wann genom sequenzierung – unterschied zu syndrom ......1st generation (sanger sequencing) maxam,...
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Wann Genom Sequenzierung –Unterschied zu Syndrom basierten
Multiplex-PCR-Verfahren?
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WGS vs. mpPCR
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1st generation (Sanger sequencing) Maxam, Gilbert & Sanger (1975): maximum sequencing length ~1000bp
(>30€/sample) First bacterial genome 1995 (Haemophilus influenzae, genome size ~1.9
Mill. basepairs; costs ~1.3 Mio€)
2nd generation (Pyro sequencing) 454 Life Sciences = 1st NGS instrument (costs 25.000€/ sample)
3rd generation (massive parallel sequencing of shortfragments <500 bp) Illumina, Fisher scientific (IonTorrent)
4th generation (single molecule sequencing) PacBio & Oxford Nanopore: very long reads; >300€/sample
Evolution of sequencing
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NGS - Analyse
16S rDNA Databases:• Greengenes• SilvaPathogen discovery tools: • Taxonomer, Flygare et al. (2016).
Pathoscope, Francis et al. (2013)
MikrobielleNGS-Reads
Amplicon
Shot-gun
16S rDNA
Metagenom
Virulenzen
Resistenzen
InfiziertesHumangewebe
Reinkultur
…
Contigs Scaffolds
Artenprofil
Res/ Vir Profile
Artenprofil
Pathogennachweisl
De novoMapping
Annotierung
SurveillancePhylogenie
Identifizierung
Syntenie & Genomorganisation
Assemblierung
PCR Signaturen
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Isolierung genomischerDNAHerstellung der DNA Library• Fragmentierung der gDNA• Ligation von Adaptern und
Barcodes (Indices)• Normalisierung/
Quantifizierung(Emulsions-PCR – nur ABI Technologie)
NGSAllgemeiner Workflow
©Illumina
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Clusterbildung• Bindung der Fragmente auf
der Flow Cell• Bridgeamplifizierung
NGSAllgemeiner Workflow
©Illumina
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• Sequenzierung• Demultiplexing• Output file = Raw Reads + QC Info• Weitere Datenanalyse
NGSSequenzierung
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Assemblierung von Sequenzen
D. Harmsen, 2016
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Zusammenfassung Workflow NGS
gDNA isolation Library Preparation
Data analysis
~1 Woche für 128 Listeria/ MRSA
Assembled genome(Contigs)
Sequence reads(300 bp max)
contig 1 contig 2
Assembly(de novo or reference based
MLST, cgMLST, SNPSerotype, Spoligotype, MIRUResistance, Virulence, ToxingenesPlasmidsEtc.
Report
MST
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WGS vs. mpPCRWGS Charakterisierung von
Isolaten (Phylogenie, Virulenz, Resistenz, etc.)
Ausbruchsaufklärung Identifizierung der
Infektionsquelle Identifizierung „Metagenomanalyse“ Kosten!? Ergebnis in Tagen Analyse ev. aufwändig Kultivierung meist nötig
mpPCR Direkte Analyse aus
Probenmaterial Ergebnis in Stunden
verfügbar Methode der Wahl für eine
schnelle Diagnostik/ Screening
Kosten!? Bekannte Erreger Ungenaue Identifizierung Keine Charakterisierung
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1995: 1. mikrobielle Genomsequenz - Haemophilusinfluenzae - Kosten 1,5 Mio$
Kosten aktuell (mittlere Genomgröße) ab ~ 10€!?; MiSeq ~50€
Humangenom: 2003 3 Milliarden € (& 2,5 Jahre); 2011 ~1000€ (~3 Tage)
Daten NGS
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Beispiel – schnelle Diagnostik & WGS
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WGS Endergebnis AusbruchsaufklärungMinimum spanning tree basierend auf einem Vergleich von 1127 Genen
„Die unbekannte Ursache, welche so entsetzliche Verheerungen anrichtete, war demnach in den an der Hand klebenden Cadavertheilen der Untersuchenden an der ersten Gebärklinik gefunden.“ – Ignaz Semmelweis[6]
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Cluster I: Oktober 2013 – März 2014Cluster II: Jänner 2014Ergebnis:• Cluster I ein lokales, kein KH-weites
Problem• Ursache für Cluster II unklar• Unklar auch die diversen Isolate von
P18Etablierung Surveillance für MDR A.b.Kosten 120€Finanzielle Auswirkung auf Krankenpflege unklar!
´´
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NGS ist eine offene Plattform
Möglichkeit Bakterien, Pilze, Viren in einem Assay zu detektieren
NGS ist quantitativ! (Anzahl der Sequenzierreads)
NGS ergibt eine unverzerrte und ungezielte DNA Sequenzinformationaus Patientenproben - höhere Sensitivität und Spezifität
Nachweis von Resistenzen
Nutzen - Vorteile
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Metagenomanalyse
Deurenberg RH et al., Journal of Biotechnology, Volume 243, 2017, 16–24
Noch nicht für die Diagnostik etabliert
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How to type bacteria
Phenotypic features Morphology on diverse culture
media Serotyping (1900) Phagetyping (1920‘s) Resistance
Genotypic featuresVariations in DNA – Genetic
fingerprint Fragment based methods Sequence based methods
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NGS ist der neue Goldstandard für die BakterientypisierungNGS liefert ein Maximum an Informationen• Charakterisierung/ Typisierung
• Ausbruchsaufklärung (Epidaten!)• Übertragungswege & Infektionsquellen (Epidaten)• Überwachung/ Surveillance• Virulenzgene• Resistenzgene• Toxingene• Plasmiddaten
KostenersparnisVerbesserte Behandlung+ Nutzen für die KH Hygiene
Metagenom Analytik – Amplicon Sequenzierung• Eine Zeitfrage bis zur Routineanwendung!
Zusammenfassung