Universitatea de Ştiinte Agricole şi Medicină VeterinarăCluj-NapocaFacultatea de Horticultură

Caracterizarea taxonomică a ghimbirului Malaezian (Zingiber officinale Roscoe)

utilizând gaz cromatografia şi spectrometria de masă

Masterandă:

Teleky Bernadette-Emoke

Cluj – Napoca

Cuprins

Cap. I. – Zingiber officinale

1. Privire de ansamblu............................................................................... 32. Clasificare ştiinţifică ............................................................................. 33. Etimologie ............................................................................................. 34. Utilizări culinare .................................................................................... 35. Utilizări medicale .................................................................................. 46. Utilizări externe .................................................................................... 57. Compoziţie chimică .............................................................................. 5

Cap. II. – Metoda GC – MS

1. Principiul cromatografiei gazoase ........................................................ 72. Detectori utilizaţi în GC ....................................................................... 103. Ionizarea prin impact electronic ........................................................... 12

Cap. III. - Caracterizarea taxonomică a ghimbirului Malaezian

1. Amprenta metabolomică ..................................................................... 132. Materiale şi metode ............................................................................. 143. Rezultate .............................................................................................. 174. Discuţii ................................................................................................ 245. Concluzii ............................................................................................. 25

Bibliografie

2

Cap. I. Ghimbir (Zingiber officinale)

1. Privire de ansamblu

Ghimbirul (Zingiber officinale), denumit în trecut și ghimber, este numele dat

unei plante erbacee din regiunile tropicale, cu rizom aromatic bogat în uleiuri eterice. Este o

specie perenă care are nevoie de o temperatură ridicată și constantă precum și de o umiditate

permanentă pentru a se dezvolta corespunzător. Rizomul de ghimbir are o formă neregulată,

contorsionată şi e noduros, atingând până la 5-6 centimetri în lungime.

Ghimbirul e deosebit de prețuit în bucătăriile orientale cum ar fi

cea chineză, indiană, tailandeză, etc. Rizomul nu se consumă crud, ci se curăță îndepărtându-

se coaja, și se taie în felii care se gătesc ca acompaniment la cărnuri sau sosuri, în

salate, curry-uri etc. Ghimbirul se consumă câteodată în forma sa pisată, mărunțită. În acest

caz ghimbirul e o pulbere fină asemănătoare piperului alb. De altfel un nume alternativ al

ghimbirului, introdus de turci în Moldova și Muntenia a fost cel de 'piper alb'.

Denumirea de ghimbir a fost folosită mai ales în Banat și Transilvania provenind

din maghiarul gyömber, iar apoi s-a impus în intreaga țară. În fostele colonii britanice, cum ar

fi Canada, Australia, Jamaica, Kenia, se consumă o așa-zisă "bere" din ghimber (ginger beer)

care de fapt este o băutură ne-alcoolică, răcoritoare.

2. Clasificare ştiinţifică

Regn : PlantaeÎncrengătură : MagnoliophytaClasă : LiliopsidaOrdin : ZingiberalesFamilie : ZingiberaceaeGen : “Zingiber”Specie : Z. OfficinaleNume binomial : Zingiber officinale Roscoe

3. Etimologie

Cuvântul "ghimbir" provine, asemenea altor denumiri ale plantei în mai multe limbi

europene (”Ingwer” în germană, ”gingembre” în franceză, ”ghimbir” în română, ”zenzero” în

italiană, ”ginger” în engleză etc.) din latinescul ”zingiber”, împrumutat şi el din greaca veche

(”zingiberis”).

Cum India a fost sursa de ghimbir a Europei în antichitate, denumirea greacă este, de

fapt, o preluare din limbile vorbite pe teritoriul Indiei în acea perioadă: ”singivera” în pali şi

”shringavera” în sanscrită. Aceste denumiri înseamnă ”în formă de corn de cerb”.

3

Cu toate că denumirile în majoritatea limbilor europene provin din greaca veche, în

mod surprinzător grecii contemporani îl numesc ”piperoriza” (rădăcina de piper), cu referire

la gustul iute al rizomului.

4. Utilizări culinare

Ghimbirul este, poate, cel mai versatil condiment, fiind folosit în absolut toate tipurile

de preparate, de la sosuri, supe si feluri principale, până la deserturi şi băuturi. Deşi a fost

încă de pe vremea romanilor un condiment important, popularitatea acestuia a scăzut

temporar in Europa, cel mai probabil din cauză că ghimbirul proaspăt era arareori

comercializat pe continent. Situaţia s-a schimbat o dată ce acesta a devenit mult mai

disponibil, şi datorită popularităţii crescute a bucătăriei asiatice.

Dacă ghimbirul proaspăt este fiert, iuteala sa creşte, iar aroma scade. Thailandezii

folosesc ghimbir dat prin răzătoare, alături de alte condimente, la prepararea pastele de curry.

Indonezienii utilizează frecvent paste condimentate pe bază de ghimbir proaspăt şi ardei iuţi

proaspeţi, cu care marinează carnea înainte de a o găti.

Ghimbirul prăjit are un gust diferit, iuteala sa domolindu-se. Merge foarte bine prăjit

alături de usturoi, sau ceapă. Indienii folosesc adesea această tehnică pentru a obţine sosuri

delicioase cu care asezonează mâncărurile de legume şi carne.

În bucătăria chineză ghimbirul este folosit atât prăjit cât şi fiert. Mâncarea care fierbe

inăbuşit mai mult timp este aromată cu feliuţe de ghimbir, care işi eliberează aroma destul de

repede. Tehnica chinezească stir-fry (chao), care înseamnă gătirea pe foc iute, rapidă a

mâncării, cu amestecare continuă, cere adesea ghimbir mărunţit sau dat prin răzătoare.

Ghimbirul ocupă un loc important în bucătăria japoneză, unde este folosit în cantităţi

mici. De exemplu, carnea de pui este aromată prin stropire cu sucul obţinut prin stoarcerea

ghimbirului proaspăt. Ghimbirul murat, (beni shoga), este preparat din rizomi foarte tineri şi

este adesea servit alături de sushi. ”Ginger ale” este o băutură foarte populară in SUA. Nu

este o bere fermentată, ci doar zahăr, extract de plante şi apă gazoasă. Oricum, în Evul Mediu

ghimbirul a fost folosit şi la aromatizarea berii adevarăte.

Ghimbirul uscat este destul de diferit ca gust şi nu poate substitui rizomul proaspăt. El

este doar un ingredient opţional în unele amestecuri de condimente, ca pudra de curry, ”5

arome” şi bere. Ghimbirul uscat nu este folosit în regiunile unde acesta este cultivat. Gustul

său este mai mult aromat decât iute şi este folosit în Europa la prepararea unor deserturi.

5. Utilizări medicale

Recunoscut de asiatici încă din secolul I ca o plantă medicinală cu efecte rapide asupra problemelor reumatice şi digestive, ghimbirul este studiat acum în vestite laboratoare de medicii europeni. Când a fost descoperită, rădăcina de ghimbir era folosită ca un agent antiinflamator şi împotriva senzaţiei de vomă. Specialiştii precizează că mii de ani ghimbirul a fost administrat, în special, bolnavilor cu artrită reumatoidă. Acţiunea sa antiinflamatoare l-a recomandat cu succes acestei categorii de bolnavi.

4

Fitoterapeuţii au constatat că, spre deosebire de medicamentele alopate, ghimbirul scuteşte această categorie de bolnavi de efectele secundare ale medicamentelor folosite pe termen lung - mai ales ulcerele de stomac. Cercetările continuă în acest sens, pentru a se dovedi cum poate să neutralizeze planta acizii inflamatori din articulaţii. Specialiştii homeopaţi au ajuns la concluzia că ghimbirul mai poate înlătura greaţa ce se datorează deplasării cu maşina, avionul sau vaporul. Un alt studiu a dovedit efectele plantei, după intervenţii chirurgicale, care impun anestezia generală. Un test efectuat asupra unui lot de 30 de femei care au fost supuse anesteziei generale în timpul unor intervenţii ginecologice a demonstrat efectele sale puternice în combaterea stării de vomă.

Ceaiul din rădăcină de ghimbir s-a dovedit eficient şi în tratamentul bolnavilor de cancer care au făcut chimioterapie. De aceea este studiat şi pentru proprietăţile sale anticancerigene. În privinţa greţurilor „de mişcare", planta a dat rezultate excelente într-un procent impresionant - de peste 90% la persoanele care au testat-o. Pe langă faptul că le înlătură greaţa, ghimbirul îi ajută şi pe cei cu ameţeli şi vertijuri.

Ca afrodisiac este folosită mai ales rădăcina. Ghimbirul intra in multe combinatii afrodisiace alaturi de miere, cardamon, scortisoara şi alte plante aromatice. Printre efectele benefice ale ghimbirului mentionam: inlaturarea starii de moleseala, a plictiselii sau a blazarii, redarea acuitatii gustative. Este una din ierburile menite sa trezeasca si sa reinvioreze fiinta.

6. Utilizări externe

Industria parfumurilor: graţie uleiului esenţial pe care îl conţine, rizomul de ghimbir emană o savoare de lămâie piperată şi conferă astfel căldură şi personalitate parfumurilor.

Industria cosmeticelor: La spitalele din Beijing, este utilizat în tratamentul alopeciilor (cheliilor) sub formă de rondele proaspete.

Cosmetologii europeni au fabricat loţiuni cu ghimbir pentru tonificarea şi revitalizarea părului. Loţiunile de corp pe bază de ghimbir au efecte de întinerire: hrănesc epiderma şi îi conferă fineţe şi supleţe. Fiind bogat în magneziu, fosfor şi acizi aminaţi, ghimbirul este omniprezent în formule revitalizante ale cremelor de faţă.

Medicina alternativă: Moleculele aromatice de ghimbir trimit impulsuri creierului imediat ce ating pielea, relaxând şi detensionând musculatura. Rădăcina încălzeşte meridianele de acupunctură. Terapeuţii folosesc uleiurile aromatice de ghimbir pentru fricţionarea zonelor unde se acumulează tensiuni negative: tâmplă, ceafă, încheieturi.

7. Compoziţie chimică

Rizomul de ghimbir are următoarea compoziţie chimică : 60% amidon, 10% proteine, 10% grăsimi, 5% fibre, 6% materiale inorganic,

5

10% umiditate reziduală, 1-4% Ulei esenţial.Procentul de ulei esenţial variază de originea geografică. Cu toate acestea, constituenţii

principali hidrocarburii sesquiterpene rămân constanţi. Acestea include (-)-zingiberene, (+)-ar-curcumene, (-)-ßsesquiphellandrene, E, E- a -farnesene, and b -bisabolene. Aceste uleiuri esenţiali apar alături de alcooli monoterpenici şi aldehide prezente ca glicozide. Un amestec de terpene multe şi nişte compuşi non-terpenoide formeză uleiul esenţial.

Rizomul conţine o varietate de chimicale denumite gingeroli care furnizează gustul său distinctive şi efectele farmaceutice caracteristice. Constituenţii chimici răspunzători pentru gustul iute sunt 1-(3’ –methoxy –4’-hydroxypheny1)-5-hydroxyalkan- 3-ones, deasemenea cunoscute sub denumirea de [3-6]-, [8]-, [10]-,and [12]-gingerol.

Compuşi fenolici : shogaol şi gingerolSesquiterpene : bisapolene, zingiberene, zingiberol, sesquiphellandrene, curcumeneAltele : 6-dehzdrogingerdione, galanolactone, acid gingesulfonic, zingerone, geraniol, neral, monoacyldigalactosylglyceroli, gingerglycolipide

Cap. II. METODA CROMATOGRAFIEI GAZOASE CUPLATE CU

SPECTROMETRIE DE MASĂ (GC-MS)

6

Dacă gaz cromatografia era la început aplicată doar analizelor compuşilor volatili,

studiile ulterioare au revoluţionat chimia separărilor. În prezent, GC poate fi utilizată atât

pentru probe gazoase, cât şi pentru soluţii lichide şi solide volatile. Dacă proba analizată este

nevolatilă, se pot folosi tehnicile de derivatizare sau piroliză GC .

Tehnica cromatografiei gazoase cuplată cu spectrometria de masă se bazează pe

natura şi distribuţia fragmentelor moleculare rezultate prin bombardarea componenţilor

probei cu electroni de o anumită energie. Spectrometria de masă este cea mai performantă şi

sigură tehnică de identificare a compuşilor, întrucât face posibilă compararea numerelor de

masă obţinute cu numerele de masă a unor compuşi cunoscuţi, din librăria de spectre.

Datorită acestui fapt, toate metodele bazate pe cromatografie fără utilizarea MS, trebuie

confirmate prin spectrometrie de masă, prevede Decizia Comisiei Europene 2002/657/CE.

1. Principiul cromatografiei gazoase

Ca principiu de funcţionare, cromatografia gazoasă realizează separarea substanţelor

volatile pe baza adsorbţiei sau repartiţiei lor într-o fază staţionară (solidă sau lichidă) şi o fază

mobilă gazoasă ( un gaz sau un amestec de gaze).

În funcţie de natura fazei staţionare, gaz cromatografia se poate diviza în

cromatografie gaz-solid (GSC) şi cromatografie gaz-lichid (LGC). În primul caz, faza

staţionară introdusă în coloana cromatografică este adsorbant sau suport polar activ, iar în al

doilea caz suportul este legat chimic de o peliculă de lichid nepolar cu tensiune de vapori

mică, nevolatil la temperatura de lucru. Faza mobilă este constituită din gaze inerte (H , N ,

He, Ar, CO ) care nu sunt reţinute de faza staţionară.

Faza mobilă se deplasează de-a lungul coloanei prin porii fazei staţionare. Dacă la

capătul superior al coloanei se introduce amestecul de separat în stare de vapori, fiecare

component al amestecului va fi transportat diferenţiat de gaz, menţinându-se un echilibru

între cantitatea reţinută în faza staţionară şi cantitatea din faza mobilă. Dintr-un amestec de

substanţe, fiecare component va fi separat la timpi de retenţie (t ) diferiţi. Efluentul care

părăseşte coloana este analizat de un detector care permite trasarea cromatogramei: variaţia

concentraţiei fiecărui component eliminat din coloană în funcţie de timpul de retenţie pe

coloană sau variaţia concentraţiei în funcţie de volumul efluentului.

Separarea se poate face în sistem izoterm şi izobar (temperatura, debitul fazei mobile

şi presiunea în coloană sunt constante) sau în sistem de gradient (variază unul sau doi dintre

parametri, de obicei temperatura coloanei sau debitul gazului purtător). Separarea compuşilor

7

este realizată atât de stratul activ al coloanei, cât şi de programarea temperaturii (separarea

compuşilor condensaţi în capul coloanei pe baza punctelor de fierbere). Între factorii care pot

influenţa capacitatea separării se numără: numărul de talere teoretice din stratul

cromatografic, factorul de separare şi volumul de retenţie a componentelor (Socaciu, 2000).

Un cromatograf de gaze conţine următoarele componente principale: butelia cu gazul

transportor, injectorul, coloana de separare situată într-un cuptor termostatat, detectorul şi

înregistratorul.

Schema de principiu a unui gaz cromatograf

Coloanele cromatografice sunt foarte diverse, cu lungimi, diametre, compoziţii

diferite, în funcţie de natura componenţilor de separat. Se disting două tipuri de coloane:

coloane cu umplutură ce conţin suporturi solide şi care pot fi analitice sau preparative în

funcţie de lungime şi coloane capilare construite dintr-un tub de oţel moale sau Cu, Al, sticlă,

în care pereţii interiori pot fi folosiţi ca atare, ca fază staţionară sau pot fi tapetaţi cu o fază

staţionară. Coloanele capilare sunt net superioare celor cu umplutură, larga lor utilizare

datorându-se eficienţei ridicate de separare a acestora.

Numărul de talere teoretice este proporţional cu lungimea coloanei, deci pentru

separări optime se folosesc coloane lungi. Diametrul interior al coloanelor este de 2-500mm

pentru coloanele clasice şi <1mm pentru coloanele capilare. Diametrul interior influenţează

viteza optimă a gazului transportor, capacitatea de lucru a coloanei şi cantitatea maximă de

material separat. Cu cât diametrul coloanei este mai mic, separarea este mai performantă.

Umplutura coloanelor clasice depinde de tipul cromatografiei, astfel în GSC se folosesc faze

staţionare active: cărbune activ, silicagel, alumină, site moleculare, zeoliţi, sticlă poroasă,

silicat de Mg. Întrucât energiile de absorbţie sunt mai mari decât energiile de disociere,

8

analiza se realizează la temperaturi mai mari decât în GLC. Faza staţionară în GLC este

constituită dintr-un suport inactiv, poros (suprafaţa specifică de 1-10 m /g) impregnat 5-20%

cu un lichid. Faza staţionară astfel constituită este repartizată uniform ca peliculă subţire pe

pereţii coloanei, pentru a opune rezistenţă cât mai mică amestecului de separat. Suporturile

poroase folosite sunt: Chromosorb W sau P, celita, pământul de diatomee, produsele Brique

C , iar suporturile mai puţin poroase sunt: bile de sticlă, pudra de teflon, grafit, polietilenă

microporoasă. Înălţimea unui taler teoretic este proporţională cu diametrul particulelor. Este

important ca particulele să aibă dimensiuni apropiate. Pentru a elimina proprietăţile

absorbante ale suportului se pot face tratamente chimice cu dimetildiclorsilan sau acoperirea

suportului cu polivinilpirolidonă (PVP), cu teflon sau argintare.

În alegerea fazei staţionare trebuie să se ţină seama de tipul substanţelor de separat

(polaritate, legături de hidrogen, etc.), de interacţiunile chimice posibile cu faza staţionară sau

faza mobilă, de capacitatea de adsorbţie pe suport. S-a făcut o scală de selectivitate a

lichidelor staţionare care începe cu squalenul (nepolar) şi se încheie cu β, β’- dioxipropionitril

(cel mai polar). Suportul impregnat cu lichid este încălzit într-un curent de gaz inert la o

temperatură apropiată de cea de separare. Umplerea coloanei se face sub vid, iar

condiţionarea ei constă în încălzire sub curent de gaz purtător la temperatură înaltă pentru a

îndepărta impurităţile volatile.

Coloanele capilare pot fi constituite din tuburi goale în care faza staţionară nu este

fixată pe suport, fiind repartizată uniform pe pereţii interiori ai coloanei. Practic se realizează

o peliculă foarte subţire prin evaporarea fazei staţionare lichide. Diametrul interior este de

0.25-0.5mm, iar lungimea de 20-50m, realizându-se aproximativ 10000 talere teoretice.

Proba nu se introduce direct în coloană, ci printr-o cameră de injectare a cărei formă şi

volum influenţează mult separarea. Această cameră are o temperatură mai mare decât

coloana, permiţând evaporarea probei. Volumul probei trebuie să fie cât mai mic. Când

coloanele sunt supraîncărcate, se reduce numărul de talere teoretice, creşte înălţimea unui

taler şi picurile devin asimetrice şi cu lăţime mare. Injectarea probei poate fi făcută cu sau

fără splitare. În cel de-al doilea caz, toată cantitatea injectată intră în coloana cromatografică.

Pentru compuşii mai volatili decât solventul este obligatoriu să se lucreze cu splitare: o parte

din extractul de injectat va intra în coloană, o parte va fi direcţionată în exteriorul

cromatografului. În calculul concentraţiilor componenţilor determinaţi se va ţine seama de

raportul de splitare, care are practic semnificaţia unei diluţii.

9

Analiza unei probe implică etapele de pregătire a probei, de separare a componenţilor

şi de evaluare calitativă şi cantitativă a componenţilor separaţi. Analiza calitativă presupune

identificarea fiecărui pic din cromatogramă. Analiza cantitativă se face prin integrarea

picurilor şi calculul ariilor acestora, exprimate ca procent din totalul picurilor. Acest procent

este proporţional cu ponderea fiecărei componente în amestec. Pentru a exprima în valori

absolute cantitatea fiecărei componente din amestec, trebuie determinată concentraţia totală a

substanţelor în amestec şi apoi pe baza procentelor deduse din cromatograme se calculează

concentraţia fiecărei componente.

2. Detectori utilizaţi în cromatografía gazoasă

Detectorul pune în evidenţă componentele separate pe coloana cromatografică, sub

forma unor semnale electrice care pot fi înregistrate. Detectorul trebuie să deosebească o

proprietate oarecare a componentului de analizat faţă de gazul purtător. Există detectori

universali, sensibili la un număr mare de componenţi şi specifici, sensibili numai la anumiţi

componenţi (la anumite grupări funcţionale sau legături chimice).

Caracteristicile detectorului:

sensibilitate cât mai mare pentru a putea detecta chiar şi urmele de componenţi şi pentru a

nu fi necesară încărcarea coloanei cu cantităţi mult prea mari de probă

viteză de răspuns cât mai mare

liniaritate: sensibilitatea detectorului să rămână constantă într-un domeniu larg de

concentraţii

limită de sensibilitate ( concentraţia minimă de substanţă în eluent pentru care se obţine un

pic) cât mai joasă

stabilitate: linia de fond şi reproductibilitatea să fie cât mai puţin afectate de condiţiile de

lucru (temperatură, debit, presiune, etc) .

Cele mai importante tipuri de detectori sunt:

. Detectorul de conductibilitate termică (DCT) a fost primul care a apărut, făcând

parte din categoria detectorilor universali. Se mai numeşte şi catarometru, este nedestructiv,

10

putând fi utilizat şi în cromatografia preparativă. Principiul de funcţionare se bazează pe

diferenţa de conductibilitate termică dintre component şi eluent.

. Detectorul cu flacără de ionizare (FID) este tipul de detector cel mai mult folosit

în GC. Principiul de funcţionare constă în măsurarea conductibilităţii electrice a unei flăcări

de hidrogen în prezenţa unui compus organic. La ieşirea din coloană, eluentul este amestecat

cu un curent de hidrogen şi este aprins la capătul unei duze din oţel inoxidabil. Creând un

câmp electric între duză şi un electrod colector aşezat deasupra flăcării, se stabileşte un curent

slab (10-14 A) între cei doi electrozi prin flacără. Apariţia în flacără a unui compus organic

măreşte intensitatea curentului datorită ionizării acestuia în funcţie de natura şi concentraţia

componentului respectiv. Acest curent va fi amplificat şi apoi înregistrat. Detectorul FID are

o sensibilitate înaltă, stabilitate pe termen lung, răspuns al semnalului rapid, simplitate în

operare şi întreţinere.

. Detectorul cu captură de electroni (ECD) prezintă o mare sensibilitate pentru

compuşii capabili de captură de electroni, cum ar fi compuşii conţinând halogeni. Mulţi

compuşi de interes biologic prezintă proprietatea de a capta electroni sau posilitatea de a fi

derivatizaţi cu compuşi care au această proprietate. Sursa de ionizare constă din tritiu sau Ni63

radiocactiv. Azotul se utilizează ca gaz purtător şi produce prin iradiere electroni şi ioni

pozitivi: N2 N2 + +e-

Datorită mobilităţii ridicate a electronilor liberi, nu are loc recombinarea lor cu ionii pozitivi.

Prin aplicarea unui câmp electric între electrozii camerei de ionizare, ionii formaţi prin

iradiere vor fi colectaţi. Prezenţa unor molecule cu afinitate ridicată pentru captarea

electronilor liberi favorizează formarea ionilor negativi:

[component] + e- [component]-

Ionii negativi se recombină cu ionii pozitivi mult mai uşor decât electronii liberi:

N2 + + [component]- [moleculă neutră]

Detectorul ECD are avantajul selectivităţii şi sensibilităţii foarte ridicate.

. Detectorul cu fotoionizare (DFI) are la bază ionizarea fotonică a moleculelor

probei şi măsurarea curentului format cu ajutorul electrodului colector cuplat cu un

electrometru.

11

. Spectrometrul de masă (MS): în urma ionizării în vid a moleculelor substanţei de

analizat, are loc fragmentarea acestora cu formarea unui grup de ioni caracteristici, cu mase

diferite. Procesele se desfăşoară în sursa de ionizare a spectrometrului. Ionii formaţi sunt

separaţi în funcţie de masa lor în analizorul de masă şi apoi sunt detectaţi şi înregistraţi.

Reprezentarea abundenţei lor (concentraţiei relative) în funcţie de masă constituie spectrul de

masă.

Ionizarea moleculelor poate avea loc în două modalităţi: prin impact electronic (EI) şi

ionizare chimică (CI).

Ionizarea prin impact electronic

În camera de ionizare se realizează un vid înaintat, de 10 -8 torr. Electronii proveniţi de

la un filament încălzit sunt focalizaţi în timp ce străbat camera şi colectaţi de un electrod

având un potenţial de 70V. Acesta îi conferă fiecărui electron o energie de 70eV. Dacă în

camera de ionizare se introduce o substanţă într-o cantitate suficientă ca presiunea să crească

la 10-5torr, ciocnirile dintre electroni şi moleculele compusului respectiv determină

fragmentarea acestora. Întrucât electronii la 70eV au energie suficientă pentru a rupe orice

legatură din moleculă, prin fragmentare se vor forma toţi ionii posibili. Din cauza presiunii

scăzute din camera de ionizare, numai o moleculă din aproximativ 106 va realiza ciocnirea şi

ionizarea. Fragmentele de molecule neutre şi de ioni formaţi nu se vor ciocni între ei, ci

numai cu pereţii camerei, fiind posibilă aşadar îndepărtarea lor din camera de ionizare şi

colectarea ionilor de mase diferite în detector.

Ionizarea EI duce la fragmentarea moleculei şi la obţinerea unui amestec complex de

ioni a căror masă si abundenţă relativă se poate utiliza pentru identificarea calitativă a

compuşilor respectivi. Spectrul de masă obţinut în asemenea condiţii va fi reproductibil şi

caracteristic pentru compusul respectiv. Primul ion care se formează în urma impactului este

aşa-numitul ion molecular, care are mare importanţă în identificarea substanţei deoarece are

aceeaşi masă cu masa moleculară a compusului respectiv. Din păcate însă, stabilitatea ionului

molecular este aşa de redusă (el se va fragmenta mai departe) încât, abundenţa sa relativă va

fi foarte mică şi identificarea de cele mai multe ori imposibilă. În consecinţă, a devenit

necesară utilizarea unei tehnici de ionizare mai blânde, prin care să se obţină informaţii

despre masa moleculară. Această tehnică este ionizarea chimică, introdusă în anul 1966.

Spectrele de masă cu ionizare chimică sunt produse prin reacţii ion-moleculare între

moleculele neutre ale componentului (10-5 torr) şi o presiune ridicată (0.2-2 torr) a plasmei de

ioni a gazului reactiv (de obicei metan sau izobutan). Gazul reactiv poate să înlocuiască gazul

purtător în GC-MS şi poate fi introdus direct în sursă, cu puţine efecte asupra rezoluţiei

12

cromatografice. Întrucât concentraţia gazului reactiv este cu câteva ordine de mărime peste

concentraţia probei, fasciculul de electroni ionizează gazul reactiv cu puţine molecule ale

probei ionizate direct. Deoarece sursa este operată la presiune înaltă comparativ cu sursa EI,

reacţiile ion-molecule sunt favorizate, realizându-se ionizarea probei. Aceste reacţii au loc cu

energie mică în comparaţie cu impactul direct cu electroni, abundenţa ionului molecular faţă

de alte fragmente rezultate va fi mare şi mecanismul de fragmentare va fi mult mai simplu.

Majoritatea tehnicilor de ionizare chimică lucrează cu ioni pozitivi, dar s-au dezvoltat

şi cele cu ioni negativi bazate pe captura unor electroni cu energie mai mică. Comparativ cu

ionizarea prin EI, ionizarea chimică prezintă dezavantajul că oferă rezultate mai puţin

reproductibile şi nu este posibilă alcătuirea unei librării de spectre care să fie folosită în

scopuri de identificare.

Spectrele de masă pot fi înregistrate sub formă de picuri cu maxime (forma originală a

spectrului), dar în practică se utilizează reprezentarea fiecărui pic sub forma unei linii. Celei

mai înalte linii din spectru i se atribuie arbitrar valoarea 100, iar restul sunt exprimate ca

procente faţă de aceasta, obţinându-se concentraţia diverselor fragmente ionice ca valori de

abundenţă relativă.

Cap. III. Caracterizarea taxonomică a ghimbirului Malaezian

Studiul de faţă utilizează metoda GC-MS (gaz-cromatografie şi spectrometrie de masă) bazat pe amprenta metabolică, pentru a putea examina dacă variaţia chimică este datorată factorilor environmentali sau factorilor genetici. Utilizând o abordare metabolomică

13

a fost determinat profilul chimic a trei explanturi de ghimbir micropropagate, cultivare numite Bukit Tinggi, Tanjung Sepat şi Sabah. Ma şi Gang (2006) au raportat convenienţa de utilizare a ţesutului de cultură a plantei ghimbir pentru detectarea variaţiei chimice. Ma şi Gang au arătat că nu există diferenţe semnificative între cultivarele din serele convenţionale şi plantele de ghimbir propagate-derivate in vitro.

1. Amprenta metabolomică

Amprenta metabolomică pare să fie cea mai ușoară apropiere pentru analiza metabolomică, analiză ce utilizează toate detectoarele de lectură pentru analiza numeric mai precis pentru a identifica metaboliții prezenți în aceste experimente.

În plus, amprenta metabolomică sunt aplicate pentru compararea modelului metabolomic destinate la descoperirea condițiilor experimentali care rezultă în răspunsuri metabolice similar sau identice. Această abordare este utilizată în analiza de funcție genetică și are un potențial de grupare a genelor cu funcții cunoscute și gene orfane cu funcții hipotetice sau neștiute în clase de funcții metabolice similar sau identice. Acest tip de model de analiză metabolică pare să fie cea mai promițătoare când modificările genetice rezultă în fenotipuri ”silențioase” (schimbări a statutului metabolic în organisme, care nu arată trăsături vizuale evidente sau morfologice)(Steinhauser și Kopka, 2007). Măsurarea numerelor mari de compuși a evoluat în ultimii ani (Last și colab., 2007). Aceste tehnici care cuplează cromatografia cu spectrometria de masă oferă cea mai mare confidență în identificarea și cuantificarea probelor (Fiehn și colab.,2000; Dunn,2008). Întrucât gaz cromatografia este potrivit numai compușilor non-polare stabile termic vrem să facem o detectare cuprinzătoare (pe cât posibil) a tuturor metaboliților, deci este necesară o derivatizare chimică. Derivatizarea este o recție chimică a unei probe care produce un produs mult mai volatile și stabil și care îmbunătățește comportarea gaz cromatogramei peste substanțele originale (Kitson și colab. 1996). În majoritatea cazurilor, derivatizarea este efectuată pentru a converti grupurile N-H polar, O-H și S-H în grupuri non-polari și stabile termice(Gullberg,2005;AnalytiX Newsletters, 2008; Hübschmann, 2001). Amprenta metabolic ca și o abordare a metabolomiei, este o analiză cuprinzătoare și un tr4ansfer mare de probe brute sau extracte de probe cu cerințe minime pentru prepararea probei (Dunn și colab., 2005). Amprenta metabolomică este adecvat pentru utilizarea de clasificare a probelor (Halket și colab., 2005) sau ecranizarea probelor care utiliyeayă toate citirile detectoare pentru analiza numeric (Fiehn, 2002). Analiza amprentei metabolomice pare să fie cea mai promițătoare când rezultă modificări de gene în fenotipuri „silențioase” sau mutații silențioase. Fenotipurile silențioase sunt definite mai bine ca și modificări a stării metabolice în organisme, care nu arată modificări vizuale sau morfologice (Steinhauser și Kopka, 2007).

2. Materiale și metode

În studiul de față, am efectuat o analiză a amprentei metabolice la frunzele de ghimbir micropropagate din cultivarele Bukit Tinggi, Tanjung Sepat și Sabah într-o tentativă de a detecta variații chimice prezente printre cele trei cultivare de ghimbir. Gradul de corelare

14

prezentă între cultivarele de ghimbir va fi examinată, bazat pe compararea directă a metaboliților ghimbirului.

Materialul vegetal : Rizomi de ghimbir de nouă luni din cultivarele Bukit Tinggi, Tanjung sepat și Sabah obținute din regiunile de plantație originale din Malaezia. Un mugure tânăr, steril de ghimbir este utilizat pentru inițierea unei culturi de stoc a platulelor de ghimbir crescute în Murashige and Skoog (MS) un mediu care conține 3% (w/v) zaharoză; 2 mg L-1 1-naphtalen acid acetic în combinație cu 2 mg L-1 kinetin ca hormoni de creștere și agar 0.08% (w/v). Explantul de ghimbir au fost subculturate lunar pentru a elimina reportarea efectelor condițiilor de dinainte de creștere (din sursa originală) pe compoziția chimică și pentru a putea fi asigurată de condiția de creștere uniformă care a trebuit să fie asigurată egal la toate plantele. În acest experiment au fost utilizate explanturi de ghimbir de trei luni. (Fig. 1.).

Fig. 1. Explant de ghimbir vechi de trei luni

Instrumente : Mojar și pisă, Centrifugă (Rotofix 32, hettich Zentrifugen, Germany), Incubator shaker (innova 4000, M1192, NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC), Evaporator de centrifugare (VR-maxi st. a. – 1, Heto vacuum centrifuge, Heto Holten A/s, Denmark), Incubator (incubator de precizie, BE 400, Memmert) și GC-MS System (Agilent Technologies 6890N network GC system)(Fig. 2.).

15

Fig. 2. Poza cu GC-MS utilizat în studio (Agilent Technologies 6890N network GC system)

Pregătirea probei : Prepararea probei a fost făcută conform Jiang și colab. (2005) metodă cu o mică schimbare. Pentru fiecare cultivar de ghimbir, au fost recoltate trei probe de explanturi (vechi de trei luni), frunzele au fost tăiate și scufundate imediat în azot lichid pentru a opri orice activitate enzimatică care ar putea bduce la orice fel de modificare a constituenților chimici. Ulterior, frunzele de ghimbir au fost măcinate într-o pulbere fină cât timp au fost ținute sub îngheț în azot lichid și omogenizate. Pe urmă probele de plante au fost stocate la -80˚C în congelator pînă la următoarea utilizare (cel mult trei săptămâni).

Extracția metaboliților polari și non-polari : Protocolul de extracție a fost efectuat după Shepherd și colab. (2007) cu unele modificări. Pe scurt, 500 mg de pulbere fină, înghețată din Frunze de ghimbir au fost cântărite și transferate imediat într-un tub de cultură din sticlă (125x16 mm) cu un conținut de 3 mL metanol. Un standard intern non-polar 100 μL de zaharoză (2.5 mg mL-1) au fost adăugate ca și standard intern polar; agitat viguros pe un incubator agitator timp de 30 min la 60˚C, înainte de adăugarea a 6 mL de cloroform. Amestecul rezultat a fost agitat în continuare timp de 60 min la 60˚C. A fost adăugat unu și jumate de mililitri de apă distilată și amestecată viguros de mână, după aceea a fost separate prin centrifugare la o viteză de 4000 rpm timp de 3 min. O fracție polară metanolică (strat superior) a fost separată de o fracție non-polară de cloroform (strat inferior) cu o pipetă și transferată într-un flacon de sticlă de 5 mL. Ambele fracțiuni erau procesate direct sau

16

alternative stocate la -20˚C până la următoarea folosință. Fracția metanolică a putut fi stocată imediat întrucât fracția de cloroform erau evaporate până la uscare sub un gaz de azot.

Derivatizarea fracției metanolice : Derivatizarea fracțiunei metanolice a mers conform Shepher și colab. (2007) cu o mică modificare. Un milimetru de fracțiune metanolică a fost transferată într-un tub eppendorf și evaporate până la uscăciune utilizând un evaporator de centrifugă. Ulterior, 40 μL de 20 mg mL-1 hidrochloride metoxiaminic în piridină anhidru a fost adăugată la fracțiunea uscată și după aceea proba a fost incubată la 30˚C pentru 90 min cu o continuă agitare. MSTFA (40 μL) a fost adăugat și incubat la 37˚C pentru 60 min. Proba derivatizată (de mărime 40 μL) a fost diluat cu 60 μL n-heptane și 1μL de probă a fost injectată în GC-MS.

Derivatizarea fracției de cloroform : Pentru această fracție, protocolul a demers conform Shepherd și colab. (2007) cu o mică modificare. Toată fracțiunea a fost evaporată până la uscăciune sub un gaz de azot uscat și pur. Două milimetri de acid sulphuric metanolic (1% v/v) a fost adăugat și incubat pe seară la 50˚C pentru trans-esterificare. Cinci mililitri de clorură de sodium (5% w/v) și 3 mL de cloroform a fost adăugat la probă, acest amestec a fost agitat și lăsat să se separe in două straturi. Stratul superior apos a fost eliminat. La stratul inferior am adăugat 3 mL de bicarbonate de sodium ( 2% w/v), după agitare este lăsat să se separe. Stratul inferior de cloroform a fost îndepărtat, uscat sub un sulfat de sodium anhidru după ce a fost evaporate până la uscăciune utilizând gaz de azot. Fracțiunea uscată a fost solubilizată în 50 μL de cloroform și 10 μL de piridină. Derivatizarea a fost realizat cu 80 μL MSTFA la 37 ˚C pentru 60 min, după ce, 40 μL de probă derivatizată a fost luată și amestecată cu 60 μL n-Heptan și 1 μL de probă a fost injectată în GC-MS pentru analiză.

Condiții de GC-MS : Următoarele parametrii de operare au fost utilizate : GC capilar cu o coloană HP-5MS 5% fenil metal siloxane ( 30x0,25 mm i.d. X0,25 mm de grosime a unui film), un gaz purtător de Helium (rata de curgere 1,2 mL min-1) și fără o ruptură de mod de injectare. Temperatura de injectare este de 250 ˚C, temperatura cuptorului era setată inițial la 50 ˚C, după care este ridicată la 250 ˚C la o rată de 10 ˚C min-1 până la sfârșitul analizei. Analiții impregnați care au fost detectați utilizând (rețeaua 5973) cu detector de masă selectivă și un Ionizator cu Impact Electronic (EID) a fost purtată afară la 70eV. Datele au fost procurate utilizând un ChemStation intensificat G1701CA versiunea C00.0021, tehnologie Agilent. Identitatea compușilor va controlată, verificată utilizând un Wiley7n.1 bază de date spectru.

3. Rezultate

Principalul criteriu pentru selectarea unor ioni convenabili la identificarea compusului ar fi să aibă un areal mare de vârf (>0.05 % ) și ar trebui să fie unic și/sau bine rezolvată de alți ioni cu aceeași masă de încărcare rata (m/z) în fereastra definită. Identificarea compușilor indicate in librărie caută programme care să fie mai mult de 80% văzând că aproape imită (Jiang și colab., 2006). Compușii erau identificați prin analize standard, compararea cu wiley7n.1 baza de date din librarie. Spectrul pentru fiecare compus impregnate a fost după aceea comparat manual cu date și spectrul standard (NIST Chemistry WebBook) pentru dea

17

mai buna imitare pentru a determina dacă ionul molecular al vârful picului și modelul de fragmentare chiar se potrivesc. Noi am găsit în total în jur de 314-385 metaboliți care au constat atât din compusi polari cât și nepolari (Tabelul 1) care a fost detectat din amprenta metabolică a GC-MS a frunzelor celor trei cultivare de ghimbir din Bukit Tinggi, Tanjung Sepat și Sabah.

Aproximativ 30% din numărul total de picuri au putut fi identificați atât în fracțiunea de metanol cât și în cloroform din cultivarul de ghimbir Bukit Tinggi , în timp ce doar 24 și 25,7 % din totalul picurilor erau identificate dic cultivarele de ghimbir din Tanjung Sepat și Sabah. De astfel, bazat pe fragmentarea GC-MS, trei diferite clase de metabolite erau detectați din cultivarele de ghimbit, numite aminoacizi, carbohidrați și niște acizi organic.

Cromatograma GC-MS a fracției metanolice (Figura 3-5) si fracția de cloroform (Figura 6-8) a celor trei probe din extractul de frunze de ghimbir au arătat calitativ diferențe aparente în tipul metaboliților (tabelul 2 și 3). Fracția polară a ghimbirului din cultivarul Bukit Tinggi a conținut un remarcabil înalt nivel de zahăr comparat cu celelalte două cultivare în timpul de retenție în jur de 33-42 de minute. Cultivarul Tanjung Sepat a arătat un nivel relative înalt în aminoacizi mai mult decât în cultivarele din Sabah și Tanjung Sepat în timpul de retenție din fereastră la 19-29 min.

Tabelul 1. Numărul de metaboliți detectați în fracțiunea de metanol și cloroform în diferite cultivare de ghimbir

Cultivarul de ghimbir

Metaboliţi detectați în fracția metanolică

Metaboliți detectați în fracția de cloroform

Nr. Total de metaboliți

Bukit TinggiTanjung SepatSabah

207174169

178141145

385315314

18

Figura 3 : Cromatograma totală a ionilor (TIC) a MSTFA fracțiunea de metanol derivatizată a ghimbirului (Z. Officinale Roscoe) a frunzelor din cultivarul Bukit Tinggi folosind GC-MS.

Figura 4: Cromatograma totală a ionilor (TIC) a MSTFA fracția derivatizată metanolică a frunzelor de ghimbir (Z. Officinale Roscoe) din cultivarul Tanjung Sepat utilizând GC-MS

19

În orice caz, o mică diferență în nivelul metaboliților a fost detectată între cele trei cultivare de ghimbir (Tabelul 4 și 5).

Tabelul 2: O comparație calitativă a tipurilor de metaboliți în fracția metanolică

Rt.±SD(n=3)(min)

IdentitateaBT

CultivareleTS SB (m/z)

19.70±0.0420.00±0.0521.68±0.0522.38±0.0525.69±0.0527.98±0.0829.21±0.0031.66±0.0432.58±0.02

I-ThreonineGlycineL-SerineL-ThreonineL-Aspartic acidGlutamic acidL-AsparagineRibonic acidSorbose

---------

+++++++++

++++++-+-

248276278291232363231333437

-De notat: BT – Bukit Tinggi; TS – Tanjung Sepat; SB – Sabah; Rt – timpul de retenție; (+) – Se referă la compusii prezenți; (-) – se referă la absența compușilor

Tabelul 3: O comparație calitativă a nivelului metaboliților în fracția de cloroform

Rt.(min)

IdentitateaBT

CultivareleTS SB (m/z)

19.1227.05

28.4729.81

30.2732.5834,0735.1437.8538.9242.4548.9849.6652.4553.24

2-Tertiobutil cyclohexyl acetate3,5- Dymethyl-2,4,6-tri chloro

phenolCarbamothioic acid

1,3,5-tricyano-2-(trichloro ethenyl) benzene

ThymineDibutyl phthalateNormethandrone

2(1H)-NaphthalenoneHeptadecanoic acid

11-TricoseneRicinelaidic acid

StigmasterolPentacosanoic acid

Cerotic acidβ - Sitosterol

-+

++

+-+-+++-+++

+-

--

-+-+-+--+--

+-

--

-------+--+

138224

151281

270223288208342111328484396410396

-De notat: BT – Bukit Tinggi; TS – Tanjung Sepat; SB – Sabah; Rt – timpul de retenție; (+) – Se referă la compusii prezenți; (-) – se referă la absența compușilor

20

Figura 5: Cromatograma totale a ionilor (TIC) a MSTFA fracția derivatizată a metanolului din frunzele de ghimbir (Z. Officinale Roscoe) din cultivarele Sabah utilizând GC-MS

Tabelul 4: O comparație cantitativă în nivelul metaboliților secundari în fracția metanolică

Rt.±SD(n=3)(min)

IdentitateaBT

CultivareleTS SB (m/z)

24.99±0.0425.53±0.0433.19±0.0433.78±0.0534.09±0.0634.58±0.0535.31±0.0435.92±0.0637.76±0.0539.63±0.0441.87±0.04

Acid malicL-prolineβ -D-galacto furanose D-fructoseL-glucose 5 TMSGlucoză, Oximeα-D-glucopyranoseD-glucoseMyo-inozitolGlucoseD-manno-pyranose

21222112111

21222112211

22122112211

335258319307231319204231343231219

De notat: Rt- Timpul de retenție; BT – Bukit Tinggi; TS – Tanjung Sepat;SB – Sabah; (1) – indică <0,5%;(2) – indică 0,5 – 5 % din totalul areal al picului a TIC a unei probe particulare

21

Figura 6 : Cromatograma totală a ionilor (TIC) a MSTFA fracția derivatizată a cloroformului din frunzele de ghimbir (Z. Officinale Roscoe) din cultivarele Bukit Tinggi utilizând GC-MS

Figura 7 : Cromatograma totală a ionilor (TIC) a MSTFA fracția derivatizată a cloroformului din frunzele de ghimbir (Z. Officinale Roscoe) din cultivarele Tanjung Sepat utilizând GC-MS

22

Rt.±Sd(n=3)(min)

IdentitateaBT

CultivareleTS SB (m/z)

15.01±0.01123.15±0.01125.05±0.00027.59±0.00028.06±0.00628.66±0.004

29.09±0.01329.60±0.00930.10±0.02731.70±0.00431.96±0.00432.47±0.00933.19±0.00733.82±0.01134.28±0.00436.09±0.00737.08±0.02437.20±0.02237.51±0.01339.00±0.00739.10±0.00739.56±0.00444.10±0.00745.64±0.00447.28±0.00447.43±0.000

Meta-cresolΑ-NeocloveneLauric acisTau-CadinolΑ-Gurjunene(Z)-3-(4-n-Butyl-3thienyl)propenalm-XyleneMyristic acidΑ-Hexylcinnamic aldehydePentadecanoic acidNeophytadieneTetradecanoic acidNeophytadiene9-Hexadecenoic acidPalmitic acidCinnamic acidMargaric acidPalmitic acid TMSLinoleic acidLinolenic acid TMSOleic acidStearic acid TMSBehenic acidTricosanoic acidCholest-7-eneTetracosanoic acid

111111111111131123322222111

111111111111131123321221111

111111111111131123321221111

180204214204204194

297242216256137285278236270265284328294236298352354356399382

De notat : Rt- timpul de retenție; BT–Bukit Tinggi; TS-Tanjung Sepat;SB-Sabah;(1)-indică <0,5%; (2)-indică 0,5-5%;(3)-indică >5%din totalul areal al picului impregnate a TIC a unei

anumite probe.

23

Figura 8 : Cromatograma totala de ioni (TIC) a MSTFA fracțiune derivatizată de cloroform din Frunze de ghimbir (Z. Officinale Roscoe) din cultivarele Sabah utilizând GC-MS.

4. Discuții

Procentul mic de picuri nedeterminate (24-30%) atât în metanolic cât și în fracții de cloroform în toate cele trei cultivare. Ar putea fi datorită unor influențe care sunt suprapuse, un număr mic de analize (~0.05-1%) sau simplu, din cauză că nu era utilizabil nici o dată din baza de date spectru.

O variație calitativă pe tipul metaboliților ghimbirului a fost observant că nuele metaboliți erau prezenți în una dar nu în toate cultivarele. Se pare că aceste variații chimice nu erau cauzate de diferențe geografice sau environmentale sau cum aceste explanturi micropropagate de ghimbir erau folosite în prezentul studio. Ar putea fi datorată şi variaţiilor genetice al ghimbirului. Aceste rezultate nu puteau fi datorate factorilor environmentali cum toate plantele erau crescute sub aceleaşi condiţii, aceeaşi compoyiţie a mediilor de cultură şi aceeaşi vechime a plantelor.

Genele sunt exprimate diferenţial şi sub diferite condiţii environmentale şi intrinsec la fel şi disponibilitatea nutrienţilot (Oh şi colab.,2002). Variaţia în gene a ratei de expresie va conduce la variaţii în concentraţia metaboliţilor. Ca urmare, dacă eliminăm toţi factorii externi ne aşteptăm să vedem aceeaşi nivel de expresie a genelor şi deasemenea nici o diferenţă cantitativă va detecta şi concentraţia metaboliţilor nu arată nici o variaţie semnificativă între cultivare.

24

5. Concluzii

Amprenta metabolică cu GC - MS a extractelor de frunze de ghimbir ne dezvăluie prezenţa unei variaţii chimice între cele trei cultivare. Cultivarul Bukit Tinggi a arătat cel mai înalt număr de metaboliţi detectaţi. Altfel, cultivarele Tanjung Sepat şi Sabah au arătat cel mai mare număr de metaboliţi detectaţi. Nici o variaţie semnificativă nu există între concentraţiile diferiţilor compuşi între cele trei cultivare din probele de frunze. Unele dintre metaboliţii detectaţi, pot fi folosite ca markeri biochimici pentru identificarea şi diferenţierea probelor între cultivarele de ghimbir.

Aceste rezultate au apărut la nivelul amprentei metabolice. O metodă mai precisă pentru detectarea de concentraţie a unor compuşi este ca şi profilul metabolic a metaboliţilor specifici, grup sau ţintă,. Analiză metabolică am avea nevoie pentru a confirma rezultatele.

25

Bibliografie

Oh, M.K., L. Rohlin, K.C. Kao and J.C. Liao, 2002.Global expression profiling of acetate-grown Escherichia coli. J. Biol. Chem., 277: 13175.

Steinhauser, D. and J. Kopka, 2007. Methods, Applications and Concepts of Metabolite Profiling: Primary Metabolism. In: Plant Systems Biology, Sacha, Baginsky, Alisdair and R. Fernie (Eds.).Birkhäuser Verlag, Switzerland, pp: 171-194.

Dunn, W.B., 2008. Current trends and future requirements or the mass investigation of microbial, mammalian and plant metabolomes. Phys. Biol., 5: 24. stacks.iop.org/physBiol/5/011001

Dunn, W.B., N.J.C. Baileyb and H.E. Johnsonc, 2005. Measuring the metabolome: Current analytical technologies. Analyst, 130: 606-625. www.rsc.org/analyst

Fiehn, O., 20002. Metabolomics the link between genotypes and phenotypes. Plant Mol. Biol., 48: 155-171.

Fiehn, O., J. Kopka, P. Dörmann, T. Altmann and R.N. Trethewey et al., 2000. Metabolite profiling for plant functional genomics. Nature Biotechnol. , 18: 1157-1161.

Jiang, H., Z. Xie, H.J. Koo, S.P. McLaughlin and B.N. Timmermann, 2006. Metabolic profiling and phytogenetic analysis of medicinal Zingiber species: Tools for authentication of ginger (Zingiber officinale Rosc.). J. Phytochem., 67: 1673-1685.

Kitson, F.G., S.L. Barbara and N.M. Charles, 1996. Gas Chromatography and Mass Spectrometry a Practical Guide. Academic Press, San Diego.

Last, R.L., A.D. Jones and Y. Shachar-Hill, 2007. Towards the plant metabolome and beyond. Mol.

Halket, J.M., D. Waterman, A.M. Przyborowska, P.D. Fraser and P.M. Bramley et al., 2005. Making sense of the metabolome: Chemical derivatization and mass spectral libraries in metabolic profiling by GC/MS and LC/MS/MS. J. Exp. Bot. , 56: 219-243. http://www.naturaldatabase.com

Shepherd, T., G. Dobson, S.R. Verrall, S. Conner and D.W. Griffiths et al., 2007. Potato metabolomics by GC-MS: What are the limiting factors. Metabolomics, 3: 475-488.

Ma, X. and D.R. Gang, 2006. Metabolic profiling of in vitro micro-propagated and conventionally greenhouse grown ginger (Zingiber officinale). J. Phytochem., 67: 2239-2255.

26