Óxido nÍtrico incrementa la permeabilidad …
TRANSCRIPT
Profesor Patrocinante
Dra. Fabiola Sánchez Vásquez
Instituto de Inmunología
Facultad de Medicina
ÓXIDO NÍTRICO INCREMENTA LA PERMEABILIDAD
MICROVASCULAR INDUCIENDO CAMBIOS EN PROTEINAS DE
LAS UNIONES ADHERENTES
Tesis de Grado presentada como parte de
los requisitos para optar al grado de
Licenciado en Bioquímica y Título
Profesional de Bioquímico
RODRIGO ANDRÉS CARRASCO LEÓN
VALDIVIA – CHILE
2012
AGRADECIMIENTOS
Quiero agradecer en primer lugar a mis padres y hermanos, por la preocupación
y el apoyo que he recibido de ellos en diversos ámbitos, lo cual ha sido fundamental en
estos años de estudio. A Paulina, que desde hace varios años ha estado junto a mí,
quien ha sido un pilar importante en mi vida y una gran compañía.
A la Dra. Fabiola Sánchez, mi tutora de tesis en la Universidad Austral de Chile,
por permitirme desarrollar este trabajo dentro de su grupo de investigación y por
siempre apoyarme e instarme a seguir adelante, pese a las dificultades. A la profesora
Marcela por sus consejos y buena disposición.
Quiero agradecer a todos los miembros del Instituto de Inmunología, a mis
compañeros e integrantes del laboratorio por su buena disposición y generosidad con
sus conocimientos cuando era necesario, sobre todo al grupo de trabajo de la profesora
Fabiola: Paty, Natalie, Anita, Caro y Alex por su buena onda y simpatía en todo
momento.
También un agradecimiento muy especial a todos mis amigos y amigas que he
conocido en Valdivia, ya que junto a ellos he compartido grandes alegrías como
también nos hemos apoyado en las dificultades: Jorgito, Cristian, Pedro, Sandro,
Sapex, Gonzalo, Oscarin y a la Magda, un cariño muy especial a cada uno de ellos, así
como también a mis amigos de Temuco: Alejandro, Eduardo y Javier. Esta tesis fue
financiada por el proyecto FONDECYT 1100569.
i
ÍNDICE DE CONTENIDOS
página
ÍNDICE DE CONTENIDOS i
ÍNDICE DE FIGURAS iii
LISTA DE ABREVIATURAS iv
1. RESUMEN 1
1.1 Summary 2
2. INTRODUCCIÓN 3
2.1 Barrera endotelial 5
2.2 VE-caderina y cateninas 5
2.3 Óxido nítrico y PAF 11
2.4 Hipótesis del trabajo 17
2.5 Objetivo general 17
2.6 Objetivos específicos 17
3. MATERIALES Y MÉTODOS 18
3.1 Materiales 18
3.1.1 Material biológico 18
3.1.2 Reactivos 18
3.1.3 Equipos 20
3.2 Métodos 20
3.2.1 Cultivo celular 20
3.2.2 Extracción de proteínas totales 21
3.2.3 Ensayo de permeabilidad 21
ii
3.2.4 Ensayo de biotinilación 22
3.2.5 Ensayo de coinmunoprecipitación para VE-caderina y
β-catenina 23
3.2.6 Separación de proteínas por gel de
poliacrilamida desnaturante (PAGE-SDS) y electrotransferencia 23
3.2.7 Inmunodetección de proteínas mediante Western blot 24
3.2.8 Inmunodetección de proteínas de membrana mediante
ensayo de inmunofluorescencia indirecta 25
3.2.9 Inhibidor L-NMA 26
3.2.10 Análisis estadístico 26
4. RESULTADOS 27
4.1 Producción de NO y ensayo de permeabilidad con L-NMA 27
4.2 PAF induce fosforilación de eNOS 29
4.3 Internalización de VE-caderina inducida por PAF 31
4.4 Internalización de VE-caderina detectada por ensayo de
inmunofluorescencia indirecta 33
4.5 PAF inhibe la coinmunoprecipitación de β-catenina con VE-caderina 35
4.6 Inhibición de la internalización de VE-caderina en células EA.hy926
pretratadas con L-NMA 38
4.7 Interacción de VE-caderina con β-catenina es regulada por NO 41
5. DISCUSIÓN 44
6. CONCLUSIONES 51
7. BIBLIOGRAFÍA 52
iii
ÍNDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1
Organización molecular de uniones adherentes endoteliales. 9
Figura 2
Diagrama de los mecanismos regulatorios en hiperpermeabilidad
paracelular inducida por agonistas en células endoteliales. 14
Figura 3
Producción de NO y Ensayo de permeabilidad con L-NMA. 28
Figura 4
Fosforilación de eNOS en respuesta a PAF. 30
Figura 5
Ensayo de Biotinilación de VE-caderina. 32
Figura 6
Internalización de VE-caderina detectada por ensayo de inmunofluorescencia
indirecta. 34
Figura 7
El tratamiento con PAF estimula la disociación de VE-caderina de β-catenina. 36
Figura 8
Internalización de VE-caderina en presencia de L-NMA. 39
Figura 9
L-NMA previene la ruptura inducida por PAF de las asociaciones entre
VE-caderina y β-catenina. 42
iv
LISTA DE ABREVIATURAS
A absorbancia.
AJs uniones adherentes.
Akt/PKB proteína quinasa B.
BSA albúmina sérica de bovino.
C-terminal carboxilo terminal.
cGMP guanosina monofosfato cíclica.
EDTA ácido etilendiaminotetraacético.
EGTA ácido etilenglicoltetraacético.
ERK 1/2 quinasa reguladora de señales extracelulares 1 y 2.
FBS suero bovino fetal.
GTP guanosina trifosfato.
L-NMA L-N metil arginina.
NO óxido nítrico.
N-terminal amino terminal.
PAF factor activante de plaquetas.
PI-3k fosfatidil inositol 3-quinasa.
PKG proteína quinasa G.
PMSF fluoruro de sulfonilfenilmetano.
PSA persulfato de amonio.
SDS dodecil sulfato de sodio.
sGC guanilato ciclasa soluble.
v
Temed N, N, N´, N´-tetrametiletilendiamina.
TJs uniones estrechas.
Tris Tris (hidroximetil) aminometano.
VEGF factor de crecimiento endotelial vascular.
1
1. RESUMEN
El óxido nítrico (NO), es un importante regulador de la homeostasis vascular,
pero su rol en el control de la permeabilidad microvascular no es aun bien entendido.
Utilizando ratones knockout para eNOS y células endoteliales depletadas de eNOS,
hemos demostrado previamente que el NO derivado de la óxido nítrico sintasa
endotelial (eNOS) es una señal clave para el inicio de la permeabilidad microvascular
inducida por agonistas. La depleción de eNOS perjudica la respuesta inflamatoria a los
agentes, pero no altera la permeabilidad basal. Hemos demostrado también que el
movimiento molecular de eNOS y la localización citosólica son cruciales en la
determinación de funciones vasculares del NO. En este trabajo de tesis se examinó la
organización de las uniones de las células endoteliales en EAhy926, una línea celular
endotelial inmortalizada, mediante microscopia de fluorescencia, examinando la
localización de VE-caderina, la principal proteína de las uniones adherentes. Bajo
condiciones control, VE-caderina se localiza en la membrana de las células endoteliales
de células adyacentes como una estructura continua. La administración del factor
activante de plaquetas (PAF), causa internalización de VE-caderina y desestabilización
del complejo de uniones adherentes entre VE-caderina y β-catenina. El pretratamiento
de las células EAhy926 con L-NMA, un inhibidor de la óxido nítrico sintasa, bloquea la
internalización de VE-caderina y la pérdida de interacción entre ambas proteínas.
Nuestros resultados sugieren que el NO regula la permeabilidad microvascular
mediante modificaciones de proteínas de uniones adherentes.
2
1.1 SUMMARY
Nitric oxide (NO) is an important regulator of vascular homeostasis but its role in
the control of microvascular permeability is incompletely understood. Using eNOS
knockout mice and eNOS depleted endothelial cells; we demonstrated previously that
NO derived from endothelial nitric oxide synthase (eNOS) is a key signal for the onset of
agonist-induced hyperpermeability. eNOS depletion impairs the response to
inflammatory agents but does not alter basal permeability. We have also demonstrated
that eNOS molecular movement and cytosolic location are crucial in determining NO
vascular functions. In this work, we examined the organization of endothelial cell
junctions in EAhy926, an immortalized endothelial cell line, by fluorescence microscopy,
studying VE-cadherin localization, the main protein from the adherens junction. Under
control conditions, VE-cadherin locates to the endothelial cell membranes of adjacent
cells as a continuous structure. Administration of platelet activating factor (PAF) caused
VE-cadherin internalization and destabilization of the interaction between VE-cadherin
and β-catenin. Pretreatment of EAhy926 cells with L-NMA, an inhibitor of nitric oxide
synthases, blocked the internalization of VE-cadherin and the loss of interaction
between both proteins. Our results suggest that NO regulates microvascular
permeability by modifying adherens junction proteins.
3
2. INTRODUCCIÓN
Los procesos inflamatorios se caracterizan por un aumento de la permeabilidad
microvascular, la cual es controlada principalmente en las vénulas postcapilares. El
control de esta función reside principalmente en las células endoteliales que revisten los
vasos sanguíneos y regulan el paso de solutos y solventes desde el lumen de los vasos
sanguíneos hacia los tejidos subyacentes (Andriopoulou et al., 1999).
Esta función es finamente regulada por diferentes sistemas (Andriopoulou et al.,
1999). La permeabilidad endotelial es mediada por las llamadas vías transcelular y
paracelular, es decir a través (transcelular) o entre (paracelular) las células endoteliales
(Dejana et al., 2008). Estas últimas controlan el paso de proteínas del plasma, solutos
y fluidos a través de las uniones interendoteliales de la barrera endotelial, regulando así
la permeabilidad endotelial y la homeostasis entre fluidos y tejidos. Mientras la ruta
paracelular restringe el paso de solutos que superen los 3nm de radio (Pappenheimer
et al., 1951), el tráfico de vesículas transcelular transporta selectivamente
macromoléculas tales como albúmina a través del endotelio (Ghitescu et al., 1986). La
vía transcelular en el endotelio continuo es responsable del transporte de albúmina u
otras proteínas del plasma a través de la barrera endotelial por mecanismos de
transporte vesicular vectorial (Minshall et al., 2002). El trafico transcelular de estas
proteínas ocurre predominantemente vía fisión de los macro-dominios de la membrana
plasmática enriquecidas con caveolina-1 (Cav-1), desde la superficie luminal de la
célula endotelial seguida por transporte vesículo-caveolar a la superficie basal. Las
vesículas se fusionan con la membrana plasmática del lado abluminal y liberan
4
macromoléculas por exocitosis (Minshall et al., 2002). Este proceso finamente regulado
es esencial para transportar albumina, albumina unida a ligandos, hormonas y para
controlar la presión oncótica de tejidos en el endotelio continuo normal (Mehta y Malik,
2006).
Las vías transcelular y paracelular son generalmente consideradas como
procesos independientes en la regulación de la barrera endotelial. Sin embargo, la
creciente evidencia favorece también el concepto de interdependencia entre las vías
paracelular y transcelular que son responsables en el mantenimiento de la homeostasis
de fluidos y tejidos. Este trabajo de tesis se centrará principalmente en la vía
paracelular, mediada por la apertura y el cierre coordinado de las uniones
interendoteliales célula-célula.
La permeabilidad paracelular de la barrera endotelial es mantenida
principalmente por las uniones interendoteliales o uniones adherentes que restringen el
transporte de proteínas del plasma del tamaño de la albúmina (67kDa) desde la luz del
vaso al estroma.
Dos tipos de uniones interendoteliales están presentes en el endotelio, uniones
estrechas (TJs) y uniones adherentes (AJs), las cuales contribuyen al mantenimiento de
la barrera endotelial. Las uniones adherentes compuestas por los complejos de
caderina endotelial vascular (VE-caderina) con cateninas, son dominantes en la
mayoría de los lechos vasculares (Mehta y Malik, 2006).
Los mecanismos celulares que regulan la permeabilidad endotelial paracelular
son complejos. La integridad de las uniones adherentes son fundamentales en la
regulación de la permeabilidad paracelular y la interrupción de las adhesiones
5
homotípicas de VE-caderina que conducen a una acumulación excesiva de fluido en el
intersticio y se asocian con procesos patológicos tales como inflamación, aterogénesis y
daño pulmonar agudo (Wallez y Huber et al., 2008).
2.1 BARRERA ENDOTELIAL
La barrera endotelial está formada por una continua monocapa de células
endoteliales vinculadas entre sí por diferentes estructuras adherentes. Células
endoteliales de vénulas postcapilares normalmente muestran uniones adherentes, las
cuales contienen VE-caderina, formando un complejo con proteínas citosólicas α-
catenina, β-catenina, plakoglobina y p120-catenina (Bazzoni y Dejana, 2004; Dejana,
1996; Durán, 2008; Geiser y Ayalon, 1992; Weis y Nelson, 2006). Las uniones
adherentes y en particular VE-caderina, son blancos de las vías de señalización de
agentes que incrementan la permeabilidad vascular tales como factor de crecimiento
endotelial vascular (VEGF), histamina y trombina. (Dejana et al., 2008).
2.2 VE-CADERINA Y CATENINAS
Las caderinas consisten en una superfamilia de glicoproteínas que son
responsables de la adhesión homotípica dependiente de calcio de las células
(Lampugnani et al., 1992). Esta superfamilia consiste en 5 subfamilias que se
distinguen basándose en su composición de domino, en la similitud de secuencia y por
análisis filogenéticos (Breier et al., 1996; Nollet et al., 2000). En el endotelio, la principal
6
caderina encontrada constantemente en los contactos intercelulares es la caderina
endotelial vascular (VE-caderina), la cual es célula específica (Alexander et al., 2000).
VE-caderina es expresada en células endoteliales y es necesaria para la organización
de estructuras vasculares y el mantenimiento de la integridad de la pared vascular
endotelial (Vittet et al., 1997). VE-caderina puede ser agrupada con las caderinas de
tipo II basados en su estructura genómica (Nollet et al., 2000). Como todas las
caderinas tipo I y II, VE-caderina, posee una estructura modular general de cinco
repeticiones extracelulares (EC) que forman una estructura rígida en forma de barra, la
cual se estabiliza por la unión de iones calcio a una secuencia localizada en la base de
cada dominio (Takeichi, 2000; Vincent et al., 2004). VE-caderina es una proteína
transmembrana de paso único, con el extremo amino terminal (N-terminal) en el
dominio extracelular y el extremo carboxilo terminal (C-terminal) en el dominio
intracelular. El extremo N-terminal es el sitio de adhesión homotípica, mientras que el
extremo C-terminal regula el crecimiento celular (Caveda et al., 1996) y está asociada
con varias proteínas citoplasmáticas, incluyendo β-catenina, p120 catenina y γ-catenina
(también llamada plakoglobina).
El dominio extracelular de VE-caderina media la uniones homotípicas y de
adhesión entre células adyacentes. Estas uniones de adhesión homotípicas de VE-
caderina son mediadas por medio de interacciones cis y trans. Las interacciones cis
ocurren a través de interacciones laterales entre la repetición EC1 de moléculas de VE-
caderina en la misma superficie celular. Esta interacción es mediada por un crítico
residuo conservado de triptófano (Trp-2) dentro de un bolsillo hidrofóbico en EC1. La
dimerización trans es la interacción entre caderinas de células adyacentes.
7
La importancia de VE-caderina in vivo es destacada por reportes en ratones
knock-out para VE-caderina que presentan gran deterioro de la función de la barrera
endotelial (Carmeliet et al., 1999). Por esto nuestro trabajo se enfoca también en esta
proteína de gran importancia en la composición de la barrera endotelial y clave en la
hiperpermeabilidad vascular.
El incremento de la permeabilidad microvascular por mediadores inflamatorios,
ha sido correlacionada con la activación del citoesqueleto contráctil celular y la
formación de pequeños gaps entre las células endoteliales adyacentes tanto in vitro
como in vivo desestabilizando el complejo de uniones interendoteliales (Moy et al.,
1996; Drenckhahn y Ness, 1997; Andriopoulou et al., 1999).
Los complejos de uniones adherentes compuestos por VE-caderina, β-catenina,
p120-catenina y α-catenina, controlan la permeabilidad efectuada por VEGF en las
células endoteliales (Dejana et al., 2008). El complejo catenina estabiliza VE-caderina
en las uniones, previniendo la endocitosis mediada por clatrina (Davis et al., 2003; Xiao
et al., 2003; Xiao et al., 2005). En particular, β-catenina se une a complejos de caderina
y α-catenina, que a su vez se une al citoesqueleto de actina. Estas uniones parecen ser
importantes para el mantenimiento entre las uniones homotípicas y moléculas de VE-
caderina de células endoteliales adyacentes [Figura 1]. VEGF fue el primer factor
vascular potente descrito que estimula un incremento rápido y reversible en
permeabilidad microvascular (Gavard y Gutkind, 2006). El factor VEGF promueve la
rápida endocitosis de VE-caderina. Este proceso es iniciado por la unión de VEGF a su
receptor VEGFR-2, el cual induce la activación de Src, un factor intercambiador-
nucleótidico. Src activa vía fosforilación a Vav2, la cual a su vez promueve la activación
8
de la pequeña GTPasa Rac. La activación de Rac, promueve la activación de la
quinasa p21 (PAK), la cual fosforila Ser 665, un motivo altamente conservado en la cola
citoplasmática de VE-caderina. Esto resulta en el reclutamiento de β-arrestina 2,
promoviendo así su internalización en vesículas cubiertas de clatrina y en consecuencia
la ruptura de las uniones intercelulares (Gavard y Gutkind, 2006).
La familia Src quinasa (SFK) median la fosforilación del residuo tirosina de VE-
caderina y β-catenina, mostrado en paralelo el desensamblaje de las uniones
adherentes y el incremento de la permeabilidad en diferentes sistemas de cultivos
celulares (Esser et al., 1998; Eliceiri et al., 1999). Alternativamente, el receptor- 2 de
VEGF (VEGFR-2), el cual induce activación de Src, también ha sido relacionado a
endocitosis de VE-caderina dependiente de clatrina, la cual podría también contribuir a
la ruptura de la barrera endotelial (Lampugnani et al., 2006; Gavard y Gutkind, 2006).
9
A
B
VE-caderina
Vimentina Actina
Dominio yuxtamembrana
Dominio de unión a catenina
Sitio CAR
(Caderina tipo I/II)
10
Figura 1. Representación esquemática de la composición de las uniones
adherentes (AJs).
A) Representación de caderina tipo I/II que destaca las cinco repeticiones en el dominio
extracelular. Notar en el extremo N-terminal el residuo triptófano (Trp-2), como también
el sitio de reconocimiento de adhesión celular (CAR) en el dominio EC1 y la posición del
sitio de unión del Ca+2 entre cada repetición. El dominio citoplasmático de VE-caderina
incluye la “región yuxtamembrana” y el “domino de unión a catenina” que une p120 y
que interactúa con β-catenina y plakoglobina respectivamente. Modificado de Peter
(2004).
B) VE-caderina por medio de uniones homotípicas dependiente de calcio media la
adhesión de células endoteliales adyacentes. El dominio citoplasmático de VE-caderina
se une a β-catenina, que a su vez recluta IQGAP1 y α-catenina para AJs. p120-catenina
se asocia con la región yuxtamembrana de VE-caderina y previene la internalización de
VE-caderina. Modificado de Komorova (2010).
11
La hiperpermeabilidad endotelial estimulada por VEGF e histamina ha sido
asociada con una elevada fosforilación de tirosina de VE-caderina, β-catenina y p120-
catenina (Andriopoulou et al., 1999; Cohen et al., 1999; Esser et al., 1998; Shasby et
al., 2002) y además cambios en la organización de VE-caderina en uniones
intracelulares (Alexander et al., 2000; Aramoto et al., 2004; Esser et al., 1998; Kevil et
al., 1998).
2.3 ÓXIDO NÍTRICO (NO) Y PAF
El NO es reconocido como un importante regulador de la homeostasis vascular,
pero su rol en el control de la permeabilidad microvascular solo ha sido descrito
recientemente. Nuestro grupo ha demostrado un rol clave de eNOS en la
hiperpermeabilidad inducida por agonistas, utilizando ratones knock-out para eNOS y
células endoteliales depletadas de eNOS mediante RNA de interferencia (Hatakeyama
et al., 2006; Sánchez et al., 2008). En ambos modelos la permeabilidad basal es normal
y sólo se afecta la permeabilidad en respuesta a agonistas. El óxido nítrico y su
constitutiva sintasa (eNOS), han emergido como un importante mecanismo de
señalización en el sistema cardiovascular (Durán et al., 2000).
Los mecanismos de regulación de la actividad de eNOS, tales como la
fosforilación y translocación de la enzima, han sido estudiados en cultivos de células
endoteliales. En estas células, la fosforilación de eNOS ha sido asociada con la
activación de la enzima (Corson et al., 1996; García- Cardena et al., 1996; Chen et al.,
1999; Dimmeler et al., 1999). El principal sitio de fosforilación, regulador de la actividad
12
de eNOS es Ser 1177. Además de los sitios de fosforilación reconocidos serina/
treonina, la fosforilación de tirosina también puede desempeñar un papel en la
regulación de eNOS (García- Cardena et al., 1996; Durán et al., 2000).
Debido al potencial y amplio espectro de la acción celular de NO y su vida media
corta, los mecanismos que regulan la síntesis de NO con respecto al tiempo y espacio
son cruciales en determinar las funciones biológicas de NO. A nivel celular, eNOS está
estrechamente regulada con respecto a su actividad y localización. En la membrana
plasmática, la mayor parte de eNOS se localiza en caveolas que se encuentran en las
membranas endoteliales luminal y abluminal, pero no en la unión endotelial (Schroeder
et al., 2001). eNOS se une directamente a caveolina-1 (cav1) a través de un sitio de
consenso, una interacción que inhibe la actividad de eNOS (Dimmeler et al., 1999).
Bajo estimulación con agonistas, eNOS se activa por fosforilación (Dimmeler et al.,
1999; Fulton et al., 1999; Sánchez et al., 2006), liberándose de la interacción inhibitoria
con caveolina-1 (Fulton et al., 2002; Garcia-Cardena et al., 1997), siendo internalizada
(Prabhakar et al., 1998; Sánchez et al., 2008; Sánchez et al., 2009; Sánchez et al.,
2006).
Después de la estimulación por agentes inflamatorios tales como PAF (factor
activante de plaquetas) y VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular), los
receptores específicos gatillan una cascada de señalización que involucra PI-3K
(fosfatidil inositol 3-quinasa), Akt (proteína quinasa B), fosforilación de eNOS y
producción de NO (óxido nítrico).
El óxido nítrico activa su blanco sGC (guanilato ciclasa soluble) activando PKG
vía cGMP. Subsecuentemente, PKG estimula ERK 1/2. Esta proteína quinasa activada
13
por mitógenos fosforila proteínas de la unión endotelial e induce cambios
conformacionales que promueven la hiperpermeabilidad. Estos cambios
conformacionales probablemente operan en sincronía con fuerzas centrípetas
generadas por el citoesqueleto, particularmente vía actina (Yuan, 2000) [Figura 2].
El NO regula muchos procesos biológicos través de mecanismos dependientes
de cGMP (Friebe y Koesling, 2009). Sin embargo, recientemente la S-nitrosilación ha
emergido como una importante modificación no enzimática causada por NO con
significancia biológica. Es una modificación postraduccional (Hess et al., 2005; Whalen
et al., 2007) que consiste en la unión de NO a cisteína libres de proteínas formando un
S-nitrosotiol (SNO) (Stamler et al., 1992a; Stamler et al., 1992b). Por lo tanto, S-
nitrosotiol puede prolongar y ampliar espacialmente la acción in vivo del NO producido
localmente (Liu et al., 2004).
14
Figura 2. Diagrama de los mecanismos regulatorios en hiperpermeabilidad
paracelular inducida por agonistas en células endoteliales (Durán et al., 2010). El
óxido nítrico activa su blanco sGC (guanilato ciclasa soluble) activando PKG vía cGMP.
Subsecuentemente, PKG estimula ERK 1/2. Esta proteína quinasa activada por
mitógenos fosforila proteínas de la unión endotelial e induce cambios conformacionales
que promueven la hiperpermeabilidad.
15
La desregulación de la S-nitrosilación de proteínas está asociada con una
creciente lista de condiciones fisiopatológicas incluyendo shock endotóxico, esclerosis
múltiple, enfermedad de Parkinson, enfermedad de células falciformes, hipertensión
pulmonar, fibrosis quística y asma (Gaston et al., 2003).
Otra modificación recientemente descrita inducida por NO corresponde a la
nitración de proteínas, que se refiere a la unión covalente de NO a residuos de tirosina
de proteínas. Ambas modificaciones, S-nitrosilación y nitración han sido postuladas a
regular procesos de aumento de permeabilidad microvascular. En el caso de la S-
nitrosilación, se ha descrito que -catenina es S-nitrosilada en la cisteína 619 en
respuesta a VEGF después de 15 minutos de tratamiento, para lograr aumento en la
permeabilidad endotelial (Thibeault et al, 2010). Por otra parte, estudios recientes
encontraron que p190RhoGAP (componente de las uniones adherentes) fue
selectivamente nitrada en Tyr 1105, resultando en un deterioro de la actividad GAP y
activación de Rho, la que participa en la vía de señalización que conduce a contracción
del citoesqueleto, lo cual lleva a un aumento en la permeabilidad endotelial (Siddiqui et
al., 2011).
El factor activante de plaquetas (PAF), es un potente fosfolípido que se
encuentra en gran abundancia en las células endoteliales (Axelrad et al., 2004). Se ha
demostrado que estimula la migración de las células endoteliales y promueve la
angiogénesis (Axelrad et al., 2004). El factor activante de plaquetas es también un
autacoide importante en la hiperpermeabilidad inflamatoria asociada con daño por
isquemia-reperfusión (Noel et al., 1996; Pappas, 1994). PAF incrementa la
permeabilidad endotelial a macromoléculas in vitro e in vivo vía fosforilación de eNOS y
16
producción de NO (Durán et al., 2000; Ramírez et al., 1995; Sánchez et al., 2008;
Sánchez et al., 2009; Sánchez et al., 2006). A nivel de uniones endoteliales PAF induce
la fosforilación e internalización de VE-caderina (Hudry-Clergeon et al., 2005; Knecevic,
2009).
Así PAF es un agonista apropiado en nuestro estudio dado que por un lado
promueve la hiperpermeabilidad a través de la vía del óxido nítrico, y por otro lado
promueve alteraciones en las proteínas de las uniones adherentes.
Hasta el momento no hay una relación entre NO y cambios en proteínas de las
uniones adherentes en respuesta a PAF, por esto mismo, y junto a todos los
antecedentes presentados quisimos evaluar si la permeabilidad microvascular inducida
por el agonista PAF, involucra cambios mediados por NO en proteínas de las uniones
adherentes, utilizando la línea celular EAhy926.
17
2.4 HIPÓTESIS DEL TRABAJO
La permeabilidad microvascular inducida por PAF, involucra cambios mediados
por NO en proteínas de las uniones adherentes.
2.5 OBJETIVO GENERAL
Determinar si existe una relación causa-efecto entre señalización por eNOS y
cambios en la composición de VE-caderina y β-catenina en la barrera endotelial que
llevan a hiperpermeabilidad.
2.6 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Validar las células EAhy926 como un modelo adecuado de estudio de la
permeabilidad microvascular.
2. Estudiar cambios en la localización e interacciones de VE-caderina y β-catenina
en las uniones adherentes en respuesta al agonista PAF.
3. Determinar que los cambios de interacción y localización de VE-caderina en las
uniones adherentes son dependientes de NO, por medio de la utilización de un
inhibidor de la enzima eNOS, L-NMA.
18
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 MATERIALES
3.1.1 MATERIAL BIOLÓGICO
La línea celular EAhy926 fue proporcionada por la Dra. C. J. S. Edgell, (University of
North Carolina, Chapel Hill, NC, USA).
3.1.2 REACTIVOS
Las soluciones y reactivos fueron obtenidos de:
Amresco: acrilamida, persulfato de amonio, N,N,N´,N´-tetrametiletilendiamina
(TEMED).
BD Biosciences: anticuerpo monoclonal IgG de ratón para la detección de eNOS/NOS
tipo III, anticuerpo monoclonal IgG de ratón para pS1177; detección de p-eNOS.
Bio-Rad Laboratories, Inc.: reactivo de Bradford, estándar de peso molecular para
electroforesis en geles de poliacrilamida (Protein ladder Benchmark).
Calbiochem: fluoruro de sulfonilfenilmetano (PMSF), factor activante de plaquetas
(PAF), coctel de inhibidores de proteasas, 2-mercaptoetanol.
Cell Signaling Technology, Inc.: anticuerpo monoclonal IgG de conejo para la
detección de β-catenina.
19
Equilab: agua oxigenada (H2O2).
Fermelo biotec.: dodecil sulfato de sodio (SDS)
Gibco Laboratorios Life Technologies, Inc.: mix de antibióticos (penicilina,
estreptomicina, neomicina), suero bovino fetal (FBS), tripsina, medio Eagle modificado
por Dulbecco de alta glucosa (DMEM).
Invitrogen: Alexa fluor 488 anti-goat.
Merck & Co, Inc.: paraformaldehído, glicerol.
Rockland: BSA fracción V; libre de inmunoglobulinas y proteasas.
Santa Cruz Biotechnology: anticuerpo monoclonal IgG de cabra para la detección de
VE-caderina, proteína-A agarosa.
Sigma Chemical Co.: tritón X- 100, N, N´-Metilenbisacrilamida, anticuerpo monoclonal
IgG de cabra conjugado a peroxidasa, anticuerpo monoclonal IgG de ratón para la
detección de β-actina, isotiocianato de fluoresceína dextrano 70kDa (FITC-Dx-70),
inhibidores de fosfatasa (NaF, NaVO4).
THERMO Scientific: membrana de transferencia PVDF, reactivo quimioluminiscente
ECL, streptavidina, sulfo biotina-NHS.
TLC: metanol, isopropanol.
US Biological: ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido etilenglicoltetraacético
(EGTA), tris (hidroximetil) aminometano (tris).
Winkler: Tween 20, glicina, cloruro de sodio (NaCl), HEPES, etanol, acetona.
20
3.1.3 EQUIPOS
Agitador orbital Labroller II Labnet, espectrofotómetro UV-120-02 Shimadzu,
microscopio óptico Leitz Labovert, microscopio de fluorescencia Saenz, refrigerador
Mademsa -20 y 4°C, refrigerador Fensa -20 y 4°C, refrigerador Phillips -20 y 4°C,
balanza analítica Precisa 120A, vórtex Mixer Labnet , agitador magnético Rocket 35
Labnet, agitador magnético K Gemmy Industrial Corp. Model: VRN-360, centrífuga
Sprectrofuge 7M Labnet, baño termorregulador Köttermann, cámara de flujo TL2448
Heraeus LaminAir, cámara de flujo Healforce HFsafe-1200, fuente de poder EC 105 E-C
Apporatus Corporation, fuente de poder PowerPacTM HC Biorad, sistema de
electroforesis Mini-Protean Tetra System, sistema de transferencia Biorad, Incubadora
Forma Scientific modelo 3548, pH-metro SCHOTT modelo pH-Meter CG837 , Termo
block Fisher Scientific, scanner Canon Canoscan 5600F, espectrofluorímetro Perkin-
Elmer LS-50B.
3.2 MÉTODOS
3.2.1 CULTIVO CELULAR
Las células EAhy926 fueron cultivadas en medio DMEM con 10% de suero
bovino fetal, 50U/mL de penicilina, 50mg/mL de estreptomicina. El cultivo se mantuvo
en incubadora a 37°C en ambiente con 5% de CO2.
21
3.2.2 EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES
Placas de cultivo de 100mm confluentes por 2 a 3 días, fueron estimuladas con
PAF 10-7M, luego fueron lavadas con PBS 1X (pH 7,4). Los cultivos se lisaron con
350μL de solución de lisis (Tris/HCl 50mM [pH 7,5], Tritón X-100 1%, EDTA 1,0mM,
EGTA 10mM, NaF 25mM, NaVO4 2,0mM, DTT 25mM e inhibidores de proteasa:
100μg/ml PMSF, 0,08 mM) y fueron incubados en hielo por 15 minutos y se
centrifugaron a 14000rpm durante 5 minutos a 4°C. Se recolectó el sobrenadante que
contenía las proteínas solubles en tritón X-100. Se cuantificó por el método de Bradford.
3.2.3 ENSAYO DE PERMEABILIDAD
Se realizó de acuerdo a protocolos previamente establecidos (Sánchez 2006,
2008, 2009). Las células se cultivaron en membranas de policarbonato recubiertas con
fibronectina, durante cinco a seis días para alcanzar la confluencia. En el día del
experimento, las membranas se colocaron en un sistema Navicyte (San Diego, CA). La
permeabilidad al isotiocianato de fluoreceina dextrano 70kDa (FITC-Dx-70) se
determinó de acuerdo a la ecuación de Fick. El FITC-Dx-70 se midió utilizando un
espectrofluorímetro. Las muestras de fluorescencia para medir permeabilidad basal se
obtuvieron cada 10 minutos durante un periodo de 60 minutos. Después de la adición
de PAF, las muestras de fluorescencia se obtuvieron por un periodo adicional de 60
minutos.
22
3.2.4 ENSAYO DE BIOTINILACIÓN
El ensayo se realizó de acuerdo a protocolos previamente establecidos (Kevil et
al, 2000; Sánchez et al, 2009; Xiao et al, 2005). Esta técnica se basa en la capacidad
de sulfo NHS-biotina para reaccionar con aminas primarias en las proteínas y en su
incapacidad para penetrar a través de la membrana plasmática. Por lo tanto, sólo las
proteínas con dominios extracelulares que poseen aminas primarias, se pueden marcar
mediante este procedimiento.
El control y las células tratadas con el agonista se lavaron en PBS frío, luego se
agregó sulfo-NHS-LC-biotina a las células y se incubó durante 30 minutos a 4°C, luego
las células se lavaron en hielo con TBS frío tres veces y posteriormente se rasparon con
350µl de buffer de lisis (3.2.2). Este lisado se incubó en hielo 30 minutos con agitación,
luego se obtuvo el sobrenadante de los lisados por centrifugación a 14000rpm durante
5 minutos a 4°C. Posteriormente se agregó 50µL de beads de neutravidina a cada tubo
y se incubó por 2 horas a 4°C en un agitador orbital para capturar las proteínas con
biotina. Las beads se recuperaron por centrifugación a alta velocidad y se lavaron seis
veces con buffer de lisis. Por último, las beads con las proteínas que tienen biotina se
resuspendieron en buffer de carga (30µL) y posteriormente se corrieron en geles de
PAGE-SDS. Las proteínas de interés fueron detectadas mediante Western blot.
23
3.2.5 ENSAYO DE COINMUNOPRECIPITACIÓN PARA VE-CADERINA Y β-
CATENINA
Para 1mg de proteínas del extracto, se adicionaron a cada tubo 15µL de
proteína-A-agarosa para el pre-aclaramiento (se debe resuspender y homogeneizar el
stock de proteína A), se incubó por 30 minutos a 4°C en agitador orbital, y luego se
centrifugó a 14000rpm (10000g) por 5 minutos a 4°C. Después de centrifugar, el
sobrenadante se transfirió a otro tubo. Se añadieron 10µL que contenían 2µg de
anticuerpo primario anti-VE-caderina a cada tubo (2µg de anticuerpo en 10µL para
1000µg de proteína) y se incubó por 3 horas a 4°C en agitador orbital. Luego se
agregaron 20µL de proteína-A-agarosa y se incubó en agitador orbital por 2 horas a
4°C. Posteriormente se centrifugó a 14000rpm (10000g) por 5 minutos a 4°C. Luego el
extracto unido a proteína A se lavó seis veces con 1mL de buffer de lisis. Entre cada
lavado se centrifugó igual que antes y se descartó el sobrenadante. Finalmente se
resuspendió el pellet con 30µL buffer de carga. Antes de cargar al gel, calentamos a
95°C por 10 minutos. Como input, después de cuantificar proteínas se separaron 100µg
de proteína y usadas como control de carga.
3.2.6 SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS POR GEL DE POLIACRILAMIDA
DESNATURANTE (PAGE-SDS) Y ELECTROTRANSFERENCIA
Los geles de poliacrilamida fueron realizados al 7,5%. El gel separador y el
espaciador se prepararon a partir de una solución de acrilamida: bisacrilamida 30:0.8,
24
conteniendo Tris (pH 8,8) 375mM, SDS 0,1%, persulfato de amonio 0,04% y TEMED
0,03%. Se cargaron 50µg de proteínas para la detección de las proteínas en estudio, a
cada muestra se les agregó buffer carga 1X (Tris 500mM pH 6,8, SDS 10%, glicerol
20%, 2-mercaptoetanol 700mM). Luego las muestras fueron separadas mediante
electroforesis a 100-140mV durante 60 minutos en tampón Tris (pH 8,3) 25mM, glicina
190mM y SDS 0,1%. Luego las proteínas fueron transferidas a membranas de PVDF.
La solución de transferencia se compone de 25mM Tris [pH 8,3], 190nM glicina y 20%
metanol. La transferencia se realizó a 450mA durante 120 minutos a 4°C.
3.2.7 INMUNODETECCIÓN DE PROTEÍNAS MEDIANTE WESTERN BLOT
Las membranas PVDF fueron bloqueadas con 5mL de solución de bloqueo
(PBS-leche descremada 5% y TBS-BSA 1% en el caso de p-eNOS) durante 1 hora en
agitación a temperatura ambiente. Luego fueron incubadas por 3 horas o durante toda
la noche con los anticuerpos correspondientes, anti-VE-caderina (dilución de 1:100),
anti-β-catenina (dilución 1:5000) y anti p-eNOS (dilución 1:1000) en solución de
bloqueo, respectivamente. Finalizado el tiempo de incubación con el anticuerpo
primario, se lavaron las membranas con solución de lavado, PBS-Tween 20 (Tween 20;
0,05%), tres veces durante 10 minutos. Después de los lavados, se incubaron las
membranas con el anticuerpo secundario anti IgG de cabra o IgG de conejo, conjugado
a peroxidasa en una dilución 1:5000 para todas, durante 2 horas con agitación a
temperatura ambiente. Finalmente, se lavó tres veces durante 10 minutos con PBS-
Tween 20. Para revelar las membranas fue utilizado el reactivo quimioluminiscente ECL
25
(basado en peróxido de hidrógeno y luminol) que se vierte sobre las membranas
durante 1 minuto y luego se expusieron a films fotográficos durante 1-15 minutos. Para
revelar y fijar se utilizaron los reactivos D72 y U3 respectivamente.
3.2.8 INMUNODETECCIÓN DE PROTEINAS DE MEMBRANA MEDIANTE ENSAYO
DE INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA
En nuestro laboratorio los protocolos utilizados fueron modificados a partir de
(Aramoto et al., 2004; Kevil et al., 2000; Xiao et al., 2003). Las células fueron cultivadas
sobre cubreobjetos redondos y se estimularon mediante el tratamiento correspondiente
(PAF 10-7M). Se eliminó el medio de las placas, luego fueron lavadas tres veces con
PBS 1X frío y fijadas con paraformaldehído 4% durante 20 minutos (en hielo).
Nuevamente las células se lavaron tres veces con PBS 1x frío. Se bloqueó durante 30
minutos en frío con 1% PBS-BSA, inmediatamente se lavaron tres veces con PBS 1X
frío. Luego las células se incubaron con el anticuerpo primario (anti-VE-caderina) en
dilución 1:50 en 0.1% PBS-BSA durante 1 hora en cámara húmeda en oscuridad.
Luego de haber incubado, se lavaron tres veces durante 10 minutos con 0.1% PBS-
BSA y se incubaron con el anticuerpo secundario en dilución 1:250 anti IgG de cabra
conjugado con Alexa fluor 488. Nuevamente se lavaron cinco veces con 0.1% PBS-BSA
por 5 minutos. Las muestras fueron montadas con medio de montaje de fluorescencia y
fueron visualizadas con un microscopio de epifluorescencia.
26
3.2.9 INHIBIDOR L-NMA
Células EAhy926 en confluencia de 3 días, fueron pretratadas con el inhibidor L-
N metil arginina (L-NMA) a una concentración de 300µM por una hora en incubadora a
37°C y 5% CO2. Luego las células fueron tratadas con PAF 10-7M a su respectivo
tiempo de estimulación. Luego se lavaron 3 veces con PBS 1X frío para eliminar el
medio de cultivo y trazas de L-NMA y PAF. A partir de este punto, las células quedan en
condiciones para realizar los ensayos correspondientes.
3.2.10 ANÁLISIS ESTADÍSTICO
En este trabajo de tesis se utilizó un n = 3 experimentos independientes como
mínimo para todos los experimentos. Los datos fueron expresados como la media ±
error estándar. Se aplicaron los test de ANOVA o t student según correspondiera.
Fueron aceptados como resultados significativos, los datos que arrojaron un valor de
p<0.05 (*).
27
4. RESULTADOS
4.1 PRODUCCIÓN DE NO Y ENSAYO DE PERMEABILIDAD CON L-NMA
Para validar las células EAhy926 como un modelo útil en este estudio y
demostrar que PAF induce hiperpermeabilidad para macromoléculas, el primer paso es
medir la producción de óxido nítrico en dicha línea celular mediante una medición
indirecta de NO por medio de un ensayo enzimático que mide la formación de nitritos a
partir de nitratos. En la Figura 3A, en presencia del agonista PAF a una concentración
de 10-7M, la producción de NO se ve aumentada significativamente en comparación a
células no tratadas. Por otra parte, al pretratar las células con L-NMA, un inhibidor de la
óxido nítrico sintasa, se observa claramente que la producción de NO disminuye
estadísticamente significativa entre las células estimuladas con el agonista y el
inhibidor, demostrando que para la línea celular EAhy926, hay producción de NO.
Posteriormente se determinó que PAF induce hiperpermeabilidad a
macromoléculas, mediante un ensayo de permeabilidad. En la Figura 3B, las células
EAhy926 tratadas con una concentración de PAF 10-7M, aumentan significativamente la
permeabilidad a FITC-Dx-70 en comparación con células no estimuladas, y el
pretratamiento con el inhibidor L-NMA, no altera la permeabilidad, sugiriendo que la
hiperpermeabilidad inducida por PAF en células EAhy926 es bloqueada por inhibición
de la eNOS por L-NMA.
28
A
B
Figura 3. Producción de NO y Ensayo de permeabilidad con L-NMA. A) PAF induce
producción de NO en células EAhy926 pero en presencia del inhibidor para eNOS, L-
NMA, la producción de nitritos disminuye estadísticamente significativa. B) La
hiperpermeabilidad inducida por PAF en células EAhy926 es bloqueada por inhibición
de la eNOS con L-NMA. n= 3 ensayos independientes. (*) p<0.05.
C PAF C PAF 0
5.010- 7
1.010- 6
1.510- 6
2.010- 6
*
L-NMA
____________
Perm
eabili
dad (
cm
/sec) 0.05
Co
nce
ntr
ació
n N
itri
tos
(pm
ol/
min
)
29
4.2 PAF INDUCE FOSFORILACIÓN DE eNOS
Luego de haber evaluado la producción de NO y la permeabilidad en la línea
celular EAhy926, debemos examinar la activación de eNOS, analizando la fosforilación
que ocurre en el residuo de Ser 1177.
Células EAhy926 en confluencia de 3 días, fueron tratadas con el agente
agonista PAF a una concentración de 10-7M por 0.5, 1, 3, 5 minutos respectivamente. El
control correspondiente equivale a células no tratadas con el agente agonista. Luego de
haber extraído proteínas, se realizó un Western blot contra eNOS fosforilada y para
eNOS total.
En la Figura 4A, se muestra un Western blot para eNOS fosforilada (p-eNOS), en
la cual, observamos que a medida que aumenta el tiempo de estimulación con PAF, la
marca de p-eNOS, aumenta para cada uno de los tiempos en comparación con las
células no tratadas con el agonista (control). El aumento significativo se hace efectivo a
partir de los 30 segundos de tratamiento, lo que indicaría que en células EAhy926 el
agonista PAF induciría la fosforilación y activación de eNOS. En la Figura 4B, vemos
un gráfico de barras que muestra la normalización de la señal respecto a eNOS total del
Western blot para p-eNOS. p < 0.05 (*) comparada con el control; n = 3, ensayos
independientes.
Estos resultados demuestran que la línea celular EAhy926 es un buen modelo
para estudiar permeabilidad microvascular mediada por NO. Ahora procederemos a
evaluar la acción que tendría el NO en las uniones adherentes, en especial en las
proteínas VE-caderina y β-catenina.
30
A
B
Figura 4. Fosforilación de eNOS en respuesta a PAF. A) Inmunodetección en
Western blot de p-eNOS en células EAhy926 tratadas con PAF 10-7M. Se observa el
aumento de la fosforilación de eNOS. B) Gráfico de barras que muestra la
normalización de la señal respecto a eNOS total del Western blot para p-eNOS. p <
0.05 (*) comparada con control; n = 3, ensayos independientes.
C 0.5 1 3 5 minutos
PAF 10-7M
p-eNOS
eNOS
C 0.5 1 3 5
0
1
2
3*
tiempo(min)
_________________________
0.0145
0.0432
0.0056
0.0242
Norm
aliz
ació
n
(penos/e
nos)x
/(penos/e
nos)c
140 kDa
140 kDa
31
4.3 INTERNALIZACIÓN DE VE-CADERINA INDUCIDA POR PAF
Basándonos en la capacidad de sulfo NHS-biotina para reaccionar con aminas
primarias en las proteínas y en su incapacidad para penetrar a través de la membrana
plasmática, esta técnica es ideal para evaluar la localización e internalización de VE-
caderina en EAhy926.
Células EAhy926 en confluencia de 3 días, fueron tratadas con el agente
agonista PAF a una concentración de 10-7M por diferentes tiempos; 0.5, 1, 3, 5 minutos
respectivamente. El control correspondiente equivale a células no tratadas con PAF.
Posteriormente las células se incubaron por 30 minutos con sulfo NHS-biotina y luego
de haber extraído proteínas, se agregaron beads de neutravidina a cada tubo para
capturar las proteínas con biotina. Luego de separar y capturar las beads del
sobrenadante por centrifugación, se realizó un Western blot contra VE-caderina
biotinilada y VE-caderina total.
En la Figura 5A, se presenta una imagen representativa de la inmunodetección
en Western blot de VE-caderina, en el que observamos que a medida que aumenta el
tiempo de estimulación con PAF, la marca que constituye a VE-caderina en la
membrana plasmática, disminuye para cada uno de los tiempos en comparación con las
células no tratadas con el agonista (control). La disminución significativa se hace
efectiva a partir del minuto de tratamiento, lo que nos indicaría que en células EAhy926
el agonista PAF induciría la internalización de VE-caderina. En la Figura 5B, se
muestra un gráfico de barras que muestra la semicuantificación de los Western blots
para VE-caderina. p< 0.05 (*) comparada con el control; n = 3, ensayos independientes.
32
A
B
Figura 5. Ensayo de biotinilación de VE-caderina. Células EAhy926 tratadas con
PAF 10-7M a diferentes tiempos; 0.5, 1, 3 y 5 minutos respectivamente fueron marcadas
en la superficie con biotina seguida de una inmunodetección en Western blot con
anticuerpos dirigidos a VE-caderina. A) inmunodetección en Western blot de VE-
caderina, la disminución estadísticamente significativa de la señal (t student), es
efectiva desde el minuto de estimulación con PAF, confirmando que PAF induce la
internalización de VE-caderina. B) Gráfico de barras muestra la cuantificación de la
inmunodetección en Western blot para VE-caderina. p < 0.05 (*) comparada con el
control; n = 3, ensayos independientes.
c 0.5 1 3 50.0
0.5
1.0
1.5
*____________________
tiempo (min)
Norm
aliz
ació
n
(VE
ca
d-B
iot/
VE
ca
d)x
/(V
Eca
d-B
iot/
VE
ca
d)c
0.0400.0472
0.0068
C 0.5 1 3 5 minutos
130 kDa
PAF 10-7M
Biotinilación VE-caderina
VE-caderina 130 kDa
33
4.4 INTERNALIZACIÓN DE VE-CADERINA DETECTADA POR ENSAYO DE
INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA
Por otra parte, los resultados obtenidos del ensayo de biotinilación se
correlacionan con los conseguidos mediante un ensayo de inmunofluorescencia
indirecta, en la cual se observa que, las células EAhy926 en confluencia de 3 días, al
ser tratadas con PAF 10-7M (0.5, 1, 3, 5 minutos), VE-caderina fue internalizada a partir
de los 30 segundos de tratamiento con el agonista, dejando en evidencia la mayor
internalización a los tres minutos de tratamiento, logrando una notable marca a nivel
perinuclear , observándose también el restablecimiento de la localización de VE-
caderina en la superficie celular a los 5 minutos [Figura 6].
Esta evidencia junto con los resultados obtenidos por medio del ensayo de
biotinilación nos sugiere que en células EAhy926, una concentración de PAF 10-7M
induce la internalización de VE-caderina, eventualmente teniendo efecto en un aumento
significativo en la permeabilidad y por este mecanismo induciría un aumento entre
permeabilidad de células EAhy926 cultivadas in vitro.
34
Figura 6. Internalización de VE-caderina detectada por ensayo de
inmunofluorescencia indirecta. Células EAhy926 para VE-caderina en control y
después de la estimulación con PAF 10-7M. La internalización de VE-caderina desde la
membrana al citosol ocurre tan pronto como a los 30 segundos en comparación al
control (células no tratadas con PAF), en la cual VE-caderina permanece localizada en
la membrana plasmática.
35
4.5 PAF INHIBE LA COINMUNOPRECIPITACIÓN DE β-CATENINA CON VE-
CADERINA
Otro punto importante que hay que analizar junto con la internalización de
proteínas del complejo de uniones adherentes (VE-caderina), es evaluar que ocurre con
las interacciones proteína-proteína entre VE-caderina y β-catenina. Esta última, una
proteína que se une a la “región de unión a cateninas” en el domino citoplasmático de
VE-caderina, estabilizando el complejo adherente.
Mediante un ensayo de coinmunoprecipitación, que consiste en aislar la proteína
VE-caderina utilizando un anticuerpo especifico, las moléculas que interaccionan con la
proteína se identifican posteriormente mediante una inmunodetección en Western blot,
en este caso el blot es para β-catenina y evaluaremos la interacción existente entre VE-
caderina y β-catenina.
En la Figura 7A, observamos una inmuno Western blot para β-catenina, en el
cual vemos que al estimular células EAhy926 en total confluencia a diferentes tiempos
de tratamiento con el agonista PAF a una concentración de 10-7M; 0.5, 1, 3 y 5 minutos
respectivamente, vemos que la interacción entre ambas proteínas disminuye a medida
que aumenta el tiempo de tratamiento con dicho agonista, lográndose la menor
interacción a los cinco minutos de estimulación. Esto nos sugiere que dicho complejo es
alterado de alguna manera al ser tratado con PAF, desestabilizándose por medio de la
ruptura de las interacciones entre ambas proteínas, permitiendo así un aumento en la
permeabilidad microvascular.
36
A
B
Figura 7. El tratamiento con PAF estimula la disociación de VE-caderina de β-
catenina. Células EAhy926 tratadas con PAF 10-7M a diferentes tiempos; 0.5, 1, 3 y 5
minutos respectivamente fueron lisados e inmunoprecipitados con anticuerpo anti-VE-
caderina. A) Inmunodetección en Western blot con anticuerpo anti-β-catenina. B)
Gráfico de barras que muestra la normalización de la señal de β-catenina
coinmunoprecipitada respecto a β-catenina total. p=0.0259 (*) comparada con control;
n = 3, ensayos independientes.
PAF 10-7 M
C 0.5 1 3 5 minutos
IP: antiVE-caderina
IB: β-catenina
β-catenina
94 kDa
c 0.5 1 3 5
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
*
tiempo (min)
Norm
aliz
ació
n
(IB
-Bcat/B
cat)
x/(
IB-B
cat/B
cat)
c
0.0259
94 kDa
37
En la Figura 7B, vemos un gráfico de barras que muestra la semicuantificación
de las inmunodetecciones en Western blot para β-catenia coinmunoprecipitada con VE-
caderina. p = 0.0259 (*) comparada con el control; n = 3, ensayos independientes.
38
4.6 INHIBICIÓN DE LA INTERNALIZACIÓN DE VE-CADERINA EN CÉLULAS
EAhy926 PRETRATADAS CON L-NMA
Luego de haber evaluado que ocurre con la internalización de VE-caderina
mediante la estimulación con el agente PAF en los ensayos de biotinilación e
inmunofluorescencia, demostramos que la internalización significativa de VE-caderina
ocurre a los tres minutos de estimulación [Figura 5 y 6]. Por lo tanto, una vez obtenido el
tiempo en el cual es significativo el ensayo de biotinilación, analizamos que sucede con
la localización de VE-caderina en la membrana plasmática al ser tratadas con el
inhibidor de la eNOS, L-NMA.
Células EAhy926 fueron previamente tratadas por una hora con L-NMA a una
concentración de 300µM y posteriormente fueron estimuladas por tres minutos con PAF
10-7M. Luego se realizó una inmunodetección en Western blot de VE-caderina, para
células pretratadas, no tratadas con L-NMA y control. En la Figura 8A, se observa un
Western blot para VE-caderina en la cual tenemos células sin el tratamiento previo con
L-NMA y estimuladas con PAF respectivamente como control de ensayo (Figura 8A,
carril C y 3). En las dos marcas de la derecha (Figura 8A, carril C* y 3*), logramos
observar claramente que la biotinilación de VE-caderina en las células pretratadas con
el inhibidor y estimuladas con PAF 10-7M, no induce la internalización de VE-caderina
desde la membrana plasmática al citosol, en comparación a las células que no fueron
pretratadas con L-NMA (células control), lo que nos sugeriría que en células EAhy926 la
internalización de VE-caderina inducida por el agonista PAF estaría siendo favorecida
por la acción del óxido nítrico producido por la enzima eNOS.
39
A
B
Figura 8. Internalización de VE-caderina en presencia de L-NMA. Células EAhy926
controles y pretratadas con L-NMA 300µM por 1 hora antes de comenzar la
estimulación con PAF A) Inmunodetección en Western blot de VE-caderina. L-NMA
inhibe la internalización de VE-caderina inducida por PAF. B) Gráfico de barras que
muestra la semicuantificación de la inmunodetección en Westen blot de VE-caderina.
(*) p = 0.0206 comparadas con control; n = 3, ensayos independientes.
C 3 C* 3* minutos
L-NMA - - + +
PAF - + - +
130 kDa Biotinilación VE-caderina
VE-caderina 130 kDa
C 3 C* 3*
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
*
L-NMA - - + +
PAF - + - +
time(min)
No
rma
liza
ció
n
(VE
ca
d-B
iot/
VE
ca
d)x
/(V
Eca
d-B
iot/
VE
ca
d)c
0.0206
40
En la Figura 8B, vemos un gráfico de barras que muestra la semicuantificación
de la inmunodetección en Westen blot de VE-caderina. (*) P = 0.0206 comparadas con
control; n = 3, ensayos independientes.
41
4.7 INTERACCÓN DE VE-CADERINA CON β-CATENINA ES REGULADA POR NO
Finalmente, luego de haber evaluado que ocurre con la interacción del complejo
adherente entre VE-caderina y β-catenina mediante la estimulación con el agente PAF
en el ensayo de inmunoprecipitación, demostramos que la ruptura significativa de la
interacción entre ambas proteínas se hace efectiva a los cinco minutos de estimulación
con el agonista [Figura 7]. Por lo tanto, una vez obtenido el tiempo en el cual es
significativo el ensayo de inmunoprecipitación, analizamos que sucede con la pérdida
de interacción entre VE-caderina y β-catenina en la línea celular EAhy926 al ser
tratadas con el inhibidor de la eNOS, L-NMA.
Las células EAhy926 fueron previamente tratadas por una hora con L-NMA a una
concentración de 300µM y posteriormente son estimuladas por cinco minutos con el
agente PAF 10-7M. Luego se inmunoprecipitó con el anticuerpo para VE-caderina y
posteriormente se realizó un Western blot contra β-catenina para células pretratadas y
no tratadas con L-NMA y con su respectivo control. En la Figura 9A, se observa un
Western blot para β-catenina, en la cual tenemos células sin el tratamiento previo con L-
NMA y estimuladas con PAF respectivamente como control de ensayo (Figura 9A, carril
C y 5). En las dos marcas de la derecha (Figura 9A, carril C* y 5*), logramos observar
claramente que la inmunoprecipitación de VE-caderina/ WB β-catenina, en células
pretratadas con el inhibidor y estimuladas con PAF 10-7M, no induce la pérdida de
interacción entre VE-caderina y β-catenina, en comparación a las células que no fueron
pretratadas con L-NMA (células control), lo que nos sugeriría que en células EAhy926 la
ruptura de las interacciones proteína-proteína en el complejo adherente entre VE-cade-
42
A
B
Figura 9. L-NMA previene la ruptura inducida por PAF de las asociaciones entre
VE-caderina y β-catenina. Las células EAhy926 fueron pretratadas con L-NMA 300µM
por 1 hora previamente a la estimulación con PAF. A) Western blot para β-catenina. B)
Gráfico de barras que muestra la normalización de la señal de β-catenina
coinmunoprecipitada respecto a β-catenina total. p=0.0406 (*) comparada con control;
n= 3, ensayos independientes.
C 5 C* 5* minutos
IP: anti-VE-caderina
IB: β-catenina
L-NMA - - + +
PAF - + - +
94 kDa
β-catenina
C 5 C 5
0.0
0.5
1.0
1.5
L-NMA - - + +
PAF - + - +
*
tiempo (min)
Norm
aliz
ació
n
(IB
-Bcat/B
cat)
x/(
IB-B
cat/B
cat)
c
0.0203
94 kDa
43
na y β-catenina inducida por el agonista PAF, estaría siendo favorecida por la acción
del óxido nítrico producido por la enzima eNOS.
En la Figura 9B, vemos un gráfico de barras que muestra la semicuantificación
de la inmunodetección en Western blot de β-catenina coinmunoprecipitada con VE-
caderina, con y sin pretratamiento con L-NMA p =0.0406 (*) comparada con el control;
n= 3, ensayos independientes.
44
5. DISCUSIÓN
La principal función del sistema cardiovascular es permitir el intercambio de
sustancias entre la sangre y los tejidos para sostener la vida celular. La vida de las
células depende de la cantidad adecuada de nutrientes y la eliminación de los
catabolitos a través de la circulación sanguínea. Tal función es regulada y llevada a
cabo principalmente por las células endoteliales de vasos sanguíneos y vénulas.
El incremento en permeabilidad microvascular a macromoléculas por medio de la
vía paracelular, ha sido atribuida a dos mecanismos principales: contracción
citoesquelética mediada por cadenas livianas de miosina (Yuan, 2000) y fosforilación de
proteínas de uniones adherentes que causan su internalización desde las uniones
adherentes (Alexander et al., 2000; Esser et al., 1998; Kevil et al., 1998). Este proceso
conlleva a la reorganización de los complejos de uniones adherentes y permite el
transporte de macromoléculas a través de la monocapa endotelial. Por otro lado, la
importancia del NO en la permeabilidad endotelial ha sido mostrada usando ratones
knock-out para eNOS (Hatakeyama et al., 2006) y células tratadas con siRNA para
eNOS (Sánchez et al., 2008). Hasta ahora ningún efecto directo del NO en las uniones
adherentes ha sido reportado en respuesta a PAF.
En este trabajo de tesis hemos demostrado que existe una conexión directa entre
la producción de NO y cambios en la distribución e interacciones de proteínas de las
uniones adherentes, las cuáles conducen a un aumento de permeabilidad
microvascular.
45
Trabajos previos han demostrado que PAF incrementa la permeabilidad
endotelial a macromoléculas in vitro e in vivo vía fosforilación de eNOS y producción de
NO (Durán et al., 2000; Sánchez et al., 2008; Sánchez et al., 2009; Sánchez et al.,
2006), por lo tanto en este trabajo de tesis nuestro primer paso fue validar las células
EAhy926 como modelo de estudio de permeabilidad microvascular. Estas células
derivan de células endoteliales de vena umbilical humanas (HUVEC, cultivo primario) y
han sido transformadas, lo cual les da propiedades de inmortalidad celular (Edgell et al.,
1983).
Las células EAhy926 al ser estimuladas con el agente pro-inflamatorio PAF a una
concentración de 10-7M, aumentan la producción de oxido nítrico, la permeabilidad a
FITC-Dx-70 y la fosforilación de eNOS en la Ser1177 [Figura 3 y 4].
Por otra parte, en presencia del inhibidor L-NMA, la producción de NO se ve
afectada demostrando que para la línea celular EAhy926, en primer lugar hay una
producción de NO significativa y segundo, que la producción de NO está siendo
regulada por la actividad enzimática de eNOS [Figura 3A].
El inhibidor L-NMA, bloquea también el aumento de permeabilidad a FITC-Dx-70
en respuesta a PAF, no observándose un cambio aparente entre células control y
estimuladas con el agente pro-inflamatorio, demostrando que PAF estaría induciendo la
permeabilidad mediante la activación enzimática de eNOS. La utilización de un inhibidor
para eNOS en células EAhy926, en este caso L-NMA (L-N metil arginina) deja
demostrado que PAF induce hiperpermeabilidad por medio de la acción del NO
derivado de eNOS.
46
La fosforilación del residuo Ser 1177, corresponde al sitio de fosforilación por Akt,
que regula la actividad enzimática de eNOS (Dimmeler et al., 1999). Observamos que a
partir de los 30 segundos de estimulación con PAF 10-7M, este residuo es fosforilado
demostrando que tal evento es un proceso que ocurre rápidamente, similar a lo que
ocurre en condiciones fisiológicas pro-inflamatorias. Nuestros resultados que mostraron
la fosforilación de la eNOS en respuesta al tratamiento con PAF 10-7M, son consistentes
con los mecanismos reportados por Sirois y Edelman (1997) por la acción de VEGF, un
poderoso agente de hiperpermeabilidad que interactúa con PAF in vivo. Con estos
resultados podemos certificar que, el modelo en la línea celular EAhy926 es válido,
demostrando así que es una línea propicia para evaluar hiperpermeabilidad.
Es importante poder evidenciar los mecanismos por los cuales el NO estaría
influyendo sobre la permeabilidad vascular, sobre todo por medio de las proteínas de
las uniones adherentes, encargadas de las uniones interendoteliales entre células
adyacentes y el paso restringido de macromoléculas.
Otro resultado fue Evaluar los cambios en la localización de las proteínas que
contribuyen a la función de la barrera endotelial mediante microscopia de
epifluorescencia y por medio de ensayos de biotinilación. También evaluamos las
interacciones entre proteínas, en este caso entre VE-caderina y β-catenina, mediante
ensayos de inmunoprecipitación y Western Blot.
VE-caderina es expresada en células endoteliales y es necesaria para la
reorganización de la estructura vascular y el mantenimiento de la integridad de la
barrera endotelial vascular (Vittel et al., 1997). La importancia de VE-caderina in vivo es
destacada por trabajos en ratones knock-out para VE-caderina, los que exhiben
47
generalmente una función de la barrera endotelial y no son viables. VE-caderina es una
proteína transmembrana de paso único, con el extremo amino terminal (N-terminal) en
el dominio extracelular y el extremo carboxilo terminal (C-terminal) en el dominio
intracelular. El extremo N-terminal es el sitio de adhesión homotípica, mientras que el
extremo C-terminal regula el crecimiento celular (Caveda et al., 1996) y está asociada
con varias proteínas citoplasmáticas, incluyendo β-catenina, p120 catenina y γ-catenina
(también llamada plakoglobina).
El complejo de catenina estabiliza VE-caderina previniendo su endocitosis
mediada por clatrina (Davis et al., 2003; Xiao et al., 2003; Xiao et al., 2005). En
particular, β-catenina se une al complejo de caderina por α-catenina, la cual se une al
citoesqueleto de actina. Estas uniones parecen ser importantes para el mantenimiento
de las uniones homotípicas entre moléculas de VE-caderina de células endoteliales
adyacentes. La hiperpermeabilidad endotelial estimulada por VEGF e histamina ha sido
asociada con una elevada fosforilación de tirosina de VE-caderina, β-catenina y p120-
catenina (Andriopoulou et al., 1999; Cohen et al., 1999; Esser et al., 1998; Shasby et
al., 2002) y cambios en la organización de VE-caderina en las uniones intracelulares
(Alexander et al., 2000; Aramoto et al., 2004; Esser et al., 1998; Kevil et al., 1998).
Los ensayos de biotinilación e inmunofluorescencia indirecta, Figura 5 y 6
respectivamente, realizados en esta tesis, demostraron la internalización de la proteína
VE-caderina, desde la membrana plasmática inducida por el agonista pro-inflamatorio
PAF 10-7M, a partir de los 30 segundos de estimulación para el ensayo de
inmunofluorescencia y al minuto para el ensayo de biotinilación. Ambas técnicas fueron
suficientes para demostrar el efecto esperado en la internalización de VE-caderina, solo
48
mostrando una leve variación en el tiempo de internalización, atribuida a la diferencia en
sensibilidad entre una técnica y otra. Esto es avalado por estudios de Alexander (2000),
donde demostró que por medio de mediadores inflamatorios, tales como H2O2 (1 mM),
e histamina (0.1 mM) la cantidad de VE-caderina en la superficie celular disminuye de
manera dependiente del tiempo.
Una vez obtenido los tiempos requeridos como control de translocación de VE-
caderina (Figura 5 y 6), posteriormente demostramos en la Figura 8, que la
internalización de VE-caderina es bloqueada, inhibiendo la enzima eNOS por medio de
la utilización de L-NMA, dejando en claro que existe una estrecha relación entre NO y la
desestabilización de las uniones adherentes.
Luego de haber analizado el efecto del NO y la implicancia de éste en la
translocación de VE-caderina, nos enfocamos en la interacción existente entre VE-
caderina y β-catenina.
En la Figura 7 y 9, logramos demostrar que al ser tratadas las células EAhy926
con PAF 10-7M, hay una disociación del complejo formado por VE-caderina y β-
catenina, la que alcanza su mayor disociación a los cinco minutos de tratamiento con
PAF. Posteriormente realizamos el mismo ensayo en presencia del inhibidor L-NMA.
Los resultados obtenidos nos demostraron que en células EAhy926, la ruptura de las
interacciones proteína-proteína en el complejo adherente entre VE-caderina y β-
catenina inducida por el agonista PAF, efectivamente es favorecida por la acción del
óxido nítrico producido por la enzima eNOS. Esto es avalado por trabajos recientes que
demuestran que la estimulación en células endoteliales con VEGF induce S-
nitrosilación de β-catenina, la cual es dependiente de la expresión y actividad de eNOS
49
y esto conduce a perturbación de la interacción con VE-cadherina (Thibeault et al.,
2010).
Otra posibilidad es que el NO esté influenciando la actividad de dinamina, una
GTPasa que participa en la endocitosis de VE-caderina (Gavard y Gutkind, 2006). La S-
nitrosilación de dinamina aumenta su actividad GTPasa y por lo tanto mejora los
procesos de endocitosis (Wang et al., 2006).
Como vemos existen diferentes mecanismos por los cuales puede aumentar la
permeabilidad endotelial vascular, ya sea por translocación de proteínas por endocitosis
medida por fosforilación, modificaciones postraduccionales tales como S-nitrosilación y
nitración, etc. Todas y cada una de ellas, pueden estar actuando de forma conjunta o
de manera independiente favoreciendo cambios a nivel molecular en proteínas de las
uniones adherentes.
Como sabemos el óxido nítrico (NO), es un importante regulador de la
homeostasis vascular, pero su rol en el control de la permeabilidad microvascular no es
aun bien entendido. El agonista PAF activa eNOS mediante la fosforilación de Ser1177
produciendo NO, éste puede activar sGC activando PKG vía GTP cGMP.
Posteriormente PKG estimula ERK 1/2. Esta proteína quinasa podría fosforilar proteínas
de la unión endotelial e induce cambios conformacionales que promueven la
hiperpermeabilidad. Por otro lado, emerge la S-nitrosilación, como una alternativa en
los mecanismos de acción del NO en vías de señalización y modificaciones
postraduccionales de proteínas involucradas en las uniones interendoteliales, actuando
de manera independiente de PKG (Thibeault et al., 2010).
50
Nosotros pensamos, que el haber utilizado un inhibidor para eNOS en este
trabajo, demostró efectivamente que los cambios observados a nivel de las uniones
adherentes dependen de NO. En estos momentos nuestro grupo de trabajo está
desarrollando estudios en los cuales se utilizará siRNA para eNOS para así probar mas
definitivamente que la permeabilidad microvascular inducida por PAF está ligada con la
vía de señalización del oxido nítrico, modificando proteínas de las uniones adherentes.
Un punto importante a destacar de este trabajo de tesis, es que por primera vez
se logra demostrar que mediante la estimulación con el factor activante de plaquetas
(PAF), el óxido nítrico derivado de eNOS, actúa sobre las uniones adherentes
induciendo permeabilidad microvascular, el cual es avalado por reportes previos que
indican que el agente pro-inflamatorio PAF induce la ruptura de las uniones
interendoteliales (IEJs) incrementando la permeabilidad endotelial (Knezevic et al.,
2009). Esto ayuda a esclarecer que existen diferentes mecanismos por los cuales la
permeabilidad microvascular puede estar siendo afectada y la comprensión de los
mecanismos que regulan la permeabilidad por medio de células endoteliales, puede
proporcionar importante conocimiento sobre una variedad de patologías en la que la
función de la barrera endotelial esta alterada.
51
6. CONCLUSIONES
Las células EAhy926 son validadas como un modelo para el estudio de
permeabilidad microvascular.
El mecanismo de permeabilidad endotelial inducido por PAF implica
internalización de VE-caderina y la pérdida de las interacciones proteína-proteína
con cateninas, lo que depende de la producción de NO por eNOS.
52
7. BIBLIOGRAFÍA
Alexander, J.S., Alexander, B.C., Eppihimer, L.A., Goodyear, N., Haque, R., Davis, C.P.,
Kalogeris, T.J., Carden, D.L., Zhu, Y.N. and Kevil, C.G. (2000). Inflammatory
mediators induce sequestration of VE-cadherin in cultured human endothelial
cells. Inflammation, 24, 99-113.
Andriopoulou, P., Navarro, P., Zanetti, A., Lampugnani, M.G. and Dejana, E. (1999).
Histamine induces tyrosine phosphorylation of endothelial cell-to-cell adherens
junctions. Arterioscler Thromb Vasc Biol., 19, 2286-2297.
Aramoto, H., Breslin, J.W., Pappas, P.J., Hobson, R.W., 2nd and Durán, W.N. (2004).
Vascular endothelial growth factor stimulates differential signaling pathways in in
vivo microcirculation. Am J Physiol Heart Circ Physiol., 287, H1590-H1598.
Axelrad, T.W., Deo, D.D., Ottino, P., Van Kirk, J., Bazan, N.G., Bazan, H.E. and Hunt,
J.D. (2004). Platelet-activating factor (PAF) induces activation of matrix
metalloproteinase 2 activity and vascular endothelial cell invasion and migration.
Faseb J., 18, 568-570.
Bazzoni, G. and Dejana, E. (2004). Endothelial cell-to-cell junctions: molecular
organization and role in vascular homeostasis. Physiol Rev., 84, 869-901.
53
Boric, M.P., Roblero, J.S. and Durán, W.N. (1987). Quantitation of bradykinininduced
microvascular leakage of FITC-dextran in rat cremaster muscle. Microvasc Res.,
33, 397–412.
Breier, G., Breviario, F., Caveda, L., Berthier, R., Schnürch, H., Gotsch, U., Vestweber,
D., Risau, W. and Dejana, E. (1996). Molecular cloning and expression of
murine vascular endothelial-cadherin in early stage development of
cardiovascular system. Blood, 87, 630–641.
Breslin, J.W., Pappas, P.J., Cerveira, J.J., Hobson, R.W., 2nd and Duran, W.N. (2003).
VEGF increases endothelial permeability by separate signaling pathways
involving ERK-1/2 and nitric oxide. Am J Physiol Heart Circ Physiol., 284, H92-
H100.
Carmeliet, P., Lampugnani, M.G., Moons, L., Breviario, F., Compernolle, V., Bono, F.,
Balconi, G., Spagnuolo, R., Oosthuyse, B., Dewerchin, M., Zanetti, A., Angellilo,
A., Mattot, V., Nuyens, D., Lutgens, E., Clotman, F., de Ruiter, M.C.,
Gittenberger-de Groot, A., Poelmann, R., Lupu, F., Herbert, J.M., Collen, D. and
Dejana, E. (1999). Targeted deficiency or cytosolic truncation of the VE-cadherin
gene in mice impairs VEGF-mediated endothelial survival and angiogenesis.
Cell, 98, 147-157.
54
Caveda, L., Martin-Padura, I., Navarro, P., Breviario, F., Corada, M., Gulino, D.,
Lampugnani, M.G. and Dejana, E. (1996). Inhibition of cultured cell growth by
vascular endothelial cadherin (cadherin-5/VE-cadherin). J Clin Invest., 98, 886-
893.
Chen, Z.P., Mitchelhill, K.I., Michell, B.J., Stapleton, D., Rodriguez- Crespo, I., Witters,
L.A., Power, D.A., Ortiz de Montellano, P.R. and Kemp, B.E. (1999). AMP-
activated protein kinase phosphorylation of endothelial NO synthase. FEBS Lett.
443, 285–289.
Cohen, A.W., Carbajal, J.M. and Schaeffer, R.C., Jr. (1999). VEGF stimulates tyrosine
phosphorylation of beta-catenin and small-pore endothelial barrier dysfunction.
Am J Physiol., 277, H2038-H2049.
Corson, M.A., James, N.L., Latta, S.E., Nerem, R.M., Berk, B.C. and Harrison, D.G.
(1996). Phosphorylation of endothelial nitric oxide synthase in response to fluid
shear stress. Circ. Res. 79, 984–991.
Davis, M.A., Ireton, R.C. and Reynolds, A.B. (2003). A core function for p120-catenin in
cadherin turnover. J Cell Biol., 163, 525-534.
55
Dejana, E., Orsenigo, F. and Lampugnani, M.G. (2008). The role of adherens junctions
and VE-cadherin in the control of vascular permeability. Journal of Cell Science,
121, 2115-2122.
Dejana, E. (1996). Endothelial adherens junctions: implications in the control of vascular
permeability and angiogenesis. J Clin Invest., 98, 1949-1953.
Dimmeler, S., Fleming, I., Fisslthaler, B., Hermann, C., Busse, R. and Zeiher, A.M.
(1999). Activation of nitric oxide synthase in endothelial cells by Akt-dependent
phosphorylation. Nature, 399, 601-605.
Drenckhahn D. and Ness W. (1997). The endothelial contractile cytoskeleton. In: Born
GVR, Schwartz CJ (eds): Vascular Endothelium: Physiology, Pathology, and
Therapeutic Opportunities. Stuttgart: New Horizon Series 3; 1–25.
Durán, W.N., Breslin, J.W. and Sánchez, F.A. (2010). The NO cascade, eNOS location,
and microvascular permeability. Cardiovascular Research, 87, 254–261.
Durán, W.N. and Breslin J.W. (2008). Microcirculatory Exchange Function. In:
“Handbook of Physiology: Microcirculation” American Physiological Society;
Academic Press - Elsevier, San Francisco, CA., Chpt 4, 81-124.
56
Durán, W.N., Seyama, A., Yoshimura, K., Gonzalez, D.R., Jara, P.I., Figueroa, X.F. and
Boric, M.P. (2000). Stimulation of NO production and of eNOS phosphorylation
in the microcirculation in vivo. Microvasc Res., 60, 104-111.
Dvorak, H.F. (2002). Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor: a
critical cytokine in tumor angiogenesis and a potential target for diagnosis and
therapy. J. Clin. Oncol. 20, 4368–4380.
Edgell, C.J., McDonald, C.C. and Graham J.B. (1983). Permanent cell line expressing
human factor VIII-related antigen established by hybridization. Proc Natl Acad
Sci USA. 80:3734-7.
Esser, S., Lampugnani, M.G., Corada, M., Dejana, E. and Risau, W. (1998). Vascular
endothelial growth factor induces VE-cadherin tyrosine phosphorylation in
endothelial cells. J Cell Sci., 111 (Pt 13), 1853-1865.
Eliceiri, B.P., Paul, R., Schwartzberg, P.L., Hood, J.D., Leng, J., and Cheresh, D.A.
(1999). Selective requirement for Src kinases during VEGF-induced
angiogenesis and vascular permeability. Mol. Cell 4, 915–924.
Foster, M.W., Hess, D.T. and Stamler, J.S. (2009). Protein S-nitrosylation in health and
disease: a current perspective. Trends Mol. Med. 15, 391–404.
57
Friebe, A. and Koesling, D. (2009). The function of NO-sensitive guanylyl cyclase: what
we can learn from genetic mouse models. Nitric Oxide 21, 149–156.
Fulton, D., Fontana, J., Sowa, G., Gratton, J.P., Lin, M., Li, K.X., Michell, B., Kemp, B.E.,
Rodman, D. and Sessa, W.C. (2002). Localization of endothelial nitric-oxide
synthase phosphorylated on serine 1179 and nitric oxide in Golgi and plasma
membrane defines the existence of two pools of active enzyme. J Biol Chem.,
277, 4277-4284.
Fulton, D., Gratton, J.P., McCabe, T.J., Fontana, J., Fujio, Y., Walsh, K., Franke, T.F.,
Papapetropoulos, A. and Sessa, W.C. (1999). Regulation of endothelium-
derived nitric oxide production by the protein kinase Akt. Nature, 399, 597-601.
Garcia-Cardena, G., Martasek, P., Masters, B.S., Skidd, P.M., Couet, J., Li, S., Lisanti,
M.P. and Sessa, W.C. (1997). Dissecting the interaction between nitric oxide
synthase (NOS) and caveolin. Functional significance of the nos caveolin
binding domain in vivo. J Biol Chem., 272, 25437-25440.
Gaston, B., Reilly, J., Drazen, J.M., Fackler, J., Ramdev, P., Arnelle, D., Mullins, M.E.,
Sugarbaker, D.J., Chee, C., Singel, D.J. (1993). Endogenous nitrogen oxides
and bronchodilator S-nitrosothiols in human airways. Proc Natl Acad Sci USA,
90, 10957-10961.
58
Gaston, B.M., Carver, J., Doctor, A. and Palmer, L.A. (2003). S-nitrosylation signaling in
cell biology. Mol Interv., 3, 253-263.
Gavard, J. and Gutkind, J.S. (2006). VEGF controls endothelial-cell permeability by
promoting the beta-arrestin-dependent endocytosis of VE-cadherin. Nat Cell
Biol., 8, 1223-1234.
Gawlowski, D.M. and Durán, W.N. (1986). Dose-related effects of adenosine and
bradykinin on microvascular permselectivity to macromolecules in the hamster
cheek pouch. Circ Res., 58, 348-355.
Geiger, B. and Ayalon, O. (1992). Cadherins. Annu Rev Cell Biol., 8, 307-332.
Ghitescu, L., Fixman, A., Simionescu, M., Simionescu, N. (1986). Specific binding sites
for albumin restricted to plasmalemmal vesicles of continuous capillary
endothelium: receptor-mediated transcytosis. J. Cell Biol., 102, 1304–11.
Gratton, J.P., Lin, M.I., Yu, J., Weiss, E.D., Jiang, Z.L., Fairchild, T.A., Iwakiri, Y.,
Groszmann, R., Claffey, K.P., Cheng, Y.C. and Sessa, W.C. (2003). Selective
inhibition of tumor microvascular permeability by cavtratin blocks tumor
progression in mice. Cancer Cell. 4, 31–39.
59
Hatakeyama, T., Pappas, P.J., Hobson, R.W., 2nd, Boric, M.P., Sessa, W.C. and Duran,
W.N. (2006). Endothelial nitric oxide synthase regulates microvascular
hyperpermeability in vivo. J Physiol., 574, 275-281.
Hess, D.T., Matsumoto, A., Kim, S.O., Marshall, H.E. and Stamler, J.S. (2005). Protein
S-nitrosylation: purview and parameters. Nat Rev Mol Cell Biol., 6, 150-166.
Hudry-Clergeon, H., Stengel, D., Ninio, E. and Vilgrain, I. (2005). Platelet-activating
factor increases VE-cadherin tyrosine phosphorylation in mouse endothelial
cells and its association with the PtdIns3'-kinase. Faseb J., 19, 512-520.
Kevil, C.G., Oshima, T., Alexander, B., Coe, L.L. and Alexander, J.S. (2000). H(2)O(2)-
mediated permeability: role of MAPK and occludin. Am J Physiol Cell Physiol.,
279, C21-C30.
Kevil, C.G., Payne, D.K., Mire, E. and Alexander, J.S. (1998). Vascular permeability
factor/vascular endothelial cell growth factor-mediated permeability occurs
through disorganization of endothelial junctional proteins. J Biol Chem., 273,
15099-15103.
60
Knezevic, II, Predescu, S.A., Neamu, R.F., Gorovoy, M.S., Knezevic, N.M., Easington,
C., Malik, A.B. and Predescu, D.N. (2009). Tiam1 and Rac1 are required for
platelet-activating factor-induced endothelial junctional disassembly and
increase in vascular permeability. J Biol Chem., 284, 5381-5394.
Kobayashi, I., Kim, D., Hobson, R.W., II, Durán, W.N. (1994). Platelet-activating factor
modulates microvascular transport by stimulation of protein kinase C. Am. J.
Physiol.–Heart Circ. Physiol., 266, H1214–H1220.
Komarova, Y. and Malik, A.B (2010). Regulation of endothelial permeability via
paracellular and transcellular transport pathways. Annu. Rev. Physiol., 72, 463-
493.
Lal, B.K., Varma, S., Pappas, P.J., Hobson, R.W., 2nd and Durán, W.N. (2001) VEGF
increases permeability of the endothelial cell monolayer by activation of
PKB/akt, endothelial nitric-oxide synthase, and MAP kinase pathways.
Microvasc Res., 62, 252-262.
Lampugnani, M.G., Orsenigo, F., Gagliani, M.C., Tacchetti, C. and Dejana, E. (2006).
Vascular endothelial cadherin controls VEGFR-2 internalization and signaling
from intracellular compartments. J. Cell Biol., 174, 593–604.
61
Lampugnani, M.G., Resnati, M., Raiteri, M., Pigott, R., Pisacane, A., Houen, G., Ruco,
L.P. and Dejana, E. (1992). A novel endothelial-specific membrane protein is a
marker of cell-cell contacts. J. Cell Biol., 118, 1511–22.
Liu, L., Yan, Y., Zeng, M., Zhang, J., Hanes, M.A., Ahearn, G., McMahon, T.J., Dickfeld,
T., Marshall, H.E., Que, L.G. and Stamler, J.S. (2004). Essential roles of S-
nitrosothiols in vascular homeostasis and endotoxic shock. Cell, 116, 617-628.
Mayhan, WG. (1999). VEGF increases permeability of the blood-brain barrier via a nitric
oxide synthase/cGMP-dependent pathway. Am J Physiol Cell Physiol., 276,
C1148–C1153.
Mehta, D. and Malik, A.B. (2006). Signaling mechanisms regulating endothelial
permeability. Physiol. Rev., 86, 279–367.
Minshall, R.D., Tiruppathi, C., Vogel, S.M., Malik, A.B. (2002). Vesicle formation and
trafficking in endotelial cells and regulation of endothelial barrier function.
Histochem. Cell Biol., 117, 105–12.
Moy, A.B., Van Engelenhoven, J., Bodmer, J., Kamath, J., Keese, C., Giaever I.,
Shasby, D.M. (1996). Histamine and thrombin modulate endothelial focal
adhesion through centripetal and centrifugal forces. J Clin Invest., 97, 1020–
1027.
62
Noel, A.A., Hobson, R.W., 2nd and Durán, W.N. (1996). Platelet-activating factor and
nitric oxide mediate microvascular permeability in ischemia-reperfusion injury.
Microvasc Res., 52, 210-220.
Nollet, F., Kools, P. and Van Roy, F. (2000). Phylogenetic analysis of the cadherin
superfamily allows identification of six major subfamilies besides several solitary
members. J Mol Biol., 299, 551–572.
Pappas, P.J. and Durán., W.N. (1994). Platelet Activating Factor. In: "Ischemia-
Reperfusion Injury of Skeletal Muscle. 61 - 76.
Pappenheimer, J.R., Renkin, E.M., Borrero, L.M. (1951). Filtration, diffusion and
molecular sieving throughperipheral capillary membranes; a contribution to the
pore theory of capillary permeability. Am. J.Physiol., 167, 13–46.
Pi, X., Wu, Y., Ferguson, J.E., III, Portbury, A.L., and Patterson, C. (2009). SDF-1alpha
stimulates JNK3 activity via eNOS-dependent nitrosylation of MKP7 to enhance
endothelial migration. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106, 5675–5680.
Prabhakar, P., Thatte, H.S., Goetz, R.M., Cho, M.R., Golan, D.E. and Michel, T. (1998).
Receptor-regulated translocation of endothelial nitric-oxide synthase. J Biol
Chem., 273, 27383-27388.
63
Ramírez, M.M., Kim, D.D. and Durán, W.N. (1996). Protein kinase C modulates
microvascular permeability through nitric oxide synthase. Am. J. Physiol.–Heart
Circ. Physiol., 271, H1702-H1705.
Ramírez, M.M., Quardt, S.M., Kim, D., Oshiro, H., Minnicozzi, M. and Durán, W.N.
(1995). Platelet activating factor modulates microvascular permeability through
nitric oxide synthesis. Microvasc Res., 50, 223-234.
Sánchez, F.A., Rana, R., Kim, D.D., Iwahashi, T., Zheng, R., Lal, B.K., Gordon, D.M.,
Meininger, C.J. and Durán, W.N. (2009). Internalization of eNOS and NO
delivery to subcellular targets determine agonist-induced hyperpermeability.
Proc Natl Acad Sci USA, 106, 6849-6853.
Sánchez, F.A., Kim, D.D., Durán, R.G., Meininger, C.J. and Durán, W.N. (2008).
Internalization of eNOS via caveolae regulates PAF-induced inflammatory
hyperpermeability to macromolecules. Am J Physiol Heart Circ Physiol., 295,
H1642-H1648.
Sánchez, F.A., Savalia, N.B., Durán, R.G., Lal, B.K., Boric, M.P. and Durán, W.N.
(2006). Functional significance of differential eNOS translocation. Am J Physiol
Heart Circ Physiol., 291, H1058-H1064.
64
Schroeder, F., Gallegos, A.M., Atshaves, B.P., Storey, S.M., McIntosh, A.L., Petrescu,
A.D., Huang, H., Starodub, O., Chao, H., Yang, H., Frolov, A. and Kier, A.B.
(2001). Recent advances in membrane microdomains: rafts, caveolae, and
intracellular cholesterol trafficking. Exp Biol Med (Maywood), 226, 873-890.
Shasby, D.M., Ries, D.R., Shasby, S.S. and Winter, M.C. (2002). Histamine stimulates
phosphorylation of adherens junction proteins and alters their link to vimentin.
Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol., 282, L1330-L1338.
Siddiqui, M.R., Komarova, Y.A., Vogel, S.M., Gao, X., Bonini, M.G., Rajasingh, J.,
Zhao,Y., Brovkovych, V. and Malik, A.B. (2011). Caveolin-1–eNOS signaling
promotes p190RhoGAP-A nitration and endothelial permeability. J.Cell Biol.,
193, 841-850.
Sirois, M.G. and Edelman, E.R. (1997). VEGF effect on vascular permeability is
mediated by synthesis of platelet-activating factor. Am. J. Physiol., 272, H2746–
H2756.
Stamler, J.S., Simon, D.I., Jaraki, O., Osborne, J.A., Francis, S., Mullins, M., Singel, D.
and Loscalzo, J. (1992a). S-nitrosylation of tissue-type plasminogen activator
confers vasodilatory and antiplatelet properties on the enzyme. Proc Natl Acad
Sci USA, 89, 8087-8091.
65
Stamler, J.S., Simon, D.I., Osborne, J.A., Mullins, M.E., Jaraki, O., Michel, T., Singel,
D.J. and Loscalzo, J. (1992b). S-nitrosylation of proteins with nitric oxide:
synthesis and characterization of biologically active compounds. Proc Natl Acad
Sci USA, 89, 444-448.
Takeichi, M. (1990). Cadherins: a molecular family important in selective cell-cell
adhesion. Annu. Rev. Biochem, 59, 237–252.
Thibeault, S., Rautureau, Y., Oubaha, M., Faubert, D., Wilkes, B.C., Delisle, C. and
Gratton, J.P. (2010). S-nitrosylation of beta-catenin by eNOS-derived NO
promotes VEGF-induced endothelial cell permeability. Mol. Cell. 39, 468–476.
Vincent, P.A., Xiao, K., Buckley, K.M. and Kowalczyk, A.P. (2004). VE-cadherin:
adhesion at arm's length. Am J Physiol Cell Physiol., 286, C987-C997.
Vittet, D., Buchou, T., Schweitzer, A., Dejana, E. and Huber, P. (1997). Targeted null-
mutation in the vascular endothelial-cadherin gene impairs the organization of
vascular-like structures in embryoid bodies. Proc Natl Acad Sci USA, 94, 6273-
6278.
Wang, G., Moniri, N.H., Ozawa, K., Stamler, J.S. and Daaka, Y. (2006). Nitric oxide
regulates endocytosis by S-nitrosylation of dynamin. Proc Natl Acad Sci USA,
103, 1295-1300.
66
Wallez, Y. and Huber, P. (2008). Endothelial adherens and tight junctions in vascular
homeostasis, inflammation and angiogenesis. Biochim. Biophys. Acta, 1778,
794–809.
Weis, W.I. and Nelson, W.J. (2006). Re-solving the cadherin-catenin-actin conundrum. J
Biol Chem., 281, 35593-35597.
Whalen, E.J., Foster, M.W., Matsumoto, A., Ozawa, K., Violin, J.D., Que, L.G., Nelson,
C.D., Benhar, M., Keys, J.R., Rockman, H.A., Koch, W.J., Daaka, Y., Lefkowitz,
R.J. and Stamler, J.S. (2007). Regulation of beta-adrenergic receptor signaling
by S-nitrosylation of G-protein-coupled receptor kinase 2. Cell, 129, 511-522.
Yuan, S.Y. (2000). Signal transduction pathways in enhanced microvascular
permeability. Microcirculation, 7, 395-403.
Yuan, Y., Granger, H.J., Zawieja, D.C. and Chilian, W.M. (1993). Histamine increases
venular permeability via a phospholipase C-NO synthase-guanylate cascade.
Am. J. Physiol.–Heart Circ. Physiol., 264, H1734–H1739.
Xiao, K., Garner, J., Buckley, K.M., Vincent, P.A., Chiasson, C.M., Dejana, E., Faundez,
V. and Kowalczyk, A.P. (2005). p120-Catenin regulates clathrin-dependent
endocytosis of VE-cadherin. Mol Biol Cell, 16, 5141-5151.
67
Xiao, K., Allison, D. F., Kottke, M. D., Summers, S., Sorescu, G. P., Faundez, V. and
Kowalczyk, A. P. (2003). Mechanisms of VE-cadherin processing and
degradation in microvascular endothelial cells. J. Biol. Chem., 278, 19199-
19208.