AVALIAÇÃO DE MEMBRANAS DE POLI(3-HIDROXIBUTIRATO) CONTENDO ANTIBIÓTICO PARA UTILIZAÇÃO EM

REGENERAÇÃO TECIDUAL GUIADA

Marcio A. C. Silva1, Marysilvia M. F. Costa1, Rossana M.S.M. Thiré1*

1 Laboratório de Biopolímeros, Programa de Engenharia Metalúrgica e de Materiais - COPPE - Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro (RJ), Brasil

E-mail: rossana@metalmat.ufrj.br

Resumo. A periodontite é a inflamação dos tecidos periodontais e leva à deterioração dos tecidos que dão suporte ao dente. A técnica de Regeneração Tecidual Guiada (RTG) pode ser utilizada para a reconstrução do periodonto. Esta técnica faz uso de membranas de barreira que evitam o crescimento epitelial para o local da ferida. Além disso, as membranas de RTG também podem ser utilizadas em sistemas para liberação de antibióticos para proteger o defeito de infecções oportunistas. Recentemente, tem sido crescente o interesse na utilização de membranas constituídas por polímeros biodegradáveis, assim como o poli(3-hidroxibutirato) - PHB, a fim de evitar a necessidade de um segundo procedimento cirúrgico para a remoção da membrana. O PHB é um poliéster microbiano, biodegradável e biocompatível com uma grande variedade de células animais. O objetivo deste trabalho foi produzir e caracterizar membranas periodontais absorvíveis de PHB contendo o metronidazol. Este fármaco é um coadjuvante que possibilita um resultado mais satisfatório do que o tratamento mecânico exclusivo. Membranas de PHB contendo 2% de fármaco e 20% de citrato de etila (plastificante) foram fabricadas via moldagem por compressão. Essas membranas foram submetidas a ensaios de liberação de fármaco em solução tampão de acetato de potássio a pH 5,0 e analisadas ao longo do tempo por ensaios de tração e microscopia eletrônica de varredura (MEV). A quantidade de metronidazol liberada foi quantificada por espectrofotometria UV-Vis. Os resultados obtidos mostraram que houve aproximadamente 100% de liberação do fármaco após cinquenta dias. A análise da cinética de liberação do fármaco indicou a difusão fickiana como mecanismo dominante para transferência de massa. Ensaios de tração mostraram que as membranas mantiveram a integridade mesmo após a liberação do fármaco. Desta forma, pode-se concluir que os filmes de PHB carregados com metronidazol apresentam propriedades desejáveis para utilização como membranas de RTG.

Palavras-chave: poli(3-hidroxibutirato), metronidazol, regeneração tecidual guiada, membrana periodontal, liberação de fármaco

1. INTRODUÇÃO

A periodontite é a inflamação dos tecidos periodontais. A lesão periodontal tem seu início no acúmulo de placa bacteriana. Essa inflamação promove a perda precoce dos elementos dentários por deterioração dos tecidos que dão suporte ao dente. A técnica de Regeneração Tecidual Guiada (RTG) pode ser utilizada para a reconstrução do periodonto [Magini, 2009]. Esta técnica envolve a colocação de uma membrana de barreira entre o dente e o tecido conjuntivo gengival, a fim de evitar o crescimento epitelial para o local da ferida,

permitindo assim a formação de estruturas funcionais. Essas membranas podem ser bioabsorvíveis ou não-bioabsorvíveis. Apesar dos resultados clínicos serem semelhantes entre membranas bioabsorvíveis e não-bioabsorvíveis, as membranas bioabsorvíveis apresentam a vantagem de evitar um segundo procedimento cirúrgico para a remoção da membrana [Costa e Thiré, 2011].

O PHB é um poliéster microbiano, biodegradável e biocompatível com uma grande variedade de células animais [Shishatskaya, 2008]. Por isso, é um material interessante para a confecção de membranas para RTG. No entanto, é necessário acrescentar aditivos, assim como plastificantes, aos filmes de PHB a fim de aumentar a sua ductilidade.

O fármaco metronidazol é um coadjuvante que, quando aplicado ao tratamento das lesões periodontais, possibilita um resultado mais satisfatório do que o tratamento mecânico exclusivo [Griffiths, 2000]. Sendo assim, este fármaco é utilizado na confecção de algumas membranas [Tatakis, 1999].A tecnologia de liberação controlada de fármacos busca resolver inúmeros problemas associados à administração tradicional dos princípios ativos por meio da regulação da taxa e da localização espacial de liberação do agente. Os sistemas de liberação controlada proporcionam, por um longo período de tempo, efeitos terapêuticos que só poderiam ser alcançados após múltiplas administrações pelas formas convencionais [Costa e Thiré, 2011].

O objetivo deste trabalho foi estudar a liberação “in vitro” do metronidazol contido em membranas de PHB visando a sua aplicação em RTG.

2 MATERIAIS E MÉTODOS

As membranas periodontais foram confeccionadas em PHB, fornecido pela PHB Industrial S/A (Biocycle 1000®, lote 141), contendo o fármaco Metronidazol e o plastificante citrato de etila, ambos P.A. e adquiridos da Sigma-Aldrich. O fármaco (2% p/p) e o plastificante (20% p/p) foram adicionados ao PHB por meio de agitação manual. Os filmes foram produzidos pelo processo de moldagem por compressão. Para os ensaios de liberação de fármaco e de tração foram produzidos corpos de prova retangulares nas dimensões de 8 mm X 100 mm x 0,284 mm (L x C x E).

A avaliação morfológica dos filmes foi realizada por microscopia eletrônica de varredura (MEV) em um equipamento JEOL JSM (modelo 6460 LV). As amostras foram recobertas com uma fina camada de ouro obtida por pulverização a vácuo (20 mA por 2 min) e observadas a 10 kV. Também foi utilizada microscopia ótica em um microscópio Olympus (modelo GX71).

Os ensaios de liberação do metronidazol foram realizados com base nos procedimentos descritos por Shifrovitch et al. (2008). As amostras foram colocadas em tubos Falcon contendo 15 ml de solução tampão acetato de potássio pH 5,0. Os tubos foram mantidos a 37˚C em agitação orbital de 120 rpm. Foram coletadas amostras de 1,5 ml da solução tampão acetato de potássio do interior dos tubos ao longo de 48 dias. Após a coleta de cada amostra, o nível de solução dentro do tubo foi completado com o mesmo volume de solução tampão [Shifrovitch, 2008]. A concentração do fármaco na amostra coletada foi determinada por espectrofotometria UV-Vis com base na curva padrão do metronidazol obtida

no comprimento de onda de 320 nm. Esse comprimento de onda foi escolhido por ser aquele no qual o metronidazol apresentou o maior pico de absorção, Fig. (1).

200 250 300 350 400 450-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

Abso

rbân

cia (A

)

Comprimento de Onda (nm)

Acetato pH 5

Figura 1 - Varredura do espectro UV (200-450 nm) para o fármaco metronidazol em meio tampão acetato de potássio a pH 5,0.

Para eliminar o erro produzido pela diluição da solução por inserção de solvente um fator de correção foi aplicado à concentração da amostra, conforme apresentado na Eq. (1) [Shifrovitch, 2008]:

Fator de correção= (15/(15-1,5))(n-1), Equação (1)

onde n é o número sequencial da amostra, 1,5 é o volume em mililitros da alíquota retirada e 15 é o volume total do tubo em mililitros.

Para a avaliação da manutenção da integridade das membranas corpos de prova foram submetidos a ensaios de tração antes e depois da liberação de fármaco. Os corpos de prova foram cortados com as dimensões de 0,80 cm X 10 cm, conforme a Norma ASTM D882-91 [D882-91, 1991]. Os ensaios de tração foram conduzidos numa máquina universal de testes, INSTRON (modelo 5582), utilizando uma cela de carga de 1 KN. A velocidade do travessão foi de 0,5 mm/min. Os resultados foram apresentados como médias de todos os ensaios efetuados para cada uma das amostras.

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1 Análise morfológica

Os filmes de PHB carregados com metronidazol apresentaram espessura média de (284 ± 29) μm. Em uma análise por microscopia ótica, o fármaco mostrou-se bem distribuído pela matriz, sem a formação de agregados. Os cristais de metronidazol apresentaram comprimento médio do eixo maior de (3,29 ± 2,37) μm (Fig. (2a)). Em função da diferença de foco, foi possível inferir que o fármaco estava também distribuído no interior do filme.

Pelas imagens de microscopia eletrônica de varredura (MEV), os cristais do fármaco presentes na superfície da membrana podem ser visualizados em detalhes (Fig. (2b)).

Observa-se que as membranas produzidas com (Fig. (2b)) e sem fármaco (Fig. (2c)) são densas.

Figura 2 - Micrografias dos filmes de PHB contendo metronidazol. Imagem de Microscopia ótica da membrana contendo metronidazol (a). Imagens de MEV da membrana de PHB (b)

contendo metronidazol e (c) sem fármaco.

3.2 Cinética de Liberação do Fármaco

A Fig. (3) mostra o perfil de liberação de metronidazol a partir de membranas de PHB imersas em solução tampão com pH 5,0 a 37°C, simulando um ambiente de inflamação.

Os resultados obtidos mostraram que houve aproximadamente 100% de liberação do fármaco após cinquenta dias. É possível inferir também que mais de 50% do fármaco inicialmente contido no corpo de prova foi liberado após 1,5 dias. Levando-se em consideração a concentração mínima inibitória (MIC) para este fármaco contra o patógeno Porphyromonas gingivalis descrita na literatura como sendo de 0,122 µg/ml [Poulet, 1999], podemos afirmar que uma membrana assim produzida seria eficaz contra esse patógeno já a partir da primeira hora após a sua implantação, uma vez que, de acordo com a Fig. (3a), neste período, já teriam sido liberados para o meio 0,12 mg/ml de metronidazol. Podemos notar também que a liberação do fármaco para o meio parece ter atendido a dois comportamentos distintos, uma fase inicial de liberação rápida e uma fase tardia de liberação mais lenta. O ponto da curva que divide esses dois comportamentos localiza-se em 80% do fármaco

liberado, o que ocorreu por volta do nono dia do ensaio. A primeira etapa pode estar associada à liberação dos cristais de metronidazol adsorvidos na superfície do filme.

0 10 20 30 40 50-0,05

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

Conc

Med

(mg/m

l)

Tempo (Dias)

A

0 10 20 30 40 50

0

20

40

60

80

100

120

Liber

acao

(%)

Tempo (Dias)

B

Figura 3 - Liberação acumulada de metronidazol a partir de membranas de PHB . (a) liberação mássica do fármaco. (b) liberação percentual do fármaco.

Para que se possa afirmar que há difusão do fármaco pela matriz polimérica do filme de PHB algumas condições precisam estar presentes [Higuchi, 1961]:

1.A concentração inicial na matriz precisa ser muito maior do que o limite de solubilidade do fármaco.

2.As dimensões das partículas de fármaco precisam ser menores do que as dimensões do filme de PHB.

3.Inchamento e dissolução da matriz do polímero devem ser desprezíveis.4.A difusão do fármaco deve ser constante.5.O filme deve estar perfeitamente mergulhado no meio.

Como forma de checar se a liberação do fármaco atende à Lei de Fick utilizamos a equação de Higuchi, Eq (2):

Mt=kt(1/2), Equação (2)

onde Mt é a quantidade de fármaco liberada no tempo t e k é a taxa constante [Higuchi, 1961].No caso da reta definida pelo gráfico traçado por essa equação possuir inclinação igual

ou superior a 1 dizemos que a liberação segue uma difusão Fickiana. Para aqueles sistemas que se desviam da equação de Higuchi a relação de Korsmeyer-Peppas (Eq. (3)) pode mostrar a adequação à Lei de Fick [Korsmeyer, Peppas, 1983].

Mt/Minf=ktn, Equação (3)

onde (Mt/Minf) é a fração de fármaco liberada no tempo t, k é a constante referente ao sistema matriz / fármaco. O n é um parâmetro que varia com o mecanismo de liberação. Se o n é 0,5 ou menos o mecanismo de liberação segue a difusão fickiana, se está entre 0,5 e 1 então segue uma transferência de massa não fickiana.

O gráfico gerado pela equação de Higuchi para o sistema proposto pode ser visto na Fig. (4). Embora a inclinação da reta definida pela regressão linear da curva do gráfico seja de 12,5. O coeficiente de correlação (r2) é de 0,80 mostrando que a equação de Higuchi não descreve bem o perfil de liberação do metronidazol.

Figura 4 - Curva da liberação de fármaco traçada segundo a equação de Higuchi.

No entanto, traçando o gráfico liberação do fármaco versus tempo pela equação de

Korsmeyer-Peppas (Eq. (3)), o coeficiente de correlação (r2) de 0,96 indica um comportamento muito mais próximo ao linear, Fig. (5). Uma vez que o coeficiente angular n tem o valor de 0,2, é possível afirmar que a transferência de massa segue o modelo de difusão Fickiana.

Figura 5 - Curva da liberação de fármaco traçada segundo a equação de Korsmeyer-Peppas.

3.3 Avaliação da Integridade da Membrana

Os corpos de prova foram avaliados quanto à sua integridade estrutural antes e após o ensaio de liberação de fármaco. Os valores de módulo de elasticidade, tensão máxima e alongamento na ruptura das amostras foram obtidas por meio de ensaios de tração, Fig. (6). Os resultados obtidos demonstraram que as condições nas quais o ensaio de liberação de fármaco foi conduzido levaram a uma redução pouco significativa de suas propriedades após 48 dias.

Antes Depois0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

E (M

Pa)

A

Antes Depois0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

Tens

ao M

ax (M

Pa)

B

Antes Depois0

1

2

3

4

5

6

Al

onga

men

to n

a Ru

ptur

a (%

)

C

Figura 6 - Propriedades mecânicas dos corpos de prova antes e após do ensaio de liberação de fármaco (48 dias). (a) Módulo de Elasticidade. (b) Tensão Máxima. (c) Alongamento na

Ruptura.

4. CONCLUSÕES

O ensaio de liberação do fármaco mostrou que o metronidazol liberado para o meio alcança rapidamente altos níveis já na primeira hora. Possivelmente, esse regime de rápida liberação inicial deve-se, possivelmente, aos cristais adsorvidos à superfície dos filmes. Já o segundo regime de liberação do fármaco é regido pela transferência de massa por difusão segundo a lei de Fick e será responsável pela manutenção dos níveis de fármaco na ferida em uma etapa mais tardia da cicatrização.

As membranas precisam manter sua resistência mecânica para funcionar como proteção à ferida, caso contrário o tratamento pode falhar independentemente do fato dela ter sido competente em manter o local da regeneração livre de patógenos agressivos. Como as membranas testadas nesse trabalho tiveram pouca alteração em suas propriedades mecânicas, mantendo assim sua integridade estrutural, podemos indicar esse material como uma boa alternativa para a produção de membranas periodontais de barreira.

REFERÊNCIAS

Costa, M.F. e Thiré, R.M.S.M. (2011), “Materiais Poliméricos”, in Biomaterias em Odontologia: princípios, métodos investigativos e aplicações, J.M. Granjeiro e G.D.A. Soares (eds.), V. 2, VM Cultural, São Paulo.D882-91, ASTM. (1991). ASTM D882-91 - Standard Test Methods for Properties of Thin Plastic Sheeting. ASTM. 1991Griffiths, G. S., et al., Journal of Clinical Periodontology. (2000), Vol. 27, pp. 910-917.

Higuchi, T., J. Farm. Sci. (1961), Vol. 50, pp. 874-875.Korsmeyer, R. W.; Gurny, R.; Doelker, E. M.; Buri, P.; Peppas, N. A. Int. J. Pharm. (1983), Vol. 15, pp. 25–35Magini, Ricardo de Souza, Publicação Eletrônica em Reabilitação Oral.(2009) [Online].Poulet, PP, et al. Journal of Clinical Periodontology. (1999), Vol. 26, pp. 261-263Shifrovitch, Yael, et al. Journal of Periodontology. (2009) pp. 330-337.Shishatskaya, et al. J. Mater. Sci.: Mater. Med.. (2008), Vol. 19, pp. 2493–2502.Tatakis, D. N., Promsudthi, Ananya and Wikesjö, Ulf M. E. Periodontology 2000. (1999), Vol. 19, pp. 59-73.

EVALUATION OF A POLY (3-HYDROXYBUTYRATE) MEMBRANE LOADED WITH ANTIBIOTIC FOR USE IN GUIDED TISSUE

REGENERATION

Marcio A. C. Silva1, Marysilvia M. F. Costa1, Rossana M.S.M. Thiré1*

1Laboratory of Biopolymers, Program of Metallurgical and Materials Engineering - COPPE - Federal University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro (RJ), Brazil

E-mail: rossana@metalmat.ufrj.br

Abstract. Periodontitis is the inflammation of periodontal tissues and leads to deterioration of the tissues that support the tooth. The technique of Guided Tissue Regeneration (GTR) may be used for reconstruction of the periodontium. This technique uses barrier membranes to prevent epithelial growth to the wound site. Membranes of GTR also can be used in systems for the release of antibiotics to protect the defect of bacterial invasion. Recently, there has been a growing interest in using membranes consisting of biodegradable polymers, like poly (3-hydroxybutyrate) - PHB in order to avoid the need of a second surgical procedure to remove the membrane. PHB is microbial polyester, biodegradable and biocompatible with a wide variety of animal cells. The objective of this work was to produce and characterize periodontal absorbable membranes of PHB containing metronidazole. This drug is an adjuvant that allows a more satisfactory result than the mechanical treatment solely. PHB membranes containing 2% drug and 20% ethyl citrate (plasticizer) were produced via compression molding. “In vitro” release studies were conducted in potassium acetate buffer pH 5.0 at 37ºC. The quantity of metronidazole released was quantified by UV-Vis spectrophotometer. The samples were also analyzed by tensile tests and optical and scanning electron microscopes (SEM). The results showed that approximately 100% of antibiotic released from PHB membrane after fifty days. The analysis of the kinetics of drug release indicated Fickian diffusion as dominant mechanism. Tensile tests have shown that membranes maintained their integrity even after the drug release. Thus, it can be concluded that the films of PHB loaded with metronidazole have potential to be used as membranes for RTG.

Keywords: poly(3-hydroxybutyrate), metronidazole, guided tissue regeneration, periodontal membrane, drug release