vloga antioksidantov in selenovih spojin v listih …

UNIVERZA V LJUBLJANI PEDAGOŠKA FAKULTETA

Poučevanje - Predmetno poučevanje Biologija in kemija

Tanja MURN

VLOGA ANTIOKSIDANTOV IN SELENOVIH SPOJIN V LISTIH NAVADNE IN TATARSKE AJDE NA

PRENOS IN UČINKE ŽIVEGA SREBRA VZDOLŽ PREHRANJEVALNE VERIGE

Magistrsko delo

Ljubljana, 2018

UNIVERZA V LJUBLJANI PEDAGOŠKA FAKULTETA

Poučevanje - Predmetno poučevanje Biologija in kemija

Tanja MURN

VLOGA ANTIOKSIDANTOV IN SELENOVIH SPOJIN V LISTIH NAVADNE IN TATARSKE AJDE

NA PRENOS IN UČINKE ŽIVEGA SREBRA VZDOLŽ PREHRANJEVALNE VERIGE

Magistrsko delo

Mentor: izr. prof. dr. Katarina Vogel-Mikuš

Ljubljana, 2018

Murn T. Vloga antioksidantov in selenovih spojin v listih … ajde na prenos in učinke živega srebra vzdolž prehranjevalne verige. Magistrsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Kemija in biologija, 2018.

I

POVZETEK

Idrija je majhno mesto, znano po neprekinjenem petstoletnem rudarjenju živega srebra (Hg). Kar četrtina celotne proizvodnje Hg se je med pridobivanjem sprostila v okolje, kar je in še vedno negativno vpliva na tamkajšnje organizme. Rastline so v neposrednem stiku s prstjo in lahko kot primarni vir hrane Hg iz tal in zraka posredujejo iz neživega okolja v prehranjevalne verige ljudi in živali. Namen magistrske naloge je bil preučiti kako sekundarni metaboliti (polifenolne spojine) navadne (Fagopyrum esculentum) in tatarske (Fagopyrum tataricum) ajde vplivajo na prenos in učinke Hg v kombinaciji s selenom (Se) pri rastlinah in naprej v prehranjevalni verigi. Sekundarni metaboliti so namreč ključne komponente obrambnih mehanizmov pred oksidativnim stresom, ki ga lahko povzročijo različne okoljske razmere, kot so npr. UV-sevanje, kovine ali mikroorganizmi. Ti lahko v stiku z organizmom tvorijo reaktivne kisikove spojine (ROS), ki poškodujejo celične strukture. Znano je, da ima tatarska ajda večji antioksidativni potencial od navadne ajde. To lahko pripišemo višji vsebnosti nekaterih flavonoidov, ki oksidativni stres preprečujejo z lovljenjem prostih radikalov in večji reducirajoči moči. Tudi Se pozitivno vpliva na rast in preživetje rastlin ter na obrambo pred oksidativnim stresom, saj lahko reagira s Hg in tako zmanjša negativne vplive Hg na rastline. Kot testni rastlinski vrsti smo izbrali navadno in tatarsko ajdo, kot testno žival pa polža španskega lazarja (Arion vulgaris). Navadno in tatarsko ajdo smo gojili v zemlji, onesnaženi s Hg. Polovico rastlin smo listno obogatili s Se, ki smo ga nanesli kot raztopino dikalijevega selenata (K2SeO4). Spektrofotometrično smo določili, kako kopičenje Hg (v kombinaciji s Se) vpliva na vsebnost fotosinteznih pigmentov, stopnjo lipidne peroksidacije ter vsebnost polifenolnih spojin v navadni in tatarski ajdi. Z vzgojenimi rastlinami smo hranili polže španske lazarje. Z rentgensko fluorescenčno spektrometrijo smo določili, v kolikšni meri so ajde privzemale Hg iz idrijske zemlje ter listno dodan Se in v kolikšni meri so polži privzemali Hg in Se iz rastlinskega materiala. Pri polžih smo spektrofotometrično določili tudi stopnjo lipidne peroksidacije prebavne žleze ter mišičnega tkiva. Rezultati so pokazali, da je kombinacija Hg in Se različno vplivala na fiziološke lastnosti obeh vrst ajd. Obe vrsti ajd sta v kombinaciji s Se različno privzemali Hg. Transport Hg vzdolž prehranjevalne verige je bil v kombinaciji s Se vrstno specifičen. Ker so rastline rasle v kontroliranih pogojih, večje razlike v antioksidativnem potencialu med obema vrstama niso bile opazne, prav tako niso bili opazni antioksidativni učinki na polžja tkiva v prisotnosti Hg. Živo srebro se je večinoma kopičilo v koreninah navadne in tatarske ajde ter v prebavni žlezi polžev španskih lazarjev, medtem ko se je Se kopičil v poganjkih navadne in tatarske ajde ter v mišičnem tkivu polžev španskih lazarjev. Ključne besede: onesnaženost tal, Idrija, živo srebro, selen, navadna ajda, tatarska ajda, prehranjevalna veriga, polži


II

ABSTRACT

Idrija is a small city known for its continuous five-hundred-year long mercury (Hg) mining. During the process, a quarter of the processed Hg was released in the surrounding environment, which had and is still having a negative impact on the local organisms. Plants are first in direct contact with the soil and they can as a primary source of nourishment to people and animals, transfer the accumulated Hg from the ground and air to the food chain. The goal of this master thesis was to investigate how the secondary metabolites (polyphenolic compounds) of the common (Fagopyrum esculentum) and Tartary (Fagopyrum tataricum) buckwheat affect the transfer and effects of Hg in combination with selenium (Se) in plants and further on through the food chain. Secondary metabolites are the main components of defence mechanisms against oxidative stress, which can be caused by different environmental conditions, such as UV radiation, metals or microorganisms. In contact with the organism, they can form reactive oxygen compounds (ROS) and can therefore damage cellular structures. It is known that the Tartay buckwheat has higher antioxidant potential than common buckwheat. This can be attributed to the higher content of some flavonoids, which prevent oxidative stress by catching free radicals and greater reducing power. Selenium also has a positive influence on the growth and survival of plants and on the defence against oxidative stress, because it can react with Hg and reduce negative effects of Hg on plants. As test plants a common and Tartary buckwheat were used and as a test animal the snail, Spanish lazarus (Arion vulgaris) was used. Common and Tartary buckwheat were grown in the soil, contaminated with Hg. Half of them were foliarly enriched with Se, which was applied as a prepared solution of dipotassium selenate (K2SeO4). The effects of Hg accumulation (in combination with Se) on the content of photosynthetic pigments, level of lipid peroxidation and the content of polyphenolic compounds in the common and Tartary buckwheat were spectrophotometrically measured. The grown plants were used to feed the snails from the family Spanish Lazarus (Arion vulgaris). With the use of X-Ray fluorescent spectrometry, we defined to what extent the buckwheats accumulated the Hg and Se from the plant material. The level of lipid peroxidation of the digestive gland and muscle tissue in snails was spectrophotometrically defined. The results showed that the combination of Hg and Se had a different effect on the physiological properties on both types of buckwheat. Both species of buckwheat in combination with Se accumulated Hg differently. The transport of Hg along the food chain was in combination with Se specific to the species. Because plants were grown under controlled conditions, there was no significant difference in the antioxidant potential between the two species and no antioxidants effects on the snail’s tissue in the presence of Hg were observed. Mercury has mostly accumulated in the roots of common and Tartary buckwheat and in the digestive gland of the Spanish Lazarus snails, while Se accumulated in the sprouts of the common and Tartary buckwheat and in muscle tissue of the Spanish Lazarus snails. Keywords: soil pollution, Idria, mercury, selenium, common buckwheat, Tartary buckwheat, food chain, snail


III

KAZALO VSEBINE

1 UVOD .................................................................................................................... 1 2 PREGLED OBJAV .............................................................................................. 3 2.1 ŽIVO SREBRO..................................................................................................... 3 2.1.1 FIZIKALNE IN KEMIJSKE OBLIKE ŽIVEGA SREBRA .................................. 3 2.1.2 IDRIJA KOT ANTROPOGENI VIR ŽIVEGA SREBRA V OKOLJU ................ 3 2.1.3 ŽIVO SREBRO V IDRIJSKIH TLEH ................................................................... 3 2.1.4 VPLIV ŽIVEGA SREBRA NA RASTLINE ......................................................... 4 2.1.5 VPLIV ŽIVEGA SREBRA NA ŽIVALI ............................................................... 5 2.2 SELEN ................................................................................................................... 6 2.2.1 FIZIKALNE IN KEMIJSKE OBLIKE SELENA .................................................. 6 2.2.2 VPLIV SELENA NA ORGANIZME .................................................................... 6 2.3 INTERAKCIJE ŽIVEGA SREBRA IN SELENA ............................................ 7 2.4 AJDA...................................................................................................................... 8 2.4.1 NAVADNA AJDA ................................................................................................. 8 2.4.2 TATARSKA AJDA ................................................................................................ 8 2.5 KEMIJSKA SESTAVA NAVADNE IN TATARSKE AJDE........................... 9 2.6 RASTLINE IN OKSIDATIVNI STRES ............................................................ 9 2.7 ANTIOKSIDANTI ............................................................................................. 10 2.7.1 POLIFENOLNE SPOJINE ................................................................................... 10 2.7.2 ANTIOKSIDATIVNA FUNKCIJA POLIFENOLOV IN KOVINE ................... 11 3 METODE DELA ................................................................................................ 13 3.1 RASTLINE .......................................................................................................... 13 3.1.1 PRIPRAVA SUBSTRATA .................................................................................. 13 3.1.2 GOJENJE RASTLIN ............................................................................................ 13 3.1.3 IZPOSTAVITEV RASTLIN SELENU................................................................ 13 3.1.4 DOLOČANJE SUHE BIOMASE ........................................................................ 13 3.1.5 MERJENJE FOTOSINTEZNIH PIGMENTOV .................................................. 14 3.1.6 DOLOČANJE STOPNJE LIPIDNE PEROKSIDACIJE ..................................... 14 3.1.7 DOLOČANJE VSEBNOSTI FENOLNIH SPOJIN............................................. 14 3.1.7.1 Določanje vsebnosti skupnih fenolnih spojin ................................................... 15 3.1.7.2 Določanje vsebnosti flavonoidov ....................................................................... 15 3.1.7.3 Določanje antioksidativnega potenciala ........................................................... 15 3.2 ŽIVALI ................................................................................................................ 16 3.2.1 PRIPRAVA POLŽEV IN LONČKOV ZA POSKUS .......................................... 16 3.2.2 PRIPRAVA HRANE IN HRANJENJE POLŽEV ............................................... 16 3.2.3 PRIPRAVA POLŽEV ZA MERITVE ................................................................. 16 3.3 DOLOČANJE KONCENTRACIJ ELEMENTOV V VZORCIH ................. 17 3.4 STATISTIČNA ANALIZA PODATKOV........................................................ 18 4 REZULTATI ....................................................................................................... 19 4.1 RASTLINE .......................................................................................................... 19 4.1.1 SUHA BIOMASA ................................................................................................ 19 4.1.2 DOLOČANJE FOTOSINTEZNIH PIGMENTOV .............................................. 20 4.1.3 DOLOČANJE STOPNJE LIPIDNE PEROKSIDACIJE ..................................... 20 4.1.4 DOLOČANJE VSEBNOSTI FENOLNIH SPOJIN............................................. 21 4.1.4.1 Določanje vsebnosti skupnih fenolov ................................................................ 21 4.1.4.2 Določanje vsebnosti flavonoidov ....................................................................... 22 4.1.4.3 Določanje antioksidativnega potenciala ........................................................... 22 4.2 ANALIZA IDRIJSKE ZEMLJE ...................................................................... 22 4.3 ANALIZA ŽIVEGA SREBRA IN SELENA V RASTLINAH ....................... 23


IV

4.3.1 BIODOSTOPNOST ŽIVEGA SREBRA V ZEMLJI .......................................... 23 4.3.2 KONCENTRACIJA ŽIVEGA SREBRA V KORENINAH IN POGANJKIH ... 23 4.3.3 VSEBNOST ŽIVEGA SREBRA V KORENINAH IN POGANJKIH ................ 24 4.3.4 KONCENTRACIJA SELENA V KORENINAH IN POGANJKIH ................... 25 4.3.5 VSEBNOST SELENA V KORENINAH IN POGANJKIH ................................ 25 4.4 ANALIZA ŽIVEGA SREBRA IN SELENA V ŽIVALIH ............................. 26 4.4.1 ANALIZA POJEDENE HRANE ......................................................................... 26 4.4.2 BIODOSTOPNOST ŽIVEGA SREBRA V AJDAH ........................................... 26 4.4.3 BIODOSTOPNOST SELENA V AJDAH ........................................................... 27 4.4.4 LIPIDNA PEROKSIDACIJA .............................................................................. 27 4.4.5 VSEBNOST ŽIVEGA SREBRA V POLŽJIH TKIVIH ...................................... 28 4.4.6 VSEBNOST SELENA V POLŽJIH TKIVIH ...................................................... 29 4.4.7 TRANSLOKACIJSKI FAKTOR PRENOSA ŽIVEGA SREBRA V POLŽJIH

TKIVIH ................................................................................................................ 29 4.4.8 TRANSLOKACIJSKI FAKTOR PRENOSA SELENA V POLŽJIH TKIVIH .. 30 5 DISKUSIJA ......................................................................................................... 31 5.1 RAST IN BIOKEMIJSKI PARAMETRI RASTLIN ..................................... 31 5.2 FOTOSINTEZNI PIGMENTI .......................................................................... 31 5.3 LIPIDNA PEROKSIDACIJA ........................................................................... 32 5.4 VSEBNOST POLIFENOLNIH SPOJIN.......................................................... 32 5.5 ANALIZE ŽIVEGA SREBRA V RASTLINAH ............................................. 33 5.6 ANALIZE SELENA V RASTLINAH .............................................................. 34 5.7 ANALIZA ELEMENTOV V ŽIVALIH........................................................... 34 6 SKLEPI................................................................................................................ 36 7 VIRI ..................................................................................................................... 37 ZAHVALA ......................................................................................................................... 46 PRILOGE .......................................................................................................................... 47


V

KAZALO PREGLEDNIC

Preglednica 1: Koncentracije elementov v zemlji, nabrana okoli dimnika nekdanjega delujočega rudnika in talilnice Hg v Idriji, v kateri smo gojili navadno in tatarsko ajdo (µg/g) ............................................................................................................................................. 22

Preglednica 2: Koncentracija Se v koreninah in poganjkih ajd, izpostavljenih zemlji, nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se (µg/g SM).. ............................................................. 25

Preglednica 3: Vsebnost Se v koreninah in poganjkih ajd, izpostavljenih zemlji, nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se (µg/rastlino). .............................................................. 25

Preglednica 4: Vsebnost elementov (µg/pojedeno hrano) ter vsebnost fenolnih spojin in flavonoidov (mg/pojedeno hrano) v pojedeni hrani polžev španski lazar (Arion vulgaris) po 7 – dnevnem hranjenju z ajdami, izpostavljenih zemlji, nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se ......................................................................................................................................... 26

Preglednica 5: Biodostopnost Se v prebavni žlezi in mišičnem tkivu polžev, hranjenih z navadno in tatarsko ajdo z dodanim Se (%).. ...................................................................... 27

Preglednica 6: Translokacijski faktor prenosa Se iz prebavne žleze v mišično tkivo polžev španskih lazarjev, hranjenih z navadno in tatarsko ajdo z dodanim Se .............................. 30


VI

KAZALO SLIK

Slika 1: Suha masa korenin in poganjkov ajd, izpostavljenih zemlji, nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se.. .......................................................................................................... 19

Slika 2: Koncentracija klorofila a, b in karotenoidov ajd, izpostavljenih zemlji, nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se. ............................................................................................. 20

Slika 3: Koncentracija MDA ekvivalenta v koreninah in poganjkih ajd, izpostavljenih zemlji, nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se.. .................................................................. 21

Slika 4: Vsebnost fenolov v koreninah in poganjkih ajd, izpostavljenih zemlji, nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se. ............................................................................................. 21

Slika 5: Antioksidativna učinkovitost v koreninah in poganjkih ajd, izpostavljenih zemlji, nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se po 20 min.. ................................................ 22

Slika 6: Biodostopnost Hg za korenine in poganjke ajd, izpostavljenih zemlji, nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se. ............................................................................................. 23

Slika 7: Koncentracija Hg v koreninah in poganjkih ajd, izpostavljenih zemlji, nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se.. ............................................................................................ 24

Slika 8: Vsebnost Hg v koreninah in poganjkih ajd, izpostavljenih zemlji, nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se. ..................................................................................................... 24

Slika 9: Biodostopnost Hg v prebavni žlezi in mišičnem tkivu pri polžih španski lazar (Arion

vulgaris) po 7-dnevnem hranjenju z ajdami, izpostavljenih zemlji nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se. ........................................................................................................... 27

Slika 10: Koncentracija MDA ekvivalenta v prebavni žlezi in mišičnem tkivu pri polžih španski lazar (Arion vulgaris) po 7-dnevnem hranjenju z ajdami, izpostavljenih zemlji nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se.. ............................................................................................ 28

Slika 11: Vsebnost Hg v prebavni žlezi in mišičnem tkivu pri polžih španski lazar (Arion

vulgaris) po 7-dnevnem hranjenju z ajdami, izpostavljenih zemlji nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se. ........................................................................................................... 28

Slika 12: Vsebnost Se v prebavni žlezi in mišičnem tkivu pri polžih španski lazar (Arion

vulgaris) po 7-dnevnem hranjenju z ajdami, izpostavljenih zemlji nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se.. .......................................................................................................... 29

Slika 13: Translokacijski faktor prenosa Hg iz prebavne žleze v mišično tkivo pri polžih španski lazar (Arion vulgaris) po 7-dnevnem hranjenju z ajdami, izpostavljenih zemlji nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se.. ............................................................................................ 30


VII

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI A (λ) absorbanca ADP adenozin difosfat ATP adenozin trifosfat Al aluminij AlCl3 aluminijev klorid Ca(NO3)2 x 7 H20 kalcijev nitrat heptahidrat CH3

- metilni anion Cr krom Cu+ bakrov ion Ca kalcij Ca(NO3)2 kalcijev nitrat(V) CaCl2 kalcijev klorid

Ca3(PO4)2 kalcijev fosfat(V) CaCO3 kalcijev karbonat -COOH karboksilna skupina DMHg ((CH3)2Hg) dimetil živo srebro DNA deoksiribonukleinska kislina DPPH• 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil FC Folin-Ciolalteu reagent Fe2+ železov ion FeNaEDTA železo natrijev etilendiamintetraocetna kislina H2O voda Hg živo srebro Hg0 elementarno živo srebro Hg+ enovalentno živo srebro Hg2+ dvovalentno živo srebro HgCl2 živosrebrov(II) klorid Hg(OH)2 živosrebrov hidroksid HgS živosrebrov sulfid (cinabarit) H2O2 vodikov peroksid KH2PO4 dihidrogen kalijev fosfat(V) KNO3 kalijev nitrat(V) K2SeO4 dikalijev selenat KCl kalijev klorid M mišica MeHg (CH3Hg+) metil živo srebro MDA manondialdehid Mg magnezij MgSO4 x 7 H2O magnezijev sulfat(VI) MgCl2 magnezijev klorid NaCl natrijev klorid Na2CO3 natrijev karbonat NaOH natrijev hidroksid O2

•- superoksidni anion

OH• hidroksilni anion -OH hidroksilna skupina PŽ prebavna žleza Pb svinec PO4

- fosfatni(V) ion


VIII

ROS prosti kisikovi radikali SM suha masa S žveplo Se selen Se0 elementarni selen Se2- selenid SeO3

2- - Se4+ selenit SeO4

2- - Se6+ selenat Se-Cys selenocistein Se-Met selenometionin SM suha masa TBA 2-tiobarbitudna kislina TCA trikloroocetna kislina Te telur -SH tiolna oz. sulfhidrilna skupina UV ultravijolično sevanje µg mikrogram


1

1 UVOD

V poznem srednjem veku je bila, po legendi pripovedujoč, pod curkom idrijske studenčnice odkrita neznana tekoča snov, kasneje poimenovana živo srebro (Hg). Kljub ozaveščenosti ljudi o strupenosti Hg tamkajšnjim prebivalcem izkopavanje živosrebrove rude ni predstavljalo težave, saj je večini ljudi prinašalo kruh za preživetje. Neprekinjeno petstoletno rudarjenje je povzročilo znatno onesnaževanje idrijske kotline s Hg, kar se kljub zaprtju rudnika odraža še danes. Nekatere kemijske oblike Hg v tleh se tako vnašajo v rastline in s tem v višje trofične nivoje v prehranjevalni verigi ter povzročajo oksidativni stres v organizmih (Zidar in sod., 2010; Navarro in sod., 2008).

Za obrambo pred oksidativnim stresom organizmi izrabljajo lastne antioksidativne mehanizme (Navarro in sod., 2008). Med antioksidativne mehanizme prištevamo encime ter antioksidativne snovi, ki jih zaužijemo s prehrano. Ti organizem zaščitijo z odstranjevanjem in lovljenjem prostih radikalov (Hegedus in sod., 2001; Cao in sod., 2008).

Ajda je skromna poljščina, cenjena kot zdravilna rastlina, ki ima poleg hranilnih snovi, kot so kakovostne beljakovine, surove vlaknine, mineralne snovi in vitamine, tudi veliko antioksidantov, med katere prištevamo rutin, polifenolne spojine in podobno (Chao in sod., 2008). Kreft (1995) navaja, da pri nas poznamo dve vrsti ajde: navadno (Fagopyrum

esculentum) in tatarsko (Fagopyrum tataricum) ajdo. Sama sestava v hranilni snovi navadne in tatarske ajde se ne razlikuje, znano pa je, da tatarska ajda vsebuje večje količine vitaminov iz skupine B ter še več antioksidantov v primerjavi z navadno ajdo (Bonafaccia in sod., 2003a).

Tudi številne raziskave o Se potrjujejo njegovo antioksidativno vlogo, saj pri mnogih rastlinah omili stres ter zmanjša upad biomase (Breznik in sod., 2005a; Breznik in sod., 2005b). Študije tudi kažejo (Shanker in sod., 1996; Mounicou in sod., 2006; Zhang in sod., 2012), da lahko njegova povečana raven v tleh zmanjša privzem Hg v rastline, vendar le malo študij obravnava nadaljnji prenos Hg na višje trofične nivoje.

Interakcije Hg z antioksidanti in s Se pri rastlinah so le slabo raziskane, prav tako pa ni podatkov, kako antioksidanti in Se vplivajo na učinke in prenos Hg vzdolž prehranjevalne verige. V naši magistrski nalogi, smo navadno in tatarsko ajdo gojili v zemlji, onesnaženi s Hg. Polovico rastlin smo listno obogatili s Se, ki smo ga nanesli kot raztopino dikalijevega selenata (K2SeO4). V magistrskem delu smo določali vplive kopičenja Hg (v kombinaciji s Se) na biomaso in izbrane fiziološke parametre navadne in tatarske ajde - vsebnost fotosinteznih pigmentov, stopnjo lipidne peroksidacije, vsebnost polifenolnih spojin. Z vzgojenimi rastlinami smo nato hranili polže španske lazarje (Arion vulgaris), kjer smo določali, v kolikšni meri so polži privzemali Hg iz rastlinskega materiala in fiziološke parametre prebavne žleze ter mišičnega tkiva (stopnja lipidne peroksidacije). Cilj naše raziskave je bil preučiti, kako sekundarni metaboliti (polifenolne spojine) navadne (Fagopyrum esculentum) in tatarske (Fagopyrum tataricum) ajde vplivajo na prenos in učinke Hg v kombinaciji s Se pri rastlinah in naprej v prehranjevalni verigi.


2

HIPOTEZI

• Selen in antioksidanti v ajdi bodo vplivali na privzem Hg v rastline in naprej na višji trofični nivo

• Selen in antioksidanti v ajdi bodo omilili negativne učinke Hg v ajdi in naprej v prehranjevalni verigi


3

2 PREGLED OBJAV

2.1 ŽIVO SREBRO

2.1.1 FIZIKALNE IN KEMIJSKE OBLIKE ŽIVEGA SREBRA

Živo srebro, ki izhaja iz grške besede hydrargyrum (hidros - voda in agyrum - srebro) je edini prehodni element, ki je pri sobni temperaturi tekočina in je srebrno-bele barve. Nahaja se v II. stranski skupini periodnega sistema s kemijskim simbolom Hg, atomskim številom 80 in relativno atomsko maso 200,59 (Brenčič in Lazarini, 1995).

V naravnem okolju lahko Hg zaradi številnih biokemijskih pretvorb, hlapnosti večine oblik Hg in raznovrstnih geokemijskih sprememb nastopa v treh oksidacijskih stanjih: samorodno živo srebro (Hg0) v elementarnem stanju, enovalentno živo srebro (Hg+) in dvovalentno živo srebro (Hg2+). Samorodno Hg0 je večinoma prisotno v atmosferi in na mineraliziranih cinabaritnih tleh z aktivno predelavo rude, medtem ko imata Hg+ in Hg2+ veliko afiniteto do tvorbe vezi z mnogimi anorganskimi in organskimi ligandi v vodi, tleh in sedimentih. Med najpogostejše anorganske spojine v okolju prištevamo živosrebrov klorid (HgCl2), živosrebrov hidroksid (Hg(OH)2) in živosrebrov sulfid (HgS). Slednji je kot cinabarit, poleg samorodnega Hg0, prisoten v Idriji. Organske Hg spojine pa predstavljajo tiste spojine, kjer je Hg2+ ion neposredno vezan s kovalentno vezjo na vsaj en C atom, najpogosteje na C atom iz metilne skupine (CH3

-

). Najpomembnejši organski spojini sta metil-Hg – MeHg (CH3Hg+) in dimetil-Hg – DMHg ((CH3)2Hg), ki imata veliko nagnjenost k vezavi na različne biotsko aktivne makromolekule, preko katerih se akumulirata naprej v višje trofične nivoje v prehranjevalni verigi (EPA, 1997; Robinson in Tuovinen, 1984).

2.1.2 IDRIJA KOT ANTROPOGENI VIR ŽIVEGA SREBRA V OKOLJU

Emisije Hg in njegovih spojin v okolju so naravnega in antropogenega izvora. Največji naravni vir Hg v atmosferi predstavlja izhlapevanje Hg iz površine zemlje ob preperevanju kamnin, bogatih s Hg, t. i. cinabaritnih območjih ter ob vulkanskih izbruhih. Naravni viri prispevajo le majhen delež k emisiji Hg, saj gre povišane koncentracije Hg pripisati antropogenim virom Hg, kot so izkopavanje in predelava Hg rude, izhlapevanje Hg iz žgalniških ostankov, zažiganje odpadkov, izgorevanje fosilnih goriv, gnojila, industrija in drugo (Fitzgerald, 1995). Rudnik v Idriji, katerega je prekašal le španski Almaden, je veljal za drugi največji rudnik na svetu, z več kot 13 % svetovne proizvodnje Hg. Tekom 500-letnega neprekinjenega rudarjenja je bilo izkopane več kot 12 milijonov ton živosrebrove rude, od tega se je tekom pridobivanja v okolje izgubilo okoli 37.000 ton Hg (Gnamuš in Horvat, 1999). Idrija je zato torej odlično vzorčno mesto za raziskovanje vpliva dolgotrajnega onesnaževanja Hg na ekosistem (Gnamuš, 2002).

2.1.3 ŽIVO SREBRO V IDRIJSKIH TLEH

Vsebnosti Hg v tleh lahko različno vplivajo na prenos kovin v talno favno, rastline in naprej v kopenske prehranjevalne verige. Vezave in sproščanje Hg v tleh in s tem biodostopnost Hg rastlinam, so v različnih talnih horizontih različne in odvisne od osnovnih fizikalnih lastnosti, kot so temperatura ter vlažnost tal in zraka. Slednji povečujejo njegovo izhlapevanje iz tal ob višjih temperaturah in nižji talni vlagi (Gnamuš, 2002).

Na mobilnost Hg oz. sprejem kovine v rastline vplivajo tudi pedološki dejavniki, ki so različni od območja do območja. Med njih prištevamo (i) kemizem tal - pH, (ii) količino organske snovi, (iii) teksturo tal oz. delež gline in (iv) kationsko izmenjevalno kapaciteto. Za idrijsko zemljo ob topilniškem dimniku je značilno (povzeto po Gnamuš, 2002):


4

Kemizem tal - pH

Pri nižjih pH vrednostih (pH<4) Hg v tleh pogosto tvori slabo topne obstojne komplekse z žveplom (S) - HgS, zaradi česar je ovirana mobilnost Hg v prsti ter njegova biodostopnost rastlinam. Pri pH>4 so prisotne rastlinam bolj dostopne in mobilne oblike Hg - predvsem HgCl2 in Hg(OH)2. Vrednost pH je ob topilniškem dimniku v Idriji 6,8. Količina organske snovi

Kompleksi Hg s huminskimi in fulvinskimi kislinami povzročijo vezavo Hg na talne delce in posledično zmanjšajo privzem Hg v rastline. Yin in sod. (2005) so dokazali močno korelacijo tvorbe kompleksov Hg2+ s povečevanjem organskih snovi v tleh. Za privzem Hg iz tal skozi korenine je za rastline pomemben predvsem Hg2+. Dostopnost tega je večja v spodnjih mineralnih horizontih tal z malo organske snovi. Tla ob topilniškem dimniku v Idriji vsebujejo visoko vsebnost organske snovi (0-5 cm globine 38 % in 5-10 cm globine 10 %).

Tekstura tal oz. delež gline

Tekstura tal pomembno vpliva na privzem kovin v rastline. Tla, ki jih sestavljajo pretežno glineni delci, imajo veliko afiniteto do vezave kovin, medtem ko peščena tla vodijo v izpiranje kovin v podtalnico. V mineralnih horizontih tal, glina prevzema funkcijo huminskih in fulvinskih kislin, ki s tvorbo kompleksov s Hg zmanjšuje biorazpoložljivost in biodostopnost Hg. Tla ob topilniškem dimniku v Idriji so pretežno meljasta (46,5 %) in vsebujejo majhen delež gline (18,8 %). Vpliv vezave Hg na glino je v idrijski zemlji torej majhen, kar posledično poveča razpoložljivost za sprejem Hg v rastline. Vendar so horizonti tal ob topilniškem dimniku razmeroma bogati z organsko snovjo, ki prispeva pri vezavi Hg in zmanjšuje sprejem kovine v rastline.

Kationska izmenjevalna kapaciteta

Kationska izmenjevalna kapaciteta je vsota izmenljivih kationov, ki jih tla lahko zadržijo. Večjo kationsko izmenjevalno kapaciteto imajo tla z velikim deležem glinenih delcev, ki na svoji površini zadržujejo katione kovin. Raziskave idrijske zemljo ob topilniškem dimniku so pokazale, da kationi ne vplivajo na vezavo Hg v tleh. Pomen pripisujejo drugim vezavnim mehanizmom Hg v tleh.

2.1.4 VPLIV ŽIVEGA SREBRA NA RASTLINE

Rastline zasedajo pomembno mesto v ekosistemih, saj so v neposrednem stiku s prstjo, hkrati pa predstavljajo hrano za živali in ljudi. So prve, ki sprejemajo kovine in delujejo kot vezni člen, ki privzeto Hg iz tal in zraka posredujejo iz neživega okolja v prehranjevalne verige (Gnamuš, 2002). Živo srebro v rastlinah nima znane biološke vloge, lahko pa že pri zelo nizkih koncentracijah negativno vpliva na njihovo rast in razvoj (Patra in Sharma, 2000). Posledično je bil v zadnjih desetletjih velik poudarek na raziskovanju biodostopnosti in strupenosti Hg za višje rastline ter njihovih obrambnih strategijah.

Privzem Hg v rastline je poleg okoljskih dejavnikov, kot so stopnja obremenjenosti okolja, meteorološki pogoji, kamninska sestava in način ter obseg izpostavljenosti rastline in ostale značilnosti rastišča, odvisen od metabolnih lastnosti in razvojne stopnje rastline (Zyrin in Obukhovskaya, 1980). Na splošno je dostopnost Hg za rastline iz tal nizka, saj se Hg v tleh veže na organske in mineralne snovi (Patra in Sharma, 2000). Poleg tega se večina privzetega Hg zadrži v koreninah, točneje v celični steni, saj Hg težko vstopa preko celične membrane v celice korenin. Korenine tako služijo kot zadrževalnik pred prenosom Hg iz zemlje v nadzemne dele rastlin (Debeljak in sod., 2013).


5

Strupenost Hg se odraža tako na nivoju celotne rastline, kot tudi na celičnem nivoju. Ob močno povišanih koncentracijah rastlina zmanjša intenzivnost rasti in reprodukcijsko sposobnost, poškodbe membran pa blokirajo nekatere procese v celici (Prasad, 1997). Privzem Hg je najbolj učinkovit pri mladih rastlinah, na rastlinskem zarodku in semenskem endospermu. Strupenost Hg se kaže predvsem v njegovi afiniteti do tiolnih skupin (-SH), ki so sestavni del aminokislin, predvsem cisteina in metionina in posledično proteinov. Živo srebro v mladih rastlinah, ki so bogate s -SH skupinami, tvori komplekse z biološkimi molekulami preko tvorbe mostu -S-Hg-S- in tako ovira kalitev in posledično rast mlade rastline (Carrasco-Gil in sod., 2013; Rajan in sod., 2008; Kodre in sod., 2017). Živo srebro ima tudi veliko afiniteto do fosfatnih skupin (PO4

-

) v ADP, ATP in DNK. Velikokrat nadomesti atome magnezija (Mg) v molekuli klorofila, s čimer zavira fotosintezno aktivnost. Kovina lahko v tkivih rastlin inhibira odpiranje rež ter blokira aktivnost številnih encimov, med drugimi tudi hidrolitične encime, odgovorne za mobilizacijo hranil (Patra in Sharma, 2000).

2.1.5 VPLIV ŽIVEGA SREBRA NA ŽIVALI

Onesnažena območja zaradi neposredne okolice rudnikov, topilnic in odlagališč odpadkov, pomembno prispevajo h kopičenju Hg v kopenskih organizmih. Vdihovanje Hg0 skozi pljuča in vstop anorganskih in organskih Hg spojin s hrano in vodo skozi prebavila, predstavljata dve glavni poti vnosa Hg v višje kopenske vretenčarje. Razlike v privzemu, metabolizmu, strupenosti in zadrževalnih časih so močno pogojeni s topnostjo različnih Hg spojin v vodi in notranjih telesnih tekočinah (Gnamuš, 2002).

V organizmih hlapni Hg0 zaradi svoje velike difuzibilnosti in topnosti v lipidih intenzivno prehaja preko celičnih membran. Po inhalaciji se nekaj Hg0 raztopi v plazmi, preostali del pa se absorbira v kri. V rdečih krvnih celicah se manjša količina Hg0 veže na hemoglobin, večji del pa se s pomočjo tkivnih katalaz oksidira do Hg2+ ionov. Ti tvorijo komplekse z različnimi ligandi, predvsem s -SH skupinami, ki so v tkivih pogosto gradniki proteinov (MacGregor in Clarkson, 1974).

V primerjavi z dobro topnim elementarnim Hg0 je absorpcija anorganskih Hg spojin s hrano in vodo skozi prebavila zelo majhna - komaj 7 % (Clarkson, 1972). Večjo težavo predstavljajo lipidotopne organske Hg spojine, saj je njihova absorpcija iz prebavnega trakta popolna (Gnamuš, 2002). Znan je privzem MeHg s hrano živalskega izvora v živali in človeka, medtem ko privzem MeHg iz rastlinske hrane ostaja slabo raziskan (WHO, 1976, Gnamuš in sod., 2000). Obstaja možnost, da lahko na močno onesnaženih območjih, rastline kopičijo večje količine anorganskih in le 2 % organskih Hg spojin. Pri kopenskih rastlinojedih sesalcih je absorpcija anorganskih Hg spojin v telo omejena, absorpcija ostalih 2 % organskih Hg spojin pa celostna. MeHg se iz hrane skupaj z vezavo na beljakovinske komponente absorbira iz prebavnega trakta v kri. Po krvožilnem sistemu se MeHg prenaša do telesnih tkiv, se veže na -SH skupine različnih makromolekul in povzroča mutagene ter rakotvorne učinke (Gnamuš, 2002).


6

2.2 SELEN

2.2.1 FIZIKALNE IN KEMIJSKE OBLIKE SELENA

Selen je leta 1817 odkril švedski kemik Jons Jakob Berzelius - na dnu svinčevih komor v tovarni žveplove kisline. Zaradi podobnosti z elementom telurjem (Te) ga je kemik poimenoval po luni, grško »selene«. Nahaja se v VI. skupini periodnega sistema s kemijskim simbolom Se in atomskim številom 79 (Brenčič in Lazarini, 1995). Selen ima veliko afiniteto do tvorbe vezi z mnogimi anorganskimi in organskimi ligandi. V anorganskih spojinah lahko nastopa v štirih oksidacijskih stanjih, in sicer kot elementarni selen (Se0), kot selenid (Se2-), kot selenit (Se4+ - SeO3

2-) ali kot selenat (Se6+- SeO42-), v organskih spojinah pa se nahaja kot selenocistein (Se-

Cys) in selenometionin (Se-Met) (Pyrzyńska, 2002). Organske Se spojine imajo v primerjavi z anorganskimi v telesu daljši zadrževalni čas, so bolj biološko razpoložljive in manj strupene (Hall in sod., 2014).

Njegove kemijske lastnosti so analogne žveplovim, zato Se pogosto zamenjuje S. Pri asimilaciji tako selenovih kot žveplovih anorganskih spojin sodelujejo isti encimi, zato oba elementa tekmujeta v biokemijskih procesih. Ob povišanih koncentracijah Se lahko pride do vključitve Se na mesto v molekuli, kjer je običajno vezano S. Na tak način prihaja do nastanka Se-Cys in Se-Met, kar vodi v napačno zvijanje proteinov in posledično nefunkcionalnost proteinov (Minorsky, 2003, Germ in Stibilj, 2007).

2.2.2 VPLIV SELENA NA ORGANIZME

Selen je eden izmed esencialnih elementov za mnoge organizme, vključno z živalmi in ljudmi. V majhnih koncentracijah ima pomembno vlogo za normalno delovanje vseh fizioloških funkcij v organizmih, medtem ko je v velikih koncentracijah strupen. Esencialnost tega elementa za višje rastline še vedno ni dokazana (Hasanuzzaman in sod., 2014). Primarni vir Se za človeka predstavljajo rastline. Težava nastane, če ljudje v želji po vnosu zadostnih količin Se v telo, uživajo pretežno rastlinsko hrano, ki uspeva v tleh, onesnaženih s kovinami (Zhang, 2014). Kopičenje Se v tleh je odvisno od vrste in strukture tal, vsebnosti organskih snovi in od količine padavin. Slednja z izpiranjem zmanjša količino Se v tleh. Povprečna koncentracija Se v tleh se giblje od 0,1 do 0,7 mg kg-1 zemlje, večje koncentracije pa že lahko povzročajo negativne učinke na organizme (Martens in sod., 1996; Barceloux, 1999).

Največ Se v tleh se nahaja v obliki selenita (SeO42-) in selenata (SeO3

2-). Slednjega rastline privzemajo največ, saj je dobro topen v vodi in tako rastlinam lahko dostopen. Zaradi kemijske podobnosti s sulfatom se transportira v kloroplaste preko sulfatnih transporterjev v membrani celic korenin (Terry in sod., 2000). Selenat se zaradi dobre topnosti v vodi akumulira v poganjkih, medtem ko se slabše topni selenit in organske oblike Se zadržujejo predvsem v koreninah (Terry in sod., 2000). Znano je, da lahko rastline sprejemajo Se tudi iz ozračja preko površine listov. To so dokazali tudi Wang in sod. (2013), kjer je bila koncentracija Se v zrnju koruze v primeru foliarnega nanosa večja kot koncentracija Se v zrnju koruze, ki je kalilo v substratu z dodanim Se.

Selen ima na rastline pozitivne in negativne učinke. V nižjih koncentracijah Se deluje kot antioksidant, ki ščiti rastline pred oksidativnim stresom, poleg tega pa pospeši rast sadik, upočasni njihovo staranje, pozitivno vpliva na biomaso rastlin ter zmanjša transpiracijo v sušnih obdobjih (Xue in sod., 2001; Pennanen in sod., 2002; Germ in sod., 2005). V primeru povečane koncentracije Se v rastlinah lahko upočasni rast, zmanjša sintezo proteinov, povzroči ovenelost listov ter s tem hitrejši propad rastline (Terry in sod. 2000).


7

Tudi živalske vrste so v primeru prevelike zaužite količine Se dovzetne za zastrupitev z njim. Zastrupitev je pogosta pri pašnih živalih (ovce, goveda, konji), saj jim glavni vir hrane predstavljajo rastline, ki lahko kopičijo povišane koncentracije Se (Hall in sod., 2014).

2.3 INTERAKCIJE ŽIVEGA SREBRA IN SELENA

Zaščitne vloge Se pred strupenimi učinki Hg segajo že v leto 1967, ko sta Pařizek in Ošťadalova (1967) na svojih poskusnih organizmih (podgane) dokazala, da Se v obliki selenita zmanjšuje črevesne in ledvične nekroze, povzročene z vbrizgano anorgansko Hg spojino (HgCl2). Leta 1972 so Ganther in sod. ob prisotnosti Se pokazali tudi zmanjšano strupenost MeHg v ribah. Od takrat naprej so študije na mikroorganizmih, ribah, perutnini, ljudeh in drugih sesalcih še dodatno potrdile pozitivne učinke Se in s tem odprle možnost, da je Se-Hg antagonizem splošno razširjen med organizmi, če ne celo univerzalen (McNear in sod., 2012).

Prvi, ki so proučevali interakcije Hg-Se v rastlinah so bili Shanker in sod. (1996). Njihove testne rastline so bile redkvice (Raphanus sativus), ki so bile izpostavljene Hg v kombinaciji dodajanja selenata ali selenita v dveh različnih substratih, v prsti in pesku. Opazili so zmanjšanje privzema Hg v redkvice z naraščajočimi koncentracijami Se ne glede na anorgansko obliko Se. Opazili so, da je zmanjšan privzem Hg v rastline rezultat tvorbe kompleksa Hg-Se v rizosferi. Varovalni učinki rastline se kažejo v znižanem pH okoli korenin, ki je posledica sproščanja organskih kislin iz korenin. Znižan pH okoli korenin povzroči redukcijo selenata in selenita do elementarnega Se0, ki se poveže s Hg2+ v stabilen, netopen in zato rastlinam nedostopen Hg-Se kompleks.

Prvi poskus določitve kompleksov Hg-Se v rastlinah so izvedli Mounicou in sod. (2006), ki so indijsko ogrščico (Brassica juncea) na hidroponiki izpostavili Hg in Se. Ugotovili so, da se je v koreninah, izpostavljenih Hg, akumuliralo več Hg, kot pa v koreninah, izpostavljenih Hg in Se. Pri slednjih se Hg ni translociral v nadzemne dele rastlin, čemur so vzrok pripisali najverjetnejši vezavi Hg in Se na vodotopne polisaharidne ali proteinske biomolekule z visoko molekulsko maso ali pa tvorbi netopnih Hg-Se kompleksov. Ti izsledki bi bili lahko izredno pomembni v smislu uživanja nadzemnih delov nekaterih rastlin, gojenih na s Se bogatih ter s Hg onesnaženih tleh. Njihove raziskave so leta 2012 potrdili tudi Zhang in sod., ki so zmanjšan privzem Hg2+ iz zemlje v korenine riža pripisali tvorbi netopnega Hg-Se kompleksa v rizosferi in/ali na površini korenin. Tako so pokazali, da v riževih zrnih Se igra pomembno vlogo v omejevanju biorazpoložljivosti, biodostopnosti, privzema in bioakumulacije Hg2+ iz zemlje v podzemne in naprej v nadzemne dele riža.

Kljub hitremu širjenju Hg-Se antagonizma med organizmi, je še veliko kraljestev neraziskanih. Tako je še danes vloga Se na sam privzem Hg v rastline tako v vodnih kot tudi v terestričnih ekosistemih slabo raziskana.


8

2.4 AJDA

Ajda je starodavna rastlina, ki je bila nekoč v Sloveniji in ponekod drugje hrana kmečkih delavcev in revnih ljudi. Vsebuje zelo kakovostne beljakovine, ki so ljudi v starih časih, ko si niso mogli privoščiti mesa, nasitile, poleg tega pa jim zagotovile tudi druge nujno potrebne snovi (Vombergar in sod., 2012). Njeno ime, kot ga poznamo v Sloveniji, izhaja iz nemške besede Heide, z drugo besedo »ajd, pogan«, saj so jo v 12. stoletju križarji prinesli iz poganskih krajev jugozahodne Kitajske, Junan. Od tam se je postopoma širila proti severu Kitajske, se preko Rusije in Ukrajine razširila v srednjo Evropo in potem naprej proti zahodni Evropi (Kreft, 1995).

Ajda po botaničnih lastnostih ni uvrščena med prava žita, ki so enokaličnice (Poaceae), temveč v družino dresnovk (Polygonaceae), ki so dvokaličnice (Bonafaccia in Fabjan, 2003). Kljub tej botanični razliki pa jo v kmetijstvu in trgovini skupaj z žiti uvrščamo v isto skupino, saj jo pridelujemo na podoben način kot žita in njena mleta zrna uporabljamo za moko (Kreft, 1995).

Je zelo nezahtevna poljščina, skromna glede potreb po hranilih. Zaradi sposobnosti korenin, da lahko izkorišča snovi, ki drugim rastlinam niso dostopne, gnojenje sploh ni potrebno. Je neobčutljiva na bolezni in škodljivce in deluje kot naravni herbicid. V primerjavi z drugimi žiti vsebuje določene snovi, t.i. naravne antioksidante, ki v rastlini služijo kot naravni obrambni mehanizmi, imajo pa tudi ugoden učinek na zdravje ljudi (Kreft, 1995; Kreft, 2010).

Slovenija je od nekdaj poznana po ajdovih žgancih, kruhu, štrukljih in kaši ter zagotovo je ajda rastlina, s katero si lahko popestrimo vsakdanjo prehrano. V zadnjih letih se počasi, a vztrajno vrača na slovenska polja. Poleg tega, da lahko njeno uživanje prispeva k ohranjanju našega zdravja, so cvetoča polja ajde ne samo paša za čebele, temveč tudi prispevek k ohranjanju lepe slovenske kulturne krajine.

Kreft (1995) navaja, da pri nas poznamo dve vrsti ajdi: navadno (Fagopyrum esculentum) in tatarsko (Fagopyrum tataricum) ajdo.

2.4.1 NAVADNA AJDA

Navadna ajda (Fagopyrum esculentum Moench) je enoletna rastlina, ki lahko v nižinskih predelih, pod pogojem, da ima na voljo dovolj hranil, vlage in časa za rast, doseže tudi do 150 cm. V skromnih razmerah njena višina doseže le okoli 30 cm, v hribovitih območjih pa do 70 cm. Korenine ajde se z dolgimi koreninskimi laski v zemlji razraščajo zelo plitvo. Stebla navadne ajde so zelena, na osončeni strani pa pogosto rdečkasto obarvana. Steblo ajde je sočno in zaradi vsebnosti oksalne kisline kiselkastega okusa. Listi so srčasto puščičasti in skoraj tako široki kot dolgi (Kreft, 1995). V mesecu avgustu so dišeče cvetoči beli, rožnati ali rdečkasti cvetovi ajde vaba za čebele, ki nabirajo medičino in s tem prenašajo pelod iz rastline na rastlino. Semena navadne ajde so gladka, triroba, svetlo sive do srebrne barve (Vombergar in sod., 2014).

2.4.2 TATARSKA AJDA

Tatarska ajda (Fagopyrum tataricum Gaertn.) znana tudi kot zelena ali grenka ajda je zelo podobna navadni ajdi, vendar je opaznih nekaj morfoloških razlik. V primerjavi z navadno ajdo so stebla navadno zelena, cvetovi so manjši, skoraj neopazni, zeleno ali zeleno rumene barve. Prav zaradi tega se cvetovi samooprašijo, obiskujejo jih le nekatere manjše žuželke. Semena tatarske ajde so triroba, robovi niso gladki, temveč nagubani in nekoliko zaobljeni. So zelene ali rjave barve (Vombergar in sod., 2014).


9

2.5 KEMIJSKA SESTAVA NAVADNE IN TATARSKE AJDE

V starih časih so bila ajdova zrna primarni vir prehrane ljudi. Ajdovo zrno vsebuje različne hranilne snovi, ki pozitivno vplivajo na naše zdravje. Mednje prištevamo proteine, polisaharide, prehranske vlaknine, lipide, antioksidante in mikrohranila (Kim in sod., 2004). Vsebnost posameznih snovi je odvisna od sorte ajde in okoljskih dejavnikov (Barta in sod., 2004).

Škrob predstavlja glavno komponento v semenu ajde, saj zavzema kar 70 % v suhi snovi. Kemijsko je sestavljen iz dveh strukturnih komponent, amiloze, kjer so glukozne enote povezave v nerazvejane verige in amilopektina, kjer so glukozne enote povezane v razvejane verige (Zhu, 2016). Zaradi večje vsebnosti nerazvejanega škroba, ki se prebavlja bistveno počasneje, je ajda primerna za bolnike s sladkorno boleznijo ter za ljudi s celiakijo, saj ne vsebuje glutena (Kreft, 1995).

Ajda vsebuje veliko vlaknin, ki lahko prispevajo k zmanjšanju črevesnega raka in debelosti. Bonafaccia in sod. (2003) so ugotovili, da navadna in tatarska ajda vsebujeta enake količine vlaknin, le da so pri tatarski ajdi nekoliko bolj topne, odvisno od tipa, rastnih razmer in metode mletja ajde. Z vlakninami izredno bogate snovi so ajdovi otrobi, ki predstavljajo 21 % proteinov v navadni ajdi in 25 % proteinov v tatarski ajdi. Proteini v ajdi so zelo kakovostni, saj vsebujejo vseh osem esencialnih aminokislin (Kreft, 1995). Otrobi navadne in tatarske ajde so tudi znani po visoki vsebnosti vitamina B2. Vsebnost ostalih vitaminov B, vitamin B1 (tiamin) in B2 (riboflavin) je v primerjavi z navadno ajdo, večja v tatarski. Dokazali so tudi, da tatarska ajda vsebuje 6 % več vitamina B12 (Bonafaccia in sod., 2003).

Čeprav ajdovo zrno vsebuje različne hranilne snovi, težava nastane pri uživanju nadzemnih delov ajde. Namreč zeleni deli ajde vsebujejo fluorescenten rdeč pigment t.i. fagopirin, ki pri ljudeh in živali povzroča občutljivost na svetlobo. Ob preveliki količini zaužitih zelenih delov rastlin ajde in ob hkratni izpostavljenosti sončni svetlobi, lahko pride do fagopirizma. Bolezen se kaže v obliki srbečice in vnetja na neporaščenih predelih telesa (Benković in Kreft, 2015).

2.6 RASTLINE IN OKSIDATIVNI STRES

Rastline so izpostavljene različnim stresnim dejavnikom. Naj bo to izpostavljenost patogenim mikroorganizmom oziroma izpostavljenost neugodnim okoljskim dejavnikom, se bo rastlina na stres ali prilagodila ali pa bo stres zanjo premočan in ji bo tako onemogočil rast in razvoj.

Kisik je ključnega pomena za preživetje rastlin, vendar lahko zanje predstavlja tudi velik problem, če se pretvarja v reaktivne oblike kisika (ROS) (Jovanovic in Simic, 2000). Reaktivne kisikove spojine (ROS) so prosti radikali oz. atomi, molekule ali ioni z vsaj enim prostim elektronom brez para (Korošec, 2000). Glavni vir nastanka ROS predstavlja mitohondrijska elektronska transportna veriga, ki za produkcijo energije v celici porabi več kot 90 % kisika (Lushchak, 2011). Energija se sprošča ob redukciji kisika v vodo. Ob nepopolni redukciji nastajajo delno reducirane oblike kisika, ki imajo težnjo po stabilnosti. Med njih prištevamo reaktivne superoksidne anione (O2

•-), vodikove perokside (H2O2) in hidroksilne radikale (OH•). Ti določenim spojinam, ki niso radikali, odvzamejo elektron, se na ta način stabilizirajo, spojine pa postanejo radikali. Tarče reduciranih oblik kisika so večinoma celične komponente, ki vsebujejo nenasičene maščobne kisline, nukleinske kisline, beljakovine in ogljikove hidrate. Sprožijo se verižne reakcije, ki lahko vodijo do poškodb celic (Hagendus in sod., 2001).

ROS so lahko tudi stranski produkti med fotorespiracijo v peroksisomih in posledica okoljskih dejavnikov, kot so temperatura, slanost, suša, napad patogenov, pomanjkanje hranil in prisotnost kovin (Dat in sod., 2000).


10

2.7 ANTIOKSIDANTI

V organizmu homeostazno neškodljivo koncentracijo ROS uravnavajo antioksidanti. V tem primeru ROS pozitivno delujejo kot signalne molekule, ki so vključene v razvojne procese in rast celic ter imajo obrambne odzive na patogene, saj omejijo širitev okužbe z okrepitvijo celičnih sten. Ko nastanek ROS preseže antioksidativno kapaciteto, nastane za organizem neugodno stanje, imenovano oksidativni stres. Oksidativni stres se kaže v poškodbah celičnih struktur, vključno z nukleinskimi kislinami, beljakovinami in proteini (Apel in Hirt, 2004). Spremembe lahko privedejo do mutacij, kot so delecije in substitucije v molekuli DNK, kar je povod za razvoj rakastih obolenj (Cao in sod., 2008).

Med antioksidante prištevamo encime, vitamine (vitamin A, C in E), karotenoide (beta karoten, alfa karoten, lutein, likopen) in polifenolne spojine, vključno s flavonoidi (katehini, flavonoli, flavoni in izoflavonoidi) (Cao in sod. 2008). Ti organizem pred oksidativnim stresom zaščitijo z lovljenjem prostih radikalov, s keliranjem kovinskih ionov, lahko pa tudi z odstranjevanjem in popravilom oksidativno poškodovanih biomolekul. Prosti radikali na ta način pridobijo manjkajoče elektrone in se pretvorijo v stabilno, neškodljivo obliko (Hegedus in sod., 2001; Cao in sod., 2008).

2.7.1 POLIFENOLNE SPOJINE

Fenolne spojine so neencimski antioksidanti, sestavljene iz najmanj enega aromatskega obroča in najmanj ene hidroksilne (-OH) skupine, vezane na obroč. V naravi so spojine običajno prisotne z več -OH skupin, od tod ime polifenolne spojine. Znano je, da se njihova antioksidativna učinkovitost povečuje z naraščanjem števila -OH skupin. So sekundarni rastlinski metaboliti, ki sodelujejo pri reprodukciji rastlin in njihovi rasti. Pomembno vlogo imajo tudi pri preprečevanju bioloških razkrojev ter pred vdorom patogenov in plenilcev (Bravo, 1998 in Chao in sod., 2002). Polifenolne spojine delimo na hidrolizirajoče tanine, lignine, stilbene, tripolene in flavonoide. Slednji so najbolj razširjeni sekundarni metaboliti v rastlinskih celicah (Luthar, 1992).

Flavonoidi

Flavonoidi so najpogostejša in najbolj razširjena skupina rastlinskih vodotopnih polifenolnih spojin s strukturno formulo C6C3C6. Nahajajo se v vakuolah vsake rastlinske celice in ščitijo rastline pred različnimi biotskimi (virusi, bakterije, glive) in abiotskimi (odpornost na mraz, sušo) dejavniki. Hkrati delujejo kot signalne in obrambne molekule pred UV-sevanjem ter so odgovorni za barvo cvetov, s katerimi privabljajo insekte za opraševanje (Samantha in sod., 2011).

Najbolj poznani rastlini, bogati s flavonoidi sta navadna in tatarska ajda. Vsebnost in sestava flavonoidov v semenih ajde je odvisna od vrste le-te in razvojne faze. Holasova in sod. (2002) so dokazali, da ima ajda večjo antioksidativno učinkovitost na račun do 5-krat večje vsebnosti polifenolnih spojin v primerjavi z ovsom in ječmenom.

Najpomembnejši flavonoidi v ajdi so rutin, kvercetin in kvercetrin. Fabjan in sod. (2003) so v svojih raziskavah ugotovili, da zrnje tatarske ajde vsebuje več rutina kot zrnje navadne ajde. Vsebnost rutina in kvercetina je odvisna od genotipa ajde, rastnih pogojev, razvojne faze, dela rastline, leta žetve ter okoljskih dejavnikov. Največ rutina je v socvetju, v steblih in zgornjih listih (Hagels, 1999).


11

2.7.2 ANTIOKSIDATIVNA FUNKCIJA POLIFENOLOV IN KOVINE

Kovine pomembno prispevajo k onesnaževanju okolja, ki so posledica človekovih dejavnosti, kot so rudarstvo, taljenje, galvanizacija, proizvodnja energije in goriva, intenzivno kmetijstvo, odlaganje odpadkov in podobno (Nedelkoska in Doran, 2000). Kopičenje kovin v zemlji lahko privede do njihove bioakumulacije v rastline, kar predstavlja veliko tveganje za zdravje živali in potencialno tudi ljudi (Kabata-Pendias in Pendias, 2001).

Dietz in sod. (1999) so poročali, da lahko kovine povzročijo oksidativni stres v celicah in tkivih na več načinov:

1. H2O2 difundira skozi celične membrane. Ob prisotnosti železovih (Fe2+) ali bakrovih (Cu+) ionov pride do reakcije, kjer se kovinski ion oksidira, H2O2 pa pretvori v hidroksilni radikal (OH•), ki je najbolj reaktiven prosti radikal.

2. Kovine motijo metabolične poti, še posebej v tilakoidnih membranah, kjer prihaja do povečane tvorbe prostih radikalov.

3. Kovine večinoma inaktivirajo antioksidativne encime (glutation peroksidaze, katalaze, superoksid dismutaze), ki so odgovorni za razstrupljanje prostih radikalov.

4. Akumulacija kovin povzroči izčrpanost antioksidantov z nizko molekulsko maso, npr. glutationa.

Rastline so razvile različne antioksidativne mehanizme za obrambo pred kovinami. Eden izmed njih je tvorba fenolnih spojin, ki oksidacijo lipidov, zaradi kovin, zmanjšajo s kelacijo ionov kovin. Sestavni del fenolov so hidroksilne (-OH) in karboksilne (-COOH) skupine, ki so sposobne vezave kovinskih ionov, še posebno Cu+ in Fe2+ v kelatne spojine (Jung, 2003). Dokazano je bilo, da korenine koruze, izpostavljene aluminiju (Al), izločajo velike koncentracije fenolnih spojin (Winkel-Shirley, 2002). Lavid in sod. (2001) so v metanolnih ekstraktih lokvanjevk (Nympheaeceae) dokazali kelacijo Cr, Pb in Hg oz. vezavo le-teh na polifenole. Morgan in sod. (1997) kelacijo pripisujejo visokim nukleofilnim značajem aromatskega obroča in ne specifičnim kelatnim skupinam znotraj molekule.

Ioni kovin lahko reagirajo z lipidnimi hidroperoksidi, ki so produkti lipidne peroksidacije. S cepitvijo vezi med O-O nastanejo alkoksilni radikali, ki sprožijo verižno reakcijo lipidne peroksidacije. Fenolne spojine preprečujejo lipidno peroksidacijo z lovljenjem alkoksilnih radikalov. Reakcija je pogojena s strukturo molekule ter številom in položajem hidroksilnih skupin v molekulah fenolnih spojin (Millic in sod., 1998). Bors in sod. (1990) opišejo tri karakteristike za determinacijo močnih antioksidantov: (i) prisotnost orto-dihidroksi oziroma kateholne skupine na obroču B, (ii) 2,3-dvojno vez na obroču C ter (iii) hidroksilni skupini na mestih 3 in 5.

Arora in sod. (2000) so pokazali, da lahko fenoli stabilizirajo membrane preko zmanjšanja membranske tekočine. Tako je lahko ovirana difuzija prostih radikalov, ki povzročajo peroksidacijo. Fosfolipidni dvosloj lahko zaščitijo tudi tako, da se vodiki fenolov povežejo s polarnimi glavami fosfolipidov. Posledično se te spojine nabirajo na površini membran in v notranjosti celic in tako preprečijo dostop škodljivih molekul do hidrofobne regije fosfolipidnega dvosloja.


12

Raziskave so tudi pokazale, da lahko flavonoidi delujejo kot donorji elektronov ali atomov vodika (Arora, 1998). Atom vodika se poveže z reaktivnim radikalom. Na ta način se radikali stabilizirajo, sam radikal antioksidanta pa še lahko reagira z naslednjim reaktivnim radikalom. Ena molekula antioksidanta lahko torej stabilizira dva prosta radikala (Fuhrman in Aviram, 2002).


13

3 METODE DELA

3.1 RASTLINE

3.1.1 PRIPRAVA SUBSTRATA

Za poskus smo uporabili zemljo, nabrano okoli dimnika nekdanjega delujočega rudnika in talilnice Hg v Idriji. Nabrano zemljo smo razporedili na vrečki za smeti, jo 3 dni sušili na zraku pri sobni temperaturi ter jo presejali. Na ta način smo se izognili morebitnim prisotnim koreninam, kamenju in drugim. Zemljo smo nato enakomerno razdelili v 4 različna korita za rože, v vsakega izmed njih po približno 3 kg.

3.1.2 GOJENJE RASTLIN

Za poskus smo si izbrali dve vrsti ajde, in sicer navadno (Fagopyrum esculentum) ter tatarsko (Fagopyrum tataricum) ajdo. Imeli smo 4 različne izpostavitve, od tega 2 izpostavitvi navadne in 2 izpostavitvi tatarske ajde. Semena dveh vrst ajd smo enakomerno razporedili po zemlji ter jih zalili z vodo.

Ajde smo gojili 7 tednov v kontroliranem okolju, v rastnih komorah pri 60 % relativni zračni vlagi, 16/8 dnevno/nočni periodi in temperaturi 19 °C. Zalivanje ajd je potekalo dvakrat tedensko, od tega smo jo enkrat tedensko za boljšo rast zalivali s hranilno Hoglandovo raztopino (sestava: 250 mM Ca(NO3)2, 250 mM KNO3, 250 mM MgSO4, 250 mM KH2PO4, 50 µM FeNaEDTA, mikroelementi, destilirana H2O) (Machils in Torrey, 1965).

3.1.3 IZPOSTAVITEV RASTLIN SELENU

Po treh tednih gojenja ajd, ko so bile velike približno 10 cm, smo eno korito navadne in eno korito tatarske ajde listno obogatili s Se. Pripravili smo 5 µM raztopino K2SeO4 (Alfa aesar) in s pripravljeno raztopino poškropili liste ajd. Ostali dve koriti smo škropili z navadno destilirano vodo. Ajde smo s Se škropili dvakrat tedensko, do konca poskusa.

3.1.4 DOLOČANJE SUHE BIOMASE

Po sedmih tednih smo poskus končali. Najprej smo zemljo v posameznem koritu razrezali na 10 enakih delov. V vsakem delu je bilo od 30 do 50 rastlin ajde. Nadzemne dele rastlin smo ločili od korenin in jih sprali z destilirano H2O za odstranitev morebitno prisotnega Se. Korenine smo za lažjo odstranitev iz substrata namočili v vodovodno vodo, jih sprali z destilirano H2O ter jih osušili s pomočjo papirnatih brisač. Nato smo zatehtali po 80 mg svežih korenin in 80 mg svežih poganjkov, ki smo jih uporabili za določanje stopnje lipidne peroksidacije. Material smo strli v terilnici s pomočjo tekočega dušika ter jih shranili v 2 ml epice. Epice smo takoj prenesli v tekoči dušik ter jih do nadaljnje analize hranili v zamrzovalniku na -80 °C. Preostanek posameznega rastlinskega materiala smo ločeno zavili v aluminijasto folijo, vsak paket ustrezno označili in jih prav tako zmrznili v tekočem dušiku. Zamrznjene pakete rastlin smo posušili v liofilizatorju (liofilizer Alpha 2-4 Christ). Rastlinski material se je pod zelo nizkim tlakom in temperaturi -96 °C sušil 5 dni. Po končanem sušenju smo rastlinski material stehtali in na ta način pridobili podatke o suhi masi (SM). Liofiliziran rastlinski material smo strli v terilnici z dodanim tekočim dušikom. Del rastlinskega materiala smo uporabili za rastlinske analize, ostali material pa za hranjenje polžev španski lazar (Arion vulgaris).


14

3.1.5 MERJENJE FOTOSINTEZNIH PIGMENTOV

Za merjenje fotosinteznih pigmentov smo uporabili liofilizirane poganjke. V steklene centrifugirke smo zatehtali po 30 mg uprašenih liofiliziranih poganjkov, vzorcu dolili 5 ml 80 % acetona (Empatra, ASC Nemčija) ter premešali na vorteksu. Na centrifugirkah smo označili nivo acetona, jih pokrili z gumijastimi pokrovčki, da smo se izognili izhlapevanju acetona ter jih čez noč shranili v hladilniku. Naslednji dan smo do označene črte vzorca dopolnili z 80 % acetonom, ki je med nočjo kljub zamaškom izhlapel. Vzorce smo ponovno premešali na vorteksu in centrifugirali 2 minuti pri 2500 obratih/minuto pri sobni temperaturi.

Tako pripravljenim vzorcem smo s pomočjo spektrofotometra 8452A (HP-Hewlett Packard) izmerili absorpcijo pri valovnih dolžinah 470, 647 in 664 nm. Spektrofotometer smo umerili z 80 % acetonom, katera vrednost se je odštela od vsakega izmerjenega vzorca posebej (Monni in sod., 2001).

Iz dobljenih absorpcij smo preko enačb preračunali koncentracijo posameznih pigmentov v µmol/l za klorofil a, klorofil b in karotenoide (Graan in Ort, 1984). Na koncu smo izračunali še končne koncentracije fotosinteznih pigmentov v mg/g suhe mase, pri čemer smo upoštevali še maso rastlinskega materiala in volumen ekstrakta.

3.1.6 DOLOČANJE STOPNJE LIPIDNE PEROKSIDACIJE

Stopnjo lipidne peroksidacije se določa preko indikatorja malondialdehida (MDA), ki je sekundarni produkt oksidacije in encimske razgradnje večkrat nasičenih maščobnih kislin. Metoda temelji na kislinski razgradnji lipidnih hidroperoksidov v MDA. MDA reagira s tiobarbiturno kislino v rožnato rdeč produkt, TBA-MDA kompleks, ki ga lahko spektrofotometrično pomerimo z določitvijo absorpcije pri valovni dolžini 532 nm (Hodges in sod., 1999).

Zatehtali smo 80 mg svežega rastlinskega materiala (korenine, poganjki) in ga homogenizirali v 2 ml 80 % etanola. Pripravljene epice smo centrifugirali 10 min na 3000 obratih (centrifuga tip 3K30, Sigma). S tem smo pelet ločili od supernatanta, ki smo ga uporabili za nadaljnji postopek. Iz vsake epice smo prenesli dvakrat po 800 µl supernatanta v dve novi epici. V eno izmed epic istega vzorca smo odpipetirali 800 µl +TBA, v drugo pa 800 µl -TBA. Vzorce smo ponovno zvorteksirali, pokrovčke epic s pomočjo segrete ostre kovinske konice preluknjali, jih razporedili na stojala ter segrevali 25 min v pečici (pečica Semlab) na 95 °C. Po preteklih minutah smo vzorce postavili na led ter tako reakcijo ustavili. Ohlajene vzorce smo ponovno centrifugirali 10 min na 3000 obratih. Zaradi bolj zanesljivih rezultatov smo v vsako kiveto odpipetirali po 1 ml posameznega vzorca. Vzorcem smo nato spektrofotometrično pomerili absorpcijo pri valovnih dolžinah 440, 532 in 600 nm. Iz izmerjenih absorpcij smo ob dodatnem upoštevanju volumna in mase rastlinskega vzorca izračunali količino MDA ekvivalenta (Hodgens in sod., 1999).

3.1.7 DOLOČANJE VSEBNOSTI FENOLNIH SPOJIN

Vsebnost fenolnih spojin, flavonoidov in antioksidativne učinkovitosti smo določili spektrofotometrično. Najprej smo si pripravili ekstrakte iz uprašenega rastlinskega materiala. V 2 ml epico smo zatehtali po 30 mg prahu korenin in poganjkov ajde, dodali 1,5 ml 60 % etanola ter stresali preko noči na stresalniku (Eppendorf). Ekstrakt smo nato centrifugirali pri 4000 obratih 10 minut in bister supernatant uporabili za nadaljnje analize (Kreft in sod., 2013).


15

3.1.7.1 Določanje vsebnosti skupnih fenolnih spojin

Vsebnost skupnih fenolnih spojin smo določili s Folin-Ciocalteu metodo. Folin-Ciocalteu (FC) reagent vsebuje fosmolibdenski/fosfovolframov kompleks. Metoda temelji na redukciji le-tega v prisotnosti fenolnih spojin, ki se kaže v modri obarvanosti raztopine (Magalhaes in sod., 2008).

Posamezen supernatant smo v treh ponovitvah po 20 µl nanesli v mikrotitrsko ploščico. Dodali smo 150 µl H2O ter 10 µl FC reagenta. Vzporedno smo naredili tudi tri kontrole, kjer smo uporabili supernatant in 160 µl H2O. Po 3 minutah smo povsod dodali 20 µl 20 % Na2CO3, raztopljenega v vodi. FC reagent ob dodatku Na2CO3 oksidira fenolne spojine. Po 60 min smo pri valovni dolžini 750 nm pomerili absorbanco nastalega kompleksa. Večja absorbanca pomeni večjo koncentracijo fenolnih spojin (Kreft in sod., 2013; Košmerl in Kač, 2007). Pomerili smo tudi standardno raztopino pirogalol (determinacijski koeficient R2= 0,997) pri različnih koncentracijah.

Vsebnost skupnih fenolov v vzorcu smo izračunali po enačbi 1:

�� ( �

�) =

((��)��,��)∗��

!,"#""∗ $ ��%� (1)

A1 - absorbanca vzorca (ekstrakt vzorca + reagent) A0 - absorbanca slepega vzorca (ekstrakt vzorca + voda).

3.1.7.2 Določanje vsebnosti flavonoidov

Določanje vsebnosti flavonoidov temelji na reakciji flavonoidov in AlCl3, pri čemer se tvori kompleks, ki raztopino obarva rumeno (Bohm, 1998). Po ekstrakciji in centrifugiranju smo posamezen supernatant v treh ponovitvah po 180 µl nanesli v mikrotitrsko ploščico. Vsem trem ponovitvam smo dodali 20 µl 5 % AlCl3 raztopljenega v 100 % etanolu. Po 30 minutah, ko je reakcija potekla, smo na spektrofotometru izmerili absorbanco pri 425 nm. Vzporedno smo naredili tudi kontrolo, kjer smo uporabili supernatant in 100 % etanol (A0). Pomerili smo tudi standardno raztopino rutin (determinacijski koeficient R2= 0,9962) pri različnih koncentracijah.

Vsebnost flavonoidov v vzorcu smo izračunali po enačbi 2:

�� &��'(�� ( �

�) =

((��)��,��)�)∗��

�,#!�∗ $ ��%� (2)

A1 - absorbanca vzorca (ekstrakt vzorca + reagent) A0 - absorbanca slepega vzorca (ekstrakt vzorca + 100 % etanol).

3.1.7.3 Določanje antioksidativnega potenciala

Antioksidativni potencial smo določili s pomočjo meritve koncentracije DPPH* radikala. Molekula 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH*) je stabilen radikal, ki lahko reagira s spojinami, ki so sposobne oddati vodikov atom ali elektron (npr. fenoli). Pri tem se tvori reducirana oblika molekule (DPPH-H), ki pretvori modro vijolično barvo DPPH* v bledo svetlo rumeno barvo. Večja kot je koncentracija antioksidantov, več DPPH* bo reagiralo z njimi. Koncentracijo preostalega DPPH* se določi spektrofotometrično in je merilo za antioksidativno učinkovitost določene spojine (Roginsky in Lissi, 2005; Kedare in Singh, 2011).

Posamezen supernatant smo v treh ponovitvah po 100 µl nanesli na mikrotitrsko ploščico. Dodali smo 100 µl DPPH*raztopine (3,9 mg ml-1 etanola). Vzporedno smo naredili tudi


16

kontrolo, kjer smo uporabili supernatant in 100 µl etanola. Po 20 minutah smo pomerili absorbanco (A1) pri valovni dolžini 520 nm.

Skupno antioksidativno aktivnost posameznega vzorca smo določili preko izmerjene stopnje inhibicije DPPH*, ki je premo sorazmerna s količino antioksidantov v vzorcu (Brand-Williams in sod., 1995). Stopnjo inhibicije DPPH*smo določili po 20 min. Delež inhibicije DPPH je bil določen po enačbi 3 in je izražen v odstotkih:

*�ℎ'�','-& .//0 (%) =(�2�(��3) �,��

�2∗ 100 (3)

A0 - absorbanca slepega vzorca (100 % etanol + DPPH*) A1 - absorbanca vzorca (ekstrakt vzorca + DPPH*) A2 - absorbanca vzorca brez DPPH* (ekstrakt vzorca + 100 % etanol)

3.2 ŽIVALI

3.2.1 PRIPRAVA POLŽEV IN LONČKOV ZA POSKUS

Polže španske lazarje (Arion vulgaris) smo nabrali po okoliških vrtovih. Polže smo v poskusu gojili v veliki plastični posodi. Spodnjo četrtino posode je prekrival mavec, zmešan z vodo in aktivnim ogljem v prahu. Nanj smo položili še filter papir ter ga navlažili z destilirano vodo. Dodatek aktivnega oglja je preprečeval razvoj plesni in bakterij, zaradi katerih bi polži lahko zboleli, mavec in filter papir pa sta služila kot dober nadomestek zemlje. Slednja tudi dobro zadržujeta vlago, ki jo polži nujno potrebujejo, hkrati pa ne vsebujeta potencialno strupenih elementov, ki bi motili potek poskusa. V vsak primerno označen lonček smo dali po enega polža, katerega smo osušili s papirnato brisačo. Imeli smo 8-10 polžev na izpostavitev.

3.2.2 PRIPRAVA HRANE IN HRANJENJE POLŽEV

Pripravili smo mešanico korenin in poganjkov ajd v razmerju 1:3. Mešanici smo dodali še uprašeno proteinsko mešanico, primerno za presnovne potrebe polžev španski lazar (Arion vulgaris). Proteinska mešanica je vsebovala koruzno moko, sojine kosmiče, ribjo hrano, natrijev klorid (NaCl), sončnična semena, liofilizirane nadzemne dele solate in podzemne dele korenja ter kalcijev fosfat(V) (Ca3(PO4)2) in kalcijev karbonat (CaCO3) v obliki krede. Proteinsko mešanico smo v terilnici strli s pomočjo tekočega dušika na delčke, manjše od 2 mm in s tem zagotovili večjo absorpcijo med samim procesom prebave. Skupaj z uprašenimi koreninami in poganjki smo iz pripravljene končne mešanice s pomočjo hidravlične stiskalnice naredili 150 mg tabletke. Polži so se hranili 7 dni tako, da je vsak polž na dan dobil po eno 150 mg tabletko. Tabletko smo položili v malo petrijevko znotraj plastične posode, da se le ta ne bi prehitro razmočila na vlažnem filter papirju. Preden je vsak polž prejel novo tabletko hrane, smo njegovo posodo vsakodnevno očistili iztrebkov in zamenjali filter papir. S tem smo zagotovili dobro počutje polžev, kar se je odražalo tudi v njihovi stopnji prehranjevanja. Zadnji dan, 8. dan, polžev nismo hranili, da so čim bolj izpraznili črevo tekom noči. S tem smo preprečili prepolno črevo, ki ga bi lahko zaradi neprevidnosti prebodli med sekcijo. Vsebina bi se lahko izpraznila na tkiva, v katerih smo želeli analizirati mineralne snovi in jih tako onesnažila.

3.2.3 PRIPRAVA POLŽEV ZA MERITVE

Po 9 dneh poskusa smo polže žrtvovali. S pomočjo igle smo jih pritrdili na stiropor in s skalpelom vzdolžno zarezali v smeri od glave proti koncu mišičaste noge. Za nadaljnje analize smo uporabili prebavno žlezo in mišico, ki smo ju očistili s fiziološko raztopino za polže,


17

imenovana Ringer raztopina (sestava: 80 mM NaCl, 4 mM KCl, 7 mM CaCl2, 5 mM MgCl2, 20 mM HEPES pufer, pH smo uravnali na 7,5 z NaOH) (Thomas in Postma, 2007). Po 80 mg sveže prebavne žleze smo shranili v že predhodno označene epice, jih zamrznili v tekočem dušiku in jih uporabili za določanje stopnje lipidne peroksidacije celičnih membran, po postopku, ki je opisan za rastline. Preostanek prebavne žleze smo zavili v aluminijasto folijo, ga ravno tako zamrznili v tekočem dušiku in liofilizirali. Postopek smo ponovili tudi za mišico. Posušen živalski material smo stehtali in na ta način pridobili podatke o suhi masi. Liofiliziran živalski material smo strli v terilnici z dodanim tekočim dušikom. Uprašen liofiliziran živalski material smo nato uporabili za merjenje koncentracij elementov.

3.3 DOLOČANJE KONCENTRACIJ ELEMENTOV V VZORCIH

Iz 0,5 - 1,5 g liofiliziranega uprašenega rastlinskega in živalskega materiala smo s pomočjo nerjavečega modela za izdelavo tabletk in hidravlične stiskalnice stisnili tabletke ter jih stehtali. Med izdelavo tabletk različnih izpostavitev smo uporabljen model čistili z etanolom in s tem preprečili možnost kontaminacije med vzorci. Tabletke smo do meritev shranili v čistih plastičnih posodicah.

Za analize rastlinskih (korenine in poganjki) ter živalskih vzorcev (prebavna železa in mišica) smo uporabili rentgensko fluorescenčno spektrometrijo (XRF). Metoda je v primerjavi z drugimi tehnikami enostavna v pripravi vzorca, hitra (nekaj 100 do nekaj 1000 sekund), hkrati lahko analizira več elementov ter ima široko koncentracijsko območje analize (Kump, 2005).

Metoda XRF temelji na vzbujanju (ionizaciji) atomov iz osnovnega stanja v vzbujeno stanje, pri čemer so elektroni atomov trdno vezani v K in L lupinah. Prehod v energijsko manj ugodno stanje (vzbujeno stanje) dosežemo s fotoni rentgenske svetlobe iz radioaktivnih izvorov, v našem primeru 109Cd (Nečemer in sod., 2003). Kadar je vzbujevalna energija podobna vezavni energiji elektronov v posamezni lupini, je vzbujanje elektronov najbolj uspešno (Nečemer in sod., 2011). Vzbujeni elektroni pri prehodu nazaj v stabilno osnovno stanje oddajajo odvečno energijo v obliki rentgenske svetlobe, ki je enaka razliki vezavnih energij obeh lupin. Rentgenska svetloba se v vzorcu absorbira in vzbudi fluorescenčno sevanje, katerega spekter izmerimo z rentgenskim spektrometrom. Izsevano fluorescenčno sevanje je po energiji karakteristično za določen atom, kar nam omogoča določitev elementarne sestave vzorca (Kump, 2005). Iz dodatnih meritev intenzitete oddanega sevanja lahko določimo tudi koncentracije elementa v vzorcu (Kump, 2005; Nečemer in sod., 2011).

Kot primarni vir sevanja za določanje koncentracij Hg in Se smo uporabili radioizotop 109Cd (Isotope Products Laboratories, ZDA). Rentgenska svetloba je obsevala vzorec, izsevano fluorescenčno sevanje smo izmerili z energijsko disperzijskim spektrometrom (EDS), ki je sestavljen iz SDD (silicon drift diode) detektorja (Amptek) in digitalnega multikanalskega analizatorja (Amptek).

Energijska ločljivost rentgenskega spektrometra je bila 140 eV pri 5900 eV (Nečemer in sod., 2003). Meritev spektra za posamezni vzorec s 109Cd virom je trajala 2000 s.

Spektre smo analizirali v programu za analizo spektrov AXIL, kvantitativno analizo pa s programom QAES (Quantitative Analysis of Environmental Samples) (Nečemer in sod., 2008).

S pridobljenimi podatki smo določili koncentracije Hg in Se v rastlinskih in živalskih organih. Tako rastline kot živali so imele različne mase posameznih rastlinskih in živalskih organov. Vsebnost Hg in Se za posamezen organ smo izračunali tako, da smo maso posameznega rastlinskega in živalskega organa pomnožili s koncentracijo posameznega elementa za posamezen rastlinski in živalski organ.


18

Koncentracije Hg in Se smo izrazili v µg g-1 suhe mase za posamezen rastlinski in živalski material, medtem ko smo vsebnost izrazili v µg na rastlinski oz. živalski organ.

Vsebnosti Hg v rastlinskem materialu smo v nadaljevanju uporabili za izračun biodostopnosti Hg za korenine in poganjke. Z biodostopnostjo smo določili, kolikšen delež Hg se je iz zemlje absorbiral v rastline. Biodostopnost Hg smo izračunali tako, da smo vsebnost Hg v koreninah (µg/korenino) oz. poganjkih (µg/poganjek) delili z vsebnostjo Hg v zemlji (µg/korito).

Poleg biodostopnosti Hg za rastlino smo izračunali tudi biodostopnost Hg in Se za prebavno žlezo in mišično tkivo, to je razmerje med količino pojedene hrane in v tkivih nakopičenega posameznega elementa. Biodostopnost smo izračunali tako, da smo vsebnost Hg oz. Se v prebavni žlezi (µg/prebavno žlezo) oz. mišičnem tkivu (µg/mišico) delili z vsebnostjo Hg oz. Se v pojedeni hrani (µg).

Izračunali smo tudi translokacijski faktor prenosa Hg in Se iz prebavne žleze v mišično tkivo, in sicer tako, da smo vsebnost Hg oz. Se v prebavni žlezi posameznega polža (µg/prebavno žlezo), delili z vsebnostjo Hg oz. Se v mišičnem tkivu istega polža (µg/mišico).

3.4 STATISTIČNA ANALIZA PODATKOV

Za analizo podatkov smo uporabili standardne statistične metode. Podatke smo obdelali v programu MS Excel 2007 in programu Statistica (Statsoft 7.0.61.0.). Statistično značilne razlike smo določili v programu enosmerna ANOVA, Duncanov test (p < 0,05), pri čemer smo predpostavili, da so vzorci normalno porazdeljeni.


19

4 REZULTATI

4.1 RASTLINE

4.1.1 SUHA BIOMASA

Biomasa korenin je bila pri navadni in tatarski ajdi brez ali z dodanim Se primerljiva. Biomasa poganjkov je bila večja od biomase korenin pri obeh vrstah ajde. Pri navadni ajdi brez ali z dodanim Se ni bilo statistično značilnih razlik, medtem ko je bila biomasa poganjkov tatarske ajde z dodanim Se statistično značilno večja od biomase poganjkov tatarske ajde brez Se (Slika 1).

Slika 1: Suha masa korenin in poganjkov ajd, izpostavljenih zemlji, nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se. Legenda: NA - navadna ajda, NA + Se - navadna ajda s foliarno dodanim Se, TA - tatarska ajda, TA + Se - tatarska ajda s foliarno dodanim Se. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p < 0,05).

a a m m

aa

m

n

0

0.5

1

1.5

2

2.5

NA NA + Se TA TA + Se

SM

kor

enin

in p

ogan

jkov

(g)

Izpostavitev

KORENINE POGANJKI


20

4.1.2 DOLOČANJE FOTOSINTEZNIH PIGMENTOV

Selen je pri navadni ajdi statistično značilno znižal koncentracijo klorofilov a, pri tatarski ajdi pa koncentracijo klorofila b in karotenoidov. Koncentracije karotenoidov so bile večje od koncentracij klorofila a in b pri obeh vrstah (Slika 2).

Slika 2: Koncentracija klorofila a, b in karotenoidov ajd, izpostavljenih zemlji, nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se. Legenda: NA - navadna ajda, NA + Se - navadna ajda s foliarno dodanim Se, TA - tatarska ajda, TA + Se - tatarska ajda s foliarno dodanim Se. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p < 0,05).

4.1.3 DOLOČANJE STOPNJE LIPIDNE PEROKSIDACIJE

Selen je statistično značilno povečal koncentracijo MDA ekvivalenta v koreninah tatarske ajde, medtem ko pri navadni ajdi ni imel vpliva. Največjo koncentracijo MDA ekvivalenta so imele korenine tatarske ajde z dodanim Se (20,2 mmol/g) (Slika 3).

V poganjkih navadne ajde je Se statistično značilno povečal koncentracija MDA ekvivalenta, v poganjkih tatarske ajde pa statistično značilno znižal. V povprečju je imela navadna ajda z dodanim Se največjo koncentracijo MDA ekvivalenta (37,3 mmol/g), tatarska ajda z dodanim Se pa najnižjo (18,5 mmol/g) (Slika 3).

ba

m m

a a n m

aa

n m

0

1

2

3

4

5


Kon

cent

raci

ja f

otos

inte

znih

pi

gmen

tov

(mg/

gS

M)

Izpostavitev

klorofil A klorofil B karotenoidi


21

Slika 3: Koncentracija MDA ekvivalenta v koreninah in poganjkih ajd, izpostavljenih zemlji, nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se. Legenda: NA - navadna ajda, NA + Se - navadna ajda s foliarno dodanim Se, TA - tatarska ajda, TA + Se - tatarska ajda s foliarno dodanim Se. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p < 0,05).

4.1.4 DOLOČANJE VSEBNOSTI FENOLNIH SPOJIN

4.1.4.1 Določanje vsebnosti skupnih fenolov

Vsebnosti skupnih fenolov so bile večje v poganjkih kot v koreninah. Selen je statistično značilno znižal vsebnost fenolnih spojin v koreninah in poganjkih navadne ajde. Pri tatarski ajdi je Se statistično značilno povečal vsebnost fenolnih spojin v koreninah, medtem ko so bile vsebnosti v poganjkih primerljive. Tatarska ajda z dodanim Se je imela v povprečju največjo vsebnost fenolov v koreninah (29,7 mg/g SM) in poganjkih (45,4 mg/g SM), navadna ajda z dodanim Se pa najmanjšo v koreninah (22,6 mg/g SM) in poganjkih (36,0 mg/g SM) (Slika 4).

Slika 4: Vsebnost fenolov v koreninah in poganjkih ajd, izpostavljenih zemlji, nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se. Legenda: NA - navadna ajda, NA + Se - navadna ajda s foliarno dodanim Se, TA - tatarska ajda, TA + Se - tatarska ajda s foliarno dodanim Se. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p < 0,05).

a am

na

b

n

m

05

1015202530354045


MD

A e

kviv

alen

t (m

mol

/g)

Izpostavitev

KORENINE POGANJKI

ba m

n

ba

mm

0

10

20

30

40

50

60


Vse

bnos

t fen

olov

v k

oren

inah

in

poga

njki

h (m

g/g

SM

)

Izpostavitev

KORENINE POGANJKI


22

4.1.4.2 Določanje vsebnosti flavonoidov

Vsebnosti flavonoidov so bile v primerjavi s koreninami večje v poganjkih navadne in tatarske ajde. Selen ni statistično značilno vplival na vsebnost flavonoidov v koreninah in poganjkih navadne in tatarske ajde. V povprečju so bile vsebnosti flavonoidov v koreninah tatarske ajde večje v primerjavi z navadno ajdo (Priloga 1).

4.1.4.3 Določanje antioksidativnega potenciala

Antioksidativna učinkovitost v koreninah in poganjkih je bila v primerjavi s tatarsko ajdo, večja pri navadni ajdi. Pri navadni ajdi Se ni statistično značilno vplival na % inhibicije v koreninah in poganjkih, medtem ko je pri tatarski ajdi povečal % inhibicije v koreninah (Slika 5).

Slika 5: Antioksidativna učinkovitost v koreninah in poganjkih ajd, izpostavljenih zemlji, nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se po 20 min. Legenda: NA - navadna ajda, NA + Se - navadna ajda s foliarno dodanim Se, TA - tatarska ajda, TA + Se - tatarska ajda s foliarno dodanim Se. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p < 0,05).

4.2 ANALIZA IDRIJSKE ZEMLJE

Preglednica 1 prikazuje koncentracije mineralnih snovi v zemlji, nabrani okoli dimnika nekdanjega delujočega rudnika in talilnice Hg v Idriji, v kateri smo gojili navadno in tatarsko ajdo.

Preglednica 1: Koncentracije elementov v zemlji, nabrana okoli dimnika nekdanjega delujočega rudnika in talilnice Hg v Idriji, v kateri smo gojili navadno in tatarsko ajdo (µg/g).

zemlja iz Idrije Si 15700 P 2420 S 2250 Cl 370 K 2200 Ca 278000 Mn 420 Fe 15000 Zn 170 Hg 7000

a a

mn

a am

m

01020304050607080


DP

PH

* %

Izpostavitev

KORENINE POGANJKI


23

4.3 ANALIZA ŽIVEGA SREBRA IN SELENA V RASTLINAH

4.3.1 BIODOSTOPNOST ŽIVEGA SREBRA V ZEMLJI

Povprečne vrednosti biodostopnosti Hg v zemlji za korenine so bile večje od tistih za poganjke. Selen je statistično značilno povečal biodostopnost Hg za korenine navadne ajde, medtem ko na biodostopnost Hg za korenine tatarske ajde ni imel vpliva. Biodostopnost Hg za korenine je bila največja pri navadni ajdi z dodanim Se (0,018 %). Pri tatarski ajdi je bila biodostopnost Hg primerljiva (0,013%).

V poganjkih navadne in tatarske ajde Se ni statistično značilno vplival na biodostopnost Hg. Največja povprečna vrednost biodostopnosti Hg za poganjke je bila pri tatarski ajdi z dodanim Se (0,008 %), najnižja pa pri navadni ajdi z dodanim Se (0,004 %) (Slika 6).

Slika 6: Biodostopnost Hg za korenine in poganjke ajd, izpostavljenih zemlji, nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se. Legenda: NA - navadna ajda, NA + Se - navadna ajda s foliarno dodanim Se, TA - tatarska ajda, TA + Se - tatarska ajda s foliarno dodanim Se. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p < 0,05).

4.3.2 KONCENTRACIJA ŽIVEGA SREBRA V KORENINAH IN POGANJKIH

Živo srebro je bilo prisotno v poganjkih vseh izpostavitev, vendar so bile koncentracije Hg večje v koreninah. Selen je statistično značilno povečal koncentracijo Hg v koreninah in statistično značilno znižal koncentracijo Hg v poganjkih navadne ajde. Pri tatarski ajdi Se ni imel vpliva na koncentracijo Hg v koreninah in poganjkih. Največjo koncentracijo Hg v koreninah je imela navadna ajda z dodanim Se (1365 µg/g SM), najmanjšo pa navadna ajda brez dodanega Se (849 µg/g SM). V povprečju je bila koncentracija Hg v koreninah tatarske ajde brez dodanega Se (1316 µg/g SM) večja, kot v koreninah tatarske ajde z dodanim Se (1234 µg/g SM), vendar med njima ni bilo statistično značilnih razlik (Slika 7).

a

b

m m

aa m

m

0

0.005

0.01

0.015

0.02

0.025

0.03

NA NA+Se TA TA+SeBio

dost

opno

st H

g za

kor

enin

ein

po

ganj

ke(%

)

Izpostavitev

KORENINE POGANJKI


24

Slika 7: Koncentracija Hg v koreninah in poganjkih ajd, izpostavljenih zemlji, nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se. Legenda: NA - navadna ajda, NA + Se - navadna ajda s foliarno dodanim Se, TA - tatarska ajda, TA + Se - tatarska ajda s foliarno dodanim Se. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p < 0,05).

4.3.3 VSEBNOST ŽIVEGA SREBRA V KORENINAH IN POGANJKIH

Živo srebro je bilo prisotno tako v koreninah kot poganjkih vseh izpostavitev. Vsebnosti Hg so bile večje v koreninah kot v poganjkih. Selen je statistično značilno povečal vsebnost Hg v koreninah navadne ajde. Pri tatarski ajdi Se ni vplival na vsebnost Hg v koreninah in poganjkih. Največja vsebnost Hg je bila v koreninah navadne ajde z dodanim Se (362 µg/rastlino), najmanjša pa v koreninah navadne ajde brez dodanega Se (242 µg/rastlino) (Slika 8).

Slika 8: Vsebnost Hg v koreninah in poganjkih ajd, izpostavljenih zemlji, nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se. Legenda: NA - navadna ajda, NA + Se - navadna ajda s foliarno dodanim Se, TA - tatarska ajda, TA + Se - tatarska ajda s foliarno dodanim Se. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p < 0,05).

a

b m m

b a m m

0200400600800

1000120014001600


Kon

cent

raci

ja H

g v

kore

nina

h in

po

ganj

kih

(µg/

gS

M)

Izpostavitev

KORENINE POGANJKI

a

bm m

a a m m0

50100150200250300350400450


Vse

bnos

t Hg

v ko

reni

nah

in

poga

njki

h(µ

g/or

gan)

Izpostavitev

KORENINE POGANJKI


25

4.3.4 KONCENTRACIJA SELENA V KORENINAH IN POGANJKIH

Selen smo zasledili samo v poganjkih navadne in tatarske ajde z dodanim Se. Koncentracije Se v koreninah navadne in tatarske ajde brez ali z dodanim Se so bile pod mejo detekcije, ki je 1 µg/g SM . Tudi koncentracije Se v poganjkih navadne in tatarske ajde brez dodanega Se so bile pod mejo detekcije (Preglednica 2). Preglednica 2: Koncentracija Se v koreninah in poganjkih ajd, izpostavljenih zemlji, nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se (µg/g SM). Prikazane so povprečne vrednosti ± standardna napaka. Različne črke v tabeli opisujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p < 0,05). Legenda: NA - navadna ajda, NA + Se - navadna ajda s foliarno dodanim Se, TA - tatarska ajda, TA + Se - tatarska ajda s foliarno dodanim Se.

KORENINE POGANJKI NA <1µg/g ± a <1µg/g ± a

NA + Se <1µg/g ± a 5,1 ± 1,3 b TA <1µg/g ± m <1µg/g ± m

TA + Se <1µg/g ± m 4,4 ± 0,4 n

4.3.5 VSEBNOST SELENA V KORENINAH IN POGANJKIH

Selen smo zasledili samo v poganjkih navadne in tatarske ajde z dodanim Se. Vsebnosti Se v koreninah navadne in tatarske ajde brez ali z dodanim Se so bile pod mejo detekcije. Tudi vsebnosti Se v poganjkih navadne in tatarske ajde brez dodanega Se so bile manj kot 1 µg/rastlino (Preglednica 3).

Preglednica 3: Vsebnost Se v koreninah in poganjkih ajd, izpostavljenih zemlji, nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se (µg/rastlino). Prikazane so povprečne vrednosti ± standardna napaka. Različne črke v tabeli opisujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p < 0,05). Legenda: NA - navadna ajda, NA + Se - navadna ajda s foliarno dodanim Se, TA - tatarska ajda, TA + Se - tatarska ajda s foliarno dodanim Se.

KORENINE POGANJKI NA <1µg/rastlino ± a <1µg/rastlino ± a

NA + Se <1µg/rastlino ± a 10,0 ± 2,1 b TA <1µg/rastlino ± m <1µg/rastlino ± m

TA + Se <1µg/rastlino ± m 5,2 ± 0,4 n


26

4.4 ANALIZA ŽIVEGA SREBRA IN SELENA V ŽIVALIH

4.4.1 ANALIZA POJEDENE HRANE

Preglednica 4 prikazuje vsebnost elementov (µg/pojedeno hrano) ter vsebnost fenolnih spojin in flavonoidov (mg/pojedeno hrano) v pojedeni hrani polžev španski lazar (Arion vulgaris) pri različnih izpostavitvah.

Preglednica 4: Vsebnost elementov (µg/pojedeno hrano) ter vsebnost fenolnih spojin in flavonoidov (mg/pojedeno hrano) v pojedeni hrani polžev španski lazar (Arion vulgaris) po 7 – dnevnem hranjenju z ajdami, izpostavljenih zemlji, nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se. Legenda: NA - navadna ajda, NA + Se - navadna ajda s foliarno dodanim Se, TA - tatarska ajda, TA + Se - tatarska ajda s foliarno dodanim Se.

NA NA + Se TA TA + Se elementarna sestava (μg/pojedeno hrano)

K 24700 23000 21300 17700 Ca 30300 25100 31100 26500 Mn 47 53 68 69 Fe 1260 1340 943 637 Cu 41 47 37 34 Zn 49 47 47 46 Hg 188 250 227 216 Se <1 µg/g 2 <1 µg/g 2 od tega sestava v proteinski mešanici (μg/pojedeno hrano)

K 11800 11600 11400 11500 Ca 7620 7520 7360 7460 Mn 25 24 24 24 Fe 125 124 121 123 Cu 9 9 9 9 Zn 25 25 24 25 Se <1 µg/g <1 µg/g <1 µg/g <1 µg/g ostale spojine (mg/pojedeno hrano)

FENOLNE SPOJINE 28 23 24 28 FLAVONOIDI 13 12 12 12

4.4.2 BIODOSTOPNOST ŽIVEGA SREBRA V AJDAH

Povprečne vrednosti biodostopnosti Hg v ajdah za prebavno žlezo se pri navadni ajdi brez ali z dodanim Se niso statistično značilno razlikovale. Pri tatarski ajdi je Se statistično značilno povečal biodostopnost Hg za prebavno žlezo. Največja povprečna vrednost biodostopnosti Hg za prebavno žlezo se je gibala pri navadni ajdi brez dodanega Se, in sicer okoli 4,8 %, medtem ko je bila biodostopnost Hg v tatarski ajdi brez dodanega Se najnižja, in sicer je v povprečju znašala 2,5 % (Slika 9).

Povprečne vrednosti biodostopnosti Hg za mišična tkiva so bile bistveno manjše od tistih za prebavno žlezo. Navadna in tatarska ajda z dodanim Se (0,6 %) sta imeli v primerjavi z ajdama brez Se (0,5 %) večjo biodostopnost Hg za mišična tkiva, vendar se med izpostavitvami niso pokazale statistično značilne razlike (Slika 9).


27

Slika 9: Biodostopnost Hg v prebavni žlezi in mišičnem tkivu pri polžih španski lazar (Arion vulgaris) po 7-dnevnem hranjenju z ajdami, izpostavljenih zemlji nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se. Legenda: NA - navadna ajda, NA + Se - navadna ajda s foliarno dodanim Se, TA - tatarska ajda, TA + Se - tatarska ajda s foliarno dodanim Se. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p < 0,05).

4.4.3 BIODOSTOPNOST SELENA V AJDAH

Preglednica 5 prikazuje biodostopnost Se v ajdah za prebavne žleze in mišična tkiva polžev, hranjenih z navadno in tatarsko ajdo z dodanim Se. Biodostopnost Se za mišično tkivo je bila bistveno večja kot za prebavno žlezo, kar kaže na uspešen prenos Se iz prebavne žleze v mišično tkivo. Biodostopnosti Se za prebavno žlezo in mišično tkivo polžev, hranjenih z navadno in tatarsko ajdo brez Se nista prikazani, saj je bila vsebnost Se v posameznem organu manj kot 1µg/organ.

Preglednica 5: Biodostopnost Se v prebavni žlezi in mišičnem tkivu polžev, hranjenih z navadno in tatarsko ajdo z dodanim Se (%). Prikazane so povprečne vrednosti ± standardna napaka. Legenda: Na + Se – navadna ajda s foliarno dodanim Se, TA + Se - tatarska ajda s foliarno dodanim Se.

NA + Se TA + Se PREBAVNA ŽLEZA 20,9 ± 3,6 16 ± 1,9 MIŠIČNO TKIVO 55,3 ± 8,1 46 ± 5,6

4.4.4 LIPIDNA PEROKSIDACIJA

Koncentracije MDA ekvivalenta so bile v primerjavi z mišičnim tkivom, večje v prebavni žlezi polžev. Selen je statistično značilno povečal koncentracijo MDA ekvivalenta v prebavni žlezi polžev, hranjenih s tatarsko ajdo z dodanim Se. Na koncentracijo MDA ekvivalenta v prebavni žlezi polžev, hranjenih z navadno ajdo z dodanim Se, ni imel vpliva.

Največjo koncentracijo MDA ekvivalenta v prebavni žlezi, so imeli polži, hranjeni s tatarsko ajdo z dodanim Se (32 mmol/g), najmanjšo pa polži, hranjeni z navadno ajdo z dodanim Se (24,7 mmol/g). Koncentracije MDA ekvivalenta v mišicah so bile primerljive (Slika 10).

a

a

m

n

a a m m

0

1

2

3

4

5

6

7


Bio

dost

opno

stH

g za

pre

bavn

o žl

ezo

in m

išič

no tk

ivo

(%)

Izpostavitev

PREBAVNA ŽLEZA MIŠIČNO TKIVO


28

Slika 10: Koncentracija MDA ekvivalenta v prebavni žlezi in mišičnem tkivu pri polžih španski lazar (Arion vulgaris) po 7-dnevnem hranjenju z ajdami, izpostavljenih zemlji nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se. Legenda: NA - navadna ajda, NA + Se - navadna ajda s foliarno dodanim Se, TA - tatarska ajda, TA + Se - tatarska ajda s foliarno dodanim Se. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p < 0,05).

4.4.5 VSEBNOST ŽIVEGA SREBRA V POLŽJIH TKIVIH

Živo srebro je bilo prisotno tako v prebavni žlezi kot v mišičnem tkivu polžev španskih lazarjev. Vsebnosti Hg so bile v primerjavi z mišičnim tkivom, večje v prebavni žlezi polžev. Selen je statistično značilno povečal vsebnost Hg v prebavnih žlezah polžev španskih lazarjev, hranjenih s tatarsko ajdo z dodanim Se, medtem ko pri polžih, hranjenih z navadno ajdo z dodanim Se ni imel vpliva. Ravno tako ni imel vpliva na vsebnosti Hg v mišičnem tkivu polžev, hranjenih z navadno in tatarsko ajdo z in brez dodanega Se (Slika 11).

Slika 11: Vsebnost Hg v prebavni žlezi in mišičnem tkivu pri polžih španski lazar (Arion vulgaris) po 7-dnevnem hranjenju z ajdami, izpostavljenih zemlji nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se. Legenda: NA - navadna ajda, NA + Se - navadna ajda s foliarno dodanim Se, TA - tatarska ajda, TA + Se - tatarska ajda s foliarno dodanim Se. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p < 0,05).

a

am

n

a a m m0

5

10

15

20

25

30

35


MD

A e

kviv

alen

t (m

mol

/g)

v pr

ebav

ni ž

lezi

in m

išič

nem

tkiv

u

Izpostavitev

PREBAVNA ŽLEZA MIŠIČNO TKIVO

a

a

m

n

a a m m

0

2

4

6

8

10

12


Vse

bnos

t Hg

v pr

ebav

ni ž

lezi

in

miš

ici (μg

/org

an)

Izpostavitev

PREBAVNA ŽLEZA MIŠICA


29

4.4.6 VSEBNOST SELENA V POLŽJIH TKIVIH

Vsebnosti Se v prebavni žlezi in mišičnem tkivu polžev, hranjenih z navadno in tatarsko ajdo brez dodanega Se so bile manj kot 1µg/organ.

Pri polžih, hranjenih z navadno in tatarsko ajdo z dodanim Se so bile vsebnosti Se v primerjavi s prebavno žlezo večje v mišičnem tkivu (Slika 12).

Slika 12: Vsebnost Se v prebavni žlezi in mišičnem tkivu pri polžih španski lazar (Arion vulgaris) po 7-dnevnem hranjenju z ajdami, izpostavljenih zemlji nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se. Legenda: NA - navadna ajda, NA + Se - navadna ajda s foliarno dodanim Se, TA - tatarska ajda, TA + Se - tatarska ajda s foliarno dodanim Se. Različne črke nad stolpci označujejo Se pod mejo detekcije, ki je 1 µg/g in statistično značilno razliko med izpostavitvami (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p < 0,05).

4.4.7 TRANSLOKACIJSKI FAKTOR PRENOSA ŽIVEGA SREBRA V POLŽJIH TKIVIH

Vsebnosti Hg v prebavni žlezi so bile v povprečju večje kot v mišičnem tkivu. Selen je pri navadni ajdi statistično značilno povečal prenos Hg iz prebavne žleze v mišično tkivo, medtem ko pri tatarski ajdi ni imel vpliva (Slika 13).

a

m

a m

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4


Vse

bnos

t Se

v pr

ebav

ni ž

lezi

in

miš

ici (μg

/org

an)

Izpostavitev

PREBAVNA ŽLEZA MIŠICA

<1µg/g <1µg/g <1µg/g <1µg/g

a

bm

m

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

NA NA+Se TA TA+Se

Tra

nslo

kaci

jski

fak

tor

pren

osa

Hg

iz P

Ž v

M

Izpostavitev


30

Slika 13: Translokacijski faktor prenosa Hg iz prebavne žleze v mišično tkivo pri polžih španski lazar (Arion

vulgaris) po 7-dnevnem hranjenju z ajdami, izpostavljenih zemlji nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se. Legenda: NA - navadna ajda, NA + Se - navadna ajda s foliarno dodanim Se, TA - tatarska ajda, TA + Se - tatarska ajda s foliarno dodanim Se. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p < 0,05).

4.4.8 TRANSLOKACIJSKI FAKTOR PRENOSA SELENA V POLŽJIH TKIVIH

Preglednica 6 prikazuje translokacijski faktor prenosa Se iz prebavne žleze v mišično tkivo polžev španskih lazarjev, hranjenih z navadno in tatarsko ajdo z dodanim Se. Translokacijska faktorja prenosa Se iz prebavne žleze v mišično tkivo polžev, hranjenih z navadno in tatarsko ajdo brez Se nista prikazana, saj je bila vsebnost Se manj kot 1µg/organ.

Preglednica 6: Translokacijski faktor prenosa Se iz prebavne žleze v mišično tkivo polžev španskih lazarjev, hranjenih z navadno in tatarsko ajdo z dodanim Se. Prikazane so povprečne vrednosti ± standardna napaka. Legenda: TFHP = prebavna žleza/mišično tkivo, Na + Se – navadna ajda s foliarno dodanim Se, TA + Se - tatarska ajda s foliarno dodanim Se.

NA + Se TA + Se TFHP 0,69 ± 0,05 0,73 ± 0,05


31

5 DISKUSIJA

5.1 RAST IN BIOKEMIJSKI PARAMETRI RASTLIN

Zavrta rast rastlin je ena izmed prvih in najbolj očitnih rastlinskih reakcij na stresne dejavnike, med katere prištevamo okoljske dejavnike, UV-sevanje, kovine in podobno (Baker in Walker, 1989). Z biomaso rastlin lahko ocenimo strpnost rastlin na prisotnost različnih koncentracij kovin v tleh (Appenroth, 2010). Živo srebro spada med ene najbolj strupenih kovin za rastline, ki s proizvodnjo ROS, zavira rast rastlin in povečuje oksidativni stres (Chen in sod., 2009).

V našem poskusu Se ni vplival na suho biomaso korenin in poganjkov navadne ajde. Nasprotno so Breznik in sod. (2005) ugotovili, da izpostavitev s Se omili negativen učinek UV-B sevanja ter s tem povezano zniževanje biomase poganjkov pri navadni ajdi. Do podobnih zaključkov so prišli tudi Hartikainen in sod. (2000) za vrsto angleška ljuljka (Lolium perenne) ter in Xue in sod. (2001) na solati. V povprečju je navadna ajda brez ali z dodanim Se imela večjo biomaso poganjkov od tatarske ajde.

Pri tatarski ajdi je dodatek Se statistično značilno povečal biomaso poganjkov glede na suho biomaso poganjkov brez dodanega Se. Tudi Štrekelj (2015) je dokazala večjo biomaso kontrolnih kalic tatarske ajde, izpostavljenih 10 mg Se(VI)/L v primerjavi s kontrolnimi kalicami brez Se. Pri navadni ajdi med s Se izpostavljenimi in brez s Se izpostavljenimi kalicami ni opazila razlik. Na suho biomaso korenin tatarske ajde, Se ni imel vpliva.

Zhou in sod. (2017) so riž (Oryza sativa) na hidroponiki z 0,5 mg Hg/L izpostavili različnim koncentracijam Se (0, 1, 2, 3, 4 µmol/L). Ob prisotnosti Se so opazili povečano suho maso podzemnih in nadzemnih delov, ki je pozitivno naraščala z večanjem koncentracije Se do 4 µmol/L. Slednja koncentracija Se je biomaso rastlinskih delov riža zmanjšala, vendar je bila še vedno večja v primerjavi z rastlinskimi deli riža, ki so bili izpostavljeni samo s Hg.

5.2 FOTOSINTEZNI PIGMENTI

Moteno delovanje fotosinteze je velikokrat posledica povečanih koncentracij kovin v prsti. Fotosintezni pigmenti so eden izmed prvih najbolj občutljivih parametrov pri ocenjevanju rastlinskega stresa in so pogosto uporabljeni kot biomarkerji v rastlinah (Aggarwall in sod., 2011; Pinheiro in sod., 2013). Kovine lahko vplivajo na absorpcijo in porazdelitev hranil. Živo srebro moti privzem Mn in Fe, potrebna za sintezo klorofilov (Gill in sod., 2012). Izguba elementov lahko privede do prekinitve fotosistema II in posledično do zavrtja elektronskega transportnega sistema (ETS) (Doening, 2000). Selen naj bi v nižjih koncentracijah zmanjševal škodo, povzročeno zaradi suše in kovin (Feng in sod., 2013) ter spodbujal rast in razvoj rastlin (Kaur in Nayyar, 2015).

Klorofili

Pri navadni ajdi je Se statistično značilno znižal koncentracijo klorofila a, medtem ko so bile koncentracije klorofila b primerljive. Do podobnih rezultatov je prišla tudi Germ (2006). Navadno ajdo, vzkaljeno iz semen, namočenih v raztopini z 10 mg Se/L je gojila pod različnimi UV-sevanji. Dokazala je znižano aktivnost ETS v ajdah, izpostavljenih Se v primerjavi z ajdami brez Se. Tudi raziskave Breznik in sod. (2005) so potrdile negativne učinke Se pri navadni ajdi, izpostavljenih UV-sevanju.


32

Pri tatarski ajdi je Se statistično značilno znižal koncentracijo klorofila b, medtem ko so bile koncentracije klorofila a primerljive. Pri raziskavah klorofilov na tatarski ajdi so Breznik in sod. (2005) ugotovili, da Se ob izpostavitvi tatarskih ajd UV-sevanju zniža koncentracijo klorofila a, Hočevar (2016) pa je dokazala ravno nasprotno.

Zhou in sod. (2017) so na rižu (Oryza sativa), izpostavljenem 0,5 mg Hg/L pokazali negativne učinke Hg na vsebnost klorofilov v primerjavi s kontrolnim rižem brez Hg. Ob dodatku različnih koncentracij Se v raztopino z 0,5 mg Hg/L je vsebnost klorofilov v poganjkih riža naraščala z njegovo naraščajočo koncentracijo vse do 3 µmol Se/L. Dodatek večjih koncentracij Se je vsebnost klorofilov ponovno znižal, vendar je bila še vedno večja v primerjavi z vsebnostjo klorofilov v poganjkih, izpostavljenih samo Hg. Do podobnega mnenja so prišli tudi Pennanen in sod. (2002), ki so dokazali, da Se zviša koncentracijo klorofila a in b v mladih listih špinače.

Karotenoidi

Povečanje koncentracije karotenoidov je eno izmed obrambnih mehanizmov rastlin proti stresu, povzročenem s Hg (Pandey in sod. 2009). Karotenoidi kot neencimski antioksidanti delujejo kot zaščitni faktorji klorofilov pred ROS (Gratao in sod., 2012). Povečano koncentracijo karotenoidov v primerjavi s klorofilom a in b potrjujejo tudi naši rezultati. Podobno so pri vrsti vodna hijacinta (Eichhornia crassipes), izpostavljenih Hg, dokazali tudi Pandey in sod. (2009). Pri tatarski ajdi je Se statistično značilno znižal koncentracijo karotenoidov, medtem ko pri navadni ajdi ni imel vpliva.

5.3 LIPIDNA PEROKSIDACIJA

Kopičenje ROS v rastlinah je eden izmed glavnih kazalnikov negativnih učinkov Hg. MDA je skupen produkt lipidne peroksidacije, ki deluje kot občutljiv indikator za merjenje poškodb, povzročenih preko oksidativnega stresa (Hawrylak-Nowak, 2009).

V našem poskusu je Se statistično značilno povečal koncentracijo MDA ekvivalenta v koreninah tatarske ajde, medtem ko pri navadni ajdi ni imel vpliva. Naši rezultati se ne ujemajo z raziskavo Zidarja in sod. (2016), kjer je foliarno nanesen Se, zmanjšal koncentracijo Hg v solati in posledično omilil njegove negativne učinke.

Selen je v poganjkih tatarske ajde zmanjšal koncentracijo MDA ekvivalenta, medtem ko jih je pri navadni ajdi povečal.

5.4 VSEBNOST POLIFENOLNIH SPOJIN

Polifenolne spojine so sekundarni rastlinski metaboliti, ki lahko organizme ščitijo pred oksidativnim stresom, in sicer z lovljenjem prostih radikalov, s keliranjem kovinskih ionov, lahko pa tudi z odstranjevanjem in popravilom oksidativno poškodovanih biomolekul. Prosti radikali na ta način pridobijo manjkajoče elektrone in se pretvorijo v stabilno, neškodljivo stanje (Cao in sod. 2008).

Fabjan in sod. (2003) ter Bonafaccia in sod. (2003) navajajo, da ima tatarska ajda v primerjavi z navadno ajdo več polifenolov, ki delujejo kot kelati za vezavo kovin. V našem poskusu smo ugotovili, da so bile vsebnosti polifenolnih spojin med navadno in tatarsko ajdo primerljive, prisotne pa so bile statistično značilne razlike znotraj navadne in tatarske ajde brez ali z dodanim Se. Selen je pri tatarski ajdi statistično značilno povečal samo vsebnost polifenolnih spojin v koreninah, medtem ko je vsebnost fenolnih spojin v navadni ajdi statistično značilno znižal tako v koreninah kot v poganjkih.


33

Saffaryazdi in sod. (2012) so dokazali povečano vsebnost polifenolnih spojin v listih špinače v prisotnosti Se. Nasprotno in tudi skladno z našimi rezultati so dokazali Finley in sod. (2005), kjer so koncentracije Se znižale vsebnost polifenolnih spojin v brokoliju.

Vsebnost flavonoidov

V našem poskusu Se ni vplival na vsebnost flavonoidov v koreninah in poganjkih tako pri navadni kot tatarski ajdi. Vsebnosti so bile večje v poganjkih glede na vsebnost v koreninah.

Ožbolt in sod. (2008) so ugotavljali, kako oblika selena (selenit ali selenat) v kombinaciji s fenolnimi spojinami vplivajo na rast navadne ajde, izpostavljene različnim oblikam UV-sevanja (okoljsko in povečano UV-sevanje). Zmanjšana biomasa navadne ajde, izpostavljena selenitu, je bil dober pokazatelj večje strupenosti selenita. Navadna ajda, izpostavljena selenitu, je imela v poganjkih večjo vsebnost flavonoidov, v primerjavi z navadno ajdo, izpostavljeno selenatu. Iz tega so zaključili, da so bile ajde, izpostavljene selenatu, manj pod stresom in jim ni bilo potrebno sintetizirati flavonoide, kot del zaščitnih dejavnikov.

Določanje antioksidativnega potenciala

Antioksidativna učinkovitost je bila v našem poskusu v povprečju večja v koreninah in poganjkih navadne ajde brez ali z dodanim Se v primerjavi s koreninami in poganjki tatarske ajde. Pri navadni ajdi Se ni imel vpliva na % inhibicije v koreninah in poganjkih, medtem ko jo je pri tatarski ajdi statistično značilno povečal v koreninah.

Antioksidativna učinkovitost ajd je povezana z vsebnostjo njihovih polifenolov (Ideda in sod. 2001; Alvarez-Jubete in sod. 2010). Zhou in sod. (2015) ter Yoon in sod. (2009) so preučevali vsebnost antioksidantov v kalicah navadne in tatarske ajde. Njihovi rezultati so v nasprotju z našimi, saj so ugotovili, da je v kalicah navadne ajde antioksidativna učinkovitost bistveno nižja v primerjavi s tatarsko ajdo. O veliki razliki v vsebnosti rutina in posledično antioksidativni učinkovitosti med navadno in tatarsko ajdo poročajo tudi Fabjan in sod. (2003), vendar v našem poskusu nismo merili vsebnosti rutina. Dietrych-Szostak (2004) trdi, da je antioksidativna aktivnost različnih flavonoidov različna in da interakcija med beljakovinami in flavonoidi lahko prikrije del antioksidativne aktivnosti fenolnih spojin (Arts in sod., 2002).

5.5 ANALIZE ŽIVEGA SREBRA V RASTLINAH

S pomočjo koncentracij Hg (µg/g SM) v koreninah in poganjkih ter njihove celotne mase (g) smo preračunali vsebnost Hg v posameznem rastlinskem delu. Vsebnosti Hg so bile prisotne tako v koreninah, kot poganjkih vseh izpostavitev. Večina Hg se je akumuliralo v koreninah, saj služijo kot zadrževalnik za prenos Hg v nadzemne dele. S tem smo potrdili tudi druge raziskave (Carrasco-Gil in sod., 2013; Debeljak in sod., 2013; Moreno-Jiménez in sod., 2006). V našem poskusu je Se statistično značilno povečal biodostopnost Hg iz zemlje v korenine navadne ajde in s tem statistično značilno povečal vsebnost Hg v koreninah. Pri tatarski ajdi Se ni imel vpliva. Nasprotno z našimi rezultati so Zidar in sod. (2016) sadike solate (Lactuca

sativa) posadili v zemljo, nabrano na vrtu v Idriji ter jih polovico listno obogatili s Se. Solate, izpostavljene Se so imele nižjo koncentracijo Hg tako v koreninah kot poganjkih.

Leta 2014 so Wang in sod. rastline riža (Oryza sativa) posadili v zemljo, onesnaženo s HgCl2. Zemljo so poleg s Hg izpostavili tudi 5 µg Se/g. Selen je znatno povečal pridelek riža (za kar 50 %) in skupno vsebnost Se za 2,8-krat. Znižanje koncentracije Hg pripisujejo Se, ki naj bi zaviral vnos Hg v koreninske celice in povečeval razvoj apoplastičnih barier v endodermisu


34

korenin. S tem naj bi podprli antagonistično delovanje Se na privzem Hg in tako predstavili potencialno uporabno metodo za proizvodnjo istočasno varnega in obogatenega riža, gojenega na tleh, onesnaženih s Hg.

5.6 ANALIZE SELENA V RASTLINAH

Wanek in sod. (1995) trdijo, da je privzem selena v rastlino odvisen od vrste rastline ter od oblike Se. V našem poskusu smo si zaradi njegove dobre topnosti v vodi in lažje mobilnosti izbrali Se v obliki selenata (SeO4

2-). Rezultati so pokazali, da je bila koncentracija Se v koreninah navadne in tatarske ajde brez ali z dodanim Se pod mejo detekcije (<1µg/g). Pod mejo detekcije so bile tudi koncentracije Se v poganjkih navadne in tatarske ajde, ki niso bile izpostavljene Se.

S pomočjo koncentracij Se (µg/g SM) v poganjkih navadne in tatarske ajde z dodanim Se ter njihove celotne mase (g) smo preračunali vsebnost Se. Navadna ajda z dodanim Se je vsebovala enkrat večjo vsebnost Se v poganjkih kot tatarska ajda. Selen je bil v tem primeru bolj strupen za poganjke navadne ajde, kar se kaže tudi v povečani koncentraciji MDA ekvivalenta.

5.7 ANALIZA ELEMENTOV V ŽIVALIH

Fizikalno-kemijske oblike Hg pomembno vplivajo na kopičenje Hg v prehranske verige, saj imajo lahko različne spojine Hg različne lastnosti in s tem različno biodostopnost organizmom. Znano je, da je biomagnifikacija v vodnem okolju bolj izrazita kot v kopenskih prehranskih verigah, vendar tudi pri slednjih prihaja do številnih pretvorb in vezav Hg na različne ligande. Tudi za kopenske prehranske verige velja, da so koncentracije Hg v tkivih višje v mesojedih vrstah v primerjavi z rastlinojedimi (Lodenius, 1995). Polži kot rastlinojede vrste, predstavljajo pomemben prehrambni vir za sesalce, ptice ter nevretenčarske plenilce. Coughtrey in Martin (1976) so polža označili kot potencialni bioindikatorski organizem, ki v prebavni žlezi kopiči različna onesnažila in je dober pokazatelj povezave v prenosu onesnažil iz rastlin na karnivore.

Jetra in ledvice imajo vodilno vlogo pri presnovnih pretvorbah različnih oblik Hg, ki vstopajo v živalsko telo ter pri njihovi izločitvi iz telesa. Zaradi teh pomembnih funkcij so jetra in ledvice zelo izpostavljene, kar se odraža tudi v povečanih koncentracijah Hg v njih (Scheuhammer, 1987; Nordberg in Nordberg, 1988; Magos, 1997). Pri polžih prebavne žleze hkrati opravljajo vlogo jeter ter trebušne slinavke. Te ugotovitve so skladne z našimi rezultati, ker se je Hg večinoma kopičil v prebavnih žlezah polžev v primerjavi z mišičnim tkivom.

Biodostopnost Hg za prebavno žlezo polžev je bila zelo nizka, komaj 4 %. To lahko potrdimo tudi iz rezultatov koncentracij Hg, izmerjenih v prebavnih žlezah, ki niso presegale koncentracij Hg v njihovi hrani. V našem poskusu je pri polžih, hranjenih s tatarsko ajdo z dodanim Se, Se statistično značilno povečal biodostopnost Hg iz hrane v prebavne žleze polžev in s tem statistično značilno tudi povečal vsebnost Hg v prebavnih žlezah polžev. Pri navadni ajdi Se ni imel vpliva.

Delovanje prebavne žleze in mišičnega tkiva polža smo preverili tudi z določitvijo stopnje lipidne peroksidacije. Kot že zgoraj omenjeno se je večina Hg kopičilo v prebavnih žlezah polžev. Posledično so bile koncentracije MDA ekvivalenta v primerjavi z mišičnim tkivom, večje v prebavnih žlezah polžev. Kombinacija Hg s Se je pri polžih, hranjenih s tatarsko ajdo z dodanim povečala koncentracijo MDA ekvivalenta v prebavnih žlezah polžev. Pri navadni ajdi kombinacija Hg in Se ni imela vpliva.


35

Koncentracije Hg v mišičnem tkivu so bile manjše kot v prebavnih žlezah. Selen ni vplival na vsebnost Hg v mišičnih tkivih polžev. Leta 2011 so Silbernagel in sod. dokazali, da se Hg v mišicah rib nahaja v organski obliki Hg, metil-Hg (MeHg). Tudi pri polžih obstaja verjetnost, da je nakopičen Hg v mišicah v resnici MeHg, vendar bi morali to dodatno preveriti. Gnamuš in Horvat (1999) sta mnenja, da je MeHg, ki predstavlja razmeroma nizek % celokupnega Hg v tleh in gozdni vegetaciji, zaradi učinkovitega privzema skozi prebavila in trajnega zadrževanja v živalskih organizmih pomemben člen za kopenske rastlinojedce ter za prenos in kopičenje v prehranskih verigah.

Poudariti moramo tudi, da je bila biodostopnost Hg za prebavne žleze večja kot za mišična tkiva, medtem ko je pri Se bilo ravno obratno. Čeprav so bile vsebnosti Se v prebavnih žlezah polžev nižje od vsebnosti Hg, je bila biodostopnost Se za mišično tkivo bistveno večja kot za prebavno žlezo. S tem lahko potrdimo uspešen prenos Se iz prebavne žleze v mišično tkivo, medtem ko se je Hg raje zadrževal v prebavnih žlezah.

Podobno z našimi rezultati so dokazali tudi Zidar in sod. (2016), ki so navadne prašičke (Porcellio scaber) izpostavili solatam, gojenih v zemlji, nabrani v Idriji brez ali s foliarno dodanim Se. To so pripisali drugačni sestavi različnih oblik Hg v zemlji, nabrani v Idriji, ki bi lahko ovirala privzem Hg v solate in posledično zmanjšala absorpcijo in učinkovitost Se na Hg. V nasprotnem primeru sta Komsta-Szumska in Chmielnicka (1977) s poskusi na podganah dokazala, da imajo selenoproteini, ki se kopičijo v jetrih in ledvicah, pomembno vlogo pri uravnavanju kopičenja Hg, ki z vezavo na njih preprečujejo njegovo strupenost.


36

6 SKLEPI

• Selen je v primerjavi z navadno ajdo povečal suho biomaso poganjkov tatarske ajde, medtem ko na suho biomaso korenin navadne in tatarske ajde ni vplival. Antioksidanti niso korelirali s suho biomaso ajd.

• Selen je zaviral tvorbo klorofila a pri navadni ajdi ter tvorbo klorofila b in karotenoidov pri tatarski ajdi.

• Selen je v primerjavi z navadno ajdo znižal koncentracijo MDA ekvivalenta v poganjkih tatarske ajde. Selen je tudi povečal koncentracijo MDA ekvivalenta v koreninah tatarske ajde, medtem ko na korenine navadne ajde ni imel vpliva.

• Vsebnosti fenolov so bile v primerjavi s koreninami večje v poganjkih. Dodatek Se je negativno vplival na vsebnost fenolnih spojin v koreninah in poganjkih navadne ajde. Nasprotno je dodatek Se pri tatarski ajdi vsebnost fenolnih spojin v koreninah povečal, na poganjke pa ni imel vpliva.

• Selen je povečal antioksidativno učinkovitost v koreninah tatarske ajde. • Ugotovili smo, da je izpostavitev ajd Se povečala biodostopnost Hg iz zemlje v korenine

navadne ajde. • Vsebnosti Hg so bile višje v koreninah kot v poganjkih ne glede na vrsto ajde. Dodatek Se

je povečal vsebnost Hg v koreninah navadne ajde. • Listno škropljenje s Se je povečal vsebnosti Se v poganjkih obeh vrst ajd, v koreninah pa je

bil pod mejo detekcije. Prav tako so bile vsebnosti Se v koreninah in poganjkih pod mejo detekcije pri obeh vrstah brez dodanega Se.

• Pri polžih se je Hg ne glede na vrsto izpostavitve ajde večinoma kopičil v prebavni žlezi, medtem ko se je Se kopičil v mišičnem tkivu.

• Večja kot je bila biodostopnost Hg za prebavno žlezo polžev španskih lazarjev, hranjenih z navadno in tatarsko ajdo brez ali z dodanim Se, večja je bila koncentracija MDA ekvivalenta.

• Dodatek Se je povečal vsebnost Hg v prebavnih žlezah polžev, hranjenih s tatarsko ajdo. Pri navadni ajdi Se ni imel vpliva.

Rezultati so pokazali, da je kombinacija Hg in Se različno vplivala na fiziološke lastnosti obeh vrst ajd. Obe vrsti ajd sta v kombinaciji s Se različno privzemali Hg. Transport Hg vzdolž prehranjevalne verige je bil v kombinaciji s Se vrstno specifičen. Živo srebro se je večinoma kopičilo v koreninah navadne in tatarske ajde ter v prebavni žlezi polžev španskih lazarjev, medtem ko se je Se kopičil v poganjkih navadne in tatarske ajde ter v mišičnem tkivu polžev lazarjev. Ker so rastline rastle v kontroliranih pogojih, večje razlike v antioksidativnem potencialu med obema vrstama niso bile opazne, prav tako niso bili opazni antioksidativni učinki na polžja tkiva v prisotnosti Hg.


37

7 VIRI

Aggarwal, A., Sharma, I., Tripathi, B.N., Munjal A.K., Baunthiyal, M., Sharma, V. (2012). Metal toxicity and Photosynthesis. Overviews on Recent Progress and Future Perspectives, 16, 229-236.

Alvarez-Jubete, L., Wijngaard, E.K., Arendt, E.K., Gallager, E. (2010). Polyphenol composition and in vitro antioxidant activity of amaranth, quinoa, buckwheat and wheat as affected by sprouting and baking. Food Chemistry, 119(2), 770-778.

Apel, K., Hirt, H. (2004). Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress, and signal transduction. Annual Review of Plant Biology, 55, 373-99.

Appenroth, K.J. (2010). Definition of heavy metals and their role in biological systems. In: Sherameti I., Varma A. (ed.), Soil Heavy Metals, Soil Biology, 19, 19-29.

Arora, A., Nair, M.G., Strasburg, G.M. (1998). Structure-activity relationships for antioxidant activities of a series of flavonoids in a liposomal system. Free Radical Biology Medicine, 24(9), 1355-63.

Arora, A., Byrem, T.M., Nari, M.G., Strasburg, G.M. (2000). Modulation of liposomal membranes fluidity by flavonoids and isoflavonoids. Archives of Biochemistry and Biophysics, 373(1), 102-9.

Arts, M.J., Haenen, G.R., Wilms, L.C., Beetstra, S.A., Heijnen, C.G., Voss, H.P., Bast, A. (2002). Interactions between flavonoids and proteins: effect on the total antioxidant capacity. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50(5), 1184-7.

Baker, A.J.M., Walker, P.L. (1989). Physiological responses of plants to heavy metals and the quantification of tolerance and toxicity. Chemical Speciation Bioavailability, 1, 7-17.

Barceloux, D.G. (1999). Selenium. Journal of Toxicology: Clinical Toxicology, 37, 145-172.

Barta, J., Kalinova, J., Moudry, J., Curn, V. (2004). Effects of environmental factors on protein content and composition in buckwheat flour. Cereal Research Communications, 32, 541-548.

Bohm, B. A. (1998) Introduction to Flavonoids. Harwood Academic Publishers, Netherlands, 503.

Bonafaccia, G., Fabjan, N. (2003). Nutritional comparison of tartary buckwheat with common buckwheat and minor cereals. Zbornik Biotehniške Fakultete Univerze v Ljubljani Kmetijstvo, 81(2), 349-355.

Bonafaccia, G., Gambelli, L., Fabjan, N., Kreft, I. (2003). Trace elements in flour and bran from common and tartary buckwheat. Food Chemistry, 83, 1-5.

Bors, W., Heller, W., Michel, C., Saran, M. (1990). Flavonoids as antioxidants: determination of radical-scavenging effciency. Methods Enzymology, 186, 343-55.

Bravo, L. (1998). Polyphenols: chemistry, dietary sources, metabolism, and nutritional significance. Nutrition Reviews, 56(11), 317-33.

Brenčič, J., Lazarini, F. (1995). Splošna in anorganska kemija. Ljubljana: DZS.


38

Breznik, B., Germ, M., Gaberščik, A., Kreft, I. (2005a). Combined effects of elevated UV-B radiation and the addition of selenium on common (Fagopyrum esculentum Moench) and tartary (Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn.) buckwheat. Photosynthetica, 43, 583-589.

Breznik, B., Germ, M., Gaberščik, A., Germ, M., Kreft, I. 2005b. The combined effects of enhanced UV-B radiation and selenium on common buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) habitus. Fagopyrum, 22, 83-87.

Cao, W., Chen, W. J., Suo, Z. R., & Yao, Y. P. (2008). Protective effects of ethanolic extracts of buckwheat groats on DNA damage caused by hydroxyl radicals. Food Research

International, 41, 924-929.

Carrasco-Gil, S., Siebner, H., LeDuc, D.L., Webb, S.M., Millan, R., Andrews, J.C., Hernandez, L.E. (2013). Mercury Localization and Speciation in Plants Grown Hydroponically or in a Natural Environment. Environmental Science Technology, 47, 3082-3090.

Chao, P.D.L., Hsiu, S.L., Hou, Y.C. (2002). Flavonoids in herbs: biological fates and potential interactions with xenobiotics. Journal of Food Drug and Analysis, 10, 219-228.

Chen, J., Shiyab, S., Han, F.X., Monts, D.L., Waggoner, A.W., Su, Z.Y. (2009). Bioaccumulation and physiological effects of mercury in Pteris vittata and Nephrolepis exaltata. Ecotoxicology, 18, 110-121.

Clarkson, T.W. (1972). The pharmacology of mercury compounds. Annual Review

Pharmacology, 12, 375-406.

Coughtrey, P.J., Martin, M.H. (1976). The distribution of Pb, Zn, Cd and Cu within the pulmonate mollusc Helix aspersa Müller. Oecologia, 23, 315-22.

Dat, J., Vandenabeele, S., Vranová, E., Van Montagu, M., Inzé, D., Van Breusegem, F., (2000). Review: Dual action of the active oxygen species during plant stress responses. Cellular

Molecular Life Sciences, 57, 779-795.

Debeljak, M., van Elteren, J.T., Vogel-Mikuš, K. (2013). Development of a 2D laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry mapping procedure for mercury in maize (Zea mays L.) root cross-section. Analytica Chimica Acta, 787, 155-162.

Debeljak, N. (2015). Vpliv selena na privzem in porazdelitev živega srebra pri koruzi (Magistrska naloga). Biotehniška fakulteta, Ljubljana.

Dietrych-Szostak, D. (2004). Flavonoids in hulls of different varieties of buckwheat and their antioxidant activity. In: Advances in Buckwheat Research. Proceedings of the 9th International Symposium on Buckwheat, Prague, 621-625.

Dietz, K.J., Baier, M., Kramer, U. (1999). Free radicals and active oxygen species as mediators of heavy metal toxicity in plants. In: Prasad, M.N.V., Hagemeyer J. (ed.) Heavy Metal Stress

in Plants: From Molecule to Ecosystems. Heidelberg: Springer, 73-97.

Doening, D.W. (2000). Ecological effects, transport, and fate of mercury: a general review. Chemosphere, 40, 1335-1351.

EPA: Rice, G.E., Bullock, O.R., Ambrose, R.B., Swartout, J. (1997). Fate and transport of mercury in the environment. Mercury study report to congress, 3.


39

Fabjan, N., Rode, J., Košir, I.J., Wang, Z., Zhang, Z., Kreft, I. (2003). Tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn.) as a source of dietary rutin and quercitrin. Journal of

Agricultural and Food Chemistry, 51(22), 6452-6455.

Feng, R., Wei, C., Tu, S. (2013). The roles of selenium in protecting plants against abiotic stresses. Environmental and Experimental Botany, 87, 58-68.

Finley, J.W., Sigrid-Keck, A., Robbins, R.J., Hintze, K.J. (2005). Selenium Enrichment of Broccoli: Interactions between Selenium and Secondary Plant Coumpounds. Journal of

Nutrition, 135, 1236-1238.

Fitzgerald, W. (1995). Is mercury increasing in the atmosphere? The need for an atmospheric mercury network. Water, Air and Soil Pollution, 80(1), 245-254.

Fuhrman, B., Aviram, M. (2002). Polyphenols and flavonoids protect LDL against atherogenic modifications. In: Cadenas, E., Packer, L. (ed.) Handbook of antioxidants. New York, Marcel Dekker, 303-336.

Ganther, H.E., Goudie, C., Wagner, P., Sunde, M.L., Kopecky, M.J. Oh, S.H., Hoekstra, W.G. (1972). Selenium-relation to decreased toxicity of methylmercury added too diets containing tuna. Science, 175(4026), 1122−1124.

Germ, M., Kreft, I., Osvald, J. (2005). Influence of UV-B exclusion and selenium treatment on photochemical efficiency of photosystem II, yield and respiratory potential in pumpkins (Cucurbita pepo L.). Plant Physiology and Biochemistry, 43(5), 448-448.

Germ, M. (2006). The effect of UV-B radiation and selenium on respiratory potential in common buckwheat (Fagopyrum esculentum). Fagopyrum, 23, 91-93.

Germ, M., Stibilj, V. (2007). Selenium and plants. Acta Agriculturae Slovenica, 89(1), 65-71.

Gill, S.S., Khan, N., Tuteja, N. (2012) Cadmium at high dose perturbs growth, photosynthesis and nitrogen metabolism while at low dose it up regulates sulphur assimilation and antioxidant machinery in garden cress (Lepidium sativum L.). Plant Science, 182,112-120.

Gnamuš, A., Horvat, M. (1999). Mercury in terrestrial food webs of the Idrija mining area. In: Springer Environmental Book Series: Mercury Contaminated Sites: characterization, Risk

assessment and Remediation, Springer Verlag, Berlin, New York, Tokyo, 281-320.

Gnamuš, A. (2002). Živo srebro v kopenski prehranski verigi - indikatorski organizmi, privzem in kopičenje. Ljubljana: Inštitut Jožef Štefan.

Graan, T., Ort, D.R. (1984). Quantitation of the rapid electron donors to P700, the functional plastoquinone pool and the ratio of the photosystems in spinach chloroplasts. The Journal of

Biological Chemistry, 259(22), 14003-10.

Gratao, P.L., Monteiro, C.C., Tezotto, T., Carvalho, R.F, Alves, L.R., Peters, L.P., Azevedo, R.A. (2015). Cadmium stress antioxidant responses and root-to-shoot communication in grafted tomato plants. Biometals, 28(5), 803-16.

Hagels, H. (1999). Fagopyrum esculentum Moench. Chemical review. Zbornik Biotehniške

fakultete Univerze v Ljubljani. Kmetijstvo, 73, 29-38.


40

Hall, J.A., Bobe, G., Vorachek, W.R., Estill, C.T., Mosher, W.D., Pirelli, G.J., Gamroth, M. (2014). Effect of Supranutritional Maternal and Colostral Selenium Supplementation on Passive Absorption of Immnoglobulin G in Selenium-Replete Dairy Calves. Journal of Dairy

Science, 97(7), 4379-4391.

Hartikainen, H., Xue, T., Piironen, V. (2000). Selenium as an anti-oxidant and pro-oxidant in ryegrass. Plant and Soil, 225, 193-200.

Hasanuzzaman, M., Nahar., K., Fujita, M. (2014). Silicon and selenium: two vital trace elements that confer abiotic stress tolerance to plants. V P. Ahmad (ur.), Emerging

Technologies and Management of Crop Stress Tolerance (str. 377-422). Amsterdam: Elsevier.

Hawrylak-Nowak, B., (2009). Beneficial Effects of Exogenous Selenium in Cucumber Seedlings Subjected to Salt Stress. Biological Trace Element Research, 132, 259-269.

Hegedüs, A., Erdei, S., Horváth, G. (2001). Comparative studies of H2O2 detoxifying enzymes in green and greening barley seedlings under cadmium stress. Plant Science, 160, 1085-1093.

Hočevar A. (2016). Vpliv ultravijoličnega sevanja in selena na optične lastnosti listov dveh vrst

ajd (Diplomsko delo). Biotehniška fakulteta, Ljubljana.

Hodges, D.M., DeLong, J.M., Forney, C.F., Prange, R.K. (1999). Improving the thiobarbituric acid-reactive-substances assay for estimating lipid peroxidation in plant tissues containing anthocyanin and other interfering compounds. Planta, 207, 604-611.

Holasova, M., Fiedlerova, V., Smrcinova, H., Orsak, M., Lachman, J., Vavreinova, S. (2002). Buckwheat - the source of antioxidant activity in functional foods. Food Research

International, 35, 207-211.

Ideda, S., Tomura, K., Yamashita, Y., Kreft, I. (2001). Nutritonal profile of minerals in bukwheat and its products. In: Advances in Buckwheat Research II. The proceeding of the 8th International Symposium on Buckwheat, 485-488.

Jovanovic, S.V., Simic, M.G. (2000). Antioxidants in nutrition. Annals of the New York

Academy of Sciences, 352-359.

Jung, C., Maeder, V., Funk, F., Frey, B., Sticher, H., Frossard, E. (2003). Release of phenols from Lupinus albus L. roots exposed to Cu and their possible role in Cu detoxifcation. Plant and Soil, 252(2), 301-312.

Kabata-Pendias, A., Pendias, H. (2001). Trace Elements in Soils and plants. Third edition, CRC Press, Boca Raton.

Kaur, S., Nayyar, H. (2015). Selenium fertilization to salt-stressed mungbead (Vigna radiate L. Wilczek) plants reduces sodium uptake improves reproductive function, pod set and seed yield. Scientia Horticulturae, 197, 304-317.

Kedare, S.B., Singh, R.P. (2011). Genesis and development of DPPH method of antioxidant assay. Journal of Food Science and Technology, 48, 412-422.

Kim, S.L., Kim, S.K., Park, C.H. (2004). Introduction and nutritional evaluation of buckwheat sprouts as a new vegetable. Food Research International, 37, 319-327.


41

Kodre, A., Arčon, I., Debeljak, M., Potisek, M., Likar, M., Vogel-Mikuš, K. (2017). Arbuscular mycorrhizal fungi alter Hg root uptake and ligand environmental as studied by X-ray absorption fine structure. Environmental and Experimental Botany, 133, 12-13.

Komsta-Szumska, E., Chmielnicka, J. (1977). Binding of mercury and selenium in subcellular fractions of rat liver and kidney following separate joint administration. Archives of Toxicology, 38, 217-227.

Korošec, L. (2000). Prosti radikali in vloga antioksidantov v bioloških sistemih. V: Antioksidanti v živilstvu. 20. Bitenčevi živilski dnevi, Portorož, 26. in 27. oktober 2000. Žlender B., Gašperlin L. (ur.). Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 11-21.

Košmerl, T., Kač, M. (2007). Osnovne kemijske in senzorične analize mošta in vina: laboratorijske vaje za predmet Tehnologija vina. 3. izdaja, popravljena in dopolnjena. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 106 str.

Kreft, I. (1995). Ajda. Ljubljana, Kmečki glas.

Kreft I. (2010). Pridelovanje in uporaba tatarske ajde- nov izziv v Slovenij. V: Simpoziji Novi izzivi v poljedelstvu, Rogaška Slatina 2. in 3. december. 2010. Kocjan-Ačko D., Čeh B. (ur.) Ljubljna, Slovensko agronomsko društvo: 155-159.

Kreft, S., Janeš, D., Kreft, I. (2013). The content of fagopyrin and polyphenols in common and tartary buckwheat sprouts. Acta Pharmaceutica, 63(4), 553-560.

Kump, P. (2005). Rentgenska fluorescenca. Kemija v šoli, 17, 9-16.

Lavid, N., Schwartz, A., Yarden, O., Tel-Or, E. (2001). The involvement of polyphenols and peroxidase activities in heavy metal accumulation by epidermal glands of waterlily (Nymphaeceaea). Planta, 212(3), 323-31.

Lodenius, M. (1995). Cadmium and mercury in Nord-European forest ecosystems. In: Munawar, M., Luotola, M. (ed.), The Contaminants in the Nordic Ecosystem: Dynamics, Processes and Fate. Ecovision World Monograph Series, Academic Publishing, Amsterdam, 25-32.

Luthar, Z. (1992). Polyphenol classification and tannin content buckwheat seeds (Fagopyrum esculentum Moench). Fagopyrum, 12, 36-42.

Lushchak, V.I. (2011). Adaptive response to oxidative stress: bacteria, fungi, plants and animals. Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Toxicology and Pharmacology, 153, 175-190.

MacGregor, J.T., Clarkson, T.W. (1974). Distribution, tissue binding and toxicity of mercurials. Advance in Experimental Medicine and Biology, 48, 463-503.

Machils, L., Torrey, J.G. (1956). Plants in Action, a Laboratory Manual of Plants Physiology. W.H. Freeman and Company.

Magalhaes, L.M., Segundo, M.A., Reis, S., Lima, J.L.F.C. (2008). Methodological aspects about in vitro evaluation of antioxidant properties. Analytica Chimica Acta, 613, 1-19.


42

Magos, L. (1997). Physiology and toxicology of mercury. In: Sigel, A., Sigel, H. (ed.), Metals

Ions in Biological Systems. Vol. 34 - Mercury and its effects on Environment and Biology, Chapter 11. Marcel Dekker, Inc., New York, Basel, Hong Kong, 321-358.

Martens, D.A., Suarez, D.L. (1996). Selenium speciation of soil/sediment determined with sequential extractions and hydride generation atomic absorption spectrophotometry. Environmental Science Technology, 31, 133-139.

McNear, D.H., Afton, S.E., Caruso, J.A. (2012). Exploring the structural basis for selenium/mercury antagonism in Allium fistulosum. Metallomics, 4, 267-276.

Millic, B.L., Djilas, S.M., Canadanovic-Brunet, J.M. (1998). Antioxidative activity of phenolic compounds on the metal-ion breakdown of lipid peroxidation system. Food Chemistry, 61(4), 443-447.

Minorsky, P.V. (2003). Selenium in plants. Plant Physiology, 133(1), 14-15.

Monni, S., Uhlig, C., Junttila, O., Hansen, E., Hynynen, J. (2001). Chemical composition and ecophysiological responses of Empetrum nigrum to above ground element application. Environmental Pollution, 112, 417-426.

Moreno-Jimenez, E., Gamarra, R., Carpena-Ruiz, R.O., Millan, R., Peñalosa, J.M., Esteban, E. (2006). Mercury bioaccumulation and phytotoxicity in two wild plant species of Almaden area. Chemosphere, 63(11), 1969-1973.

Morgan, J.F., Klucas, R.V., Grayer, R.J., Abian, J., Becana, M. (1997). Complexes of iron with phenolic compounds from soybean nodules and other legume tissues. Free Radical Biology and

Medicine, 22(5), 861-70.

Mounicou, S., Shah, M., Meija, J., Caruso, J.A., Vonderheide, A.P., Shann, J. (2006). Localization and speciation of selenium and mercury in Brassica juncea - implications for Se-Hg antagonism. Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 21, 404-412.

Navarro, E., Baun, A., Behra, R., Hartmann, N.B., Filser, J., Miao, A.J., Quigg, A., Santschi, P.H., Sigg, L. (2008). Environmental behavior and ecotoxicity of engineered nanoparticles to algae, plants and fungi nanoparticles to algae, plants, and fungi. Ecotoxicology, 17(5), 372-386.

Nečemer, M., Kump, P., Rajčević, M., Jačimovič, R., Budič, B., Ponikvar, M. (2003). Determination of sulfur and chlorine in fodder by X-ray fluorescence spectral analysis and comparison with other analytical methods. Spectrochimica Acta Part B: Atomic Spectroscopy, 58, 1367-1373.

Nečemer, M., Kump, P., Ščančar, J., Jaćimović, R., Simčič, J., Pelicon, P., Budnar, M., Jeran, Z., Pongrac, P., Regvar, M., Vogel-Mikuš, K. (2008). Application of X-ray fluorescence analytical techniques in phytoremediation and plant biology studies. Spectrochimica Acta Part

B: Atomic Spectroscopy, 63(11), 1240-1247.

Nečemer, M., Kump, P., Vogel-Mikuš, K. (2011). Use of X-ray fluorescence-based analytical techniques in phytoremediation. In: Golubev, I.A. (ed.), Handbook of phytoremediation. Nova

Science Publishers New York, 331-358.

Nedelkoska, T.V., Doran, P.M. (2000). Characteristics of heavy metal uptake by plants species with potential for phytoremediation and phytomining. Minerals Engineering, 13, 549-561.


43

Nordberg, G., Nordberg, M. (1988). Biological monitoring of cadmium. In: Clarkson, T.W., Friberg, L., Nordberg, G., Sager, P.R. (ed.), Biological Monitoring of toxic metals, 151-168.

Ožbolt, L., Kreft, S., Kreft, I., Germ, M., Stibilj, V. (2008). Distribution of selenium and phenolics in buckwheat plants grown from seeds soaked in Se solution and under different levels of UV-B radiation. Food Chemistry, 110, 691-696.

Pařízek, J., Oštdalová, I. (1967). The protective effect of small amounts of selenite in sublimate intoxication. Cellular and Molecular Life Sciences, 23(2), 142-143.

Patra, A., Sharma, A. (2000). Mercury toxicity in plants. The Botanical review, 66(3), 379-422.

Pinheiro, J.N., Marques, C., Pinto, G., Mestiri, A., Mendo, S., Gomes, N.C., Gonçalves, F., Rocha-Santos, T., Duarte, A.C., Römbke, J., Sousa, J.P., Ksibi, M., Haddioui, A., Pereira, R. (2013). The performance of Fraxinus angustifolia as a helper for metal phytoremediation programs and its relation to the endophytic bacterial communities. Geoderma, 202-203, 171-182.

Prasad, M.N.V. (1997). Trace Metals. In: Prasad, M.N.V. (ed), Plant Ecophysiology. Willey, New York, 207-249.

Pyrzyńska, K. (2002). Determination of selenium species in environmental samples. Microchimica Acta, 140(1), 55-62.

Rajan, M., Darrow, J., Hua, M., Barnett, B., Mendoza, M., Greenfield, B.K., Andrews, J.C. (2008). Hg L3 XANES Study of Mercury Methylation in Shredded Eichhornia crassipes. Environmental Science Technology, 42, 5568-5573.

Rayman, M.P. (2012). Selenium and human health. Lancet, 379, 1256-1268.

Robinson, J.B., Tuovinen, O.H. (1984). Mechanisms of microbial resistance and detoxification of mercury and organomercury compounds: physiological, biochemical and genetic analyses. Microbiological Reviews, 48(2), 95-124.

Roginsky, V., Lissi, E.A. (2005). Review of methods to determine chain-breaking antioxidant activity in food. Food Chemistry, 92, 235-254.

Samanta, A., Das, G., Das, S.K. (2011). Roles of flavonoids in plants. International Journal of

Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 6(1), 12-34.

Scheuhammer, A.M. (1987). The chronic toxicity of aluminum, cadmium, mercury and lead in birds: a review. Environmental Pollution, 46(4), 263-295.

Silbernagel, S.M., Carpenter, D.O., Gilbert, S.G., Gochfeld, M., Groth, E., Hightower, J.M., Schiavone, F.M. (2011). Recognizing and preventing overexposure to methylmercury from fish and seafood consumption: Information for physicians. Journal of Toxicology, 1-7.

Štrekelj, P. (2015). Privzem kovin in selena v tatarski ajdi (Fagopyrum tataricum Gaertn.) in

njena vloga pri fitoremediaciji tal (Doktorska disertacija). Biotehniška fakulteta, Ljubljana.

Vombergar, B., Kreft, I., Horvat, M., Vorih, S. (2014). Ajda. Ljubljana, Kmečki glas.

Vombergar B., Kreft I., Germ M., Vogrinčič M. (2012). Comparison of nutritional value of common and tartary buckwheat and possibilities for their use in nutrition. V: First scientific

conference with international participation. Izola, Slovenija. Oktober 25. 167: 143-149.


44

Terry, N., Zayed, A.M., de Souza, M.P., Tarun, A.S. (2000). Selenium in higher plants. Annual

Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 51, 401-432.

Thomas, RC, Postma, M. (2007). Dynamic and static calcium gradients inside large snail (Helix aspersa) neurones detected with calcium-sensitive microelectrodes. Cell

Calcium, 41(4), 365-78.

Pandey, N., Pathak, G. C., Pandey, D. K., & Pandey, R. (2009). Heavy metals Co, Ni, Cu, Zn and Cd produce oxidative damage and evoke differential antioxidant responses in spinach. Brazilian Journal of Plant Physiology, 21(2), 103-111.

Pennanen, A., Xue, T., Hartikainen, H. (2002). Protective role of selenium in plant subjected to severe UV irridiation stress. Journal of Applied Botany, 76(1-2), 66-76.

Saffaryazdi, A., Lahouti, M., Ganjeali, A., Bayat, H. (2012). Impact of selenium supplementation on growth and selenium accumulation on spinach (Spinacia oleracea L.) plants. Notulae Scientia Biologicae, 4(4), 95-100.

Shanker, K., Mishra, S., Srivastava, S., Srivastava, R., Dass, S., Prakash, S., Srivastava, M.M. (1996). Study of mercury-selenium (Hg-Se) interactions and their impact on Hg uptake by the radish (Raphanus sativus) plant. Food and Chemical Toxicology, 34(9), 883-886.

Tavčar Benković, E., Kreft, S. (2015). Fagopyrins and Protofagopyrins: Detection, Analysis, and Potential Phototoxicity in Buckwheat. Journal of Agricultural and Food Chemistry, A-J.

Wanek, P.L., Vance, G.F., Williams, S.E. (1995). Selenium uptake by four-wing saltbush and yellow-blossom sweet clover as influenced by vesicular-arbuscular mycorrhizae. In: Schuman, G.E., Vance, G.F. (ed.), Decades Later: A Time for Reassessment. American Society for Surface Mining and Reclamation on Annual Meetings, Gillette, June 3-8, 1995. Wyoming, University of Wyoming: 309-316

Wang, J., Wang, Z., Mao, H., Zhao, H., Huang, D. (2013). Increasing Se concentration in maize grain with soil- or foliar-applied selenite on the Loess Plateau in China. Field Crops Research, 150, 83-90.

Wang, X., Fung-Yee Tam, N., Fu, S., Ametkhan, A., Ouyang, Y., Ye, Z. (2014). Selenium addition alters mercury uptake, bioavailability in the rhizosphere and root anatomy of rice (Oryza sativa). Annals of Botany, 114(2), 271-278.

WHO (1976). Mercury. Environmental Health Criteria 1. World Health Organization Geneva: 1-132.

Winkel-Shirley, B. (2002). Biosynthesis of flavonoids and effects of stress. Current Opinion in

Plant Biology, 5(3), 218-23.

Xue, T., Hartikainen, H., Piironen, V. (2001). Antioxidative and growth-promoting effect of selenium on senescing lettuce. Plant and Soil, 237(1), 55-61.

Yin, Y., Allen, H.E., Huang, C.P., Li, Y., Sanders, P.F. (1995). Adsorption of Hg(II) by soil: Effects of pH, chloride concentration, and organic matter. Journal of Environmental Quality, 25(4), 837-844.

Yoon, Y.H., Lee, J.G., Jeong, J.C., Jang, D.C., Park, C.S. (2009). The effect of temperature and light conditions on growth and antioxidant contents of tartary buckwheat sprouts. In: Park,


45

C.H., Kreft, I. (ed.), Development and Utilization of Buckwheat Sprouts as medicinal natural

products. ISBS - International Symposium of Buckwheat Sprouts. (Bongpyong, IBRA), 59.

Zayed, A., Lytle, C.M., Terry, N. (1998). Accumulation and volatilization of different chemical species of selenium by plants. Planta, 206(2), 284-292.

Zhang, H., Feng, X.B., Chan, H.M., Larssen, T. (2014). New insights into traditional health risk assessments of mercury exposure: implications of selenium. Environmental Science

Technology, 48(2), 1206-1212.

Zhang, H., Feng, X., Zhu, J., Sapkota, A., Meng, B., Yao, H., Qin, H., Larssen, T., (2012). Selenium in soil inhibits mercury uptake and translocation in Rice (Oryza sativa L.). Environmental Science Technology, 46(18), 10040- 10046.

Zhou, X., Hao, T., Zhou, Y., Tang, W., Xiao, Y., Meng, X., Fang, X. (2015). Relationships between antioxidant compounds and antioxidant activities of Tartary buckwheat during germination. Journal of Food Science and Technology, 52(4), 2458-2463.

Zhou, X.B., Gao, A.X., Zhang, C.M., Xu, W.H., Shi, X.J. (2017). Exogenous selenium alleviates mercury toxicity by preventing oxidative stress in rice (Oryza sativa) seedlings. International Journal of Agriculture and Biology, 19(6), 1593-1600.

Zhu, F. (2016). Chemical composition and health effects of Tartary buckwheat. Food

Chemistry, 203, 231-245.

Zidar, P., Kržišnik, Š., Debeljak, M., Žižek, S., Vogel Mikuš K. (2016). The effect of selenium on mercury transport along the food chain. Agrofor International Journal, 1(3), 119-126.

Zyrin, N.G., Obukhovskaya, T.D. (1980). Mercury in soils and plants. Agrokhimiya, 7, 126-139.


46

ZAHVALA

V prvi vrsti gre zahvala moji mentorici izr. prof. dr. Katarini Vogel-Mikuš za vodenje in

skrokovno znanje tekom magistrskega dela.

Zahvala gre tudi ostalima članicama komisije, izr. prof. dr. Mateji Germ in prof. dr. Alenki

Gaberščik, ki sta postavili piko na i končnemu izdelku.

Posebna zahvala gre mladi raziskovalki Anji Kavčič, ki me je uvedla v laboratorijsko delo in

mi vedno priskočila na pomoč pri praktičnem delu, kadar dve roki nista bili dovolj. Tekom

magistrske naloge me je usmerjala, mi svetovala pri statistični obdelavi podatkov, si vzela čas

za prvo branje in popravo besedila in mi bila ob vsem tem ob hudih urah še v moralno oporo.

Hvala Mileni Kubelj in dr. Evi Kovačec za njihovo pomoč, nasvete in usmeritve.

Največja zahvala pa gre mojih staršem, ki sta mi stala ob strani vsa dolga leta študija in mi

omogočila, da ga končam ob svojem času.

Hvala vsem za podporo, prijaznost in potrpežljivost.


47

PRILOGE

Priloga 1: Vsebnost flavonoidov v koreninah in poganjkih ajd, izpostavljenih zemlji, nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se. Legenda: NA - navadna ajda, NA + Se - navadna ajda s foliarno dodanim Se, TA - tatarska ajda, TA + Se - tatarska ajda s foliarno dodanim Se. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p < 0,05).

aa

mm

a a m m

0

5

10

15

20

25

30

35


Vse

bnos

t fla

vono

idov

v k

oren

inah

in

pog

anjk

ih (

mg/

g S

M)

Izpostavitev

KORENINE POGANJKI

vloga antioksidantov in selenovih spojin v listih …

Documents