1

Western Blot Tips and Tricks Filling the Gap Between Art and Science 

Webinar July 30, 2014 

 [0:00:00]  Slide 1  Sean Sanders:  Hello everyone and a very warm welcome to the Science/AAAS webinar, 

My name is Sean Sanders, Editor for Custom Publishing at Science, and I'll be the moderator for today's webinar. 

   In  today's  event,  we  will  be  investigating  the  art  and  science  behind 

Western  blotting,  a  technique  used  in  practically  every  life  science's laboratory by  thousands of  scientists worldwide. Despite  its popularity, the method remains as much of a skilled art as a science and  is often a significant challenge to produce reproducible and reliable results. 

   Our three expert panelists in the studio today will give us their hints and 

tips  of  how  to  get  the  best  possible Western  blot  data  using  current techniques as well as take a glimpse into the future of how technological advances could bring the needed standardization to Western blotting. 

   It's my pleasure to introduce those speakers to you now. They are to my 

left Prof. Pier Giorgio Righetti from the Polytechnic University of Milan in Milan,  Italy; Dr.  Biji  T.  Kurien  from  the University  of Oklahoma Health Sciences  Center  in  Oklahoma  City;  and  Dr.  Nick  Thomas  from  GE Healthcare  in Cardiff, Wales. A warm welcome  to all of you! Thanks  for being with us. 

   Before  we  get  started,  I  have  some  important  information  for  our 

audience. Note  that you can  resize or hide any of  the windows  in your viewing console. The widgets at the bottom of the console control what you see. Click on these to see the speaker bios or to download a PDF of the slides. 

   Each  of  our  guests  will  give  a  short  presentation  followed  by  a  Q&A 

session during which  they will  address questions  submitted by our  live online  viewers.  So  if  you're  joining  us  live,  start  thinking  about  some questions now and submit them at any time by typing them into the box 

2

on  the  bottom  left  of  your  viewing  console  and  clicking  the  "submit" button. 

   If you can't see this box, click the red Q&A widget at the bottom of the 

screen. Please do  remember  to keep your questions  short and concise. That will give them the best chance of being put to our panel. 

   You can also log in to your Facebook, Twitter, or LinkedIn accounts during 

the webinar  to post updates or  send  tweets about  the event.  Just click the relevant widgets at the bottom of the screen. For tweets, you can add the  hashtag  #ScienceWebinar.  Finally,  thank  you  to  GE  Healthcare  for sponsoring today's webinar. 

   Before  I kick off the presentations,  I'd  like to put up a quick poll for our 

viewers. Please make your choice now and click the submit button. We'll come  back  to  the  results  of  the  poll  during  the  Q&A  portion  of  the webinar. Now,  I'd  like  to  introduce our  first  speaker, Prof. Pier Giorgio Righetti. 

   Prof.  Righetti  is  a  full  professor  of  Proteomics  at  the  Polytechnic 

University of Milan. He is on the editorial board of numerous journals and has co‐authored a 2013 book on proteomics with Dr. Egisto Boschetti.  

   Some  of  the  technologies  developed  by Dr.  Righetti  include  isoelectric 

focusing  in  immobilized  pH  gradients, multicompartment  electrolyzers with  isoelectric  membranes,  membrane‐trapped  enzyme  reactors, temperature‐programmed  capillary  electrophoresis,  and  combinatorial peptide ligand libraries for detection of low‐abundance proteome. 

   Recently,  Dr.  Righetti  won  the  2014  HUPO  Award  for  Distinguished 

Achievements in Proteomic Sciences. A warm welcome, Prof. Righetti!  Slide 3  Dr. Pier Righetti:  Thank you, Sean, and thanks to all of you for being with us today. I think I 

would try to tackle this topic  from a perhaps unexpected point of view, which  is  basically  that  I  believe  that  one  of  the  major  problems  in Western blotting is the protein load. 

 Slide 4    We  typically  work  with  loads  as  low  as  1  nanogram,  even  below  0.1 

nanogram, which  is  the  detection  limit  of  silver  staining.  At  such  low loads, blots can be poorly reproducible due to antigen losses even during 

3

the sample preparation, losses due to adsorption onto glass and plastics, losses  due  to  adsorption  even  to  the  polyacrylamide  gel  fibers,  and incomplete electrophoretic transfer, of course. 

   Due  to  these  accidents,  it  is  no wonder  that  trace  antigens  have  very 

small chances to be detected.  I think there could be a solution to  it and this  remedy could be sample pre‐fractionation, which  is something  that people often overlook, but we  in proteomic science do have  two major methods for reduction of the sample dynamic range. 

 Slide 5    Remember,  the sample dynamic  range  in any of your sample can be as 

much as ten orders of magnitude, which is really a huge, huge interval. So we have two methods, one called the Subtraction Approach by which we take a serous of 20 or even many more anti‐sera. We try to remove the most  abundant  proteins  and  I  believe  there  are  quite  a  few  problems with that. 

   The  other  approach  is  the  Enrichment  Approach  by  which  we  try  to 

enrich  categories  like  phosphoproteins,  glycoproteins,  and  the method we have is more ecumenical. 

 [0:05:09]    It's  broader. We  try  to  accept  every  protein  in  your  sample  and  this 

method that we developed is called combinatorial peptide ligand library. This method allows you for instance to handle very large volumes of your sample. We have even treated up to 1 liter volume. 

   And  it  acts  simultaneously  by  reducing  the  high‐abundance  proteins 

which are pestilent  in  the detection of any  low‐abundance species, and simultaneously enriching  the  low‐abundance proteins. Often we  get an increment  of  visibility  for  these  low‐abundance  species  up  to  three, sometimes even four orders of magnitude. 

   So what  is  the chemistry of  these combinatorial peptide  ligand  libraries 

and what is their action mechanism? We will see it in this slide.  Slide 6    This  chemistry, we  prepare  them  by  a  combinatorial  chemistry,  so we 

hook  20  different  amino  acids  to  these  polymethacrylate  beads  via  a 

4

spacer and a  linker, and  it's a classical Merrifield chemistry, except  that it's on combinatorial. 

   At the end of the process, we make only six amino acid  long peptide, so 

we  only work with  hexapeptides,  but  these  hexapeptides  could  be  as many as a diverse, huge population, as many as 64 million diverse baits, each one  to collect and hook on  to a  specific protein. So, how do  they function? Here it is. 

 Slide 7    Basically, you  take your  sample, which has a broad, very  large dynamic 

range  and  you  load  it  not  necessarily  into  kernel. We  can do  it  batch‐wise.  You  can  take  any  volume  and  drop  tiny  amounts  of  beads. Sometimes, we work with  only  100 microliters  of  beads.  You  let  them equilibrate  for  a  couple  of  hours  then  we  wash  out  the  excess  of whatever that's not been bound under native conditions. 

   And  then  under  denatured  conditions, we  collect  the  sample  that  had 

been bound. So as you can see  in the  lower right, the dynamic range of the collected sample  is much, much different from the  initial sample, so you have a much higher chance to see the low‐abundance components. 

 Slide 8    Now, to explain better this mechanism of action, when these samples are 

incubated with the beads, the high‐abundance proteins quickly saturate your  specific  ligands,  which  means  that  we  only  capture  a  tiny,  tiny amount  of  the  high‐abundance  species.  The  remaining  gets  lost  in  the washing process, whereas the  low‐abundance species could be enriched on  a  specific  ligand  bead.  And  so,  you  can  get  as much  as  you want provided you give to the beads larger and larger volumes of your sample. That's the way. 

 Slide 9    Finally, what you end up is this situation. The initial situation you can see 

in the upper graph to the right. We have these huge peaks, which are the high‐abundance  proteins,  which  obliterate  the  signal  of  the  low‐abundance proteins, and the valleys are the low‐abundance components.  

   The valleys are enormous as compared to the peaks in polydispersity. At 

the end of this process, if you're lucky, we try to bring the vast majority of our  proteins  within  the  range  of  detection  of  your,  let's  say,  mass 

5

spectrometer, blotting units, Western blotting and  so on,  so  this  is  the real mechanism. Now, let's see how they work. 

 Slide 10    Let me show you. This is a nice example. We took human serum in which 

we believe that the dynamic range could be 12 orders of magnitude and we spotted it with 1 to 160 nanograms per microliter of serum amyloid A. What you see in these eight panels are tiny sections of 2D maps taken in the  lower  range  of  masses  and  acidic  ranges.  As  you  can  see,  zero nanogram  is  the  control  and  then  you  see  the  different  notes  from  1 nanogram to 160 nanograms. 

   You  can  easily  see  that  you  begin  to  see  something  at  a  load  of  10 

nanograms. You  see  these  red  circles. 20 nanograms are visible and  so on, but below 10 nanograms, we essentially don't see anything. 

 Slide 11    Now,  the  same  one,  the  same  serum  treated with  these  combinatory 

ligand  libraries,  look at  that.  I want you  to  look at  the  second panel, 1 nanogram. You see already how visible are these spots. 

   The second spot is so dense that in reality ‐‐ let's go back ‐‐  Slide 10    It's as dense as the 80 nanogram load, which means that basically ‐‐  Slide 11    And  then  you  see  a  constellation of  spots  all  around because  you  also 

enhance  the  visibility  of  other  low‐abundance  species.  So  you  can  see that by this technique, we enhance the visibility of your  low‐abundance species by perhaps close to two orders of magnitude. 

 [0:10:09]    Now, let us go to another real sample.  Slide 12    This  is  a  sample  trying  to  detect  allergens  in maize  kernels. Maize  has 

been  introduced to Europe 500 years ago and yet up to today, only one 

6

allergen had been  identified, which  is the  lipid transfer protein, which  is ubiquitous. You can find it anywhere. We thought it is impossible that it is just  a  single  allergen,  so  we  treated  this  maize  extract  with  our combinatorial ligand libraries. 

   As you can see from these three other panels, which are blot to the right 

with  these  red  circles, we  could  identify many more allergens  that had been  invisible before and we  identified five more. So we went from one to  six  ‐‐  Vicilin,  globulin‐2,  endo‐chitinase,  thioredoxin  and  trypsin inhibitor.  And  here  on  the  left,  you  can  see  the  Coomassie  stain,  SDS monodimensional profile, and different blots for different patients. This is just one example. 

 Slide 13    Now,  let me  show  you  ‐‐ we did  recently  some  tropical  fruits  and  it  is 

interesting. For  instance,  in avocado, only one antigen had been known, Pers  a  1.  Here  you  can  see  the  blots,  immunoblots  from  16  different patients extracted in two different conditions, either phosphate buffered saline or TUC, which is thiourea, urea and CHAPS. You can see the bands of the reacted allergenic proteins. 

   After this combinatorial  ligand treatment, we could detect not  just one, 

this Pers a 1, but  five more allergens  ‐‐ profilin, a polygalacturonase, a thaumatin‐like  protein,  a  glucanase,  and  an  isoflavone  reductase‐like protein. You can see a big jump from one to six, one to seven and so on, so  it  really  shows  that  this  technique  has much  to  offer  in  terms  of detecting antigens and allergens in your sample. 

 Slide 14    This is another example, a banana. In a banana, there were five allergens 

already reported, which are called Mus a 1, Mus a 2, Mus a 3, Mus a 4, and Mus a 5. Of course, we detected all of  them, but additionally after the combinatory  ligand  library  treatment, we could detect another  two allergens  that have been previously unreported, a pectinesterase and a superoxide dismutase. 

   I would also like you to notice that as much as we enhance the visibility of 

allergens, we also enhance the visibility of plenty of other low‐abundance proteins that had never been reported up to present time. 

   So  for  instance,  the control, untreated one,  this violet bar  that you can 

see, we could only detect 452 unique gene products, unique proteins. But 

7

after  this  treatment, we  could  detect  849,  so  about  twice  as many  as compared  to  the  control. That  tells you  the power of  this  technique  in detecting everything, not just allergens and antigens, but any other  low‐abundance species. 

 Slide 15    Now, the  last example I want to show you  is this mango. Mango, as you 

know,  is  a  tropical  fruit  and  it  is  used  a  lot  in  the  kitchens  in  Eastern countries and so on. 

   In mango,  very  little was known. There were essentially no  reports, no 

studies on that. Again, what  I want to show you  in the control, we took the pulp. We homogenized  it. We extracted  it.  In the control, untreated sample, we could detect only 374 proteins, but after the treatment with this combinatorial peptide  ligand  library, we could detect close  to 3000 proteins. So here, we have an increment of visibility of almost one order of magnitude, which is quite unique. 

   And then in terms of allergens, no allergen had been reported so far, but 

after this treatment, we could detect of course the lipid transfer protein, which  is  as  I  told  you  a  universal  allergen  found  in  any  type  of  food, essentially superoxide dismutase, germin‐like protein and profilin, so we could  detect  at  least  four  allergens. Maybe  there  are more  that  have escaped our dictation, but still it's a big step forward. 

   I would like to finish my brief presentation by telling you that sometimes, 

you have the feeling especially in this field of Western blotting where so many  problems  are  reported  and  will  be  treated  by  the  other  two speakers. 

 [0:15:01]  Slide 16    Sometimes or even most of the time, you have the feeling that your prey 

is escaping capture, and here  is a nice presentation. This pig  is trying to escape that sentence. And so, if you don't capture your pig, you will end up with an empty dish. You will have  to  skip your meal, which  is what happens most often. 

 Slide 17  

8

  Now, maybe we have a remedy for you. This is the cover of the book that we  wrote  together  with  Egisto  Boschetti.  This  book  deals  very,  very extensively with this topic and it has ‐‐ at the end of it, there are 50 pages of  protocols,  so  any  protocol,  steps  and  procedures,  including  some protocols in Western blotting, so maybe this will be your lifesaver. Thank you so much for your attention. Thank you. 

 Sean Sanders:  Great! Thank you so much, Prof. Righetti.  Slide 18    Our second speaker  for  today  is going  to be Dr. Biji Kurien. Dr. Kurien's 

research  interests  include the study of free radical, mediated damage  in systemic lupus erythematosus and Sjögren's syndrome as well as the role of the nutraceutical curcumin in autoimmune diseases. 

   His  publication  record  includes  numerous  publications  in  national  and 

international  peer‐reviewed  journals.  In  addition,  he  co‐edited  two volumes  entitled  "Protein  Blotting  and  Detection  and  Protein Electrophoresis" as part of the Methods in Molecular Biology series. 

   Welcome to you, Dr. Kurien.  Slide 19  Dr. Biji Kurien:  Thank  you,  Sean.  It's  a  privilege  to  be  here  today  for  this  Science 

Webinar, as well as to participate alongside Dr. Righetti and Dr. Thomas. I'm grateful to you, AAAS and GE, for the invitation to present on tips and challenges in Western blotting. 

 Slide 20    Western  blotting  involves  the  transfer  of  protein  patterns  from  gel  to 

microporous membranes. Electrophoretic transfer was first described by Dr. Harry Towbin and then later by Dr. Neal Burnette. Dr. Burnette coined the  term  Western  blotting  to  retain  the  geographic  naming  tradition initiated by Dr. Southern's paper.  

 Slide 21    There are several advantages of transfer to membrane. Wet membranes 

are  pliable  and  are  easy  to  handle.  This  allows  easy  accessibility  of proteins  immobilized  on  membrane  to  different  ligands.  Only  small amount of reagents are required for transfer analysis. 

9

 Slide 22    It is possible to obtain multiple replicas of a gel. This allows for prolonged 

storage of  transferred patterns. The  same protein  transfer  can be used for multiple successive analyses. 

 Slide 23    There are three kinds of Westerns ‐‐ the good, the bad, and the ugly.  Slide 24    One can take several steps to obtain a good Western blot. This  includes 

proper  sample  preparation,  the  choice  of  right  lysis  buffer,  proper  gel preparation, right electrophoresis and transfer conditions. 

 Slide 25    When one prepares samples from cultured cells,  it  is customary to wash 

the cells with PBS to remove cell culture media. It is important to remove PBS completely prior to cell  lysis. This  is because salt contamination can cause horizontal streaking in two‐dimensional gel electrophoresis. 

 Slide 26    To eliminate viscosity  from DNA  in  crude  cell extracts,  it  is essential  to 

treat  cell  extracts  with  protease‐free  nuclease.  This  can  also  be accomplished by sonication or vigorous vortexing of heated sample. 

 Slide 27    There are several lysis buffers to solubilize proteins. Laemmli lysis buffer 

has  been  used  to  solubilize  cell  extracts  for  SDS‐PAGE.  Urea/thiourea containing  lysis  buffer  has  been  used  to  solubilize  proteins  for  two‐dimensional gel electrophoresis. This buffer has been especially found to be  useful  to  solubilize  small  HR  proteins.  Radio‐Immune  Precipitation Assay  buffer  has  been  found  to  be  useful  to  solubilize  smooth muscle proteins. One can also personalize  lysis buffer  to  solubilize a protein of one's own interest. 

 Slide 28  

10

  SDS to protein ratio, 1.4 microgram of SDS binds to 1 microgram of most proteins. It is better to have excess SDS compared to protein sample. Dr. Hames recommends SDS to protein ratio of 3:1. Therefore, it is important to  determine  protein  concentration  to  prevent  inadequate  protein  to sample buffer ratios. 

 Slide 29    SDS does not unfold  certain proteases. Therefore,  it's essential  to heat 

sample soon after adding lysis buffer. This avoids protein degradation by proteases. A very small amount of protease can degrade proteins  if  the sample is not heated soon after adding lysis buffer. 

 [0:20:06]  Slide 30    Do not heat sample with lysis buffer at 100 degrees centigrade for more 

than  five  minutes.  This  is  because  the  aspartyl‐proline  bond  is  most susceptible  for  cleavage by heat and acidic  conditions. Heating  it at 75 degrees centigrade for five minutes avoid bond cleavage. It also helps to inactive proteases. 

 Slide 31    Heating  with  SDS  lysis  buffer  alone  may  not  solubilize  proteins  or 

membrane proteins. One may need to add 6 to 8 mole urea or Triton X‐100  for  this  purpose.  Insoluble material  should  be  removed  by  a  high speed spin for a couple of minutes. This will help avoid streaking within gel. 

 Slide 32    Protein  aggregates  can  form  in  SDS  samples. This  is because  reductant 

becomes  partly  oxidized  upon  cooling  sample,  letting  part  of  the cysteines unprotected. This can lead to back‐folding and creation of inter‐polypeptide  aggregates  which  can  in  turn  lead  to  blurred  zones  and formation of double bands. 

 Slide 33    Cooling sample of about 60 degrees centigrade and adding an alkylating 

agent  avoids  this  problem,  which  can  lead  to  sharper  bands  and abolishment of artifacts. 

11

 Slide 34    Miscalculating cross‐linking factor. The pore size of a polyacrylamide gel 

is  dependent  on  two  factors,  (a)  the  total  concentration  of  acrylamide referred to as "T", and (b) the degree of cross‐linking referred to as "C". We mistakenly assume that given total acrylamide concentration T is the percentage  of  acrylamide  per  volume,  and  C  is  the  percentage  of  bis acrylamide per volume. 

 Slide 35    To avoid this, one can calculate percent T or percent C by the  following 

formulas. T = [(a+b) x 100] / v; C = (bx100) / (a+b) where "a"  is equal to the  mass  of  acrylamide  in  grams,  "b"  is  equal  to  the  mass  of  bis acrylamide  in grams, and  "v"  is equal  to  the volume. Alternatively, one can  use  commercially  available  acrylamide/bis  acrylamide  solutions  for making gels. 

 Slide 36    Overloading  and  underloading  are  the  two  commonly  encountered 

problems  in  electrophoresis.  Overloading  leads  to  distorted  bands  in lane, as well as in adjacent lanes. Underloading leads to poor detection of minor bands. 

 Slide 37    It  is not necessary  to  adjust  the pH of  the  running buffer  in  SDS‐PAGE 

even though the pH is above 9. Adjusting pH to 8.3 leads to higher load of chloride, which leads to longer protein separation times and some zones remain poorly resolved.  

 Slide 38    It  is  best  to  polymerize  SDS‐PAGE  overnight  at  room  temperature  to 

ensure complete polymerization. However, Dr. Haeberle described a gel with greatly accelerated rate of polyacrylamide cross‐linking. One can run this gel  in a dramatic fashion  in five minutes using the Haeberle running buffer heated at 70 degrees centigrade. 

 Slide 39  

12

  It  takes  about  two  to  four  hours  to  run  a  standard mini‐gel. We  have found that it is possible to run a pre‐cast gel in ten minutes using heated Laemmli running buffer. The next couple of slides will show very recent results,  actually,  the  results  we  got  about  the  day  before  yesterday evening showing that electrophoresis, Western blot, and immunoblotting can be accomplished in a few hours with actual run time of 60 minutes. 

 Slide 40    This slide shows the Western blot of protein marker. The pristine protein 

molecular weight marker was electrophoresed on a 4%  to 20% precast gel  in  ten minutes and  transferred  to nitrocellulose membrane  in seven minutes using a  semi‐dry  transfer  system. Lanes one  to  four  shows  the molecular weight markers. 

 Slide 41    This slide shows the result of an ultra‐fast bovine La immunoblot. Bovine 

La,  purified  bovine  La  was  purchased  from  ImmunoVision  and  this antigen was electrophoresed on a 4% to 20% pre‐cast gradient gel in ten minutes and transferred to membrane in seven minutes. 

   The subsequent immunoblotting steps were all carried out at 37 degrees 

centigrade. All the reagents were pre‐warmed to 37 degrees centigrade prior  to  adhesion  to  the membrane.  The membrane was  blocked with milk for ten minutes and then incubated with a primary antibody for ten minutes.  The membrane was  then washed  three  times with  deionized water and three times with TBST all in three minutes. 

 [0:25:05]    Then  the  membrane  was  incubated  with  secondary  antibody  for  ten 

minutes and washed as described previously for three minutes. Then the NBT/BCIP mixture was  added  and  the  bands  appeared  in  less  than  30 seconds. 

   Another  antigen  was  experimented  similarly  and  the  results  obtained 

were  only  the  positive  control  bound;  the  negative  and  the  conjugate control  did  not  bind.  This  result  shows  that  the  entire  process  of electrophoresis, Western blot, and  immunoblot  can be  carried out  in a very rapid manner. 

 Slide 42  

13

  There are  two  types of  transfer buffers, Towbin  transfer buffer and  the CAPS  buffer  system.  Towbin  buffer  system  contains  Tris,  glycine, methanol,  none  to  0.01%  SDS.  CAPS  buffer  system  contains methanol, CAPS at a pH of 11. This buffer is used to transfer proteins to PVDF prior to in situ blot sequencing. 

 Slide 43    Transfer buffers without SDS are better. This is because proteins can pass 

through  the  PVDF membrane  in  the  presence of  SDS. However,  SDS  is required during transfer of proteins that have a tendency to precipitate. 

 Slide 44    Methanol  in  the  transfer buffer helps  in  stripping SDS  from proteins.  It 

stabilizes the geometry of the gel during transfer. It increases the binding capacity of nitrocellulose from protein and helps proteins to bind better to nitrocellulose. 

 Slide 45    Transfer  buffer  without methanol  is  useful  to  transfer  high molecular 

weight proteins,  for  transferring conformation  sensitive antibodies, and when enzyme activity needs to be preserved. However, the drawback  is that PAGE gels tend to swell  in  low  ionic buffers. The bands tend to get distorted if the swelling occurs during transfer. 

 Slide 46    When  blotting  proteins  from  SDS‐PAGE,  the  proteins  are  eluted  as 

anions. Therefore, the membrane should be placed on the anode side of the gel. It is important to remove bubbles trapped between nitrocellulose and  gel  to  prevent  bald  spots.  The  gel  plus  filter  plus  pads  assembly should  be  tightly  held  together  to  ensure  good  transfer  and  no  band distortion. 

 Slide 47    Do not exceed the binding capacity of membrane because excess protein 

can  get weakly  associated with membrane  and  is  readily  accessible  to antibody. However,  the ensuing protein‐antibody complex will wash off in the subsequent immunoblotting steps leading to reduced signal. 

 Slide 48 

14

   High molecular weight proteins transfer very poorly. This can be avoided 

by  using  reversible  gel  cross‐linkers  followed  by  gel  depolymerization prior to Western blot transfer, limited protease digestion during transfer, prolonged  transfer with addition of SDS, and heat mediated  transfer  in tank buffer systems. 

 Slide 49    Low  molecular  weight  proteins  tend  to  bind  with  low  affinities  to 

membrane. Such proteins can be lost during transfer or washing. This can be  avoided  by  cross‐linking  proteins  to membrane,  and  the  use  of  0.2 micrometer membrane can  reduce  the phenomenon of "blow  through" through which these proteins can be lost. 

 Slide 50    To  conclude,  Western  blotting  is  a  simple  method.  The  potential  of 

Western blotting has greatly evolved. There are huge numbers of ways to transfer  proteins.  This  method  has  led  to  a  deeper  understanding  of protein  ligand  interaction.  This  concludes my  presentation.  Thanks  for listening. 

 Sean Sanders:  Thank  you  so much, Dr. Kurien.  Just  a  reminder  to  those watching  the 

webinar  that  I  know  there  was  a  lot  of  information  on  those  slides. Thanks, Dr. Kurien, for putting all of that together, a lot of great advice. If you want to download a PDF of the slides,  just click the green widget at the bottom of your screen labeled "resources list" and you can get a PDF right there. 

 Slide 51    We're going to move on to our final speaker now. That's Dr. Nick Thomas. 

Dr.  Thomas  is  currently  a  principal  scientist  in  Life  Sciences  at  GE Healthcare based in Cardiff, Wales. In a 30‐year career in industry, he has held a number of positions  in Operations, Marketing, and Research and Development. 

   He  is  the  inventor  or  co‐inventor  of  over  60  patents  covering  a wide 

range of  technologies  including microfabrication, molecular and cellular sensors, and cellular  imaging. Dr. Thomas received the GE Edison Award for contributions  to  research and development  in 2012 and  is currently an honorary visiting professor at Cardiff University. 

 

15

Slide 52    Welcome, Dr. Thomas. Thanks for being here.  Dr. Nick Thomas:  Thanks, Sean.  It's great  to be here. So our previous  two  speakers have 

given you some great technical tips and information about how to get the best out of your Western blotting. I'd  like to spend a few minutes giving you my perspective of 30 odd years of doing Western blotting in various guises and where I think the technique is going in the future. 

 [0:30:08]    It  seems  somewhat  strange  to  me  to  think  back  to  when  I  started 

Western  blotting.  At  that  time,  blotting  was  a  standard  method  for detecting  not  just  proteins,  but  also  DNA  and  RNA  and  Southern  and Northern  blots.  Of  course,  PCR  has  killed  all  of  that.  So  I  guess  until somebody  gets  a Nobel Prize  for working out how  to  amplify proteins, we're still going to be doing Western blotting for some time. 

 Slide 53    As Sean said in the introduction to the webinar, Western blotting is a very 

widely  used  technique  in  many  labs  worldwide  and  there's  a  huge amount of  information and data published every day on  the  technique. It's still a key technique for  looking at protein expression, characterizing proteins,  and  looking  at  post‐translational  modifications  like phosphorylation. 

   But despite  its widespread use around the world  in different  labs, all of 

those  different  labs  tend  to  use  different  workflows.  Even  different people within  the  same  lab will  use  different workflows  and  that  has potential to have quite significant variability in data, and the technique is highly  dependent  on  skill  and  experience,  and  probably  about  one  in four, one in five Western blotting experiments don't get too good results. 

 Slide 54    So  there's obviously,  I  think, need  for  improvement. One  thing  is  to get 

around  common errors  that people make or  things  that happen during the course of their experiments. I've put together a row of gallery on the right  hand  side  of  this  and  it  shows  some  of  the  common  things  that happen when people are doing their Western blotting experiments when they're  in  a  hurry  to  get  data  for  publication  because  the  lab  boss  is screaming at them for that data. 

16

   Everybody will recognize things on this, I guess, that's happened to them, 

things  like the one  in the top  left there. You've run your gel. You've cast your gel or you've run your gel. You've got a nice gel then you go on to put  your  blotting  stack,  so  you  very  carefully  put  your  blot  and  gel together, get all the bubbles out. You don't crack the gels. You put  it  in the blotter and  then you connect  the  stack  the wrong way around and you wave goodbye to your sample. 

   As I said, I think there are areas that need improving in Western blotting, 

standardizing, improving the reproducibility of the process, getting better quantitation, simplifying the workflow, basically to get it right every time and basically to free up research time. 

 Slide 55    So in terms of my experience, as I said, I started a long time ago. In those 

days,  we  were  using  colourimetric  detection,  DAB‐HRP  detection  on nitrocellulose. At that time, I was and still am a very keen photographer. We  published  a  number  of methods  adapting  photographic  processing techniques  to  Western  blot  processing,  improving  the  background, reducing reagent usage. 

   At  that  time, my  group  also  developed  the  first  pre‐stained molecular 

weight markers for SDS‐PAGE in Western blotting and we worked on the first commercial ECL detection system. 

 Slide 56    I mentioned I'm a keen photographer. This  is Ansel Adams, an American 

photographer  and  in my  opinion,  and  I  guess  in  the  opinion  of many people,  the greatest  landscape photographer  that's ever been. The key thing that made Ansel Adams so well‐revered is basically summarized by this quote from him. "You don't take a photograph; you make it." 

   Here's a picture of him taken  in the 1940s with a plate camera about to 

expose. Basically, his photography was not about  taking photos  just by pressing the shutter button. He had a very standardized, rigorous process from  visualizing  the  image  that  he  wanted,  going  to  the  location, exposing his film correctly, exposing the prints correctly, a very complex, standard way of making prints, which  I  think has  a  lot of  commonality with Western blotting. 

 

17

  Western blotting, I think, starts with the time at which you visualize your experiment.  You  visualize  what  type  of  data  it  is.  You  plan  your experiment.  You  go  through  the  process  and  then  you  interpret  your data. And the real skill in Western blotting, I think, the science in it is that at the beginning of the process, visualizing and planning your experiment, and at the end of the process, interpreting the data. That's where the skill comes. The bit in the middle, really it's cookery in my opinion.  

 Slide 57    So  let's  look at  the parallels between  the evolution of photography and 

the  evolution of Western blotting.  This  slide  illustrates basically what  I was doing when  I  first started processing black and white prints 30 odd years  ago.  You  start  with  film.  You  go  through  a  whole  series  of operations, which are basically sloshing stuff around  in chemicals.  I can see the similarity to Western blotting there and you end up with a print. 

 [0:34:59]    I still got a  lot of the contact sheets and the prints that  I made  in those 

days  in filing cabinets. I still get them out and  look at them occasionally, but the processing trays that I used to develop those contact prints have now no use and they now in fact make very good snow shovels. 

 Slide 58    Nowadays, like many photographers, I've converted entirely to digital, so 

I can go from a digital raw negative in a camera on location, take that raw negative into a computer, process it, using many of the same techniques that I used for wet chemistry in developing. I can change the contrast. 

   I can selectively dodge and burn different areas, but the key thing is what 

digital gives you, it frees you from that tyranny of the dark room. You can establish  a  reproducible  workflow.  As  illustrated  here,  I  can  go  from Adobe light room straight into a final process print, which then gets sent off to a publisher for a magazine cover. 

 Slide 59    That evolution,  I  think,  is very  similar  in many ways  to  the evolution of 

Western blotting from 20th Century techniques if you like to 21st Century techniques. 

 

18

  We started, as  I mentioned, colourimetric detection using either HRP or alkaline phosphatase on nitrocellulose membranes, then we moved on to chemiluminescent  detections,  better  membranes  on  PVDF,  and  the advent of imagers and scanners and so on replacing in a lot of case X‐ray film and  it brings much better quantification, which  is really what  it's all about.  That's  really  in  the  end  what  a  Western  blot  is  to  do,  is  to measure.  Okay,  something  is  present,  but  it's  much  better  to  know quantitatively home much is there. 

   And  if  we  move  into  the  more  recent  history,  moving  from  film  to 

detection  to  digital  imaging,  using  fluorescence  labels  to  do Western blotting, and that's brought out a lot of techniques which basically when I started weren't dreamed of, the ability to do multiplexing in two or three colors to ask much more complicated biological questions. 

 Slide 60    If we  just  touch on a couple of  technical aspects, here  I'm showing you 

improvements  in dynamic  range using solid state CCD detectors against X‐ray film, so you get a much wider dynamic range with CCD imaging. And as I mentioned before, using fluorescence has a great advantage of doing multiplexing. 

   In this example shown on the right, you can  look at the amount of ERK, 

but you can also use a housekeeping protein such as GAPDH to normalize within your bands. 

 Slide 61    You can take that a stage further. Showing here on the left hand side, the 

measurement  of  ERK,  phosphor  work  [Phonetic]  and  a  housekeeping protein. As  I  said  before,  that  type  of  experiment  gives  you  very  good quantification of  the  involvement of  a protein  and  a  signaling pathway within a cell that you couldn't have dreamed of or even attempted to do using standard techniques that we had years ago. 

 Slide 62    So  in  terms  of Western  blotting  evolution,  I  think  it's  really  poised  for 

evolving  to  its next stage and  that will be  taking all  the  types of  things, the  sample  preparation,  the  electrophoresis,  the  blotting,  everything that's shown on the right hand side there, and going through a process of systems  integration  basically  aiming  to  get  protocols  that  are standardized, quantitative and smart and free up science. 

19

 Slide 63    Basically,  just  to  conclude,  I  think  that  systems  integration,  which  is 

coming  very  quickly  I  think  now,  streamlining  the workflow,  removing those  errors,  those  opportunities  for  errors  that  I  showed  you,  still providing  light digital photography,  the artistry. You still need  the same skills.  Now,  it's  an  often  used  maxim  that  digital  cameras  or  better cameras don't make you a better photographer, and  that's exemplified by all the rather bad images that you can see on the web these days from camera phones. 

   So basically, systemizing but basically allowing the skills of a scientist still 

to be applied at the important place, which is at the beginning, I think, in the design of the experiment and in the interpretation, which is all about better science in the end. 

 Slide 64    I  think  all  of  that  will  come  into  a  systemized  workflow  and  as  a 

byproduct, you'll have a better place for your lab goldfish to hang out.  Slide 65    So with that, I'll finish. Thank you for your attention.  Sean Sanders:  Great!  Thanks  so  much,  Dr.  Thomas,  and  many  thanks  to  all  of  our 

speakers for the great presentations.    Before we move on  to questions  submitted by our online  viewers,  I'm 

going to give everyone a final chance to answer our poll, which should be up  in your slide viewer right now. Give me one second.  I think  it should be coming up for you. 

 [0:40:01]    So  just  click  on  the  answer  that  you would  like  to  choose  and  hit  the 

"submit" button and it should get through to us. We'll look at those poll results in a minute. 

   For those watching us live, you can still ask questions by typing them into 

the text box and hitting the "submit" button. If you don't see the text box on  your  screen,  just  click  the  red Q&A  icon and  it  should appear.  Let's take a look at our results. I'm going to send those out to the audience.  

20

   Well,  it seems  that about 26% of our audiences  think  it's simply an art, 

18%  is science, 8% a burden, and 46% all of  the above.  I guess  I would expect something like that. I think we all agree that it's a bit of an art and a science, but it seems that for a lot of people, it's also a burden. 

   Maybe  I  can  ask  each  of  you  very  quickly  to  talk  about  when  you're 

looking  at  a Western  blot  protocol,  what  do  you  think  are  the most critical  steps  for  somebody  either  starting  a  Western  developing experiment  or  who's  had  some  experience  should  be  looking  at?  Dr. Righetti? 

 Dr. Pier Righetti:  I think that just about all the steps are critical  in a way, but I repeat, my 

personal view is that if you don't enhance somehow the concentration of your highly diluted antigen by any technique, of course, we suggest the combinatorial  ligand  library,  but  often  you  have  to  concentrate  it somehow  by  a  factor  of  one  to  two  orders  of magnitude.  Then  your Western blot likely will succeed. That's my personal feeling. 

 Sean Sanders:  Dr. Kurien?  Dr. Biji Kurien:  I believe that every step is critical for getting a good Western blot result. 

However, if I was to pick two important aspects, I would say the position of the membrane during the transfer, if you mess up that, you lose all the proteins. Finally, if you add the wrong conjugate, then you get nothing. 

 Sean Sanders:  No signal, right. Dr. Thomas?  Dr. Nick Thomas:  They're all important in that if you make a mistake in any of them, you'll 

ruin your experiment. I think my view is that the very first step is the key one, and that's the design of your experiment.  I think that's where a  lot of the scientific skill comes in, and also at the end in the interpretation. 

   The other thing I would say is yes, all the processing steps, the detection 

steps,  the best  thing  to do  is  to  standardize  those and  to use  the best techniques  available  for  each  step,  and  then  have  the  effective technique. 

 Slide 66  Sean Sanders:  Excellent!  Great  advice.  I'm  going  to  get  on  to  some  more  specific 

questions  that we've  had  come  in.  Let me  start maybe with  you,  Dr. Kurien.  I've had a number of questions about handling  large proteins.  I 

21

know that it was something that you mentioned. Do you have any advice for people working with proteins 250 to 300 kilodaltons? 

 Dr. Biji Kurien:  Yes. Dr. Greaser has published a paper using agarose SDS, SDS agarose 

gel, a vertical gel, and he uses a  reducing buffer  in  the upper chamber. This helps to run the gel  like he uses ‐‐ he ran a protein titin that's over 3000 kilodalton, up to 3700. He was able to transfer that very efficiently.  

   The  heat‐mediated  transfer  protocol  that  we  published  that  we  can 

transfer  in  tank buffer  systems,  it depends upon  the  gel  thickness. We can transfer at very varying time periods ranging from 10 to 20 minutes. It shows that you can transfer very high molecular weight proteins very efficiently. 

 Sean Sanders:  Now, how about very small proteins?  Dr. Biji Kurien:  Very  small  proteins,  we  have  to  be  very  more  careful  because  low 

molecular weight proteins tend to come out first. The best way would be after you transfer, you can fix the membrane, immobilize the protein on the membrane, as well as using 0.2 micrometer membrane can help. 

 Sean Sanders:  Okay.   Dr. Pier Righetti:  Can I add something about the high molecular mass proteins? There is a 

technique  that  people  often  overlook  because  it's  a  little  bit  more laborious, but basically you could cast your own polyacrylamide gel to as low as 4% T total monomers by  increasing the percent C, the percent of crosslink fluorescence to 10% and so on. 

 [0:45:17]    The gel, you enlarge  the pore  size  substantially, but  the gel can  still be 

handled  because  of  the  higher  percent  of  crosslink.  By  the  way, increasing  the  percent  of  crosslinkage  also  increases  the  pore  sizes. Obviously, that requires more skills and obviously, you would not be able to use pre‐casted gels. You will have to do your own gels and that might add to the burden, but this  is a technique we used a  lot  in the past and it's quite successful. 

 Sean Sanders:  Great! Maybe that brings us nicely to the discussion of cast your own gels 

or your pre‐cast gels.  I remember my experience casting gels. You mess that up and your whole experiment is gone. 

 Dr. Pier Righetti:  Yeah. Right. 

22

 Sean Sanders:  Dr. Kurien, I know you had some advice on that in your talk.  Dr. Biji Kurien:  Yeah. I would prefer pre‐cast gels to bring constant results. The variability 

would be  less.  It's  convenient  also because  acrylamide  is  a neurotoxin. You can avoid handling acrylamide. 

 Sean Sanders:  Dr.  Thomas was  commenting  last night  that we might be banning  that 

one day.  Dr. Nick Thomas:  Well, we're not going to be around forever.  Dr. Pier Righetti:  It  could be  coming  soon.  It  could be  coming  soon. Actually,  at  least  in 

Europe, they are pushing the  legislation to total elimination.  In  fact, we are  desperately  trying  to  figure  out  what  can  substitute  acrylamide, which is not easy. 

   For  instance,  you  can  use  agarose.  But  immobilized  pH  gradient  gels, 

which is a classic, a first dimension of 2D maps, there is no way to cast, to graph  immobilized  chemicals  to  agarose. We've  tried  that  for  decades and we never succeeded, so an acrylamide‐free life is difficult to me. 

 Dr. Nick Thomas:  Yeah, I would agree.  Dr. Pier Righetti:  What would be a substitute? We do not know.  Dr. Nick Thomas:  Yeah, but pre‐cast gels  ‐‐ unless you have a  rare example of needing a 

very low porosity get that isn't within the standard ‐‐  Dr. Pier Righetti:  Could  I  add  another  comment  that we  have  been  discussing with  you 

here  last  summer  and  so  on?  You  could  have  pre‐cast  gels, which  are really  toxin‐free because no matter how hard you  try, when you cast a polyacrylamide gel, there are always given amounts, up to 5% or more, of free monomers that have not been  incorporated and the toxicity comes from  the  double  bond  of  the  free  monomers  obviously.  Do  you understand? 

   So you never get rid of  it, but we now have tricks to supply acrylamide‐

free, monomer‐free gels because we can treat them with scavengers so that at  least  if you dispose of  them,  there would be no  toxicity  for  the environment, which is also another interesting point. 

 Sean Sanders:  So  I'm going  to come  to you, Dr. Thomas, with  I  think one of  the more 

difficult questions about normalization, so I'll throw this your way. 

23

 Dr. Nick Thomas:  Okay.  Sean Sanders:  This  viewer  asks,  "What  about  normalization? What  is  the  difference 

between target protein normalization and total protein normalization? Is normalization important?" 

 Dr. Nick Thomas:  Yes, normalization is important. Nobody would dream of doing an RT‐PCR 

experiment  without  having  the  right  normalization.  Normalization, people will use ‐‐ there's a lot of debate in that community whether you use something like beta‐actin, whether you use what people would call a housekeeping gene like GAPDH. 

   So two issues, I guess, one is to have ‐‐ your normalization protein should 

be around the same abundance as the thing you're detecting. So if you're looking for something, which  is very  low‐abundance, then you shouldn't really be using beta‐actin. 

   The other issue is if you're using a housekeeping protein ‐‐ and GAPDH is 

probably the one most people use or  is very commonly used ‐‐  it's clear from  RT‐PCR  experiments  that  that  is  not  an  invariant  protein  and particularly  if  you're  interested  in working  in  stem  cell  differentiation. GAPDH values can go up and down considerably. 

   So basically think about your experiment and always plan it as if you were 

doing an RT‐PCR experiment, and I think that's a good analogy for lots of Western blotting. People would not dream of doing RT‐PCR with buffers that they thought might be contaminated. Well, why would you tolerate that in Western blotting? 

   So coming back to the normalization and  I think that's a great potential 

advantage of fluorescent detection in that you've got three colors, so you could  if  you  like,  if  you  want  to  do  a  very  critical  quantitation  in normalization, you could have one color for your protein of  interest and use two colors for two different normalization proteins. 

 [0:50:11]    You  might,  for  example,  use  beta‐actin  and  GAPDH,  but  you  would 

absolutely be looking to see that the ratio of those two proteins stay the same  across  your  sample  because  if  you  didn't,  then  one  of  them  is obviously changing and therefore, you can't normalize against a changing target. 

 

24

  Coming  back  to  what  I  was  saying  before,  design  your  experiment appropriately at the beginning and think about what's going to go on or what could possibly vary in your sample. Otherwise, you're going to have to do it again. 

 Sean Sanders:  Right.  Dr.  Kurien,  I'm  going  to  come  to  you  with  I  guess  a  related 

question,  and  that's  if  somebody  wants  to  do  quantitation,  what  is needed in order to make a gel quantitative? 

 Dr. Biji Kurien:  So just minimize the variability from gel to gel. We have seen in diffusion‐

mediated non‐electrophoretic transfer, you can quantitate actually. It has been found that 10% of the proteins are transferred in three minutes in a diffusion‐mediated non‐electrophoretic transfer and 30% in 30 minutes.  

   But the major problem is for electrophoretic transfer, you have to decide 

which  protein  you  need  to  do  because  it  transfers  differentially  to membranes.  It's  like  a  biased  transfer.  So  it  all  depends  upon  what protein you are interested in and then work on that particular protein to adjust  the  conditions  and  reduce  variability.  There  are  several  good papers  to  show  how  you  can  quantitate  proteins. Dr. Gad  Baneth  has published one on how to quantify proteins. 

 Sean Sanders:  Good! Prof. Righetti, I'm going to come to you with a couple of questions 

specific  to  your  technique  that  came  in,  the CPLL  technique.  First,  you were asked, "Can you use  this enrichment  technique  if you have a very small amount of starting material?" 

 Dr. Pier Righetti:  Yes, you can. You can. In that case, you can reduce the amount of beads 

that  you  use.  For  instance,  when  working  with  cerebral  spinal  fluid, people told us that often you cannot draw from a patient more than half a milliliter or something, so they said, "What do we do?" 

   In that case, you reduce dramatically the amount of beads that you use. 

Normally for each experiment, we use hundred microliters of beads, but in  that particular  case, we went  to down only  ten microliters of beads and  it was very efficiently  ‐‐ but you have  to  remember  that of course, that tiny sample volume, you have a tiny amount of your antigen and you collect what is in there. You can collect even 100%, but you cannot collect more than that. 

   So  if  it  is still too  low, that's  it. You will not see  it. To see  it, you would 

have  to use a  larger volume,  so  this  is  the problem. You  can do  it, but with limitations. 

 

25

Sean Sanders:  And  how  would  you  know  that  your  low‐abundance  proteins  aren't binding to the beads and remaining there? 

 Dr. Pier Righetti:  That's  a  very  good  question.  In  reality, our beads  ‐‐  you  know,  I  come 

from a Catholic country, so we try to be ecumenic. That's what our pope tell us,  to embrace every  faith, every religion, everything, but  in reality, our beads are not as ecumenical as we would like them to be. 

   No matter how much we have now optimized everything, we  still  lose 

some 10% of  the  initial sample. We do not know what's  the  reason  for that. So basically, ideally you would want to look at the weight from your beads, but  just as a  control,  look also at what you had  in your original sample, and then combine both data. 

 Sean Sanders:  Okay. Excellent! Dr. Kurien, I'll come back with a question for you. There 

have been a number of questions  in different ways about aberrations  in gels,  things  like dumbbell‐shaped band,  smiling  gels,  that  sort of  thing. The other big one  is a protein  that doesn't  seem  to match up with  the size that you're expecting, so you get a nice band, but  it's at a different size.  So  can  you  talk  about  some  of  the  causes  for  these  kinds  of aberrations? 

 Dr. Biji Kurien:  Posttranslational modification can lead to different sizes of protein.  [0:55:05]    The  uneven  heating  of  gel  can  cause  the  dumbbell  type  bands. We're 

discussing,  as Dr.  Righetti was  saying,  the  pore  size.  The  pores  can  be blocked and ‐‐ 

 Dr. Pier Righetti:  Particulate material in your sample, yeah.  Dr. Biji Kurien:  And that can cause aberrant ‐‐ the migration of proteins.  Dr. Pier Righetti:  Right. Yeah.  In fact, may  I add,  it  is very  important prior to  loading your 

sample to a gel, even  if  it  is  in SDS or so on, always give a sharp, quick, efficient  centrifugation  because  there  might  be  particulate  material which is so dispersed, so minute that you don't see it. But when you load it,  it clogs  the gel pores and  that  is a disaster, so a quick centrifugation step will surely help. 

   May  I also add something more? That we never  load anything  into  two 

outerlays because at the edges of the gel, the field strand is not constant as  inside, so we always  the  two extreme empty because we always get 

26

curved, hearts, bands and so on due to uneven field strand distribution, field ‐‐ 

 Dr. Nick Thomas:  Put sample buffer in them.  Sean Sanders:  Okay, so ‐‐  Dr. Pier Righetti:  Yeah. Correct.  Dr. Biji Kurien:  May I add one more?  Sean Sanders:  Sure.  Dr. Biji Kurien:  The heat  that's  running  the samples using a heated buffer seems  to be 

avoiding all  those  things because  the uniform heating of  the gel avoids smiling  completely.  It  runs  really  nice  and  straight.  Sometimes,  I  see  a figure on a paper where you see the dumbbell kind of thing all across the lane. It looks like maybe streaking. 

   But  I  think  for uniform  running  ‐‐  if you're  running  regular gel,  running 

slowly and with proper sample preparation,  then running  it normally as without increasing the current, so you can get good bands and avoid the dumbbell thing. 

 Sean Sanders:  Great! We're coming  to  the end of  the webinar. We've got a couple of 

minutes,  so  I'm  just going  to give you a couple more questions. Maybe Dr. Thomas, I'll come to you with this one. What is the most critical step to avoid or minimize non‐specific antibody binding? 

 Dr. Nick Thomas:  Use a good blotter. Use a blocker.  If you're  talking about  your primary 

antibody, use a good primary antibody and use a primary antibody that's good  for Western  blotting. Not  all  antibodies  to  the  same  protein  are equal. You  can  look at  the manufacturers or  the provider  specification. You can believe that. 

   Basically,  use  a  good  antibody  that  you  know  works.  Use  a  good 

detection  system  that  works.  Use  a  good  blocking  solution,  a  good blocking protocol that you know that works. If you know all those things work, then you've got the basis for good protocol. 

   But  if you've got something  that works half  the  time and not  the other 

half  the  time,  and  then  you've  got  another  step  which  only  works  a quarter  of  the  time,  when  you  add  all  these  things  up,  that's  where 

27

people get really frustrated with the Western blotting and tear their hair out. 

   That's what I said before. It doesn't cease to amaze me really that people 

will take  infinite care  in an RT‐PCR. They get their primer design exactly right.  They  get  all  their  buffers  clean  and  nuclease‐free  because  they know that if they don't do that, it's not going to work. 

   They'll  take  a blocking  solution or  a washing  solution out of  the  fridge 

that  somebody  else  has  used  and  they  have  no  idea  really  how much bacteria are  in  it. They waft  their membranes around,  they crack  them, they crease them, and they wonder why they've got marks on their films when they put it under the detector. 

 Sean Sanders:  Good!  I'm  going  to  come with  one  last  question  to  the  whole  panel. 

Before  that, actually,  I want  to  just  come back  very quickly  to  you, Dr. Kurien. Somebody was asking  if you could  repeat  the  reference  for  the protein quantitation. You mentioned ‐‐ 

 Dr. Biji Kurien:  It's  in the protein blotting book.  I forgot the author's name. She ran the 

non‐electrophoretic  transfer  on  support,  on  a  plastic  support.  She  did label the protein, radiolabeled the protein and looked at the counts. 

 [1:00:10]  Sean Sanders:  Okay. Maybe we can put  that up  later  for our viewers. Dr. Thomas, do 

you have anything to add for the quantitation issue?  Dr. Nick Thomas:  Not particularly. Well, only to reiterate what I said before, when Western 

blotting  started,  it was  pretty much  qualitative.  You might  have made some judgment as to there was more of protein whatever in this sample than the other. 

   It's  very  much  moved  to  a  quantitative  science,  but  without  the 

development or the adoption of the best practice  in the various stages, which would justify it, in my opinion, being a full quantitative science. It is in some aspects and  in some  labs, but  I think as a technique  in average, it's ‐‐ to do another analogy, it's more like PCR than it is like RT‐PCR.  

   You're basically  looking for a band and saying, "Well, this band  is darker 

than  that band." As  I discussed  in my  talk,  the next evolution will be  in having systemized approaches using the best technologies for each step, and  in  some  cases,  bringing  those  altogether  in  an  automated  system. 

28

The whole  point  is  doing  it  faster, more  reproducible,  and  freeing  up scientists that do science, not slosh things around in chemicals. 

 Sean Sanders:  Right. Dr. Kurien?  Dr. Biji Kurien:  The doctor's name is Dr. Gad Baneth.  Sean Sanders:  Baneth, great!  Dr. Biji Kurien:  Yeah, for the quantification.  Sean Sanders:  Okay. Excellent!  Slide 67    Well,  I'm  afraid  we're  going  to  have  to  end  there  because  we  are 

unfortunately  out  of  time  for  today.  So  on  behalf  of myself  and  our viewing audience, I want to thank our speakers very much for being with us  today,  Prof.  Pier Giorgio  Righetti  from  the  Polytechnic University  of Milan, Dr. Biji T. Kurien from the University of Oklahoma Health Sciences Center, and Dr. Nick Thomas from GE Healthcare. 

   Please  go  to  the URL now  at  the bottom of  your  slide  viewer  to  share 

your own  tips or  tricks about Western blotting. These will be  collected together by our webinar sponsor and published as an infographic.  

   Look  out  for  more  webinars  from  Science  available  at 

webinar.sciencemag.org.  This particular webinar will be made  available to you again as an on‐demand presentation within about 48 hours from now. We'd  love  to know what you  thought of  the webinar. Send us an email at the address now up in your slide viewer, webinar@aaas.org. 

   Again,  thank  you  to  our  panel  and  to  GE  Healthcare  for  their  kind 

sponsorship of today's educational seminar. Goodbye.  [1:03:25]  End of Audio