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Xeider Gerrikagoitia Sagarna

LOS CARNÍVOROS SILVESTRES COMO RESERVORIOSDE ENFERMEDADES DE INTERÉS

EN SANIDAD ANIMAL Y SALUD PÚBLICA

Edición: 1.ªmayo2010

Tirada: 50ejemplares

© AdministracióndelaComunidadAutónomadelPaísVascoDepartamentodeMedioAmbiente,PlanificaciónTerritorial,AgriculturayPesca

Internet: www.euskadi.net

Edita: EuskoJaurlaritzarenArgitalpenZerbitzuNagusiaServicioCentraldePublicacionesdelGobiernoVasco Donostia-SanSebastián,1-01010Vitoria-Gasteiz

Impresión: EuskoPrintingService,S.L. www.eps-grupo.com

ISBN: 978-84-457-3069-0

D.L.: VI241-2010

UnregistrobibliográficodeestaobrapuedeconsultarseenelcatálogodelaBibliotecaGeneraldelGobiernoVasco:<http://www.euskadi.net/ejgvbiblioteka>.

Este trabajo de Tesis Doctoral ha sido realizado en el Departamento de Producción y

Sanidad Animal del Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario- Neiker-

Tecnalia.

La realización de este trabajo ha sido posible gracias a las becas de Formación de

Tecnólogos del Departamento de Agricultura, Pesca y Alimentación del Gobierno

Vasco y de Formación de Doctores en centros de la Red Vasca de Ciencia, Tecnología e

Innovación del Departamento de Comercio, Industria y Turismo del Gobierno Vasco y a

la beca de la Fundación Cándido Iturriaga.

AGRADECIMIENTOS

En primer lugar tengo que agradecer la oportunidad que me ofrecieron la Dra. Marta Barral y el Dr. Ramón A. Juste para llevar a cabo el presente trabajo de Tesis Doctoral en Neiker y les doy las gracias por la labor que han desempeñado en dirigir esta Tesis. Muchas gracias Marta por el apoyo que me has ofrecido y la confianza depositada en mí en todo este tiempo.

Mis agradecimientos también van dirigidos al Dr. Christian Gortázar, por ofrecerme la oportunidad de realizar prácticas en el Irec, donde de alguna forma considero que me empecé a interesar por este mundillo de la investigación. Y cómo no, a los que fueron unos estupendos compañeros durante mi estancia allí: Joaquín, Javi y Jota, muchas gracias por acogerme tan bien y transmitirme ese gusto por la investigación.

Un especial agradecimiento a los que fueron mis compañeros de trabajo en Zaragoza, justo antes de emprender este nuevo reto y de quienes obtuve un gran apoyo para embarcarme en esta nueva aventura: Javier Marco, Marco, Susana, Jose Luis, Yolanda, Natalia, Manolo, Emilio, Javi, Laura, Alex, Edurne, Gregorio y Javi F.

Desde entonces han sido muchas las personas que me han ayudado y apoyado durante este largo trayecto de muy diversas maneras, por ello muy gustosamente les ofrezco mi más sincero agradecimiento.

Por un lado quiero agradecer a las Diputaciones forales de Gipuzkoa, Bizkaia y

Álava, a los centros de recuperación, asociaciones de cazadores y otras entidades por la labor colaborativa realizada principalmente en el envío de cadáveres de carnívoros, sin el cual no hubiese sido posible la realización del presente trabajo:

Agradezco muy especialmente a todas aquellas personas implicadas en dicha labor, por un lado a los guardas forestales de la Diputación de Gipuzkoa y más concretamente a Mikel Olano, Jon Ugarte, Agustin Erkiaga, Jon Zulaika, Esteban Iriarte, Javier Vázquez, Iñaki Garmendia, Tomas Aierbe, Josetxo e Iñigo Mendiola.

Asimismo, doy las gracias a Imanol Sagarzazu y a los miembros de la clínica veterinaria “Lardy” de Donostia.

También quiero agradecer a todas las personas que han estado trabajando y colaborando en el centro de recuperación de fauna silvestre de Gorliz y en especial a Iñaki Intxausti.

Mis agradecimientos también van dirigidos a los componentes del Grupo Alavés para la Defensa y el Estudio de la Naturaleza (GADEN): Diana Paniagua, Andrés Illana y Jorge Echegaray, por toda la ayuda, el apoyo e interés mostrado durante todo este tiempo.

Asimismo, también quiero agradecer la inestimable ayuda recibida por parte de todos los componentes del centro de recuperación de fauna silvestre de Mártioda, de Pagoa Consultores Ambientales y en especial de Patricia Lizarraga, por su gran disposición y colaboración a lo largo de todo este trayecto.

Muchas gracias a Ibon Telletxea de la Asociación de Cotos de Caza de Álava (ACCA).

Muchas gracias también a Oscar Berdión, sobre todo por todas las muestras de suero.

Muchas gracias al Dr. Jean Beaucournu por su inestimable ayuda a la hora de la identificación de las pulgas. A la Dra. Mª Paz Martín por ayudarme con la identificación de piojos. A la Facultad de Farmacia de la Universidad Complutense de Madrid y en especial al Dr. Antonio R. Martínez-Fernández, por la identificación de las Triquinas. A Sonia Almería y a todo su equipo de la Universidad Autónoma de Barcelona por realizar los análisis serológicos de Toxoplasma. Al Laboratorio Central Veterinario de Algete por realizar el tipado de las Salmonelas. Al Instituto Carlos III de Madrid y en especial a Horacio Gil y a Pedro Anda por su ayuda en la identificación de las Bartonelas.

Un especial agradecimiento para Arantxa y Luis de Tourline.

Doy las gracias a aquellas personas implicadas en la realización de este trabajo desde un comienzo (Patricia S e Itziar L) y agradezco mucho la labor de todos los responsables y compañeros del grupo de microbiología y serología (Gorka, Jose Carlos, Raquel, Argiñe, Gloria, Itziar, Zuriñe y Ainara), anatomía patológica (Nico, Esme, Arrate, Nieves), parasitología (Ana G, Inés, Naiara, Jesse), biología molecular (Ana H), micobacterias y de “vacas locas” (Joseba, Mertxe, Leyre, Galder, Patri, Amaia E, Mariví, Iker, Elena, Patricia) por toda la ayuda y todos los consejos y las recomendaciones recibidas para la correcta realización de esta Tesis.

Muchas gracias también a Lucía por ayudarme con los reactivos y los pedidos y también por preocuparse de mí.

Muchas gracias a los chicos de mantenimiento: Sergio, Fidel, Fernando, Ainara, Felix, Unai y Jose Angel.

Agradezco también a Gontzal por su inestimable ayuda informática y a Jon-Paul, Leire, Iñigo, Jokin, Rosa, Jon e Iranzu por su apoyo administrativo.

Muchas gracias a Paqui y a Claudina, no sólo por mantenerlo todo tan limpio a diario, sino por su gran simpatía y buen humor.

También quiero destacar la ayuda que me ofrecieron Joseba Odriozola y Saioa Landa durante su estancia de prácticas en Neiker.

Muchas gracias a Iker por la gran ayuda con el “Reference” y a Sorkunde por atreverse a leer esta Tesis. A Fran, muchas gracias por toda la ayuda y consejos ofrecidos en esta última fase.

Muchísimas gracias a todas las personas que de muy distintas maneras me habéis ayudado a realizar este trabajo con ilusión. A mis compañeros Itziar, Iker, Natalia, Iratxe, Ianire, Bea, Amaia R, Olaia, Belen, Jon, Sonia, Elena, Patricia, Vega, Ainara, Zuriñe, Idoia, Monica, Fran y Marta A. A los que ya no están: Nagore, Itziar K, Esther, Monica, Josune, Dani, David, Laura M, Laura E, Patri, Laura L, Ane, Ainara C, Julio y Mara. A los compañeros del “edificio rojo”: Sorkunde, Haritz, Roberto, Lur, Nahia, Joana, Fen Xia, Dazhou, Santiago, Iker, Oscar, Ainara A, Berdaitz, Luis, Olatz y Fernando. Muchas gracias a todos por apoyarme en el laboratorio, por ayudarme a resolver dudas, por enseñarme lo que no sabía, por animarme, por hacerme reír, por esa amistad, por los viajes tan entretenidos en el tren, por esas parrandas tan divertidas… por todo ello, muchas gracias a todos!!!

A aquellas compañeras con las que he tenido el gran privilegio de convivir también quiero agradecerles: Itziar, Ainara C, Laura L, Patri y Mara. A Amaia por su amistad y su estupendo piso de Atxuri y cómo no, a mi última compañera y gran amiga Alaitz.

A los compañeros que muchas veces me facilitaron mis idas y venidas de Donosti: Itziar, Raquel, Gorka y Felix.

A los Irec-íes: Mónica, Elena, Elisa, Pelayo, Lorenzo, Isabel, Diego, Úrsula, Peibol, Miguel, Fabian, Oscar, Manolo, Paqui, Álvaro, Ricardo, Salva por su gran amabilidad, amistad y esos momentos tan estupendos que me habéis ofrecido por las tierras manchegas.

Un especial agradecimiento también para Julian Garde, por su gran amabilidad y por su eficacia en la tramitación de papeleos.

A Ahinitz por ayudarme con la traducción al euskara y a Felix por ayudarme con

la traducción al inglés. A Marco y a Antonio por cederme las fotos de zorro y tejón.

A todos mis amig@s: Aloña, Ainara, Jaione, Ametza, Amaia, Laura, Idoia,

Beñat, Iñaki, Anjel, Ekley, Mikel, Xabi, Argiñe, Edurne, Markos, Lorea, Pili, Gari, Alaitz, Nagore y a los más “peques”: Aiala, Jon, Eki, Enara y Oier. Muchas gracias por vuestra amistad y por esos incansables ánimos y… nos vemos pronto por el monte!!!

A Ana y Antonio, Nagore y Juanjo, Mikel y Naia, por transmitirme tanta alegría.

A Alberto, por enseñarme tanto y tan bien de lo fundamental de esta vida.

Mi mayor y más especial agradecimiento va dirigido a mi familia: ama y aita,

Ziortza y Ahinitz, de vosotros he obtenido el cariño y el mayor de los apoyos incondicionales. Amama y aitite esto también va por vosotros, a mis tíos y primos. A David. A Salma y a toda la familia gatuna. A Aitzol, por compartir conmigo tu tiempo, por confiar en mí, por tu gran comprensión y por todo tu cariño.

En todas estas líneas me quedo corta a la hora de transmitir mis agradecimientos a todos aquellos que habéis formado parte de esta larga etapa, sin embargo, mi mejor manera de deciros ESKERRIK ASKO no queda solamente plasmada aquí, sino que prefiero demostrároslo en el día a día.

INTRODUCCIÓN

1.- INTRODUCCIÓN:

La fauna silvestre es uno de los recursos naturales que enriquece el medio

natural que nos rodea. Las enfermedades infecciosas y parasitarias de las especies

silvestres tienen interés por su efecto directo o indirecto sobre la población animal, así

como por su importancia desde el punto de vista epidemiológico y su relación con la

salud del ser humano o de los animales domésticos (Artois, 1997).

Estas enfermedades infecciosas y parasitarias, a las que nos referiremos

genéricamente como patologías, pueden mostrar una prevalencia muy variable en los

animales dependiendo de la zona en la que éstos se encuentren y de la interrelación

existente entre las diferentes especies tanto domésticas, sobre todo de ganado en

régimen extensivo, como silvestres que habitan en esa área.

En un lugar como la Comunidad Autónoma del País Vasco (CAPV), donde

debido a su orografía y tradiciones es común el aprovechamiento de zonas de monte

para la ganadería extensiva y donde cada vez se observa un mayor acercamiento de la

población urbana a estas zonas, la vigilancia sanitaria de la fauna silvestre permite

obtener información sobre la prevalencia y distribución de las enfermedades existentes

en el medio natural.

Puede resultar de gran utilidad determinar el estado sanitario de algunas especies

silvestres y evaluar el impacto epidemiológico de diversas enfermedades importantes en

sanidad animal por su carácter zoonótico, así como por sus repercusiones en sanidad

animal. Gracias a estudios de tipo comparado se pueden identificar los principales

riesgos sanitarios de cada zona y determinar las especies animales implicadas. Los

resultados que se observen pueden ser la base de futuras acciones de control de algunas

enfermedades o de otras actuaciones que se consideren de interés.

El orden Carnivora engloba a diversas especies que pueden actuar como

reservorios de una gran variedad de agentes infecciosos y parasitarios (Williams y

Thorne, 1996). De esta manera, el interés epidemiológico de los carnívoros silvestres

reside, por un lado, en los hábitos carnívoros y/o carroñeros de estos animales, ya que

forman parte del ciclo epidemiológico de algunas patologías. Por otra parte, en nuestro

territorio encontramos una gran variedad de especies de carnívoros, algunas de las

cuales son muy abundantes y presentan una amplia distribución como el zorro (Vulpes

vulpes), el tejón (Meles meles), la garduña (Martes foina), la gineta (Genetta genetta) y

la comadreja (Mustela nivalis) (Fernández de Mendiola y Bea, 1998; Palomo y Gisbert,

2002), siendo ideales candidatas para estudios de vigilancia.

Diversos estudios han constatado la importancia de los carnívoros como

reservorios de algunos agentes infecciosos o parasitarios (Gortázar, 1999; Sobrino,

2008) y se ha comprobado que son numerosos los agentes zoonóticos presentes en los

carnívoros silvestres de todo el mundo. La rabia se considera uno de los procesos

infecciosos más importantes que afectan a estos animales, aunque la Península Ibérica

se encuentra libre de ella. No obstante, se han detectado casos de rabia canina en la

Ciudad Autónoma de Melilla (OIE, 2001, 2003).

Cabe destacar el papel que se atribuye a los tejones en el Reino Unido e Irlanda

como reservorios de la bacteria Mycobacterium bovis, causante de la tuberculosis

bovina (Clifton-Hadley y cols., 1993), al impedir una erradicación eficaz de la

enfermedad en el ganado vacuno a pesar de los programas de control emprendidos

(Cheeseman y cols., 1989).

Además, los carnívoros pueden verse afectados por un gran número de agentes

parasitarios de carácter zoonótico. Los zorros son considerados los principales

hospedadores del ácaro Sarcoptes scabiei, agente etiológico de la sarna sarcóptica,

afección que también ha sido descrita en diversas especies de mustélidos (Bornstein y

cols., 2001). El lobo forma parte del ciclo epidemiológico del agente causal de la

equinococosis (Echinococcus granulosus), enfermedad endémica en algunas regiones

de España (Sobrino y cols., 2006). El jabalí es uno de los principales reservorios de la

triquinelosis en todo el mundo (Pozio, 2005), aunque algunos carnívoros como el zorro

y el lobo también desempeñan un papel importante en el ciclo epidemiológico de esta

parasitosis (Cabaj y cols., 2000; Pozio y cols., 2001).

Todos estos casos constituyen un claro ejemplo de la importancia del

conocimiento de los procesos patológicos presentes en el medio natural para poder

tomar las medidas de control oportunas. Además, es muy probable que se descubran

nuevas zoonosis en un futuro próximo como consecuencia del desarrollo de nuevas

técnicas de diagnóstico, aunque probablemente también sea debido a una mayor

concienciación a estudiar este tipo de patologías (Williams y cols., 2002). Todo ello

refuerza la necesidad de profundizar en el conocimiento de la epidemiología y

prevalencia de ciertas enfermedades presentes en la fauna silvestre, para poder instaurar

medidas preventivas encaminadas a conseguir una disminución de su incidencia y a

monitorizar la aparición de procesos exóticos o nuevos (Sainsbury y cols., 2001;

Morner y cols., 2002; Chomel y cols., 2007; Gortázar y cols., 2007).

Al hilo de lo expuesto, dada la escasa información existente acerca de las

patologías de la fauna silvestre en nuestro entorno, los carnívoros silvestres pueden

actuar como buenos indicadores de las enfermedades presentes en el medio, tanto por su

amplia distribución como por sus hábitos alimenticios, aportándonos información

valiosa acerca de la presencia o ausencia y distribución de determinados agentes

patógenos en la zona de estudio.

En este trabajo se pretende profundizar en la epidemiología de algunas zoonosis

de interés en relación con los carnívoros silvestres. Los agentes seleccionados son

relevantes principalmente por su repercusión en la salud humana, pero también, en

algunos casos, por las pérdidas económicas que ocasionan en los animales domésticos,

bien directamente por la enfermedad que producen o bien por los costes económicos

derivados de su control. Además, en la mayoría de los casos se desconoce si las especies

de carnívoros silvestres de la CAPV están implicadas en su epidemiología.

Algunos de los agentes seleccionados son de declaración obligatoria, como el

agente causante de la tuberculosis, la encefalopatía espongiforme bovina, la

leptospirosis, la fiebre Q, la tularemia y la triquinelosis (OIE, 2009b). Además, se han

incluido en este estudio enfermedades transmitidas por artrópodos como la enfermedad

de Lyme, la anaplasmosis, la rickettsiosis y la bartonelosis, así como otras

enfermedades como la salmonelosis, la yersiniosis, la toxoplasmosis y la sarna

sarcóptica.

Los resultados obtenidos pueden ser de utilidad en programas de conservación de

algunas especies, ya que mejoran el conocimiento de las patologías que les puedan afectar y

pueden ser tenidos en cuenta en la aplicación de medidas de control.

Por lo tanto, el objetivo propuesto en el presente trabajo de Tesis Doctoral es:

Describir el patrón de presentación de diferentes agentes patógenos en las

poblaciones de carnívoros silvestres, en relación con algunos factores

ambientales.

REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

2.- REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA: 2.1.- LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO: BIOGEOGRAFÍA,

VEGETACIÓN Y CLIMA:

Los diferentes grupos de especies animales que conforman la fauna presente en

un área geográfica determinada dependen en gran medida de la situación geográfica de

la zona que habitan, es decir del relieve, la altitud, el clima y la vegetación. En este

sentido, la Comunidad Autónoma del País Vasco (CAPV), a pesar de ser un territorio

pequeño (7200 km2), es un lugar bastante heterogéneo donde a grandes rasgos se

pueden distinguir tres zonas: la vertiente atlántica al norte, la zona media en el centro y

el extremo sur, entrando en la depresión del Ebro y Rioja alavesa (Aseginolaza y cols.,

1996) (Fig. 1).

Fig. 1. Clasificación de territorios climáticos: vertiente atlántica (amarillo), zona media (verde), extremo sur (gris). Fuente: Agencia Vasca de Meteorología, http://www.euskalmet.euskadi.net/s07-5921/es/contenidos/informacion/cla_clasificacion/es_7264/es_clasificacion.html.

La vertiente atlántica comprende la totalidad de los territorios históricos de

Bizkaia, Gipuzkoa y parte del norte de Álava. Presenta un tipo de clima mesotérmico,

moderado en cuanto a las temperaturas y muy lluvioso. Los valles atlánticos presentan

un relieve accidentado de colinas y montañas bajas recorridas por innumerables arroyos

y ríos. La vegetación presente en estos ambientes, por una parte, consta de plantas y

flores típicas de la zona costera y, por otra parte, destacan los cultivos y prados

generalmente verdes, así como abundantes pinares de repoblación. En algunos

Gasteiz/Vitoria

Bilbo/Bilbao

GIPUZKOA BIZKAIA

ÁLAVA

Donostia/San Sebastian

afloramientos calizos se instala el encinar, y de manera dispersa pueden verse pequeños

robledales y bosques mixtos de frondosas.

La zona media o zona de transición, que ocupa gran parte de Álava, se presenta

como una zona de transición entre el clima oceánico y el clima mediterráneo,

predominando las características atlánticas, ya que no existe un auténtico verano seco.

En este sentido, podemos diferenciar el clima subatlántico, con precipitaciones menores

que en la vertiente atlántica y que comprende los valles occidentales de Álava y la

llanada alavesa. El clima submediterráneo, más al sur, en una zona que comprende

aproximadamente Treviño y la montaña alavesa, donde predomina un clima templado

con verano más cálido y algo más seco, con lluvias anuales moderadas. En esta zona

encontramos formaciones montañosas algo más elevadas y entre ellas discurren valles y

cuencas más o menos extensos. En cuanto a la vegetación, los hayedos y robledales, así

como el quejigal constituyen las formaciones boscosas de la mayor parte de la comarca,

aunque adquieren gran relevancia diferentes tipos de pastos y matorrales.

En el sur de la CAPV, en la zona de la depresión del Ebro ocupada por la Rioja

alavesa, se observa ya un clima del tipo mediterráneo, con veranos claramente secos y

calurosos. Normalmente, debido a sus inviernos bastante fríos y de escasas

precipitaciones, se le ha denominado mediterráneo de interior o continental

mediterráneo. El valle del Ebro, en cuanto al relieve se refiere, está mucho más

organizado alrededor de la depresión principal que se va ensanchando hacia el sureste,

junto a los valles afluentes de dirección norte-sur. Estas llanuras se complementan con

largas series de colinas redondeadas o planas. La suavidad del relieve y los suelos

margo-arcillosos, fácilmente trabajables con el arado, han condicionado el actual

paisaje, en el que dominan las superficies dedicadas a cultivos. La vegetación natural de

tipo boscoso, representada por los quejigales, queda reducida a masas pequeñas.

Asimismo, el territorio vasco se clasifica en ocho regiones naturales en base a la

altitud del territorio, la pluviometría anual, las temperaturas medias máximas y mínimas

y la composición vegetal (Fig. 2) (Gobierno Vasco, 1989). Estas regiones son los valles

atlánticos, las montañas septentrionales, los valles subatlánticos, las montañas y altos

valles de transición, los valles submediterráneos, las montañas meridionales, la Rioja

alavesa y la franja costera que está representada únicamente por zonas de acantilados de

escasa relevancia para el presente estudio.

Fig. 2. Distribución geográfica de las regiones naturales en la CAPV (Gobierno Vasco, 1989). 2.2.- ASPECTOS BIOLÓGICOS DE LOS CARNÍVOROS:

2.2.1.- Introducción:

Los carnívoros constituyen un orden heterogéneo formado por algo más de 200

especies muy diferentes entre sí y agrupadas en ocho familias, que se extienden por todos

los continentes a excepción de la Antártida (Rodríguez, 2002).

Su tamaño varía desde la diminuta comadreja, cuyo peso oscila entre 60 y 200 gr,

hasta el corpulento oso polar que puede llegar a alcanzar los 650 kg, dejando claro la enorme

diversificación en cuanto a forma y tamaño. Asimismo, la elección del hábitat, la

especialización trófica y sus costumbres son muy variables (Blanco, 1998).

Los carnívoros terrestres son mamíferos adaptados a una dieta a base de carne, si

bien algunas especies salvajes son omnívoras. Su gran diversidad de tamaños y de

adaptaciones hace que su espectro de presas vaya desde los invertebrados a los grandes

herbívoros. La característica común de todos los carnívoros es la posesión de cuatro dientes

grandes y puntiagudos, llamados caninos, con los que dan muerte a sus presas. El cuarto

premolar superior y el primer molar inferior, presentan unas puntas afiladas, altas cúspides y

bordes mellados, que encajan perfectamente ofreciendo una superficie ideal para desgarrar la

carne y se denominan dientes carniceros. En determinadas especies están poco diferenciados

y tienden a aplanarse, debido a la evolución hacia hábitos alimenticios más vegetarianos

(Rodríguez, 2002).

Valles atlánticos

Montaña septentrional

Valles subatlánticos

Montaña y valle transición

Valles submediterráneos

Montañas meridionales

Rioja alavesa

Regiones Naturales

2.2.2.- Taxonomía:

En la CAPV, el orden Carnivora está representado por cuatro familias, que incluyen

ocho géneros que suman un total de 13 especies (Rodríguez, 2002) (Tabla 1; Foto 1).

Tabla 1. Clasificación de las especies de carnívoros silvestres presentes en la CAPV.

ORDEN FAMILIA GÉNERO Y ESPECIE NOMBRE VULGAR (Castellano-Euskara)

Canis lupus Lobo- Otsoa Canidae

Vulpes vulpes Zorro- Azeria

Felidae Felis silvestris Gato montés- Basakatua

Meles meles Tejón- Azkonarra

Lutra lutra Nutria- Igaraba

Martes martes Marta- Lepahoria

Martes foina Garduña- Lepatxuria

Mustela putorius Turón- Ipurtatsa

Mustela nivalis Comadreja- Erbinude arrunta

Mustela erminea Armiño- Erbinude zuria

Mustela lutreola Visón europeo- Bisoi europarra

Mustelidae

Mustela vison Visón americano- Bisoi amerikarra

Carnivora

Viverridae Genetta genetta Gineta- Katajineta

Foto 1. Algunos de los carnívoros estudiados: (a) el zorro, (b) el gato montés, (c) el tejón, (d) la gineta.

2.2.3.- Descripción:

2.2.3.1.- Familia Canidae:

Los cánidos evolucionaron para adaptarse a la persecución de presas en zonas

abiertas, por lo que presentan el sentido del olfato, del oído y de la vista muy desarrolladas.

La característica más notable de estos carnívoros es, sin lugar a dudas, la capacidad de

formar grupos jerarquizados y altamente coordinados como ocurre fundamentalmente en el

caso del lobo, que aumentan la eficacia para la caza y favorecen la defensa de la manada

frente a posibles depredadores. La estructura social de los zorros, en cambio, parece

depender fundamentalmente de la riqueza y distribución de las fuentes de alimento.

a b c d

2.2.3.2.- Familia Felidae:

El gato montés es más grande y corpulento que el doméstico, con el cual está

estrechamente emparentado. Suelen ser animales solitarios, huidizos y ágiles trepadores. La

vista de estos animales es muy aguda, con una gran adaptabilidad a la oscuridad. Además, el

oído es excelente y el olfato bueno. Generalmente sólo se unen los machos y las hembras

durante la época de celo.

2.2.3.3.- Familia Mustelidae:

Entre los mustélidos se incluyen carnívoros de pequeño y mediano tamaño.

Presentan cuerpos alargados y patas cortas, provistas de uñas no retráctiles. Un rasgo

anatómico común a muchos de ellos es la posesión de dos grupos de glándulas a ambos

lados del ano que descargan voluntariamente una secreción con olor muy penetrante y es

empleado en el marcaje territorial, la información sexual y la defensa.

En general, son especies solitarias que únicamente se unen durante la cópula, salvo el

tejón, que pueden vivir en grupos compartiendo un territorio común, aunque buscan el

alimento y realizan el resto de sus actividades en solitario.

En algunas especies se suele producir el fenómeno de la implantación diferida que

consiste en la capacidad de ciertas hembras de acoger un óvulo fecundado sin que éste se

desarrolle hasta que las condiciones externas sean las propicias para el nacimiento y cuidado

de la prole. Esta pecularidad la poseen el armiño, el tejón, la marta, la garduña, el visón

europeo y el visón americano.

2.2.3.4.- Familia Viverridae:

La gineta posee un cuerpo alargado y esbelto, con extremidades cortas y una gruesa y

larga cola. Básicamente se considera una especie nocturna y solitaria. Entre los individuos

del mismo sexo no hay solapamiento en el uso del terreno, lo que sugiere un

comportamiento territorial.

En cuanto al estado de conservación de las especies de carnívoros silvestres

presentes en la CAPV, según la Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza

(UICN), la categoría propuesta para cada una de estas especies es la siguiente: el visón

europeo “En Peligro”, el gato montés y el armiño “Vulnerables”, el lobo, la nutria y el turón

“Casi amenazados”, el tejón, el zorro, la garduña, la marta y la gineta como “Preocupación

menor”, la comadreja como “Datos Insuficientes” y el visón americano como “No evaluado”

(Palomo y Gisbert, 2002).

2.2.4.- Distribución:

De todas estas especies presentes en la CAPV, ocho tienen una distribución muy

amplia, como la comadreja, el turón, la garduña, el tejón, la nutria, el zorro, el gato montés y

la gineta (Palomo y Gisbert, 2002)

El lobo sería históricamente una especie de amplia distribución en toda la Península

Ibérica, sin embargo, su persecución por parte del ser humano ha hecho que su ocupación

disminuya notablemente, desapareciendo casi en su totalidad de la zona suroriental de la

península. No obstante, en la actualidad se encuentra en vías de expansión en algunas zonas

del norte peninsular.

El visón americano, especie exótica introducida para su explotación en peletería, se

encuentra en expansión debido a su capacidad colonizadora y los escapes constantes de

granjas peleteras de toda España y podría convertirse en breve en una especie de amplia

distribución.

En cuanto al armiño y a la marta, se encuentran ampliamente distribuidos únicamente

en la franja septentrional de la península, mientras que las poblaciones de visón europeo son

muy escasas y se encuentran restringidas a algunas zonas concretas localizadas también en

el norte peninsular (Blanco, 1998).

En el conjunto de la CAPV contamos como referencia inicial con la información

recopilada para la realización del Atlas de vertebrados (Alvarez y cols., 1986; Fernández de

Mendiola y Bea, 1998), trabajos que recogen observaciones de distinta naturaleza realizadas

entre los años 1981 y 1998, ofreciéndonos una primera imagen de la distribución de las

distintas especies. Posteriormente, Aihartza y cols. (1999) realizaron un examen más

exhaustivo de los carnívoros silvestres presentes en la provincia de Bizkaia y más

recientemente se ha publicado el Atlas de los mamíferos terrestres de España, en el que se

describe la distribución actual de las especies (Palomo y Gisbert, 2002). Estos autores

describen la presencia de 13 especies de carnívoros en el territorio de la CAPV, con una

distribución generalizada de algunas de ellas como el zorro, el tejón, la comadreja, la

garduña, el turón y la gineta. Sin embargo, el gato montés, la marta, el visón europeo, el

visón americano, el lobo, la nutria y el armiño se encontrarían restringidos a localizaciones

concretas.

2.2.5.- Hábitat:

Algunos carnívoros viven en hábitats muy variados, mientras que otros necesitan

unas condiciones específicas, fuera de las cuales no estaría garantizada su supervivencia. El

hábitat ideal les proporciona alimento y refugio, por lo que sus características dependerán de

la dieta de cada especie, así como de sus necesidades de seguridad.

El zorro es un carnívoro generalista, ya que muestra una gran capacidad de

adaptación a diferentes medios, desde áreas periurbanas hasta picos de montaña de alrededor

de 3000 metros de altura (Palomo y Gisbert, 2002). Otros carnívoros que también pueden

vivir en una amplia variedad de hábitats son la gineta, la garduña y la comadreja, aunque

todos ellos seleccionan preferiblemente las áreas más cálidas o templadas. Todos estos

carnívoros son frecuentemente encontrados en los alrededores de zonas habitadas por el ser

humano.

El lobo también ha sido considerado tradicionalmente como carnívoro generalista

por su gran capacidad de adaptación, aunque la persecución por parte del ser humano ha

limitado su distribución a medios abruptos o arbolados de mayor protección (Blanco, 1998).

El armiño es el carnívoro que mejor se ha adaptado a las condiciones de frío de las

altas cotas montañosas, mientras que la marta se asocia a extensas masas forestales

eurosiberianas.

El tejón generalmente se ha asociado a masas forestales, aunque en ocasiones

también se ha incluido como especie generalista.

La nutria, el visón europeo y el visón americano son los tres únicos carnívoros

semiacuáticos que se encuentran en la Península Ibérica, ya que acostumbran a buscar

alimento tanto en el agua como en tierra firme. Además de estas tres especies, el turón vive

con frecuencia en las orillas de ríos y zonas húmedas, por lo que en ocasiones se ha

considerado como carnívoro semiacuático. No obstante, también se ha constatado su

presencia en lugares alejados del agua y en ocasiones en zonas próximas al ser humano

(Blanco, 1998).

Por lo tanto, suele ser frecuente la presencia de muchos de estos carnívoros en las

proximidades de áreas humanizadas, lo que constituye un factor a tener en cuenta en la

transmisión o diseminación de determinados agentes patógenos.

2.2.6.- Alimentación:

Tal y como hemos mencionado anteriormente, no todos los carnívoros se alimentan

exclusivamente de carne, ya que muchos de ellos incluyen en su dieta una gran variedad de

frutos y vegetales.

De esta forma, el gato montés y el lobo son los más carnívoros del grupo. Así, el gato

montés se alimenta sobre todo de micromamíferos y aves, mientras que el lobo come

básicamente ungulados domésticos y silvestres. Por otra parte, el armiño, la comadreja y el

turón apenas consumen alimentos de origen vegetal. En cambio, el zorro, la marta, la

garduña, el tejón y la gineta se consideran carnívoros generalistas u oportunistas, adaptados

a consumir los alimentos más abundantes en un lugar y época determinados (Blanco, 1998).

Los micromamíferos forman parte de la dieta de la mayoría de los carnívoros de

mediano y pequeño tamaño, considerándose al armiño y a la comadreja como los más

especializados para su caza. Los lagomorfos, principalmente conejos, y las aves también se

incluyen en la alimentación de los carnívoros. La nutria está especializada en la captura de

peces y cangrejos, y los consumen en mayor proporción que los visones. La dieta del turón

está compuesta por anfibios principalmente, mientras que los tejones muestran una clara

predilección por el consumo de lombrices de tierra en las regiones lluviosas. En ambientes

humanizados, más de la mitad de la dieta del zorro la conforman las basuras y las carroñas

de animales domésticos (Palomo y Gisbert, 2002).

2.3.- LA IMPORTANCIA DE ALGUNOS AGENTES PATÓGENOS:

En los últimos años, las enfermedades transmisibles de la fauna silvestre están

acaparando gran parte de la atención de los profesionales de la sanidad, así como del público

en general. Esto se debe principalmente a la posible transmisión desde o hacia los animales

domésticos, el carácter zoonótico de algunas de ellas, las repercusiones que pudieran tener

en materia de conservación de especies protegidas y en su relación con la calidad

medioambiental (Briones y cols., 2000b).

Este estudio se centra básicamente en aquellas enfermedades de interés por ser

zoonosis, que según la Organización Mundial de la Salud (OMS) se definen como

“aquellas enfermedades o infecciones que se transmiten de forma natural entre los

animales vertebrados y el hombre o viceversa”.

A continuación se detallan las características más relevantes de las enfermedades

objeto de análisis en el presente trabajo:

2.3.1.- Salmonelosis:

2.3.1.1.- Etiología y Taxonomía:

La salmonelosis es un proceso patológico importante para el ser humano y los

animales de todo el mundo (Lax y cols., 1995). Las bacterias causantes fueron aisladas

por primera vez a partir del intestino de cerdos en 1884 (Smith, 1894) y hoy en día se

conoce como un bacilo Gram-negativo perteneciente a la familia Enterobacteriaceae.

Hasta hace poco se consideraba que el género Salmonella contenía dos especies,

S. enterica y S. bongori, pero actualmente se ha descrito una tercera especie

denominada S. subterranea (Su y Chiu, 2007) (Tabla 2).

Tabla 2. Nomenclatura actual del género Salmonella (Su y Chiu, 2007).

Género Especies Subespecies Nº de serotipos en cada

especie o subespecie

enterica (o subespecie I) 1504

salamae (o subespecie II) 502

arizonae (o subespecie IIIa) 95

diarizonae ( o subespecie IIIb) 333

houtenae (o subespecie IV) 72

enterica

indica (o subespecie VI) 13

bongori subespecie V 22

Salmonella

subterranea

La especie S. enterica consta de seis subespecies, siendo la subespecie I la que

se aísla con mayor frecuencia en el ser humano y los animales de sangre caliente.

Dentro de ésta se incluyen dos de los serotipos más importantes por ser patógenas para

el ser humano, S. enterica serotipo Enteritidis y S. enterica ser. Typhimurium (Echeita y

cols., 2005a).

2.3.1.2.- Epidemiología y Transmisión:

Los microorganismos del género Salmonella habitan en el tracto intestinal de los

animales vertebrados e invertebrados de todo el mundo, los cuales excretan la bacteria

mediante las heces, contaminando de esta manera el agua, los alimentos y el entorno

que les rodea (Morner, 2001).

Se trata de una bacteria ubicua, que tolera un amplio rango de temperaturas, por

lo que es capaz de sobrevivir en el suelo durante un periodo largo de tiempo y además,

presenta la capacidad de multiplicarse en el agua (Murray, 1991; Polo y cols., 1999). No

obstante, el estado de portador de algunos hospedadores es lo que proporciona una

importante fuente de infección para los animales y el ser humano (Wray y Sojka, 1977).

Los animales domésticos son la principal fuente de infección para el ser humano

y esta bacteria es más frecuente en las aves de corral y en el cerdo que en el ganado

vacuno (Murray, 1991; Refsum y cols., 2002). Por otra parte, los animales de vida libre

actúan como importantes fuentes de infección para los animales domésticos (Humphrey

y Bygrave, 1988). Así, se ha documentado el aislamiento de Salmonella spp. en varias

especies de vida libre, tanto en aves como en mamíferos y reptiles (Wilson y

MacDonald, 1967; Morner, 2001; Briones y cols., 2004), sugiriendo en muchos casos su

importancia como reservorios de la bacteria.

En el caso de las aves, Refsum y cols. (2002) aislaron el serotipo Typhimurium

afectando a pequeñas aves paseriformes en un estudio llevado a cabo durante más de 30

años en Noruega, lo que sugiere la presencia endémica de este serotipo en la avifauna en

esa zona. Otros autores comprobaron que las gaviotas jugaban un papel importante en la

diseminación de este microorganismo, ya que consiguieron aislar idénticos serotipos en

aguas residuales y en las heces de estas aves (Fenlon, 1983; Wahlstrom y cols., 2003).

Al mismo tiempo, se observó que la contaminación de los pastos con heces de gaviotas

implicaba la transmisión de la infección al ganado doméstico (Murray, 1991).

Por otra parte, tanto los reptiles en cautividad como los silvestres, están

considerados como importantes reservorios de Salmonella spp. en diferentes lugares del

mundo (Geue y Loschner, 2002; Corrente y cols., 2004). En algunos estudios llevados a

cabo en la Península Ibérica, varios autores aislaron la bacteria de diferentes especies

presentes en el centro y suroeste peninsular (Briones y cols., 2004), con una menor

persistencia de la bacteria en ejemplares de tortuga acuáticos comparados con los

terrestres (Hidalgo-Vila y cols., 2007).

En lo que concierne a otras especies animales, Jones y Twigg (1976) aislaron S.

enterica ser. Dublin y S. Typhimurium en el ratón común (Mus musculus), mientras que

Handeland y cols. (2002) constataron que el erizo (Erinaceus europaeus) actuaba como

reservorio de S. Typhimurium en Noruega. Además, la liebre (Lepus europaeus) y

algunos ungulados silvestres como el jabalí (Sus scrofa), el corzo (Capreolus capreolus)

y el ciervo (Cervus elaphus) también se han visto afectados por diferentes serotipos de

Salmonella en Europa (Morner, 2001).

En cuanto a los carnívoros silvestres, se ha aislado Salmonella sp. en el tejón y el

zorro en el Reino Unido (Wray y cols., 1977; Euden, 1990) y en el zorro ártico (Alopex

lagopus) en Noruega (Sorensen y cols., 2005). Por lo que respecta a otras especies de

carnívoros, Jones y Twigg (1976) no consiguieron aislar la bacteria en ninguno de los

ejemplares de armiño y comadreja analizados en el Reino Unido.

2.3.1.3.- Patogenia y Cuadro clínico:

Tras la ingestión del material contaminado, la bacteria invade los enterocitos de

la superficie del intestino y dependiendo del daño producido causa una enteritis en el

hospedador. En algunos casos el microorganismo persiste e invade los macrófagos, con

los cuales alcanza los nódulos linfáticos regionales y finalmente la circulación

sanguínea. Es decir, se produce una bacteriemia que alcanza el hígado y el bazo, así

como los pulmones, las articulaciones, las meninges, la placenta o el feto (Morner,

2001).

La enfermedad puede afectar a todas las especies animales, aunque los

individuos jóvenes y las hembras gestantes suelen ser los más susceptibles. De forma

general, la enfermedad se manifiesta a modo de enteritis, diarrea, septicemia, abortos,

artritis y enfermedades respiratorias, aunque puede variar en función del serotipo y

especie animal implicados (Jones y cols., 1997). No obstante, suele ser común la

aparición de hospedadores portadores asintomáticos, los cuales no presentan lesiones ni

signos clínicos de ningún tipo (Murray, 1991).

La salmonelosis en el ser humano es una afección bastante extendida que se

manifiesta con signos gastroentéricos y que se produce fundamentalmente por la

ingestión de alimentos contaminados. Generalmente, el individuo presenta dolor de

cabeza, fiebre, dolor abdominal, diarrea y erupciones máculo-papulosas en el pecho y

en la espalda, siendo las manifestaciones gastroentéricas los signos dominantes (OIE,

2005c).

2.3.1.4.- Diagnóstico:

El diagnóstico de la salmonelosis se basa fundamentalmente en el aislamiento

del agente mediante cultivo microbiológico a partir de muestras de tejido o de heces de

los individuos investigados, así como a partir de muestras ambientales (OIE, 2008c).

Actualmente existen numerosas alternativas de diagnóstico rápido, entre las

cuales se incluyen algunas técnicas serológicas, como por ejemplo la técnica de la

aglutinación en suero (SAT) y el ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), así

como diversos métodos de biología molecular (Blackburn, 1993; Swaminathan y Feng,

1994; Rijpens y Herman, 2002; Cook, 2003).

No obstante, si bien estas técnicas son capaces de ofrecer un diagnóstico más

rápido que los métodos de cultivo convencional, la mayoría de ellas no han sido

validadas para muestras fecales y ambientales y están recomendadas sólo para el

análisis de alimentos destinados para consumo humano (Peplow y cols., 1999).

2.3.1.5.- Salmonelosis en nuestro entorno:

Según los datos publicados por el Centro Nacional de Epidemiología, entre los

años 2002 y 2005 se estudiaron en España alrededor de 26.000 cepas de Salmonella

obtenidas de muestras clínicas de origen humano, el 6,9% de las cuales procedían de la

CAPV, tanto de casos esporádicos como de brotes de origen alimentario y el serotipo

más frecuentemente aislado fue Enteritidis (Echeita y cols., 2005a; 2005b; 2007).

Asimismo, durante el periodo comprendido entre los años 2002-2004, de entre los

análisis de serotipos de Salmonella aislados por los laboratorios de Sanidad Animal en

España, el mayor número de cepas serotipadas fueron de aves, seguidas del porcino y

con menor número de aislados de ovino, caprino y bovino (de Frutos y cols., 2005).

Durante estos años el serotipo predominante también fue Enteritidis, obtenido

básicamente de las aves y el serotipo Typhimurium ocupaba el segundo lugar,

relacionándose fundamentalmente con el porcino.

En la CAPV, Salmonella spp. es considerado uno de los agentes bacterianos

habituales en los casos de abortos en el ganado ovino (Barandika y cols., 2002). Por otra

parte, Esteban y cols. (2008) han publicado un estudio acerca de la prevalencia de

Salmonella sp. en gallinas camperas, sugiriendo que la baja prevalencia detectada puede

estar asociada al sistema de producción extensivo.

En lo que concierne a las especies silvestres, Millán y cols. (2004a) identificaron

nueve serotipos distintos entre la fauna silvestre del País Vasco, detectando una

prevalencia global del 7,8%, siendo ligeramente superior en aves (8,5%) que en

mamíferos (7,2%). En un estudio llevado a cabo en jabalíes en el centro-sur peninsular

se constató una baja seroprevalencia de anticuerpos de Salmonella spp. (Vicente y cols.,

2002), mientras que en otro estudio llevado a cabo en el sur de España aislaron S.

enterica a partir de muestras tisulares de zorro, gineta y meloncillo (Millán y cols.,

2008b).

2.3.2.- Yersiniosis:


El género Yersinia incluye 11 especies diferentes pertenecientes a la familia

Enterobacteriaceae, de las cuales destacan tres por su carácter zoonótico: Y. pestis, Y.

pseudotuberculosis y Y. enterocolitica. La primera es el agente de la “peste bubónica” y

las otras dos son las causantes de una enfermedad que se conoce comúnmente como

yersiniosis (Jones y cols., 1997).

El bacilo Y. pestis fue aislado por primera vez por el bacteriólogo Alexander

Yersin en 1894 y durante décadas ha tenido una gran repercusión por los brotes

humanos producidos en África, Asia y América, así como por los casos esporádicos que

han tenido lugar en muchos países. Causa una enfermedad conocida como “peste

bubónica”, “peste negra” o “plaga”, cuyos principales reservorios son los roedores y que

es transmitida a través de la picadura de pulgas (Gasper y Watson, 2001). En el siglo

XIV la plaga sacudió Europa y la Península Ibérica también se vio afectada, aunque

desde entonces no se conocen brotes causados por Y. pestis en el territorio español

(Sabbatani, 2003).

Y. pseudotuberculosis se aisló por primera vez en un cobayo (Cavia porcellus)

inoculado con muestras infectadas de origen humano (Malassez y Vignal, 1883),

mientras que la primera referencia de Y. enterocolitica procede del aislamiento de la

bacteria a partir de un absceso facial de un granjero que padecía linfadenitis cervical

(McIver y Pike, 1934). Ambos patógenos afectan a diferentes especies de mamíferos,

incluido el ser humano y también a aves, tratándose de una infección que se encuentra

presente en nuestra geografía, por lo que de aquí en adelante nos referiremos

únicamente a las características concernientes a estas dos especies.


La transmisión de Y. pseudotuberculosis y Y. enterocolitica es la digestiva y el

contagio se produce tras la ingestión de agua o alimentos contaminados con heces

infectadas, o en el caso de las especies carnívoras, también con la ingestión de presas

infectadas (Mair y cols., 1967).

Ambas especies son capaces de sobrevivir y multiplicarse en medio terrestre y

acuático por un largo periodo de tiempo, dado que requieren un bajo aporte nutricional

y además, son tolerantes a temperaturas extremas (Gasper y Watson, 2001). Por ello, en

ocasiones, se ha relacionado una mayor incidencia de la yersiniosis con el periodo

invernal (Mair, 1973).

Los principales reservorios de Y. pseudotuberculosis son los roedores y las aves,

pero también se ha aislado con relativa frecuencia en los lagomorfos. Así, la liebre

(Lepus sp.) parece ser una especie propensa a padecer la infección y en Europa se han

descrito devastadoras epizootias afectando a este lepórido (Mair, 1973; Frolich y cols.,

2003). Además, también se ha descrito la presencia de Y. pseudotuberculosis en el gato,

el cerdo, el caballo, el ovino, el vacuno y el caprino, así como en el ser humano (Slee y

Button, 1990; Jones y cols., 1997; Lanada y cols., 2005; Foster y cols., 2008) y se

considera uno de los agentes infecciosos más significativos en cérvidos en cautividad en

Nueva Zelanda (Henderson, 1983).

Y. enterocolitica, si bien parece tener un menor rango de hospedadores, se ha

descrito afectando al perro, al caballo y al ganado vacuno, aunque el cerdo se considera

el reservorio más importante de las cepas patógenas para el ser humano (Jones y cols.,

1997).

En un estudio llevado a cabo en Bulgaria, Nikolova y cols. (2001) aislaron Y.

pseudotuberculosis y Y. enterocolitica en la liebre (Lepus europaeus), el jabalí, el

muflón (Ovis musimon), el chacal (Canis aureus), el zorro, la nutria, la garduña, el turón

y el gato montés. Los autores concluyeron que, posiblemente, la fauna silvestre es un

reservorio natural de Y. pseudotuberculosis y Y. enterocolitica, y que estas especies han

de ser tenidas en cuenta en los estudios epidemiológicos de esta bacteria.


La bacteria, tras ser ingerida por el hospedador, invade el epitelio intestinal,

generalmente a la altura del yeyuno o el íleon, y penetra a través de las células M de las

placas de Peyer hasta llegar a la lámina propia, donde se multiplica y origina una

reacción inflamatoria local y la formación de microabscesos (Hanski y cols., 1989).

Posteriormente, puede diseminarse por todo el organismo, generalmente hacia el hígado

y el bazo, aunque los pulmones, los riñones y la médula ósea también pueden verse

afectados (Jones y cols., 1997).

Las infecciones producidas por ambas especies de Yersinia presentan un cuadro

similar, que generalmente se caracterizan por una gastroenteritis acompañada de

linfadenitis mesentérica, tumefacción del bazo y presencia de nódulos granulomatosos

en varios órganos. Clínicamente, los animales manifiestan letargia, anorexia, diarrea,

dificultad respiratoria e incoordinación de movimientos (Gasper y Watson, 2001).

En el ser humano, Y. enterocolitica es la especie que más frecuentemente se

aísla y suele cursar con síntomas abdominales, similares a las de una apendicitis aguda,

acompañados de episodios de diarrea y de fiebre (Bissett y cols., 1990).


El diagnóstico de la yersiniosis se realiza principalmente mediante cultivo

microbiológico a partir de heces o de tejidos (Bottone, 1997). El diagnóstico serológico

de las infecciones causadas por Yersinia spp. está condicionado por las reacciones

cruzadas que se producen frecuentemente con otras especies de la familia

Enterobacteriaceae, con Brucella y también con Rickettsia (Bercovier, 1984).

Asimismo, también se han desarrollado técnicas de PCR (Polymerase Chain

Reaction), tanto convencional como a tiempo real, para la detección e identificación de

las especies Y. enterocolitica y Y. pseudotuberculosis a partir de muestras de cultivos de

tejidos, muestras ambientales y alimentarias (Wren y Tabaqchali, 1990; Fenwick y

Murray, 1991; Nakajima y cols., 1992; Hrusková y Kaclíková, 2009).

2.3.2.5.- Yersiniosis en nuestro entorno:

Aunque el número de casos humanos de infección por Yersinia spp. notificados

al Sistema de Información Microbiológica está muy por debajo de lo notificado para

otras bacterias causantes de gastroenteritis, como es el caso de la Salmonella spp. y

Campylobacter spp., las notificaciones de este microorganismo han ido aumentando de

forma continuada a lo largo de los años (Instituto de Salud Carlos III, 2001). Así, Serra

y cols. (2005) describieron tres casos de infección gastrointestinal, sin aparente relación

epidemiológica producida por la misma cepa de Y. pseudotuberculosis en pacientes

registrados en un hospital de Palma de Mallorca.

Y. pseudotuberculosis se ha documentado como causante esporádico de abortos

en el ganado ovino en la CAPV (Barandika y cols., 2002; Oporto y cols., 2006).

Más recientemente se ha producido un brote por esta bacteria en un rebaño ovino en

Álava, asociado a mastitis y mortalidad en corderos (Juste y cols., 2009).

Entre la fauna silvestre, se ha descrito la presencia de Y. pseudotuberculosis en

el ciervo (Vicente y Gortázar, 2003). Además, también se ha aislado Y.

pseudotuberculosis en el 23% de los lagomorfos y Y. enterocolitica en el 0,6% de los

ungulados en la CAPV (Barral y cols., 2005).

2.3.3- Tuberculosis:


La tuberculosis es una enfermedad crónica que afecta a la mayoría de los

vertebrados terrestres, incluido al ser humano y cuyo agente causal es capaz de persistir

en el individuo infectado durante toda su vida. Está causada por bacterias del género

Mycobacterium, único dentro de la familia Mycobacteriaceae. El bacilo de la

tuberculosis fue descubierto por Robert Koch en 1882 (Koch, 1882).

Actualmente, se conocen alrededor de 100 especies de micobacterias (Tortoli,

2003) y han sido descritos dos grandes grupos: micobacterias de crecimiento rápido y

de crecimiento lento. En este último grupo se incluyen las micobacterias patógenas más

importantes, tanto para el ser humano como para los animales (Shinnick y Good, 1994).

Más específicamente, se definen grupos de especies entre las micobacterias de

crecimiento lento, como son el complejo M. tuberculosis (CMT), dentro del cual se

incluyen las especies M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis, M. microti y M. caprae,

así como el complejo M. avium (CMA). Este último se incluye dentro del grupo de las

micobacterias no tuberculosas o distintas de la tuberculosis (Falkinham, 1996; Rastogi y

cols., 2001), que está compuesto de las especies M. avium (M. avium subespecie avium,

M. avium subsp. silvaticum, M. avium subsp. paratuberculosis y M. avium subsp.

hominissuis) y M. intracellulare (Wayne y cols., 1993; Frothingham y Wilson, 1994;

Mijs y cols., 2002).

Entre las micobacterias del CMT, M. tuberculosis es el agente etiológico de la

mayoría de los casos de tuberculosis en el ser humano, mientras que la infección por M.

bovis se ha identificado como una enfermedad zoonótica, que afecta mayoritariamente

al ganado vacuno. Las micobacterias del CMA en cambio, se aíslan a partir de animales

y de pacientes inmunodeprimidos, pero rara vez a partir de individuos

inmunocompetentes (Kaneene y Thoen, 2004).


La transmisión de la enfermedad se produce fundamentalmente por vía

aerógena, aunque también puede producirse por vía digestiva, tras la ingestión de

alimento o agua contaminados con secreciones nasales o mucosas, orina o leche que

contienen organismos infectantes (Kaneene y Thoen, 2004).

Las micobacterias son muy resistentes en el medio natural, donde conservan su

capacidad infectante durante dos semanas en heces y hasta varios meses en esputos

secos protegidos de la luz solar. Resisten la desecación, el frío y la putrefacción, tanto

en el suelo como en el agua (Clifton-Hadley y cols., 2001).

El CMT afecta a una amplia variedad de animales de sangre caliente. Así, M.

tuberculosis se asocia principalmente con el ser humano, mientras que la mayoría de las

afecciones por micobacterias descritas en los animales son causadas por M. bovis. La

tuberculosis por M. bovis ha sido citada en diversas especies de animales domésticos:

ovejas, cabras, caballos, cerdos, perros y gatos, aunque se considera al ganado vacuno

como el principal reservorio de este patógeno (Kaneene y Thoen, 2004).

Numerosas especies de la fauna silvestre se ven implicadas en el mantenimiento

y transmisión de M. bovis en todo el mundo, destacando el tejón en las islas Británicas,

la zarigüella (Trichosurus vulpecula) en Nueva Zelanda, el búfalo africano (Syncerus

caffer) en Sudáfrica, el ciervo de cola blanca (Odocoileus virginianus) y el bisonte

(Bison bison) en Norteamérica y el jabalí en España (Schmitt y cols., 1997; Delahay y

cols., 2002; Gortázar y cols., 2003; Caley y Hone, 2004; Joly y Messier, 2004; Michel y

cols., 2007; Naranjo y cols., 2008).

El carácter reemergente de la enfermedad y los repetidos fallos en conseguir la

erradicación de la tuberculosis bovina en el ganado doméstico de muchos países se ha

asociado a su presencia en la fauna silvestre, que puede jugar un papel importante como

reservorio de la enfermedad (Morris y cols., 1994; Perumaalla y cols., 1999; Aranaz y

cols., 2004).

La mayoría de las micobacterias que comprenden el CMA son ubicuas en el

medio ambiente y se suelen encontrar frecuentemente en el agua, el suelo, los aerosoles,

en los alimentos y sus derivados, en las plantas, en el polvo, en el estiércol y en las

hortalizas (Dvorska y cols., 2002). Además, se han aislado a partir de aves silvestres,

pequeños vertebrados, invertebrados, poiquilotermos, gallinas, cerdos, humanos y otros

mamíferos (Mijs y cols., 2002; Dvorska y cols., 2002). M. avium subsp. avium y M.

avium subsp. hominissuis son dos patógenos oportunistas que pueden causar

enfermedad en individuos inmunodeprimidos (Komijn y cols., 1999; Mijs y cols.,

2002).


Los bacilos tuberculosos entran en el hospedador por vía respiratoria, digestiva o

percutánea. Tras la exposición, las micobacterias son fagocitadas en los bronquios

terminales o en la lámina propia de las mucosas respiratorias, digestivas y en las

tonsilas, así como en la dermis. Los fagocitos son llevados por la circulación linfática a

los linfonodos regionales, o por la circulación sanguínea general a otros sitios del

organismo. Algunas investigaciones revelan que la localización de las lesiones varía

según la ruta de exposición. De este modo, en el ganado vacuno y otras especies

animales la vía aerógena lleva a la afección de los pulmones y linfonodos torácicos,

mientras que la ingestión de alimento y agua contaminada generalmente conduce a que

los primeros focos se asocien al tracto intestinal (Kaneene y Thoen, 2004).

El cuadro clínico de la tuberculosis varía dependiendo de la extensión y

localización de las lesiones. El principal signo de esta enfermedad en los animales es la

emaciación a pesar de una adecuada alimentación, así como un debilitamiento general,

anorexia, disnea y fiebre. Cuando los pulmones se encuentran ampliamente afectados se

detecta una tos seca, sobre todo después del ejercicio.

La tuberculosis bovina se caracteriza por la formación de granulomas o

tubérculos que generalmente suelen ser encapsulados. Estos granulomas se localizan, en

la mayoría de los casos, en los linfonodos de la cabeza y del tórax, aunque también

pueden estar presentes en el pulmón, bazo e hígado (Clifton-Hadley y cols., 2001).

En el ser humano, la tuberculosis produce, en la mayor parte de los casos,

infecciones asintomáticas, aunque en aquellos casos que producen enfermedad se ve

afectado principalmente el sistema respiratorio y los nódulos linfáticos regionales. En

menor medida, también puede afectar la piel, los huesos, las articulaciones, el sistema

génitourinario, las meninges y/o el sistema respiratorio. Los síntomas que se suelen

observar incluyen fiebre, tos, dolor de la caja torácica, así como fallos renales (OIE,

2009a).


En el manual de la Oficina Internacional de Epizootias (OIE) están descritas las

diferentes técnicas que se pueden emplear para el diagnóstico de la tuberculosis (OIE,

2008e).

El método clásico es la prueba de la tuberculina, que consiste en medir la

reacción inmunitaria tras la inyección intradérmica de una pequeña cantidad de antígeno

en el animal vivo.

Se puede realizar un diagnóstico presuntivo mediante técnicas histopatológicas

y/o mediante observación al microscopio óptico de los bacilos ácido-alcohol resistentes

tras la realización de la tinción de Ziehl-Neelsen.

No obstante, el diagnóstico definitivo requiere el cultivo de las bacterias en el

laboratorio (de Lisle y cols., 2002).

Dado el tiempo requerido para el crecimiento de las micobacterias (entre 3 y 6

semanas), se han desarrollado métodos de biología molecular con una buena

sensibilidad y especificidad, que además ofrecen una mayor rapidez en la obtención de

resultados (Pinsky y Banaei, 2008).

Por otra parte, en algunos casos resultan útiles otros análisis como el ensayo de

proliferación de linfocitos, el test de gamma-interferón o el ELISA indirecto. En un

estudio llevado a cabo para el diagnóstico de M. bovis en el ciervo, se demostró que el

análisis combinado mediante proliferación de linfocitos y el ELISA indirecto mostraban

la mejor relación de sensibilidad y especificidad (Griffin y cols., 1994).

2.3.3.5.- Tuberculosis en nuestro entorno:

El número total de casos de tuberculosis respiratoria humana declarados en la

CAPV osciló entre 16,2 y 25 casos/100.000 habitantes durante el periodo comprendido

entre 2005 y 2006 (Rodríguez y cols., 2007).

Los programas de erradicación llevados a cabo, sobre todo desde la década de

los 90, han favorecido el descenso de la prevalencia de la tuberculosis bovina en el

ganado vacuno y desde hace unos años, en el País Vasco, la prevalencia de la

tuberculosis bovina en las explotaciones ganaderas se encuentra por debajo del 1%

(Ministerio de Medio Ambiente y Medio Rural Marino, 2006b, 2007).

En España, el jabalí y el ciervo están considerados como importantes reservorios

de la infección, sobre todo en la mitad sur peninsular (Gortázar y cols., 2005; Vicente y

cols., 2006; Naranjo y cols., 2008). Estas especies pueden estar infectadas con

micobacterias que presentan el mismo espoligotipo que especies domésticas de la

misma zona, lo que pone de manifiesto la existencia de contagios entre poblaciones de

animales domésticos y silvestres (Aranaz y cols., 2004).

Diversos estudios han constatado la presencia de M. bovis en los carnívoros

silvestres en el centro y sur peninsular, aislando o identificando mediante técnicas

moleculares en muestras de lince, zorro y tejón (Briones y cols., 2000a; Pérez y cols.,

2001; Martín-Atance y cols., 2005; Millán y cols., 2008b, c; Sobrino y cols., 2008b).

Además, la caracterización molecular realizada en algunos de estos animales permitió

correlacionar con otros aislamientos en ungulados silvestres y en el ganado doméstico

de la misma zona de estudio, sugiriendo una importante relación epidemiológica entre

ellos (Briones y cols., 2000a; Pérez y cols., 2001; Sobrino y cols., 2008b).

2.3.4.- Encefalopatías espongiformes transmisibles:


Las encefalopatías espongiformes transmisibles engloban a un grupo de

enfermedades degenerativas lentas del sistema nervioso central, caracterizadas por una

lesión histológica del tejido nervioso, consistente en la formación de vacuolas que

recuerdan la imagen de una esponja sin apenas componente inflamatorio (Prusiner,

1982).

La hipótesis más aceptada por la comunidad científica es que estas

enfermedades son causadas por una proteína anómala cuya forma normal (Prpc) es

codificada por un gen presente en el genoma de los mamíferos. Esta proteína anómala

parece tener la capacidad de “replicarse”, captando la forma normal (PrPc) y

convirtiéndola en más formas anómalas (PrPSc) (Prusiner, 1982).

Existen diferentes formas infecciosas de encefalopatías espongiformes

transmisibles que afectan tanto a animales como al ser humano. En los animales, las

formas más frecuentemente descritas son la tembladera o Scrapie en ovejas y cabras, así

como la encefalopatía espongiforme bovina (BSE-Bovine spongiform encephalopathy)

en el ganado vacuno (Dickinson, 1976; Denny y cols., 1992). Con una menor incidencia

se ha descrito la encefalopatía espongiforme felina (FSE-Feline spongiform

encephalopathy) en félidos, tanto domésticos como silvestres en cautividad, de

diferentes países europeos, la encefalopatía transmisible del visón (TME-Transmisible

mink encephalopathy) en el visón americano en cautividad y la enfermedad consuntiva

crónica (CWD-Chronic wasting disease) en cérvidos, tanto libres como cautivos en

Estados Unidos (Hartsough y Burger, 1965; Williams y Young, 1980, 1982; Wyatt y

cols., 1991; Spraker y cols., 1997; Lezmi y cols., 2003).

En el ser humano, la forma más común de este tipo de enfermedad es la llamada

enfermedad de Creutzfeldt-Jakob. En los últimos años ha aparecido una nueva variante

de esta enfermedad, asociada a la difusión de la BSE y ha adquirido una gran

importancia por su claro carácter zoonótico (Hill y cols., 1997).


Los priones son extremadamente resistentes en el medio natural y la vía de

transmisión más conocida de las encefalopatías espongiformes transmisibles, hasta la

fecha, es la de la ingestión de piensos contaminados con el prión (Wilesmith y cols.,

1988, 1991; Race y cols., 1998; Williams y cols., 2001). Además, en menor medida, se

ha documentado la transmisión vertical (Hoinville, 1996; Donnelly y cols., 1997;

Wilesmith y cols., 1997). A modo de excepción, la vía de transmisión de CWD

permanece aún desconocida, si bien no parece estar asociada a la vía alimentaria como

ocurre con las otras encefalopatías espongiformes transmisibles y se ha relacionado con

una posible transmisión horizontal entre animales (Miller y cols., 1998, 2000; Williams,

2005).

La nueva variante de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob se transmite por el

mismo agente infeccioso de la encefalopatía espongiforme bovina y, por lo tanto, la

transmisión se produce por ingestión de carne contaminada con BSE (Collinge y cols.,

1996; Hill y cols., 1997; Bruce y cols., 1997).

Los agentes de la BSE y FSE afectan a diferentes especies silvestres de las

familias Bovidae y Felidae respectivamente, aunque todos ellos han sido individuos

criados en cautividad, por lo que el origen de estas infecciones se ha asociado al

suministro de alimento contaminado (Kirkwood y Cunningham, 1994). Entre los

animales afectados de la familia Bovidae se encontrarían diversas especies de antílopes

(Tragelaphus sp.), el oryx (Oryx sp.), el alce (Taurotragus oryx) y el muflón del

continente africano (Jeffrey y Wells, 1988; Wood y cols., 1992; Kirkwood y

Cunningham, 1994). En cuanto a los félidos, se ha descrito la enfermedad en el puma

(Felis concolor), el ocelote (Felis pardalis), el guepardo (Acinonyx jubatus) y el tigre

(Panthera tigris) localizados en diferentes zoológicos africanos y europeos (Willoughby

y cols., 1992; Williams y cols., 2001; Lezmi y cols., 2003).

Se han descrito casos de Scrapie afectando al muflón en el Reino Unido (Wood

y cols., 1992).

Actualmente, se conocen tres especies de la familia Cervidae en las que se ha

diagnosticado la enfermedad de CWD, tanto en animales libres como cautivos, y se trata

del ciervo mulo (Odocoileus hemionus), el ciervo de cola blanca (Odocoileus

virginianus) y el uapití de América del norte (Cervus elaphus nelsoni) (Williams y cols.

1980, 1982; Spraker y cols., 1997).

Por otra parte, se ha documentado que la TME afecta a visones americanos en

cautividad, habiéndose asociado también al aporte de alimento contaminado (Hartsough

y Burger, 1965).


En general, las encefalopatías espongiformes transmisibles se caracterizan por

tener un periodo de incubación prolongado en torno a los 4 ó 5 años. Los priones

penetran inicialmente por las placas de Peyer y después alcanzan el sistema nervioso

central a través de los nervios periféricos. No obstante, la ruta de diseminación del

agente hacia otros tejidos no está del todo esclarecida aún (Williams y cols., 2001).

Se trata de una afección degenerativa e incurable del sistema nervioso central,

que se caracteriza por la aparición de síntomas nerviosos en los animales adultos y que

progresivamente conduce a la muerte del animal. Los síntomas clínicos son similares en

las distintas encefalopatías espongiformes transmisibles y los signos clínicos más

relevantes en los animales afectados consisten en un comportamiento nervioso o

agresivo, depresión, hipersensibilidad al sonido y al tacto, temblores, incoordinación y

dificultad para levantarse de la posición de reposo, pérdida de peso y disminución de la

producción de leche. Los síntomas en el ser humano se caracterizan fundamentalmente

por ansiedad, depresión, insomnio, así como por dificultades para caminar, ataxia,

pérdida de memoria y temblores (OIE, 2007).


El diagnóstico laboratorial de estas enfermedades, en los animales afectados, se

lleva a cabo a partir de muestras de tejido nervioso, preferentemente del tronco del

encéfalo. En la actualidad, se dispone de diversas técnicas de diagnóstico rápido,

aprobadas por la Unión Europea, basadas en la detección del prión patológico por

métodos inmunológicos o de afinidad conformacional en rumiantes, que permiten

disponer del resultado en un plazo inferior a las 24 horas (Ministerio de Medio

Ambiente y Medio Rural Marino, 2006a). La confirmación de todos los animales

positivos a las técnicas de diagnóstico rápido se suele llevar a cabo mediante otras

pruebas específicas, siendo las más habituales las técnicas histológicas e

inmunohistoquímicas (OIE, 2008a).

2.3.4.5.- Encefalopatías espongiformes transmisibles en nuestro entorno:

En el hombre, la forma de enfermedad más común es la de Creutzfeldt-Jakob

esporádica, con una incidencia de 1-2 casos por cada millón de habitantes al año en el

estado español. En la CAPV, durante el periodo comprendido entre 1998 y 2009, la

incidencia registrada fue de 2,25 casos por cada millón de habitantes. El sistema de

vigilancia identificó entre 2005 y 2009 cinco casos confirmados de la nueva variante de

la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (Instituto de Salud Carlos III, 2009).

En lo referente a los animales domésticos, desde el año 2000, en España se han

detectado un total de 763 animales afectados por encefalopatía espongiforme bovina y

durante el período 2001-2006 se han diagnosticado 527 animales afectados por Scrapie

(Ministerio de Medio Ambiente y Medio Rural y Marino, 2009, 2010).

Hasta donde conocemos, en España no existen casos descritos de encefalopatías

espongiformes transmisibles en carnívoros domésticos ni silvestres.

2.3.5.- Leptospirosis:


La leptospirosis es una enfermedad infecciosa de distribución mundial que

afecta tanto a animales domésticos como a silvestres, cuyo agente causal es transmisible

al ser humano.

El agente patógeno en cuestión es un microorganismo helicoidal denominado

espiroqueta, que pertenece al género Leptospira y que fue aislado e identificado por

primera vez en el año 1915 por médicos japoneses (Inada y cols., 1916). El género

Leptospira se incluye en la familia Leptospiraceae y se conocen dos especies: L.

interrogans, que comprende todas las cepas patógenas y L. biflexa, compuesta por cepas

saprófitas aisladas del medio ambiente. Actualmente, se han descrito más de 200

serovares de leptospiras patógenas, que a su vez se reagrupan en 23 serogrupos (Levett,

2001).


Las leptospiras se eliminan por vía urinaria, por lo que contaminan el suelo y el

agua de su entorno. De esta forma, la transmisión se produce fundamentalmente por el

contacto directo con la orina o el material infectado y también por los aerosoles

producidos. Asimismo, también puede producirse la transmisión venérea, la transmisión

por infección transplacentaria, así como por la ingesta de leche y tejidos contaminados

(Leighton y Kuiken, 2001). Reilly y cols. (1970) observaron que la transmisión por la

vía alimentaria entre predador-presa es un método natural de infección, tratándose de un

factor importante de diseminación de los serovares mantenidos por los roedores.

Las leptospiras no se multiplican fuera del hospedador y requieren de unas

condiciones de humedad apropiadas para garantizar su supervivencia, ya que no resisten

a la desecación y a las temperaturas por encima de los 50ºC (Leighton y Kuiken, 2001).

Entre los animales domésticos que actúan como reservorios se incluyen el

ganado vacuno, el ovino, el porcino y el perro (Alonso y Ortega, 2002).

Por otra parte, la infección por leptospiras es común en una gran variedad de

animales silvestres, aunque los roedores en general, y los miembros de la familia

Microtidae en particular, son los principales portadores de leptospiras a nivel mundial

(Mesina y Campbell, 1975). Numerosos estudios llevados a cabo, tanto en Europa como

en Estados Unidos, han constatado la importancia de diversas especies de roedores,

como la rata común (Rattus norvegicus), diferentes especies de topillo (Microtus sp. y

Clethrionomys sp.) y la ardilla (Sciurus sp.), así como de algunas especies de

insectívoros, como el erizo (Erinaceus sp.), considerándolos como importantes

reservorios de leptospiras (Twigg y cols., 1969; Fennestad y Borg-Petersen, 1972;

Hartskeerl y Terpstra, 1996).

Además, también se han llevado a cabo numerosos estudios serológicos y

microbiológicos en carnívoros silvestres de todo el mundo. Así, se puede decir que los

cánidos han sido de los más estudiados, habiéndose detectado la presencia de esta

espiroqueta en el zorro, el lobo y el coyote (Canis latrans) (Kingscote, 1986; Khan y

cols., 1991; Holzman y cols., 1992; Gese y cols., 1997; Riley y cols., 2004; Slavica y

cols., 2008). En un estudio llevado a cabo en Estados Unidos, el lince rojo (Lynx rufus)

y el puma presentaron anticuerpos frente a leptospiras (Cirone y cols., 1978), mientras

que entre los mustélidos, se han llegado a identificar diferentes serovares afectando al

tejón, al armiño, a la comadreja, a la garduña, al visón europeo y al visón americano, en

diferentes lugares del mundo (Twigg y cols., 1969; Salt y Little, 1977; Hathaway y

cols., 1983; Slavica y cols., 2008).

Por otra parte, aunque se hayan realizado menos estudios, también se han

detectado anticuerpos frente a diferentes serovares de leptospiras en algunos lagomorfos

como el conejo (Oryctolagus cuniculus) y la liebre (Lepus europaeus y L. californicus),

así como en artiodáctilos: el ciervo rojo, el ciervo mulo (Odocoileus hemionus

columbianus), el corzo y el jabalí (Twigg y cols., 1969; Fennestad y Borg-Petersen,

1972; Cirone y cols., 1978; Slavica y cols., 2008).


En condiciones naturales, la vía de infección es la cutáneo-mucosa,

especialmente la de los genitales y de la conjuntiva, o bien a través de la piel lesionada o

macerada. Posteriormente, las leptospiras se propagan por vía linfática hasta la

circulación sanguínea, alcanzando los tejidos y los órganos diana. Las leptospiras

muestran tropismo por las células de los endotelios vasculares, especialmente por los

epitelios de los túbulos renales y de ciertos tramos del tracto genital, donde se

multiplican y se eliminan con la orina o con las descargas vaginales, tras el parto o el

aborto. En aquellos casos en los cuales progresa la infección, las consecuencias

patológicas dependen del tipo de serovar implicado, de su virulencia y de factores

inherentes al propio hospedador (Levett, 2001; Leighton y Kuiken, 2001).

De esta manera, la leptospirosis puede cursar de forma inaparente o ser de

intensidad severa e incluso fatal. En las distintas especies animales, los síntomas suelen

ser similares e incluyen fiebre, anorexia, hemoglobinuria, anemia, abortos y el cese de

la producción de leche. En el ser humano, suele cursar de forma subclínica, no obstante

los síntomas más aparentes consisten en escalofríos, dolor de cabeza, mialgia y dolor

adominal. La muerte puede producirse por fallo renal y afectación cardiaca (OIE,

2005a).


Para el diagnóstico de la leptospirosis se pueden emplear los métodos directos,

como el examen microscópico directo en campo oscuro de diferentes muestras

biológicas, especialmente de la orina, así como la inmunofluorescencia directa, la

inmunohistoquímica y las tinciones histológicas especiales (Atxaerandio y cols., 2002).

El aislamiento de las leptospiras mediante cultivo de distintas muestras

biológicas, y su caracterización serológica y genética, constituyen el diagnóstico

definitivo de la infección. Sin embargo, se trata de un proceso laborioso y lento, por lo

que no puede ser aplicado de forma rutinaria (Thiermann, 1984).

Entre las técnicas de diagnóstico de tipo indirecto están la Microaglutinación-

lisis (MAT) y el ELISA, siendo MAT la técnica de referencia considerada por la OIE

(2008b).

2.3.5.5.- Leptospirosis en nuestro entorno:

Los serovares icterohaemorrhagiae y copenhageni, cuyos hospedadores

principales son las ratas, son los que más frecuentemente se identifican en los casos de

leptospirosis humana, aunque depende de la localización geográfica y de los

hospedadores de mantenimiento presentes en esa zona (Levett, 2001).

En España, se han descrito varios casos de abortos afectando a diversas especies

domésticas, como al ganado vacuno en el norte y al porcino, al ovino y al caprino en el

sur peninsular, siendo los serovares más prevalentes bratislava, hardjo y pomona en

estos animales (León-Vizcaíno, 1975, 1987; Atxaerandio y cols., 2005). Asimismo,

también se han identificado diferentes serovares afectando al perro (canicola) y al gato

(icterohaemorrhagiae) (León-Vizcaíno, 1975; Benito y cols., 2005; Millán y cols.,

2008a).

En lo concerniente a la fauna silvestre, Vicente y cols. (2002) detectaron la

presencia de anticuerpos frente al serovar pomona en jabalíes en el centro-sur español.

Más recientemente, otros autores han demostrado la presencia de anticuerpos frente a

distintos serovares de L. interrogans en el lince, el zorro, el meloncillo, la gineta y el

tejón en Andalucía. En el caso del lince y del meloncillo, además, consiguieron aislar el

patógeno mediante cultivo (Millán y cols., 2008a, 2008b).

2.3.6.- Toxoplasmosis:


La toxoplasmosis es una enfermedad zoonótica de distribución mundial causada

por el parásito Toxoplasma gondii que afecta a animales de sangre caliente, incluido el

ser humano (Dubey y Beattie, 1988). T. gondii es un protozoo intracelular obligado,

perteneciente a la familia Sarcocystidae y al género Toxoplasma, que fue descubierta

por primera vez por Nicolle y Manceaux (1908) en un pequeño roedor (Ctenodactylus

gundi) del norte de África que se utilizaba como animal de experimentación.


Los félidos, tanto domésticos como salvajes, son los únicos hospedadores

definitivos (HD) y, por lo tanto, los únicos capaces de eliminar las formas infectantes

del parásito, conocidas como ooquistes (Dubey, 1994). La mayoría de los mamíferos,

así como algunas aves, actúan como hospedadores intermediarios (HI), infectándose por

la ingestión de quistes tisulares o por la ingestión de alimentos o bebidas contaminadas

con ooquistes (Frenkel y cols., 1970).

Los ooquistes esporulados son muy resistentes frente a condiciones ambientales,

pudiendo persistir en el medio ambiente durante años (Dubey, 1998b).

T. gondii está biológicamente adaptado para ser transmitido al HD vía

depredación y al HI vía oral-fecal, ya que la transmisión de T. gondii parece ser más

eficiente cuando los gatos consumen quistes tisulares y los HI ingieren ooquistes

(Dubey, 2006).

Entre los animales domésticos, la infección suele ser más frecuente en gatos,

ovejas, cabras y cerdos, mientras que la prevalencia de infección suele ser más baja en

perros y caballos. El ganado vacuno, en cambio, parece ser resistente a la infección por

T. gondii (Dubey y cols., 1992).

La mayoría de los estudios de toxoplasmosis en la fauna silvestre se han llevado

a cabo mediante análisis serológico. Así, se han detectado anticuerpos frente a T. gondii

en diversas especies de félidos silvestres, tanto en Europa como en Estados Unidos

(Riemann y cols., 1975; Marchiondo y cols., 1976; McOrist y cols., 1991; Roelke y

cols., 1993; Paul-Murphy y cols., 1994; Zarnke y cols., 2001; Ryser-Degiorgis y cols.,

2006).

Además, también se han detectado anticuerpos en el coyote y el lobo, aunque el

zorro ha sido una de las especies más estudiadas y las prevalencias observadas han sido

generalmente elevadas (Smith y Frenkel, 1995; Lindsay y cols., 1996; Buxton y cols.,

1997; Dubey y cols., 1999; Zarnke y cols., 2000; Jakubek y cols., 2007).

En los mustélidos, si bien se han estudiado en menor número, los análisis

serológicos han permitido poner en evidencia la presencia de anticuerpos en algunas

especies como el tejón (Taxidea taxus y M. meles), la marta, el visón americano y la

nutria (Lutra canadensis y Enhydra lutris nereis) (Riemann y cols., 1975; Marchiondo y

cols., 1976; Tizard y cols., 1976; Smith y Frenkel, 1995; Tocidlowski y cols., 1997;

Miller y cols., 2002; Philippa y cols., 2004; Anwar y cols., 2006). Por otra parte,

Hurkova y Modry (2006) encontraron ADN de T. gondii en zorros y garduñas de la

República Checa.

Otras especies animales, como los roedores, y en concreto la rata común, pueden

actuar como importantes transmisores de la toxoplasmosis (Dubey y Frenkel, 1998).

Numerosas especies cinegéticas presentan infección por T. gondii. La importancia de

estos animales, además de actuar como reservorios, radica en el riesgo de infectar al ser

humano, tanto por la manipulación de los animales abatidos como por el posterior

consumo de éstos. Entre los artiodáctilos, el jabalí ha sido uno de los más estudiados,

aunque también se ha detectado la presencia del parásito en el corzo y en diferentes

especies de cérvidos, así como en los lagomorfos (Marchiondo y cols., 1976; Dubey,

1982; Hejlicek y cols., 1997; Frolich y cols., 2003; Shiibashi y cols., 2004; Bartova y

cols., 2006; Gamarra y cols., 2008). Algunos autores han aportado valiosa información

acerca de la seroprevalencia y aislamiento de este protozoo en aves silvestres, tanto en

Europa como en América (Kirkpatrick y cols., 1990; Literak y cols., 1992; Dubey,

2002; Aubert y cols., 2008).


La patogenicidad de T. gondii está determinada por varios factores, como la

susceptibilidad del hospedador frente al parásito y la virulencia de la cepa y del estadío

del parásito (Dubey, 1996).

Asimismo, la localización y la cantidad de quistes tisulares en tejidos de

hospedadores susceptibles difieren de acuerdo con la cepa de T. gondii y de la especie

hospedadora infectada. En ratas y ratones, los quistes tisulares se distribuyen

principalmente en el cerebro, independientemente de la cepa ingerida, mientras que en

el ganado vacuno, el gato, la oveja, la cabra, el ciervo de cola blanca y en algunas

especies de carnívoros silvestres, los quistes se localizan preferentemente en tejido

muscular (Dubey, 1998a).

Generalmente, la infección cursa de forma subclínica. En casos de estrés o de

inmunosupresión del hospedador pueden reactivarse los quistes tisulares latentes en el

individuo, produciendo la enfermedad (Dreesen, 1990).

En los animales, la enfermedad se caracteriza fundamentalmente por causar

abortos y/o malformaciones en el feto, aunque éstos pueden presentar también fiebre,

disnea, encefalitis e infecciones generalizadas. En el ser humano, en aquellos individuos

inmunocompetentes, la infección suele cursar de forma asintomática, aunque en algunos

casos los pacientes pueden desarrollar linfadenitis, con fiebre y dolor de cabeza. No

obstante, las infecciones adquiridas durante el embarazo suelen transmitirse al feto por

vía congénita. En este caso, los síntomas suelen estar relacionados con afecciones del

cerebro y de la retina. En pacientes inmunodeprimidos, en cambio, la enfermedad suele

cursar generalmente con encefalitis, aunque también puede verse afectado cualquier

otro órgano (OIE, 2005d).


La toxoplasmosis se diagnostica frecuentemente mediante el análisis serológico.

Entre las diversas técnicas serológicas utilizadas para la detección de anticuerpos frente

a T. gondii se encuentran la prueba de Sabin-Feldman o Dye Test (DT), la aglutinación

al látex (LAT), la inmunofluorescencia indirecta (IFI), pruebas inmunoenzimáticas de

ELISA, la hemaglutinación indirecta (IHAT) y la técnica de aglutinación modificada

(MAT) (Hill y Dubey, 2002). La MAT es una de las técnicas serológicas más utilizadas

por su elevada sensibilidad y especificidad (Dubey y cols., 1997, 2002).

Por otra parte, dada la gran similitud entre las formas tisulares de la

toxoplasmosis con otros parásitos como Neospora caninum y Sarcocystis sp., estos

organismos se pueden distinguir mediante inmunohistoquímica o mediante técnicas

moleculares. La PCR se puede puede llevar a cabo mediante la detección directa del

ADN del parásito a partir de la sangre y tejidos del animal, siendo además, una técnica

de gran utilidad en el diagnóstico de abortos en ovino (Buxton y Losson, 2007; Hurtado

y cols., 2001).

2.3.6.5.- Toxoplasmosis en nuestro entorno:

En España, se han llevado a cabo diversos estudios serológicos en mujeres

embarazadas, obteniendo unos resultados de seroprevalencia de entre el 18,8-49,6%

(Gutiérrez y cols., 1996a; Gutiérrez-Zufiaurre y cols., 2004).

Algunos estudios de seroprevalencia realizados en el gato doméstico en el estado

español, permitieron obtener valores de seroprevalencia de entre el 32,3-45%,

habiéndose observado diferencias estadísticamente significativas, con una mayor

prevalencia en gatos callejeros o de granja, comparados con los domésticos (Gauss y

cols., 2003; Miró y cols., 2004; Lopes y cols., 2008). Asimismo, Millán y cols. (2008b)

detectaron la presencia de ooquistes de T. gondii en el 17% de los gatos analizados en

Andalucía.

Algunos estudios han demostrado que la toxoplasmosis es una causa bastante

común de aborto y mortalidad neonatal en ovino en España, detectándose unas

prevalencias de entre el 18,9 y 28,3% (Hurtado y cols., 2001; Pereira-Bueno y cols.,

2004).

En relación con estudios de fauna silvestre, en España se han detectado

anticuerpos frente a T. gondii en el ciervo, el gamo, el corzo, el muflón, el jabalí y en el

conejo silvestre (Almería y cols., 2004; Gauss y cols., 2005, 2006; Gamarra y cols.,

2008). También se ha documentado la presencia de T. gondii en cetáceos de la costa

mediterránea (Cabezón y cols., 2004).

En cuanto a los carnívoros, sendos estudios publicados por Millán y cols.

(2008b) y Sobrino y cols. (2007) demuestran la presencia de anticuerpos frente a este

protozoo en las especies analizadas pertenecientes a las familias Felidae, Canidae,

Mustelidae, Viverridae y Herpestidae.

2.3.7.- Enfermedades transmitidas por artrópodos:

En este apartado se agrupan varias enfermedades infecciosas cuyo rasgo común

es su transmisión por la picadura de vectores artrópodos, principalmente por garrapatas

y que hacen que su picadura constituya un riesgo para la salud humana.

2.3.7.1.- Enfermedad de Lyme:

2.3.7.1.1.- Etiología y Taxonomía:

La enfermedad de Lyme es un proceso multisistémico producido por la

espiroqueta Borrelia burgdorferi, que afecta tanto al ser humano como a los animales y

que se transmite por la picadura de garrapatas (Burgdorfer y cols., 1989).

Esta enfermedad se describió por primera vez en 1975, cuando se detectó una

epidemia de artritis en los habitantes de varios pueblos de los Estados Unidos (Steere y

cols., 1977).

B. burgdorferi es una bacteria helicolidal y Gram-negativa, perteneciente a la

familia Spirochaetaceae. A nivel de género se diferencian dos complejos: B.

recurrentis, asociado a las fiebres recurrentes y B. burgdorferi sensu lato (s.l.). El

complejo B. burgdorferi s.l. está compuesto por 12 genoespecies y en Europa, la

enfermedad de Lyme es producida principalmente por tres de ellas: B. burgdorferi sensu

stricto (s.s.), B. garinii y B. afzelii.

2.3.7.1.2.- Epidemiología y Transmisión:

B. burgdorferi s.l. se distribuye principalmente por Europa, Asia y el norte de

América. Esta distribución geográfica se encuentra asociada a la distribución de las

garrapatas que actúan como vectores. Entre las especies vectoras se incluyen Ixodes

ricinus, que se distribuye por toda Europa, Ixodes persulcatus en Europa del este y norte

de Asia, así como Ixodes pacificus e Ixodes scapularis en América del norte (Brown y

Burgess, 2001).

Las garrapatas, generalmente las larvas y las ninfas, adquieren el agente

patógeno cuando se alimentan de un animal infectado y transmiten la infección de

forma transestadial a la siguiente fase, ya que la transmisión transovárica parece tener

poca relevancia. Cuando las garrapatas infectadas se alimentan en otro hospedador, la

toma de sangre desencadena la división celular de las espiroquetas, haciendo que

atraviesen la pared intestinal y se desplacen hacia la glándula salivar, donde pueden

encontrarse a las 48 horas de comenzar la ingesta. A partir de ese momento pueden ser

transmitidas a un nuevo hospedador mediante la saliva (Benach y cols., 1987).

La enfermedad se ha descrito en animales domésticos como el perro, el caballo y

el ganado vacuno (Burgess, 1986, 1987; Burgess y Mattison, 1987; Mather y cols.,

1994; Shaw y cols., 2005).

En Europa, los principales reservorios de esta espiroqueta son la ardilla (Sciurus

carolinensis y S. vulgaris), el ratón leonado (Apodemus flavicollis), el ratón de campo

(A. sylvaticus), el topillo rojo (Clethrionomys glareolus), el erizo (E. eruopaeus) y la

liebre (L. timidus) (Service, 2001).

Por otra parte, entre los carnívoros silvestres se ha documentado la presencia de

anticuerpos de B. burgdorferi en el coyote y el mapache (Procyon lotor) en el norte de

América, así como en el zorro y en el tejón en Europa (Burgess y Windberg, 1989;

Doby y cols., 1991; Norris y cols., 1996; Gern y cols., 1998). También se han aislado

espiroquetas identificadas como B. afzelii a partir de diferentes tejidos del zorro (V.

vulpes schrencki), así como de las garrapatas recogidas a partir de él (I. persulcatus) en

Asia (Isogai y cols., 1994).

2.3.7.1.3.- Patogenia y Cuadro clínico:

La patogenia de la enfermedad de Lyme resulta compleja, dado que puede variar

en función de la cepa de B. burgdorferi implicada, de la especie de garrapata vectora y

de la especie de hospedador afectada. En general, la primera reacción se caracteriza por

la aparición de un cuadro de eritema que se produce en la piel tras la picadura de la

garrapata y que se extiende de forma centrífuga o migratoria. Después, se diseminan por

la circulación sanguínea y linfática, pudiendo llegar hasta el corazón, el ojo, la

musculatura, los huesos, las articulaciones sinoviales, el hígado, el bazo, las meninges o

el cerebro, produciendo un cuadro clínico diferente en función del órgano afectado

(Steere, 1989; Hu y Klempner, 1997).

En los animales, la sintomatología más notable cursa con fiebre, cojera y artritis,

mientras que, en ocasiones, también se observan lesiones renales, neurológicas, oculares

e incluso cardiacas. En el ser humano es frecuente que se produzca una infección

multisistémica, aunque en algunas personas puede cursar también de manera subclínica.

La enfermedad se caracteriza, en su forma inicial, por la aparición de un eritema

migratorio indoloro en el lugar de la picadura, que llega a desaparecer en el transcurso

de un mes. Semanas o meses más tarde se puede producir una evolución de la

enfermedad a formas clínicas que pueden cursar con artritis, meningoencefalitis o

miocarditis, entre otros (OIE, 2005b).

2.3.7.1.4.- Diagnóstico:

En el diagnóstico de la enfermedad de Lyme se emplean preferentemente

técnicas serológicas como el ELISA, la inmunofluorescencia indirecta o el Western blot

(OIE, 2005b). Otra técnica de uso muy común es la PCR, que permite la detección del

ADN de borrelias directamente a partir de tejidos, líquido cefalorraquídeo y orina, y que

tiene una alta sensibilidad (Service, 2001).

El aislamiento de B. burgdorferi en medios de cultivo específicos no resulta

práctico debido al tiempo de crecimiento requerido, que puede ser de varias semanas y

que resulta de baja sensibilidad (Bratton y Corey, 2005).

2.3.7.1.5.- Enfermedad de Lyme en nuestro entorno:

La enfermedad de Lyme en el ser humano es frecuente en algunas regiones de

España y algunos estudios de seroprevalencia realizados apuntan a la existencia de una

mayor incidencia en la zona norte de la península, en relación a la mayor distribución

del vector de B. burgdorferi (Anda y cols., 1993; Saz y cols., 1994). Por otra parte,

Arteaga y García-Monco (1998) realizaron un análisis retrospectivo de los pacientes

hospitalizados con la enfermedad de Lyme durante los años 1989-1996 en Bizkaia,

observándose un número creciente de casos y asociándolos con aquellos individuos que

realizaban actividades rurales.

Tras la realización de diversos estudios epidemiológicos en las poblaciones de

garrapatas de la CAPV mediante la técnica de arrastre en la vegetación, se han

identificado cinco genoespecies: B. burgdorferi s.l., B. garinii, B. valaisiana, B.

lusitaniae y B. afzelii, sugiriendo la existencia de algunas zonas endémicas a la

enfermedad de Lyme en el área estudiada. Además, se identificó una nueva especie

próxima a Borrelia (R57), circulando en las poblaciones de micromamíferos de la

CAPV con una alta prevalencia (Barral y cols., 2002; Gil y cols., 2005).

Por otra parte, tras el estudio de las garrapatas recogidas a partir de zorros del

noreste español, Estrada-Peña y cols. (1995) encontraron que el 30% de I. canisuga y el

28% de I. hexagonus presentaban evidencias de infección por B. burgorferi. Asimismo,

Sobrino y Gortázar (2008) observaron que la población de cánidos silvestres de

Asturias, León y Huesca tuvo contacto en alguna ocasión con B. burgdorferi a

diferencia de los animales procedentes de otras regiones españolas. Otros autores, en

cambio, tras la realización de la inmunofluorescencia directa en muestras de bazo de

176 carnívoros domésticos y silvestres de Andalucía, no encontraron antígenos de B.

burgdorferi en ninguno de ellos (Millán y cols., 2008b).

2.3.7.2.- Fiebre transmitida por garrapatas:


Anaplasma phagocytophilum es el agente causante de lo que se conoce como

fiebre transmitida por garrapatas y afecta principalmente a rumiantes domésticos y

silvestres, así como al ser humano (“Ehrlichiosis granulocítica humana”).

Fue descrita por primera vez en los años 30 en el ganado ovino en Escocia

(Gordon y cols., 1932). Actualmente, se incluye dentro de la familia Anaplasmataceae y

se trata de una bacteria Gram-negativa, intracelular obligada y pleomórfica, que parasita

principalmente neutrófilos y también monocitos (Dumler y cols., 2001).


En Europa, se ha observado que I. ricinus es el principal vector de este

patógeno, aunque también se ha reconocido la posible transmisión por otras especies de

ixódidos como Ixodes trianguliceps, I. persulcatus, Haemaphysalis punctata y

Riphicephalus sanguineus (MacLeod, 1962; Ogden y cols., 1998; Strle, 2004; Alberti y

cols., 2005; Masuzawa y cols., 2008).

Las larvas suelen tener predilección por animales de talla pequeña como los

micromamíferos, algunas aves y los pequeños carnívoros, mientras que las ninfas y los

adultos tienen preferencia por especies domésticas y silvestres de mayor talla (García-

Pérez y cols., 2002).

El ovino está considerado como uno de los principales reservorios de esta

bacteria en Europa (Foggie, 1951).

En Estados Unidos y en Europa los roedores parecen estar implicados como

reservorios naturales de A. phagocytophilum, como es el caso de Peromyscus sp. y

Apodemus sp. (Walls y cols., 1997; Christova y Gladnishka, 2005).

Otras especies silvestres como el corzo, el ciervo y el jabalí parecen desempeñar

un papel como hospedadores naturales de este agente patógeno, pero no se ha

demostrado su papel como reservorios (Petrovec y cols., 2003; Stefanidesova y cols.,

2008).

Aunque se han realizado menos estudios en los carnívoros silvestres, Petrovec y

cols. (2003) detectaron ADN de A. phagocytophilum en zorros de Austria y la

República Checa, mientras que Ryser-Degiorgis y cols. (2005) detectaron anticuerpos

de este patógeno en linces (Lynx lynx) en Suecia.


A. phagocytophilum infecta al hospedador a través de la picadura una garrapata

vectora y, una vez en el torrente sanguíneo, se introduce en las células diana, que son

los neutrófilos y los monocitos, como cuerpos elementales. Una vez dentro, se

multiplican por fisión binaria, transformándose en cuerpos iniciales, que se hallan

dentro de mórulas en un número variable de uno a 15. Una vez la célula infectada se

rompe y la mórula libera nuevos cuerpos elementales que invaden nuevas células hasta

instaurar la bacteriemia (McDade, 1990).

Los síntomas generales más comúnmente observados en los animales son la

fiebre, letargia, apatía, inapetencia, pérdida de peso, descargas nasales, disnea, tos y

mamitis (Hudson, 1950; Cranwell y Gibbons, 1986). Además, en aquellos animales

gestantes que se infectan por primera vez se suelen producir abortos (Wilson y cols.,

1964). Se observa también una inmunodepresión que puede favorecer el desarrollo de

otras enfermedades (Munro y cols., 1982; Brodie y cols., 1986).

En el ser humano, los síntomas suelen ser generalmente similares a la gripe y

cursan con fiebre, dolor de cabeza, dolores musculares, así como con náuseas, tos y

desorientación en algunos casos (Chen y cols., 1994). En ocasiones, se pueden producir

complicaciones que se manifiestan con neumonía e infecciones secundarias oportunistas

(Bakken, 1996).


La técnica tradicionalmente empleada en el diagnóstico laboratorial de A.

phagocytophilum en los rumiantes consistía en la demostración del agente en los

leucocitos mediante extensión de sangre en capa fina y su posterior tinción con Giemsa

y examen microscópico.

En la actualidad, se han desarrollado métodos específicos de detección mediante

PCR, con un gran éxito en la detección de algunas especies de Anaplasma en sangre y

otros tejidos, tanto en especies que afectan al ser humano como a los animales

(Anderson y cols., 1991; Chen y cols., 1994).

También es posible el aislamiento microbiológico del agente patógeno, aunque

éstas no son técnicas que ofrecen un diagnóstico rápido de la enfermedad, ya que se

requiere de cultivos celulares (García-Pérez y cols., 2002).

La inmunoelectroforesis, la inmunofluorescencia indirecta, y el ELISA son las

técnicas que más frecuentemente se emplean en la detección de anticuerpos (Webster y

Mitchell, 1988; Hardeng, 1991; Larsen y cols., 1994). Esta última, además de ser una

técnica rápida y económica, permite el estudio de grandes poblaciones en un corto

periodo de tiempo.

2.3.7.2.5.- Fiebre transmitida por garrapatas en nuestro entorno:

La primera descripción de A. phagocytophilum en España tuvo lugar en la

CAPV, en el curso de una infección experimental con parásitos hemáticos en ganado

ovino (Juste y cols., 1986). Años más tarde, se detectó la enfermedad afectando al

ganado vacuno y al ovino en la misma comunidad (Juste y cols., 1989; Zuloaga y cols.,

1990).

En la CAPV, se ha detectado la presencia de este agente en las garrapatas

recogidas de la vegetación (Barral, 1998), así como a partir de las garrapatas recogidas

en algunos micromamíferos (Barandika y cols., 2008), considerándolo uno de los

principales causantes de abortos en el ganado ovino y bovino en diversas áreas

montañosas de la zona (Juste y cols., 1989; García-Pérez y cols., 2002). Asimismo, en

la CAPV se ha detectado ADN de A. phagocytophilum a partir de muestras de bazo de

corzo y a partir de muestras de tejidos de micromamíferos (Oporto y cols., 2003;

Barandika y cols., 2007).

Por otra parte, diversos estudios han constatado una baja seroprevalencia en

perros y gatos en la región mediterránea (Solano-Gallego y cols., 2006a, 2006b),

asociándolo a la escasa presencia de la garrapata-vector I. ricinus (Estrada-Peña y cols.,

1992). Asimismo, Tabar y cols. (2008) detectaron una baja frecuencia de ADN de

Ehrlichia/Anaplasma sp. en gatos en la zona de Barcelona.

En el centro peninsular de La Fuente y cols. (2004) detectaron ADN de A.

phagocytophilum en garrapatas distintas a I. ricinus recogidas a partir de ciervos y

jabalíes. Asimismo, se ha llegado a detectar el agente tras el análisis serológico y

molecular realizado en los corzos del sur peninsular (de La Fuente J. y cols., 2008).

En 2001 se detectó, por primera vez en España, la presencia de A.

phagocytophilum mediante técnicas moleculares en el ser humano (Oteo y cols., 2001),

aunque hasta hace poco no se había descrito el primer caso clínico de la “Ehrlichiosis

granulocítica humana” en el territorio español (García y cols., 2006).

2.3.7.3.- Fiebre Q:


La fiebre Q es un proceso causado por el agente Coxiella burnetii, de

distribución mundial y causante de problemas de abortos en rumiantes. Además,

también afecta a otros animales domésticos y salvajes, así como a las aves y al hombre

(Maurin y Raoult, 1999).

Fue descubierta por primera vez en 1935, durante un brote de una enfermedad

febril que ocurrió entre los trabajadores de un matadero de Australia (Derrick, 1937).

C. burnetii es un microorganismo intracelular obligado y actualmente se

clasifica como única especie dentro de la familia Coxiellaceae (Maurin y Raoult, 1999).


La transmisión de la fiebre Q se produce principalmente mediante la inhalación

de aerosoles que contengan C. burnetii o bien por contacto directo (Service, 2001).

Las garrapatas son importantes reservorios de la infección en el medio natural y

desempeñan un papel fundamental en el mantenimiento de la viabilidad de C. burnetii

en la naturaleza, transmitiendo el microorganismo de unos animales a otros, si bien su

papel directo en la transmisión de la fiebre Q a las personas es despreciable (Velasco,

1996).

La fuente básica de contagio para el ser humano la constituyen algunos animales

domésticos considerados como reservorios, como son el ganado ovino, vacuno y

caprino (Maurin y Raoult, 1999). En estos casos la gestación parece ser un momento

crítico para la transmisión de la enfermedad a partir de los animales infectados, ya que

durante la misma se produce una reactivación de la infección con eliminación de

numerosas bacterias con el feto y sus productos, en el caso de que se produzca el aborto.

Además, también puede producirse la excreción de la bacteria por la orina,

heces, calostro y leche. Por otra parte, también se ha detectado la bacteria en el semen,

la lana, el pelo de los animales y en el estiércol (Moreno y Aduriz, 1999).

También pueden verse infectadas por C. burnetii otras especies domésticas como

el perro y el gato, el caballo, el burro, el cerdo, el conejo, la gallina, el pato, el pavo, el

ganso o la paloma, si bien su importancia en la transmisión de la infección al hombre

parece ser mucho menor (Velasco, 1996).

Existe, en general, escasa bibliografía acerca de la infección por C. burnetii en

especies animales de vida libre, no obstante, algunos autores demostraron la presencia

de C. burnetii en aves silvestres en Japón y observaron una mayor prevalencia entre las

aves que frecuentaban áreas próximas a las ocupadas por el ganado doméstico infectado

(To y cols., 1998). Además, se ha descrito la presencia de anticuerpos frente a C.

burnetii en diversas especies de mamíferos silvestres del continente asiático,

principalmente en el oso (Ursus tibethanus), el ciervo (Cervus nippon) y la liebre

(Lepus brachyurus) (Ejercito y cols., 1993), así como en otras especies animales del

continente americano, principalmente en el coyote (McQuiston y Childs, 2002). En

Europa, se ha conseguido detectar el microorganismo mediante técnicas moleculares en

leones (Panthera leo) en cautividad (Ejercito y cols., 1993).


El agente patógeno, tras penetrar en el organismo del animal, se multiplica en los

linfonodos regionales. Posteriormente, se produce una bacteriemia y los

microorganismos se localizan principalmente en las glándulas mamarias y en la placenta

de los individuos gestantes (Woldehiwet, 2004).

En los rumiantes, el resultado de la infección parece variar entre las diferentes

especies, ya que mientras en ovino y caprino únicamente suele causar abortos, en

vacuno también está relacionada con infertilidad y mamitis. Así, a excepción de los

problemas reproductivos, de forma general, la enfermedad en los animales suele cursar

de manera asintomática (Moreno y Aduriz, 1999).

En el ser humano, los síntomas clínicos se manifiestan de forma aguda o crónica.

La mayoría de los casos de fiebre Q aguda suelen cursar de forma asintomática. Entre

los síntomas más característicos se incluyen fuertes dolores de cabeza, fiebre,

escalofríos, dolor de garganta y fatiga. Algunos pacientes desarrollan una neumonía

atípica o incluso hepatitis. La forma crónica se caracteriza fundamentalmente por una

endocarditis, aunque se suele dar generalmente en aquellos individuos que previamente

padecían daños en el corazón. En el caso de las mujeres embarazadas, la enfermedad

suele cursar de forma asintomática, si bien se han descrito casos de abortos y partos

prematuros (Maurin y Raoult, 1999).


Hoy en día se dispone de numerosas técnicas serológicas que permiten un

correcto diagnóstico de la fiebre Q. De todas las técnicas existentes la fijación del

complemento, la inmunofluorescencia indirecta y las técnicas inmunoenzimáticas

(ELISA) son las más utilizadas (Moreno y Aduriz, 1999), aunque la técnica del ELISA

posee una sensibilidad superior al resto (Zeman y cols., 1990). Por otra parte, las

técnicas de PCR se han empleado a menudo para confirmar la identificación de C.

burnetii en cultivos, así como para su detección a partir de muestras clínicas (Stein y

Raoult, 1992).

2.3.7.3.5.- Fiebre Q en nuestro entorno:

La fiebre Q es una enfermedad endémica en España y su incidencia es

relativamente alta en el ser humano en el norte peninsular, sobre todo en la CAPV

(Montes y cols., 2006), aunque durante los últimos años se ha constatado una alta

prevalencia de infección en diferentes regiones españolas (Pascual-Velasco y cols.,

1998; Cardenosa y cols., 2006).

C. burnetii está considerado como un importante agente causal de abortos en el

ganado ovino de la CAPV (Oporto y cols., 2006) y un estudio reciente ha demostrado

una alta seroprevalencia de este agente entre los rumiantes domésticos (García-Pérez y

cols., 2009). Asimismo, también se ha detectado ADN de este agente en

micromamíferos capturados en una granja de ovino infectada, sugiriendo la posibilidad

de que estos roedores hubieran adquirido la infección por el contacto directo con los

animales infectados o con los productos del parto o de los abortos (Barandika y cols.,

2007). Por otra parte, las garrapatas parecen no intervenir en la transmisión de la

infección en algunas áreas estudiadas de la CAPV (Barandika y cols., 2008).

Recientemente, Astobiza y cols. (2010) detectaron ADN de C. burnetii en

algunas especies silvestres como el corzo, el jabalí, la liebre y algunas aves, a partir de

muestras tisulares y de garrapatas.

Pérez-Gallardo y cols. (1952) aislaron C. burnetii en lirones en el área de

Madrid. Más recientemente Ruiz-Fons y cols. (2008) detectaron anticuerpos frente a C.

burnetii en ciervos y corzos en el sur peninsular.

2.3.7.4.- Tularemia:


La tularemia es una zoonosis bacteriana poco frecuente, aunque grave y en

ocasiones letal, producida por la bacteria Francisella tularensis (Morner y Addison,

2001).

Se aisló por primera vez en 1911 a raíz de una epidemia en roedores en el

condado de Tulare en Estados Unidos (McCoy y Chapin, 1912).

Se trata de una bacteria Gram-negativa y pleomórfica, perteneciente a la familia

Francisellaceae, de la que se conocen cuatro subespecies: tularensis, holarctica,

mediaasiatica y novicida. Todas ellas se han aislado en América del norte, así como en

el continente asiático, en el caso de las subespecies holarctica, mediaasiatica y

novicida. En Europa, únicamente se han aislado las subespecies tularensis y holarctica.

Hasta el momento, F. tularensis tularensis es la que se considera la más virulenta para

el ser humano (Ellis y cols., 2002).


F. tularensis es un agente patógeno que puede transmitirse por el contacto

directo con animales o materiales infectados, por la ingestión de carne de animales

enfermos, por la inhalación de aerosoles contaminados, así como a través de la picadura

de vectores artrópodos infectados, aunque estas tres últimas vías se consideran menos

frecuentes para adquirir la infección (Service, 2001).

En el centro de Europa, las garrapatas D. reticulatus e I. ricinus están

consideradas como importantes vectores, aunque F. tularensis también puede ser

transmitido por otros artrópodos como los mosquitos y las pulgas (Ellis y cols., 2002).

Este agente es capaz de infectar a más de 250 especies animales, entre las que se

incluyen mamíferos, aves, anfibios e invertebrados, aunque afecta principalmente a

lagomorfos y roedores. El ganado ovino parece ser relativamente susceptible a la

infección por F. tularensis. Asimismo, también se ha descrito la enfermedad afectando

al perro, al gato, al cerdo y al caballo, mientras que el ganado vacuno parece ser

resistente a la infección (OIE, 2005e).

La liebre se considera el principal reservorio de este patógeno, por lo que

algunos estudios realizados en otros mamíferos silvestres revelan la exposición de estos

animales frente a este tipo de presas. Así, en diferentes lugares de Estados Unidos y

Alaska, se ha llegado a detectar una prevalencia de anticuerpos frente a F. tularensis de

entre el 0 y el 41% en animales predadores como los lobos y los coyotes (10-32%)

(Gese y cols., 1997; Zarnke y cols., 2004; Bischof y Rogers, 2005). En cuanto a otros

carnívoros se refiere, Ryser-Degiorgis y cols. (2005) no encontraron anticuerpos frente

a este patógeno en ninguno de los linces (Lynx lynx) analizados en Suecia. Por otra

parte, se ha comprobado que los micromamíferos pueden llegar a desempeñar un papel

importante como reservorios de F. tularensis, actuando como fuente de infección para el

hombre (Christova y Gladnishka, 2005).


El agente patógeno penetra en el organismo del individuo infectado y se

multiplica de forma local causando necrosis y ulceración en la piel. Después invade los

vasos sanguíneos causando inflamación y necrosis en diversos órganos como el hígado,

bazo, médula ósea y pulmones (Morner y Addison, 2001).

En los animales existe escasa documentación que haga referencia al cuadro

clínico de la enfermedad, principalmente debido al carácter agudo de la misma. No

obstante, se pueden observar cuadros septicémicos, en los que los principales síntomas

suelen ser la fiebre, letargia, anorexia, tos y diarrea (OIE, 2005e).

En el ser humano, se suelen diferenciar seis formas clínicas de la enfermedad,

dependiendo del lugar de inoculación del agente patógeno. Así, se definen la forma

tifoidea, la glandular, la oculoglandular, la orofaríngea, la neumónica y la

ulceroglandular, siendo esta última la forma más frecuentemente observada (Ohara y

cols., 1998). Asimismo, también es frecuente observar esta forma clínica de la

enfermedad en los cazadores como consecuencia de la manipulación de carne infectada.

Los síntomas más característicos suelen ser fiebre, dolor de cabeza, escalofríos, mialgias

y vómitos (Ellis y cols., 2002).


F. tularensis es un microorganismo difícil de aislar, puesto que no crece en los

medios de crecimiento habituales (Ellis y cols., 2002).

La serología es imprescindible para confirmar el diagnóstico en casos

bacteriológicamente negativos y resulta útil en las especies menos susceptibles, ya que

las especies animales sensibles a la tularemia suelen morir antes de desarrollar

anticuerpos frente al agente (Morner y Addison, 2001). Las técnicas habitualmente

empleadas suelen ser la seroaglutinación en tubo (SAT) y la microaglutinación, que a

pesar de sus limitaciones son técnicas sensibles y baratas, útiles para el diagnóstico

sistemático (Dueñas y cols., 2000).

Por otra parte, desde que se describió por primera vez la técnica de PCR para la

detección de F. tularensis en ratones infectados experimentalmente (Long y cols.,

1993), se han ido desarrollando nuevas técnicas moleculares también para la detección

del agente patógeno en muestras de tejidos tanto humanos como de animales (Fulop y

cols., 1996; Sjostedt y cols., 1997; Higgins y cols., 2000).

2.3.7.4.5.- Tularemia en nuestro entorno:

En nuestro país, la tularemia se consideraba inexistente hasta que en el año 1997

se describió el primer brote en el ser humano en Castilla y León. Se diagnosticaron 559

casos, que se correspondieron con personas que cazaron o manipularon liebres

infectadas (Instituto de Salud Carlos III, 1997). Se desconoce el origen de dicho brote,

aunque se sugirió que la bacteria pudo ser introducida en España al importar liebres o

conejos infectados procedentes de países en los que la tularemia es endémica (Campos y

cols., 1999).

El segundo brote tuvo lugar en Castilla-La Mancha en 1998 y estuvo

relacionado con ambientes acuáticos y con la pesca del cangrejo de río (Procambarus

clarkii) (Anda y cols., 2001). Desde entonces, se han descrito diversos casos

esporádicos a lo largo de los últimos años, principalmente relacionados con

antecedentes de caza o manipulación de liebres en Castilla y León, así como a través de

la inhalación de la bacteria (García y Martín, 2005; Allue y cols., 2008).

2.3.7.5.- Rickettsiosis del grupo de las fiebres maculosas:


Las rickettsiosis transmitidas por garrapatas están causadas por bacterias

intracelulares pertenecientes al grupo de las fiebres maculosas (SFG-spotted fever

group). Éstas se incluyen en la familia Rickettsiaceae y a su vez dentro del género

Rickettsia (Raoult y Roux, 1997).

En el grupo de las fiebres maculosas se incluyen un conjunto de enfermedades

zoonóticas que se distribuyen por todo el mundo y que son transmitidas por garrapatas y

pulgas. Hasta el momento se han descrito al menos 15 especies de rickettsias

transmitidas por garrapatas que son patógenas o presuntamente patógenas para el ser

humano: R. rickettsii, R. conorii, R. sibirica, R. australis, R. japonica, R. africae, R.

honei, R. slovaca, R. heilongjiangensis, R. aeschlimannii, R. parkeri, R. massiliae, R.

canadensis, R. helvetica y R. monacensis (Parola y cols., 2005). En nuestras latitudes, la

rickettsiosis más frecuente es la denominada fiebre exantémica o botonosa

mediterránea, causada por la bacteria Ricketssia conorii (Herrero y Ruiz, 1994).


Las garrapatas son las principales vectoras y a su vez reservorios de las

rickettsias del grupo SFG, habiéndose identificado en Europa en Rhipicephalus

sanguineus (R. conorii y R. massiliae), I. ricinus (R. helvetica y R. monacensis),

Dermacentor marginatus (R. slovaca) e Hyalomma marginatum (R. aeschlimannii),

(Raoult y Roux, 1997; Cardenosa y cols., 2000; Simser y cols., 2002; Christova y cols.,

2003; Fernández-Soto y cols., 2003; Segura, 2004).

Las garrapatas adultas pueden transmitir la infección a los huevos y/o estadíos

siguientes mediante transmisión transovárica y transestadial (Parola y cols., 2005).

Además, también se ha descrito la transmisión a través de otros vectores

artrópodos, como es el caso de la especie R. felis a través de la pulga (Ctenocephalides

felis) (Blanco y cols., 2006).

Entre los hospedadores vertebrados susceptibles se encuentran el perro y el gato,

además del hombre. Éstos se infectan generalmente por la picadura de los ácaros

infectados, los cuales transmiten la bacteria junto con la saliva y la inoculan

subcutáneamente (Parola y cols., 2005).

En cuanto a las especies de vida libre, si bien la bibliografía existente es escasa,

recientemente Camer y Lim (2008) detectaron anticuerpos frente a R. japonica en

mapaches (Nyctereutes procyonoides koreensis) en Corea. Por otra parte, Stefanidesova

y cols. (2008) detectaron ADN de R. helvetica en un bajo número de ciervos y de corzos

(1,3±2,5%), así como de jabalíes y de muflones (0,9±1,8%) en Eslovaquia.


Las garrapatas infectadas, cuando se alimentan de un hospedador, eliminan la

bacteria junto con la saliva y el agente patógeno se disemina prácticamente por todos los

órganos del individuo, multiplicándose en las células endoteliales de los vasos

sanguíneos. Todas las rickettsiosis, tanto en los animales como en el ser humano,

entrañan fiebre, cefaleas, artralgias, mialgias y adenopatías localizadas. Además,

frecuentemente se suele observar una erupción exantemática. Sin embargo,

ocasionalmente pueden producirse alteraciones renales, pulmonares y más raramente

cerebrales (Parola y cols., 2005).


Las técnicas serológicas son las más frecuentemente empleadas para el

diagnóstico de las SFG-Rickettsiosis en las personas afectadas. El método más antiguo

es el test de Weil-Felix que, pese a su baja especificidad y sensibilidad, todavía continúa

en uso. No obstante, la microinmunofluorescencia está considerada como técnica de

referencia actual (Raoult y Roux, 1997), aunque también es posible el aislamiento de las

rickettsias mediante cultivo (Parola y cols., 2005).

Asimismo, existen diferentes protocolos para la detección de rickettsias por

métodos moleculares a partir de garrapatas, muestras sanguíneas, así como de biopsias

humanas y animales, que permiten llevar a cabo estudios epidemiológicos de una forma

rápida y eficaz (Nilsson y cols., 1997; Bayliss y cols., 2009 Boretti y cols., 2009).

2.3.7.5.5.- Rickettsiosis del grupo de las fiebres maculosas en

nuestro entorno:

En España, se ha documentado la existencia de diferentes especies de SFG-

Rickettsia afectando al hombre: R. conorii, R. massiliae, R. slovaka, R. aeschlimanni, R.

monacensis, R. felis y R. sibirica subsp. mongolitimonae (Beati y cols., 1996;

Cardenosa y cols., 2000; Oteo y cols., 2001, 2006b; Fernández-Soto y cols., 2003; Jado

y cols., 2007; Aguirrebengoa y cols., 2008), considerándose endémica en amplias zonas

de su geografía a excepción de las regiones más septentrionales (Herrero y Ruiz, 1994).

Además, sendos estudios serológicos llevados a cabo en perros y gatos en el

noreste peninsular permitieron detectar anticuerpos frente a R. conorii en estos animales

(Solano-Gallego y cols., 2006a, 2006b).

En la CAPV, Barandika y cols. (2007) no detectaron ADN de las SFG-Rickettsia

a partir de muestras de tejido de micromamíferos y sugirieron que estos vertebrados no

estaban involucrados como reservorios del agente en el área estudiada. No obstante, un

estudio más reciente ha demostrado que las garrapatas se encuentran infectadas por

SFG-Rickettsia en algunas áreas del territorio vasco (Barandika y cols., 2008).

Algunos estudios serológicos han permitido detectar anticuerpos frente a R.

slovaka en el jabalí en el noreste peninsular (Ortuño y cols., 2007), así como la

presencia de anticuerpos frente a R. conorii en lagomorfos en la zona de Salamanca

(Ruiz-Beltrán y cols., 1992).

2.3.7.6.- Bartonelosis:


Las especies pertenecientes al género Bartonella se incluyen dentro de la familia

Bartonellaceae y son bacilos Gram-negativos que se han llegado a identificar en una

gran variedad de mamíferos domésticos y silvestres en todo el mundo (Breitschwerdt y

Kordick, 2000).

Desde su descubrimiento por el científico peruano Alberto Barton en 1909, el

género Bartonella incluye hoy en día más de 20 especies o subespecies, de las cuales al

menos 11 se consideran como patógenas para el ser humano: B. bacilliformis, B.

henselae, B. quintana, B. clarridgeiae, B. elizabethae, B. vinsonii, B. grahamii, B.

alsatica, B. koehlerae, B. washoensis y B. rochalimae (Clarridge y cols., 1995; Kosoy y

cols., 2003; Avidor y cols., 2004; Rolain y cols., 2004; Raoult y cols., 2006; Eremeeva

y cols., 2007).

Las diferentes especies de Bartonella son consideradas bacterias reemergentes

con una amplia distribución a nivel mundial a excepción de B. bacilliformis, que se

localiza en la zona noroeste de América del sur (Service, 2001).


La transmisión de la bacteria de un hospedador a otro se lleva a cabo mediante

vectores artrópodos (Service, 2001). Entre ellos se encuentran la pulga del gato

(Ctenocephalides felis), en la que se ha aislado B. henselae, B. clarridgeiae, B.

koehlerae y B. quintana (Rolain y cols., 2003). Otro de los vectores de B. quintana es el

piojo del hombre (Pediculus humanus corporis) (Roux y Raoult, 1999). Además,

también se ha descrito la presencia de Bartonella sp. en la garrapata I. ricinus, si bien se

desconoce el papel epidemiológico que tienen las garrapatas en este tipo de infecciones

(Sanogo y cols., 2003).

El ser humano es el principal reservorio de las especies B. bacilliformis y B.

quintana (Service, 2001). En cambio, los gatos y algunos félidos silvestres son los

principales reservorios de las especies B. henselae, B. clarridgeiae y B. koehlerae,

mientras que algunos cánidos como el perro, el coyote y el zorro gris están actuando

como reservorios de las especies B. vinsonii subsp. berkhoffi y de la recientemente

descrita B. rochalimae (Yamamoto y cols., 1998; Chang y cols., 2000; Henn y cols.,

2009ª, 2009b).

Asimismo, se ha descrito el papel como reservorio del ganado vacuno para la

especie B. bovis y del corzo para las especies B. capreoli y B. schoebuchensis (Dehio y

cols., 2001; Bermond y cols., 2002; Martini y cols., 2008). Por otra parte, se ha

documentado la implicación de los conejos silvestres como reservorios de B. alsatica y

de algunos roedores y micromamíferos para las especies B. vinsonii, B. grahamii, B.

doshiae, B. taylorii y B. birtlesii, B. washoensis (Heller y cols., 1999; Knap y cols.,

2007).


Las diferentes especies de Bartonella presentan tropismo por los hematíes y por

las células endoteliales, a las que infectan. Tras la inoculación de las bacterias en la

sangre, éstas desaparecen rápidamente del torrente circulatorio. No se conoce el primer

nicho en el que se multiplican los microorganismos, pero existen evidencias que

sugieren que esta multiplicación tiene lugar en las células endoteliales. Posteriormente

las bacterias invaden los hematíes y una vez que el microorganismo sale al exterior,

vuelve a infectar las células endoteliales, lo que perpetúa el ciclo infeccioso (Blanco y

Raoult, 2005).

Una misma especie de Bartonella puede causar un amplio espectro de

manifestaciones clínicas, por lo que a continuación se hace referencia únicamente a la

sintomatología más relevante producida por dos de las especies más comunes.

Así, la especie B. quintana puede ser responsable de la denominada “fiebre de

las trincheras”, que cursa con fiebre, cefalea e intensos dolores óseos. Se puede incluso

manifestar con meningitis, bacteriemia, endocarditis o una angiomatosis bacilar

(Brouqui y Raoult, 2006; Foucault y cols., 2006).

Por otra parte, B. henselae es el agente etiológico de la conocida como

“enfermedad por el arañazo del gato”, que se manifiesta principalmente por una

linfadenitis regional y una angiomatosis bacilar, aunque también puede producir

abscesos en el cerebro o incluso una lesión parenquimatosa hepática en las personas

inmunodeprimidas (Chomel y cols., 2006).


El diagnóstico serológico es el más utilizado y se basa fundamentalmente en la

aplicación de las técnicas de la inmunofluorescencia indirecta y/o del ELISA. Por otra

parte, la amplificación mediante PCR de los genes de la citrato-sintasa (gltA), de la

fracción 16S del ARN ribosomal o el espacio intergénico del 16S-23S ARNr (ITS)

constituyen herramientas útiles para el diagnóstico de este grupo de enfermedades

(García-Esteban y cols., 2008). Además, estas bacterias no necesitan medios especiales

para ser cultivadas, por lo que el único inconveniente del diagnóstico por aislamiento

del microorganismo es que necesitan aproximadamente 2-6 semanas para su

crecimiento (Anderson y Neuman, 1997; Blanco y Raoult, 2005).

2.3.7.6.5.- Bartonelosis en nuestro entorno:

En la geografía española se han detectado anticuerpos frente a B. henselae en

propietarios de gatos y en donantes de sangre (Blanco y cols., 1998). Asimismo, se ha

comprobado que la seroprevalencia de B. henselae y B. quintana es superior en aquellos

individuos que padecen el síndrome de la inmunodeficiencia adquirida (SIDA), en

comparación con la población sana de la misma zona de estudio (Blanco y cols., 1999;

Pons y cols., 2008). Se ha documentado la existencia de un elevado número de

individuos portadores asintomáticos de Bartonella sp. entre la población sana del norte

y sur peninsular (García-García y cols., 2005; Pérez-Irezabal y cols., 2006) aunque B.

henselae es la única especie implicada en causar endocarditis en los individuos de

nuestro entorno (Oteo y cols., 2006a).

En cuanto a los animales domésticos, se ha descrito la presencia de anticuerpos

frente a las especies B. henselae (16,8%) y B. vinsonii subsp. berkhoffii (1,07-28%) en

perros de Cataluña (Roura y cols., 2005; Solano-Gallego y cols., 2006b). Asimismo,

algunos autores han documentado la presencia de ADN y de anticuerpos frente a B.

henselae y B. clarridgeiae afectando al gato doméstico (1-29,6%) (Pons y cols., 2005;

Solano-Gallego y cols., 2006a; Tabar y cols., 2008).

Por otra parte, se han identificado tres nuevos genotipos de Bartonella,

genéticamente relacionados con B. elizabethae en roedores en el sur peninsular

(Márquez y cols., 2008) y más recientemente, se ha detectado ADN de B. henseale y B.

clarridgeiae en pool de pulgas de perros y gatos, así como de B. alsatica en pool de

pulgas de un gato montés (Márquez y cols., 2009). Estos mismos autores detectaron

ADN de Bartonella sp., con homología similar a B. rochalimae en pool de pulgas

obtenidas de zorros.

2.3.8.- Triquinelosis:


La triquinelosis es una zoonosis que está ampliamente distribuida por todo el

mundo y es endémica en España (Martínez Fernández, 1999). Se ha encontrado

parasitando una gran variedad de hospedadores en todo el mundo, desde los mamíferos

hasta las aves y también en reptiles.

El agente causal es un nematodo perteneciente a la familia Trichinellidae y al

género Trichinella. Se han descrito diferentes especies del parásito en todos los

continentes, salvo en la Antártida, donde no se han publicado estudios epidemiológicos

(Pozio, 2000; Pozio y Zarlenga, 2005).

Actualmente se conocen ocho especies de Trichinella, cinco de ellas

encapsuladas: T. spiralis, T. nativa (incluye el genotipo Trichinella T6), T. britovi

(incluye dos genotipos independientes, Trichinella T8 y T9), T. murrelli, T. nelsoni y

tres no encapsuladas: T. pseudospiralis, T. papuae y T. zimbabwensis (Pozio, 2005).

Hasta ahora, en Europa se han descrito cuatro especies de Trichinella: T.

spiralis, T. pseudospiralis, T. nativa y T. britovi. Las especies encapsuladas son capaces

de infectar únicamente a mamíferos, mientras que las tres especies no encapsuladas

tienen una mayor variedad de hospedadores: T. pseudospiralis infecta a mamíferos y a

aves, mientras que T. papuae y T. zimbabwensis parasitan a mamíferos y reptiles (Pozio

y Darwin, 2006).


Se conocen dos ciclos epidemiológicos de Trichinella sp., uno doméstico y otro

salvaje (Campbell, 1983). El ciclo doméstico o sinantrópico tiene dos variedades. Por

un lado, el que se conoce como ciclo urbano, que se desarrolla entre los cerdos

domésticos o entre el cerdo y los animales sinantrópicos como la rata común, el perro,

el gato y los animales de peletería, siendo un ciclo característico de la especie T.

spiralis. Por otro lado, está el ciclo rural, que se produce cuando los cerdos se explotan

de modo extensivo en contacto con la fauna silvestre, con lo cual T. spiralis se extiende

en el medio silvestre, al mismo tiempo que T. britovi, típico del ciclo silvestre, puede

entrar a formar parte de este ciclo.

El cerdo doméstico es el principal reservorio del parásito T. spiralis y en

ocasiones también se han descrito casos de infección por Trichinella spp. afectando al

caballo (Pozio y Darwin, 2006).

Entre la fauna silvestre es bien conocida la presencia de diferentes especies de

Trichinella en jabalíes en todo el mundo, desempeñando un papel importante en la

epidemiología de la triquinelosis (Kapel, 2000;Pozio, 2000, 2001). Además, está

considerado como el hospedador más importante de T. spiralis, aunque también se han

descrito infecciones por T. britovi, T. pseudospiralis y T. nativa. Entre otros

artiodáctilos, únicamente se conoce la infección en un reno (Rangifer tarandus) en

Rusia y en dos corzos en Croacia (Pozio, 2005).

Los carnívoros se consideran el orden de mamíferos que juegan el papel más

importante en la epidemiología de la triquinelosis, dado el hábito caníbal y/o carroñero

de muchos de ellos. Se han detectado larvas de Trichinella spp. en más de 80 especies

de carnívoros en todo el mundo, habiéndose llevado a cabo la mayoría de los estudios

en zorros. Así, en Europa se han descrito unas prevalencias del 0-5,4% en este cánido

(de la Rosa y cols., 1991; Malczewska y cols., 1997; van der Giessen y cols., 1998;

Enemark y cols., 2000). Algunos autores han destacado la importancia de T. britovi

como agente etiológico del ciclo salvaje de la triquinelosis, así como el rol de los zorros

como reservorios de este parásito en la naturaleza (Cabaj y cols., 2000; Sreter y cols.,

2003a).

Entre otros carnívoros que pueden infectarse con larvas de Trichinella sp. se

encuentran algunos cánidos como el coyote, la mayoría de los félidos y diversos

mustélidos (Brglez, 1989; Georgieva y cols., 2000; Kapel, 2000; Pozio, 2007;

Malakauskas y cols., 2007; Blaga y cols., 2009; Frey y cols., 2009).

Por otra parte, se ha descrito la infección por larvas de Trichinella sp. en

diferentes especies de roedores, aunque se desconoce la implicación de estos

micromamíferos en la epidemiología de esta parasitosis. En un estudio publicado por

Stojcevic y cols. (2004) se sugiere que la rata común actúa más como vector o víctima

que como reservorio. De hecho, la presencia de la infección en estos roedores se ha

relacionado frecuentemente con deficientes condiciones higiénico-sanitarias,

habiéndose detectado ratas infectadas donde existía una infección en el ganado porcino,

pero no a la inversa (Pozio, 2005).

Se han llevado a cabo un menor número de estudios en las aves en comparación

a las realizadas en los mamíferos, lo cual puede ser uno de los motivos del escaso

número de casos descritos. Por lo tanto, se desconoce el papel que desempeñan las aves

en la epidemiología de la triquinelosis, si bien diversas infecciones experimentales

realizadas en estos vertebrados demuestran que son capaces de albergar especies no

encapsuladas del nematodo (Pozio, 2005).

El ser humano se infecta de modo accidental por la ingestión de carne o

productos cárnicos crudos o insuficientemente cocinados, procedentes de animales

infectados (Bartuliene y cols., 2005).

Las larvas encapsuladas pueden sobrevivir durante años en el tejido muscular

del huésped. A medida que pasa el tiempo, la cápsula fibrosa se espesa y se inicia un

proceso de calcificación dentro del quiste. Desde el punto de vista epidemiológico es

muy importante su resistencia a la putrefacción, habiéndose encontrado larvas vivas y a

menudo infectantes durante al menos cuatro meses en carnes en avanzado estado de

descomposición. En este estado, la temperatura ambiental y la humedad desempeñan un

papel importante en la viabilidad y, por tanto, en la transmisión de Trichinella spp. entre

los animales silvestres (Pozio, 2000).


Los hospedadores se infectan cuando ingieren tejido muscular contaminado con

larvas de Trichinella spp. Estas larvas llegan al duodeno, donde se desarrollan los

adultos, que se localizan en la luz intestinal. Los ejemplares adultos se reproducen

sexualmente en el tracto intestinal del hospedador y las hembras realizan la puesta de

nuevas larvas, que se diseminan por todo el cuerpo del individuo vía sanguínea,

pudiendo llegar a todos los tejidos (Martínez Fernández, 1999).

Las larvas de Trichinella spp. se enquistan en el tejido muscular de los animales

susceptibles, localizándose fundamentalmente en los músculos estriados de mayor

actividad y, por lo tanto, superior concentración de oxígeno, como son los pilares

diafragmáticos, maseteros, intercostales, linguales, oculares y en el caso de los zorros en

los músculos flexores y extensores de las extremidades (Kapel y cols., 1994). No

obstante, algunos estudios sugieren que el sitio de predilección de estos nematodos está

influenciado por la especie de hospedador, así como por la edad y por el nivel de

infección provocados (Kapel, 2000).

Salvo en infecciones masivas es muy raro apreciar signo alguno, tanto en los

animales como en el ser humano, aunque los individuos afectados pueden padecer

fiebre alta, debilidad, dolores musculares y articulares, diarrea, edema de cara y

párpados, así como sintomatología nerviosa caracterizada por paresia y mareos

(Martínez Fernández, 1999).


La única técnica recomendada, hoy en día, para la detección de larvas de

Trichinella spp. en la carne es la digestión artificial, si bien la sensibilidad de esta

técnica depende de la cantidad y de la muestra de carne analizada (OIE, 2008d).

El triquinoscopio, a pesar de su frecuente uso durante décadas, en la actualidad

se ha visto que presenta una menor sensibilidad con respecto a la técnica de la digestión

artificial (Beck y cols., 2005b).

Además, también se pueden emplear técnicas serológicas como el ELISA, en

cuyo caso Beck y cols. (2005a) observaron que el ELISA realizado a partir de líquido o

jugo muscular en cerdos es un buen método y puede adaptarse para analizar un gran

número de muestras. Se trata de una técnica económica, fácil de realizar y que ofrece

una buena sensibilidad y especificidad, aunque se recomienda su uso para programas de

vigilancia y diagnóstico de brotes de la enfermedad, pero no para análisis de muestras

para consumo humano (OIE, 2008d).

Por otra parte, de cara a identificar la especie de Trichinella de la que se trata, el

método más empleado hoy en día es la PCR a partir de una única larva (Rombout y

cols., 2001; Zarlenga y cols., 2001; Gasser y cols., 2004).

2.3.8.5.- Triquinelosis en nuestro entorno:

A pesar de las medidas de control instauradas para hacer frente a la infección por

triquinelosis, todavía se considera un problema sanitario en España, donde la carne de

cerdo doméstico y del jabalí son las principales fuentes de la infección (Rodríguez y

cols., 2004). Entre los años 1994 y 2006, se declararon en España 29 brotes de

triquinelosis, la mayoría de las cuales se detectaron en Castilla-La Mancha, Castilla y

León y Extremadura, mientras que durante todo el periodo estudiado no se detectó

ningún brote en la CAPV (Martín y cols., 2007). Asimismo, el alimento consumido en

el 80% de los brotes fue el jabalí y el agente etiológico identificado en la mayoría de los

casos fue T. spiralis (44%). La aparición de todos estos brotes coincidía con los

momentos de mayor actividad cinegética de caza del jabalí y matanza domiciliaria del

cerdo (Martín y cols., 2007).

En general, los casos de infección descritos en jabalíes son principalmente por T.

spiralis y en menor medida por T. britovi (Pérez-Martín y cols., 2000). Recientemente,

Rodríguez y cols. (2008) han descrito un caso de infección mixta de T. spiralis y T.

britovi en un jabalí cazado en la provincia de Cáceres, aunque se desconoce el

mecanismo por el cual adquirió esta parasitación mixta.

Con lo que respecta a los carnívoros silvestres en España, se tiene constancia

acerca de la infección por Trichinella spp. en el zorro, el lobo, el tejón, la comadreja, la

marta, la gineta y el gato montés (Miquel y cols., 1993; Cordero del Campillo y cols.,

1994; Torres y cols., 1996c, 2000b, 2001; Gortázar y cols., 1998b; Pérez-Martín y cols.,

2000; Criado-Fornelio y cols., 2000; Magalhaes y cols., 2004; Segovia y cols., 2001,

2007), aunque no se ha llegado a evaluar el papel de estos animales en la epidemiología

de esta parasitosis.

2.3.9.- Ectoparásitos:

Algunas especies parásitas como son las garrapatas, algunos piojos, las pulgas y

los ácaros de la sarna, son agentes a tener en cuenta por el daño que pueden producir en

el animal que parasitan, pero su relevancia es aún mayor si se tienen en cuenta los

agentes patógenos que pueden transmitir a los animales y también al ser humano.

Los ectoparásitos que se describen a continuación pertenecen al Phylum

Arthropoda.

2.3.9.1.- Garrapatas:

Las garrapatas son un grupo de ectoparásitos que se alimentan de la sangre de

los hospedadores a los que parasitan y que son capaces de transmitir una gran variedad

de agentes patógenos, algunos de ellos causantes de importantes zoonosis (Service,

2001).

Actualmente se conocen alrededor de 850 especies de garrapatas en todo el

mundo, las cuales se clasifican dentro de las familias Argasidae e Ixodidae (Sonenshine,

1993). Las especies que parasitan con mayor frecuencia a los carnívoros de nuestro

entorno son las pertenecientes a la familia Ixodidae (Castellá, 1999), por lo que a

continuación se hace referencia a las características más representativas de esta familia.

Dentro de la familia Ixodidae se incluyen seis géneros diferentes: Ixodes,

Rhipicephalus, Boophilus, Dermacentor, Haemaphysalis, Hyalomma (Sonenshine,

1993).

Las garrapatas se caracterizan por ser ectoparásitos temporales, dado que pasan

la mayor parte de su vida en el medio natural (hasta 3 años) y sólo sirven como

parásitos durante 2-3 semanas (Sonenshine, 1993). Algunas especies de garrapatas,

como Ixodes hexagonus e Ixodes canisuga, son especies endófilas, por lo que no es

frecuente encontrarlas en la vegetación, ya que habitan principalmente en madrigueras

de diferentes mamíferos o en los nidos de las aves, por lo tanto, el ciclo completo de la

garrapata discurre en los propios hábitats de esos hospedadores (Jaenson y cols., 1994).

Por otra parte, otras especies de garrapatas, como Ixodes ricinus y Haemaphysalis

punctata, son exófilas, desarrollándose entre la vegetación y trepando por ella hasta

encontrar un hospedador del que alimentarse. Además, algunas especies utilizan un solo

hospedador para todas sus fases, mientras que otras cambian de hospedador en cada fase

(Sonenshine, 1993).

El ciclo biológico de los ixódidos comienza con la puesta de huevos. Antes de

alcanzar el estado adulto sufren dos mudas pasando por las fases de larva y de ninfa,

para lo cual necesitan alimentarse de sangre de un hospedador. Una vez que la garrapata

establece contacto con un hospedador adecuado busca zonas de piel fina y de difícil

acceso donde fijarse (Castellá, 1999). Los carnívoros silvestres son hospedadores de

numerosas especies de garrapatas, como se describe en la Tabla 3:

Tabla 3. Especies de garrapatas que se han encontrando parasitando a los carnívoros silvestres en España. ESPECIE ANIMAL

ESPECIES GARRAPATAS REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA

COMADREJA

Ixodes hexagonus, Ixodes ricinus, Rhipicephalus

pusillus, Ixodes ventalloi, Rhipicephalus sanguineus,

Boophilus annulatus, Ixodes acuminatus

Cordero del Campillo y cols., 1994;

Domínguez, 2004

GARDUÑA I. hexagonus, I. ricinus, Haemaphysalis punctata Cordero del Campillo y cols., 1994;

Domínguez, 2004

GATO MONTÉS I. hexagonus, I. ricinus, Ixodes canisuga, R. pusillus,

I. ventalloi, H. punctata


Domínguez, 2004

GINETA I. ricinus, R. pusillus, I. acuminatus


Domínguez, 2004; Refojos y cols., 2006;

Millán y cols., 2007

LINCE B. annulatus, I. ventalloi, I. ricinus, I. hexagonus, R.

pusillus, Rhipicephalus turanicus, R. sanguineus

Cordero del Campillo y cols., 1994; Millán

y cols., 2007

LOBO I. ricinus, Dermacentor reticulatus, R. pusillus, R.

sanguineus


Domínguez, 2004

MARTA I. ricinus, R. pusillus Cordero del Campillo y cols., 1994

MELONCILLO I. ventalloi, I. ricinus, I. hexagonus, Hyalomma sp., R.

pusillus, R. turanicus


y cols., 2007

TEJÓN I. hexagonus, I. ricinus, I. canisuga, R. pusillus, R.

turanicus, I. ventalloi, R. sanguineus, H. punctata


y cols., 2007

TURÓN I. hexagonus, I. ricinus, I. canisuga, R. pusillus Cordero del Campillo y cols., 1994;

Domínguez, 2004

VISÓN

EUROPEO I. hexagonus, I. acuminatus Refojos y cols., 2006

VISÓN

AMERICANO I. hexagonus, . I. acuminatus Refojos y cols., 2006

ZORRO

I. hexagonus, I. ricinus, I. canisuga, R. pusillus, R.

turanicus, I. ventalloi, R. sanguineus, H. punctata, D.

reticulatus, Hyalomma marginatum, Rhipicephalus

bursa

Encinas-Grandes, 1986; Cordero del

Campillo y cols., 1994; Domínguez, 2004;

Millán y cols., 2007; Martínez-Carrasco y

cols., 2007

En el País Vasco se han identificado las especies I. ricinus, I. trianguliceps, H.

punctata, H. sulcata, H. inermis, H. hispanica, H. concinna, R. bursa, R. sanguineus, R.

pusillus, R. turanicus, D. reticulatus y D. marginatus a partir de la vegetación y

micromamíferos (Barral, 1998; Gil, 2002; Barandika y cols., 2006, 2007), así como las

especies I. hexagonus e I. acuminatus a partir de algunos carnívoros silvestres (Refojos

y cols., 2006).

En nuestras latitudes hay especies de ixódidos que tienen un interés

epidemiológico especial por su capacidad de transmisión de agentes patógenos al ser

humano y a los animales. I. ricinus es un importante vector de diferentes genoespecies

de Borrelia burgdorferi s.l., causante de la enfermedad de Lyme, cuya presencia se ha

confirmado en las problaciones de I. ricinus de la CAPV (Barral y cols., 2002).

Asimismo, también se ha descrito como vector de A. phagocytophilum, Rickettsia spp.,

virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, C. burnetii y de la Babesiosis humana

(Oteo y cols., 2001; Barral y cols., 2002; Márquez y cols., 2005). La especie R.

sanguineus destaca por ser transmisora de Rickettsia conorii, agente causal de la fiebre

botonosa mediterránea (Márquez y cols., 2005).

2.3.9.2.- Pulgas:

El orden Siphonaptera, engloba alrededor de 2350 especies y subespecies de

pulgas en todo el mundo. Las pulgas son un orden de pequeños insectos sin alas que se

alimentan mediante la ingestión de la sangre de mamíferos y de aves (Beaucournu y

Launay, 1990).

En la Península Ibérica se han descrito 91 especies diferentes de pulgas, que se

engloban en 6 familias diferentes: Pulicidae, Vermipsyllidae, Ctenophthalmidae,

Hyxtrichopsyllidae, Ceratophyllidae e Ischnopsyllidae (Beaucournu y Launay, 1990).

Para su supervivencia, las pulgas precisan de un hospedador, al menos

temporalmente, ya que las hembras adultas pueden depositar los huevos tanto en el

pelaje del huésped como en su nido o madriguera. Normalmente, las larvas evolucionan

a ninfas y finalmente a adultos en las madrigueras de los hospedadores, en contacto

directo con ellos. La gran capacidad para el salto que poseen las pulgas se ve favorecida

por el desarrollo del tercer par de patas, lo que les permite acoplarse a un nuevo

hospedador (Beaucournu y Launay, 1990).

A continuación se resumen las diferentes especies de pulgas que se han

encontrado parasitando a los carnívoros silvestres en España (Tabla 4):

Tabla 4. Especies de pulgas que se han encontrado parasitando a los carnívoros silvestres en España. ESPECIE

ANIMAL ESPECIES PULGAS REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA

COMADREJA

Amalareus penicilliger pyrenaicus,

Ctenophthalmus (C) apertus personatus,

Ctenophthalmus (C) baeticus boisseani,

Peromyscopsylla spectabilis spectabilis,

Rhadinopsylla (Actenophthalmus)

pentacantha

Cordero del Campillo y cols., 1994

GARDUÑA

Chaetopsylla trichosa, Paraceras melis,

Ctenocephalides felis felis, Nosopsyllus

fasciatus, Chaetopsylla matina

Domínguez, 2004

GATO MONTÉS C. felis felis, Ceratophylus sciurorum,

Spilopsyllus cuniculi Domínguez, 2004

GINETA C. canis, C. sciurorum, S. cuniculi Millán y cols., 2007

LINCE C. canis, S. cuniculi, Odontopsyllus

quirosi quirosi

Cordero del Campillo y cols. 1994; Millán y cols.

2007b

LOBO Pulex irritans, P. melis, Cordero del Campillo y cols., 1994; Domínguez, 2004

MARTA C. sciurorum Domínguez, 2004

MELONCILLO Xenopsylla cunicularis Millán y cols., 2007

TEJÓN P.irritans, C. trichosa, P. melis Cordero del Campillo y cols., 1994; Domínguez, 2004;

Millán y cols., 2007

TURÓN P. melis Domínguez, 2004

ZORRO P. irritans, C. trichosa, P. melis, C. canis,

C. felis felis, O. quirosi quirosi, S. cuniculi

Cordero del Campillo y cols., 1994; Domínguez, 2004;

Millán y cols., 2007; Martínez-Carrasco y cols., 2007

En el País Vasco se han identificado las especies C. baeticus arvernus,

Peromyscopsylla spectabilis y Palaelopsylla soricis a partir de micromamíferos (Gil,

2002).

Las pulgas juegan un papel importante como vectoras de algunos agentes

patógenos, como algunas especies de Bartonella spp. y de Rickettsia spp. (Blanco y

cols., 2006; Venzal y cols., 2006). También se ha documentado que pueden transmitir

enfermedades como la “peste bubónica”, cuyo agente causal es Y. pestis (Service,

2001). Además, algunas especies de pulgas como C. felis, C. canis y P. irritans pueden

actuar como hospedadores intermediarios del cestodo Dipylidium caninum (Cordero del

Campillo y cols., 1999).

2.3.9.3.- Piojos:

Los piojos son pequeños insectos no alados y dorsoventralmente aplanados que

parasitan a la mayoría de mamíferos y aves. Taxonómicamente se distingues tres

subórdenes: Anoplura, Ischnocera y Amblycera. Los piojos del suborden Anoplura se

conocen también como “piojos chupadores” e incluyen los parásitos que parasitan al ser

humano, mientras que los del suborden Ischnocera parasitan exclusivamente a las aves.

Los Amblycera se denominan también “piojos masticadores” y junto con los Ischnocera

anteriormente pertenecían al suborden Mallophaga y parasitan tanto a mamíferos como

a aves (Service, 2001). Los piojos presentes en la Península Ibérica se componen de

algo más de 100 insectos parásitos, agrupados en 17 familias diferentes (Martín-Mateo,

2009).

Estos ectoparásitos se alimentan de la sangre de los hospedadores, aunque los

denominados “masticadores”, además, también ingieren restos de piel, partes de plumas

y secreciones sebáceas.

Las hembras adultas depositan los huevos en el pelo o plumas, a partir de los

cuales, al cabo de unos días, nacen los individuos jóvenes que son los que

evolucionarán a adultos.

Los piojos son altamente específicos con respecto al huésped que parasitan, es

decir, un variado número de especies diferentes de piojos suelen parasitar a una única

especie de hospedador o a varias especies diferentes, pero en este caso suelen pertenecer

a grupos taxonómicos cercanos. Así, estos ectoparásitos dependen de la existencia de

los hospedadores para su supervivencia, no pudiendo sobrevivir más de unas pocas

horas fuera de ellos, ya que incluso mueren por enfriamiento del cuerpo del hospedador

(Séguy, 1944). La forma de transmisión de los piojos entre diferentes individuos suele

producirse por el estrecho contacto entre los animales (Durden, 2001).

A continuación se describen las principales especies de piojos que se han

encontrado parasitando a los carnívoros silvestres en España (Tabla 5):

Tabla 5. Especies de piojos que se han encontrado parasitando a los carnívoros silvestres en España.

ESPECIE ANIMAL ESPECIES PIOJOS REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA

COMADREJA Trichodectes mustelae Cordero del Campillo y cols., 1994

GINETA Felicolla genettae, Lorisicola

genettae Cordero del Campillo y cols., 1994

LOBO Trichodectes canis Domínguez, 2004

MELONCILLO Felicola inaequalis Cordero del Campillo y cols., 1994

TEJÓN Trichodectes melis Cordero del Campillo y cols., 1994; Domínguez,

2004; Millán y cols., 2007

ZORRO Felicola vulpis Cordero del Campillo y cols., 1994

En el País Vasco únicamente está registrado la identificación de las especies

Bovicola bovis en vacuno y Menacanthus meleagridis en aves (Cordero del Campillo y

cols. 1994).

Aparentemente pocos patógenos de los mamíferos silvestres se transmiten a

través de los piojos, si bien también son pocos los estudios que lo investiguen. El más

frecuente es el cestodo Dipylidium caninum, que generalmente parasita a los cánidos

(Durden, 2001) y que es transmitida por Trichodectes canis, que actúa como

hospedador intermediario. Además, algunos autores han documentado la transmisión de

Bartonella quintana por los piojos humanos (Pediculus humanus) (Bonilla y cols.,

2009).

2.3.9.4.- Ácaros. Sarna sarcóptica:


La sarna sarcóptica es una enfermedad de la piel causada por el ácaro Sarcoptes

scabiei. Se trata de una ectoparasitosis extremadamente contagiosa, de distribución

mundial, que afecta a diferentes especies de mamíferos, incluido el ser humano

(Bornstein y cols., 2001).

De Guer en 1778 descubrió el ácaro de la sarna humana al que llamó Acarus

scabiei, mientras que Latreille en 1802 modificó el nombre genérico denominándolo

Sarcoptes scabiei. Taxonómicamente se incluye dentro de la familia Sarcoptidae



La enfermedad es fácilmente transmisible por el contacto directo entre

individuos o también por el contacto indirecto, como por ejemplo, por compartir lugares

comunes que puedan estar infectados con los ácaros. Además, se considera una

enfermedad denso-dependiente, es decir, la prevalencia es más alta cuando la densidad

poblacional de los animales es más elevada (Pence y Windberg, 1994).

Se trata de una enfermedad que parece tener una mayor implicación en

especies silvestres, afectando severamente la dinámica poblacional de algunas de ellas

(Morner, 1992; Balestrieri y cols., 2006).

Entre algunos de los hospedadores de la fauna silvestre más destacados se

incluirían los cánidos en norteamérica, el zorro, los félidos y los ungulados silvestres en

Europa, los marsupiales, zorros y dingos en Australia y diversos ungulados, primates y

cánidos en África (Pence y cols., 1983; Fernández-Morán y cols., 1997; Little y cols.,

1998; Martin y cols., 1998; Bornstein y cols., 2001).

Todavía no se conoce bien la epidemiología de la sarna sarcóptica en las

poblaciones de la fauna silvestre, aunque parece que difiere según la región geográfica y

la especie animal implicada. Así, en Norteamérica, Pence y Windberg (1994) estudiaron

la incidencia de una epizootia de sarna sobre una población de coyotes durante

aproximadamente 15 años. Los autores concluyeron que dicha epizootia fue causada por

la presencia de una cepa muy virulenta del ácaro S. scabiei, favorecida por la alta

densidad de coyotes presentes en la zona.

Otro brote epizoótico tuvo lugar en zorros en el norte de Europa. Durante 8 años

la sarna se expandió por las regiones nórdicas produciendo una mortalidad del 50% en

la población vulpina. Durante este tiempo, en algunas regiones, también se vieron

afectadas otras especies como el lince y la marta (Morner, 1992). En Europa, en general,

los félidos salvajes como el lince boreal (Lynx lynx) y algunos mustélidos como la

garduña, la marta y el tejón son algunos de los carnívoros que se han visto afectados por

esta infección, aunque menos frecuentemente (Bornstein y cols., 2001; Ryser-Degiorgis

y cols., 2002).


El parásito adulto coloniza la epidermis del hospedador excavando galerías y

depositando huevos a medida que penetra en la piel. Los huevos eclosionan y las larvas

emergen a la superficie, donde se transforman en ninfas y posteriormente en adultos


La patogénesis y los correspondientes síntomas clínicos de la sarna dependen de

la especie animal afectada y del estado inmunitario de éste. Un ejemplar no expuesto

previamente, en deficientes condiciones inmunitarias, puede sufrir una hiperqueratosis

epidérmica muy extendida, generalmente con una alopecia poco marcada, pero con

inflamación dérmica subyacente de carácter crónico. Los ejemplares

inmunológicamente competentes, en cambio, experimentan un engrosamiento de la piel

generalizada, una alopecia casi completa y prurito intenso (Pence y Ueckermann, 2002).

Las zonas inicialmente lesionadas varían según la especie animal afectada, pero

con mayor frecuencia se observan pequeñas depilaciones, zonas eritematosas y costras

en cabeza y cuello, base de la cola y salientes óseos. En casos graves se observa una

intensa depilación que afecta especialmente al dorso, desde el hocico hasta la cola. En

todo caso esta enfermedad se caracteriza porque los animales padecen un intenso

prurito. Los ejemplares severamente infestados tienden a presentar caquexia y debilidad,

mientras que las infestaciones muy leves pueden pasar prácticamente desapercibidas

(Pence y Ueckermann, 2002).

En el ser humano las lesiones se suelen observar generalmente en el tronco,

brazos y abdomen y más raramente en los dedos y genitales. Suele presentar un intenso

prurito que desaparece en unas pocas semanas (Bornstein y cols., 2001).


El diagnóstico clínico se basa en la observación visual de lesiones en la piel,

complementada con un examen de las costras mediante digestión de raspados de piel,

así como la inspección al microscopio óptico de cortes histológicos de las zonas

cutáneas afectadas (Bornstein y cols., 2001; Pence y Ueckermann, 2002).

También se han desarrrollado técnicas serológicas (ELISA) que permiten

verificar si un animal que presenta lesiones en la piel ha estado en contacto con el ácaro

S. scabiei (Bornstein y cols., 1995, 1996).

2.3.9.4.5.- Sarna sarcóptica en nuestro entorno:

Se dispone de escasa bibliografía en lo referente a la sarna sarcóptica en la

población humana española, si bien algunas referencias describen una epidemia de sarna

que ocurrió en la región asturiana en el año 1971 (Barthe y Martín, 1976) y desde

entonces únicamente se ha documentado la existencia de algunos casos esporádicos

ocurridos en distintos lugares de la geografía española, asociados generalmente a

individuos inmunodeprimidos y a las escasas condiciones higiénico-sanitarias

(Cárdenas y cols., 1993; Larrosa y cols., 2004).

También hay pocos estudios acerca de la prevalencia de la sarna sarcóptica en

los animales domésticos en España. No obstante, algunos trabajos llevados a cabo tanto

en el noroeste como en el suroeste español detectaron prevalencias entre el 33,7-37% en

explotaciones porcinas (Gutiérrez y cols., 1996b; Alonso de Vega y cols., 1998).

En el País Vasco se ha descrito la presencia de S. scabiei cuniculi en conejos y

de S. scabiei ovis en ovejas (Cordero del Campillo y cols., 1994).

En cuanto a los animales de vida libre, la sarna sarcóptica afecta a las

poblaciones de cabra montés (Capra pyrenaica hispanica) en el sur peninsular desde

1988 y esta enfermedad también parece haber afectado a una población de rebecos

(Rupicapra pyrenaica parva) en el noroeste español (Fernández-Morán y cols., 1997;

León-Vizcaíno y cols., 1999). Además, recientemente se ha documentado la presencia

del ácaro S. scabiei afectando al ciervo y al corzo en la región asturiana (Oleaga y cols.,

2008a, 2008b). También se conocen casos de sarna sarcóptica afectando al zorro y al

lobo en el norte peninsular (Gortázar y cols., 1998a; Domínguez y cols., 2008), mientras

que Millán y cols. (2007) no encontraron ácaros de la sarna en ninguno de los 173

carnívoros, silvestres o asilvestrados, analizados en el suroeste peninsular.

2.3.10.- Endoparásitos:

Los endoparásitos de los carnívoros constituyen un grupo muy amplio y diverso,

aunque en general hay poca información disponible sobre los efectos de estos parásitos

sobre las poblaciones de carnívoros silvestres ibéricos (Gortázar, 1996).

Existe abundante información acerca de los parásitos del perro y del gato

(Cordero del Campillo y cols., 1999) y en cuanto a los carnívoros silvestres de la

Península Ibérica, disponemos de una extensa recopilación realizada por Cordero del

Campillo y cols. (1994), así como de diversos estudios que tratan de la totalidad de

especies que se pueden encontrar en España (ver Tablas de la 6 a la 10).

A continuación se describe la vermifauna más relevante debido a su carácter

zoonótico, presente en los carnívoros en España.

Entre los parásitos del aparato digestivo destacan los siguientes:

La coccidiosis intestinal en el perro y el gato producida por parásitos

protozoarios de los géneros Eimeria, Isospora, Hammondia, Besnoitia, Sarcocystis,

Toxoplasma, Neospora y Cryptosporidium. La vía de contagio más frecuente es la

ingestión de ooquistes esporulados procedentes de heces de otros animales enfermos

que contaminan el medio. Ocasionalmente se producen infecciones por la ingestión de

tejidos procedentes de rumiantes o roedores que contienen quistes infectantes.

En general, la mayoría de los animales infectados por coccidiosis cursan sin

sintomatología aparente, mientras que los casos de coccidiosis clínica se asocian

generalmente a condiciones de hacinamiento, estrés, deficiencias sanitarias y en

definitiva, a estados de inmunosupresión del animal.

En España se ha documentado la presencia de diversas especies de coccidios

parasitando a los carnívoros silvestres (Tabla 6).

Tabla 6. Principales especies de coccidios encontradas en los carnívoros silvestres en España. ESPECIE ANIMAL ESPECIE DE COCCIDIO REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA

GINETA Toxoplasma gondii* Millán y cols., 2008b

LINCE T. gondii*, Neospora caninum Millán y cols., 2008b

LOBO Eimeria sp., Sarcocystis sp.* Domínguez y de la Torre, 2002

MELONCILLO T. gondii*, Eimeria vulpis Palomo y Gisbert, 2002; Millán y cols. ,2008b

NUTRIA Isospora lutrae Torres y cols., 2000a; Méndez-Hermida y cols.,

2007

TEJÓN T. gondii*, Cryptosporidium sp.* Millán y cols., 2008b

ZORRO Isospora sp, N. caninum, T. gondii*,

Hepatozoon canis Gortázar, 1999; Criado-Fornelio y cols., 2000

* Algunas de las especies de Cryptosporidium sp. y de Sarcocystis sp., así como T. gondii están consideradas como zoonosis.

Las trematodosis entéricas tienen escasa importancia en Europa como

agentes patógenos de perros y gatos. Entre los carnívoros silvestres se ha descrito un

mayor número de especies de trematodos diferentes en el tejón y el zorro, aunque

también se han descrito parasitando al lince, al lobo, a la gineta, a la marta, al turón y al

visón americano (Tabla 7).

Tabla 7. Principales especies de trematodos encontradas en los carnívoros silvestres en España ESPECIE ANIMAL ESPECIE DE TREMATODO REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA

GINETA Brachylaima sp. Feliú y cols., 1996

LINCE Brachylaima sp. Torres y cols., 1998

LOBO Alaria alata Soulsby 1982; Segovia y cols., 2001

MARTA Euryhelmis squamula Segovia y cols., 2007

TEJÓN Brachylaima sp., E. squamula Torres y cols., 2001

TURÓN E. squamula, Troglotrema acutum Torres y cols., 1996a

VISÓN AMERICANO T. acutum Torres y cols. 2006

ZORRO Brachylaima sp., Metorchis albidus, Metorchis

bilis

Feliú y cols., 1996; Gortázar y cols., 1998b;

Torres y cols., 2001; Segovia y cols., 2004

Las cestodosis del perro y el gato son un grupo de enfermedades

parasitarias originadas por diversas especies de cestodos que en su forma adulta se

desarrollan en el intestino delgado de estos hospedadores. Las especies de mayor

relevancia pertenecen a los géneros Taenia, Echinococcus y Dipylidium.

Las cestodosis son de distribución cosmopolita y la prevalencia está determinada

por diversos factores epidemiológicos, especialmente la forma de vida de los

hospedadores.

En la familia Taeniidae (Taenia y Echinococcus) los hospedadores definitivos

son los cánidos y félidos, tanto domésticos como silvestres, mientras que los

hospedadores intermediarios suelen ser mamíferos herbívoros u omnívoros y

ocasionalmente el ser humano (Taenia multiceps, Echinococcus spp.), en cuyas vísceras

y tejidos se desarrolla el metacestodo, que según la especie puede ser un cisticerco, un

quiste hidatídico, un cenuro o un estrobilocerco. Por lo tanto, las teniosis o

equinococosis están ligadas al consumo de carne o vísceras de animales herbívoros, por

lo que están relacionadas con el contacto con el ganado o hábitos depredadores y se

distribuyen mayoritariamente en las zonas rurales.

En España se ha documentado la presencia de T. multiceps en el zorro y el lobo,

aunque se han descrito numerosas especies de Taenia spp. parasitando a una gran

variedad de carnívoros silvestres (Tabla 8).

Tabla 8. Principales especies de cestodos encontradas en los carnívoros silvestres en España. ESPECIE ANIMAL ESPECIE DE CESTODO REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA

ARMIÑO Taenia tenuicollis Palomo y Gisbert, 2002

COMADREJA T. tenuicollis, Taenia mustelae Miquel y cols., 1992; 1993; Feliú y cols., 1996;

Torres y cols., 1996a, 1996c

GATO MONTÉS Taenia taeniformis, Taenia pisiformis, Joyeuxiella

pasqualei, Mesocestoides litteratus Cordero del Campillo y cols.,1994

GARDUÑA T. tenuicollis Feliú y cols., 1996

GINETA T. taeniformis, Taenia crassiceps, Taeina parva, J.

pasqualei, Mesocestoides sp.

Miquel y cols., 1992; Cordero del Campillo y cols.,

1994; Feliú y cols., 1996

LINCE T. taeniformis,, Taenia polyncatha, J. pasqualei,

Mesocestoides litteratus

Cordero del Campillo y cols., 1994; Millán y cols.,

2007a

LOBO

Echinococcus granulosus*, Taenia hydatigena,

Taenia multiceps*, T. pisiformis, Taenia serialis*,

Dipylidium caninum*

Torres y cols., 2000b; Segovia y cols., 2001; Sobrino

y cols., 2006

MARTA Taenia martis Segovia y cols., 2007

MELONCILLO D. caninum* Palomo y Gisbert, 2002

TEJÓN Taenia sp. Millán y cols., 2004b

TURÓN T. tenuicollis Cordero del Campillo y cols., 1994; Torres y cols.,

1996a

VISÓN AMERICANO T. martis Miquel y cols., 1992; Feliú y cols., 1996

ZORRO

E. granulosus*,T. taeniformis, T. hydatigena, T.

multiceps*, T. pisiformis, T. crassiceps, T.

polyncatha, T. serialis* , D. caninum*, J. pasqualei,

M. litteratus

Cordero del Campillo y cols., 1994; Feliú y cols.,

1996; Gortázar y cols., 1998b, 1999; Criado-Fornelio

y cols., 2000; Segovia y cols., 2004; Martínez-

Carrasco y cols., 2007

*Especies de cestodos consideradas como zoonosis.

En cambio, el cestodo Echinococcus granulosus únicamente se ha descrito

parasitando al zorro y al lobo (Tabla 8).

En el caso de Dipylidium caninum los hospedadores definitivos suelen ser

especies domésticas y silvestres de cánidos y félidos, aunque ocasionalmente también

pueden afectar al ser humano. Los hospedadores intermediaros habituales son las pulgas

(C. felis, C. canis, P. irritans) y a veces los piojos masticadores (T. canis), por lo que se

trata de una parasitosis frecuente tanto en zonas urbanas como rurales. En este caso el

metacestodo es un cisticercoide que se desarrrolla en la cavidad corporal. Hasta donde

conocemos, el zorro, el lobo y el meloncillo son las tres únicas especies de carnívoros

silvestres en las que se ha encontrado el parásito D. caninum (Tabla 8).

En general, los cestodos adultos son escasamente patógenos para perros y gatos.

Sin embargo, la infección por los metacestodos (quistes hidatídicos, cisticercos,

cenuros) provoca importantes pérdidas económicas en diversas especies de mamíferos

domésticos que participan como hospedadores intermediarios, puesto que originan un

descenso de las producciones animales y el decomiso de las vísceras o canales

parasitadas. Asimismo, tienen graves repercusiones sanitarias, ya que son causa de

zoonosis.

La nematodosis intestinal de los perros y gatos la producen diversas

especies de helmintos cuyos ciclos biológicos y acciones patógenas varían

considerablemente. Los más frecuentes son Toxocara canis, Toxocara cati y Toxascaris

leonina, seguidos por Trichuris vulpis, Ancylostoma caninum, Uncinaria stenocephala

y con menor representación Strongyloides stercoralis y Spirocerca lupi.

Las ascaridosis están causadas por las especies de los géneros Toxocara y

Toxascaris, cuyos adultos se localizan en el intestino delgado de perros, gatos y algunos

carnívoros silvestres. Los ascáridos de los carnívoros son de distribución mundial y se

encuentran entre los endoparásitos más frecuentes de estos hospedadores.

T. canis utiliza como hospedadores definitivos a cánidos domésticos y silvestres,

aunque también se ha descrito en la gineta, el turón, el gato montés y el lince (Tabla 9).

Su ciclo biológico presenta cuatro posibilidades de infección: ingestión de restos fecales

con huevos embrionados, transmisión placentaria o prenatal, transmisión por la leche

materna y transmisión mediante hospedadores paraténicos como los roedores, aves y

algunos invertebrados.

Las larvas llegan al hígado y algunas quedan retenidas ahí, mientras que otras

continúan hacia los pulmones. La migración somática tiene lugar cuando el ser humano

y otros hospedadores no habituales se infectan con este nematodo.

T. cati parasita a gatos domésticos y silvestres, aunque también se ha descrito

parasitando al zorro y a la garduña, y ocasionalmente al ser humano (Tabla 9). Los

hospedadores se infectan por la ingestión de huevos con larvas infectantes, mediante

transmisión galactógena y/o mediante la ingestión de hospedadores paraténicos. Las

larvas ingeridas migran por vía hepatopulmonar de modo similar a T. canis. No

obstante, las larvas adquiridas con la leche o a través de hospedadores paraténicos no

realizan ninguna migración orgánica, sino que se desarrollan en el intestino.

T. leonina parasita tanto a cánidos como a félidos silvestres, aunque también se

ha encontrado en la gineta (Tabla 9).

Los hospedadores se infectan por la ingestión de huevos con larvas infectantes o bien

mediante la ingestión de hospedadores paraténicos.

En los tres casos, el paso de las larvas por los distintos órganos puede causar

inflamaciones focales. Las infecciones moderadas normalmente no cursan con

manifestaciones apreciables en la fase de migración intraorgánica, en cambio las

infecciones intensas pueden manifestarse por tos, taquipnea, flujo nasal y alteraciones

digestivas, con diarreas intermitentes y abundante mucosidad.

Las ancilostomatidosis son procesos parasitarios relativamente frecuentes en los

carnívoros domésticos y silvestres, causados por nematodos de la familia

Ancylostomatidae, que se localizan en el intestino delgado y se caracterizan por su

hematofagia. Son cosmopolitas, aunque son más frecuentes en regiones tropicales y

subtropicales que en las templadas y frías.

La especie más patógena es A. caninum y la infección se puede producir por

ingestión de larvas infectantes o por su penetración activa a través de la piel. Algunas

larvas ingeridas permanecen en el intestino donde completan su desarrollo, otras

alcanzan el sistema circulatorio, pasando por los pulmones y efectuando una migración

traqueal para regresar finalmente al intestino, aunque algunas migran hacia los músculos

donde permanecen aletargados durante un largo periodo de tiempo. Éstos pueden

reactivarse durante la gestación y ser eliminados con la leche. Los síntomas más

manifiestos son la anemia y las alteraciones respiratorias y cutáneas.

Las larvas de ancilostomas en contacto con la piel humana pueden penetrar y

aunque no migren a otros tejidos, pueden provocar lesiones reptantes y prominentes

sobre la superficie cutánea que se acompañan de eritema con intenso prurito durante

varias semanas. En España se ha descrito la presencia de A. caninum en el zorro y el

lobo (Tabla 9).

Los nematodos del género Uncinaria también forman parte de los

ancilostómidos y la especie más representativa es U. stenocephala que se encuentra con

más frecuencia en zonas templadas. Este nematodo suele parasitar al perro, al gato, al

zorro, al lobo y al ser humano (Tabla 9). La infección oral predomina sobre la

percutánea y no va seguida de migración pulmonar. Asimismo, tampoco suele causar

anemia en el individuo afectado.

Trichuris vulpis se localiza en el ciego y con menos frecuencia en el colon.

Afecta al perro y a los cánidos silvestres de todas las edades, estando distribuido

mundialmente. En el ser humano es responsable del síndrome de Larva migrans

causada por la inflamación tisular producida por la migración de las larvas. En general,

su presencia es frecuente, pero suele pasar inadvertido clínicamente. La viabilidad de

los huevos en el medio se ve favorecida en suelos húmedos, pero resisten poco a la

desecación. Las infecciones ligeras no provocan una reacción importante, pero las

cargas masivas originan procesos diarreicos con abundante mucus, acompañado con

estrías sanguinolentas, delgadez y anemia. Hasta donde conocemos, se ha descrito la

presencia de T. vulpis en el zorro y el lobo (Tabla 9).

La estrongiloidosis más habitual es la causada por el nematodo Strongyloides

stercoralis, que es frecuente en zonas cálidas y húmedas y que en nuestro país se ha

hallado en el ser humano y en el perro, pero no en los gatos. Las larvas de S. stercoralis

se encuentran en el agua y suelo húmedos de los lugares de reposo donde contactan con

la piel del hospedador hasta que logran penetrar por ella. La vía digestiva es menos

habitual. La importancia de la infección deriva en que producen procesos diarreicos,

neumonía y dermatitis. Además, también causa alteraciones cutáneas con prurito y

alopecia. En nuestro entorno se ha descrito también la especie S. mustelorum en la

comadreja y el turón, si bien en otros carnívoros como el tejón, la garduña y el zorro

sólo se ha identificado a nivel de género (Tabla 9).

La espirocercosis es una parasitosis provocada por nematodos del género

Spirocerca, que afectan al perro y a otros carnívoros (Tabla 9), caracterizada por la

presencia de lesiones nodulares en el esófago y aorta, y más raramente en el estómago,

presentando manifestaciones digestivas, respiratorias y nerviosas. Los helmintos

parásitos pueden causar importantes patologías en los individuos. A pesar de que en la

mayoría de los casos produzcan lesiones poco severas en los hospedadores, en

ocasiones llegan a provocar consecuencias fatales en el animal.

Tabla 9. Principales especies de nematodos intestinales encontradas en los carnívoros silvestres en España.

ESPECIE ANIMAL ESPECIE DE NEMATODO INTESTINAL REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA

COMADREJA Strongyloides mustelorum, Molineus patens Cordero del Campillo y cols., 1994; Miquel y cols., 1992, 1993;

Feliú y cols., 1996; Torres y cols., 1996c

GARDUÑA Strongyloides sp.**, Toxocara cati* Feliú y cols., 1996

GATO MONTÉS Toxocara canis*, T. cati*, Toxascaris

leonina Miquel y cols., 1993; Cordero del Campillo y cols.,1994

GINETA T. canis*, T. leonina, Spirocerca lupi,

Toxocara genettae Miquel y cols., 1993; Cordero del Campillo y cols., 1994

LINCE T. canis*, T. cati*, T. leonina, Ancylostoma

tubaeforme, S. lupi Cordero del Campillo y cols., 1994; Millán y cols., 2007a

LOBO

T. canis*, T. leonina, Ancylostoma

caninum*, Uncinaria stenocephala*,

Trichuris vulpis*, S. lupi

Soulsby, 1982; Cordero del Campillo y cols., 1994; Segovia y cols.,

2001; Domínguez y de la Torre, 2002

MARTA Uncinaria criniformis, S. lupi Segovia y cols., 2007

TEJÓN U. criniformis, Strongyloides sp.**, M.

patens, Uncinaria criniformis

Rocamora y cols., 1978; Miquel y cols., 1992, 1993; Cordero del

Campillo y cols., 1994; Feliú y cols., 1996; Torres y cols., 2001

TURÓN T. canis*, S. mustelorum, M. patens, Cordero del Campillo y cols., 1994; Torres y cols., 1996

ZORRO

T. canis*, T. cati*, T. leonina, A. caninum*,

U. stenocephala*, T. vulpis*, Strongyloides

sp.**, S. lupi

Miquel y cols., 1993; Feliú y cols., 1996; Gortázar y cols., 1998b;

Criado-Fornelio y cols., 2000; Martínez-Carrasco y cols., 2007

*Especies de nematodos intestinales consideradas como zoonosis. **Únicamente las especies Strongyloides stercoralis y Strongyloides fuelleborni están consideradas como zoonosis.

Entre las parasitosis respiratorias y cardiopulmonares destacan los siguientes

nematodos:

La angiostrongilosis está provocada por especies de nematodos del género

Angiostrongylus. Los adultos se localizan en las arterias pulmonares y sus

ramificaciones y menos frecuentemente en la aurícula y el ventrículo del lado derecho

del corazón. Ocasionalmente pueden realizar migraciones erráticas a los riñones, los

ojos e incluso al sistema nervioso central. Son hematófagos, particularmente las

hembras que realizan la puesta de huevos en la luz arterial. Las larvas eclosionan en los

capilares pulmonares y salen a la luz alveolar, de donde son expulsados para ser

deglutidas con los esputos. Después, circulan por todo el tubo digestivo y salen con las

heces. En el medio ambiente necesitan un hospedador intermediario para continuar el

ciclo que es un molusco gasterópodo (caracoles y limacos), aunque pueden existir

hospedadores paraténicos (anfibios). Cuando los hospedadores ingieren los moluscos

con las larvas infectantes, éstas se liberan atravesando la barrera intestinal y migran vía

porta por el sistema venoso hasta las aurículas y ventrículos del lado derecho del

corazón y de aquí a los capilares pulmonares. Los vermes adultos tienen una acción

patógena mecánica e irritativa evidente que es el origen de las lesiones de las paredes

arteriales y de los problemas circulatorios, lo que conduce a un estado de anemia

progresivo. Los huevos dan lugar a múltiples alteraciones cardiopulmonares, mientras

que las larvas suelen provocar bronconeumonía. Las manifestaciones que producen son

muy variadas y pueden cursar de manera crónica con disnea e insuficiencia cardiaca o

bien de forma aguda, como cuadros neumónicos con disnea e hipertermia, aunque

también puede cursar de una forma atípica con manifestaciones oculares, renales y

cutáneas. En los pulmones se suele observar la formación de múltiples granulomas

parasitarios y también lesiones de neumonía intersticial.

Entre los carnívoros silvestres, hasta el momento únicamente se ha descrito la

presencia de la especie Angiostrongylus vasorum afectando al zorro, al lobo y al tejón

en España (Tabla 10).

La aelurostrongilosis la produce principalmente la especie Aelurostrongylus

abstrusus que se localiza en las arterias pulmonares de los félidos. Los huevos liberan

las larvas y éstas son deglutidas, llegando al aparato digestivo y salen al exterior con las

heces. Los hospedadores intermediarios suelen ser la babosa o el caracol, aunque

pueden existir hospedadores paraténicos como las aves, las ranas, especies insectívoras

y los roedores. La sintomatología suele ser principalmente respiratoria y los trastornos

cardiovasculares suelen ser menos evidentes. Las lesiones pulmonares consisten en

granulaciones grisáceas y, hasta el momento, en los carnívoros silvestres únicamente se

ha descrito la especie Aelurostongylus pridhami (Tabla 10).

La filaroidosis es una parasitosis provocada por la especie Filaroides osleri de

los cánidos y la especie Oslerus rostratus, de los felinos. Ambos se localizan en el

aparato respiratorio, concretamente en la mucosa de la tráquea y bronquios, donde dan

lugar a la formación de granulomas de color blanco-grisáceos. Los animales enfermos

presentan una tos persitente, dolor respiratorio, pérdida de apetito y emaciación. Entre

los carnívoros silvestres, se ha observado la presencia de Filaroides martis en la

comadreja, garduña, marta, meloncillo y turón (Tabla 10). Oslerus rostratus, en cambio,

sólo se ha detectado en el gato doméstico, pero cabe suponer que procedía de un ciclo

silvestre en el gato montés (Juste y cols., 1992).

La dirofilariosis es una enfermedad cardiopulmonar producida por Dirofilaria

immitis que afecta principalmente al perro. En el ciclo biológico interviene un mosquito

culícido y el ser humano puede ser hospedador accidental de este parásito. Las

alteraciones más importantes se producen en las arterias pulmonares y en el

parénquima, aunque es frecuente que se presenten lesiones en otros órganos,

principalmente en los riñones y en el hígado. Generalmente el curso es crónico, pero en

primoinfecciones masivas o en animales muy jóvenes pueden presentarse cuadros

agudos de curso muy rápido y mortal. Entre los carnívoros silvestres, además del zorro,

también se ha descrito afectando al lobo y a la nutria (Tabla 10).

El género Crenosoma comprende varias especies de nematodos, cuyas formas

adultas se localizan en el árbol bronquial, donde las hembras ponen los huevos y de los

que eclosionan las larvas que salen al exterior con las heces. Estos parásitos también

requieren de un hospedador intermediario que generalmente suelen ser babosas o

caracoles.

Las especies Capillaria aerophila y Capillaria putorii se localizan en la tráquea,

los bronquios y a veces en la cavidad nasal y en los senos paranasales de varias especies

de carnívoros. Los animales parasitados eliminan los huevos con las heces. En este caso

la lombriz de tierra puede actuar como hospedador paraténico.

Estos dos últimos géneros de nematodos respiratorios suelen provocar

traqueobronquitis, aunque también puede cursar con ausencia total de síntomas.

Tabla 10. Principales especies de nematodos respiratorios y cardiopulmonares encontradas en los carnívoros silvestres en España.

ESPECIE ANIMAL ESPECIE DE NEMATODO

RESPIRATORIO REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA

COMADREJA Filaroides martis, Crenosoma melesi Miquel y cols., 1993; Torres y cols., 1996c; Feliú y cols., 1996

GARDUÑA F. martis, Crenosoma petrowi,

Capillaria aerophila* Miquel y cols., 1992, 1993; Feliú y cols., 1996

LOBO Angiostrongylus vasorum, Dirofilaria

immitis* Soulsby, 1982; Segovia y cols., 2001

MARTA F. martis, C. petrowi, C. aerophila* Miquel y cols., 1993; Segovia y cols., 2007

MELONCILLO F. martis Cordero del Campillo y cols., 1994

NUTRIA D. immitis* Torres y cols., 2004

TEJÓN A. vasorum, Aelurostrongylus

pridhami, C. melesi Miquel y cols., 1993; Feliú y cols., 1996; Torres y cols., 2001

TURÓN F. martis, Capillaria putorii Cordero del Campillo y cols. 1994; Torres y cols., 1996a

VISÓN AMERICANO C. melesi Miquel y cols., 1993; Feliú y cols., 1996

ZORRO A. vasorum, A.pridhami, D. immitis*,

C. vulpis, C. aerophila*

Miquel y cols., 1993; Gortázar y cols., 1994; Cordero del Campillo y

cols., 1994; Feliú y cols., 1996; Gortázar y cols., 1998b; Mañas y cols.,

2001; Segovia y cols., 2004; Martínez-Carrasco y cols., 2007

*Especies de nematodos respiratorios consideradas como zoonosis.

MATERIALES Y MÉTODOS

3.- MATERIALES Y MÉTODOS:

3.1.- OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS:

La recogida de muestras para el presente estudio se llevó a cabo entre los años

2001-2006 en la CAPV y para ello se contó con la participación de diferentes entidades

relacionadas con la gestión de la fauna silvestre: Diputaciones Forales, centros de

recuperación y asociaciones de cazadores. Las muestras consistían en cadáveres de

carnívoros silvestres encontrados muertos en el campo, así como aquellos que morían

en los centros de recuperación y en el caso de las especies cinegéticas, también animales

abatidos durante la temporada de caza. En los casos en los que fue posible, se tomaron

muestras de sangre, preferiblemente mediante punción cardíaca, pero también

directamente de la cavidad torácica. Además, se pudieron recoger muestras de sangre de

animales vivos ingresados por diversas causas en los centros de recuperación y de

algunos carnívoros capturados vivos y posteriormente puestos en libertad.

Se diseñó una ficha (Anexo 1) para recopilar información en relación con cada

ejemplar a estudiar. En ella se registraba el sexo y la edad aproximada en aquellos casos

en que no se enviaba el cadáver, como es el caso de los animales capturados vivos, de

los cuales se obtuvieron únicamente muestras de sangre. También se recogió

información acerca del lugar preciso donde se encontraron los animales, así como la

fecha. Del mismo modo, en los ejemplares encontrados muertos, se anotó la proximidad

de una carretera o de un tendido eléctrico alrededor del cadáver, así como la presencia

de cualquier indicio que pudiera estar relacionado con la muerte del animal.

3.2.- NECROPSIA Y TOMA DE MUESTRAS:

A partir de los cadáveres de los animales recogidos se llevó a cabo un estudio

completo que incluyó la realización de la necropsia, así como la obtención de muestras

de tejidos para la realización de analíticas encaminadas a detectar la presencia de

diversos agentes patógenos.

Las necropsias se llevaron a cabo en instalaciones de bioseguridad de nivel 3

(Foto 2). En primer lugar, se pesaron los animales y se tomaron las medidas generales

de cada uno de ellos. Además, se realizó una valoración de la condición corporal de

cada individuo, calificando del 1 al 5 el contenido de grasa corporal, siendo 3 el de

condición óptima. El sexo se determinó por examen de los órganos genitales y en

cuanto a la edad, los animales se clasificaron en adultos o jóvenes, en base al tamaño y

al desgaste de las piezas dentales, el sexo y el peso.

Foto 2. Ejemplar de zorro dispuesto sobre la mesa de la sala de necropsias.

En todos los casos se llevó a cabo una necropsia ordenada, sistemática y

completa, para lo cual se realizó, en primer lugar, un examen externo del cadáver para

detectar la presencia de lesiones cutáneas y fracturas (Andrews y cols., 1986; Peña y

Rodríguez-Bertos, 2002). Se examinaron las mucosas externas y las aberturas naturales.

Asimismo, se inspeccionaron minuciosamente la piel y el pelo, así como la bolsa o caja

en la que se transportó el cadáver, con el fin de recoger los ectoparásitos presentes en

ella para su posterior identificación.

Las garrapatas que se encontraron enganchadas en la piel se extrajeron con unas

pinzas de punta fina, traccionando desde la base de la piel con sumo cuidado, con el fin

de evitar su rotura y facilitar de esta manera su posterior identificación.

En cuanto a las pulgas, se recogieron todos los ejemplares presentes en el

animal, mientras que únicamente se recogió una muestra de los piojos presentes, debido

a su abundancia en la mayoría de los individuos. En ambos casos se emplearon unas

pinzas de punta fina.

Por otra parte, en los animales que presentaron lesiones compatibles con sarna se

recogió una muestra de piel lesionada del borde del área depilada que limitaba con piel

sana, para la identificación de los ácaros causantes de la enfermedad.

El siguiente paso consistió en practicar una incisión longitudinal cortando la piel

por la línea media de la cara ventral del animal, cranealmente hasta el extremo anterior

de la mandíbula y caudalmente hasta el periné. Tras la observación del aspecto de los

tejidos conjuntivo y adiposo se procedió a la apertura de la cavidad abdominal,

seccionando la musculatura correspondiente, comenzando desde el apéndice xifoides,

siguiendo el arco costal hasta el periné. La apertura de la cavidad torácica se realizó a

partir de una incisión en el diafragma y un corte de las costillas, para finalmente analizar

minuciosamente el aspecto y la posición de las vísceras de ambas cavidades,

examinando la presencia de posibles contenidos anómalos en ellas.

Posteriormente se extrajeron las vísceras de la cavidad abdominal, para lo cual

hubo que seccionar el esófago por un lado y el recto por otro, apartando todo el paquete

gastrointestinal, así como el hígado, bazo y páncreas del cadáver en una bandeja

específica para su posterior examen. De esta manera se accedió a la cavidad pelviana

para examinar el aparato genitourinario: glándulas adrenales, riñones, uréteres, vejiga,

uretra y ovarios o testículos.

Después se examinaron todas las vísceras del abdomen, realizando las

palpaciones e incisiones pertinentes del hígado, bazo, páncreas, estómago, intestinos

delgado y grueso, así como los nódulos linfáticos mesentéricos adyacentes, para

detectar posibles anomalías.

La evisceración de la cavidad torácica se llevó a cabo mediante la realización de

dos incisiones pararelas a las ramas mandibulares, para poder extraer la lengua, la

laringe, el esófago, la tráquea, los pulmones y el corazón. El conjunto de estos órganos

también se colocó aparte para su inspección, de la misma manera que la descrita para el

resto de las vísceras.

Además, de forma rutinaria y para la detección de parásitos hepáticos, se

seccionaron los conductos biliares y se troceó el hígado en una bandeja blanca con agua.

Tras agitarlo bien se llevó a cabo el examen minucioso del agua y de los restos de

tejido.

En el caso del corazón se seccionaron longitudinalmente ambas aurículas y

ventrículos, continuando con las arterias y venas correspondientes.

También se inspeccionó la tráquea, realizando una incisión longitudinal,

avanzando por los bronquiolos hasta llegar a los lóbulos pulmonares, para la

visualización de parásitos presentes en estas localizaciones.

Finalmente se examinaron la cavidad oral, las amígdalas, los gánglios faríngeos,

las glándulas salivales, la cavidad nasal y los senos, en busca de cualquier anomalía y se

procedió a la apertura y examen de la cavidad craneal. Para ello se separó la cabeza del

resto del cadáver seccionando piel, músculos y médula espinal a nivel de los cóndilos

del occipital y se serró cuidadosamente la tapa ósea del cráneo hasta visualizar el

encéfalo tras seccionar la duramadre. En este caso se valoró la existencia de

inflamaciones, hemorragias, necrosis o tumores.

Todos los hallazgos de la necropsia fueron registrados en la ficha

correspondiente (Anexo 2).

En todos los casos se recogió una muestra de tejido para la realización de

analíticas específicas para la detección de agentes zoonóticos de interés. Así, se

recogieron muestras de íleon, hígado, bazo, corazón, pulmón, riñón, tejido cerebral,

nódulos linfáticos, tejido muscular, piel y heces (Foto 3). En aquellos casos en los que

fue posible, se realizó una punción cardiaca o recogida del líquido torácico para la

obtención de suero.

Foto 3. Realización de la toma de muestras durante la necropsia.

Todas las muestras recogidas se almacenaron en recipientes individuales

estériles y se mantuvieron en refrigeración si se procesaban en menos de 24 horas desde

su toma o a -20ºC y/o -80ºC si el estudio se iba a retrasar. Además, se conservó en

formaldehído al 10% un fragmento de las mismas muestras tisulares que las descritas

anteriormente.

Los ectoparásitos y endoparásitos se guardaron en viales con etanol al 70%,

salvo las garrapatas. Éstas se mantuvieron en recipientes en los que se introdujo un

papel de filtro humedecido y se almacenaron a 4ºC hasta su identificación, que se

realizó en los días siguientes, tras lo cual se conservaron en congelación a -20ºC para la

realización de estudios posteriores, ajenos al desarrollo de esta tesis.

La preparación de los reactivos y soluciones empleadas durante el procesado de

las muestras se especifican en el Anexo 3.

3.3.- TÉCNICAS MOLECULARES. PAUTAS GENERALES EMPLEADAS:

3.3.1.- Extracción y cuantificación del ADN (ácido desoxirribonucleico):

La extracción del ADN a partir de tejidos se llevó a cabo con el kit de extracción

Qiamp®ADN Blood mini kit (Qiagen; Alemania), siguiendo el protocolo especificado

por la casa, con algunas modificaciones:

- Se troceó aproximadamente 1 gr de tejido, en porciones lo más pequeña

posibles con la ayuda de un bisturí y se introdujeron en bolsas de plástico para

digestor de Stomacher®80 (Seward; Reino Unido).

- Se añadieron 2 ml de tampón TE.

- Se homogeneizó en un digestor Stomacher®80 (Seward; Reino Unido), durante

aproximadamente 10 segundos.

- Se recogieron 400 l de macerado en un tubo estéril para proseguir con la

extracción del ADN. El resto del macerado se almacenó a -20ºC.

- Se añadieron 360 l de tampón de lisis ATL y 40 l de proteinasa K (20

mg/ml. Invitrogen; Estados Unidos).

- Se incubó a 55ºC durante 1-3 horas, con agitaciones periódicas en vórtex cada

15 minutos aproximadamente y hasta la lisis completa del macerado.

- Se añadieron 400 l de tampón AL que se mezclaron mediante agitación en

vórtex durante unos 15 segundos.

- Se incubó a 70ºC durante 10 minutos.

- Se añadieron 400 l de etanol absoluto y se volvió a mezclar mediante

agitación en vórtex.

- Se incorporaron 600 l de la mezcla a una columna con un tubo de recolección

en la parte inferior, suministrada por el kit.

- Se centrifugó a 8000 rpm durante un minuto y se descartó el líquido sobrante.

Se repitió este paso hasta incorporar toda la mezcla en la columna y en cada una

de las tandas se eliminó el líquido sobrante.

- Se añadieron 500 l de tampón de lavado AW1 en la columna.

- Se centrifugó a 8000 rpm durante 1 minuto y se desechó el líquido recogido en

el tubo de recolección.

- Se añadieron 500 l de tampón de lavado AW2.

- Se centrifugó a 13000 rpm durante 3 minutos, se eliminó el líquido recogido y

se colocó un nuevo tubo de recolección.

- Se añadieron 50 l de tampón de elución AE y la mezcla se incubó a

temperatura ambiente durante 5 minutos.

- Finalmente, se centrifugó a 8000 rpm durante un minuto y se recogió el ADN

en un tubo estéril.

En cada tanda de extracción se incluyó un control negativo de extracción por

cada nueve muestras, desde el principio del procesado. Se trataba de 2 ml de tampón

TE, el cual se sometió a las mismas condiciones, tanto de extracción como de PCR, que

las muestras, para detectar posibles contaminaciones ocurridas durante el procesado de

las mismas.

En cada muestra obtenida se midió la concentración de ácidos nucleicos

empleando el espectofotómetro NanoDrop® ND-1000 Spectrophotometer (NanoDrop

Technologies; Estados Unidos). Este equipo mide la absorbancia de las muestras a

diferentes longitudes de onda en una muestra de solamente 2 l, lo que permite, entre

otras cosas, la cuantificación de los ácidos nucleicos presentes. La concentración de

ácidos nucleicos (ng/ l) se calculó multiplicando la absorbancia a 260 nm (A260) por el

coeficiente de extinción molar C, que en el caso del ADN en solución acuosa es de 50

(Sambrook y cols., 1989).

La calidad o pureza del ADN se estimó mediante la razón de absorbancia a

260/280 nm. Se consideró una pureza alta cuando la razón era entre 1,8 y 2.

3.3.2.- Análisis por PCR (Reacción en cadena de la polimerasa):

Las reacciones se realizaron en un volumen total de 25 l. Para asegurar que las

condiciones de reacción fueran homogéneas para todas las muestras se preparó una

premezcla con todos los componentes necesarios para la reacción, excepto la muestra.

Una vez añadidos todos los ingredientes de la premezcla, se mezclaron bien y se

repartieron en tubos de PCR previamente identificados. Finalmente, las muestras se

añadieron en un área físicamente separada de la anterior. Además, las salas de

preparación de la PCR se irradiaron con luz ultravioleta antes y después de su uso. Todo

el material empleado fue de uso exclusivo para la PCR y tras la manipulación del

producto amplificado se evitó la manipulación de muestras, extracción del ADN o

preparación de reactivos de la PCR hasta el día siguiente.

[Ac. Nucleicos]= A260 x C

Las reacciones se colocaron en el termociclador, que también se encontraba en

un área perfectamente separada de la zona donde se trabajaba con el ADN y se

sometieron a un perfil específico para cada caso.

En cada experimento, además de las muestras, se incluyeron los siguientes

controles:

Control negativo de componentes de PCR: se incluyeron todos los

reactivos de PCR excepto el ADN, en cuyo lugar se añadió agua. Permitió

comprobar que los reactivos de PCR no estaban contaminados.

Control positivo de PCR: consistió en ADN extraído de una muestra

positiva o cultivo puro. Permitió comprobar que los parámetros y condiciones de

PCR elegidos eran adecuados y que no se produjo ningún incidente en la

reacción.

3.3.3.- Electroforesis:

La visualización de los productos amplificados se llevó a cabo mediante

electroforesis en gel de agarosa. El gel se preparó mediante la disolución de la agarosa

(Seakem® LE Agarose; Estados Unidos) al 1,5% en tampón TBE 0,5x. Para ello se

calentó la mezcla en el microondas hasta obtener una solución transparente y

homogénea, dejándola gelificar en una bandeja de electroforesis con un peine de entre

22 y 30 pocillos.

El gel obtenido se colocó en una cubeta de electroforesis con una solución

tampón TBE 0,5x y se dispensaron 10 l de las muestras mezcladas con 2 l de

colorante orange G en cada pocillo. Se añadió un marcador de peso molecular adecuado

al tamaño del producto a detectar en cada caso, en el primer y último pocillo de cada

gel. Finalmente, se aplicó una corriente de entre 100-150 voltios (V) durante 30-60

minutos, en función del tamaño del producto a detectar y la cubeta utilizada.

Tras la electroforesis se tiñió el gel en una solución de bromuro de etidio (0,5

g/ml. Bio-Rad; Francia) durante 20 minutos en agitación y posteriormente se lavó en

agua durante 10 minutos, también en agitación. Los productos de PCR obtenidos se

visualizaron en un transiluminador de luz ultravioleta (Imagestore 7500, versión 7.12,

Ultraviolet Products Limited; Inglaterra).

La detección de fragmentos con el tamaño esperado e igual al obtenido en el

control positivo indicó que la muestra contenía ADN del agente diana y que, por lo

tanto, el resultado era positivo.

En los casos en los que el control negativo de extracción fue positivo por PCR,

se repitió todo el proceso analítico a partir de la muestra inicial, usando nuevas alicuotas

de reactivos de extracción.

En aquellos casos en los que el control negativo de componentes de PCR fue

positivo por PCR, pero el control de extracción fue negativo, se repitió todo el proceso

analítico a partir del ADN extraído, usando nuevas alicuotas del resto de reactivos de

PCR.

En los casos en los que el control positivo de PCR fue negativo, se repitió todo

el proceso analítico a partir del ADN extraído usando nuevas alicuotas del resto de

reactivos de PCR y una nueva alicuota de control positivo.

3.3.4.- Secuenciación:

La secuenciación del ADN sirve para determinar la sucesión precisa de

nucleótidos de un fragmento de ADN o de un gen completo. Asimismo, la

secuenciación de productos de PCR puede servir para confirmar si el fragmento

amplificado de secuencia conocida se corresponde con el agente esperado de secuencia

también conocida. Para ello se comparó la secuencia obtenida con todas las secuencias

depositadas en la base de datos del GenBank mediante búsquedas tipo Blast en el

servidor del National Center for Biotechnology Information (NCBI). Se realizaron

alineamientos múltiples con secuencias conocidas del producto esperado obtenidas del

GenBank, mediante el programa AlignX (Vector NTI suite 8.0, InfoMax, North

Bethesda, MD, EEUU), con un instrumento basado en el algoritmo ClustalW

(Thompson y cols., 1994). En aquellos casos en los que se consideró necesario, se

prepararon árboles filogenéticos con el programa Neighbor-Joining (Saitou y Nei,

1987), con modelo de sustitución de nucleótidos de Kimura 2p (Kimura, 1980) y

empleando 1000 repeticiones BootsRap. Todo ello mediante el empleo del software

Mega4 (Tamura y cols., 2007).

La secuenciación se llevó a cabo a partir del producto de PCR obtenido en

aquellas muestras en las que en el gel se había comprobado la existencia de una banda

del tamaño esperado y sin la presencia de bandas inespecíficas, que podrían interferir en

la secuenciación:

Se emplearon 5 l de producto amplificado y se le añadieron 2 l de una

exonucleasa (exo SAP-IT; Amersham Biosciences; Estados Unidos) para degradar los

cebadores residuales y para defosforilar los desoxirribonucléido trifosfatos (dNTP)

restantes. La mezcla se incubó a 37ºC durante 15 minutos y a 80ºC durante otros 15

minutos, tras lo cual se midió la concentración del ADN obtenido (ver apartado 3.3.1).

La reacción de secuenciación se llevó a cabo con el kit comercial BigDye®

Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems; Estados Unidos),

mezclando 2 l de Reddy Reaction Premix, 2 l de BigDye Sequencing Buffer, 1 l de

uno de los cebadores empleados en la PCR (5 M), ADN diana purificado a la

concentración requerida y, en caso necesario, una cantidad suficiente de agua estéril

miliQ para completar un volumen total de 20 l en la reacción. Con cada muestra se

llevaron a cabo dos reacciones de secuenciación, cada una con uno de los cebadores

empleados en la PCR.

Durante todo el proceso se evitó al máximo el contacto de la premezcla con la

luz y se mantuvieron los viales en hielo. La reacción se llevó a cabo en un termociclador

GeneAmp®PCR System 2700 (Applied Biosystems; Estados Unidos) según el siguiente

patrón: 1 ciclo de 1 minuto a 96ºC, 30 ciclos de 10 segundos a 96ºC, 5 segundos a la

temperatura de hibridación específica de cada cebador y 4 minutos a 60ºC.

El producto obtenido se purificó mediante precipitación con etanol, EDTA y

acetato sódico. Para ello se añadieron, en un vial estéril, el volumen total de la reacción

de secuenciación y a continuación se añadieron 2 l de acetato sódico 3M pH 4.5, 2 l

de EDTA 125 mM y 50 l de etanol absoluto. Se mezclaron y se incubaron a

temperatura ambiente durante 15 minutos en oscuridad. Se centrifugaron a 13000 rpm

durante 20 minutos y tras eliminar el sobrenadante se añadieron 250 l de etanol al

70%. Se centrifugaron a 13000 rpm durante 10 minutos y tras eliminar el sobrenadante

se dejaron secar los viales. Las muestras se resuspendieron en 15 l de formamida (Hi-

Di Formamide. Applied Biosystems; Estados Unidos) y se analizaron en el

secuenciador (AB3130 Genetic Analyzer. Applied Biosystems, Estados Unidos),

mediante un programa de secuenciación estándar rápido, usando polímero POP-7 y

capilar de 36 cm (RapidSeq36_POP7).

3.4.- DETECCIÓN DE AGENTES ZOONÓTICOS DE INTERÉS:

3.4.1.- Detección de Salmonella spp.

La detección de la presencia de bacterias del género Salmonella se llevó a cabo

mediante aislamiento en medio de cultivo (OIE, 2008c). La muestra empleada fue 1 gr

de íleon, que se homogeneizó en 9 ml de Agua de Peptona Tamponada -APT- (bio-

Mérieux; Francia) en un digestor Stomacher®80 (Seward; Reino Unido). La mezcla se

incubó durante 16-20 horas a 37ºC (±1) y posteriormente se transfirió a dos caldos de

enriquecimiento, Muller-Kauffman Tetrathionate (MKTT) y Rappaport Vassiliadis

(RV) (bio-Mérieux; Francia), 1 ml y 0,1 ml de la suspensión, respectivamente. El caldo

de MKTT se incubó a 37ºC y el de RV a 41,5ºC (±0,5), ambos durante 24 horas.

Se inocularon en placas de agar selectivo xilosa-lisina-desoxicolato (XLD) y de

agar verde brillante (bio-Mérieux; Francia), que se incubaron durante 24-48 horas a

37ºC (±1).

Las colonias de morfología compatible con Salmonella spp. se identificaron

mediante pruebas bioquímicas convencionales (agar TSI, lisina-decarboxilasa) o

automatizadas (VITEK. bio-Mérieux; Francia) y mediante la aglutinación con

antisueros comerciales (DIFCO; Estados Unidos), mientras que el serotipado definitivo

se realizó en el Laboratorio Central Veterinario de Algete (Madrid).

3.4.2.- Detección de Yersinia spp.

La detección de la presencia de bacterias del género Yersinia se llevó a cabo

mediante cultivo microbiológico (Quinn y cols., 1994), empleando 1 gr de íleon, que se

homogeneizó en 9 ml de solución salina estéril en un digestor Stomacher®80 (Seward;

Reino Unido). Se inocularon 20 l de la suspensión obtenida en una placa de agar

selectivo (CIN agar. bio-Mérieux; Francia), que se incubó durante 24-48 horas a 24ºC

(±1).

Las colonias compatibles con Yersinia spp. se identificaron a nivel de especie

mediante pruebas bioquímicas convencionales (citocromo oxidasa y agar TSI) o

automatizadas (VITEK. bio-Mérieux; Francia).

3.4.3.- Detección de Mycobacterium spp.

Para el aislamiento de micobacterias se emplearon muestras de nódulos

linfáticos de la cabeza, así como los nódulos linfáticos mediastínicos y bronquiales en el

caso de tejones y de zorros. En algunos casos se emplearon los nódulos linfáticos

mesentéricos y cecales, así como una porción de íleon.

Se siguió el protocolo descrito por Gutiérrez (1996) con algunas modificaciones,

para lo que se homogeneizaron 2 gr de una mezcla de los tejidos descritos en 38 ml de

HCP 0,75% en un digestor Stomacher®80 (Seward; Reino Unido). La bolsa que

contenía la muestra homogeneizada se colocó en posición vertical durante 18-24 horas

para efectuar la decontaminación de la muestra y el enriquecimiento de la interfase

líquido-sólido, de donde se tomó aproximadamente 1 ml para sembrar tres tubos de

medio Coletsos (bio-Mérieux; Francia), con aproximadamente 0,2 ml de inóculo por

tubo. Para contrarrestar la mayor concentración de micobacterias en la parte inferior de

la pipeta la siembra se realizó en dos fases. En la primera se inoculó una gota en cada

uno de los tubos y en la segunda tres gotas más en orden inverso.

Los tubos se colocaron con los tapones sin apretar en una estufa de sala a 35ºC

±2ºC sin humedad, con el fin de permitir la evaporación del líquido del inóculo. Al cabo

de una semana, se comprobó la absorción del inóculo y la ausencia de contaminación, y

se cerraron completamente, tras lo cual se cambiaron a una estufa de sala a 35ºC ±2ºC,

pero con humedad controlada, donde permanecieron aproximadamente unas 20

semanas. Durante ese tiempo se inspeccionaron los tubos cuatro veces con una lupa

binocular y las colonias compatibles con Mycobacterium sp. se recogieron y se tiñieron

mediante el método Ziehl-Neelsen (Anexo 4) para observar al microscopio óptico y

verificar la presencia de microorganismos de morfología y tamaño compatibles con

micobacterias. La identificación definitiva se llevó a cabo mediante distintos protocolos

de PCR disponibles en el laboratorio para la detección del CMT (del Portillo y cols.,

1991), así como a M. avium subsp. paratuberculosis (Garrido y cols., 2000), M. avium

subsp. avium (Marsh y cols., 1999) y a M. avium subsp. silvaticum (Moss y cols., 1992).

3.4.4.- Detección de la proteína priónica patológica

La detección de la proteína priónica patológica (PrPSc) se realizó mediante una

técnica inmunoenzimática homologada por la Unión Europea para BSE y Scrapie

(Reglamento CE nº99/2001 del Parlamento Europeo y Consejo), a partir de una muestra

del sistema nervioso central, preferentemente del área del obex del tronco cerebral.

Este procedimiento consta de dos fases. La primera consistió en la purificación

in vitro de la PrPSc y se realizó siguiendo el protocolo homologado (Bio-Rad TeSeE®

Purification Kit; Francia):

- Se homogeneizaron aproximadamente 0,35 gr de tejido nervioso (Ribolyser®;

Reino Unido).

- Se transfirieron 250 l a otros viales.

- Se dispensaron 250 l de proteinasa K reconstituida.

- Se homogeneizó por inversión.

- Se incubó a 37ºC±1ºC al “baño maría” durante 10±1 minutos.

- Se dispensaron 250 l de solución de precipitación.

- Se homogeneizó por inversión hasta obtener una coloración azul homogénea.

- Se centrifugó durante 7 minutos a 13000 rpm a 20ºC (Heraeus Biofuge Fresco;

Estados Unidos).

- Se eliminó el sobrenadante y se dejó secar durante 5 minutos.

- Se dispensaron 25 l de tampón de solubilización.

- Se incubó en un bloque de calor durante 5±1 minutos a 100ºC.

- Se homogeneizaron los viales mediante agitación en vórtex.

- Se añadieron 125 l del diluyente de las muestras.

La segunda fase consistió en la detección de la PrPSc mediante una reacción

inmunoenzimática con dos anticuerpos monoclonales (Bio-Rad TeSeE® Detection Kit;

Francia):

- Se diluyeron las muestras purificadas con 125 l de diluyente.

- Se dispensaron 100 l en una microplaca recubierta con un anticuerpo

monoclonal anti-PrP, junto con los controles negativos y positivos suministrados

por el kit.

- Se cubrió la placa y se incubó durante 75±15 minutos a 37±2ºC.

- Se realizaron tres ciclos de lavado con el lavador de placas (Bio-Rad PW 40;

Francia).

- Se añadieron en cada pocillo 100 l de una solución de conjugado

(concentrado 10 veces del anticuerpo monoclonal anti-PrP marcado con

peroxidasa).

- Se incubó durante 60±5 minutos a 2-8ºC.

- Se realizaron cinco ciclos de lavado de la misma manera que la descrita

anteriormente.

- Se añadieron en cada pocillo 100 l de la solución de revelado.

- Se mantuvo la placa durante 30 minutos en oscuridad a temperatura ambiente.

- Se añadieron 100 l de solución de parada en cada pocillo, manteniendo la

misma secuencia y el mismo ritmo de distribución que la solución de revelado.

- Se realizó la lectura de la densidad óptica en un espectofotómetro a 450/620

nm en los 30 minutos posteriores a la parada de la reacción.

Las muestras cuya densidad óptica fue mayor o igual al valor umbral se

consideraron inicialmente reactivas, mientras que las que tenían valores inferiores a éste

se consideraron negativas.

3.4.5.- Detección de anticuerpos frente a Leptospira spp.

La detección de anticuerpos frente a Leptospira interrogans se llevó a cabo

mediante la microaglutinación-lisis (MAT). Para ello se empleó la técnica descrita por

Wolff (1954), a la que se le aplicaron algunas modificaciones (Atxaerandio, 2001). La

técnica MAT se desarrolló en dos fases, primero se realizó el cribado de las muestras

positivas y dudosas, y posteriormente se llevó a cabo su titulación.

Se empleó el patrón de dilución de los sueros determinado por Ellis y Michna

(1976) y se utilizaron placas de microtiter de 96 pocillos de fondo plano (Greiner

Labortechnik; Alemania) como soporte para la técnica.

Se seleccionaron siete serovares de L. interrogans para llevar a cabo el estudio.

Los serovares se escogieron bien por tratarse de las de mayor difusión en el ganado

vacuno de la zona de estudio (bratislava, pomona, hardjoprajitno) o por haber sido

descritas previamente en especies silvestres en otras regiones europeas

(icterohaemorrhagiae, canicola, gryppotiphosa, muenchen) (Fennestad y Borg-

Petersen, 1972; Hathaway y cols., 1983; Khan y cols., 1991; Atxaerandio, 2001; Alonso

y Ortega, 2002).

Los cultivos de leptospiras que se utilizaron como antígeno para el desarrollo de

esta técnica se subcultivaron en el laboratorio a partir de las cepas madre mantenidas a

temperatura ambiente. Se emplearon antígenos cultivados en 10 ml de medio líquido de

entre 4 y 8 días de crecimiento.

Cada suero se enfrentó a los siete serovares de leptospiras seleccionados. Para la

fase de cribado se diluyeron 10 l de cada suero en 115 l de solución salina al 0,85%

(dilución 1:12,5). Se mezclaron 50 l de antígeno (densidad 0,5 McFarland) con 50 l

de suero diluido, con lo que finalmente se obtuvo una dilución del suero de 1:25. Las

placas se cubrieron y se incubaron a 37±3 ºC durante 60±5 minutos. Transcurrido ese

tiempo, se dispensó una gota de cada pocillo en un portaobjetos con un microdiluidor

manual y se observó en un microscopio de campo oscuro. Se anotó la presencia de

aglutinación y/o lisis de las leptospiras y el grado de aglutinación, considerándose

positivos aquellos sueros que presentaron la mayor parte de las leptospiras aglutinadas o

lisadas a la dilución 1:25 (Acevedo-Whitehouse y cols., 2003; Jung y cols., 2007).

Para realizar la titulación se emplearon 20 l de suero, al que se le añadieron 105

l de solución salina al 0,85% (dilución 1:6,25) y se prepararon las siguientes

diluciones: 1:12,5; 1:25; 1:50; 1:100; 1:200; 1:400; 1:800, aunque en aquellos casos en

los que se seguía observando aglutinación se realizaron más diluciones. De la misma

forma a la anteriormente descrita para la fase de cribado, se mezclaron 50 l de

antígeno con 50 l de suero de cada dilución. La incubación de las placas y la lectura se

enfectuaron de la misma forma detallada anteriormente.

3.4.6.- Detección de anticuerpos frente a Toxoplasma gondii

Las muestras de suero se analizaron mediante la técnica de aglutinación

modificada (MAT), siendo en la actualidad una de las técnicas más utilizadas por su

elevada sensibilidad y especificidad para la detección de infecciones frente a T. gondii

(Dubey, 1997), y además ha sido validada para la detección de anticuerpos frente a T.

gondii en diversas especies silvestres de carnívoros (Williamson y cols., 1980; Dubey,

2004).

Esta técnica se llevó a cabo en la Universidad Autónoma de Barcelona, en

colaboración con la Dra. Sonia Almería y se siguió el protocolo especificado por Dubey

y Desmonts (1987). Esta técnica detecta anticuerpos IgG frente a T. gondii debido a la

incorporación de 2-Mercaptoetanol, que tiene la finalidad de destruir los anticuerpos

IgM en las muestras de suero. En esta técnica se empleron taquizoitos de T. gondii

completos, fijados en formalina como antígeno. La reacción de aglutinación se realizó

en microplacas de 96 pocillos de fondo redondo. Cada suero se diluyó a 1:25, 1:50,

1:100 y 1:500 en solución salina tamponada (PBS pH 7,2) y el antígeno se diluyó con

un tampón alcalino que contenía mercaptoetanol. Se mezclaron 0,05 ml de la dilución

de suero con 0,05 ml de la dilución antigénica, incubándolos a 37ºC durante 24 horas.

Para la lectura se consideró que la presencia de anticuerpos séricos produce la

aglutinación en suspensión de los parásitos, lo cual es visible microscópicamente en el

fondo de las microplacas. La ausencia de anticuerpos produce la sedimentación en un

“botón azul” en el fondo de las microplacas. Durante el procesado se incluyeron sueros

controles positivos y negativos, considerando positivas aquellas muestras que

presentaron aglutinación a una dilución 1:25.

3.4.7.- Detección de ADN de Toxoplasma gondii

Se analizaron muestras de corazón y de cerebro mediante una PCR en nido en un

solo tubo, con la que se amplifica parte de la secuencia del espacio intergénico 18S-5.8S

rRNA (ITS1) del genoma de T. gondii (Hurtado y cols., 2001).

La muestra de ADN se obtuvo a partir de un macerado de 1 gr de corazón y 1 gr

de cerebro de forma individual para cada individuo. En muestras de gato montés

también se analizó 1 gr de intestino (ver apartado 3.3.1 de materiales y métodos).

Para la realización de la PCR se emplearon los cebadores externos NN1 (5´-

CCTTTGAATCCCAAGCAAAACATGAG-3´) y NN2 (5´-

GCGAGCCAAGACATCCATTGCTGA-3´) y los internos Tg-NP1 (5´-

GTGATAGTATCGAAAGGTAT-3’) y Tg-NP2 (5´-ACTCTCTCTCAAATGTTCCT-

3´) obteniéndose un producto de 227 pares de bases.

La reacción de PCR se llevó a cabo en un volumen final de 25 l, incorporando

un total de 250 ng de ADN, 20 mM Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2,

200 M de cada dNTP, 0,01 M de NN1 y NN2, 0,4 M de TgNP1 y TgNP2, 1 U de

Taq polimerasa (Invitrogen; Estados Unidos) y una gota de aceite mineral (Sigma-

Aldrich Química S.A.; Estados Unidos), para evitar la evaporación de la reacción.

La amplificación se llevó a cabo en un termociclador RoboCycler 40

(Stratagene; Estados Unidos) según el siguiente patrón: 1 ciclo de 3 minutos a 94ºC, 15

ciclos de 30 segundos a 94ºC, 45 segundos a 65ºC y 1 minuto a 72ºC, 35 ciclos de 30

segundos a 94ºC, 30 segundos a 53ºC, 30 segundos a 72ºC y una extensión final de 5

minutos a 72ºC.

Se empleó como control positivo el ADN genómico obtenido a partir de los

taquizoitos de la cepa RH de T.gondii (Instituto Carlos III, Madrid).

La electroforesis se llevó a cabo tal y como se indica en el apartado 3.3.3 de

materiales y métodos, empleando un gel de agarosa al 1,5% con un marcador de peso

molecular de 100 pares de bases (100 pb DNA Ladder. Invitrogen; Francia),

sometiéndolo a una corriente de 145 V durante 50 minutos.

En el caso de obtener un resultado positivo en cualquiera de estos órganos se

realizó la PCR del resto de tejidos disponibles del ejemplar, incluyendo hígado, bazo,

riñón, intestino y pulmón, aplicando las mismas condiciones descritas para corazón y

cerebro.

Para confirmar la identidad de T. gondii, algunas de las muestras con resultado

positivo fueron secuenciadas siguiendo las pautas generales descritas en el apartado

3.3.4 de materiales y métodos. De forma más concreta, la concentración de amplicón

empleada en cada reacción de secuenciación fue de 50 ng/ l y 5 M de cada cebador

TgNP1 y TgNP2. La reacción de secuenciación se sometió a las siguientes condiciones:

1 ciclo de 1 minuto a 96ºC y 30 ciclos de 10 segundos a 96ºC, 5 segundos a 53ºC y 4

minutos a 60ºC.

3.4.8.- Detección de agentes bacterianos transmitidos por artrópodos

Se seleccionaron seis agentes bacterianos transmitidos por artrópodos: Coxiella

burnetii, Anaplasma phagocytophilum, Francisella tularensis, Bartonella spp.,

Rickettsia del grupo de las fiebres maculosas (SFG-Rickettsia) y Borrelia spp., para su

detección mediante técnicas moleculares.

La muestra analizada consistió en un macerado obtenido a partir de una mezcla

de aproximadamente 0,5 gr de hígado y 0,5 gr de bazo de cada animal, a partir de la

cual se llevó a cabo la extracción, tal y como se indica en el apartado 3.1 de materiales y

métodos.

Se realizaron tres PCRs multiplex, detectando dos agentes en cada una de ellas,

agrupados de la siguiente manera: PCR Co-An para la detección de Coxiella burnetii y

Anaplasma phagocytophilum, PCR Fr-Bt para Francisella tularensis y Bartonella spp.

y PCR Ri-Bo para SFG-Rickettsia y Borrelia spp. El extremo 5´de los cebadores

reversos de cada pareja se marcaron con biotina (Genotek; España) para la posterior

visualización mediante hibridación inversa (RLB-Reverse Line Blot).

Los controles positivos empleados en la PCR fueron plásmidos suministrados

por el Instituto Carlos III de Madrid, obtenidos a partir de la clonación de los

amplicones de cada uno de los genes analizados.

La secuencia y la concentración de los cebadores empleados, el gen diana y el

tamaño del producto amplificado se detallan en la Tabla 11.

Tabla 11. Información relativa a los cebadores empleados en cada PCR multiplex.

Agente Gen diana Cebador Concentración

( m) Secuencia (5´-3´)

Tamaño del

producto(pb)

Referencia

bibliográfica

Co htpAB Trans 1 Trans 2

0,2 TAT GTA TCC ACC GTA GCC AGT C biotina-CCC AAC AAC ACC TCC TTA TTC

687 Willems y cols.,

1994

An msp2 Msp2-3F Msp2-3R

0,4 CCA GCG TTT AGC AAG ATA AGA G biotina-GCC CAG TAA CAA CAT CAT AAG C

334 Zeidner y cols.,

2000

Fr Tul4 FT-393 FT-642

0,6 ATG GCG AGT GAT ACT GCT TG biotina-GCA TCA TCA GAG CCA CCT AA

250 Long y cols.,

1993

Bt 16S rRNA P24Emod P12Bmod

0,6

CCT TCA GTT (AC) GGC TGG ATC biotina- GAG ATG GCT TTT GGA GAT TAG CTC G

296

Basados en Relman y cols.,

1990 con algunas

modificaciones

Ri ompA Rr190.70p Rr190.602n

0,6 ATG GCG AAT ATT TCT CCA AAA biotina-AGT GCA GCA TTC GCT CCC CCT

491 Regnery y cols.,

1991

Bo 16S rRNA BORF

16S 0,6

CGC TGG CAG TGC GTC TTA A biotina-GCG GCT GCT GGC ACG TAA TTA GC

532 Gil y cols., 2005

Co: Coxiella burnetii; An: Anaplasma phagocytophilum; Fr: Francisella tularensis; Bt: Bartonella spp.; Ri: SFG-Rickettsia; Bo: Borrelia spp.; m: concentración de cebadores; pb: producto obtenido.

En todos los casos se siguió el protocolo descrito por Barandika y cols. (2007) y

se emplearon 150 ng de ADN de muestra en cada una de las PCRs en un volumen final

de 25 l, incluyendo 20 mM Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM

de cada dNTP, la concentración especificada en la Tabla 11 para cada cebador y 1,5 U

de Taq polimerasa (Invitrogen; Francia).

La amplificación se llevó a cabo en el termociclador iCycler (Bio-Rad; Francia),

aplicando diferentes combinaciones de tiempo y temperaturas en cada reacción:

PCR Co-An: 6 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 1 minuto a 71ºC (con una

disminución de 2ºC por cada ciclo) y 1 minuto a 72ºC y 40 ciclos de 30 segundos a

94ºC, 30 segundos a 63ºC y 1 minuto a 72ºC.

PCR Fr-Br: 1 ciclo de 3 minutos a 94ºC y 40 ciclos de 15 segundos a 94ºC, 30

segundos a 56ºC y 30 segundos a 72ºC.

PCR Ri-Bo: 1 ciclo de 3 minutos a 94ºC y 40 ciclos de 15 segundos a 94ºC, 1

minuto a 46ºC, 1,5 minutos a 72ºC y 7 minutos a 72ºC.

La electroforesis se llevó a cabo siguiendo el protocolo descrito en el apartado

3.3.3 de materiales y métodos, empleando el marcador de 100 pares de bases (100 pb

DNA Ladder. Invitrogen; Francia), pero sólo con los controles negativos y positivos de

cada reacción para comprobar el correcto funcionamiento de la PCR y descartar la

presencia de contaminaciones.

Una vez verificada la calidad de las reacciones, la mezcla de los productos

amplificados se sometió a una RLB con sondas específicas (MWG Biotech AG;

Alemania) para C. burnetii, A. phagocytophilum, SFG-Rickettsia, Borrelia sp., la cepa

R57 de Borrelia sp., F. tularensis y Bartonella sp., tal y como se indica en la Tabla 12.

Tabla 12. Información relativa a las sondas utilizadas en la RLB.

Agente Gen

diana Sonda Secuencia (5´-3´)

Concentración

( M)

Referencia

bibliográfica

Co htpAB C. burnetii amino-GCA AGA ATA CGG ACT CAC GA 2 y 4 Barandika y cols., 2007

An msp2 A.

phagocytophilum amino-GGT TAC GAG CGC TTC AAG ACC 2 y 4

Barandika y cols., 2007

Fr Tul4 F. tularensis amino-TCG TAA TGT TAG CTG TAT CAT CAT T 2 y 4 Long y cols.,

1993

Bt 16S

rRNA Bartonella spp. amino-GTT GGG CAC TCT A(AG) GG 2 y 4

Schouls y cols., 1999

Ri ompA ompA-All amino-GGC AAA AGC TTA ACT TTA AA 2 y 4 Barandika y cols., 2007

Bo 16S

rRNA Borrelia spp.

amino-GAG GAA TAA GCT TTG TAG GAA ATG ACA

2 y 4 Gil y cols.,

2005

Bo R57 16S

rRNA Borrelia R57 amino-AGT CAT TAA AGA TGT TTA ATG 8 y 16

Gil y cols., 2005

Co: Coxiella burnetii; An: Anaplasma phagocytophilum; Fr: Francisella tularensis; Bt: Bartonella spp.; Ri: SFG-Rickettsia; Bo: Borrelia spp; Bo R57: Cepa R57 de Borrelia spp.

La preparación de la membrana de RLB así como la hibridación fueron llevadas

a cabo según lo descrito por Gubbels y cols. (1999), incorporando las modificaciones

realizadas por Barandika y cols. (2007):

- Se incubó la membrana con carga negativa durante 10 minutos, con un tamaño

de 15 cm x 15 cm (Biodyne C®, Pall Europe Ltd.; Reino Unido) con 20 ml

EDAC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride; Sigma-

Aldrich Química S.A.; Estados Unidos) al 16% a temperatura ambiente para su

activación.

- Se lavó con agua destilada y se colocó en el miniblotter (Immunetics;

Cambridge; Estados Unidos).

- Se diluyeron las sondas a las concentraciones de uso (Tabla 12) en 500 mM

NaHCO3 pH 8,4.

- Se llenaron los canales del miniblotter con cada una de las sondas, salvo el

primero y el último, los cuales se rellenaron con tinta china diluida (1/100 en 2x

SSPE) como indicadores de la dirección de las sondas. Asimismo, las líneas

libres se rellenaron con tampón 2x SSPE.

- Se incubó toda la preparación a temperatura ambiente durante 5 minutos.

- Se eliminó el líquido sobrante por aspiración.

- Se retiró la membrana del miniblotter.

- Se incubó en 100 mM de NaOH durante 9 minutos para inactivarla.

- Se lavó con tampón 2x SSPE-0,1% SDS a 60ºC durante 5 minutos en

agitación.

- Se montó de nuevo la membrana en el miniblotter, girándola 90º respecto de su

posición anterior para que las sondas quedaran enfrentadas horizontalmente a

todos los productos de PCR y de tal manera que la membrana con las sondas

fijadas estaba expuesta a los canales.

- Se mezclaron los tres productos de PCR obtenidos para cada muestra y se

diluyeron con tampón 2x SSPE-0,1% SDS hasta completar una cantidad de 155

l.

- Se incubó a 100ºC durante 10 minutos y se enfrió inmediatamente en hielo.

- Se rellenaron los canales con la muestra diluida. En este caso, el primero y el

último, así como los que quedaban vacíos se rellenaron con tampón 2x SSPE-

0,1% SDS.

- Se incubó a 48ºC en posición horizontal durante 1 hora en el horno de

hibridación para favorecer la unión del ADN a la membrana.

- Se aspiró el contenido y se sacó la membrana del miniblotter.

- Se realizaron dos lavados sucesivos en el horno de hibridación a 40ºC durante

10 minutos mediante agitación horizontal con tampón 2x SSPE-0,5%,

previamente precalentado, para favorecer la eliminación de las uniones

inespecíficas creadas durante la fase de hibridación.

- Se incubó a 42ºC durante 30 minutos en una solución de Streptavidin POD

conjugate (500 unidades/ l; Roche Diagnostics; Alemania) diluida en tampón de

lavado 2x SSPE-0,5%.

- Se realizaron dos lavados con tampón 2x SSPE-0,5% SDS, con incubaciones a

42ºC durante 10 minutos, para favorecer la unión entre la estreptavidina y la

biotina.

- Se colocó la membrana extendida en un recipiente con tampón 2x SSPE y se

incubó a temperatura ambiente en agitación durante 5 minutos, dos veces.

- Se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente con sustrato

quimioluminiscente (SuperSignal West Duration Substrate; Pierce

Biotechnology; Estados Unidos) en un recipiente seco.

- Se expuso la membrana con la película Hiperfilm ECL (Amersham Pharmacia

Biotech, Reino Unido) durante 1 minuto.

- Se realizó el revelado de las placas en los correspondientes líquidos

fotográficos (revelador-agua-fijador-agua, durante 1 minuto en cada uno de

ellos).

La membrana se podía reutilizar hasta un máximo de ocho veces, para lo cual

era necesario eliminar los productos de PCR de las reacciones anteriores mediante los

siguientes pasos:

- Incubación de la membrana con SDS al 1% a 90ºC durante 30 minutos en un

baño con agitación. Este paso se repitió dos veces.

- Incubación a temperatura ambiente durante 10 minutos con EDTA 20 mM pH

8,0. Este paso se repitió dos veces.

- Almacenamiento cubierto de una nueva alícuota de EDTA 20 mM pH 8,0 a

4ºC.

Para confirmar los resultados obtenidos, se secuenciaron algunas de las muestras

en las que se había obtenido un resultado positivo tras la realización de la RLB. De esta

forma, se puso en evidencia que la reacción de PCR-RLB que se estaba empleando para

la detección de Bartonella spp. resultaba poco específica, ya que también se estaban

detectando otros agentes diferentes (ver detalles en el apartado 4.3.8 de resultados). Por

ese motivo se puso a punto una PCR de Bartonella spp. que amplificaba el gen citrato

sintasa (gltA) y que permitiría una posterior secuenciación para la identificación de la

especie de Bartonella detectada. Esta técnica consistía en una PCR en nido.

Para la realización de la primera PCR se emplearon los cebadores CS 140f (5´-

TTACTTATGATC(G y T)GG(C y T)TTTA-3´) (Birtles y Raoult, 1996) y BhCS1137n

(5´-AATGCAAAAAGAACAGTAAACA-3´) (Norman y cols., 1995), que amplifican

un fragmento de 1038 pares de bases. Se emplearon 150 ng de ADN en un volumen

final de 25 l y se añadieron 20 mM Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0,1

mM dNTP mix de cada una, 0,4 M cebadores y 1,5 U Taq polimerasa (Invitrogen;

Estados Unidos). La amplificación se llevó a cabo en un termociclador i-Cycler (Bio-

Rad; Francia) según el siguiente programa: 1 ciclo de 4 minutos a 94ºC, 35 ciclos de 10

segundos a 95ºC, 20 segundos a 50ºC, 50 segundos a 72ºC y una extensión final de 7

minutos a 72ºC (Birtles y Raoult, 1996).

Los cebadores empleados para la segunda PCR fueron BhCS781p (5´-

GGGGACCAGCTCATGGTGG-3´) y BhCS1137n (5´-

AATGCAAAAAGAACAGTAAACA-3´) (Norman y cols., 1995) que amplifican un

fragmento de 379 pares de bases. En este caso la reacción incluía, para un volumen final

de 25 l, 20 mM Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP mix de

cada una, 0,5 M cebadores, 0,4 U Taq Platinum (Invitrogen; Estados Unidos) y 5 l del

producto amplificado de la primera PCR. La amplificación se llevó a cabo en un

termociclador GeneAmp®PCR System 2700 (Applied Biosystems; Estados Unidos)

según el siguiente programa: 1 ciclo de 2 minutos a 95ºC, 35 ciclos de 30 segundos a

95ºC, 30 segundos a 51ºC, 30 segundos a 72ºC y una extensión final de 5 minutos a

72ºC.

Todas las muestras con un resultado positivo en esta PCR fueron secuenciadas

para confirmar el resultado e identificar la especie de Bartonella, y para ello se siguió el

protocolo general descrito en el apartado 3.4 de materiales y métodos. Cada reacción de

secuenciación se llevó a cabo con 75 ng de ADN del producto de PCR, con los

cebadores BhCS781p y BhCS1137n, según el siguiente patrón: 1 ciclo de 1 minuto a

96ºC y 30 ciclos de 10 segundos a 96ºC, 5 segundos a 51ºC y 4 minutos a 60ºC.

3.4.9.- Detección de Trichinella spp.

Para la detección de larvas de Trichinella spp. se empleó la técnica de la

digestión artificial de muestras de tejido muscular. La muestra de elección mínima a

analizar fueron los pilares del diafragma, aunque también se analizó una mezcla de la

musculatura de la base de la lengua, el músculo masetero y el músculo intercostal del

mismo animal, siempre que fue posible. En los cánidos, además de las muestras citadas,

también se analizó una mezcla de los músculos flexores y extensores de las

extremidades.

Para ello se empleó la técnica descrita por Gamble y cols. (2000), con algunas

modificaciones:

- Se trocearon 10 gr de muestra, cortando las fibras musculares en transversal,

dejando trozos de 0,5-1 cm aproximadamente y posteriormente se trituraron con

una picadora de carne.

- Se mezcló la muestra troceada con 1 gr de pepsina (Pepsin 1:10,000; Sigma-

Aldrich Química S.A.; Estados Unidos).

- Se precalentaron 200 ml de agua y 1 ml de HCl 37% a 45±1ºC.

- Se añadió la muestra mezclada con pepsina a la solución de digestión y se

incubó a 45±1ºC durante aproximadamente 30 minutos en un agitador

magnético hasta la disgregación total de la muestra.

- Se filtró la mezcla a través de un tamiz de 1 mm de diámetro y se dejó

decantando el líquido en un embudo con punta de goma y pinza de Hoffman,

durante aproximadamente 2 horas.

- Se recogieron 30 ml del sedimento y se examinaron en alícuotas de 5 ml en una

lupa binocular. Se realizó el recuento de todas las larvas de Trichinella spp.

observadas en los 30 ml de sedimento y los resultados se expresaron como el

número de larvas observadas por cada gramo de tejido muscular analizado (lpg).

Con todas las larvas recopiladas se llevó a cabo un estudio morfométrico al

microscopio óptico a 40 aumentos, siguiendo las claves de Soulsby (1982) y Cordero

del Campillo y cols. (1999).

En caso de no disponer de 10 gr de muestra, se modificaron las cantidades de los

reactivos empleados de forma proporcional.

3.4.10.- Identificación de ectoparásitos

3.4.10.1.- Garrapatas:

Las garrapatas se examinaron directamente en lupa estereoscópica (ninfas y

adultos) o montados en porta para su observación en microscopio óptico (larva), y se

clasificaron con la ayuda de claves taxonómicas generales y específicas (Nosek y Sixl,

1972; Gil-Collado y cols., 1979; Manilla, 1998).

3.4.10.2.- Pulgas y piojos:

La identificación de las pulgas la realizó el Dr. Jean-Claude Beaucournu de la

Facultad de Medicina de Rennes (Francia) y la identificación de los piojos se llevó a

cabo en colaboración con la Dra. Mª Paz Martín Mateo del Museo Nacional de Ciencias

Naturales (CSIC) de Madrid.

3.4.10.3.- Ácaros de la sarna:

Para la detección de los ácaros causantes de la sarna se aplicó una técnica

cualitativa para discriminar entre la presencia o la ausencia de ácaros parásitos

(Laboratorio Veterinario Central de Weybridge, 1971). De esta forma, se realizó un

raspado del trozo de piel recogido y se sumergió en una placa de petri pequeña con

hidróxido potásico 0,1 N. Se incubó a 37ºC durante un mínimo de 2 horas hasta que la

muestra se disgregó completamente. Después, se colocó una pequeña cantidad de ese

material en un porta, añadiendo un par de gotas de hidróxido potásico. Inmediatamente

se colocó un cubre y se presionó ligeramente para extender la muestra. Finalmente, se

examinó en el microscopio con el diafragma semicerrado o con el condensador bajo a

40 aumentos para lograr un mayor contraste y facilitar la detección de los ácaros. La

identificación de estos ectoparásitos se llevó a cabo también mediante claves específicas

(Walter, 1994).

3.4.11.- Identificación de endoparásitos

3.4.11.1.- Análisis coprológico:

El análisis coprológico se llevó a cabo a partir de las heces recogidas de la parte

final del recto, mediante la técnica cuantitativa de McMaster para el recuento de huevos

de nematodos, trematodos y cestodos, así como de ooquistes de coccidios (Laboratorio

Veterinario Central de Weybridge, 1971). El fundamento de esta técnica consiste en la

separación de los huevos de los restos fecales mediante la flotación diferencial en

soluciones de diversas densidades, ya que los huevos de helmintos tienen un peso

específico inferior al de la mayoría de los detritos fecales. Los pasos llevados a cabo

fueron los siguientes:

- Se homogeneizaron hasta 3 gr de heces en 42 ml de agua (o cantidades

proporcionales) mediante un digestor Stomacher®80 (Seward; Reino Unido).

- Se filtraron 5 ml a través de un tamiz de 1 mm de diámetro, depositándolos en

tubos de centrífuga de 10 ml.

- Se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 minutos y se desechó el sobrenadante.

- Se añadieron 5 ml de solución de yodomercuriato y se mezcló todo mediante

agitación en vórtex.

- Se llevaron 500 l de la mezcla a una celda de la cámara de McMaster. Ésta se

examinó al microscopio a bajos aumentos (10x), realizando el contaje

diferencial de los distintos tipos de huevos observados, siguiendo claves

específicas (Soulsby, 1982; Anderson y Salmon, 1984; Cordero del Campillo y

cols., 1999).

Además del recuento, en aquellos animales en los que se disponía de muestra de

heces suficiente, también se realizó la técnica de Baermann para la cuantificación e

identificación de larvas pulmonares (Laboratorio Veterinario Central de Weybridge,

1971). Este método consiste en inducir la migración de las larvas en agua durante un

mínimo de tiempo de 6 horas. El procedimiento que se llevó a cabo fue el siguiente:

- Se pesaron hasta 10 gr de heces y se colocaron en un tamiz de 1mm de

diámetro.

- El tamiz con las heces se colocó en la parte superior de un embudo lleno de

agua y en contacto con el tamiz. Además, el embudo estaba provisto de un

extremo de goma y cerrado mediante una pinza de Hoffman. Las larvas, al ser

muy activas y tener hidrotropismo positivo, abandonan las heces, pasan al agua

y por gravedad se depositan en el extremo de goma del embudo.

- Una vez transcurrido el tiempo previsto (mínimo 6 horas), se abrió la pinza y

se recogieron 10 ml en un tubo de ensayo, donde se dejaron sedimentar durante

30 minutos.

- Se eliminó el sobrenadante hasta dejar 0,5 ml de la mezcla y se homogeneizó

mediante agitación en vórtex para recoger 20 l.

- Este volumen se colocó entre porta y cubre con una gota de lugol para su

observación al microscopio óptico a distintos aumentos (10-40x). La

identificación de huevos, larvas y ooquistes se realizó en base a su tamaño,

color, forma y estructura, mediante claves especializadas (Soulsby, 1982;

Anderson, 2000).

El resultado del análisis coprológico se expresó como el número de huevos o

larvas observados por gramo de heces analizado (hpg o lpg).

3.4.11.2.- Identificación de endoparásitos recogidos durante la necropsia:

Se llevó a cabo la identificación, tanto morfológica como morfométrica, de los

ejemplares encontrados tras el examen del hígado y del sistema cardiorrespiratorio

durante la necropsia. Para ello, los parásitos se montaron entre porta y cubre con una

gota de lactofenol durante 12 horas, y después se visualizaron mediante microscopio

óptico a distintos aumentos (10-40x), según las correspondientes claves de

identificación morfológica (Guilhon y Cens, 1973; Soulsby, 1982; Janchev y Genov,

1988).

3.4.11.3.- Detección de Angiostrongylus spp.:

Para la identificación de Angiostrongylus spp. se llevó a cabo una PCR

siguiendo el protocolo descrito por Caldeira y cols. (2003), en la que se amplificó el

segundo espacio intergénico del rADN (ITS2).

La extracción y la cuantificación del ADN se llevó a cabo tal y como se describe

en el apartado 3.3.1 de materiales y métodos. En este caso, se empleó como muestra un

ejemplar adulto de Angiostrongylus sp., al que se le añadieron 200 l de tampón TE y la

cantidad proporcional del resto de componentes descritos en dicho apartado.

En la PCR se emplearon los cebadores NC1 (5´-

ACGTCTGGTTCAGGGTTGTT-3´) y NC2 (5´-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3´)

que amplifican un fragmento de 600-650 pares de bases. Se emplearon 150 ng de ADN

en un volumen final de 25 l y se añadieron 20 mM Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM KCl, 1,5

mM MgCl2, 0,2 mM dNTP mix de cada una, 0,75 M cebadores y 1,2 U Taq

polimerasa (Invitrogen; Estados Unidos).

La amplificación se llevó a cabo en un GeneAmp®PCR System 2700 (Applied

Biosystems; Estados Unidos) con el siguiente patrón: 1 ciclo de 90 segundos a 94ºC, 39

ciclos de 1 minuto a 58ºC, 90 segundos a 72ºC, 50 segundos a 94ºC y una extensión

final de 10 minutos a 72ºC.

Posteriormente, se llevó a cabo la electroforesis tal y como se describe en el

apartado 3.3.3 de materiales y métodos, empleando un gel de agarosa al 1,5% con un

marcador de peso molecular de 100 pares de bases (100 pb DNA Ladder; Invitrogen,

Estados Unidos) y sometiéndolo a 145V durante 50 minutos.

Las muestras positivas se sometieron a una reacción de secuenciación para

identificar la especie, siguiendo el procedimiento descrito en el apartado 3.3.4 de

materiales y métodos. Para ello se empleó 50 ng de ADN diana purificado y las

condiciones de la reacción de secuenciación fueron: 1 ciclo de 1 minuto a 96ºC, 30

ciclos de 10 segundos a 96ºC, 5 segundos a 58ºC y 4 minutos a 60ºC.

3.5- ANALÍTICAS COMPLEMENTARIAS:

En algunas ocasiones se contempló la necesidad de completar los estudios ya

realizados con técnicas adicionales, para profundizar en el estudio de algunas lesiones

observadas durante la realización de la necropsia.

3.5.1.- Estudio anatomopatológico:

A continuación se describe el procedimiento llevado a cabo para el procesado de

muestras histológicas (Bancroft y Stevens, 1982):

- Las muestras de tejido recogidas durante la necropsia fueron fijadas en formol

tamponado entre 24-48 horas.

- A continuación se tallaron seleccionando la zona afectada, cortando fragmentos

con un espesor de unos 2 mm con un bisturí, de forma que quedaban 2

superficies planas paralelas.

- Estos fragmentos se introdujeron en casetes plásticos que se mantuvieron en

formol hasta su procesado.

- El procesado consistió en una deshidratación, aclaración e infiltración en

parafina con un procesador automático (Excelsior, Termo Shandon, Reino

Unido). Los bloques de parafina se obtuvieron en la estación de parafinado

(Tissue-Tek TEC-5, Sakura, Japón).

- Tras solidificarse los bloques de parafina, se realizaron secciones de 4 m de

espesor en un microtomo (HM-350 Microm GmbH, Alemania). Estos cortes se

recogieron en portaobjetos y se secaron durante al menos 2 horas a 37ºC.

- Finalmente, se llevó a cabo la tinción de las secciones mediante Hematoxilina-

Eosina (Anexo 4), para el posterior estudio de las estructuras tisulares. Para ello,

primero se desparafinaron las secciones en xileno durante 20 minutos y después

se sometieron a una hidratación mediante su paso sucesivo por etanol de 100º,

95º, 60º y finalmente se hidrataron en agua, antes de proceder a la tinción con

solución acuosa de Hematoxilina-Eosina. Posteriormente, se volvieron a

deshidratar mediante su paso por soluciones de graduación creciente de etanol,

de 95º a 100º y xileno, antes de añadirles una gota de medio de montaje DPX y

cubrirlos con el cubreobjetos.

- Una vez secas, las preparaciones se examinaron en microscopio óptico

empleando los objetivos de 4 a 60 aumentos. En ocasiones, se realizaron nuevos

cortes y posteriores tinciones con los métodos de Ziehl-Neelsen, Gram o Pas

(Anexo 4).

3.5.2.- Cultivo microbiológico general:

En aquellos casos en los que se consideró necesario, se llevó a cabo un cultivo

en medios generales para el aislamiento de la mayor parte de las bacterias patógenas

(Quinn y cols., 1994):

- Se homogeneizó 1 gr de muestra de tejido en 9 ml de agua destilada estéril

mediante un Stomacher®80 (Seward; Reino Unido).

- A partir de esta mezcla se sembraron 20 l en agar sangre y otros 20 l en agar

McConkey.

- Las placas fueron incubadas durante 18-24 horas a 37ºC (±1).

- En función del tejido empleado, de las características de las lesiones y de las

características de las colonias, se realizó una primera clasificación presuntiva del

crecimiento obtenido tras la incubación.

-Posteriormente, se realizó la tinción de Gram (Anexo 4) y se observaron las

bacterias al microscopio óptico para su identificación.

En los casos en los que fue necesario, se llevaron a cabo pruebas bioquímicas

específicas o aislamientos en medios selectivos para la identificación de la bacteria

aislada.

3.5.3.- Cultivo microbiológico para aislamiento de hongos:

En otros casos se llevó a cabo un cultivo en medio de crecimiento específico

para hongos (Quinn y cols., 1994):

-Se homogeneizó 1 gr de muestra en solución salina (1:9) en un Stomacher®80

(Seward; Reino Unido).

- Se inocularon 10 l del homogenizado en una placa de agar Sabouraud-

cloranfenicol (bio-Mérieux; Francia).

- La placa se incubó a 24ºC durante 7-10 días.

- La identificación presuntiva de las colonias obtenidas se realizó mediante el

estudio de sus características morfológicas macro y microscópicas, estas últimas

tras su tinción del material de cultivo con azul de lactofenol (Anexo 4).

3.6.-ANÁLISIS DE DATOS:

Los datos relativos a cada animal, así como los resultados de todas las analíticas

realizadas, se introdujeron en una base de datos (Microsoft Access 2003) y en hojas de

cálculo (Microsoft Excel 2003), para finalmente llevar a cabo los análisis estadísticos

mediante el paquete informático SAS 9.1 (SAS Institute Inc., Estados Unidos).

Se aplicó la prueba de la probabilidad exacta de Fisher para analizar las

asociaciones de cada agente con diferentes niveles de las variables independientes

relativas a cada observación: especie animal, sexo, edad, localización y estación anual

en la que fueron recogidos. Debido a la necesidad de incrementar el poder estadístico en

las comparaciones realizadas, generada en muchas ocasiones por el bajo número de

animales que se pudieron muestrear, algunas de las variables independientes fueron

reagrupadas. Así, se comparó la prevalencia de cada patógeno en concreto en una

especie de carnívoro, con respecto a la prevalencia en el resto de las especies estudiadas

de forma agrupada, salvo en casos concretos (lo que está indicado al presentar los

resultados en la sección correspondiente). De igual forma, en las comparaciones

realizadas a nivel geográfico, los datos de una provincia concreta fueron comparados

con los datos agrupados del resto de provincias. Finalmente, los datos de cada estación

fueron comparados con las medias de los datos agrupados del resto de las estaciones de

año. En los casos necesarios, se realizaron las correcciones de comparaciones múltiples

correspondientes mediante la aplicación del test de Bonferroni (pB). El nivel general de

significación estadística fue el estándar de 5% (p< 0,05). Los valores no significativos

(n.s.) también se representaron en cada apartado.

Adicionalmente, se aplicó el análisis de regresión logística múltiple para tratar

de identificar la influencia de las variables independientes con posible efecto sobre la

frecuencia de cada agente: especie, sexo, edad, localización, estación anual, comarcas

naturales y carga ganadera (como el número de cabezas totales a nivel de comarca

ganadera) bovina, ovina-caprina, porcina, equina y aviar presentes en la zona (Eustat).

Además, se utilizó el programa de SIG (Sistema de Información Geográfica)

(ArcGis 9) para representar geográficamente la procedencia de los animales de este

estudio y las patologías asociadas.

RESULTADOS

4.- RESULTADOS:

4.1.- NÚMERO DE MUESTRAS:

4.1.1.- Número de cadáveres:

Se examinó un total de 215 ejemplares de carnívoros silvestres de 10 especies

diferentes agrupados en cuatro familias (Tabla 13). Las familias mejor representadas

fueron los mustélidos (59,5%) y los cánidos (31,2%), aunque también se estudiaron

ejemplares de vivérridos (6,5%) y félidos (2,8%). Con respecto a las especies, las más

numerosas fueron el tejón (34,9%) y el zorro (29,8%), y en menor medida la garduña

(12,1%), la marta (6,5%) y la gineta (6,5%). Las especies peor representadas fueron la

comadreja, el turón, el visón americano, el lobo y el gato montés, especies de las que se

procesaron solamente entre tres y seis ejemplares.

Tabla 13. Relación de carnívoros silvestres estudiados, agrupados en función de la familia y de la especie.

FAMILIA N (%) FAMILIA ESPECIE N (%) ESPECIE

Comadreja 5 (2,3) Garduña 26 (12,1)

Marta 14 (6,5) Tejón 75 (34,9) Turón 5 (2,3)

Mustelidae 128 (59,5)

Visón americano 3 (1,4) Lobo 3 (1,4)

Canidae 67 (31,2) Zorro 64 (29,8)

Viverridae 14 (6,5) Gineta 14 (6,5) Felidae 6 (2,8) Gato montés 6 (2,8) TOTAL 215 215

N (%): número y porcentaje de ejemplares.

La mayoría de los ejemplares fueron recogidos en Álava (50,7%), mientras que

el porcentaje de animales recogidos en Gipuzkoa (29,8%) y en Bizkaia (19,5%) fue

inferior (Fig. 3). A la hora de analizar los resultados, los ejemplares encontrados en el

condado de Treviño (Burgos) y Orduña (Bizkaia) se incluyeron junto con los individuos

hallados en la provincia de Álava, mientras que los individuos recogidos en una

provincia fuera de la CAPV, pero próximos a este límite, se incluyeron junto con los de

la provincia colindante.

Fig. 3. Localización geográfica de los ejemplares de carnívoros silvestres estudiados.

Atendiendo a la totalidad del periodo de estudio, la gran mayoría de los

cadáveres (73%) se obtuvieron entre los años 2003 y 2005, mientras que los recogidos

durante los años 2001, 2002 y 2006 fueron menos numerosos.

En cuanto a la época del año, la mayoría se recogieron durante los meses de

invierno (40,5%) y el resto en primavera (24,2%), otoño (19,5%) y verano (15,8%),

destacando los meses de enero y de febrero con el mayor número de recogidas (Fig.4).

0

5

10

15

20

25

30

35

40

Nº

eje

mp

lare

s

Mes

ENERO

FEBRERO

MARZO

ABRIL

MAYO

JUNIO

JULIO

AGOSTO

SEPTIEMBRE

OCTUBRE

NOVIEMBRE

DICIEMBRE

Fig. 4. Distribución del número de ejemplares estudiados atendiendo al mes de recogida.

Gato montés

Zorro

Visón americano

Tejón

Turón

Comadreja

Garduña

Lobo

Marta

Gineta

En la mayor parte de los casos (174) se obtuvieron cadáveres de animales

encontrados muertos o incluso de individuos enfermos que permanecieron un periodo

de tiempo variable en un centro de recuperación antes de su muerte. También se

recogieron cadáveres de especies cinegéticas abatidas durante la temporada de caza,

como fue el caso de 37 zorros y dos lobos. Además, se dispuso de dos ejemplares de

visón americano que fueron capturados vivos mediante jaulas-trampa y posteriormente

sacrificados en el marco del programa de conservación de las poblaciones de visón

europeo.

4.1.2.- Número de sueros:

Se recogieron 42 muestras de suero de carnívoros silvestres de seis especies

diferentes, pertenecientes a tres familias (Tabla 14). La mayoría pertenecían a

mustélidos (64,3%) y en menor número también se obtuvieron sueros de vivérridos

(26,2%) y de cánidos (9,5%).

Atendiendo a las especies, se obtuvo un mayor número de sueros de tejón, marta

y gineta, suponiendo cada una de ellas el 26,2% del total de las muestras, mientras que

de garduña, turón y zorro sólo se dispuso de un pequeño número de sueros, entre uno y

cuatro.

Tabla 14. Relación de sueros de carnívoros silvestres estudiados, agrupados en función de la familia y de la especie.

FAMILIA N(%) FAMILIA ESPECIE N (%) ESPECIE

Garduña 1 (2,4) Marta 11 (26,2) Tejón 11 (26,2)

Mustelidae 27 (64,3)

Turón 4 (9,5) Canidae 4 (9,5) Zorro 4 (9,5)

Viverridae 11 (26,2) Gineta 11 (26,2) TOTAL 42 42

N (%): número y porcentaje de sueros.

Con respecto a la procedencia de los animales, casi la totalidad de las muestras

de suero procedían de Álava (92,9%), ya que de Gipuzkoa y de Bizkaia solamente se

pudieron recoger dos y una muestras, respectivamente (Fig. 5). A la hora de analizar los

resultados, los sueros de aquellos ejemplares encontrados en el condado de Treviño

(Burgos) se incluyeron junto con los individuos hallados en la provincia de Álava.

Fig. 5. Localización geográfica de los sueros de carnívoros silvestres estudiados.

Atendiendo a la totalidad del periodo de estudio, la mitad de los sueros se

obtuvieron durante el año 2005 (50%), mientras que el 42,9% fueron recogidos entre los

años 2001, 2002 y 2006. Durante los años 2004 y 2003, sólo se recogieron dos y una

muestras, respectivamente.

Atendiendo a la época del año, el mayor número de muestras de suero se recogió

durante los meses de invierno (54,8%) y de otoño (30,9%), mientras que durante la

primavera y el verano sólo se recogieron cuatro y dos muestras, respectivamente. El

mayor número de sueros se obtuvo en febrero y marzo (Fig. 6).

0

2

4

6

8

10

12

Nº

suer

os

Mes

ENERO

FEBRERO

MARZO

ABRIL

MAYO

JUNIO

JULIO

AGOSTO

SEPTIEMBRE

OCTUBRE

NOVIEMBRE

DICIEMBRE

Fig. 6. Distribución del número de sueros estudiados atendiendo al mes de recogida.

Tejón

Zorro

Turón

Garduña

Marta

Gineta

4.2.- RESULTADOS DE NECROPSIA:

4.2.1.- Determinación de la edad y el sexo:

La determinación de la edad de los animales examinados durante la necropsia

reveló que el 70,8% eran adultos y el 29,2% jóvenes, aunque no se pudo determinar la

edad en 30 individuos. Con respecto al sexo, el 61,1% eran machos y el 38,9% hembras,

y no se registró el dato del sexo de cuatro animales.

En cuanto a las muestras de suero, dado que la mayoría de éstas fueron recogidas

en animales vivos que posteriormente fueron liberados, los datos referentes al sexo y a

la edad corresponden a las anotaciones realizadas por el remitente en la ficha del animal

(Anexo 1). El 62,5% de los sueros procedían de ejemplares adultos y el 37,5% de

jóvenes, aunque no se pudo determinar la edad en uno de los individuos. Atendiendo al

sexo, el 58,5% de los sueros eran de ejemplares machos, mientras que el 41,5% fueron

de hembras, y en este caso tampoco se dispuso del dato del sexo de uno de los

individuos.

4.2.2.- Determinación de la causa de la muerte:

La principal causa de muerte observada entre los animales encontrados muertos

o enfermos fueron los traumatismos (85,7%).

Tal y como queda reflejado en la Tabla 15, en la mayor parte de los casos se

trataron de atropellos (77,6%), pero en el 5,2% de los animales la muerte se produjo tras

quedarse atrapado en lazos o jaulas-trampa y en el 2,3% de los carnívoros por disparo.

Además, en un ejemplar se atribuyó la muerte a las lesiones por mordedura producidas

por otro animal.

El 9,8% de los animales murió a consecuencia de alguna enfermedad no traumática y

cinco (2,9%) ejemplares murieron por otras causas como inanición, intoxicación y

electrocución. No se pudo esclarecer la causa de la muerte de tres animales (1,7%).

Tabla 15. Clasificación de las distintas causas de muerte observadas, en función de la especie de los carnívoros silvestres encontrados muertos y/o enfermos.

ESP: especie animal; ENF: enfermedad; NO DET: no determinada; CO: comadreja; GA: garduña; GM: gato montés; GI: gineta; LO: lobo; MA: marta; TE: tejón; TU: turón; VA: visón americano; ZO: zorro; Atrop: atropello; Tr-lz: trampa-lazo; Disp: disparo; Mord: mordedura; Ina: inanición; Into: intoxicación; Elect: electrocución.

En este caso, no se ha realizado el análisis estadístico para determinar una

posible relación entre la causa de la muerte y la especie animal, puesto que la variable

definida (causa de la muerte) es una combinación de muchas otras, algunas de las cuales

presentan un sesgo claro. A modo de ejemplo, la mayor parte de los tejones se han

encontrado en la carretera, mientras que otras especies se encuentran más dispersas.

En el caso de los traumatismos como consecuencia de algún atropello, los

hallazgos más representativos durante la necropsia fueron la presencia de fracturas en

diferentes localizaciones: craneales, costales, en las extremidades, en las vértebras

cervicales y en la cadera, con presencia de hematomas en las zonas afectadas. Además,

en la mayoría de los casos, los órganos internos se encontraron desestructurados y

disgregados entre las cavidades torácica y abdominal, presentándose fuertes

hemorragias internas. En todos estos casos el hallazgo de los cadáveres junto a alguna

carretera o pista indicaba que el traumatismo había sido producido por atropello de

algún vehículo.

Algunos animales murieron a causa de la práctica ilegal de la colocación de

lazos-trampa y en algunos de estos casos la compresión producida por el lazo en la

cavidad torácica o abdominal fue suficiente para producir la muerte del animal como

consecuencia de las laceraciones provocadas a nivel costal o incluso en tráquea y

esófago (Foto 4). Otros animales presentaron signos de haberse quedado atrapados en el

lazo por alguna de las extremidades, lo cual posiblemente los inhabilitó para desplazarse

CAUSA DE LA MUERTE TRAUMATISMO OTROS ESP

Atrop. Tr-lz. Disp. Mord. ENF.

Ina. Into. Elect.

NO DET.

CO 1 1 1 - - 2 - - - GA 20 1 - - 3 - 1 - 1 GM 6 - - - - - - - - GI 10 - - - 3 - - 1 - LO - - - - 1 - - - - MA 13 - - - 1 - - - - TE 63 5 2 1 3 1 - - - TU 3 - 1 - 1 - - - - VA 1 - - - - - - - - ZO 18 2 - - 5 - - - 2

TOTAL (n=174)

135 (77,6%)

9 (5,2%)

4 (2,3%)

1 (0,6%)

17 (9,8%)

3 (1,7%)

1 (0,6%)

1 (0,6%)

3 (1,7%)

en busca de alimento o defenderse de situaciones adversas, y fueron hallados muertos o

moribundos en estado de extrema delgadez.

Foto 4. Perforaciones observadas en el tórax de un tejón como consecuencia de haber quedado atrapado en un lazo-trampa.

Además, una comadreja (0412110028) fue encontrada muerta en el interior de

una jaula colocada para la captura en vivo de ejemplares de visón americano. En este

caso, las observaciones realizadas durante la necropsia apuntaron a que la muerte del

animal pudo deberse a traumatismos sufridos al quedarse atrapado en la jaula, ya que se

observaron hematomas en la musculatura del tórax y del abdomen, coágulos en la

cavidad torácica y hemorragias a nivel pulmonar.

La muerte como consecuencia de un disparo se determinó en dos tejones

(0107930008 y 0111510020), una comadreja (0452260000) y un turón (0416020000).

En todos estos animales se observó la presencia de orificios bien definidos en la piel, así

como en los órganos internos, compatibles por los producidos por perdigones, que en

algunos casos fueron hallados en los propios tejidos del animal. La musculatura de la

zona afectada se encontraba hemorrágica y en algunos casos fueron visibles fracturas en

diferentes localizaciones.

En un tejón (0315611014) se observaron lesiones compatibles con las

producidas por la mordedura de otro animal. El animal presentaba perforaciones

alrededor del cuello y de la espalda, coincidiendo con hematomas internos en esas

localizaciones. También presentaba perforaciones en proceso de cicatrización en la zona

lumbar, así como desgarros y hematomas en la musculatura abdominal, con salida de

masa intestinal.

La enfermedad como primera causa provocó la muerte de 17 animales. En

algunos casos se llegó a diagnosticar la patología causante de la muerte del animal,

mientras que en otros únicamente se llegó a determinar la presencia de una serie de

factores que contribuyeron al debilitamiento y a la muerte del animal. En ocasiones, la

autolisis de los órganos internos impidió la realización de un diagnóstico más preciso.

Se determinó la muerte por moquillo en un tejón, en el que se observaron

lesiones típicas de esta enfermedad tras el estudio histopatológico (ver apartado 4.2.3.1).

Una marta murió por las fatales consecuencias producidas por una listeriosis

septicémica asociada a una infección respiratoria crónica (ver apartado 4.2.3.2) y en un

turón se observó una obstrucción intestinal producida por la ingestión de un trozo de

tela.

Tres ejemplares murieron como consecuencia de procesos tumorales: un linfoma

en una garduña (ver apartado 4.2.3.3), un adenocarcinoma intestinal en un tejón (ver

apartado 4.2.3.4) y un linfoma en una gineta (ver apartado 4.2.3.5).

Por otra parte, una gineta (0512170067) presentó lesiones de neumonía lipídica

endógena, además de lesiones de arteritis/vasculitis en el hígado, con engrosamiento de

la pared y ocasionalmente un infiltrado inflamatorio perivascular, asociadas a una

infección que no se llegó a determinar. En una garduña (0354100000) se evidenciaron

lesiones obstructivas en el pulmón, como consecuencia de una congestión intensa, con

edema alveolar, enfisema y atelectasia. En estos casos, a pesar de que estos resultados

no nos permitieron determinar la causa primaria de su estado, ambos animales

presentaban muy mal aspecto general, mostrando el pelo sucio, las mucosas pálidas, un

bajo índice de engrasamiento y el estómago vacío, hallazgos indicativos de una

inanición y debilidad prolongada que desembocaron en la muerte del animal.

En algunos de los animales estudiados se observó una alta tasa de parasitación,

habiéndose encontrado la mayoría de ellos en un estado de caquexia avanzada. Un zorro

(0323460000) presentó una elevada tasa de eliminación de parásitos, principalmente

capilarias. Además, tras el estudio histopatológico se observó que presentaba una ligera

gastritis crónica asociada a la presencia de numerosas bacterias de tipo bacilar, así como

zonas de nefritis intersticial a nivel renal.

Un lobezno (0336420000) presentó abundantes parásitos de Toxocara sp.

obstruyendo la luz intestinal, mientras que un zorro (0609430082) presentó un cuadro

respiratorio importante por la alta acumulación de gran número de larvas pulmonares.

En una gineta (0418650031) se evidenciaron lesiones tanto macroscópicas como

microscópicas causadas por parásitos, que consistieron en la presencia de múltiples

quistes parasitarios en la mucosa del estómago, así como áreas calcificadas y necróticas

en el intestino delgado, el hígado y el pulmón. Una garduña (0354100000) presentó una

intensa parasitosis provocada por nematodos en el pulmón y con la presencia ocasional

en el intestino delgado.

En un tejón (0118240033) se observaron lesiones compatibles con una

septicemia agravada por la masiva multiplicación de parásitos gastrointestinales

(principalmente por ancilostómidos y trematodos). Asimismo, en un zorro

(0524960074) se observó una bronconeumonía parasitaria asociada a una infección

bacteriana.

Además, se confirmó la muerte de dos zorros (0508080064 y 0124060049) por

sarna sarcóptica. Ambos presentaban lesiones compatibles de la enfermedad y se pudo

identificar el ácaro Sarcoptes scabiei.

Por otra parte, se confirmó la muerte por inanición en dos comadrejas

(0438650046 y 0441700049) y un tejón (0227220685). Se trataba de tres ejemplares

crías, que fueron hallados vivos y sin la presencia de ningún adulto en un estado de gran

debilidad y que murieron al poco tiempo de ser recogidos. Tras la necropsia no se

observaron lesiones macroscópicas ni microscópicas de ninguna patología, pero se pudo

confirmar que presentaban el estómago vacío.

En el caso de la garduña (0111850000) muerta por intoxicación se observó una

intensa congestión del estómago con presencia de gránulos similares a los observados

en el cebo que fue encontrado junto al individuo muerto. Las pruebas toxicológicas

realizadas consistieron en espectrometría ultravioleta del extracto clorofórmico y

detección de cianuro (Thier y Kirchhof, 1992) confirmando una intoxicación por un

plaguicida químico llamado carbamato, cuyo principio activo es el Aldicarb (Temik).

La gineta (0348010000) que murió por electrocución fue hallada en una

subestación eléctrica. El animal presentaba quemaduras en la piel y ausencia total de

pelo, además la musculatura presentaba un aspecto “cocido” y los órganos internos se

encontraban congestivos.

No se pudo determinar la causa de muerte de dos zorros (0438660047 y

0462100000) y una garduña (0442370053). Uno de los zorros llegó con sospecha de

ahogamiento y los otros dos ejemplares fueron encontrados vivos con sospecha de

envenenamiento, ya que presentaban signos de incoordinación motora, convulsiones y

dificultades para mantenerse de pie. En ninguno de estos casos se pudo confirmar tal

sospecha, aunque tampoco se hallaron evidencias de otro tipo de causa de muerte.

En el anexo 6 se representa, en un listado, el total de ejemplares y de sueros de

carnívoros silvestres estudiados, junto con la identificación correspondiente y algunos

datos de interés.

4.2.3.- Casos relevantes:

En este apartado se describen más detalladamente algunos casos que se

consideraron relevantes tras la realización de la necropsia y posteriores analíticas:

4.2.3.1.- Moquillo en un tejón:

Un ejemplar hembra y adulto de tejón (0249640691) fue encontrado con vida en

Álava, en octubre del año 2002 y fue remitido al centro de recuperación de Mártioda. El

animal presentaba una marcada sintomatología nerviosa, con convulsiones e

incoordinación motora y finalmente fue sacrificado tras presentar un resultado

serológico (Inmunofluorescencia indirecta) positivo frente al virus del moquillo.

El cadáver fue remitido a Neiker para confirmar la existencia de un cuadro de

moquillo. Tras la realización de la necropsia y posterior estudio histopatológico, se

observaron las lesiones especificadas en la Tabla 16.

Tabla 16. Lesiones macroscópicas y microscópicas más características observadas durante el estudio histopatológico del tejón.

LOCALIZACIÓN LESIONES MACROSCÓPICAS LESIONES MICROSCÓPICAS

Encéfalo No se aprecian lesiones significativas.

Encefalitis de tipo no purulento, principalmente localizada en la sustancia blanca, con desmielinización y degeneración axonal. Picnosis y degeneración neuronal en algunos casos. Perivasculitis intensa de carácter mononuclear (Foto 5 a).

Pulmón No se aprecian lesiones significativas.

Presencia de cuerpos de inclusión citoplasmáticos e intranucleares (Foto 5 b). Bronconeumonía purulenta crónica, con bronquiolos y alveolos parcialmente llenos de mucina, restos tisulares y algún neutrófilo.

Glándulas sebáceas No se aprecian lesiones significativas. Presencia de cuerpos de inclusión citoplasmáticos e intranucleares.

Estómago No se aprecian lesiones significativas. Infiltración leve de eosinófilos y células redondas en algunos puntos.

Intestino No se aprecian lesiones significativas. Discreta reacción inflamatoria perivascular de tipo mononuclear en la lámina propia.

Hígado No se aprecian lesiones significativas.

Presencia de cuerpos de inclusión citoplasmáticos e intranucleares. Congestión pasiva con dilatación de sinusoides. Perivasculitis de carácter moderado, principalmente en espacios porta.

Riñón No se aprecian lesiones significativas. Presencia de cuerpos de inclusión citoplasmáticos e intranucleares.

Foto 5. Lesiones microscópicas de moquillo en un tejón. (a) Encéfalo: encefalitis y perivasculitis. H-E (Hematoxilina Eosina) 200x; (b) Pulmón: cuerpos de inclusión intracitoplasmáticos e intranucleares. H-E 400x.

4.2.3.2.- Listeriosis septicémica asociada a una infección respiratoria

crónica en una marta:

Un ejemplar macho y adulto de marta (0509340065) fue encontrado vivo en

Álava, en febrero del 2005, en un estado de debilidad generalizada y murió a las pocas

horas de ser ingresado en el centro de recuperación de Mártioda.

Durante la necropsia se observó que presentaba un bajo índice de engrasamiento.

En la siguiente tabla se resumen las principales lesiones observadas, tanto

durante la necropsia como durante el estudio histopatológico (Tabla 17):

Tabla 17. Lesiones macroscópicas y microscópicas más características observadas durante el estudio histopatológico de la marta.


Cavidad torácica

Empiema con gránulos amarillentos y engrosamiento de las serosas del tórax con adherencias que afectan a linfonodos, pericardio y pleura visceral, formando una masa que ocupa la zona mediastínica (Foto 6 a).

Masa en el mediastino: acúmulos de bacilos filamentosos Gram negativos, con exudado inflamatorio alrededor, compuesto por neutrófilos, fibrina y macrófagos (Foto 6 b). Se aprecian quistes protozoarios en la masa (Foto 6 d).

Pulmón Adherencias con las serosas del tórax. Neumonía multifocal y pleuritis. Linfonodo

mediastínico Adherencias con las serosas del tórax. Mediastinitis.

Corazón Adherencias con las serosas del tórax. Pericarditis. Se aprecian quistes protozoarios.

Hígado Punteado blanquecino miliar por todo el parénquima. Lesiones necróticas asociadas a la presencia de cocobacilos Gram-positivos (Foto 6 c).

Riñón No se aprecian lesiones significativas. Émbolos bacterianos en glomérulos.

Bazo No se aprecian lesiones significativas. Pulpa blanca con escasa población de linfocitos. Con frecuencia se observan megacariocitos en la pulpa roja.

Músculo esquelético No se aprecian lesiones significativas. Fibras distendidas con material basófilo. Encéfalo No se aprecian lesiones significativas. No se aprecian lesiones significativas.

Se realizaron cultivos microbiológicos generales a partir de una muestra de la

masa mediastínica, el hígado, el pulmón y el riñón, en condiciones de aerobiosis y

anaerobiosis, para lograr el aislamiento y la identificación de las bacterias Gram

negativas y positivas observadas durante el estudio histopatológico. Se aislaron dos

tipos de colonias: por un lado cocobacilos Gram-positivos que se identificaron como

Listeria monocytogenes tanto bacteriológica como molecularmente (PCR) en muestras

a b

de masa mediastínica, hígado y pulmón (Bubert y cols., 1997). Por otro lado, se

observaron los bacilos Gram-negativos que no se lograron identificar con las técnicas

disponibles, incluyendo la PCR del gen 16S rARN y posterior secuenciación (Edwards

y cols., 1989).

El análisis serológico para la detección de anticuerpos de Toxoplasma gondii

mediante MAT, produjo un resultado positivo con un título alto (1:500) que se confirmó

mediante PCR (ver apartados 3.4.6. de materiales y métodos y 4.3.7. de los resultados).

Asimismo, se llevó a cabo el ensayo inmunocromatográfico para la detección de

anticuerpos frente al virus de la inmunodeficiencia felina (Ingezin FIV-Crom,

Ingenasa), que resultó ser negativo.

Foto 6. Lesiones macroscópicas y microscópicas de listeriosis septicémica asociada a una infección respiratoria crónica en una marta. (a) Engrosamiento de las serosas del tórax con adherencias que afectan a linfonodos, pericardio y pleura visceral y que forman una masa que ocupa la zona mediastínica; (b) Bacilos filamentosos Gram-negativos en masa. Gram 200x; (c) Cocobacilos Gram-positivos en hígado. Gram 200x; (d) Quiste protozoario en masa. H-E 600x.

Finalmente, se concluyó que la afección crónica del aparato respiratorio causada

por las bacterias Gram-negativas pudo haber sido el proceso primario que facilitara el

curso septicémico de la listeriosis, probablemente causa directa de la muerte.

a b

c d

Resultados

139

RESULTADOS

121

4.2.3.3.- Linfoma en una garduña:

Un ejemplar hembra y joven de garduña (0316471015) fue encontrado con vida

en Álava, en marzo del 2003, en un estado de debilidad generalizada. El animal murió a

las pocas horas de haber ingresado en el centro de recuperación.

Durante la necropsia se constató que se encontraba en un estado de caquexia

avanzada y se observaron las siguientes lesiones macroscópicas y microscópicas (Tabla

18):

Tabla 18. Lesiones macroscópicas y microscópicas más características observadas durante el estudio histopatológico de la garduña.


Timo Hipertrofia. Infiltrado de células de tipo linfoide muy manifiesto.

Pulmón Pequeñas lesiones neumónicas. Infiltrado de células de tipo linfoide poco manifiesto.

Intestino Adherencias con las serosas del tórax. Presencia de

tenias. Infiltrado de células de tipo linfoide poco manifiesto.

Bazo Intensa esplenomegalia (Foto 7 b). Infiltrado de células de tipo linfoide muy manifiesto.

Riñón Presencia de punteado blanquecino superficial. Infiltrado de células de tipo linfoide poco manifiesto.

Linfonodos Hipertrofia ganglionar generalizada (Foto 7 a). Infiltrado de células de tipo linfoide muy manifiesto (Foto 7 c).

Médula ósea No se aprecian lesiones significativas.Infiltrado de células de tipo linfoide muy manifiesto.

Piel Presencia de abundantes garrapatas. Infiltrado de células de tipo linfoide poco manifiesto.

Foto 7. Lesiones macroscópicas y microscópicas de linfoma en una garduña. (a) Hipertrofia de linfonodos superficiales; (b) Hipertrofia esplénica; (c) Nódulo linfático preescapular. Población difusa de células linfoides de pequeño tamaño. H-E 1000x; (d) Encéfalo. Vaso sanguíneo ocupado por células tumorales. H-E 400x.

a b

c d

Microscópicamente se observó un infiltrado de células de tipo linfoide en todos

los órganos, aunque con variable intensidad, siendo especialmente manifiesto en

linfonodos (Foto 7 c), timo, bazo y médula ósea. Las células tumorales aparecían

densamente agrupadas, separadas por escaso estroma conjuntivo y se caracterizaban, en

su mayoría, por tener un núcleo redondeado con cromatina intensamente teñida, escaso

citoplasma eosinofílico y escasas mitosis. Entre ellas, se encontraban algunas células de

tamaño más grande, de aspecto linfoblástico, con cromatina laxa y mayor cantidad de

citoplasma eosinófilo. En algunas zonas se observaba necrosis de las células tumorales.

Algunos vasos aparecían ocupados por células tumorales (Foto 7 d). Estas

características histológicas eran compatibles con un linfoma de tipo linfocítico, difuso y

de bajo grado de malignidad.

4.2.3.4.- Adenocarcinoma intestinal con metástasis al linfonodo regional

mesentérico en un tejón:

Un ejemplar hembra y adulto de tejón (0420800000) fue encontrado con vida en

Bizkaia, en el mes de abril del 2004 y fue trasladado al centro de recuperación de

Gorliz, donde murió a las pocas horas. El análisis coprológico realizado en el propio

centro de recuperación reveló la presencia de una alta tasa de parasitación por coccidios.

En la necropsia se observó que se encontraba en un estado acusado de

emaciación y con abundantes piojos (Trichodectes melis) por todo el cuerpo, así como

con manchas de heces de consistencia líquida alrededor del ano. Las lesiones

macroscópicas y microscópicas observadas, tanto durante la necropsia como durante el

estudio histopatológico, se detallan en la Tabla 19:



Intestino Pared intestinal alrededor del íleon engrosada. Adenocarcinoma intestinal con abundante fibrosis.

Linfonodo mesentérico

Consistencia compacta. Adenocarcinoma localizado en la zona medular.

Corazón Presencia de nematodos (Angiostrongylus daskalovi) en la unión de la arteria pulmonar y el ventrículo derecho.

Autolisis.

Pulmón No se aprecian lesiones significativas.

Bronconeumonía verminosa con la presencia de vermes en diferentes estadíos. Presencia de edema alveolar y fibrosis de los tabiques interalveolares.

Hígado No se aprecian lesiones significativas. Autolisis. Bazo No se aprecian lesiones significativas. Autolisis. Riñón No se aprecian lesiones significativas. Autolisis.

4.2.3.5.- Linfoma en una gineta:

Una hembra de gineta (0619603635) fue hallada en Bizkaia, en abril del 2006 y

fue remitida al centro de recuperación de Gorliz. La necropsia fue realizada por el

propio personal del centro de recuperación y únicamente se recibieron en Neiker

algunas vísceras en las que se observaron las lesiones descritas en la Tabla 20:

Tabla 20. Lesiones macroscópicas y microscópicas más características observadas durante el estudio histopatológico de la gineta. LOCALIZACIÓN LESIONES MACROSCÓPICAS LESIONES MICROSCÓPICAS

Tórax Líquido turbio y presencia de una masa de color blanquecino-amarillento.

Masa tumoral compuesta por linfocitos y linfoblastos.

Tráquea Presencia de una masa de color blanquecino-amarillento. No se aprecian lesiones significativas. Esófago Presencia de una masa de color blanquecino-amarillento. No se aprecian lesiones significativas.

Pulmón

Presencia de una masa de color blanquecino-amarillento. Atelectasia. Presencia de edema alveolar y de infiltrados linfocíticos y linfoblásticos en los tabiques interalveolares, pero principalmente subpleurales, formando nódulos linfoides.

Bazo Presencia de una masa de color blanquecino-amarillento. No se aprecian lesiones significativas.

Hígado Presencia de una masa de color blanquecino-amarillento. Folículos linfoides parenquimatosos,

principalmente perivasculares, aunque también subcapsulares.

Riñón Presencia de una masa de color blanquecino-amarillento. No se aprecian lesiones significativas. Útero Presencia de una masa de color blanquecino-amarillento. No se aprecian lesiones significativas.

Las lesiones se consideraron compatibles con un linfoma, si bien no fue posible

determinar el origen tímico o multicéntrico del mismo por la alteración anatómica de las

estructuras provocada por el tumor. Por un lado, podría tratarse de un linfoma tímico,

con extensión a pleura, siempre y cuando la masa tumoral estuviera localizada en el

tórax. Por otra parte, si la masa tumoral hubiese estado localizada en el abdomen, se

trataría de un nódulo linfático y en este caso el linfoma sería multicéntrico.

4.2.3.6.- Coccidioidomicosis en un tejón:

Un ejemplar hembra y adulto de tejón (0124060046) fue recogido muerto por

atropello en Álava, en junio del 2001.

Durante la necropsia se observó que se encontraba en muy mal estado de

condición corporal y que presentaba un politraumatismo craneal y de la columna

cervical. Asimismo, el individuo se encontraba parasitado por garrapatas (Ixodes

ricinus).

Las lesiones macroscópicas y microscópicas observadas, tanto durante la

necropsia como durante el estudio histopatológico, se detallan en la Tabla 21:



Pulmón Consistencia gomosa y presencia de un punteado miliar blanquecino de distribución generalizada y homogénea, sin exudado a la sección.

Neumonía intersticial y granulomatosa de carácter crónico, con presencia de granulomas con una esférula central. En ocasiones la esférula presentaba endosporas en su interior, compatibles morfológicamente y morfométricamente con el hongo Coccidioides

immitis. Presencia de nematodos.

Linfonodos Los nódulos linfáticos mediastínicos y el bronquial izquierdo compactados, duros y aumentados de tamaño.

No se aprecian lesiones significativas.

Bazo Esplenomegalia. Ligeramente reactivo, hemosiderosis. Hígado Pequeños focos de necrosis dispersos. No se aprecian lesiones significativas.

Intestino Contenido mucoso. Presencia de parásitos. Intensa autolisis. Riñón No se aprecian lesiones significativas. No se aprecian lesiones significativas.

En el cultivo microbiológico general y de hongos, a partir de muestras de

pulmón, se aislaron las bacterias Escherichia coli y Streptococcus sp. (alfa-hemolítico).

El hallazgo más interesante fue el aislamiento de un hongo cuyas colonias medían 1 cm

de diámetro, eran de color blanco, algodonosas y de reverso amarillento. La

identificación morfológica reveló la presencia de micelio con artrosporas en forma de

barril, que aparecían de forma alterna. Tras llevar a cabo el diagnóstico diferencial con

los hongos Malbranchia y Gymnoascus en medio con cicloheximida (Fungisel), se

consiguió identificar el hongo dimórfico Coccidioides immitis.

Esta identificación se confirmó posteriormente mediante técnicas moleculares

específicas para la detección de Coccidioides immitis, por la amplificación del gen csa

(Pan y Cole, 1995), que arrojó un resultado claramente positivo, confirmado finalmente

mediante secuenciación.

4.2.4. Otros hallazgos observados en la necropsia:

En algunos casos, a pesar de no haber causado la muerte directa de los animales,

ni de tratarse de agentes de especial interés a nivel patológico, se observaron lesiones en

los órganos internos que llamaron la atención durante la necropsia y se aislaron

diferentes tipos de microorganismos a partir de muestras tisulares de estos individuos

(Tabla 22).

Se trataba, en la mayoría de los casos, de animales que murieron como

consecuencia de un traumatismo por atropello, aunque la causa de muerte en un tejón y

en una gineta fue por enfermedad. Así, en dos tejones y en una gineta se observaron

lesiones en el pulmón durante la necropsia. En uno de los tejones (01018240033) se

diagnosticó neumonía intersticial y se aisló la bacteria Streptococcus equi

zooepidemicus, mientras que el otro tejón (01018680037), que murió como

consecuencia de una septicemia agravada por una masiva multiplicación de parásitos, se

diagnosticó una neumonía granulomatosa y se aislaron los microorganismos Penicillium

sp. y Paecilomyces sp. En la gineta (04018650031), muerta como consecuencia de la

intensa parasitación a nivel respiratorio y digestivo, se observaron lesiones de

atelectasia y enfisema, típicos de una neumonía y se aisló la bacteria Pseudomona

aeruginosa. En dos tejones (04023520000 y 04025350035), que presentaron secreción

purulenta en el útero, se aislaron las bacterias Proteus sp. y Escherichia coli en ambos.

Tabla 22. Diversos aislamientos microbiológicos obtenidos a partir de lesiones sospechosas en algunos carnívoros silvestres.

4.3.- DETECCIÓN DE AGENTES ZOONÓTICOS DE INTERÉS:

4.3.1.- DETECCIÓN DE Salmonella spp.

La prevalencia global de la infección por Salmonella spp. fue del 9,2% en los

206 animales en los que se investigó esta bacteria (Tabla 23).

Atendiendo a las especies estudiadas, si bien no se observaron diferencias

estadísticamente significativas (p>0,1 n.s.), se detectó la mayor proporción de

resultados positivos (20%) en la comadreja y el turón. En la garduña y el tejón se

observaron porcentajes de infección del 16% y 11,3% respectivamente, mientras que los

porcentajes más bajos los presentaron la gineta (7,7%), la marta (7,1%) y el zorro

(4,8%). No se aisló Salmonella spp. a partir de ninguna de las muestras de visón

americano, lobo y gato montés estudiadas, si bien el número de muestras fue muy

pequeña (menor de seis).

Nº IDENTIFICACIÓN

ESPECIE CAUSA MUERTE LESIONES AISLAMIENTO

01018240033 Tejón Traumatismo

(atropello) Pulmón: neumonía intersticial

Streptococcus equi

zooepidemicus

01018680037 Tejón Enfermedad Pulmón: neumonía granulomatosa

Penicillium sp., Paecilomyces sp.

04018650031 Gineta Enfermedad Pulmón: atelectasia, enfisema Parásitos digestivos y respiratorios

Pseudomona aeruginosa


(atropello) Útero: secreción purulenta Proteus sp., Escherichia coli


(atropello) Útero: secreción purulenta Proteus sp., Escherichia coli

Tabla 23. Aislamientos de Salmonella spp. obtenidos a partir de las muestras de las diferentes especies de carnívoros silvestres. FAMILIA ESPECIE N POS (%) SEROTIPO

Tejón 71 8 (11,3) Salmonella sp.**, Coeln*, Arapahoe, Give, Heidelberg, Newport, Umbilo

Garduña 25 4 (16) Typhimurium, Thompson, 9,12:a:1,5* Marta 14 1 (7,1) 9,12:a:1,5

Comadreja 5 1 (20) Enteritidis Turón 5 1 (20) Veneziana

Mustelidae

Visón americano

3 0

Total Mustelidae 123 15 (12,2) Zorro 62 3 (4,8) Enteritidis*, Typhimurium

Canidae Lobo 2 0

Total Canidae 64 3 (4,7) Viverridae Gineta 13 1 (7,7) Salmonella sp.**

Total Viverridae 13 1 (7,7)

Felidae Gato

montés 6 0

Total Felidae 6 0 TOTAL 206 19 (9,2)

N: número de individuos analizados; POS (%): número y porcentaje de aislamientos obtenidos. * Dos individuos de la misma especie presentaron el mismo serotipo. **No se pudo determinar el serotipo.

No se observaron diferencias estadísticamente significativas en cuanto a la edad

(p=0,6 n.s.) y el sexo (p=0,4 n.s.) de los animales positivos a Salmonella spp., ya que se

aisló la bacteria en un número similar de individuos adultos (8,5%) y jóvenes (7,8%),

así como de machos (9,7%) y de hembras (7,6%).

Se observó un mayor número de positivos en individuos recogidos en Bizkaia

(15,4%; p=0,1 n.s.), que en Gipuzkoa (8,2%; p=0,5 n.s.) y Álava (7,5%; p=0,3n.s.) (Fig.

7).

Se aisló Salmonella spp. a lo largo de todo el año, sin embargo, el mayor número

de individuos positivos se encontró en verano (27,3%), siendo esta diferencia

estadísticamente significativa en relación con los ejemplares positivos encontrados el

resto del año (p=0,0007).

El análisis de regresión logística llevado a cabo con la prevalencia de este

patógeno se realizó considerando la variable estación agrupada en dos categorías

(verano y resto), proporcionando un modelo significativo en el que la Odds ratio entre el

verano y el resto de las estaciones fue de 7,8 (intervalo de confianza del 95%:

2,6÷23,7).

Fig. 7. Localización geográfica de los ejemplares con aislamiento de Salmonella spp. positivo y negativo

Se identificaron 11 serotipos pertenecientes a la especie S. enterica. Los más

frecuentemente aislados, en tres ocasiones, fueron Enteritidis y el serotipo 9.12:a:1.5

compatible con Miami y Sendai. El serotipo Typhimurium se aisló en dos ocasiones,

mientras que el resto de serotipos (Coeln, Arapahoe, Give, Heidelberg, Newport,

Umbilo, Thompson y Veneziana) se aislaron en una única ocasión (Tabla 23). Los

serotipos Enteritidis y Typhimurium, causantes de brotes en el ser humano más

frecuentemente, se aislaron únicamente en muestras de garduña, comadreja y zorro.

El tejón fue la especie en la que se aislaron el mayor número de serotipos

distintos, ya que en los ocho aislamientos obtenidos en este mustélido, se identificaron

seis serotipos diferentes.

No se observaron lesiones macroscópicas ni microscópicas compatibles con una

salmonelosis en ninguno de los animales positivos.

4.3.2.- DETECCIÓN DE Yersinia spp.

Se aisló Yersinia spp. en el 5,8% de los 173 casos estudiados (Tabla 24).

Los porcentajes de infección más elevados se observaron en el gato montés

(20%) y en la gineta (11,1%), mientras que en la garduña (8,3%), el zorro (5,7%) y el

tejón (5,4%) la frecuencia fue inferior. No se aisló Yersinia spp. a partir de ninguna de

las muestras de comadreja, turón, visón americano, lobo y de marta estudiados, aunque

estas diferencias no fueron estadísticamente significativas (p>0,2 n.s.).

Tabla 24. Aislamientos de Yersinia spp. obtenidos a partir de las muestras de las diferentes especies de carnívoros silvestres.

FAMILIA ESPECIE ANIMAL N POS (%) ESPECIE DE Yersinia sp. Tejón 56 3 (5,4) Y. enterocolitica

Garduña 24 2 (8,3) Y. enterocolitica, Yersinia sp.* Marta 12 0

Comadreja 5 0

Turón 5 0

Mustelidae

Visón americano 2 0 Total Mustelidae 104 5 (4,8)

Zorro 53 3 (5,7) Y. enterocolitica Canidae

Lobo 2 0 Total Canidae 55 3 (5,5)

Viverridae Gineta 9 1 (11,1) Yersinia sp.* Total Viverridae 9 1 (11,1)

Felidae Gato montés 5 1 (20) Y. pseudotuberculosis Total Felidae 5 1 (20)

TOTAL 173 10 (5,8) N: número de individuos analizados; POS (%): número y porcentaje de aislamientos obtenidos. *No se pudo identificar la especie.

No se observaron diferencias estadísticamente significativas en cuanto a la edad

(p=0,08 n.s.) y el sexo (p=0,6 n.s.) de los ejemplares positivos, si bien el porcentaje de

jóvenes infectados era mayor (12,5%) frente al 4,4% de los adultos. El porcentaje de

individuos machos y hembras positivos fue idéntico (5,8%; p=0,6 n.s.).

Con respecto al lugar de procedencia, una frecuencia similar de individuos

recogidos en Álava (4,9%; p=0,5 n.s.), Bizkaia (6,5%; p=0,6 n.s.) y Gipuzkoa (6,6%;

p=0,5 n.s.) presentó resultado positivo (Fig. 8).

Por otra parte, únicamente se aisló Yersinia spp. en ejemplares recogidos durante

los meses de invierno (12,9%) y otoño (2,8%). En este caso, las diferencias fueron

estadísticamente significativas en cuanto a los ejemplares recogidos durante la época

invernal con respecto al resto de las estaciones (p=0,001).



(invierno y resto), proporcionando un modelo significativo en el que la Odds ratio

(O.R.) entre los individuos jóvenes y adultos fue de 4 (intervalo de confianza del 95%:

1÷15,9) y la O.R. entre los individuos recogidos durante el invierno y el resto de las

estaciones fue de 14,4 (intervalo de confianza del 95%: 1,7÷119,9).

Fig. 8. Localización geográfica de los ejemplares con aislamiento de Yersinia spp. positivo y negativo

Se identificaron dos especies diferentes de Yersinia, siendo Y. enterocolitica la

especie más frecuentemente aislada, concretamente en tres tejones, tres zorros y una

garduña, mientras que Y. pseudotuberculosis únicamente se aisló en un gato montés.

No se observaron lesiones macroscópicas ni microscópicas compatibles con una

yersiniosis en ninguno de los animales positivos.

4.3.3.- DETECCIÓN DE Mycobacterium spp.

Se aislaron micobacterias en dos de los 172 ejemplares analizados (1,2%) (Tabla

25). Únicamente se aislaron micobacterias a partir de muestras de tejón, lo que supone

el 3,5% de los tejones estudiados y el 2% del total de mustélidos.

Por lo que respecta a los dos ejemplares de tejón que presentaron micobacterias,

uno de ellos (0329740000) era una hembra de edad indeterminada, que murió por un

traumatismo como consecuencia de un atropello durante la primavera del año 2003 en

Bizkaia. El otro individuo (0514970071) era un macho adulto que también murió

atropellado durante la primavera del año 2005 en la provincia de Álava (Fig. 9).

A la vista de los escasos resultados obtenidos no fue posible llevar a cabo

ninguna valoración estadística.

Tabla 25. Aislamientos de Mycobacterium spp. obtenidos a partir de las muestras de las diferentes especies de carnívoros silvestres.

FAMILIA ESPECIE ANIMAL

N POS (%) ESPECIE DE Mycobaterium sp.

Tejón 57 2 (3,5) Mycobacterium intracellulare,

Mycobacterium avium subsp. hominissuis Garduña 22 0

Marta 12 0 Comadreja 3 0

Turón 4 0

Mustelidae

Visón americano 2 0 Total Mustelidae 100 2 (2)

Zorro 56 0 Canidae

Lobo 1 0 Total Canidae 57 0

Viverridae Gineta 10 0 Total Viverridae 10 0

Felidae Gato montés 5 0 Total Felidae 5 0

TOTAL 172 2 (1,2) N: número de individuos analizados; POS (%): número y porcentaje de aislamientos obtenidos.

Fig. 9. Localización geográfica de los ejemplares con aislamiento de micobacterias positivo y negativo

Las colonias de micobacterias obtenidas de ambos animales se analizaron

mediante técnicas de PCR para la identificación de la especie. En las dos muestras se

descartó que se tratara de micobacterias del CMT, M. avium subsp. paratuberculosis,

M. avium subsp. avium y M. avium subsp. silvaticum. Sin embargo, en uno de los casos

se pudo identificar la especie M. intracellulare (Centro Nacional de Microbiología,

Instituto de Salud Carlos III, Madrid) y el otro fue identificado como M. avium subsp.

hominissuis mediante PCR (Bartos y cols., 2006).

En ninguno de los dos casos positivos se observaron lesiones macroscópicas ni

microscópicas compatibles con una tuberculosis.

4.3.4.- DETECCIÓN DE LA PROTEÍNA PRIÓNICA PATOLÓGICA

Se analizaron 133 muestras pertenecientes a cuatro familias y 10 especies

diferentes de carnívoros, la mayoría correspondientes a muestras de zorro (39,8%) y de

tejón (36,8%) (Tabla 26). Todas las muestras fueron negativas a la detección de la

proteína priónica patológica.

Tabla 26. Detección de la proteína priónica patológica (PrPsc).

FAMILIA ESPECIE N POS (%) Tejón 49 0

Garduña 9 0 Marta 6 0

Comadreja 2 0 Turón 2 0

Mustelidae

Visón americano 1 0 Total Mustelidae 69 0

Zorro 53 0 Canidae

Lobo 2 0 Total Canidae 55 0



TOTAL 133 0 N: Número de individuos analizados. POS (%): número y porcentaje de muestras positivas obtenidas.

A la vista de los resultados obtenidos no fue posible llevar a cabo ninguna

valoración estadística.

4.3.5.- DETECCIÓN DE Leptospira spp.

Se analizaron muestras de suero de 39 animales y en 24 (61,5%) se detectaron

anticuerpos frente al menos un serovar (Tabla 27). Se observaron anticuerpos frente a

leptospiras en todas las especies y familias animales estudiadas.

Así, presentaron anticuerpos todos los ejemplares de garduña y de turón

estudiados, si bien se analizaron sólo uno y cuatro ejemplares, respectivamente. En el

resto de las especies, más de la mitad de los ejemplares de marta, gineta y zorro

estudiados presentaron anticuerpos (72,7%, 60% y 50%, respectivamente), mientras que

los porcentajes más bajos se obtuvieron en el tejón (33,3%). Las frecuencias halladas en

las distintas especies no fueron significativamente diferentes en ningún caso (p 0,06

n.s.).

Tabla 27. Detección de anticuerpos frente a diferentes serovares de Leptospira spp. a partir de las muestras de las diferentes especies de carnívoros silvestres. FAMILIA ESPECIE N POS (%) bratis muen ictero cani

Tejón 9 3 (33,3) 3 1 0 0 Garduña 1 1 (100) 1 1 0 0

Marta 11 8 (72,7) 8 3 1 0 Mustelidae

Turón 4 4 (100) 4 2 1 0 Total Mustelidae 25 16 (64) 16 7 2 0

Canidae Zorro 4 2 (50) 2 2 1 1 Total Canidae 4 2 (50) 2 2 1 1

Viverridae Gineta 10 6 (60) 6 0 0 0 Total Viverridae 10 6 (60) 6 0 0 0

TOTAL 39 24 (61,5) 24 (61,5%) 9 (23,1%) 3 (7,7%) 1 (2,6%) N: número de individuos analizados; POS (%): número y porcentaje global de muestras positivas obtenidas, así como para cada serovar estudiado; bratis: bratislava, muen: muechen, ictero:

icterohaemorrhagiae, cani: canicola.

Un número similar de individuos adultos (62,5%) y jóvenes (57,1%) presentaron

anticuerpos (p=0,5 n.s.), mientras que el porcentaje fue más elevado en las hembras

(76,5%) que en los machos (47,6%) (p=0,07 n.s.).

El 59,5% de las muestras recogidas en Álava fueron positivas frente al resto

(p=0,3 n.s.). De Bizkaia y de Gipuzkoa únicamente se pudo estudiar un suero de cada

una de las provincias y en ambos casos el resultado fue positivo (p=0,6 n.s. en ambos

casos) (Fig. 10).

Los porcentajes más altos se observaron durante los meses de invierno (76,2%;

p=0,2 n.s.), otoño (50%; p=0,3 n.s.) y verano (50%; p=0,6 n.s.), mientras que durante la

primavera únicamente mostraron anticuerpos el 25% (pB=0,2 n.s.) de los ejemplares

estudiados.


patógeno se realizó considerando las variables que se describen en el apartado de

materiales y métodos. En este caso, ninguna de las variables incluidas en el modelo

final tuvo una influencia significativa.

Fig. 10. Localización geográfica de los ejemplares con presencia y ausencia de anticuerpos frente a Leptospira sp.

Los mayores porcentajes de positividad correspondieron al serovar bratislava

(61,5%), seguido del serovar muenchen (23,1%) y en menor medida frente a

icterohaemorrhagiae (7,7%) y canicola (2,6%). Ninguna muestra fue positiva frente a

los serovares hardjo, pomona y grippotyphosa. Asimismo, el serovar bratislava se

detectó en las seis especies de carnívoros estudiadas, el serovar muenchen en cinco e

icterohaemorragiae en tres. El serovar canicola sólo se detectó en el suero de un zorro.

El 72,5% de los sueros positivos presentaron una titulación 1:400, mientras

que el 27,5% restante presentaron una titulación mayor, con valores comprendidos entre

1:800 y 1:12800. Los títulos más altos se observaron en una garduña y en un turón, y

correspondían al serovar bratislava.

Se observaron reacciones de aglutinación frente a más de un serovar en el 46,2%

de las muestras positivas. Por una parte, lo más frecuente fue observar anticuerpos

frente a dos serovares (83,3%), la mayoría frente a bratislava y muenchen, aunque en

una marta se detectaron frente a bratislava e icterohaemorrhagiae. Por otra parte, en un

zorro se detectaron anticuerpos frente a cuatro serovares (bratislava, muenchen,

canicola e icterohaemorrhagiae) y en un turón frente a tres (bratislava, muenchen e

icterohaemorrhagiae).

4.3.6.- DETECCIÓN DE ANTICUERPOS FRENTE A Toxoplasma gondii

Se analizaron los sueros de 40 animales mediante MAT y se observaron

anticuerpos frente a T.gondii en el 72,5% de las muestras estudiadas (Tabla 28).

En cuanto a las familias animales implicadas, todas ellas presentaron unos

porcentajes de infección superiores al 60%, habiéndose observado anticuerpos en las

seis especies de carnívoros estudiadas. El porcentaje de positivos más elevado se

observó en la gineta (80%), mientras que el más bajo fue detectado en el turón (50%).

En ningún caso las diferencias de prevalencia entre las distintas especies fueron

estadísticamente significativas (p>0,2 n.s.).

Tabla 28. Detección de anticuerpos frente a T. gondii en las distintas especies de carnívoros silvestres. FAMILIA ESPECIE N POS (%)

Tejón 10 7 (70) Garduña 1 1 (100)

Marta 11 8 (72,7) Mustelidae

Turón 4 2 (50) Total mustelidae 26 18 (69,2)

Canidae Zorro 4 3 (75) Total Canidae 4 3 (75)

Viverridae Gineta 10 8 (80) Total Viverridae 10 8 (80)

TOTAL 40 29 (72,5) N: número de individuos analizados; POS (%): número y porcentaje de muestras positivas.

Se obtuvo resultado positivo en un número significativamente mayor de

individuos adultos (83,3%) que de jóvenes (50%) (p=0,04). En cuanto al sexo, los

porcentajes fueron similares tanto para los machos (72,7%) como para las hembras

(70,6%) (p=0,6 n.s.).

Prácticamente la totalidad de las muestras que se recogieron en Álava (73%)

resultaron ser positivas, pero sin que la prevalencia fuese significativamente distinta de

las otras dos provincias (p=0,6 n.s.). Asimismo, las dos únicas muestras recogidas en

Gipuzkoa fueron positivas (p=0,5 n.s.), mientras que la única muestra de Bizkaia resultó

ser negativa (p=0,3 n.s.) (Fig. 11).

Los porcentajes de infección más altos se observaron durante el verano (100%) e

invierno (90,5%), ya que durante el resto del año el porcentaje de seropositividad fue

inferior al 60%. En este caso, se observaron diferencias estadísticamente significativas

entre la prevalencia de los individuos recogidos durante la época invernal y la de los

ejemplares recogidos durante el resto de las estaciones (pB=0,04).



(invierno y resto), proporcionando un modelo significativo en el que la Odds ratio entre

los individuos recogidos durante el invierno y el resto de las estaciones fue de 9

(intervalo de confianza del 95%: 1,6÷50,7).

Fig. 11. Localización geográfica de los ejemplares que presentaron anticuerpos o no frente a T. gondii.

El 79,3% de los sueros positivos presentó títulos 1:100, mientras que el 20,7%

restante tenían títulos 1:25 y 1:50.

4.3.7.- DETECCIÓN DE ADN DE Toxoplasma gondii

Se analizaron un total de 193 muestras y se detectó la infección por T. gondii en

el 8,8% de los animales estudiados en, al menos, uno de los tejidos analizados (Tabla

29).

Con respecto a las especies animales implicadas, se detectó T. gondii en todas

las especies estudiadas salvo en el lobo, y los mayores porcentajes de positividad se

obtuvieron en la marta (38,5%) y en el gato montés (33,3%). Asimismo, uno de los dos

ejemplares de visón americano analizados también fue positivo. La prevalencia en el

turón fue del 20% y en el resto de especies inferior al 10%, siendo el valor de

prevalencia más bajo el del zorro (1,6%). En este caso, fue la marta la especie que

presentó una mayor significación estadística en su diferencia de prevalencia con el resto

de las especies animales (pB=0,02).

Tabla 29. Detección del parásito T. gondii mediante PCR.

FAMILIA ESPECIE N ANIMAL POS (%) N CZ CZ (%) N CB CB (%) N INT INT (%) Tejón 70 4 (5,7) 65 2 (3,1) 47 2 (4,3) - -

Garduña 21 2 (9,5) 18 1 (5,6) 13 1 (7,7) - -

Marta 13 5 (38,5) 13 5 (38,5) 6 1 (16,7) - -

Turón 5 1 (20) 5 1 (20) 2 0 - -

Mustelidae

Visón americano

2 1 (20) 1 0 2 1 (50) - -

Total Mustelidae 111 13 (11,7) 102 9 (8,8) 70 5 (7,1) - - Zorro 62 1 (1,6) 61 1 (1,6) 53 1 (1,9) - -

Canidae Lobo 3 0 3 0 2 0 - -

Total Canidae 65 1 (1,5) 64 1 (1,6) 55 1 (1,8) - - Viverridae Gineta 11 1 (9,1) 11 1 (9,1) 6 1 (16,7) - -

Total Viverridae 11 1 (9,1) 11 1 (9,1) 6 1 (16,7) - -

Felidae Gato

montés 6 2 (33,3) 6 1 (16,7) 4 0 3 1

Total Felidae 6 2 (33,3) 6 1 (16,7) 4 0 3 1 (33,3) TOTAL 193 17 (8,8) 183 12 (6,6) 135 7 (5,2) 3 1 (33,3)

N ANIMAL: Número de individuos analizados; POS (%): número y porcentaje de animales positivos. Número y porcentaje de muestras de corazón (N CZ; CZ%), cerebro (N CB; CB%) e intestino (N INT; INT%) analizados y con resultado positivo.

El 11,6% de los ejemplares jóvenes fueron positivos frente al 8,3% de los

adultos (p=0,4 n.s.). El 12,2% de las hembras resultaron ser positivas frente al 6,8% de

los machos (p=0,2 n.s.).

En cuanto al lugar de recogida de los animales, se observó un número similar de

individuos positivos en las tres provincias: 7,7% en Bizkaia (p=0,5 n.s.), 8,2% en

Gipuzkoa (p=0,5 n.s.) y 9,7% en Álava (p=0,4 n.s.) (Fig. 12).

Con respecto a la época en la que se recogieron, se encontró un mayor número

de individuos infectados durante los meses de otoño (13,9%; p=0,2 n.s.), que en

invierno (9,1%; p=0,6 n.s.) y primavera (7,8%; p=0,5 n.s.), mientras que durante el

verano sólo el 3,4% (p=0,2 n.s.) de los ejemplares presentaron resultado positivo.


patógeno se realizó considerando la variable especie agrupada en dos categorías (marta

y resto), proporcionando un modelo significativo en el que la Odds ratio entre la marta y

el resto de las especies fue de 7,3 (intervalo de confianza del 95%: 1,9÷28,9).

Fig. 12. Localización geográfica de los ejemplares con resultado positivo y negativo frente a T.

gondii, detectados mediante PCR.

En lo concerniente a los tejidos analizados, se obtuvieron resultados positivos en

el 6,6% de las muestras de corazón, en el 5,2% de las muestras de cerebro y en una de

las tres muestras de intestino analizadas (Tabla 29). Por otra parte, se detectó la

presencia de T. gondii en el 80% de las muestras de corazón y en el 58,3% de las

muestras de cerebro de los 17 animales positivos (Tabla 30).

Tabla 30. Relación de muestras adicionales estudiadas por PCR y resultados obtenidos en los ejemplares en los que se detectó T. gondii.

Nº ID ESPECIE CZ CB INT HG BZ PM RÑ 03016471015 Garduña POS - NEG NEG NEG POS NEG 03054100000 Garduña - POS - - NEG NEG - 03004141000 Gato montés POS - NEG NEG NEG NEG NEG 03043260000 Gato montés NEG NEG POS - NEG NEG - 03048010000 Gineta POS POS NEG NEG NEG POS - 02023730678 Marta POS POS NEG NEG NEG NEG - 04028810000 Marta POS NEG - NEG NEG NEG - 05009340065 Marta POS NEG - NEG NEG POS NEG 05026210000 Marta POS - NEG NEG NEG NEG NEG 05045680000 Marta POS - - NEG NEG NEG - 01018240033 Tejón NEG POS NEG NEG NEG NEG NEG 02049640691 Tejón POS NEG NEG NEG NEG NEG - 03015611014 Tejón POS - - NEG NEG NEG - 04006670000 Tejón NEG POS - NEG NEG NEG - 04004780000 Turón POS NEG NEG NEG NEG - - 04058200000 Visón americano - POS - - - - - 04007780000 Zorro POS POS NEG NEG NEG - -

TOTAL 12/15 (80%) 7/12 (58,3%) 1/10 (10%) 0/14 0/16 3/14 (21,4%) 0/5

Nº ID: nº de identificación; CZ: corazón, CB: cerebro,INT: intestino, HG: hígado, BZ: bazo, PM: pulmón, RÑ: riñón. POS: positivo, NEG: negativo, (-): no realizado.

Sólo en tres casos (una gineta, una marta y un zorro) resultaron positivas ambas

muestras. En estos 17 ejemplares se estudiaron, además, muestras de pulmón e hígado

en 14 casos, de bazo en 16, de intestino en nueve y de riñón en cinco. Todas las

muestras de hígado, bazo, intestino y riñón fueron negativas, sin embargo, el 21,4% de

las muestras de pulmón fueron positivas.

4.3.8.- DETECCIÓN DE AGENTES BACTERIANOS TRANSMITIDOS

POR ARTRÓPODOS

Se analizaron un total de 212 muestras mediante PCR multiplex y RLB y se

observó que 101 muestras hibridaron con la sonda de Bartonella spp. Todas las

muestras fueron negativas a la detección de C. burnetii, A. phagocytophilum, Borrelia

sp., Borrelia R57, F. tularensis y SFG-Rickettsia.

La secuenciación de 15 muestras positivas a Bartonella spp. mostró que la

región secuenciada no permitía diferenciar Bartonella spp. de otras bacterias

(Uncultured alpha proteobacterium, Sinorhizobium spp., ...etc.). Por ello se decidió

primar la especificidad, a pesar de la posible pérdida de sensibilidad de la técnica,

realizando la amplificación del gen citrato sintasa (gltA) a partir de las muestras

positivas. Mediante este análisis se confirmó la presencia de Bartonella spp. en 12

muestras, lo que supuso el 5,7% de los animales estudiados (Tabla 31).

Tabla 31. Detección de Bartonella spp. mediante PCR y RLB.

FAMILIA ESPECIE N POS (%) ESPECIE de Bartonella sp. Tejón 75 9 (12) Bartonella sp.

Garduña 26 0 Marta 14 0


Mustelidae

Visón americano

3 0

Total Mustelidae 128 9 (7) Zorro 62 1 (1,6) B. rochalimae

Canidae Lobo 3 1 (33,3) B. rochalimae

Total Canidae 65 2 (3,1)

Viverridae Gineta 13 0

Total Viverridae 13 0

Felidae Gato montés 6 1 (16,7) B. henselae

Total Felidae 6 1 (16,7)

TOTAL 212 12 (5,7) N: número de individuos analizados. POS (%): número y porcentaje de animlaes positivos.

Estas muestras se secuenciaron para la identificación a nivel de especie, de

manera que la secuencia de 372 pares de bases obtenida a partir de la muestra de gato

montés se identificó como B. henselae, presentando una homología del 100% con la

secuencia de B. henselae depositada en el GenBank (DQ222471) (Fig. 13; Anexo 5.1).

Fig. 13. Árbol filogenético de las secuencias de Bartonella spp. obtenidas a partir de la amplificación del gen citrato sintasa (gltA). Con una flecha se marcan las secuencias obtenidas en este estudio.

Las secuencias obtenidas a partir de las muestras de lobo (03036420000) y de

zorro (01024970051) positivos resultaron idénticas entre sí y tras la secuenciación de

318 pares de bases presentaron una homología del 100% con la secuencia de B.

rochalimae depositada en el GenBank (DQ683195) (Fig. 13; Anexo 5.2). Las

secuencias de 348 pares de bases obtenidas en los nueve tejones positivos resultaron

idénticas entre sí y no se correspondían con ninguna de las secuencias depositadas en el

GenBank. La mayor homología (96,4%) se observó con B. clarridgeiae (U84386)

(Anexo 5.3.). El análisis filogenético de las secuencias del gen citrato sintasa de las

diferentes especies de Bartonella disponibles en el Blast permitió confirmar que las

Bartonella sp. identificadas en los tejones se encontraban filogenéticamente más

próximas a B. clarridgeiae (Fig. 13). Este resultado se confirmó mediante la

secuenciación del gen 16S rARN y del espacio intergénico 16S-23SrARN (García-

Esteban y cols., 2008).

La secuencia del gen de la citrato sintasa de Bartonella sp. de los tejones

obtenida en el presente estudio se depositó en GenBank con el código de acceso

GU570947.

Únicamente se detectaron Bartonella spp. en ejemplares pertenecientes a cuatro

especies de carnívoros. Así, el lobo fue la especie animal que presentó una mayor

prevalencia (33,3%), seguido del gato montés (16,7%) y del tejón (12%), siendo el

resultado más bajo el del zorro (1,6%). En este caso, fue el tejón la especie que presentó

una mayor significación estadística en su diferencia de prevalencia con el resto de las

especies animales (pB=0,02). No obstante, las frecuencias más altas corresponden al

lobo y al gato montés, aunque el número de observaciones en estas especies es bajo para

la realización de análisis estadísticos. Así, se optó por hacer comparaciones de la

prevalencia del patógeno agrupando estas especies (gato montés y lobo) frente al resto

de las especies, aunque excluyendo los datos de tejón debido a un mayor tamaño

muestral y un mayor nivel de prevalencia que en el resto de especies estudiadas. En este

caso se observó una mayor significación estadística (pB=0,04). Por otro lado, se

comparó la prevalencia en gato montés con la prevalencia media del resto de las

especies, exceptuando el tejón, y también la prevalencia en lobo con la prevalencia

media del resto de especies, igualmente, exceptuando el tejón. En estos dos últimos

casos las diferencias no fueron estadísticamente significativas.

El 11,3% de los animales jóvenes presentó resultado positivo frente al 4,7% de

los adultos (p=0,1 n.s.). El porcentaje de machos y de hembras positivos fue similar

(7,1% y 3,7%, respectivamente) (p=0,2 n.s.).

Se observó un mayor número de animales positivos entre los individuos recogidos

en Álava (9,4%; p=0,06 n.s.), ya que únicamente el 3,1% de los ejemplares recogidos en

Gipuzkoa fueron positivos (p=0,2 n.s.) y no se detectó este patógeno en ninguno de los

ejemplares recogidos en Bizkaia (p=0,07 n.s.) (Fig. 14).

Fig. 14. Localización geográfica de los ejemplares con resultado positivo y negativo frente a

Bartonella spp. detectados mediante PCR-RLB.

Un porcentaje similar de individuos recogidos durante el invierno y la primavera

presentaron resultado positivo (6,9% y 7,7%, respectivamente), mientras que aquellos

ejemplares encontrados durante los meses de otoño y verano presentaron unos valores

de prevalencia inferiores al 3% (en todos los casos p>0,3 n.s.).


patógeno se realizó considerando la variable especie agrupada en dos formas: i)

considerando tejón y el resto de las especies juntas; ii) considerando gato montés y lobo

en un grupo y el resto de las especies menos el tejón en otro grupo. Así, obtuvimos dos

modelos finales. En el primer modelo significativo (i), la Odds ratio (O.R.) entre el

tejón y el resto de las especies juntas fue de 11 (intervalo de confianza del 95%:

2,6÷47,6) y la O.R. entre individuos jóvenes y adultos fue de 5,4 (intervalo de confianza

del 95%: 1,4÷20,4). En el segundo modelo significativo (ii), la O.R. entre las especies

gato montés-lobo y el resto de especies juntas menos el tejón fue de 37 (intervalo de

confianza del 95%: 2,2÷467,8).

4.3.9.- DETECCIÓN DE Trichinella spp.

En total se analizaron muestras de 170 animales. Así, se examinaron 163

muestras de diafragma (DI), 146 muestras de una mezcla de lengua (L), músculos

masetero (M) e intercostal (I), y 58 de flexores y extensores (FE) de las extremidades

(Tabla 32).

Tabla 32. Tipo y número de muestras de diafragma (DI), mezcla de lengua, masetero e intercostal (LMI) y mezcla de flexores y extensores de la extremeidad (FE) analizados mediante digestión artificial para la detección de larvas de Trichinella spp.

FAMILIA ESPECIE N DI LMI FE POS (%) Tejón 57 55 50 - 0

Garduña 22 22 21 - 0 Marta 9 9 8 - 0

Comadreja 1 1 1 - 0 Turón 4 4 3 - 0

Mustelidae

Visón americano 2 2 2 - 0 Total Mustelidae 95 93 85 - 0

Zorro 58 53 46 56 2 (3,5) Canidae

Lobo 3 3 3 2 0 Total Canidae 61 56 49 58 2 (3,3)

Viverridae Gineta 9 9 8 - 0 Total Viverridae 9 9 8 - 0

Felidae Gato montés 5 5 4 - 0 Total Felidae 5 5 4 - 0

TOTAL 170 163* 146* 58 2 (1,2) N: número total de carnívoros estudiados; POS (%): número y porcentaje de muestras positivas. *En 32 animales no se realizó la digestión artificial a partir de muestra de diafragma y en 31 animales de LMI.

Se encontraron larvas con morfología y medidas compatibles con Trichinella

spp. en dos de los 56 zorros estudiados (3,5%). Ninguna de las otras especies de

carnívoros estudiadas presentó larvas de Trichinella spp. en su musculatura.

Uno de los zorros positivos (02055970699) era un ejemplar macho y adulto, que

murió como consecuencia de un traumatismo por atropello y fue encontrado en otoño

del 2002, en la provincia de Álava.

El otro zorro positivo (03023460000), hembra y de edad desconocida, murió por

enfermedad en la primavera del 2006, también en Álava (Fig. 15).

En estos dos ejemplares se analizaron, de forma individual, las muestras

musculares disponibles y se observó que la tasa de infección más elevada, expresada en

número de larvas por gramo (lpg), la presentaba el zorro 02055970699, en el que se

encontraron 1,5 lpg en el diafragma. De este ejemplar se pudo analizar una muestra de

músculos flexores y extensores, observándose una tasa de infección de 0,3 lpg. En el

otro zorro positivo (03023460000) la tasa de infección osciló entre 0,4 y 0,5 lpg en las

distintas muestras analizadas, salvo en el músculo masetero, en el que no se encontraron

larvas.

A la vista de los resultados obtenidos no fue posible llevar a cabo ninguna

valoración estadística.

Fig. 15. Localización geográfica de los ejemplares con resultado positivo y negativo frente a Trichinella spp.

4.3.10.-IDENTIFICACIÓN DE ECTOPARÁSITOS

De los 213 carnívoros examinados, el 60,1% estaban infestados por

ectoparásitos (Tabla 33).

Se observó un porcentaje similar de parasitaciones simples (47,7%) y mixtas

(52,3%), aunque lo más frecuente fue encontrar animales parasitados únicamente por

garrapatas (25%), seguido de las combinaciones garrapata-pulga (16,4%) y garrapata-

piojo (14,8%) (Tabla 33). También se observaron animales parasitados por garrapatas,

pulgas y piojos de forma conjunta, así como únicamente por piojos en un porcentaje

similar de individuos (13,3% en ambos casos).

Los ejemplares de visón americano, tejón, zorro y lobo fueron los únicos que

presentaron una tasa de parasitación igual o superior al 50%, mientras que el turón fue

la única especie de este estudio en el que no se encontraron ectoparásitos de ningún tipo.

El tejón fue la especie en la que se observaron un mayor número de diferentes

combinaciones de ectoparásitos, seguido del zorro y de la garduña.

En el caso del tejón, se encontraron más frecuentemente animales infestados por

las combinaciones de garrapatas-piojos (27%) y garrapatas-pulgas-piojos (25,4%).

Además, también se encontró parasitación únicamente por piojos en el 23,8% de los

individuos.

En el zorro, lo más frecuente fue encontrar individuos infestados únicamente por

garrapatas o por la combinación garrapatas-pulgas (25% en ambos casos). Asimismo, en

la garduña también se observaron mayoritariamente individuos parasitados sólo por

garrapatas (30%), seguido de infestaciones por piojos o por la combinación pulgas-

piojos (20% en ambos casos).

En el resto de los animales, si bien las combinaciones de estos ectoparásitos fue

menor a las descritas anteriormente, las garrapatas fueron los parásitos que se

encontraron en un mayor número de individuos.

Tabla 33. Infestaciones simples y mixtas de ectoparásitos en los carnívoros examinados. Infestación simple Infestación mixta

N POS

(%) GA (%)

PU (%)

PI (%)

AC (%)

GAPUPI (%)

GAPU (%)

GAPI (%)

GAAC (%)

GAPUAC (%)

PUPI (%)

CO 5 2 (40) 1 (50) 1 (50) - - - - - - - -

GA 26 10

(38,5) 3 (30) -

2 (20)

- 1 (10) 1 (10) 1 (10) - - 2 (20)

GM 6 1 (16,7) 1

(100) - - - - - - - - -

GI 13 5 (38,5) 4 (80) - - - - 1 (20) - - - -

LO 2 1 (50) - - - - - - 1

(100) - - -

MA 14 3 (21,4) 1

(33,3) 1

(33,3) - - -

1 (33,3)

- - - -

TJ 75 63 (84) 5 2 15

(23,8) - 16 (25,4) 2

17 (27)

- - 6

(9,5) TU 5 0 - - - - - - - - - -

VA 3 3 (100) 2

(66,7) - - - -

1 (33,3)

- - - -

ZO 64 40

(62,5) 15

(25) 6 - 2 (5) - 15 (25) - 1 (2,5) 1 (2,5) -

Total 213 128

(60,1) 32

(25) 10

(7,8) 17

(13,3) 2

(1,6) 17

(13,3) 21

(16,4) 19

(14,8) 1 (0,8) 1 (0,8)

8 (6,3)

61 (47,7) 67 (52,3)

N: número de animales analizados. POS (%): número y porcentaje de individuos positivos. Número y porcentaje de individuos que presentan garrapatas (GA), pulgas (PU), piojos (PI), ácaros (AC), garrapatas-pulgas-piojos (GAPUPI), garrapatas-pulgas (GAPU), garrapatas-piojos (GAPI), garrapatas-ácaros (GAAC), garrapatas-pulgas-ácaros (GAPUAC) y pulgas-piojos (PUPI). (-): no se han encontrado ectoparasitos. CO: comadreja, GA: garduña, GM: gato montés, GI: gineta, LO: lobo, MA: marta, TJ: tejón, TU: turón, VA: visón americano, ZO: zorro.

4.3.10.1.- Identificación de garrapatas:

Se observó que el 42,7% de los carnívoros examinados estaban parasitados por

garrapatas (Tabla 34).

Atendiendo a la familia, los cánidos fueron los que se encontraron más

frecuentemente parasitados (50%), seguidos de los mustélidos (40,6%) y vivérridos

(38,5%), mientras que se obtuvo una prevalencia del 16,7% en el caso de los félidos.

Se encontraron garrapatas en todas las especies animales, salvo en los

mencionados cinco turones. El visón americano fue la única especie en la que todos los

individuos inspeccionados fueron portadores de garrapatas, si bien sólo se examinaron

tres ejemplares de esta especie. El zorro, el tejón y el lobo fueron especies en las que

prácticamente la mitad de los animales examinados se encontraron parasitados por

garrapatas, mientras que el porcentaje de ginetas parasitadas fue del 38,5%. En el resto

de especies, presentaban garrapatas menos del 25% de los individuos. Se optó por hacer

comparaciones de la prevalencia de garrapatas entre el tejón y el resto de especies y

entre el zorro y el resto especies, expectuando al turón en ambos casos, puesto que

ninguno de los ejemplares presentaba parasitación por garrapatas. En ambos casos no se

observaron diferencias estadísticamente significativas (p 0,06 n.s.).

Tabla 34. Descripción de la parasitación por garrapatas en los carnívoros silvestres estudiados. FAMILIA ESPECIE N POS (%)

Tejón 75 40 (53,5) Garduña 26 6 (23,1)

Marta 14 2 (14,3) Comadreja 5 1 (20)

Turón 5 0

Mustelidae

Visón americano 3 3 (100) Total Mustelidae 128 52 (40,6)

Zorro 64 32 (50) Canidae

Lobo 2 1 (50) Total Canidae 66 33 (50)

Viverridae Gineta 13 5 (38,5) Total Viverridae 13 5 (38,5)

Felidae Gato montés 6 1 (16,7) Total Felidae 6 1 (16,7)

TOTAL 213 91 (42,7) N: número de animales analizados. POS (%): número y porcentaje de animales parasitados por garrapatas.

Los porcentajes de animales que presentaban garrapatas fueron similares en los

distintos grupos de edad (44,3% adultos y 38,9% jóvenes; p=0,3 n.s.) y sexo (45,3%

machos y 40,7% hembras; p=0,3 n.s.).

Un porcentaje similar de animales recogidos en las diferentes provincias

presentaban garrapatas (el 45,3% en Gipuzkoa, el 44% en Álava y el 42,5% en Bizkaia;

p 0,5 n.s.) (Fig. 16).

Se encontraron un mayor número de individuos parasitados en invierno (54%),

con respecto a la primavera (39,2%), otoño (38,1%) y verano (33,3%). En este caso se

agrupó la variable estación en dos categorías (invierno-resto) y se observaron

diferencias estadísticamente significativas en el resto de las estaciones (p=0,04) con

respecto al invierno.

El análisis de regresión logística llevado a cabo con la prevalencia de garrapatas

se realizó considerando la variable estación agrupada en dos categorías (invierno y

resto), proporcionando un modelo significativo en el que la Odds ratio entre los

individuos recogidos durante el resto de las estaciones y el invierno fue de 1,9 (intervalo

de confianza del 95%: 1,0÷3,4).

Fig. 16. Localización geográfica de los carnívoros con presencia y ausencia de garrapatas.

Se recogieron un total de 421garrapatas pertenecientes a la familia Ixodidae. El

género más frecuentemente encontrado fue Ixodes (81%), aunque en menor medida,

también se identificaron garrapatas de los géneros Haemaphysalis (8,1%), Dermacentor

(7,6%) y Rhipicephalus (3,3%).

Se identificaron ocho especies de garrapatas, siendo la más frecuente Ixodes

hexagonus (42,3%). Asimismo, I. ricinus (18,8%) (Foto 8) e I. canisuga (12,6%) fueron

otras dos de las especies más frecuentemente identificadas (Fig. 17). Otras especies

identificadas en menor número fueron D. reticulatus (7,4%), H. hispanica (5%), R.

pusillus (3,3%), H. punctata (1,7%) y H. concina (0,5%). En algunos casos, y debido al

estado de la garrapata, no se pudo determinar la especie y únicamente se pudo

identificar el género.

H. punctata

1,2%R. pusillus

3,3%

Haemaphysalis sp.

1,4%

H. concinna

0,5%

Dermacentor sp.

0,2%H. hispanica

5%

D. reticulatus

7,4%

Ixodes sp.

7,4%

I. canisuga

12,6% I. ric inus

18,8%

I. hexagonus

42,3%

Fig. 17. Especies de garrapatas identificadas en los carnívoros estudiados. I: Ixodes, D: Dermacentor, H:

Haemaphysalis, R: Rhipicephalus.

Se encontraron garrapatas del género Ixodes en todas las especies animales,

salvo en el gato montés. En cuanto a las garrapatas del género Haemaphysalis, se

encontraron en el tejón, el zorro y el gato montés, mientras que las del género

Dermacentor únicamente estuvieron presentes en el tejón y en el zorro. Asimismo, el

tejón fue la única especie de este estudio que presentaba garrapatas del género

Rhipicephalus. Por lo tanto, los tejones fueron la única especie que albergaba garrapatas

pertenecientes a los cuatro géneros anteriormente descritos, identificándose cinco

especies diferentes de garrapatas. Las garrapatas encontradas en el zorro pertenecían a

tres géneros y a siete especies diferentes, mientras que la gineta, la marta y el visón

americano albergaban dos especies diferentes de garrapatas del género Ixodes. En las

demás especies animales se identificó una única especie de garrapata.

Foto 8. Ejemplares de macho (izquierda) y hembra (derecha) de I. ricinus.

En cuanto a la media de parasitación por garrapatas entre las diferentes especies

de carnívoros, el lobo (13 garrapatas/individuo), el visón americano (8,7

garrapatas/individuo), la gineta (8,2 garrapatas/individuo) y la garduña (7

garrapatas/individuo) son los que presentaron los valores más elevados, si bien el

número de animales positivos para cada una de estas especies era inferior a seis. Las

especies mejor representadas fueron el zorro y el tejón, presentando unas medias de

parasitación por garrapatas de 4,8 y 3,4 respectivamente (Tabla 35). El zorro y el tejón

presentaron una mayor parasitación por I. hexagonus comparado con el resto de las

especies de garrapatas (2,1 y 1,3 garrapatas/individuo, respectivamente). En cambio, la

gineta y la marta se asociaron principalmente con I. ricinus (4 y 1 garrapatas/individuo,

respectivamente) y el visón americano con I. canisuga (5,7 garrapatas/individuo).

Se observó una significación estadística mayor en la garduña por parasitación de

I. hexagonus comparando con el resto de especies parasitadas por esta especie de

garrapata (pB=0,04).

Tabla 35. Media de parasitación por las distintas especies de garrapatas en los carnívoros silvestres estudiados.

ESPECIE N I.c I.h I.r H.h H.p H.c D.r R.p No

iden TOTAL

COMADREJA 1 - 2,0 - - - - - - - 2,0

GARDUÑA 6 - 7,0

(±7,2) - - - - - -

- 7,0 (±7,2)

GATO MONTÉS 1 - - - - 3,0 - - - - 3,0

GINETA 5 - 1,0

(±1,2) 4,0

(±3,8) - - - - -

3,0 (±3,7)

8,2 (±7,1)

LOBO 1 - - 13,0 - - - - - - 13,0

MARTA 2 - 0,5

(±0,7) 1,0

(±0,0) - - - - - -

1,5 (±0,7)

TEJÓN 40 0,7

(±1,5) 1,3

(±2,5) 0,5

(±1,8) - - -

0,1 (±0,3)

0,4 (±2,2)

0,5 (±1,7)

3,4 (±5,1)

TURÓN 0 - - - - - - - - - - VISÓN

AMERICANO 3

5,7 (±9,8)

3,0 (±4,4)

- - - - - - - 8,7

(±8,0)

ZORRO 32 0,3

(±1,0) 2,1

(±2,8) 0,7

(±1,8) 0,7

(±3,7) 0,1

(±0,2) 0,1

(±0,4) 0,9

(±1,4) -

0,1 (±0,5)

4,8 (±4,5)

N: número de animales que presentaban garrapatas. Media del número de garrapatas por cada individuo (± desviación estándar). I.c: I. canisuga; I.h: I. hexagonus; I.r: I. ricinus; H.h: H. hispanica; H.p: H.punctata; H.c: H. concinna;

D.r: D. reticulatus; R.p: R. pusillus; No iden: garrapatas no identificadas a nivel de especie.

Atendiendo al grado de parasitación de los animales, la mayoría (76,9%) se

encontraban parasitados por 1-5 garrapatas. El animal que presentó el mayor número de

garrapatas enganchadas fue un tejón que estaba parasitado por 30 ejemplares (Fig. 18).

0

5

10

15

20

25

30

35

Nº

anim

ales

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

Nº garrapatas

Fig. 18. Distribución del número de garrapatas encontradas sobre los animales.

En el 71,4% de los animales con garrapatas, únicamente se pudo identificar una

especie, mientras que en el 28,6% restante se encontraron garrapatas pertenecientes a, al

menos, dos especies diferentes, siendo las combinaciones más frecuentes la de I.

hexagonus e I. ricinus (34,6%) por un lado, y por otro, la de las especies I. hexagonus y

D. reticulatus (19,2%). Además, en un zorro se identificaron hasta cuatro especies

diferentes de garrapatas: I. hexagonus, I. ricinus, H. hispanica y H. concinna, mientras

que en el resto de animales se observaron otras combinaciones de las diferentes especies

de garrapatas identificadas.

Se encontraron animales parasitados por garrapatas a lo largo de todo el año, sin

embargo, el número medio de garrapatas por individuo fue más alto en verano e

invierno (Fig. 19).

Fig. 19. Número medio de garrapatas encontradas por individuo a lo largo del año.

Atendiendo a las especies de garrapatas, durante el invierno se recogieron

principalmente las especies I. hexagonus y D. reticulatus, mientras que las recogidas en

otoño fueron principalmente I. hexagonus (Fig. 20).

Durante los meses de verano se recogieron en mayor número I. ricinus e I.

canisuga, al igual que las especies H. hispanica, H. concinna y H. punctata, mientras

1.8

2.5

1.3

2.2

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

Nº

ga

rra

pa

tas/

ind

ivid

uo

PRIMAVERA VERANO OTOÑO INVIERNO

Estación

que el único animal en el que se encontró la especie R. pusillus fue recogido en

primavera.

Fig. 20. Número medio de las distintas especies de garrapatas encontradas a lo largo del año.

4.3.10.2.- Identificación de pulgas:

El porcentaje de animales parasitados por pulgas fue del 26,8% (Tabla 36) y

fueron los ejemplares pertenecientes a las familias de los cánidos y mustélidos los más

frecuentemente parasitados (33,3% y 26,6%, respectivamente).

Tabla 36. Descripción de la parasitación por pulgas en los carnívoros silvestres estudiados. FAMILIA ESPECIE N POS (%)

Tejón 75 26 (34,7) Garduña 26 4 (15,4)

Marta 14 2 (14,3) Comadreja 5 1 (20)

Turón 5 0

Mustelidae

Visón americano 3 1 (33,3) Total Mustelidae 128 34 (26,6)

Zorro 64 22 (34,4) Canidae

Lobo 2 0 Total Canidae 66 22 (33,3)

Viverridae Gineta 13 1 (7,7) Tabla Viverridae 13 1 (7,7)


TOTAL 213 57 (26,8) N: número de animales analizados. POS (%): número y porcentaje de animales parasitados por pulgas.

En este sentido, las especies que se encontraron más frecuentemente infestadas

por pulgas fueron el tejón (34,7%), el zorro (34,4%) y el visón americano (33,3%). En

el caso de la garduña, la marta, la comadreja y la gineta, el porcentaje de individuos que

0.20.5

0.020.2

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

Nº

garr

apat

as/in

divi

duo


I. canisuga

0.5 0.4

1 1.1

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

Nº

garr

apat

as/in

divi

duo


I. hexagonus

0.4

0.8

0.07

0.4

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

Nº

garr

apat

as/in

divi

duo


I. ricinus

0.04 0 0.020.3

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

Nº

garr

apat

as/in

divi

duo


D. reticulatus

presentaron pulgas fue inferior al 20%. No se encontraron pulgas en ninguno de los

ejemplares de turón, lobo y gato montés examinados. Se optó por hacer comparaciones

de la prevalencia de pulgas entre las especies parasitadas y por lo tanto se excluyeron el

turón, lobo y gato montés.

En este caso no se observaron diferencias estadísticamente significativas entre

los niveles de parasitación por especies de hospedador (p 0,1 n.s.).

El 34,4% de los individuos adultos presentaron pulgas frente al 15% de los

jóvenes, siendo esta diferencia estadísticamente significativa (p=0,01). Por otra parte, el

porcentaje de individuos machos y hembras con pulgas fue similar (del 28,9% y 24,7%,

respectivamente; p=0,2 n.s.).

Se observó un mayor número de individuos con pulgas entre los animales

recogidos en Gipuzkoa (32,8%), mientras que el porcentaje de animales parasitados fue

inferior en Bizkaia y Álava (p>0,1 n.s.) (Fig. 21).

Fig. 21. Localización geográfica de los carnívoros con presencia y ausencia de pulgas.

Se encontraron un mayor número de individuos parasitados en otoño (35,7%) e

invierno (32,2%), con respecto al verano (21,7%) y a la primavera (13,7%). Debido a la

similitud de frecuencias, se optó por hacer comparacines agrupando la variable estación

en dos categorías: otoño-invierno por un lado y verano-primavera por otro, siendo esta

diferencia estadísticamente significativa (p=0,005).

El análisis de regresión logística llevado a cabo con la prevalencia de pulgas se

realizó considerando la variable estación agrupada en dos categorías (otoño-invierno por

un lado y verano-primavera por otro), proporcionando un modelo significativo en el que

la Odds ratio (O.R.) entre los individuos adultos y jóvenes era de 2,7 (intervalo de

confianza del 95%: 1,2÷6,3) y la O.R. entre las estaciones invierno-otoño y las

estaciones primavera-verano era de 2,3 (intervalo de confianza del 95%: 1,1÷4,7).

En total se recogieron 129 pulgas adultas correspondientes a cuatro familias

diferentes, siendo las más numerosas las pertenecientes a las familias Pulicidae (48,1%)

y Ceratophyllidae (42,6%), mientras que el 8,5% pertenecían a la familia

Vermipsyllidae y una única a la familia Ctenophtalmidae.

Se identificaron 10 especies diferentes de pulgas en los carnívoros silvestres de

nuestra área de estudio, siendo Paraceras melis y Ctenocephalides canis las más

frecuentemente identificadas (30,2% y 28,7%, respectivamente) (Foto 9), la primera

parasitando principalmente al tejón y la segunda, única y exclusivamente al zorro.

Además, aunque con un porcentaje más bajo, se identificaron las especies Ceratophyllus

(Monopsyllus) sciurorum (11,6%), Pulex irritans (9,3%), Chaetopsylla trichosa (8,5%)

y Ctenocephalides felis felis (7,8%). Finalmente, en un porcentaje inferior al 2%, se

identificaron las especies Spilopsyllus cuniculi, Archeopsylla erinacei, Nosopsyllus

(Nosopsyllus) fasciatus y Ctenophthalmus (Ctenophtalmus) baeticus arvernus.

Foto 9. Ejemplares de Paraceras melis (izquierda) y Ctenocephalides canis (derecha).

Las pulgas de la familia Ceratophyllidae se encontraron en todas las especies

animales parasitadas salvo en la gineta, mientras que las de la familia Pulicidae

estuvieron presentes en todos los hospedadores salvo en la comadreja y en el visón

americano. Pulgas pertenecientes a la familia Vermipsyllidae únicamente se encontraron

en el tejón y el único ejemplar de la familia Ctenophtalmidae en el zorro. Así, los zorros

fueron los animales que albergaban una mayor diversidad de especies, habiéndose

identificado pulgas pertenecientes a seis especies y a tres familias diferentes. Por otra

parte, en el tejón también se identificaron tres especies de tres familias diferentes de

estos ectoparásitos, mientras que los encontrados en la garduña y en la marta

pertenecían a dos especies de dos familias diferentes. Asimismo, en la comadreja, la

gineta y el visón americano sólo se encontraron pulgas pertenecientes a una especie.

En ninguno de los casos se detectaron infecciones mixtas y en cada individuo

parasitado sólo se identificó una única especie de pulga.

La intensidad media de parasitación más elevada la encontramos en la garduña

(4 pulgas/individuo), habiéndose observado una gran asociación con C. sciurorum (3,3

pulgas/individuo) (Tabla 37). En el zorro se encontró una media de 2,5 pulgas por cada

individuo, observándose una mayor afinidad con C. canis (1,7 pulgas/individuo). En el

caso del tejón, la media de parasitación fue de 2 pulgas por individuo, siendo P. melis

(1,4 pulgas/individuo) la que presentó una mayor afinidad por este mustélido. En el

resto de especies animales parasitadas se observó una intensidad media de una única

pulga por cada hospedador parasitado.

Tabla 37. Media de parasitación por las distintas especies de pulgas en los carnívoros silvestres estudiados.

ESPECIE N

POS C.C.

C.f.

S.c.

P.i.

A.e.

P.m.

C.s.

N.f. C.t.

C.a.

TOTAL

CO 1 - - - - - - 1,0 - - - 1,0

GA 4 - 0,8

(±1,5) - - - -

3,3 (±5,2)

- - - 4,0

(±4,8) GM 0 - - - - - - - - - - -

GI 1 - 1

- - - - - - - - 1,0

LO 0 - - - - - - - - - - -

MA 2 - 0,5

(±0,7) - - - -

0,5 (±0,7)

- - - 1,0

TJ 26 - 0,2

(±1,0) - - -

1,4 (±1,6)

- - 0,4

(±0,9) -

2,0 (±1,5)

TU 0 - - - - - - - - - - - VA 1 - - - - - - - 1 - - 1,0

ZO 22 1,7

(±2,4) -

0,09 (±0,4)

0,5 (±1,8)

0,05 (±0,2)

0,09 (±0,3)

- - - 0,05

(±0,2) 2,5

(±2,5)

N: número de animales que presentaban pulgas. x: Media de pulgas por especie animal (± desviación estándar). C.C., C. canis ; C.f., C. felis; S.c., S. cuniculi; P.i., P. irritans; A.e., A. erinacei; P.m., P. melis; C.s., C.

sciurorum; N.f., N. fasciatus; C.t., C. trichosa; C.a., C. baeticus arvernus.

CO: comadreja, GA: garduña, GM: gato montés, GI: gineta, LO: lobo, MA: marta, TJ: tejón, TU: turón, VA: visón americano, ZO: zorro.

En cuanto al número de estos ectoparásitos encontrados en cada individuo, la

mayoría albergaban entre 1 y 7 (96,4%). Únicamente en un zorro y en una garduña se

observó la presencia de 10 y 11 pulgas, respectivamente.

Atendiendo a la época del año, se encontraron pulgas en los animales recogidos

durante las cuatro estaciones, si bien el pico más alto se observó durante los meses de

verano y de otoño (Fig. 22).

Fig. 22. Número medio de pulgas encontradas por individuo a lo largo del año.

Por otra parte, se observaron diferencias en cuanto a la estacionalidad de las

distintas especies de pulgas recogidas (Fig. 23). Así, C. felis y C. sciurorum se

recogieron principalmente en verano. La especie P. melis estuvo presente

mayoritariamente en los animales recogidos durante el verano y el otoño. Además, C.

canis y C. trichosa se recogieron en otoño e invierno.

En cuanto al resto de especies de pulgas, si bien se recogieron en un menor

número, P. irritans se encontró durante la primavera, A. erinacei y N. fasciatus durante

el otoño, C. baeticus en invierno y S. cuniculi durante la época estival.

0.4

0.8 0.8

0.6

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1N

º pu

lgas

/indi

vidu

o


Fig. 23. Número medio de las distintas especies de pulgas por individuo encontradas a lo largo del año.

4.3.10.3.- Identificación de piojos:

Los piojos estuvieron presentes en el 28,6% de los animales (Tabla 38).

Únicamente se encontraron estos ectoparásitos en los mustélidos (46,9%) y en

los cánidos (1,5%).

Atendiendo a la especie animal, fueron los tejones los más frecuentemente

parasitados por piojos (72%). Dado que únicamente se encontraron piojos en tres

especies animales, se optó por hacer comparaciones de la prevalencia de piojos entre las

especies parasitadas (tejón, garduña y lobo). Teniendo en cuenta que el tejón presentaba

la frecuencia y el número de observaciones más altas, se enfrentó el tejón con el resto

(garduña y lobo), obteniendo resultados estadísticamente significativos (p=0,00001).

0 0

0.3 0.3

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

Nºp

ulga

s/in

divi

duo


C.canis

0

0.20.1

0.010

0.2

0.4

0.6

0.8

1

Nº p

ulga

s/in

divi

duo


C.felis

0.02

0.3

0.02 0.020

0.2

0.4

0.6

0.8

1

Nº

pulg

as/in

divi

duo


C.sciurorum

0 0 0.050.1

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

Nº

pulg

as/in

divi

duo


C.trichosa

0.1

0.3 0.3

0.1

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

Nº

pulg

as/in

divi

duo


P.melis

Tabla 38. Descripción de la parasitación por piojos en los carnívoros silvestres estudiados. FAMILIA ESPECIE N POS (%)

Tejón 75 54 (72) Garduña 27 6 (22,2)

Marta 14 0 Comadreja 4 0

Turón 5 0

Mustelidae

Visón americano 3 0 Total Mustelidae 128 60 (46,9)

Zorro 64 0 Canidae

Lobo 2 1 (50) Total Canidae 66 1 (1,5)



TOTAL 213 61 (28,6) N: número de animales analizados. POS (%): número y porcentaje de animales parasitados por piojos.

Se observó un mayor porcentaje de individuos adultos con piojos (29,8%) que

jóvenes (16,7%) (p=0,05 n.s.) y de hembras (32,1%) que de machos (27,3%) (p=0,3

n.s.).

Algo más de la mitad de los individuos recogidos en Bizkaia presentaron

parasitación por piojos (57,5%), frente al 28,4% de Álava y al 10,9% de Gipuzkoa (Fig.

24). Las diferencias fueron estadísticamente significativas entre los individuos

recogidos en Bizkaia y los que procedían del resto de las provincias (pB=0,00006).

No se observaron diferencias estadísticamente significativas en cuanto a la época

del año en el que fueron recogidos los animales, aun así, los porcentajes de parasitación

oscilaron entre el 35,3% de los animales recogidos en primavera, el 30,3% en verano, el

28,6% en otoño y el 24,1% de los recogidos en invierno (p 0,1 n.s.).

El análisis de regresión logística llevado a cabo con la prevalencia de piojos se

realizó considerando la variable especie agrupada en dos categorías (tejón por un lado y

garduña y lobo agrupadas conjuntamente por otro), proporcionando un modelo

significativo en el que la Odds ratio entre el tejón y el resto de especies fue de 5,5

(intervalo de confianza del 95%: 1,9÷15,5).

Fig. 24. Localización geográfica de los carnívoros con presencia y ausencia de piojos.

A pesar de que se recogieron una muestra de los ejemplares de piojos presentes

en cada uno de los individuos parasitados, se pudo disponer de 768 de estos

ectoparásitos para su identificación, de los cuales 720 se recogieron en el tejón, 43 en la

garduña y cinco en el lobo.

Todos los piojos identificados pertenecían al orden Mallophaga y a la familia

Trichodectidae, en la que se diferenciaron tres especies: Trichodectes melis (Foto 10) en

tejones, Trichodectes canis en el lobo y Trichodectes retusus en la garduña.

Foto 10. Ejemplar de Trichodectes melis.

4.3.10.4.- Identificación de ácaros de la sarna:

Se encontraron lesiones compatibles con la sarna en cinco animales de los 213

examinados. Se trataba de ejemplares de zorro en todos los casos y las lesiones

consistieron principalmente en la depilación de mayor o menor extensión de la

superficie corporal, con engrosamiento y enrojecimiento de la piel y formación de

costras, en algunos casos con aspecto de escamas.

El examen de los raspados de las zonas lesionadas permitió la detección de

ácaros pertenecientes a la especie Sarcoptes scabiei en cuatro animales. En uno de ellos,

a pesar de presentar unas lesiones muy extensas de alopecia por todo el cuerpo, no se

consiguió detectar ningún ácaro en el examen realizado. Por lo tanto, se confirmó la

presencia de los ácaros causantes de la enfermedad de la sarna en el 6,3% de los 64

zorros estudiados y únicamente en esta especie (p=0,002).

No se observaron diferencias estadísticamente significativas en estos cánidos en

cuanto a la edad (11,8% jóvenes y 7% adultos; p=0,4 n.s.) y el sexo (12,5% hembras y

5,1% machos; p=0,3 n.s.) de entre los individuos que se encontraban parasitados por el

ácaro de la sarna.

Por otra parte, en cuanto al lugar y a la época en la que se recogieron los

animales, los individuos que presentaron lesiones de sarna procedían únicamente de las

provincias de Álava (8,7%; p=0,5 n.s.) y Gipuzkoa (5,6%; p=0,2 n.s.) (Fig. 25) y fueron

recogidos durante los meses de otoño (9,1%; p=0,7 n.s.) e invierno (5,4%; p=0,3 n.s.).

Fig. 25. Localización geográfica de los carnívoros con presencia y ausencia de ácaros causantes de la sarna. Zorro con lesiones, aunque no se consiguió aislar el ácaro.

El análisis de regresión logística llevado a cabo con la prevalencia de ácaros se

realizó considerando las variables que se describen en el apartado de materiales y

métodos. En este caso, ninguna de las variables incluidas en el modelo final tuvo una

influencia significativa.

4.3.11.- IDENTIFICACIÓN DE ENDOPARÁSITOS

4.3.11.1.- Análisis coprológico:

Se llevó a cabo un estudio coprológico de 191 muestras fecales, encontrándose

huevos y/o larvas de helmintos o bien ooquistes de coccidios en el 71,7% (Tabla 39).

Todos los ejemplares de gato montés resultaron positivos en el análisis

coprológico, y lo mismo ocurrió con los dos ejemplares de comadreja y de lobo, así

como con los tres ejemplares de visón americano analizados. Además, un alto

porcentaje de ejemplares de marta y de zorro excretaban huevos y/o larvas de parásitos

(84,6% y 83,1%, respectivamente), mientras que en el caso del tejón, la garduña, el

turón y la gineta, sólo aproximadamente la mitad de los individuos eliminaban parásitos

con las heces.

Tabla 39. Las diferentes especies de carnívoros silvestres en los que se llevó a cabo el análisis coprológico y el resultado obtenido.

FAMILIA ESPECIE N POS (%) Tejón 70 43 (60)

Garduña 22 13 (59,1) Marta 13 11 (84,6)

Comadreja 2 2 (100) Turón 5 3 (60)

Mustelidae

Visón americano 3 3 (100) Total Mustelidae 115 75 (65,2)

Zorro 59 49 (83,1) Canidae

Lobo 2 2 (100) Total Canidae 61 51 (83,6)

Viverridae Gineta 9 5 (55,6) Total Viverridae 9 5 (55,6)

Felidae Gato montés 6 6 (100) Total Felidae 6 6 (100)

TOTAL 191 137 (71,7) N: número de animales analizados. POS (%): número y porcentaje de animales con presencia de endoparásitos.

Los porcentajes de animales que excretaban parásitos a través de las heces

fueron similares en los distintos grupos de edad (76,1% de los jóvenes, 71,7% adultos) y

sexo (72,2% hembras y 71,6% machos).

Un porcentaje similar de animales recogidos en Gipuzkoa (72,9%) y Álava

(72,3%) presentaban helmintos en el tracto digestivo, mientras que esta cifra fue

ligeramente inferior para los ejemplares recogidos en Bizkaia (65,9%) (Fig. 26).

No se realizó ningún análisis estadístico porque cada animal presentaba parásitos

específicos de especie.

Fig. 26. Localización geográfica de los ejemplares con resultado positivo y negativo frente al análisis coprológico.

Entre las diferentes especies animales analizadas, se pudieron observar distintas

prevalencias e intensidades de eliminación de estos parásitos, tal y como se muestra en

la Tabla 40.

Los nematodos gastrointestinales constituyeron el grupo de parásitos más

frecuente (57,6%) y además, se encontraron en todas las especies de carnívoros

estudiadas. Dentro de este grupo, lo más frecuente fue encontrar parasitaciones por

ancilostómidos (28,8%) y capilarias (25,1%). Aproximadamente la mitad de los

ejemplares de zorro y de comadreja analizados excretaban huevos de ancilostómidos,

así como la marta y la comadreja en el caso de las capilarias. Asimismo, los tres únicos

ejemplares de visón americano analizados eliminaban huevos de capilaria en sus heces.

Los nematodos pulmonares fueron el segundo grupo de parásitos más frecuente

(25,1%), destacando la presencia de larvas de Angiostrongylus spp. en tejones (18%) y

en zorros (22%).

La excreción de larvas de trematodos (7,3%) y ooquistes de coccidios (8,4%) fue

similar, infestando a un diverso grupo de carnívoros en ambos casos, mientras que los

cestodos fueron los helmintos menos frecuentemente detectados en este estudio y

únicamente se identificaron huevos de Dipylidium spp. en una garduña y de Taenia spp.

en un gato montés y en un zorro.

Por otra parte, la especie animal que albergaba un mayor número de especies

diferentes de helmintos fue el zorro (con 12 parásitos distintos identificados), seguido

del gato montés (con nueve parásitos distintos) y el tejón (ocho parásitos distintos). En

el resto de carnívoros se identificaron seis o menos parásitos diferentes.

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4.3.11.2.- Identificación de los endoparásitos recogidos durante la

necropsia:

Se observó la presencia de diferentes especies de nematodos en corazón, pulmón

y tráquea en el 18,5% de los carnívoros estudiados (Tabla 41). El hígado fue la única

víscera de las analizadas en la que no se encontró ningún parásito.

Se identificaron tres especies diferentes de nematodos: dos especies de

Angiostrongylus spp. y Capillaria aerophila. Los nematodos Angiostrongylus vasorum

se encontraron en zorros (33,3%) y Angiostrongylus daskalovi en tejones (24%),

mientras que los de Capillaria aerophila se encontraron en marta (9,1%), zorro (6,3%)

y garduña (4,3%). En el caso de los tres zorros, cabe mencionar que la parasitación fue

mixta entre A. vasorum y C. aerophila (Tabla 41). En este caso, dado que las

frecuencias más altas se encontraron en tejón y zorro, y dado que el número de

observaciones en el resto de especies fue escaso o nulo, se optó por hacer

comparaciones de la prevalencia de endoparásitos entre el tejón y el resto de especies

por un lado, y entre el zorro y el resto de especies por otro. En este último caso se

observaron diferencias estadísticamente significativas (pB=0,002).

Tabla 41. Descripción de los endoparásitos presentes en el corazón, pulmón y tráquea de los carnívoros silvestres estudiados.

FAMILIA ESPECIE N POS (%) ENDOPARÁSITOS Tejón 50 12 (24) Angiostrongylus daskalovi

Garduña 23 1 (4,3) Capillaria aerophila

Marta 11 1 (9,1) Capillaria aerophila


Mustelidae

Visón americano 2 0

Total Mustelidae 96 14 (14,6)

Zorro 48 16 (33,3) Angiostrongylus vasorum,

Capillaria aerophila Canidae Lobo 3 0

Total Canidae 51 16 (31,4) Viverridae Gineta 10 0

Total Viverridae 10 0 Felidae Gato montés 5 0

Total Felidae 5 0 TOTAL 162 30 (18,5)

N: número de animales analizados. POS (%): número y porcentaje de animales con presencia de endoparásitos.

El 75% de los nematodos del género Angiostrongylus spp. se encontraron en el

corazón, localizados en el ventrículo derecho y/o entrada de la arteria pulmonar de

dicho órgano, mientras que el resto aparecía, bien sólo en bronquiolos (14,3%), bien en

pulmón y corazón (10,7%).

La especie C. aerophila se encontró siempre en la tráquea de todos los

individuos, excepto en el caso de un zorro, que además, también tenía vermes en los

bronquiolos pulmonares.

Los zorros (75%) y tejones (33%) parasitados por Angiostrongylus spp.

presentaron lesiones macroscópicas de neumonía verminosa.

Los nematodos A. vasorum se encontraron con algo más de frecuencia en

individuos adultos (12,1%) que en individuos jóvenes (8,6%; p=0,4 n.s.). También

resultaron ser más frecuentes en ejemplares machos (12,4%) que en hembras (6,2%)

(p=0,2 n.s.). En el caso de los nematodos A. daskalovi, se encontraron únicamente en

individuos adultos (9,3 %), si bien no se pudo determinar la edad de dos individuos

(p=0,1 n.s.). Asimismo, fueron detectados en un número similar de ejemplares machos

(7,2%) que de hembras (7,7%) (p=0,6 n.s.).

En cuanto al lugar de la recogida, todos los animales con A. vasorum fueron

recogidos en Gipuzkoa (26,2%; p<0,00001), mientras que los tejones con A. daskalovi

fueron recogidos principalmente en Bizkaia (28,1%) y en menor medida en Gipuzkoa

(3,3%) y Álava (1,4%), siendo las diferencias estadísticamente significativas en Bizkaia

comparado con el resto (pB=0,00006), así como en Bizkaia y Gipuzkoa conjuntamente,

comparado con Álava (pB=0,03) (Fig. 27).

Fig. 27. Localización geográfica de los ejemplares con endoparásitos: A. vasorum, A. daskalovi,

A. vasorum y C. aerophila, C. aerophila, ausencia de endoparásitos.

Por otra parte, todos los animales con A. vasorum fueron recogidos en invierno

(18,8%) y otoño (9,4%). En este caso, las diferencias fueron estadísticamente entre el

invierno y el resto de las estaciones (pB=0,02). Los ejemplares con A. daskalovi fueron

recogidos principamente durante el verano (11,5%) y la primavera (11,4%), y en menor

medida durante el otoño (6,3%) y el invierno (4,3%) (p=0,1 n.s.).

El análisis de regresión logística llevado a cabo con la prevalencia de ambas

especies de nematodos por separado se realizó considerando la variable provincia

agrupada en dos categorías (Gipuzkoa y resto de provincias en el caso de A. vasorum;

Bizkaia y resto de provincias en el caso de A. daskalovi). En este último caso, la Odds

ratio entre Bizkaia y el resto de provincias fue de 19,7 (intervalo de confianza del 95%:

4,6÷84,8).

Los nematodos pulmonares de los zorros se identificaron fácilmente como A.

vasorum gracias a sus características morfométricas (Guilhon y Cens, 1973; Soulsby,

1982). El hallazgo de nematodos del género Angiostrongylus en tejones fue un hecho

inesperado que, al estudiarse más a fondo, puso de manifiesto que no se correspondía

con las características de la única especie reconocida hasta la fecha en la Península

Ibérica. Tal y como se indica en la tabla 42 se trataba de la especie A. daskalovi

(Guilhon y Cens, 1973; Soulsby, 1982; Janchev y Genov, 1988).

En la Tabla 42 se describen las medias de las dimensiones de las diferentes

especies adultas de Angiostrongylus identificadas en zorro y tejón. Asimismo, se

comparan con las medias descritas en carnívoros en otros estudios (Guilhon y Cens,

1973; Soulsby, 1982; Janchev y Genov, 1988). La comparación estadística de las

medias de las dimensiones proporcionó diferencias significativas entre las longitudes

totales y longitudes de esófago, tanto en ejemplares machos (p<0,0001 y p=0,0065,

respectivamente) y hembras (p=0,0018 y p=0,0025, respectivamente), de A. daskalovi

con respecto a A. vasorum. En general, A. daskalovi presentaba unas mayores

dimensiones que A. vasorum, salvo en el caso de las espículas de los machos, que eran

significativamente más pequeñas en los ejemplares de A. daskalovi (p=0,0452).

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La confirmación de la identificación de las especies A. vasorum y A. daskalovi

se llevó a cabo mediante PCR de la región ITS2 y secuenciación del producto

amplificado en tres individuos en cada caso.

En el caso del zorro, se obtuvo una secuencia de 472 pares de bases, con una

homología del 100% con las de A. vasorum depositadas en el GenBank (EU627595), e

idéntica para todos los ejemplares de los distintos zorros examinados (Anexo 5.4).

Las secuencias obtenidas a partir de los nematodos recogidos en los tejones

resultaron idénticas entre sí (Anexo 5.5), sin embargo, al someterlas a un análisis Blast,

no se correspondían con ninguna de las depositadas en el GenBank, aunque no existían

secuencias de A. daskalovi. El alineamiento de todas estas secuencias permitió construir

un árbol filogenético con las especies más próximas, en el que se demostraba una mayor

proximidad genética de A. daskalovi con A. vasorum (88%, EU627595) y en menor

medida con A. cantonensis (83%, EU636008) y A. costaricensis (81%, DQ028990)

(Fig. 28).

La secuencia de la región ITS2 de A. daskalovi obtenida en el presente estudio se

depositó en GenBank con el código de acceso GU323341.

Fig. 28. Árbol filogenético de las secuencias obtenidas a partir de la amplificación de la región ITS2 de las diferentes especies de Angiostrongylus spp. Con una flecha se marcan las secuencias obtenidas en este estudio.

DISCUSIÓN

5.- DISCUSIÓN:

5.1.- OBTENCIÓN DE MUESTRAS, NECROPSIA Y CAUSA DE LA

MUERTE

Las especies mejor representadas del presente estudio fueron el tejón y el zorro,

considerándose ambas especies de las más abundantes y ampliamente distribuidas en la

fauna silvestre de la CAPV (Fernández de Mendiola y Bea, 1998; Palomo y Gisbert,

2002).

También se ha constatado una distribución generalizada de la garduña, la gineta, la

comadreja y el turón, aunque en nuestro estudio se dispuso de un menor número de

ejemplares, mientras que la marta, el gato montés, el lobo, el visón europeo y el visón

americano se han localizado en enclaves concretos de la geografía de la CAPV

(Fernández de Mendiola y Bea, 1998; Palomo y Gisbert, 2002).

Aunque los datos del origen geográfico de las especies estudiadas son sesgados

debido al método de obtención de las muestras, éstos aportan información válida en

cuanto a su presencia en aquellas localizaciones para los que no se disponía de

referencias previas.

El presente estudio no refleja las causas de mortalidad reales de los carnívoros

silvestres en la CAPV, sino que únicamente es una descripción de las causas de

mortalidad de los ejemplares específicamente recogidos para el mismo. La información

sobre mortalidad en carnívoros silvestres es escasa tanto en la Península Ibérica como

en otros países, pero parece haber una clara coincidencia en la alta mortalidad

provocada por los traumatismos como consecuencia de atropellos por vehículos a

motor, principalmente entre los tejones. En la CAPV contamos con una profusa red

viaria en determinadas zonas, lo que viene a favorecer la mortalidad por esta causa.

Algunos autores señalan que, en ocasiones, la mortalidad por atropello puede superar la

mortalidad por otro tipo de causas como la depredación y las enfermedades (Forman y

Alexander, 1998), tal y como se ha constatado en Países Bajos y Gran Bretaña con el

tejón (Van der Zee y cols., 1992; Clarke y cols., 1998). Además, algunos autores

sugieren que la distribución de los atropellos en las carreteras no se da al azar, sino que

sigue un patrón agregado que se debe a numerosos factores en función de las

características de la carretera, el hábitat, la especie, etc. (Clevenger y cols., 2003). En

este sentido, se ha sugerido que los atropellos no dependen únicamente del factor

tráfico, sino que tienen además una clara relación con la biología de las especies

afectadas y especialmente con sus ciclos de actividad y movilidad (Tennés y cols.,

2007). Así, algunos autores han observado una mayor mortalidad entre los individuos

adultos, relacionado con el momento en el que están alimentando a sus crías o con la

época de dispersión de los individuos (Grilo y cols., 2009). Otros autores señalan que

las mortalidades más altas se dan entre los individuos que son más abundantes en una

determinada zona (Baker y cols., 2004; Guter y cols., 2005; Grilo y cols., 2009), aunque

a veces no se llegan a detectar todos los ejemplares muertos, ya que pueden estar

interviniendo otros factores como la predación o el carroñeo (Love y cols., 2000).

Por otra parte, es difícil evaluar el efecto de los agentes morbosos en las

poblaciones de especies silvestres, ya que rara vez se dispone de una población

accesible para la observación de síntomas clínicos y aún se conoce poco acerca de la

distribución de los agentes patógenos en sus hospedadores naturales (Gulland, 1994).

Además, muchas veces estos animales han sido encontrados en fases finales de la

enfermedad, coincidiendo con la presencia de otros agentes patógenos oportunistas o

secundarios, lo que en ocasiones impide una correcta identificación del agente

etiológico primario de la enfermedad.

En los carnívoros de este estudio se han detectado afecciones víricas,

bacterianas, fúngicas, parasitarias y tumorales de distinta índole, que pueden ser reflejo

de las diversas patologías que afectan a estos animales en nuestro entorno.

Haciendo referencia a algunas de las patologías observadas a lo largo de este

estudio, se podría destacar el caso de moquillo en un tejón. Se trata de una enfermedad

vírica altamente contagiosa entre los carnívoros y que se ha diagnosticado con

frecuencia en perros, así como en hurones domésticos (Mustela putorius furo), en el

turón, el visón americano, la gineta, el zorro, la garduña y el lobo en el territorio español

(López-Peña y cols., 2001; Sobrino y cols., 2008a; Millán y cols., 2008b; Perpiñán y

cols., 2008). Por lo tanto, hasta donde conocemos, éste sería el primer caso de moquillo

en un tejón descrito en la Península Ibérica. No obstante, la presencia de moquillo en los

tejones se ha descrito previamente en Alemania y la República Checa (van Moll y cols.,

1995; Frolich y cols., 2000; Pavlacik y cols., 2007). Se trata de un virus habitual en

especies silvestres, por lo que es de suponer que exista una circulación del agente entre

carnívoros domésticos y silvestres.

En cuanto a las enfermedades neoplásicas, hay que señalar que la información

existente acerca de este tipo de patologías en especies silvestres es limitada y que por lo

tanto, los hallazgos de este estudio suponen una contribución relevante al conocimiento

de su distribución entre los carnívoros silvestres.

El caso de una garduña y una gineta afectadas por un linfoma, hasta donde

conocemos, constituiría la primera descripción de un linfoma en estas especies. En el

caso de la garduña, el linfoma, por sus características histológicas, es semejante al tipo

linfocítico, difuso y de bajo grado de malignidad descrito previamente en hurones

jóvenes (Li y cols., 1998). El linfoma es una enfermedad relativamente común en

muchos animales domésticos y de laboratorio (Jones y cols., 1997) y entre las distintas

especies animales de la familia Mustelidae, se ha descrito en la mofeta rayada (Mephitis

mephitis), en los hurones domésticos, en la nutria (Enhydra lutris) y en el tejón (Smith y

Barker, 1983; Erdman y cols., 1996; Kim y cols., 2002; Mutinelli y cols., 2004).

El adenocarcinoma intestinal descrito en un tejón de este estudio, se sumaría a

otros procesos tumorales semejantes descritos en un leopardo (Neofelis nebulosa) y un

tigre (Panthera tigris corbetti) en cautividad en el continente asiático, así como en

hurones domésticos en norteamérica (Hoefer y cols., 1992; Rice y cols., 1992; Wada y

cols., 1996; Helmick y cols., 2006). Si bien se desconoce el origen etiológico de esta

enfermedad neoplásica, algunos autores han sugerido que existe relación entre la

aparición de tumores gastrointestinales y la infección por bacterias como Helicobacter

sp. (Parsonnet y cols., 1991; Yamazaki y cols., 2002).

Tal y como hemos mencionado anteriormente, las enfermedades neoplásicas

conforman un grupo de patologías poco conocidas, sobre todo a nivel etiológico. A la

vista de que en este estudio se han obtenido tres individuos con afección tumoral,

resulta evidente la necesidad de seguir investigando para conocer los factores que

predisponen a estas especies animales a padecer estas patologías, dado que no ha sido

posible establecer factores etiológicos comunes.

Sin embargo, el agente que por su carácter zoonótico ha suscitado un especial

interés ha sido el hallazgo de un caso de coccidioidomicosis en un tejón encontrado

muerto como consecuencia de un atropello. Esta enfermedad afecta al ser humano y a

los animales que se infectan tras inhalar las formas infectantes del hongo Coccidioides

immitis en las zonas endémicas localizadas en las zonas áridas y semiáridas del

continente americano (Kirkland y Fierer, 1996). La tasa de infección en el ser humano

puede llegar a ser del 100% en áreas endémicas de los Estados Unidos, mientras que en

los animales se han encontrado muchas especies de mamíferos naturalmente infectadas,

siendo una infección frecuente en bovinos y perros, aunque también se ha comprobado

la infección en ovinos, equinos, cerdos y roedores silvestres (Acha y Szyfres, 2003). En

cuanto a los carnívoros, se ha diagnosticado coccidioidomicosis en un tigre en

cautividad, en un puma y en varias nutrias, también en Norteamérica (Thomas y

Pappagianis, 1996; Adaska, 1999; Helmick y cols., 2006).

En Europa se han descrito diversos casos de coccidioidomicosis en el ser

humano, inclusive en España, aunque todos ellos tienen en común que los individuos

afectados realizaron algún viaje o estancia previa a las áreas endémicas del continente

americano, donde pudieron haber adquirido la infección (Hernández y cols., 1997;

Holemans y cols., 2000; Hombach y cols., 2008; Chandesris y cols., 2008).

Con respecto al origen de esta infección en un tejón del País Vasco, la hipótesis

más plausible es que el tejón hubiese estado en contacto con las formas infectantes del

hongo en su hábitat y que, por lo tanto, este hongo se encontrase en nuestro territorio en

un lugar no muy accesible, ya que no se ha detectado ningún otro caso entre los

animales estudiados, ni nos consta ninguna sospecha entre los animales domésticos o

personas del área en el que fue encontrado este tejón. En definitiva, parece ineludible

concluir que pudiera tratarse de un caso aislado en la zona, pero también que es la

primera descripción de una coccidioidomicosis en un mamífero salvaje en España y en

Europa. En consecuencia, este hallazgo parece ser una alerta precoz de la posible

entrada de un nuevo agente patógeno en Europa y, por lo tanto, resalta la importancia de

seguir realizando programas de vigilancia epidemiológica en la fauna silvestre como el

presente, para registrar y prepararse ante la aparición de nuevas patologías con

antelación suficiente (Williams y cols., 2002).

Este estudio ha puesto de manifiesto la persistencia de prácticas ilegales, o al

menos negligentes, como causa de mortalidad de carnívoros, tales como el empleo de

lazos-trampa y el envenenamiento, contra los que la sociedad en general y las

autoridades competentes en particular deben mantener una vigilancia y concienciación

permanentes apoyadas por las imprescindibles medidas represivas.

5.2.- DETECCIÓN DE Salmonella spp.

Se detectó la infección por Salmonella spp. en siete de las 10 especies

estudiadas, constatando una amplia distribución de este agente entre los carnívoros

silvestres, ya que en las tres especies en las que no se detectó se habían estudiado menos

de seis ejemplares, por lo que no se puede descartar su posible infección.

Las especies en las que se detectó un porcentaje de infección más alto (20%)

fueron la comadreja y el turón, sin embargo, sólo se pudieron analizar cinco individuos

de estas especies, mientras que las especies mejor representadas fueron el tejón, el zorro

y la garduña, siendo los porcentajes de infección detectados en ellos del 11,3%, 4,8% y

16%, respectivamente. Estos niveles de infección son ligeramente más altos a los

observados en otros países europeos para el zorro (1,6%) y el tejón (7,2-9,2%) (Wray y

cols., 1977; Euden, 1990). Sin embargo, en el caso del zorro, esta cifra es inferior a la

documentada en el sur peninsular donde se detectó una prevalencia superior al 10%

(Millán y cols., 2008b).

El presente estudio ha permitido poner en evidencia la presencia de Salmonella

spp. en especies de carnívoros silvestres, en las que no se había documentado

previamente, como son la garduña, la marta, la comadreja y el turón.

De entre los distintos serotipos identificados en nuestro estudio hay que destacar

el aislamiento de Enteritidis en tres individuos y de Typhimurium en dos, ya que se trata

de los serotipos más frecuentemente involucrados en los casos de salmonelosis humanos

(Echeita y cols., 2005c). Así, los tres aislamientos obtenidos en el zorro se

correspondían con estos dos serotipos. El zorro se considera una especie generalista y se

relaciona frecuentemente con una alimentación a base de carroña y basura (Blanco,

1998) y, por lo tanto, con una mayor proximidad con los desechos producidos por el ser

humano y con un mayor contacto con zonas periurbanas, lo que puede haber favorecido

la detección de dos de los serotipos más frecuentemente aislados en humanos, lo que

supone, además, un mayor riesgo de diseminación.

Por otro lado, el tejón ha sido la especie en la que se ha aislado una mayor

variedad de serotipos, hasta seis, coincidiendo con lo descrito por otros autores, que

identifican más de 10 serotipos distintos en este mustélido (Wray y cols., 1977; Euden,

1990). Este hecho puede estar relacionado con los hábitos alimentarios,

fundamentalmente omnívoros de este carnívoro, que podrían representar un factor

decisivo a la hora de adquirir Salmonella spp. Al fin y al cabo, la dieta de estos animales

está compuesta por pequeñas aves y micromamíferos, entre otros (Blanco, 1998; Zabala

y cols., 2002), especies en las que es frecuente detectar distintos serotipos de

Salmonella (Jones y Twigg, 1976; Refsum y cols., 2002; Pennycott y cols., 2002;

Millán y cols., 2004a).

Los distintos serotipos aislados en esta especie se han identificado previamente a partir

de muestras ambientales (Arapahoe, Coeln, Heidelberg, Newport, Umbilo), animales

domésticos (Give, Heidelberg, Newport, Umbilo), así como a partir de muestras clínicas

humanas en todos los casos, si bien su frecuencia de aparición es baja (Valdezate y

cols., 2003; de Frutos y cols., 2005; Echeita y cols., 2005a).

En lo concerniente a la época del año, se obtuvo un mayor número de

aislamientos en aquellos animales recogidos durante los meses de verano (julio, agosto

y septiembre), que no parece perjudicar a la supervivencia del microorganismo, ya que

se trata de un agente tolerante a un amplio rango de temperaturas (Morner, 2001).

Algunos autores consideran que las infecciones por Salmonella spp. en aves ocurren

más frecuentemente durante la época invernal (Kirkwood y Cunningham, 1994; Refsum

y cols., 2002; Millán y cols., 2004a), aunque otros autores han observado que se suele

producir un pico en invierno y otro en verano (Pennycott y cols., 2002).

El hecho de que no se hayan observado lesiones macroscópicas ni microscópicas

en los animales positivos, indicaría que se trataba de animales portadores y, por lo tanto,

de reservorios difusores de Salmonella spp., que excretarían la bacteria a través de las

heces, contaminado el suelo y el agua, con el consiguiente riesgo de infección para el

ganado doméstico y el ser humano.

Finalmente, el estudio llevado a cabo en otras especies de fauna silvestre en la

CAPV, en los que se observa un alto porcentaje de portadores en aves rapaces diurnas

(14,3%) y en jabalíes (7,5%) (Millán y cols., 2004a), corrobora la hipótesis de que el

comportamiento y los hábitos alimentarios de estos animales son determinantes en la

adquisición de Salmonella spp. Además de las especies animales carnívoras y

carroñeras, en la CAPV, también se ven afectadas por Salmonella spp. algunas especies

herbívoras como el ovino y los cérvidos (Barandika y cols., 2002; Barral y cols., 2005),

por lo que la vía de adquisición de la infección por contaminación a partir de

excrementos de los animales infectados podría considerarse también una posible vía de

infección en los animales del presente trabajo.

Se puede concluir que los carnívoros silvestres de la CAPV, pese a encontrarse

en la cúspide de la cadena trófica, no acumulan tasas de infección superiores a otras

especies. Aun así, probablemente desempeñan un papel importante como reservorios de

Salmonella spp. y pueden suponer un riesgo para el ganado y los seres humanos.

5.3.- DETECCIÓN DE Yersinia spp.

En este estudio se ha detectado una prevalencia global del género Yersinia del

5,8%, con las especies Y. enterocolitica y Y. pseudotuberculosis aisladas en cinco

especies de carnívoros silvestres de la CAPV. En particular, es de destacar el

aislamiento de Yersinia sp. en una gineta, lo que supone la primera descripción del

aislamiento de dicha bacteria en esta especie animal, aunque no se pudo confirmar la

especie de Yersinia implicada.

Esta bacteria puede causar infección en diversas especies animales, como

roedores, ungulados, lagomorfos y aves (Mair, 1973; Zamora y cols., 1979; Mackintosh

y Henderson, 1984; Nikolova y cols., 2001), por lo que, al igual que en el caso de la

Salmonella sp., los hábitos alimentarios de los carnívoros representan probablemente

una vía importante para adquirir la infección.

El hecho de que se hayan aislado casos de Yersinia spp. únicamente durante la

época otoño-invernal coincide con lo descrito por otros autores (Mingrone y Fantasia,

1988; Bielli y cols., 1999) y además, refuerza la idea de que la aparición de esta bacteria

se ve favorecida por diversos desencadenantes, como el clima húmedo y frío, así como

la menor disponibilidad de alimentos, que predispone a los animales a un debilitamiento

general, siendo de esta forma más susceptibles a adquirir enfermedades (Mair, 1973;

Gasper y Watson, 2001). Asimismo, la significativamente mayor prevalencia de esta

bacteria en individuos jóvenes, podría estar relacionada con una mayor susceptibilidad

debido a factores de estrés.

Y. pseudotuberculosis se identificó en un gato montés, corroborando las

observaciones de otros autores, que han descrito la asociación de esta especie de

Yersinia con los félidos (Spearman y cols., 1979; Owston y cols., 2006). En el resto de

especies (tejón, garduña y zorro) se identificó Y. enterocolitica, aunque esto no implica

que no puedan ser portadores también de Y. pseudotuberculosis (Mingrone y Fantasia,

1988; Nikolova y cols., 2001).

En ninguno de los casos se observaron lesiones macroscópicas ni microscópicas

aparentes, por lo que estos animales estarían actuando como portadores asintomáticos.

Este hecho unido a que las dos especies de Yersinia aisladas en nuestro estudio son

patógenas para el ser humano (Gasper y Watson, 2001), refuerza el concepto de un

posible papel de los carnívoros como diseminadores del microorganismo, con el

consiguiente riesgo de contaminación del medio y la transmisión a otras especies

animales, tanto domésticas como silvestres, así como al ser humano. Por otra parte, en

la CAPV, Juste y cols. (2009) recientemente han descrito un brote de infección por Y.

pseudotuberculosis en un rebaño de ovejas, sugiriendo el posible rol de roedores y aves

migradoras como causantes de esta infección, por lo que la vía de adquisición de la

infección por contaminación a partir de los excrementos de los animales infectados

podría considerarse como posible vía de infección de los animales en el presente

trabajo.

Estos resultados confirman la presencia de la bacteria en nuestro entorno,

sugiriéndonos el posible rol como reservorios de los carnívoros, tal y como lo han

comprobado otros autores en diversos lugares de Europa (Mair, 1973; Mingrone y

Fantasia, 1988; Nikolova y cols., 2001).

5.4.- DETECCIÓN DE Mycobacterium spp.

El hecho de que ninguno de los animales estudiados se encontrara infectado por

M. bovis, corrobora la situación descrita en otras zonas geográficas, donde existe una

marcada correlación entre la elevada prevalencia de infección por tuberculosis bovina

en ungulados en la zona y el consiguiente aislamiento de la bacteria en el tejón, así

como en otros carnívoros silvestres, como ocurre en el caso del zorro y del lince

(Briones y cols., 2000a; Pérez y cols., 2001; Martín-Atance y cols., 2005; Millán y

cols., 2008b; Sobrino y cols., 2008b).

La tuberculosis en la CAPV se encuentra prácticamente erradicada entre el

ganado doméstico (Ministerio de Medio Ambiente y Medio Rural Marino, 2006b) y

tampoco se encuentran animales infectados entre los ungulados silvestres (Aurtenetxe y

cols., 2005). Esta situación difiere bastante a la del cento-sur peninsular, donde la

prevalencia de infección por la tuberculosis bovina es elevada en ciervos y jabalíes,

hecho que se ha relacionado con la alta densidad de estas especies en fincas valladas

para el aprovechamiento cinegético, como consecuencia del hacinamiento y la

alimentación artificial (Vicente y cols., 2006).

Sin embargo, en el presente estudio se han podido identificar dos especies

diferentes de micobacterias: M. intracellulare y M. avium subsp. hominissuis, que son

bacterias ubicuas en la naturaleza y que también pueden estar presentes en individuos

inmunodeprimidos (Kirschner y cols. 1992, Brooks y cols. 1984; Komijn y cols., 1999;

Mijs y cols., 2002; Dvorska y cols., 2002; Han y cols., 2005). La presencia de estas

especies de micobacterias en tejones de nuestro estudio corroboran el hecho de que

algunas especies de micobacterias no tuberculosas presentan una amplia distribución

entre los mustélidos, tal y como observaron de Lisle y cols. (2008) en hurones y

armiños de vida libre en Nueva Zelanda. Se desconocen los efectos que pueden producir

estas micobacterias en los tejones, si bien la ausencia de lesiones en ambos individuos

indicaría que únicamente actúan como portadores de las mismas.

En el presente estudio se han analizado un número similar de zorros y de tejones,

sin que se haya aislado ninguna micobacteria de los primeros. Por lo tanto, el

aislamiento de micobacterias en los tejones apoya la hipótesis de que esta especie, por

sus costumbres y/o hábitos alimentarios, es más propensa a albergar distintas especies

de micobacterias.

5.5.- DETECCIÓN DE LA PROTEÍNA PRIÓNICA PATOLÓGICA

No se ha detectado la presencia de la proteína priónica patológica entre los

carnívoros silvestres estudiados.

Durante los últimos años se han diagnosticado casos de BSE y Scrapie afectando

al ganado doméstico en la CAPV (Ministerio de Medio Ambiente y Medio Rural y

Marino, 2009, 2010), aunque se trata de casos esporádicos y puntuales.

La proteína priónica patológica es capaz de infectar diferentes especies de

carnívoros por consumo de alimento contaminado, aunque por el momento únicamente

se ha descrito afectando a félidos y mustélidos en cautividad (Williams y cols., 2001;

Lezmi y cols., 2003). Por ello, la ausencia de este agente patógeno entre los animales de

vida libre de nuestro estudio puede considerarse como algo predecible.

La técnica empleada en el presente estudio no es específica para carnívoros y,

hasta donde conocemos, no se había empleado previamente para el análisis de muestras

en especies silvestres. Aún y todo, resulta interesante la aplicación de dicha técnica para

el análisis de muestras de otros animales distintos a los rumiantes para la realización de

estudios de vigilancia en una zona o área de estudio, aunque por el momento se

desconocen las limitaciones de la misma.

5.6.- DETECCIÓN DE Leptospira spp.

La prevalencia de anticuerpos frente a Leptospira spp. observada en este estudio

fue alta (61,5%) y comprendía a cuatro de los siete serovares analizados.

La prevalencia observada en los zorros (50%) se encontraría dentro del rango de

valores de seroprevalencia descrito por algunos autores, tanto en España como en otras

regiones europeas (31,3-58,2%) (Fennestad y Borg-Petersen, 1972; Millán y cols.,

2008a). En el caso del tejón, la prevalencia registrada en este trabajo (33,3%) resultó

algo inferior a la detectada en este mustélido en Dinamarca (42,9%) (Fennestad y Borg-

Petersen, 1972).

En cuanto al resto de carnívoros estudiados, únicamente se ha descrito la

presencia de leptospiras en la garduña en Bélgica y en Croacia, así como en la gineta en

España (Hartskeerl y Terpstra, 1996; Slavica y cols., 2008; Millán y cols., 2008a,

2008b). Por otra parte, Hathaway y Blackmore (1981) no encontraron anticuerpos frente

a Leptospira spp. en ninguno de los turones analizados en Nueva Zelanda y no se

dispone de información acerca de estudios de seroprevalencia realizados en la marta.

La presencia de anticuerpos frente a leptospiras en estos carnívoros indicaría una

infección previa, bien por el contacto con material infectado o bien por el consumo de

presas infectadas (Reilly y cols., 1970; Salt y Little, 1977; Leighton y Kuiken, 2001).

Los dos serovares más prevalentes del presente estudio fueron bratislava y

muenchen. Se detectaron anticuerpos frente a ellos en el tejón y el zorro, previamente

descritas por Hathaway y cols. (1983) en Inglaterra. Estos autores aislaron el serovar

bratislava a partir del cultivo de riñón en el tejón y en el zorro, mientras que el serovar

muenchen lo aislaron en el zorro y en el visón europeo. No obstante, describen estos

casos como un hallazgo puntual y sugieren la posible infección mediante la ingestión de

micromamíferos infectados por leptospiras.

Salt y Little (1977) observaron que el tejón, en el Reino Unido, actuaba como

hospedador de mantenimiento del serogrupo Australis, dentro del cual se incluyen los

serovares bratislava y muenchen. Este hecho sugiere la implicación de los carnívoros

como reservorios de algunos serovares de leptospiras, lo que tiene un gran interés si

tenemos en cuenta que bratislava se ha observado asociado a explotaciones bovinas con

problemas reproductivos en la CAPV, tanto por la proporción de explotaciones

seropositivas (97%), como por el porcentaje de animales seroreaccionantes (25%)

(Atxaerandio, 2001).

En cuanto a los serovares muenchen, icterohaemorrhagiae y canicola, se

encontraron con prevalencias inferiores, pero en cualquier caso, confirman su presencia

en el área de estudio. Se trata de serovares que han sido documentados en carnívoros en

otras localizaciones, como es el caso de muenchen en el tejón y en la nutria en

Inglaterra, y de icterohaemorrhagiae y canicola en el coyote y el lobo en el continente

americano, respectivamente (Hathaway y cols., 1983; Khan y cols., 1991; Gese y cols.,

1997; Burek y cols., 2005). En España, se ha descrito la presencia del serovar

icterohaemorrhagiae en el lince, el meloncillo, el tejón, el zorro y la gineta, así como

del serovar canicola en el lince (Millán y cols., 2008a, 2008b).

Respecto a los resultados negativos frente a los serovares hardjo, pomona y

grippotyphosa cabe señalar que, si bien no es posible descartar su ausencia en la zona

debido al pequeño tamaño muestral, parece poderse concluir que los carnívoros

silvestres no están involucrados en el ciclo epidemiológico de estos serovares. El

serovar hardjo se asocia principalmente con el ganado bovino, mientras que pomona se

relaciona más frecuentemente con el ganado porcino y los ungulados silvestres y el

serovar grippotyphosa con los pequeños roedores. Aunque se ha comprobado que

ambos serovares presentan una amplia difusión en explotaciones de ganado vacuno de

la CAPV, ésta ha sido en menor proporción que el serovar bratislava (Atxaerandio,

2001). En el caso de pomona y de grippotyphosa, se ha descrito en otras especies de

vida libre, como el zorro, coyote, lobo, mapache, ciervo, jabalí y en los leones marinos

en otros lugares del mundo (Kingscote, 1986; Khan y cols., 1991; Gese y cols., 1997;

Bischof y Rogers, 2005; Slavica y cols., 2008).

La alta prevalencia de anticuerpos frente a L. interrogans observada durante la

época invernal coincide con condiciones de humedad necesarias que favorecen la

supervivencia de este patógeno (Levett, 2001; Leighton y Kuiken, 2001).

En definitiva, podemos sugerir que la infección por L. interrogans entre los

carnívoros silvestres de la CAPV es muy frecuente, y que, por consiguiente, éstos

pueden estar actuando como diseminadores de este patógeno.

En el presente estudio se empleó el método de MAT por considerarse como

técnica de referencia de la OIE (2008b). No obstante, a pesar de ser la técnica más

utilizada, presenta el inconveniente de la falta de consenso a la hora de establecer el

punto de corte más eficaz que discrimine entre animales infectados y no infectados por

Leptospira spp. En este sentido, se recomienda adoptar un punto de corte que prime la

especificidad de la técnica sobre su sensibilidad, por lo que éste fue establecido en 1:25.

Este hecho, si bien implicaba una pérdida de especificidad, determinada en gran medida

por la existencia de reacciones cruzadas con otros serovares pertenecientes al mismo

serogrupo, maximizaba la sensibilidad, la cual debido a la ausencia de estudios previos

en estas especies en la CAPV, se consideró más importante y corresponde al que ha sido

empleado por otros autores en estudios similares (Acevedo-Whitehouse y cols., 2003;

Jung y cols., 2007).

5.7.- DETECCIÓN DE ANTICUERPOS FRENTE A Toxoplasma gondii

La seroprevalencia global detectada en nuestro estudio (72,5%) fue ligeramente

superior a la descrita por Sobrino y cols. (2007) en carnívoros silvestres del centro y

noroeste peninsular (67,4%).

La prevalencia encontrada para el zorro en la CAPV (75%) se encontraría dentro

del rango descrito por otros autores en estos cánidos en los numerosos trabajos

desarrollados, tanto en Europa como en otros países del continente americano (68-

85,9%) (Tizard y cols., 1976; Dubey y cols., 1999; Jakubek y cols., 2007).

En el caso del tejón, se han publicado menos trabajos, si bien las prevalencias

observadas en Europa serían similares a las encontradas en este estudio, con unos

valores próximos al 70% (Anwar y cols., 2006; Sobrino y cols., 2007). Sin embargo, las

referencias en el tejón americano (Taxidea taxus) muestran unas prevalencias inferiores

(18-50%) (Riemann y cols., 1975; Marchiondo y cols., 1976).

Para el resto de mustélidos y vivérridos, si bien los estudios son más escasos,

Tizard y cols. (1976) encontraron anticuerpos frente a T. gondii en el 10,8% de las

martas en Canadá.

Cabe destacar la prevalencia significativamente más elevada detectada en los

individuos adultos comparada con la de los jóvenes, hecho que en ocasiones se ha

asociado a la probabilidad de una mayor exposición de los animales adultos al parásito a

lo largo de su vida (Zarnke y cols., 2001; Ryser-Degiorgis y cols., 2006). Asimismo, el

hecho de que se haya detectado unos niveles de anticuerpos significativamente mayores

en individuos recogidos durante la época invernal, refuerza la idea de la mayor

susceptibilidad a este protozoo en situaciones de estrés, como las causadas por la

humedad y el frío, así como la menor disponibilidad de alimentos (Dubey y Odening,

2001).

La mayoría de los resultados de los distintos estudios no son comparables entre

sí, ya que se han empleado técnicas diferentes para el análisis de las muestras. En todo

caso, lo que podemos observar es una alta prevalencia detectada en los carnívoros de

nuestro estudio, lo que concuerda con la alta prevalencia descrita por Sobrino y cols.

(2007) en otros carnívoros de distintos lugares de España. Este hecho unido a que los

valores de seropositividad descritos en otras especies silvestres como el jabalí, los

rumiantes y los conejos en la Península Ibérica son inferiores a la de los carnívoros

(Almería y cols., 2004; Gauss y cols., 2005, 2006), corrobora la hipótesis sugerida por

algunos autores, que afirman que los grupos animales situados en lo alto de la cadena

alimentaria son los que alcanzan las prevalencias más altas de infección por T. gondii

(Marchiondo y cols., 1976; Smith y Frenkel, 1995; Hejlicek y cols., 1997).

5.8.- DETECCIÓN DE ADN DE Toxoplasma gondii

La prevalencia observada (8,8%) y el hecho de que ocho de las nueve diferentes

especies de carnívoros silvestres estudiadas estén infectadas, corrobora que, tal y como

se ha sugerido en el estudio de seroprevalencia, la toxoplasmosis está muy extendida

entre los carnívoros silvestres de la CAPV.

Existen numerosos estudios acerca de la seroprevalencia del parásito en los

carnívoros silvestres (Riemann y cols., 1975; Tizard y cols., 1976; Smith y Frenkel,

1995; Buxton y cols., 1997; Zarnke y cols., 2001), pero son escasos los estudios en los

que se detecta el parásito en los propios tejidos de los individuos. En un estudio

publicado por Hurkova y Modry (2006) en la República Checa, en el que llevaron a

cabo la detección de ADN de T. gondii en tejido cerebral de carnívoros silvestres, estos

autores describieron la presencia del parásito en Martes sp. (4,9%) y en el zorro (1,3%).

La prevalencia observada en la CAPV en Martes sp. fue significativamente mayor en la

marta (38,5%) y la garduña (10%), mientras que la prevalencia en el zorro fue similar

(1,6%). Teniendo en cuenta solamente los animales con muestra de tejido cerebral de

este estudio, Martes sp. presenta una prevalencia algo más baja (10,5%), pero superior a

la observada por Hurkova y Modry (2006), mientras que en el caso del zorro se

mantiene similar (1,9%). Otros autores realizaron el aislamiento de T. gondii a partir de

diferentes tejidos de mustélidos y encontraron el parásito en el 17% de las martas, el

33% de los turones y el 18% de las garduñas (Hejlicek y cols., 1997).

En el presente estudio, las mayores prevalencias se observaron en la marta y el

gato montés (38,5% y 33,3%, respectivamente). Se trata de dos especies generalistas,

con un amplio espectro de presas en el que se incluyen los pequeños mamíferos, aves e

insectos, entre otros (Blanco, 1998). Algunos autores sugieren que los carnívoros son

más susceptibles a adquirir la enfermedad debido a sus hábitos alimentarios y han

demostrado una mayor prevalencia en animales carnívoros, comparado con los

omnívoros y herbívoros (Marchiondo y cols., 1976; Smith y Frenkel, 1995; Hejlicek y

cols., 1997). Hasta donde conocemos, no hay estudios acerca de la prevalencia de la

infección por T. gondii en roedores o en aves en España, pero en una revisión llevada a

cabo por Tenter y cols. (2000), se señalaba que, dependiendo de la especie hospedadora,

el área geográfica y la época del año, se pueden infectar por este protozoo el 73% de los

micromamíferos y el 71% de las aves silvestres. En nuestro estudio se pudo analizar el

contenido estomacal de los carnívoros positivos, que consistió fundamentalmente en

restos de micromamíferos y de aves, por lo que es probable que la prevalencia de T.

gondii en estos grupos de animales sea muy elevada en algunas zonas y en algunas

especies concretas.

El hecho de que el gato montés presente una de las mayores prevalencias de este

estudio y, además, el que se haya detectado la presencia del parásito en el intestino, es

consistente con el papel que desempeñan los félidos, tanto domésticos como silvestres,

como hospedadores definitivos de T. gondii, diseminando los ooquistes del parásito

(Dubey, 1994).

Los resultados obtenidos en este estudio confirman que las muestras de corazón

y de cerebro son las más apropiadas para detectar el máximo número de individuos

infectados.

Los resultados de este estudio nos sugieren que la mayoría de los carnívoros

estudiados han estado en contacto en alguna ocasión a lo largo de su vida con el parásito

T. gondii y que las presas de estos animales se encuentran infectadas por este protozoo,

o bien que los individuos infectados se han contaminado por ooquistes de gato montés

directamente. El gato montés, junto con los cimarrones y los domésticos, además,

pueden estar diseminando ooquistes del parásito, contaminado el suelo y el agua, con el

riesgo que ello supone para el ganado doméstico, así como para el ser humano.

Es de señalar que, hasta donde conocemos, este es el primer estudio de detección

de ADN de T. gondii en carnívoros silvestres en España. Este método facilita

considerablemente la investigación etiológica de este protozoo y puede permitir

profundizar en los ciclos silvestres de T. gondii.

5.9.- DETECCIÓN DE AGENTES BACTERIANOS TRANSMITIDOS POR

ARTRÓPODOS

Se ha detectado ADN de Bartonella spp. en el 5,7% de los carnívoros silvestres

analizados en la CAPV, mientras que no se detectó la presencia de C. burnetii, A.

phagocytophilum, Borrelia spp., Borrelia R57, F. tularensis y SFG-Rickettsia, lo cual

resulta relativamente inesperado a la luz de los resultados de otros estudios y sugiere

que los carnívoros no juegan un papel relevante en el epidemiología de estos agentes.

Por lo tanto, la presencia habitual de casi todos estos agentes en nuestra área de

estudio frente a su ausencia en los carnívoros analizados, nos sugiere que estos animales

no están involucrados como hospedadores de estos patógenos. No obstante, cabe la

posibilidad de que la técnica empleada no sea suficientemente sensible para la detección

de todos estos agentes bacterianos, y que si bien ha permitido realizar el estudio

epidemiológico sobre un elevado número de muestras de una forma rápida, no permite

descartar totalmente la circulación de aquellos agentes que se encuentran a niveles bajos

de prevalencia.

La secuenciación de las muestras positivas a Bartonella spp. en el RLB, reveló

la alta frecuencia de agentes distintos de Bartonella spp. Así se comprobó que la región

16S rARN era poco variable y que se amplificaba el ADN de otras bacterias irrelevantes

para la patología de los carnívoros, pero que dificultaban el diagnóstico de Bartonella

spp.

En este estudio se describe por primera vez la detección de ADN de diferentes

especies de Bartonella en los carnívoros silvestres de España. Por un lado, se detectó la

presencia de B. henselae en el gato montés (16,7%), cuya prevalencia se encuentra

dentro del rango descrito por otros autores en otros félidos silvestres de Estados Unidos

y África (3,7-53%) (Yamamoto y cols., 1998; Rotstein y cols., 2000; Moliá y cols.,

2004), así como en el gato doméstico en España (17,5%) (Solano-Gallego y cols.,

2006a).

Por otra parte, la determinación de B. rochalimae en el lobo (33,3%) y el zorro

(1,6%), constituyen la primera descripción de esta especie de Bartonella en España, ya

descrita en mapaches, coyotes y zorros en Estados Unidos, Francia y Hungría (Henn y

cols., 2009a), confirmada como causante de zoonosis (Eremeeva y cols., 2007). No

obstante, recientemente Márquez y cols. (2009) han detectado una nueva Bartonella sp.

en pulgas (P. irritans) de zorros, que está estrechamente emparentado con Bartonella

spp. detectadas en Pulex sp. en Perú, así como con diversos genotipos de B. rochalimae

descritos recientemente.

La importancia de B. henselae y B. rochalimae radica en que se trata de dos

agentes capaces de infectar al ser humano (Breitschwerdt y Kordick, 2000; Wormser,

2007), por lo que su aparición en tres especies de carnívoros silvestres de nuestra área

de estudio sugiere que estos animales son un componente importante en la circulación

de este patógeno en ecosistemas salvajes de la CAPV y que la transmisión al ser

humano puede ser posible a través de la picadura de vectores artrópodos que

previamente se hayan alimentado en estas especies silvestres.

Es de destacar el alto porcentaje de tejones infectados con Bartonella spp.

(12%), que tras el estudio de la secuencia de tres genes, no se corresponde con ninguna

de las existentes en el GenBank, por lo que podría tratarse de una nueva especie de

Bartonella, cercana genéticamente a B. clarridgeiae, pero no descrita hasta la fecha. La

amplia distribución de esta especie de Bartonella entre los tejones de nuestro área de

estudio y además, el hecho de que la mayoría estaban infestados por piojos

(Trichodectes melis; 77,8%) y pulgas (Chaetopsyla trichosa; 55,6%), así como por

garrapatas en todos los casos (en el 88,9% de los casos por Ixodes sp.), sugieren la

necesidad de examinar los vectores implicados para determinar cómo se desarrolla el

ciclo de esta Bartonella sp. Así, hemos podido observar que las especies que en general

tienen una mayor parasitación por garrapatas (lobo, tejón y zorro) son las que tienen una

mayor infección por Bartonella spp., salvo en el caso del gato montés. Precisamente, el

único gato montés con resultado positivo frente a Bartonella sp. no presentaba

parasitación por ningún ectoparásito.

Se ha detectado una mayor prevalencia de Bartonella spp. entre los individuos

jóvenes de nuestro estudio que entre los adultos. Diversos estudios han constatado que

existe una mayor seroprevalencia de Bartonella spp. entre los ejemplares jóvenes de

félidos y de cánidos (Yamamoto y cols., 1998; Chang y cols., 2000; Rotstein y cols.,

2000; Chomel y cols., 2004; Pons y cols., 2005), lo que podría sugerir una mayor

probabilidad de mantenerse en un estado de portador de este patógeno, en aquellos

individuos cuyo sistema inmunitario no se encuentra totalmente desarrollado.

Es de destacar que únicamente se hayan detectado animales con Bartonella spp.

en las provincias de Álava principalmente (83,3%), y en menor medida en Gipuzkoa

(16,7%), con la ausencia de este patógeno en todos los animales analizados de Bizkaia.

Resulta curioso que, aun habiendo analizado un mayor número de tejones en Bizkaia

(27) que en Gipuzkoa (6), y dada la similitud en cuanto a las características

climatológicas y biogeográficas de ambas provincias, no se haya detectado ningún

animal positivo en Bizkaia, por lo que convendría llevar a cabo estudios más detallados

para conocer la distribución y los factores que favorecen la transmisión de esta bacteria

entre los individuos de esta especie. Asimismo, sería necesario realizar estudios

adicionales encaminados a cultivar esta nueva especie de Bartonella, para poder

completar su caracterización y evaluar su presencia en otras especies de animales

silvestres y domésticos, así como sus implicaciones zoonóticas.

5.10.- DETECCIÓN DE Trichinella spp.

Mediante la técnica de la digestión artificial empleada en el presente estudio, se

ha comprobado que se puede llegar a detectar una baja carga de larvas de Trichinella

spp. en la musculatura, a diferencia de lo que ocurre cuando se usa el triquinoscopio

(Beck y cols., 2005b). El método de la digestión, por lo tanto, resulta una técnica eficaz

para su aplicación en estudios epidemiológicos en los que se espera encontrar bajas

tasas de parasitación.

En este caso, hemos podido determinar la presencia de larvas de Trichinella spp.

en el 3,5% de los zorros de la CAPV estudiados. Este resultado es similar al registrado

por otros autores, tanto en la Península Ibérica como en otras regiones europeas (3-

4,9%) (van der Giessen y cols., 1998; Pérez-Martín y cols., 2000; Sreter y cols., 2003a;

Magalhaes y cols., 2004; Davidson y cols., 2006), pero netamente inferior a la

prevalencia del 8,9% observada en zorros de Guadalajara (Criado-Fornelio y cols.,

2000).

A pesar de que otras especies de carnívoros pueden desempeñar un papel

importante en el ciclo de este parásito (Georgieva y cols., 2000), no se han encontrado

larvas de Trichinella spp. en ninguna de las demás muestras examinadas, por lo que

convendría realizar un estudio más exhaustivo para conocer su implicación en la

epidemiología de esta parasitosis en la CAPV.

Algunos autores señalan que debido a los hábitos menos estrictamente

carnívoros de algunas de estas especies, la prevalencia de parasitación por Trichinella

spp. puede ser inferior en ellos (Zarnke y cols., 1999), lo que concordaría con los

resultados obtenidos en nuestro estudio. En el caso del lobo, el bajo número de

ejemplares estudiados no nos permite obtener conclusiones con respecto a la

parasitación por triquinelosis en esta especie. Sin embargo, la explicación más plausible

estaría relacionada con la necesidad de que las presas de los carnívoros sean a su vez

carnívoros o al menos especies carroñeras. Esta condición mejora unas importantes

restricciones al ciclo de la Trichinella spp. que pueden verse más marcadas en nuestra

media específica.

En cuanto al tipo de muestra analizado, en ambos zorros positivos se

encontraron larvas de Trichinella spp. en el músculo diafragmático y en los músculos

flexores y extensores de la extremidad, coincidiendo con lo descrito por Kapel y cols.

(2005), quienes afirman que las diferentes especies de Trichinella encapsuladas

muestran una mayor predilección por el músculo de las extremidades, la lengua y el

diafragma en el zorro.

En todo caso, los resultados obtenidos reflejan la importancia que tiene el zorro

como reservorio de Trichinella spp. en la CAPV, confirmando la existencia de un ciclo

epidemiológico salvaje de triquinelosis en nuestro territorio. Todo ello puede ser

indicativo del estado sanitario de otras especies salvajes como el jabalí (Enemark y

cols., 2000), con el consiguiente riesgo para el ser humano que podría suponer el

consumo sin previo análisis de la carne de esta especie cinegética.

5.11.- ECTOPARÁSITOS

Este estudio nos ha permitido detectar la presencia de ectoparásitos en algo más

de la mitad de los carnívoros inspeccionados (60,1%), lo que supone una estimación de

la prevalencia global para la CAPV, algo más baja que la descrita por Domínguez

(2004) en las especies de carnívoros estudiadas en la provincia de Burgos (82,8%).

El turón ha sido la única especie animal de nuestro estudio en la que no se han

encontrado ectoparásitos de ningún tipo. Esta observación está en clara contradicción

con lo descrito por Domínguez (2004) que observó una prevalencia del 42,8% en esta

misma especie de mustélido.

Los resultados de este estudio, en lo que se refiere a tejones y zorros, son

inferiores a los que algunos autores describen en el sur peninsular (75 y 100%) (Millán

y cols., 2007; Martínez-Carrasco y cols., 2007).

El tejón y la garduña han sido los únicos que han presentado una parasitación

mixta de garrapatas, pulgas y piojos, lo que en el caso del tejón, concuerda con lo

descrito por otros autores en el norte y sur peninsular (Domínguez, 2004; Millán y cols.,

2007). Asimismo, se han encontrado infecciones mixtas de garrapatas y pulgas en

ginetas y en zorros de nuestro estudio, coincidiendo también con los hallazgos

realizados por otros autores (Domínguez, 2004; Millán y cols., 2007; Martínez-Carrasco

y cols., 2007).

Los resultados generales de los ectoparásitos presentes en las distintas especies

de carnívoros de nuestro entorno, se asemejan a lo previamente descrito en estos

animales en la Península Ibérica.

5.11.1.- Garrapatas:

Se observó una prevalencia de parasitación por garrapatas del 42,7% en

carnívoros silvestres de la CAPV. Esta prevalencia es ligeramente inferior a la detectada

por Domínguez (2004) en el norte de Burgos (60%).

En nuestro estudio, los tres únicos ejemplares de visón americano

inspeccionados se encontraron parasitados por garrapatas. En este caso, el bajo número

de animales examinado y el hecho de que dos de ellos fueron encontrados en la misma

zona y época de estudio, no nos permite obtener conclusiones claras con respecto a la

alta prevalencia de parasitación observada en esta especie animal. Sin embargo, en un

estudio realizado en Bizkaia, en el que se capturaban animales vivos, se pudo

comprobar que el 69% de los 13 visones americanos examinados estaban parasitados

por garrapatas (Refojos y cols., 2006).

El tejón y el zorro fueron las dos especies en las que se pudo examinar un mayor

número de ejemplares y en los que se observó una mayor parasitación por garrapatas

(del 53,3% y 50%, respectivamente). Comparando con otros estudios, Millán y cols.

(2007) encontraron garrapatas en los dos únicos ejemplares de tejón examinados y la

prevalencia observada en los zorros del sur peninsular fue similar a la nuestra (58%).

Sin embargo, Domínguez (2004) observó prevalencias más elevadas en ambas especies

animales en el norte de Burgos (del 71,4% para el tejón y del 73% en el caso del zorro).

En cuanto a algunos estudios llevados a cabo en otros países, Sreter y cols. (2003b)

observaron que el 86% de los zorros en Hungría estaban parasitados por garrapatas,

mientras que Do-Linh-San y cols. (2003) describieron una prevalencia del 70% en

tejones en Suiza.

Del total de las especies de carnívoros examinadas, únicamente los turones se

encontraron libres de este tipo de ectoparásitos, si bien únicamente se examinaron cinco

ejemplares de esta especie. Domínguez (2004) encontró garrapatas únicamente en uno

de los siete ejemplares de turón inspeccionados.

Se encontraron más individuos parasitados entre los casos recogidos durante los

meses de primavera, verano y otoño, que coincide con una mayor actividad de las

garrapatas en la vegetación, por lo que predispone a los animales a estar más parasitados

(Sonenshine, 1993).

El zorro y el tejón fueron los animales que presentaron un mayor espectro de

especies de garrapatas de nuestro estudio, ya que se llegaron a identificar siete y cinco

especies diferentes de estos ectoparásitos respectivamente, hecho que resulta habitual en

los carnívoros estudiados en Europa (Aubert, 1976; Encinas-Grandes, 1986; Sreter y

cols., 2003b; Domínguez, 2004; Millán y cols., 2007).

En cuanto a las infecciones mixtas, el zorro fue la especie con un mayor número

de especies diferentes de garrapatas por individuo, siendo además las combinaciones

más frecuentes de I. hexagonus y D. reticulatus por un lado, y la de I. hexagonus e I.

ricinus por otro. Este último caso concuerda con lo descrito por Domínguez (2004) en la

fauna silvestre de la zona de Burgos.

En el caso del zorro y del tejón, todas las especies aquí identificadas habían sido

previamente descritas en la Península Ibérica para ambas especies animales (Cordero

del Campillo y cols., 1994), salvo H. hispanica y H. concinna en el zorro, así como D.

reticulatus en el tejón. El conejo se suele considerar un hospedador habitual de la

especie H. hispanica, por lo que no resulta extraña su presencia en animales que predan

sobre ellos y con los que comparte el hábitat (Estrada-Peña y cols., 1992). A nivel

estatal, únicamente se conoce la presencia de H. concinna en el País Vasco, en las

inmediaciones del Parque Natural de Gorbea (Barandika y cols., 2006), lugar en el que

se encontró el único zorro infestado por esta especie de garrapata.

En cuanto al resto de los carnívoros, todas las especies de garrapatas

identificadas en esta tesis han sido previamente descritas en carnívoros silvestres en la

Península Ibérica (Cordero del Campillo y cols., 1994), aunque ésta es la primera

descripción de I. hexagonus en la gineta y la marta, así como de I. canisuga en el visón

americano. No obstante, I. hexagonus ya se había descrito previamente en la marta por

otros autores en Europa (Jaenson y cols., 1994; Page y Langton, 1996).

Comparando las prevalencias de I. hexagonus e I. ricinus observadas en zorros y

tejones de otras regiones, las de nuestro estudio resultaron ser similares a las descritas

en hábitats parecidos como es el norte de Burgos, mientras que fueron superiores a las

de Salamanca y a las del sur español (Encinas-Grandes, 1986; Domínguez, 2004; Millán

y cols., 2007; Martínez-Carrasco y cols., 2007). Estas dos especies de garrapatas se

suelen asociar a climas húmedos, mostrando una elevada exigencia higrométrica, por lo

que únicamente llegan a ser abundantes en la zona norte de la península, encontrándose

muy restringida su distribución en la mitad sur peninsular (Estrada-Peña y cols., 1992;

Camacho y cols., 2003; Márquez y cols., 2005; Barandika y cols., 2006).

Por último, hay que destacar que, salvo en el caso de los zorros cazados que se

recogieron en bolsas en el momento de su muerte, en el resto de los animales transcurrió

un tiempo variable entre la muerte y la recogida de los cadáveres, lo que pudo haber

ocasionado el desprendimiento de algunas garrapatas y, por tanto, la subestimación de la

prevalencia de la parasitación.

5.11.2.- Pulgas:

En este estudio se observó una parasitación global de pulgas del 26,8% de los

individuos estudiados.

Las especies animales que presentaron una mayor prevalencia de parasitación

por pulgas fueron el tejón (34,7%) y el zorro (34,4%). Se trata de unos valores bajos si

tenemos en cuenta los resultados de otros autores, quienes describen un porcentaje de

parasitación igual o superior al 50%, tanto en estudios realizados en España en ambas

especies animales, como en otras regiones europeas en el caso del zorro (Sreter y cols.,

2003b; Domínguez, 2004; Millán y cols., 2007). No obstante, las pulgas frecuentemente

abandonan a sus hospedadores tras la muerte de éstos (Soulsby, 1982) y dado que se

desconoce el tiempo que llevaban muertos los animales antes de su recogida, es posible

que los porcentajes de parasitación obtenidos en nuestro estudio estén subestimados. De

esta manera, se ha observado una mayor parasitación por pulgas en individuos abatidos

durante la temporada de caza, lo cual podría justificarse por el hecho de que estos

animales se recogían casi inmediatamente y eran remitidos al laboratorio en un periodo

breve de tiempo.

Se observó que los individuos adultos presentaban una mayor prevalencia de

parasitación, si bien la mayor parte de los ejemplares adultos eran tejones y zorros, dos

de las especies con un mayor porcentaje de parasitación por pulgas de este estudio, tal y

como se ha descrito anteriormente.

Asimismo, la prevalencia también fue mayor en los individuos recogidos durante

los meses de otoño e invierno. Este hecho puede estar relacionado con la menor

actividad de los animales durante la época invernal (Blanco, 1998), por lo que al pasar

más tiempo refugiados en sus madrigueras se encuentran más parasitados. Además,

algunas especies de pulgas se caracterizan por sus hábitos nidícolas, como es el caso de

las pulgas pertenecientes a las familias Pulicidae y Ceratophyllidae (Beaucournu y

Launay, 1990), habiendo sido éstas las más numerosas de este estudio.

En el presente trabajo, las especies de pulgas más frecuentemente encontradas

fueron P. melis (33,3%) y C. canis (26,3%), siendo en ambos casos, la relación de

hospedadores la habitualmente descrita por otros autores (Cordero del Campillo y cols.,

1994; Sreter y cols., 2003b; Domínguez, 2004).

En cuanto a la estacionalidad, se encontraron pulgas pertenecientes a P. melis a

lo largo de las cuatro estaciones del año, sin embargo C. canis sólo estuvo presente

durante los meses de otoño e invierno, lo cual difiere a lo observado por Beaucournu y

Launay (1990), quienes describieron la presencia de esta especie a lo largo de todo el

año en la zona mediterránea occidental de Francia.

C. trichosa se encontró únicamente en el tejón, que se considera uno de sus

principales hospedadores, junto con el zorro (Beaucournu y Launay, 1990).

En algunos casos, los carnívoros actúan como hospedadores accidentales de

algunas especies de pulgas, propias de otros animales que suelen ser presa habitual de

esos animales (Beaucournu y Launay, 1990). En este sentido, se han identificado cinco

especies de pulgas cuyo hospedador habitual son los lagomorfos o los roedores,

habiéndose encontrado en un número relativamente bajo y constituyendo, en algunos

casos, la primera descripción en esos hospedadores en la Península Ibérica. Éste es el

caso de C. sciurorum, cuyos principales hospedadores son la ardilla y el lirón gris,

habiéndose encontrado en la marta, la comadreja y la garduña de nuestro estudio,

tratándose de la primera descripción en España con respecto a estos dos últimos

hospedadores.

Asimismo, S. cuniculi, que parasita básicamente al conejo, en nuestro estudio se

encontró parasitando a un zorro de una zona de Álava, donde se conoce la presencia de

este lagomorfo (Palomo y Gisbert, 2002). N. fasciatus se ha asociado mayoritariamente

a roedores del género Rattus sp. y apareció en este estudio como pulga que parasitaba a

un visón americano.

Tampoco se había descrito antes la parasitación en el zorro por la especie C.

baeticus arvernus, citado previamente en la Península Ibérica en roedores (Cordero del

Campillo y cols., 1994), así como la presencia de A. erinacei subespecie erinacei en este

mismo hospedador, ya que dicha subespecie se había citado por primera vez parasitando

a un erizo en la zona de Burgos (Domínguez, 2004).

Por otra parte, también se han identificado dos especies de pulgas que en

ocasiones se han asociado con el hombre, que son P. irritans y C. felis felis, siendo esta

última vector de algunos agentes zoonóticos, como es el caso de B. henselae en la Rioja

(Blanco y cols., 2006). En el presente estudio, C. felis felis se ha encontrado parasitando

a la gineta, garduña, marta y tejón, por lo que sería interesante profundizar en su posible

implicación como vector de B. henselae en nuestro entorno.

5.11.3.- Piojos:

No se ha realizado un estudio exhaustivo de la parasitación por piojos debido al

planteamiento multidisciplinar de este trabajo, por lo que sólo se ha llevado a cabo un

estudio sobre la presencia y/o ausencia de animales parasitados por piojos. No obstante,

el presente estudio nos permitió determinar una prevalencia de parasitación por piojos

del 28,6% en los carnívoros silvestres de la CAPV, claramente superior a la observada

por Domínguez (2004) en la fauna silvestre de Burgos (3,8%).

Se identificaron tres especies diferentes de piojos, dos de ellos previamente

identificados en el norte y suroeste peninsular (Domínguez, 2004; Millán y cols., 2007):

T. melis y T. canis parasitando al tejón y al lobo, respectivamente. Además, se identificó

una tercera especie, T. retusus en la garduña. Esta última es una especie que parasita

principalmente a la garduña, aunque también se ha encontrado en otros hospedadores

como en el armiño, el turón, la marta y el visón americano de otros lugares del mundo

(Séguy, 1944; Beaucournu y Aubert, 1986).

El lobo y el tejón son dos especies gregarias, que viven en manadas o comparten

la madriguera con otros individuos de la misma especie (Blanco, 1998), lo que favorece

la transmisión por contacto de ectoparásitos entre ellos. La garduña, en cambio, es una

especie solitaria que sólo se une con su pareja durante el periodo de acoplamiento

(Blanco, 1998), lo cual explicaría la menor prevalencia de parasitación observada en

esta especie de carnívoro.

No se han encontrado piojos en el resto de carnívoros, que en la mayoría de los

casos son especies solitarias. El zorro, en cambio, a pesar de no ser un animal solitario y

siendo una de las especies más estudiadas, no parece ser hospedador de piojos ni en

este, ni en otros estudios (Sreter y cols., 2003b; Domínguez, 2004; Millán y cols., 2007;

Martínez-Carrasco y cols., 2007).

5.11.4.- Identificación de ácaros de la sarna:

Solamente se encontró una especie de ácaro de la sarna, Sarcoptes scabiei, y

solamente afectando al zorro con una prevalencia del 6,3%. Esta prevalencia puede estar

subestimada, ya que pudimos observar lesiones extensas, características de esta

enfermedad en un zorro en el que no se llegó a detectar el ácaro. Éste es un hecho

habitual, ya que cuando la enfermedad se encuentra en una fase muy avanzada, el ácaro

puede haber sido ya eliminado por el proceso inflamatorio cutáneo (Pence y

Ueckermann, 2002).

Aun y todo, la prevalencia observada en los zorros de nuestro estudio fue

bastante inferior a la descrita por otros autores, tanto en España (34,8%), como en otras

regiones europeas (21-25,3%) (Gortázar y cols., 1998a; Sreter y cols., 2003b; Balestrieri

y cols., 2006).

Además del zorro, en España únicamente se ha descrito la infección por sarna en

el lobo, sospechándose que éste pudo haber adquirido la infección a partir de zorros

infestados encontrados muertos y carroñeados (Domínguez, 2004).

En cuanto a las demás especies animales estudiadas, no se encontraron lesiones

compatibles con la sarna en ninguno de ellos. Otros autores, sin embargo, describen la

presencia de esta patología en algunos mustélidos como la garduña, la marta y el tejón

en otros lugares de Europa. No obstante, los casos descritos en estos animales han sido

más escasos y las prevalencias han sido más bajas que las descritas en los zorros

afectados en la misma área de estudio (Holt y Berg, 1990; Morner, 1992; Bornstein y

cols., 2001; Balestrieri y cols., 2006).

En el presente trabajo, todos los zorros afectados de la sarna se recogieron

durante los meses de otoño e invierno, tratándose de una época de las más limitantes en

cuanto a la disponibilidad de recursos tróficos. Además, coincide con el celo y, por lo

tanto, con una mayor frecuencia de contactos directos entre individuos (Gortázar, 1999).

Gortázar y cols. (1998a) observaron que la presencia de la sarna en España se

asociaba al declive de la población vulpina. Este trabajo no nos permite hacer una

valoración de los efectos de la sarna en las poblaciones de zorros de la CAPV, por lo

que sería interesante la realización de estudios más detallados para conocer el impacto

de esta enfermedad en las poblaciones de este cánido, así como la posible afección de

otras especies animales, tanto domésticas como silvestres. Además, dada la capacidad

de transmisión de los ácaros, no sólo a través del contacto, sino también a partir de

material contaminado tras el rascado, y dado que estos ácaros pueden sobrevivir en el

medio ambiente, conviene destacar la importancia de tomar precauciones para evitar la

transmisión a otros animales o al ser humano.

5.12.- ENDOPARÁSITOS

Las prevalencias de parasitación observadas en el presente estudio se

consideraron elevadas, puesto que más de la mitad de los ejemplares de cada especie de

carnívoro eliminaban huevos y/o larvas de helmintos, o bien ooquistes de coccidios.

Además, los resultados obtenidos mediante el análisis coprológico no deben

considerarse como valores absolutos, sino más bien como valores mínimos de

eliminación de parásitos, dadas las numerosas variables que inciden en la estimación de

la eliminación fecal de huevos de helmintos en el momento del análisis.

En todo caso, los resultados de frecuencia de parasitación obtenidos para las

distintas especies de carnívoros son, en general, similares a las publicadas previamente,

con un método más riguroso como es la realización de la necropsia helmintológica y la

recolección e identificación de los endoparásitos en su fase adulta (Loos-Frank y

Zeyhle, 1982; Feliú y cols., 1991; Miquel y cols., 1992, 1996; Seville y Addison, 1995;

Torres y cols., 1996a, 1998; Shimalov y Shimalov, 2000).

El análisis coprológico tiene el inconveniente de que no siempre se puede

alcanzar el nivel específico en la identificación, dadas las similitudes existentes entre los

huevos y/o larvas de algunos parásitos estrechamente emparentados. No obstante, en

este estudio se han podido identificar todos los grupos parasitarios previamente

descritos en España (Feliú y cols., 1996; Martínez-Carrasco y cols., 2007).

Esta discusión se centra exclusivamente en los resultados más destacables. En

este sentido, los ancilostómidos y las capilarias han sido las especies más prevalentes de

este estudio (28,8% y 25,1%, respectivamente). En este caso, si bien no se ha podido

determinar la especie a la que pertenecían, hay que destacar que dos especies de

ancilostómidos, Ancylostoma caninum y Uncinaria stenocephala, que en España se han

descrito previamente en el zorro y el lobo (Miquel y cols., 1993; Segovia y cols., 2004),

tienen un carácter zoonótico (Soulsby, 1982; Milhaud y cols. 1999).

En cuanto a las capilarias, tampoco se han podido determinar las especies a las

que pertenecían los huevos encontrados en este estudio. Sin embargo, se ha hallado una

especie con carácter zoonótico, C. aerophila, durante el estudio postmortem. La

prevalencia de C. aerophila observada en el presente trabajo fue inferior a la descrita en

otros estudios en los que se llevó a cabo el examen de la tráquea y de los bronquiolos

pulmonares. Así, observamos que el 9,1% de las martas, el 6,3% de los zorros y el 4,3%

de las garduñas de nuestro estudio estaban parasitados por este nematodo, aunque los

resultados de otros autores en el noreste peninsular mostraban unas prevalencias

comprendidas entre el 40-50,98% para la marta, el 34,8-65,4% para el zorro y del 34-

51,7% para la garduña (Miquel y cols., 1993; Feliú y cols., 1996; Gortázar y cols.,

1998b; Segovia y cols., 2007). Estos porcentajes se asemejan más a los obtenidos

durante el análisis coprológico para la marta (46,2%), el zorro (22%) y la garduña

(36,4%). Seville y Addison (1995) sólo encontraron un 4% de parasitación en la marta

(Martes americana) en el continente americano, mientras que Davidson y cols. (2006)

describieron una prevalencia del 88% en los zorros de Noruega. El hallazgo de este

parásito en el tracto respiratorio, concuerda con lo previamente descrito por Nevárez y

cols. (2005), quienes además concluyen que se trata de un parásito cuya localización se

restringe a los bronquiolos de los lóbulos caudales del pulmón.

Algunos autores han observado que las diferencias en cuanto a la prevalencia de

parasitación por ambos nematodos difiere dependiendo de las condiciones

climatológicas de cada lugar (Miquel y cols., 1993; Richards y cols., 1995; Segovia y

cols., 2004). Además, al tratarse de nematodos que también afectan a perros domésticos

(Gracenea y cols., 2009), la coexistencia de animales domésticos y silvestres puede

favorecer el mantenimiento del ciclo de vida de estos parásitos en nuestro entorno.

En cuanto a los nematodos gastrointestinales del género Strongyloides sp., si

bien se ha obtenido una prevalencia muy baja en nuestro estudio (2,6%), se trata de un

género con dos especies que se han descrito previamente en la Península Ibérica. La

especie S. mustelorum en la comadreja y S. stercoralis, esta última afectando al perro y

al ser humano (Miquel y cols., 1993; Cordero del Campillo y cols., 1994; Feliú y cols.,

1996; Torres y cols., 1996b, 1996c).

Con respecto a los cestodos, a pesar de la baja prevalencia detectada (2,6%),

cobra especial interés la presencia de Dipylidium sp. en una garduña. Hasta donde

conocemos, sólo se había descrito la presencia de la especie D. caninum en los cánidos

silvestres (Loos-Frank y Zeyhle, 1982; Gortázar y cols., 1998b; Shimalov y Shimalov,

2000; Smith y cols., 2003; Martínez-Carrasco y cols., 2007). No obstante, recientemente

Millán y Casanova (2009) han descrito la presencia de las especies D. caninum y D.

carracidoi en gatos asilvestrados en Mallorca. D. caninum es un parásito zoonótico que

utiliza como hospedadores intermediarios a las pulgas C. canis, C. felis y P. irritans

(Soulsby, 1982), que han sido halladas parasitando a diversas especies de carnívoros

silvestres de este estudio, incluyendo a la garduña. Sería interesante determinar la

especie de Dipylidium detectada en la garduña.

La presencia de Angiostrongylus spp. cobra especial interés por el conocimiento

previo de la presencia de la especie A. vasorum en la zona y especialmente en perros

(Juste y cols., 1993).

En este caso, el hecho de haber encontrado huevos y/o larvas de este nematodo

en las heces nos permite confirmar, no sólo que estos carnívoros están actuando como

reservorios del parásito, sino también el papel como diseminadores que están

desempeñando en el área estudiada. Además, esta cuestión se ve reforzada por la alta

prevalencia de Angiostrongylus sp. (42%) encontrada previamente, tras la realización de

la necropsia helmintológica en los tejones de la CAPV por nuestro equipo (Millán y

cols., 2004b). Por otra parte, también se han encontrado ejemplares adultos de

Angiostrongylus sp. en el análisis de las vísceras de tejones y zorros de este estudio.

La localización de estos parásitos en la arteria pulmonar del corazón, así como

en el ventrículo derecho y también en los bronquiolos pulmonares, parece ser la

habitual, coincidiendo con lo que describen numerosos autores en la literatura

(Ubelaker, 1986; Lima y cols., 1994; Simpson, 1996).

El análisis morfométrico nos ha permitido observar que existen diferencias en

cuanto a las medidas de los nematodos recogidos en los zorros y en los tejones. Las

características más notables que diferencian las especies A. vasorum y A. daskalovi,

tanto en los vermes machos como hembras, han sido la longitud total y la longitud del

esófago. En general, A. daskalovi presentaba unas mayores dimensiones que A.

vasorum, salvo en el caso de las espículas de los machos, que eran significativamente

más pequeñas en lo ejemplares de A. daskalovi. Estas diferencias entre las dos especies

de Angiostrongylus se ven claramente reforzadas tras las diferencias genéticas

observadas en la secuenciación. De hecho, el estudio filogenético muestra que A.

daskalovi se encuentra genéticamente en una posición intermedia entre A. costaricensis

y A. vasorum, pero claramente separada de A. cantonensis.

El alto porcentaje de zorros parasitados por A. vasorum y de tejones con A.

daskalovi, confirman la amplia distribución de estos parásitos en el área estudiada.

Hasta donde conocemos se trata de la primera descripción de A. daskalovi en la

Península Ibérica.

La prevalencia de A. vasorum en zorros (33,3%) se encuentra dentro del rango

descrito por otros autores en la Península Ibérica. Así, Segovia y cols. (2004)

encontraron una prevalencia del 36% en 25 zorros estudiados en la costa Cantábrica,

mientras que otros estudios llevados a cabo en el noreste peninsular describen unas

prevalencias de entre el 21,85 y el 32,5% (Miquel y cols., 1993; Feliú y cols., 1996;

Segovia y cols., 2004; Mañas y cols., 2005). Gortázar y cols. (1998b) describieron una

prevalencia de infección del 20,9% a partir de 29 zorros en el valle del Ebro, mientras

que Segovia y cols. (2004) observaron una prevalencia del 3,8% en 53 zorros en

Andorra. Las prevalencias descritas en zorros en el sur peninsular son más bajas, de

entre el 1,8 y el 5,3% (Segovia y cols., 2004; Martínez-Carrasco y cols., 2007).

De este modo, la presencia de A. vasorum en los zorros de nuestro estudio, así

como la prevalencia observada, confirma que el ciclo salvaje de este parásito está

presente en la CAPV, tal y como se había descrito previamente en base a hallazgos en

perros (Juste y cols., 1993) y que los zorros podrían considerarse como reservorios de

este parásito.

La identificación de la especie A. daskalovi resulta novedosa en la Península

Ibérica, ya que tan sólo se había descrito esta especie de nematodo en tejones, garduñas

y martas en Bulgaria (Janchev y Genov, 1988). La especie Angiostrongylus

gubernaculatus identificada en tejones (Taxidea taxus) en Norteamérica presenta unas

mayores dimensiones que los nematodos identificados en el presente estudio (Janchev y

Genov, 1988).

En España, algunos autores han descrito la presencia de A. vasorum en tejones

en el noreste peninsular con una prevalencia de 6,06-7,7% (Miquel y cols., 1993; Feliú

y cols., 1996), así como en la región mediterránea oriental (6,4%) (Torres y cols., 2001).

Debido a las escasas descripciones existentes y dado que se trata de especies de

Angiostrongylus con características morfométricas similares, se plantea la necesidad de

revisar anteriores hallazgos de A. vasorum en tejones en la Península Ibérica, mediante

análisis molecular y secuenciación. A pesar de que en el presente estudio no se ha

llevado a cabo la secuenciación de la región ITS2 de todos los vermes encontrados, los

análisis morfométricos han permitido una clara diferenciación entre ambas especies.

Resulta interesante el descubrimiento por un lado, de una nueva especie de

Angiostongylus entre los carnívoros silvestres, por otro lado es de destacar la

coexistencia de los nematodos A. vasorum y A. daskalovi en un mismo área de estudio.

Resulta asimismo interesante observar la especificidad a nivel de hospedador que

presenta cada uno de ellos, A. vasorum por el zorro y A. daskalovi por el tejón. El

nematodo respiratorio A. vasorum es de ciclo indirecto, que utiliza como hospedadores

intermediarios diferentes especies de caracoles y limacos o incluso ranas (Bolt y cols.,

1994; Anderson, 2000). Por lo tanto, podemos deducir que estos invertebrados forman

parte de la cadena alimentaria del zorro principalmente, aunque también del tejón,

corroborando de esta manera lo que describen otros autores en relación a la importancia

de la dieta de cada hospedador como indicativo de la vermifauna presente en ellas (Feliú

y cols., 1996; Segovia y cols., 2007). El análisis del contenido estomacal de algunos de

estos tejones consistió en grandes cantidades de lombrices de tierra y se desconoce si

estos invertebrados pueden actuar como hospedadores intermediarios de A. daskalovi, e

incluso si estas lombrices presentan una mayor especificidad para A. daskalovi que para

A. vasorum. Además, resulta interesante el hecho de que todos los tejones, salvo uno, y

todos los zorros infestados por este nematodo procedían de las provincias de Gipuzkoa

y de Bizkaia, áreas que se caracterizan por su clima húmedo, lo que favorece la

supervivencia de estos invertebrados.

Sería necesario profundizar en los factores que intervienen en el ciclo de vida de

las especies de Angiostrongylus detectadas, así como en sus repercusiones sanitarias

para los carnívoros silvestres, domésticos o incluso para el hombre. Otra cuestión

interesante consistiría en averiguar por qué en los Balcanes se ven afectados diferentes

especies de mustélidos por este nematodo, mientras que sólo el tejón parece estar

infectado por esta especie en la Península Ibérica.

DISCUSIÓN GENERAL

6.- DISCUSIÓN GENERAL:

A la vista de los resultados obtenidos en el presente trabajo se ha comprobado

que los carnívoros silvestres pueden actuar como especies indicadoras del estado

sanitario de un entorno o área determinada, en lo que se refiere a enfermedades

zoonóticas y emergentes o de nueva aparición. Es de destacar el papel del tejón y del

zorro como candidatos de elección en estudios de vigilancia, debido por un lado, a que se

trata de dos especies muy comunes y relativamente abundantes (Fernández de Mendiola

y Bea, 1998; Palomo y Gisbert, 2002) y por otro lado, por su susceptibilidad a la casi

totalidad de agentes zoonóticos investigados y porque su estudio ha permitido poner en

evidencia la existencia, en nuestro entorno, de agentes patógenos no descritos hasta la

fecha en España.

Así, se ha constatado que los carnívoros pueden ser buenos indicadores de la

circulación en el medio silvestre de algunas enfermedades que afectan al ser humano y a

los animales domésticos, como es el caso de la salmonelosis, la yersiniosis, la

leptospirosis y la toxoplasmosis, o incluso de la ausencia de otras, como ocurre con la

tuberculosis y las encefalopatías espongiformes transmisibles en nuestro área de

estudio. En estos casos, se puede considerar que los hábitos alimentarios de los

carnívoros representan una fuente importante para adquirir la infección, dado que estos

animales se sitúan en la cúspide de la pirámide trófica y resulta evidente la vía

alimentaria de presas infectadas como posible fuente de infección de todos estos agentes

patógenos (Reilly y cols., 1970; Wray y cols., 1977; Hejlicek y cols., 1997).

En el tejón, además de los patógenos ya mencionados, se han aislado

micobacterias no tuberculosas y, una vez más, se ha podido comprobar la gran capacidad

de este mustélido de albergar distintos agentes infecciosos. No obstante, la importancia

de este carnívoro en el presente estudio radica principalmente en el descubrimiento de

una serie de agentes patógenos, como es el aislamiento del hongo zoonótico

Coccidioides immitis, cuya presencia no había sido descrita previamente en Europa,

afectando a un mamífero salvaje. Asimismo, el hallazgo de una nueva especie de

Bartonella, no descrita hasta la fecha, pero afectando a un número elevado de tejones de

este estudio, ha puesto en evidencia la necesidad de realizar estudios adicionales

encaminados a evaluar su presencia en otras especies de animales silvestres y

domésticos, así como sus implicaciones zoonóticas. Por último, el estudio de este

mustélido ha permitido identificar el escasamente conocido nematodo Angiostrongylus

daskalovi, hasta ahora no descrito en la Península Ibérica y cuya identificación plantea la

necesidad de revisar anteriores hallazgos de Angiostrongylus vasorum en tejones.

Además, la confirmación por PCR de la identidad del género de este verme, su

identificación morfológica con A. daskalovi y la obtención y depósito de una secuencia

específica de especie, constituyen una de las aportaciones más importantes de este

estudio al conocimiento de la parasitofauna Europea.

El estudio del zorro ha permitido confirmar la implicación de este cánido como

reservorio de algunos patógenos característicos de esta especie, como es el parásito

Trichinella sp., confirmando la existencia de un ciclo epidemiológico salvaje de

triquinelosis en el área estudiada, así como la presencia del ácaro Sarcoptes scabiei,

causante de la sarna sarcóptica. Asimismo, en el zorro, junto con los lobos de este

estudio, se ha detectado la presencia del agente Bartonella rochalimae, que hasta donde

conocemos, supondría la primera descripción en España y recientemente ha sido

confirmado como causante de zoonosis (Eremeeva y cols., 2007).

A pesar de que el tejón y el zorro han sido las especies que se han estudiado en

mayor número y que nos han aportado más información acerca de la presencia de los

distintos agentes infecciosos y parasitarios presentes en la zona, también merece la pena

destacar la contribución del gato montés a los resultados obtenidos en el presente

estudio. Por un lado, debido a la detección del protozoo Toxoplasma gondii, del que los

félidos se consideran los únicos hospedadores definitivos (Dubey, 1994), en cuyo ciclo

el gato montés podría estar desempeñanando un papel importante. Por otra parte, por la

detección del agente zoonótico Bartonella henselae, cuyo reservorio principal suele

considerarse al gato doméstico (Chomel y cols., 2004) y cuya presencia en el gato

montés confirma su circulación en el medio silvestre.

En cuanto a otras especies, como la garduña y la gineta, resulta interesante el

hallazgo de casos de linfoma en ambas especies, tratándose de una contribución

relevante al conocimiento de las enfermedades neoplásicas, escasamente conocidas

entre las especies silvestres.

Se pudo observar que la distribución de todos los agentes patógenos estudiados

fue muy amplia, salvo en el caso de la Bartonella, que no se detectó en ninguno de los

ejemplares recogidos en la provincia de Bizkaia. Algo similar ocurrió con

Angiostongylus sp., puesto que únicamente se encontraron en individuos recogidos en

las provincias de Gipuzkoa y Bizkaia (sólo un individuo con A. daskalovi en Álava),

aunque en este caso se asoció a la presencia de los hospedadores invertebrados

intermediarios de este parásito que se pueden encontrar más frecuentemente en climas

más húmedos.

La aparición de algunos agentes patógenos, como Yersinia sp. y T. gondii, se

asoció más frecuentemente con la época invernal, ya que se ven favorecidas por

diversos desencadenantes, como el clima húmedo y frío, así como la menor

disponibilidad de alimentos, lo que predispone a los animales a un debilitamiento

general, siendo de esta forma más susceptibles a adquirir enfermedades (Mair, 1973;

Gasper y Watson, 2001; Dubey y Odening, 2001). No obstante, otros microorganismos

son tolerantes a un amplio rango de temperaturas, por lo que, como es el caso de

Salmonella sp. (Morner, 2001), en este estudio sus prevalencias fueron más elevadas

durante los meses de verano.

Todos estos resultados ponen de manifiesto que el conocimiento actual de las

enfermedades que afectan a los carnívoros silvestres es todavía limitado en nuestro

entorno y resalta la necesidad de seguir indagando en el conocimiento de estos agentes

patógenos y, sobre todo, de aquellas enfermedades emergentes de las cuales se

desconocen, en gran medida, tanto los factores que favorecen su aparición, como las

repercusiones que podrían acarrear en nuestro entorno.

CONCLUSIONES GENERALES

7.- CONCLUSIONES GENERALES:

1- Salmonella spp. (9,2%) y Yersinia spp. (5,8%) se encuentran presentes de forma

asintomática en las poblaciones de carnívoros silvestres de la CAPV. Los

tejones albergan el mayor número de serotipos distintos de Salmonella, mientras

que los serotipos de interés zoonótico (Typhimurium y Enteritidis) se encuentran

en el zorro, la garduña y la comadreja. La especie más frecuente de Yersinia es

Y. enterocolitica, afectando al tejón, al zorro y a la garduña, aunque también ha

estado presente Y. pseudotuberculosis en un gato montés.

2- Se ha confirmado una amplia distribución de Leptospira spp. entre los

carnívoros silvestres del País Vasco (61,5%), siendo el serovar bratislava el que

presenta una mayor prevalencia.

3- Todas las especies estudiadas se ven parasitadas por Toxoplasma gondii (8,8%)

y representan un eslabón importante en la cadena epidemiológica de la

toxoplasmosis en nuestro entorno. Sin embargo, el gato montés parece ser la

única especie con potencial como hospedador definitivo de T. gondii.

4- Se han identificado tres especies de Bartonella entre los carnívoros silvestres del

País Vasco (5,7%), dos de ellas zoonóticas: B. henselae infectando al gato

montés y B. rochalimae al zorro y al lobo. Se ha identificado una nueva especie

de Bartonella, no descrita hasta la fecha, infectando a los tejones.

5- El zorro desempeña un papel importante en la epidemiología de dos parásitos

casusantes de zoonosis en la CAPV como son: Trichinella spp. (1,2%) y

Sarcoptes scabiei (6,3%), que se caracterizan por su relativamente baja

especificidad de hospedador.

6- Los carnívoros son hospedadores de distintas especies de ectoparásitos, de entre

las que se podrían destacar distintas especies de Ixodes, principalmente I.

hexagonus (42,3%). Asimismo, una gran variedad de pulgas parasitan a

prácticamente la totalidad de especies de carnívoros estudiados (26,8%). Los

piojos se han observado preferentemente parasitando al tejón (72%) y en menor

número a la garduña (22,2%) y al lobo (1,5%).

7- Se ha detectado una gran diversidad de helmintos parasitando a todas las

especies estudiadas (71,7%). Es de destacar la detección de Angiostrongylus

vasorum en un alto porcentaje de los zorros estudiados (33,3%), así como de

Angiostrongylus daskalovi en el 24% de los tejones examinados, constituyendo,

hasta donde conocemos, la primera descripción de este parásito en España.

8- Los carnívoros silvestres no parecen estar implicados en el ciclo de

Mycobacterium bovis en el País Vasco, sin embargo los tejones pueden albergar

otras micobacterias como Mycobacterium intracellulare y Mycobacterium

avium subsp. hominissuis (1,2%).

9- No se ha detectado ningún animal infectado con Coxiella burnetii, Anaplasma

phagoytophilum, Borrelia spp., Francisella tularensis, SFG-Rickettsia y la

proteína priónica patológica, indicando un bajo potencial de los carnívoros

silvestres como reservorios de estos agentes en la CAPV.

10- Se ha detectado una proporción inesperadamente alta de procesos tumorales para

las que no ha sido posible establecer posibles factores etiológicos comunes.

11- La vigilancia sanitaria de los carnívoros silvestres ha permitido detectar

enfermedades nuevas o emergentes, como la coccidioidomicosis en un tejón,

primer caso descrito en un mamífero silvestre en Europa.

12- Los carnívoros silvestres resultan unos buenos indicadores del estado sanitario

del medio natural. El tejón y el zorro son especies de elección en estudios de

vigilancia de enfermedades de interés en salud pública y sanidad animal, por su

abundancia, su implicación en la cadena trófica y por la variedad de procesos

que albergan.

RESUMEN, LABURPENA, SUMMARY

8.- RESUMEN:

Las enfermedades transmisibles de la fauna silvestre constituyen una caja negra

que actúa como reservorio de nuevas o modificadas patologías que afectan, tanto a las

especies animales domésticas y silvestres, como a la población humana. La situación en

la CAPV no es distinta del resto del mundo en este aspecto y por ello puede

considerarse que los carnívoros silvestres, al ocupar la cúpula de la pirámide

alimentaria, pueden actuar como buenos indicadores de las enfermedades presentes en

el medio natural.

En este estudio se ha centrado la atención en la descripción de los patrones de

presentación de infecciones y enfermedades incluidas en la Oficina Internacional de

Epizootias como enfermedades de declaración obligatoria, por ser importantes

problemas en la sanidad animal y/o en la salud pública, de las que se desconoce en gran

parte su epidemiología en el medio silvestre de la CAPV.

El estudio se realizó sobre los cadáveres de 215 carnívoros silvestres de 10

especies diferentes, principalmente tejones (n=75) y zorros (n=64), así como sobre 42

sueros, la mayoría pertenecientes a tejones (n=11), martas (n=11) y ginetas (n=11),

todos ellos recogidos durante los años 2001 a 2006, en el ámbito territorial de la CAPV.

A partir de este material se realizó una anamnesis sobre las circunstancias de su

recogida y, en el caso de los cadáveres, se llevó a cabo una necropsia sistemática,

ordenada y completa, en la que se tomaron muestras representativas para su estudio

histopatológico, microbiológico y molecular. En el caso de los sueros, se realizaron las

pruebas más habituales para la detección de anticuerpos específicos frente a los agentes

infecciosos correspondientes.

Como resultado se pudo determinar que la causa más frecuente de muerte de los

carnívoros examinados fue el traumatismo causado por atropello. Los animales

examinados resultaron ser portadores de Salmonella spp. en un 9,2% de los casos y de

Yersinia spp. en un 5,8%. De la primera se identificaron 11 serotipos, que aparecieron

especialmente representados en el tejón. Los serotipos de interés zoonótico, Enteritidis y

Typhimurium, se hallaron en el zorro, la garduña y la comadreja. La especie más

frecuente de Yersinia fue Y. enterocolitica, que se detectó en el zorro, el tejón y la

garduña, pero también se detectó Y. pseudotuberculosis en un gato montés. Sólo se

aislaron micobacterias de dos tejones: Mycobacterium intracellulare en un caso y

Mycobacterium avium subespecie hominissuis en otro. No se obtuvo ningún resultado

positivo a la proteína priónica patológica.

La seroprevalencia de la infección por leptospiras fue alta, destacando la de los

serovares bratislava (61,5%) y muenchen (23,1%), y en menor medida la de

icterohaemorrhagiae (7,7%) y canicola (2,6%). Se detectaron anticuerpos frente a

Toxoplasma gondii en el 72,5% de los sueros examinados, mientras que la detección

molecular de ADN del agente sólo produjo el 8,8% de resultados positivos. Los

métodos de detección molecular de las enfermedades transmitidas por artrópodos no

revelaron la presencia de Coxiella, Borrelia, Anaplasma, Francisella ni Rickettsia. Sin

embargo, pusieron de manifiesto la presencia de varias especies del género Bartonella

con una notable especificidad de especie, ya que B. henselae aparecía solamente en gato

montés (16,7%), B. rochalimae en zorro (1,6%) y lobo (33,3%), mientras que en tejones

(12%) se detectó una especie no identificada previamente.

De entre las distintas especies de carnívoros examinadas, el género Trichinella

se detectó en el 1,2% de los animales, todos ellos zorros. Los ácaros de la sarna

(Sarcoptes scabiei) se detectaron en el 6,3% de los zorros examinados. El 71,7% de los

carnívoros presentaba algún tipo de garrapata y se encontró una gran variedad de pulgas

en las distintas especies, mientras que sólo se hallaron piojos en ejemplares de tejón,

lobo y garduña. La mayor parte de los animales examinados (42,7%) eran eliminadores

fecales de huevos o larvas de helmintos y de ooquistes de coccidios. El género

Angiostrongylus se encuentra presente en el sistema cardiorrespiratorio de los zorros

(33,3%) y de los tejones (24%), representado por dos especies totalmente específicas de

hospedador: A. vasorum en zorros y A. daskalovi en tejones. Es la primera vez que esta

última especie es descrita fuera de los Balcanes y sugiere la necesidad de revisar la

identificación de A. vasorum en tejones en trabajos anteriores.

Otro hallazgo singular fue el del hongo Coccidioides immitis en un tejón, que

constituye la primera cita en un mamífero silvestre en Europa. También es de destacar

el hallazgo de dos casos de linfoma en mustélidos: en una garduña y en una gineta.

Los limitados factores individuales (especie, sexo y edad) y ambientales que se

investigaron tuvieron efectos variables y generalmente débiles en la frecuencia de las

patologías detectadas. La confirmación de la circulación de agentes patógenos

relevantes para la prevención animal y la salud pública en las poblaciones de carnívoros

silvestres, así como hallazgos inesperados de algunos agentes zoonóticos, resaltan la

importancia de mantener programas de vigilancia de la patología de la fauna silvestre.

LABURPENA:

Fauna basatiaren gaixotasun kutxakorrek kaxa beltz bat eratzen dute, patologia

berri zein eraldatuen gordailu gisa jokatuz, etxeko animalia eta basatiei, zein giza

populazioari eraginez. Zentzu honetan, Euskal Autonomia Erkidego-ko egoera ez da

ezberdina munduko beste edozein lurralderekin alderatuta, eta horrexegatik, haragijale

basatiak elikakatearen kupula osatzen dutenez gero, ingurugiroan dauden gaixotasunen

adierazle gisa joka dezakete.

Lan hau, Epizootien bulego internazionalaren arabera, nahitaezko deklarazio

gaixotasun gisa kontsideratuta dauden infekzio eta gaixotasunen aurkezpen-patroiaren

deskribapenean oinarritu da, animalia zein giza osasunarentzat garrantzitsuak diren

gaitzak kontuan hartuta eta epidemiologikoki gehiegi ezagutzen ez diren gaixotasunetan

oinarrituz. Ikerketa 10 espezie ezberdinetako 215 haragijale basatiren hilotzekin burutu

zen: azkonarrekin (n=75) eta azeriekin (n=64) gehien bat. Bestalde, 42 serum, gehienak

azkonarrenak (n=11), lepahorienak (n=11) eta katajinetenak (n=11) izan ziren batez ere.

Lagin horiek guztiak, Euskal Autonomia Erkidego-an, 2001 eta 2006 urteetan jasoak

izan ziren.

Material horrekin, anamnesi bat burutu zen alde batetik, zein egoeratan jaso

ziren jakiteko, eta bestalde, hilotzen kasuan, nekropsia sistematiko, ordenatu eta oso bat

egin zen, lagin adierazgarriak hartuz ondorengo ikerketa histopatologiko,

mikrobiologiko eta molekularrak egin ahal izateko. Serumen kasuan, probarik

ohikoenak burutu ziren agente infektagarrien antigorputz espezifikoak detektatu ahal

izateko.

Emaitza gisa haragijaleen heriotzaren kausarik ohikoena ibilgailuen

harrapatzearen ondorioz sortutako traumatismoak zirela ondorioztatu zen. Aztertutako

animalien %9,2-ak Salmonella sp. mikroorganismoaren eramaile gisa jokatzen zuela

ikusi zen eta %5,8-ak Yersinia sp.-ren eramaile gisa. Salmonella sp.-ren kasuan 11

serotipo identifikatu ziren, azkonarrengan bereziki. Interes zoonotikoa duten serotipoak,

Enteritidis eta Typhimurium, azeri, lepatxuri eta erbinudearengan aurkitu ziren. Yersinia

espezierik ohikoena Y. enterocolitica izan zen, azeri, azkonar eta lepatxuriengan aurkitu

zelarik, baina Y. pseudotuberculosis espeziea ere identifikatu zen basakatu batean.

Mikobakterioak bi azkonarrengan isolatu ziren soilik: Mycobacterium intracellulare

batean, eta Mycobacterium avium subespezie hominissuis bestean. Proteina prioniko

patologikoaren kasuan ez zen emaitza positiborik lortu.

Leptospira bidezko infekzioaren seroprebalentzia altua izan zen, bratislava

(61,5%) eta muenchen (23,1%) serobareena bereziki, eta neurri txikiago batean,

icterohaemorragiae (7,7%) eta canicola (2,6%) serobareena. Aztertutako serumen

%72,5-ean Toxoplasma gondii-ren aurkako antigorputzak antzeman ziren, biologia

molekularraren bidezko analisiak ADN-a %8,8-an bakarrik aurkitu zuelarik.

Artropodoen bidez transmitituriko gaixotasunen biologia molekularraren bidezko

analisiak negatiboak izan ziren ondorengo agenteen detekzioan: Coxiella, Borrelia,

Anaplasma, Fancisella eta Rickettsia. Dena den, Bartonella espezie ezberdinen agerrera

ikusi ahal izan zen, espezie-espezifitate handiarekin gainera, izan ere, B. henselae

basakatuan baino ez zen ageri (16,7%), B. rochalimae azeri (1,6%) eta otsoarengan

(33,3%), bestalde, azkonarrengan, aurretik identifikatu gabeko espezie bat detektatu zen

(12%).

Haragijale espezie ezberdinen artean, Trichinella parasitoa %1,2-rengan baino

ez zen aurkitu, denak azeriak zirelarik. Sarnaren gaixotasunaren eragile diren akaroak

(Sarcoptes scabiei) aztertutako azerien %6,3-an baino ez ziren aurkitu. Haragijaleen

%71,7-ak akainak zituen, bestalde, arkakuso espezie ezberdin ugari aurkitu ziren, baina

zorriak, aldiz, azkonar, otso eta lepatxuriengan bakarrik. Animalia gehienek (%71,7)

gorozkien bitartez, helmintoen arrautza zein larbak edo kokzidioen ookisteak

kanporatzen zituzten. Angiostrongylus generoko parasitoak azeri (33,3%) eta

azkonarrengan (24%) bihotz eta arnas-aparatuan aurkitzen dira, espezie-espezifitatea

duten bi espezie ezberdin identifikatu zirelarik: A. vasorum azeriengan eta A.daskalovi

azkonarrengan. Azken horren aurkikuntza Balkanetatik kanpo egin den lehen aipamena

da eta aurretik egindako zenbait lanen berrikusketa proposatzen du, A. vasorum

azkonarrengan agertu diren ikerketena bereziki.

Beste aurkikuntza bitxi bat Coccidioides immitis onddoarena izan zen; izan ere,

Europa mailan ugaztun basati batengan egin den lehen aipamena da. Azpimarragarriak

dira era berean, mustelidoengan aurkitu diren bi linfoma kasu: bata lepatxuriarengan eta

bestea katajinetarengan.

Ikertutako faktore indibidual (espezie, sexu eta adin) eta ingurumen-faktoreek,

efektu aldakorrak eta orokorrean ahulak izan zituzten, detektatutako patologien

frekuentzietan, nahiz eta eskasak izan zirela aintzat hartu behar den. Haragijale basatien

populazioan, animalia nahiz gizakiaren osasunarentzat garrantzitsuak diren agente

patogenoen zirkulazioa konfirmatu da eta espero ez ziren zenbait agente zoonotikoren

agerrera ere frogatu da, guzti honek, fauna basatiarengan zaintza programen

mantenitzeak duen garrantzia azpimarratzen duelarik.

SUMMARY:

Transmissible diseases of wildlife are like a black box that acts as a reservoir of

new or modified pathogens affecting both humans and animals (domestic and wild

animal species). The situation in the Autonomous Community of the Basque Country

(CAPV) do not differ from the rest of the world in this aspect and, therefore, it should

be considered that wild carnivores, at the top of the food chain, are good indicators of

diseases present in the environment.

The present study was focused on describing patterns of occurrence of infections

and diseases notifiable to the International Office of Epizootics (OIE). These diseases

are important for public or animal health or both, and their epidemiology in the CAPV

is largely unknown. The study included the corpses of 215 wild carnivores from 10

different species, mainly badgers (n=75) and foxes (n=64) and 42 sera mostly belonging

to badgers (n=11), European pine martens (n=11) and genets (n=11), all collected

between the years 2001-2006 in the CAPV.

Detailed records were obtained regarding the circumstances at sample collection.

For the corpses, a systematic, ordered and complete necropsy was performed, and

representative samples were taken for histopathological, microbiological and molecular

analyses. The sera were analysed using common immunological tests to detect specific

antibodies against infectious agents.

The main cause of death of carnivorous was trauma caused by car accidents. The

animals examined were carriers of Salmonella sp. and of Yersinia sp. in 9.2% and 5.8%

of cases, respectively. Eleven Salmonella sp. serotypes were identified, being most well

represented in the badger. Serotypes Enteritidis and Typhimurium, which have a

zoonotic interest, were found in foxes, martens and weasels. Y. enterocolitica was the

most frequently isolated species of Yersinia and was detected in foxes, badgers and

martens, however, Y. pseudotuberculosis was also identified in a wildcat. Mycobacteria

were only isolated in two badgers, Mycobacterium intracellulare from one case and

Mycobacterium avium subspecie hominissuis in the other. We obtained no positive

result to the pathological prion protein.

The seroprevalence of Leptospira infection was high, predominantly of the

serovars bratislava (61.5%) and muenchen (23.1%), but also icterohaemorragiae

(7.7%) and canicola (2.6 %). Antibodies to Toxoplasma gondii were detected in 72.5%

of the tested sera, yet specific DNA detection of this agent was achieved only in 8.8%

of the samples. Molecular detection methods for diseases transmitted by arthropods

yielded no positive results for Coxiella, Borrelia, Anaplasma, Rickettsia and

Francisella. However, several species of Bartonella were detected, showing these a

remarkable species-specificity: B. henselae only in the wild cat (16.7%), B. rochalimae

in the fox (1.6%) and the wolf (33.3%), while in badgers (12%) previously unidentified

species were detected.

Among the carnivore species examined, the genus Trichinella was detected in

only 1.2% of the animals, and all were foxes. The scabies mite (Sarcoptes scabiei) was

found in 6.3% of foxes examined. Most carnivores (42.7%) had ticks, and a large

variety of fleas were present in the different species. In contrast, lice were only found in

badgers, wolves and martens. The majority of fecal specimens examined (71.7%),

contained eggs or larvae of helminths and coccidial oocysts. The genus Angiostrongylus

was found in the cardiorespiratory system of foxes (33.3%) and badgers (24%).

Interestingly, the two Angiostrongylus species identified showed species-specificity, A.

vasorum was isolated only in foxes while A. daskalovi only in badgers. The latter has

previously only been reported in the Balkans, and thus, this is the first description

outside that region. This finding should prompt the review of earlier works where A.

vasorum was identified in badgers.

Another singular finding was that of the fungus Coccidioides immitis in a

badger, which is the first report in a wild mammal in Europe. Also noteworthy is the

finding of two cases of lymphoma in mustelids, one in a beech-marten and another in a

small-spotted genet.

Data on the individual (species, sex and age) and environmental factors studied

showed variable effects, generally weak, on the frequency of pathologies detected. The

confirmation of the distribution of pathogens relevant to public and animal in wild

carnivore population in the CAPV and the unexpected finding of some zoonotic agents,

highlights the importance of maintaining surveillance programs on the pathology of

wildlife.

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ANEXOS

10.- ANEXOS: ANEXO 1: FICHA DEL ANIMAL

DATOS GENERALES/ DATU OROKORRAK:

ESPECIE: IDENTIFICACIÓN: (Espeziea) (Identifikazioa) (Si se dispone)

REMITENTE: (Igorlea)

LOCALIDAD: PROVINCIA: UTM: (Herria) (Probintzia)

COTO DE CAZA: FINCA: CARRETERA ó PUNTO km: (Ehiza kotoa) (Etxaldea)

DATOS SOBRE EL EJEMPLAR/ ALEARI BURUZKO DATUAK:

FECHA MUERTE: HORA MUERTE: (Heriotz data) (Heriotz ordua)

SEXO: macho/hembra/desconocido EDAD: cría-pollo/ joven/ adulto (Sexua: arra/ emea/ ezezaguna) (Adina: jaioberri/ gazte/ heldua)

PESO(indicar si el animal está entero o no): (Pisua)

CÓMO SE ENCONTRÓ (Nola aurkitu zen):

Encontrado muerto Cazado (Hilda aurkituta) (Ehizaturik)

Capturado vivo Eutanasiado (Bizirik harrapatuta) (Eutanasiatua)

SE SOSPECHA DE (Susmatzen da): Choque contra vehículo/ Atropello Petroleado Choque contra cables/ Electrocución Trampa/cepo Choque contra ventana Enfermedad: se sospecha de…. Golpe indeterminado Cautividad: desde……….. Debilidad (malnutrición, agotamiento) Requisado Envenenamiento/Intoxicación Desconocida OBSERVACIONES(Oharrak):

ANEXO 3: SOLUCIONES Y REACTIVOS EMPLEADOS

Acetato sódico (CH3COONa) 3M pH 4,5: 12,3 gr sodio acetato anhidro, 50 ml

agua destilada.

Ácido sulfuroso: 6ml de metabislfito sódico al 10%, 5 ml de ácido clorhídrico,

100 ml de agua destilada.

Bicarbonato sódico (NaHCO3) 500 mM pH 8,4: 0,84 gr NaHCO3, 15 ml agua

destilada. Ajustar a pH 8,4 y autoclavar a 121,5ºC durante 15 minutos.

Colorante de Twort: 9 ml de 0,2% Rojo Neutro en etanol de 96ºC, 2 ml de

0,2% de Verde Brillante en etanol de 96ºC, 30 ml agua destilada.

EDTA (Ácido etliendiaminotetraacético) 0,5M: 74,4 gr EDTA, 300 ml agua

destilada; añadir 400 ml de agua destilada, ajusta a pH 8,0 y autoclavar a

121.5ºC durante 15 minutos.

EDTA 20 mM: 20 ml EDTA 0,5 M, 480 ml agua destilada. Ajustar a pH 8,0.

EDTA 125 mM: 2,3 gr EDTA, 50 ml agua miliQ.

HCP (Hexadecil-cetil-piridinium) al 0,75%: 7,6 gr N-cetil-piridinium, 1 l

agua destilada.

Ioduro de Gram: 1 gr yodo, 2 gr ioduro potásico, 100 ml agua destilada.

KOH (hidróxido potásico) 0,1N: 0,2 gr hidróxido potásico 85% (Panreac), 80

ml etanol absoluto, 20 ml agua destilada.

NaOH (sodio hidróxido) 100 mM: 4,2 gr NaOH, 1 l agua destilada. Autoclavar

a 121,5ºC durante 15 minutos.

Orange G: 3 gr sucrosa (Probus, Barcelona) 0,035 gr Orange G (Sigma Aldrich;

EEUU), 10 ml agua destilada.

SDS (Sodio Dodecil Sulfato) 10%: 10 gr SDS, 100 ml agua destilada.

Autoclavar a 121,5ºC durante 15 minutos.

SDS 1%: 100 ml SDS 10%, 900 ml agua destilada.

Solución de Eosina: 1% de Eosina amarillenta en agua destilada.

Solución de Hematoxilina: 3 gr Hematoxilina, 0,6 gr iodato potásico, 150 gr

alumbre potásico, 600 ml glicerina, 2400 ml agua destilada. Hervir 1200 ml de

agua junto con el alumbre. Sacar del fuego y añadir la hematoxilina, agitando

hasta que se disuelva. Añadir el resto de componentes y dejar enfriar.

Solución salina 0,85%: 8,5 gr NaCl, 1 l de agua destilada.

TBE (Tris Borato EDTA) 5x: 54 gr Tris base, 27,5 gr ácido bórico, 20 ml

EDTA 0,5M, 1l agua destilada.

•

•

•

•

•

•

- Previo a a la tinción hay que preparar el frotis, para lo cual se hace una

impronta de la muestra directamente sobre el portaobjetos donde puede

visualizarse con facilidad y se deja secar al aire.

- Fijar la preparación pasando un porta por encima de una llama.

- Cubrir con fucsina fenicada y durante 5 minutos se flamea el porta por

debajo hasta que emita vapor pero evitando que la fucsina hierva. Lavar con

agua corriente, realizando 2-3 lavados de unos 2 segundos.

- Lavar la superficie del porta con agua.

- Decolorar el frotis con alcohol ácido durante 90 segundos.

- Lavar la superficie del porta con agua.

- Cubrir el frotis con verde de Malaquita durante 2 minutos.

- Lavar la superficie del porta con agua para eliminar el exceso de colorante.

- Dejar secar la preparación al aire y observar al microscopio óptico a 100

aumentos.

- Observar la preparación en un microscopio óptico con el objetivo de 10-100

aumentos.

La positividad se traduce en la capacidad de resistencia al ácido-alcohol por lo que los

microorganismos aparecen de color rosa. Las reacciones negativas se caracterizan

porque no retienen el colorante mencionado de modo que aparecen teñidas de color

verde o azul debido a la segunda coloración.

Tinción de Hematoxilina-Eosina para secciones de parafina:

- Tinción con el colorante de Hematoxilina durante 8-12 minutos.

- Lavar con agua corriente durante 5-10 minutos.

- Tinción con el colorante de Eosina durante 5-10 segundos.

- Lavar con agua corriente, realizando 2-3 lavados de unos 2 segundos.


aumentos.

Tinción de Gram para secciones de parafina:

- Tinción con Cristal Violeta, dejando caer gota a gota durante 30 segundos.

ANEXO 4: TINCIONES REALIZADAS

Tinción de Ziehl-Neelsen:

- Lavar con agua destilada, realizando 3 lavados de unos 2 segundos,

manteniendo la preparación inclinada.

- Decolorar con acetona.



- Contrastar con colorante de Twort durante 5 minutos.

- Lavar con agua destilada y dejar secar con papel de filtro.


aumentos.

La interpretación de los resultados se realiza de la siguiente manera:

Azul-negro: bacterias Gram-positivas.

Rosa-rojo: bacterias Gram-negativas.

Cada vez que se lleve a cabo este procedimiento se incluirá en el lote un portaobjetos en

el que se hayan preparado un conrol positivo y uno negativo.

Tinción de Pas para secciones de parafina:

- Tinción en reactivo de Schiff durante 20-25 minutos.

- Lavar en 3 baños de ácido sulfuroso, cada uno de 2 minutos.

- Lavar con agua corriente durante 5 minutos.

- Tinción con Hematoxilina para contraste de núcleos durante 3 minutos.

- Lavar en agua corriente durante 5 minutos.


aumentos.


Magenta o púrpura: Carbohidratos.

Púrpura: Mucina en el tracto intestinal y el glucógeno hepático.

Púrpura más rojizo: Membrana basal del riñón, piel y la reticulina esplénica.

Como control positivo se utiliza una sección de tejido con estructuras fúngicas o de otro

tipo Pas positivas.



- Tinción con solución de lugol o ioduro de gram, dejando caer gota a gota

durante 20 segundos.

- Fijar la preparación, pasando el porta por encima de una llama durante 2-3

segundos.

- Cubrir el porta con una solución de cristal violeta durante 1 minuto.

- Eliminar el exceso de colorante y añadir la solución de Lugol durante 1

minuto.

- Aclarar con agua destilada.

- Decolorar cubriendo el portaobjetos con una solución de etanol-acetona

(1:1) durante 2-4 segundos.


- Cubrir el porta con Safranina durante 1 minuto.


- Secar con papel secante.

- Observar la preparación en un microscopio óptico con el objetivo de 100

aumentos.


Color violeta: resultado positivo.

Color rojo: resultado negativo.

Tinción Azul de lactofenol:

- Colocar una gota del reactivo azul de lactofenol en un porta limpio.

- Coger la colonia que se quiere identificar con la parte de pegado de un trozo

de celo y pegarlo en el porta, encima de la gota de colorante azul de

lactofenol.

- Observar la preparación en un microscopio óptico utilizando diferentes

aumentos (10-100).

- Fijar la preparación, pasando el porta por encima de una llama durante 2-3

segundos.

- Cubrir el porta con una solución de cristal violeta durante 1 minuto.

- Eliminar el exceso de colorante y añadir la solución de Lugol durante 1

minuto.

Tinción de Gram para medios de cultivo:

- En un portaobjetos limpio se pone una gota de agua y diluir una porción de

colonia de la bacteria a testar.

- Dejar secar la preparación al aire.

- Cubrir el porta con Safranina durante 1 minuto.


- Secar con papel secante.

- Observar la preparación en un microscopio óptico con el objetivo de 100

aumentos.


- Decolorar cubriendo el portaobjetos con una solución de etanol-acetona

(1:1) durante 2-4 segundos.


1 50

01020670041 (1) GACCAGCTCATGGTGGAGCTAATGAAGCATGCCTAAAAATGTTACAAGAA

DQ222471 (1) GACCAGCTCATGGTGGAGCTAATGAAGCATGCCTAAAAATGTTACAAGAA

Consenso (1) GACCAGCTCATGGTGGAGCTAATGAAGCATGCCTAAAAATGTTACAAGAA

51 100

01020670041 (51) ATAGGTTCTGTTGAAAGAATTCCTGAATTCATTGCACGTGCAAAAGATAA

DQ222471 (51) ATAGGTTCTGTTGAAAGAATTCCTGAATTCATTGCACGTGCAAAAGATAA

Consenso (51) ATAGGTTCTGTTGAAAGAATTCCTGAATTCATTGCACGTGCAAAAGATAA

101 150

01020670041 (101) AAATGATTCTTTCCGCCTTATGGGTTTTGGTCATCGAGTCTATAAAAATT

DQ222471 (101) AAATGATTCTTTCCGCCTTATGGGTTTTGGTCATCGAGTCTATAAAAATT

Consenso (101) AAATGATTCTTTCCGCCTTATGGGTTTTGGTCATCGAGTCTATAAAAATT

151 200

01020670041 (151) ATGATCCACGCGCAAAAATCATGCAACAAACCTGCCATGAGGTTTTAAAA

DQ222471 (151) ATGATCCACGCGCAAAAATCATGCAACAAACCTGCCATGAGGTTTTAAAA

Consenso (151) ATGATCCACGCGCAAAAATCATGCAACAAACCTGCCATGAGGTTTTAAAA

201 250

01020670041 (201) GAATTGAACATTCAAAATGATCCACTTCTTGATATTGCTATCACGCTTGA

DQ222471 (201) GAATTGAACATTCAAAATGATCCACTTCTTGATATTGCTATCACGCTTGA

Consenso (201) GAATTGAACATTCAAAATGATCCACTTCTTGATATTGCTATCACGCTTGA

251 300

01020670041 (251) AAATATTGCTCTAAATGATGAATATTTTATTGAAAAAAAACTTTACCCTA

DQ222471 (251) AAATATTGCTCTAAATGATGAATATTTTATTGAAAAAAAACTTTACCCTA

Consenso (251) AAATATTGCTCTAAATGATGAATATTTTATTGAAAAAAAACTTTACCCTA

301 350

01020670041 (301) ATGTCGATTTCTATTCTGGCATTACATTAAAAGCTCTAGGATTTCCAACA

DQ222471 (301) ATGTCGATTTCTATTCTGGCATTACATTAAAAGCTCTAGGATTTCCAACA

Consenso (301) ATGTCGATTTCTATTCTGGCATTACATTAAAAGCTCTAGGATTTCCAACA

351 372

01020670041 (351) GAAATGTTTACTGTTCTTTTTG

DQ222471 (351) GAAATGTTTACTGTTCTTTTTG

Consenso (351) GAAATGTTTACTGTTCTTTTTG

Anexo 5.2. Alineamiento de las secuencias de Bartonella spp. de lobo (03036420000) y de zorro (01024970051) obtenidas a partir de secuenciación de 318 pares de bases del gen citrato sintasa (gltA) y de la secuencia de Bartonella rochalimae obtenida del GenBank (DQ683195). 1 50

03036420000 (1) GCTAATGAAACATGTCTAAAAATGCTGCAAGAAATAGGCACTGTTCAAAA

01024970051 (1) GCTAATGAAACATGTCTAAAAATGCTGCAAGAAATAGGCACTGTTCAAAA

DQ683195 (1) GCTAATGAAACATGTCTAAAAATGCTGCAAGAAATAGGCACTGTTCAAAA

Consenso (1) GCTAATGAAACATGTCTAAAAATGCTGCAAGAAATAGGCACTGTTCAAAA

51 100

03036420000 (51) AATTCCTGAGTTTATCGCACGTGCAAAAGATAAAAATGATCGTTTTCGTC

01024970051 (51) AATTCCTGAGTTTATCGCACGTGCAAAAGATAAAAATGATCGTTTTCGTC

DQ683195 (51) AATTCCTGAGTTTATCGCACGTGCAAAAGATAAAAATGATCGTTTTCGTC

Consenso (51) AATTCCTGAGTTTATCGCACGTGCAAAAGATAAAAATGATCGTTTTCGTC

101 150

03036420000 (101) TTATGGGTTTTGGTCATCGTGTCTATAAAAATTATGATCCACGTGCAAAA

01024970051 (101) TTATGGGTTTTGGTCATCGTGTCTATAAAAATTATGATCCACGTGCAAAA

DQ683195 (101) TTATGGGTTTTGGTCATCGTGTCTATAAAAATTATGATCCACGTGCAAAA

Consenso (101) TTATGGGTTTTGGTCATCGTGTCTATAAAAATTATGATCCACGTGCAAAA

ANEXO 5: ALINEAMIENTOS

Anexo 5.1. Alineamiento de la secuencia de Bartonella spp. de gato montés (01020670041) obtenida a partir de la secuenciación de 372 pares de bases del gen citrato sintasa (gltA) y de la secuencia de Bartonella henselae obtenida del GenBank (DQ222471).

01024970051 (201) TGATCCACTTCTTGATATTGCTATGGAACTTGAAAAAATTGCTCTAAATG

DQ683195 (201) TGATCCACTTCTTGATATTGCTATGGAACTTGAAAAAATTGCTCTAAATG

Consenso (201) TGATCCACTTCTTGATATTGCTATGGAACTTGAAAAAATTGCTCTAAATG

251 300

03036420000 (251) ATGAATACTTTATTGAAAAAAAGCTTTATCCTAATGTTGATTTCTATTCT

01024970051 (251) ATGAATACTTTATTGAAAAAAAGCTTTATCCTAATGTTGATTTCTATTCT

DQ683195 (251) ATGAATACTTTATTGAAAAAAAGCTTTATCCTAATGTTGATTTCTATTCT

Consenso (251) ATGAATACTTTATTGAAAAAAAGCTTTATCCTAATGTTGATTTCTATTCT

301 318

03036420000 (301) GGTATCACATTAAAAGCC

01024970051 (301) GGTATCACATTAAAAGCC

DQ683195 (301) GGTATCACATTAAAAGCC

Consenso (301) GGTATCACATTAAAAGCC

Anexo 5.3. Alineamiento de las secuencias de Bartonella spp. de los nueve tejones (01011510020) (01012440021) (01014200024) (01018680037) (03015611014) (04004020000) (05005260000) (05017640073) (05057020081) obtenidas a partir de la secuenciación de 348 pares de bases del gen citrato sintasa (gltA) y de la secuencia de Bartonella clarridgeiae obtenida del GenBank (U84386). 1 50

01011510020 (1) GGGACCAGCTCATGGTGGTGCTAATGAAACATGTCTAAAAATGCTGCAA

01012440021 (1) GGGACCAGCTCATGGTGGTGCTAATGAAACATGTCTAAAAATGCTGCAA

01014200024 (1) ---ACCAGCTCATGGTGGTGCTAATGAAACATGTCTAAAAATGCTGCAA







U84386 (1) -------------------GCTAATGAAACATGTCTAAAAATGCTGCAA

51 100

01011510020 (51) AAATAGGCACTGTTCAAAAAATTCCTGAGTTTATTGCTCGCGCAAAAGA









U84386 (32) AAATAGGCACTGTTCAAAAAATTCCTGAGTTTATTGCACGCGCAAAAGA

101 150

01011510020 (101) AAAAATGACCGTTTCCGTCTTATGGGTTTTGGTCACCGTGTTTATAAAA









U84386 (82) AAAAATGATCGTTTCCGTCTTATGGGTTTTGGTCATCGTGTCTATAAAA

151 200

03036420000 (151) ATCATGCAACAAACCTGCCATGAAGTCTTAAAAGAACTCAATATTCAAGA

01024970051 (151) ATCATGCAACAAACCTGCCATGAAGTCTTAAAAGAACTCAATATTCAAGA

DQ683195 (151) ATCATGCAACAAACCTGCCATGAAGTCTTAAAAGAACTCAATATTCAAGA

Consenso (151) ATCATGCAACAAACCTGCCATGAAGTCTTAAAAGAACTCAATATTCAAGA

201 250

03036420000 (201) TGATCCACTTCTTGATATTGCTATGGAACTTGAAAAAATTGCTCTAAATG

05005260000 (148) TTATGATCCACGTGCGAAAATCATGCAGCAAACCTGCCATGAAGTCTTA



U84386 (132) TTATGATCCACGTGCGAAAATTATGCAACAAACTTGCCATGAAGTCTTA

201 250

01011510020 (201) AAGAACTCAATATTCAAGATGATCCACTTCTTGATATCGCTATGGAACT









U84386 (182) AAGAACTCAATATCCAAGATGATCCACTTCTTGATATCGCTATGGAACT

251 300

01011510020 (251) GAAAAAATTGCTCTAAATGATGAATACTTTATTGAAAAAAAGCTTTATC









U84386 (232) GAAAAAATTGCTTTGAATGATGAATACTTTATTGAAAAAAAGCTTTATC

301 350

01011510020 (301) TAATGTTGATTTCTATTCTGGTATTACATTAAAAGCCTTAGGCTTCCCA









U84386 (282) TAATGTTGATTTCTATTCTGGTATTACATTAAAAGCCTTAGGCTTCCCG

351 375

01011510020 (351) ACTGAAATGTTTACTGTTCTTTTTG






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EU627596 (1) TATGACAGCACGTATTCTTTACGCATGATGAAAGAATGCTGGACAACATT

Consenso (1) TATGACAGCACGTATTCTTTACGCATGATGAAAGAATGCTGGACAACATT

51 100

04010540000 (51) GCTTGTCGAACGGCGTTTTGCGTGGTCTTTTACGTGCGTGTGTTCATGTT



EU627596 (51) GCTTGTCGAACGGCGTTTTGCGTGGTCTTTTACGTGCGTGTGTTCATGTT

Consenso (51) GCTTGTCGAACGGCGTTTTGCGTGGTCTTTTACGTGCGTGTGTTCATGTT

101 150

04010540000 (101) TGGACTATTTGTCAAACGGTAACAGTGGTTGTCGTCGTCGTCGTCGTCGA



EU627596 (101) TGGACTATTTGTCAAACGGTAACAGTGGTTGTCGTCGTCGTCGTCGTCGA

Consenso (101) TGGACTATTTGTCAAACGGTAACAGTGGTTGTCGTCGTCGTCGTCGTCGA

151 200

04010540000 (151) TATGCTACTGTTCCCGTTTTAGTGAAGAATAAGATAATAGCTACATGTAA



EU627596 (151) TATGCTACTGTTCCCGTTTTAGTGAAGAATAAGATAATAGCTACATGTAA

Consenso (151) TATGCTACTGTTCCCGTTTTAGTGAAGAATAAGATAATAGCTACATGTAA

201 250

04010540000 (201) TAATTATATATATATATTATTACACAAAACGTAATATGTGATCATGTGCT



EU627596 (201) TAATTATATATATATATTATTACACAAAACGTAATATGTGATCATGTGCT

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251 300

04010540000 (251) TGTATGCTAGTAATGTCATTGCTACCGTCATCGATGTTGCTGATTTTCAA



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Consenso (251) TGTATGCTAGTAATGTCATTGCTACCGTCATCGATGTTGCTGATTTTCAA

301 350

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Consenso (301) TGAGTGTCGTTGAGAATCGTGAAATAAGAAGTAATATTATCGATCGATGG

351 400

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Consenso (351) ATGAATGGATGAAATGTATTTCATATGGTAATGACAAGAAATATTGCTAG

401 450

04010540000 (401) ACATATTGCCAATAGCACATAGTTTTCATGTATTGCATTTAATTCTCAAA



EU627596 (401) ACATATTGCCAATAGCACATAGTTTTCATGTATTGCATTTAATTCTCAAA

Consenso (401) ACATATTGCCAATAGCACATAGTTTTCATGTATTGCATTTAATTCTCAAA

Anexo 5.4. Alineamiento de las secuencias de Angiostrongylus spp. obtenidas a partir de la amplificación

de la región ITS2 en zorros (04010540000) (04000330000) (0400080000) y de la secuencia del nematodo Angiostrongylus vasorum obtenida del Genbank (EU627596).

1 50



Anexo 5.5. Alineamiento de las secuencias de los nematodos Angiostrongylus spp. obtenidos a partir de

la amplificación de la región ITS2 en tejones (05023520000) (05014970051) (05002450000). 1 50

05023520000 (1) TTTAGTTTCTTTTCCTCCGCTAAATGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAAT



Consenso (1) TTTAGTTTCTTTTCCTCCGCTAAATGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAAT

51 100

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Consenso (51) CACGTCTGAGTTCAGGTTGTATTCTTTGAGAAATAAAAATGTAATACGTG

101 150

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Consenso (151) CCATATGAAATATACATTTCATCCATTCATTCATTGATCGATGATTACTT

201 250

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Consenso (201) CTTATTTCGTGATTCTCAACGACACTCATTGAAAATCATCATCGACAACG

251 300

05023520000 (251) GTAGTAATGACATCACTAGCATACAAGCACATGATCACATATTACATTTT



Consenso (251) GTAGTAATGACATCACTAGCATACAAGCACATGATCACATATTACATTTT

301 350

05023520000 (301) GTGTAATAATTCTAATATAATTATTACATGTAGCTATTATTTCATTCTTC



Consenso (301) GTGTAATAATTCTAATATAATTATTACATGTAGCTATTATTTCATTCTTC

351 400

05023520000 (351) ACTAAAACGGGAACAGTAACAAATCGACGTTAACGACGTCAACGATCACC



Consenso (351) ACTAAAACGGGAACAGTAACAAATCGACGTTAACGACGTCAACGATCACC

401 450

05023520000 (401) GTTACCGTTTGACAAATAGTCCAAACATGAGCACACGCACGTAAACAACG



Consenso (401) GTTACCGTTTGACAAATAGTCCAAACATGAGCACACGCACGTAAACAACG

451 472

04010540000 (451) TAATACAACCTGAACTCAGACG

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04000800000 (451) TAATACAACC------------

EU627596 (451) TAATACAACCTGAACTCAGACG

Consenso (451) TAATACAACCTGAACTCAGACG

05023520000 (501) GAATACGTGCTACTATATGCACATGTATGCGACA



Consenso (501) GAATACGTGCTACTATATGCACATGTATGCGACA

451 500

05023520000 (451) CAAAACGCCGTTCGACGAGTAATGTCGTGCATTCTTTCATTATGCGTAAA



Consenso (451) CAAAACGCCGTTCGACGAGTAATGTCGTGCATTCTTTCATTATGCGTAAA

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ISBN: 978-84-457-3039-0

9 788445 730690

xeider gerrikagoitia sagarna - osakidetza...desde un comienzo (patricia s e itziar l) y agradezco...

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