zy jest coś, czego się nie da zrobid z bakteriofagiem? przegląd...

Czy jest coś, czego się nie da zrobid z bakteriofagiem?

Przegląd moich tematów badawczych

Marcin Łoś

Katedra Biologii Molekularnej

Uniwersytet Gdaoski

Czym jest bakteriofag?

http://micro.magnet.fsu.edu/cells/virus.html

hu.cnsi.ucsb.edu

Fagi…

… są wszędzie…

…tam, gdzie istnieją organizmy żywe!

Najliczniejsze organizmy żywe na ziemi to bakterie…

… ale wirusy są około 10x bardziej liczne

Zdecydowana ich większośd jest dla nas nieszkodliwa. Są za to zabójcze dla bakterii

Szacowana ilośd cząstek wirusowych wynosi na całej Ziemi 1031

Gdyby je ułożyd w jednym rzędzie utworzyłyby linię 1013 razy dłuższą niż średnia odległośd Ziemi od Słooca

Cykl infekcyjny bakteriofagów

www.celsalive.com

Rozwój bakteriofagów w warunkach powolnego wzrostu

komórek gospodarza

Głodzone komórki bakteryjne

• Znacznie obniżona wydolnośd aparatu biosyntezy białek

• Mniejszą objętośd komórek

• Większa odpornośd na uszkodzenia przez np. antybiotyki, chloroform

• Namnażanie się faga ograniczone lub całkiem zastopowane

Czemu takie badania są istotne?

• Wzrost bakterii używanych w wielu procesach przemysłowych jest spowolniony – wynika to głownie ze względów technologicznych

• Bakteriofagi są jednym z głównych zagrożeo procesów biotechnologicznych opartych na bakteriach

Procesy przemysłowe oparte na bakteriach

Hodowle ciągłe

bakterii w

chemostatach:

• Stała objętość

hodowli.

• Czas generacji jest

uzależniony tylko od

tempa wymiany

pożywki w

chemostacie, a nie od

stężenia substancji

odżywczej

Rozwój bakteriofagów w

procesie biofermentacji

.

Funkcje kontrolowane

automatycznie:

• Pomiar DOT, pH, temperatury,

• Utrzymywanie stałego pH,

temperatury i dozowanie pożywki

• Sterowanie szybkością mieszania

przestawione na manualne w celu

zwiększenia kontroli nad przebiegiem

fermentacji

Funkcje kontrolowane manualnie:

• Pomiar OD

• Dostosowywanie prędkości

mieszania

• Dostosowywanie szybkości

przepływu powietrza

• Dozowanie substancji przeciwdziałającej

pienieniu się hodowli

Rola genów rI i rIII w rozwoju bakteriofaga T4

Różnice w ekspresji białek w trakcie zakażenia fagami T4D, T4rI i T4rIII

Bakteriofag T4 w głodzonych kulturach bakteryjnych

• Miano fagów i bakterii w głodzonych kulturach E. coli MG1655 zakażonych fagami T4D (romby) T4rI (trójkąty) i T4rIII (kwadraty)

1,0E+02

1,0E+03

1,0E+04

1,0E+05

1,0E+06

0 10 20 30 40 50

Ph

age

tit

er

Time (days)

1,0E+02

1,0E+03

1,0E+04

1,0E+05

1,0E+06

0 10 20 30 40 50

Tite

r o

f in

fect

ed

bac

teri

a

Time (days)

Jakie są powody różnic w poziomie fagów w infekowanych hodowlach?

• Brak rozwoju mutantów T4rI i T4rIII w głodzonych komórkach przy jednoczesnym rozwoju T4D umożliwiającym podtrzymanie populacji?

• Zróżnicowana adsorpcja mutantów i szczepu dzikiego?

• Kombinacja obu?

• …?

Adsorpcja fagów na komórkach gospodarza

• Adsorpcja fagów ze

zwykłego lizatu (romby) i lizatu pasażowanego przez hodowle głodzone (kwadraty) na komórkach głodzonych (panel górny) i rosnących (dolny) w 30°C

0,01

0,1

1

0 5 10 15 20 25 30 35

No

rmal

ize

d f

ree

ph

age

Time (min)

0,01

0,1

1

0 5 10 15 20 25 30 35

No

rmal

ize

d f

ree

ph

age

Time (min)

Badania egzopolisacharydu w biofilmach bakteryjnych

Budowa biofilmu

http://www3.niaid.nih.gov

Znaczenie biofilmu

• Szkody w procesach przemysłowych

• Duże znaczenie w patogenezie (mukopolisacharydoza, rany, zapalenie wsierdzia)

• Łatwa kolonizacja powierzchni (implanty i endoprotezy, cewniki)

Cele projektu

• Optymalizacja metod hodowli biofilmów bakteryjnych

• Dostarczenie dużych ilości materiału bogatego w EPS

• Określenie struktury EPS produkowanych przez różne gatunki bakterii

Metagenomiczne poszukiwanie aktywności przeciwbakteryjnych i

przeciwbiofilmowych w populacjach fagowych

Aktywności przeciwbakteryjne

• Ze względu na charakterystykę cyklu życiowego fagów geny o działaniu przeciwbakteryjnym (lizyny, lizozymy, holiny, inhibitiory biosyntezy ściany komórkowej) stanowią duży procent ich genomów

Aktywności przeciwbiofilmowe

• Naturalne populacje bakteryjne występują często w postaci biofilmu, który jest fizyczna barierą uniemożliwiającą penetrację m.in. przez wirusy

• Niektóre fagi wytworzyły w odpowiedzi enzymy degradujące EPS (egzopolisacharyd). Enzymy takie mogą byd zasocjowane z kapsydem, lub wydzielane przez lizujące komórki bakteryjne

Czemu takie aktywności są cenne?

• Alternatywa dla antybiotyków, szczególnie w leczeniu miejscowym

• Poznanie mechanizmów działania przeciwbakteryjnego

• Niszczenie biofilmów istotne w przemyśle, służbie zdrowia oraz leczenia niektórych chorób

Cele projektu

• Znalezienie w ekspresyjnych bibliotekach genowych jak największej ilości genów godujących interesujące nas aktywności

• Scharakteryzowanie wybranych genów

• Analiza bioinformatyczna sekwencji w celu ustalenia pokrewieostwa wybranych genów z sekwencjami zdeponowanymi w bazach danych

Rozwój bakteriofagów kodujących geny toksyn Shiga

Bakteriofagi jako czynniki patogenności

• Poza bakteriobójczym działaniem bakteriofagi mogą również odpowiadad za zmianę fenotypu bakterii chorobotwórczych

• Ze względu na szerokie spektrum gospodarzy mogą zapewnid horyzontalny transfer genów między gatunkami bakterii

• Poznanie mechanizmów regulacji rozwoju fagów oraz regulacji aktywności genów stx może mied duże znaczenie dla zrozumienia patogenezy zakażeo.

Indukcja H2O2

Wypełnione kółka– lambda, kwadraty- 22deltatox, wypełnione trójkąty-24B, trójkąty–27delta tox, wypełnione kwadraty– 32 delta tox, kółka- 933Wdelta tox

Indukcja mitomycyną C

Wypełnione kółka– lambda, kwadraty- 22deltatox, wypełnione trójkąty-24B, trójkąty– 27delta tox, wypełnione kwadraty– 32 delta tox, kółka- 933Wdelta tox

Indukcja norfloksacyną


Indukcja szokiem solnym


Bakteriofagi jako składniki systemu detekcji bakterii

Czy fagi mogą zastąpid przeciwciała?

Shabani et al. Anal. Chem., 2008, 80, 9475–9482

Czy są jakieś zalety stosowania fagów zamiast przeciwciał?

• Fagi maja zwykle znacznie stabilniejsze domeny odpowiadające za oddziaływanie z bakterią

• Są tanie w produkcji i stosunkowo łatwe w izolacji

• Występują fagi zarówno o bardzo szerokich spektrach gospodarza, jak i bardzo waskich, co umożliwia dobranie specyficzności faga do danego testu.

Czy to działa?

Ilośd faga/test

• Ilośd bakterii/test-0,200

0,000

0,200

0,400

0,600

0,800

1,000

1,200

1,400

1,600

T4D λcIb2 P1vir O1

ilość faga na studzienkę

OD

405 n

m

1,00E+08

1,00E+07

1,00E+06

1,00E+05

1,00E+04

1,00E+03

kontrola bez przeciwciał biotynylowanych

kontrola bez surowicy

kontrola bez bakterii

kontrola bez faga

-0,050

0,000

0,050

0,100

0,150

0,200

0,250

0,300

0,350

0,400

0,450

O1 T4D λcIb2 P1vir

ilość bakterii na studzienkę

OD

405 n

m

1,00E+08

1,00E+07

1,00E+06

1,00E+05

1,00E+04

1,00E+03

kontrola bez przeciwciał biotynylowanych

kontrola bez surowicy

kontrola bez bakterii

kontrola bez faga

Wykorzystanie bakteriofagów w hodowli i domieszkowaniu

kryształów

Fagi filamentarne

Rozmiary faga: grubość – 6-7 nm

Długość: 900 nm

hu.cnsi.ucsb.edu

www.ncbi.nlm.nih.gov

Phage display

• Bakteriofagi filamentarne i ogoniaste umożliwiają modyfikacje niektórych składników kapsydu

• Pozwala to na produkcje dużych ilości ściśle zdefiniowanych peptydów, które są eksponowane na zewnątrz wirusa

hu.cnsi.ucsb.edu

Po co?

• Zastosowao jest wiele – od produkcji sztucznych przeciwciał do nanostruktur

• Możliwe jest tworzenie fagów o mieszanym składzie wiążącym różne elementy

• Po opłaszczeniu faga np. koloidalnymi zawiesinami metali lub ich związków uzyskujemy wysoko zorganizowane nanostruktury

• Ze wstępnych badao wynika, że użycie fagów eksponujących sekwencje wiążące takie związki może katalizowad ich krystalizacje

• Dzięki możliwościom techniki phage display takie kryształy mogą byd precyzyjnie domieszkowane wybranymi związkami lub pierwiastkami

• Wystarczy wyselekcjonowad peptydy, które je wiążą

Mgr Joanna Łoś

Mgr Agata Jurczak

Mgr Piotr Golec

Mgr Magdalena Jakubowska

Prof. Grzegorz Węgrzyn

dr hab. Borys Wróbel

Prof. UG dr hab. Janusz Madaj

Prof. Andrzej Kłonkowski

Prof. Peter Neubauer (Uniwersytet w Oulu, Finlandia)

zy jest coś, czego się nie da zrobid z bakteriofagiem? przegląd...

Documents