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312179 Bioverfugbarkeit von Nitrofurantoin 697 Arch. Pharm. (Weinheim) 312,697-703 (1979) Zur Bioverfiigbarkeit von Nitrofurantoin, 2. Mitt.') Quantitative Bestimmung von Nitrofurantoin im Blutserum Siegfried Ebel*)**), Raincr Liedtke, Barbara MiRler, Margret Richter und Peter Surmann Fachbereich Pharmazie und Lebensmittelchemie der Philipps-Universitat, Marbacher Weg 6, 3550 MarburgiLahn, und Klinische Forschung von Heyden GmbH Regensburg Eingegangen am 19. Oktober 1978 Zur quantitativen Restimmung von Nitrofurantoin im Blutserum wird ein Aufarbeitungsschema angegeben, das eine Zersetzung des Nitrofurantoins auch bei einer Zwischenlagerung der Proben im tiefgefrorenen Zustand weitestgehend ausschlieBt. Durch Kombination der Hochdruckfliissigchro- matographie und der differential pulse-polarography wird eine Stijrung durch evtl. Metabolite und durch Begleitsubstanzen des Rlutserums praktisch ausgeschlossen. Die Wiederfindungsrate liegt bei der Extraktion bei 87 %, bei der Aufarbeitung uber Extrelut-Saulen bei 90 %. Die Genauigkeit der Methode liegt bei etwa 4.4 %, die Erfassungsgrenze bei Verwendung von 5 ml Serum 0.2 pg ml ' (HPLC) bzw. 0.4 pg ml-' (Polarographie) Nitrofurantoin bezogen auf das vorliegende Blutserum. Bioavailibility of Nitrofurantoin; 11: Quantitative Determination of Nitrofurantoin in Blood Serum A method for the determination of nitrofurantoin in blood serum is described. The method is not influenced by the degradation of nitrofurantoin by light. The samples to be analyzed may be stored in a deep freezer. Systematic errors caused by metabolites or the matrix of the sample are eliminated by using a combination of differential pulse polarography and high pressure liquid chromatography. The ratio of detection is about 87 % using extraction methods with nitromethane and about 90 70 using commercially available extrelut columns. The accuracy of the method is in the order of 4.4 % and the detection limit working with 5 ml blood serum is 0.2 (HPLC) or0.4 pg (dp polarography) per ml of the blood sample. Nitrofurantoin wird vorwiegend als Chemotherapeutikurn der ableitenden Harnwege eingesetzt. Aus diesern Grunde besteht die Notwendigkeit, dieDarreichungsform so zu optirnieren, daB rnoglichst gunstige Urinspiegel-Werte errcicht werden. Von der FDA wird eine Untersuchung der Bioverfugbarkeit verlangt, da keine wirklich zuverlassigen in vitro-Versuche bekannt sind, die einc cinwandfreie Korrelation Arzneiform/Urinspiegel zulassen. Eine selektive und sehr genaue Methode zur Bestimmung des Nitrofurantoins in Urinproben wurde von uns rnitgeteilt'). Wahrend fur cine parameterlose Bioverfiigbar- keitsstudie und ebenso fur eine parameterlose pharmakokinetische Untersuchung cine rein deskriptive Darstellung der Blutspiegel-Werte ausreichen mag, ist zum wirklichen O3h.C~233/79!07(17~)697 $02,5010 0 Verlag Chcmie. GmhH. Weinhelm IY7Y

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Page 1: Zur Bioverfügbarkeit von Nitrofurantoin, 2. Mitt. Quantitative Bestimmung von Nitrofurantoin im Blutserum

312179 Bioverfugbarkeit von Nitrofurantoin 697

Arch. Pharm. (Weinheim) 312,697-703 (1979)

Zur Bioverfiigbarkeit von Nitrofurantoin, 2. Mitt.')

Quantitative Bestimmung von Nitrofurantoin im Blutserum

Siegfried Ebel*)**), Raincr Liedtke, Barbara MiRler, Margret Richter und Peter Surmann

Fachbereich Pharmazie und Lebensmittelchemie der Philipps-Universitat, Marbacher Weg 6, 3550 MarburgiLahn, und Klinische Forschung von Heyden GmbH Regensburg Eingegangen am 19. Oktober 1978

Zur quantitativen Restimmung von Nitrofurantoin im Blutserum wird ein Aufarbeitungsschema angegeben, das eine Zersetzung des Nitrofurantoins auch bei einer Zwischenlagerung der Proben im tiefgefrorenen Zustand weitestgehend ausschlieBt. Durch Kombination der Hochdruckfliissigchro- matographie und der differential pulse-polarography wird eine Stijrung durch evtl. Metabolite und durch Begleitsubstanzen des Rlutserums praktisch ausgeschlossen. Die Wiederfindungsrate liegt bei der Extraktion bei 87 %, bei der Aufarbeitung uber Extrelut-Saulen bei 90 %. Die Genauigkeit der Methode liegt bei etwa 4.4 %, die Erfassungsgrenze bei Verwendung von 5 ml Serum 0.2 pg ml ' (HPLC) bzw. 0.4 pg ml-' (Polarographie) Nitrofurantoin bezogen auf das vorliegende Blutserum.

Bioavailibility of Nitrofurantoin; 11: Quantitative Determination of Nitrofurantoin in Blood Serum

A method for the determination of nitrofurantoin in blood serum is described. The method is not influenced by the degradation of nitrofurantoin by light. The samples to be analyzed may be stored in a deep freezer. Systematic errors caused by metabolites or the matrix of the sample are eliminated by using a combination of differential pulse polarography and high pressure liquid chromatography. The ratio of detection is about 87 % using extraction methods with nitromethane and about 90 70 using commercially available extrelut columns. The accuracy of the method is in the order of 4.4 % and the detection limit working with 5 ml blood serum is 0.2 (HPLC) or0.4 pg (dp polarography) per ml of the blood sample.

Nitrofurantoin wird vorwiegend als Chemotherapeutikurn der ableitenden Harnwege eingesetzt. Aus diesern Grunde besteht die Notwendigkeit, dieDarreichungsform so zu optirnieren, daB rnoglichst gunstige Urinspiegel-Werte errcicht werden. Von d e r F D A wird eine Untersuchung de r Bioverfugbarkeit verlangt, d a keine wirklich zuverlassigen in vitro-Versuche bekannt sind, die einc cinwandfreie Korrelation Arzneiform/Urinspiegel zulassen. Eine selektive und sehr genaue Methode zur Bestimmung des Nitrofurantoins in Urinproben wurde von uns rnitgeteilt'). Wahrend fur cine parameterlose Bioverfiigbar- keitsstudie und ebenso fur eine parameterlose pharmakokinetische Untersuchung cine rein deskriptive Darstellung der Blutspiegel-Werte ausreichen mag, ist zum wirklichen

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698 Ehel. Liedtke, Mifiler, Richter und Surmann Arch. Pharm.

Verstandnis d e r Pharmakokine t ik u n d z u r Ermi t t lung der wirkl ichen Bioverfugbarkei t eine Kenntnis d e s zeitlichen Verlaufs auch d e r Blu twer te notwendig, d a n u r e ine Korrelat ion beider GroBen u n d d i e D a t e n d e r zugehor igen P a r a m e t e r wirklich aussage- kraftig sind. In d e r Li te ra tur f inden sich n u r wenige Arbei ten z u r Analyt ik d e s Nitrofurantoins i m Blut , d ie z. T. widerspruchl ich sind u n d a u a e r d e m bezuglich systematischer Fehler u n d Selektivitat ke ine n a h e r e n A n g a b e n en tha l ten . Berucksichtigt w e r d e n muB auBerdem, daR Nitrofurantoin zu m e h r als 50 % im Organismus a b g e b a u t wird, wobei allerdings bislang ansche inend ke ine Metabol i te isoliert u n d aufgeklar t ~ u r d e n * - ~ ) . Die vorl iegende Arbei t sol1 desha lb eine M e t h o d e beschreiben, d ie Nitrofuran- to in einmal aufgrund d e r Ni t rogruppe (h ie r wiirden folglich k e i n e d e r postul ier ten Aminometabol i ten erfaRt) und zum a n d e r e n u b e r d ie Konjugat ion der be iden Ringsyste- m e des in tak ten Molekuls (hier w u r d e n ke ine Spal tprodukte a n der C = N-Doppelb indung erfaBt) quant i ta t iv bes t immt und somit hochselekt iv ist.

Kolorimetrische Bestimmung

Alle in der Literatur beschriebenen Methoden zur Bestimmung des Nitrofurantoins im Blutserum bedienen sich kolorimetrischer Bestimmungsverfahren. Das auf B u ~ a r d ‘ . ~ ) zuruckgehende Verfahren verwendet eine Reaktion mit Phenylhydrazin nach saurer Hydrolyse mit nachfolgender Extraktion und Messung bei 625 nm. Es wurde von M i m i s f o h ) zur Bestimmung von Blutspiegelwerten eingesetzt. Bei diesem Verfahren storen alle Substanzen, die mit oder auch ohne Hydrolyse gefarbte Phenylhydrazone oder auch Osazone ergeben. AuRerdem schien uns die Methode insgesamt zu arbeitsaufwendig zu sein. Die von C~nklin’ .~) und spater auch von Mattock”’ bzw. Albert9) angewendete Hyamin-Methode ist ebenfalls sehr storanfallig. Einmal werden alle sauren Verbindun- gen erfaBt, die mit Hyamin ein extrahierbares Farbsalz bilden, zum anderen ist die praktische Erfassungsgrenze nicht ausreichend. Es tritt ein zeitabhangiger Blindwert auf’” und weiterhin bedingen eine ganze Reihe von Begleitstoffen eine hohe Untergrundabsorption bei der MeRwellen- lange von 450 nm. Nach unseren Erfahrungen I a R t sich auch die Untergrundabsorption nicht kompensieren; hinzukommt, daR individuelle und auch tageszeitliche Schwankungen auftreten und somit Veranderungen eines Referenzserums bewirken konnen.

Hochdruckfliissigchromatographie

Im Gegensatz zur Bestimmung des Nitrofurantoins in Urinproben, bei der eine direkte polar~graphische’*’~) oder derivativ-spektralfotometrische’) Messung moglich ist, ist bei der quantita- tiven selektiven Erfassung in Blutserum ein Abtrennen von Begleitstoffen erforderlich. Es wurde deshalb eine Methode iiber die Direktauswertung von Dunnschichtchromatogrammen ausgearbei- tet”). I m Hinblick auf einen hoheren Probendurchsatz, wie er bei einer Bioverfugbarkeitsstudie notwendig ist, wurde gleichzeitig eine HPLC-Methode erarbeitet. Allerdings ist die Nachweis- und Erfassungsgrenze bei einer fotometrischen Detektion hierbei nicht ausreichend, um Serumproben direkt aufzugeben. Dies ist bei einer elektrochemischcn Detektion moglich”), doch war bei der elektrochemischen Reduktion des Nitrofurantoins die Reproduzierbarkeit nicht ausreichend gege-

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312/79 Rio verfugharkeit von Nirrofura n toin 699

hen. Infolgedessen mul3te ein Anreicherungsschritt eingefiigt werden. Dieser Anreicherungsschritt muBte zudem mit einer Ahtrennung der im Serum vorhandenen EiweiRkorper verbunden sein, da Proteine sowohl die HPLC-Methode als auch die unten angefiihrte polarographische Bestimmung storen oder beeinflussen konnen.

Fur die chromatographische Trennung erwies sich ein chemisch gehundenes reversed-phase -Mate- rial als stationare Phase als hesonders geeignet. Durch Variation der Zusamrnensetzung der mohilen Phase MethanoVWasser konnte eine einwandfreie Abtrennung des Nitrofurantoins von anderen leicht gefarbten Substanzen aus der Analysenmatrix erreicht werden. Die Detektion erfolgt im Ahsorptionsmaximum des Nitrofurantoins bei 368-37 1 nm.

Die Auswertung erfolgte iiber die Peakhohe des registrierten Detektorsignals. Die Genauigkeit der Aufgahe auf die Saule iiher das Rheodyne-System betrug 1.24 %. Hierzu wurden Konzentratio- nen von 1-20 pg ml-'jeweilszehnmal injiziert. Da dieser Fehlerim Hinblick auf den Gesamtfehlerdes Analysenverfahrens vernachlassighar erschien, wurde von dem Zusatz eines internen Standards abgesehen. Die hei der Vermessung der Aufgabengenauigkeit erhaltenen Werte wurden gleichzeitig zur Aufstellung der Eichgeraden verwendet. Dies war vor allem deshalh notwendig, weil die Wiederfindungsrate deutlich unter 100 % lag.

Polarographische Bestimmung

Nitrofurantoin lal3t sich iiber seine Nitrogruppe sehr leicht polarographisch reduzie- ren16.17). Bei der Ausarbeitung der Bestimmung von Nitrofurantoin in Urinproben wurde von uns die differential pulse-Polarographie eingesetzt'), die sich durch eine sehr giinstige Erfassungsgrenze auszeichnet. Diese Methode eignet sich im Zusarnmenhang mit der hier beschriebenen Aufarbeitung auch zur quantitativen Bestimmung des Nitrofurantoins im Serum. Eine eingehende Analyse von Blindseren zeigte, dal3 im betrachteten Spannungs- bereich zwar eine geneigte Grundlinie vorliegt, aber nicht mit einer systematischen Storung zu rechnen ist (Abb. 1 B). Die Auswertung kann im einfachsten Fall i iber die Peakhohe unter entsprechender Korrektur des Verlaufs der Basislinie (vgl. Abb. 1 A)

Nitroflrantoin

I

Abb. 1: Bestimmung dcs Nitrofurantoins im Blutserum nach Extraktion mit Nitrorncthan iiber differential pulse Polarographic A C = 5 pg ml-' Blutserum; B Blindserum

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e r fo lgen . Dar i iberh inaus ist a u c h eine m a t h e m a t i s c h e P e a k a p p r o x i m a t i o n i iber e i n e Exponent ia l funkt ion") moglich, die v o r allem b e i einer r e c h n e r g e s t e u e r t e n Polarogra- phie") von Vor te i l ist u n d cine verbesser te R e p r o d u z i e r b a r k e i t u n d G e n a u i g k e i t mit sich br ingt .

A u f a r b e i t u n g der Serumproben

Fur die polarographische oder hochdruckfliissigchromatographische Bestimmung des Nitrofuran- toins im Blutserum ist eine Abtrennung von einer Reihe der Begleitstoffe im Serum und eine Anreicherung notwendig. Als Extraktionsrnittel kommen vor allem Nitromethan und Essigsauremc- thylester in Frage. Die Verteilungsfaktoren wurden mit p = 97 (Nitromethan) bzw. p = 90 (Methylacetat) gegen Wasser als andere Phase bestimmt. Gegeniiber Blutserum liegen die Werte etwas ungiinstiger, was auf eine gewisse Liisungsvermittlung durch die Serummatrix zuriickzufiihren sein diirfte. Am geeignetsten erschien uns eine Extraktion mit Nitromethan aus Serum. dem 0.1 M HCI zugesetzt worden war. Nitromethan besitzt eine relative Dichte von 1 .I35 gm1-I und bildet somit bei Zugabe zu Serum die untere Phase. Urn nach dem Zentrifugieren eine Phasenumkehr zu erreichen, wurden 4 g Natriumchlorid zugesetzt. Nach dem Zentrifugieren ergeben sich drei Phasen.

f

5 0 ml Serum 2 5 r d O1M HCI

15 ml Nitromethan Phasenumkehr

Ni tromet hanphase

waxhen

100 ml N-phase LM abziehen T 6 30"

I 1 0 ml Puffer I HPLC direkt vermessen Abb. 2: Aufarbeitungsschema der Serum- Polarographie + 5 0 ml h f f e r 53Z proben zur Nitrofurantoin-~cstimmung

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da sich zwischen der oberen organischen und der unteren wa13rigen Phase eine Schicht pastiiser Serumbestandteile abscheidet. Nach dem Abtrennen der organischen Phase mu13 diese noch mit Petrolether gewaschen werden, falls eine polarographische Bestimmung erfolgt, da die ehenfalls extrahierten Lipidbestandteile des Serums den Diffusionsvorgang in der Polarographie und damit die richtige Signalausbildung beeintrachtigen. Bei einer anschlieBenden Anwendung der HPLC kann diese Operation entfallen. Nitrofurantoin ist in Nitromethan nur bedingt stabil. Aus diesem Grunde und um gleichzeitig eine Konzentrierung zu erreichen, wird das Nitromethan am Olpumpenvak. bei einer 30" nicht iiberschreitenden Temperatur abgezogen. Der Ruckstand wird im Britton Robinson- Puffer pH5 aufgenommen und kann anschlieBend direkt vermessen werden.

Sol1 eine Lagerung zwischen Blutentnahme und Analytik vorgenommen werden, so kann das Blutserum bei -23" tiefgefroren gehalten werden. In tiefgefrorenem Serum tritt innerhalb 4 Wochen keinerlei Zersetzungein. Normales Serum mu13 dagegen wegen der Empfindlichkeit des Nitrofuranto- ins innerhalb einer Stunde aufgearbeitet werden.

Wiederfindungsrate, Erfassungsgrenze

Ein wesentliches Problem bei der Bestimmung von Arzneimitteln im Organmaterial oder Kiirperfliissigkeiten ist die Bestimmung der Wiederfindungsrate. Da eine einfache Zumischmethode keine wirkliche Aussagekraft besitzt, wurde von einem nitrofurantoinfreien Serum ausgegangen, dem jeweils definierte Mengen Nitrofurantoin zugesetzt wurden. Nach der gesamten Aufarbeitung nach dem oben angefiihrten Schema wurde das MeSsignal mit dem einer gleichen Menge Nitrofurantoin in derselben Pufferlosung direkt verglichen. Um zufillige Fehler auszuschliellen, wurde eine Eichgerade im gesamten interessierenden Konzentrationsbereich einschlieRlich eines Leerwertes vermessen. Diese Eichreihe konnte jedoch zusatzlich einen weiteren Fehler aufweisen, der von einem evtl. vorhandenen Serumbestandteil herruhrt. Deshalb wurden weitere Eichreihen unter Verwendung jeweils anderer Blindseren anderer Herkunft vermessen. Alle Eichgeraden waren Ursprungsgeraden, d . h. es lag bei keinem Serum ein additiver systematischer Fehler vor. Alle MeBpunkte ergaben eine Genauigkeit uber die Gesamtoperation von 4.4 90 (als genaherte relative Standardabweichung, n = 54). bei einer Wiederfindungsrate von 87.3 % fur die HPLC (Abb. 3). Bei der Polarographie ist die

2 3

Abb. 3: Eichgerade und Wieder- findungsrate von Nitrofurantoin aus Serumproben (Bestimmung durch

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Wiederfindungsrate geringfiigig kleiner, da durch noch vorhandene Serumbestandteile, die die Diffusion an die Elektrode beeinflussen, anscheinend eine schwache Verringerung der Stufenhohe bzw. der Peakhohe auftritt. Verwendet man Extrelut-Saulen, so betragt die Wiederfindungsrate fast 90 %. Hierbei werden 5 ml Serum mit 5 ml 0.9 proz. NaCI-Losung versetzt und aufgegeben. Die Elution erfolgt mit insgesamt 25-30 ml Nitromethan. Von Vorteil hei diesem Verfahren ist der wesentlich geringere Arbeitsaufwand. Die praktische Erfassungsgrenze liegt bei Serumspiegeln van 0.2 pg ml - I (HPLC) bzw. 0.4 pg m1-I (Polarographie). Geht man von 10 ml Serum aus und verwendet lediglich 0.5 ml (HPLC) bzw. 5 ml Pufferlosung (Polarographie), so ergeben sich Erfassungsgrenzen von 100 ng ml-' (HPLC) bzw. 200 ng/ml-' (Polarographie). Eine weitere Herabsetzung der Erfassungsgrenze bei der HPLC ist durch eine Erhijhung des Injektionsvolumens moglich. Prinzipiell ware somit einc Bestimmung des Nitrofurantoins im Bereich bis herab zu 10 ng m1-I Blutserum moglich. Bei einer Reihe von Versuchen an verschiedenen Seren ergaben beide Methoden Ergebnisse, die innerhalb der Fehlergrenze iibereinstimmten, d. h. das gewahlte Verfahren ist selektiv gegeniiber der zu bestimmenden Substanz.

Dem Bundesminister fur Forschung und Technologie danken wir fur die Unterstiitzung dieser Arbeiten durch Personal- und Sachmittel; Frl. Nickel fur die Mitarbeit bei der Durchfiihrung der Analysen und Messungen.

Experimenteller Teil

Hochdruckflussigchromatographie

Gerat: Perkin Elmer PE 1220 mit Rheodyne Aufgahesystem und Detektor PE 55; Stationare Phase: Hihar-Fertigsaule Lichrosorb RP 18 (E. Merck, Darmstadt); mobile Phase: Methanol/Wasser 50 + 50 (v/v); Stromungsgeschwindigkeit: 1 ml min-I; Injektionsvol. 10 PI ; MeSwellenlange 368 nm.

Polarographie

Gerat: Polarecord Metrohm E 506 mit Polarographiestand E 505; Entluftung mit Reinststickstoff; differential pulse mode. Reagenzien: Nitromethan, frisch dest.; Extrelut-Saulen (E. Merck, Darmstadt); Methanol p. a.; Britton Robinson-Puffer pH 5 (0.04M H, PO,, 0.04M CH, COOH. 0.04 M H,BO,, 0.02M NaOH 100 + 100 + 100 + 105; dv/v).

Literntur

** Auszugsweise vorgetragen auf der Tagung der Deutschen Pharmazeutischen Gesellschaft in Tiibingen 1978. S. Ebel, R. Liedtke, B. MiSler, M. Richter und P. Surmann, Arch. Pharm. (Weinheim), 312, 689 (1979). K. H. Beyer, Biotransformation der Arzneimittel, Wissenschaftl. Verlagsges., Stuttgart 1975. S. Pfeifer, Biotransformation von Arzneimitteln, Bd. 2, S. 257, Verlag Chemie, Weinheim 1977. I. A. Buzard et al., Antibiot. Chemother. (Basel) 6, 702 (1956).

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312/79 Pyrazole und Pyrazolo-pyrimidine 703

5 N. Nakamura und A. R. Takeda, Res. Labor. Rec. 20, 21 (1961). 6 P. Mannisto, Int. J. Clin. Pharmacol. Ther. Toxicol. 16, 223 (1978). 7 J. D. Conklin und R. D. Hollifield, Clin. Chem. (N. Y.) 12, 690 (1966). 8 J. D. Conklin und F. J . Hailey, Clin. Pharmacol. Ther. 10. 534 (1969). 9 K. S. Albert et al., J. Clin. Pharmacol. 1 1 . 264 (1974). 10 G L. Mattock, I. J. Mc Gilveray und C. Charette, Clin. Chem. (N. Y.) 16. 820 (1970). 11 S. Ebel und B. MiBler, unveriiffentlichte Messungen. 12 R. Griining, Dtsch. Apoth. Ztg. I l X , 13.54 (1978). 13 P. Surmann, unveroffentlichte Messungen. 14 S. Ebel, M. Richter und P. Surmann, Fresenius Z . Anal. Chem. (im Druck). 15 S. Ebel, J. Hocke. M. Richter und P. Surmann, Veroffentlichung in Vorbereitung. 16 D. E. Cadwallader und H. W. Jun in K. Florey (Hrsg.), Analytical Profiles of Drug Substances 5.

17 S. Ebel, Handbuch der Arzneimittelanalytik, Verlag Chemie, Weinheim 1977. S. 34.5, Academic Press, New York 1976.

(Ph 481

Arch. Pharm. (Weinheim) 312, 703-707 (1979)

Pyrazoles and Pyrazolo[3,4-d]pyrimidines as BiologicallyActive Agents, 11’)

Vishnu Ji Ram* and Hrishikesh Pandey

Department of Chemistry, S. C. College, Ballia (U. P.) India Eingegangen am 25. Oktober 1978

Pyrazoles with bio-active substituents at different positions are prepared and cyclised to the corresponding pyrazolo[3,4-d]pyrimidines in order to establish structure-activity relationships. The structure of the compounds is established by micro-analyses and spectroscopic studies.

Pyrazole und Pynzolol3,4-d ]pyrimidine nls biologisch aktive Verbindungen, 2. Mitt.

Es werden Pyrazole mit bioaktiven Substituenten in verschiedenen Positionen hergestellt und zu den entsprechenden Pyrazolo[3,4-d]pyrimidinen zyklisiert, urn Struktur-Wirkungsbeziehungen aufzustel- len. Die Struktur der Verbindungen wird durch Mikroanalysen und spektroskopische Daten gesichert.

The tranquilizing, muscle relaxant, psychoanaleptic’), hypnotic’), ant icon~ulsant~~~), antipyretic6) and antican~er’~), activities of pyrazoles prompted the synthesis of 1,3,4,5-tetrasubstituted pyrazoles. Recently MetcalP) has discussed cholinesterase inhibiting property of such compounds which show systemic insecticidal activity and related the presence of alkylthiosubstituents in these compounds and

03654233/7Y/07074703 S 02.50/0

0 Verlag Chemie. GmbH. Weinheim 1Y7Y