xây dựng quy trình xác Định (Định tính, Định lượng) bifidobacterium longum trong...
TRANSCRIPT
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 1/112
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
TRỊNH THỊ PHƢƠNG DUNG
XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH (ĐỊNHTÍNH, ĐỊNH LƢỢNG) BIFIDOBACTERIUM
LONGUM TRONG CÁC CHẾ PHẨMPROBIOTICS
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC
HÀ NỘI 2014
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 2/112
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
TRỊNH THỊ PHƢƠNG DUNG
XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH (ĐỊNH
TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG) BIFIDOBACTERIUM
LONGUM TRONG CÁC CHẾ PHẨM
PROBIOTICS
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ 60 72 04 10
Người hướng dẫn khoa học: TS. Trần Việt Hùng
HÀ NỘI 2014
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 3/112
LỜI C ẢM ƠN
Luận văn này được hoàn thành tại khoa Vi Sinh – Viện Kiểm nghiệm Thuốc
Trung Ương – Bộ Y tế. Để có được bản luận văn tốt nghiệp này tôi xin bày tỏ lòng
biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Trần Việt Hùng, người thầy đã trực tiếp hướng
dẫn, dìu dắt tôi trong suốt thời gian thực hiện nghiên cứu này.
Xin chân thành cám ơn các thầy cô trong Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo sau
đại học, Bộ môn Kiểm Nghiệm Thuốc và Độc chất và các Bộ môn khác của trườngĐại Học Dược Hà Nội đã giúp tôi trang bị tri thức, tạo môi trường, điều kiện thuận
lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường cũng như trong quá trình hoàn
thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Đoàn Cao Sơn – Viện trưởng Viện kiểm
Nghiệm Thuốc Trung Ương, Ban Giám Đốc Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung
Ương, các đồng nghiệp trong khoa và Th s. Khổng Thị Minh Huệ đã hỗ trợ, giúp đỡđể tôi hoàn thành tốt luận văn thạc sĩ và hoàn thành khóa học theo đúng thời hạn.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời tri ân sâu sắc đến gia đình và bạn bè đã luôn ở bên
tôi động viên, chia sẻ, giúp đỡ tôi trong thời gian vừa qua
Hà Nội 27 tháng 8 năm 2014
Dược sỹ Trịnh Thị Phương Dung
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 4/112
MỤC LỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ................................................................................ 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ PROBIOTICS ............................................................... 3
1.1.1. Định nghĩa ................................................................................................ 3
1.1.2. Ứng dụng của probiotics trong ngành Dược ............................................ 3
1.1.3. Các vi sinh vật thường được sử dụng trong chế phẩm probiotics............ 4
1.1.4. Tổng quan về tiêu chuẩn chất lượng probiotics ....................................... 4
1.2. TỔNG QUAN VỀ CHI BIFIDOBACTERIUM .......................................... 6
1.2.1. Đặc điểm chung của chi Bifidobacterium [30], [33],............................... 6
1.2.2. Bifidobacteria với vai trò là probiotics. ................................................... 6
1.3. TỔNG QUAN VỀ B. LONGUM .................................................................. 7
1.3.1. Đặc điểm hình thái ................................................................................... 7
1.3.2. Khả năng chuyển hóa carbohydrat [31]. .................................................. 8
1.3.3. Cấu trúc gen cuả B. longum [24] .............................................................. 8
1.3.4. Vai trò của B. longum [9], [11], [24], [26] , [15], [33], [35]. ................... 9
1.3.5. Phương pháp kiểm nghiệm B. longum trong chế phẩm probiotics ........ 10
1.3.6. Tình hình nghiên cứu định tính và định lượng B. longum trong các chế phẩm probiotics trong những năm gần đây ........................................... 17
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊPHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................. 20
2.1. PHƢƠNG TIỆN DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU .................................. 20
2.1.1. Môi trường, hoá chất, dung môi, thiết bị ............................................... 20
2.1.1.1. Môi trường ...................................................................................... 20
2.1.1.2. Hoá chất, dung môi ......................................................................... 22
2.1.1.3. Thiết bị, dụng cụ ............................................................................. 23
2.1.2. Phần mềm xử lý kết quả: Apiweb của hãng BioMérieux. ...................... 24
2.1.3. Chủng vi sinh vật chuẩn ......................................................................... 24
2.2. ĐỐI TƢỢ NG NGHIÊN CỨ U .................................................................... 25
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 5/112
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U .............................................................. 26
2.3.1. Phương pháp định lượng B. longum trong chế phẩm ............................ 26
2.3.2. Phương pháp định danh vi sinh vật bằng kit API 20A .......................... 27
2.3.2.1. Nguyên tắc chung ............................................................................ 27
2.3.2.2. Tiến hành ......................................................................................... 28
2.3.3. Định danh đến loài bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự ......................... 31
2.3.3.1. Sơ đồ chung định tính B. longum trong các chế phẩm probiotics bằng k ỹ thuật PCR và giải trình tự ................................................. 31
2.3.3.2. Tách DNA vi khuẩn bằng WizardR Genomic DNA Purification Kit ......................................................................................................... 32
2.3.3.3. Định lượng DNA bằng phương pháp đo độ hấp thụ ánh sáng tửngoại ở bước sóng 260 nm (A260) ................................................... 33
2.3.3.4. Nghiên cứu, thiết kế mồi đặc hiệu ................................................ 33
2.3.3.5. Kiểm tra khả năng tách DNA .......................................................... 34
2.3.3.6. Nhân bản đoạn gen đặc hiệu của các đối tượng nghiên cứu bằng kỹthuật PCR ........................................................................................ 35
2.3.3.7. Nhân dòng và giải trình tự .............................................................. 36
2.3.4. Thẩm định quy trình đã xây dựng .......................................................... 39
2.3.4.1. Thẩm định phương pháp định lượng B. longum ............................. 39
2.3.4.2. Thẩm định qui trình định danh bằng kit API 20A .......................... 41
2.3.4.3. Thẩm định qui trình định danh bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự 41
2.3.5. Ứng dụng quy trình chuẩn để định lượng và định tính B. longum trongcác chế phẩm probiotics đang lưu hành trên thị trường ........................ 44
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ......................................................... 45
3.1. XÁC ĐỊNH SỐ LƢỢNG VI SINH VẬT TRONG CHẾ PHẨMPROBIOTICS ............................................................................................. 45
3.2. ĐỊNH DANH VI SINH VẬT BẰNG KIT API 20A ................................. 46
3.3. KẾT QUẢ ĐỊNH DANH VI SINH VẬT TRONG CÁC MẪU BẰNGKỸ THUẬT PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ ................................................. 51
3.3.1. Kết quả tách DNA .................................................................................. 51
3.3.1.1 Tách DNA bằng WizardR Genomic DNA Purification kit của hãngPromega .......................................................................................... 51
3.3.1.2. Kiểm tra khả năng tách DNA .......................................................... 51
3.3.2. Nhân bản các đoạn gen đặc hiệu của các đối tượng vi sinh vật thuộc đối
tượng nghiên cứu ................................................................................... 52
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 6/112
3.3.3. Nhân dòng và giải trình tự ..................................................................... 55
3.3.3.1.Tinh sạch sản phẩm PCR nhân bản các đoạn gen đặc hiệu của các visinh vật phân lập từ các mẫu nghiên cứu bằng bộ kit Fermentas ... 55
3.3.3.2. Nhân dòng các đoạn gen đặc hiệu vào vector nhân dòng và biến nạpvào tế bào E. coli chủng DH5α ....................................................... 56
3.3.3.3. Kiểm tra sự có mặt của các đoạn gen đặc hiệu trong plasmid tái tổhợp .................................................................................................. 57
3.3.3.4. Giải trình tự mẫu chứa phân đoạn 831 bp ....................................... 60
3.4. ĐÁNH GIÁ PHƢƠNG PHÁP .................................................................... 62
3.4.1. Kết quả kiểm tra tính chọn lọc của môi trường định lượng BSM agar . 62
3.4.2. Độ lặp lại của phép định lượng .............................................................. 63
3.4.3. Thẩm định độ đặc hiệu của quy trình định danh vi sinh vật bằng kit API20A ........................................................................................................ 64
3.4.4. Đánh giá độ đặc hiệu của quy trình định danh vi sinh vật bằng kỹ thuậtPCR ........................................................................................................ 65
3.4.5. Xác định ngưỡng phát hiện của quy trình nhân bản đoạn gen đặc hiệucủa B. longum bằng cặp mồi đặc hiệu. .................................................. 68
CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN .................................................................................. 71
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................... 73
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 74
PHỤ LỤC
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 7/112
CÁC CHỮ VIẾT TẮT AA: Acid acetic
AL: Acid lactic
ATCC: American Type Culture Collection
B. longum: Bifidobacterium longum
dATP: Deoxy adenosine Triphosphat
dCTP: Deoxy cytosineTriphosphat
dGTP: Deoxy guanine Triphosphat
DNA: Deoxyribo nucleic acid
dNTP: Deoxy nucleic TriphosphatdTTP: Deoxy thymin Triphosphat
E. coli : Escherichia coli
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations
FISH: fluorescence in situ hydridization
JCM: Japan Colletion of Microorganisms
LAB: Lactic acid bacteria
LB Luria Bertani
PCR: Polymerase Chain Reaction
rRNA: Ribosome Ribonucleic acid
VSV: Vi sinh vật
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 8/112
DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Mồi đặc hiệu 22Bảng 2.2 Hóa chất, dung môi 22
Bảng 2.3 Các vi sinh vật chuẩn đượ c sử dụng 24
Bảng 2.4 Cách đọc k ết quả kit Api 20A 30
Bảng 2.5 Trình tự các cặ p mồi dùng cho phản ứng PCR 34
Bảng 2.6 Thành phần của phản ứng PCR kiểm tra DNA mớ i tách 35
Bảng 2.7 Thành phần của phản ứng PCR đơn mồi 36
Bảng 2.8 Thành phần phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector 38
Bảng 2.9 Các chủng chuẩn kiểm tra tính chọn lọc của môi trườ ng BSM
agar
40
Bảng 2.10 Công thức tính độ đặc hiệu 42
Bảng 2.11 Tiêu chuẩn đánh giá chất lượ ng của sản phẩm PCR 43
Bảng 3.1 Số lượ ng vi sinh vật trong chế phẩm 45
Bảng 3.2 Theo dõi phản ứng định danh vi sinh vật bằng kit API 20A 48Bảng 3.3 K ết quả định danh vi sinh vật bằng phần mềm Apiweb 50
Bảng 3.4 K ết quả đo quang các dung dịch DNA mớ i tách 51
Bảng 3.5 Thành phần của phản ứng PCR 53
Bảng 3.6 K ết quả kiểm tra tính chọn lọc của môi trườ ng BSM agar 62
Bảng 3.7 K ết quả đếm số lượ ng vi khuẩn trong mẫu A 64
Bảng 3.8 K ết quả kiểm tra độ đặc hiệu của cặ p mồi BlonF/BlonR trên
20 chủng
66
Bảng 3.9 K ết quả đếm số lượ ng vi khuẩn B. longum 68
Bảng 3.10 K ết quả xác định ngưỡ ng phát hiện 69
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 9/112
DANH MỤC HÌNHTrang
Hình 1.1 Hình ảnh B. longum trên kính hiển vi điện tử 8
Hình 1.2 Hình ảnh genom B. longum 8
Hình 1.3 Sơ đồ phản ứng chuỗi polymerase 14
Hình 1.4 Hình minh họa k ỹ thuật PCR 14
Hình 2.1 Sơ đồ định tính B. longum bằng k ỹ thuật PCR và giải trình tự 31
Hình 3.1 Định danh vi sinh vật trong trong mẫu A bằng kit API 20A 46
Hình 3.2 Định danh vi sinh vật trong trong mẫu B bằng kit API 20A 46Hình 3.3 Định danh vi sinh vật trong trong mẫu C bằng kit API 20A 47
Hình 3.4 Định danh vi sinh vật trong trong mẫu D bằng kit API 20A 47
Hình 3.5 Định danh vi sinh vật trong trong mẫu E bằng kit API 20A 47
Hình 3.6 Quan sát giếng ESC dưới đèn UV ở bướ c sóng 365nm 48
Hình 3.7 K ết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen 16S rDNA
bằng cặ p mồi ID16R08F và IDL16R09R
52
Hình 3.8 K ết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen đặc hiệu
của B. longum bằng cặ p mồi BlonF/BlonR
54
Hình 3.9 K ết quả điện di mẫu tinh sạch sản phẩm PCR nhân bản các
đoạn gen đặc hiệu phân lậ p từ các mẫu nghiên cứu trên gel
agarose 1%
55
Hình 3.10 Sơ đồ vector nhân dòng pGEMT-eseay 56
Hình 3.11 K ết quả biến nạ p sản phẩm gắn vào vi khuẩn E. Coli DH5α. và
cấy tr ải trên môi trườ ng nuôi cấy có bổ sung ampicillin
100µg/ml
57
Hình 3.12 K ết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra plasmid tái tổ hợ p
mang các đoạn gen có kích thướ c 831bp
58
Hình 3.13 K ết quả điện di sản phẩm cắt giớ i hạn vector tái tổ hợ p mang
các phân đoạn 831 bp bằng enzym EcoRI
59
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 10/112
Hình 3.14 Hình thái khuẩn lạc B. longum trên môi trườ ng BSM agar 63
Hình 3.15 Định danh B. longum JCM 1217 bằng kit Api 20A 65
Hình 3.16 K ết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra độ đặc hiệu của cặ p
mồi nhân bản đoạn gen đặc hiệu của B. longum
67
Hình 3.17 K ết quả điện di sản phẩm PCR xác định ngưỡ ng phát hiện của
quy trình nhân bản đoạn gen đặc hiệu của B. longum
70
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 11/112
1
ĐẶT V ẤN ĐỀ
Vi khuẩn lactic (LAB) có vai trò rất quan trọng trong cuộc sống của chúng ta.Chúng tạo ra các thực phẩm lên men và bảo quản thực phẩm khỏi bị hư hỏng. Từ
đầu thế kỷ 20, Elie Metchnikoff (1845-1916) đã đề xuất sử dụng các LAB cho mục
đích chữa bệnh. Từ đó, lĩnh vực nghiên cứu probiotics ngày càng được quan tâm và
phát triển. Đến nay, những nghiên cứu về probiotics đã không ngừng cung cấp
những bằng chứng có tính khoa học về hiệu quả thực sự của probiotics đối với sức
khỏe con người. Bên cạnh đó, các sản phẩm chức năng sử dụng các vi khuẩn
probiotics xuất hiện ngày càng nhiều ở Châu Âu, Nhật, Mỹ… Năm 2008, doanh thutừ các chế phẩm này là 15,9 tỉ USD trên toàn cầu [10].
Probiotics bắt nguồn từ ngôn ngữ Hy Lạp có nghĩa là vì sự sống (for life).
Năm 2002 tổ chức Nông Lương Liên hiệp quốc và tổ chức Y tế thế giới nêu rõ:
“ probiotics là những vi sinh vật sống mà khi sử dụng với một lượng thích hợp, sẽ
tạo nên những hiệu quả tốt đối với sức khỏe của cơ thể chủ” [32]. Các probiotics
thường có trong các chế phẩm là vi khuẩn sinh acid lactic (LAB) trong đó bao gồm
chi Lactobacillus và chi Bifidobacterium, vi khuẩn sinh bào tử Bacillus, nấm
Saccharomyces cerevisiae…
Theo Robin Temmerman (2001) trong số 55 mẫu khảo sát chỉ có khoảng 20%
chế phẩm có chứa vi khuẩn đúng như trên nhãn, 16% chế phẩm không chứa một
trong các chủng probiotics được liệt kê trên nhãn [28]. Mặt khác số lượng vi sinh
vật trong các chế phẩm probiotics giảm nhiều trong thời gian bảo quản. Như vậy,
việc định tính, định lượng các loài vi khuẩn probiotics trong các chế phẩm là rấtquan trọng, đảm bảo chất lượng của chế phẩm, mang lại hiệu quả cho người dùng.
Thị trường thuốc Việt Nam hiện có hàng trăm chế phẩm probiotics dưới dạng
thuốc và thực phẩm chức năng, trong đó có rất nhiều chế phẩm có chứa
Bifidobacterium longum ( B. longum là một vi khuẩn thuộc nhóm LAB) dưới dạng
đơn hoặc đa thành phần. Mặc dù trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu
để định tính và định lượng B. longum trong các chế phẩm đa thành phần, tuy nhiên
ở Việt Nam việc kiểm soát chất lượng của các chế phẩm probiotics còn đang bỏ
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 12/112
2
ngỏ. Cụ thể là Việt Nam chưa có một tài liệu chính thức nào hướng dẫn kiểm soát
chất lượng các chế phẩm probiotics bao gồm cả các chế phẩm chứa B. longum. Đa
số các tiêu chuẩn cơ sở của các thuốc và thực phẩm chức năng trong nước cũng như
nhập khẩu chưa định lượng riêng cũng như chưa định tính được B. longum trong
các chế phẩm có chứa hỗn hợp nhiều vi sinh vật.
Xuất phát từ nhu cầu thực tế và tính cấp thiết về yêu cầu kiểm tra chất lượng
của các chế phẩm probiotics, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng quy trình xác
định (định tính, định lượng) Bifidobacterium longum trong các chế phẩm
probiotics” với các mục tiêu:
- Xây dựng quy trình chuẩn định tính, định lượng B. longum trong các chế phẩm đa thành phần.
- Ứng dụng quy trình đã thiết lập để khảo sát chất lượng của một số chế
phẩm probiotics có chứa B. longum đang lưu hành trên thị trường.
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 13/112
3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ PROBIOTICS1.1.1. Định nghĩa
Hàng ngàn năm trước đây, con người đã biết sử dụng các chế phẩm sữa lên
men với mục đích tăng cường sức khỏe. Tuy nhiên, phải đến đầu thế kỷ 19 nhà
khoa học người Nga Elie Metchnikoff mớ i thực sự nghiên cứu về vấn đề này. Từ đó
đến nay, lĩnh vực nghiên cứu về probiotics ngày càng đượ c quan tâm và phát triển.
Có r ất nhiều định nghĩa khác nhau về probiotics, tuy nhiên định nghĩa của tổ chức
Nông Lương Liên hiệp quốc và tổ chức Y tế thế giới năm 2002 là được sử dụng
rộng rãi phổ biến nhất: “ probiotics là những vi sinh vật sống mà khi sử dụng với
một lượng thích hợp, sẽ tạo nên những hiệu quả tốt đối với sức khỏe của cơ thể
chủ” [32].
1.1.2. Ứ ng dụng của probiotics trong ngành Dƣợ c
Probiotics có các tác dụng sau:
- Tiêu diệt hoặc kìm hãm sự phát triển của các vi sinh vật có hại bằng cách
tiết ra các chất giống kháng sinh như acidolin, lactocidin và acidophilin.
- Sinh ra các vitamin bao gồm niacin, acid folic, biotin, vitamin B6...
- Hỗ trợ cho quá trình tiêu hóa, điều chỉnh nồng độ enzym.
- Giảm pH bằng cách sinh ra acid lactic, hydrogen peroxyd... do đó ức chế sự
phát triển của các vi sinh vật và nấm có hại.
- Giải độc và bảo vệ niêm mạc ruột: Lactobacillus có khả năng liên kết với
các chất độc như kim loại nặng, tế bào ung thư, các vi sinh vật này sẽ chết
cùng với chất độc và được loại trừ ra khỏi cơ thể cùng với chất độc dưới
dạng chất thải rắn.
- Giảm nồng độ cholesterol.
- Hỗ trợ hấp thu các khoáng chất, đặc biệt là calci do tác dụng làm giảm pH
ruột của chúng.
- Giảm nguy cơ bị ung thư, khối u [3], [6].
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 14/112
4
Với những tác dụng trên, Probiotics được sử dụng với mục đích chính là làm
cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột trong hoặc sau khi điều trị bằng kháng sinh do
kháng sinh đã làm thay đổi hệ vi sinh vật trong đường tiêu hóa, giảm số lượng v i
sinh vật có lợi và thường gây ỉa chảy, rối loạn tiêu hóa [34]. Ngoài ra, Probiotics
còn được sử dụng để điều trị viêm đường tiêu hóa thường gặp ở trẻ sơ sinh do bị
nhiễm Rota virus, điều trị tiêu chảy, ung thư ruột kết, đau dạ dày do nhiễm
Helicobacteria pylori, bệnh về dị ứng, ngăn cản nhiễm trùng âm đạo do Candida
albicans...[3], [6].
1.1.3. Các vi sinh vật thƣờng đƣợ c sử dụng trong chế phẩm probiotics
Nếu trướ c kia sự lựa chọn vi sinh vật cho chế phẩm Probiotics dùng làm thuốc
chủ yếu dựa trên kinh nghiệm thì hiện nay, các nhà khoa học đã đưa ra những tiêu
chí r ất rõ ràng, đó là:
- Có khả năng chịu được pH thấp ở dạ dày và acid mật ở ruột non
- Có khả năng bám dính vào niêm mạc đường tiêu hóa
- K hông gây bệnh, không sinh độc tố
- Có khả năng sống và cư trú trong ruột.
Bốn nhóm vi sinh vật thường được sử dụng trong các chế phẩm probiotics là
Lactobacillus, Bifidobacterium, Saccharomyces, Enterococcus. Ngoài ra, còn một
số nhóm vi sinh vật khác được sử dụng như Bacillus, Streptococcus… [3], [6], [29].
1.1.4. Tổng quan về tiêu chuẩn chất lƣợ ng probiotics
Hiện nay trên thế giới có rất nhiều hướng dẫn xây dựng tiêu chuẩn chất lượng
của probiotics. Theo khuyến cáo của FAO (2002), tiêu chuẩn chất lượng của các
pro biotics bao gồm các chỉ tiêu [32]:
- Định danh vi sinh vật: yêu cầu phải định danh đến loài bao gồm cả kiểu
hình và kiểu gen
- Các thử nghiệm in vitro về hoạt tính của probiotics: kháng kháng sinh,
kháng dịch vị, kháng muối mật
- Các bằng chứng về sự an toàn
- Thử in vivo trên động vật và trên người
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 15/112
5
- Các yêu cầu về nhãn sản phẩm
Năm 2009, Bộ y tế Canada cũng ban hành chuyên mục về probiotics, trong đó
cũng yêu cầu định danh vi sinh vật đến loài bao gồm cả kiểu hình và kiểu gen [10].
Đến năm 2011, Bộ sức khỏe và gia đình cùng với Bộ Công nghệ sinh học của
Ấn Độ đã ban hành hướng dẫn đánh giá chất lượng probiotics khá đầy đủ bao gồm
9 chỉ tiêu [16]:
- Định danh vi sinh vật: yêu cầu phải định danh đến loài bao gồm cả kiểu
hình và kiểu gen. Trong đó chỉ ra kỹ thuật PCR là kỹ thuật sinh học phân tử
để định danh vi sinh vật.
- Các thử nghiệm in vitro về hoạt tính của probiotics: kháng kháng sinh,kháng dịch vị, kháng muối mật
- Các bằng chứng về sự an toàn trên động vật
- Các thử nghiệm về tác dụng của probiotics trên động vật
- Các bằng chứng về sự an toàn trên người
- Thử tác dụng trên người
- Các yêu cầu về nhãn sản phẩm
- Các thử nghiệm xác định liều
- Yêu cầu ghi nhãn
- Yêu cầu trong sản xuất và thủ tục đăng ký
Hiện nay Việt Nam chưa có văn bản chính thức nào về việc đánh giá chất
lượng của các chế phẩm probiotics. Chỉ có duy nhất TCVN 7849:2008 đưa ra
phương pháp đếm L. acidophilus trong sữa và các chế phẩm sữa trên môi trường
đặc hiệu [5]. Việc kiểm soát chất lượng mới chỉ dừng lại ở xác định số lượng vi sinh
vật, định tính dựa trên kiểu hình, độ nhiễm khuẩn và các chỉ tiêu về dạng bào chế
theo tiêu chuẩn nhà sản xuất. Trong rất nhiều trường hợp, tiêu chuẩn chất lượng còn
rất sơ sài, đặc biệt chưa định danh được tất cả các vi sinh vật trong chế phẩm.
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 16/112
6
1.2. TỔNG QUAN VỀ CHI BIFIDOBACTERIUM
1.2.1. Đặc điểm chung của chi Bifidobacterium [30], [33],
Các vi khuẩn thuộc chi Bifidobacterium trước đây thường được gọi là Lactobacillus bifidus và được phân loại thành 29 loài khác nhau. Ngày nay, người
ta đã phát hiện ra hơn 33 loài thuộc chi Bifidobacterium, trong số đó có khoảng 12
loài có mặt ở đường tiêu hóa của người.
Bifidobacteria là các trực khuẩn gram dương, kị khí bắt buộc. Chúng thuộc
loại vi khuẩn lên men không đồng nhất, không di động và không hình thành bào tử.
Bifidobacter ia cho phản ứng catalase âm tính, phản ứng indol âm tính và phản ứng
fructose – 6-phosphate phosphoketolase dương tính. Chúng phát triển ở khoảng nhiệt
độ thích hợp từ 37-41oC, không phát triển ở nhiệt độ dưới 20oC và trên 46oC, Tuy
nhiên, có một số loài có thể phát triển ở nhiệt độ trên 46oC như B.
thermacidophilum. Khoảng pH tối ưu cho sự phát triển của Bifidobacteria là 6,5-
7,0. Bifidobacteria không phát triển được ở pH dưới 4,5 và trên 8,5 ngoại trừ B.
thermacidophilum có thể phát triển được ở pH 4,0.
Các vi khuẩn Bifidobacterium là những vi sinh vật quan trọng trong hệ đường
ruột của người và chiếm 3,5 đến 10% hệ sinh vật ở ruột kết. Chúng chiếm ưu thế ở
trong phân của trẻ bú mẹ, còn trong phân của trẻ bú bình chúng chiếm khoảng 40%
hệ vi sinh vật. Chúng là một trong năm loài chiếm ưu thế trong hệ thống đường tiêu
hóa của người, ngoài ra còn được tìm thấy ở âm đạo và khoang miệng . Ngoài ra
Bifidobacteria cũng được tìm thấy trong hệ thống đường tiêu hóa của nhiều động
vật như bò cái, cừu, lợn, gà, thỏ, chuột và ong mật.
1.2.2. Bifidobacteria vớ i vai trò là probiotics.
Bifidobacteria là những probitics phổ biến và là một phần quan trọng của hệ vi
khuẩn trong đường tiêu hóa. Chúng thuộc nhóm vi khuẩn sinh acid lactic (LAB), có
khả năng tổng hợp amino acid (acid glutamic và acid aspartic), sản xuất một số
vitamin như riboflavin, thiamin, vitamin B2, vitamin B6 và biotin.
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 17/112
7
Ngoài ra Bifidobacteria còn có khả năng sản xuất bacteriocin (hóa chất kháng
khuẩn) và các chất giống kháng sinh do đó chúng rất có lợi đối với hệ thống tiêu
hóa và miễn dịch [33].
Tuy nhiên, k hông giống như các vi khuẩn Lactobacillus, các vi khuẩn
Bifidobacterium còn sản sinh ra acid acetic, là acid béo chuỗi ngắn. Acid acetic hạn
chế nấm phát triển hiệu quả hơn acid lactic và nó cũng được xem là nguồn năng
lượng cho cơ thể. Do tạo ra đồng thời acid acetic và acid lactic cũng như một số
chất có ích khác nên các vi khuẩn Bifidobacterium rất cần thiết cho đường âm đạo
và đường niệu sinh dục, nơi mà nấm và các vi khuẩn cơ hội có thể gây bệnh, cũng
như trong hệ tiêu hóa [36].Một số lợi khuẩn Bifidobacterium có tác dụng tốt đối với cơ thể người do
chúng có thể làm thay đổi hệ miễn dịch. Trong một số trường hợp chúng giúp tăng
cường hệ miễn dịch cũng như có tác động chống viêm .
Một số Bifidobacteria hay được dùng trong các chế phẩm thuốc, thực phẩm
chức năng với vai trò là probiotics là Bifidobacterium longum, Bifidobacterium
infantis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium breve…
1.3. TỔNG QUAN VỀ B. LONGUM
1.3.1. Đặc điểm hình thái
B. longum thuộc nhóm vi sinh vật sinh acid lactic và thuộc chi
Bifidobacterium.
B. longum là vi khuẩn Gram dương, hình que phân nhánh, kỵ khí bắt buộc,
không di động, không sinh bào tử và cho phản ứng catalase âm tính. B. longum tăng
trưởng tối ưu ở 38 - 39°C, tối thiểu ở 19-20°C, tối đa ở 44,5-45°C. B. longum tăng
trưởng tối ưu ở pH 7-8, không tăng trưởng ở pH 5,0 hoặc 9,5 [12].
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 18/112
8
Hình 1.1. Hình ảnh B. l ongum trên kính hiển vi điện tử 1.3.2. Khả năng chuyển hóa carbohydrat [31].
B. longum có khả năng lên men các đường: arabinose, xylose, glucose,
fructose, mannose, galactose, maltose, sucrose, lactose, melibiose, raffinose. Sản
phẩm cuối cùng của quá trình lên men đường là acid lactic (AL) và acid acetic
(AA), với tỷ lệ từ 1,0 (AL): 1,7 (AA) đến 1,0 (AL): 2.0 (AA).
B. longum không lên men các đường: rhamnose, melezitose, cellobiose,
trehalose, dextrin, tinh bột, inulin, sorbitol, manitol, glycerol, salicin, gluconate và
lactate.
1.3.3. Cấu trúc gen cuả B. longum [24]
Nhiễm sắc thể của B. longum có chiều dài khoảng 2,26 Mb, tỷ lệ Guanine -
Cytosine là 65%.
Hình 1.2. Hình ảnh genom B. longum
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 19/112
9
Trong đó:
A: Kích thước gen biểu diễn trên thang Mb
B: Chuỗi mã hóa: gồm 2 sợi bổ sung, các mũi tên chỉ phần chuyển tiếp GC
C: Thang G-C
D: Cấu tạo nguyên vẹn genom của B. longum.Vùng hình tròn biểu diễn các
rARN operon, hình vuông là vùng gen của prophage, tam giác biểu diễn vị
trí của 3 vùng gen giống nhau của B. longum, hình chữ nhật là vùng gen
plasmid tích hợp.
1.3.4. Vai trò của B. longum [9], [11], [24], [26] , [15], [33], [35]. B. longum là một loại vi khuẩn rất cần thiết với cơ thể con người, thường gặp
ở ruột và âm đạo do nó có vai trò quan trọng trong việc giữ cho hệ tiêu hóa và hệ
miễn dịch con người khỏe mạnh. B. longum đặc biệt quan trọng đối với trẻ sơ sinh
do nó giúp tăng cường hệ miễn dịch của trẻ sơ sinh. B. longum có nhiều ở trong hệ
tiêu hóa của trẻ sơ sinh và chiếm ưu thế hơn ở trẻ bú mẹ so với trẻ bú bình. Một
điều dễ thấy là trẻ bú mẹ ít bị tiêu chảy và dị ứng hơn so với trẻ bú bình. Ở người
lớn, B. longum giữ cho hệ thống miễn dịch khỏe mạnh, hỗ trợ cân bằng vi khuẩn
đường ruột và có thể ngăn ngừa ung thư như ung thư ruột kết. B. longum sản sinh
acid lactic, do vậy làm giảm nguy cơ viêm âm đạo.
Một nghiên cứu liên quan đến giảm cân, béo phì và táo bón chỉ ra rằng những
người sử dụng B. longum đạt được kết quả giảm cân và cải thiện táo bón tốt hơn so
với những người dùng thuốc nhuận tràng [11].
Một nghiên cứu khác hiện được thực hiện tại Nhật Bản nhằm xác định liệu B.
longum có thể được sử dụng như là vector chuyển gen để điều trị ung thư hay
không. Tiến hành thực nghiệm trên chuột cho thấy B. longum có thể xâm nhập vào
khối u và tích lũy trong khối u. Đây là một nghiên cứu rất tích cực và hy vọng nó sẽ
giúp cho các nhà nghiên cứu tìm ra cách mới để đưa thuốc trực tiếp vào khối u [ 15].
Do có vai trò rất quan trọng đối với sức khỏe con người nên B. longum được
sử dụng rộng rãi trong các chế phẩm thuốc, thực phẩm chức năng, sữa...
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 20/112
10
1.3.5. Phƣơng pháp kiểm nghiệm B. longum trong chế phẩm probiotics
1.3.5.1. Phương pháp định lượng vi sinh vật trong chế phẩm [14], [19], [21].
a. Phương pháp đếm trên đĩa thạch
Phương pháp đếm trên đĩa thạch được sử dụng nhiều nhất để định lượng B.
longum trong chế phẩm Probiotics do có độ chính xác cao, đơn giản, dễ thực hiện ở
quy mô phòng thí nghiệm, đồng thời có thể định lượng riêng được B. longum trong
hỗn hợp. Vi sinh vật trong chế phẩm ban đầu được pha loãng đến nồng độ thích
hợp, sau đó được cấy trộn vào môi trường dinh dưỡng trong đĩa petri và nuôi cấy ở
nhiệt độ, thời gian thích hợp. Sau thời gian nuôi cấy, đếm số khuẩn lạc và tính số
lượng vi sinh vật có trong chế phẩm ban đầu Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là tốn thời gian nuôi cấy, khó
khăn trong việc lựa chọn môi trường đặc hiệu cho vi sinh vật cần định lượng trong
hỗn hợp gồm nhiều vi sinh vật khác nhau.
b. Định lượng bằng phương pháp real-time PCR
Real-time PCR là một trong những kỹ thuật cho phép định lượng chính xác
nhất số lượng trình tự DNA trong một mẫu thí nghiệm. Khác với việc định lượng
khi quá trình khuếch đại đã hoàn tất, kỹ thuật này cho phép kiểm soát và định lượng
số lượng DNA ngay cả khi phản ứng đang xảy ra. Trong kỹ thuật này, ở mỗi chu
kỳ, lượng DNA được khuếch đại sẽ phát ra một lượng tín hiệu huỳnh quang nhất
định. Nói cách khác, lượng tín hiệu huỳnh quang sẽ tăng tỉ lệ thuận với mỗi chu kỳ
khuếch đại thành công của phản ứng real-time PCR. Như vậy bằng cách ghi nhận
lượng tín hiệu huỳnh quang phát ra sau mỗi chu kỳ, ta có thể kiểm soát phản ứng
PCR ngay trong giai đoạn khuếch đại tuyến tính của chúng. Và sự gia tăng đầu tiên
của tín hiệu huỳnh quang sẽ tương ứng với lượng DNA ban đầu của mẫu
Trong phản ứng real-time PCR, người ta thường sử dụng hai tác nhân phát
huỳnh quang bao gồm tác nhân gắn vào DNA mạch đôi (Ethidium Bromide, SYBR
Green, EvaGreen...) hoặc tác nhân dùng đánh dấu mẫu dò đặc hiệu (FAM, HEX ...).
Tác nhân liên kết với mạch đôi DNA. Trong phản ứng, khi có sự hiện diện của
các sản phẩm DNA mạch đôi do quá trình nhân bản thì các tác nhân liên kết với
DNA mạch đôi như SYBR Green sẽ liên kết với các sản phẩm vừa được tạo ra này
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 21/112
11
và phát tín hiệu huỳnh quang mạnh mẽ hơn (so với trạng thái tự do trong dung
dịch). Loại tác nhân huỳnh quang này có thể sử dụng được cho mọi trình tự đích
nên chi phí sẽ thấp; nhưng độ đặc hiệu của sản phẩm phải được kiểm tra chặt chẽ
thông qua một bước phân tích bổ sung sau khi phản ứng nhân bản kết thúc – phân
tích đường cong nóng chảy (Melting curve analysis).
Tác nhân dùng đánh dấu mẫu dò đặc hiệu rất đa dạng như FAM, TAMRA,
Texas Red, Cy3, Cy5… được sử dụng với nhiều loại mẫu dò khác nhau như mẫu dò
lai, mẫu dò thủy giải, mẫu dò dạng kẹp tóc.
Khi sử dụng với các mẫu dò khác nhau, cường độ tín hiệu huỳnh quang đều tỉ
lệ thuận với hàm lượng sản phẩm đích đang được nhân bản trong phản ứng. Các tínhiệu huỳnh quang phát ra sẽ được các đầu dò của máy luân nhiệt real-time PCR thu
nhận và xử lý. Khi cường độ tín hiệu huỳnh quang của mẫu vượt qua đường tín hiệu
huỳnh quang nền (base line) của phản ứng thì mẫu được xem là dương tính và
người ta lấy thời điểm vượt qua đó (biểu hiện qua giá trị chu kỳ ngưỡng – Ct, Cycle
Threshhold) để so sánh với một đường cong chuẩn (standard curve) đã biết để suy
ra nồng độ trình tự DNA đích trong mẫu thử nghiệm ban đầu. Đường cong chuẩn
được xây dựng từ chu kỳ ngưỡng của các mẫu chuẩn có chứa sản phẩm đích đã biết
trước nồng độ.
c. Phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ (FISH-fluorescent insitu
hybridization).
FISH dò tìm và phát hiện ra các trình tự acid nucleic của vi sinh vật cần định
lượng bằng cách dùng đầu dò được đánh dấu huỳnh quang lai đặc hiệu với các trình
tự đặc hiệu bổ sung với nó bên trong tế bào nguyên vẹn (không cần phá vỡ tế bào)
Quy trình thực hiện bao gồm các bước:
- Chuẩn bị mẫu và đầu đò
- Cố định mẫu
- Lai giữa đầu dò và trình tự đích đặc hiệu nằm trong tế bào
- R ửa mẫu để loại bỏ các đầu dò không được lai
- Dò tìm mẫu (bước này có thể bỏ qua nếu sử dụng đầu dò phát huỳnh quang
trực tiếp)
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 22/112
12
- Quan sát, hiển thị và lưu trữ kết quả bằng kính hiển vi quét laze đồng tiêu
hoặc kính hiển vi gắn thêm bộ lọc dải hẹp nhiều tần cùng với một máy ảnh
và phần mềm xử lí hình ảnh.
Các đầu dò thường được sử dụng là các oligonucleotide rRNA 16S để đảm
bảo sự liên kết bổ sung đạt hiệu quả cao nhất trong quá trình lai.
Đầu dò thường được đánh dấu bằng cách gắn trực tiếp chất nhuộm huỳnh quang lên
đầu dò hoặc kết hợp đầu dò với một số chất chỉ thị như Digoxygenin, sau đó chúng
sẽ được dò tìm thông qua một chất phản huỳnh quang
Ưu điểm của 2 phương pháp Realtime PCR và FISH là nhanh, cho độ chính
xác cao. Tuy nhiên nhược điểm là đòi hỏi đầu tư thiết bị đắt tiền, yêu cầu trình độkỹ thuật cao và không phân biệt được vi khuẩn sống hay vi khuẩn chết.
1.3.5.2. Định danh
a. Định danh kiểu hình
Dựa theo khóa phân loại được công nhận quốc tế: Dựa vào đặc điểm hình thái,
phản ứng sinh hóa. Để tiến hành kiểm tra các đặc điểm sinh hóa thì phương pháp sử
dụng phổ biến hiện nay là sử dụng các kit sinh hóa có sẵn (Ví dụ Api kit của hãng
BioMerieux-Pháp). Để định danh vi sinh vật thuộc chi Bifidobacterium có thể sử
dụng kit API 20A hoặc Rapid ID 32A.
b. Định danh kiểu gen.
Để định danh đến loài, kỹ thuật phổ biến được sử dụng hiện nay là kỹ thuật
nhân gen và giải trình tự
Kỹ thuật này bao gồm các bước:
Tách chiết DNA của vi sinh vật nghiên cứu: Thành tế bào vi sinh vật được
phá vỡ nhờ lysozyme và các chất tẩy rửa mạnh như SDS-tris-hydroclorid
giúp giải phóng toàn bộ DNA của vi sinh vật. Protein và RNA được tách
khỏi DNA nhờ các enzym RNAse, protease và isopropanol. Cuối cùng DNA
được tủa bằng ethanol tuyệt đối.
Tiến hành phản ứng PCR: Với việc sử dụng DNA polymerase và các
oligonucleotid tổng hợp nhân tạo, một đoạn DNA dùng làm khuôn được
nhân lên nhanh chóng với số bản sao gấp hàng tỉ lần mà không cần đến
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 23/112
13
nhiều tế bào vi sinh vật. Nhờ phản ứng này, một đoạn gen bất kì sẽ được
khuếch đại khi biết trình tự của hai điểm từ đầu 5’ đến đầu 3’ của sợi bổ
sung và nhờ có enzym DNA polymerase mà DNA khuôn được tổng hợp khi
đã có sẵn dNTP.
Kiểm tra sản phẩm bằng điện di trên gel agarose. Phân tích trình tự 16S
rDNA theo phương pháp Sanger. Cuối cùng, chuỗi trình tự này được so
sánh với tất cả các chuỗi nucleotid 16S rDNA đã được công bố trên ngân
hàng gen quốc tế và từ đó đưa ra kết luận chính xác tên của vi sinh vật.
Phương pháp này có độ chính xác rất cao. Cho đến nay, các chuyên gia phân
loại vi sinh vật trên thế giới đều cho rằng phương pháp tốt nhất để định danh vi sinhvật và thành lập cây phát sinh chủng là dựa trên trình tự rDNA kết hợp với phương
pháp phân loại kinh điển. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi đầu tư trang thiết bị
rất lớn mà không phải phòng thí nghiệm nào cũng có khả năng trang bị được.
- Kỹ thuật nhân gen PCR (Polymerase Chain Reaction) [8].
PCR là một kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong công nghệ sinh học hiện đại
và đã đóng góp rất lớn cho những tiến bộ về sinh học phân tử.
PCR dựa trên cơ sở phản ứng kéo dài primer nhờ enzym Taq DNA
polymerase để khuếch đại in vitro các acid nucleic đặc hiệu trong thiết bị điều nhiệt
tuần hoàn (thermocycler) hay còn gọi là máy PCR. PCR cho phép khuếch đại theo
hàm mũ lên đến hàng triệu lần các đoạn DNA có chiều dài từ 200- 3000 bp. Đoạn
DNA được khuếch đại (DNA đích) được nhận dạng nhờ cặp primer đặc hiệu
(oligonucleotid) thường có chiều dài khoảng 20 nucleotide.
Taq D NA polymerase là một loại enzym DNA polymerase chịu nhiệt (có ở vi
khuẩn chịu nhiệt cao Thermus aquaticus), được dùng để tổng hợp các đoạn DNA
mới trong môi trường có bốn loại deoxyribonucleotid (dATP, dCTP, dGTP và
dTTP) và hai primer, trên cơ sở khuôn mẫu của một đoạn DNA nhất định đã biết
hoặc chưa biết trình tự. Các đoạn DNA mới hình thành lại được sử dụng làm khuôn
mẫu. Sau nhiều chu kì, số lượng đoạn DNA nói trên được nhân lên gấp nhiều lần,
nhờ vậy có thể đủ số lượng để tách ra, phân tích trình tự hoặc tạo dòng...
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 24/112
14
Nguyên tắc của phản ứng khuếch đại gen được trình bày tổng quát trong Hình
1.3 và Hình 1.4
Hình 1.3. Sơ đồ phản ứng chuỗi polymerase
Hình 1.4.
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 25/112
15
Nguyên tắc của PCR được trình bày trong Hình 1.3 và Hình 1.4. Theo đó, từ
chu kỳ thứ hai, Taq polymerase (Taq pol) bắt đầu tạo ra các đoạn DNA có chiều dài
xác định. Các primer thường là một oligonucleotid tổng hợp, có khoảng 10 - 20
nucleotid hoặc hơn. Nếu biết trình tự của đoạn gen cần khuếch đại thì có thể tổng
hợp nhân tạo các primer tương ứng để thực hiện PCR và tách chúng ra bằng kỹ
thuật điện di. Trong kỹ thuật PCR người ta thường tiến hành khoảng 25 - 35 chu kỳ.
Mỗi chu kỳ PCR bao gồm ba bước có nhiệt độ khác nhau (xem hình vẽ minh hoạ):
Bước 1 là biến tính DNA (ở 90- 95oC), có tác dụng tách hai sợi đơn từ sợi khuôn
xoắn kép. Bước 2 là bắt cặp hai mồi vào hai sợi đơn của khuôn (ở 40 -65oC). Bước 3
là kéo dài chuỗi theo mồi, (ở nhiệt độ 70-72o
C)
chiều 5’-3’ với quá trình trùng hợpgắn các dNTP dọc theo sợi khuôn để tạo thành phiên bản mới theo nguyên tắc bổ
sung. Tính đặc hiệu của phản ứng được quy định bởi mồi và sự sao chép trực tiếp
theo trình tự sợi khuôn giữa hai mồi. Như vậy, kết quả tạo ra hàng triệu phiên bản
sợi khuôn trong vài giờ.
- Điện di DNA trên gel agarose
Nguyên lý điện di: các phân tử DNA là các polyanion nên trong môi trường
trung tính và kiềm, dưới tác dụng của điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực
dương. Mức độ di chuyển của các phân tử DNA trong điện trường phụ thuộc chủ
yếu vào kích thước (hay khối lượng phân tử) của chúng. Phân tử có kích thước nhỏ
sẽ di chuyển nhanh còn phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm. Sử dụng
thang chuẩn DNA với kích thước đã biết có thể dễ dàng xác định được kích thước
tương đối của DNA mẫu.
Tiến hành: chuẩn bị gel agarose X%, tiến hành tra mẫu gồm 10 l mẫu DNA
được trộn với 2 l đệm mầu (có chứa: glycerol 20%, chất chỉ thị màu bromophenol
xanh, xylene cyanol) và tra vào các giếng trên gel. Chạy điện di với hiệu điện thế ổn
định là 10 volt/cm gel đến khi vạch màu bromophenol xanh cách mép gel khoảng 2
cm thì dừng lại. Nhuộm bản gel trong dung dịch ethidium bromide (EtBr) ở nồng độ
50 g/ l trong 15-30 phút. Sau đó, gel được lấy ra và soi dưới ánh sáng tử ngoại
của máy soi chụp gel, các băng gắn với EtBr xuất hiện dưới dạng các băng màu
sáng trên nền gel màu đen.
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 26/112
16
- Nhân dòng
Nhân dòng là sự tách lập và thu nhận nhiều bản sao đồng nhất của một gen
hay của một mảnh đoạn DNA.
Nguyên tắc:
K ỹ thuật nhân dòng bao gồm việc phải cài một mảnh (chuỗi) DNA lạ vào một
vector (plasmide hoặc phage λ) bằng phương pháp hóa sinh. Sau đó, đưa phân tử
lai nay vào tế bào chủ đã chọn lựa bằng phương pháp biến nạ p hoặc tải nạp. Trườ ng
hợ p muốn tạo dòng tổng hợ p enzym thì mảnh DNA định cài phải mã hóa cho gen
cấu trúc của một enzyme nào đó.
+ Các bước cơ bản của phương pháp nhân dòng: Tách lậ p các DNA lạ cần nhân dòng:
Chọn và xử lý vector nhân dòng
Tạo DNA tái tổ hợ p (vector tái tổ hợ p).
Chuyển DNA tái tổ hợ p vào tế bào chủ bằng phương pháp biến nạ p hoặc tải
nạ p.
Phát hiện dòng cần tìm
Kiểm tra thu nhận sản phẩm của gen tái tổ hợ p.
- Giải trình tự
Phương pháp chính xác và đưa lại nhiều thông tin nhất cho định danh và định
typ vi sinh vật là xác định chính xác trình tự chuỗi DNA của một vùng quy định
trên nhiễm sắc thể. Phương pháp giải trình tự DNA phát triển nhanh chóng, kết quả
so sánh sự tương đồng của trình tự gen nghiên cứu trở thành phương pháp phân loại
chuẩn theo sinh học phân tử trong nghiên cứu hệ thống học và cây phả hệ di truyềngiữa các đối tượng nghiên cứu. Các gen bảo thủ được giải trình tự làm cơ sở để xác
định vị trí của sinh vật nghiên cứu, trong khi đó các trình tự không tương đồng
(khác biệt) lại làm cơ sở cho sự biệt hóa cũng như xác định mối quan hệ giữa các cá
thể gần với nhau.
Từ những năm 1977 một số phương pháp giải trình tự gen đã được phát minh
như phương pháp giải trình tự gen theo phương pháp hóa học ( Alan
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 27/112
17
Maxam và Walter Gilbert), phương pháp giải trình tự gen bằng enzyme (do
Frederick Sanger và cộng sự )
Cả hai phương pháp này đã đánh dấu bước ngoặt lớn trong lịch sử phát triển
của bộ môn sinh học hiện đại. Ngày nay, rất nhiều máy giải trình tự gen tự động đều
dựa trên nguyên tắc chính là phương pháp giải trình tự gen của Sanger.
Phương pháp này dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định
nhờ DNA polymerase. Với việc sử dụng thêm các dideoxynucleotide cùng với các
deoxynucleotid thông thường, kết quả tổng hợp cũng là sự hình thành một tập hợp
nhiều đoạn DNA có kích thước khác nhau.
Các phân đoạn DNA sẽ được phân tách bằng điện di trên gel polyacrylamid cókhả năng phân tách hai trình tự DNA chỉ chênh nhau một nucleotid. Với việc sử
dụng một loại nucleotide có đánh dấu đồng vị phóng xạ, kết quả trình tự DNA cần
xác định được đọc trên bản phóng xạ tự ghi từ bản điện di.
Để thực hiện được giải trình tự bằng máy tự động thì các mạch DNA đơn sản
sinh trong ống phản ứng giải trình tự phải được đánh dấu huỳnh quang để các vạch
điện di của các mạch đơn này phát sáng khi đi qua một chùm tia sáng laser. Nguyên
tắc hoạt động của máy là trong suốt quá trình điện di, mỗi khi có một vạch điện di
đi qua chùm tia laser thì vạch điện di sẽ phát sáng lên và sự phát sáng này sẽ được
con mắt cản quang ghi nhận và lưu lại thành một đỉnh cường độ sáng trong biểu đồ.
Từ biểu đồ của các đỉnh cường độ sáng này, máy sẽ so dòng của các đỉnh tương ứng
với các màu để cuối cùng phân tích thành trình tự của đoạn DNA.
1.3.6. Tình hình nghiên cứu định tính và định lƣợ ng B. longum trong các
chế phẩm probiotics trong những năm gần đây - Trên thế giới
Phương pháp định lượng B. longum phổ biến vẫn là phương pháp đếm trên đĩa
thạch. Bên cạnh đó các nhà khoa học đã nghiên cứu thêm một số phương pháp mới
đó là phương pháp FISH, phương pháp real-time PCR và kỹ thuật nhuộm huỳnh
quang.
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 28/112
18
Để định lượng B. longum trong các chế phẩm gồm nhiều vi sinh vật bằng
phương pháp đếm trên đĩa thạch, việc khó khăn nhất là lựa chọn được môi trường
phù hợp. Môi trường này phải đáp ứng yêu cầu là khuyến khích sự phát triển của B.
longum và ức chế hoàn toàn sự phát triển của các vi sinh vật còn lại trong hỗn hợp.
Để đạt được yêu cầu này, người ta thường dựa vào khả năng nhạy cảm hoặc kháng
lại kháng sinh của vi sinh vật trong hỗn hợp. Do đó người ta sẽ thêm vào môi
trường cơ bản ban đầu một hoặc nhiều kháng sinh khác nhau với mục đích là các
kháng sinh này sẽ ức chế các vi sinh vật khác trong hỗn hợp, sẽ định lượng và phân
lập riêng được vi sinh vật cần nghiên cứu là vi sinh vật đề kháng lại các khá ng sinh
đã thêm vào môi trường. Dựa trên nhiều công trình nghiên cứu của nhiều tác giả,Janet E.L.Corry và cộng sự đã tổng quan lại một số môi trường để định lượng
Bifidobacteria trong chương 10 cuả quyển “ Handbook of culture Media for Food
and Water Microbiology, 3rd
edition” [19]. Theo đó việc lựa chọn môi trường để
định lượng tùy thuộc vào sự có mặt của những vi sinh vật nào trong hỗn hợp cần
định lượng, từ đó cho phép định lượng riêng được từng vi sinh vật trong hỗn hợp.
Để định danh B. longum trong hỗn hợp, phương pháp phổ biến thường được
dùng là định danh bằng kỹ thuật PCR [27], [22].
- Trong nước
Hiện nay, thị trường thuốc Việt Nam có rất nhiều thuốc và thực phẩm chức
năng có chứa B. longum như LACTIBIO (Công ty TNHH DP UNIVN), LAZEBIO
(Công ty INTECHPHARM), LACCLEAN GOLD (Cell Biotech CO, Ltd),
YBIOPLUS (Công ty Dược Hậu Giang), Safikid BIO (Học viện Quân Y), L-Bio-
3D (Công ty Liên Doanh Dược phẩm Mebiphar Austrapharm)…
Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào về việc định lượng và phân lập riêng B.
longum trong thuốc và thực phẩm chức năng. Việc định lượng chỉ dừng lại ở định
lượng hỗn hợp vi sinh vật trong chế phẩm. Đồng thời việc định danh B. longum
cũng chưa được nghiên cứu thấu đáo. Trong một số tiêu chuẩn cơ sở của các nhà
sản xuất trong nước đã sử dụng kít Api 20A để định danh B. longum trong chế
phẩm [1], [2]. Tuy nhiên, việc sử dụng kit Api 20A mới chỉ cho phép định danh đến
chi Bifidobacterium, đồng thời các tiêu chuẩn này cũng chưa chỉ ra được cách phân
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 29/112
19
lập khuẩn lạc thuần khiết để tiến hành phản ứng sinh hóa. Điều này sẽ dễ gây ra sai
số trong việc định danh. Chưa có công trình nghiên cứu nào ứng dụng kỹ thuật nhân
gen và giải trình tự để định danh B. longum.
Do đó hướng nghiên cứu của đề tài này là nghiên cứu lựa chọn môi trường đặc
hiệu để định lượng riêng được B. longum trong hỗn hợp, từ đó phân lập được khuẩn
lạc thuần khiết để định tính bằng kít sinh hóa và định danh bằng kỹ thuật sinh học
phân tử. Thẩm định qui trình đã thiết lập để áp dụng vào việc kiểm nghiệm B.
longum trong một số chế phẩm thuốc và thực phẩm chức năng lưu hành trên thị
trường Việt Nam.
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 30/112
20
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN V ẬT LIỆU,
TRANG THIẾT BỊ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. PHƢƠNG TIỆN DÙNG TRONG NGHIÊN CỨ U
2.1.1. Môi trƣờ ng, hoá chất, dung môi, thiết bị
2.1.1.1. Môi trườ ng
- Môi trường BSM đặc (Fluka) lô BCBK6505V.
Hỗn hợp kháng sinh để thêm vào môi trường BSM đặc, lô BCBK 1651V
- Môi trường MRS đặc (Merck)
Công thức
Pepton 10,0g
Cao thịt 8,0g
Cao men bia 4,0g
Glucose 20,0g
Dikali hydrophosphat 2,0g
Tween 80 1,0g
Amoni citrat 2,0g
Natri acetat 5,0g
Mangan sulfat 0,04g
Magnesi sulfat 0,2g
Thạch 14,0g
Nước cất vừa đủ 1000ml pH sau khi tiệt trùng: 5,7 ± 0,2
- Môi trường MRS lỏng (Merck) có công thức giống môi trường MRS đặc
chỉ khác là không có thạch.
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 31/112
21
- Môi trườ ng API 20A (BioMérieux, Pháp): Ống 4ml. Số lô: 1002717340.
Hạn dùng: 5/5/2015
Công thứ c
Trypticase 5,0g
Cao men bia 5,0g
Natri clorid 2,5g
L-tryptophan 0,2g
L-cystine 0,4g
Hemin 0,005g
Vitamin K 1 0,01g Natri sulfit 0,1g
Nướ c cất vừa đủ 1000ml
pH sau khi tiệt trùng: 6,9 – 7,3.
- Môi trườ ng thạch máu
Công thứ c
Pepton 10,0g
Natri clorid 5,0g
Cao thịt 2,5g
Thạch 20,0g
Nướ c cất vừa đủ 1000ml
pH sau khi tiệt trùng: 7,4 – 7,6
Máu thỏ 50,0ml ( máu 5%)
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 32/112
22
2.1.1.2. Hoá chấ t, dung môi
- Hóa chất, dung môi được ghi ở Bảng 2.1 và Bảng 2.2
Bảng 2.1. Mồi đặc hiệu
Loài Tên mồi Số lô Hãng sản xuất
Đoạn 16S r DNA
ID16R08F 208918A07
InvitrogenIDL16R09R 208918A08
B. longum
BlonF 208918B05
InvitrogenBlonR 208918B05
VectorpGemT easy nguyên
bản
Promega
Bảng 2.2. Hóa chất, dung môi
Tên Số lô Hãng sản xuất
Lysozym 061M13281V Sigma-Aldorich
WizardR Genomic DNA
Purification Kit
297885 Promega
Taq DNA polymerase 1130853 Life technologies
dNTPs (100mM) 1139131 Life technologies
Thang DNA chuẩn 668361 Invitrogen
DNA loading Dye (6X) 00056239 Fermentas
Đệm PCR – MgCl2 (10X) 1113366 Invitrogen
Nước cất siêu tinh khiết 764952 Invitrogen
Agarose siêu tinh khiết 0000144547 Invitrogen
Tris siêu tinh khiết 90920S196 Biobasic Inc
EDTA, free acid 1004SHLS0125B0210J Biobasic Inc
Kit API 20A 1002998430 BioMérieux
Thuốc thử BCP 1003101450 BioMérieux
Thuốc thử XYL Merck
Thuốc thử HER 1003059340 BioMérieux
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 33/112
23
- Độ đục chuẩn McFarland số 2: Hút chính xác 2,0ml dung dịch bari clorid 1,0%
vào bình định mức dung tích 100ml và pha loãng bằng dung dịch acid sulfuric 1,0%
vừa đủ đến vạch, tr ộn đều.
- Độ đục chuẩn McFarland số 3: Hút chính xác 3,0ml dung dịch bari clorid 1,0%
vào bình định mức dung tích 100ml và pha loãng bằng dung dịch acid sulfuric 1,0%
vừa đủ đến vạch, tr ộn đều.
Đo độ hấ p thụ của các độ đục chuẩn ở bướ c sóng 600nm, cốc đo dày 1cm, sử
dụng dung dịch acid sulfuric 1,0% làm mẫu tr ắng thì độ hấ p thụ của độ đục chuẩn
số 2 khoảng 0,451, độ hấ p thụ của độ đục chuẩn số 3 khoảng 0,582. Độ đục chuẩn
chỉ dùng trong vòng 3 tháng k ể từ ngày pha.2.1.1.3. Thiế t bị , d ụng cụ
a. Thiết bị.
Được hiệu chuẩn theo ISO/IEC-17025 và GLP.
- Buồng thổi khí sạch Kebo (Thuỵ Điển).
- Tủ ấm CO2 T 305-F (Thuỵ Điển)
- Tủ sấy Memmert ULE 600 (Đức)
- Nồi hấp Tomy SS-325 (Nhật)
- Cân kĩ thuật điện tử Sartorius TE 412, độ chính xác 0,01g (Đức)
- Máy quang phổ tử ngoại khả kiến Shimadzu (Nhật Bản)
- Tủ lạnh sâu Kebo 2951 (Thuỵ Điển)
- Máy li tâm lạnh Mikro-200R (Đức)
- Máy điện di gel XL-ULTRA-V-2 (Mỹ)
- Máy chụp ảnh gel UVDI- 312 (Đài Loan) - Máy khuyếch đại gen RealTime Step one Plus (Singapore)
- Máy lắc trộn Vortex Genie 2 (Mỹ)
- Đèn soi UV ở bước sóng 365nm
b. Dụng cụ
Các dụng cụ thuỷ tinh như pipet, bình định mức, bình nón... Class A.
Micropipet (Eppendorf - Đức) 10 l, 100 l 1000 l, 5ml và 10ml. Ống nhựa 1,5ml,
2,0ml; ống thủy tinh kích thước 16x120mm.
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 34/112
24
2.1.2. Phần mềm xử lý k ết quả: Apiweb của hãng BioMérieux.
2.1.3. Chủng vi sinh vật chuẩn
Các chủng vi sinh vật chuẩn đượ c sử dụng trong đề tài này đượ c trình bày ở Bảng 2.3
Bảng 2.3. Các vi sinh vật chuẩn đượ c sử d ụng
TT Tên chủng Kí hiệu TT Tên chủng Kí hiệu
1 Bacillus
cereus
ATCC 11778 11 Lactobacillus
rhamnosus
ATCC
9595
2 Bacillus
pumilus
ATCC 14884 12 Bifidobacterium
breve
ATCC
15700
3 Bacillus
stearothermo
philis
ATCC 795 13 Bifidobacterium
bifidum
ATCC
11863
4 Bacillus
subtilis
ATCC 6333 14 Streptococcus
faecalis
ATCC
33186
5 Lactobacillus
acidophilus
ATCC
4356
15 Streptococcus
pyogenes
ATCC
19615
6 Lactobacillus
leichmannii
ATCC 7830 16 Pseudomonas
aeruginosa
ATCC
9027
7 Bacilus
coagulans
ATCC 7050 17 Escherichia coli ATCC
8739
8 Lactobacillus
casei
ATCC 334 18 Staphylococcus
aureus
ATCC653
8
9 Lactobacillus
fermentum
ATCC 9338 19 Streptococcus
thermophilus
ATCC
19258
10 Lactobacillus
plantarum
ATCC 8014 20 Bifidobacterium
longum
JCM 1217
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 35/112
25
2.2. ĐỐI TƢỢ NG NGHIÊN CỨ U
Là một số chế phẩm probiotics trên thị trường
- Gói bột SamubioTHYMO (kí hiệu mẫu A)
Công ty sản xuất: Công ty cổ phần Dược, vật tư y tế Hải Dương
Số đăng kí: 12735/2011/YT-CNTC
Số lô: 010112. Hạn dùng: 300115
Công thức: Mỗi gói 3g bột chứa
+ Lactobacillus acidophilus ≥108CFU
+ Bifidobacterium longum ≥108CFU
+ Streptococcus faecalis ≥108
CFU- Gói bột safikid BIO (kí hiệu mẫu B)
Công ty sản xuất: Trung tâm nghiên cứu ứng dụng sản xuất thực phẩm chức
năng- Học viện Quân Y.
Số đăng kí: 1757/2010/YT-CNTC
Số lô: 1113. Hạn dùng: 11/2015
Công thức: Mỗi gói 3g bột chứa
+ Lactobacillus acidophilus ≥108CFU
+ Bifidobacterium longum ≥108CFU
+ Streptococcus thermophilus ≥108CFU
- Gói bột L-Bio-3D (ký hiệu mẫu C)
Công ty sản xuất: Công ty liên doanh dược phẩm MEBIPHAR -
AUSTRAPHARM
Số đăng kí: QLSP -0746-13Số lô: 061213. Hạn dùng: 25/12/2015
Công thức: Mỗi gói 1g bột chứa hỗn hợp các vi khuẩn sinh acid lactic
≥108CFU
+ Lactobacillus acidophilus
+ Bifidobacterium longum
+ Lactobacillus rhamnosus
- Gói bột Lackid (Ký hiệu mẫu D)
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 36/112
26
Công ty sản xuất: Novarex, Hàn Quốc
Số đăng kí: 3056/2013/ATTP - XNCB
Số lô: 4002. Hạn dùng: 08.04.2017
Công thức: Mỗi gói 3g bột chứa hỗn hợp các vi khuẩn sinh acid lactic
≥108CFU
+ Lactobacillus acidophilus
+ Lactobacillus rhamnosus
+ Lactobacillus plantarum
+ Bifidobacterium longum
+ Streptococcus faecalis - Gói bột Probiotics Lactomin plus (ký hiệu mẫu E)
Công ty sản xuất: Novarex, Hàn Quốc
Số đăng kí: 1160/2014/XNQC - ATTP
Số lô: 4002. Hạn dùng: 04.02.2017
Công thức: Mỗi gói 3g bột chứa hỗn hợp các vi khuẩn sinh acid lactic
≥108CFU
+ Lactobacillus acidophilus
+ Bifidobacterium longum
+ Streptococcus faecalis
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U
2.3.1. Phƣơng pháp định lƣợ ng B. longum trong chế phẩm
Sử dụng phương pháp đếm trên đĩa thạch. Trên cơ sở tham khảo các công
trình nghiên cứu có liên quan, chúng tôi lựa chọn môi trường BSM agar để định
lượ ng B. longum trong hỗn hợ p [19], [25].
Chuẩn bị hỗn dịch thử : Cân và xác định khối lượng trung bình của 20 gói chế
phẩm. Cân chính xác khoảng 10,0g bột thuốc vào bình nón vô trùng, thêm dung môi
pha loãng với thể tích tính theo mililit bằng 9 lần khối lượng bột thuốc đã cân và vài
viên bi thuỷ tinh vô trùng. Lắc mạnh trong 30 phút để vi sinh vật phân tán đều trong
dung dịch, thu được hỗn dịch có độ pha loãng 10-1
. Lấy 1000 l hỗn dịch trên cho
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 37/112
27
vào ống nghiệm đã chứa sẵn 9,0ml dung môi pha loãng, lắc đều bằng máy lắc trộn
Vortex được hỗn dịch có độ pha loãng 10-2. Tiếp tục pha loãng 10 lần như trên để
thu được hỗn dịch có có độ pha loãng 10-5, 10-6 và 10-7.
Tiến hành: Chuẩn bị ba đĩa petri vô trùng, chuyển vào mỗi đĩa chính xác
1000 l hỗn dịch có độ pha loãng 10-5. Tiếp tục làm như trên với hỗn dịch có độ pha
loãng 10-6 và 10-7. Cấy trộn với môi trường BSM đặc (đã được tiệt trùng và để nguội
xuống khoảng 45oC), để môi trường trong đĩa đông tự nhiên. Lật ngược đĩa petri và
ủ ở 37 1oC trong 48 - 72 giờ trong điều kiện kị khí. Sau thời gian ủ, đếm số lượng
khuẩn lạc trong các đĩa petri (chỉ đếm các đĩa petri có số khuẩn lạc nằm trong
khoảng 25 - 250).Tính kết quả: Số lượng vi sinh vật trong 1 gói chế phẩm được tính theo công
thức:
A = nTB d MTB
Trong đó:
A : số lượng vi sinh vật trong 1 gói chế phẩm (CFU/gói),
nTB : số lượng khuẩn lạc trung bình trong 3 đĩa petri (CFU),
MTB : khối lượng trung bình của bột thuốc trong gói chế phẩm (g/gói),
d : hệ số pha loãng của hỗn dịch thử.
2.3.2. Phƣơng pháp định danh vi sinh vật bằng kit API 20A
2.3.2.1. Nguyên t ắ c chung
Kit API 20A là một hệ thống đã đượ c tiêu chuẩn hóa của hãng BioMérieux
(Pháp). Kit API 20A đượ c dùng cùng với môi trườ ng API 20A để định danh vi sinh
vật k ị khí, trong đó có chi Bifidobacterium.
Kit API 20A gồm 20 giếng chứa các chất nền khác nhau. Vi sinh vật cần xác
định sẽ đượ c cấy vào môi trườ ng API 20A và nhỏ môi trường đã có vi sinh vật vào
từng giếng, lúc này các chất nền trong giếng sẽ được hoà tan vào trong môi trườ ng.
Trong quá trình nuôi cấy sản phẩm chuyển hóa nếu có sẽ tự làm thay đổi màu môi
trườ ng hoặc thay đổi màu sau khi thêm thuốc thử. Tên của các chất nền sẽ được đề
cập đến trong mục 2.3.2.2 13 .
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 38/112
28
2.3.2.2. Tiế n hành
Sau khi nuôi cấy vi sinh vật như mô tả trong mục định lượ ng 2.3.1, lựa chọn
một khuẩn lạc đặc trưng, tách biệt và cấy chuyển sang 5,0ml môi trườ ng MRS lỏng,
có bổ sung khoảng 0,5ml dầu khoáng ở lớ p bề mặt và ủ trong điều kiện k ị khí ở 37
1oC trong 24 giờ .
a. Nhuộm Gram: Tiến hành nhuộm tế bào theo phương pháp nhuộm Gram và
soi dướ i kính hiển vi vớ i vật kính dầu có độ phóng đại 1000 lần.
Nếu vi sinh vật bắt màu tím, hình que, không có bào tử thì k ết luận vi sinh
vật là tr ực khuẩn Gram dương, không sinh bào tử.
b.
Định danh vi sinh vật bằ ng kit API 20A:Sau khi xác định vi sinh vật là tr ực khuẩn Gram dương, không sinh bào tử
thì tiế p tục cấy một quai cấy canh chủng từ ống MRS lỏng ở trên lên môi trườ ng
thạch máu, ủ trong điều kiện k ị khí ở 37 1oC trong 18-24 giờ . Gặt vi sinh vật
trên bề mặt đĩa thạch và phân tán đều trong ống nghiệm có sẵn 1ml nướ c cất vô
trùng thu đượ c hỗ n d ịch g ố c.
Nhỏ từ từ từng giọt hỗ n d ịch g ố c ở trên vào một ống nghiệm đã chứa sẵn 4ml
nướ c cất vô trùng đến khi độ đục trong ống tương đương với độ đục chuẩn
McFarland số 3. Ghi lại số giọt hỗn dịch gốc đã cho vào ống nghiệm trên.
Cho vào 4ml môi trườ ng API 20A số giọt hỗn dịch gốc bằng số giọt đã cho
vào ống nghiệm trên và lắc đều. Như vậy, nồng độ vi sinh vật trong môi trườ ng
API 20A tương đương với độ đục chuẩn McFarland số 3 (so sánh độ đục bằng
mắt thườ ng).
Nhỏ môi trườ ng API 20 đã cấy vi sinh vật vào các giếng của bộ kit API 20A bắt đầu từ giếng số 0 đến giếng 20, chú ý tránh tạo bọt khí trong giếng, chú ý chỉ
nhỏ phần tube. Riêng đối vớ i giếng IND nhỏ dung dịch dầu khoáng vô trùng lên
trên bề mặt giếng để tạo điều kiện k ị khí cho vi sinh vật phát triển. Đối vớ i giếng
GEL nhỏ cả phần tube và phần miệng giếng. Ủ ở 36 ± 2oC trong điều kiện k ị khí
trong vòng 24± 2h.
Cách đọc k ết quả: Sau 24h nuôi cấy, quan sát và đọc k ết quả.
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 39/112
29
- Đối vớ i giếng IND: Thêm 1 giọt thuốc thử XYL vào lớ p dầu khoáng phía
trên, tr ộn đều và để 2-3 phút. Sau đó thêm 1 giọt thuốc thử EHR. Đọc k ết
quả trong vòng 5 phút. K ết quả là dương tính nếu xuất hiện màu đỏ.
- Đối vớ i các giếng có chứa các đườ ng khác nhau: Thêm vào mỗi giếng một
giọt thuốc thử BCP. K ết quả được ghi là dương tính nếu xuất hiện màu
vàng hoặc vàng-xanh.
- Phản ứng CAT: Để kit tiế p xúc vớ i không khí khoảng 30 phút, sau đó thêm
2 giọt thuốc thử H2O2 3% vào một giếng dương tính bất k ỳ. K ết quả đượ c
ghi là dương tính nếu thấy xuất hiện bọt khí.
Cách đọc giếng dương tính và giếng âm tính đượ c trình bày ở Bảng 2.4
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 40/112
30
Bảng 2.4. Cách đọc k ế t quả kit Api 20A
Giếng Chất nền
Hàm
lượ ng(mg/gi
ếng)
Phản ứng
K ết quả
âm tính Dương tính
IND L-tryptophan 0,98 Sự hình thành indol
XYL-tr ộn đ u /2-3 phút + HER/5 phút
Vàng Đỏ
URE Urea 0,648 Urease Vàng-cam Đỏ
GLU
MAN
LAC
SACMAL
SAL
XYL
ARA
D-glucose
D-manitol
D-lactose
D-saccharoseD-maltose
Salicin
D-xylose
L-arabinose
1,96
1,96
1,96
1,861,96
1,64
1,64
1,64
Acid hóa
Acid hóa
Acid hóa
Acid hóaAcid hóa
Acid hóa
Acid hóa
Acid hóa
BCP
Tím Vàng/ vàng-xanh
GEL gelatin 0,6Sự thủy phân gelatin
Không có sự khuếch tán chất
màu
Có sự khuếch tán
chất màu đen
ESCEsculin
Sắt (III) citrat
0,36
0,11Sự thủy phân Esculin
Vàng Nâu-đen
Soi dưới đèn UV 365nm
Phát quang Không phát quang
GLY
CEL
MNE
MLZ
RAF
SOR
RHA
TRE
Glycerol
D-cellobiose
D-mannose
D-melezitose
D-raffinose
D-sorbitol
L-rhamnose
D-trehalose
1,82
1,86
1,96
1,96
2,18
2,18
1,96
1,96
Acid hóa
Acid hóa
Acid hóa
Acid hóa
Acid hóa
Acid hóa
Acid hóa
Acid hóa
BCP
Tím Vàng/ Vàng-xanh
Sau khi tiế p xúc vớ i không khí 30 phút, thêm H2O2
vào 1 giếng dương tính
CAT - Catalase Không có bọt khí Xuất hiện bọt khí
SPOR - Bào tử Không có Có
GRAM - H ng Tím
COCC - Hình thái Que C u
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 41/112
31
Ghi k ết quả vào phiếu theo dõi. Nhậ p số liệu vào phần mềm Apiweb để định
danh chính xác vi sinh vật trong chế phẩm.
2.3.3. Định danh đến loài bằng k ỹ thuật PCR và giải trình tự 2.3.3.1. Sơ đồ chung định tính B. longum trong các chế phẩ m probiotics bằ ng k ỹ
thuật PCR và giải trình t ự
Sau khi lựa chọn khuẩn lạc đặc trưng tách biệt, tiến hành tăng sinh trong môi
trườ ng MRS lỏng có bổ sung 0,5ml dầu khoáng và được định danh đến chi
Bifidobacterium bằng kit API 20A như mô tả trong mục 2.3.2, tiế p tục cấy tăng sinh
VSV từ phần sinh khối còn lại sang môi trườ ng MRS lỏng, bổ sung thêm 0,5ml dầu
khoáng vô khuẩn, ủ ở 37±10C trong điều kiện k ỵ khí trong 24 giờ. Sau đó VSV
trong ống môi trườ ng MRS lỏng này sẽ đượ c tách chiết DNA và định danh bằng k ỹ
thuật PCR và giải trình tự theo sơ đồ sau
Hình 2.1. Sơ đồ định tính B. longum bằ ng k ỹ thuật PCR và giải trình t ự
VSV trong môitrường MRS lỏng
Tách chiết DNA
Kiểm tra sản phẩmtách
Tiến hành phản ứngPCR với mồi đặc hiệu
Nhân dòng và giảitrình tự
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 42/112
32
2.3.3.2. Tách DNA vi khuẩ n bằ ng WizardR Genomic DNA Purification Kit
Nguyên tắc:
Tách chiết DNA của vi sinh vật nghiên cứu: Thành tế bào vi sinh vật được phá
vỡ nhờ lysozyme và dung dịch ly giải tế bào giúp giải phóng toàn bộ DNA của vi
sinh vật. Protein và RNA được tách khỏi hỗn hợp nhờ enzym RNAse và dung môi
kết tủa protein. Cuối cùng DNA được tủa bằng Isopropanol.
DNA của các chủng nghiên cứu và của các vi sinh vật phân lập trong các mẫu
được tách và tinh sạch bằng kit của Promega có cải tiến. Quy trình thực hiện như
sau:
- Các chủng chuẩn được tăng sinh từ các ống gốc bằng môi trường MRSlỏng, ủ ở 370C trong 48 giờ. Đối với các mẫu nghiên cứu, tiếp tục tăng sinh
VSV trong môi trường MRS lỏng từ phần sinh khối của VSV được phân lập
sau khi đã định danh đến chi Bifidobacterium (mục 2.3.2 )
- Lấy 1,0 – 1,5ml môi trường tăng sinh chủng trên vào ống nhựa 1,5ml.
- Mang ly tâm 10000-12000 vòng/phút trong 2 phút loại dịch nổi thu lấy cắn.
- Thêm 480µl dung dịch EDTA 50mM vào ống cắn, lắc đều.
- Thêm tiếp 120µl dung dịch lysozyme (nồng độ 20mg/ml) trộn đều.
- Ủ ở 370C trong 30-60 phút, sau đó ly tâm ở 10000-12000 vòng/phút trong 2
phút. Bỏ dịch nổi thu lấy cắn.
- Thêm 600µl dung dịch Nuclei Lysis vào ống cắn vừa thu được. Dùng pipet
đảo nhẹ tạo thành hỗn dịch.
- Ủ hỗn dịch trên ở 800C trong 5 phút để ly giải tế bào, sau đó để nguội đến
nhiệt độ phòng
- Thêm 3µl dung dịch RNAse vào dịch ly giải tế bào, trộn đều bằng cách đảo
ống từ 5-7 phút.
- Ủ ở 370C trong 15-60 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng.
- Thêm 200µl dung dịch Protein Precipitation (dung dịch kết tủa protein)
vào hỗn hợp trên, lắc mạnh tr ong 20 giây.
- Ủ trong đá lạnh 5 phút.
- Đem ly tâm 10000-12000 vòng/phút trong 3 phút.
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 43/112
33
- Chuyển dịch nổi chứa DNA vào một ống nhựa 1,5ml sạch khác chứa 600µl
isopropanol. Trộn đều bằng cách đảo ngược ống từ 5-7 lần.
- Ly tâm 10000-12000 vòng/phút trong 2 phút.
- Loại bỏ dịch nổi, thu lấy cắn. Thêm 600µl dung dịch ethanol 70% vào ống,
đảo nhẹ nhàng để rửa cắn DNA.
- Ly tâm 10000-12000 vòng/phút trong 2 phút. Cẩn thận loại hết ethanol
thừa, để khô tự nhiên trong 10-15 phút.
- Thêm 100µl dung dịch DNA Rehydration (dung dịch hòa tan DNA) vào
ống chứa cắn DNA, ủ 650C trong 1 giờ.
- Bảo quản dung dịch DNA vừa tách được ở -200
C.2.3.3.3. Định lượ ng DNA bằng phương pháp đo độ hấ p thụ ánh sáng t ử ngoại ở
bướ c sóng 260 nm (A260 )
Nguyên tắc: Dựa vào khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm
(A260) của các phân tử DNA. Từ giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm của các
mẫu, với hệ số A260 = 1 tương đương với 50 ng/µl, sử dụng công thức C = A260 x 50
x n (trong đó n là số lần pha loãng) để định lượng DNA có trong mẫu tách chiết.
Tiến hành:
Lấy 20µl dung dịch DNA trên, thêm 1,98 ml nước cất siêu tinh khiết vô
khuẩn. Tiến hành đo quang ở bước sóng 260nm thu được A260. Dựa vào kết quả đo
tính toán nồng độ dung dịch DNA gốc rồi pha loãng dung dịch DNA gốc đến nồng
độ 50 ng/µl.
2.3.3.4. Nghiên cứ u, thiế t k ế mồi đặc hiệu
Trên cơ sở tham khảo các công trình nghiên cứu có liên quan, tham khảonguồn gen của các loài vi sinh vật trên hệ thống ngân hàng gen thế giới (Genbank)
và phần mềm Primer 3, NCBIblast. Từ đó nghiên cứu để thiết kế cặp mồi đặc hiệu
cho đối tượng nghiên cứu.
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 44/112
34
Bảng 2.5. Trình tự các cặp mồi dung cho phản ứng PCR
Loài Tên mồi Trình tự
Kích
thước
gen đích
Tài
liệu
tham
khảo
Đoạn
16S
rDNA
ID16R08
F
5’-GGGGGATCCAGAGTTTGATCCTGGCTCA- 3’
1500 bp [20]IDL16R0
9R
5’-GGGCTCGAGTACCTTGTTACGACTTCACC-3’
B.
longum
BlonF 5’-TTC CAG TTG ATC GCA TGG TC-3’
831 bp [27],
[22]
BlonR 5’-GGG AAG CCG TAT CTC TAC GA-3’
Vector
pGemT
nguyên
bản
T7-Fw5’ – AATACGACTCACTATAG – 3’
186 bp
[23]
SP6-Rv5’ – TATTTAGGTGACACTATAG – 3’
2.3.3.5. Kiể m tra khả năng tách DNA
16S ribosome RNA là một thành phần của các tiểu đơn vị 30s nhỏ trong
ribosome vi khuẩn. Các gen mã hóa cho thành phần này được gọi là 16S r DNA có
tính đặc thù cho vi khuẩn. Dựa trên tính chất này tiến hành phản ứng nhân bản đoan
gen 16s rDNA bằng mồi đặc hiệu để chứng minh sự có mặt của DNA vi khuẩn.
* Phản ứng PCR
Kiểm tra sản phẩm DNA tách được bằng phản ứng nhân bản đoạn gen đặc
hiệu 16S r DNA của vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR.
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 45/112
35
Bảng 2.6. Thành phần của phản ứng PCR kiểm tra DN A mới tách
STT Thành phần Thể tích (µl)
1 Đệm PCR (10X) 2,5
2 dNTPs (2mM) 2,5
3 Dung dịch MgCl2 (50mM) 0,75
4 ID16R08F (10 pmol) 1
5 IDL16R09R (10 pmol) 1
6 Tag DNA polymerase (5u/µl) 0,1
7 DNA khuôn (50ng/µl) 3
8 Nước cất 14,15Tổng thể tích phản ứng 25µl
Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân bản đoạn gen 16S r DNA: 940C trong
5 phút để biến tính hoàn toàn DNA khuôn, tiếp theo là 30 chu kỳ của 3 bước: 940C
trong 45 giây để làm biến tính DNA, 560C trong 45 giây để gắn mồi và 720C trong 1
phút 30 giây để kéo dài chuỗi. Mẫu sau đó được ủ tiếp ở 720C trong 5 phút và giữ ở
40C cho đến khi phân tích.
* Điện di trên gel agarose
Chuẩn bị bản gel có nồng độ 1% (kl/tt) trong đệm TBE (pH 8,0) (Tris-Boric
acid-EDTA), nhuộm sản phẩm theo kỹ thuật điện di trên gel giới thiệu ở mục
1.3.5.2 b, kèm theo một giếng nhỏ chứa thang kích thước DNA chuẩn. Điện di bằng
máy điện di gel XL-ULTRA-V-2 ở 100V trong 30 phút. Nhuộm sản phẩm bằng
dung dịch ethidium bromide 0,1% trong 15-30 phút. Ghi lại kết quả bằng máy chụpảnh bản gel UVDI- 312.
2.3.3.6. Nhân bản đoạn gen đặc hiệu của các đối tượ ng nghiên cứ u bằ ng k ỹ
thuật PCR
Tiến hành phản ứng PCR với các thành phần ghi trong Bảng 2.7
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 46/112
36
Bảng 2.7. Thành phần phản ứng PCR đơn mồi
STT Thành phần Thể tích (µl)
1 Đệm PCR (10X) 2,52 dNTPs (2mM) 2,5
3 Dung dịch MgCl2 (50mM) 0,75
4 BlonF (10pmol) 1
5 BlonR (10pmol) 1
6 Tag DNA polymerase (5u/µl) 0,1
7 DNA khuôn (50ng/µl) 3
8 Nước cất 14,15
Tổng thể tích phản ứng 25µl
Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân bản đoạn gen đặc hiệu: : 94oC trong
5 phút để biến tính hoàn toàn DNA khuôn, tiếp theo là 30 chu kỳ của 3 bước: 940C
trong 45 giây để làm biến tính DNA, 56oC trong 45 giây để gắn mồi và 720C trong
30 giây để kéo dài chuỗi. Mẫu sau đó được ủ tiếp ở 72
o
C trong 5 phút và giữ ở 4
o
Ccho đến khi phân tích.
2.3.3.7. Nhân dòng và giải trình t ự
a. Tinh sạch DNA/dsRNA từ gel agarose bằng bộ kit Fermentas.
Bộ kít GenJETTM Gel Extraction được thiết kế để tinh sạch các phân đoạn
DNA từ gel agarose chạy trong đệm TAE hoặc TBE với hiệu suất cao trong thời
gian ngắn. Bộ kít sử dụng để tinh sạch các phân đoạn DNA/dsRNA sợi đôi có kíchthước từ 25 bp đến 20 kb, hiệu suất có thể lên đến 95% đối với các phân đoạn từ
100 bp đến 10 kb. Quy trình được thực hiện ở nhiệt độ phòng bao gồm những bước
như sau:
- Băng DNA/dsRNA quan tâm được cắt chính xác bằng lưỡi dao sạch từ gel
agarose và đưa vào ống eppendorf 1,5 ml.
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 47/112
37
- Bổ sung đệm bám (binding buffer) với 1 thể tích bằng khối lượng miếng
gel (1µl : 1 mg) và ủ trong bể ổn nhiệt 60°C trong khoảng 10 phút đến khi
gel tan hoàn toàn.
- Dung dịch gel agarose đã hòa tan được chuyển lên cột tinh sạch và ly tâm
10000 vòng/phút trong 1 phút. Sau đó phần dịch đi qua màng được gạn bỏ.
- Bổ sung 500 µl đệm rửa (wash buffer) vào cột và ly tâm 1 phút với vận tốc
10000 vòng/phút. Phần dịch đi qua màng được gạn bỏ. Lặp lại bước này
một lần nữa.
- Cột tinh sạch có chứa DNA/dsRNA được chuyển sang ống eppendorf 1,5
mới và bổ sung 100 µl elution buffer vào chính giữa lớp màng silica củacột.
- Sau đó DNA/dsRNA được thu bằng cách ly tâm 1 phút với tốc độ 10000
vòng/phút.
Lượng DNA/dsRNA tinh sạch được giữ ở -20°C để phục vụ cho thí nghiệm
tiếp theo.
b. Nhân dòng sản phẩm PCR bằng bộ kit pGEMT-Easy cloning.
- Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pGEMT- Easy.
Các đoạn gen đặc hiệu của các đối tượng nghiên cứu được nhân bản bằng
phản ứng PCR nhờ enzyme Taq polymerase, do đó sản phẩm PCR được tạo ra là
các đoạn DNA có sẵn đầu A. Các đoạn DNA này dễ dàng ghép nối vào vector
pGEMT-Easy có đầu T nhờ tác dụng của enzyme T4 ligase. Phản ứng gắn sản phẩm
PCR vào vector pGEMT-Easy đầu T được thực hiện theo quy trình kèm theo của bộ
kit, với các thành phần như trong Bảng 2.8
Hỗn hợp phản ứng gắn sau đó được ủ trong bể ổn nhiệt 16°C qua đêm.
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 48/112
38
Bảng 2.8. Thành phần phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector.
TT Thành phần Thể tích (µl)
1 Đệm phản ứng 2X 10 µl
2 Sản phẩm PCR 3 µl
3 Vector đầu T pGEMT-T 1 µl
4 T4 DNA ligase (5 u/µl) 1 µl
5 H2O cất khử ion vô trùng 5 µl
Tổng thể tích 20 µL
- Biến nạp DNA vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α. Tế bào khả biến E.coli DH5α (bảo quản trong tủ lạnh sâu -80°C) được làm tan
trên đá trong 10 phút. Tiếp đó, bổ sung 10µl hỗn hợp phản ứng gắn sản phẩm PCR
vào vector pGEMT-easy vào dung dịch tế bào đã rã đông và ủ trên đá 20 phút để
tạo điều kiện cho vector bám vào thành tế bào. Tế bào được sốc nhiệt bằng cách
chuyển sang bể ổn nhiệt 42°C trong 45 giây, sau đó được chuyển lại ủ trên đá trong
2 phút. Tiếp theo, bổ sung 450µl LB lỏng vào hỗn hợp biến nạp và ủ ở nhiệt độ
37°C trong vòng 20 phút trước khi được nuôi lắc với tốc độ 220 vòng/phút trong
thời gian 30 phút. Hỗn hợp tế bào biến nạp được cấy trải trên đĩa môi trường LB
đặc có bổ sung ampicillin 100 µg/ml, phủ trên bề mặt cơ chất X-gal (20 l, nồng độ
20 mg/ml) và IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, 20 l, nồng độ
100mM), ủ ở 37°C qua đêm.
c. Tinh sạch plasmid từ vi khuẩn E. coli bằng bộ kit GenJETTM Plasmid Miniprep.
DNA tái tổ hợp được tinh sạch từ tế bào vi khuẩn E. coli bằng bộ kitGenJETTM Plasmid Miniprep (Fermentas). Quy trình được thực hiện như sau:
- Một khuẩn lạc dương tính được nuôi lắc trong 5ml môi trường LB lỏng có
bổ sung kháng sinh ampicillin 100 µg/ml với tốc độ 220 vòng/phút ở 37°C
qua đêm.
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 49/112
39
- Tế bào được thu bằng cách ly tâm ở vận tốc 6000 vòng/phút trong 10 phút,
ở 4oC. Tế bào được hòa trở lại trong 250 µl đệm P1 (Resuspension
solution) đã bổ sung enzyme RNase A.
- Bổ sung 250 µl đệm P2 (lysis solution) vào dịch tế bào và đảo nhẹ 3-5 lần,
ủ ở nhiệt độ phòng 5 phút để phá vỡ tế bào giải phóng plasmid.
- Hỗn hợp được trung hòa bởi 350 µl đệm P3 (neutralization solution), đảo
đều 4-6 lần. Mảnh vỡ tế bào và protein biến tính được loại bỏ bằng cách ly
tâm hỗn hợp với vận tốc 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C.
- Dịch nổi sau khi ly tâm được đưa lên cột tinh sạch plasmid và ly tâm 10000
vòng/phút trong 1 phút. Plasmid được giữ lại trên lớp màng silica còn dịchqua cột được gạn bỏ.
- Bổ sung 500 µl đệm rửa (Wash buffer), ly tâm 30- 60 giây, sau đó gạn bỏ
dịch qua cột. Bước này được lặp lại một lần nữa.
- Cột tinh sạch chứa plasmid được chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới.
Bổ sung 50 µl đệm đẩy (Elution buffer) vào chính giữa màng silica của cột
và ủ ở nhiệt độ phòng 2 phút.
- Plasmid được thu bằng cách ly tâm với vận tốc 10000 vòng/phút trong 1
phút.
Mẫu plasmid tinh sạch được bảo quản ở -20°C.
2.3.4. Thẩm định quy trình đã xây dự ng
Lựa chọn mẫu A làm đối tượng nghiên cứu để tiến hành thẩm định phương
pháp.
2.3.4.1. Thẩm định phương pháp định lượ ng B. longum
a. Kiểm tra tính chọn lọc của môi trường định lượng BSM agar
Tăng sinh các chủng chuẩn được ghi trong Bảng 2.9 trong môi trường MRS
lỏng, có thêm lớp dầu khoáng ở bề mặt, ủ ở 35-37oC trong 48 giờ trong điều kiện kỵ
khí. Sau đó mang hỗn dịch li tâm với tốc độ 3000-4000 vòng/phút, loại bỏ dịch nổi,
thu lấy sinh khối. Thêm từ từ vào ống nghiệm một lượng dung dịch nước muối sinh
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 50/112
40
lý 0,9 % vô khuẩn, trộn đều cho đến khi thu được hỗn dịch có độ đục tương đương
với độ đục Mc Farland số 2 (khoảng 6,0 x108 CFU/ml).
Chuẩn bị một dãy ống nghiệm thủy tinh vô trùng, mỗi ống chứa 9 ml nước
muối sinh lý 0,9 % vô khuẩn. Lấy 1ml hỗn dịch chủng ở trên thêm vào một ống
nghiệm trên, lắc đều thu được hỗn địch có độ pha loãng 10-1. Tiếp tục pha loãng đến
độ pha loãng 10-7.
- Lấy các ống nghiệm có độ pha loãng 10-5, 10-6, 10-7, với mỗi độ pha loãng
tiến hành cấy vi khuẩn trên 4 đĩa. Cấy vào mỗi đĩa petri vô trùng 1ml hỗn dịch
chủng ở độ pha loãng 10-5, 10-6, 10-7, thêm vào 2 đĩa ở cùng một độ pha loãng 15-
20ml môi trường BSM agar vô trùng đã làm nguội đến 45 -500
C. Thêm vào 2 đĩa ởcùng một độ pha loãng còn lại 15-20ml môi trường MRS agar. Ủ ở 35-37oC trong
điều kiện kỵ khí. Sau 48 giờ đem ra đếm số lượng khuẩn lạc trên đĩa (chỉ đếm đĩa
có 25-250 khuẩn lạc) và so sánh số lượng khuẩn lạc thu được trên 2 môi trường.
Bảng 2.9. Các chủng chuẩn được dùng để kiểm tra tính chọn lọc của môi trường
BSM agar
STT Tên chủng Kí hiệu
1 Lactobacillus rhamnosus ATCC9595
2 Lactobacillus acidophilus ATCC 4356
3 Lactobacillus plantarum ATCC 8014
4 Lactobacillus casei ATCC 334
5 Lactobacillus fermentum ATCC 9338
6 Streptococcus faecalis ATCC 33186
7 Bifidobacterium longum JCM 1217
8 Streptococcus thermophilus ATCC 19258
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 51/112
41
b. Đánh giá độ lặp lại của phương pháp [7], [17], [18].
Tiến hành phép thử định lượng như đã mô tả ở mục 2.3.1. Tiến hành định
lượng lặp lại 10 lần. Đánh giá kết quả
Tất cả các kết quả định lượng được chuyển sang dạng log 10 (để thu được mẫu
có phân bố tương đối chuẩn) trước khi phân tích thống kê.
Yêu cầu: Sr ≤ 0,25
Tính độ lệch chuẩn Sr theo công thức:
Trong đó:
- xi: Kết quả của mỗi lần lặp lại
- x : Kết quả trung bình của các lần lặp lại
- n: Số lần lặp lại (n=10)
2.3.4.2. Thẩm định qui trình định danh bằ ng kit API 20A
Tiến hành tăng sinh chủng chuẩn B. longum trong môi trường MRS lỏng, ủ ở
điều kiện kị khí ở 36-38oC trong 48 giờ. Sau thời gian nuôi cấy, cấy một quai cấy từ
hỗn dịch này lên môi trường thạch máu, ủ ở 36-38oC trong điều kiện kị khí trong 24
giờ.
Sau đó tiến hành định tính chủng vi sinh vật chuẩn B. longum bằng kit API 20A
theo phương pháp ghi trong mục 2.3.2. Ghi lại kết quả phản ứng. Nhập kết quả vào phần mềm Apiweb
TM
- Yêu cầu:
+ Kết quả định tính chủng chuẩn là thuộc chi Bifidobacterium với %ID > 80%
2.3.4.3. Thẩm định qui trình định danh bằ ng k ỹ thuật PCR và giải trình t ự
a. Đánh giá độ đặc hiệu
1
2
1
n
x x
S
n
i
i
ri
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 52/112
42
Nguyên tắc: Trong cùng một phản ứng PCR tiến hành nhân bản đoạn gen đặc
hiệu của đối tượng nghiên cứu với sự có mặt DNA của nhiều loài khác.
Bảng 2.10. Công thức tính độ đặc hiệu
Phép thử Chủng chuẩn
Cộng Dương tính Âm tính
Kỹ thuật PCR Dương tính a b a+b
Âm tính c d c+d
Cộng a+c b+d a+b+c+d
* Độ đặc hiệu = số trường hợp âm tính thật/(số trường hợp âm tính thật +số trườnghợp dương tính giả)=d/(b+d)
Quy trình được tiến hành như sau:
- Tách DNA từ chủng chuẩn B. longum JCM 1217 và các chủng kiểm tra độ
đặc hiệu như quy trình ghi ở mục 2.3.3.2.
- Kiểm tra kết quả tách DNA như trong mục 2.3.3.5.
- Tiến hành thử nghiệm kiểm tra độ đặc hiệu bằng phản ứng PCR với thành
phần các ống thử nghiệm được ghi ở Bảng 2.7 ngoại trừ khuôn lần lượt là
DNA của 20 chủng vi sinh vật chuẩn được ghi ở Bảng 2.3. Các điều kiện
của phản ứng được ghi trong mục 2.3.3.5.
- Điện di DNA trên gel agarose
Tiến hành: Như mô tả trong mục 2.3.3.5
b. Đánh giá độ nhạy của phương pháp
Nguyên tắc: Tiến hành đánh giá ngưỡng phát hiện của toàn bộ quy trình phân
tích bao gồm cả phần xử lý mẫu (tách DNA) và phân tích mẫu (phản ứng PCR)
bằng cách pha một loạt hỗn dịch chủng có nồng độ giảm dần. Tiến hành quy trình
phân tích và xác định nồng độ hỗn dịch nhỏ nhất còn lên kết quả phản ứng PCR.
Quy trình được tiến hành như sau:
- Tăng sinh chủng chuẩn B. longum JCM 1217 trong môi trường MRS lỏng
sau 48 giờ trong điều kiện kỵ khí, đem ly tâm 3000 - 4000 vòng/phút trong
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 53/112
43
15 phút. Bỏ dịch nổi thu lấy cắn. Thêm vào ống nghiệm 2ml dung dịch
nước muối sinh lý 0,9 % vô khuẩn trộn đều.
- Chuẩn bị một dãy ống nghiệm thủy tinh vô trùng, mỗi ống chứa 9 ml nước
muối sinh lý 0,9 % vô khuẩn. Lấy 1ml hỗn dịch chủng ở trên thêm vào một
ống nghiệm ở trên, lắc đều thu được hỗn địch có độ pha loãng 10 -1. Tiếp tục
pha loãng như vậy đến độ pha loãng 10-8.
- Lấy các ống nghiệm có độ pha loãng 10-6, 10-7, 10-8, với mỗi độ pha loãng
đếm số lượng vi khuẩn trên 2 đĩa. Cấy vào mỗi đĩa petri vô trùng 1ml hỗn
dịch chủng ở độ pha loãng 10-6, 10-7, 10-8, thêm vào từng đĩa 15-20ml môi
trường BSM agar vô trùng đã làm nguội đến 45-500
C. Ủ ở 36-38o
C trongđiều kiện kỵ khí. Sau 48 giờ đem ra đếm số lượng khuẩn lạc trên đĩa (chỉ
đếm đĩa có 25-250 khuẩn lạc).
- Các ống hỗn dịch chủng trên được bảo quản ở 2-80C.
- Xác định số lượng vi khuẩn trong các ống pha loãng
X= ((N1 + N2)/2) x k
Tr ong đó: N1, N2: số khuẩn lạc trên từng đĩa.
k: hệ số pha loãng tương ứng.
- Sau khi xác định được nồng độ của các chủng trong các ống hỗn dịch, tiến
hành tách DNA theo quy trình ghi ở trong mục 2.3.3.2, thực hiện phản ứng
PCR với thành phần và chu trình nhiệt như trong mục 2.3.3.6 . Điện di sản
phẩm trên gel agarose, xác định ống pha loãng cuối cùng còn lên phản ứng
PCR chính là độ nhạy của phương pháp.
+ Đánh giá chất lượng của sản phẩm PCR
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 54/112
44
Bảng 2.11. Tiêu chuẩn đánh giá chất lượ ng của sản phẩ m PCR
Tính chất băng điện di trên bản gel chạy điện di Đánh giá kết quả
Không có băng (-)
Băng DNA mờ hoặc chấm hạt thẳng hàng (+)
Băng DNA nhỏ hoặc vừa, quan sát rõ (++)
Băng DNA lớ n, đậm, quan sát r ất rõ (+++)
2.3.5. Ứ ng dụng quy trình chuẩn để định lƣợng và định tính B. longum
trong các chế phẩm probiotics đang lƣu hành trên thị trƣờ ng
Tiến hành định lượng, định tính B. longum trong các chế phẩm probiotics
được liệt kê trong phần đối tượng nghiên cứu theo quy trình đã xây dựng (Phụ lục
12). Khi tiến hành phản ứng PCR thí nghiệm được bố trí như sau:
- Một ống phản ứng PCR với DNA khuôn tách từ mẫu.
- Một ống phản ứng PCR với DNA khuôn của loài vi khuẩn chuẩn tương ứng
(chứng dương tính)
- Một ống phản ứng PCR với nước cất siêu tinh khiết thay thế cho phần dung
dịch ADN khuôn (chứng âm tính)
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 55/112
45
CHƯƠNG 3. KẾT QU Ả NGHIÊN CỨU
3.1. XÁC ĐỊNH SỐ LƢỢ NG VI SINH VẬT TRONG CHẾ PHẨMPROBIOTICS
Định lượng vi sinh vật trong các mẫu A, B, C, D, E bằng phương pháp ghi ở
mục 2.3.1. Kết quả được ghi trong Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Số lượng vi sinh vật trong chế phẩm
Stt MẪU Kết quả
(CFU/gói)
1 A
1, 17 108CFU/gói
(117,0% so với lượng ghi trên nhãn)
2 B
0,86 108 CFU/gói
(86,0% so với lượng ghi trên nhãn)
3 C 7,32 X 106 CFU/gói
4 D 2,83 x 108CFU/gói
5 E 3,22 x 108CFU/gói
Từ kết quả ở bảng trên cho thấy, mẫu A hàm lượng B. longum so với lượng
ghi trên nhãn là 117,0% do đó đạt chỉ tiêu về định lượng, mẫu B số lượng B.
longum chỉ được 86,0% so với lượng ghi trên nhãn. Các mẫu C, D, E do không có
yêu cầu về số lượng B. longum mà nhà sản xuất chỉ công bố tổng số lượng các vi
sinh vật trong hỗn hợp là 108CFU, do đó không kết luận. Trong trường hợp này việc
sử dụng môi trường BSM agar nhằm mục đích phân lập khuẩn lạc thuần khiết để
định danh B. longum.
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 56/112
46
3.2. ĐỊNH DANH VI SINH VẬT BẰNG KIT API 20A
Tiến hành định danh vi sinh vật bằng kit API 20A trong các đã nêu trong phần
đối tượng nghiên cứu bằng phương pháp ghi ở mục 2.3.2.
K ết quả định danh bằng kit API 20A đượ c ghi lại trong Hình 3.1, Hình 3.2,
Hình 3.3, Hình 3.4, Hình 3.5, Hình 3.6, Phụ lục 1, Phụ lục 2, Phụ lục 3, Phụ lục
4, Phụ lục 5, Bảng 3.2 và Bảng 3.3
Hình 3.1. Định danh vi sinh vật trong mẫu A bằng kit API 20 A
Hình 3.2. Định danh vi sinh vật trong mẫu B bằng kit API 20A
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 57/112
47
Hình 3.3. Định danh vi sinh vật trong mẫu C bằng kit API 20 A
Hình 3.4. Định danh vi sinh vật trong mẫu D bằng kit API 20A
Hình 3.5. Định danh vi sinh vật trong mẫu E bằng kit API 20A
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 58/112
48
Hình 3.6. Quan sát giếng ESC dưới đèn UV ở bước sóng 365nm.
Bảng 3.2. Theo dõi phản ứng định danh vi sinh vật bằng kit API 20A
Mẫu A Mẫu B Mẫu C Mẫu D Mẫu E
TT Giếng Chất nền
1 IND L-tryptophane - - - - -
2 URE Urea - - - - -
3 GLU D-glucose + + + + +
4 MAN D-mannitol + + + + +
5 LAC D-lactose + + + + +
6 SAC D-saccharose + + + + +
7 MAL D-maltose + + + + +
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 59/112
49
8 SAL Salicin + + + + +
9 XYL D-xylose - - - - -
10 ARA L-arabinose + + + + +
11 GEL Gelatin - - - - -
12 ESC Esculin ferric
citrate
+ + + + +
13 GLY Glycerol - - - - -
14 CEL D-cellobiose + + + + +
15 MNE D-mannose + + + + +
16 MLZ D-melezitose - - - - -
17 RAF D-raffinose - + + - +
18 SOR D-sorbitol - - - - -
19 RHA L-rhamnose - - - - -
20 TRE D-trehalose - - - - -
CAT (catalase) - - - - -
Bào tử - - - - -
Gram + + + + +
Hình cầu - - - - -
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 60/112
50
Bảng 3.3. K ế t quả định danh vi sinh vật bằ ng phần mề m Apiweb
Stt Tên mẫu K ết quả định danh Độ tin cậy Phản ứ ng nghi ngờ
1 A Bifidobacterium spp1 94,3% RAF 91%
Actinomyces israelii 4,5% XYL 99%, RAF
82%, TRE 90%
2 B
Bifidobacterium spp1 97,1%
Actinomyces israelii2,2%
XYL 99%, RAF
82%,
3 C Bifidobacterium spp1 97,1%
Actinomyces israelii 2,2% XYL 99%, RAF
82%,
4 D
Bifidobacterium spp1 94,3% RAF 91%
Actinomyces israelii4,5% XYL 99%, RAF
82%, TRE 90%
5 E Bifidobacterium spp1 97,1%
Actinomyces israelii2,2% XYL 99%, RAF
82%,
Từ kết quả trên cho thấy các vi sinh vật phân lập từ các mẫu A, B, C, D, E đều
thuộc chi Bifidobacterium với % ID cao (>90%).
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 61/112
51
3.3. K ẾT QUẢ ĐỊNH DANH VI SINH VẬT TRONG CÁC MẪU BẰNG
K Ỹ THUẬT PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ
3.3.1. K ết quả tách DNA3.3.1.1 Tách DNA bằ ng Wizard R Genomic DNA Purification kit của hãng
Promega
Tiến hành tăng sinh chủng B. longum chuẩn và các vi sinh vật trong các mẫu
probiotics trong phần đối tượng nghiên cứu phân lập được ở mục 3.1, tiến hành tách
DNA theo hướng dẫn tại mục 2.3.3.2. Tiến hành đo quang các dung dịch DNA mới
tách theo mô tả trong mục 2.3.3.3 và pha loãng các dung dịch DNA bằng nước cất
siêu tinh khiết vô khuẩn để thu được dung dịch DNA có nồng độ 50 ng/µl.
Bảng 3.4. Kết quả đo quang các dung dịch DNA mới tách
Đối tƣợng Atn Nồng độ dung dịch
DNA (ng/µl)
B. longum 0,1125 562,5
Mẫu A 0,0911 455,5
Mẫu B 0,0956 478Mẫu C 0,1174 587
Mẫu D 0,0851 425,5
Mẫu E 0,1052 526
3.3.1.2. Kiể m tra khả năng tách DNA
Sau khi tách DNA, các dung dịch DNA được pha loãng tới nồng độ thích hợp.
Kiểm tra sản phẩm DNA đã tách bằng bằng phản ứng PCR nhân bản đoạn gen 16S
rDNA của vi khuẩn, với thành phần và chu trình như trong mục 2.3.3.5. Sản phẩm
PCR được điện di kiểm tra trên bản gel agarose 1%. Kết quả được trình bày ở Hình
3.7
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 62/112
52
Từ Hình 3.7 cho thấy, phản ứng PCR nhân bản đoạn gen 16S rDNA đặc hiệuđều cho các băng nhân bản kích thước 1500 bp, trong khi ở mẫu chứng âm (không
có DNA) không xuất hiện băng nhân bản nào. Kết quả này cho thấy đã thu được các
khuôn DNA của các đối tượng nghiên cứu. DNA sau khi tách chiết được bảo quản ở
-200C để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.3.2. Nhân bản các đoạn gen đặc hiệu của các đối tƣợ ng vi sinh vật thuộc
đối tƣợ ng nghiên cứ uSử dụng cặp mồi BlonF /BlonR để nhân bản các đoạn gen của các đối tượng
nghiên cứu đã tách được ở trên (mục 3.3.1.1).
Thành phần của phản ứng PCR được ghi lại tại Bảng 3.5
M 1 2 3 4 5 6 7
1500bp
Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen 16S rDNA bằng
cặp mồi ID16R08F & IDL16R09R
M: Marker 100 bp (Invitrogen)
Giếng 1: Khuôn là DNA tách chiết từ hỗn dịch B. longum JCM 1217
Giếng 2: Chứng âm ( Khuôn là nước cất)
Giếng 3-7: Khuôn là DNA tách chiết từ hỗn dịch tăng sinh từ khuẩn lạc phân
lập từ các mẫu A, B, C, D và E.
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 63/112
53
Bảng 3.5. Thành phần của phản ứng PCR
STT Thành phần Thể tích ( l)
1 Đệm PCR(10X) 2,52 dNTPs (2mM) 2,5
3 Dung dịch MgCl2 (50mM) 0,75
4 Mồi xuôi (10 pmol) 1
5 Mồi ngược (10 pmol) 1
6
Taq DNA polymerase
(5u/ l)
0,1
7 DNA khuôn (50ng/µl) 3
8 Nước cất 14,15
Tổng thể tích phản ứng 25
Vớ i thành phần như trên tiến hành phản ứng PCR vớ i chu trình nhiệt:
94oC – 45 giây
94oC – 5 phút 56oC – 45 giây x 30 chu kỳ 72oC - 5 phút 4oC – ∞
72oC – 30 giây
K ết quả phản ứng PCR được điện di trên gel agarose 1% và đượ c ghi lại k ết
quả bằng máy chụ p ảnh bản gel UVDI-312 (Hình 3.8)
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 64/112
54
Kết quả thu được ở Hình 3.8 cho thấy với chu trình nhiệt và thành phần phản
ứng như trên, với phản ứng PCR sử dụng cặp mồi BlonF/BlonR , chúng tôi đã thu
được băng nhân bản có kích thước khoảng hơn 800 bp ở giếng với khuôn là DNA
tách chiết từ chủng chuẩn B. longum JCM1217 (giếng 1). Kích thước băng này hoàn
toàn phù hợp với kích thước tính toán lý thuyết của B. longum là 831 bp. Trong khi
đó, chúng tôi không thu được băng nhân bản nào ở mẫu không chứa DNA (chứng
âm-giếng 2).
Như vậy, kết quả thí nghiệm thu được cho phép khẳng định với cặp mồi
BlonF/BlonR chúng tôi đã nhân bản thành công đoạn gen đặc hiệu tương ứng của B.
longum.
Với các giếng từ 3-7 có khuôn là DNA tách từ các vi sinh vật phân lập được
từ các mẫu đã nêu trong phần đối tượng nghiên cứu, cũng đều cho băng nhân bản có
kích thước khoảng 831 bp, tương ứng với với băng nhân bản với khuôn là DNA của
B. longum JCM 1217 . Điều này bước đầu đã khẳng định các vi sinh vật phân lập từ
các mẫu này là B. longum.
Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen đặc hiệu của
B. longum bằng cặp mồi BlonF/BlonR
M: Marker 100 bp ( Invitrogen)Giếng 1: Khuôn là DNA tách chiết từ hỗn dịch B. longum JCM 1217 Giếng 2: Chứng âm ( Khuôn là nước cất không chứa DNA) Giếng 3-7: Khuôn là DNA tách chiết từ hỗn dịch tăng sinh từ khuẩn lạc phânlập được từ các mẫu A, B, C, D và E.
800 bp
M 1 2 3 4 5 6 7
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 65/112
55
3.3.3. Nhân dòng và giải trình tự
3.3.3.1.Tinh sạch sản phẩ m PCR nhân bản các đoạn gen đặc hiệu của các vi
sinh vật phân l ậ p t ừ các mẫ u nghiên cứ u bằ ng bộ kit FermentasSử dụng 5 mẫu DNA là sản phẩm nhân bản đoạn gen đặc hiệu của các đối
tượng nghiên cứu bằng kỹ thuật PCR để làm nguyên liệu cho thí nghiệm nhân dòng
gen.
Sản phẩm PCR nhân bản các đoạn gen đặc hiệu được điện di trên gel agarose
1%, kết quả chúng tôi đã thu được băng DNA có kích thước 831 bp. Các băng DNA
này được cắt chính xác khỏi bản gel agarose và tinh sạch bằng bộ kit GenJETTM Gel
Extraction (Fermentas) theo quy trình của nhà sản xuất nhằm loại bỏ toàn bộ cácthành phần dư thừa của phản ứng PCR. Sản phẩm DNA tinh sạch tiếp tục được điện
di kiểm tra trên gel agarose 1%, kết quả chúng tôi thu được trên Hình 3.9 cho thấy
chúng tôi đã thu được sản phẩm DNA hoàn toàn tinh sạch, có kích thước 831 bp.
Hình 3.9. Kết quả điện di mẫu tinh sạch sản phẩm PCR nhân bản các đoạn gen đặchiệu phân lập từ các mẫu nghiên cứu trên gel agarose 1%.
M: Marker 100 bp ( Promega )
Giếng 1-5: Sản phẩm PCR tinh sạch của các mẫu nghiên cứu
Các sản phẩm PCR tinh sạch nhân bản 5 đoạn gen đặc hiệu được bảo quản ở -
20oC để sử dụng cho thí nghiệm nhân dòng tiếp theo.
831 b
M 1 2 3 4 5 M
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 66/112
56
3.3.3.2. Nhân dòng các đoạn gen đặc hiệu vào vector nhân dòng và biế n nạ p vào
t ế bào E. coli chủng DH5α
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã dòng hóa 5 đoạn gen đặc hiệu trên vào
vector nhân dòng pGEMT-easy. Vector nhân dòng này được thiết kế có chứa điểm
khởi đầu sao chép nên có khả năng sao chép độc lập với hệ gen của tế bào chủ E.
coli, đồng thời chứa gen chỉ thị kháng kháng sinh Ampicillin, cho phép chọn lọc các
thể biến nạp mang vector này trên môi trường nuôi cấy có Ampicillin. Ngoài ra,
vector nhân dòng còn chứa gen chọn lọc giúp phân biệt các thể biến nạp mang
plasmid tái tổ hợp và plasmid tự đóng vòng.
Hình 3.10. Sơ đồ vector nhân dòng pGEMT - Easy
Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector nhân dòng được thực hiện theo quy
trình kèm theo của nhà sản xuất. Hỗn hợp phản ứng gắn đầu bằng sau đó được
chúng tôi biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5α bằng phương pháp sốc
nhiệt. Kết quả biến nạp sản phẩm PCR vào tế bào E. coli trên Hình 3.11 cho thấy
chúng tôi đã thu được nhiều khuẩn lạc trắng (có khả năng mang vector tái tổ hợp)
trên môi trường chọn lọc có bổ sung ampiciline 100 µg/m l, phủ trên bề mặt cơ chấtX-gal (20 l, nồng độ 20 mg/ml) và IPTG (20 l, nồng độ 100mM )
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 67/112
57
Hình 3.11. Kết quả biến nạp sản phẩm gắn vào vi khuẩn E. coli DH 5α và
cấy trải trên môi trường nuôi cấy có bổ sung ampicillin 100 µg/ml , phủ trên bề mặtcơ chất X -gal (20 l, nồng độ 20 mg/ml) và IPTG (20 l, nồng độ 100mM )
3.3.3.3. Kiể m tra sự có mặt của các đoạn gen đặc hiệu trong plasmid tái t ổ hợ p
Để tiếp tục khẳng định sự có mặt của các đoạn gen đặc hiệu trong vector nhân
dòng, đối với mỗi mẫu, chúng tôi chọn 1 khuẩn lạc dương tính (có màu trắng) để
tinh sạch plasmid và kiểm tra plasmid này bằng PCR và phản ứng cắt enzyme giới
hạn.
a/ Kiểm tra sự có mặt các phân đoạn
Khuẩn lạc dương tính được nuôi cấy và tách chiết plasmid theo quy trình tách
chiết plasmid như mô tả ở mục 2.3.3.7 c. Sản phẩm DNA tinh sạch được chúng tôi
sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với hai cặp mồi khác nhau: cặp mồi đặc hiệu
Blon F/Blon R và cặp mồi đặc hiệu của vector. Trong đó, cặp mồi vector là hai trình
tự nằm trên vector nhân dòng, có khoảng cách khoảng 186 bp.
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 68/112
58
Hình 3.12. Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra plasmid tái tổ hợp mang các
đoạn gen có kích thước 831 bp
M: Marker 100 bp (Invitrogen)
Giếng 1-7 : sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu BlonF/BlonR.
Giếng 8-14: sản phẩm PCR với cặp mồi vector
Giếng 1: sản phẩm PCR với khuôn là DNA của B. longum JCM 1217
Giếng 2,9: đối chứng âm không sử dụng DNA khuôn.Giếng 3-7; 10-14: sản phẩm PCR với khuôn là DNA của các plasmid tái tổ hợp
mang các đoạn gen có kích thước 831bp.
Giếng 8: sản phẩm PCR với khuôn là vector nhân dòng nguyên bản tách từ khuẩn
lạc xanh
K ết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% ở Hình 3.12 cho thấy sản
phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu có kích thước khoảng 831 bp ( giếng 1, 3-7), tương
ứng với kích thước tính toán lí thuyết của đoạn gen đặc hiệu của các loài B. longum.
Sản phẩm PCR với cặp mồi vector và khuôn là plasmid tách từ khuẩn lạc xanh cho
một băng điện di với kích thước khoảng 186 bp, tương ứng với kích thước theo tính
toán lý thuyết (giếng 8). Sản phẩm PCR với cặp mồi vector khi điện di trên gel
agarose 1% cho một băng có kích thước khoảng 1017bp ( giếng 10-14), kích thước
này phù hợp với kích thước đoạn DNA theo tính toán lý thuyết cộng với 186 bp của
plasmid. Đối với các phản ứng đối chứng âm không sử dụng DNA khuôn, chúng tôi
1017bp831 bp
M 1 2 3 4 5 6 7 M 8 9 10 11 12 13 14
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 69/112
59
không thu được băng DNA nào (giếng 2, 9). Kết quả này cho phép chúng tôi khẳng
định plasmid tinh sạch được là plasmid tái tổ hợp mang các đoạn gen phân lập được
từ genome của loài B. longum
với enzyme cắt giới hạn
Để khẳng định chắc chắn đoạn DNA đã được chèn vào vector nhân dòng là
đoạn gen có kích thước 831bp, chúng tôi tiến hành thí nghiệm cắt giới hạn plasmid
tái tổ hợp đã được tinh sạch từ khuẩn lạc dương tính. Theo lý thuyết, trên vector
pGEMT Easy (Hình 3.10) có hai vị trí cắt giới hạn của EcoRI nằm trong vùng đa
điểm cắt. Như vậy, khi được xử lí bằng EcoRI vector tái tổ hợp sẽ bị cắt thành 2
đoạn DNA, một đoạn chính là các đoạn gen được chèn vào và một đoạn là bộ khung
vector có kích thước 3 kb.
Hình 3.13. Kết quả điện di sản phẩm cắt giới hạn vector tái tổ hợp mang các
phân đoạn 831 bp bằng enzyme EcoRI.
M1:Marker 1000 bp (Fermentas)
M2: Marker 100 bp (Promega)
Giếng 1, 3, 5, 7, 9, 11, 12: vector tái tổ hợp nguyên bản;
Giếng 2, 4, 6,8,10: sản phẩm cắt giới hạn.
M1 M2 1 2 M2 3 4 M2 5 6 M2 M2 7 8 M2 9 10 M2 11 12 M1
KL xanh
831 831 831831 831
3000
3000
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 70/112
60
K ết quả thu được trên Hình 3.13 cho thấy các sản phẩm cắt vector tái tố hợp
mang các đoạn gen đích của các đối tượng nghiên cứu xuất hiện 2 băng DNA
(giếng 2, 4, 6, 8, 10): trong đó băng DNA 3 kb là bộ khung nguyên bản của vector,
và các đoạn DNA kích thước 831bp là kích thước tương ứng của đoạn gen đặc hiệu
nhân bản từ hệ gen B. longum theo tính toán lí thuyết. Kết quả thu được ở trên cho
phép chúng tôi khẳng định chắc chắn hơn việc nhân dòng thành công các đoạn gen
phân lập được từ genome của các loài phân lập từ đối tượng nghiên cứu của đề tài.
Các vector nhân dòng mang các đoạn gen đặc hiệu của các đối tượng nghiên
cứu được tinh sạch và bảo quản ở -20oC. Các dòng tế bào E. coli mang các vector
tái hợp chứa các đoạn gen này được giữ trong glycerol 25% và bảo quản ở -80o
C.3.3.3.4. Giải trình t ự mẫ u chứa phân đoạn 831 bp
Để khẳng định DNA tách chiết được từ các mẫu trong phần đối tượng nghiên
cứu có đúng là của loài B. longum hay không, chúng tôi đã tiến hành nhân bản
đoạn gen 831 bp bằng quy trình đã thiết lập, nhân dòng đoạn gen này vào vector
nhân dòng. Sản phẩm vector nhân dòng mang đoạn gen đặc hiệu 831 bp được gửi đi
giải trình tự.
Kết quả giải trình tự của mẫu C như sau:
GAAGGAATCCAACGCGTTGGGAGCTCTCCCATATGGTCGACCTGCA
GGCGGCCGCGAATTCACTAGTGATTTTCCAGTTGATCGCATGGTCT
TCTGGGAAAGCTTTCGCGGTATGGGATGGGGTCGCGTCCTATCAGC
TTGACGGCGGGGTAACGGCCCACCGTGGCTTCGACGGGTAGCCGG
CCTGAGAGGGCGACCGGCCACATTGGGACTGAGATACGGCCCAGA
CTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGGAGGCCTTCGGGTTGT
AAACCTCTTTTATCGGGGAGCAAGCGAGAGTGAGTTTACCCGTTGA
ATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAG
GGTGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGTAGGC
GGTTCGTCGCGTCCGGTGTGAAAGTCCATCGCTTAACGGTGGATCC
GCGCCGGGTACGGGCGGGCTTGAGTGCGGTAGGGGAGACTGGAAT
TCCCGGTGTAACGGTGGAATGTGTAGATATCGGGAAGAACACCAA
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 71/112
61
TGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCCGTTACTGACGCTGAGGAGCGAA
AGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCG
TATACGGTGGATGCTGGATGTGGGGCCCGTTCCACGGGTTCCGTGT
CGGAGCTAACGCGTTAAGCATCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAA
GGCTAAAACTCAAAGAAATTGACGGGGGCCCGCACAGCGGGCGGA
GCATGCGGAATTATTCGATGCAACGCGAAGAACCCTTACCCTGGGG
CTTGACATGTTTCCCGGACGGTTGGTTAGAAGAATAACGGGC
Kết quả giải trình tự trên được chúng tôi tiến hành so sánh trình tự với các
trình tự khác trên ngân hàng gen thế giới bằng ứng dụng BLAST ( Basic Local
Alignmen CSearch Tool ) trên trang web của NCBI ( National Center forBiotechnology Information-http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) [37].
Kết quả blast khẳng định đoạn gen nhân bản được chính là đoạn gen được
phân lập từ hệ gen của Bifidobacterium longum.
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 72/112
62
Kết quả giải trình tự đều cho thấy cả 5 mẫu nghiên cứu đều chứa B. longum.
Kết quả giải trình tự của các mẫu A, B, D và E được trình bày ở Phụ lục 7, Phụ lục
8, Phụ lục 9 và Phụ lục 10.
3.4. ĐÁNH GIÁ PHƢƠNG PHÁP
3.4.1. K ết quả kiểm tra tính chọn lọc của môi trƣờng định lƣợ ng BSM agar
Tiến hành kiểm tra tính chọn lọc được mô tả tr ong mục 2.3.4.1a. Kết quả thử
nghiệm được trình bày ở Bảng 3.6.
Bảng 3.6. Kết quả kiểm tra tính chọn lọc của môi trường BSM agar
STT Tên chủng
Môi trƣờng BSM agar (số
lƣợng khuẩn lạc trên đĩa)
Môi trƣờng MRS agar
(số lƣợng khuẩn lạc trên
đĩa)
10-5 10-6 10-7 10-5 10-6 10-7
1 Lactobacillus
rhamnosus ATCC 9595
Không
mọc
Không
mọc
Không
mọc
Nhiều 45 +37 4 +3
2 Lactobacillus ATCC
4356
Không
mọc
Không
mọc
Không
mọc
Nhiều 40+ 50 2+4
3 Lactobacillus plantarum
ATCC 8014
Không
mọc
Không
mọc
Không
mọc
Nhiều 35+29 2+2
4 Lactobacillus casei
ATCC 334
Không
mọc
Không
mọc
Không
mọc
Nhiều 48 +39 3+5
5 Lactobacillus fermentum ATCC 9338
Khôngmọc
Khôngmọc
Khôngmọc
Nhiều 37+ 46 3+3
6 Streptococcus faecalis
ATCC 33186
Không
mọc
Không
mọc
Không
mọc
Nhiều 50 +57 5+4
7 Bifidobacterium longum
JCM 1217
Nhiều 45 +34 3 +4 Nhiều 48+ 38 4+4
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 73/112
63
Từ kết quả Bảng 3.6 cho thấy các chủng thuộc chi Lactobacillus và
Streptococcus faecalis không phát triển được trên môi trường BSM agar, trong khi
đó vẫn mọc tốt trên môi trường MRS agar. B. longum mọc tốt trên cả hai môi
trường MRS agar và BSM agar. Như vậy chứng tỏ môi trường BSM agar có tính
chọn lọc cao, thích hợp để định lượng và phân lập riêng B. longum trong hỗn hợp vi
sinh vật đã được nêu trong phần đối tượng nghiên cứu. Trên môi trường MRS agar
khuẩn lạc của B. longum có màu trắng, còn trên môi trường BSM agar khuẩn lạc
của B. longum có màu tím đỏ rất thuận tiện cho việc nhận biết và đếm khuẩn lạc
Hình 3.14. Hình thái khuẩn lạc B. longum trên môi trường BSM agar
3.4.2. Độ lặp lại của phép định lƣợ ng
Tiến hành phép thử định lượng như đã mô tả ở mục 2.3.1. Tiến hành định
lượng lặp lại 10 lần. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.7
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 74/112
64
Bảng 3. 7. Kết quả đếm số lượng vi khuẩn trong mẫu A
Áp dụng công thức tính đã trình bày ở mục 2.3.4.1 ta được Sr = 0,04.
Vậy Sr < 0,25. Như vậy phương pháp định lượng B. longum trong đề tài này có độ lặp lại
chấp nhận được đối với phương pháp đếm vi sinh vật.
3.4.3. Thẩm định độ đặc hiệu của quy trình định danh vi sinh vật bằng kit
API 20A
Tiến hành định tính chủng vi sinh vật chuẩn B. longum bằng API kit theo
phương pháp ghi trong mục 2.3.2. Kết quả định danh được trình bày ở Hình 3.15 vàPhụ lục 6 .
Lần Nồng độ 10-6
TB CFU/góiĐĩa 1 Đĩa 2 Đĩa 3 Lần 1 30 36 27 31 96x10
Lần 2 29 40 42 37 114x106
Lần 3 34 38 47 40 124x106
Lần 4 30 35 42 36 111x106
Lần 5 41 31 31 34 105x10
Lần 6 48 33 36 39 120x106
Lần 7 40 30 36 35 108x106
Lần 8 29 39 31 33 102x106
Lần 9 31 35 43 36 111x10
Lần 10 37 30 28 32 99x106
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 75/112
65
Hình 3.15. Định danh B. l ongum JCM 1217 bằng kit Api 20A
Kết quả định danh cho thấy vi sinh vật thuộc chi Bifidobacterium với % ID là97,1%
Như vậy phương pháp định tính vi sinh vật đến chi Bifidobacterium bằng kit
Api 20A có độ đặc hiệu cao.
3.4.4. Đánh giá độ đặc hiệu của quy trình định danh vi sinh vật bằng k ỹ
thuật PCR
Tiến hành quy trình đánh giá độ đặc hiệu như trong mục 2.3.4.3 a. Kết quảkiểm tra độ đặc hiệu của các cặp mồi trên 20 loài chủng vi sinh vật chuẩn được trình
bày ở Bảng 3.8 và Hình 3.16
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 76/112
66
Bảng 3.8. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của cặp mồi Blon F/Blon R trên 20 chủng
TT Tên chủng Kết quả
PCR
TT Tên chủng Kết
quảPCR
1 Bacillus cereus ATCC
11778
- 11 Lactobacillus fermentum
ATCC 9338
-
2 Bacillus pumilus ATCC
14884
- 12 Lactobacillus plantarum
ATCC 8014
-
3 Bacillus
stearothermophilis
ATCC 795
- 13 Bifidobacterium breve
ATCC 15700
-
4 Bacillus subtilis ATCC
6633
- 14 Bifidobacterium bifidum
ATCC11863
-
5 Lactobacillus rhamnosus
ATCC 9595
- 15 Streptococcus faecalis
ATCC 33186
-
6 Lactobacillus casei
ATCC 334
- 16 Streptococcus pyogenes
ATCC 19615
-
7 Lactobacillus
acidophilus ATCC 4356
- 17 Pseudomonas
aeruginosa ATCC 9027
-
8 Bacillus coagulans
ATCC 7050 - 18 Escherichia coli
ATCC8739 -
9 Bifidobacterium longum
JCM 1217
+ 19 Staphylococcus aureus
ATCC6538
-
10 Lactobacillus
leichmannii ATCC 7830
- 20 Salmonella typhimurium
ATCC 14028
-
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 77/112
67
Ghi chú: (-): Kết quả PCR âm tính: không xuất hiện băng nhân bản.
(+): Kết quả PCR dương tính: xuất hiện băng nhân bản
Kết quả trên cho thấy, với cặp mồi Blon F/ Blon R quy trình PCR nhân bản
đoạn gen đặc hiệu chỉ cho kết quả PCR dương tính với khuôn là DNA của loài
B. longum trong khi 19 loài vi sinh vật dùng để kiểm tra độ đặc hiệu còn lại đều có
kết quả PCR âm tính.
*Tính độ đặc hiệu:
Áp dụng vào công thức
Phép thử Chủng chuẩn
Cộng Dương tính Âm tính
Kỹ thuật PCR Dương tính a (1) b (0) a+b
Âm tính c (0) d (19) c+d
Cộng a+c b+d a+b+c+d
* Độ đặc hiệu = số trường hợp âm tính thật/(số trường hợp âm tính thật +số trường
hợp dương tính giả) = d/(d+b)
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 M 14 15 16 17 18 19 20
831bp
Hình 3.16. Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra độ đặc hiệu của cặp
mồi nhân bản đoạn gen đặc hiệu của B.longum
M: Marker 100 bp
Giếng 1,14: sản phẩm PCR với khuôn là DNA của B. longum JCM 1217
Giếng 2-13,15-20: sản phẩm PCR với khuôn là DNA của 19 loài vi khuẩn
khác được trình bày ở Bảng 3.8
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 78/112
68
Trong đó: d: số trường hợp âm tính thật = 19 (19 mẫu không phải là loài B.
longum đều có kết quả PCR âm tính).
b: số trường hợp dương tính giả = 0 ( các chủng vi sinh vật đều là chủngchuẩn, đã được chứng nhận có nguồn gốc rõ ràng. Không có chủng vi sinh
vật khác ngoài B. longum JCM 1217 có kết quả PCR dương tính)
Như vậy, độ đặc hiệu của cặp mồi BlonF/BlonR cũng như quy trình đã thiết
lập để nhân bản đoạn gen đặc hiệu cho loài B. longum là: 19/(19+0)= 1
(100%)
Kết luận: Với các thành phần phản ứng, quy trình đã thiết lập và cặp mồi đã
thiết kế, chúng tôi đã nhân bản thành công đoạn gen đặc hiệu cho đối tượng nghiên
cứu. Trong khuôn khổ của đề tài nghiên cứu, quy trình đạt độ đặc hiệu rất cao
(100%).
3.4.5. Xác định ngƣỡ ng phát hiện của quy trình nhân bản đoạn gen đặc hiệu
của B. longum bằng cặp mồi đặc hiệu.
Tiến hành quy trình xác định ngưỡng phát hiện như mô tả ở mục 2.3.4.3 b. Kết
quả đếm số lượng hỗn dịch B. longum chuẩn được ghi tại bảng như sau.
Bảng 3.9. Kết quả đếm số lượng vi khuẩn B. longum
Độ pha loãng 10-6 10-7 10-8
Đĩa 1(CFU/đĩa) Nhiều 115 9
Đĩa 2 (CFU/đĩa) Nhiều 127 7
Trung bình 121Dd D (CFU/ml) 1,21 x 10
Từ hỗn dịch D trên pha loãng thành một dãy các dung dịch có nồng độ
109CFU/ml, 108 CFU/ml, 107 CFU/ml, 106 CFU/ml, 105 CFU/ml và 104CFU/ml.
Tách chiết DNA từ các hỗn dịch này theo quy trình được trình bày ở mục
2.3.3.2. Tiến hành phản ứng PCR đơn mồi với khuôn là các DNA tách được từ hỗn
dịch ở trên. Sau đó điện di trên gel agarose 1%. Kết quả thu được như sau
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 79/112
69
Bảng 3.10. Kết quả xác định ngưỡng phát hiện
Nồng độ vi khuẩn Kết quả PCR trong các lần thử
Trong hỗn
dịch trước khi
tách chiết
(CFU/ml)
Trong dịch
chiết DNA
(copy/µl)(*)
1 2 3
109 107 ++ ++ ++
108
106
++ ++ ++107 105 ++ ++ ++
10 10 ++ ++ +
105 103 + + +
104 102 - - -
(*) Vì DNA sau khi tách chiết được hòa trở lại trong 100 µl DNA Rehydration
Solution, nên số lượng bản copy của phân tử DNA trong dung dịch sau khi táchchiết sẽ giảm 100 lần so với số lượng vi khuẩn bắt đầu trong hỗn dịch trước khi
tách chiết.
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 80/112
70
Kết quả cho thấy:
- Ngưỡng phát hiện của quy trình nhân bản đoạn gen đặc hiệu cho B. longum
là 105 CFU/ml vi khuẩn (tương ứng với khoảng 103copy/µl dùng làm khuôn
cho phản ứng PCR). Kết quả được thể hiện như Hình 3.17
M 1 2 3 4 5 6
831 bp
Hình 3.17. Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định ngưỡng phát hiện của
quy trình nhân bản đoạn gen đặc hiệu của B.longum
M: Marker 100 bp (Invitrogen)
Giếng 1-6: Sản phẩm PCR với khuôn là DNA tách chiết từ nồng độ chủng từ
109 CFU/ml vi khuẩn đến 104 CFU/ml vi khuẩn (tương ứng với khoảng 107
copy/ µl đến 102 copy/ µl dùng làm khuôn cho phản ứng PCR)
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 81/112
71
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN
Hiện nay, các chế phẩm probiotics lưu hành trên thị trườ ng hầu hết là các sản phẩm hỗn hợ p của nhiều loài vi khuẩn khác nhau. Tuy nhiên các tiêu chuẩn cơ sở
do các nhà sản xuất đưa ra còn rất nhiều thiếu sót. Việc định lượ ng chỉ dừng lại ở
việc đếm tổng số vi sinh vật trong mẫu. Trong đa số các trườ ng hợp, định danh
còn r ất sơ sài, chỉ dừng lại ở phản ứng nhuộm soi và một vài phản ứng sinh hóa.
Do đó, nếu thực hiện theo tiêu chuẩn, r ất khó để k ết luận mẫu đạt hay không và sẽ
ảnh hưởng đến quyền lợ i của bệnh nhân. Xuất phát từ thực tế, nhu cầu cấ p thiết
đặt ra là phải nghiên cứu định lượng, định danh đến loài đối vớ i các vi sinh vật đãđượ c ghi trên nhãn của chế phẩm. Cùng vớ i sự phát triển của khoa học k ỹ thuật,
việc định danh vi sinh vật không chỉ bao gồm kiểu hình mà còn phải định danh
kiểu gen.
Nghiên cứu trước đây của Nguyễn Thị Thu Hườ ng [4] đã ứng dụng k ỹ thuật
PCR để định danh một số vi sinh vật thuộc chi Lactobacillus trong hỗn hợ p nhiều
vi sinh vật bằng cách tách chiết DNA tr ực tiế p từ mẫu. Trong nghiên cứu này, tác
giả đã thành công trong việc định danh đến loài một số Lactobacillus trong hỗn
hợ p gồm nhiều vi sinh vật thuộc chi Lactobaccillus mà bằng các phản ứng sinh
hoá không thể thực hiện đượ c. Tuy nhiên, nhược điểm của k ỹ thuật này là không
phân biệt đượ c vi khuẩn sống hay vi khuẩn chết. Với quy trình đã xây dựng đượ c
trong đề tài này, chúng tôi đã định lượng riêng đượ c B. longum trong hỗn hợ p
đồng thờ i phân lập đượ c khuẩn lạc thuần khiết để tiến hành định danh kiểu hình
bằng kit sinh hóa và định danh kiểu gen bằng k ỹ thuật PCR và giải trình tự. Do đósẽ khẳng định đượ c chắc chắn số lượ ng B. longum có mặt trong hỗn hợ p ở nồng độ
là bao nhiêu. Điều này r ất có ý nghĩa trong việc kiểm tra giám sát chất lượ ng
thuốc.
Ứ ng dụng quy trình đã thiết lập, chúng tôi đã kiểm tra đượ c một số mẫu lưu
hành trên thị trườ ng, khẳng định đượ c chắc chắn các sản phẩm này đều có chứa B.
longum như trên nhãn do nhà sản xuất công bố. Vớ i những mẫu probiotics mà nhà
sản xuất chỉ công bố tổng số lượ ng vi sinh vật trong hỗn hợ p (L-Bio-3D, Lackid,
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 82/112
72
Lactominplus ), việc sử dụng môi trường BSM agar để định lượ ng riêng B.longum
vẫn có ý nghĩa trong việc phân lập đượ c khuẩn lạc thuần khiết để định danh B.
longum .
Sử dụng kit Api 20A chỉ cho phép định danh đến chi Bifidobacterium, nhưng
theo quy định gần đây về tiêu chuẩn chất lượ ng probiotics [16], [10], [32] việc định
danh kiểu hình vẫn r ất cần thiết. Đồng thờ i, nghiên cứu sử dụng kit Api 20A cũng
cho phép định danh đến loài đối vớ i Bifidobacterium breve, Bifidobacterium
bifidum, Bifidobacterium adolescentis, và Bifidobacterium dentium bằng cách làm
thêm các test bổ sung. Các vi khuẩn này cũng hay đượ c dùng trong các chế phẩm
probiotic. Hơn nữa do không yêu cầu k ỹ thuật cao, chi phí r ẻ nên việc sử dụng kitApi 20A để định danh một số probiotics thuộc chi Bifidobacterium r ất dễ áp dụng ở
các trung tâm kiểm nghiệm thuốc và thực phẩm chức năng, nhằm góp phần vào
công tác kiểm tra chất lượ ng các chế phẩm probiotic ở địa phương.
Để định danh đến loài B. longum, công cụ hiệu quả nhất vẫn là k ỹ thuật PCR
và giải trình tự. Ưu điểm lớn nhất của phương pháp này là có độ nhạy và độ chính
xác rất cao, vượt trội so với các phương pháp thông thường . Tuy nhiên, đây cũng
không phải là một phương pháp hoàn hảo vì vẫn có một số hạn chế: yêu cầu kỹ
thuật viên có trình độ cao, trang thiết bị hiện đại, đắt tiền, quy trình thực hiện phức
tạp không dễ áp dụng ở mọi phòng kiểm nghiệm. Mặc dù vậy, với những ưu điểm
vượt trội về độ nhạy, tính đặc hiệu cũng như khả năng xác định chính xác đến loài,
kỹ thuật PCR và giải trình tự ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong việc định
danh B. longum cũng như nhiều vi khẩn khác trong các chế phẩm probiotics, đặc
biệt là đối với những chế phẩm có chứa nhiều vi sinh vật thuộc chi Bifidobacterium.
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 83/112
73
KẾT LU ẬN VÀ KIẾN NGHỊ
K ẾT LUẬN:Từ những k ết quả thu đượ c trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã đạt đượ c
mục tiêu đề ra:
1. Đã xây dựng được quy trình định tính, định lượ ng B. longum trong hỗn hợ p
gồm nhiều vi sinh vật bằng việc sử dụng môi trườ ng BSM agar, kit API
20A, k ỹ thuật PCR và giải trình tự. Vớ i qui trình này, chúng tôi sẽ khẳng
định được chính xác đến loài B. longum vớ i số lượng là bao nhiêu. Điều này
r ất có ý nghĩa trong công tác kiểm tra giám sát chất lượ ng thuốc. Ứ ng dụng
đượ c quy trình nghiên cứu để định tính, định lượ ng B. longum trong một số
chế phẩm lưu hành trên thị trường như: Samubiothymo, Safikid BIO, L-
Bio-3D, Lackid và Lactomin plus.
2. Đã thẩm định được độ lặ p lại của phương pháp định lượng, độ đặc hiệu của
k ỹ thuật định danh bằng kit sinh hóa, độ nhạy, độ đặc hiệu của k ỹ thuật
định danh vi khuẩn bằng k ỹ thuật PCR đơn mồi và giải trình tự.
KIẾN NGHỊ:
Chúng tôi có một số kiến nghị sau:
1. Do gặp khó khăn trong việc mua đượ c hỗn dịch B. longum chuẩn có số
lượ ng biết trước, nên chúng tôi chưa thẩm định được độ đúng của phép định
lượng. Do đó tiếp theo đây chúng tôi sẽ tiế p tục tra cứu và đặt mua hỗn dịch
chuẩn này để thẩm định độ đúng.
2. Tiế p tục nghiên cứu quy trình định danh một số loài khác thuộc chi Bifidobacterium cũng hay đượ c sử dụng trong các chế phẩm probiotics như
Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium infantis...
bằng việc sử dụng kit API 20A cùng vớ i k ỹ thuật PCR và giải trình tự.
3. Tiế p tục nghiên cứu định tính, định lượ ng một số vi khuẩn probiotic đang
gặ p nhiều khó khăn trong công tác kiểm tra, giám sát chất lượng như
streptococcus faecalis, Enterococcus faecium...
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 84/112
74
TÀI LIỆU THAM KH ẢO
TIẾNG VIỆT 1. Công ty liên doanh Dược phẩm Mebiphar -Austrapharm (2007), Tiêu chuẩn
nhà sản xuất: Thuốc L-BIO-3D.
2. Công ty liên doanh Dược phẩm Mebiphar -Austrapharm (2007), Tiêu chuẩn
nhà sản xuất: Thuốc Lactomin plus.
3. Nguyễn Tr ọng Hiệ p, Bùi Tùng Hiệ p (2008), "Vi sinh vật trong chế phẩm
Probiotics", T ạ p chí Dượ c học, số 390, Bộ Y tế, Hà nội.
4. Nguyễn Thị Thu Hường (2012), Định tính một số loài thuộc chi Lactobacillus
trong chế phẩm probiotics lưu hành trên thị trường bằng kỹ thuật PCR, Hà
Nội
5. Tổng cụ đo lường Việt Nam (2008), TCVN 7849 :2008 Sữa và sản phẩm .
sữa. Định lượng Lactobacillus acidophilus giả định trên môi trường chọn
lọc, kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 37 0C.
6.
Phạm Văn Ty, Vũ Nguyên Thành (2006), Công nghệ sinh học, Nhà xuất bảnGiáo dục, tậ p 5, tr. 129-154.
7. Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 3 (2013), Định trị và tính
toán độ không đảm đo kết quả thử nghiệm vi sinh., Hồ Chí Minh.
8. Nguyễn Hùng Vân (2009), PCR và Realtime PCR. Các vấn đề cơ bản và các
áp dụng thường gặp. Nhà xuất bản Y học chi nhánh thành phố Hồ Chí Minh.
TIẾNG ANH 9. Akatsu H, Iwabuchi N, Xiao JZ, Matsuyama Z, Kurihara R, Okuda K,
Yamamoto T, Maruyama M (2012), “Clinical Effects of Probiotic
Bifidobacterium longum BB536 on Immune Function and Intestinal
Microbiota in Elderly Patients Receiving Enteral Tube Feeding”, JPEN J
Parenter Enteral Nutr , 37(5), p. 631-640.
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 85/112
75
10. Alschuler Lise (2011), “Ensuring Probiotics quality” , Natural medicine
journal , 3(10).
11. Amenta M, Cascio MT, Di Fiore P, Venturini I (2006), “Diet and chronic
constipation. Benefits of oral supplementation with symbiotic zir fos
( Bifidobacteriumlongum W11 + FOS Actilight)”, Actabiomed , 77(3), p.157-
162.
12. Bahaka D, Neut C, Khattabi A, Monget D, Gavini F (1993), “Phenotypic and
genomic analyses of human strains belonging or related to Bifidobacterium
longum, Bifidobacterium infantis and Bifidobacterium breve”, Int J Syst
Bacteriol, 43(3), p. 565-73.13. BioMerieux, Inc (2011), API 20A, France.
14. Ethiopian standard ES ISO 29981 (2012), Milk products Enumeration of
presumptive bifidobacteria Colonycount technique at 37 °C .
15. Hamaji Y, Fujimori M, Sasaki T, Matsuhashi H, Matsui-Seki K, Shimatani-
Shibata Y, Kano Y, Amano J and Taniguchi S (2007), “Strong Enhancement
of Recombinant Cytosine Deaminase Activity in Bifidobacterium longum for
Tumor-Targeting Enzyme/Prodrug Therapy”, Biosci. Biotechnol. Biochem,
71, p. 874-883.
16. Indian council of medical research (2011), Guidelines for the Evalution of
Probiotics in Food , Indian.
17. IOS/TS 19036 (2006), Microbiology of food and animal feeding stuffs –
Guidelines for the estimation of measurement uncertainty for quantitative
determinations.
18. IOS/TS 4833 (2003), Microbiology of food and animal feeding stuffs –
Horizontal method for the enumeration of microorganisms – Colony – count
technique at 30oC.
19. Janet E L Corry, Gordon D W Curtis, Baird.R.M (2012), Handbook of
Culture Media for Food and Water Microbiology, 3rd Edition, Royal Society
of Chemistry, p. 199-221.
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 86/112
76
20. Kwon HS, Yang EH, Yeon SW, Kang BH, Kim TY (2004), “Rapid
identification of probiotic Lactobacillus species by multiplex PCR using
species-specific primers based on the region extending from 16S rRNA
through 23S rRNA.”, FEMS Microbiology Letters, 239, p 267-275.
21. Lahtinen SJ, Gueimonde M, Ouwehand AC (2006), “Comparison of four
methods to enumerate probiotic bifidobacteria in a fermented food product”,
Food microbiology, 23, p. 571-577.
22. Matsuki T, Watanabe K, Tanaka R, Fukuda M and Oyaizu H (1999),
“Distribution of Bifidobacterial Species in Human Intestinal Microflora
Examined with 16S rRNA-Gene-Tareted Species –Specifics Primers”, Applied and Enviroment Microbiology, 65 (10), p. 4506-4512.
23. Promega Technical manual, pGEM-T and pGEM-T easy vector system, USA,
6/2009.
24. Schell MA, Karmirantzou M, Snel B, Vilanova D, Berger B, Pessi
G, Zwahlen MC, Desiere F, Bork P, Delley M, Pridmore RD, Arigoni F
(2002), “The genome sequence of Bifidobacterium longum reflects its
adaptation to the human gastrointestinal tract”, Proc Natl Acad Sci U SA
99(22), p. 14422-14427.
25. Simpson. P.J, Fitzgerald.G.F, Stanton.C, Ross.R.P (2004), “ The evaluation
of a mupirocin-based selective medium for the enumeration of bifidobacteria
from probiotic animal feed”, Journal of Microbiological Methods, 57(1), p. 9-
16.
26. Singh J, Rivenson. A, Tomita. M, Shimamura. S, Ishibashi. N, Reddy. B.S
(1997), “ Bifidobacterium longum, a lactic acid-producing intestinal bacterium
inhibits colon cancer and modulates the intermediate biomarkers of colon
carcinogenesis”, Carcinogenesis, 18(4), p.833 – 841.
27. Sul Sy, Kim HJ, Kim TW và Kim KY (2007), “Rapid Identification of
Lactobacillus and Bifidobacterium in Probiotic Products Using Multiplex
PCR ”, J. Microbiol. Biotechnol , 17 (3), p.490-495.
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 87/112
77
28. Temmerman R, Pot B, Huys G, Swing J (2001), “A quality analysis of
commercial probiotic products”, BiomedExperts 66 (3b), p. 535, 537-542.
29. Tuomola E, Crittenden R, Playne M, Isolauri E, and Salminen S(2001),
"Quality assurance criteria for probiotic bacteria", The American Journal of
Clinical Nutrition, 73(2), p.393-398.
30. UELI VON AH (2006), Identification of Bifidobacterium thermophilum
RBL67 isolated from baby faeces and partial purification of its bacteriocin,
Zurich.
31. Wasilewska Ewa, Bielecka Maria, Markiewicz Lidia(2003), “Numerical
analaysis of biochemical and morphological features of bifidobacteria as atool for species characteristic and identification ”, Polish jounal of food and
nutrition sciences, 12(53), p 149-156.
32. World Health Organization (2002), “Guidelines for the Evalution of
Probiotics in Food ”, FAO of the United Nations.
33. Zinedine. A and Faid. M (2007), “Isolation and Characterization of Strains
of Bifidobacteria with Probiotic Proprieties In vitro”, World Journal of Dairy
& Food Sciences, 2(1), p. 28-34.
34. Zoppi G, Cinquetti M, Benini A, Bonamini and Minelli EB (2001),
"Modulation of the Intestinal Ecosystem by Probiotics and Lactulose in
children during treatment with Ceftiazone", Current Therapeutic Research,
62(5), p. 418 - 435.
35. http://www.questhealthlibrary.com/news/bifidobacterium-longum
36. http://www.powerofprobiotíc.com/Bifidobacterium.html
37. http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 88/112
PHỤ LỤC
Phụ lục 1. Xử lý k ết quả định danh vi sinh vật trong chế phẩm
SamubioTHYMO (mẫu A) bằng phần mềm Apiweb
Phụ lục 2. Xử lý k ết quả định danh vi sinh vật trong chế phẩm Safikid
BIO (mẫu B) bằng phần mềm Apiweb
Phụ lục 3. Xử lý k ết quả định danh vi sinh vật trong chế phẩm L-Bio-3D
(mẫu C) bằng phần mềm Apiweb
Phụ lục 4. Xử lý k ết quả định danh vi sinh vật trong chế phẩm Lackid
(mẫu D) bằng phần mềm Apiweb
Phụ lục 5. Xử lý k ết quả định danh vi sinh vật trong chế phẩm Probiotic
Lactomin Plus (mẫu E) bằng phần mềm Apiweb
Phụ lục 6. Xử lý k ết quả định danh B. longum JCM 1217 bằng phần mềm
Apiweb
Phụ lục 7. K ết quả giải trình tự vi sinh vật trong chế phẩm
SamubioTHYMO (mẫu A)
Phụ lục 8. K ết quả giải trình tự vi sinh vật trong chế phẩm Safikid BIO(mẫu B)
Phụ lục 9. K ết quả giải trình tự vi sinh vật trong chế phẩm Lackid (mẫu
D)
Phụ lục 10. K ết quả giải trình tự vi sinh vật trong chế phẩm Probiotics
Lactomin Plus (mẫu E)
Phụ lục 11. Quy trình định lượng, định tính B. longum trong các chế phẩm
probiotics
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 89/112
Phụ lục 1
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 90/112
Phụ lục 2
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 91/112
Phụ lục 3
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 92/112
Phụ lục 4
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 93/112
Phụ lục 5
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 94/112
Phụ lục 6
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 95/112
Phụ lục 7
Kết quả giải trình tự của VSV phân lập từ mẫu SamubioTHYMO
CGGTTTGCATCCAACGCGTTGGTGAGCTCTCCCATATGGTCGACCTGCA
GGCGGCCGCGAATTCACTAGTGATTTTCCAGTTGATCGCATGGTCTTCTG
GGAAAGCTTTCGCGGTATGGGATGGGGTCGCGTCCTATCCGCTTGACGGCGGGGTAACGGCCCACCGTGGCTTCGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGG
CGACCGGCCACATTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGG
CAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACG
CCGCGTGAGGGATGGAGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTTATCGGGGA
GCAAGCGAGAGTGAGTTTACCCGTTGAATAAGCACCGGCTAACTACGTG
CCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTATCCGGAATTATTG
GGCGTAAAGGGCTCGTAGGCGGTTCGTCGCGTCCGGTGTGAAAGTCCAT
CGCTTAACGGTGGATCCGCGCCGGGTACGGGCGGGCTTGAGTGCGGTAG
GGGAGACTGGAATTCCCGGTGTAACGGTGGAATGTGTAGATATCGGGA
AGAACACCAATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCCGTTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCAC
GCCGTAGACGGTGGATGCTGGATGTGGGGCCCGTTCCACGGGTTCCGTG
TCGGAGCTAACGCGTTAAGCATCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAGGGC
TAAAACTCAAAGAAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGC
GGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGCTTGACATGTTC
CCGACGGTCGTAGAGATACGGCTTCCCAATCGAATTCCCGCGGCCGCCA
TGGCGGCCGGGAGCATGCGACGTCAGGCCCAATTCGCCCTATATGGAGGTCGTATTAAT
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 96/112
Kết quả so sánh trình tự đã giải với các trình tự trong ngân hàng gen thế giới bằng ứng dụng BLAST
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 97/112
Phụ lục 8
Kết quả giải trình tự của VSV phân lập từ mẫu Safikid BIO
CGCGGGTCTATGTGATCTTACAGTGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCG
GGAATTCGTATCTGGGAAGCCGTATCTCTACGACCGTCGGGAACATGTC
AAGCCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCGCATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTTCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCC
GTACTCCCCAGGCGGGATGCTTAACGCGTTAGCTCCGACACGGAACCCG
TGGAACGGGCCCCACATCCAGCATCCACCGTTTACGGCGTGGACTACCA
GGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTA
ACGGCCCAGAGACCTGCCTTCGCCATTGGTGTTCTTCCCGATATCTACAC
ATTCCACCGTTACACCGGGAATTCCAGTCTCCCCTACCGCACTCAAGCCC
GCCCGTACCCGGCGCGGATCCACCGTTAAGCGATGGACTTTCACACCGG
ACGCGACGAACCGCCTACGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGATAAC
GCTTGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTG
CTTATTCAACGGGTAAACTCACTCTCGCTTGCTCCCCGATAAAAGAGGTTTACAACCCGAAGGCCTCCATCCCTCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTT
GCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGC
CGTATCTCAGTCCCAATGTGGCCGGTCGCCCTCTCAGGCCGGCTACCCGT
CGAAGCCACGGTGGGCCGTTACCCCGCCGTCAAGCGGATAGGACGCGA
CCCCATCCCATACCGCGAAAGCTTTCCCAGAAGACCATGCGATCAACTG
GAAAATCACTAGTGAATTCGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAG
AGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGCTTGAGTATCTATAGTAGTCACCTAAAT
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 98/112
Kết quả so sánh trình tự đã giải với các trình tự trong ngân hàng gen thế giới bằng ứng dụng BLAST.
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 99/112
Phụ lục 9
Kết quả giải trình tự của VSV phân lập từ mẫu Lackid
TGGGTGGGTACACGCATTGGGAGGGTCCCACATGGCGACCTGCAGGCGT
CCGCGAATTCACAAATGATTTTCCAGTTGATCTTATGGTCTTCTGGGAAA
GCTTTCGCGGTATGGGATGGGGTCGCGTCCTATCCGCTTGACGGCGGGGTAACGGCCCACCGTGGCTTCGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACC
GGCCACATTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCA
GTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCG
TGAGGGATGGAGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTTATCGGGGAGCAAG
CGAGAGTGAGTTTACCCGTTGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGC
AGCCGCGGTAATACGTAGGGTGGAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGT
AAAGGGCTCGTAGGCGGTTCGTCGCGTCCGGTGTGAAAGTCCATCGCTT
AACGGTGGATCCGCGCCGGGTAAGGGCGGGCTTGAGTGCGGTAGGGGA
GACTGGAATTCCCGGTGTAACGGTGGAATGTGTAGATATCGGGAAGAAC
ACCAATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCCGTTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGT
AAACGGTGGATGCTGGATGTGGGGCCCGTTCCACGGGTTCCGTGTCGGA
GCTAACGCGTTAAGCATCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCGAGGCTAAA
ACTCAAAGAAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGAT
TAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGCTTGACATGTTCCCGA
CGGTCGTAGAGATACGGCTTCCCAATCGAATTCCCGCGACCGCCATGGC
GGCCGGGAGCATGCGACGTCGGGCCCATTTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCC
TGGCGTTACCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTG
GCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCACAGTTGCGCA
GCCTGAATGGCGAATGGACGCGGCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGC
GGGGGGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCAGGGCCTAG
CGCCGCTCCTTTCCCTTTCTTCCCTTCTTTCTCGCCCGTTCGCGGGTTCCC
GTCAAGTTTAATCGGGGGCTCCCTTTAGGTTCGATTATGGCTTTACGGAC
CTCAACCCCAAAACTTGATAAGGGGGTGGTCAGGGTTTG
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 100/112
Kết quả so sánh trình tự đã giải với các trình tự trong ngân hàng gen thế giới bằng ứng dụng BLAST.
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 101/112
Phụ lục 10
Kết quả giải trình tự của VSV phân lập từ mẫu Probiotics Lactomin Plus
CCGATGTTCTCTGTACTCTCGTCGAGTCGTTCTCTGCGCTCCGGCCGCCT
GGCGGCCGCGGGAATTCGTTCTGGGAAGCCGTATCTCTACGACCGTCGG
GAATTGCCAAGCCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCGCATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTTCTTTGAGTTTTAGCC
TTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGATGCTTAACGCGTTAGCTCCGACAC
GGAACCCGTGGAACGGGCCCCACATCCAGCATCCACCGTTTACGGCGTG
GACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAG
CGTCAGTAACGGCCCAGAGACCTGCCTTCGCCATTGGTGTTCTTCCCGAT
ATCTACACATTCCACCGTTACACCGGGAATTCCAGTCTCCCCTACCGCAC
TCAAGCCCGCCCGTACCCGGCGCGGATCCACCGTTAAGCGATGGACTTT
CACACCGGACGCGACGAACCGCCTACGAGCCCTTTACGCCGAATAATTC
CGGATAACGCTTGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTG
AGCCGGTGCTTATTCAACGGGTAAACTCACTCTCGCTTGCTCCCCGATAAAAGAGGTTTACAACCCGAAGGCCTCCATCCCTCACGCGGGTCGCTGCTC
AGGCTTGCGCCCATTGTACAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGATC
TGGGCCGTATCTCATCCCAATGTGGCCGGTCGCCCTCTCAGGCCGGTAC
CCGTCAAAGCCCGGGGGGGCCGTTACCCCGCCGTCAAGCGGATAGGAC
GCGACCCCATCCATACCGGGAAAGCTTTCCCAGAAGACCATGCGTTCAA
CTGGAAAAATCACTAATGAATTCGGGGGCCGCCTGTAGGCGACCATATG
GGAA
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 102/112
Kết quả so sánh trình tự đã giải với các trình tự trong ngân hàng gen thế giới bằngứng dụng BLAST
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 103/112
Phụ lục 11
1. Định lượng B. longum trong các chế phẩm probiotics Cân và xác định khối lượng trung bình của 20 gói chế phẩm. Cân chính xác
khoảng 10,0g bột thuốc vào bình nón vô trùng, thêm dung môi pha loãng với thểtích tính theo mililit bằng 9 lần khối lượng bột thuốc đã cân và vài viên bi thuỷ
tinh vô trùng. Lắc mạnh trong 30 phút để vi sinh vật phân tán đều trong dung dịch,
thu được hỗn dịch có độ pha loãng 10 -1. Lấy 1000 l hỗn dịch trên cho vào ống
nghiệm đã chứa sẵn 9,0ml dung môi pha loãng, lắc đều bằng máy lắc trộn Vortex
được hỗn dịch có độ pha loãng 10 -2. Tiếp tục pha loãng 10 lần như trên để thu
được hỗn dịch có có độ pha loãng 10-5, 10
-6 và 10
-7.
Tiến hành: Chuẩn bị ba đĩa petri vô trùng, chuyển vào mỗi đĩa chính xác
1000 l hỗn dịch có độ pha loãng 10-5. Tiếp tục làm như trên với hỗn dịch có độ pha
loãng 10-6
và 10-7. Cấy trộn với môi trường BSM đặc (đã được tiệt trùng và để nguội
xuống khoảng 45oC), để môi trường trong đĩa đông tự nhiên. Lật ngược đĩa petri và
ủ ở 37 1oC trong 48 - 72 giờ trong điều kiện kị khí. Sau thời gian ủ, đếm số lượng
khuẩn lạc trong các đĩa petri (chỉ đếm các đĩa petri có số khuẩn lạc nằm trong
khoảng 25 - 250).
Tính kết quả: Số lượng vi sinh vật trong 1 gói chế phẩm được tính theo công
thức:
A = nTB d MTB
Trong đó:
A : số lượng vi sinh vật trong 1 gói chế phẩm (CFU/gói),
nTB : số lượng khuẩn lạc trung bình trong 3 đĩa petri (CFU),
MTB : khối lượng trung bình của bột thuốc trong gói chế phẩm (g/gói),
d : hệ số pha loãng của hỗn dịch thử.
2. Định danh đến chi Bifidobacterium bằng kit APi 20A
Sau khi nuôi cấy vi sinh vật như mô tả trong mục định lượ ng (mục 1), lựa
chọn một khuẩn lạc đặc trưng, tách biệt và cấy chuyển sang 5,0ml môi trườ ng MRS
lỏng, có bổ sung khoảng 0,5ml dầu khoáng ở lớ p bề mặt và ủ trong điều kiện k ị khí
ở 37 1o
C trong 24 giờ .
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 104/112
2.1. Nhuộm Gram
Tiến hành nhuộm tế bào theo phương pháp nhuộm Gram và soi dướ i kính hiển
vi vớ i vật kính dầu có độ phóng đại 1000 lần.
Nếu vi sinh vật bắt màu tím, hình que, không có bào tử thì k ết luận vi sinh vậ là
tr ực khuẩn Gram dương, không sinh bào tử.
2.2. Định danh vi sinh vật bằ ng kit API 20A
Sau khi xác định vi sinh vật là tr ực khuẩn Gram dương, không sinh bào tử thì
tiế p tục cấy một quai cấy canh chủng từ ống MRS lỏng ở trên lên môi trườ ng thạch
máu, ủ trong điều kiện k ị khí ở 37 1oC trong 18-24 giờ . Gặt vi sinh vật trên bề
mặt đĩa thạch và phân tán đều trong ống nghiệm có sẵn 1ml nướ c cất vô trùng thu
đượ c hỗ n d ịch g ố c.
Nhỏ từ từ từng giọt hỗ n d ịch g ố c ở trên vào một ống nghiệm đã chứa sẵn 4ml
nướ c cất vô trùng đến khi độ đục trong ống tương đương với độ đục chuẩn
McFarland số 3. Ghi lại số giọt hỗn dịch gốc đã cho vào ống nghiệm trên.
Cho vào 4ml môi trườ ng API 20A số giọt hỗn dịch gốc bằng số giọt đã cho vào
ống nghiệm trên và lắc đều. Như vậy, nồng độ vi sinh vật trong môi trườ ng API
20A tương đương với độ đục chuẩn McFarland số 3 (so sánh độ đục bằng mắt
thườ ng).
Nhỏ môi trườ ng API 20 đã cấy vi sinh vật vào các giếng của bộ kit API 20A bắt
đầu từ giếng số 0 đến giếng 20, chú ý tránh tạo bọt khí trong giếng, chú ý chỉ nhỏ
phần tube. Riêng đối vớ i giếng IND nhỏ dung dịch dầu khoáng vô trùng lên trên bề
mặt giếng để tạo điều kiện k ị khí cho vi sinh vật phát triển. Đối vớ i giếng GEL nhỏ
cả phần tube và phần miệng giếng. Ủ ở 36 ± 2oC trong điều kiện k ị khí trong vòng
24± 2h.
Cách đọc k ết quả: Sau 24h nuôi cấy, quan sát và đọc k ết quả.
- Đối vớ i giếng IND: Thêm 1 giọt thuốc thử XYL vào lớ p dầu khoáng phía trên, tr ộn
đều và để 2-3 phút. Sau đó thêm 1 giọt thuốc thử EHR. Đọc k ết quả trong vòng 5
phút. K ết quả là dương tính nếu xuất hiện màu đỏ.
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 105/112
- Đối vớ i các giếng có chứa các đườ ng khác nhau: Thêm vào mỗi giếng một giọt
thuốc thử BCP. K ết quả đượ c ghi là dương tính nếu xuất hiện màu vàng hoặc vàng-
xanh.
- Phản ứng CAT: Để kit tiế p xúc vớ i không khí khoảng 30 phút, sau đó thêm 2 giọt
thuốc thử H2O2 3% vào một giếng dương tính bất k ỳ. K ết quả được ghi là dương
tính nếu thấy xuất hiện bọt khí.
Cách đọc giếng dương tính và giếng âm tính đượ c trình bày ở Bảng 1
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 106/112
Bảng 1. Cách đọc k ế t quả kit Api 20A
Giếng Chất nền
Hàm
lượ ng(mg/gi
ếng)
Phản ứng
K ết quả
âm tính Dương tính
IND L-tryptophan 0,98 Sự hình thành indol
XYL-tr ộn đ u /2-3 phút + HER/5 phút
Vàng Đỏ
URE Urea 0,648 Urease Vàng-cam Đỏ
GLU
MAN
LAC
SACMAL
SAL
XYL
ARA
D-glucose
D-manitol
D-lactose
D-saccharoseD-maltose
Salicin
D-xylose
L-arabinose
1,96
1,96
1,96
1,861,96
1,64
1,64
1,64
Acid hóa
Acid hóa
Acid hóa
Acid hóaAcid hóa
Acid hóa
Acid hóa
Acid hóa
BCP
Tím Vàng/ vàng-xanh
GEL gelatin 0,6Sự thủy phân gelatin
Không có sự khuếch tán chất
màu
Có sự khuếch tán
chất màu đen
ESCEsculin
Sắt (III) citrat
0,36
0,11Sự thủy phân Esculin
Vàng Nâu-đen
Soi dưới đèn UV 365nm
Phát quang Không phát quang
GLY
CEL
MNE
MLZ
RAF
SOR
RHA
TRE
Glycerol
D-cellobiose
D-mannose
D-melezitose
D-raffinose
D-sorbitol
L-rhamnose
D-trehalose
1,82
1,86
1,96
1,96
2,18
2,18
1,96
1,96
Acid hóa
Acid hóa
Acid hóa
Acid hóa
Acid hóa
Acid hóa
Acid hóa
Acid hóa
BCP
Tím Vàng/ Vàng-xanh
Sau khi tiế p xúc vớ i không khí 30 phút, thêm H2O2
vào 1 giếng dương tính
CAT - Catalase Không có bọt khí Xuất hiện bọt khí
SPOR - Bào tử Không có Có
GRAM - H ng Tím
COCC - Hình thái Que C u
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 107/112
Ghi k ết quả vào phiếu theo dõi. Nhậ p số liệu vào phần mềm Apiweb để định
danh chính xác vi sinh vật trong chế phẩm.
3. Định danh đế n loài B. longum b ằng k ỹ thu ật PCR vàgi ải trình t ự
3.1. Sơ đồ chung định tính B. longum trong các chế phẩ m probiotics bằ ng k ỹ
thuật PCR và giải trình t ự
Sau khi lựa chọn khuẩn lạc đặc trưng tách biệt, tiến hành tăng sinh trong môi
trườ ng MRS lỏng có bổ sung 0,5ml dầu khoáng và được định danh đến chi
Bifidobacterium bằng kit API 20A như mô tả trong mục 2, tiế p tục cấy tăng sinh
VSV từ phần sinh khối còn lại sang môi trườ ng MRS lỏng, bổ sung thêm 0,5ml dầu
khoáng vô khuẩn, ủ ở 37±10C trong điều kiện k ỵ khí trong 24 giờ. Sau đó VSVtrong ống môi trườ ng MRS lỏng này sẽ đượ c tách chiết DNA và định danh bằng k ỹ
thuật PCR và giải trình tự theo sơ đồ sau
VSV trong môi
trường MRS lỏng
Tách chiết DNA
Kiểm tra sản phẩmtách
Tiến hành phản ứngPCR với mồi đặc hiệu
Nhân dòng và giảitrình tự
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 108/112
3.2. Tách DNA vi khuẩ n bằ ng WizardR Genomic DNA Purification Kit
DNA của các chủng nghiên cứu và của các vi sinh vật phân lập trong các
mẫu được tách và tinh sạch bằng kit của Promega có cải tiến. Quy trình thực hiện
như sau:
Các chủng chuẩn được tăng sinh từ các ống gốc bằng môi trường MRS lỏng, ủ ở
370C trong 48 giờ. Đối với các mẫu nghiên cứu, tiếp tục tăng sinh VSV trong môi
trường MRS lỏng từ phần sinh khối của VSV được phân lập sau khi đã định danh
đến chi Bifidobacterium (mục 2 )
- Lấy 1,0 – 1,5ml môi trường tăng sinh chủng trên vào ống nhựa 1,5ml. Mang ly
tâm 10000-12000 vòng/phút trong 2 phút loại dịch nổi thu lấy cắn. - Thêm 480µl dung dịch EDTA 50mM vào ống cắn, lắc đều.
- Thêm tiếp 120µl dung dịch lysozyme (nồng độ 20mg/ml) trộn đều.
Ủ ở 370C trong 30-60 phút, sau đó ly tâm ở 10000-12000 vòng/phút trong 2 phút.
Bỏ dịch nổi thu lấy cắn.
- Thêm 600µl dung dịch Nuclei Lysis vào ống cắn vừa thu được. Dùng pipet đảo
nhẹ tạo thành hỗn dịch. Ủ hỗn dịch trên ở 800C trong 5 phút để ly giải tế bào, sau
đó để nguội đến nhiệt độ phòng
- Thêm 3µl dung dịch RNAse vào dịch ly giải tế bào, trộn đều bằng cách đảo ống từ
5-7 phút. Ủ ở 370C trong 15-60 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng.
- Thêm 200µl dung dịch Protein Precipitation (dung dịch kết tủa protein) vào hỗn
hợp trên, lắc mạnh trong 20 giây. Ủ trong đá lạnh 5 phút. Đem ly tâm 10000-12000
vòng/phút trong 3 phút.
- Chuyển dịch nổi chứa DNA vào một ống nhựa 1,5ml sạch khác chứa 600µl
isopropanol. Trộn đều bằng cách đảo ngược ống từ 5-7 lần. Ly tâm 10000-12000
vòng/phút trong 2 phút. Loại bỏ dịch nổi, thu lấy cắn.
- Thêm 600µl dung dịch ethanol 70% vào ống, đảo nhẹ nhàng để rửa cắn DNA. Ly
tâm 10000-12000 vòng/phút trong 2 phút. Cẩn thận loại hết ethanol thừa, để khô tự
nhiên trong 10-15 phút.
- Thêm 100µl dung dịch DNA Rehydration (dung dịch hòa tan DNA) vào ống chứa
cắn DNA, ủ 650C trong 1 giờ.
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 109/112
Bảo quản dung dịch DNA vừa tách được ở -200C.
3.3. Định lượ ng DNA bằng phương pháp đo độ hấ p thụ ánh sáng t ử ngoại ở
bướ c sóng 260 nm (A260 )Lấy 20µl dung dịch DNA trên, thêm 1,98 ml nước cất siêu tinh khiết vô
khuẩn. Tiến hành đo quang ở bước sóng 260nm thu được A260. Dựa vào kết quả đo
tính toán nồng độ dung dịch DNA gốc rồi pha loãng dung dịch DNA gốc đến nồng
độ 50 ng/µl.
- Kiể m tra khả năng tách DNA
Kiểm tra sản phẩm DNA tách được bằng phản ứng nhân bản đoạn gen đặc
hiệu 16S rDNA của vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR. Thành phần phản ứng được trình
bày ở Bảng 2.
Bảng 2. Thành phần của phản ứng PCR kiểm tra DNA mới tách
STT Thành phần Thể tích (µl)
1 Đệm PCR (10X) 2,5
2 dNTPs (2mM) 2,5
3 Dung dịch MgCl2 (50mM) 0,754 ID16R08F (10 pmol) 1
5 IDL16R09R (10 pmol) 1
6 Tag DNA polymerase (5u/µl) 0,1
7 DNA khuôn (50ng/µl) 3
8 Nước cất 14,15
Tổng thể tích phản ứng 25µl
Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân bản đoạn gen 16S rDNA: 940C trong
5 phút để biến tính hoàn toàn DNA khuôn, tiếp theo là 30 chu kỳ của 3 bước: 94 0C
trong 45 giây để làm biến tính DNA, 560C trong 45 giây để gắn mồi và 720C trong 1
phút 30 giây để kéo dài chuỗi. Mẫu sau đó được ủ tiếp ở 720C trong 5 phút và giữ ở
40C cho đến khi phân tích.
* Điện di trên gel agarose
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 110/112
Chuẩn bị bản gel có nồng độ 1% (kl/tt) trong đệm TBE (pH 8,0) (Tris -Boric
acid-EDTA), tiến hành điện di sản phẩm bằng máy điện di gel XL-ULTRA-V-2 ở
100V trong 30 phút. Nhuộm sản phẩm bằng dung dịch ethidium bromide 0,1%
trong 15-30 phút. Ghi lại kết quả bằng máy chụp ảnh bản gel UVDI- 312.
3.4. Nhân bản đoạn gen đặc hiệu của các đối tượ ng nghiên cứ u bằ ng k ỹ thuật
PCR
Tiến hành phản ứng PCR với các thành phần ghi trong Bảng 3
Bảng 3. Thành phần phản ứng PCR đơn mồi
STT Thành phần Thể tích (µl)
1 Đệm PCR (10X) 2,5
2 dNTPs (2mM) 2,5
3 Dung dịch MgCl2 (50mM) 0,75
4 BlonF (10pmol) 1
5 BlonR (10pmol) 1
6 Tag DNA polymerase (5u/µl) 0,1
7 DNA khuôn (50ng/µl) 3
8 Nước cất 14,15
Tổng thể tích phản ứng 25µl
Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân bản đoạn gen đặc hiệu: : 94oC trong
5 phút để biến tính hoàn toàn DNA khuôn, tiếp theo là 30 chu kỳ của 3 bước: 94 0C
trong 45 giây để làm biến tính DNA, 56oC trong 45 giây để gắn mồi và 720C trong
30 giây để kéo dài chuỗi. Mẫu sau đó được ủ tiếp ở 72 oC trong 5 phút và giữ ở 4o
C
cho đến khi phân tích.
3.5. Nhân dòng và giải trình t ự
3.5.1. Tinh sạch DNA/dsRNA từ gel agarose bằng bộ kit Fermentas.
Quy trình được thực hiện ở nhiệt độ phòng bao gồm những bước như sau:
- Băng DNA/dsRNA quan tâm được cắt chính xác bằng lưỡi dao sạch từ gel agarose
và đưa vào ống eppendorf 1,5 ml. Bổ sung đệm bám (binding buffer) với 1 thể
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 111/112
tích bằng khối lượng miếng gel (1µl : 1 mg) và ủ trong bể ổn nhiệt 60°C trong
khoảng 10 phút đến khi gel tan hoàn toàn.
- Dung dịch gel agarose đã hòa tan được chuyển lên cột tinh sạch và ly tâm 10000
vòng/phút trong 1 phút. Sau đó phần dịch đi qua màng được gạn bỏ.
- Bổ sung 500 µl đệm rửa (wash buffer) vào cột và ly tâm 1 phút với vận tốc 10000
vòng/phút. Phần dịch đi qua màng được gạn bỏ. Lặp lại bước này một lần nữa.
- Cột tinh sạch có chứa DNA/dsRNA được chuyển sang ống eppendorf 1,5 mới và
bổ sung 100 µl elution buffer vào chính giữa lớp màng silica của cột. Sau đó
DNA/dsRNA được thu bằng cách ly tâm 1 phút với tốc độ 10000 vòng/phút.
Lượng DNA/dsR NA tinh sạch được giữ ở -20°C để phục vụ cho thí nghiệm tiếptheo.
3.5.2. Nhân dòng sản phẩm PCR bằng bộ kit pGEMT-Easy cloning.
- Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pGEMT- Easy.
Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pGEMT-Easy đầu T được thực hiện
theo quy trình kèm theo của bộ kit, với các thành phần như trong Bảng 4
Hỗn hợp phản ứng gắn sau đó được ủ trong bể ổn nhiệt 16°C qua đêm.
Bảng 4. Thành phần phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector.
TT Thành phần Thể tích (µl)
1 Đệm phản ứng 2X 10 µl
2 Sản phẩm PCR 3 µl
3 Vector đầu T pGEMT-T 1 µl
4 T4 DNA ligase (5 u/µl) 1 µl
5 H2O cất khử ion vô trùng 5 µlTổng thể tích 20 µL
Biến nạp DNA vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α.
Tế bào khả biến E.coli DH5α (bảo quản trong tủ lạnh sâu -80°C) được làm tan
trên đá trong 10 phút. Tiếp đó, bổ sung 10µl hỗn hợp phản ứng gắn sản phẩm PCR
vào vector pGEMT-easy vào dung dịch tế bào đã rã đông và ủ trên đá 20 phút để
tạo điều kiện cho vector bám vào thành tế bào. Tế bào được sốc nhiệt bằng cách
chuyển sang bể ổn nhiệt 42°C trong 45 giây, sau đó được chuyển lại ủ trên đá trong
7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics
http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 112/112
2 phút. Tiếp theo, bổ sung 450µl LB lỏng vào hỗn hợp biến nạp và ủ ở nhiệt độ
37°C trong vòng 20 phút trước khi được nuôi lắc với tốc độ 220 vòng/phút trong
thời gian 30 phút. Hỗn hợp tế bào biến nạp được cấy trải trên đĩa môi trường LB
đặc có bổ sung ampicillin 100 µg/ml, phủ trên bề mặt cơ chất X-gal (20 l, nồng độ
20 mg/ml) và IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, 20 l, nồng độ
100mM), ủ ở 37°C qua đêm.
3.5.3. Tinh sạch plasmid từ vi khuẩn E. coli bằng bộ kit GenJETTM Plasmid Miniprep.
DNA tái tổ hợp được tinh sạch từ tế bào vi khuẩn E. coli bằng bộ kit
GenJETTM
Plasmid Miniprep (Fermentas). Quy trình được thực hiện như sau:
-
Một khuẩn lạc dương tính được nuôi lắc trong 5ml môi trường LB lỏng có bổ sungkháng sinh ampicillin 100 µg/ml với tốc độ 220 vòng/phút ở 37°C qua đêm.
- Tế bào được thu bằng cách ly tâm ở vận tốc 6000 vòng/phút trong 10 phút, ở 4oC.
Tế bào được hòa trở lại trong 250 µl đệm P1 (Resuspension solution) đã bổ sung
enzyme RNase A.
- Bổ sung 250 µl đệm P2 (lysis solution) vào dịch tế bào và đảo nhẹ 3-5 lần, ủ ở
nhiệt độ phòng 5 phút để phá vỡ tế bào giải phóng plasmid.
-
Hỗn hợp được trung hòa bởi 350 µl đệm P3 (neutralization solution), đảo đều 4-6
lần. Mảnh vỡ tế bào và protein biến tính được loại bỏ bằng cách ly tâm hỗn hợp với
vận tốc 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C.
- Dịch nổi sau khi ly tâm được đưa lên cột tinh sạch plasmid và ly tâm 10000
vòng/phút trong 1 phút. Plasmid được giữ lại trên lớp màng silica còn dịch qua cột