Virchows Arch. Abt. B Zellpath. 2, 163--170 (1969)

Wirkung von Aceton auf die Chromosomen-Verteilung bei menschlichen Leukocyten

( W i r k u n g y o n A c e t o n a u f C h romosome n)

A. KABARITY*

Institut fiir Humangenetik und Anthropologie der Universit~t Dfisseldorf (Direktor: Prof. Dr. H. SCHADE)

Eingegangen am 20. Juni 1968

El/act o/Acetone on the Chromosome Division o/Human Leucocytes Summary. In the present investigation, the treatment of human leucocytes with acetone

shows that acetone has a specific merokinetic effect (multipolarity). The formation of multiple spindle apparatus is discussed and it is concluded that acetone may cause the centrosome to divide into more than two parts. Each part of the centrosome then moves to one pole, thus several spindle-fiber apparatus are formed instead of the normally one.

A high percentage of star metaphases were found beyond the multipolar anaphases. I t was concluded that star metaphases are caused by the application of high concentrations of acetone and not by a specific effect of it.

Zusammen/assung. Aceton ruft eine spezifische ,,merokinetische" Wirkung (Multipolarit~t) auf die Mitosen in menschlichen Leukocyten hervor. Es wurde festgestellt, dab Aceton in einem frfihen Stadium auf den Aufbau der Spindelfasern so wirkt, daft das Centrosom sich mehrfach teilt, statt sich in zwei Teile zu spalten. Jedes geteilte Centrosom ist zu einem Pol gewandert, so dab anstatt eines Spindelfaser-Apparates mehrere aufgebaut wurden.

Die Beobachtung yon Stern-Metaphasen (star-metaphases) nach Einwirkung des ,,mero- kinetischen" Stoffes Aceton wird diskutiert. Stern-Metaphasen werden danach nicht dureh spezifisehe Wirkung des Acetons, sondern durch die Applikation von hohen Konzentrationen der Agensl6sungen hervorgerufen.

Die Wi rkung yon Aceton auf Mitosen wurde yon BARTH~L~WSS und EIN- LSCHNnR (1959) bei Al l ium Cepa-Zellen untersucht . I n einer frfiheren Arbe i t (KABAI~ZTY, 1966) wurde die Wi rkung yon Aceton auf die Meiose bei Tr i t i cum vulgare durchgeff ihr t . I n beiden Arbe i ten wurde festgestel l t , dab Aceton eine spezifische merokine t i sche Wi rkung auf die Mitose sowie auf die Meiose bei Pflanzenzel len ausi ibt .

I n der vor l iegenden Arbe i t war es mSglich, die W i r k u n g des Acetons auf menschliche Leukocy ten zu untersuchen. Eine op t imale cytologische W i r k u n g wurde nach en tsprechender Tes tung bei Ace ton in einer niedr igen K onz e n t r a t i on (0,0014%) erreicht . Die F rage des Aufbau eines mul t ipol igen Spindelfaser- Appa ra t e s konnte nach E inwi rkung yon Aceton im F r / i h s t a d i u m der Mitose ver- folgt warden.

* Stipendiat der Alexander von Humboldt-Stiftung.

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Methode Um die Wirkung der Agensl6sungen auf die Leukocyten zu zeigen wurde die Methode yon

MOORHEAD et al. (1960) modifiziert. 1. Makro-Methode. Nachdem sich das Blut 11/2 Std im Eiswasser abgesetzt hat, wird das

Plasma abpipettiert und in 20 ml T.C. 199 Medium gegeben, 0,3 ml Phyto. wird direkt vor Zu- gabe der Zellen zum Medium zugegeben. Nach 93 Std wird diese Kultur in 5 Flaschen aufge- teilt, jede Flasche enth~lt 5 ml Medium mit suspendierten Zellen. Zu jeder Unterkultur werden 5 Tropfen der Agensl6sung zugegeben, sodann wurden die Kulturen 2, 3 und 4 Std bei 37~ inkubiert.

2. Mikro-Methode I. Zu 8 ml T.C. 199 Medium gibt man 15 Tropfen Blur und mischt dies mit 0,2 Tropfen Phyto., danach mug man es bei 37~ wachsen lassen. Die Agensl6sungen werden dann - - ebenso wie bei der Makro-Methode - - zugegeben.

3. Zu 5 ml T.C. 199 Medium gibt man 6 Tropfen Blut und 3 Tropfen Phyto. Nach 3 Tagen erfolgt Behandlung wie bei Methode 1.

Naeh der im Text angegebenen Behandlungszeit zentrifugiert man das gesamte Medium 5 min bei 800 Umdrehungen. Der Uberstand, ohne Zellen aufzuwirbeln, wird abpipettiert. Der Zellriickstand wird nicht durehpipettiert, um das Platzen der Zellen zu vermeiden. Es wurde kein hypotonischer Schock durchgefiihrt, die Zellen wurden vielmehr gleich fixiert. Fixierung erfolgte in Carnoy (3 : 1 J~thylalkohol : Eisessig). Naehdem die Fixierl6sung ca. 1/2 Std. bei Zimmertemperatur eingewirkt hat, wird die Suspension bei 500 Umdrehungen 10 min lang zentrifugiert.

Zum Herstellen der Pr~parate wurde nach dem Zentrifugieren eine geringe Flfissigkeits- menge zuriickgelassen. Auf die noeh feuchten Objekttr~ger tri~gt man einen Tropfen der Suspension vorsichtig auf und liift die Pr~parate an der Luft trocknen. Bei dieser modifizier- ten Methode wurde darauf geachtet, daft die Leukocyten nicht durch Preparation platzen, um die genaue Orientierung der Chromosomen nach der Einwirkung der Agensl6sung nicht zu st6ren. Mitosen, die sich nicht innerhalb der Zellmembrane befanden, wurden nieht ana- lysiert. Anschliefend werden die Pr~parate mit frisch gefiltertem 1%igem Orcein 10--15 rain gef~rbt und in Euparal eingebettet.

Unter denselben Bedingungen wurden Kontrollpr~parate hergestellt und sorgf~ltig unter- sucht. In keiner der Zellen dieser Kontrollen wurden Abweichungen beobachtet, die Mitose verlief stets ganz normal.

Ergebnisse Der s t6rende EinfluB yon Aceton auf menschliche Leukocy ten mani fes t i e r t

sich deut l ich zwischen 0,05 Mol/1 (0,0029%) und 0,025 Mol/1 (0,0014%).

Die H a u p t ~ r k u n g auf die Metaphase in 0,05 Mol/1 Aceton ist das Auf t re ten von , ,S te rn -Metaphasen" (Star -metaphases) . Die Chromosomen liegen h~ufig d ich t zusammengepack t in einer einzigen Gruppe. Die Centromere liegen zentral , und nur die Arme werden abgespreizt . Die Abb. 1 a und b zeigen Beispiele solcher S tern-Metaphasen . Nach 4st i indiger Bchandlung mi t 0,05 Mol/1 Aceton t r e t en fas t alle Mctaphasen in dieser F o r m auf, un te rha lb 0,05 Mol/1 war keine Stern-Meta- phase zu l inden. Alle andcren Tei lungss tadien weisen in dieser K o n z e n t r a t i o n

deut l iche , ,s t ickiness" (Verklebung) auf.

Das O p t i m u m der charakter i s t i schen Mitosest6rung liegt in menschl ichen Zellen bei einer L6sung yon 0,025 Mol/1 Aeeton. An den Prophasen is t zwar auch in dieser Konzen t ra t ionss tu fe keinerlei Abnormit~tt zu entdecken, es s ind aber fas t s~mtliche Metaphasen (40 yon 41) verKndert . Die St6rung s sich vorwiegend in einem Nachh inken einzelner Chromosomen bei der Bewegung aus der Prophase- lage in die Aqua to r i a lp l a t t e (Abb. I c - -h ) . Vielfach scheinen sie t i be rhaup t keine

Wirkung von Aceton auf die Chromosomen-Verteilung bei menschlichen Leukocyten 165

Abb. 1. a u. b Stern-Metaphase (star-metaphases) in Leukocyten nach 4stfindiger Behandlung mit 0,05 Mol/1 Aceton. c ~ Herausgezogene Chromosomen nach 4stfindiger Behandlung mit 0,025 Mol/1 Aceton. e--h Non-Congression in Leukocyten-Metaphase nach 2- und 4stfindiger Behandlung mit 0,05 Mol/1 Aceton. j Zwei Metaphaseplatten in einer Zelle nach 4stiindiger

Behandlung mit 0,025 Mol/1 Aceton

Ortsver/~nderung, sondern nur die normale Verkiirzung zu erfahren, dieses kann man aus dem weiten Abstand yon der ~quatorialplat te und der Riehtung der Arme schlie6en (Abb. 1 c und d).

Abb. l j zeigt erstmatig eine multipolare Metaphase nach E i n ~ r k u n g yon Aceton. Das diploide Genom (46 Chromosomen) hat sich in 2 J~quatorialplatten eingeordnet, ohne dal~ die Chromosomen regelm/~6ig verteilt sind. Wie aus der Abb. 1 j zu entnehmen ist, sind 2 Spindelfaser-Apparate in einer Zelle vorhanden.

Aus der Tabelle erkennt man sofort, da6 der Ubergang yon der Metaphase in die Anaphase offenbar gehemmt ist. Die Abb. 2a und b zeigen Chromosomen- Stickiness in den Anaphasestadien naeh Einwirkung yon 0,05 Mol/1 Aceton. Bei dieser Konzentration wurden in den Anaphasen immer Chromosomenbrficken beobachtet. Die Chromosomen haben die Pole erreicht, bleiben jedoch zusammen-

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Abb. 2. a u. b Chromosomenbriicken in Anaphasen nach 4stfindiger Behandlung mit 0,0375 und 0,025 Mol/1 Aceton. c Freie Chromosomen in Anaphase nach 2stiindiger Behandlung mit

0,05 Mol/1 Aceton

Tabelle. Normale und abnormale Mitosen nach 2--4stiindiger Behandlung der menschlichen Leukocyten mit Aceton

Konzentrat ion Behandlungs- Prophasen Metaphasen Anaphasen zeit

nor- ab- nor- ab- nor- ab- mal normal mal normal real normal

0,05 Mol/l 2 Std 24 - - 13 14 3 3 (0,0029%)

0,025 Mol/1 2 Std - - - - 7 52 1 - - (0,0014 % )

0,05 Mol/] 4 Std 4 - - 1 20 1 1 (0,0029%)

0,025 Mol/1 4 Std 18 - - 1 40 2 3 (0,0014 % )

Kont. 48 - - 32 - - 12 - -

h /~ngend d u r c h e ine bzw. m e h r e r e C h r o m o s o m e n b r f i c k e n . Die A b n o r m a l i t i i t d e r

A n a p h a s e be i 0 ,025 Mol/1 b e s t e h t n u r in M u l t i p o l a r i t ~ t . I n d e n m e i s t e n F a l l e n

Wirkung yon Aceton auf die Chromosomen-Verteilung bei menschlichen Leukocyten 167

Abb. 3. a Chromosomenbrficke und freies Fragment in zwei geteilten Zellen nach 4stfindiger Behandlung mit 0,025 Mol/1 Aceton. b 3 Pole, c 3 Pole und ein freies Chromosom in Leuko- cyten-Anaphase nach 2stfindiger Behandlung mit 0,05 Mol/1 Aceton. c Mehrkernige Zellen im

•bergang zur Interphase nach Behandlung mit 0,025 Mol/1 Aeeton

trennt sich die Mehrzahl der Chromosomen in 3 4 Gruppen von iihnlicher GrS~e (Abb. 3b---d). H~ufig sieht man aber auch zwei nahezu normal bipolar angeord- nete fast gleich grol~e Gruppen und daneben meistens seitw~rts einzelne sich eben trennende Chromatidenpaare (Abb. 2c). Die Zahl der Pole bzw. Chromosomen- gruppen kann bis zu 6 steigen. Aus den multipolaren Telophasen gehen mehr- kernige Interphasezellen hervor. Jede der Chromosomengruppen einer multi- polaren Ana-Telophase bildet sich also zu einem eigenen Interphasekern um, mit scharfer Umgrenzung, also offenbar einem eigenen Kernmembran und anscheinend auch stets mit einem Nukleolus. Eine Unterteilung des Cytoplasma findet w~hrend der 4stfindigen Behandlungsdauer nicht mehr start. Das weitere Schicksal dieser Kerne bzw. Zellen wurde nicht verfolgt.

Diskussion

Aceton hat eine ausgesprochen ,,merokinetische" Wirkung (Multipolariti~t) auf die Mitosen in menschlichen Leukocyten. Abnorme multipolare Anaphasen und Metaphasen sowie zweiplattige Metaphasen wurden sehr h~ufig beobachtet.

Es war in der vorliegenden Arbeit mSglich, den mehrpoligen Spindelfaser- Apparat in Metaphase zu demonstrieren (Abb. 1 j). Bei tierischen Zellen macht das Centrosom eine Reihe yon Veriinderungen durch, dadurch wird es auf seine Funk- tion bei der Zellteilung vorbereitet. In der frfihesten Prophase liegt es an der Kernmembran, und in seinem Inneren liil~t sich, wenn vorhanden, das Centriol als geteiltes, gut f~rbbares KSrnchen erkennen. Bci normaler Zellteilung teilt sich das Centrosom in zwei Teile, deren jedes ein einzelnes Centriol enthiilt. Die Hiilften

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wandern entlang der Kernmembran in entgegengesetzte Richtung auseinander und bleiben liegen, wenn der Winkel zwischen ihnen und dem Kern ungef/~hr 180 ~ betr/~gt. Die endgfiltige Lage der Centriolen bestimmt den Ort der Spindelpole. An Stelle des Centrosoms bilden die Zellen h6herer Pflanzen w/ihrend der Teilung eine Polkappe aus, die durch den Kernmembran austritt, wenn sich diese an den Polen nach innen zurfickzieht. Die Verwandtschaft oder Homologie dieser Struktur mit dem tierischen Centrosom ist aber sehr problematisch, obwohl vermutlich auch die Polkappe bei der Zellteilung mitwirkt (DAx~LINOTO~, 1939; SwA~so_<, 1960). Auf Grund der Befunde der Abb. l j und 3 b - - d k6nnte man vermuten, da$ Aceton in einem friiheren Stadium auf den Aufbau der Spindelfasern so wirkt, da$ das Centrosom sich mehrfaeh teilt, s tat t sich in zwei Tcile zu spalten. Jedes ge- teilte Centrosom wandert zu einem Pol, so da$ anstatt eines Spindelfaser-Appara- tes mehrere aufgebaut wurden.

In einer friiheren Arbeit (KABARITY, 1966) wurde festgestellt, dal~ Aceton nut den extrachromosomalen Mechanismus stSrt. Der intrachromosomale Mechanismus wurde nicht beeinflugt. Die vorliegenden Ergebnisse bestKtigen diese frfiheren Feststellungen und geben einen Beweis, wie der Chromosomal-Mechanismus be- einfluSt wird.

Merkwfirdig ist jedoch das Vorkommen yon Stern-Metaphasen bei Einwirkung von Aceton. Erstmalig wurde diese Form der Metaphase yon BARB~ und CALLA~ (1943) an Molchen (Triton) nach Behandlung mit Colehicin beschrieben: " the undivided centromeres come together at one focus with the arms of the chromo- somes radiating outwards in all directions." P~TERS (1948) land ~hnlich ausge- bildete Metaphasen ebenfalls naeh Colchicin-Behandlung bei Triturus viridescens, E~I~BERC und 0ST~I~GRE~ (1942) an Salix nach Anwendung yon Acenaphthen, Pacault, CARe~NTIER und SEINES (1947) an Zwiebeln mit verschiedenen Naphta- halin-Derivaten und L~.VA~ (1945) am selben Objekt mit anorganischen Salzen. Ferner gehSrt hierher auch der ,,Seeigeltyp", der B~RCER und WITXUS (1942) an Spinat nach Colchicin-Behandlung beobachteten.

0STE~GX~ suchte 1950 eine Erkl/~rung ffir das Zustandekommen tier Stern- Metaphase. Er nimmt an, da$ wahrscheinlich nut ein einziger Spindelpol, und zwar im Zentrum der Spindel ausgebildet wird, welcher die yon ihm ausgehenden Fasern strahlenartig naeh allen Richtungen schickt. Die Centromere aller Chromo- somen sind auf diesen Pol gerichtet, ihre Arme strahlenfSrmig yon ihm fort.. Nach den Untersuchungen yon GAVLD~ und CAX~LS On (1951 ) an lebenden Neuroblasten yon Heuschrecken unter Colehicineinwirkung kommt noeh eine zweite Erkl/~rung in Frage: Die Stern-Metaphase entsteht dadurch, da$ fiberhaupt keine Spindel gebildet wird, sondern die Centromer der Chromosomen in der gleichen dichtge- dr/~ngten Lage verbleiben, in der sie am Ende der vorhergehenden Telophase in den Kern eingeschlossen wurden.

ALTMANN und HAUBRICH (1965) geben folgende Erkl/~rung ffir die ausgebildc- ten Stern-Metaphasen in Leberze]len nach Behandlung yon M/iusen mit Colchicin : ,,Ausgestaltung und Aktivit/~t der Cytocentren werden unterdrfickt. Chromoso- menfasern kSnnen gelegentlich noch vorhanden sein. Dann werden bevorzugt monopolare lockere Steine gebildet, in deren Mittelpunkt mitunter das reduziert

Wirkung von Aceton auf die Chromosomen-Verteilung bei menschlichen Leukocyten 169

gebliebene Zentrosom nachweisbar ist. Solche Formen entwiekcln sich, ebenso wit Verklumpungen und Versperrungen unmittelbar aus der Prophase. Sic kSnnen die gesammelte und eingedickte Flfissigkeit darstellen, die bei der abnormen Kon- t rakt ion der Chromosomen freigesetzt worden ist."

Stern-Metaphasen wurden in der vorliegenden Arbeit nur bei hohen Konzen trat ionen beobachtet. Bei derselben Konzentration wurden auch Anaphasen mit Chromatiden-Brficken gefunden, i.e. alle Teilungsstadien weisen in dieser Kon- zentration (0,05 Mol/1 Aceton) Verklebungen (,,stickiness") auf. Unterhalb dieser Konzentrat ion (0,05 Mol/1 Aceton) war keine Stern-Metaphase zu linden. Von WINTERHOFF (1966) wurden Untersuchungen auf Gewebekulturen des Menschen und des Rhesus-Allen mit Cyren A, Suprarenin, Arterenol und Milchs~ure sowie Polioviren der Typen I, I I und I I I und Seren viruserkrankter Patienten dureh- geffihrt. Insbesondere bei Milehsiiure wurden auch Verklebungen und Chromo- somen-Briicken sowie Tripolare Spindeln gefunden. KABARITY und KHODARY (1967) haben ebenfalls Stern-Metaphasen, jedoeh nur durch hShere Konzentra- tionen von Conovid (Norethynodrel und 3-methoxyethinyl-Oestradiol) beobach- tat. Deswegen w~re es auch denkbar, dal~ in der Stern-Metaphase zwar eine nor- male bipolare Spindel vorhanden ist, ihre Gestalt aber nicht wie sonst breit- ellipsoid, sondern schmal strangartig ist. Dies kSnnte wahrscheinlich durch eine J~nderung der Viscosit~t des Plasma sowie des Spindelfaser-Materials als Wirkung der hSheren Konzentration der AgenslSsung bewirkt warden. PETERS (1946) stellte fest, da ] nach der Einwirkung yon Sulfanilamide an Allium Cepa-Zellen die erhShte Viskosit~tt der Matrix der Grund ffir das Zusammenhalten der Chro- mosomenarme ist. In diesem Fall w~re die Aquatorialplatte stark verkleinert und in ihr die Centromer daher dieht zusammengedr~ngt. Die Raumnot mfil~te dann zwangsl~ufig dazu ffihren, da~ die Arme der Chromosomen sehon nahe am Centromer aus der Ebene der kleinen Aquatorialplatte nach beiden Seiten heraus- gedrfickt werden. Wenn die Chromosomenarme noch dazu infolge starker Spira- lisierung steif und gerade sind, resultiert zweifellos ein sternfSrmiges Abspreizen, d.h., Stern-Metaphasen sind keine spezifischen Wirkungen des Acetons, sondern sie treten durch die Applikation yon hohen Konzentrationen der AgenslSsungen ein.

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170 A. KABARITY: Wirkung yon Aceton auf die Chromosomen-Verteilung bei Leukoeyten

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Dozent Dr. A. KABARITY Institut fiir Humangenetik und Anthropologie 4 Dfisseldorf, UlenbergstraBe 127

VII Latin American Congress of Pathology and II Panameriean Meeting of the International Academy of Pathology

November 2C--27, 1969

will be held in the c i ty of Buenos Aires, Argent ina .

I n fo rma t ion abou t i t can be ob ta ined wr i t t en to :

Pro/essor Dr. Mauricio Rapaport, Montevideo 945. Buenos Aires, Argentina