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Western Blot Western Blot 相关技术的相关技术的原理与操作原理与操作

解放军总医院分子生物学研究室 宋海静解放军总医院分子生物学研究室 宋海静

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◆◆ 实验目的实验目的

●● 掌握细胞总蛋白提取技术掌握细胞总蛋白提取技术

●● 掌握掌握 SDS-SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳技术聚丙烯酰胺凝胶电泳技术 ● ● 掌握蛋白质转印及抗体染色技术掌握蛋白质转印及抗体染色技术 ●● 掌握掌握 ECLECL 试剂的使用、试剂的使用、 X-X- 片曝光及显影方法片曝光及显影方法

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实验原理 实验原理

●● 将获得的蛋白质样品通过将获得的蛋白质样品通过 SDS-SDS- 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳 电泳 [SDS-olyacrylamide gelelectrophoresi[SDS-olyacrylamide gelelectrophoresis], s], 对不同分子量的蛋白质进行分离 对不同分子量的蛋白质进行分离

● ● 将分离到的蛋白质通过转移电泳方式转印至固将分离到的蛋白质通过转移电泳方式转印至固 相支持物上相支持物上 (PVDF(PVDF 膜 硝酸纤维素膜或尼龙膜膜 硝酸纤维素膜或尼龙膜

上上 ) )

●● 用抗靶蛋白的非标记抗体（一抗）与转印膜用抗靶蛋白的非标记抗体（一抗）与转印膜 进行反应，使其与膜上的靶蛋白发生特异性结 进行反应，使其与膜上的靶蛋白发生特异性结 合合 ..

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●● 结合上的抗体与辣根过氧化物酶标记的二抗结合上的抗体与辣根过氧化物酶标记的二抗 进行结合进行结合 ; ;

● ● 经经 ECLECL 发光试剂作用、发光试剂作用、 X-X- 光片曝光、显影既光片曝光、显影既可显示与特异抗体结合的靶蛋白条带。可显示与特异抗体结合的靶蛋白条带。

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一抗一抗

一抗 ( 兔抗 Actin)

曝光后的蛋白条带

二抗 ( 辣根酶标记的羊抗兔 IgG)

ECL

X 光片曝光显影

ECL 试剂

含有转印蛋白的 PVDF 膜

++

转印膜上蛋白检测示意图

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◆ ◆ 实验分为三个部分实验分为三个部分

●● 细胞总蛋白质的提取及含量测定细胞总蛋白质的提取及含量测定；；●● SDS-SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳●● 凝胶转膜及其检测凝胶转膜及其检测

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♣♣ 实验流程实验流程 提取细胞总蛋白、测定含量提取细胞总蛋白、测定含量 ↓↓ 制备制备 SDS-PAGESDS-PAGE 胶胶 ↓↓ 蛋白样品变性、电泳 蛋白样品变性、电泳 ↓ ↓ 凝胶转膜凝胶转膜 ↓ ↓ 封闭封闭 (( 室温室温 11 小时小时 ) ) ↓ ↓ 一抗反应一抗反应 (4℃(4℃ 过夜过夜 ) ) ↓ ↓ 二抗反应 二抗反应 (( 室温、避光室温、避光 5050 分钟分钟 )) ↓ ↓ ECLECL 试剂作用 试剂作用 ↓ ↓ X-X- 光片曝光光片曝光、显影 、显影 ↓↓ 结果分析结果分析

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♣♣ 实验方法实验方法

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　　　 　　　　 　第一部分第一部分 　 　 细胞总蛋白的提取及含量测定细胞总蛋白的提取及含量测定

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◆◆ 细胞总蛋白裂解液　细胞总蛋白裂解液　 　　　　 1 X PBS 1 X PBS 　　 80ml80ml　　 　　 Tritonx-100 1mlTritonx-100 1ml　　 去氧胆酸钠 　　 去氧胆酸钠 0.5g 0.5g 　 　 　 　 SDS SDS 　 　 0.1g 0.1g 　　 补　　 补 1x PBS1x PBS 缓冲液至　　　 缓冲液至　　　 100ml100ml PMSFPMSF 储存液储存液 (100mmol/L)(100mmol/L)

★ ★ PMSFPMSF 储存液为储存液为 17.4mg/ml17.4mg/ml 异丙醇 异丙醇 -20℃-20℃ 保存保存 ..

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☻☻ 提取细胞总蛋白提取细胞总蛋白

　　选取于选取于 60mm60mm 细胞培养皿中培养的细胞培养皿中培养的 Hela Hela 细胞细胞 (( 细胞数约为细胞数约为 5 X 105 X 1066// 培养皿） 培养皿） ↓ ↓ 吸弃细胞培养液，用吸弃细胞培养液，用 4℃4℃ 预冷的预冷的 1X PBS1X PBS洗细胞表面洗细胞表面 33 ～～ 44 次（－次（－ 8080℃℃ 冻存冻存 ,, 至少可保存两周至少可保存两周 )) ↓ ↓（ 由（ 由－－ 80℃80℃ 取出冻存细胞）每培养皿加入取出冻存细胞）每培养皿加入 100ul100ul蛋白裂解液，轻轻晃动，使裂解液均匀铺于细胞表面 蛋白裂解液，轻轻晃动，使裂解液均匀铺于细胞表面 ↓ ↓ 冰浴 冰浴 4040 分钟，期间晃动分钟，期间晃动 3 ~43 ~4 次次 ↓ ↓ 用细胞刮子集中裂解液，收入用细胞刮子集中裂解液，收入 1.5ml EP1.5ml EP 管中， 管中， 12,000g 4℃ 12,000g 4℃ 离心离心 20min20min ↓ ↓ 　小心吸取上清液并分装 ，　小心吸取上清液并分装 ， -80℃-80℃ 保存保存

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★★ 提取细胞总蛋白注意事项 提取细胞总蛋白注意事项

●● FMSFFMSF严重损害呼吸道黏膜、眼睛及皮肤，吸严重损害呼吸道黏膜、眼睛及皮肤，吸　　　入、进或通过皮肤吸收有致命危险。一旦眼睛　　　入、进或通过皮肤吸收有致命危险。一旦眼睛　　　或皮肤接触了　　　或皮肤接触了 PMSFPMSF ，立即用大量水冲洗，立即用大量水冲洗 .. ●● PMSF(PMSF( 苯甲基磺酰氟苯甲基磺酰氟 ))在水溶液中不稳定在水溶液中不稳定 , , 应在应在　　　临用前加入　　　临用前加入，使终浓度为，使终浓度为 1 mmol/L ( 10ul1 mmol/L ( 10ul 储储　　　存液　　　存液 /ml/ml 裂解液 裂解液 ))

　　

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　● 　● 　为防止蛋白降解， 操作全部应在冰上完成 　为防止蛋白降解， 操作全部应在冰上完成 ,,　　　　所用离心机需提前预冷　　　　所用离心机需提前预冷 ..

●● 　提取的蛋白质样品应小量分装　提取的蛋白质样品应小量分装 ,, 冻存于冻存于 -80℃,-80℃,　　　　切勿反复冻融已制备好的样品。　　　　切勿反复冻融已制备好的样品。

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☻☻ 蛋白质含量测定蛋白质含量测定

◆ ◆ 测定意义 测定意义

●● 　 　 为确保蛋白质通过为确保蛋白质通过 SDS-PAGESDS-PAGE 获得最好分离效获得最好分离效　　果　　果 ,, 有必要对提取的蛋白质总量做粗略的估计有必要对提取的蛋白质总量做粗略的估计

●● 　　蛋白质总量不足可能妨碍对目的蛋白的鉴定蛋白质总量不足可能妨碍对目的蛋白的鉴定 ; ; 蛋蛋 白质含量太高则会使带形扭曲白质含量太高则会使带形扭曲 ,,甚至会影响此电泳甚至会影响此电泳 方法的分辨力方法的分辨力

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◆ ◆ 蛋白质含量测定常用方法蛋白质含量测定常用方法

● ● 标准标准 BradfordBradford 分析法分析法 ●● 双缩尿测定法双缩尿测定法 ●● 紫外光谱吸收法紫外光谱吸收法 ●● FolinFolin酚法 酚法

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☻ ☻ 测定细胞总蛋白含量步骤 测定细胞总蛋白含量步骤 (Bradford)(Bradford)　　 　　 　 　 ◆◆ 制作样品蛋白标准曲线 制作样品蛋白标准曲线

　　　　　　　　　将牛血清白蛋白　将牛血清白蛋白 (BSA(BSA ）用生理盐水配制成）用生理盐水配制成　　　　　　　　　　 0.5mg/ml0.5mg/ml 的标准品蛋白，４℃保存的标准品蛋白，４℃保存　　　　　　　　　　　　　↓　　　　　　　　　　　　　↓　　　　 　用　　　　 　用 PBSPBS稀释上述标准品蛋白，使成　　稀释上述标准品蛋白，使成　　 　　 00 、、 22 、、 44 、、 66 、、 8 8 、、 10ug/100ul 10ug/100ul 　分别编号为　分别编号为 11 、、 22 、、 33 、、 44 、 、 55 、、 66 　　 　 　　　↓　 　　　↓ 　 每管中分别加入　 每管中分别加入 1.5ml1.5ml 考马斯亮蓝使用液 考马斯亮蓝使用液 　　↓　　↓ 　紫外分光光度计上测定　紫外分光光度计上测定 595nm595nm 吸光度值 吸光度值 　　↓　　↓ 　依据所得读数制作标准曲线图 　依据所得读数制作标准曲线图 　　　　

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◆◆ 　　测定样品蛋白浓度测定样品蛋白浓度

　　　　吸取适量样品蛋白加至　　　　吸取适量样品蛋白加至 PBSPBS 中　 中　 　　　　　　使总体积至　　　　　　使总体积至 100ul100ul

　 　　　　　↓　 　　　　　↓　　　向上述管中加入　　　向上述管中加入 1.5ml1.5ml 考马斯亮蓝使用液 考马斯亮蓝使用液

　　　　　　　↓　　　　　　　↓ 　　　　　　测定　　　　　　测定 595nm595nm 吸光度值　吸光度值　

　　　　　　　↓　　　　　　　↓ 　　　　将所得读数与标准曲线图比对，　　　　将所得读数与标准曲线图比对，　　　　　从而推算出蛋白样品浓度　　　　　从而推算出蛋白样品浓度

　　

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　　◆　◆　标准曲线及待测蛋白样品稀释方法标准曲线及待测蛋白样品稀释方法

编号　　加样量　　　生理水量　　考马斯亮蓝　　　　实际浓度　 编号　　加样量　　　生理水量　　考马斯亮蓝　　　　实际浓度　 （ＢＳＡ）（ＢＳＡ）　　　　　　 1 1 　　　０　　　０ ulul 　　　　　　　　 100ul100ul 　　　　　　 1500 ul1500 ul 　　　　 ０　　　　 ０ ug/100ul ug/100ul 　　　　 2 2 　　 　　　 　 4ul4ul 　　　　　　　　 96ul96ul 　　　　　　　　 1500 ul 1500 ul 　　　　 　　　　 2 ug/100ul 2 ug/100ul 　　　　 3 3 　　　　　　 8ul8ul 　　　　　　　　 92ul92ul 　　　　　　　　 1500 ul1500 ul 　　　　 　　　　 4 ug/100ul 4 ug/100ul 　　　　 4 4 　　　　　　 12ul12ul 　　　 　　　 88ul88ul 　　　 　　　 1500 ul1500 ul 　　　　 　　　　 6 ug/100ul 6 ug/100ul 　　　　 5 5 　　 　　　 　 16ul16ul 　　　 　　　 84ul84ul 　　　 　　　 1500 ul1500 ul 　　　　 　　　　 8 ug/100ul 8 ug/100ul 　　　　 6 6 　　　　　　 20ul20ul 　　　 　　　 80ul80ul 　　　 　　　 1500 ul1500 ul 　　　　 　　　　 10ug/100ul10ug/100ul 　　蛋白样品蛋白样品　　　　 11 　　　　　　 2 ul2 ul 　　　　　　　　 98 ul98 ul 　　　　　　　　 1500 ul1500 ul 　　　　　　　　　　 ug/100ulug/100ul　　　　 2 2 　　　　　　 2 ul2 ul 　　　 　　　 98 ul98 ul 　　　 　　　 1500 ul1500 ul 　　　　　　　　　　 ug/100ulug/100ul　　　　 33 　　　　　　 2 ul2 ul 　　　　　　　　 98 ul98 ul 　　　 　　　 1500 ul1500 ul 　　　　　　　　　　 ug/100ulug/100ul　　　　 44 　　　　　　 2 ul2 ul 　　　 　　　 98 ul98 ul 　　　 　　　 1500 ul1500 ul 　　　　　　　　　　 ug/100ulug/100ul 　　

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• 　　

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BSA BSA 浓度　浓度　 OD OD 值值 2ug2ug 　 　 0.080.08 4ug 0.169 4ug 0.169 6ug 0.265 6ug 0.265 8ug 0.327 8ug 0.327 10ug 0.377 10ug 0.377

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★★ 　　测定蛋白含量注意事项测定蛋白含量注意事项

●● 制作的制作的 BSABSA 标准曲线如不规律，应重新再做标准曲线如不规律，应重新再做

● ● 如果待测样品浓度过高（如组织提取物如果待测样品浓度过高（如组织提取物 )) ，可用生理盐水，可用生理盐水 将其稀释将其稀释 1010 ～～ 2020倍后测定；如样品浓度低，可适当增加倍后测定；如样品浓度低，可适当增加 样品微升数或减少水的微升数样品微升数或减少水的微升数 .. ●● 比色皿的清洁：考马斯亮蓝不易被清水冲洗干净，因此使用后 比色皿的清洁：考马斯亮蓝不易被清水冲洗干净，因此使用后 的比色皿除用清水冲洗后，还需用无水乙醇将比色皿浸泡数分的比色皿除用清水冲洗后，还需用无水乙醇将比色皿浸泡数分 以脱色，而后分别用自来水、蒸馏水冲洗后备用。 以脱色，而后分别用自来水、蒸馏水冲洗后备用。

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第二部分第二部分

　　 SDS-SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳

　　　　　　

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◆ ◆ 原理原理

　 　 ●　●　 SDS-SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳是对蛋白质做定性聚丙烯酰胺凝胶电泳是对蛋白质做定性　　　分析的常用的实验方法　　　分析的常用的实验方法 , , 适用于蛋白质纯度检适用于蛋白质纯度检　　　测和分子量测定　　　　测和分子量测定　

　　● ● SDS-SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳分为只有分离胶的聚丙烯酰胺凝胶电泳分为只有分离胶的　　　连续系统　　　连续系统和既有分离胶又有浓缩胶的和既有分离胶又有浓缩胶的不连续系统不连续系统 ..

　　●● 连续系统的电泳体系中缓冲液 连续系统的电泳体系中缓冲液 pHpH值及凝胶浓度值及凝胶浓度　　　相同　　　相同 ,, 带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子　　　筛效应。　　　筛效应。

　　　　　　

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● ● 在在不连续系统中由于缓冲液离子成分、不连续系统中由于缓冲液离子成分、 pH pH 、凝、凝　　胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场　　胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场　　中泳动不仅有电荷效应， 分子筛效应，还具有把　　中泳动不仅有电荷效应， 分子筛效应，还具有把　　样品中的复合物全部浓缩于极小体积的能力　　样品中的复合物全部浓缩于极小体积的能力 . . 当样当样　　品首先通过高度多孔性的积层胶时，样品中所含　　品首先通过高度多孔性的积层胶时，样品中所含　　　　 SDSSDS多肽复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的多肽复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的　　区带（或称积层），因此其分离条带的清晰度及　　区带（或称积层），因此其分离条带的清晰度及　　分辨率均较高。　　分辨率均较高。

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● ● SDSSDS 聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围　　取决于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联　　取决于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联 度度 . . 在进行电泳时在进行电泳时 ,, 蛋白质分子的迁移速蛋白质分子的迁移速 度取决于分子大小 度取决于分子大小 ..

　　

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ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围 丙烯酰胺浓度丙烯酰胺浓度 (%)(%) 　　　　　　线性分离范围／　　　　　　线性分离范围／ KDaKDa　　　 　 1515 　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　 10-43 10-43 12 12-60 12 12-60 10 20-80 10 20-80 7.5 36-94 7.5 36-94 5.0 57-2125.0 57-212

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●● 对蛋白质样品做对蛋白质样品做 SDSSDS －聚丙烯酰胺凝胶电泳－聚丙烯酰胺凝胶电泳　　分析时，要在样品中加入含有　　分析时，要在样品中加入含有 SDSSDS （十二烷（十二烷　　基磺酸钠）、　　基磺酸钠）、 --巯基乙醇、指示剂及甘油或巯基乙醇、指示剂及甘油或　　蔗糖的电泳上样液．　　蔗糖的电泳上样液．

●● 　　 SDSSDS是一种阴离子表面活性剂，它可以断开是一种阴离子表面活性剂，它可以断开　　分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的　　分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的　　二级和三级结构；　　二级和三级结构； --巯基乙醇是强还原剂，巯基乙醇是强还原剂，　　它可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键．　　它可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键．

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●● 　蔗糖或甘油可以增大上样溶液的密度，有助于　蔗糖或甘油可以增大上样溶液的密度，有助于　　加样时样品溶液沉入加样孔底部　　加样时样品溶液沉入加样孔底部 ;;

● ● 　　样品蛋白中加入电泳上样液后，要经过高温处样品蛋白中加入电泳上样液后，要经过高温处　　 理，使　　 理，使 SDSSDS 与蛋白质充分结合，造成蛋白质完与蛋白质充分结合，造成蛋白质完 全变性和解聚，并形成棒状结构全变性和解聚，并形成棒状结构 ;;

●● 电泳上样液中通常含有溴酚蓝染料做指示剂，电泳上样液中通常含有溴酚蓝染料做指示剂，　　 用于控制电泳过程　　 用于控制电泳过程 ;;

　　

　　

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☻☻ 制备制备 SDS-PAGESDS-PAGE 凝胶程序凝胶程序

　　●● 制备电泳用玻璃凝胶槽　 制备电泳用玻璃凝胶槽　 　　 ●● 确定灌制分离胶液面标志线 确定灌制分离胶液面标志线

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◆ ◆ 配制分离胶和浓缩胶 配制分离胶和浓缩胶

配制配制 10%SDS-PAGE10%SDS-PAGE 分离胶 分离胶 (15ml) 5%(15ml) 5%浓缩胶浓缩胶 (4ml)(4ml) 　去离子水 　去离子水 5.9ml 2.7 ml5.9ml 2.7 ml 30%30%丙烯酰胺 丙烯酰胺 5.0ml 0.67ml5.0ml 0.67ml 1.5mol/L Tris-Cl pH8.8 3.8ml /1.5mol/L Tris-Cl pH8.8 3.8ml / 1.0mol/L Tris-Cl pH6.8 / 0.5ml1.0mol/L Tris-Cl pH6.8 / 0.5ml 1 0%1 0%过硫酸胺 过硫酸胺 0.15ml 0.04ml0.15ml 0.04ml 10%SDS 0.15ml 0.04ml10%SDS 0.15ml 0.04ml　　　　　　　　ＴＥＭＥＤ（临用前加入）ＴＥＭＥＤ（临用前加入）　　 　　 0.008 ml 0.004ml0.008 ml 0.004ml

●● 取上述分离胶取上述分离胶 1ml, 1ml, 加入加入 TEMED3ul, TEMED3ul, 混匀后用其 封电泳用玻璃夹板周边至其凝固．混匀后用其 封电泳用玻璃夹板周边至其凝固．　　　　

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◆◆ 灌制分离胶灌制分离胶 ●● 在分离胶液中加入 在分离胶液中加入 6ul TEMED6ul TEMED ，混合均匀，迅速，混合均匀，迅速 用巴斯德吸管轻轻加入玻璃凝胶槽中，直至液面标用巴斯德吸管轻轻加入玻璃凝胶槽中，直至液面标 志线处．　志线处．　

● ● 立即用 立即用 0.1%SDS0.1%SDS 液覆盖胶面，室温放置约液覆盖胶面，室温放置约 4040 分钟分钟 至分离胶凝固。至分离胶凝固。

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●● 轻轻倒掉轻轻倒掉 0.1%SDS0.1%SDS覆盖液，去离子水冲洗分离胶覆盖液，去离子水冲洗分离胶 表面表面 2-32-3 次，洗净未聚合的丙烯酰胺凝胶，用吸水次，洗净未聚合的丙烯酰胺凝胶，用吸水 纸吸掉残留的液体。纸吸掉残留的液体。 ● ● 将凝胶板垂直放置，轻轻加入将凝胶板垂直放置，轻轻加入 5%5% 积层胶液，插入积层胶液，插入 样品梳，室温凝胶约样品梳，室温凝胶约 4040 分钟。分钟。

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◆ ◆ 蛋白样品变性蛋白样品变性

●● 由由 -80℃-80℃冰箱取出细胞总蛋白样品，立即插入冰中冰箱取出细胞总蛋白样品，立即插入冰中 （ 减少蛋白降解）待其融化 （ 减少蛋白降解）待其融化

●● 吸取吸取 15ul 15ul 细胞总蛋白样品 细胞总蛋白样品 , , 加入 加入 4×4× 蛋白质凝胶电蛋白质凝胶电泳泳

上样液 上样液 , , 将二者轻轻混合将二者轻轻混合 , 98℃, 98℃ 变性变性 88 分钟分钟 , , 立即插立即插入入

冰中冰中

● ● vortexvortex 数秒，短暂离心后轻轻加入凝胶孔中 数秒，短暂离心后轻轻加入凝胶孔中

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◆◆ 电 泳电 泳

●● 正确连接电泳连线（负极在上，正极在下）以保证电荷正确连接电泳连线（负极在上，正极在下）以保证电荷 由负极向正极方向流动。 由负极向正极方向流动。

●● 接通电源接通电源 ,, 将电压调至将电压调至 100V,100V, 使样品通过浓缩胶（电压约使样品通过浓缩胶（电压约 8v/cm8v/cm ）） ; ; 当染料进入分离胶后，将电压调高到当染料进入分离胶后，将电压调高到 130V 130V （约（约 15v/cm )15v/cm ) 继续电泳继续电泳 ,, 染料至分离胶适当位置时结束电染料至分离胶适当位置时结束电 泳 　泳 　　　　　　　●● 　　尽量在尽量在 4℃4℃冰箱中进行电泳　冰箱中进行电泳　

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★ ★ 制备凝胶及电泳中注意问题制备凝胶及电泳中注意问题

●● 丙烯酰胺和双丙烯酰胺在聚合前具有很强的神经丙烯酰胺和双丙烯酰胺在聚合前具有很强的神经 毒性并容易吸附于皮肤，其作用具有累积性毒性并容易吸附于皮肤，其作用具有累积性 , , 故故 称量时应戴手套及口罩称量时应戴手套及口罩

● ● 不同厂家的不同厂家的 SDSSDS 可引起多肽的迁移图谱变化较大，可引起多肽的迁移图谱变化较大， 建议找出个人喜欢的某一试剂级别并认准使用 建议找出个人喜欢的某一试剂级别并认准使用

● ● 电泳同时设立标准蛋白分子量电泳同时设立标准蛋白分子量 Marker Marker

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● ● 过硫酸铵会缓慢分解，应隔周新鲜配制过硫酸铵会缓慢分解，应隔周新鲜配制 ;;

● ● 一旦加入一旦加入 TEMEDTEMED ，应立即混旋并快速灌注入玻璃夹，应立即混旋并快速灌注入玻璃夹 槽中槽中 ;;

● ● 为保持电泳的平衡，在无样品孔中也应加入适量的为保持电泳的平衡，在无样品孔中也应加入适量的 4x4x 蛋白质电泳上样缓冲液蛋白质电泳上样缓冲液 ;;

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● ● 制备凝胶电泳用制备凝胶电泳用玻璃板的硅化处理玻璃板的硅化处理

将二氯二甲硅烷用氯仿或庚烷配成将二氯二甲硅烷用氯仿或庚烷配成 5%5% 溶液，用其溶液，用其 浸泡或擦拭玻璃板浸泡或擦拭玻璃板 , , 有机溶剂挥发时，二氯二甲硅烷有机溶剂挥发时，二氯二甲硅烷 即沉积在玻璃制品上。使用前用水反复冲洗多次或于即沉积在玻璃制品上。使用前用水反复冲洗多次或于 180℃180℃烘考烘考 22 小时。 小时。

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第三部分第三部分 　　　　　　　 　 凝胶转膜及其检测凝胶转膜及其检测 　　通过电转移法将ＳＤＳ－通过电转移法将ＳＤＳ－ PAGEPAGE 胶上分离到的蛋白质转印至胶上分离到的蛋白质转印至 PVDFPVDF 膜膜

上上

　　

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◆◆ 转膜步骤转膜步骤

●● 　　 PVDFPVDF 膜预处理膜预处理：剪裁与胶大小一致的：剪裁与胶大小一致的 PVDFPVDF 膜，膜，　　将其浸入甲醇液中浸泡　　将其浸入甲醇液中浸泡 10sec 10sec 、去离子水中浸泡、去离子水中浸泡　　　　 5min5min 、 、 1 X1 X 转移缓液中浸泡至少转移缓液中浸泡至少 15min15min 。。

●● 剪裁与胶同样大小的剪裁与胶同样大小的 66层滤纸，用转移缓冲液打湿层滤纸，用转移缓冲液打湿　　后待用。 　　后待用。

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●● 　　电泳结束后由电泳槽上取下电泳板，将其平置电泳结束后由电泳槽上取下电泳板，将其平置 （ “凹”面玻璃板在下）（ “凹”面玻璃板在下） ,, 小心取出两玻璃板之小心取出两玻璃板之 间的垫片，掀去上层玻璃板，切除多余凝胶，间的垫片，掀去上层玻璃板，切除多余凝胶， 将样品胶在转膜液中漂洗一次。将样品胶在转膜液中漂洗一次。

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●● 安装转膜板：安装转膜板：　　 打开转膜夹板打开转膜夹板 ,, 由阳极侧开始由阳极侧开始 , , 依次为海绵垫片→依次为海绵垫片→ 33层层 滤纸→滤纸→ PVDFPVDF 膜→样品凝胶→三层滤纸（排除气泡）膜→样品凝胶→三层滤纸（排除气泡） → →海绵垫片海绵垫片

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蛋白质印迹转移示意图

电转仪

极极

转移方向

转移液

转移液

三层滤纸转膜夹板 PVDF膜胶

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●● 　扣紧转膜夹板，放入含有转膜缓冲液的转移　扣紧转膜夹板，放入含有转膜缓冲液的转移　　电泳槽中。　　电泳槽中。

● ● 接通电源，恒压状态下，接通电源，恒压状态下， 80v 80v 转膜转膜 2h2h （此步（此步 操作宜在 操作宜在 4℃4℃冰箱中进行）。冰箱中进行）。

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★★ 注 意注 意●● 为避免操作中的失误为避免操作中的失误 , , 在转移前将膜与胶做同侧在转移前将膜与胶做同侧 标记；标记；

● ● 检查样品凝胶是否与转移槽的 检查样品凝胶是否与转移槽的 ““ -”-” 侧保持一致 侧保持一致 , , 以以 确保样品蛋白由凝胶转移至确保样品蛋白由凝胶转移至 PVDFPVDF 膜 膜 ..

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◆◆ 封闭转印膜封闭转印膜

●● 转移结束后转移结束后 , , 小心取出转移膜（用铅笔轻轻瞄出蛋白小心取出转移膜（用铅笔轻轻瞄出蛋白 MarkerMarker 带），在带），在 1XTBST1XTBST 液中漂洗两次 液中漂洗两次 ●● 将转移后的膜放入将转移后的膜放入 5%(w/v)5%(w/v)脱脂奶粉中，室温、摇床 脱脂奶粉中，室温、摇床 上避光封闭上避光封闭 1h1h （ 或（ 或 4℃4℃ 过夜）过夜）

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◆◆ 抗体孵育及洗膜抗体孵育及洗膜

●● 将一抗抗体（兔抗将一抗抗体（兔抗 ActinActin ）用）用 1 X TBST 1 X TBST 稀释４稀释４ 0000倍倍

● ● 将封闭后的膜直接放入上述稀释抗体中，将封闭后的膜直接放入上述稀释抗体中，　　　　 4℃4℃ 反应过夜。反应过夜。

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●● 将反应膜放入洗膜盒中，用将反应膜放入洗膜盒中，用 1×TBST1×TBST漂洗漂洗 一次，继而用一次，继而用 1X TBST1X TBST 洗涤三次（室温 洗涤三次（室温 下避光缓慢摇动洗涤），每次换入新液洗涤 下避光缓慢摇动洗涤），每次换入新液洗涤 1010 分钟。 分钟。

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　 　●● 二抗反应：二抗反应：将膜放入１：将膜放入１： 2000 2000 二抗 （兔抗羊二抗 （兔抗羊 IgG/HRPIgG/HRP ）溶液中）溶液中 ,, （（ 1×TBST1×TBST稀释）稀释） ,, 室温、 室温、 缓慢摇动、避光作用缓慢摇动、避光作用 5050 分钟。分钟。 ● ● 1×TBST1×TBST 洗膜三次，每次洗膜三次，每次 1010 分钟。分钟。

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◆◆ 显色反应显色反应 ●● 按按 11：： 11 （（ v/vv/v）混合）混合 ECLECL 试剂盒中Ａ液Ｂ液两种液体 试剂盒中Ａ液Ｂ液两种液体

（注 意：更换（注 意：更换 Tip Tip 尖；两种液体一经混合，应在尖；两种液体一经混合，应在 3030 分分 钟内曝光）；钟内曝光）；

●● 　将上述混合液均匀铺在　将上述混合液均匀铺在 PVDFPVDF 膜表面，室温作用膜表面，室温作用 22 分钟。分钟。 ●● 　抖掉膜上ＥＣＬ液体，用保鲜膜包裹（避免在膜的上面　抖掉膜上ＥＣＬ液体，用保鲜膜包裹（避免在膜的上面 出现气泡）出现气泡）

●● 　 暗室中压Ｘ－光片曝光、显影、定影　　 暗室中压Ｘ－光片曝光、显影、定影　

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★★ 转膜及抗体检测注意问题转膜及抗体检测注意问题

●● 选择合适的转移缓冲系统 　选择合适的转移缓冲系统 　

●● 处理膜的过程中处理膜的过程中 ,,切勿使膜干掉 切勿使膜干掉 　　　　　　　　 ●　　　 ●　选择合适的一抗及二抗浓度选择合适的一抗及二抗浓度

　　 　　 ●　●　选择合适的封闭液选择合适的封闭液

　　　　　　

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　　●● 　　吸取吸取 ECLECL 试剂时要注意更换试剂时要注意更换 TipTip尖尖

●● 　　应考虑ＥＣＬ试剂的发光强度及其衰灭时间应考虑ＥＣＬ试剂的发光强度及其衰灭时间 , , 按按 说明书及实验具体情况进行　说明书及实验具体情况进行　

● ● 建议采用预染色的蛋白分子量建议采用预染色的蛋白分子量 Marker Marker

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　　　　　　　　　　　结果分析　结果分析

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谢　谢谢　谢