεοπλάσματος έστω και σε απόσταση από το σημείο που ανευρίσκονται, καιαποτελούν εύρημα κακής προγνωστικής σημασίας 36.Σχήμα 3.1.1 Σχηματική αναπαράσταση της ανάπτυξης του γλοιοβλαστώματος α, perineuronalsatelatosis και subpial accumulation of glioblastoma cells b, intrafascicular spread και διήθηση τουμεσολοβίου c, perivascular accumulation of tumor cells d.(arrowhead)59Σχήμα 3.1.2 Δευτεροταγείς δομές του Scherer (Scherer secondary stractures)Α. perivascularsatellitosisΒ. perinneuronalsatellitosisC.. SubpialaccumulationD. intrafascicularspread.

Οι διατάξεις αυτές των κυττάρων του όγκου είναι αποτέλεσμα της διηθητικής και μεταναστευτικήςτους ικανότητας. Η περισσότερο γνωστή από τις δομές του Scherer είναι η συσσώρευση κυττάρωντου όγκου κάτω από τη χοριοειδή μήνιγγα και οφείλεται στα κύτταρα που φθάνουν στη περιοχήαυτή ακολουθώντας αγγεία ή νευράξονες ενώ αδυνατούν να περάσουν από τη χοριοειδή μήνιγγαστον υπαραχνοειδή χώρο37.Σχήμα 3.1.3. Μαγνητική τομογραφία ασθενών με γλοιοβλάστωμα. α. Διήθηση διαμέσω του μεσολοβίουκαι στο αντίπλευρο ημισφαίριο (baterfly glioma) b,c Ενώ η Τ1ακολουθία αποκαλύπτει δύο βλάβεςανεξάρτητες μεταξύ τους, η Τ2 ακολουθία αποκλύπτει συνέχεια των βλαβών αυτών.3.2 Ρύθμιση της διηθητικής ικανότητας των αστροκυτωμάτωνΤο φαινόμενο της κυτταρικής διασποράς που παρατηρούμε στα γλοιώματα πιστεύεταιότι είναι αποτέλεσμα αλληλεπίδρασης του γλοιακού κυττάρου με στοιχεία τηςαb cεξωκυττάριας ουσίας. Η διαδικασία αυτή χαρακτηρίζεται από δύο ξεχωριστές φάσειςτην κυτταρική μετανάστευση που είναι η μετακίνηση του κυτταρικού σώματος πάνωστην εξωκυττάρια ουσία (cell locomotion) και τη διήθηση η οποία εκτός από τηνμετανάστευση περιλαμβάνει και την αποδόμηση στοιχείων του φραγμού τηςεξωκυττάριας ουσίας, διευκολύνοντας έτσι την κυτταρική μετακίνηση (cell invasion-E.C.M. degradation). Τόσο η κυτταρική μετανάστευση όσο και η διήθηση πιστεύεταιότι αποτελούν κυτταρικές διεργασίες πολύ καλά εναρμονισμένες. Οι διεργασίες αυτέςπεριλαμβάνουν:α)την προσκόλληση του κυττάρου σε στοιχεία εξωκυττάριας ουσίας μέσωμεμβρανικών υποδοχέων38. Παράλληλα την παραγωγή από το κύτταρο δομικών αλλάκαι ρυθμιστικών στοιχείων της εξωκυττάριας ουσίας με στόχο την διαμόρφωση τουπλέον καταλληλότερου υποστρώματος για την κυτταρική διήθηση.β) την αλλαγή διαμόρφωσης του κυτταρικού σκελετού που έχει ως αποτέλεσμααλλαγή του κυτταρικού σχήματος και την ανάπτυξη ψευδοποδίων στην οδηγόπεριοχή της κυτταρικής μεμβράνης 39.γ) την έξοδο πρωτεολυτικών ενζύμων που η ενεργοποίησή τους στον εξωκυττάριοχώρο συντελεί στην αποδόμηση της εξωκυττάριας ουσίας.δ) την αποδέσμευση του γλοιακού κυττάρου από προηγούμενες θέσεις δέσμευσηςστην εξωκυττάρια ουσία ή σε γειτονικά κύτταρα.Η συστολή των ινιδίων του κυτταρικού σκελετού οδηγεί σε μετακίνηση τουκυτταρικού σώματος διαμέσου του χάσματος της εξωκυττάριας ουσίας που έχειδημιουργηθεί, ενώ στην «ουραία» περιοχή του κυττάρου συμβαίνει διάσπαση τωνσυνδέσεών του με την εξωκυττάρια ουσία και γειτονικά κύτταρα. Ο κύκλος αυτόςεπαναλαμβάνεται.61

Σχήμα 3.2.1. Στο διάγραμμα αυτό φαίνονται οι διακριτές φάσεις της κυτταρικής μετανάστευσηςκαι κυτταρικής διήθησης των γλοιακών κυττάρων. Οι διαδικασίες αυτές είναι απόλυταεναρμονισμένες και είναι φανερό ότι ρυθμίζονται από κυτταρικά προγράμματα (τα οποία μπορεί ναείναι διαταραγμένα στα γλοιώματα λόγω γενετικών και επιγενετικών μεταβολών) αλλά καιεξωγενείς παράγοντες.Κεντρικό ρόλο στις παραπάνω διεργασίες διαδραματίζουν τα μόρια κυτταρικήςπροσκόλλησης στην εξωκυττάρια ουσία με σημαντικότερο από όλα την οικογένειατων ιντεγκρινών40. Οι ιντεγκρίνες είναι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες αποτελούμενες απόδύο υπομονάδες α και β. Έχουν βρεθεί έως σήμερα πάνω από 17 α διαφορετικέςυπομονάδες που συνδυάζονται με πάνω από 8 β υπομονάδες. Αποτελούνται από έναδιαμεμβρανικό τμήμα, ένα εξωκυττάριο τμήμα που προσδένεται σε στοιχεία τηςεξωκυττάριας ουσίας (λαμινίνη, φιμπρονεκτίνη, κολλαγόνο ΙV) και ένακυτταροπλασματικό. Η μεγάλη ποικιλία συνδυασμών α και β υπομονάδων είναιυπεύθυνη για την πρόσδεση σε διαφορετικά συστατικά της εξωκυττάριας ουσίαςόπως φαίνεται στον πίνακα που ακολουθεί.Ηπρόσδεση της ιντεγκρίνης στοναντίστοιχο προσδέτη οδηγεί σε αλλαγήτης στερεοδιαμόρφωσης τουκυτταροπλασματικού τμήματός της(ιδίως της β υπομονάδας). Αυτό έχει ωςαποτέλεσμα συσσώρευση καιενεργοποίηση μιας πληθώραςρυθμιστικών πρωτεϊνών και ενζύμωνπλησίον του κυτταροπλασματικούτμήματος της ιντεγκρίνηςδημιουργώντας μια περιοχή αυξημένηςπρωτεϊνικής πυκνότητας γνωστή ωςfocal adhesion περιοχή (περιοχήεστιακής πρόσφυσης). Η αλυσιδωτήενεργοποίηση ενζύμων καιρυθμιστικών πρωτεϊνών στις περιοχές εστιακής πρόσφυσης είτε με φωσφορυλίωση, είτε μεπρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις έχει ως αποτέλεσμα την αλλαγή στη διαμόρφωση του κυτταρικούσκελετού (αλλαγή στον πολυμερισμό της ακτίνης) πράγμα το οποίο οδηγεί στην αλλαγή τουσχήματος του κυττάρου και στην κυτταρική μετακίνηση. Εκτός όμως από τις τροποποιήσεις πουεπέρχονται στον κυτταρικό σκελετό, από τις περιοχές εστιακής πρόσφυσης κατόπιν ενεργοποίησηςενζύμων (κινασών) ξεκινούν να ενεργοποιούνται ενδοκυττάριοι βραχίονες μεταγωγής σήματος,όπως είναι ο δρόμος Ras/MAP κινάσες/ ΑΡ-1 ή ο δρόμος ΡΙ-3Κ-Akt, με τελικό αποτέλεσμα τηντροποποίηση του ρυθμού μεταγραφής γονιδίων που είναι ημαντικά για κυτταρικές λειτουργίεςόπως η κυτταρική αύξηση, η απόπτωση, η κυτταρική διήθηση και η κυτταρική προσκόλληση41.Είναι σαφές λοιπόν ότι η προσκόλληση μέσω ιντεγκρινών του κυττάρου στην εξωκυττάρια ουσίαοδηγεί σε μία σειρά μηνυμάτων από το εξωτερικό προς το εσωτερικό του κυττάρου (outside – in)που αφορούν όχι μόνο την κυτταρική κίνηση αλλά κι άλλες ζωτικές διεργασίες για το κύτταρο.Παράλληλα το κύτταρο μεταβιβάζει μηνύματα από το εσωτερικό του προς την εξωκυττάρια ουσία(inside – out) τα οποία αφορούν στη συσσώρευση (clustering) ιντεγκρινών και ενεργοποίηστους,στην έκκριση ενζύμων που διασπούν την ECM (ECM – remodeling) και στην έκκριση μιας σειράςπρωτεϊνών με ρυθμιστικό ρόλο στις συνδέσεις κυττάρου- εξωκυττάριας __________ουσίας γνωστές ως

κυτταροθεμελιακές πρωτεΐνες (matricellular) όπως θρομβοσπονδίνη, η SPARC (secreted proteinAcidic and riched in cystein), οστεοποντίνη κ.τ.λ.42, 43, 44

63Σχήμα 3.2.2 Εκτός από τις αλληλεπιδράσεις με τον κυτταρικό σκελετό, από τις Focal adhesion περιοχές ξεκινάμια σειρά μονοπατιών ενδοκυττάριας σηματοδότησης που καταλήγουν στην μεταγραφική ρύθμιση γονιδίων πουεμπλέκονται σε κυτταρικές λειτουργίες όπως κυτταρική προσκόλληση, μετανάστευση, κυτταρικόςπολλαπλασιασμός και διήθηση. Κεντρικό ρόλο στη σηματοδότηση των ιντεγκρινών διαδραματίζει η FocalAdhesion Kinase, η Integrin Linked Kinase και το PINCH. H σύνδεση των ιντεγκρινών με την εξωκυττάριαουσία ενεργοποιεί σηματοδοτικά μονοπάτια όπως αυτό Ras/MAP κινασών και ΡΙ-3k/Akt ρυθμίζοντας τονκυτταρικό πολλαπλασιασμό, την διήθηση, την απόπτωση την αγγειογέννεση, (↑ της έκρισης VEGF από την Akt)και την επιβίωση. Πολλά από τα μονοπάτια μεταγωγής σήματος είναι κοινά με αυτά που ενεργοποιούνταικατόπιν διέγερσης των υποδοχέων των αυξητικών παραγόντων45

Σχήμα 3.2.3. Η σύνδεση ιντεγκρινών με τους αντίστοιχους προσδέτες στην εξωκυττάρια ουσία έχειως αποτέλεσμα τη συσσώρευση (Clustering) των ιντεγκρινών και τη δημιουργία των Focal adhesionπεριοχών από τη σταδιακή υπομεμβρανική συσσώρευση ρυθμιστικών–προσαρμοστικών πρωτεϊνών64(adaptor proteins) και ενζύμων. Η αλληλεπίδραση του κυτταρικού σκελετού με τις περιοχές αυτέςοδηγεί σε αλλαγή του σχήματος του κυττάρου και κυτταρική κίνηση.Σχήμα 3.2.4. Μετανάστευση του κυττάρου στην εξωκυττάρια ουσία 46.Έχει αποδειχθεί ότι τα γλοιώματα εκφράζουν πολλές από τις υπομονάδες τωνιντεγκρινών και μάλιστα έχει δειχθεί ότι υπερέκφραση των ιντεγκρινών σεγλοιωματικές σειρές αυξάνει την προσκόλληση και την μετανάστευση πάνω στουπόστρωμα των καρκινικών κυττάρων. Επιπλέον μελέτες πάλι σε κυτταρικέςσειρές υποστηρίζουν ότι αναστολή πρόσδεσης των ιντεγκρινών σε συστατικά τηςεξωκυττάριας ουσίας έχει ως αποτέλεσμα την αναστολή της μετανάστευσήςτους.47

Εκτός από τις ιντεγκρίνες στα αστροκυττώματα εκφράζονται και άλλα μόριαπροσκόλλησης πολύ σημαντικά για τη μετανάστευση των γλοιακών κυττάρων. Τασημαντικότερα από αυτά είναι το CD44 που αποτελεί τον υποδοχέα τουυαλουρονικού οξέως, το CD155/PVR (poliovirus receptor) που συνδέεται με τηνvintronectin ,οι Ephrin B2-B3 και Fn14 υποδοχέας επαγόμενος από τον FGF.Ακόμη ανοσοϊστοχημικές μελέτες αποδεικνύουν ότι στο μέτωπο διήθησης στα΄΄όρια΄΄ του όγκου υπερεκφράζονται εκτός από ιντεγκρίνες και μόρια προσκόλλησηςστην εξωκυττάρια ουσία, μόρια της εξωκυττάριας ουσίας όπως tenascin, osteopontin,vintronectin, καθώς και ρυθμιστικά μόρια όπως η SPARC και η thrombospondin.48 Ταευρήματα αυτά ενισχύουν την άποψη τα γλοιακά κύτταρα δημιουργούν τοκαταλληλότερο υπόστρωμα για τις διαδικασίες κυτταρικής μετανάστευσης καιδιήθησης.

Επιπλέον πολύ σημαντικό υπόστρωμα για την μετανάστευση των γλοιακώνκυττάρων αποτελεί και η μυελίνη των δεματίων της εξωκυττάριας ουσίας και οινευάξονες των νευρικών κυττάρων. Το γεγονός αυτό εξηγεί τα ιστοπαθολογικάευρήματα των δευτεροπαθών δομών του Scherer –intrafascicular spread καιperineuronal satelatosis. Η διήθηση των γλοιακών κυττάρων χρησιμοποιώντας ωςυπόστρωμα την μυελίνη των νευραξόνων οδηγεί στην διασπορά των κυττάρων τουόγκου διαμέσου των δεματίων της λευκής ουσίας ενώ στην περίπτωση της διήθησηςδια του μεσολοβίου και των άλλων συνδέσμων στη δημιουργία του butterfly glioma.3.3Ένζυμα που συμμετέχουν στη διάσπαση της εξωκυττάριας ουσίαςκαι στη διηθητική ικανότητα των γλοιωμάτωνΌπως έχει ήδη αναφερθεί η αποδόμηση της εξωκυττάριας ουσίας είναι ένασημαντικό στάδιο στη διασπορά των καρκινικών κυττάρων των γλοιωμάτων. Όλες οιμελέτες που έχουν γίνει στα γλοιώματα αναδεικνύουν τις Μatrix Metalloproteases(μεταλλοπρωτεάσες θεμέλιας ουσίας) ως τα σημαντικότερα ένζυμα αποδόμησης τηςεξωκυττάριας ουσίας συνεπικουρούμενες από τις πρωτεάσες σερίνης και τιςπρωτεάσες κυστεΐνης.ΜΜPs: Οι ΜΜPs είναι μια μεγάλη ομάδα ενζύμων που έχουν στο ενεργό τουςκέντρο ένα του Zn+2. Υπάρχουν πολλά ένζυμα και ανάλογα με το υπόστρωμα τοοποίο διασπούν παίρνουν και το όνομα τους (Βλέπε πίνακα). Τα ένζυμα αυτάσυμμετέχουν σε μιά πληθώρα φυσιολογικών και παθολογικών καταστάσεων όπως οκαρκίνος, τα εκφυλιστικά νοσήματα, αυτοάνοσα νοσήματα, φλεγμονώδεις παθήσειςκαθώς και σε πολλές βιολογικές διαδικασίες όπως η εμβρυϊκή ανάπτυξη, ηαγγειογένεση, η μετανάστευση κ.α.Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες εκκρίνονται από τα καρκινικά κύτταρα σε ανενεργόμορφή (προένζυμα) και ενεργοποιούνται εκτός του κυττάρου όπου και εξασκούν τηδράση τους. Η ρύθμιση της λειτουργίας των ΜΜPs γίνεται σε τρία επίπεδα α) Στοεπίπεδο της μεταγραφής του γονιδίου του προενζύμου β) στο επίπεδο ενεργοποίησηςτου προενζύμου στον εξωκυττάριο χώρο γ) στο επίπεδο απενεργοποίησης των ΜΜPsαπό την παρουσία ιστικών αναστολέων των ΜΜPs.Η ενεργοποίηση του προενζύμου πραγματοποιείται με τη δράση άλλωνπρωτεϊνασών όπως η πλασμίνη και μεμβρανικού τύπου μεταλλοπρωτεάσες (ΜΤ –ΜΜPs) που βρίσκονται καθηλωμένες στην κυτταρική μεμβράνη στην οδηγό περιοχή.Η ενεργοποίηση γίνεται με τη διάσπαση του αμινοτελικού άκρου του μορίου. Τοενεργοποιημένο ένζυμο αναστέλλεται από την παρουσία

ιστικών αναστολέων τωνΜΜPs (ΤΙΜPs) που και αυτοί εκκρίνονται από τα κύτταρα. Η ισορροπία ΜΜP –ΤΙΜΡ είναι αυτή που καθορίζει τη δραστικότητα των ΜΜPs.Σχήμα 3.3.1 Στο παραπάνω διάγραμμα παρουσιάζεται σχηματικά ο τρόπος ενεργοποίησης τωνMMPs. Κύριο ρόλο στη διαδικασία αυτή διαδραματίζει η πλασμίνη η οποία προέρχεται από τηνενζυμική διάσπαση του πλασμινογόνου μέσω των ενεργοποιητών του πλασμινογόνου t-PA, u-PAπου συνδέονται με τον αντίστοιχο μεμβρανικό υποδοχέα PAR. Επιπλέον μεμβρανικού τύπου MMPsσυμμετέχουν στη διαδικασία της ενεργοποίησης. Η όλη διαδικασία της ενεργοποίησης τωνμεταλλοπρωτεινασών φαίνεται ότι αναστέλεται από ιστικούς αναστολείς όπως οι TIMPs, α2AP (α2antiplasmin) και PAI (plasminogen activator inhibitor).Οι MMPs χωρίζοναι σε έξι υποομάδες ανάλογα με την δομή τους και τουπόστρωμα που χρησημοποιούν (collagenases, gelatinases, stromelysins,transmembrane MMPs, matrilysins και άλλες).6869Συνέχεια......Σχήμα 3.3.2 Στο παραπάνω πίνακα εμφανίζονται οι έως σήμερα γνωστές MMPsΌλες οι MMPs έχουν παρόμοια δομή παρότι δεν υπάρχουν σε όλες τις ομάδεςόλες οι δομικές μοριακές περιοχές. (βλέπε διάγραμμα). Όλες οι MMPs έχουν ένασηματοδοτικό αμινιτελικό άκρο, την αμινοτελική καταλυτική περιοχή που περιέχειένα ιόν Zn και ένα καρβοξυτελικό άκρο με δομή αιμοπηκτίνης. Η καταλυτική περιοχήσυνδέεται με την περιοχή αιμοπηκτίνης με έναν βραχίονα κυστείνης και η σύνδεσηαυτή είναι σημαντική για τον καθορισμό της ειδικότητας του ενζύμου και τηναλληλεπίδραση με TIMPs. Η ενεγότητα του ενζύμου περιορίζεται από την σύνδεσηκυστεινών του προπεπτιδικού τμήματς (βλέπε διάγραμμα) με το ιόν Zn. Διάσπασητης σύνδεσης αυτής είτε με πρωτεολυτική απομάκρυνση του προπεπτιδίου, είτε μεαλλαγές της τριτοταγούς δομής απελευθερώνει το ενεργό κέντρο του ενζύμου. Οι δύοgelatinases MMP-2, MMP-9 διαθέτουν στην καταλυτική περιοχή τρία κατάλoιπαινοδονεκτίνης τύπου ΙΙ. Οι έξι MT-MMPs προσδένονται στην κυτταρική μεμβράνη μετο καρβοξυ-τελικό διαμεμβρανικό άκρο του μορίου ή έναν συνδέτηpolyphosphatidylinositol.Σχήμα 3.3.3 Διάγραμμα απεικόνισης της δομής των MMPs.Σχήμα 3.3.4Στο διπλανό διάγραμμαπαρουσιάζεται η ΄΄προστασία΄΄ τουενεργού κέντρου του ενζύμου απότο αμινοξύ κυστείνη τουπροπεπτιδίου. Αλλαγή στηντριτοταγή δομή του μορίου τηςMMP π.χ. από αποδιαταχτικά μέσαή ενζυμική διάσπαση ουπροπεπτιδίου οδηγούν σεενεργοποίηση του ενεργού κέντρουτου ενζύμου το οποίο εν συνεχείαμε τον μηχανισμό τηςαυτοκατάλυσης προκαλείαπόσπαση του NH2 άκρου καιλή ί ζύ

Η ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων των MMPs πραγματοποιείται από πολλαπλά μονοπάτιαμεταγωγής σήματος που πυροδοτούνται από ενεργοποίηση ιντεγκρινών, υποδοχέων με ενεργότητακινάσης της τυροσίνης και άλλων μορίων της κυτταρικής μεμβράνης. Ορισμένα από αυτά είναι: τομονοπάτι των MAP κινασών, το JAK-STAT μονοπάτι, η ενεργοποίηση μέσω της AKT και της ERKΑπό μελέτες που έχουν γίνει έχει βρεθεί ότι τα γλοιώματα εκφράζουν υψηλά ποσά ΜΜPs και ιδίωςΜΜP-2 και ΜΜP-9. Η έκφραση των ΜΜPs αυξάνει με τον βαθμό κακοήθειας του όγκου ενώαντίστροφη σχέση παρουσιάζει η έκφραση των TIMPS. Επιπλέον αυξημένη έκφραση έχειαναγνωρισθεί και για τις ΜΤ – ΜΜPs. Μελέτες επίσης σε καρκινικές σειρές γλοιωμάτων απέδειξανότι διαμόλυνση κυττάρων με το γονίδιο ΜΜP-2 ή ΜΜP-9 καθώς και το γονίδιο ΜΤ-1ΜΜΡ αυξάνειτην διηθητική ικανότητα των καρκινικών κυττάρων. Τα ευρήματα αυτά υποδεικνύουν τονκαθοριστικό ρόλο των ΜΜPs στην διηθητική ικανότητα των γλοιωμάτων.49-51

Πρωτεάσες σερίνης: Η περισσότερο μελετημένη πρωτεάση αυτής της ομάδας είναι οενεργοποιητής του πλασμινογόνου τύπου ουροκινάσης (uPA). Το ένζυμο αυτόδεσμεύεται στον μεμβρανικό υποδοχέα uPAR και από τη θέση αυτή επιδρά στοπλασμινογόνο RAI-1. Αυξημένα ποσά έκφρασης του uPA έχουν βρεθεί στοπολύμορφο γλοιοβλάστωμα που υποδηλώνουν πιθανή συμμετοχή τους τις διαδικασίεςδιήθησης. Χρειάζονται όμως περισσότερες μελέτες για να εκτιμηθεί ο ακριβής ρόλοςτης ομάδας αυτής στα αστροκυττώματα52και το μετατρέπει σε πλασμίνη. Η πλασμίνηδιασπά πολλά από τα στοιχεία της εξωκυττάριας όπως ινωδονεκτίνη, λαμινίνη,πρωτεογλυκάνες και ενώ ενεργοποιεί και πολλές ΜΜPs όπως η προ ΜΜP-9. Ηδράση του uPA αναστέλλεται από το αναστολέα.53

.Πρωτεάσες Κυστεΐνης: Η ομάδα αυτή περιλαμβάνει μεγάλο αριθμόενδοπεπτιδασών από τις οποίες η καθεψίνη Β και λιγότερο η καθεψίνη L έχουν βρεθείνα υπερεκφράζονται στα γλοιώματα. Ο ακριβής τους ρόλος στην διηθητική ανάπτυξητων όγκων αυτών παραμένει ασαφής.Όπως αναφέρθηκε ήδη η ικανότητα των αστροκυττωμάτων να διηθούν τογειτονικό φυσιολογικό εγκεφαλικό ιστό αυξάνεται καθώς αυξάνεται ο βαθμόςκακοήθειας του νεοπλάσματος. Στο γεγονός αυτό φαίνεται ότι συντελούν οι γενετικέςβλάβες που συσσωρεύονται στο γενετικό υλικό των κυττάρων του όγκουπαρεμβαίνοντας στη ρύθμιση των μηχανισμών διήθησης. Συγκεκριμένα έχει βρεθείότι οι μεταλλάξεις ή η απώλεια του γονιδίου p53, που συμβαίνει από τα αρχικάστάδια της ογκογένεσης στα αστροκυττώματα, οδηγούν σε αυξημένη μεταγραφή τουγονιδίου ΜΜP-2. Έτσι λοιπόν η απώλεια του ελέγχου του κύκλου που επέρχεται μετις μεταλλάξεις του p53 φαίνεται ότι δεν είναι η μοναδική συμβολή στην κακοήθηεξαλλαγή. Η υιοθέτηση ενός πιο διηθητικού φαινότυπου ως αποτέλεσμα απώλειας τηςp53 είναι μια έκφραση της κακοήθους

εξεργασίας.Ένα άλλο γονίδιο σημαντικό για την ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου είναι αυτόπου κωδικοποιεί την κυκλίνη D1. Βρίσκεται ενισχυμένο στα γλοιώματα καισυγκεκριμένα στα αναπλαστικά αστροκυττώματα που χαρακτηρίζονται από μεγάλοαριθμό μιτωτικών διαιρέσεων. Εκτός όμως από τις διαταραχές του κυτταρικούκύκλου ή αυξημένη έκφρασης της κυκλίνης D1 φαίνεται πως με κάποιο τρόποαυξάνει την ενεργότητα των ΜΜPs ενισχύοντας έτσι τη διηθητική ικανότητα τωνκαρκινικών κυττάρων. Ο ακριβής μηχανισμός του ελέγχου της ενεργοποίησης τωνMMPs από την κυκλίνη D1 δεν είναι γνωστός.Τέλος η ενίσχυση του γονιδίου του EGFR που είναι χαρακτηριστική σταγλοιοβλαστώματα πιστεύεται ότι επηρεάζει τη διηθητική ικανότητα των καρκινικώνκυττάρων. Ο πιθανότερος μηχανισμός είναι η αύξηση των ενζύμων ΜΜP-2 καιΜΜP-9 καθώς και του ΜΤ1-ΜΜΡ μέσω του δρόμου των ΜΑΡ Κινασών και τηςP.K.C.54Συμπερασματικά μπορούμε να πούμε πως η συσσώρευση όλο και περισσότερωνγενετικών διαταραχών στη διαδικασία της κακοήθους εξαλλαγής τωναστροκυττωμάτων οδηγεί σε αύξηση της διηθητικής ικανότητας του όγκου, πέρα απότις άλλες διαταραχές των βασικών κυτταρικών λειτουργιών συμβάλλοντας έτσι στηνυιοθέτηση κακοήθους φαινοτύπου.73Σχήμα 3.3.5 Στο παραπάνω διάγραμμα παρουσιάζονται τα κυριότερα στάδια της κυτταρικήςδιήθησης με τα σημαντικότερα μόρι- πρωταγωνιστές του κάθε σταδίου. Επιπλέον διαφαίνονταιχαρακτηριστικές αλλαγές του κυτταρικού σχήματος με την δημιουργία ψευδοποδίων καιαπαραίτητων για την διηθητική ικανότητα του γλοιακού κυττάρου55.

3.4 Ο ρόλος του μεταγραφικού παράγοντα NF-κB στη διηθητικήικανότητα των αστροκυττωμάτων.Ο μεταγραφικός παράγοντας NF-κB περιλαμβάνει τις υπομονάδες Rel A/p65,NF-κB1, NF-κB2, cRel και RelB οι οποίες σχηματίζουν ομοδιμερή ή ετεροδιμερή.Λειτουργώντας ως διμερές ο NF-κB ρυθμίζει την έκφραση μιας πληθώρας γονιδίωναπαρτιώνοντας έτσι πληροφορίες που φθάνουν στον πυρήνα προερχόμενες απόκυττοκίνες, αυξητικούς παράγοντες, μόρια προσκόλλησης ή άλλα μιτογόναερεθίσματα. Αρνητικός ρυθμιστής της λειτουργίας του NF-κB είναι η ομάδα τωνπρωτεινών IκB οι οποίες δεσμεύουν τον NF-κB, αυξάνουν τη συσσώρευσή του στοκυτταρόπλασμα και παρεμποδίζουν τη δράση του στον πυρήνα. Θετκοί ρυθμιστές του74

NF-κB αποτελούν οι κινάσες των ΙκΒ (ΙΚΚ) οι οποίες φωσφορυλιώνοντας τις ΙκΒεπάγουν την αποδόμησή τους από το σύστημα της ubiquitin και σα συνέπειααπελευθερώνεται ο NF-κB (βλέπε σχήμα). Με τη δράση τους αυτή αυξάνεται ησυγκέντρωση του NF-κB στον πυρήνα. Ο NF-κB ως διμερές συνδέεται στο D.N.A.και επάγει την έκφραση πολλών γονιδίων που εμπλέκονται σε ποικίλες βιολογικέςδιεργασίες όπως η ανοσολογική απάντηση, η αγγειογένεση, η ρύθμιση τουκυτταρικού κύκλου, η απόπτωση, η κυτταρική διήθηση κ.α56.Σχήμα 3.4.1 Στο διάγραμμα αυτό παρουσιάζονται οι κυριότερες αιτίες αυξημένης δραστηριότηταςτου NF-κB (Α ) και οι σημαντικότερες λειτουργίες και τα γονίδια των οποίων την έκφραση ρυθμίζει(Β).Πολλά από τα ένζυμα που σχετίζονται με την αποδόμηση της εξωκυττάριας ουσίαςκαι την κυτταρική διήθηση εμφανίζουν στους υποκινητές τους αλληλουχίεςπρόσδεσης για τον NF-κB με σημαντικότερους εκπροσώπους την MMP-2, MMP-9,και το u-PA57.Σχήμα 3.4.2. Στο διάγραμμα αυτό εμφανίζονται τα κύρια μεταγωγικά μονοπάτια που ρυθμίζουντην δραστηριότητα του NF-κB καθώς και τα σημαντικότερα γονίδια στόχοι του μεταγραφικούαυτού παράγοντα.Είναι σαφές ότι ο NF-κB διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην έκκριση ενζύμων πουδιασπούν την εξωκυττάρια ουσία συμμετέχοντας έτσι στις διεργασίας προαγωγής τουόγκου. Πολλές πειραματικές μελέτες παρουσιάζουν αυξημένη έκφραση του NF-κB σεμια πληθώρα νεοπλασιών μεταξύ των οποίων και στα αστροκυττώματα. Το γεγονόςαυτό καθιστά τον NF-κB κεντρικό ρυθμιστή της κακοήθους υμπεριφοράς των όγκωναυτών.58

76

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4Η ογκοκατασταλτική πρωτείνη ING-4 (inhibition of growth) και ορόλος της στη διηθητική ικανότητα των αστροκυττωμάτων.4.1 Κύρια χαρακτηριστικά της οικογένειας των ING πρωτεινών.Η οικογένεια των ανθρώπινων ογκοκατασταλτικών γονιδίων Inhibition of Growthπεριλαμβάνει πέντε μέλη: ING1…ING5. Το πρώτο μέλος της οικογένειας ING-1ανακαλύφθηκε το 1996 με τεχνικές υβριδοποίησης εναιωρήματος φυσιολογικών καικαρκινικών κυττάρων του μαστού59

ενώ με τεχνικές DNA sequencing ταυτοποιήθηκεη αλληλουχία βάσεών του. Μελέτες που ακολούθησαν έδειξαν ότι “sense DNA “

αλληλουχίες του γονιδίου προκαλούσαν αναστολή της ανάπτυξης και της κακοήθουςεξαλλαγής όταν εισήχθηκαν σε κυτταρικές σειρές και λόγω της δράσης αυτής έλαβεκαι το όνομα inhibition of growth. Έρευνα σε DNA βιβλιοθήκες αποκάλυψε τηνύπαρξη τεσσάρων ακόμη μελών της οικογένειας αυτής ING-2, ING-3, ING-4, ING-5τα οποία παρουσιάζουν 32-76% ομολογία στην αλληλουχία βάσεων του DNA ενώ ταγονίδια αυτά παρουσιάζονται συντηρημένα από τους μύκητες έως τον άνθρωπο60.Η βασική δομή των ING γονιδίων παρουσιάζει πολλά κοινά χαρακτηριστικά καιτα γονίδια αυτά εδράζονται σε διαφορετικά χρωμοσώματα (βλέπε σχήμα). Λόγω τουεναλλακτικού ματίσματος του mRNA το ING-1, ING-3, ING-4 εμφανίζουναντίστοιχα 4,2 και 5 μεταγράμματα ενώ το ING-2 και ING-5 μόνο ένα.61

77Σχήμα 4.1.1 Στο παραπάνω διάγραμμα εμφανίζονται τα βασικά χαρακτηριστικά των γονιδίων τηςοικογένειας ING η θέση τους στο γονιδίωμα στον άνθρωπο (πάνω) και στο ποντίκι (κάτω).Επιπλέον εμφανίζονται τα διαφορετικά μεταγράμματα που προκύπτουν από διαφορετικό μάτισματου mRNA.Η κύρια δομή των πρωτεινών του ING-4 παρουσιάζει σημαντικές ομοιότητες για ταδιάφορα μέλη της οικογένειας. Όλες οι πρωτείνες περιέχουν ένα plant homeodomainπλησίον του καρβοξυτελικού άκρου του μορίου (PHD), μία αλληλουχία υπεύθυνη γιατην πυρηνική εντόπιση του μορίου (NLS) και εν συνεχεία μία μοναδική αλληλουχίαμε άγνωστη λειτουργία που ονομάζεται novel conserved region. Η περιοχή PHDπεριλαμβάνει 60 αμινοξέα και έχει την δυνατότητα δέσμευσης δύο ιόντων Zn ενώεμπλέκεται στην αλλαγή της τριτοταγούς δομής της χρωματίνης. Πρόσφατες μελέτεςυποδηλώνουν ότι η περιοχή PHD των ING πρωτεινών συνδέεται απευθείας μεμεθυλιωμένες ιστόνες και ιδίως με τις H3K4me2 και H3K4me3.Μία άλλη κοινή περιοχή στις ING πρωτεΐνες είναι αυτή που περιέχει αλληλουχίεςπυρηνικής εντόπισης (NLS) και ορισμένες ING πρωτεΐνες περιέχουν πολλές τέτοιεςπεριοχές. Απώλεια της περιοχής αυτής οδηγεί σε κυτταροπλασματική συσσώρευσητης πρωτεΐνης και απώλεια της δράσης τους όπως έχει αναφερθεί σε πληθώρανεοπλασμάτων.Σχήμα 4.1.2 Στο παραπάνω διάγραμμα παρουσιάζονται οι κύριες περιοχές στην αμινοξικήαλληλουχία των ING πρωτεινών. Κάθε ING πρωτείνη εμφανίζεται να περιέχει τρεις καλώςσυντηρημένες περιοχες: α) μία περιοχή PHD (plant homeodomain), μία περιοχή απαραίτητη για τηνπυρηνική εντόπιση του μορίου NLS (nuclear localization sequence) και μία συντηρημένη περιοχήNCR (novel conserved region). Η περιοχή NLS για το ING-4 πιστεύεται ότι είναι η περιοχή

δέσμευσης του p53. Μία περιοχή LZL (luezine zipper like) υπάρχει στο ING2-5 και πιστεύεται ότιείναι υπεύθυνη για την επιδιόρθωση του DNA και την απόπτωση. Η πρωτείνη ING-1 περιέχειεπίσης και τις αλληλουχίες PIP PIP (PCNA-interacting protein motif) και PBD. Η αλληλουχία PBD(partial bromodomain) φαίνεται να διαντιδρά με την SAP30 υπομονάδα του συμπλέγματοςmSin3A-HDAC. Η ING-1 και 2 έχουν την αλληλουχία PBR (poly basic region) η οποία καιδεσμεύεται με την φωσφοινοσιτόλη.79

4.2 Πρωτεΐνες της οικογένειας ING συμμετέχουν σε πολλές κυτταρικέςλειτουργίες.Μία ανασκόπηση στην πρόσφατη βιβλιογραφία αποκαλύπτει ότι η οικογένεια τωνING πρωτεϊνών εμπλέκεται σε πληθώρα κυτταρικών λειτουργιών όπως η κυτταρικήανάπτυξη, ο πολλαπλασιασμός, η απόπτωση, η επιδιόρθωση του DNA, η κυτταρικήγήρανση και η αγγειογένεση.62 Υπάρχουν πολλές ενδείξεις που συνηγορούν υπέρ τουρόλου των ING πρωτεϊνών στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου διαδραματίζονταςρόλο κλειδί σε κομβικά σημεία ελέγχου. Η πλειονότητα αυτών των ενδείξεων αφοράτην ING-1 πρωτεΐνη παρόλα αυτά ένας σημαντικός αριθμός μελετών εμπλέκει και τιςυπόλοιπες πρωτεΐνες της οικογένειας, ING2-5, στις προαναφερθείσες κυτταρικέςλειτουργίες. Επιπρόσθετα με τα παραπάνω αναστολή της έκφρασης των INGπρωτεινών αυξάνει την κυτταρική μετανάστευση και διήθηση και παράλληλα οδηγείσε απώλεια της εξ επαφής αναστολής του πολλαπλασιασμού (contact inhibition).63

Αποτελέσματα πολλών μελετών διαμόλυνσης κυτταρικών σειρών υποδεικνύουν ότι οιπρωτεΐνες της οικογένειας αυτής είναι απαραίτητες για την σωστή λειτουργία της p53καθώς και για άλλες σηματοδοτικές λειτουργίες όπως η ρύθμιση της δράσης του NF-κB και του Hypoxia Inducible Factor (H.I.F.). Επιπλέον οι πρωτεΐνες της οικογένειαςING συμμετέχουν ως υπομονάδες σε πρωτεϊνικά συμπλέγματα αναδιαμόρφωσης τηςχρωματίνης ρυθμίζοντας έτσι την μεταγραφή σημαντικών γονιδίων που εμπλέκονταιστις προαναφερθείσες κυτταρικές λειτουργίες.64

80Σχήμα 4.2.1. Στον παραπάνω πίνακα παρουσιάζονται τα μέλή της οικογένειας ING, τα πρωτεινικάσυμπλέγματα αναδιαμόρφωσης της χρωματίνης στα οποία συμμετέχουν, οι λειτουργίες πουεπιτελούν και η μέθοδος που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση της ING πρωτεΐνης σε κάθεσύμπλεγμα. (Co-IP: co-mmunoprecipitation, IAP-MS: immune affinity purified-massspectroscopy).Διαταραχή στην λειτουργία των πρωτεϊνών της οικογένειας αυτής οδηγεί στηνκακοήθηεξαλλαγή γεγονός το οποίο χαρακτηρίζει τα γονίδια αυτά ωςογκοκατασταλτικά. Στον πίνακα που ακολουθεί παρουσιάζονται

οι συχνότερααπαντώμενες μεταλλάξεις γονιδίων της οικογένειας ING και οι αντίστοιχεςνεοπλασίες στις οποίες απαντώνται.65

Σχήμα 4.2.2. Στον παραπάνω πίνακα παρουσιάζονται οι σημαντικότερες μεταλλάξεις γονιδίων τηςοικογένειας ING και οι νεοπλασίες στις οποίες απαντώνται.Παρακάτω γίνεται εκτενέστερη αναφορά στις λειτουργίες του ING-4 το οποίοαποτελεί και αντικείμενο της παρούσας διατριβής.82

4.3 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΕΣ ΤΗΣ ING-4 ΠΡΩΤΕΪΝΗΣΌπως και τα άλλα μέλη της οικογένειας ING η πρωτεΐνη ING-4 διαδραματίζεικαθοριστικό ρόλο στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης. Έκτοπηέκφραση του ING-4 σε RKO κύτταρα βρέθηκε ότι αναστέλλει την δημιουργίααποικιών εξαιτίας της μείωσης του ποσοστού των κυττάρων στην S φάση και αυξάνειτο ρυθμό απόπτωσης λόγω αύξησης της έκφρασης του Bax γονιδίου.Ωστόσο σημαντικές διαφορές στην λειτουργία του ING-4 σε σχέση με της άλλεςING πρωτεΐνες φαίνεται ότι υπάρχουν: το ING-4 δεν φαίνεται να έχει ρόλο στο NERενώ πιστεύεται ότι εμπλέκεται στην ρύθμιση της αγγειογένεσης και της κυτταρικήςμετανάστευσης.• Ρόλος του ING-4 στην αγγειογένεση και στην κυτταρικήμετανάστευση.Η σχέση του ING-4 με την αγγειογένεση διερευνήθηκε σε κυτταρικές σειρέςγλοιβλαστώματος U87MG οι οποίες εμφυτεύθηκαν στον εγκέφαλο ποντικών. Σειρέςστις οποίες η έκφραση του ING-4 μειώθηκε χρησιμοποιώντας siRNA αναπτύχθηκανπολύ πιο γρήγορα και διμιούργησαν όγκους που εμφάνισαν μεγαλύτερη αγγειογένεσησε σχέση με κυτταρικές σειρές στις οποίες η έκφραση του ING-4 διατηρήθηκεφυσιολογική. Επιπρόσθετες μελέτες σε κυτταρικές σειρές πολλαπλού μυελώματοςαποκάλυψαν ότι η μείωση της έκφρασης του ING-4 οδήγησε στην αυξημένη έκφρασηπροαγγειογενετικών μορίων όπως η IL-8 και η οστεοπντίνη.Σημαντικές μελέτες σε διάφορες κυτταρικές σειρές συνδέουν το ING-4 με τηνκυτταρική μετανάστευση και διασπορά, αποκαλύπτοντας ότι έκτοπη υπερέκφρασητου γονιδίου οδηγεί σε αναστολή της κυτταρικής μετανάστευσης. Μελέτες μεφασματοσκοπία μάζας σε RKO κύτταρα που υπερεκφράζουν ING-4 δείχνουν ότι τοING-4 διαντιδρά με την Liprin a1στα λαμελιπόδια των κυττάρων, το G3BP2a, τοCOP1b, το CaBP1 καθώς και ριβοσωμιακές πρωτεΐνες. Δεδομένου ότι η Liprin a1διαδρανατίζει σημαντικό ρόλο στην ακεραιότητα των focal adhesion περιοχών, το

ING-4 διαμέσου της διαντίδρασης του με την Liprin a1 πιστεύεται ότι διαδραματίζεισημαντικό ρόλο στην κυτταρική μετανάστευση, στην κυτταρική διασπορά και στηνκυτταρική προσκόλληση στην εξωκυττάρια ουσία. Υποστηρικτική της παραπάνωπρότασης είναι και η παρατήρηση σε κυτταρικές σειρές μαστικού καρκίνου T47Dστις οποίες η υπερέκφραση του ING-4 προκαλεί μείωση της ικανότητάς τους ναμεταναστεύουν στο άγαρ και εξάλειψη της αναστολής της ανάπτυξης εξ επαφής(contact inhibition).4.4 Ο ρόλος του ING-4 στο μονοπάτι τουNF-κB.Υπάρχουν σημαντικές ενδείξεις που υποστηρίζουν ότι το ING-4 εμπλέκεταιστη λειτουργία του p53, NF-κB και HIF-1a μονοπατιού. Υπερέκφραση του ING-4σε κυτταρικές σειρές γλοιβλαστώματος U87MG καθώς και πειράματαανοσοκαθίζησης αποκαλύπτουν ότι το ING-4 διαντιδρά με την p65(RelA) υπομονάδατου NF-κB γεγονός το οποίο συνδέει την λειτουργία του ING-4 με το μονοπάτι τουNF-κB. Επιπρόσθετες αναλύσεις της διαντίδρασης αυτής με τεχνικές band shift καιαναστολής της μετάφρασης του ING-4 με χρήση siRNA υποστηρίζουν ότι το ING-4ανταγωνίζεται τον NF-κB σε επίπεδο δέσμευσης στον υποκινητή γονιδίων.Επιπρόσθετα μελέτες με κυτταρικές σειρές knockdown για το ING-4, διαμολυσμένεςμε πλασμίδια που φέρουν το γνίδιο της lusiferase υπό τον έλεγχο του NF-κBπαρουσιάζουν αυξημένη έκφραση του γονιδίου αυτού. Τα δεδομένα αυτάυποστηρίζουν ότι το ING-4 δεσμεύεται με τον p65(RelA) και αναστέλει τηνμεταγραφική λειτουργία του NF-κB.66

84

Σχήμα 4.4.1 Α.Στο διπλανό διάγραμμα παρουσιάζεται ο ρόλος του ING-4 στο μονοπάτι του NF-κB. Πρόσφατες μελέτες υποδεικνύουν ότι το ING-4 δεσμεύεται με τον p65(RelA) και αναστέλει τηνμεταγραφική δραστηριότητα του NF-κB. Επιπλέον παρουσιάζεται η αλληλεπίδραση του ING-4 μετις HBO1 ιστόνες παρότι ο ρόλος τους στο μονοπάτι του NF-κB δεν είναι απόλυτα γνωστός.

Β. Τελευταίες μελέτες παρουσιάζουν τον ρόλο των ING 1,2 στο μονοπάτι του NF-κB. Οιπρωτεΐνες αυτές p33ING1β και p33ING2 οδηγούν σε αυξημένη έκφραση της heat shock protein-70HSP70 η οποία παρεμποδίζει την διάσπαση της ανασταλτικής πρωτεΐνης IκΒ αναστέλωντας έτσιτην είσοδο του NF-κB στον πυρήνα και της μεταγραφικής του δραστηριότητας.85

4.5 Ο ρόλος του ING-4 στο μονοπάτι του HIF-1a.Νεότερες πειραματικές μελέτες σε κυτταρικές σειρές στις οποίες έχει μειωθεί ηέκφραση του ING-4 με τη χρήση siRNA παρουσιάζουν αυξημένη έκφραση γονιδίων

που ελέγχονται από τον HIF-1a όπως NIP3 καιAK3 κάτω από συνθήκες υποξίας10.67

Δεν έχει παρατηρηθεί άμεση διασύνδεση του ING-4 με τον HIF-1a και πιστεύεται ότιτο ING-4 καταστέλει την έκφραση των γονιδίων στόχων του HIF-1a τροποποιώνταςτη δραστικότητα του HIF-1a. Πρόσφατες μελέτες υποστηρίζουν ότι το ING-4τροποποιεί την δραστικότητα του HIF-1a είτε επιδρώντας στα ενζυμικά συστήματαπου υπεισέρχονται στον καθορισμό της δομής της χρωματίνης, είτε τροποποιώνταςτην λειτουργία της HIF-1 υδροξυλάσης-2 μιας πρωτεΐνης-ανιχνευτή της τάσης τουοξυγόνου η οποία συμβάλει στη αποδόμηση του HIF-1.Παρότι έχει βρεθεί ότι η μείωση της έκφρασης του ING-4 οδηγεί σε αύξηση τουσχηματισμού αγγείων σε κύτταρα RPMI-8226 σε συνθήκες υποξίας δεν υπάρχουνμελέτες που να ξεκαθαρίζουν τον τρόπο ρύθμισης της δραστικότητας του HIF-1απότο ING-4.4.6 Ο ρόλος του ING-4 στην αναδιάταξη της χρωματίνης.Όπως έχει ήδη αναφερθεί το ING-4 αποτελεί στοιχείο του HBO1 συμπλέγματος.Οι πρωτεΐνες HBO1 αποτελούν μέλη δύο HAT συμπλεγμάτων τα οποίαακετυλιώνουν τις ιστόνες H4 και HBO1 και εμπλέκονται στην αντιγραφή του DNA,στην πρόοδο της S φάσης του κυτταρικού κύκλου και στη ρύθμιση της μεταγραφήςτων γονιδίων. Επιπλέον, έχει αναφερθεί ότι οι πρωτεΐνες HBO1αποτελούναρνητικούς ρυθμιστές των ανδρογονικών υποδοχέων και του NF-κB. Τέλος, ηογκοκατασταλτική πρωτεΐνη p53 αντιδρά με τις πρωτεΐνες HBO1 και αποτελείαρνητικό ρυθμιστή της δραστηριότητά τους ως ακετυλάσες.86Είναι γεγονός ότι τα υπάρχοντα έω σήμερα στοιχεία για τον ρόλο των HBO1πρωτεϊνών στη ρύθμιση της μεταγραφής δεν είναι επαρκεί. Επιπρόσθετες μελέτεςαπαιτούνται για την αποσαφήνιση της λειτουργίας τους αυτής καθώς και γιατηνδράση του ING-4 στη αναδιαμόρφωση της δομής της χρωματίνης και στηνμεταγραφική λειτουργία.87

ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ88Α. Σκοπός της μελέτηςΟ σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η εκτίμηση της έκφρασης του ING-4, p65,MMP-2, MMP-9 και u-PA στα αστροκυττώματα του ανθρώπου.

Για το σκοπό αυτό εφαρμόσθηκε η ανοσοϊστοχημική τεχνική βιοτίνης –στρεπταβιδίνης – υπεροξειδάσης σε τομές παραφίνης των όγκων αυτών.Όπως αναφέρθηκε ήδη στο γενικό μέρος της διατριβής μία πολύ χαρακτηριστικήιδιότητα των γλοιωμάτων είναι η ικανότητα που έχουν να διηθούν το γειτονικό ωςπρος τον όγκο φυσιολογικό εγκεφαλικό παρέγχυμα. Η διαδικασία αυτή είναι μία πολύαυστηρά ρυθμιζόμενη κυτταρική λειτουργία στην οποία διακρίνονται δύοπαράλληληλα εξελισσόμενες φάσεις: Την κυτταρική μετακίνηση (locomotion) και __________τηνκυτταρική διήθηση (invasion) που ειτυγχάνεται με την αποδόμηση στοιχείων τηςεξωκυττάριας ουσίας (extracellular matrix degradation).Στην παρούσα μελέτη γίνεται προσπάθεια κατανόησης της δεύτερης φάσης τηςκυτταρικής διήθησης με την χρήση ανοσοιστοχημικών τεχνικών εφαρμοζόμενων σετομές παραφίνης αστροκυττώματων του ανθρώπου όλων των βαθμίδωνδιαφοροποίησης. Με την χρήση κατάλληλων αντισωμάτων έγινε εκτίμηση τηςέκφρασης των ενζύμων που είναι υπεύθυνα για την δίασπαση στοιχείων τηςεξωκυττάριας ουσίας (MMP-2, MMP-9, u-PA) και της υπομονάδας p65 τουμεταγραφικού παράγοντα NF-κB ο οποίος είναι κοινός ρυθμιστής της μεταγραφής καιτων τριών αυτών ενζύμων. Επιπλέον εκτιμήθηκε και η έκφρασης της πρωτείνης τουογκοκατασταλτικού γονιδίου ING-4 η οποία είναι γνωστό ότι αποτελεί πρόσφαταταυτοποιημένο ρυθμιστή της λειτουργίας του NF-κB ως μετσγραφικός παράγον.Προηγούμενες μελέτες που έχουν πραγματοποιηθεί σε κυτταρικες σειρέςαστροκυττωμάτων αναδεικνύουν το ρόλο του ING-4 στη ρύθμιση τηςδραστηριότητας του NF-B και στον έλεγχο της αγγειογένεσης στα νεοπλάσματα89αυτά.68Επιπρόσθετες μελέτες στο μελάνωμα69 αλλά και στο καρκίνο κεφαλής καιτραχήλου70 υποστηρίζουν πιθανή συμμετοχή του ING-4 στη ρύθμιση της διηθητικήςικανότητας των νεοπλασματικών κυττάρων.Στην παρούσα μελέτη δίνεται προσπάθεια εκτίμησης της σχέσης τηςογκοκατασταλτικής πρωτείνης ING-4 με την ρύθμιση της ενεργότητας του NF-κB καιτην ρυθμιζόμενη από αυτών έκφραση των ενζύμων αποδόμησης της εξωκυττάριαςουσίας.Β. Υλικό και μέθοδοιΒ1. Υλικό

Το υλικό που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη προέρχεται από ταεργαστήρια Παθολογικής Ανατομικής του Γενικού Νοσοκομείου Πατρών ΄΄Ο ΑγιοςΑνδρέας΄΄, του κρατικού Νοσοκομείου Νίκαιας Πειραιά και του κρατικούΝοσοκομείου ΄΄Τζανειο΄΄ Πειραιά. . Μελετήθηκαν συνολικά 101 αστροκυτταρικοίόγκοι ασθενών που χειρουργήθηκαν στις Νευροχειρουργικές Κλινικές Νοσοκομείωντων Αθηνών και των Πατρών. Για τους όγκους αυτούς έχει γίνει ιστολογική διάγνωσημε χρήση της χρώσης αιματοξυλίνη ηωσίνη και η κατανομή τους στις διάφορεςβαθμίδες διαφοροποίησης είναι η εξής:-Χαμηλού βαθμού διαφοροποίησης (grade I,II κατά W.H.O.):11 περιστατικά,-Αναπλαστικά αστροκυττώματα (grade IΙΙ): 18 περιστατικά,-Πολύμορφα γλοιοβλαστώματα (gradeIV):72 περιστατικά.(Πίνακας1,δίαγραμμα1.)90Πίνακας 1ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΗ ΒΑΘΜΙΔΑΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗΣΑΡΙΘΜΟΣΠΕΡΙΣΤΑΤΙΚΩΝΠΟΣΟΣΤΟ(%) ΕΠΙ ΤΟΥΣΥΝΟΛΟΥgrade I,II 11 10.9Grade III 18 17.8grade IV 72 71.3

ΣΥΝΟΛΟ 101 100Το υλικό των νεοπλασμάτων που χρησιμοποιήθηκε ήταν εγκλεισμένο σε blocksπαραφίνης. Από κάθε περιστατικό χρησιμοποιήθηκε ένας αντιπροσωπευτικός κύβοςπαραφίνης από τον οποίον πάρθηκαν τομές πάχους 4 – 5 μm με τη χρήση μικροτόμουκαι μονιμοποιηθήκαν σε αντικειμενοφόρους πλάκες.Χρησιμοποιήθηκαν επίσης πλακίδια φυσιολογικού εγκεφαλικού ιστού (υλικό τουΕργαστηρίου Ανατομικής) προκειμένου να ελεγχθεί η έκφραση των ανωτέρω μορίωνστο φυσιολογικό εγκέφαλο.Β2. ΜέθοδοιΗ μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε στη παρούσα μελέτη είναι η ανοσοϊστοχημικήτεχνική. Βιοτίνης – στρεπταβιδίνης – υπεροξειδάσης. Η πειραματική εργασίαΜ/F=092πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Ανατομικής τς Ιατρικής Σχολής τουΠανεπιστημίου Πατρών.Γενικά για τις ανοσοϊστοχημικές μεθόδους.Η ανοσοϊστοχημική μέθοδος ανήκει στις μορφολογικές τεχνικές προσδιορισμούκαι εφαρμόζεται σήμερα πολύ συχνά στην εργαστηριακή και κλινικοεργαστηριακήέρευνα. Στην ομάδα των μορφολογικών τεχνικών προσδιορισμού ανήκουν επίσης οιιστοχημικές μέθοδοι, οι αυτοραδιογραφικές μέθοδοι και μέθοδοι ανοσοφθορισμού.

Το κύριο χαρακτηριστικό των μορφολογικών τεχνικών είναι ότι εφαρμόζονται στονιστό χωρίς να αλλοιωθεί (τουλάχιστον σημαντικά) η δομή του. Η μελέτηπραγματοποιείται σε τομές ιστού που έχουν παρθεί με τον μικροτόμο καιμονιμοποιηθεί σε αντικειμενοφόρους πλάκες. Ένα σημαντικό πλεονέκτημα τωνμεθόδων αυτών σε σχέση με τις βιοχημικές και ανοσολογικές τεχνικές, πουπραγματοποιούνται σε ομογενοποίημα ή εκχύλισμα ιστού, είναι ότι διατηρούν τηνεντερογένεια του ιστού.Η ανοσοϊστοχημική τεχνική βασίζεται στη χρησιμοποίηση μονοκλωνικών ήπολυκλωνικών αντισωμάτων που στοχεύουν σε αντιγονικούς επιτόπους της υπόανίχνευση πρωτεΐνης του ιστού. Η παρουσία ή μη της πρωτεΐνης γίνεται εμφανής μεκάποιο σύστημα ανίχνευσης που στηρίζεται στη χρήση φθοριζουσών ή χρωμοφόρωνουσιών. Η τεχνική αυτή είναι κατεξοχήν ποιοτική τεχνική, μπορεί όμως ναχρησιμοποιηθεί και για ποσοτικούς προσδιορισμούς εάν υπάρχει η δυνατότηταεκτίμησης των μεταβολών έντασης του χρώματος ή του φθορισμού ή εάν είναιδυνατή η μέτρηση του ποσοστού των κυττάρων που είναι θετικά για την υπόανίχνευση πρωτεΐνης. Ωστόσο η ανάπτυξη όλο και περισσότερο αναβαθμισμένωνσυστημάτων ανάλυσης εικόνας υπόσχεται την ευρύτερη χρήση της ανοσοϊστοχημείαςγια ποσοτικούς προσδιορισμούς.Μπορούνε αδρώς να διακρίνουμε δύο φάσεις στην πειραματική διαδικασία τηςανοσοϊστοχημείας: α) Η πρώτη στοχεύει στην προετοιμασία του ιστού, στην ανάδειξητων αντιγονικών θέσεων και στην εξάλειψη του μη ειδικού ήματος ενώ β) η δεύτερηφάση αφορά στην τοποθέτηση του ειδικού αντισώματος και του συστήματοςανίχνευσης. Η προετοιμασία του ιστού περιλαμβάνει την αποπαραφίνωση των τομών(εάν πρόκειται για τομές παραφίνης) και τη σταδιακή ενυδάτωσή τους προκειμένουνα εξασφαλισθεί υδατικό περιβάλλον στο εσωτερικό του ιστού, που είναι απαραίτητοστη δεύτερη φάση του πειράματος για την διεξαγωγή των ενζυμικών καιανοσολογικών αντιδράσεων. Η ανάδειξη των αντιγονικών θέσεων έχει ως σκοπό τηναποκάλυψη των αντιγονικών επιτόπων της υπό αναζήτηση πρωτεΐνης που πιθανόνέχουν καλυφθεί λόγω των διαδικασιών μονιμοποίησης του ιστού, και γίνεται μεδιάφορους τρόπους: i) χρήση φούρνου μικροκυμάτων, δηλαδή εμβάπτιση τωνπλακιδίων σε ειδικό διάλυμα και τοποθέτηση τους στο φούρνο. Η έκθεση του ιστούστην ενέργεια των μικροκυμάτων αποσκοπεί στην αποκάλυψη (unmasking) τωναντιγονικών επιτόπων. Η μέθοδος αυτή είναι η περισσότερο διαδεδομένη. ii)

Θέρμανση των τομών στο υδατόλουτρο σε περιβάλλον κορεσμένο με υδρατμούς καιθερμοκρασία 80 – 90ο C. Η έκθεση του ιστού σε υψηλή θερμοκρασία θεωρείταιυπεύθυνη για την αντιγονική ανάδειξη (antigen retreival). iii) Κατεργασία με ειδικάένζυμα (π.χ. θρυψίνη). Η διαδικασία αυτή αποβλέπει στην αύξηση της διείσδυσης τουαντισώματος στον ιστό.Η εξάλλειψη του μη ειδικού σήματος έχει ως στόχο τη μείωση του backgroundκαι την αύξηση έτσι της ειδικότητας της μεθόδου. Γίνεται σε δύο βήματα. Στο πρώτοκαταναλώνουμε την ενδογενή υπεροξειδάση του ιστού με διαλύματα Η2Ο2 εάν τοσύστημα ανίχνευσης χρησιμοποιεί το ένζυμο αυτό. Έτσι το σήμα που θα έχουμε στοτέλος της διαδικασίας προέρχεται μόνο από την αντίδραση του ενζύμου τουσυστήματος ανίχνευσης (ειδικό σήμα). Στο δεύτερο βήμα γίνεται η κάλυψη μηειδικών αντιγονικών θέσεων (protein blocking). Το αντίσωμα που χρησιμοποιούμεπαρότι συνδέει με τον αντιγονικό επίτοπο της υπό αναζήτηση πρωτεΐνης με μεγάλησυγγένεια είναι δυνατόν να συνδεθεί ασθενώς με άλλους αντιγονικούς επιτόπους. Σεαυτές τις μη ειδικές θέσεις δέσμευσης στοχεύει το protein blocking που γίνεται στοβήμα αυτό χρησιμοποιώντας διαλύματα βόειας αλβουμίνης ή ορό αλόγου ή άλλαπρωτεϊνικά μίγματα που διατίθενται. Τα πρωτεϊνικά μόρια των διαλυμάτων αυτών94συνδέονται με τις μη ειδικές θέσεις εμποδίζοντας την πρόσδεση του αντισώματοςεκεί.Στη δεύτερη φάση της πειραματικής διαδικασίας γίνεται η ανάδειξη του ειδικούσήματος. Χρησιμοποιούνται, όπως αναφέρθηκε πολυκλωνικά ή μονοκλωνικάαντισώματα τα οποία συνδέονται με αντιγονικούς επιτόπους της πρωτεΐνης πουμελετούμε με μεγάλη σταθερά σύνδεσης. Τα δύο αυτά είδη των αντισωμάτων πουχρησιμοποιούνται έχουν το καθένα τα δικά του μειονεκτήματα και πλεονεκτήματα.Τα πολυκλωνικά αντισώματα ουσιαστικά είναι μίγμα αντισωμάτων που τοκαθένα στρέφεται και προς διαφορετικό επίτοπο και υπό μελέτη πρωτεΐνης. Λόγω τηςμεγάλης ετερογένειας τους τα πολυκλωνικά αντισώματα παρουσιάζουν αυξημένοποσοστό μη ειδικής δέσμευσης. Όμως η σύνδεση πολλών αντισωμάτων στηνπρωτεΐνη στόχο σε πολλούς και διαφορετικούς επιτόπους οδηγεί σε ενίσχυση τουειδικού σήματος. Η παρασκευή των πολυκλωνικών αντισωμάτων γίνεται με ένεσητου πρωτεϊνικού μορίου σε κάποιο ζώο και λαμβάνονται από τον ορό του ζώου. Είναιπροφανές ότι το μίγμα αντισωμάτων που λαμβάνουμε ποικίλει ανάλογα με το ζώοπου έγινε η ένεση της πρωτεΐνης.

Τα μονοκλωνικά αντισώματα είναι μεταγενέστερα των πολυκλωνικών και είναιειδικά για έναν μόνο αντιγονικό επίτοπο του πρωτεϊνικού μορίου–στόχος.Παρασκευάζονται από καλλιέργειες υβριδικών κυττάρων (λεμφοκύτταρο –κυτταρολεμφώματος) και παρουσιάζουν υψηλή ομογένεια. Το κύριο πλεονέκτηματους είναι ότι λόγω ακριβώς της μεγάλης τους ειδικότητας δεν παρουσιάζουν μηειδική δέσμευση και κατά συνέπεια το μη ειδικό σήμα είναι ελάχιστο. Έχουν όμως τομειονέκτημα της χαμηλότερης ευαισθησίας διότι είναι πιθανόν ο μοναδικόςαντιγονικός επίτοπος στον οποίον στοχεύουν ή να καταστραφεί ή να «καλυφθεί» κατάτις διαδικασίες προετοιμασίας του ιστού.Η παρουσία ή μη της υπό μελέτης πρωτεΐνης στον ιστό που εξετάζουμε θα γίνειμε το σύστημα ανίχνευσης. Υπάρχουν πολλά συστήματα ανίχνευσης τα οποίαστηρίζονται είτε στη χρήση φθορίζουσων ουσιών είτε στη χρήση ενζύμων, όπου τοπροϊόν της κατάλυσής τους είναι μια χρωμοφόρος ουσία κα μπορεί να παρατηρηθείστο φωτονικό μικροσκόπιο. Τα πιο συχνά χρησιμοποιούμενα ένζυμα είναι ηυπεροξειδάση και αλκαλική φωσφατάση. Η υπεροξειδάση που χρησιμοποιείταιευρύτερα λειτουργεί προκαλώντας οξείδωση στο υπόστρωμα διαμινοβενζιδίνη (DAB)και το χρωμοφόρο προϊόν της αντίδρασης είναι αυτό που παρατηρείται στομικροσκόπιο.Ανάλογα με τον τρόπο σύνδεσης του ενζύμου στο ειδικό πρώτο αντίσωμαδιακρίνουμε τις παρακάτω παραλλαγές της ανοσοϊστοχημείας:α) Άμεση μέθοδοςΣτη μέθοδο αυτή το ένζυμο είναι συνδεδεμένο άμεσα με το ειδικό (πρωτογενές)αντίσωμα. Στη συνέχεια προστίθεται η DAB και έτσι αναδεικνύονται οι θέσειςδέσμευσης του ενζύμου στο φωτονικό μικροσκόπιο.β) Έμμεση μέθοδος δύο βημάτων Στην έμμεση μέθοδο ή σύνδεση του ενζύμου δενγίνεται απευθείας με το ειδικό αντίσωμα άλλα παρεμβάλλεται ένα δεύτερο αντίσωμα.Το δεύτερο αντίσωμα στρέφεται προς αντιγονικούς επιτόπους του πρώτουαντισώματος (αντι-αντισώματα) και φέρει χημικά συνδεδεμένο το ένζυμο. Έτσι μετάτην τοποθέτηση του ειδικού αντισώματος και την επώαση του στον ιστό ακολουθεί ητοποθέτηση του δεύτερου αντισώματος που φέρει το ένζυμο και εν συνεχείαπροστίθεται το DAB. Ο στόχος της έμμεσης μεθόδου είναι η ενίσχυση του σήματος ηοποία επιτυγχάνεται διότι το δεύτερο αντίσωμα μπορεί να προσκολληθεί σε πολλούς

αντιγονικούς τόπους του πρώτου.Σχήμα 1 Έμμεση ανοσοϊστοχημική μέθοδος δύο βημάτων.96γ) Έμμεση μέθοδος των τριών βημάτωνΗ συχνότερα χρησιμοποιούμενη είναι η μέθοδος στρεπταβιδίνης βιοτίνης. Στημέθοδο αυτή το ένζυμο προσδένεται χημικά με την βιοτίνη. Το δεύτερο αντίσωμα πουχρησιμοποιούμε (αντιαντίσωμα) είναι ουσιαστικά ο συνδετικός κρίκος (link) μεταξύτου ειδικού αντισώματος και του συμπλέγματος στρεπταβιδίνης–ενζύμου. Φέρεισυνδεδεμένο στο Fe τμήμα μόρια βιοτίνης με τα οποία συνδέεται η στεπταβιδίνη τουσυμπλέγματος στρεπταβιδίνη–ένζυμο. Τέλος προστίθεται το χρωμογόνο DAB. Ηστρεπταβιδίνη προέρχεται από το βακτήριο Streptomyces avidinii και δημιουργεί ένασταθερό σύμπλεγμα με το ένζυμο που διατηρείται πολλά χρόνια. Η παραλλαγή αυτήτης ανοσοϊστοχημικής μεθόδου επιφέρει μεγάλη ενίσχυση του σήματος καιχαρακτηρίζεται έτσι από μεγάλη ευαισθησία. Επιπλέον λόγω της χαμηλής σύνδεσηςτης στρεπταβιδίνης με μη ειδικές θέσεις έχει και μεγάλη ειδικότητα.Σχήμα 2 Ανοσοϊστοχημική μέθοδος αβιδίνης/ βιοτίνης/ υπεροξειδάσης. Όπως και η μέθοδος τηςστρεπταβιδίνης / βιοτίνης αποτελεί μια έμμεση τριών σταδίων παραλλαγή της ανοσοϊστοχημικήςτεχνικής, χρησιμοποιείται όμως λιγότερο συχνά.

Εφόσον ολοκληρωθεί η ανοσοϊστοχημική τεχνική γίνεται χρώση των πυρήνωντων κυττάρων του ιστού με αιματοξυλίνη, σταδιακή αφυδάτωση του με διέλευση τωντομών από διαλύματα αυξανόμενης συγκντρωσης αλκοόλης και επικόλλησης τωνκαλυπτρίδων. Η εκτίμηση της χρώσεως (παρουσία ή όχι της μελετούμενης πρωτεΐνης)γίνεται στο φωτονικό μικροσκόπιο ή στο μικροσκόπιο φθορισμού αναλόγως τουσυστήματος ανίχνευσης που χρησιμοποιείται.Όπως όλες οι τεχνικές που χρησιμοποιούνται στην εργαστηριακή καικλινικοεργαστηριακή έρευνα, έτσι και η ανοσοϊστοχημεία χαρακτηρίζεται απόπλεονεκτήματα και μειονεκτήματα. Ορισμένα απ’ αυτά αναφέρονται παρακάτω.Πλεονεκτήματα ανοσοϊστοχημικών τεχνικών• Η μέθοδος της ανοσοϊστοχημείας μας δίνει τη δυνατότητα να εξετάσουμε άμεσατην ετερογένεια του ιστού (π.χ. νεοπλάσματος) τη μορφολογία των κυττάρων, τηνεντόπιση της ανοσοχρώσης (πυρήνας – κυτταρόπλασμα – εξωκυττάριος χώρος)και άρα το κυτταρικό διαμέρισμα που εκφράζεται η πρωτεΐνη που μελετούμε.Επιπλέον μας επιτρέπει να γνωρίζουμε ποιος κυτταρικός πληθυσμός εκφράζει τη

συγκεκριμένη πρωτεΐνη (διάκριση μεταξύ νεοπλασματικών κυττάρων καιφυσιολογικών), γεγονός που είναι δύσκολο να το συμπεράνουμε χρησιμοποιώνταςβιοχημικές τεχνικές.• Μας επιτρέπει επίσης να γνωρίζουμε το ποσοστό των κυττάρων που εκφράζουν μια συγκεκριμένη πρωτεΐνη π.χ. υποδοχέα. Αυτό έχει ιδιαίτερη σημασία σεασθενείς με νεοπλάσματα που λαμβάνουν ορμονική θεραπεία. Στην περίπτωσηαυτή ένα νεόπλασμα με χαμηλή κυτταροβρίθεια θα έδινε ψευδώς αρνητικάαποτελέσματα με χρήση βιοχημικών μεθόδων.98• Η ανοσοϊστοχημεία είναι απλή, γρήγορη, και οικονομική τεχνική και άρα εύκολαεφαρμόσιμη.• Τα αποτελέσματα της ανοσοϊστοχημείας είναι μόνιμα. Η χρώση μπορεί ναδιατηρηθεί για χρόνια και να χρησιμοποιηθεί σε αναδρομικές μελέτες αρκεί οιτομές να φυλάσσονται στο σκοτάδ.• Επιτρέπει την ποσοτική εκτίμηση των αποτελεσμάτων ιδίως με τις σύγχρονεςτεχνικές ανάλυσης εικόνας.Μειονεκτήματα ανοσοϊστοχημικών τεχνικών• Η διαδικασία της μονιμοποίησης είναι δυνατόν να αλλοιώσει τη δομή τωνπρωτεϊνών και να προκύψουν ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα πράγμα που δενσυμβαίνει με τις βιοχημικές μεθόδους.• Η εκτίμηση της ανοσοχρώσης ενέχει στοιχεία υποκειμενικότητας καθιστώντας τηνανοσοϊστοχημεία όχι την καταλληλότερη μέθοδο για ποσοτικούς προσδιορισμούς.• Οι πληροφορίες που μας παρέχονται από την τεχνική αυτή αφορούν μόνο τοεπίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης τη συγκεκριμένη χρονική στιγμή που γίνεται ημελέτη ενώ δεν μας πληροφορούν για το ρυθμό έκφρασης. Επιπλέον δεν μας δίνειστοιχεία για τις αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών ούτε για το επίπεδο της ενεργότηςένζυμων.• Η χρήση του DAB είναι καρκινογόνος.Συμπερασματικά μπορούμε να πούμε ότι η βελτίωση που διενεργείται στιςτεχνικές ανάλυσης εικόνας καθώς και η χρήση της ηλεκτρονικής μικροσκοπίας πουεπιτρέπει την εντόπιση της ανοσοχρώσης σε επίπεδο υποκυτταρικού διαμερίσματοςθα πολλαπλασιάσουν στο εγγύς μέλλον τις χρήσεις της μεθόδου αυτής. Είναι γεγονόςόμως ότι για την πολύπλευρη και πληρέστερη κατανόηση των πολύπλοκωνβιολογικών φαινομένων απαιτείται η γνώση από την πλευρά του ερευνητή και άλλωντεχνικών εργαστηριακής έρευνας.Στην παρούσα μελέτη προκειμένου να εκτιμηθούν τα επίπεδα έκφρασης της ILKστα ανθρώπινα αστροκυττώματα χρησιμοποιήθηκε η

έμμεση ανοσοϊστοχημικήτεχνική τριών βημάτων βιοτίνης – στρεπταβιδίνης – υπεροξειδάσης.Αναλυτική περιγραφή της μεθόδου που εφαρμόστηκε για την μελέτη τωνεπιπέδων έκφρασης των ING-4, p65, MMP-2, MMP-9, u-PA στα ανθρώπινααστροκυττώματα• Αποπαραφίνωση των τόμων: ολονύχτια τοποθέτηση των τομών σε φούρνοθερμοκρασίας 56ο C, εμβάπτιση 5 min στη ζεστή ξυλόλη Ι (56ο C), 5 min στηζεστή ξυλόλη ΙΙ (56ο C), 5 min στη ζεστή ξυλόλη ΙΙΙ (56ο C), και 5 min στην κρύαξυλόλη (θερμ. δωματίου).• Ενυδάτωση των τομών σε κατιούσα συγκέντρωση αλκοολών:Εμβάπτιση των τόμων σε αλκοόλες 100ο, 96ο, 80ο, 70ο, 5min στην καθεμία, καιξέπλυμα των πλακιδίων με απιονισμένο Η2Ο στο τέλος.• Ανάδειξη αντιγονικών θέσεων. Κάλυψη των τόμων με διάλυμα κιτρικού Να(10mΜ, pΗ=6) και τοποθέτηση στον φούρνο μικροκυμμάτων(στα 800watt x2minκαι στα 300watt x7 min). Εν συνεχεία επάνοδος των τομών σε θερμοκρασίαδωματίου και ξέπλυμα με δ/μα TBS για 10 min, δύο φορές. Στην περίπτωση τηςMMP-2 το στάδιο αυτό παραλείφθηκε ενώ στην περίπτωση του u-PAχρησιμοποιήθηκε EDTA αντί του κιτρικού οξέως.• Κατανάλωση της ενδογενούς υπεροξειδάσης. Εμβάπτιση των τόμων σε διάλυμαΗ2Ο2 1% σε απιονισμένο Η2Ο για 20 min. Εν συνεχεία ξέπλυμα των τόμων μεαπιονισμένο Η2Ο (2 φορές x 10 min) και με διάλυμα TBS (2 φορές x 10 min).100• Protein blocking. Επικάλυψη των τόμων με διάλυμα TBS-BSA 1% για 10 min.• Τοποθέτηση του ειδικού αντισώματος για τo κάθε μόριο στην κατάλληλη αραίωσηκαι για τον κατάλληλο χρόνο επώασης. (βλεπε πίνακα 2).• Έκπλυση των τόμων με διάλυμα TBS (3 φορές x 10 min)• Τοποθέτηση του αντιδραστηρίου envision (DAKO rabbit,mouse Lot 44771) στορόλο του δεύτερου και τρίτου αντισώματος.• Ξέπλυμα των τόμων με διάλυμα TBS (3 φορές x 10 min)• Ανίχνευση των θέσεων δέσμευσης της υπεροξειδάσης με επικάλυψη τομών μεδιάλυμα τετρανδροχλωρικής διαμινοβενζίδίνης (DAB) (DAKO K5007) για χρόνο5 min σε θερμοκρασία δωματίου σε σκοτεινό χώρο.• Έκπλυση των τόμων με απιονισμένο Η2Ο 3 φορές x 5 min.• Χρώση αντίθεση των πυρήνων (counterstaining) με αιματοξυλίνη Harris καιέπλυμα με τρεχούμενο νερό βρύσης για απομάκρυνση της περίσσειας.

• Στιγμιαία εμβάπτιση στην όξινη αλκοόλη και ξέπλυμα με τρεχούμενο H2O.• Διέλευση των τόμων από διαλύματα αλκοολών συνεχώς αυξανομένηςσυγκέντρωσης 70ο, 80ο, 96ο, 100ο. Εμβάπτιση σε ξυλόλη και επικόλληση τωνκαλυπτρίδων.Διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν :• Διάλυμα Tris: 6,1 Tris σε 500 ml H2O ρύθμιση το pH σε 7,6 με πυκνό HCl.• Διάλυμα κιτρικού Να+: 2,1 gr κιτρικού Να+ σε 1 lit απιον. H2O ρύθμιση του pH =6 με π. HCl.• Διάλυμα EDTA• Διάλυμα NaCl: 900 ml απιονισμένο H2O + 8,1 gr NaCl.• Διάλυμα (Tris Buffer Saline) TBS 5 mM: 900 ml δ/τος NaCl +100 ml δια/τος Tris• Διάλυμα TBS/BSA 5%: 4 ml δ/τος TBS + 0,2 gr Bovine Serum Albumin101• Διάλυμα όξινης αλκοόλης: 105 ml απόλυτης αλκοόλης + 45 mlαπιονισμένο H2O + 1,5 ml πυκνού HCl• Διαλυμα Η2Ο2 30%

Αξιολόγηση της ανοσοϊστοχημικής χρώσεωςΗ αξιολόγηση των τομών έγινε στο φωτονικό μικροσκόπιο σε μεγέθυνση 1:20και 1:40. Εκτιμήθηκε η ετερογένεια του νεοπλάσματος, η ένταση και η κατανομή τηςανοσοχρώσης, που υποδηλώνει το επίπεδο έκφρασης της αντίστοιχης πρωτείνης, σεότι αφορά το κυτταρικό διαμέρισμα και το είδος του κυττάρου που εμφανίζεταιθετικό. Η ένταση της ανοσοχρώσεως αξιολογήθηκε ως ασθενής, μέτρια και ισχυρή(+,++,+++) με βάση τη διαβάθμιση του καφέ χρώματος του προϊόντος της οξείδωσηςτης DAB από την υπεροξειδάση. Η ακριβής εκτίμηση του ποσοστού των θετικώνκυττάρων ανά τομή έγινε ως εξής: Επιλέχθηκαν τυχαία δέκα οπτικά πεδία ανά τομήστη μεγέθυνση x 40. σε κάθε οπτικό πεδίο μετρήθηκαν τα θετικά κύτταρα και τοσύνολο των κυττάρων του όγκου. Η άθροιση των τιμών αυτών και για τα δέκα οπτικάπεδία οδήγησε στο ποσοστό των θετικών καρκινικών κυττάρων ανά τομή. Ηβαθμονόμηση της κατανομής έγινε ως εξής: score 0 : ποσοστό θετκών κυττάρων<10%, score + : ποσοστό θετικών κυττάρων 10-40%, score ++: ποσοστό θετικώνκυττάρων 40-80% , score +++: ποσοστό __________θετκών κυττάρων >80%. Συνδυάζοντας την

ένταση και την κατανομή της χρώσης προέκυψε το τελικό συνδυασμένο score όπωςφαίνεται στον πίνακα που ακολουθεί.(πίνακας 3). Στην περίπτωση του p65 η πυρηνικήκαι η κυτταροπλασματική χρώση αξιολογήθηκαν χωριστά ως προς την ένταση καιτην κατανομή τους. Η ολική χρώση προέκυψε από την άθροιση τηςκυτταροπλασματικής και της πυρηνικής χρώσης (πίνακας 4).Στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτωνΗ στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων έγινε με τη βοήθεια του στατιστικούπακέτου SPSS 10. Για κάθε ομάδα αποτελεσμάτων υπολογίσθηκε η μέση τιμή τωνποσοστών θετικότητας και η τυπική απόκλιση, ενώ η κατανομή των τιμώνπαρουσιάζεται γραφικά με τη μορφή ιστογράμματος.103Για τη σύγκριση των ποσοστών θετικότητας μεταξύ των διαφόρων ομάδωννεοπλασμάτων εφαρμόσθηκε ο στατιστικός έλεγχος one – way ANOVA και ο Tukeytest post- hoc analysis.ΤελικόScore ένταση κατανομή0 0 <10%1+ή ++++/++++2++ή +++ ++/++++3 +++ ++/+++Πίνακας 3 Πίνακας 4Άθροισηπυρηνικής+κυτταρο-πλασματικήςΤελικό score1-2 13-4 25-6 3104105

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ106

Η έκφραση του ING-4 ελαττώνεται με την αύξηση του grade τουόγκου.

Στο φυσιολογικό εγκεφαλικό ιστό καθώς και στο γειτονικό του όγκουφυσιολογικό εγκεφαλικό παρέγχυμα υπάρχει ισχυρή πυρηνική έκφραση της ING-4πρωτείνης εντοπιζόμενη τόσο στα γλοιακά κύτταρα όσο και στους νευρώνες. Εκ τουσυνόλου των όγκων ισχυρή πυρηνική ανοσοχρώση της ING-4 εμφανίστηκε σε 28 απότα 101 νεοπλάσματα (27.7%) μέτριας έντασης ανοσοχρώση εμφανίστηκε σε 21 απότα 101(20.8%) νεοπλάσματα, ενώ ασθενής ανοσοχρώση σε 7 από τα 101 (6.9%)νεοπλάσματα. Δεν υπήρχε ισχυρή στατιστική συσχέτιση της ανοσοχρώσης μεταξύτων ηλικιακών ομάδων των ασθενών ούτε μεταξύ άρρενος και θήλεως φύλου.Ωστόσο, εμφανίστηκε ισχυρή αρνητική στατιστική συσχέτιση της έκφρασης τουING-4 και του βαθμού διαφοροποίησης του όγκου (grade) με τα γλοιοβλαστώματα(grade IV) να εμφανίζουν χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης του ING-4 σε σχέση με τααναπλαστικά αστροκυτώματα (grade III) και ακόμη χαμηλότερο σε σχέση με τουςκαλώς διαφοροποιημένους αστροκυτταρικούς όγκους (grade I,II)(p<0.001) (βλέπεπίνακα 1, διάγραμμα 1).107Πίνακας 1 Συσχέτηση της έκφρασης του ING-4 με κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους.NING4 expressiona pvalueb

0 1 2 3n (%) n (%) n (%) n (%)GLIOMAS101 45 (44.5) 7 (0.6) 21 (20.7) 28 (27.7)Age<20 5 4 (80) 1 (20) 0 (ο) 0 (ο)20-50 32 22 (68.8) 8 (25) 2 (6.3) 0 (0)>50 64 47 (73) 12 (18.8) 5 (7.8) 0 (0)SexM 45 33 (73.3) 8 (17.8) 4 (8.9) 0 (0)F 56 40 (71.4) 13 (23.2) 3 (5.4) 0 (0)GradeGrade 1/II 11 2 (18.2) 7 (63.6) 2 (18.2) 0 (0) <0.001Grade III 18 13 (72.2) 2 (11.1) 3 (16.7) 0 (0)Grade IV 72 58 (80.6) 12 (16.7) 2 (2.8) 0 (0)

108. ING-4,00 1,00 2,00Count706050403020100

gradeGrade I/ΙΙGrade IIIGrade IV

Διάγραμμα 1Χαμηλού βαθμού αστροκύττωμα. Αναπλαστικό αστροκύττωμα. Μικρότερο ποσοστό κυττάρωνΔιακρίνεται έντονη πυρηνική χρώση για το ING-4 εμφανίζουν θετική ανοσοχρώση.109Πλειόμορφο γλοιοβλάστωμα. Εξάλειψη πυρηνικής Φυσιολογικός εγκέφαλος. Παρατηρείται πυρηνική ανοσοχρώσηανοσοχρώσης ING-4 στα αστροκύτταραΧαμηλού βαθμού αστροκύττωμα x40. Αυξημένη Γλοιοβλάστωμα.x40 Εξάλειψη της πυρηνικής χρώσης γιαπυρηνική ανοσοχρώση για το ING-4. το ING-4Η έκφραση του NF-κB (p65) αυξάνεται με την αύξηση του grade του όγκου τόσοη κυτταροπλασματική όσο και η πυρηνική της εντόπιση.110Ο φυσιολογικός νευρικός ιστός και το γειτονικό νευρικό παρέγχυμα του όγκουεμφάνισε ασθενή πυρηνική και κυτταροπλασματική έκφραση του p65 στα κύτταραγλοίας και στους νευρώνες. Σε αντίθεση τα κύτταρα του όγκου εμφάνισαν πυρηνικήκαι κυτταροπλασματική χρώση σε 94 από τα 101 (93.1%) και 92 από τα 101 (91.1% )περιστατικά αντίστοιχα. Η έκφραση του p65 τόσο η κυτταροπλασματική όσο και ηπυρηνική υπήρξε σημαντικά υψηλότερη στα λοιοβλαστώματα (gradeIV) σε σχέσημε τα αναπλαστικά αστροκυττώματα (gradeIII) και τα καλώς διαφοροποιημένααστροκυττώματα (gradeI,II) (p<0.001). Δεν ανεδείχθη σημαντική στατιστικήσυσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του p65 και της ηλικίας και του φύλλου τωνασθενών (πίνακας 2, διάγραμμα 2,3).Επιπρόσθετα παρατηρήθηκε σημαντική στατιστικά αρνητική συσχέτιση μεταξυ τηςέκφρασης του ING-4 και της έκφρασης του p65.(r=-0.326,p=0.001 για την ολικήέκφραση του p65, r=-0.290, p=0.003 για την πυρηνική χρώση του p65 και r=-0.326,p=0.001 για την κυτταροπλασματική χρώση του p65).nuclear-p65,00 1,00 2,00 3,00Count50403020100gradeGrade IVGrade IIIGrade I/ΙΙ

Διάγραμμα 2111

cytop-p65,00 1,00 2,00 3,00Count403020100gradeGrade I/ΙΙGrade IIIGrade IVΔιάγραμμα 3112Πίνακας 2 Συσχέτιση της έκφρασης του p65 με κλινικοπαθολογικές παραμέτρουςN Nuclear p65a pvalueb

Cytoplasmic p65a pvalueb

0 1 2 3 0 1 2 3n(%)n(%)n(%)n(%)n(%)n(%)n(%)n(%)

GLIOMAS101 23(33.3)11(15.9)22(31.9)13 (18.8)

Age<20 5 0(0)3(60)2(40)0(0)0(0)2(40)

2(40)1(20)

20-50 32 2(6.3)13(40.6)15(46.9)2(6.3)2(6.3)7(21.9)14(43.8)9(28.1)

>50 64 5(7.8)22(34.4)28(43.8)9(14.1)7(6.9)16(25)20(31.3)21(32.8)

sexM 45 3(6.7)15(33.3)22(48.9)5(11.1)5(11.1)13(28.9)14(31.1)13(28.9)

F 56 4(7.1)23(41.1)23(41.1)6(10.7)4(7.1)12(21.4)22(39.3)

18(32.1)

GradeGrade I/II 11 1(9.1)8(72.7)2(18.2)0(0)0.001 1(9.1)7(63.6)3(27.3)0(0)<0.001

Grade III 184(22.2)8(44.7)5(27.8)1(5.6)4(22.2)6(33.3)6(33.3)2(11.1)

Grade IV 72 2(2.8)22(30.6)38(52.8)10(13.9)4(5.6)12(16.7)27(37.5)29(40.3)

113Χαμηλού βαθμού αστροκύττωμα. Ασθενής πυρηνική Αναπλαστικό αστροκκύτωμα. Διακρίνεται κυτταροπλασματικήκαι κυτταροπλασματική χρώση για τον p65 και πυρηνική ανοσοχρώση για τον p65.Πλειόμορφο γλοιοβλάστωμα. Παρατηρείται έντονη Φυσιολογικός εγκέφαλος.κυτταροπλασματική και πυρηνική ανοσοχρώση για τον p65

114p65. Χαμηλού βαθμού αστροκύττωμα x40 Γλοιοβλάστωμα x40. Έντονη πυρηνική και κυτταροπλα-σματική χρώση για τον p65.Αύξηση της MMP-9 ανοσοχρώσης σε σχέση με το grade του όγκου.Κυτταροπλασματική ανοσοχρώση για την MMP-9 παρατηρήθηκε σε 93/101 (92.1%)των όγκων ενώ δεν ανιχνεύθηκε ανοσοχρώση στο φυσιολογικό εγκεφαλικόπερέγχυμα. Τα επίπεδα έκφρασης της MMP-9 συσχετίζονται στατιστικά σημαντικάμε το βαθμό διαφοροποίησης του αστροκυττώματος με τα γλοιβλαστώματα (gradeIV) να εμφανίζουν υψηλότερα επίπεδα έκφρασης συγκριτικά με τα αναπλαστικάαστροκυττώματα (grade III) και τους καλά διαφοροποιημένους όγκους ( grade I,II)(P<0.001), πίνακας 3, διάγραμμα 4. Δεν παρατηρήθηκε στατιστική συσχέτιση μεταξύ τηςέντασης της ανοσοχρώσης και της ηλικίας ή του φύλλου των ασθενών. Σημαντικήθετική στατιστική συσχέτιση προέκυψε μεταξύ της έκφρασης της MMP-9 και τηςέκφρασης του p65 (r=0.415, p<0.001 για την ολική έκφραση του p65, r=0.399,p<0.001 για την πυρηνική χρώση του p65 και r=0.393, p<0.001για τηνκυτταροπλασματική χρώση του p65). Αντιθέτως ισχυρή αρνητική στατιστική115συσχέτιση αποκαλύφθηκε μεταξύ της έκφρασης της MMP-9 και των επιπέδωνέκφρασης του ING-4 (r=-0.264,p=0.008).Ανοσοιστοχημική έκφραση της MMP-2.Όπως και με την MMP-9 η έκφραση της MMP-2 ήταν ανύπαρκτη στοφυσιολογικό εγκεφαλικό παρέγχυμα ενώ 99/101 (98%) των αστροκυττωμάτωνεμφάνισαν κυτταροπλασματική ανοσοχρώση. Η στατιστική ανάλυση τωναποτελεμάτων ανέδειξε ισχυρή στατιστική συσχέτιση του ποσοστού των κυττάρωνκαι της έντασης της ανοσοχρώσης με το βαθμό διαφοροποίησης του όγκου.Αυξημένη ένταση της χρώσης παρατηρήθηκε στα γλοιοβλαστώματα σε σχέση με τααναπλαστικά γλοιώματα και τα χαμηλού βαθμού αστροκυττώματα (p<0.001). Δενπαρατηρήθηκε στατιστική διαφορά στην ένταση της ανοσοχρώσης σε σχέση με τοφύλλο και την ηλικία. Η έκφραση της MMP-2 σχετίζεται στατιστικά σημαντικά μετην έκφραση της MMP-9 (r=0.393, p<0.001) και την έκφραση του p65 (r=0.300,p=0.002 για την ολική έκφραση του p65, r=0.270, p=0.006 για την πυρηνική χρώσητου p65, r=0.261 p=0.008 για την κυτταροπλασματική χρώση του p65) πίνακας 3,διάγραμμα5.. Aνιχνεύθηκε μια τάση προς αρνητική συσχέτιση μεταξύ MMP-2 και ING-4 (r=-0.186, p=0.062).

Πίνακας 3 Συσχέτιση της έκφρασης της MMP-9, MMP-2 με κλινικοπαθολογοανατομικέςπαραμέτρους.118Χαμηλή έκφραση της MMP-9 σε low grade astrocytoma Αυξημένη πυρηνική έκφραση της MMP-9 στα. αναπλαστικά _____αστροκυττώματα.Αυξημένη κυτταροπλασματική ανοσοχρώση για την MMP-9 Πολύ χαμηλή κυτταροπλασματική έκφραση της MMP-9καθώς και χρώση της μεσοκυττάριας ουσίας στα πολύμορφα στον φυσιολογικό εγκέφαλο.γλοιοβλαστώματα.119Μηδαμινή έκφραση της MMP-9 στα χαμηλού βαθμού Γλοιοβλάστωμα x40. Αυξημένη κυτταροπλασματικήαστροκυττώματα. x40 έκφραση MMP-9Χαμηλού βαθμού αστροκύττωμα x40. Ασθενής χρώση Γλοιωβλάστωμα x40. Έντονη κυτταροπλασματικήγια την MMP-2. χρώση για την MMP-2120Χαμηλή κυτταροπλασματική έκφραση της MMP-2 στα lowgrade astrocytomaΑυξημένη κυτταροπλασματική έκφραση της MMP-2 Μηδαμινή έκφραση της MMP-2 στο φυσιολογικόστα γλοιοβλαστώματα εγκέφαλο.121

Ανοσοιστοχημική έκφραση του u-PAΚυτταροπλασματική ανοσοδραστικότητα για το u-PA παρατηρήθηκε σε 89/101(88.1%) των εξετασθέντων όγκων ενώ δεν παρατηρήθηκε ανοσοχρώση στοφυσιολογικό εγκεφαλικό παρέγχυμα. Αυξημένη ένταση και κατνομή τηςανοσοχρώσης παρατηρήθηκε στα γλοιοβλαστώματα σε σχέση με τα αναπλαστικάαστροκυττώματα και τα καλώς διαφοροποιημένα αστροκυττώματα (p<0.001), ενώδεν παρατηρήθηκε στατιστική συσχέτηση με την ηλικία και το φύλλο του ασθενούς.Η έκφραση του u-PA εμφάνισε ισχυρή στατιστική συσχέτιση με την έκφραση του p65(r=0.277,p=0.005 για την ολική έκφραση του p65, r=0.248, p=0.12 για την πυρηνικήέκφραση και r=0.265, p=0.007 για την κυτταροπλασματική έκφραση. Ισχυρήσυσχέτιση επίσης παρατηρήθηκε ως προς την έκφραση του MMP-9 (r=0.427,p<0.001) και την έκφραση του MMP-2 (r=0.358, p<0,001). Aσθενής αρνητικήσυσχέτιση εμφανίσθηκε μεταξύ της έκφρασης του u-PA και του ING-4 (r=-0.192,p=0.054) (πίνακας 4,διάγραμμα 6).

Πίνακας 4. Συσχέτιση της έκφρασης του u-PA με κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους.123ING4 r/p-value

0 1 2Total p65 -326/0.0010 4 (4%) 1 (1%) 2 (2%)1 12 (11.9%) 8 (7.9%) 3 (3%)2 31 (30.7%) 9 (8.9%) 2 (2%)3 26 (25.7%) 2(3%) 0 (0%)Nuclear p65 -0.290/0.0030 4(4%) 1 (1%) 2 (2%)1 22 (21.8%) 13(12.9%) 3 (3%)2 37 (36.6%) 7 (6.9%) 1(1%)3 10(9.9%) 0(0%) 1(1%)Cytoplasmic p65 -0.323/0.0010 4 (5%) 2 (2%) 2 (2%)1 14 (13.9%) 7(6.9%) 4 (4%)2 26(25.7%) 8 (8.9%) 1 (1%)3 28(27.7%) 3 (3%) 0(0%)MMP9 -0.264/0.0080 2(2%) 4 (4%) 2 (2%)1 16 (15.8%) 6 (5.9%) 1(1%)2 23 (22.8%) 7(6.9%) 2 (2%)3 32 (31.7%) 4(4%) 2(2%)MMP2 -0.186/0.0620 1 (1%) 0 (0%) 1 (1%)1 8 (7.9%) 7 (6.9%) 2 (2%)2 36(35.6%) 9 (8.9%) 1 (1%)3 28(27.7%) 5 (5%) 3 (3%)UPA -0.129/0.054018(7.9%)10(9,9%)3(3%)9(8.9%)1(1%)3(3%)2 47(46.5%) 7(6.9%) 1(1%)3 8(7.9%) 2(2%) 2(2%)Πίνακας 5. Συσχέτιση της έκφρασης του ING-4 με p65, MMP-9, MMP-2, u-PA124Nuclear p65 r/p-value0 1 2 3

MMP9 0.399/0.0010 2 (2%) 6 (5.9%) 0(0%) 0(0%)1 1 (1%) 15 (14.9%) 6 (45.9%) 1 (1%)2 2 (2%) 9 (8.9%) 17 (16.8%) 4 (4%)3 2 (2%) 8 (7,9%) 22 (21.8%) 6 (54.5%)MMP2 0.270/0.0060 1(1%) 1 (1%) 0 (0%) 0(0%)1 3 (3%) 8(7.9%) 5 (5%) 1 (1%)2 3 (30%) 17 (16.8%) 21(20.8%) 5(5%)3 0(0%) 12(11.9%) 19(18.8%) 5(5%)UPA 0.265/0.0070 3 (3%) 5 (5%) 2 (2%) 2 (2%)1 1 (1%) 13 (12.9%) 7 (6.9%) 1(1 %)2 2(2%) 17 (16.8%) 30 (29.7%) 6 (5.9%)3 1(1%) 3 (3%) 6(5.9%) 2 (2%)Πίνακας 6 Συσχέτιση της έκφρασης του nucler p65 με MMP-9, MMP-2,u-PAΧαμηλή έκφραση του u-PA στα χαμηλής διαφορροποίησης Αυξημένη κυτταροπλασματική έκφραση του u-PA στααστροκυττώματα. αναπλαστικά αστροκυττώματα.125Έντονη κυτταροπλασματική ανοσοχρώση του u-PA στα Δεν ανιχνεύεται ανοσοχρώση για το u-PA στονγλοιοβλαστώματα. φυσιολογικό εγκέφαλο.Χαμηλή έκφραση του u-PA στα χαμηλού βαθμού Πολύ έντονη κυτταροπλασματική χρώση για τοαστροκυττώματα x40. u-PA στα γλοιοβλαστώματα. X40126127

ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΤΩΝΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ128Στην παρούσα μελέτη αναδείχθηκε πολύ μειωμένη πυρηνική ανοσοχρώση τηςογκοκατασραλτικής πρωτεΐνης ING-4 στα αστροκυττώματα που μελετήθηκαν σεσχέση με το φυσιολογικό εγκεφαλικό ιστό. Το γεγονός αυτό υποδηλώνει τον πιθανόρόλο του ING-4 στη δημιουργία των νεοπλασμάτων αυτών, υπόθεση η οποίαυποστηρίζεται και από πρόσφατες μοριακές μελέτες στις οποίες έχει μελετηθεί ορόλος του σε κυτταρικές σειρές νεοπλασμάτων του μαστού και της κεφαλής καιτραχήλου71 H υπόθεση αυτή επιπλέον υποστηρίζεται από το γεγονός ότι είναι συχνή ηαπώλεια του χρωμοσωμικού τόπου 12-p13.3 στην οποία εδράζεται το

ογκοκατασταλτικό γονίδιο ING-469,72Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης υποδεικνύουν επιπλέον ότι η απώλειατης έκφρασης της ογκοκατασταλτικής πτωτεΐνης ING-4 σχετίζεται με την προαγωγήτου όγκου προς περισσότερο αδιαφοροποίητα νεοπλάσματα. Η υπόθεση αυτήστηρίζεται στη μείωση της πυρηνικής έκφρασης του ING-4 στα γλοιβλαστώματα καιστα αναπλαστικά σε σχέση με τα καλώς διαφοροποιημένα αστροκυττώματα. Ταδεδομένα αυτά βρίσκονται σε συμφωνία με πρόσφατα δημοσιευμένες in vivo μελέτεςσε κυτταρικές σειρές πολλαπλού μυελώματος και γλοιοβλαστώματος οι οποίεςπαρουσίαζουν αρνητική συσχέτιση μεταξύ έκφρασης του ING-4 και του grade τουόγκου73,74. Λαμβάνοντας υπόψιν τα δεδομένα αυτά οδηγούμαστε στο συμπέρασμα ότιη απώλεια της πυρηνικής χρώσης του ING-4 πιθανώς σχετίζεται τόσο με τηνπαθογένεια όσο και με την προαγωγή των αστροκυττωμάτων.Aρκετά μεγάλος αριθμός μελετών αφορά στη ρύθμιση γονιδίων από τονμεταγραφικό παράγοντα NF-κB τα οποία είναι σημαντικοί ρυθμιστές θεμελιωδώνδιαδικασιών στην κακοήθη εξαλλαγή όπως ο πολλαπλασιασμός, η κυτταρικήμετανάστευση, η διήθηση, η νεοαγγείωση και η μετάσταση75. Στην παρούσα μελέτηαναδεικνύεται υψηλή κυτταροπλασματική και πυρηνική ανοσοέκφραση για την p65υπομονάδα του NF-κB στους αστροκυτταρικούς όγκους σε σχέση με το φυσιολογικόεγκεφαλικό παρέγχυμα, στοιχείο το οποίο υποδεικνύει τον πιθανό ρόλο του στην129παθογένεια της δημιουργίας των αστροκυττωμάτων. Επιπρόσθετα στην παρούσαεργασία αναδεικνύεται σαφώς ισχυρή θετική συσχέτιση της πυρηνικής, τηςκυτταροπλασματικής και της ολικής ανοσοέκφρασης του p65 με την ιστολογικήβαθμίδα διαφοροποίησης του αστροκυττώματος με τα αναπλαστικά αστροκυττώματακαι τα γλοιβλαστώματα να παρουσιάζουν υψηλότερη έκφραση σε σχέση με τα καλώςδιαφοροποιημένα νεοπλάσματα. Η παρατήρηση αυτή υποδηλώνει ότι η απορύθμισητης έκφρασης του NF-κB είναι πιθανόν ότι συμβάλει στην αύξηση της επιθετικότηταςτων όγκων αυτών.Τελευταίες μελέτες σε κυτταρικές σειρές γλοιοβλαστώματος αποκαλύπτουναλληλεπίδραση της ογκοκατασταλτικής πρωτεΐνης ING-4 και της υπομονάδας p65του NF-κB76. Στην παρούσα εργασία αποκαλύπτεται ισχυρή ανάστροφη στατιστικήσυσχέτιση μεταξύ της έκφρασης της πρωτεΐνης ING-4 και της υπομονάδας p65 τουNF-κB και η μείωση της έκφρασης του ING-4 συσχετίζεται ισχυρά με την αύξησητης έκφρασης του p65. Το γεγονός αυτό μας οδηγεί

δικαιολογημένα στην υπόθεση ότιείναι πιθανόν στα αστροκυττώματα να προκαλείται ενεργοποίηση του μοριακούμονοπατιού ING-4 / NF-κB και η απώλεια της έκφρασης του ING-4 να οδηγεί σεαυξημένη δραστηριότητα του μεταγραφικού παράγοντα NF-κB καθώς αυξάνει ηιστολογική διαβάθμιση (grading) του αστροκυττώματος. Παράλληλα επιπρόσθετηέρευνα υποδηλώνει ότι η ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη ING-4 εμπλέκεται στη ρύθμισητης αγγειογένεσης και κατ’επέκταση στην πρόοδο του όγκου λόγω τηςαλληλεπίδρασής της με τον μεταγραφικό παράγοντα NF-κB77. Οι παρατηρήσειςαυτές μας οδηγούν στο συμπέρασμα ότι η απώλεια της έκφρασης της πρωτεΐνης ING-4 στα αστροκυττώματα συμβάλει στην παθογένεια των όγκων αυτών αλλά και στηνπροαγωγή τους σε περισσότερο αδιαφοροποίητα νεοπλάσματα όπως το αναπλαστικόαστροκύττωμα και το πλειόμορφο γλοιβλάστωμα και ένας από τους μηχανισμούς μετους οποίους αυτό πραγματοποιείται είναι η απελευθέρωση της δράσης του NF-κBμεταγραφικού παράγοντα.Προκειμένου να εκτιμηθεί η ο ρόλος του ING-4 στην προαγωγή τωναστροκυττωμάτων προς περισσότερο αδιαφοροποίητους όγκους εξετάσαμε με τηντεχνική της binary logistic regression κατά πόσο τα πυρηνικά επίπεδα της ING-4πρωτεΐνης μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως ιστολογικοί δείκτες διάκρισης τωνυψηλής από χαμηλής διαφοροποίησης νεοπλασμάτων. Η ανάλυση αυτή καθόρισε ότιτα επίπεδα της ING-4 πρωτεΐνης μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως δείκτες δίακρισηςτων high grade από τα low grade αστροκυττώματα με ποσοστό ακρίβειας 89%γεγονός το οποίο ενισχύει την παραπάνω υπόθεση για τον ρόλο που διαδραματίζει ηογκοκατασταλτική αυτή πρωτεΐνη στην αύξηση της επιθετικότητας τωναστροκυττωμάτων.Η διηθητική ικανότητα των αστροκυττωμάτων είναι μια πολυσύνθετη βιολογικήδιεργασία η οποία περιλαμβάνει την κυτταρική προσκόλληση, την κυτταρικήμετακίνηση και την αποδόμηση στοιχείων της εξωκυττάριας ουσίας78. Σε ότι αφοράτην τελευταία διεργασία της διάσπασης της εξωκυττάριας ουσίας έχουν βρεθεί πολλάένζυμα που διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο σε αυτή όπως οι MMPs και το u-PA ταγονίδια των οποίων φέρουν στον υποκινητή τους ακολουθίες πρόσδεσης του NF-κB.Στην εργασία αυτή παρατηρήθηκε αυξημένη έκφραση του u-PA στα αστροκυττώματασε σχέση με το φυσιολογικό εγκεφαλικό παρέγχυμα και η έκφραση αυτή βρέθηκε νασχετίζεται σημαντικά με το grade του __________νεοπλάσματος. Αυτό είναι σε συμφωνία μεπαλαιότερες in vivo μελέτες που δείχνουν αυξημένη δραστηριότητα του u-PA σε

όγκους του Κ.Ν.Σ.79. Παρόμοιες μελέτες σε άλλα νεοπλάσματα δείχνουν αυξημένηέκφραση του u-PA σε σχεση με τον φυσιολογικό ιστό αλλά και θετική συσχέτιση τηςέκφραση σε σχέση με το grade του εοπλάσματος80. ΄Ενας μεγάλος πρωτεινών έχειβρεθεί να διαδραματίζει ρυθμιστικό ρόλο στην έκφραση του γονιδίου του u-PAμεταξύ των οποίων και ο NF-κB81) για τον οποίο υπάρχουν θέσεις πρόσδεσης στονυποκινητή του82,83. Σε συμφωνία με τις μελέτες αυτές στην ανωτέρω μελέτη βρέθηκεότι τα επίπεδα έκφρασης του NF-κB και του u-PA παρουσίασαν θετική συσχέτισητόσο μεταξύ τους όσο και με το grade του νεοπλάσματος γεγονός το οποίουποδηλώνει ότι στα αστροκυττώματα η έκφραση του u-PA βρίσκεται υπό τον έλεγχοτου μεταγραφικού παράγοντα NF-κB.131Όπως και το u-PA οι matrix metalloproteases εμπλέκονται στη διασπαση τωνμορίων της εξωκυττάριας ουσίας και στη διηθητική ικανότητα τωναστροκυττωμάτων84. Μεταξύ των MMPs οι σημαντικότερες για την διήθηση τωναστροκυττωμάτων είναι οι MMP-2 και MMP-985,86. Στη μελέτη αυτή βρέθηκεαυξημένη έκφραση τόσο της MMP-2 όσο και της MMP-9 στους αστροκυτταρικούςόγκους σε σχέση με το εγκεφαλικό παρέγχυμα και η έκφραση των ενζύμων αυτώνήταν συγκριτικά μεγαλύτερη στα γλοιοβλαστώματα σε σχέση με τα αναπλαστικάαστροκυττώματα και με τα χαμηλού βαθμού αστροκυττώματα. Το εύρημα αυτόσυμφωνεί με προηγούμενες μελέτες35.85,87 και συνηγορεί υπέρ του ρόλου των MMPsστην παθογένεια αλλά και στην εξέλιξη των αστροκυττωμάτων σε περισσότεροδιηθητικά νεοπλάσματα.Δεδομένου ότι οι MMPs ενεργοποιούνται από την πλασμίνη μπορούμε εύκολανα συμπεράνουμε ότι τα ένζυμα αυτά διαδραματίζουν συνεργατικό ρόλο στηδιηθητική ικανότητα των αστροκυττωμάτων.Στη μελέτη αυτή παρατηρήθηκε θετική συσχέτιση στην έκφραση του NF-κB καιτων MMP2/9. Το γεγονός αυτό είναι αναμενόμενο λόγω της ρύθμισης της έκφρασηςτου γονιδίου των MMP2/9 από τον NF-κB και ενισχύει την υπόθεση ότι στααστροκυττώματα ο NF-κB πιθανότατα διαδραματίζει ρόλο κλειδί στη ρύθμιση τηςδιηθητικής τους ικανότητας.Συμπερασματικά τα ευρήματα της μελέτης αυτής υποδηλώνουν ότι υπάρχουνισχυρές ενδείξεις πως η μείωση της πυρηνικής έκφρασης της ογκοκατασταλτικήςπρωτεΐνης ING-4 στα αστροκυττώματα οδηγεί σε αυξημένη έκφραση των MMP2/9πιθανόν μέσω απελευθέρωσης της δράσης του μεταγραφικού παράγοντα NF-κB.Είναι βέβαιο ότι περισσότερες μελέτες απαιτούνται για την εξακρίβωση της δρασηςτου ING-4 γονιδίου και της πρωτεΐνης στα αστροκυττώματα.

Εάν όντως αποδειχθείότι το γονίδιο αυτό διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στη ρύθμιση της διηθητικήςικανότητας των αστροκυττωμάτων ανοίγουν νέα προοπτικές για την εφαρμογήπερισσότερο ειδικών θεραπευτικών παρεμβάσεων.

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ133134Reference List1. Goldbrunner,R.H., Bernstein,J.J. & Tonn,J.C. Cell-extracellular matrix interaction in gliomainvasion. Acta Neurochir. (Wien. ) 141, 295-305 (1999).2. Quinones-Hinojosa,A. & Chaichana,K. The human subventricular zone: a source of newcells and a potential source of brain tumors. Exp. Neurol. 205, 313-324 (2007).3. Sanai,N., Alvarez-Buylla,A. & Berger,M.S. Neural stem cells and the origin of gliomas. N.Engl. J. Med. 353, 811-822 (2005).4. Holland,E.C. Progenitor cells and glioma formation. Curr. Opin. Neurol. 14, 683-688 (2001).5. Clarke,D.L. et al. Generalized potential of adult neural stem cells. Science 288, 1660-1663(2000).6. Sanai,N., Alvarez-Buylla,A. & Berger,M.S. Neural stem cells and the origin of gliomas. N.Engl. J. Med. 353, 811-822 (2005).7. Louis,D.N. et al. The 2007 WHO classification of tumours of the central nervous system.Acta Neuropathol. 114, 97-109 (2007).8. Buckner,J.C. et al. Central nervous system tumors. Mayo Clin. Proc. 82, 1271-1286 (2007).9. Miller,C.R. & Perry,A. Glioblastoma. Arch. Pathol. Lab Med. 131, 397-406 (2007).10. Buckner,J.C. et al. Central nervous system tumors. Mayo Clin. Proc. 82, 1271-1286 (2007).11. Miller,C.R. & Perry,A. Glioblastoma. Arch. Pathol. Lab Med. 131, 397-406 (2007).12. Mason,W.P. & Cairncross,J.G. Invited article: the expanding impact of molecular biology onthe diagnosis and treatment of gliomas. Neurology 71, 365-373 (2008).13. Buckner,J.C. et al. Central nervous system tumors. Mayo Clin. Proc. 82, 1271-1286 (2007).14. Read,T.A., Hegedus,B., Wechsler-Reya,R. & Gutmann,D.H. The neurobiology of

neurooncology. Ann. Neurol. 60, 3-11 (2006).15. Canoll,P. & Goldman,J.E. The interface between glial progenitors and gliomas. ActaNeuropathol. 116, 465-477 (2008).16. Dirks,P.B. Brain tumour stem cells: the undercurrents of human brain cancer and theirrelationship to neural stem cells. Philos. Trans. R. Soc. Lond B Biol. Sci. 363, 139-152(2008).17. Canoll,P. & Goldman,J.E. The interface between glial progenitors and gliomas. ActaNeuropathol. 116, 465-477 (2008).18. Dirks,P.B. Brain tumour stem cells: the undercurrents of human brain cancer and theirrelationship to neural stem cells. Philos. Trans. R. Soc. Lond B Biol. Sci. 363, 139-152(2008).13519. Canoll,P. & Goldman,J.E. The interface between glial progenitors and gliomas. ActaNeuropathol. 116, 465-477 (2008).20. Dirks,P.B. Brain tumour stem cells: the undercurrents of human brain cancer and theirrelationship to neural stem cells. Philos. Trans. R. Soc. Lond B Biol. Sci. 363, 139-152(2008).21. Behin,A., Hoang-Xuan,K., Carpentier,A.F. & Delattre,J.Y. Primary brain tumours in adults.Lancet 361, 323-331 (2003).22. Furnari,F.B. et al. Malignant astrocytic glioma: genetics, biology, and paths to treatment.Genes Dev. 21, 2683-2710 (2007).23. Kapoor,G.S. & O'Rourke,D.M. Mitogenic signaling cascades in glial tumors. Neurosurgery52, 1425-1434 (2003).24. Kitange,G.J., Templeton,K.L. & Jenkins,R.B. Recent advances in the molecular genetics ofprimary gliomas. Curr. Opin. Oncol. 15, 197-203 (2003).25. Shiraishi,T. & Tabuchi,K. Genetic alterations of human brain tumors as molecular prognosticfactors. Neuropathology. 23, 95-108 (2003).26. Knobbe,C.B., Merlo,A. & Reifenberger,G. Pten signaling in gliomas. Neuro. Oncol. 4, 196-211 (2002).27. Sanai,N., Alvarez-Buylla,A. & Berger,M.S. Neural stem cells and the origin of gliomas. N.Engl. J. Med. 353, 811-822 (2005).28. Furnari,F.B. et al. Malignant astrocytic glioma: genetics, biology, and paths to treatment.Genes Dev. 21, 2683-2710 (2007).

29. Sathornsumetee,S. et al. Molecularly targeted therapy for malignant glioma. Cancer 110, 13-24 (2007).30. Anderson,J.C., McFarland,B.C. & Gladson,C.L. New molecular targets in angiogenic vesselsof glioblastoma tumours. Expert. Rev. Mol. Med. 10, e23 (2008).31. Sathornsumetee,S. & Rich,J.N. Designer therapies for glioblastoma multiforme. Ann. N. Y.Acad. Sci. 1142, 108-132 (2008).32. Mason,W.P. & Cairncross,J.G. Invited article: the expanding impact of molecular biology onthe diagnosis and treatment of gliomas. Neurology 71, 365-373 (2008).33. Sathornsumetee,S. et al. Molecularly targeted therapy for malignant glioma. Cancer 110, 13-24 (2007).34. Peiffer,J. & Kleihues,P. Hans-Joachim Scherer (1906-1945), pioneer in glioma research.Brain Pathol. 9, 241-245 (1999).35. Claes,A., Idema,A.J. & Wesseling,P. Diffuse glioma growth: a guerilla war. ActaNeuropathol. 114, 443-458 (2007).13636. Claes,A., Idema,A.J. & Wesseling,P. Diffuse glioma growth: a guerilla war. ActaNeuropathol. 114, 443-458 (2007).37. Peiffer,J. & Kleihues,P. Hans-Joachim Scherer (1906-1945), pioneer in glioma research.Brain Pathol. 9, 241-245 (1999).38. D'Abaco,G.M. & Kaye,A.H. Integrins: molecular determinants of glioma invasion. J. Clin.Neurosci. 14, 1041-1048 (2007).39. Claes,A., Idema,A.J. & Wesseling,P. Diffuse glioma growth: a guerilla war. ActaNeuropathol. 114, 443-458 (2007).40. D'Abaco,G.M. & Kaye,A.H. Integrins: molecular determinants of glioma invasion. J. Clin.Neurosci. 14, 1041-1048 (2007).41. Giancotti,F.G. & Ruoslahti,E. Integrin signaling. Science 285, 1028-1032 (1999).42. Bornstein,P. & Sage,E.H. Matricellular proteins: extracellular modulators of cell function.Curr. Opin. Cell Biol. 14, 608-616 (2002).43. Schultz,C., Lemke,N., Ge,S., Golembieski,W.A. & Rempel,S.A. Secreted protein acidic andrich in cysteine promotes glioma invasion and delays tumor growth in vivo. Cancer Res. 62,6270-6277 (2002).44. Fiorilli,P. et al. Integrins mediate adhesion of medulloblastoma cells to tenascin and activatepathways associated with survival and proliferation. Lab Invest 88, 1143-1156 (2008).

45. Fiorilli,P. et al. Integrins mediate adhesion of medulloblastoma cells to tenascin and activatepathways associated with survival and proliferation. Lab Invest 88, 1143-1156 (2008).46. Suzuki,S.O. & Iwaki,T. Dynamic analysis of glioma cells: looking into "movementphenotypes". Neuropathology. 25, 254-262 (2005).47. Farber,K. et al. An alpha5beta1 integrin inhibitor attenuates glioma growth. Mol. CellNeurosci. 39, 579-585 (2008).48. Rempel,S.A., Golembieski,W.A., Fisher,J.L., Maile,M. & Nakeff,A. SPARC modulates cellgrowth, attachment and migration of U87 glioma cells on brain extracellular matrix proteins.J. Neurooncol. 53, 149-160 (2001).49. Rorive,S. et al. Matrix metalloproteinase-9 interplays with the IGFBP2-IGFII complex topromote cell growth and motility in astrocytomas. Glia 56, 1679-1690 (2008).50. Du,R. et al. Matrix metalloproteinase-2 regulates vascular patterning and growth affectingtumor cell survival and invasion in GBM. Neuro. Oncol. 10, 254-264 (2008).51. Huang,H.P. et al. Inhibitory effect of penta-acetyl geniposide on C6 glioma cells metastasisby inhibiting matrix metalloproteinase-2 expression involved in both the PI3K and ERKsignaling pathways. Chem. Biol. Interact. (2009).52. Tsatas,D. & Kaye,A.H. The role of the plasminogen activation cascade in glioma cellinvasion: a review. J. Clin. Neurosci. 10, 139-145 (2003).13753. Zhao,Y. et al. Urokinase directly activates matrix metalloproteinases-9: a potential role inglioblastoma invasion. Biochem. Biophys. Res. Commun. 369, 1215-1220 (2008).54. Binder,C., Hagemann,T., Husen,B., Schulz,M. & Einspanier,A. Relaxin enhances in-vitroinvasiveness of breast cancer cell lines by up-regulation of matrix metalloproteases. Mol.Hum. Reprod. 8, 789-796 (2002).55. Nakada,M. et al. Molecular targets of glioma invasion. Cell Mol. Life Sci. 64, 458-478(2007).56. Kim,H.J., Hawke,N. & Baldwin,A.S. NF-kappaB and IKK as therapeutic targets in cancer.Cell Death. Differ. 13, 738-747 (2006).57. Aggarwal,B.B. Nuclear factor-kappaB: the enemy within. Cancer Cell 6, 203-208 (2004).58. Tsunoda,K. et al. Expression of the constitutively activated RelA/NF-kappaB in human

astrocytic tumors and the in vitro implication in the regulation of urokinase-type plasminogenactivator, migration, and invasion. Brain Tumor Pathol. 22, 79-87 (2005).59. Garkavtsev,I., Kazarov,A., Gudkov,A. & Riabowol,K. Suppression of the novel growthinhibitor p33ING1 promotes neoplastic transformation. Nat. Genet. 14, 415-420 (1996).60. He,G.H., Helbing,C.C., Wagner,M.J., Sensen,C.W. & Riabowol,K. Phylogenetic analysis ofthe ING family of PHD finger proteins. Mol. Biol. Evol. 22, 104-116 (2005).61. Coles,A.H. & Jones,S.N. The ING gene family in the regulation of cell growth andtumorigenesis. J. Cell Physiol 218, 45-57 (2009).62. Campos,C.B. et al. Ibuprofen-induced Walker 256 tumor cell death: cytochrome c releasefrom functional mitochondria and enhancement by calcineurin inhibition. Biochem.Pharmacol. 68, 2197-2206 (2004).63. Unoki,M., Shen,J.C., Zheng,Z.M. & Harris,C.C. Novel splice variants of ING4 and theirpossible roles in the regulation of cell growth and motility. J. Biol. Chem. 281, 34677-34686(2006).64. Doyon,Y. et al. ING tumor suppressor proteins are critical regulators of chromatinacetylation required for genome expression and perpetuation. Mol. Cell 21, 51-64 (2006).65. Coles,A.H. & Jones,S.N. The ING gene family in the regulation of cell growth andtumorigenesis. J. Cell Physiol 218, 45-57 (2009).66. Nozell,S. et al. The ING4 tumor suppressor attenuates NF-kappaB activity at the promotersof target genes. Mol. Cell Biol. 28, 6632-6645 (2008).67. Colla,S. et al. The new tumor-suppressor gene inhibitor of growth family member 4 (ING4)regulates the production of proangiogenic molecules by myeloma cells and suppresseshypoxia-inducible factor-1 alpha (HIF-1alpha) activity: involvement in myeloma-inducedangiogenesis. Blood 110, 4464-4475 (2007).68. Garkavtsev,I. et al. The candidate tumour suppressor protein ING4 regulates brain tumourgrowth and angiogenesis. Nature 428, 328-332 (2004).13869. Li,J., Martinka,M. & Li,G. Role of ING4 in human melanoma cell migration, invasion andpatient survival. Carcinogenesis 29, 1373-1379 (2008).70. Gunduz,M. et al. Frequent deletion and down-regulation of ING4, a candidate tumorsuppressor gene at 12p13, in head and neck squamous cell carcinomas. Gene 356, 109-117

(2005).71. Gunduz,M. et al. Frequent deletion and down-regulation of ING4, a candidate tumorsuppressor gene at 12p13, in head and neck squamous cell carcinomas. Gene 356, 109-117(2005).72. Gunduz,M. et al. Frequent deletion and down-regulation of ING4, a candidate tumorsuppressor gene at 12p13, in head and neck squamous cell carcinomas. Gene 356, 109-117(2005).73. Colla,S. et al. The new tumor-suppressor gene inhibitor of growth family member 4 (ING4)regulates the production of proangiogenic molecules by myeloma cells and suppresseshypoxia-inducible factor-1 alpha (HIF-1alpha) activity: involvement in myeloma-inducedangiogenesis. Blood 110, 4464-4475 (2007).74. Garkavtsev,I. et al. The candidate tumour suppressor protein ING4 regulates brain tumourgrowth and angiogenesis. Nature 428, 328-332 (2004).75. Perkins,N.D. NF-kappaB: tumor promoter or suppressor? Trends Cell Biol. 14, 64-69 (2004).76. Garkavtsev,I. et al. The candidate tumour suppressor protein ING4 regulates brain tumourgrowth and angiogenesis. Nature 428, 328-332 (2004).77. Garkavtsev,I. et al. The candidate tumour suppressor protein ING4 regulates brain tumourgrowth and angiogenesis. Nature 428, 328-332 (2004).78. Lefranc,F., Brotchi,J. & Kiss,R. Possible future issues in the treatment of glioblastomas:special emphasis on cell migration and the resistance of migrating glioblastoma cells toapoptosis. J. Clin. Oncol. 23, 2411-2422 (2005).79. Sawaya,R., Ramo,O.J., Shi,M.L. & Mandybur,G. Biological significance of tissueplasminogen activator content in brain tumors. J. Neurosurg. 74, 480-486 (1991).80. Janicke,F., Schmitt,M., Ulm,K., Gossner,W. & Graeff,H. Urokinase-type plasminogenactivator antigen and early relapse in breast cancer. Lancet 2, 1049 (1989).81. Das,R., Philip,S., Mahabeleshwar,G.H., Bulbule,A. & Kundu,G.C. Osteopontin: it's role inregulation of cell motility and nuclear factor kappa B-mediated urokinase type plasminogenactivator expression. IUBMB. Life 57, 441-447 (2005).82. Reuning,U. et al. Inhibition of NF-kappa B-Rel A expression by antisenseoligodeoxynucleotides suppresses synthesis of urokinase-type plasminogen activator (uPA)

but not its inhibitor PAI-1. Nucleic Acids Res. 23, 3887-3893 (1995).83. Mignatti,P. & Rifkin,D.B. Biology and biochemistry of proteinases in tumor invasion.Physiol Rev. 73, 161-195 (1993).13984. Mott,J.D. & Werb,Z. Regulation of matrix biology by matrix metalloproteinases. Curr. Opin.Cell Biol. 16, 558-564 (2004).85. Choe,G. et al. Active matrix metalloproteinase 9 expression is associated with primaryglioblastoma subtype. Clin. Cancer Res. 8, 2894-2901 (2002).86. Nakada,M. et al. Expression and tissue localization of membrane-type 1, 2, and 3 matrixmetalloproteinases in human astrocytic tumors. Am. J. Pathol. 154, 417-428 (1999).87. Rao,J.S. Molecular mechanisms of glioma invasiveness: the role of proteases. Nat. Rev.Cancer 3, 489-501 (2003).__