wyk.ad okre.lanie struktury r..nych toksyn przy zastosowaniu techniki chromatografii ... · 2013....

OKREŚLANIE STRUKTURY RÓŻNYCHOKREŚLANIE STRUKTURY RÓŻNYCHTOKSYN PRZY ZASTOSOWANIU TECHNIKITOKSYN PRZY ZASTOSOWANIU TECHNIKI

CHROMATOGRAFII CIECZOWEJCHROMATOGRAFII CIECZOWEJSPRZĘŻONEJ ZE SPEKTROMETREMSPRZĘŻONEJ ZE SPEKTROMETREM

MASOWYM (HPLC-MS)MASOWYM (HPLC-MS)

Dr inż.Agata Kot-Wasik

Katedra Chemii Analitycznej,Wydział Chemiczny, Politechnika Gdańska

ul. G.Narutowicza11/12,80-952 Gdańsk, [email protected]

Dr Hanna Mazur-Marzec

Instytut Oceanografii, Uniwersytet Gdański,

Al. Marszałka Piłsudskiego 46,81-378 Gdynia, [email protected]

TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJĄCETECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJĄCEANALIZĘ TOKSYN:ANALIZĘ TOKSYN:

TESTY IMMUNOLOGICZNE I ENZYMATYCZNETESTY IMMUNOLOGICZNE I ENZYMATYCZNE

––ELISA (ELISA (angang.. EEnzymenzyme--LLinked inked IImmunommunossorbentorbentAAssayssay)) pozwala na oszacowanie obecności toksyn,np. wydzielanych przez glony z rodzaju Microcystis,na poziomie kilku µgL-1 bez przygotowania próbki,lecz nie pozwala na ich identyfikację.

––PPIPPI ((angang. . PProteinrotein PPhospatase hospatase IInhibition assaynhibition assay))

metody wysoce selektywne, czułe i szybkie

J. Rapala, K. Erkomaaa, J. Kukkonen, K. Sivonen, K. Lahti, Analytica Chimica Acta 466 (2002) 213-231


METODY CHROMATOGRAFICZNEMETODY CHROMATOGRAFICZNE

– GC–MSGC–MS - zapewnia wysoką selektywność(specyficzność) oznaczenia, lecz wymagaderywatyzacji analitów, a poza tym nie możebyć zastosowana do analizy nielotnych toksynwysokocząsteczkowych.


–– HPLC-UVHPLC-UV lub HPLC-DADHPLC-DAD - jedna z najczęściejnajczęściejstosowanych technik, jednakże nie zapewniaona wystarczającej jakości uzyskiwanychwyników bez zastosowania żmudnych idługotrwałych procedur przygotowania próbki.

––HPLC-fluorescencjaHPLC-fluorescencja - rzadziej stosowanatechnika, gdyż wymaga derywatyzacji analitów;ale znacznie czulsza niż HPLC-UV.

HPLC–DADHPLC–DADanaliza ekstraktu analiza ekstraktu NodulariiNodularii

HPLC-DAD

238 nm254 nm

HPLC–DADHPLC–DADanaliza ekstraktu analiza ekstraktu NodulariiNodularii

Analiza widma DAD

Wniosek: niezbędny jest wzorzeccelem potwierdzenia czasu

retencji i porównania widma UV

238 nm254 nm


––HPLC-UVHPLC-UV lub HPLC-DADHPLC-DAD

Pozwala na uzyskanie informacji omasie cząsteczkowej oznaczanychtoksyn, a nawet ich identyfikację.

HPLC–DAD-MSHPLC–DAD-MS

HPLC-MSHPLC-MS

TAK, ALE ...

problem połączenia LC i MS !

Przepływ fazy ruchomej w LC wymusza problemy związane zuzyskaniem wysokiej próżni. Podczas analizy GC (faza ruchoma:gaz) przepływ gazu u wlotu do MS wynosi około 0.5-2ml/min.

Podczas kiedy w HPLC faza ruchoma w postaci ciekłej daje przepływgazu u wlotu MS rzędu 350ml/min w przypadku metanolu i aż

1000 ml/min w przypadku wody!

( J.Abian "The coupling of Gas and Liquid Chromatography with Mass Spectrometry ")

HPLC, 1 ml/min, 100-250 bar MS, próżnia

HPLC-MSHPLC-MS

KwadrupolKwadrupol

KolumnaKolumna HPLC HPLC

CiśnienieCiśnienieatmosferyczneatmosferyczne

PróżniaPróżniaWysokie ciśnienieWysokie ciśnienie

+HV+HV

ElektrorozpylanieElektrorozpylanie((electrosprayelectrospray))

ODPAROWANIEROZPUSZCZALNIKA

ROZPYLENIE

ROZSZCZEPIENIEI POWSTANIE JONÓW

[M+[M+nHnH]]n+n+

++

+

+

++

+

++

+

++ +

++++

++

+++

+++

+

++++

++

+++

+++

+

++++

++

+++

+++++

+ +++

++ +

+

++

++

HPLC–MSHPLC–MSanaliza ekstraktu analiza ekstraktu NodulariiNodularii

HPLC-MS

SCAN

SIM


Widmo MS

SCAN


Analiza widma MS

Wniosek: wzorzec może potwierdzićhipotezę o obecności nodularyny wekstrakcie, ale nie jest niezbędny.

[M+H][M+H]++ = 825.4 = 825.4

M=824.4M=824.4

NH

H

H

H H

H

OMe

H

NH

O

HN

H COOH

O

CH3

H

NH

O

O

NH

NH

NH2NH

O

CH3H

HCOOHH

CH3


Widmo MS

SCAN


HPLC-MS

NH

H

H

H H

H

OMe

H

NH

O

HN

H COOH

O

CH3

H

NH

O

O

NH

NH

NH2NH

O

CH3H

HCOOHH

CH3

[M+H][M+H]++ = 811.3 = 811.3

M=810.3M=810.3

dm-Nod

HPLC–DAD-MS HPLC–DAD-MS analiza ekstraktu:analiza ekstraktu:jezioro Karczemnejezioro Karczemne

HPLC-DAD

HPLC-MS

MS-SCAN

MS-SIM

DAD

MS-SCAN MS-SCAN analiza ekstraktu: jezioro Karczemneanaliza ekstraktu: jezioro Karczemne[M+H][M+H]++

NH2+ O

Anatoksyna A

NH

CH3H

HCH3

H

CH3

H

HH

O

NH

OCH3

H

N

O

OHH

NH

CH2

OCH3

A

H

CH3

O

NH

H

NH

O

NH

OH

R1

H

H

NH2NH MC RR

[M+2H][M+2H]2+2+

MS-SIM MS-SIM analiza ekstraktu: jezioro Karczemneanaliza ekstraktu: jezioro Karczemne

Jon monitorowany:166 (Anatoksyna-a)

Jon monitorowany:995 (MC-LR)

Jon monitorowany:520 (MC-RR)

Jon monitorowany:825 (Nod)

1046 (MC-YR)


– HPLC–MSHPLC–MS - technika ta pozwala nauzyskiwanie informacji o masie cząsteczkowejoznaczanych toksyn.

Widmo masowe - “odcisk palca” substancjipozwala na jej identyfikację. Technika HPLC-DAD-MSzaczyna być coraz powszechniej stosowana do analizy

toksyn ze względu na jej zalety oraz fakt, iż dzisiajsystemy HPLC-MS stają się niezawodne, oferuje je corazwiększa liczba producentów, a ich ceny zbliżają się do

poziomu akceptowalnego przez większość laboratoriów.


– HPLC–MSHPLC–MS


niezwykle użytecznym rozwinięciem techniki HPLC-MSjest LC-MS-MSLC-MS-MS

––HPLC-MS-MSHPLC-MS-MS - dzięki zastosowaniudodatkowego detektora masowego możliwa jestidentyfikacja nieznanych substancji jedynie napodstawie ich widma masowego (nawet bezkonieczności posiadania wzorców).

WNIOSKI KOŃCOWE:WNIOSKI KOŃCOWE:

Technika HPLC–MSHPLC–MS zaczyna być corazpowszechniej stosowana w laboratoriachanalitycznych ze względu na jej zalety.

Wkrótce technika LC-MS stanie się technikąrutynowych analiz.

wyk.ad okre.lanie struktury r..nych toksyn przy zastosowaniu techniki chromatografii ... · 2013....

Documents