webinar nuevos desarrollos tecnológicos para el … · disponibilidad de plantillas ajustadas al...

1

Webinar

Nuevos desarrollos

tecnológicos para el

Screening por LCMS Mayor productividad y confianza en el screening

Agilent Webinar

April 19, 2013

Jaume C. Morales

Agilent Technologies

Especialista de Producto

19 Abril de 2013

11:00h AM

Agenda 1. Screening : Objetivos, Tendencias y Requisitos

2. UHPLC. El primer paso para el alto rendimiento ¿Porqué es Importante la Velocidad en UHPLC?

Posibilidades de la gama 1200 Infinity

Innovaciones Tecnológicas del 1290 Infinity UHPLC

3. Enfoques para el screening por LCMS

4. Herramientas para LCQQQ Screening DMRM y tMRM para mayor rendimiento y confianza

5. Herramientas para LC TOF/QTOF Screening All Ions para el Screening en alta resolución

El poder del análisis retrospectivo

6. LCMS Application Kits

Agilent Webinar

April 19, 2013

Screening : Objetivos, Tendencias y Requisitos

OBJETIVOS

Técnica analítica para detectar la presencia o ausencia de sustancias generalmente a nivel de trazas o bajos niveles de concentración.

Los recientes desarrollos de la espectrometría de masas permiten que el análisis de contaminantes a nivel de trazas resulte una tarea menos laboriosa, más exacta y de mayor confianza.

La legislación europea establece regulaciones para métodos analíticos basados en espectrometría de masas como herramienta de detección reconociendo su potencial de sensibilidad y confianza.

Agilent Webinar

April 19, 2013


TENDENCIAS

Las entidades reguladoras establecen el listado de compuestos a controlar así como sus límites máximos.

Sin embargo, éstas listas van incrementando por razón de los contaminantes emergentes, nuevos estudios así como por los límites más exigentes.

Esta mayor exigencia en número de sustancias a tener en cuenta y mayor sensibilidad obliga a buscar herramientas que permitan un mayor rendimiento.

Hoy en día coexisten principalmente dos enfoques atendiendo a la técnica de espectrometría de masas:

Análisis Dirigido - Análisis No Dirigido

Estos dos enfoques pueden ser únicos o complementarios y cada uno tiene sus ventajas e inconvenientes.

Agilent Webinar

April 19, 2013


REQUISITOS

Cuando el objetivo es buscar el MAYOR RENDIMIENTO de la técnica de screening, es importante tener en cuenta diferentes factores :

• Preparación de Muestra. Lo más simple y mayor recuperación posible.

• Cromatografía. Rapidez, rendimiento y robustez.

• Espectrometría de Masas. Sensibilidad, confianza y reproducibilidad.

• Software de tratamiento de datos. Rápido, inteligente y sencillo.

• Review. Claro, interactivo y sencillo.

• Reporting. Disponibilidad de Plantillas ajustadas al tipo de informe.

Todos éstos factores son importantes, todos SUMAN

Agilent Webinar

April 19, 2013










Agilent Webinar

April 19, 2013

¿Porqué es Importante la Velocidad en UHPLC? El poder de separación de elevadas velocidades lineales

Cromatogramas con escala de tiempo alineada a primer y último pico I.D. & I.M - Waldbronn 5/2009

Columna: ZORBAX SB-C18 2.1 x 100mm 1.8 µm

Gradiente: ACN/H2O 30/70 a 100/0 a 40ºC Cromatogr. A: 0.5mL/min en 3.0min // B: 0.833mL/min en 1.8min

Inyección: 1µL (Uracilo, Fenol, Metil/Etil/Propil/Butil/Heptil-parabens).

P máx. grad. A= 590bars. B= 905 bars

A 0.5mL/m gr.. 3.0min

K‘ = (87 x F x Tg) / ( % x V0 x S)

FxTg = 0.5x3 = 0.833x1.8 = 1.5

B 0.833mL/m

gr. 1.8min

3min Si el producto de Flujo x Tgrad se mantiene

constante el poder de separación no variará (utlizando la misma columna y sin variar los %

solvente orgánico)

1.8min

↑Flujo: Reduce tiempo análisis y mejora

capacidad de separación en gradientes

A 0.5mL/m gr.. 3.0min

B 0.833mL/m

gr. 1.8min Columnas UHPLC permiten subir el flujo para:

- Reducir tiempos (manteniendo Rs)

- Aumentar resolución (sin sacrificar tiempo)

Agilent Webinar

April 19, 2013

• No perder eficacia al aumentar el flujo.

¿Qué se Requiere para Trabajar a Velocidades

Lineales Elevadas? +

EFI

CA

CIA

-

S.T.M.: Sub Two Microns

UHPLC

HEPT = A+ B/u + C u

4.6mm d.i.

UHPLC permite velocidades elevadas sin pérdida de rendimiento

• Poder trabajar a flujos y presiones elevadas.

∆P = f (η .u .L / dp2)

Agilent Webinar

April 19, 2013

UHPLC – Agilent Infinity Series

600 bar

1200 bar

Máxima Presión

(Resolución) RESOLUCION

Agilent Webinar

April 19, 2013

11

Transferencia de métodos de HPLC a UHPLC

www.agilent.com/chem/1200

April 19, 2013 Agilent Webinar

0

200

400

600

800

1000

1200

0 1 2 3 4 5

1290 Infinity

1290 Infinity UPHLC: Compatible con

cualquier HPLC y UHPLC del mercado

bar

ml/min

Standard LC

Vendor A 1.7µm columns

Agilent RRLC 1.8µm columns

Vendor B 1.9µm columns

Vendor C

Vendor D

1290 Infinity le permitirá la máxima reducción de sus tiempos de

análisis y/o aumento de la resolución de sus aplicaciones

5 2

1200

Agilent Webinar

April 19, 2013

1290 Infinity – ¿Qué aporta al mundo del UHPLC?

1290 Infinity NO solo es un equipo capaz de proporcionar

unos rangos mayores de Flujo y de Presión…

1290 Infinity es un equipo INNOVADOR

1290 Infinity incorpora grandes avances en todos sus

módulos, que una vez más, marca la diferencia tecnológica.

Agilent Webinar

April 19, 2013

1290 Infinity Bomba Binaria: nuevo diseño La siguiente generación en Tecnología de Bombas UHPLC

Mezclador

“Jet Weaver“

µ-Desgasificador

Válvula de

Purga

automática

Canal

B Canal

A

Válvula de selección

de 4 disolventes

Gradientes binarios

Pistones de

Carburo de

Silicio

Bombas

de alta

resolución

Alta velocidad y resolución

1200 bar @ 2.0 mL/min

1000bar @ 3.5ml/min

800 bar @ 5.0 mL/min

Volumen muerto: 10 µl / 45 µl

Amortiguador electrónico de pulsos

Procesador de doble núcleo

dedicado al control de pulsos

Motores de 300 picolitros

por paso (0.0003µL)

Largos intervalos de mantenimiento

Corrección Automática Fugas

> 150 Litros de disolvente

Automatismo

Purga automática

4 Motores de alta

precisión:

independientes

para cada pistón

Intercambiador

de calor

multicapa

Agilent Webinar

April 19, 2013

Precision Peak 1 Peak 2 Peak 3 Peak 3 Peak 5 Peak 6 Peak 7 Peak 8 Peak 9

% RSD RT 0.016 0.0077 0.0052 0.0058 0.0058 0.0054 0.0059 0.0057 0.0080

% RSD Area

0.5 µl 0.40 0.39 0.43 0.47 0.40 0.46 0.44 0.52 0.56

RT RSD = 0.005% !!!

Phenone Standard, 10 Consecutive Runs

2.1 x 50mm RRHD SB C18, 1.8µm

1.2ml/min, 0.5ul, 40C

80Hz, 245/10nm, REF 360/80nm

5 - 95% ACN in 0.5min

1290 Infinity UHPLC:

Precisión del Tiempo de Retención

Agilent Webinar

April 19, 2013

Agilent 1290 Infinity

El más Versátil UHPLC:

Binario o Cuaternario

• Cualquier tipo de columnas:

UHPLC, LC, Solid Core, Monolitics,…

• Columnas de 1 a 8 mm d.i..

• Longitudes hasta 25cm x1.8µm.

• UHPLC, HPLC, UFLC…

• ….

• ..

•.

Infinitas Posibilidades !!

Agilent 1290 Infinity UHPLC Poder de separación por unidad de tiempo. Ejemplo Repetibilidad en condiciones extremas

Columna: ZORBAX UHPLC SB-C18 2.1 x 50mm 1.8 µm Gradiente: ACN/H2O 30/70 a 100/0 en 30 segundos 2.4mL/min a 80ºC P.máx. Grad.= 1060 bars

Inyección: 1µL (Uracilo, Fenol, Metil/Etil/Propil/Butil/Heptil-parabens)

min 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4

mAU

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Tiempos RSD% : 0.01 – 0.03%

Áreas RSD% : 0.03 - 0.4% (6 inyecciones de 1µL)

I.D. & I.M - Waldbronn 5/2009

DAD1 A, Sig=254,10 Ref=360,40 (1290 INFINITY\DAY3_B___ 2009-05-28 16-23-46\002-0901.D)






Pk Wd = 0.004-0.005min

1.5 seg.

0.4min

Condiciones Extremas: • Muy elevada velocidad

(eq. 12mL/min en col. 4.6mm d.i.)

• Elevada presión: 1060bars

• Elevada temperatura: 80ºC

• Pequeño vol. inyec.: 1µL

• Gradiente muy rápido: 30s.

• Picos solapados

• ….

*RSD en tiempos para picos K’>0

Agilent Webinar

April 19, 2013

Muestra de tranquilizantes

Columna: Porosa superficial

Poroshell-120 50 x 2.1mm, 2.7um

Flujo 3.5ml/min, ~ 700 bar Gradiente 2-92% ACN en 0.4min

T= 80 °C

0.095sec PW

0.140secPW

Agilent 1290 Infinity UHPLC: Poder de

separación con todo tipo y marcas de columnas

Columnas Superficialmente Porosas:

permiten muy elevadas velocidades lineales

con elevada resolución y menor presión

0.5 s

Núcleo

Sólido

1.7um

} 0.5µm

2.7µm

Agilent Webinar

April 19, 2013

Agilent 1290 Infinity UHPLC Poder de separación con todo tipo de diámetros y flujos. Ejemplo Gradiente Agua/Metanol

Columna: ZORBAX RRHH (600bars) SB-C18 4.6 x 50mm 1.8 µm

Gradiente: MeOH/H2O 30/70 a 100/0 en 1.71min

3.5mL/min a 80ºC Presión. máx grad.: 590bars

Inyección: 5µL (Uracilo, Fenol, Metil/Etil/Propil/Butil/Heptil-parabens)

I.D. & I.M - Waldbronn 5/2009

min 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4

mAU

0

20

40

60

80

100

120

140

T0

1

2

3

4

5

6

DAD1 A, Sig=254,10 Ref=360,40 (002-0501.D)

DAD1 A, Sig=254,10 Ref=360,40 (002-0502.D)

DAD1 A, Sig=254,10 Ref=360,40 (002-0503.D)

DAD1 A, Sig=254,10 Ref=360,40 (002-0601.D)

DAD1 A, Sig=254,10 Ref=360,40 (002-0602.D)

DAD1 A, Sig=254,10 Ref=360,40 (002-0603.D)

min0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4

mAU

0

100

200

300

400

500

DAD1 A, Sig=254,10 Ref=360,40 (002-0501.D)

T0

1

2

3 4 5

6

PMP1, PMP1B, Pressure

DAD1 A, Sig=254,10 Ref=360,40 (002-0502.D)


DAD1 A, Sig=254,10 Ref=360,40 (002-0503.D)


DAD1 A, Sig=254,10 Ref=360,40 (002-0601.D)


DAD1 A, Sig=254,10 Ref=360,40 (002-0602.D)


DAD1 A, Sig=254,10 Ref=360,40 (002-0603.D)

PMP1, PMP1B, PressureTiempos RSD% : 0.01 – 0.05% Áreas RSD% : 0.10 - 0.34% (6 inyecciones de 5µL)

6 perfiles

presión

1ª iny. serie

1.4min

U.F.L.C.

con columnas de

d.i. 4.6mm

Agilent Webinar

April 19, 2013

0

200

400

600

800

1000

1200

0 1 2 3 4 5

Agilent 1290 Infinity UHPLC: Rango

Potencia con Columnas TP 2.1mm d.i.x 1.8um

50 x 2.1 mm

100 x 2.1 mm

150 x 2.1 mm

250 x 2.1 mm

STM = Sub-2um SP = Superficially Porous

TP = Totally Porous

H2O/ACN, 40 °C

bar

ml/min

0.45 mL/min 40ºC

50 x2.1mm

x 1.8µm

40ºC

ZORBAX RRHT SB-C18

2.1 x 50mm x 1.8µm

H2O/ACN

2.4ml/min

T=95 °C

560bar RRLC

50 x2.1mm

x 1.8µm

95ºC

1290 infinity permite usar columnas 250mm x 1.8µm

250mm

40ºC

10 -50

100x2.1mm

40ºC


Quaternary UHPLC Con tecnología de

bomba binaria

1290 Infinity Bomba Cuaternaria

Diversas innovaciones que permiten el alto rendimiento

4-channel

Degasser

MCGV (Multi-

Channel-Gradient-

Valve) Inlet-Weaver Pump Head

Multi-Purpose-

Valve

Switchable Jet

Weaver Mixer

In-line Filter

Agilent Webinar

April 19, 2013

Rango de Potencia de la Bomba Cuaternaria

1290 Infinity

2.0 5.0 10.0

250

800

1200

p [bar]

[ml/min]

= Bomba binaria

Adicional

Bomba Cuaternaria

(HPLC semi-preparativa)

600

1000

1.0

Bomba

Cuaternaria


• 1200 bars: 0-2mL/min

• 800 bars: 5mL/min

• 5-10mL/min hasta 250 bars

Bomba Cuaternaria

Competidor

Agilent Webinar

April 19, 2013

Los 3 Puntos Cruciales para conseguir las máximas prestaciones en una

bomba cuaternaria con mezclado a baja presión:

1. Conocer y tener muy bien caracterizados los eluyentes utilizados.

La Historia de la Bomba Cuaternaria 1290

Infinity es una Historia sobre EXACTITUD!!

Agilent Webinar

April 19, 2013

La Historia de la Bomba Cuaternaria 1290

Infinity es una Historia sobre EXACTITUD!!

Los 3 Puntos Cruciales para conseguir las máximas prestaciones en una bomba

cuaternaria con mezclado a baja presión:

1. Conocer y tener muy bien caracterizados los eluyentes utilizados.

2. Disponer de una bomba inteligente – Amortiguación Activa – con una

bomba de alta resolución (~300 pL por paso del motor)

3. Nuevo mezclador InletWeaver basado en la super-eficiente tecnología Jet

Weaver:

La Bomba Cuaternaria 1290 Infinity ofrece la mayor exactitud y precisión en

todo tipo de aplicaciones.

Premezcla el eluyente

antes de entrar en el

cabezal de bombeo

Mezclador opcional

situado después del

cabezal de bombeo (sólo para condiciones

muy críticas- p.e. TFA)

Agilent Webinar

April 19, 2013

min 2 4 6 8 10 12

mAU

0

20

40

60

80

100

120

0

0.0005

0.001

0.0015

0.002

0.0025

Peak1 Peak2 Peak3 Peak4 Peak5 Peak6 Peak7 Peak8 Peak9

SD data Especificación SD < 0.01min

0,002min

0,0003min

SD = 0,001min

1290 Infinity Cuaternaria–Análisis Gradientes

Precisión Composición

1/5

1/10

1/20

Agilent Webinar

April 19, 2013

El mayor desarrollo tecnológico en la serie 1290 es que apenas hay diferencias en la

calidad y robustez de la mezcla entre ambas bombas.

La principal diferencia entre ambas, por el propio diseño de un cabezal o dos, es el

Volumen muerto interno.

Esto hace que la única limitación de una bomba 1290 cuaternaria sean análisis de

gradiente Ultra-rápido :

P.e. Gradiente de 0-100% en 3 min. High throughput (Farma, Clinical,…)

Serie 1290 Infinity. Binaria - Cuaternaria

Idoneidad del tipo de bomba

BINARIA CUATERNARIA

Precisión de Flujo ≤0.07 % RSD ≤0.07 % RSD

Exactitud de Flujo ±1 % or ± 10 μL/min ±1 % or ± 10 μL/min

Precisión de Composición <0.15 % RSD, or 0.01

min

<0.15 % RSD, or 0.02 min

Exactitud de Composición ±0.35 % absolute ±0.40 % absolute

Precio - - 77% BIN

Agilent Webinar

April 19, 2013


UHPLC/MS

La mejor capacidad de

separación para mejorar

sus resultados en

LC/MS

Una buena

separación

ayuda a

minimizar la

“supresión”

de

Ionización

en LC/MS

30:70 agua/metanol, 0.2 % ácido acético

Inte

nsity

, cps

Difenhidramina

m/z 256.17

Ketoprofeno

m/z 255.10

Time, min

0.0

6.0e4

1.2e5

1.8e5

2.4e5

3.0e5

3.6e5

4.2e5

4.8e5

0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 1.10 1.20 1.30 1.40

Difenhidramina

m/z 256.17

0.0

6.0e4

1.2e5

1.8e5

2.4e5

3.0e5

3.6e5

4.2e5

4.8e5

Inte

nsity

, cps

0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00

Time, min

Ketoprofeno

m/z 255.10

5:95 agua/metanol, 0.2 % ácido acético

1/7 respuesta (-85%)

Una buena cromatografía

puede mejorar

considerablemente la

sensibilidad y robustez de

los resultados por LC/MS

La Importancia de una Buena Separación incluso con LC/MS Altamente Selectivos

Agilent Webinar

April 19, 2013

1290 Infinity UHPLC + 6460 QQQ Jet Stream Productividad: Análisis 250 Pesticidas en 8 min - Dynamic MRM.

Columna 100x2,1mm x 1.8µm Zorbax Eclipse Plus C18

500ppt, dynamic MRM Retention Time Window = 12 sec

Peak widths ~ 1 second

Zorbax Eclipse Plus C18

2.1 x 100mm (1.8μm)


1290 Infinity/6540-UHD-QTOF: Fast UHPLC

“Screening” 250 Pesticidas en 90 segundos.


Fenpyroximate E Mass [M+H]+ = 422.20806 Resolution = 38636 -0.25ppm

1290/6540 90seg análisis 250 pesticidas (125pg on-column)

MS con masa exacta

1-naphthol Mass [M+H]+ = 145.06489 Resolution = 24909 0.06 ppm

Spinosad A Mass [M+H]+ = 732.4687

Resolution = 47094 -0.77ppm

90s

LC/MS-TOF(/QTOF): “Screening” de cualquier compuesto ionizado

6540-QTOF

Resolución

espectral: 25-47K

2.1 x 50 mm x 1.8µm Eclipse Plus C18

1.2 mL/min, 60 ºC

1290 Infinity/6540-UHD-QTOF: 10 ppb Pesticidas

en Pimiento Rojo en 90 segundos


2.1 x 50 mm x 1.8µm Eclipse Plus C18

1.2 mL/min, 60 ºC

1

Counts vs. Acquisition Time (sec) 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88

1a

1b

3a 4a

4b

2a

2b

3b

Name RT Mass Mass (Tgt) Diff (Tgt, ppm) Score (Tgt)

1a tricyclazole 0.652 189.036175 189.036068 0.57 98.10

1b propazine 0.929 229.109356 229.109423 -0.29 97.50

2a diethofencarb 0.953 267.146937 267.147058 -0.45 85.49

2b cyprodinil 0.936 225.126620 225.126598 0.10 98.82

3a cyproconazole 0.925 291.114106 291.113840 0.91 97.92

3b paclobutrazol 0.923 293.129448 293.129490 -0.14 96.74

4a tetraconazole 0.972 371.021290 371.021530 -0.65 99.45

4b azoxystrobin 0.957 403.116637 403.116821 -0.45 99.19

50 pg on-column

Exactitud m/z (promed. abs. ) : 0.45ppm

90s

90s

4 seg.

10 ppb’s

10 ppb’s

36

Transferencia de métodos de HPLC a UHPLC

www.agilent.com/chem/1200











Agilent Webinar

April 19, 2013

La determinación de compuestos residuales puede abordarse con dos enfoques :

• Dirigido. Número acotado de compuestos a confirmar.

• Más sensible (*)

• El nº de compuestos depende principalmente del sistema cromatográfico y de la velocidad del MS.

• Sin capacidad de determinar NO esperados.

• Sin capacidad de análisis retrospectivo.

• NO Dirigido. Adquisición indiscriminada de Full Scan y/o MS/MS.

• El nº de compuestos a detectar es mucho mayor (casi ilimitado).

• La detección del compuesto se realiza a través algoritmos de deconvolución.

• La acotación de compuestos detectados viene limitada por la base de datos o librerías de los posibles compuestos a identificar

• Menos sensible (*)

Dos enfoques de Screening

38

(*) Depende del modelo de QQQ y TOF/QTOF

Agilent Webinar

April 19, 2013

Dos enfoques de Screening

39

Dirigido

No dirigido

Agilent Webinar

April 19, 2013

Dos enfoques de Screening, COMPLEMENTARIOS

• El barrido o screening nos permite confeccionar un listado de los compuestos que

estan presentes por técnicas de IDENTIFICACIÓN.

• La Cuantificación y confirmación posterior de SÓLO aquellos compuestos que

dieron positivo permite obtener unos resultados más sensibles, reproducibles y

robustos.

40

Screening Confirmación Cuantificación

Agilent Webinar

April 19, 2013

Screening Cuantificción

Flujo de trabajo óptimo para LC/MS 1200 Infinity LC

Agilent LC/TOF/QTOF

El TOF/QTOF

detecta todo

aquello que se

ionice en la fuente

Los compuestos

se identifican por

masa exacta

Agilent Webinar

April 19, 2013

Cuantificción

Flujo de trabajo óptimo para LC/MS 1200 Infinity LC

Agilent LC/TOF/QTOF

Confirmación Cuantificación

1290 Infinity UHPLC

Agilent 6400 LC/QQQ

El TOF/QTOF

detecta todo

aquello que se

ionice en la fuente

Los compuestos

se identifican por

masa exacta

Screening

Agilent Webinar

April 19, 2013

Nuevas herramientas

• El objetivo del desarrollo de estas nuevas herramientas es

dotar de mayor confianza a los resultados.

• El Screening puede abordarse desde dos enfoques

complementarios, “Dirigido” y “NO Dirigido” y Agilent ha

desarrollado herramientas para ambos.

• La mayor confianza viene determinada por una mayor

capacidad de confirmación de positivos y negativos.

43

Agilent Webinar

April 19, 2013

Nuevas herramientas

• El enfoque Dirigido basa la confirmación en la respuesta relativa de una 2a o 3a MRM que en demasiadas ocasiones la matriz desvirtúa por interferencias o en técnicas de atrapado lentas que deterioran la cuantificación.

Requiere una herramienta alternativa de mayor confianza en la confirmación : tMRM

• El enfoque NO Dirigido basa la confirmación en la masa exacta y perfil isotópico pero en muchas ocasiones NO es suficiente pues existen compuestos isobáricos que dan la misma ID.

Requiere una herramienta alternativa de mayor confianza en la confirmación : All Ions

44

Agilent Webinar

April 19, 2013










Agilent Webinar

April 19, 2013

DMRM y tMRM

aplicaciones

Screening Dirigido

46

Mayor confianza en la confirmación

Agilent Webinar

April 19, 2013

x3 x4 x4 x3 x4 x2 x1 Nº de Transiciones Concurrentes =

Rt

Selección de 24 transiciones de analitos Para ilustrar la eficacia de los Tiempos de Ciclo usando dynamic MRMs.

Tiempo de Ciclo

MRM dinámico

Agilent Webinar

April 19, 2013

Time >>>

Abundance >

>>

Concurrent

Compounds

MRM dinámico - Simulación

Agilent Webinar

April 19, 2013

¿Para qué sirve el triggered MRM? Cuantificación y Confirmación : Fingerprinting

49

Enfoque de barrido:

Barrido de la huella del compuesto

Estrategia tMRM:

Foco en las características (fragmentos)

del compuesto

Dos posibles escenarios:

- Confirmación de positivos con información adicional

(confirmación espectral)

- Eliminación de negativos debido a interferencias de la matriz


Agilent Webinar

April 19, 2013

50

Triggered MRM (tMRM) Analysis

Threshold

MRM Secundarias

“Triggered”

MRMs Primarias (bajo threshold)

Triggered MRM (sobre threshold)

Compound Precursor Product

Analyte 1 334.0 145.0

Analyte 1 334.0 117.0


Analyte 1 334.0 145.0

Analyte 1 334.0 117.0

Analyte 1 334.0 132.1

Analyte 1 334.0 105.1

Analyte 1 334.0 91.1

Analyte 1 334.0 76.0

Analyte 1 334.0 119.0


Agilent Webinar

April 19, 2013

tMRM Scanning

51

0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0

tMRM Scan < 50ms

Acquisition Time (seconds)

tMRM Scans

Compatible con UHPLC

buen perfil cromatográfico +

buena cuantificación

Trigger

tMRM


Agilent Webinar

April 19, 2013

0 .1 .2 .3 .4 .5 .6 .7 .8 .9 1.0

_Trap Product Ion Scan = 200ms

Acquisition Time (seconds)

Scanning por Atrapado

52

Trigger

Full Scan

Full Scan

Full Scan

Full Scan

Requiere analisis más largos con

picos más anchos

Perfil de pico pobre,

cuantificación no

reproducible

Agilent Webinar

April 19, 2013

53

Triggered MRM (tMRM) Analysis

Threshold

MRM Secundarias

“Triggered”

MRMs Primarias (bajo threshold)

Triggered MRM (sobre threshold)


Analyte 1 334.0 145.0

Analyte 1 334.0 117.0


Analyte 1 334.0 145.0

Analyte 1 334.0 117.0

Analyte 1 334.0 132.1

Analyte 1 334.0 105.1

Analyte 1 334.0 91.1

Analyte 1 334.0 76.0

Analyte 1 334.0 119.0


Agilent Webinar

April 19, 2013

54

tMRM Product Ion Spectrum

x103

8

7

6

5

4

3

2

1

0 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340

334.2 171.1

145.0

132.1

117.0

105.1 91.1 76.0

tMRM Product Ion

Spectrum

x103 8

7

6

5

4

3

2

1

0 80

76.0

x103 8

7

6

5

4

3

2

1

0 80 100

91.1

x103 8

7

6

5

4

3

2

1

0 80 100 120

105.1

x103 8

7

6

5

4

3

2

1

0 80 100 120

117.0

x103 8

7

6

5

4

3

2

1

0 100 140

132.1

x103 8

7

6

5

4

3

2

1

0 80 100 120

119.0

x103 8

7

6

5

4

3

2

1

0 100 140 180

145.0 x103

8

7

6

5

4

3

2

1

0 100 140 180

147.0

x103 8

7

6

5

4

3

2

1

0 80 100 120 140 160 180

171.1

334 > 76 334 > 91 334 > 105 334 > 117 334 > 119

334 > 132 334 > 145 334 > 147 334 > 171

Agilent Webinar

April 19, 2013

tMRM Library Searching

Tebufenpyrad Standard 50 ppb

Library match score: 96.75

Agilent Webinar

April 19, 2013

La Solución Analítica Ideal

para compuestos conocidos

tMRM

Cualitativo Coste

Efectivo Cuantitativo

POINT

POINT

POINT

POINT

POINT

POINT

Fast Cycle Time

Single Instrument

Accurate

Sensitive

High Throughput

Short Run Time

Product Ion Spectrum

Library Searching

Confirmation

Page 56


Agilent Webinar

April 19, 2013

Funciones tMRM

Funciones de Triggering en MH Acquisition

Permiten centrar los tMRM en el centro del pico

57

Agilent Webinar

April 19, 2013

Acephate as example

• Entrance delay 0

• Trigger delay 0

• Trigger Window 0.5

• Threshold 500

• Repeat 3

59

Agilent Webinar

April 19, 2013

Acephate as example


• Trigger delay 0


• Threshold 500

• Repeat 3

60

Agilent Webinar

April 19, 2013

Acephate as example


• Trigger delay 2


• Threshold 500

• Repeat 3

62

Agilent Webinar

April 19, 2013

Acephate as example


• Trigger delay 1


• Threshold 500

• Repeat 5

63

Agilent Webinar

April 19, 2013

Nuevos parámetros de tMRM

También el Optimizer puede usar tMRM para detectar todas las

transiciones de un compuesto

64

Agilent Webinar

April 19, 2013

Nuevos parámetros de tMRM

Funciones Triggering en MH Qual

Fácil navegación de compuesto a compuesto

67

Agilent Webinar

April 19, 2013

tMRM

• Ejemplo de aplicación – uso del tMRM

• Comparación con el dMRM

• Ejemplos con matrices reales

68

Agilent Webinar

April 19, 2013

Parámetros de método

UHPLC method

MS method

Electrospray ionization

Triggered MRM: 2 MRM primarias más 8 MRM adicionales de confirmación

Dynamic MRM: 2 MRM por compuesto

71

UHPLC column Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 RRHD

2.1 x 150 mm, 1.8 µm @ 30°C

Mobile phase A: 5 mM NH4 formate + 0.1% formic acid

B: 5 mM NH4 formate + 0.1% formic acid in methanol

Gradient

program

Min % B

0 5

0.5 5

3.0 40

17 100

19 100

19.1 5

Stop time 22 min

Flow rate 0.40 ml/min

Injection volume 3 µl

Agilent Webinar

April 19, 2013

Cromatograma UHPLC-MS/MS a 10ng/mL en

extracto de limón

72

Agilent Webinar

April 19, 2013

0

20

40

60

80

100

120

< 0.1 0.1 to 0.25 0.25 to 0.5 0.5 to 1 >1

Nu

mber

of

pest

icid

es

Limit of quantitation in µg/kg

Solvent

Lemon extract

Validación del método – Límites de cuantificación

73

Agilent Webinar

April 19, 2013

Rendimiento cuantitativo - Oxamyl

75

Curva de calibración dMRM Curva de calibración tMRM

Agilent Webinar

April 19, 2013

y = 0.9987x

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 140000 160000 180000

Calib

rati

on s

lopes

Trig

gere

d M

RM

Calibration slopes Dynamic MRM

Rendimiento cuantitativo - Comparación

76

Pendientes de la curva de calibración para todos los pesticidas en el método

Agilent Webinar

April 19, 2013

Muestra real– Napropamida en extracto de limón

77

Acquisition Time (min)

12.5 12.6 12.7 12.8 12.9 13 13.1 13.2 13.3

Counts

4 x10

-0.2

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

2.2

2.4

2.6

2.8

3

3.2

Napropamid: Lemon spike 1 µg/kg.d: +ESI MRM: 272.2 -> 58.1 , 272.2 -> 171.1

Ratio = 65.3 (100.9 %)

Cromatograma MRM de las 2 transiciones primarias a 1µg/kg

Agilent Webinar

April 19, 2013

+ MRM (14.865-15.031 min, 13 scans) (334.2 -> * …

Mass-to-Charge (m/z)

50 100 150 200 250 300

C o u n t s

3 x10

-1.4

-1.2

-1

-0.8

-0.6

-0.4

-0.2

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2 117.0

117.0

147.1

145.0 91.1

76.0

57.1 334.2

Lib Match Score=55.9

Muestras Reales– Tebufenpyrad en extracto de

gengibre

78

Reference spectrum


14.6 14.8 15 15.2 15.4

C o u n t s

5 x10

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

334.2 -> 117.0 , 334.2 -> 145.0

Ratio = 46.9 (209.9 %)

Agilent Webinar

April 19, 2013

Muestras Reales– Tebufenpyrad en extracto de

gengibre

79

Reference spectrum

Agilent Webinar

April 19, 2013

Muestras reales – Tebuthiuron en extracto de

camamilla

80

Reference spectrum


9.2 9.3 9.4 9.5 9.6 9.7 9.8 9.9 10

Co

un

ts 4x10

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

229.1 -> 172.1 , 229.1 -> 116.0

Ratio = 40.3 (204.3 %)

Agilent Webinar

April 19, 2013

Muestras reales – Tebuthiuron en extracto de

camamilla

81

Reference spectrum


9 9.1 9.2 9.3 9.4 9.5 9.6 9.7 9.8

Co

un

ts 4x10

-0.2

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

2.2

229.1 -> 172.1 , 229.1 -> 116.0

Ratio = 19.8 (100.6 %)

Agilent Webinar

April 19, 2013

Library match score

Pesticide Matrix Target compound Matrix interference

Dichlovos Lemon 94.5 % 78.1 %

Thifensulfuron-methyl Green Tea 96.6 % 71.5 %

Tebufenpyrad Ginger 99.8 % 55.9 %

Tebuthiuron Chamomile 97.8 % 58.0 %

Imazalil Chamomile 99.8 % 58.1 %

Terbutylazin Chamomile 99.6 % 82.1 %

Muestras reales– ejemplos por interferencia de

matriz

Agilent Webinar

April 19, 2013

Compounds at a glance Eficaz herramienta gráfica y rápida de revisión de resultados

83

Agilent Webinar

April 19, 2013

Resumen del tMRM

84

• El Triggered MRM epermite confirmación espectral a niveles de LOQ

• Mismo rendimiento cuantitativo que los métodos MRM tradicionales

• Integration única con las nuevas triggered MRM databases y librerías

• La comprobación automática con la librería de espectros permite una eficaz

revisión de los resultados y “etiquetado” de los casos sospechosos.

• Utilizando una sola transión primaria en tMRM, nos permite afrontar un método

con mayor número de compuestos en multiresiduo.

Innovation Tour

19 de abril de 2013

Application notes para su información

85

5990-8461EN 5991-1183EN

Agilent Webinar

April 19, 2013










Agilent Webinar

April 19, 2013

Fundamentos de

All Ions y aplicaciones

Screening NO dirigido

87


en Alta Resolución

Agilent Webinar

April 19, 2013

All Ions MS/MS AIM para mayor confianza en la identificación

La mejor solución del mercado para screening en alimentación, medio ambiente y forensica/toxicología

• Exclusivo de Agilent:

– Librerías de espectros MS/MS de masa exacta para identificar los fragmentos

– Coelution score para confirmar que los fragmentos pertenecen al ión precursor

• Re-procesado de los datos para desconocidos sin re-adquisición

Análisis retrospectivo

• Rápida incorporación de desconocidos a la librería de MS/MS para incluir en el screening

• Rápida creación del método cuantitativo para screening

multiresiduos

88

Agilent Webinar

April 19, 2013

Conforme a los requisitos de screening SANCO 12495

– Al menos 2 iones producto

– Confirmación final con un compuesto referencia

Agilent ofrece un flujo de trabajo totalmente desarrollado en All Ions MS/MS para la confirmación del compuesto y la creación del método cuantitativo.

Para TOF y QTOF

Características:

– Fácil y simple método de Adquisición (Full Scan)

– Identificación dirigida del compuesto usando las librerías Agilent de espectros MS/MS

– Confirmación cromatográfica de los iones producto (coelution score)

– Rápida creación del método Quant. Automáticamente selecciona dos iones producto de alta calidad para cada compuesto, eliminando la tediosa tarea de crearlo manualmente.

El usuario dispone de forma rápida y segura de hacer la cuantificación dirigida de sus compuetos

All Ions MS/MS – Screening Superior

89

Agilent Webinar

April 19, 2013

Canal Baja energía

All Ions MS/MS – Screening Superior

90

Agilent Webinar

April 19, 2013

Adquisición en doble canal de Energía (TOF /QTOF) :

Ión Molecular :

Masa Exacta

Perfil Isotópico

Fragmentación

No Fragmentación

MS

MS/MS

Sucesión Energía Baja/Alta

espectro a espectro

Max. 50 spectros / segundo

Fragmentos : Espectro MS/MS Masa Exacta

Canal Alta energía

Cuantificación del

compuesto

encontrado con

información adicional

de fragmentos

Flujo de trabajo de All Ions MS/MS Dirigido

Adquisición PCDL Qual Quant

MassHunter Acquisition

Voltage

Alto/bajo

de Fragmentor

en TOF y Q-TOF

Librería de

pesticidas

(~450-500

compuestos con

espectros)

Librería Forensics

/Tox (2720

compuestos con

espectros)

Energía de Colisión

Alta/Baja

en Q-TOF

“Find by Formula”

en MS canal baja Ɛ

“EICs” de los

fragmentos en el canal

MS de alta Ɛ

Correlaciona

fragmentos cualificados

con el compuesto

Busca

Extracción

Cualifica y confirma

fragmentos

Exporta

Alinea EIC’s de los

fragmentos con EIC del

ión padre

Targets

m/z, especies

iónicas

Quant

Report

Qual

Report

91

Agilent Webinar

April 19, 2013

Características de All Ions MS/MS :

Facil creación del método de Adq.

En el método de MassHunter Acquisition tan sólo hay que

especificar dos canales de diferente energía. Un “low channel”

(e.g. sin Collision Energy) y un “high channel” (e.g. CE = 20).

No hay necesidad de entrar parámetros para cada compuesto

como en un QQQ. ¡Mucho más fácil y rápido!

92

Al crear un

Experiment # nos

permite crear

canales de baja y

alta energía para

Frag y CE

Agilent Webinar

April 19, 2013

Ejemplo: Trazodone All Ions MS/MS

93

Espectro de baja Energía

Espectro de alta Energía

Agilent Webinar

April 19, 2013

Características de All Ions MS/MS : Targeted

Identification Using Agilent’s PCDLs

Personal Compound Database and Libraries (PCDLs) contiene

espectros MS/MS de masa exacta. All Ions MS/MS utiliza los

product ions del espectro para confirmar la identificación de los

iones padre — Resultado : ¡menor nº de falsos positivos!

.

Aplicación PCD PCDL

Forensics / Tox 7360 compuestos Más espectros para 2720

compuestos

Pesticides 1609 compuestos Más espectros para 500

compuestos

Veterinary Drugs ~1000 compuestos Más espectros para ~500

compuestos

Metabolomics METLIN rev. B.05.00

(~50,000 compuestos)

METLIN rev. B.05.00 (Más

espectros para ~9000

compuestos)

94

Agilent Webinar

April 19, 2013

Características de All Ions MS/MS : Confirmación Cromatográfica de los Product Ions

95

Solapamiento de los

cromatogramas de Baja

y Alta Energía

Curvas de Coelución

Los iones Precursor y

Producto coinciden

exactamente en sus

máximos.

Agilent Webinar

April 19, 2013

All Ions MS/MS in Qualitative Analysis rev. B.06.00

New panel allows easy setup of All Ions MS/MS:

96

Minimum Coelution

score

Turn on All Ions MS/MS

using the current

Formula Source PCDL

Agilent Webinar

April 19, 2013

New Compound Details View in Qual rev. B.06.00

97

Nuevas

ventanas que

muestran toda

la información

compuesto a

compuesto

Todos los

datos

pertenecientes

a un único

compuesto se

visualizan fácil

y rápidamente

Agilent Webinar

April 19, 2013

Compound results .cef file Quant method

- Accurate mass

EICs for quantifier

and qualifier

- Relative responses

- Retention times

Adduct patternReference pattern library

Import and Build Qual/Quan Method from Qual

98

MH Qual

MH Quant

Agilent Webinar

April 19, 2013

Rapid Quant Method Setup by Importing the .CEF

File from Qual

99

Precursor ions with

different fragmentor

voltages are used as

qualifiers

Agilent Webinar

April 19, 2013

Rapid Quant Method Setup by Importing the .CEF

File from Qual

100

Quant

methods with

hundreds of

compounds

can be set up

in minutes!

There is no

need to type

in the

compound

names—they

are already in

the PCDL.

Agilent Webinar

April 19, 2013










Agilent Webinar

April 19, 2013

Simplify Your Startup

102

LC/MS Application

Kits

Method

Standards

On Site Training

LC Column

Databases and

Libraries

Agilent Webinar

April 19, 2013

LC/MS Application

Kits

Method

Standards

On Site Training

LC Column

tMRM Database

tMRM LC/MS Application Kits Targeted Screening with QQQ

103

Pesticides

-Test Mix: 253 compounds

-DB: 700+ compounds

-Library: 250+ compounds

Veterinary Drugs


-DB: 600+ compounds


Forensic Toxicology


-DB: 2500+ compounds


Agilent Webinar

April 19, 2013

Accurate Mass LC/MS Application Kits Untargeted Screening with TOF or QTOF

LC/MS Application

Kits

Method

Standards

On Site Training

LC Column

Accurate Mass

MS/MS Library

104

Pesticides




Veterinary Drugs




Forensic Toxicology




Agilent Webinar

April 19, 2013

105

Agilent Webinar

April 19, 2013

106

Agilent Webinar

April 19, 2013

107

Webinar

Nuevos desarrollos

tecnológicos para el

Screening por LCMS Mayor productividad y confianza en el screening

Agilent Webinar

April 19, 2013

Jaume C. Morales

Agilent Technologies

Especialista de Producto

[email protected]

19 Abril de 2013

11:00h AM

webinar nuevos desarrollos tecnológicos para el … · disponibilidad de plantillas ajustadas al...

Documents