Problema 1

a) Describa un protocolo típico de inmunización. ¿Qué adyuvantes conoce y que función cumplen?

b) Mencione cuatro factores relativos al antígeno a tener en cuenta en una inmunización.

c) ¿Si inmunizo con un hapteno acoplado a un carrier de plástico en presencia de un adyuvante fuerte como el AFC voy a tener una buena respuesta inmune? Justifique claramente su respuesta.

d) ¿Qué controles debo tener en cuenta al realizar una titulación de anticuerpos en suero por el método de ELISA?

e) ¿Qué función cumplen los distintos reactivos? Descríbalo claramente.

Leche descremadaÁcido sulfúricoSustrato colorimétrico

f) Usted tiene que realizar un ELISA y posee todos los reactivo necesarios:

Placa de ELISA, antígeno, TBS, leche descremada, suero de ratones inmunizado, anticuerpo secundario (anti-conejo acoplado a peroxidasa), sustrato para peroxidasa, H2O2, lector de ELISA. Cuando termina el ELISA, usted observa que no hay desarrollo de color. ¿qué pudo haber pasado?

g) Mediante el uso de técnicas biotecnológicas, usted ha podido desarrollar una familia de anticuerpos monoclonales los cuales poseen idéntica región variable (contra KLH-p), los cuales se denominaron 3E5.Analice el gráfico, calcule el título y discuta un posible mecanismo por el cual se observan estas diferencias.

Problema 2 Dada la siguiente curva de Absorbancia vs dilución de suero, determinar cuál es el título de ambos sueros y cuál es la línea de corte. Como se informa el título? Cual/es curva/s faltaría dibujar en el grafico?

Problema 3Explique en que con consiste la Enfermedad Hemolítica del Recién Nacido o

Eritroblastosis Fetal. ¿Cómo podría detectarla a través del test de Coombs

Indirecto? Justifique su respuesta.

Problema 4

Usted ha encontrado que un porcentaje de la población es alérgico a una nueva fruta recientemente importada de Myanmar (antigua Birmania). Con mucho trabajo logró una proteína que reproduce los síntomas del humano en ratones. Para terminar su trabajo le resta diseñar un ELISA con el fin de identificar que subtipos de anticuerpos se desarrollan durante esta patología.

Describa paso a paso desde la inmunización, como detectaría los distintos anticuerpos.

Problema 5

Un laboratorio desea desarrollar un ELISA de captura “tipo sándwich” para detectar y cuantificar la presencia del alérgeno del maní arah1 en diferentes muestras de alimentos.

Para ello obtienen 12 anticuerpos monoclonales específicos para arah1. Para evaluar qué par de anticuerpos es el mejor para el ELISA sándwich evaluaron las combinaciones de cada par de anticuerpos posibles en un ensayo de ELISA tipo sándwich.

La tabla 1 muestra los resultados obtenidos para cada par testeado como Ac de captura (Capture mAb - columnas) o anticuerpo de detección conjugado a peroxidasa (HRP)

(Detection mAb - filas). Los resultados se expresan como el cociente entre la OD obtenida para cada par en presencia de Ag dividido la OD del blanco.

a) Indique qué par de anticuerpos seleccionaría para utilizar en el ELISA y por qué?

b) ¿A qué se deben la diferencias observadas?c) Escriba un protocolo detallado, indicando todos los reactivos

necesarios para determinar mediante el ELISA desarrollado la cantidad de arah1 en una muestra de jugo fortificado.

d) Si el resultado que ud obtuvo es que el alimento a testear posee una cantidad de arah1 de 3mg/ml. Teniendo en cuenta la curva std obtenida (Figura 2 y tabla 2). Indique cómo procesó la muestra y qué valor de OD aproximado obtuvo, justifique.

Problema 6

Usted necesita obtener un suero anti-IgG humana.

Cómo puede obtenerlo? Indique todos los materiales y reactivos que necesita y el procedimiento para realizarlo, incluyendo los tiempos entre tratamientos, dosis (número y cantidad de Ag), Fuente del Ag, etc.

Problema 7a) Usted quiere hacer anticuerpos contra un epitope glicosídico. ¿Cómo realizaría la inmunización? ¿Qué antígeno utilizaría y por qué?

Problema 8Discuta las siguientes afirmaciones. Justifique

a. Los anticuerpos anti-OVA presentes en un suero no pueden cuantificarse mediante ELISA.b. Los antisueros contra proteínas de alto peso molecular pueden obtenerse inmunizando ratones con péptidos pertenecientes a la mismas.c- Para obtener un antisuero de alto título de anticuerpos es conveniente inmunizar con una única inoculación de alta dosis.

Figura 1: Curva de calibración obtenida.

Tabla 2: curva std

CC DO

0 0,001

1 0,002

2 0,004

4 0,008

8 0,016

16 0,031

32 0,063

64 0,125

128 0,250

256 0,500

512 1,000

1024 2,000

Problema 9

Completar el siguiente cuadro comparativo entre los ELISA ensayados durante los trabajos prácticos.

ELISAtitulación de sueros

ELISA sandwich ELISA competitivo

Molécula a detectarAntígenoMétodo para el cálculoFasesTipo de mediciónMuestra incógnita

Problema 10

Las proteínas se deforman cuando se adsorben al plástico y esto puede afectar al/los epítopes que el anticuerpo reconoce en el antígeno, disminuyendo su afinidad por él. Si eso le ocurriese durante un ensayo de ELISA comprometiendo el resultado, cómo haría para solucionarlo?

Problema 11

Se desea estudiar el efecto de una droga inmunosupresora, el FK-506, en un modelo de infección experimental en ratón con virus VSV. Este virus, de la familia del virus de la rabia, es administrado intranasalmente en ratones, generando, a altas dosis, la muerte de los mismos por efectos de una inmunopatología. Para realizar la experiencia se toman grupos de 10 ratones Balb/c machos, de entre 45-60 días de edad y se infectan con una dosis subletal del virus. Considerando al día de la infección como DIA CERO, se ensaya un esquema de tratamiento con la droga que abarca los días + 1 a + 5. La misma se administra por vía intraperitoneal, en una única dosis diaria y en una concentración de 200 μg/animal. A grupos de animales controles se les administra PBS por la misma vía. Luego se procede a estudiar distintos parámetros inmunológicos.

A los 8 días post-infección los animales se sangran y se titulan los anticuerpos específicos IgM contra el virus por la técnica de ELISA de captura. Se utiliza una dilución de trabajo 1/200 y se obtienen las siguientes DO:

Grupo tratado: 0.98; 0.85; 0.75; 0.70; 0.95; 0.76; 0.87; 0.76; 0.80; 0.79Grupo Control: 1.2; 1.4; 1.3; 1.45; 1.65; 1.34; 1.28; 1.5; 1.4; 1.30.

a. Haga un diagrama de flujo del protocolo descripto anteriormente.b. Esquematice el diseño de este ELISA, indicando la especie animal fuente de c/u de los antisueros necesarios.

c. Determine el título promedio de los sueros anti-virus de cada grupo de ratones a partir de la curva patrón que se muestra en la Figura 2

Problema 12

La leche es uno de los principales alérgenos presente en los alimentos. En su laboratorio Ud puso a punto un ELISA competitivo para cuantificar caseína (proteína de la leche) utilizando un anticuerpo monoclonal 3B7 hecho en ratón. En la tabla se muestran los volúmenes utilizados para la curva, teniendo en cuenta que se realiza por cuatriplicado (100 ul por well), considerando un exceso de volumen del 10 %. A continuación se muestra los valores de % de inhibición correspondientes a la curva de calibrado. Log conc.

(ng/ml) % inhibición

4,61 92,574,01 85,463,41 63,672,81 30,64

2,2 13,211,6 12,81

1 12,230,4 13,65

-0,2 16,7-0,81 15,2

En el siguiente paso Ud. desea probar si con su ELISA competitivo puede cuantificar la caseína presente en una muestra de alimento comercial para bebés, el cuál según su rótulo, contiene 1,5 gramos cada 100 ml de alimento.

Indique detalladamente cómo procedería para cuantificar la caseína presente en la muestra.

Incluya todas las cuentas y los volúmenes utilizados, teniendo en cuenta que también sembrará la muestra por cuatriplicado.

Problema 13

En el laboratorio donde Ud trabaja hacen determinaciones de gelatina porcina en alimentos mediante un ELISA competitivo. Brevemente, el protocolo consiste en los siguientes pasos:

1- Pegado del antígeno a la placa2- Lavado3- Reacción Ag-Ac en fase líquida: se incuba durante 1 h un volumen de la

muestra incógnita diluída, con un mismo volumen del anticuerpo monoclonal específico para la gelatina porcina.

4- Siembra de la mix a la placa5- Lavado6- Incubación con anticuerpo secundario conjugado a peroxidasa7- Revelado8- Lectura a 450 nm

En paralelo, realiza una curva de calibrado con diluciones seriadas de una solución stock de la proteína y obtiene la siguiente curva:

a) Calcule el % de inhibición para su muestra incógnita si obtiene una OD450=0,3 (Dato: B0 OD450=1,2).

b) Calcule en base a la curva la concentración en μg/ml de gelatina porcina de su muestra, teniendo en cuenta que la misma fue previamente diluída llevando 100 μl de la misma a un volumen final de 2 ml en buffer de bloqueo.

c) Responda verdadero o falso. Justifique

El ELISA competitivo:- es muy utilizado para el dosaje de hormonas- es un método directo

- necesita siempre un anticuerpo monoclonal y el antígeno purificado - es un método cuantitativo

Problema 14Describa el o los ELISAS necesarios para detectar pacientes deficientes en la proteína AID (deficiencia en cambio de isotipos de inmunoglobulinas).

a) Diga reactivos y pasos a seguir. b) Grafique cuales son los resultados esperados y compárelos con un gráfico de una

persona sana.

Problema 15

En su laboratorio Ud se encuentra desarrollando un ELISA competitivo para la determinación de cantidades traza de Hidromorfona en orina humana, sangre o fluido oral para ser utilizado en medicina forense. El ensayo debe ser capaz de cuantificar la Hidomorfona en muestras que podrían contengan Codeína, un compuesto de estructura similar.Para ello dispone de 3 anticuerpos monoclonales que ha logrado conseguir: 1A12; 5D3 y 8B5.Ud. Realiza un ELISA competitivo utilizando Hidromorfona o Codeína como competidor y obtuvo los siguientes resultados:

1A12

-1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100.0

0.5

1.0

log cc (ng/ml)

B/B

0

5D3

-1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100.0

0.5

1.0

log cc (ng/ml)

B/B

0

8B5

-1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100.0

0.5

1.0

log cc (ng/ml)

B/B

0

Hidromorfona Codeína

1- Qué anticuerpo utilizaría para la cuantificaciónde Hidromorfona en las muestras? Justifique.

2- Aproximadamente qué cantidades de Hidromorfona podrá detectar en las muestras? Justifique

3- Cuál es la cantidad máxima aproximada de Codeína que puede haber en la muestra sin generar error en la deerminación? Justifique.

Para poder realizar determinaciones cuantitativas Ud. aplicó la transformación logit a los datos y obtuvo la siguiente curva:

En simultáneo procesó una muestra de sangre en la que quería determinar la concentración de Hidromorfona.Para que la muestra entre en curva Ud realizó diferentes diluciones y obtuvo los siguientes resultados:

4- Qué concentración de Hidromorfona contiene la muestra? (Considere que la concentración de la curva estándar utilizada para los cálculos es la concentración del analito final en el well y que el anticuerpo y la hidromorfona soluble se incubaron en volumenes iguales).

5- Explique cómo y para qué se realizan los controles B0 y Blanco en este tipo de ELISA.

6- Comente una ventaja y una desventaja del ELISA competitivo respecto al ELISA sandwich.

ELISA competitivo vs. ELISA sandwichVENTAJA DESVENTAJA

0 1 2 3 4 5-5

0

5

10

y = -2,96x + 7,65

log cc (ng/ml)lo

git p

Muestra Abs (450nm)

Blanco 0,02B0 1,22Muestra TC 0,03Dilución 1:10 0,62Dilución 1:100 1,20Dilución 1:1000 1,21

Problema 16

1- ¿Qué característica debe presentar el antígeno para poder ser cuantificado mediante un ELISA sándwich?

2- ¿Cuál es la diferencia entre un ELISA sándwich directo y un ELISA sándwich indirecto? ¿Qué ventajas y desventajas presenta cada uno?

3- En su laboratorio se encuentran desarrollando un ELISA sándwich para detectar la presencia de leche (alérgeno) en alimentos procesados. Para ello obtuvieron dos anticuerpos monoclonales que reconocen caseína. En primer lugar, va a realizar una curva de calibrado con una solución patrón de caseína (1 mg/ml) probando las concentraciones finales que se detallan a continuación:

Caseína (ng/ml)6403201608040200

a) Haga las cuentas necesarias, e indique detalladamente cómo proceder para realizar la curva, teniendo en cuenta que la misma se realizará por triplicado y que el volumen final por well es 100 μl. (Considerar también un exceso del 10 % como mínimo)

b) ¿En qué solución va a realizar las diluciones?

c) Usando lo curva anterior, decidió cuantificar el contenido de caseína de una muestra de galletitas de chocolate. Para ellos pesó 1 gr de galletitas previamente disgregadas y homogeneizadas y lo disolvió en 10 ml de buffer de extracción y luego sembró 100 μl de esa muestra en el well. Extrapolando en la curva, obtuvo una concentración de caseína de 50 ng/ml en la muestra de extracto de galletitas. Considerando que el limite permitido de caseína en alimentos aptos para personas alérgicas a la leche es de 100 ppm, ¿puede decir que estas galletitas de chocolate son aptas?

Problema 17Usted desea inmunizar ratones para producir anticuerpos monoclonales contra Δ9-tetrahidrocannabinol (THC) para ser utilizados en el problema 2.

Responda las siguientes respuestas.A) ¿Qué antígeno utilizaría para la inmunización?B) Diseñe un ELISA para determinar qué ratones tienen el título más elevado con el fin de fusionarlos para obtener anticuerpos monoclonales.C) ¿Qué controles utilizaría en el ELISA y cómo calcularía el título?

Probelma 18Una empresa biotecnológica se encuentra desarrollando un método para la detección y cuantificación de de Δ9-tetrahidrocannabinol (THC) en materiales confiscados o muestras biológicas (orina, plasma, saliva).Para ello inicialmente produjeron anticuerpos monoclonales anti-THC en ratones.Los esplenocitos de los ratones inmunizados en el problema 17 se fusionaron con células de mieloma NS1. Un experimento de fusión de células individuales produjo cuatro clones de hibridoma #12, #15, #30 y #33, cada uno secretando un anticuerpo que se une al THC. Estos anticuerpos se denominaron Ab-THC n° 12 (γ1, κ), n° 15 (γ1, κ), n° 30 (γ2b, κ) y n° 33 (γ1, κ) con isotipos de cadena pesada y ligera indicados entre paréntesis.En el ELISA competitivo, estos anticuerpos generaron curvas de dosis-respuesta con para THC (figura 1). (Fase sólida: THC; competidor:THC)La IC50% es la concentración de competidor que inhibe la unión del anticuerpo al THC inmovilizado en un 50% y es una medida de la sensibilidad del ensayo.A) Una con flechas cada set de anticuerpos con

su IC50%: (justifique su respuesta)

B) Con qué anticuerpo se logra la sensibilidad más alta. (Justifique)

En humanos, el THC se biotransforma resultando principalmente en metabolitos más polares, incluyendo 11-hidroxi-Δ9-tetrahidrocannabinol, 11-nor-9-carboxi-Δ9-tetrahidrocannabinol (THC-COOH) y su conjugado con glucurónico ácido (THC-COOGlu).

Figura

THC (ng/ml)

Anticuerpo IC50% (ng/ml)

Ab-THC #30 1.1

Ab-THC #15 7.0

Ab-THC #33 3.0

Ab-THC #12 40

En un ELISA competitivo utilizando THC en la fase sólida y THC-COOH como competidor, se obtuvieron las siguientes curvas:

El Servicio de Abuso de Sustancias y Salud Mental (SAMHSA) considera negativa una muestra con menos de 50 pg/ml de THC-COOH en orina.

C) Haga un esquema de los pasos a seguir para determinar la concentración de THC-COOH en una muestra de orina. (Incluya todos los pasos del ELISA y los controles del mismo).

Utilizando el anticuerpo seleccionado en B), luego de la transformación de datos logit(p) vs. log cc, es posible linealizar las curvas para el analito THC-COOH.

La regresión lineal de los datos dio la siguiente curva:logit p = -2,503 – 3,288×log(cc)

Si la muestra de Juan dió: B: 2,50; la muestra de Marcos dio B: 1,2 y el B0: 2,52.D) Calcule la concentración de THC-COOH en la orina de Juan y Marcos.E) ¿Puede afirmar si alguno había consumido la sustancia?

THC-COOH (ng/ml)

-2 -1 0 1-6

-4

-2

0

2

4

6

log cc (ng/ml)

logi

t p

Log (cc) Logit p (p=B/B0)

-2,000 4,595121-1,39794 2,197224

-1,000 1,098612-0,69897 -0,2006707-0,30103 -0,8472978

0,000 -1,992430,69897 -4,59512