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Monitorización de la Limpieza y Desinfección. Proyecto BioliSME
Monitorización de la limpiezay desinfección. Proyecto BIOLISME
ainia
Zaragoza, 17 de noviembre de 2010
Monitorización de la Limpieza y Desinfección. Proyecto BioliSME
HIGIENE: “Todas las condiciones y medidas necesarias paragarantizar la seguridad y buena condición de los alimentos a lolargo de toda la cadena de producción”(Codex Alimentarius rev. 4/2003)
Sistema de Análisis de Peligros y Puntos Control Crítico (APPCC)
• El R.852/2004 exige que todos los operadores de alimentación(producción, procesado o distribución de alimentos), deben instaurar,i l t t di i t b d l i t APPCCimplantar y mantener un procedimiento basado en el sistema APPCC.
• Uno de los requisitos del sistema APPCC limpieza y desinfección
Evaluación del programa de L+D método de muestreo ycontrol de superficies en contacto con los alimentos.
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Plan de Control
La Seguridad Microbiológica de los alimentos requiere:
Buenas PrácticasDiseño efectivo
Buenas Prácticas de Fabricación
(BPF)Análisis Peligros yPuntos Control Crítico
(APPCC)
Su aplicación no impide totalmente que el alimento
(APPCC)
p p qpueda contaminarse cuando queda expuesto al entorno
Establecimiento de PLANES DE CONTROL
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Establecimiento de PLANES DE CONTROL para evaluar el control del entorno
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Plan de control
- Manipulación- Transporte- Almacenamiento- Distribución
son oportunidades para la contaminación del producto- Distribución
- Envasado
p
Plan de Muestreo y Análisis
• Microbiota presente en superficies y equipos (patógenos, indicadoresde higiene o alteración del producto)
• Efectividad de las prácticas de limpieza y desinfección.
• Resistencia o persistencia de determinados contaminantes
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• Resistencia o persistencia de determinados contaminantes.
• Origen de contaminantes (nichos), contaminaciones cruzadas.
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Plan de control
Plan de control en Planta de producción
Muestreo Método Analítico Interpretación Resultados
Plan de muestreo Sensible y eficiente
Tratamiento estadísticode datos
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Detección y control de la contaminación en zonas de riesgoDetección y control de la contaminación en zonas de riesgo utilizando equipos y técnicas apropiados y según un PLAN.
Vestimenta(ropas y guantes)
Aire
Suelos y paredes
Aire
Equipos
AguaMuestreo
Microbiológico
Detección y Cuantificación
Superficies Equipos
Detección y Cuantificación de microorganismos
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Estimación de la cantidad microbiana del entorno
Determinación y evaluación de tendencias
Monitorización de la Limpieza y Desinfección. Proyecto BioliSME
Definir puntos de muestreo
Definir métodos
Diseño del muestreoDefinir métodos
de muestreo
Plan de muestreoPlan de muestreo
Definir límitesDefinir límites
Indicadores de calidad (ej. presencia de Listeria spp en planta)
QuéListeria spp en planta)
Fuentes de contaminación (materias primas, producto final, superficies de máquinas, suelos,…)
Dónde
Cuándo
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Frecuencia de muestreos.
Métodos de análisisCómo
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fi i dDefinir puntos de muestreo
La selección de puntos y frecuencia de muestreo depende de:
• diseño de las plantas• diseño de las plantas• nº líneas producción y productos• ubicación de equipos de procesado• flujo de producto.
Definir métodos de muestreo
Puntos muestreo designados a partir del análisis de riesgos (APPCC)
Definir métodos de muestreo
• Su elección dependerá:
- Microorganismo a controlar: Tipo de célula (bacteria, espora, hongo),g p ( , p , g ),sensibilidad, viabilidad.
- Umbral de detección, capacidad, eficacia.
- Tipo de superficie y condiciones del entorno
• Factores que afectan al muestreo: Tipo de superficie nivel de
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• Factores que afectan al muestreo: Tipo de superficie, nivel decontaminación de la muestra, condiciones ambientales, biofilms.
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Plan de control
• Puntos de muestreoá• Tamaño del área de la muestra
• Frecuencia y momento del muestreo(Nivel de control, tipo producto, actividad y disponibilidad de la zona)
• Técnica/s de toma de muestras/• Acciones de seguimiento en caso de muestras positivas
-limpieza a fondo de zonas sospechosas y equipo-intensificación/ampliado de pruebas
Definir límites
• Falta de criterios legales de valoración.• Cada usuario fijará sus propios límites (según la clasificación de zonade riesgo, requisitos cliente, etc)• El establecimiento de los valores límite dependerán de la muestra y
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• El establecimiento de los valores límite dependerán de la muestra yel método utilizado.
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Criterios microbiológicos
• Rto de bacterias aerobias mesófilas• Rto. de bacterias aerobias mesófilas• Rto. de bacterias aerobias psicrotrofas• Rto. de enterobacterias• Rto. de Staphilococcus aureus
Microorganismos indicadores dep
• Rto. de mohos y levaduras• Rto. indicadores fecales (E. Coli) o enterococos• Rto. de bacterias esporuladas
indicadores de higiene o alterantes
del producto
• Investigación de Salmonellaó d Microorganismos
patógenos
• Investigación o Recuento de L. monocytogenes• Investigación de Campylobacter• Legionella,…
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Métodos de muestreo de superficies y ambiente
M t d fi iMuestreo del ambiente
Sedimentación
Recogida en medio líquido
Placas de contacto
Paletas de contacto
Muestreo de superficies
Filtración
Impactación (aereobiocolectores)
Paños estériles
Torundas
BioluminiscenciaBioluminiscencia
Técnicas de derramamiento
Técnicas de enjuagadoTécnicas de enjuagado
Muestreador de aire SAS
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ISO 18593:2004. Horizontal methods for sampling techniques from surfaces using contact plates and swabs.
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Técnicas análisis
Técnicas clásicas Métodos rápidos
• Pruebas bioquímicasEXTRACCIÓN q
• Pruebas inmunológicas
• Pruebas enzimáticas
• Microscopía
CULTIVO
PREENRIQUECIMIENTO (no selectivo)
• Métodos eléctricos
• Amplificación molecular
• Citometría
(no selectivo)
ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO
AISLAMIENTO EN PLACA
CONFIRMACIÓN
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Técnicas análisis
• Pruebas bioquímicas
• Pruebas inmunológicas
Sistemas miniaturizados, tiras catalasa, oxidasa...
• ELISAS ió i éti
Pruebas inmunológicas
Reacción antígeno-anticuerpo
• Pruebas enzimáticas
• Separación inmunomagnética• Inmunoensayo en fase sólida• Sistemas inmunológicos en latex
Determinación ATP
• Microscopía
• Métodos eléctricos: Impedancia
105
104
103SEÑAL
p
• Técnicas base genética
Cit t í
TIEMPO DE DETECCIÓN
- Hibridación con sondas- Técnicas PCR: PCR-RT, rep-PCR.
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• Citometría
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Interpretación de resultados
Puntos críticos de contaminaciónPuntos críticos de contaminación
16 1980%
100%4
2
960%
80%
100%PRESENC.
19%
26
23
23
13
0%
20%
40%
60%
PROCESADO ENVASADO
L. monocytogenes Listeria spp No detectado
13
3 2
2
2
0%
20%
40%
60%
SUELO PUERTAS OPERARIOS CONDENSADOS
L. monocytogenes Listeria spp No detectado
AUSENCIA81%
Evolucion Presencia de Listeria spp en maquinas en funcionamiento
Valor Puntual
Tendencias
253035404550
cia
List
eria
spp
Acumulado
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05
101520
01 03 05 07 09 11 13 15 17 19 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52
% P
rese
nc
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H i t A t l
Caracterización genética mediante REP-PCR
Herramientas Actuales para la interpretación de resultados
Caracterización genética mediante REP PCR
Interpretación de los resultados mediante un potente software deanálisis vía web (Diversilab System v.3)
Tipificación: permite el análisiscomparativo entre cepas paraver similitudes y diferencias.
Clasificación: identificación de cepasmediante la comparación de los perfilesgenéticos con una base de datos.
• Estudios epidemiológicos (comparación de muestras procedentes dediferentes pacientes, lugares y/o fechas).
ó
Aplicaciones
• Trazabilidad de microorganismos patógenos y alterantes en lacadena alimentaria.
• Autentificación de microorganismos de interés y estudio evolutivo.
• Confirmación de resultados analíticos.
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• Identificación de especies y serotipos (Salmonella, Listeria…).
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H i t A t l
Gel de Agarosa, muestra la talla de los fragmentos
Herramientas Actuales para la interpretación de resultados
Té i d l t f i d ADN di t
1000bp
Técnica de electroforesis de ADN en gradiente (DGGE)
• Técnica de separación de ácidos nucleicos. (“ l l fi i ti ”)
p
500
250bp
(“molecular fingerprinting”)
• Estudio de la evolución de la diversidad microbiana de una instalación, equipo o proceso.
Zaragoza, 17 de noviembre de 2010 Gel de gradiente, permite separar las bandas en base a su secuencia.
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Limitaciones de los métodos de control
• Tipo de superficie
• Sensibilidad de las técnicas
• Especificidad de las técnicas
Las células pueden crecer en capas, formando biopelículas (biofilms)
Generalmente, las técnicas utilizadas • Adhesión microbiana
• Otros factores
,subestiman el nºmicroorganismos en una superficie.
Problemas de repetibilidad y reproducibilidad
Es necesario el desarrollo de nuevos métodos de control- Rápidos- fiables- con una sensibilidad similar (o mayor) que los métodos convencionales
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Monitorización de la Limpieza y Desinfección. Proyecto BioliSME
P E Bi liSME i iProyecto Europeo BioliSME ainia
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Monitorización de la Limpieza y Desinfección. Proyecto BioliSME
Proyecto financiado por la Comisión Europea (7º programa Marco)htt // bi lihttp://www.biolisme.eu
BIOLISME es el acrónimo del proyecto "Speedy system for sampling anddetecting Listeria monocytogenes in agri-food and related Europeande ec g s e a o ocy oge es ag ood a d e a ed u opeaindustries".
Objetivo del proyecto: Sistema de monitorización de los niveles de Listeriamonocytogenes en superficies en contacto con alimentos.y g p
Consorcio del proyecto: 7 socios de 5 países de la EU (especializados en elcampo de la bioquímica, microbiología de alimentos, biosensores, óptica, higieney desinfección industrial)y )
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Esquema del proyecto:
Preparación de superficies
contaminadas
Desarrollo del inmuno-ensayo
Desarrollo del sistema de muestreo y
Desarrollo del Immunosensor
Integración y
muestreo y recuperación de
Listeria
Immunosensor
Integración y Pruebas piloto
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Monitorización de la Limpieza y Desinfección. Proyecto BioliSME
Mayor tasa de recuperación de microorganismos en el muestreo de superficies.
Beneficios que aportará el sistema:
Mejora de los niveles de detección del microorganismo.
Integración de las etapas de análisis (muestreo, procesamiento de la muestra y
detección).
Facilidad de uso Sistema semi-automatizado, mínima manipulación.
Reducción de la duración y el coste por análisis.
Aumento del nivel de seguridad alimentaria para el consumidor
Con este sistema, las empresas podrán realizar sus propias determinaciones, li d á i i d f á id ill fi bl
Aumento del nivel de seguridad alimentaria para el consumidor.
Ventaja competitiva para las empresas usuarias.
analizando más muestras in situ y de una forma rápida, sencilla y fiable.
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Monitorización de la Limpieza y Desinfección. Proyecto BioliSME
Gracias por su atenciónGracias por su atención.
Sonia PortaL b t i d BiLaboratorio de Bioensayos
ainia Centro Tecnoló[email protected]
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