VIRUS THỰC

VẬT, PHYTOPLASMA

VÀ VIROID

1

TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

KHOA NÔNG HỌC

VIRUS THỰC VẬT, PHYTOPLASMA VÀ VIROID

(Bài giảng)

Biên soạn

TS. Hà Viết Cƣờng

Hà Nội, 2010

2

MỤC LỤC

MỤC LỤC .................................................................................................................................................................... 2

LỜI NÓI ĐẦU .............................................................................................................................................................. 6

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................................................................................... 7

DANH SÁCH BẢNG .................................................................................................................................................... 8

DANH SÁCH HÌNH ..................................................................................................................................................... 9

PHẦN I: ĐẠI CƢƠNG ................................................................................................................................................12

CHUƠNG 1. GIỚI THIỆU ......................................................................................................................................13

1.1 TÓM TẮT NỘI DUNG ..................................................................................................................................13 1.2 LỊCH SỬ VIRUS ...........................................................................................................................................13 1.3 CÁC CỘT MỐC LỊCH SỬ QUAN TRỌNG KHÁC .......................................................................................14 1.4 THUÂT NGỮ VIRUS ...................................................................................................................................15 1.5 ĐỊNH NGHĨA VIRUS ...................................................................................................................................15 1.6 NGUỒN GỐC VIRUS ...................................................................................................................................16 1.7 TẦM QUAN TRỌNG CỦA VIRUS THỰC VẬT...........................................................................................17 1.8 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 1 ....................................................................................................................18 1.9 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH .................................................................................................................18

CHƢƠNG 2. PHÂN LOẠI VÀ DANH PHÁP ........................................................................................................19

2.1 TÓM TẮT NỘI DUNG ..................................................................................................................................19 2.2 PHÂN LOẠI VÀ DANH PHÁP .....................................................................................................................19 2.3 LịCH SỬ DANH PHÁP VÀ PHÂN LOẠI VIRUS .........................................................................................19 2.4 ỦY BAN PHÂN LOẠI VIRUS QUỐC TẾ (ICTV) .........................................................................................20 2.5 DANH PHÁP VIRUS HIỆN TẠI THEO ICTV ..............................................................................................22 2.6 PHÂN BIỆT VIRUS VÀ LOÀI VIRUS .........................................................................................................23 2.7 KHÁI NIỆM LOÀI VIRUS............................................................................................................................23 2.8 CÁC CHỈ TIÊU PHÂN LOẠI VIRUS ............................................................................................................24 2.9 HỆ THỐNG PHÂN LOẠI VIRUS HIỆN TẠI THEO ICTV............................................................................26 2.10 HỆ THỐNG PHÂN LOẠI VIRUS THEO BALTIMORE...........................................................................28 2.11 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 2 ...............................................................................................................29 2.12 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH ............................................................................................................29

CHƢƠNG 3. HÌNH THÁI VÀ CẤU TRÚC VIRUS ..............................................................................................31

3.1 TÓM TẮT NỘI DUNG ..................................................................................................................................31 3.2 MỘT SỐ THUẬT NGỮ.................................................................................................................................31 3.3 HÌNH THÁI VIRUS ......................................................................................................................................31 3.4 VIRUS TRẦN VÀ VIRUS CÓ VỎ BỌC .......................................................................................................31 3.5 CẤU TRÖC PHÂN TỬ VIRUS .....................................................................................................................33 3.6 CẤU TRÖC DẠNG KHỐI ĐA DIỆN ĐỐI XỨNG (ICOSAHEDRON) ..........................................................33 3.7 CÁC PHÂN TỬ VỚI KHỐI ĐA DIỆN ĐỐI XỨNG DÀI ...............................................................................36 3.8 CẤU TRÖC ĐỐI XỨNG XOẮN ...................................................................................................................36 3.9 CẤU TRÖC KHÔNG ĐỐI XỨNG (PHỨC TẠP) ...........................................................................................37 3.10 THÀNH PHẦN CẤU TẠO CỦA PHÂN TỬ VIRUS ................................................................................38 3.11 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 3 ...............................................................................................................39 3.12 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH ...........................................................................................................39

CHƢƠNG 4. TÁI SINH VIRUS (REPLICATION) .................................................................................................40

4.1 TÓM TẮT NỘI DUNG ..................................................................................................................................40 4.2 KHÁI NIỆM ..................................................................................................................................................40 4.3 ĐẶC ĐIỂM TÁI SINH VIRUS ......................................................................................................................40 4.4 TÁI SINH CỦA CÁC VIRUS CÓ BỘ GEN RNA SỢI (+) ..............................................................................40 4.5 TÁI SINH CỦA CÁC VIRUS CÓ BỘ GEN RNA SỢI (-) ..............................................................................44 4.6 TÁI SINH CỦA VIRUS RNA SỢI KÉP .........................................................................................................45 4.7 TÁI SINH CỦA VIRUS RNA QUA PHIÊN MÃ NGƢỢC (RETROVIRUS) ..................................................47 4.8 TÁI SINH CỦA VIRUS DNA SỢI VÕNG ĐƠN ............................................................................................50 4.9 TÁI SINH CỦA VIRUS DNA SỢI VÕNG KÉP PHIÊN MÃ NGƢỢC (PARARETROVIRUS) ......................51 4.10 CÁC CHIẾN LƢỢC DỊCH MÃ CỦA VIRUS THỰC VÂT .......................................................................53 4.11 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 4 ...............................................................................................................58

3

4.12 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH ............................................................................................................58

CHƢƠNG 5. SỰ DI CHUYỂN CỦA VIRUS TRONG CÂY ..................................................................................60

5.1 TÓM TẮT NỘI DUNG ..................................................................................................................................60 5.2 DI CHUYỂN GIỮA CÁC TẾ BÀO................................................................................................................60 5.3 DI CHUYỂN HỆ THỐNG QUA KHOẢNG CÁCH XA .................................................................................62 5.4 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 5 ....................................................................................................................63 5.5 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH .................................................................................................................63

CHƢƠNG 6. CƠ CHẾ GÂY BỆNH CỦA VIRUS THỰC VẬT .............................................................................64

6.1 TÓM TẮT NỘI DUNG ..................................................................................................................................64 6.2 TRIỆU CHỨNG BỆNH VIRUS .....................................................................................................................64 6.3 HAI MÔ HÌNH GIẢI THÍCH CƠ CHẾ GÂY BỆNH CỦA VIRUS.................................................................65 6.4 CÁC CƠ CHẾ GÂY BỆNH CỦA VIRUS ......................................................................................................66 6.5 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 6 ....................................................................................................................68 6.6 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH .................................................................................................................68

CHƢƠNG 7. LAN TRUYỀN CỦA VIRUS THỰC VẬT ........................................................................................69

7.1 TÓM TẮT NỘI DUNG ..................................................................................................................................69 7.2 GIỚI THIỆU .................................................................................................................................................69 7.3 LAN TRUYỀN QUA TIẾP XÖC CƠ HỌC ....................................................................................................69 7.4 LAN TRUYỀN QUA NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH ............................................................................................69 7.5 TRUYỀN QUA HẠT GIỐNG (SEED) ...........................................................................................................70 7.6 LAN TRUYỀN QUA MÔI GIỚI (CỰC KỲ QUAN TRỌNG) ........................................................................71 7.7 CƠ CHẾ TRUYỀN VIRUS NHỜ VECTOR CÔN TRÙNG ............................................................................71 7.8 HÀNH VI CHÍCH HÖT CỦA CÔN TRÙNG BỘ HEMIPTERA ....................................................................73 7.9 LAN TRUYỀN VIRUS THEO KIỂU KHÔNG BỀN VỮNG ..........................................................................73 7.10 LAN TRUYỀN VIRUS THEO KIỂU BÁN BỀN VỮNG ..........................................................................77 7.11 LAN TRUYỀN VIRUS THEO KIỂU BỀN VỮNG TUẦN HOÀN ............................................................78 7.12 TRUYỀN THEO KIỂU BỀN VỮNG TÁI SINH .......................................................................................79 7.13 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 7 ...............................................................................................................81 7.14 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH ............................................................................................................82

CHƢƠNG 8. PHÒNG CHỐNG BỆNH VIRUS THỰC VẬT .................................................................................83

8.1 TÓM TẮT NỘI DUNG ..................................................................................................................................83 8.2 CÁC CHIẾN LƢỢC PHÕNG CHỐNG BỆNH VIRUS ...................................................................................83 8.3 SỬ DỤNG VẬT LIỆU GIỐNG SÁCH BỆNH................................................................................................83 8.4 SỬ DỤNG GIỐNG KHÁNG BỆNH MANG GEN KHÁNG CỦA CÂY .........................................................83 8.5 SỬ DỤNG GIỐNG KHÁNG BỆNH DÙNG GEN VIRUS..............................................................................86 8.6 ỨNG DỤNG TÍNH KHÁNG TẠO ĐƢỢC (INDUCED RESISTANCE) .........................................................92 8.7 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 8 ....................................................................................................................96 8.8 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH .................................................................................................................97

CHƢƠNG 9. CHẨN ĐOÁN BỆNH VIRUS THỰC VẬT .......................................................................................99

9.1 TÓM TẮT NỘI DUNG ..................................................................................................................................99 9.2 GIỚI THIỆU .................................................................................................................................................99 9.3 CHẨN ĐOÁN DỰA VÀO TRIỆU CHỨNG ..................................................................................................99 9.4 CHẨN ĐOÁN DỰA VÀO CÂY CHỈ THỊ .....................................................................................................99 9.5 KĨ THUẬT HIỂN VI ĐIỆN TỬ ................................................................................................................... 100 9.6 KĨ THUẬT CHẨN ĐOÁN DỰA VÀO THỂ VÙI ........................................................................................ 101 9.7 KĨ THUẬT PCR VÀ RT-PCR...................................................................................................................... 102 9.8 CHẨN ĐOÁN DỰA VÀO RNA SỢI KÉP ................................................................................................... 106 9.9 CHẨN ĐOÁN DỰA VÀO HUYẾT THANH HỌC ...................................................................................... 106 9.10 CÁC KĨ THUẬT DOT BLOT ................................................................................................................. 112 9.11 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 9 ............................................................................................................. 113 9.12 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH .......................................................................................................... 113

PHẦN II: CHUYÊN KHOA ...................................................................................................................................... 114

CHƢƠNG 10. CÁC VIRUS THỰC VẬT Ở VIỆT NAM ...................................................................................... 115

10.1 TÓM TẮT NỘI DUNG ........................................................................................................................... 115 10.2 CÁC VIRUS ĐƢỢC PHÁT HIỆN Ở VIỆT NAM ................................................................................... 115 10.3 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH .......................................................................................................... 119

4

CHƢƠNG 11. VIRUS DNA SỢI KÉP (PHIÊN MÃ NGƯỢC): HỌ CAULIMOVIRIDAE .................................. 121

11.1 TÓM TẮT NỘI DUNG ........................................................................................................................... 121 11.2 HỌ CAULIMOVIRIDAE ....................................................................................................................... 121 11.3 RICE TUNGRO BACILLIFORM VIRUS ............................................................................................... 122 11.4 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 11 ........................................................................................................... 124 11.5 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH .......................................................................................................... 124

CHƢƠNG 12. VIRUS DNA SỢI ĐƠN: CHI BEGOMOVIRUS (HỌ GEMINIVIRIDAE) ................................... 125

12.1 TÓM TẮT NỘI DUNG ........................................................................................................................... 125 12.2 HỌ GEMINIVIRIDAE ........................................................................................................................... 125 12.3 CHI BEGOMOVIRUS ............................................................................................................................ 126 12.4 BỆNH DO BEGOMOVIRUS.................................................................................................................. 130 12.5 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 12 ........................................................................................................... 133 12.6 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH .......................................................................................................... 134

CHƢƠNG 13. VIRUS DNA SỢI ĐƠN (TIẾP): CHI BABUVIRUS (HỌ NANOVIRIDAE) ................................ 135

13.1 TÓM TẮT NỘI DUNG ........................................................................................................................... 135 13.2 HỌ NANOVIRIDAE .............................................................................................................................. 135 13.3 BANANA BUNCHY TOP VIRUS (BBTV) ............................................................................................ 137 13.4 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 13 ........................................................................................................... 138 13.5 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH .......................................................................................................... 138

CHƢƠNG 14. VIRUS RNA SỢI ĐƠN CỰC DƯƠNG: CHI TOBAMOVIRUS (HỌ VIRGAVIRIDAE) ............ 139

14.1 TÓM TẮT NỘI DUNG ........................................................................................................................... 139 14.2 HỌ VIRGAVIRIDAE ............................................................................................................................. 139 14.3 CHI TOBAMOVIRUS ............................................................................................................................ 139 14.4 TOBACCO MOSAIC VIRUS (TMV) ..................................................................................................... 140 14.5 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 14 ........................................................................................................... 144 14.6 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH .......................................................................................................... 144

CHƢƠNG 15. VIRUS RNA SỢI ĐƠN CỰC DƯƠNG (TIẾP): CHI POTYVIRUS (HỌ POTYVIRIDAE) ........ 145

15.1 TÓM TẮT NỘI DUNG ........................................................................................................................... 145 15.2 HỌ POTYVIRIDAE ............................................................................................................................... 145 15.3 CHI POTYVIRUS .................................................................................................................................. 146 15.4 PAPAYA RING SPOT VIRUS (PRSV) .................................................................................................. 150 15.5 POTATO VIRUS Y (PVY) ..................................................................................................................... 152 15.6 BEAN COMMON MOSAIC VIRUS (BCMV) ........................................................................................ 155 15.7 SUGARCANE MOSAIC VIRUS (SCMV) VÀ SORGHUM MOSAIC VIRUS (SRMV) .......................... 160 15.8 ONION YELLOW DWARF VIRUS (OYDV), LEEK YELLOW STRIPE VIRUS (LYSV) VÀ SHALLOT

YELLOW STRIPE VIRUS (SYSV) ................................................................................................................................. 163 15.9 TURNIP MOSAIC VIRUS (TUMV) ....................................................................................................... 164 15.10 DASHEEN MOSAIC VIRUS (DSMV) ................................................................................................... 166 15.11 SWEET POTATO FEATHERY MOTTLE VIRUS (SPFMV) .................................................................. 167 15.12 ZUCCHINI YELLOW MOSAIC VIRUS (ZYMV) .................................................................................. 168 15.13 CHILLI VEINAL MOTLE VIRUS (CHIVMV) VÀ CHILLI RINGSPOT VIRUS (CHIRSV)................... 170 15.14 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 15 ........................................................................................................... 171 15.15 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH .......................................................................................................... 171

CHƢƠNG 16. VIRUS RNA SỢI ĐƠN CỰC ÂM: RHABDOVIRUS .................................................................. 173

16.1 TÓM TẮT NỘI DUNG ........................................................................................................................... 173 16.2 HỌ RHABDOVIRIDAE ......................................................................................................................... 173 16.3 RICE YELLOW STUNT VIRUS (RYSV) ............................................................................................... 175 16.4 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 16 ........................................................................................................... 178 16.5 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH .......................................................................................................... 178

CHƢƠNG 17. VIRUS RNA SỢI ĐƠN CỰC ÂM (TIẾP): TOSPOVIRUS ......................................................... 179

17.1 TÓM TẮT NỘI DUNG ........................................................................................................................... 179 17.2 HỌ BUNYAVIRIDAE ........................................................................................................................... 179 17.3 CHI TOSPOVIRUS ................................................................................................................................ 179 17.4 TOMATO SPOTTED WILT VIRUS (TSWV)......................................................................................... 180 17.5 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 17 ........................................................................................................... 183 17.6 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH .......................................................................................................... 183

5

CHƢƠNG 18. CÁC VIRUS RNA SỢI KÉP: HỌ REOVIRIDAE ........................................................................ 184

18.1 TÓM TẮT NỘI DUNG ........................................................................................................................... 184 18.2 HỌ REOVIRIDAE ................................................................................................................................. 184 18.3 RICE RAGGED STUNT VIRUS (RRSV) ............................................................................................... 186 18.4 SOUTHERN RICE BLACK-STREAKED DWARF VIRUS (SRBSDV) .................................................. 189 18.5 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 18 ........................................................................................................... 192 18.6 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH .......................................................................................................... 192

CHƢƠNG 19. VIRUS RNA SỢI KÉP (TIẾP): CHI TENUIVIRUS ..................................................................... 194

19.1 TÓM TẮT NỘI DUNG ........................................................................................................................... 194 19.2 CHI TENUIVIRUS ................................................................................................................................. 194 19.3 RICE GRASSY STUNT VIRUS (RGSV) ................................................................................................ 194 19.4 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 19 ........................................................................................................... 197 19.5 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH .......................................................................................................... 197

CHƢƠNG 20. PHYTOPLASMA .......................................................................................................................... 198

20.1 TÓM TẮT NỘI DUNG ........................................................................................................................... 198 20.2 GIỚI THIỆU .......................................................................................................................................... 198 20.3 ĐẶC ĐIỂM ............................................................................................................................................ 198 20.4 PHÂN LOẠI .......................................................................................................................................... 199 20.5 TRIỆU CHỨNG ..................................................................................................................................... 199 20.6 LAN TRUYỀN ....................................................................................................................................... 200 20.7 PHÕNG CHỐNG ................................................................................................................................... 200 20.8 CA. PHYTOPLASMA ASTERIS ............................................................................................................ 200 20.9 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 20 ........................................................................................................... 201 20.10 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH .......................................................................................................... 201

CHƢƠNG 21. VIROID .......................................................................................................................................... 202

21.1 TÓM TẮT NỘI DUNG ........................................................................................................................... 202 21.2 GIỚI THIỆU .......................................................................................................................................... 202 21.3 ĐỊNH NGHĨA VIROID .......................................................................................................................... 202 21.4 CẤU TRÖC VIROID .............................................................................................................................. 202 21.5 DANH PHÁP VÀ PHÂN LOẠI .............................................................................................................. 203 21.6 TRIỆU CHỨNG, CƠ CHẾ GÂY BỆNH VÀ LAN TRUYỀN .................................................................. 204 21.7 TÁI SINH CỦA VIROID ........................................................................................................................ 205 21.8 POTATO SPINDLE TUBER VIROID (PSTVD) ..................................................................................... 205 21.9 COCONUT CADANG-CADANG VIROID (CCCVD) ............................................................................ 206 21.10 AVOCADO SUNBLOTCH VIROID (ASBVD) ...................................................................................... 206 21.11 CÂU HỎI ÔN TẠP CHƢƠNG 21 ........................................................................................................... 206 21.12 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH .......................................................................................................... 206

PHẦN 3: THỰC HÀNH ............................................................................................................................................ 207

BÀI 1. ĐIỀU TRA BỆNH VIRUS ........................................................................................................................ 208

BÀI 2. LÂY NHIỄM NHÂN TẠO VIRUS BẰNG TIẾP XÖC CƠ HỌC ............................................................ 210

BÀI 3. PHÁT HIỆN VIRUS BẰNG ELISA ......................................................................................................... 211

BÀI 4. PHÁT HIỆN VIRUS BẰNG PCR/RT-PCR ............................................................................................. 213

6

LỜI NÓI ĐẦU

Tài liệu này đƣợc biên soạn để giảng dạy môn virus thực vật, phytoplasma và viroid cho

sinh viên và học viên cao học khối ngành nông học, công nghệ sinh học thực vật. Tài liệu giúp

ngƣời học hiểu và có khả năng vận dụng kiến thức của môn học nhằm định hƣớng nghiên cứu

bệnh virus thực vật.

Tài liệu giới thiệu các vấn đề quan trọng của virus thực vật bao gồm: Lịch sử nghiên cứu

virus; bản chất và phân phân loại virus; các đặc điểm hình thái, sinh học, đặc biệt là cơ chế gây

bệnh, sinh sản và sự lan truyền virus; chẩn đoán và phòng chống virus. Các ví dụ cụ thể là các

virus thực vật có ý nghĩa lịch sử, kinh tế trên thế giới. Phần lớn các ví dụ đã đƣợc xác định có

mặt ở Việt Nam. Ngoài ra, 2 nhóm tác nhân gây bệnh có đặc điểm gây bênh giống với virus là

phytoplasma và viroid cũng đƣợc đề cập. Một số nội dung, đặc biệt phần đại cƣơng, cũng đƣợc

so sánh với virus động vật, thực khuẩn thể để ngƣời đọc có cái nhìn tổng thể đối với virus học

nói chung. Kiến thức cơ bản về virus trình bày trong tài liệu này đều đƣợc cập nhật và phổ quát

trên thế giới.

Tài liệu đƣợc biên soạn gồm 3 phần:

Phần đại cƣơng. Phần đại cƣơng giới thiệu các khái niệm cơ bản của virus thực vật học

liên quan đến bản chất của virus. Phần này cũng giới thiệu các kỹ thuật chẩn đoán hiện đang

đƣợc sử dụng phổ biến trên thế giới và Việt Nam cũng nhƣ các chiến lƣợc phòng chống bệnh

chính.

Phần chuyên khoa. Phần chuyên khoa giới thiệu các ví dụ cụ thể về các virus có ý nghĩa

lịch sử, có ý nghĩa kinh tế. Phần lớn các virus này đã đƣợc phát hiện thấy ở Việt Nam. Các virus

đƣợc trình bày theo đơn vị phân loại chứ không theo đối tƣợng gây hại.

Phần thực hành. Phần thực hành trình bày các bài thực hành giúp sinh viên củng cố khả

năng đánh giá bệnh virus ngoài thực tiễn cũng nhƣ nắm đƣợc kỹ thuật chẩn đoán bệnh virus thực

vật hiện đang đƣợc sử dụng rộng rãi trên thế giới và Việt Nam

Đối với chƣơng trình đại học, các nội dung học đƣợc sắp xếp tƣơng đƣơng 2 tín chỉ và đƣợc

tổ chức thành 8 bài lý thuyết (3 tiết / bài) và 3 bài thực hành. Mức độ tự học của sinh viên tập

trung ở phần chuyên khoa. Sinh viên sẽ đƣợc học lý thuyết, đƣợc thực hành và phải thực hiện

một bài tiểu luận liên quan đến nội dung môn học.

Do trình độ có hạn, việc biên soạn bài giảng này không tránh khỏi sai sót. Tác giả rất mong

nhận đƣợc ý kiến đóng góp của bạn đọc để tài liệu đƣợc hoàn chỉnh.

Tác giả

Hà Viết Cƣờng

7

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

aa Amino acid

AP Alkaline phosphatase

ATPase Adenosine triphosphatase

Avr Avirulence

bp Base pair

CP Coat protein

CTAB Cetyl trimethylammonium bromide

DAS-ELISA Double antibody sandwich - ELISA

DdRp DNA-dependent DNA polymerase

dsDNA Double-stranded DNA

dsRNA Double-stranded RNA

eIF4E Eukaryotic translation initiation factor 4E

ELISA Enzyme linked immunosorbent assay

EM Electron microscope

g Gravity

ICTV International Committee on Taxonomy of Viruses

IgG Immunoglobulin gamma

IR Induced resistance

IRES Internal Ribosome Entry Site

ISR Induced systemic resistance

kb Kilobase

LIV Longevity in vitro

Mab Monoclonal antibody

MP Movement protein

NPP Nitrophenyl phosphate

nt nucleotide

NTP Nucleotide triphosphate

NTPase Nucleotide triphosphatase

ORF Open reading frame

Pab Polyclonal antibody

PCR Polymerase Chain Reaction

PDR Pathogen derived resistance

PR Pathogenesis related (protein)

pRBR Plant retinoblastoma-related protein

PTA-ELISA Plate trapped antigen - ELISA

PTGS Post-transcriptional gene silencing

R Resistance

RdRp RNA-dependent RNA polymerase

Rep Replication

RF Replicative form

RI Replicative intermediate

RISC RNA induced silencing complex

RNAi RNA interference

RT Reverse Transcriptase

RT-PCR Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction

SA Salycilic acid

SAR Systemic acquired resistance

SEL Size exclusion limit

ssDNA Single-strannded DNA

ssRNA Single-strannded RNA

TDP Thermal death point

UTR Untralslated region

VRC Viral replication complex

8

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2-1 Các bộ, họ virus theo phân loại của ICTV (dựa trên số liệu 2009) .......................................................... 26 Bảng 2-2 Hệ thống phân loại virus theo Baltimore ............................................................................................... 28 Bảng 3-1. So sánh một số đặc điểm hình thái – cấu trúc của các nhóm virus .......................................................... 39 Bảng 7-1 Thành phần vector của virus thực vật tính đến 2007 (Hogenhout et al., 2008) ......................................... 71 Bảng 7-2. Bốn phƣơng thức truyền virus thực vật của côn trùng môi giới .............................................................. 72 Bảng 7-3. Các họ, chi virus truyền qua aphid và phƣơng thức truyền (James & Perry, 2004) ................................. 74 Bảng 8-1. Một số gen kháng R của cây và Avr tƣơng ứng của virus (Soosaar et al., 2005; Kang et al., 2005) ......... 86 Bảng 9-1 Mã suy biến trong thiết kế mồi chung .................................................................................................. 105 Bảng 11-1 Phân loại các virus thuộc họ Caulimoviridae ...................................................................................... 121 Bảng 12-1. Phân loại các virus họ Geminiviridae theo ICTV năm 2009................................................................ 125 Bảng 12-2 Các begomovirus hại cây trồng đƣợc phát hiện cho tới nay tại Việt Nam ............................................. 133 Bảng 13-1 Phân loại họ Nanoviridae ................................................................................................................... 135 Bảng 14-1 Phân loại họ Virgaviridae ................................................................................................................. 139 Bảng 15-1. Phân loại họ Potyviridae (Berger et al. 2005) ..................................................................................... 145 Bảng 15-2. Một số isolate BCMV ở Việt Nam đƣợc giải trình tự gen CP ............................................................. 157 Bảng.15-3 Một số isolate SCMV và SrMV đƣợc giải trình tự gen CP................................................................... 161 Bảng 15-4 Một số isolate TuMV tại Việt Nam đƣợc giải trình tự gen CP............................................................ 165 Bảng 15-5 Một số mẫu ZYMV tại Việt Nam đƣợc giải trình tự gen CP ................................................................ 169 Bảng 15-6 Các mẫu potyvirus trên ớt tại Việt Nam đƣợc giải trình tự ................................................................... 170 Bảng 16-1. Phân loại họ Rhabdoviridae (bộ Monogavirales) theo ICTV (2009) .................................................. 173 Bảng 16-2 So sánh khả năng truyền RYSV của 3 loài rầy xanh trên lúa................................................................ 177 Bảng 17-1. Phân loại họ Bunyaviridae theo ICTV (2009).................................................................................... 179 Bảng 18-1 Phân loại họ Reoviridae (các reovirus đƣợc ghi nhận đến 2009) .......................................................... 184 Bảng 18-2 Đặc điểm bộ gen và chức năng protein của RRSV .............................................................................. 187 Bảng 18-3 Đặc điểm bộ gen và dự đoán chức năng các protei của virus SRBSDV (Wang et al., 2010) ................. 190 Bảng 19-1 Phân loại chi Tenuivirus (loài chuẩn: Rice stripe virus) ...................................................................... 194 Bảng 20-1 Phân loại phytoplasma dựa trên đặc điểm RNA ribosome 16S............................................................. 199 Bảng 21-1 Phân loại viroid (ICTV, 2009) ............................................................................................................ 204

9

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1-1 Triệu chứng bệnh virus trên hoa tulip. Ảnh trái, một bức tranh thế kỷ 17. Ảnh phải, hoa tulip bị nhiễm

TBV (Lesnaw & Ghabrial, 2000). 13 Hình 1-2 Ba nhà khoa học có đóng góp lớn về virus học. Từ trái sang phải: Adolf Mayer (ngƣời Hà Lan, 1843-

1942), Dimitrij Ivanovskij (ngƣời Nga, 1864-1920) và Martinus Beijerinck (ngƣời Hà Lan, 1851-1931). 14 Hình 2-1 Sơ đồ minh họa 5 thành viên của 1 lớp đa hình có 5 đặc điểm (Van Regenmortel, 2007) 24 Hình 2-2 Minh họa phân loại các chi, họ virus thực vật theo báo cáo lần thứ 8 (2005) của ICTV 27 Hình 2-3 Sơ đồ phân loại virus theo Baltimore (http://expasy.org/viralzone/all_by_protein/230.html) 28 Hình 3-1. Minh họa virus trần (hàng trên) và virus có vỏ bọc (hàng dƣới) 32 Hình 3-2 Sơ đồ cấu trúc phân tử TSWV (và các bunyavirus khác) với cấu trúc có vỏ bọc 32 Hình 3-3 Cấu trúc đối xứng đa diện icosahedron cơ bản của virus (T=1, số tiểu phần = 60) 33 Hình 3-4. Hai hình tam giác đều với số số tam giác phụ T = 4 (trái) và T = 9 (phải) 33 Hình 3-5 Minh họa cách vẽ các trục h, k và tọa độ các hình lục giác, cách tạo hình icosahedron tƣơng ứng với 1 T

xác định và cách xắp xếp các tiểu phần protein trên 1 mặt của các virus với 4 mức T khác nhau 34 Hình 3-6 Minh họa virus với T khác nhau sẽ có các đơn vị hình thái (capsomer) khác nhau 35 Hình 3-7 Hình thái Banana bunchy top virus (BBTV) 35 Hình 3-8 Hình thái Tomato bushy stunt virus (TBSV) 35 Hình 3-9 Cách cấu tạo của khối đa diện đối xứng kéo dài (hình trên) và cấu trúc phân tử với T=13 nhƣng có các Q

khác nhau (hình dƣới) 36 Hình 3-10 Cấu trúc đối xứng xoắn của TMV 37 Hình 3-11 Cấu trúc dạng nòng nọc của thực khuẩn thể T4 (Viralzone, 2009) 37 Hình 3-12 Cấu trúc phức tạp của virus đậu mùa 38 Hình 4-1 Sơ đồ giải thích cơ chế tái bản sợi (+) trên khuôn sợi (-). (b) và (c) là cơ chế tổng hợp của virus thực vật

TMV, còn (a) là dạng trung gian RI của thực khuẩn thể Qβ (Buck et al., 1999) 42 Hình 4-2 Sơ đồ tái sinh virus RNA sợi đơn, cực dƣơng 43 Hình 4-3 Sơ đồ tái sinh của rhabdovirus 44 Hình 4-4 Quá trình tái sinh của các rhabdovirus hại thực vật (cytorhabdovirus và nucleorhabdovirus) (Hull, 2002) 45 Hình 4-5 Sơ đồ tái sinh virus RNA sợi kép 46 Hình 4-6 Tổ chức bộ gen của 1 retrovirus động vật (HIV) và của 1 retrovirus thực vật (GmaSIREV) 47 Hình 4-7 Sơ đồ tái sinh của retrovirus động vật 49 Hình 4-8 Tái sinh của retrovirus thực vật 49 Hình 4-9 Sơ đồ tái sinh của begomovirus 51 Hình 4-10 Sơ đồ tái sinh của các caulimovirus 52 Hình 4-11 tổ chức bộ gen và chiến lƣợc dịch mã kiểu polyprotein của potyvirus 53 Hình 4-12 Tổ chức bộ gen và chiến lƣợc dịch mã kiểu gen phụ, bỏ qua mã kết thúc và dịch mã nội phân tử của

TMV 54 Hình 4-13 Bộ gen phân đoạn của BBTV (trái) và RRSV (phải) (Viralzone, 2009) 55 Hình 4-14 Chiến lƣợc dịch mã kiểu ―dò‖. Dấu * là mã ATG. Mũi tên chỉ hƣớng dịch mã. 55 Hình 4-15 Minh họa bộ gen của CaMV và 2 phân tử mRNA 35S và 19S (Haas et al., 2002) 56 Hình 4-16 Mô hình dịch mã của CaMV, RTBV theo cơ chế ―nhảy‖ (Thiébeauld et al., 2007) 57 Hình 4-17 Dịch mã theo kiểu chuyển khung 57 Hình 4-18 Tổ chức bộ gen của TSWV và dịch mã 2 chiều trên phân đoạn M 58 Hình 5-1 Cấu tạo sợi liên bào. A và B là mô hình sợi liên bào, trong đó A là tiết diện dọc và B là tiết diện ngang. C

là ảnh hiện vi điện tử của sợi liên bào (Lucas, 2006). 60 Hình 5-2 Chiến lƣợc tạo ống của virus thực vật để di chuyển giữa các tế bào (Hull, 2002) 61 Hình 5-3 Mô hình di chuyển giữa các tế bào của TMV 62 Hình 5-4 Hƣớng và tốc độ di chuyển hệ thống của virus trong cây (Agrios, 2005) 63 Hình 6-1 Thí nghiệm chứng minh protein P2 của RDP đã can thiệp vào đƣờng hƣớng tổng hợp gibberelline của cây

lúa (Wang et al., 2005) 67 Hình 6-2 Tƣơng tác giữa protein Rep của begomovirus với pRBR của tế bào cho phép khởi động lại chu kỳ tế bào 68 Hình 7-1. Giải phẫu chung côn trùng chích hút và phân bố virus 72 Hình 7-2 Bộ gen của potyvirus (trái) và CMV (phải) kèm theo các gen và motif cần cho lan truyền virus (Ng &

Falk, 2006) 76 Hình 7-3Mô hình tƣơng tác virus và vector theo phƣơng thức không bền vững và bền vững (Ng & Falk, 2006) 76 Hình 7-4 Sơ đồ phân tử TSWV (Hogenhout et al., 2008) 80

10

Hình 7-5 Các cơ quan bên trong của bọ trĩ liên quan đến lan truyền tospovirus và các rào cản dạng màng mà virus

phải vƣợt qua. Các số tƣơng ứng với các loại màng và tế bào liên quan đến đƣờng đi của virus từ khi đƣợc

chích nạp đến khi đƣợc chích truyền. L, lumen (tuyến dẫn); PSg, primary salivary gland (tuyến nƣớc bọt sơ

cấp); s, cross sections of muscle (tiết diện cắt ngang cơ); VP, viroplasm (vị trí tái sinh và lắp ráp virus); DM,

dense mass (vị trí có màu đậm khi chụp dƣới kính hiển vi) (Hogenhout et al., 2008). 81 Hình 8-1. Các lớp gen kháng R và một số ví dụ mỗi lớp 85 Hình 8-2. Minh họa tính kháng rất cao và bền vững đối với PRSV của giống đu đủ Rainbow chuyển gen CP so với

giống không chuyển gen Sunrise tại Hawai (Golsalves et al., 2004) 87 Hình 8-3. Cơ chế câm gen của thực vật chống virus và các các acid nucleic lạ 88 Hình 8-4. Hiệu quả PTGS với các cấu trúc chuyển gen potato virus Y (PVY) khác nhau. Hiệu quả đƣợc tính là %

cây chuyển gen miễn nhiễm với PVY; gen virus (PVY-pro) là NIa; chuỗi loop là chuỗi unidA (GUS) dài ~800

nucleotides; intron là của gen Pdk từ cây Flaveria (Smith et al., 2000). 90 Hình 8-5 Tạo cây cà chua chuyển gen kháng TYLCV bằng công nghệ RNAi (Fuentes, 2006) 91 Hình 8-6 Hai loại tính kháng tạo đƣợc: tính kháng tập nhiễm hệ thống (SAR) và tính kháng hệ thống tạo đƣợc (ISR)

(Vallad & Goodman, 2004). 93 Hình 8-7 Cấu trúc hóa học của SA, INA và BTH 93 Hình 8-8. Cây thuốc lá xử lý BTH (Bion) (trái) ức chế biểu hiện triêu chứng bệnh trên thuốc lá do TSWV gây ra.

Đối chứng không xử lý (phải) có triệu chứng dữ dội (Mandal et al., 2007) 94 Hình 8-9 Sự hình thành chitosan từ chitin 95 Hình 8-10 Hiệu quả ức chế của oligochitosan đối với TMV trên thuốc lá. (A) đối chứng, (B)–(F): xử lý chitosan lần

lƣợt ở các nồng độ 1 ppm, 10 ppm, 25 ppm, 50 ppm và 100ppm (Yin et al., 2010). 96 Hình 9-1 Lây nhiễm nhân tạo trên cây chỉ thị thuốc lá và rau muối (ảnh trái, giữa). Triệu chứng đốm chết hoại do

Citrus psorosis virus (CPsV) trên cây rau muối C. amaranticolor (http://www.DPWeb.net) 100 Hình: 9-2 Sơ đồ (trái) và ảnh chụp hiển vi điện tử (phải) của thể vùi tế bào chất của potyvirus 101 Hình 9-3 Dụng cụ và vật liệu dùng để kiểm tra thể vùi virus thực vật bằng kính hiển vi quang học

(http://plantpath.ifas.ufl.edu/pdc/Inclusionpage/Florvirus.html) 102 Hình 9-4 Phát hiện bộ gen dsRNA của virus lùn sọc đen phƣơng Nam (Zhou et al., 2008) 106 Hình 9-5 Cấu trúc kháng thể (Hull, 2002) 108 Hình 9-6 Sơ đồ sản xuất kháng thể đơn dòng 109 Hình 9-7 Kỹ thuật Outerlony chẩn đoán virus. Các mẫu ABCDE là các mẫu dƣơng 110 Hình 9-8 Các kỹ thuật ELISA khác nhau 111 Hình 9-9 Phát hiện virus bằng kỹ thuạt dot blot miễn dịch (western blot, trái, Hull, 2002) và dot blot lai DNA

(southern blot, phải, Hsu et al., 2005) 112 Hình 11-1 Hình thái phân tử và tổ chức bộ gen của RTBV (Hull, 1996) 123 Hình 11-2 Cây lúa nhiễm các tổ hợp virus khác nhau và khả năng truyền virus qua rầy xanh đuôi đen (Azzam et al.,

2000) 123 Hình 12-1 Hình thái phân tử geminiviruses. A, Phân tử Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), bar = 100 nm

(Gafni, 2003). B, Mô hình phân tử Maize streak virus (MSV) (Zhang et al., 2001). 126 Hình 12-2 Tổ chức bộ gen của begomovirus và DNA vệ tinh (Hà Viết Cƣờng, 2008) 129 Hình 12-3 Bệnh khảm lá sắn tại châu Phi. B và E là triệu chứng bệnh; C là vector bọ phấn và F là cây chuyển gen

kháng bệnh (Legg & Fauquet, 2004). 130 Hình 12-4 Triệu chứng bệnh cuốn lá bông tại Pakistan. Chú ý sự hình thành lá phụ ở mặt sau của lá bông ở ảnh

dƣới bên phải (Bridon & Markham, 2000) 131 Hình 13-1 Tổ chức bộ gen của các virus thuộc họ Nanoviridae (Gronenborn, 2004) 136 Hình 13-2 Bụi chuối bị bệnh chùn ngon (tại Gia Lâm) và triệu chứng trên lá 137 Hình 14-1 Sơ đồ cấu trúc phân tử của các tobamovirus (Viralzone, 2009) 139 Hình 14-2 Hình thái virion và cấu trúc của TMV 140 Hình 14-3 Tinh thể virus TMV hình thành trong tế bào thuốc lá 141 Hình 14-4 Tổ chức bộ gen chính và 2 phân tử phụ genome của TMV 142 Hình 14-5 Triệu chứng do TMV gây ra trên thuốc lá (trái), ớt (giữa) và cà chua (phải) 143 Hình 15-1 Hình thái virion và thể vùi của potyvirus. Ảnh trái: phân tử PVY, bar = 100 nm (Shukla et al., 1998).

Hình phải: thể vùi tế bào chất của PVY trong tế bào thuốc lá (Arbatova et al. 1998). 146 Hình 15-2 Tổ chức bộ gen của các potyvirus (Shukla et al., 1998). 147 Hình 15-3 Triệu chứng bệnh trên đu đủ (CABI, 2006) và bầu bí (cây bí xanh tại Việt Nam) 151 Hình 15-4 Ba nhóm phả hệ PVY trên thế giới và Việt Nam (in đậm) 153 Hình 15-5 Các triệu chứng khảm, khảm nhăn, lùn, chết hoại lá và đốm vòng chết hoại trên khoai tây do PVY

(Kerlan, 2006; Hà Viết Cƣờng, 2005) 154 Hình 15-6 Mức đa dạng của BCMV ở Việt Nam (đƣợc in đậm). 157

11

Hình 15-7 Bệnh khảm lá do BCMV trên cây họ đậu Việt Nam (ảnh trái:đậu đen, ảnh giữa: muồng 3 lá, Hà Viết

Cƣờng et al., 2008) và triệu chứng chết hoại gân của bệnh ―thối đen‖ (CABI, 2006). 158 Hình 15-8 Bệnh khảm lá do SCMV trên mía (trái), ngô (giữa) và hoàng tinh (phải) tại Việt Nam 161 Hình 15-9 Phân tích phả hệ dựa trên gen CP của các mẫu SCMV và SrMV thu tại Việt Nam (đƣợc in đậm) với các

mẫu thế giới. 162 Hình 15-10 Các potyvirus trên hành ta và tỏi tây ở Việt Nam 163 Hình 15-11 TuMV trên cây cải củ (hàng trên) và cải bẹ (hàng dƣới) ở Việt Nam 164 Hình 15-12 Phân tích phả hệ các mẫu TuMV từ Việt Nam (in đậm) và thế giới dựa trên gen CP 165 Hình 15-13 Bệnh do DsMV trên cây họ Ráy 166 Hình 15-14 Triệu chứng bệnh do SPFMV trên khoai lang Việt Nam 167 Hình 15-15 Cây phả hệ dựa trên gen CP của các mẫu SPFMV Việt Nam và các mẫu thế giới 167 Hình 15-16 Triệu chứng do ZYMV trên cây bí ngồi (Desbiez & Lecoq, 1997) 168 Hình 15-17 Cây phả hệ của các mẫu ZYMV Việt Nam và thế giới dựa trên gen CP 169 Hình 15-18 Bệnh do ChiVMV trên ớt và thuốc lá 170 Hình 16-1 Cấu tạo và tổ chức bộ gen của rhabdovirus hại thực vật 174 Hình 16-2 Sơ đồ tổ chức bộ gen của RYSV 176 Hinh 16-3 Bệnh vàng lụi lúa tại miền Bắc năm 2010 do RYSV 176 Hình 17-1 Hình thái và cấu trúc phân tử TSWV 180 Hình 17-2 Sơ đồ quá trình tái sinh của TSWV 181 Hình 17-3 Một số bệnh do TSWV gây ra trên cà chua, thuốc lá và lạc 182 Hình 18-1 Cấu trúc của một số reovirus đại diện 185 Hình 18-2 Sơ đồ virion của RRSV (hàng trên) và ảnh EM (hàng dƣới) cho thấy virion hình cầu với mấu gai (trái)

và 2 lớp vỏ (phải), thanh bar 50 nm (Shikita, 1979; Milne, 1982) 186 Hình 18-3 Tổ chức bộ gen của RRSV 187 Hình 18-4 Một số triệu chứng điển hình của bệnh lúa lùn xoắn lá do RRSV (3 hình đầu, Hà Viết Cƣờng, 2009).

Hình ngoài cùng bên phải là một phần tế bào chất của tế bào nhu mô mạch phloem tại vị trí nốt phồng với

―viroplasm‖ màu đậm chứa đầy các phân tử virus (Hibino, 1979) 188 Hình 18-5. Thể vùi virus và phân tử virus SRBSDV trong tế bào cây bị bệnh lùn sọc đen tại Việt Nam năm 2009 190 Hình 18-6. Triệu chứng bệnh LSĐ trên lúa ở miền Bắc vụ mùa năm 2009. Lá lúa bị xoắn vặn (a, b, c), trỗ không

thoát với hạt bị bị biến màu nâu (a). Có các nốt phồng màu trắng chạy dọc gân của lá (d), phiến lá (d), thân

(e). Các nốt phồng lúc đầu trắng sau chuyển màu nâu đến đen (e, f). 191 Hình 18-7. Triệu chứng bệnh LSĐ trên ngô ở miền Bắc năm 2010. 191 Hình 19-1 Phân tử virus RGSV có dạng tràng hạt khép vòng (Hibino, 1986) 195 Hình 19-2 Tổ chức bộ gen của RGSV 195 Hình 19-3 Triệu chứng bệnh lúa cỏ do RGSV tại Cần Thơ 196 Hình 20-1 Tế bào phytoplasma trong tế bào mạch rây ký chủ (Lee et al., 2000) 198 Hình 20-2 Triệu chứng chổi phù thủy và rễ tóc do Ca. Phytoplasma asteris gây ra trên cà rốt, tre 200 Hình 21-1 Cấu trúc viroid. A) hình dạng chung của viroid. B) phân tử viroid dƣới kính hiển vi điện tử. C) cấu trúc

dạng hình gậy của các pospiviroid. D) cấu trúc dạng gần hình gậy của các avsunviroid. 203 Hình 21-2 Sơ đồ tái sinh của viroid (Daros et al., 2006) 205 Hình 21-3 Bệnh củ khoai tây hình thoi 205

12

PHẦN I: ĐẠI CƢƠNG

13

Chuơng 1. GIỚI THIỆU

1.1 TÓM TẮT NỘI DUNG

Nội dung chính của chƣơng là giới thiệu lịch sử nghiên cứu virus, các cột mốc khoa học chủ

chốt liên quan đến virus và bản chất cũng nhƣ nguồn gốc của virus.

1.2 LỊCH SỬ VIRUS

Cho tới cuối thế kỷ 19, khoa học vẫn chƣa biết tới virus. Tuy nhiên, văn học đã mô tả nhiều

triệu chứng giống bệnh virus trên thực vật. Tài liệu cổ nhất là một bài thơ tiếng Nhật thời hoàng

đế Koken (năm 752 sau Công nguyên) mô tả hiện tƣợng vàng lá trên một cây cỏ dại, sau này

đƣợc xác định là cây bội lan (Eupatorium lindleyanum). Ngày nay, các nhà khoa học biết rằng

cây này mẫn cảm với nhiều virus thực vật thuộc chi Begomovirus (chẳng hạn Eupatorium yellow

vein virus, EYVV). Các begomovirus gây hiện tƣợng vàng gân và cuối cùng vàng lá trên cây bội

lan.

Ở Tây Âu, vào những năm 1600 -1660, nhiều tác phẩm nghệ thuật đã thể hiện bông hoa tulip

với triệu chứng khảm sọc rất đẹp. Một củ hoa tulip với triệu chứng khảm sọc rất có giá thời đó;

chẳng hạn củ của một giống hiếm nhƣ Semper Augustus có thể bán đƣợc 3000 guine (tiền Hà

Lan). Để so sánh, giá một con bò là 120 guine và một con tàu là 500 guine. Hiện tƣợng khảm

sọc hoa tuilip ngày nay đã đƣợc chứng minh là do một số virus thực vật, điển hình là Tulip

breaking virus (TBV) gây ra.

Hình 1-1 Triệu chứng bệnh virus trên hoa tulip. Ảnh trái, một bức tranh thế kỷ 17. Ảnh phải, hoa

tulip bị nhiễm TBV (Lesnaw & Ghabrial, 2000).

Vào cuối thế kỷ 19, kiến thức về bệnh vi khuẩn đã tích lũy khá nhiều và một thiết bị lọc vi

khuẩn đã đƣợc Chamberland (một trợ lý của Louis Pasteur) chế tạo. Thiết bị lọc này – cấu tạo

bằng sứ, có hình nến – đƣợc gọi là nến lọc Chamberland không cho phép các vi sinh vật có kích

thƣớc vi khuẩn đi qua. Năm 1882, Adolph Mayer đã mô tả một bệnh bí ẩn trên cây thuốc lá mà

ông gọi là bệnh khảm. Năm 1886, Mayer đã chứng tỏ rằng bệnh khảm thuốc lá có thể lan truyền

qua dịch cây và ông cho rằng tác nhân gây bệnh có lẽ là vi khuẩn. Năm 1892, Iwanowski đã

chứng minh rằng tác nhân gây bệnh khảm thuốc lá có thể truyền qua nến lọc vi khuẩn và ông giả

thiết rằng tác nhân gây bệnh có thể là chất độc do vi khuẩn tiết ra hoặc vi khuẩn có kích thƣớc

14

rất nhỏ để có thể qua lọc. Độc lập với Iwanowski, năm 1898, Beijerinck đã công bố kết quả

nghiên cứu thí nghiệm qua lọc với dịch cây thuốc lá bị khảm lá. Khác với Iwanowski và do

không phát hiện thấy bất cứ vi sinh vật nào, ông đã gọi tác nhân gây bệnh là contagium vivum

fluidum (tiếng Latin nghĩa là dịch sống truyền nhiễm‖ để phân biệt với các thực thể gây bệnh

dạng hạt khác. Đóng góp quan trọng của Beijerinck ở chỗ ông là ngƣời đầu tiên chứng minh sự

tồn tại của một loại tác nhân gây bệnh không phải vi khuẩn, có khả năng qua lọc, sống (nhân lên

trong cây bệnh) và hòa tan. Công trình của ông đƣợc xem là khai sinh nghành virus học và ông

đƣợc cộng đồng các nhà virus học công nhận là ―cha đẻ‖ của virus học.

Ngày nay, chúng ta biết rõ rằng tác nhân gây bệnh khảm thuốc lá là Tobacco mosaic virus

(TMV). Đây là một virus có ý nghĩa lịch sử lớn, cả trong virus học cũng nhƣ sinh học. Nhiều

phát minh quan trọng trong sinh học đều dựa trên virus này.

Hình 1-2 Ba nhà khoa học có đóng góp lớn về virus học. Từ trái sang phải: Adolf Mayer (ngƣời Hà

Lan, 1843-1942), Dimitrij Ivanovskij (ngƣời Nga, 1864-1920) và Martinus Beijerinck (ngƣời Hà

Lan, 1851-1931).

1.3 CÁC CỘT MỐC LỊCH SỬ QUAN TRỌNG KHÁC

Năm 1927, Dvorak cho thấy dịch cây nhiễm TMV và cây khỏe tạo ra kháng huyết thanh có

tính đặc hiệu khác nhau.

Năm 1935, Stanley đã kết tinh đƣợc tinh thể TMV nhƣng ông cho rằng đây là tinh thể chỉ có

bản chất protein (đoạt giải Nobel).

Năm 1936, Bawden & Pirie chứng minh đƣợc tinh thể TMV có bản chất nucleoprotein và

phân tử virus có hình gậy.

Năm 1931, Ruska & Knoll phát minh kính hiển vi điện tử.

Năm 1955-1956, Brakke phát triển kỹ thuật ly tâm gradient dùng siêu li tâm để tinh chiết

virus.

Năm 1956, Crick & Watson chứng minh vỏ protein của TMV gồm nhiều tiểu phần protein

xắp xếp theo vòng xoắn.

Năm 1977, Clack & Adam áp dụng kỹ thuật ELISA để chẩn đoán virus thực vật.

Năm 1980, Franck et al. lần đầu tiên giải mã toàn bộ bộ gen virus (Cauliflower mosaic

virus, CaMV).

15

Năm 1983, Kary Mullis phát minh kỹ thuật PCR (đoạt giải Nobel).

1.4 THUÂT NGỮ VIRUS

Về mặt lịch sử, theo từ điển Oxford English Dictionary, từ ―virus‖ đƣợc sử dụng vào thế kỷ

16 với nghĩa nọc độc đƣợc tiết ra bởi động vật độc, vào thế kỷ 18 với nghĩa bệnh lý là ―nguồn

gốc của sự ốm yếu hoặc là chất độc hình thành trong cơ thể do hậu quả của một số bệnh, đặc biệt

các bệnh có thể truyền sang ngƣời khác hoặc động vật khác‖. Cũng theo từ điển này, vào thế kỷ

19, từ ―virus‖ lại đƣợc sử dụng bởi các nhà vi khuẩn học với nghĩa vi khuẩn. Năm 1881, Paster

đã viết ―virus là ký sinh vi sinh vật, có thể nhân lên bằng nuôi cấy bên ngoài cơ thể động vật‖.

Theo nghĩa này, virus là vi khuẩn. Để phân biệt virus theo nghĩa vi khuẩn, các tác nhân gây bệnh

khảm thuốc lá và một số bệnh tƣơng tự trên động vật (ví dụ nhƣ bệnh dại) đƣợc gọi là các ―virus

qua lọc‖.

Từ 1900 – 1935, nhiều bệnh cây đƣợc cho do các virus qua lọc gây ra. Tuy nhiên, đã có nhiều

nhầm lẫn về bệnh do thiếu phƣơng pháp phân biệt virus. Chỉ tiêu ban đầu dựa vào khả năng qua

lọc. Ở một số bệnh có triệu chứng virus, mặc dù tác nhân gây bệnh không thể quan sát đƣợc

dƣới kính hiển vi (có khả năng qua lọc) nhƣng bệnh lại không truyền qua lây nhiễm cơ học. Các

bệnh này, ví dụ bệnh biến vàng cây cúc tây và củ hình thoi khoai tây, hiện đƣợc xác định là do

phytoplasma và viroid gây ra. Trong khoảng thời gian này, các nghiên cứu chủ yếu tập trung

vào mô tả bệnh, gồm triệu chứng, các biến đổi tế bào ký chủ, pham vi ký chủ và phƣơng thức

lan truyền. Cũng có một số cố gắng cải tiến lỹ thuật lọc nhằm xác định kích thƣớc virus. Các ảnh

hƣởng của nhiều tác nhân vật lý và hóa học đến sự xâm nhiễm virus cũng đƣợc nghiên cứu

nhƣng kỹ thuật khá nguyên thủy. Cho tới năm 1930, đã có rất nhiều nhầm lẫn nghiêm trọng về

bệnh virus và bản thân virus

1.5 ĐỊNH NGHĨA VIRUS

Nhờ các nghiên cứu cơ bản trong lĩnh vực sinh hóa, sinh học phân tử, di truyền, ngày nay,

bản chất virus đã đƣợc hiểu rất rõ. Có vô số khái niệm, định nghĩa nhằm giải thích thế nào là

một virus. Một trong các định nghĩa phản ánh đầy đủ bản chất virus đƣợc trình bày trong cuốn

Matthew‘s Plant Virology (Hull, 2002) là:

“Virus là các tác nhân gây bệnh không có cấu tạo tế bào, có bộ gen là acid nucleic

thƣờng đƣợc bao bọc bởi các protein vỏ, chỉ có thể tái sinh bên trong tế bào ký chủ. Quá

trình tái sinh của virus (i) phụ thuộc hoàn toàn vào bộ máy tổng hợp protein của ký chủ,

(ii) tổng hợp riêng rẽ các thành phần của virus để lắp ráp nên phân tử virus (virion) mới”.

Mặc dù các nhà virus học đồng ý rằng virus là một thực thể sinh học (và do đó thuộc đối

tƣợng nghiên cứu của sinh học) vì chúng có bộ gen, có thể tái sinh, có thể đột biến và tiến hóa

để thích nghi với điều kiện sống khác nhau thì vẫn chƣa có sự thống nhất xem liệu virus có thể

đƣợc coi là một sinh vật (organism) thực sự hay không. Hiện có 2 quan điểm khác nhau khi xét

bản chất sống của virus.

Quan điểm thứ nhất, cũng là quan điểm của Ủy ban Phân loại Virus Quốc tế (ICTV), cho

rằng virus, mặc dù có một số thuộc tính của sự sống, nhƣng không phải là một sinh vật thực sự

vì chúng vẫn thiếu một số thuộc tính cơ bản của một sinh vật sống nhƣ:

1. Virus không có khả năng thu nhận và lƣu trữ năng lƣợng tự do.

2. Virus không có chức năng sống khi ở bên ngoài tế bào ký chủ. Virus chỉ thể hiện đặc tính

của sự sống khi bộ gen của nó ở bên trong tế bào ký chủ thích hợp.

16

3. Virus không tăng trƣởng.

4. Virus không có bộ máy tổng hợp protein.

Quan điểm thứ nhất này dựa trên cơ sở cho rằng hệ thống sống đơn giản nhất là tế bào, do

vậy chỉ các sinh vật/visinh vật đơn bào hoặc đa bào mới có các đặc tính của sự sống còn các cơ

quan tử của nó thì không.

Quan điểm thứ hai coi virus là một sinh vật (chính xác là sinh vật không có cấu tạo tế bào)

dựa trên một số lập luận sau:

1. Virus có thể tái sinh.

2. Bộ gen của virus có thể bị đột biến.

3. Virus tiến hóa độc lập đối với ký chủ của chúng và có khả năng thích ứng với các ổ sinh thái

khác nhau.

4. Mặc dù virus phụ thuộc tế bào ký chủ để tái sinh (ký sinh chuyên tính) nhƣng nhiều loại tác

nhân gây bệnh khác cũng chỉ có thể sống đƣợc trong tế bào ký chủ.

5. Mặc dù virus thiếu ty thể nhƣng một số protozoa cũng thiếu.

6. Mặc dù kích thƣớc phân tử virus nhỏ nhƣng một số virus, chẳng hạn các virus thuộc nhóm

―nucleocytoplasmic large DNA viruses‖ nhƣ virus đậu mùa (pox virus) có kích thƣớc lớn

hơn vi khuẩn Chlamydia (gây bệnh viêm đƣờng tiết niệu).

7. Mặc dù virus có kích thƣớc bộ gen nhỏ nhƣng các virus thuộc nhóm ―nucleocytoplasmic

large DNA viruses‖ có kích thƣớc rất lớn. Ví dụ Acanthamoeba polyphaga mimivirus

(APMV), một virus mới đƣợc khám phá gần đây, có bộ gen lớn tới 1.2 Mb, lớn hơn bộ gen

của nhiều loài phytoplasma, riketsia và chlamydia.

8. Mặc dù virus không có hệ thống tái tạo năng lƣợng nhƣng vi khuẩn chlamydia cũng thiếu.

Lập luận chủ chốt nhất của quan điểm thứ hai là dựa vào đặc tính tái sinh của virus.

1.6 NGUỒN GỐC VIRUS

Vì đặc điểm bộ gen của virus rất đa dạng nên virus đƣợc xem là đa nguồn gốc (polythetic) và

virus DNA thì tiến hóa độc lập với virus RNA. Tuy nhiên vì chúng có một đặc điểm rất chung là

bộ gen lại đƣợc bao bọc bởi các protein vỏ nên hiện vẫn không có một quan điểm thống nhất về

nguồn gốc virus. Cho tới nay, đã có 3 giả thuyết về nguồn gốc virus.

1. Thuyết virus có trƣớc. Theo thuyết này, virus chính là dạng tồn tại hay là hóa thạch sống

của các dạng sống tiền tế bào.

Thuyết này đã bị loại bỏ từ lâu vì tất cả các virus đều là các ký sinh chuyên tính cao độ và chỉ

có thể tái sinh trong một tế bào ký chủ đang sống.

2. Thuyết suy thoái. Theo thuyết này, virus là dạng suy thoái của các sinh vật đơn bào.

Thuyết này cũng thƣờng bị phản bác vì 2 lý do:

(i) Khoa học chƣa từng khám phá ra bất kỳ một dạng trung gian nào giữa tế bào và virus.

(ii) Đối với một số dạng suy thoái từ tế bào nhƣ Mycoplasma/Phytoplasma là dạng suy thoái

của vi khuẩn, hay Microsporidia là dạng suy thoái của tế bào Eukaryote, hay Nanoarchaea là

dạng suy thoái của Archaea, thì tất cả chúng đều vẫn giữ đƣợc một số đặc trƣng của tế bào nhƣ

có ribosome cũng nhƣ bộ máy tổng hợp protein và năng lƣợng.

17

3. Thuyết trốn thoát (escape). Virus là các mảnh vật liệu di truyền của tế bào và bằng cách

nào đó thoát khỏi sự kiểm soát của tế bào và tiến hóa để trở thành các thực thể ký sinh độc lập

với bộ gen tế bào.

Thuyết này đã và đang trở nên phổ biến vì có nhiều bằng chứng ủng hộ nhƣ:

(i) Bộ gen virus có cả dạng DNA và RNA.

(ii) Một số virus có thể tổng hợp gen ký chủ vào bộ gen của nó (ví dụ begomovirus/thuốc lá).

(iii) Một số virus có thể tổng hợp vào bộ gen ký chủ (ví dụ các retrovirus, pararetrovirus).

(iv) Một số virus có đặc điểm bộ gen giống ký chủ (ví dụ geminivirus/plasmid,

potyvirus/mRNA…).

Tuy nhiên một số ý kiến khác không đồng ý khi cho rằng:

(i) Cơ chế nucleic acid của virus tiếp nhận và lắp ráp với protein vỏ vẫn không rõ.

(ii) Nếu theo thuyết này, thực khuẩn thể phải có nguồn gốc từ vi khuẩn và virus của

eukaryote phải có nguồn gốc từ eukaryote. Tuy nhiên ngƣời ta đã chứng minh một số gen thực

khuẩn thể T4 lại giống với gen của eukaryote hơn so với của vi khuẩn.

(iii) Cho tới nay, rất nhiều bộ gen của cả prokaryote lẫn eukaryote đã đƣợc giải trình tự

nhƣng phần lớn các gen virus lại chẳng giống chút nào với các gen ký chủ tƣơng ứng.

1.7 TẦM QUAN TRỌNG CỦA VIRUS THỰC VẬT

Cho tới nay (2010), hơn 2000 virus đã đƣợc phát hiện và công nhận, trong đó khoảng 1000 là

các virus gây hại thực vật. Các virus thực vật nhìn chung không làm chết cây nhƣng chúng ảnh

hƣởng nghiêm trọng đến sinh trƣởng, phát triển của cây, năng suất và chất lƣợng nông phẩm.

Nhiều trƣờng hợp, bệnh do virus gây có thể là một trong các nguyên nhân chính cản trở sản xuất

của một cây trồng nào đó. Một số ví dụ bệnh virus hại cây trồng quan trọng trên thế giới và đã

đƣợc xác định có ở Việt Nam bao gồm:

1. Bệnh xoăn vàng lá cà chua do nhiều begomovirus.

2. Bệnh chùn ngọn chuối do banana bunchytop virus (BBTV).

3. Bệnh đốm hình nhẫn đu đủ, bầu bí do papaya ring spot virus (PRSV).

4. Bệnh tàn lụi cây có múi do citrus tristeza virus (CTV).

5. Bệnh khảm lá khoai tây trên khoai tây do potato virus Y (PVY).

6. Bệnh khảm lá cây họ đậu do bean common mosaic virus virus (BCMV).

7. Bệnh tungro hại lúa nhƣ bệnh tungro do phức hợp 2 virus là rice tungro bacilliform

virus (RTBV) và rice tungro spherical virus (RTSV).

8. Bệnh vàng lùn (lúa cỏ) hại lúa do rice grasy stunt virus (RGSV).

9. Bệnh lùn xoắn lá (táp lá) hại lúa do rice ragged stunt virus (RGSV).

10. Bệnh lùn sọc đen hại lúa, ngô do southern rice black streaked dwarf virus (SRBSDV).

11. Bệnh vàng lụi (vàng tạm thời, vàng lá di động) trên lúa do rice yellow stunt virus

(RYSV).

18

1.8 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 1

1. Virus đƣợc thực sự nghiên cứu từ bao giờ, gắn với bệnh gì?

2. Virus có ý nghĩa lịch sử đối với ngành virus học là gì?

3. Các nhà khoa học đã thực hiện những nghiên cứu đầu tiên về virus học.

4. Ví dụ 3 sự kiện khoa học ảnh hƣởng lớn đến nghiên cứu virus.

5. Vi dụ 3 dụng cụ có ảnh hƣởng lớn đến nghiên cứu virus.

6. Nguồn gốc của thuật ngữ ―virus‖.

7. Virus là gì?

8. Sự khác biệt cơ bản của virus đối với các tác nhân gây bệnh có bản chất tế bào (các

prokaryote và eukaryote) và phi tế bào (prion, viroid) là gì?

9. Sự khác biệt trong tranh luận về bản chất sống của virus là gì? Đâu là sự khác biệt cơ bản

nhất?

10. Các giả thuyết về nguồn gốc virus. Với bằng chứng khoa học hiện có thì khả năng nhất

virus có nguồn gốc từ đâu?

11. Ví dụ 3 virus có tầm quan trọng lớn trong nông nghiệp thế giới.

12. Ví dụ 3 virus có tầm quan trọng lớn đối với nông nghiệp Việt Nam.

1.9 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH

1. Hull, R. (2002). Matthews's Plant Virology. Fourth edition: Academic Press.

2. Lesnaw, J. A. & Ghabrial, S. A. (2006). Tulip Breaking: Past, Present, and Future. Plant

Disease 84, 1052-1060.

3. Patrick, F. (2006). The origin of viruses and their possible roles in major evolutionary

transitions. Virus Research 117, 5-16.

4. Saunders, K., Bedford, I. D., Yahara, T. & Stanley, J. (2003). The earliest recorded

plant virus disease: Pathogenic DNA paints summer foliage gold, and inspired a poet

over a millennium ago. NATURE 422, 831.

5. van der Want, J. P. H. & Dijkstra, J. (2006). A history of plant virology. Archives of

Virology 151, 1467–1498.

19

Chƣơng 2. PHÂN LOẠI VÀ DANH PHÁP

2.1 TÓM TẮT NỘI DUNG

Nội dung chính của chƣơng là lịch sử và cơ sở khoa học của việc phân loại và đặt tên virus;

hệ thống tổ chức của cơ quan có thẩm quyền về mặt quốc tế đối với phân loại virus; cách phân

biệt khái niệm ―loài virus‖ và ―virus‖; cách viết tên virus và tên loài virus đúng; hệ thống phân

loại virus hiện nay.

2.2 PHÂN LOẠI VÀ DANH PHÁP

Phân loại học (Taxonomy =systemics): là khoa học phân loại gồm 2 nhánh là phân loại

―classification‖ và danh pháp ―nomenclature‖.

Phân loại là xắp xếp các các đơn vị phân loại ―taxon‖ vào các nhóm khác nhau theo mối

quan hệ của chúng dựa theo các tiêu chí xác định.

Danh pháp là đặt tên các đơn vị phân loại theo 1 qui tắc xác định.

Cả phân loại và danh pháp gắn liền với nhau và nhằm mục tiêu:

1. Tạo ra một sự sắp xếp có trật tự các virus sao cho con ngƣời có thể hiểu thấu đáo đƣợc

chúng.

2. Giúp con ngƣời có thể giao tiếp đƣợc với nhau về đối tƣợng virus nghiên cứu.

3. Giúp tiên đoán các đặc tính của một virus mới.

4. Bộc lộ mối quan hệ tiến hóa của các virus.

2.3 LịCH SỬ DANH PHÁP VÀ PHÂN LOẠI VIRUS

Khi virus đƣợc nghiên cứu lần đầu khoảng 1 thế kỷ trƣớc thì vào thời gian đó bản chất của

virus vẫn chƣa đƣợc biết: chúng không nuôi cấy đƣợc trên môi trƣờng nhân tạo, không quan sát

đƣợc dƣới kính hiển vi và chúng cũng không di chuyển qua màng lọc vi khuẩn. Do vậy, các nhà

virus học đầu tiên đã đặt tên loại tác nhân gây bệnh bí ẩn này bằng bệnh mà chúng gây ra gồm

tên cây ký chủ và triệu chứng đặc trƣng nhất, chẳng hạn virus khảm lá thuốc lá (tobacco mosaic

virus, TMV). Lúc này, virus đƣợc xem là một tác nhân gây bệnh ổn định có nghĩa trên một cây

ký chỉ cụ thể thì các bệnh khác nhau (dựa vào triệu chứng) sẽ do các virus khác nhau gây ra.

Tuy nhiên vào đầu những năm 1930, các nhà khoa học đã nhận thấy rằng: (1) các virus có thể

tồn tại dƣới dạng các chủng khác nhau và các chủng này có thể gây ra triệu chứng rất khác nhau

trên cùng một cây ký chủ; (2) các virus khác nhau có thể gây triệu chứng giống hệt nhau trên

cùng một cây ký chủ và (3) một bệnh trên một cây có thể do hai virus khác nhau gây ra.

Năm 1927, Johnson đề xuất rằng việc định tên một virus ngoài triệu chứng còn cần phải tính

đến các đặc điểm khác và đề nghị đặt tên virus bằng tên thông thƣờng (common name) của ký

chủ + từ virus + một số chỉ virus, ví dụ TMV đổi thành tobacco virus 1.

Năm 1935, Johnson và Hoggan đã sử dụng 5 đặc điểm sau để phân loại virus thực vật:

1. Phƣơng thức lan truyền.

2. Ký chủ tự nhiên và cây chỉ thị.

3. Thời gian tồn tại trong dịch chiết cây (longevity in vitro, LIV)

20

4. Ngƣỡng nhiệt độ mất hoạt tính (thermal death point, TDP).

5. Triệu chứng.

Dựa trên cách phân nhóm trên, khoảng 50 virus đã đƣợc xác định trong thời gian này.

Năm 1937, Smith đề xuất cách đặt tên và phân nhóm khác. Các virus đƣợc đặt tên và phân

nhóm theo tên khoa học của ký chủ mà trên đó virus đƣợc phát hiện đầu tiên. Nhƣ vậy TMV

đƣợc đổi thành Nicotiana virus 1. Theo hệ thống của Smith, có 15 virus thuộc nhóm Nicotiana

trong tổng số 51 virus. Với cách phân nhóm này, các virus rất khác nhau về nhiều đặc điểm cơ

bản lại đƣợc xếp vào cùng nhóm và do đó đây không phải là phân loại.

Năm 1939, Holmes đƣa ra một cách phân loại trong đó dựa chủ yếu vào phƣơng thức lan

truyền và phản ứng của ký chủ. Điểm mới là ông đã đƣa danh pháp ―tên kép La tinh‖ (Latin

binomial) để đặt tên virus giống nhƣ của các đối tƣợng khác trong phân loại sinh học. Theo cách

của ông, TMV trở thành Marmor tabaci (Marmor nghĩa là đá cẩm thạch theo tiếng la tinh, ám

chỉ triệu chứng khảm lá). Với hệ thống này, 53 trong tổng sô 89 virus đã đƣợc xếp vào chi

Marmor. Tƣơng tự nhƣ cách phân nhóm của Smith, nhiều virus thuộc chi Marmor có đặc điểm

cơ bản rất khác nhau.

Từ 1940 – 1970, một số hệ thống danh pháp virus dùng tên kép La tinh đã đƣợc đề xuất. Ví

dụ TMV đã từng đƣợc đặt là Musivum tabaci (1940), Phytovirus nicomosaicum (1941),

Nicotianavir communae (1942), Minchorda nicotianae (1957), Protovirus tabaci (1966),

Vironicotum maculans (1968), Virothrix iwanowskii (1970). Tuy nhiên việc sử dụng tên la tinh

cho virus đã bị phản đối trong thời gian dài, đặc biệt là từ các nhà virus học thực vật, vốn đi

trƣớc các nhà virus học động vật trong vấn đề phân loại virus. Lý do là họ không chấp nhận khái

niệm ―loài, species‖ đối với virus. Họ cho rằng khái niệm ―loài‖ đƣợc chấp nhận duy nhất là

―loài sinh học‖ đƣợc áp dụng cho các đối tƣợng có chung bể gen (gene pool) và biệt lập về sinh

sản. Ngoài ra theo họ, nếu chấp nhận một khái niệm loài đối với virus thì chắc chắn sẽ dẫn tới

việc la tinh hóa tên virus.

Nhƣ vậy, có thể thấy các cách phân loại và đặt tên virus ở trên chủ yếu dựa vào bệnh

chứ không phải dựa vào virus.

2.4 ỦY BAN PHÂN LOẠI VIRUS QUỐC TẾ (ICTV)

Năm 1966 tại Hội nghị Vi sinh vật học Quốc tế tổ chức tại Moscow, một Ủy ban Danh pháp

Virus Quốc tế (International Committee for the Nomenclature of Viruses) đã đƣợc thành lập với

nhiệm vụ phát triển một hệ thống phân loại và danh pháp đƣợc chấp nhận về mặt quốc tế và

thống nhất cho tất cả các loại virus.

Vào năm 1973, Ủy ban này đổi tên thành Ủy ban Phân loại Virus Quốc tế (International

Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV).

Về mặt tổ chức, hiện nay, ICTV gồm khoảng 500 nhà virus hàng đầu trên thế giới, chia thành

5 ―tiểu ban‖ (subcommittee) chuyên môn (hình 2-1) là:

1. Virus hại động vật có xƣơng sống.

2. Virus hại động vật không xƣơng sống.

3. Virus hại thực vật.

4. Virus nhiễm vi khuẩn (thực khuẩn thể).

5. Virus hại nấm.

21

6. Một tiểu ban cơ sở dữ liệu.

Các tiểu ban chuyên môn lại bao gồm các ―nhóm nghiên cứu‖ (study-group), mỗi nhóm chịu

trách nhiệm đối với 1 họ virus hoặc 1 nhóm virus chƣa phân loại.

Cho tới nay, ICTV đã công bố 7 báo cáo trình bày hệ thống phân loại và danh pháp của tất cả

các đối tƣợng virus trên thế giới vào các năm 1971, 1976, 1979, 1982, 1991, 1995, 2000 và

2005.

Báo cáo lần thứ 7 (năm 2000) đã chính thức đƣa ra khái niệm ―loài‖ virus và qui định cách

viết tên loài. Báo cáo cũng liệt kê 1550 loài, 233 chi và 56 họ.

Báo cáo lần thứ 8 (năm 2005) đã phê chuẩn 3 bộ, 73 họ, 287 chi và hơn 5450 virus thuộc >

1950 loài.

Việc bổ sung và sửa đổi các vị trí phân loại đƣợc thực hiện thƣờng xuyên tại ICTV. ICTV chỉ

chịu trách nhiệm phân loại ở 4 mức là: bộ (order), họ (family), họ phụ (subfamily), chi (genus)

và loài (species). Đơn vị phân loại cơ bản là loài và không nhất thiết phải sử dụng cả 4 mức phân

loại. Phần lớn các loài đã đƣợc phân loại tới mức chi và phần lớn các chi đã đƣợc phân loại tới

mức họ. Chỉ một số họ đã đƣợc phân loại tới mức bộ. Theo báo cáo lần thứ 8 của ICTV, chỉ có 3

bộ đƣợc ghi nhận trong đó có một bộ bao gồm cả virus thực vật là bộ Monovirales. Ngoài ra

nhiều loài hiện mới chỉ đƣợc phân loại tới mức chi.

Ví dụ loài đã đƣợc phân loại tới mức bộ là:

Bộ Monovirales

Họ Rhabdoviridae

Chi Cyorhabdovirus

Loài Lettuce necrotic yellows virus

Ví dụ loài đã đƣợc phân loại tới mức họ là:

Họ Caulimoviridae

Chi Tungrovirus

Loài Rice tungro bacilliform virus

Ví dụ loài đã đƣợc phân loại tới mức chi là:

Chi Tenuivirus

Loài Rice grassy stunt virus

ICTV không có trách nhiệm trong phân loại và định tên các mức phân loại dƣới loài nhƣ

serotype, genotype, strain, variant và isolate. Việc phân loại ở mức dƣới loài là do các tác giả

nghiên cứu tự quyết định. ICTV cũng không có trách nhiệm phân loại và định tên các virus đƣợc

tạo ra bằng con đƣờng nhân tạo. Cần phải hiểu rõ rằng trong sinh học, đơn vị phân loại cơ bản

chính thức thấp nhất là loài (species) còn các mức phân loại dƣới loài nhƣ serotype, genotype,

strain, variant và isolate là các đơn vi phân loại không chính thức và không tƣơng đƣơng nhau

giữa các đối tƣợng nghiên cứu.

22

2.5 DANH PHÁP VIRUS HIỆN TẠI THEO ICTV

Tên virus. Tên virus thƣờng do các tác giả đặt theo trật tự sau: tên ký chủ đầu tiên virus đƣợc

phát hiện + triệu chứng điển hình + từ virus.

Cần chú ý là tên virus chính là tên thông thƣờng (common name) nên hiển nhiên là khác nhau

giữa các nƣớc. Tuy nhiên chúng ta thƣờng quen với tên thông thƣờng tiếng Anh, chẳng hạn nhƣ

tobacco mosaic virus. Do vậy, các tác giả phát hiện virus thƣờng đặt tên tiếng Anh cho virus.

Mặc dù ICTV không chính thức can thiệp vào việc đặt tên nhƣng trong một số trƣờng hợp

đặc biệt khi có rất nhiều virus thuộc các loài khác nhau cùng đƣợc phát hiện đầu tiên trên một

cây ký chủ với triệu chứng giống nhau thì các ―nhóm nghiên cứu‖ có thể hƣớng dẫn cách đặt

tên, chẳng hạn thêm tên địa phƣơng vào tên virus.

Ví dụ: Tomato yellow leaf curl Vietnam virus (TYLCVNV), tomato leaf curl Vietnam virus

(ToLCVV). Đây là 2 virus thuộc chi Begomovirus và gây bệnh xoăn vàng lá cà chua ở Việt

Nam.

Tên loài virus. Tên loài virus là tên virus tiếng Anh đƣợc viết (in) nghiêng. Ký tự đầu tiên

của tên loài phải viết hoa (không kể chữ hoa chỉ danh từ riêng nếu có trong tên loài). Tên loài

không chứa tên tác giả hoặc tên ngƣời. Danh pháp tên loài virus là danh pháp tên đơn

―monomial‖.

Ví dụ cách đặt tên loài virus:

Tên virus tiếng Anh là tobacco mosaic virus => tên loài là Tobacco mosaic virus

Tên virus tiếng Anh là tomato leaf curl Vietnam virus => tên loài là Tomato leaf curl

Vietnam virus

Một số điểm chú ý về tên loài:

Mặc dù tên loài là tên đơn nhƣng thƣờng gồm nhiều từ, ví dụ Tobacco mosaic virus.

Vì tên loài virus là tên virus tiếng Anh đƣợc viết (in) nghiêng nên dễ gây nhầm lẫn và đặc

biệt là không có sự khác nhau trong cách đọc. Để tạo ra sự khác nhau giữa tên virus và tên

loài virus, danh pháp ―tên kép‖ (binomial) tiếng Anh đã đƣợc đề xuất, chẳng hạn Tobacco

mosaic tobamovirus (trong đó từ tobamovirus là tên chi). Một ƣu điểm nữa của danh pháp

này là thông tin về chi đã đƣợc thêm vào tên loài (giống nhƣ tên loài của các đối tƣợng sinh

vật khác). Danh pháp tên kép đã đƣợc sự ủng hộ và sử dụng rộng rãi trong cộng đồng các

nhà virus thực vật. Một đề xuất chính thức đã đƣợc gửi lên ICTV vào năm 1998. Tuy nhiên

ICTV đã không chính thức công nhận danh pháp này vì 3 lý do: (1) nhiều nhà virus động vật

không ủng hộ do khi áp dụng danh pháp tên kép sang virus động vật đã tạo ra nhiều tên loài

rất dài và chứa nhiều từ trùng lặp chẳng hạn Human varicella-zoster varicellovirus hay

Influenza A influenzavirus A, (2) một số nhà virus học, những ngƣời cho rằng virus không

phải là sinh vật thực sự, phản đối vì theo họ danh pháp tên kép phải dùng tên La tinh, và (3)

tại thời điểm đó, việc thay đổi vị trí phân loại ở mức chi đã xảy ra khá phổ biến đối với nhiều

virus. Mới đây, vào năm 2002, ICTV đã tổ chức thăm dò ý kiến 250 nhà virus học hàng đầu

thế giới. Kết quả cho thấy 85 % đã ủng hộ cách sử dụng danh pháp tên kép tiếng Anh. Hiện

nay, ICTV đang xây dựng các qui định để chuyển sang sử dụng hệ thống danh pháp này.

Trong văn bản khoa học (luận văn, bài báo), tên loài chỉ xuất hiện một lần. Các thứ bậc phân

loại chính thức phải đƣợc viết (in) nghiêng và ký tự đầu tiên phải viết hoa, ví dụ: loài

Tobacco mosaic virus, chi Tobamovirus.

23

Về viết tắt. Vì tên virus thƣờng dài nên trong quá trình viết và nói, ngƣời ta hay dùng tên viết

tắt của virus, chẳng hạn TMV (tobacco mosaic virus), CMV (cucumber mosaic virus). Tên

loài virus thƣờng không cần viết tắt vì tên loài đầy đủ thƣờng chỉ xuất hiện 1 lần trong văn

bản khoa học (luận văn, bài báo).

2.6 PHÂN BIỆT VIRUS VÀ LOÀI VIRUS

Virus là thực thể cụ thể (tồn tại trong không gian và thời gian) => có thể thao tác với virus,

chẳng hạn tinh chiết, lây nhiễm…một virus.

Loài virus là khái niệm trừu tƣợng (chỉ tồn tại trong trí óc con ngƣời) => không thể thao tác

với ―loài virus‖.

Nhƣ vậy có thể thấy chỉ virus mới gây ra bệnh còn loài virus thì không gây bệnh.

2.7 KHÁI NIỆM LOÀI VIRUS

Trong sinh học, loài là đơn vị phân loại cơ bản thấp nhất. Hiện có 22 định nghĩa loài khác

nhau đƣợc đề xuất (Mayden, 1997) nhƣng chẳng có định nghĩa nào có thể áp dụng cho tất cả các

đối tƣợng. Một trong những khó khăn là thuật ngữ đƣợc sử dụng theo nhiều cách khác nhau và

không phải luôn đƣợc phân biệt rõ ràng. Một số định nghĩa chính là:

Loài kiểu hình. Định nghĩa loài kiểu hình, về măt lịch sử, có từ thời Hy Lạp cổ đại. Aristot

đã chia sinh giới tự nhiên thành các nhóm sinh vật rời rạc. Về sau, Linneaus đã củng cố khái

niệm này và xây dựng danh pháp tên kép (binomial). Một ví dụ của khái niệm loài kiều hình là:

―một loài là một nhóm các sinh vật tƣơng tự nhau và khác các nhóm khác‖ (Ridley, 1993). Định

nghĩa này hiện vẫn có ích trong phân loại, đặc biệt đối với thực vật.

Loài sinh học. Khái niệm loài nổi tiếng nhất do Mayr xây dựng lần đầu vào năm 1963: ―Loài

là các nhóm quần thể giao phối tự nhiên biệt lập về sinh sản với các loài khác‖. Định nghĩa này

đã bị chỉ trích vì nó chỉ có thể áp dụng cho các sinh vật sinh sản hữu tính. Năm 1982, Mayr đã

biến đổi định nghĩa này nhƣ sau ―Một loài là một cộng đồng các quần thể sinh sản (biệt lập) và

chiếm một ổ sinh thái tự nhiên‖. Khái niệm của Mayr còn đƣợc gọi là loài biệt lập, thƣờng đƣợc

áp dụng cho động vật nhƣng khó áp dụng cho các đối tƣợng khác.

Loài tiến hóa. Dựa trên lý thuyết tiến hóa, nhiều tác giả đƣa ra khái niệm loài tiến hóa: ―Một

loài tiến hóa là một dòng các quần thể có quan hệ tổ tiên – con cháu, khác với các dòng khác và

có xu hƣớng tiến hóa cũng nhƣ số phận lịch sử riêng‖ (Wiley, 1981). Bằng cách thêm ý tƣởng tổ

tiên – con cháu, khái niệm này đã bổ sung sự gắn kết nội tại giữa các thành viên trong cùng loài

mà sự gắn kết này không có ở các khái niệm loài dựa trên kiểu hình thuần túy.

Nhƣ vậy, không có một khái niệm loài nào có thể áp dụng cho tất cả các đối tƣợng sinh học.

Đối với một đối tƣợng, cần phải biến đổi các khái niệm hiện có. Ví dụ, một khái niệm loài tiến

hóa mới đƣợc đề xuất gần đây đối với vi sinh vật tiền nhân là ― Một nhóm các sinh vật đơn hình,

gắn kết về di truyền, có mức độ tƣơng đồng cao về về nhiều đặc điểm độc lập và có thể chẩn

đoán đƣợc nhờ một đặc tính kiểu hình rõ ràng‖ (Rosselló-Mora & Amann, 2001).

Định nghĩa loài virus. ICTV, nhƣ trình bày trong Báo cáo lần thứ 7 (2000), đã chấp nhận

định nghĩa loài áp dụng cho virus do Van Regenmorten đề xuất năm 1991: ―Một loài virus là

một lớp đa hình các virus tạo thành một dòng tái sinh và chiếm một ổ sinh thái đặc biệt‖ - ―A

virus species is a polythetic class of viruses that constitute a replicating lineage and occupy a

particular ecological niche‖

24

Một số thuật ngữ cần đƣợc giải thích:

1. Lớp (class). ―Lớp‖ trong định nghĩa này không phải là ―lớp‖ theo nghĩa thứ bậc phân loại

kiểu ―bộ-họ-lớp‖. Lớp ở đây cần đƣợc hiểu là một khái niệm trừu tƣợng chỉ tập hợp các

thực thể cùng chia sẻ một thuộc tính chung. Nếu một virus có bộ gen RNA sợi dƣơng, nó tự

động là thành viên của lớp các virus RNA sợi dƣơng. Đây đƣợc gọi là lớp chung vì nó đƣợc

xác định bởi một đặc tính chung hoặc một tập hợp các đặc tính có mặt ở tất cả các thành viên

của lớp.

2. Lớp đa hình. Lớp đa hình là một lớp mà các thành viên của nó có nhiều đặc điểm chung mặc

dù không có đặc điểm riêng biệt nào có mặt trong tất cả các thành viên của nó. Hậu quả là

không một đặc điểm duy nhất nào có thể đƣợc sử dụng làm chỉ tiêu phân biệt loài. Ví dụ,

một phản ứng ký chủ đặc biệt hoặc một mức độ tƣơng đồng chuỗi gen nào đó không thể

đƣợc sử dụng nhƣ là một chỉ tiêu tuyệt đối để phân biệt 2 loài virus của cùng một chi. Loài

không phải là một lớp chung có thế đƣợc xác định bởi một đặc tính riêng lẻ, do vậy chúng

khác các thứ bậc phân loại cao hơn, chẳng hạn chi và họ – là 2 khái niệm phân loại thuộc lớp

chung – bao gồm các thành viên cùng chia sẻ một hoặc vài các đặc tính chung cần và đủ để

phân biệt mối quan hệ.

Hình 2-1 Sơ đồ minh họa 5 thành viên của 1 lớp đa hình có 5 đặc điểm (Van Regenmortel, 2007)

3. Dòng tái sinh. Khái niệm này chỉ ra rằng các thành viên của cùng loài có cùng chung nguồn

gốc. Cũng cần chú ý rằng, chia sẻ chung nguồn gốc cũng là đặc điểm liên kết các thành viên

của cùng thứ bậc phân loại cao hơn, chẳng hạn chẳng hạn chi và họ. Các thành viên của loài

trải qua biến dị liên tục theo thời gian thông qua tái sinh bộ gen. Các biến dị tích luỹ và đạt

tới điểm mà các sai khác về kiểu hình và kiểu gen đủ để phán xét một thành viên của loài trở

thành một loài khác.

4. Ổ sinh thái. Khái niệm này chỉ ra các đặc trƣng sinh học của virus bao gồm phạm vi ký chủ,

quan hệ vector, tính gây bệnh, tính độc, tính hƣớng mô, môi trƣờng sống.

Khái niệm loài virus có một khác biệt cơ bản so với nhiều khái niêm loài khác là ở chỗ: các

khái niệm loài khác, điển hình là loài biệt lập, đƣợc xây dựng trên cơ sở cho rằng loài là một

khái niệm cụ thể, chỉ một thực thể khách quan, tồn tại độc lập với ý muốn con ngƣời; trái lại,

loài virus là một khái niêm trừu tƣợng, do con ngƣời tạo ra. Khác biệt này đã và đang là chủ đề

tranh luận nóng bỏng trong phân loại học.

2.8 CÁC CHỈ TIÊU PHÂN LOẠI VIRUS

Việc chấp nhận khái niệm loài virus bởi các nhà virus học quốc tế là một bƣớc quan trọng

nhằm thiết lập một hệ thống phân loại virus thống nhất nhƣng khái niệm này ít có giá trị trong

việc phân biệt liệu một mẫu virus cụ thể nào đó có là thành viên của một loài virus đƣợc xác

định trƣớc hay không. Lý do là ngƣời ta có thể định nghĩa các khái niệm trừu nhƣ loài nhƣng

không thể định nghĩa một mẫu virus cụ thể. Một mẫu virus chỉ có thể đƣợc đặt tên và xác định

bằng các đặc điểm chẩn đoán. Vì loài là một lớp đa hình, việc xác định này đƣợc dựa trên một

25

số các tiêu chí khác nhau qui định mức độ quan hệ của một mẫu virus với một loài đã đƣợc xác

định trƣớc (các đặc điểm chẩn đoán), thay vì chỉ vì dựa vào một chỉ tiêu đơn lẻ.

Để phân biệt ở mức loài, không cần thiết dùng các đặc điểm có mặt ở tất cả các thành viên

của chi hoặc họ, chẳng hạn nhƣ hình thái virion, tổ chức bộ gen, phƣơng thức tái sinh, số lƣợng

và kích thƣớc các protein cấu trúc và phi cấu trúc. Các chỉ tiêu dƣới đây (mà tầm quan trọng

thay đổi theo chi) thƣờng đƣợc áp dụng để phân biệt các mẫu virus ở mức loài.

1. Đặc điểm virion

1. Đặc điểm hình thái (hình dạng; kích thƣớc; có hoặc không có vỏ bọc; cấu trúc các đơn vị

hình thái capsomer)

2. Đặc tính vật lý (khối lƣợng phân tử; tỷ trọng; hệ số sa lắng; tính ổn định đối với pH,

nhiệt độ, cation, dung môi, bức xạ)

3. Đặc điểm bộ gen (loại acid nucleic (DNA hay RNA); loại sợi (đơn hay kép, mạch thẳng

hay mạch vòng); loại cực (âm, dƣơng hay lƣỡng cực); số phân đoạn (phân tử) của bộ

gen; đặc điểm đầu 5‘ và đầu 3‘; so sánh trình tự.

4. Đặc điểm protein (số lƣợng; kích thƣớc; chức năng; so sánh chuỗi)

5. Đặc điểm lipid (có hay không có; bản chất)

6. Đặc điểm carbonhydrate (có hay không có; bản chất)

2. Tổ chức bộ gen và phƣơng thức tái sinh

1. Tổ chức bộ gen.

2. Phƣơng thức tái sinh.

3. Đặc điểm phiên mã.

4. Đặc điểm dịch mã và xử lý hậu dịch mã.

5. Vị trí tích lũy protein virus, lắp ráp virion, thành thục và giải phóng virion.

6. Tế bào học, hình thành thể vùi.

3. Đặc điểm kháng nguyên

1. Quan hệ huyết thanh.

2. Bản đồ epitope.

4. Đặc điểm sinh học

1. Phạm vi ký chủ (tự nhiên và thực nghiệm).

2. Tính gây bệnh.

3. Tính hƣớng mô, bệnh học, mô học.

4. Phƣơng thức lan truyền ngoài tự nhiên.

5. Quan hệ vector.

6. Phân bố địa lý.

Ngay khi một loài đã đƣợc thiết lập trên cơ sở một tổ hợp các đặc điểm, ngƣời ta có thể xác

định một mẫu virus có là thành viên của loài đó không bằng cách đánh giá chỉ một vài đặc điểm

chẩn đoán. Ví dụ, nếu chuỗi gen của một mẫu là 99,9 % đồng nhất với một thành viên đã biết

của một loài thì mẫu đó là thành viên của loài đó.

26

2.9 HỆ THỐNG PHÂN LOẠI VIRUS HIỆN TẠI THEO ICTV

Hệ thống phân loại virus hiện nay là một hệ thống phân loại sinh học, đƣợc tổ chức thành

các thứ bậc phân loại khác nhau với các hậu tố qui định nhƣ sau:

Bộ (- virales)

Họ (- viridae)

Phân họ (- virinae)

Chi (- virus)

Loài (- virus)

Hiện nay (2009), ICTV đã phê chuẩn 2.288 loài virus đƣợc xếp vào 348 chi. Tuy nhiên,

không phải tất cả các loài đã đƣợc phân loại tới bộ. Trong tổng số loài, chỉ 549 loài (24%) đã

đƣợc phân loại đến bộ (6 bộ gồm 22 họ), còn lại 1739 loài (76%) mới chỉ đƣợc phân loại đến họ

(65 họ).

Đối với virus thực vật, hiện có khoảng ~ 1000 loài, trong đó khoảng 80 % là các virus RNA,

gồm đủ các nhóm đƣợc minh họa tóm tắt ở hình 2.2.

Bảng 2-1 Các bộ, họ virus theo phân loại của ICTV (dựa trên số liệu 2009)

Bộ Số họ Đặc điểm chính Ví dụ loài

Caudovirales 3 DNA sợi kép (thực khuẩn thể)

Enterobacteria phage T4

Herpesvirales 3 DNA, sợi kép Human herpesvirus 1

Mononegavirales 4 RNA, sợi đơn, cực âm, không phân mảnh, hại cả

động vật, thực vật

Measles virus

Rice yellow stunt virus

Nidovirales 3 RNA, sợi đơn, cực +, hại

động vật

Porcine reproductive and respiratory

syndrome virus

Picornavirales 5 RNA, sợi đơn, cực +, hại động vật, thực vật, côn

trùng

Hepatitis A virus

Sacbrood virus

Rice tungro spherical virus

Tymovirales 4 RNA, sợi đơn, cực +, hại thực vật

Potato virus X

Các virus không đƣợc xếp thành bộ

65 Rất đa dạng về đặc điểm bộ gen và ký chủ

Human immunodeficiency virus 1

Hepatitis B virus

White spot syndrome virus

Influenza A virus

Papaya ring spot virus

Tomato leaf curl Vietnam virus

Tham khảo website của ICTV (http://www.ictvonline.org) và Viralzone

(http://expasy.org/viralzone) để cập nhật hệ thống phân loại virus.

27

Hình 2-2 Minh họa phân loại các chi, họ virus thực vật theo báo cáo lần thứ 8 (2005) của ICTV

28

2.10 HỆ THỐNG PHÂN LOẠI VIRUS THEO BALTIMORE

Để đơn giản hóa phân loại virus, một hệ thống phân loại virus khác cũng thƣờng đƣợc sử

dụng gọi là hệ thống phân loại Baltimore. Hệ thống này do David Baltimore (giải Nobel 1975)

đề xuất năm 1974. Baltimore phân loại các virus thành 7 nhóm dựa trên đặc điểm bộ gen và cơ

chế tái sinh (Bảng 2.2, Hình 2.3).

Bảng 2-2 Hệ thống phân loại virus theo Baltimore

Nhóm Đặc điểm bộ gen Ví dụ virus thực vật

I DNA, sợi kép Các begomovirus

II DNA, sợi đơn Banana bunchy top virus

III RNA, sợi kép Rice ragged stunt virus

IV RNA, sợi đơn, cực (+) Papaya ring spot virus

V RNA, sợi đơn, cực (-) Rice yellow stunt virus

VI RNA, sợi đơn, cực (+), tái sinh qua trung gian DNA (Retrovirus)

Glycine max SIRE1 virus

VII DNA, sợi kép, tái sinh qua trung gian RNA

(Pararetrovirus) Rice tungro bacilliform virus

Hình 2-3 Sơ đồ phân loại virus theo Baltimore (http://expasy.org/viralzone/all_by_protein/230.html)

29

2.11 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 2

1. Bản chất phân loại virus trƣớc những năm 1970. Lấy 2-3 ví dụ minh chứng.

2. Lịch sử hình thành, tổ chức và vai trò của ICTV.

3. Phân biệt 2 khái niệm ―virus‖ và ―loài virus‖.

4. Danh pháp virus hiện tại theo ICTV (tên virus, tên loài virus, các điểm chú ý; phân biệt

virus và loài virus). Lấy ví dụ 3 tên virus và tên loài virus tƣơng ứng.

5. Các cơ sở phân loại virus hiện tại. Đặc điểm nào quan trọng nhất?

6. Hệ thống phân loại virus hiện tại theo ICTV?

7. Số lƣợng loài virus (toàn bộ) đƣợc ghi nhận hiện tại. Mỗi nhóm virus động vật, virus

thực vật và thực khuẩn thể chiểm khoảng bao nhiêu phần trăm tổng số lƣợng loài?

8. Hệ thống phân loại virus thực vật hiện tại.

9. Đặc điểm chung nhất của các nhóm virus thực vật chính (DNA sợi đơn, DNA sợi kép

(phien mã ngƣợc), RNA sợi đơn cực (+), RNA sợi đơn cực (-), RNA phiên mã ngƣợc,

RNA sợi kép). Các ví dụ dại diện cho các nhóm virus chính (mức họ, mức chi, mức

loài).

10. Hệ thống phân loại Baltimor (số nhóm, đặc điểm nhóm, ví dụ). Ƣu nhƣợc điểm của hệ

thống này.

2.12 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH

1. Hull, R. 2002. Matthews‘ Plant Virology. Fourth edition

2. Mayden, R.L. (1997). A hierarchy of species concepts: the denouement in the saga of

the species problem. In: M.F. Claridge, H.A. Dawah and M.R. Wilson (eds) ―Species:

The Units of Biodiversity‖. Chapman and Hall, London, 381–424.

3. Mayr, E. (ed) (1963). Animal Species and Evolution. Harvard University Press,

Cambridge, Mass.

4. Mayr, E. (ed) (1982). The Growth of Biological Thought. ―Diversity, Evolution, and

Inheritance‖. Harvard University Press, Cambridge, Mass.

5. Rosselló-Mora, R. and Amann, R. (2001). The species concept for prokaryotes. FEMS

Microbiology Reviews. 25, 39-67

6. Ridley, M. (1993). Evolution. Blackwell Scientific Publications. Boston, MA.

7. Van Regenmortel, M.H.V. (1990).Virus species, a much overlooked but essential

concept in virus classification. Intervirology. 31, 241–254

8. Wiley, E.O. (ed.) (1981). ―Phylogenetics: The Theory and Practice of Phylogenetic

Systematics‖. Willey, New York.

9. Van Regenmortel, M.H.V., 2001. Perspectives on binomial names of virus species.

Arch. Virol. 146, 1637–1640.

10. Van Regenmortel, M.H.V., 2003. Viruses are real, virus species are man-made

taxonomic constructions. Arch. Virol. 148, 2481–2488.

30

11. Van Regenmortel, M.H.V., 2006. Virologists, taxonomy and the demands of logic.

Arch. Virol. 151, in press.

12. Van Regenmortel, M.H.V., 2007. Virus species and virus identification: Past and

current controversies. Infection, Genetics and Evolution .7: 133–144

13. Van Regenmortel, M.H.V., Fauquet, C.M., 2002. Only italicized species names of

viruses have a taxonomic meaning. Arch. Virol. 147, 2247–2250.

14. Van Regenmortel, M.H.V., Mahy, B.W.J., 2004. Emerging issues in virus taxonomy.

Emerg. Infect. Dis. 10, 8–13.

15. Van Regenmortel, M.H.V., Maniloff, J., Calisher, C.H., 1991. The concept of virus

species. Arch. Virol. 120, 313–314.

16. Van Regenmortel, M.H.V., Bishop, D.H.L., Fauquet, C.M., Mayo, M.A., Maniloff, J.,

Calisher, C.H., 1997. Guidelines to the demarcation of virus species. Arch. Virol. 142,

1505–1518

31

Chƣơng 3. HÌNH THÁI VÀ CẤU TRÚC VIRUS

3.1 TÓM TẮT NỘI DUNG

Chƣơng này chủ yếu cung cấp các khái niệm cơ bản về đặc điểm hình thái và cấu trúc của

phân tử virus.

3.2 MỘT SỐ THUẬT NGỮ

1. Tiểu phần (subunit): Là một protein đơn lẻ, đƣợc mã hóa bởi bộ gen virus, ở trạng thái cấu

trúc không gian, cấu tạo nên vỏ protein của virus

2. Đơn vị hình thái (capsomer): Là đơn vị cấu trúc bề mặt thấy đƣợc dƣới kính hiển vi điện

tử. Một đơn vị hình thái có thể đƣợc cấu tạo bởi 1 hoặc nhiều tiểu phần và đƣợc gọi là

monomer, dimmer, trimer, tetramer, pentamer, hexamer … tùy theo số lƣợng tiểu phần hợp

thành.

3. Vỏ protein (capsid): Vỏ protein bao quanh bộ gen virus.

4. Vỏ bọc (envelope): Gồm 2 phần: (i) một lớp màng kép lipid, thƣờng có nguồn gốc từ màng

tế bào hoặc màng cơ quan tử của tế bào ký chủ; (ii) các phân tử glycoprotein (thƣờng có

nguồn gốc từ virus) nhô lên trên bề mặt.

5. Phân tử virus (virion): Là cấu trúc hình thái đầy đủ của virus. Phân tử virus cũng đƣợc gọi

là hạt virus.

3.3 HÌNH THÁI VIRUS

Phân tử virus thực vật có kích thƣớc cực kỳ nhỏ, phần lớn trong phạm vi hàng chục tới hàng

trăm nm (10-9

m), nên chỉ có thể quan sát đƣợc bằng kính hiển vi điện tử (KHVĐT). Khi đƣợc

quan sát dƣới KHVĐT, phân tử virus thực vật thƣờng có hình thái ở các dạng sau:

1. Hình cầu (thực chất là hình cầu đa diện đối xứng): rất nhiều, ví dụ nanovirus, cucumovirus,

reovirus.

2. Hình cầu kép: chỉ có các geminivirus có hình dạng này.

3. Hình giống vi khuẩn: chỉ badnavirus, tugrovirus, iflavirus, alfamovirus.

4. Hình viên đạn: chỉ rhabdovirus.

5. Hình gậy: rất nhiều, ví dụ potexvirus, tobamovirus.

6. Hình sợi mềm: chỉ potyvirus, flexivirus, closterovirus.

7. Hình tràng hạt: chỉ tenuivirus.

3.4 VIRUS TRẦN VÀ VIRUS CÓ VỎ BỌC

Virus nói chung đƣợc chia làm 2 nhóm: virus trần (naked capsid virus) và virus có vỏ bọc

(enveloped virus).

Đa số virus thực vật và thực khuẩn thể thuộc nhóm virus trần. Phân tử virus chỉ đƣợc cấu tạo

bởi lõi acid nucleic và vỏ protein. Cấu trúc acid nuclecic + protein vỏ còn đƣợc gọi là

nucleocapsid.

32

Một số virus thực vật thuộc nhóm nhóm bền vững tái sinh (nhân lên trong tế bào vector; ví dụ

nhƣ tospovirus, reovirus và nucleo/cytorhabdovirus) và nhiều virus động vật có một vỏ bọc bên

ngoài. Bên trong vỏ bọc là nucleocapsid gồm bộ gen virus đƣợc bao bọc bởi lớp vỏ preotein. Vỏ

bọc đƣợc cấu tạo bởi (i) một lớp màng kép lipid, thƣờng có nguồn gốc từ màng tế bào hoặc

màng cơ quan tử của tế bào ký chủ; (ii) các phân tử glycoprotein (thƣờng có nguồn gốc từ virus)

nhô lên trên bề mặt.

Hình 3-1. Minh họa virus trần (hàng trên) và virus có vỏ bọc (hàng dƣới)

3.4.1 Ví dụ virus thực vật có vỏ bọc

Trong khi phần lớn virus động vật là các virus có vỏ bọc thì chỉ có một số nhóm virus thực

vật có vỏ bọc. Đây là các virus thƣờng truyền qua vector côn trùng theo kiểu bền vững tái sinh

(tức là virus nhân lên trong tế bào vector).

Một ví dụ là các virus thuộc họ Bunyaviridae. Phần lớn bunyavirus gây bệnh trên động vật

(ví dụ hantavirus, nairovirus và phlebovirus) nhƣng một số hại thực vật nhƣ các virus thuộc chi

Tospovirus, điển hình là Tomato spotted wilt virus (TSWV).

Các tospovirus (cũng nhƣ các bunyavirus khác) có cấu trúc phân tử (virion) giống nhau.

Phân tử virus có hình cầu, kích thƣớc 80 – 120 nm và có lớp vỏ bọc cấu tạo bởi:

- Một lớp màng kép lipid dày ~ 5 nm, có nguồn gốc từ màng tế bào ký chủ.

- Hai loại gai (mấu) nhỏ cấu tạo bằng glycoprotein nhô trên bề mặt với phần cuống gai

nằm chìm trong lớp màng kép lipid. Độ dày của lớp gai ~ 5-10 nm. Hai loại gai này là 2

loại phân tử glycoprotein, ký hiệu là Gn và Gc (còn đƣợc ký hiệu là G1 và G2).

Bên trong là 3 phân tử nucleoprotein cấu tạo bởi RNA genome liên kết với các phân tử

protein (các phân tử protein này đƣợc gọi là các nucleoprotein) và một số enzyme phiên mã

transcriptase.

Hình 3-2 Sơ đồ cấu trúc phân tử TSWV (và các bunyavirus khác) với cấu trúc có vỏ bọc

33

3.5 CẤU TRÚC PHÂN TỬ VIRUS

Về cấu trúc, các phân tử virus thực vât (và cả các virus ký sinh động vật, nấm, vi khuẩn) gồm

2 nhóm chính: (i) cấu trúc khối đa diện đối xứng dạng icosahedral và (ii) đối xứng xoắn. Ngoài

ra, một số virus động vật và thực khuẩn thể có cấu trúc phân tử phức tạp và đƣợc xếp vào nhóm

(iii) gọi là nhóm không đối xứng

3.6 CẤU TRÚC DẠNG KHỐI ĐA DIỆN ĐỐI XỨNG (ICOSAHEDRON)

3.6.1 Cấu trúc dạng icosahedron

Các virus thực vật có cấu trúc phân tử loại icosahedron rất phổ biến. Icosahedron là một hình

đa diện cấu tạo bởi 20 tam giác đều, và do đó có 12 đỉnh và 30 cạnh. Cấu trúc này dẫn tới

icosahedron có 3 trục đối xứng. Trục đối xứng 3 lần là trục xuyên tâm tam giác; trục đối xứng 5

lần là trục xuyên đỉnh và trục đối xứng 2 lần là trục xuyên trung điểm của cạnh. Cấu trúc khối đa

diện đối xứng bắt gặp ở các virus có hình thái phân tử dạng hình cầu, hình cầu kép, hình giống

vi khuẩn và hình viên đạn.

Vì phải cần tối thiểu 3 tiểu phần để tạo thành một tam giác nên một hình icosahedron sẽ phải

cần tối thiểu 3 x 20 = 60 tiểu phần. Chỉ một vài loại virus có số lƣợng tiểu phần = 60 (ví dụ nhƣ

các nepovirus hại thực vật). Ngoài ra, tại mỗi đỉnh, các tiểu phần thƣờng lắp ráp với nhau thành

các pentamer (5 tiểu phần) nhô lên rõ rệt (Hình 3.3).

Hình 3-3 Cấu trúc đối xứng đa diện icosahedron cơ bản của virus (T=1, số tiểu phần = 60)

3.6.2 Số T

Để biểu diễn số lƣợng và cách sắp xếp của các tiểu phần protein, ngƣời ta sử dụng số T dựa

theo lý thuyết ―gần đồng đều – quasi-equivalence‖ do Caspar và Klug đề xuất năm 1962. Lý

thuyết cho rằng khi số tiểu phần = 60 thì các tiểu phần sẽ sắp xếp và chiếm các vị trí đồng đều

(dạng cơ bản). Tuy nhiên, khi số tiểu phần >60 thì các tiểu phần sẽ xắp xếp và chiếm các vị trí

gần đồng đều. Số T là số tam giác phụ trên tam giác chính của hình icosahedron (Hình 3.4).

Hình 3-4. Hai hình tam giác đều với số số tam giác phụ T = 4 (trái) và T = 9 (phải)

34

Số T đƣợc tính theo công thức T = h2 + hk + k

2 (h và k là các số nguyên không âm và không

có nhân tử chung).

Để hiểu T, h và k, chúng ta lập một mạng lƣới các hình lục giác (cũng là mạng lƣới các hình

tam giác đều). Tại một điểm tùy ý (điểm gốc) tại tâm của 1 hình lục giác hoặc đỉnh của 1 tam

giác đều, ta vẽ 2 đƣờng h, k theo 2 cạnh liền kề của hình tam giác (và do đó tạo thành góc 60o).

Trên mỗi cạch, ta chia thành các khoảng đều với độ dài bằng cạnh của hình tam giác đều (và

bằng khoảng cách giữa tâm của 2 hình lục giác liền kề). Nhƣ vậy vị trí của mỗi hình lục giác có

thể đƣợc biểu diễn dƣới dạng 1 tọa độ tƣơng ứng với 2 trục h và k. Để tạo một hình đa diện

icosahedron, tại hình lục giác gốc, ta cắt bỏ một hình tam giác và nối 2 cạnh với nhau để đƣợc

một đỉnh có 5 mặt tƣơng ứng 1 pentamer. Đỉnh liền kề với đỉnh gốc đƣợc lấy từ 1 hình lục giác

có vị trí tƣơng ứng với 1 giá trị h, k xác định. Đƣơng nhiên, hình lục giác này cũng sẽ đƣợc loại

bỏ 1 hình tam giác giống nhƣ ở hình lục giác gốc (Hình 3.5).

Hình 3-5 Minh họa cách vẽ các trục h, k và tọa độ các hình lục giác, cách tạo hình icosahedron

tƣơng ứng với 1 T xác định và cách xắp xếp các tiểu phần protein trên 1 mặt của các virus với 4

mức T khác nhau

35

Vì h, k có thể nhận giá trị 0 hoặc nguyên dƣơng (nhƣng không có nhân tử chung) nên T sẽ chỉ

nhận các giá trị nhƣ 1, 3, 4, 7, 9, 12, 13…

Đối với các virus icosahedral, ngƣời ta giả thiết có 12 pentamer (ở đỉnh) và các hexamer với

số lƣợng thay đổi tùy theo T. Số lƣợng và loại các đơn vị hình thái này đƣợc tính theo công thức

sau:

M = [(60T – 60)/] hexamer + 60/5 pentamer = 10 (T-1) hexamer + 12 pentamer

Ví dụ hình 3-6 ở dƣới cho thấy 2 phân tử virus với T khác nhau sẽ có có các đơn vị hình thái

khác nhau. Virus với T = 1 (hình trái ) => có 12 pentamer (tổng = 60 tiểu phần protein); với T =

4 (hình phải) => có 30 hexamer + 12 pentamer (tổng = 240 tiểu phần protein).

Hình 3-6 Minh họa virus với T khác nhau sẽ có các đơn vị hình thái (capsomer) khác nhau

3.6.3 Ví dụ virus với T khác nhau

Ví dụ 1. Banana bunchy top virus (BBTV), T = 1. Virus có bộ gen phân đoạn, ít nhất sáu

phân tử DNA dạng vòng, sợi đơn. Mỗi phân tử DNA genome đƣợc lắp ráp trong 1 virion. Virion

có T=1, 12 pentamer, với số lƣợng tiểu phần = 60.

Hình 3-7 Hình thái Banana bunchy top virus (BBTV)

Ví dụ 2: Tomato bushy stunt virus (TBSV) với T = 3. Mỗi phân tử virus chỉ có một phân tử

RNA (~ 4.8 kb). Về cấu trúc, virus có T = 3, 20 hexamer, 12 pentamer, với số lƣợng tiểu phần

=180 (387 aa; 41 kD).

Hình 3-8 Hình thái Tomato bushy stunt virus (TBSV)

36

3.7 CÁC PHÂN TỬ VỚI KHỐI ĐA DIỆN ĐỐI XỨNG DÀI

Một số phân tử virus chẳng hạn nhƣ các virus thuộc nhóm badnavirus (ví dụ RTBV), một số

thực khuẩn thể lại có cấu trúc dạng đa diện đối xứng kéo dài. Trong cấu trúc này, 2 nửa đầu và

đáy của khối đa diện đƣợc giữ nguyên nhƣng phần thân lại kéo dài (hình 3.9).

Đối với các cấu trúc kéo dài, ngƣời ta sử dụng số Q cùng với số T để xác định số tiểu phần

(N) theo công thức: N = 30 (T + Q), trong đó Q có thể là bất kỳ số nguyên >0.

Nếu Q = T => phân tử virus hoàn toàn đối xứng kiểu isohedron

Nếu Q > T => phân tử virus dạng khối đối xứng dài

Nếu Q < T => phân tử virus dạng khối đối xứng bẹt. Tuy nhiên trƣờng hợp này hiếm.

Hình 3-9 Cách cấu tạo của khối đa diện đối xứng kéo dài (hình trên) và cấu trúc phân tử với T=13

nhƣng có các Q khác nhau (hình dƣới)

3.8 CẤU TRÚC ĐỐI XỨNG XOẮN

Cấu trúc đối xứng xoắn là cấu trúc của các virus có dạng hình gậy hoặc hình sợi (phần đuôi

của nhiều thực khuẩn thể cũng có cấu trúc tƣơng tự). Trong cấu trúc đối xứng xoắn, các tiểu

phần protein xắp xếp theo đƣờng xoắn xung quanh 1 trục. Nhìn chung, cấu trúc này giúp phân tử

virus có năng lƣợng tự do phù hợp dẫn tới phân tử có thể mềm dẻo chẳng hạn ở dạng sợi mềm

hoặc gấp lại nhƣng không bị đứt gẫy.

Một virus điển hình đƣợc nghiên cứu đầy đủ nhất về cấu trúc đối xứng xoắn là TMV. Một

phân tử TMV chỉ chứa một phân tử RNA (~ 6.4 kb) đƣợc bao bọc bởi một lớp vỏ gồm 2123 tiểu

phần protein (mỗi tiểu phần là một phân tử protein có kích thƣớc 158 amino acid (17.3 kD). Các

tiểu phần protein lắp ráp với RNA virus theo cấu trúc xoắn (Hình 3.10) với chi tiết nhƣ sau:

1. Ba nucleotide trên phân tử RNA liên kết với 1 tiểu phần protein.

2. Một đơn vị lặp hoàn hảo gồm 49 tiểu phần / 3 vòng xoắn và tạo ra độ dài 6.9 nm (tổng độ dài

phân tử ~ 300 nm).

3. Đƣờng kính phân tử là 18 nm còn đƣờng kính lõi rỗng là 4 nm.

Cần chú ý là TMV có thể tự lắp ráp thành phân tử hoàn chỉnh từ 1 hỗn hợp các tiểu phần

protein + acid nucleic trong ống nghiệm.

37

Hình 3-10 Cấu trúc đối xứng xoắn của TMV

3.9 CẤU TRÖC KHÔNG ĐỐI XỨNG (PHỨC TẠP)

Cấu trúc không đối xứng lại gồm 2 nhóm phụ là (i) dạng nòng nọc và (ii) dạng có cấu trúc

giống tế bào. Dạng cấu trúc phức tạp này không có ở virus thực vật.

Dạng nòng nọc. Dạng này chỉ gồm các thực khuẩn thể có đuôi (ví dụ T4, T7, lamda). Thực

chất, phần đầu của thực khuẩn thể có cấu tạo khối đối xứng nhƣng phần đuôi lại là cấu trúc đối

xứng xoắn. Ngoài ra chúng còn có đĩa bám ở cuối đuôi và lông bám (Hình 3.11).

Hình 3-11 Cấu trúc dạng nòng nọc của thực khuẩn thể T4 (Viralzone, 2009)

Dạng cấu trúc giống tế bào. Một số virus có kích thƣớc rất lớn nhƣ virus đậu mùa

(poxvirus). Virus có kích thƣớc ~200 – 400 nm và cấu trúc rất phức tạp giống nhƣ tế bào. Virion

của chúng chứa tới ~100 protein khác nhau, có nhiều lớp màng (Hình 3.12).

38

Hình 3-12 Cấu trúc phức tạp của virus đậu mùa

3.10 THÀNH PHẦN CẤU TẠO CỦA PHÂN TỬ VIRUS

3.10.1 Acid nucleic

Bộ gen có trong phân tử virus gồm DNA hoặc RNA, nhƣng nhƣng không bao giờ có cả 2

loại. Đa số virus thực vật (khoảng 80%) có bộ gen RNA. Bộ gen của virus có các đặc điểm sau:

Sợi đơn hoặc sợi kép

Mạch thẳng hoặc mạch vòng

Cực âm hoặc cực dƣơng hoặc lƣỡng cực

Phân đoạn hoặc không phân đoạn. Cần chú ý rằng tùy loại virus mà các phân đoạn đƣợc lắp

trong cùng một virion hay lắp ráp riêng biệt.

Phần lớn các virus thực vật có bộ gen RNA sợi đơn, cực dƣơng

3.10.2 Protein

Protein của virus nhìn chung đƣợc chia làm 2 loại: Protein cấu trúc (có mặt trong phân tử

virus) và protein phi cấu trúc (hình thành trong tế bào ký chủ trong quá trình gây bệnh). Các

protein cấu trúc chính của virus gồm các loại sau:

Protein vỏ (coat protein, CP): Có thể gồm 1 hay nhiều loại

Enzymes: Đối với các virus RNA thực vật, enzyme chủ yếu có mặt trên phân tử virus là

enzyme sao mã RNA (RdRp). Đối với các virus động vật, còn có thêm các enzyme cần cho

quá trình xâm nhập và nhận biết ký chủ (ví dụ neuramidase của virus cúm gia cầm). Đối với

thực khuẩn thể, virion của chúng còn có lysozim để giúp xâm nhập tế bào vi khuẩn.

Glycoproteins: Đây là các protein liên kết đƣờng, dạng protein xuyên màng, có vai trò quan

trọng đối với virus động vật và virus thực vật truyền qua vector theo kiểu bền vững tái sinh.

39

3.10.3 Lipid

Đối với các virus có vỏ bọc (một số virus thực vật, chẳng hạn các virus truyền qua vector

theo kiểu bền vững tái sinh và nhiều virus động vật) thì vỏ bọc của chúng đƣợc cấu tạo bởi lớp

màng kép phospholipid do lớp màng này có nguồn gốc từ màng tế bào hoặc màng cơ quan tử

của tế bào ký chủ.

3.10.4 So sánh cấu trúc các nhóm virus

Bảng 3-1. So sánh một số đặc điểm hình thái – cấu trúc của các nhóm virus

Đặc điểm Thực vật Động vật Vi khuẩn Nấm Protozoa

Kích thƣớc bộ gen RNA (kb) 0.3-28 5 – 30 5 – 8 2.5 – 28 5 – 10

Kích thƣớc bộ gen DNA (kb) 3 – 10 3 – 350 10 - 200 Không 180 – 1200

Số virus có vỏ bọc Ít Nhiều Ít Ít Tất cả

Mức độ phức tạp của bộ gen Ít Thay đổi Thay đổi Ít Thay đổi

Mức độ phức tạp về hình thái Ít Thay đổi Thay đổi Ít Thay đổi

Số virus có bộ gen phân mảnh Nhiều Một số Ít Một số Không

3.11 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 3

1. Các thuật ngữ hình thái.

2. Các hình dạng của virus thực vật, ví dụ

3. Phân biệt virus trần và virus có vỏ bọc (đặc điểm, ví dụ)

4. Cấu trúc khối đa diện đối xứng (đặc điểm, ví dụ)

5. Ý nghĩa số T, ví dụ virus có T=1, T=3.

6. Cấu trúc đối xứng xoắn (đặc điểm, ví dụ).

7. Đặc điểm bộ gien (loại acid nucleic; loại sợi: sợi đơn, sợi kép, dạng thẳng, dạng vòng; loại

cực: cực dƣơng, cực âm, lƣỡng cực; có phân mảnh hay không phân mảnh, đƣợc lắp ráp

riêng rẽ hay cùng đƣợc lắp ráp trong virion; ví dụ mỗi loại).

8. Phân biệt protein cấu trúc và phi cấu trúc; các dạng protein cấu trúc chính. Đặc điểm lipid

của virus có vỏ bọc. Các nhóm virus nào thƣờng có protein cấu trúc và nhóm nào không có,

lấy ví dụ.

3.12 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH

1. Ariska, F. (2008). Virus Capsid Model. Tokyo Institute of Technology.

2. Hull, R. (2002). Matthews's Plant Virology. Fourth edition: Academic Press.

3. Zlotnick (2005). Theoretical aspects of virus capsid assembly. Journal of Molecular

Recognition.18 (6): 479-490

4. http://www.tulane.edu/~dmsander/WWW/335/335Structure.html

5. Viralzone (http://expasy.org/viralzone)

40

Chƣơng 4. TÁI SINH VIRUS (REPLICATION)

4.1 TÓM TẮT NỘI DUNG

Chƣơng này trình bày quá trình tái sinh của tát cả các nhóm virus. Quá trình tái sinh (sinh

sản) của virus gắn liền với tế bào ký chủ và phụ thuộc hoàn toàn vào bộ máy dịch mã của tế bào.

4.2 KHÁI NIỆM

Sự tái sinh (replication) hay sinh sản là sự hình thành phân tử virus mới từ phân tử virus ban

đầu. Sau khi xâm nhập vào tế bào ký chủ, sự tái sinh virus trải qua 4 giai đoạn chính:

1. Tháo vỏ để giải phóng bộ gen virus

2. Tổng hợp protein virus

3. Tổng hợp bộ gen virus mới

4. Lắp ráp phân tử virus

4.3 ĐẶC ĐIỂM TÁI SINH VIRUS

Sự tái sinh virus, mặc dù khác nhau tùy nhóm, nhƣng đều có đặc điểm chung sau:

1. Virus sử dụng vật liệu của tế bào ký chủ (amino acid, nucleotide) để tổng hợp protein và

acid nucleic của chính virus.

2. Virus sử dụng năng lƣợng của tế bào ký chủ (chủ yếu dƣới dạng các hợp chất cao năng

nhƣ ATP) để tổng hợp protein và acid nucleic của chính virus.

3. Virus sử dụng bộ máy tổng hợp protein của tế bào ký chủ (ribosome, tRNA và các

enzyme liên quan) để tổng hợp protein của virus. Quá trình tổng hợp sẽ dựa trên khuôn

mRNA của virus. Trong nhiều trƣờng hợp (đối với các virus RNA cực dƣơng) thì bản

thân bộ gen virus đóng vai trò nhƣ mRNA. Tất cả virus thực vật sử dụng ribosome 80S

của tế bào ký chủ.

4. Hầu hết các virus thực vật tổng hợp 1 hoặc 1 số enzyme cần thiết cho quá trình tổng hợp

bộ gen virus. Ví dụ:

Tất cả các virus RNA mã hóa RdRp (RNA-dependent RNA polymerase). RdRp là

một enzyme polymer hóa và có chức năng tổng hợp RNA trên khuôn RNA.

Các geminivirus (có bộ gen DNA sợi vòng đơn) mã hóa Rep (replication) protein.

Rep không phải là một enzyme có chức năng polyme hóa nhƣng có chức năng cắt và

nối các phân tử DNA virus trong quá trình tổng hợp sợi DNA virus.

Tóm lại, sự tái sinh virus phụ thuộc hoàn toàn vào bộ máy tổng hợp protein và acid nucleic

của tế bào ký chủ. Sở dĩ nhƣ vậy là do virus nói chung và virus thực vật nói riêng chỉ mã hóa

một số ít gen; ví dụ các begomovirus chỉ mã hóa 5 – 8 gen, các potyvirus chỉ mã hóa 10 gen.

4.4 TÁI SINH CỦA CÁC VIRUS CÓ BỘ GEN RNA SỢI (+)

Phần lớn virus thực vật có bộ gen RNA sợi dƣơng (xem phần phân loại). Các bƣớc chủ chốt

của sự tái sinh của tất cả các virus thuộc nhóm này (hình 4.2) bao gốm:

41

4.4.1 Tổng hợp protein virus.

Bộ gen RNA sợi (+) đóng vai trò nhƣ là mRNA. Vì virus không có các gen mã hóa các yếu tố

cần cho quá trình dịch mã và ribosome, chúng phải sử dụng bộ máy dịch mã của ký chủ để hoàn

thành bƣớc này. Trong số các protein virus đƣợc tổng hợp, một số có vai trò quan trọng trong

quá trình tái sinh bao gồm:

RNA-dependent RNA polymerase (RdRp). RdRp xúc tác sự tổng hợp sợi RNA mới trên

khuôn RNA.

Helicase. Enzyme này có chức năng tháo xoắn (tách sợi RNA kép thành sợi RNA đơn) trong

quá trình tái sinh bằng cách phá vỡ liên kết hydro. Tháo xoắn là quá trình cần năng lƣợng nên

các helicase cũng có chức năng thủy phân adenosine triphosphate (ATP).

Methyl transferase (MT). Enzym này có chức năng tạo mũ cho đầu 5‘ của bộ gene RNA của

một số virus giống nhƣ ở mRNA của ký chủ. Chỉ các virus yêu cầu một mũ Cap đầu 5‘

(m7G5‘) nhƣ furovirus và pecluvirus mới cần chức này.

4.4.2 Hình thành phức hợp tái sinh VRC (viral replication complex)

Phức hợp tái sinh bao gồm RNA virus, các protein virus hình thành ở bƣớc 1 và các protein

ký chủ cần thiết cho quá trình tái sinh. Vì RNA virus đóng vai trò nhƣ mRNA cho quá trình dịch

mã và là khuôn cho quá trình tái sinh nên cả 2 quá trình này thƣờng liên quan chặt chẽ với nhau.

Do vậy, cần phải có một cơ chế điều hòa để cho phép chuyển từ chế độ dịch mã sang chế độ tái

sinh và để tránh sự xung đột của các ribosome, di chuyển từ đầu 5‘ sang đầu 3‘, và RdRp, di

chuyển theo chiều ngƣợc lại.

Phức hợp tái sinh luôn liên quan tới các cấu trúc màng của tế bào ký chủ bao gồm: màng lƣới

nội chất, màng ngoài lục lạp, màng không bào, màng proxisome, màng ty thể và màng nhân.

Các màng này biến đổi, hình thành các cấu trúc dạng cầu rỗng, bên trong chứa phức hợp tái

sinh. Sự gắn kết giữa phức hợp tái sinh và màng đƣợc thực hiện nhờ một hoặc nhiều protein có

nguồn gốc virus hoặc ký chủ, đƣợc gọi là các protein mỏ neo. Các protein mỏ neo thƣờng tổng

hợp vào màng, có khả năng biến đổi màng và liên kết với phức hợp tái sinh thông qua các

protein cần cho sự tái sinh nhờ tƣơng tác protein – protein. Loại màng cấu tử tế bào tham gia lắp

ráp phức hợp tái tái sinh khác nhau tùy virus, chẳng hạn đối với TMV là màng lƣới nội chất, đối

với CMV là màng không bào…

4.4.3 Tái sinh bộ gen virus

Đầu tiên, RNA (+) tức sợi virus sẽ đƣợc dùng làm khuôn để tổng hợp sợi (-). Sự tổng hợp sợi

(-) đƣợc bắt đầu từ đầu 3‘ của sợi (+). Các virus RNA có cấu trúc rất đa dạng về đầu 3‘ gồm 3

loại:

Chứa 1 vùng không dịch mã 3‘UTR + 1 đuôi polyA (ví dụ các potyvirus, potexvirus)

Chứa 1 vùng không dịch mã 3‘UTR có cấu trúc giống tRNA (ví dụ tymovirus,

cucumovirus, tobamovirus)

Chứa 1 vùng không dịch mã 3‘UTR + 1 đuôi polyA (ví dụ closterovirus, luteovirus)

Tất cả các vùng không dịch mã 3‘UTR đều có cấu trúc thứ cấp và các dấu hiệu cho phép

RdRp và các protein cần thiết tiếp cận để tổng hợp sợi (-).

Trên khuôn sợi (-), quá trình tái bản sợi (+) tức bộ gen virus bắt đầu đƣợc thực hiện. Cần chú

ý rằng một khuôn sợi (-) đƣợc sử dụng để tổng hợp nhiều sợi (+).

42

Quá trình tái bản sẽ hình thành 2 loại phân tử RNA:

Loại tái bản RF (replicative form): là 1 phân tử RNA sợi kép hoàn hảo hình thành khi

tổng hợp sợi (-) trên khuôn sợi (+).

Loại trung gian tái bản RI (replicative intermediate): là các phân tử RNA sợi kép trung

gian hình thành trong quá trình tái bản sợi (+). Ở dạng RI, nhiều phân tử RNA sợi (+) sẽ

gắn trên 1 phân tử RNA sợi (-).

Hiện có 2 giả thuyết giải thích cơ chế tái bản sợi (+) của virus thực vật:

Cơ chế bán bảo thủ. Trên khuôn sợi (-), các phân tử RNA sợi (+) đƣợc tổng hợp sau sẽ thay

thế dần sợi RNA (+) đƣợc tổng hợp trƣớc đó (hình b phía dƣới).

Cơ chế bảo thủ. Trên phân tử RF sợi kép, quá trình tháo xoắn chỉ diễn ra ngắn ngủi tại vị trí

kéo dài đầu 3‘ của các sợi (+) mới đang đƣợc tổng hơp (hình 4.1 c).

Hình 4-1 Sơ đồ giải thích cơ chế tái bản sợi (+) trên khuôn sợi (-). (b) và (c) là cơ chế tổng hợp của

virus thực vật TMV, còn (a) là dạng trung gian RI của thực khuẩn thể Qβ (Buck et al., 1999)

4.4.4 Lắp ráp thành phân tử virion mới

Khi có đủ RNA sợi (+) và protein cấu trúc, chủ yếu là CP, các phân tử này tiến hành lắp ráp

tạo viron mới. Quá trình lắp ráp này cũng đƣợc thực hiện trong phức hợp tái sinh.

43

Hình 4-2 Sơ đồ tái sinh virus RNA sợi đơn, cực dƣơng

44

4.5 TÁI SINH CỦA CÁC VIRUS CÓ BỘ GEN RNA SỢI (-)

Điểm khác biệt cơ bản là sợi RNA genome của virus không đƣợc sử dụng để dịch mã. Về cơ

bản quá trình tái sinh của virus RNA sợi đơn cực (-) khá giống với các virus RNA sợi đơn cực

(+). Tuy nhiên có một số điểm khác biệt về trình tự, tóm tắt nhƣ sau:

1. Xâm nhập => tháo vỏ để giải phóng bộ gen virus sợi (-).

2. Sợi (-) đƣợc dùng làm khuôn để ―phiên mã‖ thành các mRNA của các gen virus và tiếp theo

tổng hợp các protein virus.

3. Sợi (-) đƣợc dùng làm khuôn để tổng hợp sợi (+) có kích thƣớc bằng sợi (-). Sợi (+) này sẽ

giữ vai trò làm khuôn để tổng hợp (-) sợi virus. Trên khuôn sợi (-) mới, các mRNA lại tiếp

tục đƣợc tổng hợp để tạo protein virus

4. Lắp ráp virion mới.

Cần chú ý 2 điểm khác biệt liên quan đến tái sinh các virus RNA sợi (-)

Mặc dù đƣợc ký hiệu là sợi (+) nhƣng sợi này không đƣợc sử dung trực tiếp để dịch mã

Đối với tất cả các virus RNA sợi âm thì trong thành phần virion của chúng bao giờ cũng có

RdRp để đảm bảo khi xâm nhập vào tế bào ký chủ, bộ gen phải đƣợc ―phiên mã‖ ngay sang

mRNA.

Hình 4-3 Sơ đồ tái sinh của rhabdovirus

Một số các họ virus quan trọng có bộ gen RNA sợi đơn, cực âm bao gồm:

a) Họ Rhabdoviridae. Đây là một họ lớn. Các rhabdovirus phần lớn gây hại động vật (ví dụ

Rabies virus, gây bệnh dại). Các rhabdovirus hại thực vật chỉ thuộc 2 chi là Nucleorhabdovirus

(ví dụ Rice yellow stunt virus (RYSV) gây bệnh vàng lụi lúa) và Cytorhabdovirus. Ngoại trừ các

45

cytorhabdovirus tái sinh trong tế bào chất thì tất cả các rhabdovirus khác đều tái sinh trong nhân

tế bào ký chủ.

b) Họ Bunyaviridae (ví dụ Hantanavirus gây bệnh sốt, TSWV gây bệnh đốm héo cà chua).

c) Ngoài ra, một số các virus thuộc chi Tenuivirus (ví dụ RGSV gây bệnh vàng lùn lúa).

Hình 4-4 Quá trình tái sinh của các rhabdovirus hại thực vật (cytorhabdovirus và

nucleorhabdovirus) (Hull, 2002)

4.6 TÁI SINH CỦA VIRUS RNA SỢI KÉP

Trong số 9 họ virus có bộ gen dsRNA (Birnaviridae, Cystoviridae, Chrysoviridae,

Endornaviridae, Hypoviridae, Partitiviridae, Picobirnaviridae, Reoviridae, Totiviridae) thì họ

Reoviridae là họ đƣợc nghiên cứu nhiều nhất.

Reoviridae là một họ lớn, đa đạng, gồm các virus gây hại cả động vật và thực vật. Tất cả các

virus hại thực vật đều truyền qua vector rầy và lan truyền theo kiểu bền vững tái sinh. Các

reovirus có bộ gen phân đoạn gồm trên dƣới 10 phân tử dsRNA sợi kép đều đƣợc lắp ráp trong 1

phân tử virus hình khối đa diện với 2 lớp vỏ. Phân tử virus bị loại bỏ lớp vỏ ngoài đƣợc gọi là

―lõi virus, core‖.

Quá trình tái sinh của reovirus diễn ra trong tế bào chất và có thể đƣợc tóm tắt nhƣ sau:

1. Virus xâm nhập tế bào ký chủ, loại bỏ lớp vỏ ngoài (do protease của tế bào ký chủ) để tạo

thành phân tử ―lõi‖ virus. RdRp của virus (là một protein cấu trúc có mặt trong phần lõi)

thực hiện phiên mã trên khuôn RNA sợi (-) để tạo thành các phân tử mRNA, đây là các phân

tử mRNA monocistronic của virus đƣợc mũ hóa nhƣng không tạo đuôi poly A. Các phân tử

mRNA này thoát khỏi lõi vào tế bào chất.

46

2. Trong tế bào chất, các protein virus đƣợc dịch mã trên khuôn mRNA của virus.

3. Lắp ráp các các mRNA tức là các phân tử RNA sợi (+) của virus và các protein virus tạo

thành phân tử virus ―lõi‖ mới.

4. Trong phân tử ―lõi‖ mới, sợi RNA (+) của virus đƣợc phiên mã thành phân tử RNA sợi (-)

để tạo thành phân tử RNA sợi kép.

5. Trong phân tử ―lõi‖ mới, quá trình phiên mã mới trên khuôn sợi RNA (-) lại tiếp tục để tạo

các phân tử tạo mRNA (sợi +) mới.

6. Các phân tử ―lõi‖ tiếp tục lắp ráp với các protein cấu trúc khác để tạo phân tử virion hoàn

chỉnh

Nhƣ vậy có thể thấy 2 điểm khác biệt của quá trình tái sinh phân tử virus RNA sợi kép:

Quá trình tạo mRNA không phải bên ngoài tế bào chất mà đƣợc thực hiện trong phân tử

―lõi‖ của virus.

Khi bắt đầu lắp ráp, virus không phải lắp ráp các phân tử RNA sợi kép mà là các phân tử

RNA sợi đơn cực (-). Trong quá trình ―chín‖, các phân tử RNA sợi kép mới tiếp tục đƣợc

hoàn thiện.

Hình 4-5 Sơ đồ tái sinh virus RNA sợi kép

47

4.7 TÁI SINH CỦA VIRUS RNA QUA PHIÊN MÃ NGƢỢC (RETROVIRUS)

4.7.1 Các khái niệm

Transposons: là các chuỗi DNA trong bộ gen có thể tự di chuyển (transpose) từ vị trí này

sang vị trí khác trên bộ gen. Transposons là một trong nhiều loại yếu tố di động của bộ gen.

Ngƣời phát hiện ra trasposons đầu tiên là Barbara McClintock (giải Noben năm 1948 cho công

trình phát hiện transposon trên cây ngô). Tranposons đƣợc chia thành 2 nhóm:

DNA transposons: quá trình thay đổi vị trí đƣợc thực hiện thao hình thức ―cut/pate‖.

Retrotransposons: quá trình thay đổi vị trí theohình thức ―copy/pate‖ và đƣợc thực hiện qua 2

giai đoạn: (i) DNA phiên mã thành RNA => (ii) phiên mã ngƣợc lại thành DNA. Các phiên bản

copy DNA mới này đƣợc chèn vào các vị trí khác trên bộ gen.

Retrovirus: là các virus RNA có đặc điểm tái sinh bộ gen thông qua phiên mã ngƣợc nhờ

enzyme phiên mã ngƣợc Reverse transcriptase. Đối với các retrovirus, luôn có pha tổng hợp bộ

gen virus vào bộ gen ký chủ.

Các retrovirus động vật, ví dụ nhƣ các virus thuộc chi Lentivirus, họ Retrovirus nhƣ Human

immunodeficien virus (HIV) có bộ gen RNA sợi đơn, cực +, kích thƣớc khoảng 8-9 kb, đƣợc

bao quanh bởi 2 chuỗi LTR 0,2-1 Kb, có các gen nhƣ gag, pol, env. Ngoài ra các lentivirus cũng

chứa nhiều gen bổ trợ.

Các retrovirus thực vật (ví dụ các virus thuộc chi Sirevirus, họ Pseudoviridae nhƣ Glycine

max SIRE1 virus (GmaSIREV) cũng có đặc điểm giống các retrovirus động vật nhƣ: có bộ gen

RNA sợi đơn, cực +, kích thƣớc 9-10 kb, đƣợc bao quanh bởi 2 chuỗi lặp dài khoảng 0.5 - 1.2

kb ở đầu (LTR, Long Terminal Repeats), có 3 ORF mã hóa cho gen gag, pol và env. Các

sirevirus phát hiện thấy ở nhiều loài cây 1 lá mầm và 2 lá mầm.

Một số điểm chú ý về retrovirus thực vật: (i) cơ chế gây bệnh vẫn chƣa đƣợc hiểu rõ; (ii)

chúng đƣợc xem là các endovirus, có nghĩa bộ gen của chúng đƣợc tổng hợp trong bộ gen của

cây ký chủ và đƣợc lan truyền theo chiều dọc cùng với bộ gen của cây ký chủ qua các thế hệ

sau; (ii) virion chỉ hình thành trong quá trình tái sinh virus (phần lớn vẫn chƣa đƣợc nghiên cứu).

Hình 4-6 Tổ chức bộ gen của 1 retrovirus động vật (HIV) và của 1 retrovirus thực vật

(GmaSIREV)

LTR (Long Terminal Repeats) là các chuỗi đóng vai trò quan trọng trong quá trình dịch

chuyển vị trí của các retrovirus (và các yếu tố di động retroelements khác). Điển hình, một chuỗi

LTR thƣờng gồm gồm 3 phần:

48

Một vùng U3 khoảng 200-1.200 nucleotide chứa promoter.

Một vùng lặp R.

Một vùng U5 khoảng 75-250 nucleotides chứa phần đầu tiên của bộ gen.

Ngoài ra, liền kề phía hạ lƣu chuỗi LRT đầu 5‘ có một chuỗi PBS (Primer Binding Site)

khoảng 18 nucleotide là vị trí gắn mồi tRNA trong quá trình phiên mã ngƣợc; và liền kề phía

thƣợng lƣu chuỗi LRT đầu 3‘ có một chuỗi nhỏ ~10 A/G gọi là PPT (Polypurine Tract) là vị trí

bắt đầu tổng hợp sợi DNA (-).

Các retrovirus có một số các ORF mã hóa cho các protein đặc trƣng sau:

Gen gag mã hóa một polyprotein và tiếp theo đƣợc xử lý thành một số protein cấu trúc

của virus

Gen pol mã hóa một polyprotein và đƣợc xử lý sau dịch mã thành các protein chức năng

là PR (protease) chịu trách nhiệm phân cắt các protein khỏi polyprotein; RT (Reverse

Transcriptase) là enzyme phiên mã ngƣợc, RH (RNAse H) phân hủy nửa RNA trên từ

heteroduplex RNA:DNA, INT (Intergrase) tổng hợp bộ gen DNA virus vào bộ gen ký

chủ.

Gen env (envelope): tất cả các retrovirus động vật và một số retrovirus thực vật có gen

này. Gen này mã hóa cho các protein liên quan đến vỏ bọc của virus và do đó đặc biệt

quan trọng đối với các virus động vật.

Đối với các retrovirus động vật còn có các ORF phụ mã hóa cho các protein điều hòa phiên

mã nhƣ tat, rev, vif và nef.

4.7.2 Quá trình tái sinh của retrovirus

Bộ gen của các retrovirus đƣợc xem là cực (+) nhƣng không đƣợc dịch mã trực tiếp ngay.

Trong tế bào, bộ gen RNA của virus đƣợc phiên mã ngƣợc nhờ Reverse transcriptase thành

DNA sợi đơn cực (-), tiếp theo, đƣợc đƣợc tổng hợp thành phân tử DNA sợi kép. Phân tử DNA

sợi kép của virus này đƣợc tổng hợp vào bộ gen của ký chủ . Bộ gen DNA virus đƣợc phiên mã

thành RNA sợi (+). Các phân tử RNA sợi (+) này đƣợc dịch mã giống nhƣ gen ký chủ để tạo ra

các protein. Protein virus và các phân tử RNA (sợi +) này đƣợc lắp ráp thành virion.

Cần chú ý đối với retrovirus thực vật thì bộ gen DNA virus luôn nằm trong bộ gen ký chủ.

Virion chỉ hình thành trong quá trình tái sinh.

49

Hình 4-7 Sơ đồ tái sinh của retrovirus động vật

Hình 4-8 Tái sinh của retrovirus thực vật

50

4.8 TÁI SINH CỦA VIRUS DNA SỢI VÕNG ĐƠN

Đối với virus thực vật, chỉ có các virus thuộc hai họ Geminiviridae và Nanoviridae là có bộ

gen DNA sợi vòng đơn. Một số các virus động vật thuộc họ Circoviridae (ví dụ Porcine

circoviral virus type 2 (PCV2) gây bệnh còi cọc lợn sữa), họ Anelloviriade (một nhóm virus mới

phát hiện trên ngƣời) cũng có bộ gen DNA sợi vòng đơn. Các virus này đều tái sinh theo cơ chế

vòng lăn (rolling circular mechanism). Cơ chế vòng lăn có thể đƣợc chia làm 2 pha và đƣợc thực

hiện trong nhân tế bào ký chủ.

Các geminivirus và nanovirus đều mã hóa một protein gọi là Rep (đối với geminivirus) hoặc

Master Rep (đối với nanovirus). Các protein này không có chức năng polymerase nhƣng có chức

năng cắt và nối phân tử DNA ở một vị trí đặc biệt trên bộ gen virus. Vị trí này là một chuỗi bảo

thủ cao (TAATATTAC đối với geminivirus và TA(T/G)TATTAC đối với nanovirus). Vị trí TA

(gạch chân) chính là vị trí mà protein Rep/MasterRep cắt và nối phân tử DNA của virus. Chuỗi

bảo thủ này nằm trên vùng gọi là ―nguồn gốc tái bản‖ (ori, origin of replication). Ori bao gồm

một cấu trúc thân-thòng lọng (Stem-loop), chuỗi bảo thủ ở trên và các trình tự lặp đảo ngắn

(khoảng 4-5 nucleotid) gọi là interon cần thiết cho Rep nhận biết và bám vào sợi DNA của virus

để bắt đầu tái bản.

Quá trình tái sinh của geminivirus và nanovirus (Hình 4.9) diễn ra nhƣ sau:

1. Virus xâm nhập vào tế bào và cởi áo giải phóng bộ gen DNA virus.

2. Bộ gen đƣợc vận chuyển vào nhân. Trong nhân, quá trình tái sinh sảy ra theo 2 pha:

3. Pha 1 (pha tổng hợp sợi kép). Trong nhân, phân tử DNA sợi vòng đơn (bộ gen có mặt trong

phân tử virus) đƣợc tổng hợp thành thành phân tử DNA vòng kép. Quá trình khởi đầu tổng

hợp sợi kép vẫn chƣa đƣợc hiểu rõ. Nhƣ vậy sợi kép sẽ gồm một sợi virus và một sợi đối

virus. Trên sợi kép này, các gen đƣợc phiên mã (trên cả 2 sợi đối với geminivirus) để tạo các

mRNA. Các mRNA đƣợc vận chuyển ra tế bào chất và dịch mã để tạo ra các protein virus,

trong đó có Rep/Master Rep. Nhƣ vậy, quá trình phiên mã và dịch mã của virus hoàn toàn

dựa vào bộ máy phiên mã và dịch mã của tế bào ký chủ. Rep/Master Rep lại quay trở lại

nhân để tham gia tổng hợp bộ gen virus.

4. Pha 2 (pha vòng lăn). Tiếp theo là pha tái sinh theo cơ chế vòng lăn: Protein Rep/Master

Rep sẽ cắt sợi virus tại chuỗi bảo toàn. Nhờ vật liệu cũng nhƣ enzyme DNA polymearase

của tế bào, sợi virus đƣợc tổng hợp liên tục trên sợi tƣơng đồng virus. Protein Rep/Master

Rep lại tiếp tục cắt sợi virus mới đƣợc tổng hợp tại chuỗi bảo toàn (cũng vừa mới đƣợc tổng

hơp) thành một sợi virus hoàn chỉnh dƣới dạng sợi đơn mạch thẳng. Protein Rep/Master Rep

sau đó sẽ nối 2 đầu của mạch thẳng để tạo ra bộ gen virus sợi đơn mạch vòng hoàn chỉnh.

Bộ gen virus tiếp theo đƣợc vận chuyển ra tế bào chất và lắp ráp với CP để tạo các phân tử

virus mới.

51

Hình 4-9 Sơ đồ tái sinh của begomovirus

4.9 TÁI SINH CỦA VIRUS DNA SỢI VÒNG KÉP PHIÊN MÃ NGƢỢC

(PARARETROVIRUS)

Đây là kiểu tái sinh của virus DNA qua trung gian RNA nhờ enzyme phiên mã ngƣợc

Reverse Transcriptase. Chỉ có các virus thuộc 2 họ là Caulimoviridae (hại thực vật, ví dụ

CaMV, RTBV) và họ Hepadnaviridae (hại động vật, ví dụ Hepatitis B virus gây bênh viêm gan

B) có kiểu tái sinh này.

Đối với các virus họ Caulimoviridae, bộ gen virus có đặc điểm sau:

1. Chỉ gồm một phân tử DNA genome sợi vòng kép (dsDNA), có kích thƣớc từ ~ 8 kb.

2. DNA genome không liên tục: trên một sợi có một điểm rời, còn trên sợi còn lại có từ 1 đến 3

điểm rời tùy theo chi. Các điểm rời này là điểm gắn mồi trong quá trình tái sinh virus.

3. Bộ gen virus có từ 1 đến 7 ORF tùy thuộc chi. Các protein có chức năng chung cho tất cả họ

là CP, aspatate protease, RT (reverse transcriptase) và RNAse H.

Quá trình tái sinh virus có đặc điểm là: (i) qua trung gian RNA; (ii) diễn ra trong cả nhân và

tế bào chất. Có thể tóm tắt qua trình tái sinh virus nhƣ sau:

1. Virus xâm nhập vào tế bào (nhờ vector), cởi áo giải phóng bộ gen DNA sợi kép.

2. DNA sợi kép (dạng vòng mở) đƣợc vận chuyển vào nhân.

52

3. Trong nhân, các điểm rời đƣợc bịt kín và phân tử trở thành dạng vòng kín.

4. Trong nhân, RNA pol II của ký chủ (DdRp) phiên mã thành 1 phân tử RNA có kích thƣớc >

bộ gen virus gọi là RNA 35S (hoặc 34S). Ở một số virus nhƣ CaMV và RTBV, một số phân

tử RNA này đƣợc cắt thành RNA nhỏ hơn (ví dụ RNA 19S).

5. RNA 35S (và cả các phân tử RNA nhỏ) đƣợc vận chuyển ra tế bào chất

6. Tại tế bào chất, các ORF đƣơch dịch mã trên khuôn RNA lớn (và RNA nhỏ) thành các

protein chức năng (trong đó có Reverse transcriptase và RNAse H).

7. Tại tế bào chất, phân tử RNA lớn sẽ đƣợc dùng làm khuôn để tổng hợp DNA sợi (-). RNAse

H sẽ loại bỏ phần RNA của phân tử heteroduplex RNA:DNA để giải phóng phân tử DNA

sợi đơn cực (-). Phân tử DNA này sẽ đƣợc dùng làm khuôn để tổng hợp thành phân tử DNA

genome sợi vòng kép mở.

8. Tại tế bào chất các phân tử DNA sợi kép lắp ráp với các protein CP để tạo thành virion.

Chú ý: Các virus đều thuộc nhóm pararetrovirus nên có khả năng tổng hợp gen của nó vào bộ

gen ký chủ. Cơ chế chi tiết của quá trình tổng hợp của các virus chƣa đƣợc hiểu rõ nhƣng nhiều

ký chủ của các virus thuộc chi Caulimoviridae có chứa các đoạn DNA giống của virus (ví dụ

chuối / banana streak virus; RTBV/lúa).

Hình 4-10 Sơ đồ tái sinh của các caulimovirus

53

4.10 CÁC CHIẾN LƢỢC DỊCH MÃ CỦA VIRUS THỰC VÂT

Bộ gen virus nhìn chung nhỏ nên thông tin di truyền của virus phải nén. Virus sử dụng 11

chiến lƣợc khác nhau để đảm bảo các gen của chúng có thể tiếp cận và sử dụng hiệu quả bộ máy

dịch mã của tế bào ký chủ.

4.10.1 Polyprotein

Ví dụ: Các potyvirus (PRSV, PVY…) có bộ gen RNA sợi đơn cực dƣơng, ~10 kb, 1 đầu

5‘UTR và 1 đầu 3‘UTR. Đầu 3‘UTR tận cùng bằng 1 chuỗi polyadenine. Các potyvirus có 1

ORF lớn mã hóa 1 polyprotein => đƣợc xử lý sau dịch mã thành 10 protein chức năng.

Hình 4-11 tổ chức bộ gen và chiến lƣợc dịch mã kiểu polyprotein của potyvirus

4.10.2 Gen phụ (subgenomic)

Gen phụ là các phân tử RNA đƣợc hình thành từ bộ gen chính trong quá trình tái sinh virus.

Chúng có chung đầu 3‘, một số có thể đƣợc lắp ráp trong virion, có thể ảnh hƣởng đến triệu

chứng.

Ví dụ: TMV tạo 2 phân tử gen phụ I1 và I2. Phân tử gen phụ I1 chứa ORF4 và dịch mã tạo

CP. Phân tử gen phụ I2 chứa 2 ORF và dịch mã cả CP và MP (hình 4.12).

54

Hình 4-12 Tổ chức bộ gen và chiến lƣợc dịch mã kiểu gen phụ, bỏ qua mã kết thúc và dịch mã nội

phân tử của TMV

4.10.3 Dịch mã nội phân tử

Trên bộ gen của virus có các vị trí để ribosome của tế bào ký chủ có thể tiếp cận gọi là ―vị trí

tiếp cận ribosome nội phân tử‖ (IRES, Internal Ribosome Entry Site). Đối với mRNA thông

thƣờng, quá trình dịch mã đƣợc thực hiện ở đầu 5‘ của phân tử mRNA (gọi là dịch mã phụ thuộc

mũ CAP). Tuy nhiên do có các vị trí IRES nên virus có thể dịch mã độc lập với kiểu dịch mã

phụ thuộc CAP. Thống kê tới 2009 có khoảng 60 virus động vật và 8 virus thực vật có cách dịch

mã này.

Ví dụ: TMV. Trên phân tử gen phụ I2 của TMV có 1 vị trí IRES giữa ORF3 (MP) và ORF

M4 (CP) => CP có thể đƣợc dịch mã (Hình 4.12).

4.10.4 Bỏ qua mã kết thúc (read – through)

Trên 1 ORF có nhiều mã kết thúc, tuy nhiên mã kết thúc của ORF thứ nhất bị ―dò‖ (leaky) =>

cho phép một số ribosome tiếp tục dịch mã tới mã kết thúc tiếp theo. Hậu quả là virus sẽ tạo ra 2

protein có phần đầu N giống nhau nhƣng có kích thƣớc khác nhau.

Ví dụ hai tiểu phần protein replicase của TMV có kích thƣớc khác nhau đƣợc tạo ra bằng

cách này (Hình 4.12).

4.10.5 Bộ gen phân đoạn

Khoảng 1/3 virus thực vật có bộ gen phân đoạn. Đối với phần lớn virus có bộ gen phân đoạn

thì các phân đoạn gen này đƣợc lắp ráp riêng rẽ (Ví dụ là các nanovirus nhƣ BBTV, các

begomovirus). Một số virus lại có các phân đoạn gen cùng đƣợc lắp láp trong 1 phân tử virion

(ví dụ các reovirus, tospovirus)

55

Hình 4-13 Bộ gen phân đoạn của BBTV (trái) và RRSV (phải) (Viralzone, 2009)

4.10.6 Dò (leaky scanning)

Ở các virus có cơ chế dịch mã kiểu ―dò‖ thì tiểu phần ribosome 40S sẽ trƣợt (scanning) bắt

đầu từ đầu 5‘ của mRNA nhƣng không dịch mã ở mã khởi đầu ATG (mã bị ―dò‖) mà lại dịch

mã từ mã ATG phía hạ lƣu. Có 3 dạng ―dò‖: (i) 2 mã ATG trên cùng 1 ORF, (ii) các ORF

chồng lớp (overlapping) và (iii) 2 ORF liền kề. Dịch mã kiểu dò có thể tao ra hai hay nhiều

protein giống nhau ở phần đầu C nếu quá trình dịch mã diễn ra trên cùng 1 khung đọc hoặc tạo

ra các protein hoàn toàn khác nhau nếu khác khung dịch mã (Hình 4.14).

Hình 4-14 Chiến lƣợc dịch mã kiểu “dò”. Dấu * là mã ATG. Mũi tên chỉ hƣớng dịch mã.

56

4.10.7 Cắt mRNA (Splicing)

Ở một số virus DNA nhƣ caulimovirus, tungrovirus, geminivirus, một phân tử mRNA lớn sau

khi hình thành sẽ cắt để tạo ra các mRNA nhỏ hơn, cho phép chúng có thể đƣợc dịch mã đồng

thời.

Ví dụ: mRNA 35S của CaMV, RTBV sau khi phiên mã sẽ cắt để tạo 1 mRNA 19S nhỏ hơn

(Hình 4.15).

Hình 4-15 Minh họa bộ gen của CaMV và 2 phân tử mRNA 35S và 19S (Haas et al., 2002)

4.10.8 Bổ trợ dịch mã (transactivator)

Ở một số virus DNA nhƣ caulimovirus, tungrovirus, geminivirus, một protein đƣợc dịch mã

từ 1 mRNA sẽ điều khiển (hỗ trợ sự dịch mã của các protein trên mRNA khác (transacting). Ví

dụ: protein P48 của CaMV đƣợc dịch mã từ mRNA 19S sẽ tham gia điểu khiển sự dịch mã của

các ORF trên mRNA 35S.

4.10.9 Nhảy ribosome (Ribosome shunting)

Trên bộ gen của virus, ở vùng không mã hóa có nhiều ORF nhỏ (<50 aa) không có chức

năng => chúng không thể đƣợc dịch mã => Cơ chế ―nhảy‖. Các ORF nhỏ thƣờng tạo ra các cấu

trúc thứ cấp (stem-loop) => không cho phép ribosome trƣợt thẳng qua => buộc phải ―nhảy‖. Cơ

chế dịch mã đặc biệt này đƣợc phát hiện thấy đầu tiên ở virus CaMV và RTBV, tiếp theo cũng

đƣợc phát hiện ở nhiều virus động vật nhƣ hepatitis B.

Ở 2 virus CaMV và RTBV, phân tử mRNA 35 S có một chuỗi ―leader‖ dài chứa tới 19

ORF nhỏ và có cấu trúc phức tạp để tạo ra cấu trúc thứa cấp dạng kẹp tóc. Để có thể dịch mã

theo cơ chế ―nhảy‖, một ORF nhỏ đầu tiên phải đƣợc dịch mã theo cơ chế phụ thuộc CAP. Cơ

chế shunting có thể mô tả tóm tắt ở hình 4-16 nhƣ sau:

Bƣớc 1, 2 và 3: dịch mã ORF nhỏ thứ nhất (quá trình dịch mã sẽ phụ thuộc CAP nhƣ đối với

dịch mã mRNA thông thƣờng)

Bƣớc 4 và 5: ribosome ―nhảy‖ qua cấu trúc thứ cấp (chứa các ORF nhỏ khác).

Bƣớc 6: ribosome bắt đầu dịch mã ORF chính

57

Hình 4-16 Mô hình dịch mã của CaMV, RTBV theo cơ chế “nhảy” (Thiébeauld et al., 2007)

4.10.10 Chuyển khung (Frameshift)

Cách dịch mã này có thể bắt gặp ở các virus có mRNA chứa các ORF chồng lớp

(overlapping). Trên ORF thứ nhất (khung 1), ribosome sẽ tiến hành dịch mã; tuy nhiên trƣớc khi

tới mã kết thúc, ribosome sẽ chuyển khung dịch để dịch mã tiếp trên khung 2 chứa ORF thứ 2

(Hình 4.17). Có 2 chế độ chuyển khung là lùi (-) và tăng (+) 1 nucleotide. Nhiều virus thực vật

có kiểu dịch mã này nhƣ closterovirus, tombustvirus, crinivirus, luteovirus…

Hình 4-17 Dịch mã theo kiểu chuyển khung

4.10.11 Dịch mã 2 chiều (Ambisense)

Đây là một chiến lƣợc rất phổ biến của virus. Ví dụ ở TSWV, bộ gen gồm 3 phân tử RNA

sợi đơn cực (-) hoặc lƣỡng cực ký hiệu là L (large), M (medium) và S (small) có tổng kích thƣớc

từ 11 – 19 kb.

Trên sợi M có 2 ORF đƣợc dịch mã theo 2 chiều ngƣợc nhau. Trên sợi (-) tức là sợi virus,

có 1 ORF mã hóa protein Gn và Gc - là các glycoprotein (liên kết với đƣờng). Ký hiệu n hoặc c

có nghĩa glycoprotein nằm phía đầu amin hay đầu carboxyl của chuỗi polyprotein đƣợc dịch mã

58

từ sợi M. Trên sợi (+) tức là sợi đối virus, có 1 ORF mã hóa một protein phi cấu trúc (không có

mặt trong phân tử virion) ký hiệu là NSm. Quá trình dịch mã của các ORF trên sợi M đƣợc trình

bày ở hình dƣới. Chú ý: mặc dù sợi đối virus đƣợc ký hiệu là sợi (+) nhƣng không đƣợc dịch mã

ngay mà vẫn cần phải đƣợc phiên mã sang mRNA (Hình 4.18).

Hình 4-18 Tổ chức bộ gen của TSWV và dịch mã 2 chiều trên phân đoạn M

4.11 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 4

1. Đặc điểm chung của quá trình tái sinh (sinh sản) virus.

2. Tái sinh của nhóm virus RNA sợi đơn, cực dƣơng (đặc điểm, các bƣớc, hiểu sơ đồ, ví dụ).

3. Tái sinh của nhóm virus RNA sợi âm (đặc điểm, các bƣớc, hiểu sơ đồ, ví dụ).

4. Tái sinh của nhóm virus RNA sợi kép (đặc điểm, các bƣớc, hiểu sơ đồ, ví dụ).

5. Tái sinh của nhóm virus DNA sợi vòng đơn (đặc điểm, các bƣớc, hiểu sơ đồ, ví dụ).

6. Tái sinh của nhóm virus DNA sợi kép, phiên mã ngƣợc (đặc điểm, các bƣớc, hiểu sơ đồ, ví

dụ).

7. Tái sinh của nhóm retrovirus (đặc điểm, các bƣớc, hiểu sơ đồ, ví dụ).

8. Các chiến lƣợc dịch mã của virus (tại sao virus có các chiến lƣợc dịch mã khác nhau, đặc

điểm và ví dụ của mỗi chiến lƣợc).

4.12 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH

1. Buck, K. W. (1999). Replication of tobacco mosaic virus RNA. PhilTrans R Soc Lond B

354, 613-627.

2. Dorokhov, Y. L., Ivanov, P. A., Komarova, T. V., Skulachev, M. V. & Atabekov, J. G.

(2006). An internal ribosome entry site located upstream of the crucifer-infecting

59

tobamovirus coat protein (CP) gene can be used for CP synthesis in vivo. Journal of General

Virology 87, 2693–2697.

3. Gutierrez, C., Ramirez-Parra, E., Castellano, M. M., Sanz-Burgos, A. P., Luque, A. &

Missich, R. (2004). Geminivirus DNA replication and cell cycle interactions. Veterinary

Microbiology 98, 111-119.

4. Haas, M., Bureau, M., Geldreich, A., Yot, P. & Keller, M. (2002). Cauliflower mosaic virus:

still in the news. MOLECULAR PLANT PATHOLOGY 3, 419–429.

5. Hanley-Bowdoin, L., Settlage, S. B., Orozco, B. M., Nagar, S. & Robertson, D. (2000).

Geminiviruses: models for plant DNA replication, transcription, and cell cycle regulation.

Crit Rev Biochem Mol Biol 35, 105-140.

6. Havecker, E. R., Gao, X. & Voytas, D. F. (2004). The diversity of LTR retrotransposons.

Genome Biology 5:225.

7. Hull, R. (2002). Matthews's Plant Virology. Fourth edition: Academic Press.

8. Mackenzie, J. (2005). Wrapping Things up about Virus RNA Replication. Traffic 6, 967–

977.

9. Sanfaçon, H. (2005). Replication of positive-strand RNA viruses in plants: contact points

between plant and virus components. Canadian Journal of Botany 83, 1529-1549.

10. Thiébeauld, O., Pooggin, M. M. & Ryabova, L. A. (2007). Alternative Translation Strategies

in Plant Viruses. Plant Viruses 1, 1-20

60

Chƣơng 5. SỰ DI CHUYỂN CỦA VIRUS TRONG CÂY

5.1 TÓM TẮT NỘI DUNG

Sau khi tái sinh, virus thực vật cần phải di chuyển sang các tế bào mới, mô mới, cơ quan mới

để gây bệnh hệ thống cho cây. Chƣơng này giới thiệu một cách đơn giản cơ chế di chuyển virus

trong cây. Sự di chuyển của virus trong cây đƣợc chia làm 2 nhóm:

1. Di chuyển giữa các tế bào (Cell-to-cell movement).

2. Di chuyển hệ thống trong cây (Long distance movement).

5.2 DI CHUYỂN GIỮA CÁC TẾ BÀO

5.2.1 Cấu tạo sợi liên bào

Sợi liên bào (plasmodesmata) là kênh giao tiếp giữa các tế bào và có cấu trúc phức tạp gắn

liền với màng tế bào và lƣới nội chất. Cấu tạo cơ bản của sợi liên bào gồm 2 ống trụ cấu tạo bởi

màng và lồng vào nhau (Hình 5.1).

Ống trụ ngoài là màng plasma (PM, plasma membrance) bao gồm màng plasma ngoài (OPM,

outer palsma membrance) hƣớng về vách tế bào (CW, cell wall) và màng plasma trong (IPM,

inner plasma membrance) hƣớng vào ống trụ trong.

Ống trụ trong cấu tạo bởi màng lƣới nội chất (ER, endoplasmic reticulum). Ống trụ trong

chính là màng lƣới nội chất bị ép chặt lại nên thƣờng đƣợc ký hiệu là AER (appresed

endoplasmic reticulum). Phần ống trụ trong cũng còn đƣợc gọi là desmotubule.

Trên bề mặt trong của ống trụ ngoài và bề mặt ngoài của ống trụ trong có các protein của ký

chủ gọi là các protein sợi liên bào (PDP, plasmodesmal proteins) gắn vào. Khoảng không giữa

ống trụ ngoài và ống trụ trong là kênh hay lỗ sợi liên bào (kênh plasmodesmata). Dịch tế bào

chất giữa các tế bào liên tục với nhau qua kênh này. Nhìn chung kích thƣớc kênh sợi liên bào

chỉ khoảng 2.5 nm. Do kích thƣớc kênh rất nhỏ, lại có rào cản là các protein sợi liên bào nên

không phải tất cả các loại phân tử đều có thể tự do di chuyển qua kênh. Khả năng sợi liên bào

không cho phép các loại phân tử sinh học đạt kích thƣớc nào đó di chuyển qua gọi là giới hạn

ngăn chặn kích thƣớc (SEL, size exclusion limit) của sợi liên bào và thƣờng đƣợc biểu diễn

dƣới dạng khối lƣợng phân tử kDa. Nhìn chung SEL chỉ cho phép các phân tử có khối lƣợng tối

đa khoảng 1 – 10 kDa đi qua, tùy loại mô và cây.

Hình 5-1 Cấu tạo sợi liên bào. A và B là mô hình sợi liên bào, trong đó A là tiết diện dọc và B là tiết

diện ngang. C là ảnh hiện vi điện tử của sợi liên bào (Lucas, 2006).

61

5.2.2 Sự di chuyển của virus thực vật giữa các tế bào

Do đặc điểm cấu tạo của tế bào và mô thực vật, nhìn chung quá trình di chuyển từ tế bào này

sang tế bào khác của virus không dễ dàng. Các tế bào thực vật liên hệ với nhau bởi sợi liên bào

(plasmodesmata) có cấu tạo phức tạp. Kích thƣớc của kênh (lỗ) sợi liên bào cũng nhƣ SEL quá

nhỏ không cho phép virion của virus nhỏ nhất, thậm chí chỉ bộ gen virus có thể qua lại tự do

đƣợc.

Để khắc phục trở ngại này, các virus thực vật đều mã hóa một hoặc một vài protein đặc biệt

gọi là protein vận chuyển (MP, movement protein). Sử dụng protein MP, kết hợp với sự tham

gia của các protein khác (của cả virus và ký chủ), phân tử virus (virion) hoặc bộ gen virus mới

có thể di chuyển từ tế bào nhiễm sang tế bào khỏe bên cạnh. Virus sử dụng 2 chiến lƣợc để di

chuyển từ tế bào này sang tế bào khác thông qua sợi liên bào.

Ƣớc lƣợng thời gian cho thấy virus nhìn chung di chuyển từ tế bào nhiễm sang tế bào khỏe

trong khoảng 2 – 20 giờ, phụ thuộc nhiệt độ, tổ hợp virus và cây.

5.2.2.1 Chiến lƣợc tạo ống (tubular)

Ít nhất các virus thuộc các họ Bromoviridae, Comoviridae, Caulimoviridae, Nepoviridae và

các chi Tospovirus, Trichovirus sử dụng chiến lƣợc tạo ống để di chuyển giữa các tế bào. Quá

trình di chuyển bao gồm các bƣớc chính sau:

Protein MP của virus tiếp cận sợi liên bào và loại bỏ ống trụ trong (desmotubule) của sợi liên

bào).

Tiếp theo các protein MP của virus lắp ráp lại thành một ống ngang qua sợi liên bào

Cuối cùng, phân tử virus (virion), thông qua tƣơng tác với protein MP của virus đƣợc vận

chuyển qua ống sang tế bào bên cạnh.

Hình 5-2 Chiến lƣợc tạo ống của virus thực vật để di chuyển giữa các tế bào (Hull, 2002)

5.2.2.2 Chiến lƣợc nucleoprotein

Đây là chiến lƣợc phổ biến nhất đối với virus thực vật. Protein MP của virus liên kết với

nucleic acid của virus tạo thành phức hợp nucleoprotein. Protein MP của virus cùng với protein

62

ký chủ sẽ biến đổi sợi liên bào và làm tăng giới hạn ngăn chặn kích thƣớc SEL của sợi liên bào

lên nhiều lần. Tiếp theo, phức hợp nucleoprotein có thể di chuyển từ tế bào nhiễm ban đầu qua

sợi liên bào đã đƣợc biến đổi để sang tế bào khỏe bên cạnh. Tại tế bào khỏe, virus lại thực hiện

tiếp quá trình tái bản bộ gen và dịch mã các protein chức năng.

Chiến lƣợc này đã đƣợc chứng minh chi tiết đối với TMV (hình 5.4). Protein MP của TMV

có thể tăng kích thƣớc SEL từ 7 kDa tới 94 kDa.

Hình 5-3 Mô hình di chuyển giữa các tế bào của TMV

5.3 DI CHUYỂN HỆ THỐNG QUA KHOẢNG CÁCH XA

Về cơ bản, kiểu di chuyển này tƣơng đối tự do đối với virus. Ngoại trừ một số ít virus nhƣ

các sobemovirus di chuyển theo mạch xylem thì phần lớn virus di chuyển theo mạch phloem.

Sau khi đạt tới mạch phloem, virus có thể di chuyển hệ thống khắp cây.

Thời gian virus phát tán từ vị trí xâm nhiễm ban đầu tới khắp cả cây phụ thuộc rất nhiều yếu

tố nhƣ tổ hợp cây và virus, loại cây, loại và tuổi cây, loại virus, kiểu xâm nhiễm và nhiệt độ.

Nhìn chung virus di chuyển trong cây rất chậm (Hình 5.5).

Hƣớng di chuyển của virus trong cây theo mạch phloem nhìn chung là từ mô nguồn ―source‖

tới mô tiêu thụ ―sink‖. Mô nguồn là nơi carbohydrates đƣợc tạo ra (trên lá thành thục) hoặc đƣợc

giải phóng từ mô dự trữ (rễ, thân). Mô tiêu thụ là nơi carbohydrates đƣợc sử dụng để tăng trƣởng

và dự trữ (Hình 5.5).

63

Hình 5-4 Hƣớng và tốc độ di chuyển hệ thống của virus trong cây (Agrios, 2005)

5.4 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 5

1. Cấu tạo và chức năng của sợi liên bào.

2. Đâu là sự khác biệt giữa sự di chuyển của virus thực vật trong ký chủ nhiễm bệnh so với các

nhóm virus khác.

3. Đặc điểm sự di chuyển giữa các tế bào của virus thực vật.

4. Đặc điểm di chuyển hệ thống trong cây của virus thực vật.

5.5 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH

1. Agrios, G. (2005). Plant Pathology. Firth Edition: Academic Press.

2. Hull, R. (2002). Matthews's Plant Virology. Fourth edition: Academic Press.

3. Lough, T. J. & Lucas, W. J. (2006). Integrative Plant Biology: Role of Phloem Long-

Distance Macromolecular Trafficking. Annual Review of Plant Biology 57, 203–232.

4. Lucas, W., J. (2006). Plant viral movement proteins: Agents for cell-to-cell trafficking of

viral genomes. Virology 344 169 – 184.

64

Chƣơng 6. CƠ CHẾ GÂY BỆNH CỦA VIRUS THỰC VẬT

6.1 TÓM TẮT NỘI DUNG

Nhìn chung, so với các lĩnh vực nghiên cứu khác trong virus thực vật học thì cơ chế gây bệnh

của virus ít đƣợc chú ý hơn. Chẳng hạn, thậm chí cho tới tận bây giờ, ngƣời ta vẫn không hiểu rõ

tại sao virus lại tạo ra triệu chứng khảm lá. Hai trở ngại quan trọng dẫn tới hạn chế việc nghiên

cứu cơ chế gây bệnh của virus là (i) chúng tái sinh bên trong tế bào và (ii) không tạo ra độc tố

và phytohormon giống nhƣ đối với nấm và vi khuẩn mặc dù chúng có thể can thiệp vào đƣờng

hƣớng sinh tổng hợp phytohormone.

Cho tới nay, nhờ vào các nghiên cứu ở mức phân tử, nhiều tƣơng tác giữa virus và tế bào cây

ký chủ dẫn tới biểu hiện triệu chứng bệnh đã đƣợc sáng tỏ.

Chƣơng này giới thiệu một số nội dung liên quan đến cơ chế gây bệnh của virus và biểu hiện

triệu chứng bệnh.

6.2 TRIỆU CHỨNG BỆNH VIRUS

Triệu chứng là biểu hiện phản ứng của cây đối với sự tấn công của virus. Một cây bị bệnh và

biểu hiện triệu chứng khi các chức năng sinh lý của nó bị ảnh hƣởng. Một virus ―thông minh‖

khi nó tấn công tế bào, sinh sản mạnh mẽ qua các thế hệ mà không gây bệnh cho cây.

Triệu chứng bệnh virus trên cây trồng có thể chia là 3 nhóm: (i) biến màu, (ii) biến dạng và

(iii) vết đốm. Ngoài ra, bệnh do virus gây ra cũng có thể đƣợc xếp vào 2 nhóm là (i) bệnh hệ

thống và (ii) bệnh cục bộ. Nhìn chung, phần lớn bệnh virus thuộc nhóm bệnh hệ thống. Các

nhóm triệu chứng và triệu chứng bệnh virus có thể tóm tắt nhƣ sau:

6.2.1 Biến màu

Khảm lá (mosaic). Đây có thể đƣợc xem là triệu chứng phổ biến nhất của bệnh virus

Đốm biến vàng (mottling)

Biến vàng (yellowing)

Sáng gân (vein clearing)

Vàng gân (vein yellowing)

Dải gân (vein banding)

6.2.2 Biến dạng

Xoăn lá (curling)

Cuốn lá (rolling)

Lùn (dwarfing)

Còi cọc (stunting)

Phồng gân (enation)

6.2.3 Vết đốm

Đốm chết hoại (necrotic spot)

Đốm vòng (ringspot)

65

6.3 HAI MÔ HÌNH GIẢI THÍCH CƠ CHẾ GÂY BỆNH CỦA VIRUS

6.3.1 Mô hình cạnh tranh tài nguyên

Theo mô hình này, khi virus xâm nhiễm vào tế bào, quá trình tái sinh của virus sẽ sử dụng

các tài nguyên của tế bào nhƣ amino acid, nucleotide để cấu tạo nên phân tử virus mới. Việc

chiếm đoạt quá mức tài nguyên cũng nhƣ trƣng dụng bộ máy phiên mã và dịch mã của tế bào ký

chủ sẽ dẫn tới biểu hiện triệu chứng bệnh.

Ngƣời ta đã chứng minh rằng hàm lƣợng protein và acid nucleic của TMV có thể chiếm tới 1

% tổng số khối lƣợng vật chất của cây thuốc lá nhiễm bệnh nhƣng khi virus dịch mã, nó có thể

huy động tới hơn 50% tổng số protein của cây.

Ngƣời ta cũng quan sát thấy tại vị trí xâm nhiễm, nhiều gen của cây bị suy giảm mức độ

phiên mã và dịch mã. Sự suy giảm này giúp virus dễ dàng tiếp cận với tài nguyên của tế bào

hơn. Ngoài ra trên bộ gen của nhiều virus có chứa các cấu trúc đặc biệt nhƣ các vị trí lắp ráp

ribosome, các chuỗi tăng cƣờng dịch mã ―translation enhancer‖ làm cho mRNA của virus có lợi

thế cạnh tranh hơn so với mRNA của tế bào ký chủ trong quá trình tiếp cận bộ máy dịch mã của

tế bào.

Tuy nhiên, cơ chế gây bệnh của virus theo mô hình cạnh tranh không phải là chủ yếu vì:

Ở nhiều bênh virus, mức độ dữ dội của triệu chứng không tỷ lệ thuận với mức độ tích lũy

virus.

Trong tế bào, vòng đời của virus rất ngắn, quá trình tái sinh của virus xảy ra rất nhanh,

khoảng vài giờ, sau đó suy giảm do đó quá trình cạnh tranh tài nguyên tế bào của virus cũng

diễn ra rất nhanh. Ngoài ra, ngay sau khi virus ngừng tái sinh thì tế bào thƣờng phục hồi tài

nguyên của nó dễ dàng

6.3.2 Mô hình tƣơng tác

Theo mô hình này, virus gây bệnh cho cây thông qua sự tƣơng tác giữa các thành phần của

virus, thƣờng là các protein, với các thành phần của tế bào ký chủ, qua đó ảnh hƣởng đến các

đƣờng hƣớng sinh hóa của tế bào.

Mô hình này phức tạp hơn nhƣng hiện thực và đã đƣợc chứng minh trong nhiều trƣờng hợp

(xem các phần sau). Một trong các đặc điểm quan trọng nhất của mối tƣơng tác này là tính đặc

hiệu. Điều này giải thích tại sao triệu chứng bệnh có thể rất khác nhau khi các virus có quan hệ

gần gũi tấn công cùng cùng loại cây hoặc cùng một virus tấn công các cây khác nhau

Dựa vào hậu quả của sự tƣơng tác đến các chức năng sinh lý của cây, ngƣời ta chia các tƣơng

tác giữa virus và cây thành 2 nhóm:

6.3.2.1 Tƣơng tác gây hậu quả đến ký chủ

Các tƣơng tác nhóm này cần thiết cho các chức năng sống của virus và cũng ảnh hƣởng trực

tiếp đến các chức năng sinh lý của cây dẫn tới triệu chứng bệnh. Có rất nhiều ví dụ về các tƣơng

tác nhóm này (xem các phần sau).

6.3.2.2 Tƣơng tác không gây hậu quả đến ký chủ

Các tƣơng tác này cần thiết cho các chức năng sống của virus nhƣng không hoặc rất ít ảnh

hƣởng đến các chức năng sinh lý của cây và hậu quả là cây không bị bệnh. Ví dụ điển hình cho

các tƣơng tác này là các virus ẩn (cryptic virus). Ví dụ tƣơng tự là tƣơng tác của protein

66

replicase của TMV với 2 protein xuyên màng (TOM1 và TOM3) của tế bào thuốc lá. Tƣơng tác

này cần thiết cho sự tái sinh của TMV và không ảnh hƣởng đến cây. Khi gây bất hoạt 2 gen này

(silencing) thì mức độ tái sinh của virus giảm nhƣng không ảnh hƣởng đến sinh trƣởng của cây.

Cần chú ý là việc phân nhóm này không bất biến vì hậu quả của các tƣơng tác bị ảnh hƣởng

bởi nhiều yếu tố nhƣ môi trƣờng, trạng thái sinh lý của cây.

6.4 CÁC CƠ CHẾ GÂY BỆNH CỦA VIRUS

6.4.1 Virus gây mất cân bằng phytohormone

Nhiều triệu chứng của bệnh virus nhóm biến dạng chẳng hạn nhƣ cây lùn, còi cọc, xoăn cuốn

lá thƣờng liên quan đến mất cân bằng phytohormone trong cây.

6.4.1.1 Auxin

Auxin là một phytohormone chủ yếu của cây, điều khiển nhiều đƣờng hƣớng sinh hóa liên

quan đến sinh trƣởng của cây.

Ví dụ. Thí nghiệm trên cây Arabidopsis với TMV đã xác định đƣợc tƣơng tác của protein

replicase của virus với 1 nhóm các protein của ký chủ gọi là các protein Aux/IAA. Các protein

Aux/IAA là các protein hoạt động trong nhân với chức năng kìm hãm các protein là yếu tố phiên

mã điều khiển sự phiên mã các gen ký chủ đƣợc kích hoạt bằng auxin (ký hiệu là ARFs = auxin-

responsive transcription factors).

Khi không có mặt auxin, protein Aux/IAA liên kết với protein ARF => các gen ký chủ liên

qua đến đƣờng hƣớng auxin không đƣợc hoạt hóa.

Khi có mặt auxin, protein Aux/IAA bị phân hủy và giải phóng protein ARF => hoạt hóa các

gen ký chủ liên qua đến đƣờng hƣớng auxin.

Khi tế bào nhiễm TMV, protein replicase của virus tƣơng tác với protein Aux/IAA và không

cho nó di chuyển vào trong nhân => protein ARF hoạt động một cách không kiểm soát => tạo

triệu chứng bệnh.

Khi nhiễm TMV mang đột biến trên gen replicase làm mất chức năng tƣơng tác với protein

Aux/IAA của nó => cây biểu hiện triệu chứng nhẹ hơn rất nhiều mặc dù mức độ tái sinh và di

chuyển hệ thống của virus vân tƣơng tự nhƣ của virus TMV dạng hoang dại.

Khi gây bất hoạt gen mã hóa protein Aux/IAA của cây Arabidopsis thì cây biểu hiện kiểu

hình giống nhƣ bị nhiễm TMV.

6.4.1.2 Gibberellins

Ví dụ. Cây lúa nhiễm một số virus họ Reoviridae nhƣ RRSV, SRBSDV, RGDV thƣờng biểu

hiện triệu chứng lùn, bộ lá xanh đậm. Triệu chứng này giống với hiện tƣợng cây lúa bị đột biến

mất khả năng tổng hợp gibebrellin. Ảnh hƣởng của sự nhiễm bệnh virus đến cân bằng

gibberellin đã đƣợc chứng minh đối với 1 virus tƣơng tự thuộc họ này là RDV (Rice dwarf

virus).

RDV mã hóa 1 protein gọi là P2. Đây là protein tạo vỏ của virus, qui định tính đặc hiêu

vector và qui định triệu chứng lùn + bộ lá xanh đậm trên cây lúa.

P2 tƣơng tác với 1 protein ký chủ là ent-kaurene oxidase. Ent-Kaurene oxidases là một

protein chủ chốt trong đƣờng hƣớng sinh tổng hợp GA trong cây. Cây lúa nhiễm RDV bị lùn.

67

Khi xử lý cây bệnh với GA3 dẫn tới biến mất triệu chứng trên cây bệnh trong khi xử lý IAA thì

vẫn giống với đối chứng nhiễm (Hình 6.1).

Hình 6-1 Thí nghiệm chứng minh protein P2 của RDP đã can thiệp vào đƣờng hƣớng tổng hợp

gibberelline của cây lúa (Wang et al., 2005)

6.4.1.3 Ethylene

Ethylen là một phytohormone tham gia điều khiển quá trình già hóa và phòng thủ của cây.

Khi cây bị nhiễm virus, hàm lƣợng ethylen thƣờng tăng. Ethylen đã đƣợc chứng minh có liên

quan tới triệu chứng biến vàng và chết hoại của cây bị bệnh virus.

Ví dụ. Cây chuyển gen P6 của virus CaMV biểu hiện triệu chứng giống hệt bị nhiễm virus

nhƣ biến vàng, còi cọc và dải gân.

6.4.2 Protein của virus khởi động lại chu kỳ tế bào

Một ví dụ điển hình cho cơ chế này là các begomovirus. Quá trình tái bản của begomovirus

xảy ra trong nhân tế bào, kể cả ở các tế bào không phân chia. Do vậy, sau khi nhiễm vào tế bào,

begomovirus phải khởi động bộ máy tái sinh của tế bào. Một trong các protein của tế bào ký chủ

thực vật điều khiển chu kỳ tế bào là pRBR (plant retinoblastoma-related protein) - chịu trách

nhiệm chuyển chu kỳ tế bào từ pha G1 sang pha S (pha tổng hợp). Protein Rep của TYLCV đã

đƣợc chứng minh tƣơng tác với pRBR của tế bào ký chủ. Hậu quả là chu kỳ tế bào đƣợc khởi

động lại, tạo các enzym cần thiết cho sự tái bản DNA của virus (Hình 6.2).

68

Hình 6-2 Tƣơng tác giữa protein Rep của begomovirus với pRBR của tế bào cho phép khởi động

lại chu kỳ tế bào

6.5 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 6

1. Các nhóm triệu chứng chính trên cây do virus gây ra. Ví dụ

2. Các triệu chứng chính trên cây do virus gây ra. Ví dụ.

3. Khái niệm 2 mô hình giải thích cơ chế gây bệnh của cây. Mô hình nào hiện thực hơn ? Tại

sao ?

4. Ví dụ cơ chế gây bệnh hƣởng đến mất cân bằng phytohormone.

5. Ví dụ cơ chế gây bệnh do virus khởi động lại chu kỳ tế bào.

6.6 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH

1. Culver, J. N. & Padmanabhan, M. S. (2007). Virus-Induced Disease: Altering Host

Physiology One Interaction at a Time. Annual Review of Phytopathology 45, 221–243.

2. Gutierrez, C. (2002). Strategies for geminivirus DNA replication and cell cycle interference.

Physiological and Molecular Plant Pathology 60, 219-230.

3. Gutierrez, C., Ramirez-Parra, E., Castellano, M. M., Sanz-Burgos, A. P., Luque, A. &

Missich, R. (2004). Geminivirus DNA replication and cell cycle interactions. Veterinary

Microbiology 98, 111-119.

4. Hanley-Bowdoin, L., Settlage, S. B., Orozco, B. M., Nagar, S. & Robertson, D. (2000).

Geminiviruses: models for plant DNA replication, transcription, and cell cycle regulation.

Crit Rev Biochem Mol Biol 35, 105-140.

5. Hull, R. (2002). Matthews's Plant Virology. Fourth edition: Academic Press.

6. Zhu, S., Gao, F., Cao, X., Chen, M., Ye, G. & al., e. (2005). The rice dwarf virus P2 protein

interacts with ent-kaurene oxidases in vivo, leading to reduced biosynthesis of gibberellins

and rice dwarf symptoms. Plant Physiology 139, 1935–1945.

69

Chƣơng 7. LAN TRUYỀN CỦA VIRUS THỰC VẬT

7.1 TÓM TẮT NỘI DUNG

Chƣơng này đề cập đến các cách lan truyền ngoài tự nhiên của virus thực vật, đặc biệt nhấn

mạnh đến phƣơng thức lan truyền qua vector sinh học là côn trùng chích hút.

7.2 GIỚI THIỆU

Virus thực vật lan truyền ngoài tự nhiên theo không gian (từ cây này sang cây khác, từ ruộng

này sang ruộng khác, từ nƣớc này sang nƣớc khác…) và theo thời gian (trong một vụ trồng hoặc

từ vụ này sang vụ khác… ) nhờ các phƣơng thức sau:

1. Tiếp xúc cơ học

2. Nhân giống vô tính

3. Hạt giống/phấn hoa

4. Môi giới

Cần chú ý là một virus có thể có nhiều phƣơng thức lan truyền khác nhau.

7.3 LAN TRUYỀN QUA TIẾP XÖC CƠ HỌC

Lan truyền qua tiếp xúc cơ học là lan truyền nhờ các tổn thƣơng cơ học nhƣ tiếp xúc, cọ xát,

va chạm, chăm sóc, vun xới, tỉa cành lá.

Đây là phƣơng thức lan truyền không phổ biến ngoài tự nhiên mặc dù trong điều kiện thí

nghiệm, nhiều virus vẫn có khả năng này. Các virus có khả năng lan truyền qua tiếp xúc cơ học

phải là các virus có thể tái sinh đƣợc ở tế bào biểu bì, tế bào nhu mô.

Ngoài tự nhiên, chỉ một vài nhóm có khả năng truyền dễ dàng qua tiếp xúc cơ học là các

virus thuộc chi Tobamovirus (ví dụ TMV).

7.4 LAN TRUYỀN QUA NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH

Đây là con đƣờng lan truyền rất quan trọng của nhiều bệnh virus vì nhìn chung các bệnh virus

phần lớn là bệnh hệ thống. Một khi cây đã nhiễm virus thì các bộ phận dùng làm giống nhƣ củ

giống, hom giống, thân ngầm cũng mang virus.

Các ví dụ về virus truyền qua nhân giống vô tính đã phát hiện thấy ở Việt Nam gồm:

BBTV (banana bunchy top virus). Virus gây bệnh chùn ngọn chuối, có thể truyền dễ dàng từ

cây mẹ sang cây con qua thân ngầm.

Các potyvirus gây hại hành tỏi nhƣ OYDV, SYSV và LYSV.

Các potyvirus gây hại trên mía nhƣ SCMV, SrMV (hai virus này cùng gây bệnh trên ngô

nhƣng không truyền qua hạt ngô).

Các virus hại khoai tây nhƣ PVY, PVX

70

7.5 TRUYỀN QUA HẠT GIỐNG (SEED)

7.5.1 Phân biệt 2 khái niệm

―Seed-borne‖ (virus tồn tại trong/trên hạt giống): tồn tại trên/trong hạt nhƣng chƣa chắc

truyền bệnh sang cây con.

―Seed transmitable‖ (virus truyền qua hạt giống): tồn tại trên/trong hạt và truyền bệnh

sang cây con.

Phát hiện thấy virus trên hạt nhƣng chƣa chắc cây đã bị bệnh.

7.5.2 Tầm quan trọng

Truyền qua hạt giống là một trong các cách lan truyền virus thực vật quan trọng. Virus có

thể tồn tại lâu dài trong hạt dẫn tới tăng khả năng phát tán cao cả theo không gian và thời gian.

Khoảng 20 % virus thực vật truyền qua hạt giống. Một số các chi virus có virus truyền qua

hạt giống quan trọng là:

Alfamovirus (1/1)

Comovirus (6/15)

Cucumovirus (3/3)

Ilarvirus (8/17)

Nepovirus (17/40)

Potyvirus (16/179)

Sobemovirus (4/14)

Tobamovirus (7/17)

Tobravirus (3/3)

7.5.3 Đặc điểm của virus truyền qua hạt giống

1. Khả năng truyền virus qua hạt giống khác nhau theo loại cây. Khoảng 2/3 virus truyền qua

hạt giống nhiễm trên cây họ đậu nhƣng rất ít virus nhiễm trên cây hòa thảo truyền qua hạt

giống.

2. Các virus truyền qua hạt giống chủ yếu tồn tại trong phôi hạt (embryo). Nhìn chung phần lớn

các virus thực vật có thể nhiễm vào các bộ phận khác nhau của hạt (ví dụ vỏ hạt, nội nhũ).

Tuy nhiên trong quá trình chín của hạt, các virus tồn tại bên ngoài phôi hạt thƣờng bị bất

hoạt. Chỉ một số ít các virus có thể tồn tại bên ngoài phôi hạt là các tobamovirus nhƣ TMV,

ToMV, Cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV) và một sobemovirus là Southern

bean mosaic virus (SBMV).

3. Không phải tất cả các virus tồn tại trong hạt đều nhiễm sang cây con. Nhiều virus nhiễm vào

phôi nhƣng cũng tồn tại dƣới dạng bất hoạt ở các bộ phận khác của hạt. Ví dụ, trong một thí

nghiệm, 50% hạt đậu có phản ứng ELISA dƣơng với Pea seed borne mosaic virus (PSbMV)

nhƣng chỉ có 2—3 % có mang virus có sức sống (có khả năng truyền virus sang cây con).

4. Khả năng truyền qua hạt nhờ noãn phụ thuộc khả năng nhiễm sớm vào hoa của virus.

5. Hai yếu tố chính qui đinh tỷ lệ nhiễm qua hạt giống của một virus là (i) tƣơng tác ký sinh ký

chủ và (ii) thời điểm nhiễm.

71

6. Virus truyền qua hạt giống có khả năng truyền qua tiếp xúc cơ học và thƣờng nhiễm tế bào

nhu mô. Các virus giới hạn phloem nhìn chung không truyền qua hạt giống.

7. Hạt nhiễm virus có thể hình thành trên cây khỏe do hạt đƣợc thụ phấn từ hạt phấn mang

virus. Tỷ lệ truyền virus sang cây con qua hạt phấn thấp hơn nhiều so với truyền qua noãn.

7.5.4 Các ví dụ về virus truyền qua hạt giống ở Việt Nam

TMV/ToMV tồn tại trên vỏ hạt thuốc lá, cà chua

ZYMV tồn tại trong phôi hạt cây bầu bí, BCMV tồn tại trong phôi hạt cây họ đậu.

7.6 LAN TRUYỀN QUA MÔI GIỚI (CỰC KỲ QUAN TRỌNG)

Truyền qua môi giới là con đƣờng lan truyền quan trọng nhất của virus ngoài tự nhiên. Phần

lớn các bệnh virus thực vật lan truyền ngoài tự nhiên nhờ môi giới. Các môi giới của virus là côn

trùng, nhện hại cây, tuyến trùng, nấm, tơ hồng. Môi giới còn đƣợc gọi là vectơ truyền bệnh.

Nhóm môi giới quan trọng nhất của virus thực vật là côn trùng, trong đó, nhóm côn trùng

chích hút bộ Hemiptera nhƣ rệp muội, bọ rầy, bọ phấn là các nhóm chịu trách nhiệm truyền

nhiều virus có ý nghĩa kinh tế. Khoảng 75 % virus thực vật lan truyền nhờ vector côn trùng.

Bảng 7-1 Thành phần vector của virus thực vật tính đến 2007 (Hogenhout et al., 2008)

Bộ Nhóm vector

Nhóm virus

Tổng % RNA,

Cầu đa

diện

RNA,

Gậy, sợi DNA

RNA,

vỏ bọc

Hemiptera

Rệp muội (aphids) 26 153 13 5 197 28

Bọ phấn (whiteflies) - 13 115 - 128 18

Rầy lá (Leafhoppers) 8 - 15 3 26 4

Rầy thân (planthoppers) 10 4 - 4 18 3

Khác - 8 5 - 13 2

Thysanoptera Bọ trĩ (thrips) 2 - - 14 16 2

Coleoptera Bọ cánh cứng (beetles) 50 1 - - 51 7

Acari Nhện (mites) 10 9 - - 10 1

Nematoda Tuyến trùng 45 3 - - 48 7

Mycota Nấm 8 16 - - 24 3

Vector chƣa xác định 84 60 19 3 166 24

Tổng 133 268 167 30 697

% 33 39 24

7.7 CƠ CHẾ TRUYỀN VIRUS NHỜ VECTOR CÔN TRÙNG

7.7.1 Các kiểu truyền

Gồm 4 kiểu truyền, đặc điểm mỗi kiểu truyền đƣợc trình bày tóm tắt ở Bảng 7.2.

1. Không bền vững (non-persistence)

72

2. Bán bền vững (semi-persistence)

3. Bền vững tuần hoàn (circulative persistence)

4. Bền vững tái sinh (propagative persistence)

Bảng 7-2. Bốn phƣơng thức truyền virus thực vật của côn trùng môi giới

Kiểu truyền Vị trí trong

côn trùng

Thời gian

chích nạp

Thời

gian ẩn

Thời gian

tồn tại khả

nhiễm

Nhân lên

trong côn

trùng

Truyền

qua

trứng

Không bền vững Vòi Nhiều giây không Tối đa vài giờ không không

Bán bền vững Ruột trƣớc Nhiều phút không Vài ngày không không

Bền vững tuần

hoàn Xoang cơ thể Nhiều giờ Nhiều giờ

Nhiều ngày tới

vài tuần không không

Bền vững tái sinh Xoang cơ thể Nhiều giờ Nhiều

ngày

Liên tục,

thƣờng cả đời có có

7.7.2 Các thuật ngữ

Thời gian chích nạp (acquisition time): thời gian côn trùng chích hút trên cây bệnh và nạp

đủ lƣợng virus có thể truyền bệnh

Thời gian ẩn (latent period): thời gian côn trùng đã nạp đủ lƣợng virus nhƣng không thể

truyền virus

Thời gian tồn tại khả nhiễm (retention time): thời gian côn trùng có thể truyền thành công

virus sang cây khỏe = thời gian virus có thể tồn tại trong cơ thể côn trùng.

Hình 7-1. Giải phẫu chung côn trùng chích hút và phân bố virus

7.7.3 Ví dụ 4 kiểu truyền

Không bền vững: rệp đào truyền Papaya ringspot virus (PRSV) gây bệnh đốm hình nhẫn đu

đủ có thời gian chích nạp = 10 – 60 giây, thời gian tồn tại khả nhiễm tới 60 phút.

73

Bán bền vững: rầy xanh đuôi đen truyền Rice tungo bacilliform virus (RTBV) gây bệnh

tungro trên lúa có thời gian chích nạp = 30 phút, thời gian tồn tại khả nhiễm tới 4 ngày.

Bền vững tuần hoàn: bọ phấn truyền African cassava mosaic virus (ACMV) gây bệnh khảm

lá sắn có thời gian chích nạp tối thiểu 3.5 giờ, thời kỳ ẩn = 8 giờ, thời gian tồn tại khả nhiễm

khoảng 9 giờ.

Bền vững tái sinh: rầy nâu truyền Rice grassy stunt virus (RGSV) gây bệnh lúa cỏ có thời

gian chích nạp = 1 giờ, thời kỳ ẩn = 3-28 ngày, thời gian tồn tại khả nhiễm cả đời.

7.8 HÀNH VI CHÍCH HÚT CỦA CÔN TRÙNG BỘ HEMIPTERA

Các côn trùng chích hút bộ Hemiptera (gọi chung là hemipterans) có cấu trúc phần miệng

thích hợp cho quá trình chích hút dịch cây và đƣợc gọi vòi chích (stylets). Đối với nhóm truyền

virus theo kiểu không bền vững và bán bền vững thì phần miệng cũng chính lá nơi bám dính của

virus. Vòi chích của chúng có cấu trúc đủ để xuyên qua vách tế bào mà không làm tổn thƣơng tế

bào. Hành vi chích hút của các hemipterans tƣơng tự nhau, nhƣng chỉ có aphid có khả năng

truyền virus theo kiểu không bền vững (xem phần cơ chế và tính đặc hiệu)

Khi bay, hemipterans không thể phân biệt đƣợc đâu là ký chủ thích hợp, nơi chúng có thể hút

dịch cây, sinh sản, phát triển thành quần thể. Ngay khi hạ cánh trên một cây (chú ý hemipteran

có xu tính với màu vàng nên cây có lá biến vàng dễ hấp dẫn chúng), việc đầu tiên là hemipteran

thực hiện các cú chích hút thăm dò (probing). Khi chích hút, chúng tiết 1 giọt nƣớc bọt dạng keo

dính và nhanh chóng chọc vòi vào tế bào biểu bì để thử thức ăn. Các cú chích hút thăm dò này

thƣờng nông (có nghĩa trên lớp tế bào biểu bì) và thƣờng kéo dài ≤ 1 phút. Sau khi thăm dò trên

tế bào biểu bì, và thấy thức ăn phù hợp, chúng tiếp tục chọc vòi sâu hơn, thƣờng len lỏi giữa các

tế bào, cho tới tận ống rây của mạch phloem. Quá trình này có thể mất nhiều phút tới nhiều giờ.

Giọt nƣớc bọt dạng keo dính này sẽ hình thành 1 lớp bao vòi chích (style sheath) của vector Tuy

nhiên, khi chọc với vào tới mạch phloem, chúng lại bơm một loại nƣớc bọt thứ 2, dạng nƣớc,

chứa nhiều enzyme vào ống rây. Khi rút vòi ra, loại nƣớc bọt thứ 2 này sẽ bịt kín lớp bao vòi

chích.

Hành vi chích hút của vetor cho thấy quá trình chích hút thăm dò sẽ thích hợp để truyền các

virus thuốc nhóm không bền vững hoặc bán bền vững vì các virus này, có mặt ở khắp mọi nơi,

kể cả lớp tế bào biểu bì. Trái lại chỉ khi vòi chích của vector đạt tới mạch phloem, chúng mới có

khả năng truyền các virus nhóm bền vững vì các virus này thƣờng giới hạn ở mạch phloem.

7.9 LAN TRUYỀN VIRUS THEO KIỂU KHÔNG BỀN VỮNG

7.9.1 Lan truyền virus thực vật của aphid họ Aphididae

Trong số côn trùng, aphid là nhóm tiến hóa hóa nhất về khả năng sử dụng thức ăn là thực vật.

Do vậy có thể xem aphid là nhóm vector quan trọng nhất của virus thực vật. Aphid truyền

khoảng 50 % số virus thực vật truyền qua vector côn trùng.

Aphid có một số lợi thế để trở thành một vector hiệu quả của virus thực vật:

Nhiều loài aphid là đa thực (polyphagous). Ví dụ rệp đào (Myzus pesicae) có phổ ký chủ

rất rộng tới 50 họ thực vật.

Chúng có thể sinh sản theo kiểu trinh sinh (parthenogenesis), do đó mật độ quần thể có

thể gia tăng nhanh chóng.

74

Có cấu tạo vòi chích và hành vi chích hút thích hợp với lan truyền virus, đặc biệt đối với

các virus tồn tại ở biểu bì (phần lớn các virus).

Bảng 7-3. Các họ, chi virus truyền qua aphid và phƣơng thức truyền (James & Perry, 2004)

Phƣơng thức Họ Chi Số loài Ví dụ virus

Không bền

vững

Bromoviridae Alfamovirus 1 Alfalfa mosaic virus

Bromoviridae Cucumovirus 3 Cucumber mosaic virus

Comoviridae Fabavirus 4 Broad bean wilt virus-1

Potyviridae Macluravirus 2 Maclura mosaic virus

Potyviridae Potyvirus 91 Potato virus Y

Unassigned Carlavirus 31 Carnation latent virus

132

Bán bền

vững

Caulimoviridae Caulimovirus 9 Cauliflower mosaic virus

Closteroviridae Closterovirus 8 Beet yellows virus

Sequiviridae Sequivirus 2 Parsnip yellow fleck virus§

Sequiviridae Waikavirus 3 Anthriscus yellows virus

Unassigned Unassigned 1 Black raspberry necrosis virus

Unassigned Unassigned 1 Strawberry mottle virus

24

Bền vững

tuần hoàn

Luteoviridae Enamovirus 1 Pea enation mosaic virus-1

Luteoviridae Luteovirus 2 Barley yellow dwarf virus

Luteoviridae Polerovirus 5 Potato leaf roll virus

Luteoviridae Umbravirus 7 Carrot mottle virus‡

Unassigned Nanovirus 4 Banana bunchy top virus

Unassigned Sobemovirus† 11 Blueberry shoestring virus

30

Bền vững tái

sinh

Rhabdoviridae Cytorhabdovirus$ 8 Lettuce necrotic yellows virus

Rhabdoviridae Nucleorhabdovirus‡ 7 Sonchus yellow net virus

15

Tổng 201

7.9.2 Truyền virus bằng aphid theo kiểu không bền vững

Trong số các virus truyền qua aphid thì phần lớn truyền theo kiểu không bền vững

(132/201, 66 %, năm 2000). Cần chú ý rằng: Chỉ aphid mới có thể truyền đƣợc virus theo kiểu

không bền vững.

7.9.3 Đặc điểm truyền theo kiểu không bền vững

1. Thời gian chích nạp ngắn, thƣờng chỉ cần vài giây. Các nghiên cứu cho thấy hiệu quả truyền

virus nhóm không bền vững của aphid tỷ lệ thuận với số cú chích hút thăm dò ở lớp tế bào

biểu bì và ngay khi chúng chọc vòi xuống phía dƣới lớp tế bào biểu bì tới các tế bào nhu mô

hoặc bó mạch thì hiệu quả truyền bệnh sẽ suy giảm nhanh chóng. Các nghiên cứu cũng cho

75

thấy, nếu bỏ đói rệp thì hiệu quả truyền virus cũng tăng vì làm tăng các cú chích hút thăm

dò.

2. Quá trình chích nạp và chích truyền diễn ra tại tế bào biểu bì. Các virus truyền theo kiểu này

thƣờng không đặc hiệu mô và có mặt ở tế bào biểu bì của cây.

3. Virus chỉ tồn tại ở tầng cutile ở phần vòi mà tầng này sẽ bị tách bỏ sau mỗi lần lột xác =>

virus sẽ mất sau mỗi lần lột xác => vector trở nên sạch virus => virus không thể truyền qua

giao phối cũng nhƣ qua thế hệ sau.

4. Virus có thời gian tồn tại khả nhiễm ngắn, tối đa vài giờ. Nhìn chung, khả năng truyền virus

của rệp giảm ngay lập tức sau khi chích nạp. Tốc độ mất khả năng truyền virus phụ thuộc

nhiều yếu tố nhƣng có lẽ chủ yếu do bản chất tồn tại chỉ ở phần vòi của của virus.

5. Virus không có thời gian ẩn có nghĩa sau khi chích nạp, vector có thể truyền ngay virus.

6. Việc giải phóng virus từ vector trong quá trình chích truyền chƣa đƣợc hiểu rõ nhƣng vì

virus tồn tại ở phần vòi nên 2 cơ chế đã đƣợc đề xuất: ―chỉ do hành vi bơm nƣớc bọt‖, (ii)

kết hợp giữa ―bơm nƣớc bọt và chớ (regurgitation) thức ăn‖.

7.9.4 Cơ chế tƣơng tác virus - vector

Nhìn qua kiểu truyền thấy có vẻ không có liên hệ sinh học giữa virus và vector. Tuy nhiên

các bằng chứng khoa học cho thấy có sự tƣơng tác giữa protein của virus và phần vòi của vector.

Tƣơng tác này qui định khả năng, hiệu quả truyền và tính đặc hiệu virus – vector. Hiện có 2 mô

hình tƣơng tác giữa virus và vector:

Mô hình vỏ protein (tƣơng tác trực tiếp)

Theo mô hình này, vỏ protein của phân tử virus sẽ liên kết với receptor nằm phía trong vòi

chích của aphid. Tƣơng tác giữa vỏ protein virus với vòi của rệp qui định cả khả năng truyền lẫn

tính đặc hiệu. Không có tƣơng tác tác này, virus sẽ không thể truyền đƣợc bằng aphid. Mô hình

này đã đƣợc chứng minh ở nhiều virus, đặc biệt là CMV (Cucumber mosaic virus).

CMV là một virus hình cầu đa diện, với bộ gen gồm 3 phân tử RNA (RNA-1, RNA-1 và

RNA-3), sợi đơn, cực (+). Virus có phổ ký chủ rộng nhất trong số các virus thực vật và lan

truyền bằng nhiều loài rệp muôi theo kiểu không bền vững. Vỏ protein của virus có kích thƣớc

218 amino acid. Ngƣời ta đã chứng minh rằng thay đổi các aa ở 2 vị trí 129 và 162 có thể làm

một chủng CMV mất hoặc phục hồi khả năng truyền nhờ rệp bông Aphis gosypii; và thay đổi ở

các vị trí 24, 168 và 214 có thể làm một chủng CMV vốn chỉ truyền đƣợc bằng rệp bông có thể

truuyền đƣợc bằng rệp đào M. persicae.

Mô hình bắc cầu (tƣơng tác gián tiếp)

Theo mô hình này, vòi của aphid sẽ liên kết với một protein vỏ của phân tử virus thông qua

một cầu nối là một protein cũng của virus gọi là protein hỗ trợ. Mô hình này đã đƣợc nghiên

cứu rất kỹ đối với các potyvirus.

Potyvirus là các virus có phân tử dạng sợi mềm, có bộ gen RNA sợi đơn, cực (+). Số lƣợng

các potyvirus lớn nhất trong số các virus thực vật (khoảng 200 virus). Các potyvirus lan truyền

theo kiểu không bền vững bằng nhiều loài aphid và gây nhiều bệnh có ý nghĩa kinh tế (Ví dụ

PRSV gây bệnh đốm hình nhẫn đu đủ, PVY gây bệnh khảm lá khoai tây…).

Tất cả các potyvirus mã hóa cho 1 protein hỗ trợ ký hiệu là Hc-Pro (helper component

protein). Hc-Pro có một motif gồm 4 aa bảo thủ (KITC) nằm ở đầu amin chịu trách nhiệm tƣơng

76

tác với receptor của vòi aphid và một motif gồm 3 aa bảo thủ (PTK) nằm ở đầu carboxyl chịu

trách nhiệm tƣơng tác với motif bảo thủ DAG của protein vỏ (CP) của phân tử virus. Bất kỳ một

đột biến nào ở các motif bảo thủ này đều làm mất khả năng truyền của virus bằng aphid. Có thể

minh họa tƣơng tác mô hình bắc cầu này nhƣ sau:

Vòi aphid (receptor) <=> (KITC)-HcPro-(PTK) <=> (DAG)-CP-Virion

Ví dụ các virus truyền theo kiểu không bền vững ở Việt Nam: PRSV trên đu đủ, bầu bí, có

thể truyền bằng nhiều loài rệp muôi họ Aphididae.

Hình 7-2 Bộ gen của potyvirus (trái) và CMV (phải) kèm theo các gen và motif cần cho lan truyền

virus (Ng & Falk, 2006)

Hình 7-3Mô hình tƣơng tác virus và vector theo phƣơng thức không bền vững và bền vững (Ng &

Falk, 2006)

77

7.10 LAN TRUYỀN VIRUS THEO KIỂU BÁN BỀN VỮNG

7.10.1 Đặc điểm

1. Nhiều nhóm côn trùng khác nhau có kiểu truyền bán bền vững; trong khi chỉ aphid mới có

kiểu truyền không bền vững

2. Trái với kiểu truyền không bền vững, ở kiểu truyền bán bền vững, quá trình chích nạp cũng

nhƣ chích truyền phần lớn xảy ra ở mạch phloem. Điều này giải thích ở kiểu truyền này, thời

gian chích nạp dài hơn, tới nhiều phút và nhiều virus truyền theo kiểu bán bền vững thƣờng

cũng khó truyền bằng tiếp xúc cơ học.

3. Virus chỉ tồn tại ở tầng cutile phần ruột trƣớc (foregut) => tầng này sẽ bị tách bỏ sau mỗi

lần lột xác => giống nhƣ ở nhóm không bền vững virus sẽ mất sau mỗi lần lột xác => vector

trở nên sạch virus => virus không thể truyền qua giao phối cũng nhƣ qua thế hệ sau.

4. Virus có thời gian tồn tại khả nhiễm dài hơn so với nhóm không bền vững, có thể tới vài

ngày.

5. Virus không có thời gian ẩn có nghĩa sau khi chích nạp, vector có thể truyền ngay virus.

6. Việc giải phóng virus từ vector trong quá trình chích truyền chƣa đƣợc hiểu rõ nhƣng có lẽ

do hành vi chớ thức ăn ―regurgitation‖ vì virus tồn tại ở ruột trƣớc.

7.10.2 Tƣơng tác virus - vector

Tƣơng tác vector – virus ở nhóm này dựa trên cả mô hình ―vỏ protein‖ và mô hình ― bắc cầu‖

với sự tham gia của một hoặc nhiều protein hỗ trợ.

Tƣơng tác trực tiếp theo mô hình ―vỏ protein‖ đã đƣợc chứng minh với các virus họ

Closteroviridae nhƣ CTV (Citrus tristeza virus) gây bệnh tàn lụi cây có múi và đặc biệt LIYV

(Lettuce infectious yellows virus) gây bệnh vàng lá rau diếp. Các virus thuộc họ Closteroviridae

là các virus RNA, sợi đơn cực (+) và có hình thái dạng sợi dài mềm. Trong khi CTV truyền

bằng nhiều loài aphid thì LIYV lại truyền bằng bọ phấn theo kiểu bán bền vững. Cả 2 virus đều

có vỏ protein đƣợc cấu tạo từ 4 -5 phân tử protein vỏ khác nhau, trong đó có một protein đƣợc

dịch mã ít trong tế bào gọi là CPm (minor coat protein) đóng vai trò tƣơng tác trực tiếp với vòi

của vector.

Tƣơng tác gián tiếp theo cơ chế ―bắc cầu‖ đã đƣợc chứng minh đối với CaMV, một DNA

virus có phân tử hình cầu với bộ gen DNA dạng vòng kép, lan truyền bằng nhiều loài rệp theo

kiểu bán bền vững. CaMV có tới 3 protein (p2, p3 và p4 – là protein vỏ) tham gia vào quá trình

lan truyền qua vector. Protein p2 sẽ liên kết với vòi của rệp (và do đó nó đóng vai trò là protein

bổ trợ). Protein p3 lại liên kết với p4. Để lan truyền đƣợc, p2 sẽ liên kết với p3 và tạo cầu nối

hoàn chỉnh để virus có thể truyền đƣợc qua vector.

Tƣơng tác gián tiếp còn đƣợc chứng minh với virus tungro. Bệnh tungro là bệnh nguy hiểm

nhất trên lúa. Bệnh gây ra do 2 virus thuộc 2 đơn vị phân loại khác hẳn nhau cùng xâm nhiễm là

RTBV (một DNA virus, chi Badnavirus, có bộ gen DNA dạng vòng kép) và RTSV (một RNA

virus, chi Waikavirus, có bộ gen RNA mạch thẳng, sợi đơn, cực (+)). Bệnh do rầy xanh đuôi đen

(Nephotettix virescens) truyền theo kiểu bán bền vững. RTSV truyền dễ dàng bằng rầy xanh

đuôi đen nhƣng không tạo triệu chứng bệnh. RTBV không thể truyền đƣợc bằng rầy xanh đuôi

đen (nếu bằng cách nào đó, chẳng hạn bằng agroinoculation, chỉ nhiễm một mình trên cây lúa thì

cũng tạo triệu chứng nhẹ). RTBV chỉ lan truyền nhờ rầy khi rầy chích trên cây nhiễm hỗn hợp 2

virus hoặc chích trên cây nhiễm RTSV trƣớc. Khi rầy chích hút trên cây bị nhiễm RTSV, một

78

protein phi cấu trúc của virus này sẽ liên kết với vòi của rầy và đóng vai trò là một protein hỗ trợ

để liên kết với RTBV và do đó tạo điều kiện truyền virus này. Trong trƣờng hợp này RTSV

đƣợc gọi là virus hỗ trợ cho lan truyền RTBV bằng rầy.

7.11 LAN TRUYỀN VIRUS THEO KIỂU BỀN VỮNG TUẦN HOÀN

Các virus truyền theo kiểu bền vững tuần hoàn gồm các virus thuộc họ Luteoviridae,

Geminiviridae và Nanoviridae. Tất cả các virus này đều có phân tử dạng hình cầu đa diện đối

xứng. Các virus họ Luteoviridae và Nanoviridae chỉ truyền bằng aphid còn các virus họ

Geminiviridae thì phần lớn đƣợc truyền nhờ bọ phấn (chi Begomovirus) hoặc bằng rầy (chỉ các

topocuvirus và mastrevirus).

7.11.1 Đặc điểm

1. Quá trình chích nạp cũng nhƣ chích truyền phần lớn xảy ra ở mạch phloem => thời gian

chích nạp và chích truyền khá lâu và phần lớn virus có kiểu truyền này thì rất khó hoặc

không thể truyền đƣợc bằng tiếp xúc cơ học vì virus thƣờng chỉ giới hạn ở mạch phloem.

2. Virus tồn tại trong xoang cơ thể nhƣng nhìn chung không tồn tại ở cơ quan sinh sản. Điều

này dẫn tới:

(i) Virus sẽ không bị mất sau mỗi lần lột xác.

(ii) Virus nhìn chung không truyền qua giao phối cũng nhƣ qua thế hệ sau.

3. Tuyến luân chuyển của virus: cây bệnh => vòi chích => ruột trƣớc => ruột giữa, ruột sau =>

xoang cơ thể => tuyến nƣớc bọt => cây. Nhƣ vậy trong cơ thể côn trùng, virus nhóm bền

vững tuần hoàn phải vƣợt qua ít nhất 2 rào cản:

(i) Từ ruột vào xoang cơ thể

(ii) Từ xoang cơ thể vào tuyến nƣớc bọt

4. Virus có thời gian tồn tại khả nhiễm dài, thƣờng kéo dài nhiều ngày tới nhiều tuần.

5. Virus có thời gian ẩn khá dài vì phải vƣợt qua nhiều rào cản tế bào.

6. Việc giải phóng virus từ vector trong quá trình chích truyền do hành vi bơm nƣớc bọt mang

virus vào phloem.

7.11.2 Quan hệ virus vector

7.11.2.1 Họ Luteoviridae.

Các virus họ Luteoviridae gồm 3 chi là Enamovirus, Luteovirus, và Polerovirus. Chúng đều

là các virus RNA, sợi đơn, cực (+). Hai virus có thể có mặt ở Việt Nam là PLRV (Potato leaf

roll virus) trên khoai tây và một bệnh khá nghiêm trọng trên bông ở Việt Nam là Cotton leafroll

dwarf virus (CLRDV) gây bệnh xanh lùn.

Vỏ protein của các luteovirus đƣợc cấu tạo bởi 2 protein là CP (coat protein), đƣợc dịch mã

nhiều trong tế bào cây và một protein là RT đƣợc dịch mã ít (RT là read through, tức khi dịch

mã ribosome sẽ bỏ qua mã ngừng của protein trƣớc). Cả 2 protein CP và RT đều cần cho tƣơng

tác đặc hiệu virus – aphid. Đặc biệt, RT là protein qui định tính đặc hiệu vị trí xâm nhập của

virus ở ruột (vào chỉ ruột giữa hay cả ruột giữa và ruột sau).

79

7.11.2.2 Họ Geminiviridae

Các geminivirus là các virus DNA sợi vòng đơn. Trong số các geminivirus, các begomovirus

chiếm số lƣợng lớn nhất (~ 20% tổng số virus thực vật). Các begomovirus chỉ mã hóa một

protein vỏ (CP) và tính đặc hiệu vector do CP qui định.

Ở cả luteovirus và begomovirus, ngƣời ta đã chứng minh có sự tƣơng tác giữa phân tử virus

với 1 protein của vi khuẩn nội sinh phổ biến trong vector (vi khuẩn Buchnera). Protein này

(GroEL) thuộc nhóm symbionin và có chức năng bảo vệ phân tử virus khỏi bị phân hủy trong

xoang cơ thể côn trùng. Ngƣời ta đã lợi dụng đặc điểm này để chuyển gen mã hóa GroEL vào

cây cà chua để chống các begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá.

7.12 TRUYỀN THEO KIỂU BỀN VỮNG TÁI SINH

Tất cả các virus thực vật có vỏ bọc đều truyền theo kiểu bền vững tái sinh. Các virus thực vật

có vỏ bọc chỉ thuộc 2 họ là Bunyaviridae (đều truyền bằng bọ trĩ) và Rhabdoviridae (phần lớn

truyền bằng rầy). Một số virus có vỏ bọc có ý nghĩa kinh tế là:

Virus héo đốm cà chua (TSWV, Tomato spotted wilt virus, họ Buniaviridae) gây bệnh

trên nhiều cây trồng và phân bố khắp thế giới (truyền bằng bọ trĩ).

Virus vàng lụi (vàng lá Bắc Giang) (RYSV, Rice yellow stunt virus, họ Rhabdoviridae)

đang gây bệnh vàng lùn (vàng lá) ở miền Bắc (truyền bằng rầy xanh đuôi đen).

Các virus thực vật không có vỏ bọc mà truyền theo phƣơng thức bền vững tái sinh đều truyền

qua rầy. Các virus này thuộc 2 họ là Reoviridae, Tymoviridae và các virus thuộc chi Tenuivirus.

Một số virus thuộc nhóm này là các virus có ý nghĩa ở Việt Nam

Virus lùn sọc đen phƣơng Nam (SRBSDV, họ Reoviridae), truyền bằng rầy lƣng trắng,

rầy nâu nhỏ

Virus lùn xoắn lá (RRSV, họ Reoviridae), truyền bằng rầy nâu.

Virus lúa cỏ (RGSV, chi Tenuivirus), truyền bằng rầy nâu.

7.12.1 Đặc điểm

1. Nhìn chung nhóm này có nhiều đặc điểm chung với virus nhóm bền vững tái sinh.

2. Quá trình chích nạp cũng nhƣ chích truyền phần lớn xảy ra ở mạch phloem => thời gian

chích nạp và chích truyền rất lâu và các virus có kiểu truyền này thì rất khó hoặc không thể

truyền đƣợc bằng tiếp xúc cơ học vì virus thƣờng chỉ giới hạn ở mạch phloem.

3. Virus tồn tại trong xoang cơ thể và nhiều trƣờng hợp ở cả cơ quan sinh sản. Điều này dẫn

tới:

(i) Virus sẽ không bị mất sau mỗi lần lột xác

(ii) Virus nhìn chung có truyền qua giao phối cũng nhƣ qua thế hệ sau

4. Tuyến luân chuyển của virus: cây bệnh => vòi chích => ruột trƣớc => ruột giữa, ruột sau =>

xoang cơ thể => tuyến nƣớc bọt/cơ quan sinh sản => cây. Nhƣ vậy trong cơ thể côn trùng,

virus nhóm bền vững tái sinh phải vƣợt qua ít nhất 3 rào cản:

(i) Từ ruột vào xoang cơ thể

(ii) Từ xoang cơ thể vào tuyến nƣớc bọt

80

(iii) Từ xoang cơ thể vào cơ quan sinh sản nhƣ buồng trứng.

5. Virus nhân lên trong cơ thể côn trùng. Điều này dẫn tới virus có nhiều đặc điểm chung với

các virus động vật về đặc tính xâm nhập tế bào, sinh sản và lắp ráp phân tử.

6. Virus có thời gian tồn tại khả nhiễm dài, thƣờng kéo dài cả đời.

7. Virus có thời gian ẩn khá dài vì cần thời gian cho virus nhân lên.

8. Việc giải phóng virus từ vector trong quá trình chích truyền do hành vi bơm nƣớc bọt đƣa

virus vào phloem.

7.12.2 Ví dụ lan truyền nhờ bọ trĩ theo kiểu bền vững tái sinh

Các virus lan truyền nhờ bọ trĩ theo kiểu bền vững tái sinh đều thuộc chi Tospovirus với

virus điển hình là TSWV. Bọ trĩ là một vector hiệu quả vì chúng là các loài đa thực

Các tospovirus có virion hình cầu, kích thƣớc từ 80 – 120 nm (của tospovirus là từ 80 – 110

nm). Virion có vỏ bọc (envelope), trên có gai nhỏ cấu tạo bằng glycoprotein (Gn, Gc), phần

cuống gai nằm chìm trong một lớp màng kép lipid. Bên trong là 3 phân tử nucleoprotein và một

số transcriptase (RdRp).

Hình 7-4 Sơ đồ phân tử TSWV (Hogenhout et al., 2008)

Mối quan hệ bọ trĩ – tospovirus khá không bình thƣờng vì bọ trĩ trƣởng thành không thể

chích nạp virus và chỉ có thể truyền đƣợc nếu sâu non chích nạp virus. .

Bọ trĩ Frankliniella occidentalis là một vector rất hiệu quả vì truyền 5/14 tospovirus.

Tospovirus phải đƣơng đầu với khoảng 6 loại tế bào và màng khác nhau kể từ khi chúng

đƣợc chích nạp qua vòi và quay trở lại cây khi bọ trĩ chích truyền. Cơ chế lan truyền của

tospovirus có thế đƣợc mô tả nhƣ sau.

Ngay khi đƣợc chích nạp, phân tử virus di chuyển theo ruột trƣớc tới ruột giữa là vị trí chủ

yếu để virus xâm nhập vào tế bào vector. Ngoài cùng thành ruột giữa có một lớp tế bào biểu mô

(epithelial cells) dạng cột đƣợc ngăn cách với ống ruột bởi 1 lớp màng đỉnh (apical membrane)

[1]. Do cấu tạo của lớp tế bào biểu mô nên thành ruột giống nhƣ có một lớp lông (microvilii).

Virus sẽ xâm nhập qua lớp màng đỉnh để nhiễm vào tế bào biểu mô theo lối ―nhập bào‖, tức là

sau khi gai vỏ của virus nhận biết các thụ thể trên bề mặt tế bào biểu mô thì lớp vỏ bọc của virus

sẽ dung hợp với màng tế bào biểu mô và sau đó giải phóng nucleoprotein và enzyme RdRp của

virus vào bên trong tế bào chất của tế bào biểu mô. Tại tế bào biểu mô, virus sẽ sinh sản và tiếp

81

theo thoát khỏi tế bào biểu mô, vƣợt qua lớp màng thứ 2 là lớp màng đáy (basement membrane)

[2] để xâm nhập vào tế bào cơ bao quanh ruột. Tại tế bào cơ, virus tiếp tục sinh sản và hình

thành nhiều viroplasm [hình nhỏ, 3]. Sau khi virus mới đƣợc hình thành, chúng thoát khỏi các tế

bào cơ ruột và di chuyển qua màng đáy [hình nhỏ, 4] của tuyến nƣớc bọt [5], tiếp tục di chuyển

qua lớp màng đỉnh của tuyến nƣớc bọt [6] để vào ống dẫn của tuyến nƣớc bọt và theo dòng nƣớc

bọt để xâm nhập vào cây khi bọ trĩ chích hút cây.

Hình 7-5 Các cơ quan bên trong của bọ trĩ liên quan đến lan truyền tospovirus và các rào cản dạng

màng mà virus phải vƣợt qua. Các số tƣơng ứng với các loại màng và tế bào liên quan đến đƣờng

đi của virus từ khi đƣợc chích nạp đến khi đƣợc chích truyền. L, lumen (tuyến dẫn); PSg, primary

salivary gland (tuyến nƣớc bọt sơ cấp); s, cross sections of muscle (tiết diện cắt ngang cơ); VP,

viroplasm (vị trí tái sinh và lắp ráp virus); DM, dense mass (vị trí có màu đậm khi chụp dƣới kính

hiển vi) (Hogenhout et al., 2008).

7.13 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 7

1. Các phƣơng thức lan truyền của virus thực vật, phƣơng thức lan truyền quan trọng nhất

ngoài tự nhiên.

2. Đặc điểm truyền qua hạt giống (vidụ TMV, ZYMV).

3. Các nhóm vector của virus thực vật.

4. Đặc điểm các kiểu truyền virus nhờ vector côn trùng. So sánh thuật ngữ ―bền vững‖ và

―không bền vững‖.

5. Kiểu truyền không bền vững (đặc điểm, tƣơng tác phân tử của cơ chế trực tiếp và bắc cầu, ví

dụ).

6. Kiểu truyền bán bền vững (đặc điểm, tƣơng tác phân tử của cơ chế trực tiếp và bắc cầu, ví

dụ)

7. Kiểu truyền bền vững tuần hoàn (đặc điểm, vai trò của vi khuẩn nội sinh, ví dụ)

8. Kiểu bền vững tái sinh (đặc điểm, ví dụ).

82

9. Đặc điểm truyền tospovirus nhờ bọ trĩ, so sánh bản chất virus, cơ chế nhân lên trong bọ trĩ

với virus động vật.

7.14 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH

1. Andret-Link, P. & Fuchs, M. (2005). Transmission specificity of plant viruses by vectors.

Journal of Plant Pathology 87, 153-165.

2. Ghanim, M., Morin, S., Zeidan, M. & Czosnek, H. (1998). Evidence for transovarial

transmission of tomato yellow leaf curl virus by its vector, the whitefly Bemisia tabaci.

Virology 240, 295-303.

3. Hogenhout, S. A., Ammar, E., Whitfield, A. E. & Redinbaugh, M. G. (2008). Insect Vector

Interactions with Persistently Transmitted Viruses. Annual Review of Phytopathology 46,

327–359.

4. Hull, R. (2002). Matthews's Plant Virology. Fourth edition: Academic Press.

5. Jones, D. R. (2003). Plant viruses transmitted by whiteflies. European Journal of Plant

Pathology 109, 195–219.

6. Morin, S., Ghanim, M., Sobol, I. & Czosnek, H. (2000). The GroEL protein of the whitefly

Bemisia tabaci interacts with the coat protein of transmissible and nontransmissible

begomoviruses in the yeast two-hybrid system. Virology 276, 404-416.

7. Moritz, G., Kumma, S. & Moundb, L. (2004). Tospovirus transmission depends on thrips

ontogeny. Virus Research 100, 143–149.

8. Ng, J. C. & Perry, K. L. (2004). Transmission of plant viruses by aphid vectors. Molecular

Plant Pathology 5, 505–511.

9. Ng, J. C. K. & Falk, B. W. (2006). Virus-Vector Interactions Mediating Nonpersistent and

Semipersistent Transmission of Plant Viruses. Annual Review of Phytopathology

10. 44, 183–212.

11. Power, A. G. (2000). Insect transmission of plant viruses: a constraint on virus variability.

Current Opinion in Plant Biology 3, 336–340.

12. Syller, J. (2006). The roles and mechanisms of helper component proteins encoded by

potyviruses and caulimoviruses. Physiological and Molecular Plant Pathology 67, 119–130.

13. Whitfield, A. E., Ullman, D. E. & German, T. L. (2005). Tospovirus-Thrips Interactions.

Annual Review of Phytopathology 43, 459–489.

83

Chƣơng 8. PHÒNG CHỐNG BỆNH VIRUS THỰC VẬT

8.1 TÓM TẮT NỘI DUNG

Nội dung chƣơng này giới thiệu các nguyên lý phòng chống bệnh virus, các phƣơng pháp

hiện đang đƣợc sử dụng để phòng chống virus thực vật dựa vào tính kháng tự nhiên và tính

kháng chuyển gen. Bản chất của gen kháng virus cũng nhƣ tính kháng hình thành thông qua cơ

chế câm gen (gene silencing) đƣợc thảo luận kỹ.

8.2 CÁC CHIẾN LƢỢC PHÒNG CHỐNG BỆNH VIRUS

Không giống nhƣ đối với nấm, vi khuẩn và tuyến trùng, hiện nay có thể thấy không có thuốc

hóa học tiêu diệt trực tiếp virus trong cây. Tuy nhiên, ngƣời ta vẫn có thể phòng chống virus

thực vật bằng nhiều chiến lƣợc khác nhau. Các chiến lƣợc chính bao gồm:

1. Sử dụng giống sạch bệnh.

2. Sử dụng giống kháng bệnh dựa vào:

Tính kháng tự nhiên thông qua gen kháng của cây.

Tính kháng từ tác nhân gây bệnh.

3. Tạo tính kháng tập nhiễm hệ thống (SAR, systemic acquired resistance).

4. Tiêu diệt nguồn virus (trên cây vụ trƣớc, trên ký chủ phụ, nhổ bỏ cây bệnh vụ hiện tại)

5. Phòng chống vector (hóa học, sinh học, nhà lƣới, bẫy…)

Tùy thuộc đặc điểm sinh học và dịch tễ học của mỗi loại virus mà ngƣời ta có thể sử dụng

một hay nhiều chiến lƣợc khác nhau.

8.3 SỬ DỤNG VẬT LIỆU GIỐNG SÁCH BỆNH

Phƣơng pháp này áp dụng đối với các virus truyền qua vật liệu giống (hạt giống, các cây nhân

giống vô tính). Vật liệu giống sạch bệnh có thể đƣợc tạo ra bằng một số cách nhƣ:

1. Chọn giống từ nguồn sạch (ruộng không bị bệnh, khu vực không bị bệnh)

2. Xử lý nhiệt.

3. Xử lý hóa chất để tiêu diệt virus tồn tại trên vỏ hạt.

4. Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng.

5. Tạo giống invitro.

6. Sử dụng hóa chất (ribavirin) để tiêu diệt virus trong nuôi cấy mô.

8.4 SỬ DỤNG GIỐNG KHÁNG BỆNH MANG GEN KHÁNG CỦA CÂY

8.4.1 Khái niệm gen –đối - gen

Quan hệ gen-đối-gen (gene-for-gene) do Harol Henry Flor (1900-1991), một nhà bệnh

cây học ngƣời Mỹ xây dựng. Mặc dù không phải là ngƣời đầu tiên sử dụng thuật ngữ gen-đối-

gen, nhƣng ông là ngƣời đầu tiên chứng minh rằng biểu hiện bệnh là hậu quả mối tƣơng tác của

cả tác nhân gây bệnh và ký chủ và di truyền đƣợc.

84

Định nghĩa ―đối với mỗi gen qui định tính kháng trong cây ký chủ có một gen tƣơng ứng qui

định tính không độc trong ký sinh và 2 gen này tƣơng tác đặc hiệu với nhau‖

Quan hệ gen-đối-gen cho tới nay đã đƣợc chứng minh là tồn tại trong rất nhiều loại bệnh do

hầu hết các nhóm tác nhân gây bệnh (nấm, vi khuẩn, virus, tuyến trùng, mollicus...) gây ra.

Các gen cây ký chủ qui định tính kháng đƣợc gọi chung là gen R (Resistance). Các gen ký

sinh qui định tính không độc của ký sinh đƣợc gọi chung là gen Avr (Avirulence).

Tính kháng của cây trồng tuân theo quan hệ gen-đối-gen đƣợc gọi là tính kháng gen-đối-gen.

Tính kháng gen-đối-gen thƣờng là tính kháng đặc hiệu ký chủ, tính kháng đơn gen, tính kháng

gen chủ, tính kháng không bền vững. Hậu quả của một phản ứng kháng gen-đối-gen thƣờng là

phản ứng siêu nhạy/apoptosis.

8.4.2 Gen kháng R và protein R của cây chống virus

8.4.2.1 Gen kháng trội

Cho tới nay, rất nhiều gen kháng R của cây đã đƣợc xác định. Sản phẩm của các gen này gọi

là các protein kháng R.

Hiện nay, các protein kháng R đƣợc chia thành 5 lớp dựa trên đặc điểm cấu trúc và vị trí hoạt

động của chúng trong tế bào ký chủ (Hình 8-1). Các protein trong cùng lớp nhìn chung khá bảo

thủ. Các protein kháng R của cây chống virus phần lớn thuộc 2 lớp CNL và TNL. Đây là 2

lớp chiếm số lƣợng lớn nhất trong tất cả các loại protein kháng R của thực vật.

CNL (CC-NB-LRR). Là các protein có cấu trúc gồm (1) một vùng khóa kéo leucine

(leucine-zipper – LZ) hoặc một chuỗi xoắn kép (coiled-coil – CC) ở đầu amin; (2) một vùng

có khả năng liên kết nucleotide (nucleotide binding – NB) ở vùng trung tâm; và (3) một

vùng lặp giàu leucine (leucine-rich repeats - LRR) phía đầu carboxyl. Các protein của lớp

này hoạt động trong tế bào chất.

TNL (TIR-NB-LRR). Là các protein kháng chỉ có ở cây 2 lá mầm. Về cấu trúc, lớp protein

TNL tƣơng tự lớp CNL nhƣng thay vì chuỗi CC là một chuỗi TIR. Chuỗi TIR là một vùng

protein tƣơng đồng với receptor Toll (của ruồi dấm) và receptor Interleukin-1 (của ngƣời)

(TIR = Toll/Interleukin-1 Receptor). Tƣơng tự protein kháng lớp CNL, các protein của lớp

TNL cũng hoạt động trong tế bào chất.

Cả 2 lớp CNL và TNL còn đƣợc xếp vào chung một họ protein kháng gọi là họ NB-LRR.

Số lƣợng gen kháng của họ này đƣơc xem là chiếm số lƣợng lớn nhất trong các họ protein.

85

Hình 8-1. Các lớp gen kháng R và một số ví dụ mỗi lớp

8.4.2.2 Gen kháng lặn

Các lớp gen kháng R chống virus ở trên là các gen kháng trội. Tuy nhiên, có một nhóm khá

lớn các gen kháng lặn chống virus đã đƣợc xác định trên nhiều loại cây. Phần lớn các gen kháng

lặn này đƣợc nghiên cứu trên cây chống potyvirus. Các nghiên cứu cho thấy nhiều gen cây ký

chủ khi bị đột biến lại tạo ra tính kháng đối với virus. Một trong các gen kháng lặn quan trọng

nhất, phổ biến nhất và đƣợc ký hiệu khác nhau trên các cây khác nhau là gen mã hóa yếu tố khởi

đầu dịch mã eIF4E. Môt số ví dụ về các các gen này là pvr1 (trên ớt), mo1 (trên rau diếp), sbm1

(trên đậu), rym4/5 (trên lúa miến). Dạng isoform của eIF4E là eIF(iso)4E cũng có vai trò tƣơng

tự. Quá trình dịch mã của potyvirus là quá trình độc lập Cap. Tuy nhiên, các yếu tố ký chủ, trong

đó có eIF4E hoặc eIF(iso)4 đều cần thiết cho quá trình này. Nếu các yếu tố phiên mã của ký chủ

mất chức năng thì quá trình dịch mã của potyvirus không thể thực hiện đƣợc và hậu quả là cây

kháng bệnh.

8.4.3 Các gen Avr của virus

Không giống nhƣ gen/protein kháng R của cây, nhìn chung, gen/protein Avr của tác nhân

gây bệnh chia sẻ ít đặc điểm chung với nhau.

Đối với virus thực vật, các gen Avr thƣờng liên quan đến 1 protein chức năng của virus.

Nhiều gen Avr của virus thực vật là protein vỏ CP.

Đối với gen mã hóa yếu tố khởi đầu dịch qui định tính kháng lặn chống potyvirus thì Avr

tƣơng ứng của virus chính là VPg.

86

8.4.4 Ví dụ Gen kháng R của cây và Avr của virus

Bảng 8-1. Một số gen kháng R của cây và Avr tƣơng ứng của virus (Soosaar et al., 2005; Kang et

al., 2005)

Cây Gen R Lớp gen R Virus Avr của virus Biểu hiện kháng

Thuốc lá N TIR-NB-LRR Tobacco mosaic virus Replicase

(RdRp) HR

Khoai tây Rx1,

Rx2 CC-NB-LRR Potato virus X CP

HR, ức chế tái

sinh

Arabidopsis HRT CC-NB-LRR Turnip crinkle virus CP HR

Arabidopsis RCY1 CC-NB-LRR Cucumber mosaic virus

(chủng Y) CP HR

Cà chua Sw-5 CC-NB-LRR Tomato spotted wilt vir

us

Replicase

(RdRp) HR

Khoai tây Y-1 TIR-NB-LRR Potato virus Y ?

Cà chua Tm-2 CC-NB-LRR Tomato mosaic virus MP HR

Thuốc lá va Gen lặn (eIF4E) Potato virus Y VPg Ức chế di chuyển

cell to cell

Ớt Pvr11 Gen lặn (eIF4E) Potato virus Y VPg Ức chế di chuyển

cell to cell

Đậu (pea) Sbm-1 Gen lặn (eIF4E) Pea seed-borne mosaic

virus VPg Ức chế tái sinh

8.5 SỬ DỤNG GIỐNG KHÁNG BỆNH DÙNG GEN VIRUS

Gen qui định tính kháng là gen virus. Tính kháng này đƣợc gọi là ―tính kháng từ tác nhân

gây bệnh, PDR = Pathogen Derived Resistance‖. Tính kháng PDR đƣợc chia làm 2 nhóm:

(i) Tính kháng thông qua protein (của virus)

(ii) Tính kháng thông qua RNA (của virus)

8.5.1 Tính kháng thông qua protein

Trong những năm 1980 - 1990, nhiều nghiên cứu chuyển gen virus vào cây đã đƣợc thực

hiện. Các gen virus có thể khác nhau nhƣ gen CP, gen replicase, gen vận chuyển MP, gen thể

vùi NIa/b của potyvirus..., tuy nhiên phần lớn là gen CP. Đặc điểm nhóm này là tính kháng hình

thành khi gen chuyển đƣợc biểu hiện thành protein trong cây chuyển gen. Hai ví dụ điển hình là:

(i) Cây thuốc lá chuyển gen CP của TMV có thể kháng đƣợc virus này. Đây là nghiên cứu

nổi tiếng do nhóm nghiên cứu của Roger Beachy (http://www.danforthcenter.org/) thực hiện.

Kết quả của nghiên cứu này đã dẫn tới nhiều nghiên cứu tƣơng tự khác. Nghiên cứu chứng tỏ

rằng cây thuốc lá chuyển gen CP có thể kháng đƣợc TMV. Để có thể kháng đƣợc, gen phải đƣợc

biểu hiện thành protein. Cơ chế chính xác về tính kháng vẫn chƣa đƣợc hiểu rõ nhƣng một cơ

chế đƣợc đề xuất là protein CP đƣợc biểu hiện đã ức chế quá trình cởi áo của virus vì nếu lây

nhiễm bằng RNA của virus thì tính kháng bị mất.

(ii) Cây đu đủ chuyển gen CP của PRSV có thể kháng đƣợc virus. Sau khoảng 10 năm

nghiên cứu, nhóm nghiên cứu của Golsalves (ĐH Cornell, Mỹ) đã tạo ra cây đu đủ mang gen CP

của PRSV có thể kháng đƣợc virus này trên đảo Hawaii vốn là nơi bị nhiễm rất nặng PRSV.

87

Hiện nay, cây đu đủ chuyển gen đang chiếm một tỷ lệ lớn tại Hawaii và kỹ thuật này đã đƣợc

chuyển gia cho một số nƣớc nhƣ Brazil, Thái Lan, Đài Loan, Jamaica, Venezuela, Bangladesh,

Tanzania, Uganda, và Kenya. Khi áp dụng công nghệ này cần chú ý là cây đu đủ chuyển gen chỉ

kháng đƣợc các chủng virus tƣơng ứng với gen chuyển. Ngoài ra, các vấn đề liên quan tới sinh

vật biến đổi gen GMO (genetically modified organism) cũng gây trở ngại cho chuyển giao công

nghệ này rộng rãi hơn.

Hình 8-2. Minh họa tính kháng rất cao và bền vững đối với PRSV của giống đu đủ Rainbow

chuyển gen CP so với giống không chuyển gen Sunrise tại Hawai (Golsalves et al., 2004)

Do thành công của chƣơng trình này tại Mỹ nên một số cây trồng chuyển gen dùng kỹ thuật

tƣơng tự cũng đƣợc tạo ra và đƣợc thƣơng mại hóa, chủ yếu tại Mỹ nhƣ:

Các cây dƣa chuyển gen CP chống water melon virus 2 (WMV2), zuchini yellow mosaic

virus (ZYMV), cucumber mosaic virus (CMV).

Khoai tây chuyển gen CP chống PVY, chuyển gen replicase chống Potato leaf roll virus

(PLRV).

8.5.2 Tính kháng thông qua RNA

Cũng trong những năm 1980, một số nghiên cứu chuyển gen kháng bệnh virus đã chứng

minh rằng gen chuyển không nhất thiết phải biểu hiện thành protein. Chẳng hạn các gen vệ tinh

của Cucumber mosaic virus (CMV) hay Tobacco ringspot virus (TRSV) cũng tạo tính kháng

trên cây chuyển gen. Tiếp theo các nhà khoa học thấy rằng, gen chuyển đƣợc lấy từ vùng không

mã hóa cũng tạo ra tính kháng.

Một nghiên cứu quan trọng trong thời gian này, do nhóm Dougherty (Mỹ) thực hiện, là

chuyển gen mã hóa CP của Tobacco eatch virus (TEV) vào thuốc lá để chống virus. Các quan

sát cho thấy các dòng chuyển gen có tính kháng mạnh nhất là các dòng không hoặc có rất ít

mRNA của gen chuyển và cây chuyển gen lúc đầu bị nhiễm thì hàm lƣợng mRNA cao, dần dần

khi cây trở nên kháng thì hàm lƣợng mRNA của gen chuyển cũng dần biến mất. Các tác giả cho

rằng tính kháng này liên quan đến 1 cơ chế gọi là ―câm gen hậu phiên mã‖ (posttranscriptional

gene silencing, PTGS).

Hiện nay, tính kháng của virus thông qua RNA đã đƣợc chứng minh là do cơ chế câm gen

(RNA silencing) hay là cơ chế kiểm soát RNA (RNA interference) của các sinh vật nhân chuẩn.

88

Tính kháng virus của thực vật thông qua cơ chế câm gen có thể tóm tắt qua các bƣớc sau

(Hình 8-3):

1. Hình thành các phân RNA sợi kép (dsRNA) của virus trong tế bào chất

2. Enzyme Dicer của tế bào ký chủ cắt các phân tử dsRNA thành các phân tử RNA nhỏ

(siRNA) có kích thƣớc 21-22 nucleotides

3. Lắp ráp siRNA (sợi đơn) thành phức hợp RISC (RNA induced silencing complex)

4. Phức hợp RISC dƣới sự hƣớng dẫn của siRNA sẽ cắt đặc hiệu các phân tử RNA tƣơng

ứng (RNA virus hoặc các phân tử transcript của nó)

Hình 8-3. Cơ chế câm gen của thực vật chống virus và các các acid nucleic lạ

8.5.3 Hiện tƣợng câm gen

8.5.3.1 Công trình của Craig Mello và Andrew Fire

Năm 1998, Craig Mello và Andrew Fire (và 4 tác giả khác) đã công bố trên tạp chí Nature

một công trình nghiên cứu nhằm tìm hiểu vai trò của RNA đến sự biểu hiện gen. Các tác giả đã

sử dụng một số gen của tuyến trùng Caenorhabditis elegens nhƣ unc-22 (mã hóa protein

myofilament, liên quan đến co cơ), unc-54 (mã hóa protein myosin liên quan đến co cơ), fem-1

(mã hóa protein chứa ankyrin liên quan đến sinh sản), hlh-1 (mã hóa protein họ myoD cần cho

di chuyển và biệt hóa hình dạng), và mex (mã hóa cho 1 protein có nhiều ở phôi). Ba phát hiện

quan trọng từ công trình này là:

Các đoạn dsRNA tƣơng ứng với vùng intron hoặc promoter không tạo ra hiện tƣợng câm

(silencing) của gen tƣơng ứng. Nhƣ vây sự can thiệp (interfering) của RNA là ở mức hậu

phiên mã (post-transcriptional level).

Khi tiêm các RNA ở dạng cùng chiều (sense) hay ngƣợc chiều (antisense) vào tuyến trùng đã

không ảnh hƣởng tới lƣợng mRNA của gen tƣơng ứng tức không làm ảnh hƣởng tới sự biểu

89

hiện của gen. Tuy nhiên khi tiêm các RNA ở dạng sợi kép dsRNA (hỗn hợp của RNA cùng

chiều và ngƣợc chiều) đã làm câm (silence) gen tƣơng ứng. Nhƣ vậy hiện tƣợng câm gen

(gene silencing) đƣợc thực hiện thông qua trung gian là RNA sợi kép (dsRNA).

Khi tiêm dsRNA vào một vị trí thì hiện tƣợng câm gen xuất hiện ở các vị trí khác trong cơ

thể tuyến trùng. Nhƣ vậy dấu hiệu câm gen có thể di truyển hệ thống.

Hiện tƣợng câm gen do dsRNA đã đƣợc các tác giả đặt tên là RNA interfering (sự can thiệp

của RNA). Vì nghiên cứu này, Craig Mello và Andrew Fire đã đƣợc trao giải Nobel y học năm

2006.

8.5.3.2 Lịch sử khám phá siRNA

siRNA đã đƣợc khám phá bởi Hamilton và Baulcombe năm 1999. Các tác giả đã chuyển

gen aco, gus vào cây cà chua và thuốc lá. Trên các cây biểu hiện hiện tƣợng PTGS, các tác giả

đã phát hiện đƣợc các phân tử RNA nhỏ, kích thƣớc khoảng 25 nucleotides, đặc hiệu, nhƣng

ngƣợc chiều với gen chuyển (chứng tỏ không phải là sản phẩm phân hủy của mRNA của các gen

trên). Ngoài ra các tác giả cũng phát phát hiện thấy sau khi lây nhiễm potato virus X (PVX) 4

ngày, trên cây cũng hình thành các phân tử kích thƣớc khoảng 25 nucleotides, đặc hiệu nhƣng

ngƣợc nghĩa với PVX.

8.5.3.3 Định nghĩa siRNAs

siRNAs là các phân tử RNA sợi kép nhỏ, kích thƣớc khoảng 21-25 nucleotides, đƣợc tạo ra

bởi Dicer, một RNA endonuclease nhóm III, là thành phần quan trong của phức hợp RISC gọi là

siRISC có chức năng phân hủy mRNA đồng dạng của nó.

8.5.3.4 Nguồn gốc siRNAs

Phần lớn siRNA có nguồn gốc từ mRNAs, các yếu tố di động (transposons), virus hoặc

DNA dị nhiễm sắc thể (heterochromatic DNA). Nhƣ vậy siRNA có cùng nguồn gốc với gen mục

tiêu.

8.5.3.5 Sinh tổng hợp siRNAs

Quá trình tạo ra các phân tử siRNA có thể đƣợc tóm tắt qua các bƣớc sau:

Hình thành phân tử phiên mã sợi kép dài (dsRNA). Đầu tiên là hình thành các sản phẩm

RNA sợi kép. Các sản phẩm sợi kép này có thể là các gen chuyển đƣợc thiết kế ngƣợc chiều

nhau, hoặc là các sản phẩm trung gian trong quá trình tái sinh của virus.

Hình thành siRNA thành thục. Các phân tử dsRNA đƣợc Dicer cắt thành các phân tử RNA

nhỏ sợi kép có kích thƣớc khoảng 22 nucleotides. Do bị cắt bởi Dicer, các phân tử này có

đầu so le với gốc phosphat ở đầu 5‘ và 2-3 nucleotides đầu 3‘ (overhang). Tiếp theo, phân tử

RNA nhỏ sợi kép này đƣợc đƣợc tách bởi helicase thành 2 phân tử sợi đơn. Các phân tử

siRNA thành thục sợi đơn này sẽ tham gia hình thành phức hợp RISC.

8.5.3.6 Vai trò của siRNA

RNA silencing thông qua siRNA là (i) một cơ chế phòng thủ chống virus, (ii) ngăn chặn sự

biểu hiện quá mức hoặc không cần thiết của các mRNA, và (iii) bảo vệ bộ gen khỏi bị gián đoạn

bởi transposon.

90

8.5.4 Công nghệ RNAi trong tạo giống kháng bệnh virus

8.5.4.1 Thiết kế cấu trúc chuyển gen

Đây là bƣớc quan trọng nhất, quyết định thành công của một chƣơng trình tạo giống kháng

thông qua RNAi (RNA interference).

Có 3 cách để thiết kế cấu trúc chuyển gen virus

- Tạo cấu trúc chứa gen đồng nghĩa (sene).

- Tạo cấu trúc chứa gen ngƣợc nghĩa (antisense).

- Tạo cấu trúc chứa gen theo cả 2 chiều đồng nghĩa và ngƣợc nghĩa (cấu trúc tự bắt cặp).

Tất cả các loại cấu trúc trên muốn tạo tính kháng thì đều phải hình thành cấu trúc dsRNA

trong cây chuyển gen. Có nhiều cách để có thể hình thành cấu trúc dsRNA của gen chuyển.

Chẳng hạn, các cấu trúc đồng nghĩa và ngƣợc nghĩa có thể (i) đƣợc chuyển đồng thời vào cây,

hoặc (ii) đƣợc chuyển riêng biệt để tạo các dòng chứa gen đồng nghĩa hoặc ngƣợc nghĩa. Các

dòng này sẽ đƣợc lai để tạo dòng mang cả gen đồng nghĩa và ngƣợc nghĩa, hoặc (iii) trong

trƣờng hợp cây chỉ đƣợc chuyển với cấu trúc đồng nghĩa hoặc ngƣợc nghĩa thì RdRp của cây sẽ

tạo ra các phân tử dsRNA từ các transcripts của gen đƣợc chuyển.

Tuy nhiên, chỉ loại cấu trúc tự bắt cặp đã đƣợc chứng tỏ là hiệu quả hơn cả trong việc tạo ra

tính kháng. Hiện nay, hầu hết các nghiên cứu tạo tính kháng thông qua RNAi trên cây đều sử

dụng các cấu trúc tự bắt cặp (hình).

Đối với cấu trúc tự bắt cặp, nếu 2 chuỗi gen virus bao quanh một chuỗi intron thì hiệu quả

PTGS sẽ tăng lên rất nhiều.

Hình 8-4. Hiệu quả PTGS với các cấu trúc chuyển gen potato virus Y (PVY) khác nhau. Hiệu quả

đƣợc tính là % cây chuyển gen miễn nhiễm với PVY; gen virus (PVY-pro) là NIa; chuỗi loop là

chuỗi unidA (GUS) dài ~800 nucleotides; intron là của gen Pdk từ cây Flaveria (Smith et al., 2000).

91

8.5.4.2 Ví dụ tạo cây chuyển gen kháng TYLCV thông qua RNAi

TYLCV là một trong nhiều begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua. Các begomovirus

lan truyền ngoài tự nhiên nhờ bọ phấn (B. tabaci) theo kiểu bền vững tuần hoàn.

TYLCV có bộ gen DNA vòng đơn có kích thƣớc khoảng 2.6 – 2.8 kb, chứa 6 gen đƣợc tổ

chức theo 2 chiều ngƣợc nhau.

Trên chiều kim đồng hồ (chiều virus) có 2 gen là gen mã hóa vỏ protein CP và gen AV2.

Trên chiều ngƣợc kim đồng hồ (chiều sợi tƣơng đồng virus) có 4 gen là (i) C1 mã hóa protein tái

sinh hay còn gọi là protein Rep có chức năng chính là cắt - nối bộ gen virus tại một vị trí đặc

biệt ở vùng nguồn gốc tái sinh và tƣơng tác với protein ký chủ để tạo điều kiện thuận lợi cho tái

sinh virus, (ii) C2 mã hóa 1 protein hoạt hóa phiên mã, (iii) C3 mã hóa 1 protein tăng cƣờng tái

sinh và (iv) C4 mã hóa protein C4 với chức năng liên quan đến phổ ký chủ và phát triển triệu

chứng.

Năm 2006, một nhóm nghiên cứu tại đại học Havana (University of Havana), Cuba đã

chuyển gen Rep của TYLCV và cây cà chua và chứng minh rằng cây kháng virus rất tốt.

Hình 8-5 Tạo cây cà chua chuyển gen kháng TYLCV bằng công nghệ RNAi (Fuentes, 2006)

Cấu trúc chuyển gen kháng TYLCV: (a) Tổ chức bộ gen của TYLCV; (b) Bản đồ đoạn

chứa cấu trúc chuyển gien; (c) Sơ đồ hairpin RNA sau khi intron bị cắt khỏi transcript

CaMV 35S: promoter

Intron: chuỗi intron của Castor bean catalase.

LB, LR: bờ trái và bờ phải.

tNos: chuỗi terminator của nopaline synthase.

nptII: neomycin phosphotransferase II (kháng kanamycine).

pNos: chuỗi promoter của nopaline synthase.

92

8.6 ỨNG DỤNG TÍNH KHÁNG TẠO ĐƢỢC (INDUCED RESISTANCE)

8.6.1 Giới thiệu

Cây trồng trong quá trình tiến hóa đã phát triển một số cơ chế phòng thủ chống lại các ức chế

hữu sinh nhƣ tác nhân gây bệnh truyền nhiễm, côn trùng và cả các ức chế vô sinh nhƣ hạn, nóng

và mặn. Trong những năm 1960, Ross đã quan sát thấy rằng khi lây nhiễm nhân cây thuốc lá với

virus TMV thì cây sẽ hình thành tính kháng hệ thống vì khi lây nhiễm tiếp TMV lần thứ 2 tại vị

trí cách xa điểm lây nhiễm lần đầu thì vết đốm chết hoại hình thành nhỏ hơn. Tính kháng kiểu

này đã đƣợc gọi là Tính kháng tập nhiễm hệ thống (SAR, systemic acquired resistance).

Tiếp theo, ngƣời ta thấy rằng các vi khuẩn vùng rễ vốn thúc đẩy tăng trƣởng rễ cây trồng, khi

phát triển trên rễ cũng tạo ra tính kháng hệ thống của cây. Tính kháng kiểu này đã đƣợc gọi là

Tính kháng hệ thống tạo đƣợc (ISR, induced systemic resistance).

Cả 2 loại tính kháng trên đều là biểu hiện khác nhau của một loại tính kháng đƣợc gọi là Tính

kháng tạo đƣợc (IR, induced resistance).

8.6.2 Định nghĩa

8.6.2.1 Tính kháng tạo đƣợc

Tính kháng tạo đƣợc là ―một trạng thái sinh lý của cây với khả năng phòng thủ đƣợc tăng

cƣờng nhờ đƣợc kích hoạt bởi các kích thích môi trƣờng đặc biệt‖. Nhờ khả năng phòng thủ

đƣợc tăng cƣờng này mà cây có thể chống lại đƣợc sự tấn công tiếp theo của các tác nhân gây

bệnh. Tính kháng tạo đƣợc mang tính phổ rộng, chống lại đƣợc nấm, vi khuẩn, virus, tuyến

trùng, côn trùng. Nhƣ vậy có thể thấy tính kháng tạo đƣợc chỉ hình thành sau khi đƣợc kích thích

bởi nguồn kích hoạt (elicitor).

Dựa vào bản chất của nguồn kích hoạt và đƣờng hƣớng dẫn truyền tín hiệu, tính kháng tạo

đƣợc có thể đƣợc chia làm 2 loại chính là là tính kháng tập nhiễm hệ thống SAR và tính kháng

hệ thống tạo đƣợc ISR (Hình 8-6).

8.6.2.2 Tính kháng tập nhiễm hệ thống SAR

Tính kháng tập nhiễm hệ thống SAR là loại tính kháng tạo đƣợc có tính lƣu dẫn (hệ

thống), phổ rộng (chống lại nhiều tác nhân gây bệnh và thậm chí các ức chế vô sinh), thƣờng

dẫn tới biểu hiện protein PR (pathogenesis-related protein) và thông qua đƣờng hƣớng dẫn

truyền tín hiệu SA (salycilic acid).

Nguồn tạo SAR là vi sinh vật gồm nấm, vi khuẩn, virus…Các vi sinh vật này có thể gây bệnh

hoặc không gây bệnh cho cây. Ngoài ra, SAR cũng có thể là các hóa chất nhƣ SA, INA. BTH….

Dấu hiệu phân tử tín hiệu đặc trƣng của SAR là SA có thể đƣợc tạo ra rất nhanh trong vòng

vài giờ (4-6 giờ) sau lây nhiễm và nhân lên nhanh chóng; sau khoảng 24 giờ SAR đã biểu hiện

toàn cây. Sự di chuyển của SAR thƣờng theo hƣớng từ dƣới gốc lên trên ngọn.

Cây có thể duy trì SAR trong thời gian rất lâu, trong nhiều trƣờng hợp kéo dài cả đời của cây.

Cần chú ý nếu tính kháng tạo đƣợc nhƣng không lƣu dẫn tức tính kháng chỉ hình thành xung

quanh vị trí xâm nhiễm thì đƣợc gọi là tính kháng tập nhiễm cục bộ (local acquired resistance).

93

8.6.2.3 Tính kháng hệ thống tạo ISR

Tính kháng hệ thống tạo ISR là loại tính kháng tạo đƣợc có tính lƣu dẫn (hệ thống), phổ

rộng (chống lại nhiều tác nhân gây bệnh), không dẫn tới biểu hiện proteinPR và thông qua

đƣờng hƣớng dẫn truyền tín hiệu JA/ET (jasmonic acid và ethylen).

Nguồn tạo ISR là vi sinh vật vùng rễ không gây bệnh cho cây, điển hình là các vi khuẩn vùng

rễ nhƣ Pseudomonas, Bacillus hoặc Bradyrhizobium.

Hình 8-6 Hai loại tính kháng tạo đƣợc: tính kháng tập nhiễm hệ thống (SAR) và tính kháng hệ

thống tạo đƣợc (ISR) (Vallad & Goodman, 2004).

8.6.3 Các hợp chất có khả năng cảm ứng SAR

SAR hình thành khi có sự tấn công của vi sinh vật. Tuy nhiên nhiều thí nghiệm đã chứng tỏ

rằng SAR có thể đƣợc tạo ra khi xử lý các hợp chất tự nhiên hoặc tổng hợp. Tất cả các hóa chất

có khả năng cảm ứng SAR đƣợc gọi là các chất kích hoạt SAR (chất kích kháng).

Để có thể đƣợc xem là chất kích hoạt SAR thực sự, một hóa chất hoặc sản phẩm chuyển hóa

của nó phải không có hoạt tính kháng sinh. Một số thuốc hóa học trừ bệnh ngoài hoạt tính kháng

nấm còn có khả năng cảm ứng SAR nhƣ Fosetyl-Al (Aliet), metalaxyl, Cu(OH)2.

Dựa vào nguồn gốc hình thành, các hợp chất có thể cảm ứng tạo SAR bao gồm:

8.6.3.1 Các hóa chất tổng hợp có khả năng cảm ứng SAR

Một số hóa chất tổng hợp có khả năng kích thích cây hình thành SAR đƣợc ứng dụng nhiều

trong nghiên cứu phòng chống virus (và các tác nhân gây bệnh cây khác) là SA, INA và BTH

(Hình 8-7).

Hình 8-7 Cấu trúc hóa học của SA, INA và BTH

94

SA (Salicyclic acid) đƣợc biết là một phytohormone nội bào tham gia dẫn truyền tín hiệu

nhằm điều khiển nhiều quá trình sinh lý của cây nhƣ nảy mầm, tăng trƣởng tế bào, hô hấp, đóng

mở khí khổng, già hóa. SA cũng khởi động các phản ứng kháng chống lại các ức chế (stress) vô

sinh nhƣ hạn, mặn và hữu sinh nhƣ tác nhân gây bệnh. Trong cây SA đƣợc tổng hợp bằng 2

đƣờng hƣớng enzyme:

Từ chorismate nhờ enzyme Isochrosimate synthase (ICS) và isochrosimate pyruvate lyase

(IPL).

Từ phenylalanine (một amino acid), nhờ enzym Phenyl alanine ammonia lyase (PAL).

Vì SA tự do ở nồng độ cao có thể ảnh hƣởng bất lợi đến các đƣờng hƣớng sinh hóa của cây

nên trong cây nên để tránh nồng độ gây độc, SA đƣợc cây tổng hợp ra phần lớn đƣợc chuyển

hóa thành dạng SA O-β-glucoside (SAG) và đƣợc dự trữ trong không bào, ngoài ra SA cũng

đƣợc chuyển hóa thành các dạng methyl salicylate (MeSA), methyl salicylate O-β-glucoside

(MeSAG), và salicyloyl glucose ester (SGE). Tất cả các hợp chất này là dạng bất hoạt của SA và

không gây độc tế bào. Khi cần thiết, các hợp chất trên lại đƣợc chuyển hóa lại thành SA.

Sử dụng SA ngoại bào (tức là phun dung dịch SA lên cây) đã đƣợc chứng minh cảm ứng tạo

tính kháng SAR đối với nhiều tác nhân gây bệnh nhóm sinh dƣỡng gồm cả nấm, vi khuẩn và

virus. Tuy nhiên vì nồng độ hiệu quả để tạo tính kháng của SA (> 100 µM) có thể gây độc tế bào

nên SA tự do không đƣợc ứng dụng ngoài thực tiễn để tạo tính kháng.

INA (dichloroisonicotinic acid). INA có cơ chế cảm ứng SAR giống nhƣ SA chống lại nhiều

tác nhân gây bệnh. INA có thể cảm ứng SAR trƣớc hoặc sau khi lây nhiễm. Điểm khác biệt so

với SA là INA cảm ứng SAR độc lập với SA và hoạt động ở phía hạ lƣu đƣờng hƣớng dẫn

truyền tín hiệu so với SA. Tƣơng tự nhƣ SA, INA có thể gây độc cho cây nên cũng không đƣợc

ứng dụng ngoài thực tiễn.

BTH (benzo(1,2,3)-thiadiazole-7-carbothiolic acid (BTH, acibenzolar-S-methyl). BTH có cơ

chế tạo tính kháng SAR giống nhƣ SA và có thể chống đƣợc nhiều nhóm tác nhân gây hại kể cả

virus. BTH có hiệu quả chống nấm Cercospora nicotianae, Peronospora tabacina,

Phytophthora parasitica, nhiều nấm phấn trắng, gỉ sắt và sƣơng mai khác, vi khuẩn

Pseudomonas syringae, virus TMV, CMV và TSWV (Hình 8-8). Điểm quan trọng của BTH so

với các hợp chất tạo tính kháng SAR khác là BTH không gây độc cho cây. Chính vì vậy, BTH

đã đƣợc ứng dụng trong thực tiễn (thƣơng mại hóa) làm thuốc kích kháng. Sản phẩm thƣơng mại

của BTH gồm BION (hãng Syngenta) hoặc Actiguard (hãng Novartis).

Hình 8-8. Cây thuốc lá xử lý BTH (Bion) (trái) ức chế biểu hiện triêu chứng bệnh trên thuốc lá do

TSWV gây ra. Đối chứng không xử lý (phải) có triệu chứng dữ dội (Mandal et al., 2007)

95

8.6.3.2 Các thuốc BVTV có hoạt tính tạo SAR

Một số thuốc bảo vệ thực vật, bao gồm cả thuốc trừ bệnh và thuốc trừ sâu, ngoài khả năng ức

chế trực tiếp dịch hại cũng có hoạt tính tạo tính kháng SAR. Các ví dụ của nhóm này bao gồm:

Thuốc trừ nấm chứa gốc phosphate nhƣ fosetyl-Al (Al(PO3)3) (ví dụ thuốc thƣơng mại là

Aliette®). Đây là thuốc đặc hiệu với nấm Phytophthora. Ngoài tác động trực tiếp của fosetyl-Al

do giải phóng H3PO3 thì thuốc này (và cả các chứa gốc phosphate khác nhƣ phosphate kali) có

khả năng cảm ứng tạo SAR trong cây. Muối phosphate có thể cô lập ion Ca+2

dẫn tới phá hủy

vách tế bào và tạo thành các oligomer có khả năng cảm ứng SAR, tăng cƣờng hoạt tính enzyme

PAL và tích lũy SA.

Thuốc trừ nấm Probenazole (tên thƣơng mại Oryzemate, đặc trị nấm đạo ôn lúa, không đăng

ký tại Việt Nam) tăng cƣờng biểu hiện protein PR, tăng cƣờng hoạt tính enzyme PAL và tích lũy

SA trên lúa và thuốc lá.

Thuốc trừ nấm nhóm Strobilurin. Đây là các thuốc có có nguồn gốc từ nấm mũ Strobilurus

tenacellus. Nhóm thuốc này có nhiều hoạt chất khác nhau. Một trong số các hoạt chất là

Pyraclostrobin (một sản phẩm thƣơng mại chứa hoạt chất này là Cabrio Top, có đăng ký tại Việt

Nam). Xử lý thuốc này trên thuốc lá làm tăng tính kháng TMV do thuốc kích thích biểu hiện các

enzyme oxidase ở ty thể, làm tăng biểu hiện protein PR. Thuốc cũng làm tăng tính chịu hạn,

giảm sự già hóa và kéo dài thời gian chín của quả, hạt trên nhiều cây trồng (thuốc có ―hiệu ứng

xanh‖).

Thuốc trừ sâu Imidacloprid (ví dụ tên thƣơng mại Confidor, Admire). Đây là thuốc trừ côn

trùng chích hút nhƣng cũng tạo tính kháng SAR nhƣ thuốc trừ nấm nhóm strobilurin.

8.6.4 Hóa chất có khả năng cảm ứng tính kháng tạo đƣợc khác

8.6.4.1 Chitosan

Chitosan là polymer mạch thẳng đƣợc cấu tạo bởi liên kết β-(1-4) của 2 tiểu phần D-

glucosamine (tiểu phần bị loại bỏ nhóm acetyl) và tiểu phần N-acetyl-D-glucosamine (tiểu phần

chứa nhóm acetyl). Chitosan đƣợc hình thành từ sự loại bỏ nhóm acetyl của chitin (dạng

polymer mach thẳng của N-acetyl-D-glucosamine) (Hình 8-9). Chitosan có nhiều ứng dụng

trong nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm và y học. Chitosan không đƣợc xem là chất kích

kháng thực sự vì nó có hoạt tính kháng nấm. Tính kháng tạo đƣợc của chitosan rẩt rộng, chống

lại nhiều tác nhân gây bệnh nhƣ nấm, vi khuẩn và virus.

.

Hình 8-9 Sự hình thành chitosan từ chitin

96

Tuy nhiên chitosan có nhƣợc điểm lớn là không hòa tan trong nƣớc cũng nhƣ dung môi hữu

cơ. Để khắc phục nhƣợc điểm này, chitosan đƣợc chuyển thành dạng oligochitosan bằng cách

thủy phân chitosan. Oligochitosan có hoạt tính sinh học mạnh hơn nhiều so chitosan thô. Khả

năng kích kháng của oligochitosan phức tạp, liên quan đến cả đƣờng hƣớng SA và JA/ET và do

đó tạo tính kháng với các tác nhân gây bệnh thuộc cả 2 nhóm biotroph và necrotroph. Mức độ

kháng và tính đặc hiệu của oligochitosan phụ thuộc vào trọng lƣợng phân tử, mức độ acetyl hóa

và pH của nó. Vi dụ hình 8-10 cho thấy oligochitosan có thể ức chế sự xâm nhiễm của TMV

trên thuốc lá.

Hình 8-10 Hiệu quả ức chế của oligochitosan đối với TMV trên thuốc lá. (A) đối chứng, (B)–(F): xử

lý chitosan lần lƣợt ở các nồng độ 1 ppm, 10 ppm, 25 ppm, 50 ppm và 100ppm (Yin et al., 2010).

8.6.4.2 BABA

BABA (Beta-aminobutyric acid). Hợp chất chất này có khả năng tạo tính kháng chống cả các

ức chế vô sinh và hữu sinh. Đƣờng hƣớng hình thành tính kháng tạo đƣợc của BABA khá phức

tạp. Trong một số trƣờng hợp, tính kháng cảm ứng bởi BABA hình thành thông qua tích lũy SA

nhƣng trong nhiều trƣờng hợp khác lại liên quan đến một phytohormone nội sinh khác là ABA

(abssicic acid).

8.6.4.3 Các hợp chất khác

Nhiều loại hợp chất khác, có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp cũng đƣợc biết có khả năng

kích thích cây hình thành tạo tính kháng. Một số ví dụ là vitamin (B1, B2, K), 3-acetonyl-3-

hydroxyindole (AHO), polyamines, catechin, polyacrylic acid, các oligosaccharide có nguồn gốc

từ cây (oligogalacturonide, cellodextrin), một số hợp chất có nguồn gốc từ tác nhân gây bệnh

(glucan, peptide, ergosterol, syringolin).

8.7 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 8

1. Các chiến lƣợc phòng chống bệnh virus.

2. Các phƣơng pháp tạo giống sạch bệnh.

3. Sử dụng giống kháng bệnh mang gen kháng có nguồn gốc từ cây (đặc điểm gen kháng R

của cây chống virus và đặc điểm ge Avr của virus; ví dụ).

97

4. Sử dụng giống kháng dựa cơ chế PDR (khái niệm chung; ví dụ tạo cây chuyển gen chống

PRSV)

5. Khái niệm tính kháng thông qua RNA và cơ chế câm gen; ví du tạo cây chuyển gen kháng

TYLCV).

6. Cơ chế và đặc điểm của tính kháng tạo đƣợc và tính kháng tập nhiễm hệ thống SAR

7. Các hóa chất có thể ứng dụng tạo tính kháng SAR chống virus.

8.8 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH

1. Beachy, R. N. (1999). Coat-protein-mediated resistance to tobacco mosaic virus: discovery

mechanisms and exploitation. PhilTrans R Soc Lond B 354, 659-664.

2. Beckers, G. J. & Conrath, U. (2007). Priming for stress resistance: from the lab to the field.

Current Opinion in Plant Biology 10, 425-431.

3. Bent, A. F. & Mackey, D. (2007). Elicitors, effectors, and R genes: The new paradigm and a

lifetime supply of questions. Annu Rev Phytopathol 45, 399-436.

4. Chisholm, S. T., Coaker, G., Day, B. & Staskawic, B. J. (2006). Host-Microbe Interactions:

Shaping the Evolution of the Plant Immune Response. Cell 124, 803–814,.

5. Cieslinska, M. (2007). Application of thermo-and chemotherapy in vitro for eliminating

some viruses infecting Prunus sp. fruit trees. Journal of Fruit and Ornamental Plant Research

15, 117-124.

6. Durrant, W. E. & Dong, X. (2004). Systemic acquired resistance. Annu Rev Phytopathol 42,

185-209.

7. Gonsalves, D., Gonsalves, C., Ferreira, S., Pitz, K., Fitch, M., Manshardt, R., and Slightom, J.

(2004). Transgenic virus resistant papaya: From Hope to Reality for Controlling of Papaya ringspot virus in Hawaii. Online. APSnet feature, American Phytopathological Society.

8. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E. & Mello, C. C. (1998).

Potent and specific genetic interference by double-strandedRNA in Caenorhabditis elegans.

Nature 391, 806-811.

9. Fuentes, A., Ramos, P. L., Fiallo, E., Callard, D., Sanchez, Y., Peral, R., Rodrıguez, R. &

Pujol, M. (2006). Intron–hairpin RNA derived from replication associated protein C1 gene

confers immunity to Tomato Yellow Leaf Curl Virus infection in transgenic tomato plants.

Transgenic Research 15, 291–304.

10. Hamilton, A. J. & Baulcombe, D. C. (1999). A species of small antisense RNA in

postranscriptional gene silencing in plants. Science 286, 950-952.

11. Hammerschmidt, R. (2009). Systemic Acquired Resistance. In Plant Innate Immunity, pp.

173-222.

12. Hayat, Q., Hayat, S., Irfan, M. & Ahmad, A. (2010). Effect of exogenous salicylic acid

under changing environment: A review. Environmental and Experimental Botany 68, 14-25.

13. Hull, R. (2002). Matthews's Plant Virology. Fourth edition: Academic Press.

14. Jones, J. D. G. & Dangl, J. L. (2006). The plant immune system. NATURE 444, 323-329.

98

15. Kang, B.-C., Yeam, I. & Jahn, M. M. (2005). GENETICS OF PLANT VIRUS

RESISTANCE. Annu Rev Phytopathol 43, 581–621.

16. Kiraly, L., Barnaz, B. & Kiralyz, Z. (2007). Plant resistance to pathogen infection: Forms

and mechanisms of innate and acquired resistance. J Phytopathol 155, 385-396.

17. Mandal, B., Mandal, S., Csinos, A. S., Martinez, N., Culbreath, A. K., & Pappu, H. R.

(2008). Biological and molecular analyses of the acibenzolar- S-methyl-induced systemic

acquired resistance in flue-cured tobacco against Tomato spotted wilt virus. Phytopathology

98,196-204.

18. Mysore, K. S. & Ryu, C. M. (2004). Nonhost resistance: how much do we know? Trends

Plant Sci 9, 97-104.

19. Ryals, J. A., Neuenschwander, U. H., Willits, M. G., Molina, A., Steiner, H. Y. & Hunt, M.

D. (1996). Systemic acquired resistance. Plant Cell 8, 1809-1819.

20. Smith, N. A., Singh, S. P., Wang, M.-B., Stoutjesdijk, P. A., Green, A. G. & Waterhouse, P.

M. (2000). Total silencing by intronspliced hairpin RNAs. Nature 407, 319-320.

21. Soosaar, J. L. M., Burch-Smith, T. M. & Dinesh-Kumar, S. P. (2005). MECHANISMS OF

PLANT RESISTANCE TO VIRUSES. NATURE REVIEWS 3, 789-798.

22. Takken, F. L. W. & Joosten, M. (2000). Plant resistance genes: their structure, function and

evolution. Eur J Plant Pathol 106, 699-713.

23. Vallad, G.E. & Goodman, R.M. (2004). Systemic Acquired Resistance and Induced

Systemic Resistance in Conventional Agriculture Crop Sci. 44,1920–1934

24. Vanderschuren, H., Stupak, M., Fütterer, J., Gruissem, W. & Zhang, P. (2007). Engineering

resistance to geminiviruses – review and perspectives. Plant Biotechnology Journal 5, 207–

220.

25. Vlot, A. C., Dempsey, D. A. & Klessig, D. F. (2009). Salicylic Acid, a Multifaceted

Hormone to Combat Disease. Annu Rev Phytopathol 47, 177-206.

26. Yin, H., Zhao, X. & Du., Y. (2010). Oligochitosan: A plant diseases vaccine—A review.

Carbohydrate Polymers 82, 1–8

27. Zhang, Y.-Y., Li, H.-X., Ouyang, B. & Ye, Z.-B. (2006). Regulation of Eukaryotic Initiation

Factor 4E and Its Isoform: Implications for Antiviral Strategy in Plants. Journal of

Integrative Plant Biology 48, 1129−1139.

99

Chƣơng 9. CHẨN ĐOÁN BỆNH VIRUS THỰC VẬT

9.1 TÓM TẮT NỘI DUNG

Nội dung chƣơng này tập trung vào kỹ thuật chẩn đoán virus dựa trên đặc trƣng phân tử, cả

mức protein và acid nucleic vủa virus.

9.2 GIỚI THIỆU

Chẩn đoán là xác định chính xác tác nhân gây bệnh. Nhiều phƣơng pháp đã đƣợc sử dụng để

chẩn đoán virus thực vật dựa vào:

1. Đặc trƣng sinh học: Triệu chứng, cây chỉ thị

2. Đặc trƣng hình thái: Kính hiển vi điện tử, thể vùi

3. Đặc trƣng phân tử (mức protein): Khuyếch tán trong gel, ELISA, dot blot miễn dịch

4. Đặc trƣng phân tử (mức acid nucleic): PCR, RT-PCR, dot blot (lai DNA), dsRNA, giải

trình tự

Hiện nay, kỹ thuật chẩn đoán bệnh virus phổ biến nhất, đơn giản và tƣơng đối rẻ là kỹ thuật

ELISA. Ngoài ra, cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học thì các kỹ thuật liên quan đến

PCR, RT-PCR và giải trình tự cũng đang trở nên thông dụng.

9.3 CHẨN ĐOÁN DỰA VÀO TRIỆU CHỨNG

Hiển nhiên, chẩn đoán bằng triệu chứng phụ thuộc lớn vào kinh nghiệm của ngƣời nghiên

cứu.

Ƣu điểm: là kỹ thuật chẩn đoán nhanh chóng, rẻ nhất và trong nhiều trƣờng hợp khá chính

xác.

Nhƣợc điểm: nhìn chung, chẩn đoán dựa vào triệu chứng bệnh virus rất khó và trong nhiều

trƣờng hợp là không thể vì một số lý do sau:

Mức độ biến động triệu chứng quá lớn, phụ thuộc nhiều vào điều kiện ngoại cảnh và

trạng thái sinh lý của cây.

Một virus có thể tạo rất nhiều triệu chứng khác nhau trên cùng một cây, trên các giống

cây khác nhau.

Nhiều virus khác nhau, thậm chí thuộc các đơn vị phân loại khác nhau có thể tạo triệu

chứng giống nhau.

Trên một cây có thể nhiễm 2 hay nhiều virus khác nhau. Tƣơng tác của các virus có

thể rất phức tạp.

9.4 CHẨN ĐOÁN DỰA VÀO CÂY CHỈ THỊ

Cây chỉ thị là các cây tạo ra các triệu chứng khá đặc trƣng cho 1 virus. Đây là kỹ thuật chẩn

đoán đƣợc thực hiện nhiều trƣớc giai đoạn phát triển của công nghệ sinh học.

100

Nhiều cây chỉ thị thông dụng cho virus thực vật thuộc các chi Chenopodium, Nicotiana,

Cucumis, Phaseolus, Solanum, Vicia, Vigna và Brassica. Các cây chỉ thị thị có thể tạo vết bệnh

cục bộ hay nhiễm bệnh hệ thống

Một số cây chỉ thị nhƣ rau muối (Chenopodium amaranticolor, C. quinoa), thuốc lá cảnh (N.

benthamiana) phản ứng với rất nhiều virus khác nhau.

Ƣu điểm. Vì là một thử nghiệm sinh học nên phản ứng trên cây chỉ thị cho phép xác định

chính xác bản chất virus của tác nhân gây bệnh. Trong nhiều trƣờng hợp, sử dụng cây chỉ thị

thích hợp cho phép phân biệt đƣợc các chủng của virus.

Nhƣợc điểm.

Đắt (tốn công lao động, đòi hỏi phƣơng tiện chăm sóc nhƣ nhà lƣới, nhà kính chuẩn)

Nhiều trƣờng hợp không thể phân biệt đƣợc mức loài. Một số cây chỉ thị nhƣ thuốc lá phản

ứng với rất nhiều virus.

Tốn thời gian: để phản ứng có thể đánh giá đƣợc thƣờng mất nhiều ngày, nhiều tuần, thậm

chí nhiều tháng.

Hình 9-1 Lây nhiễm nhân tạo trên cây chỉ thị thuốc lá và rau muối (ảnh trái, giữa). Triệu chứng

đốm chết hoại do Citrus psorosis virus (CPsV) trên cây rau muối C. amaranticolor

(http://www.DPWeb.net)

9.5 KĨ THUẬT HIỂN VI ĐIỆN TỬ

Quan sát mẫu virus dƣới kính hiển vi điện tử EM (Electron microscope) là một kỹ thuật quan

trọng trong phát hiện và chẩn đoán virus. Có 2 loại kính hiển vi điện tử chính đƣợc sử dụng là

kính hiển vi xuyên TEM (Transmission EM) và kính hiển vi quét SEM (Scanning EM). Kính

hiển vi điện tử sử dụng sóng điện tử (có bƣớc sóng > sóng ánh sáng 100.000x) để khuyếch đại

hình ảnh nên có thể phóng đại hình ảnh tối đa 2.000.000x

Mẫu virus quan sát có thể từ phân tử virus đã tinh chiết hoặc trực tiếp trong mô (dùng kỹ

thuật lát cắt siêu mỏng)

Ƣu: + Phát hiện trực tiếp virus trong mô

+ Cho phép dự đoán tới chi

Nhƣợc: đắt, phức tạp

101

9.6 KĨ THUẬT CHẨN ĐOÁN DỰA VÀO THỂ VÙI

9.6.1 Loại thể vùi

Thể vùi (inclusion body) là sự kết tụ của:

Các phân tử virus (tất cả các nhóm virus),

Các protein vỏ virus (ví dụ tymovirus),

Các protein không phải protein vỏ virus (ví dụ tenuivirus, potyvirus),

Các cấu tử tế bào bị biến đổi do sự nhiễm bệnh (ví dụ chloroplasts của tế bào cây bị

nhiễm tymovirus).

9.6.2 Vị trí hình thành thể vùi trong tế bào

Trong tế bào chất (ví dụ thể vùi hình trụ của potyvirus),

Trong nhân (ví dụ thể vùi trong nhân của geminivirus),

Trong cả tế bào chất và nhân (ví dụ thể vùi tinh thể của potyvirus),

Trong không bào và tế bào chất (ví dụ thể vùi tinh thể của cucumovirus).

9.6.3 Ví dụ một số loại thể vùi

1. Thể vùi trong tế bào chất của potyvirus. Đƣợc cấu tạo từ các phân tử protein CI

(cytoplasm inclusion). phân tử protein xắp xếp thành các phiến protein. Các phiến này lại lắp ráp

thành các dạng nhƣ dạng vòng bánh xe, dạng cuốn, dạng phiến. Hình thái thể vùi đặc trƣng cho

các potyvirus và có giá trị chẩn đoán.

Hình: 9-2 Sơ đồ (trái) và ảnh chụp hiển vi điện tử (phải) của thể vùi tế bào chất của potyvirus

2. Thể vùi của TMV. Cấu tạo từ phân tử virus. Các phân tử virus hình gậy xếp thành hàng.

Các hàng lại chồng lớp lên nhau thành phiến tinh thể hình lục giác. Thể vùi của TMV hình thành

trong tế báo chất và không bào.

Ƣu điểm của chẩn đoán bằng thể vùi. Một trong các ƣu điểm của thể vùi là rất đơn giản và

có thể chẩn đoán bằng kính hiển vi quang học. Qui trình kiểm tra thể vùi virus có thể tóm tắt nhƣ

sau:

Tƣớc 1 mảnh biểu bì hoặc cắt một mảnh mô mỏng.

102

Làm trong mô bằng dung dịch Triton X-100 5 % trong khoảng 10-15 phút.

Nhuộm thể vùi bằng thuốc nhuộm (10-15 phút). Một số thuốc nhuộm phổ biến là (i)

Calcomine orange / 2-methoxyethanol, (ii) Brilliant green / 2- methoxyethanol và (iii)

Azure A / 2-methoxyethanol + 0.2 M Na2HPO4.

Xử lý mô bằng dung dịch rửa (70 % 2-methoxyethyl acetate + 30% ethanol).

Kiểm tra dƣới kính hiển vi quang học

Hình 9-3 Dụng cụ và vật liệu dùng để kiểm tra thể vùi virus thực vật bằng kính hiển vi quang học

(http://plantpath.ifas.ufl.edu/pdc/Inclusionpage/Florvirus.html)

9.7 KĨ THUẬT PCR VÀ RT-PCR

9.7.1 Giới thiệu và nguyên lý

PCR là một trong các phát minh quan trọng nhất của thế kỷ 20 trong sinh học phân tử. PCR là

một kỹ thuật đơn giản nhƣng đƣợc sử dụng trong hầu hết các nghiên cứu CNSH. Có vô số tài

liệu tiếng Việt và tiếng Anh về kỹ thuật PCR. Dƣới đây là tóm tắt kỹ thuật

Tùy thuộc khuôn là DNA hay RNA mà có tên phản ứng là PCR hay RT-PCR

Khuôn là DNA => PCR (polymerase chain reaction)

Khuôn là RNA => RT-PCR (Reverse transcription – PCR)

Các bƣớc cơ bản trong 1 phản ứng PCR gồm 3 bƣớc :

Biến tính. Hỗn hợp phản ứng đƣợc đặt ở nhiêt độ cao (92 – 94 OC) trong thời gian ngắn

(khoảng 20 – 60 giây). Ỏ nhiệt độ này, khuôn DNA dạng sợi kép tách thành sợi đơn.

Gắn mồi. Hỗn hợp phản ứng đƣợc đặt ở nhiêt độ gắn mồi (Ta) trong thời gian ngắn. Ta

đƣợc tính toán tùy thuôch đặc điểm mồi, thƣờng trong khoảng 40 – 60 OC). Ở nhiệt độ này, mồi

gắn vào khuôn sợi đơn ở vị trí đặc hiệu.

103

Tổng hợp sản phẩm PCR. Hỗn hợp phản ứng đƣợc tăng tới nhiệt độ tối ƣu cho phản ứng

tổng hợp chuỗi (72 hoặc 68 OC tùy DNA polymerase chịu nhiệt).

Trong trƣờng hợp RT-PCR, trƣớc khi thực hiện PCR, cần phải có thêm một bƣớc chuyển

khuôn RNA thành cDNA bằng enzyme phiên mã ngƣợc (reverse transcriptase). Hai bƣớc RT và

PCR có thể đƣợc thực hiện riêng rẽ hay trong cùng một tube phản ứng.

Các bƣớc trong chẩn đoán bệnh cây bằng PCR/RT-PCR :

Thiết kế mồi (primer)

Chiết acid nucleic tổng số (DNA hoặc RNA) từ mô cây; dùng các kỹ thuật chiết thông

thƣờng (rẻ) hoặc kit chiết thƣơng mại (đắt)

Chạy PCR hoặc RT-PCR

Kiểm tra và đánh giá kết quả bằng điện di

9.7.2 Thiết kế và lựa chọn mồi (primer)

Mồi là một chuỗi oligonucleotide sợi đơn ngắn (kích thƣớc thƣờng từ 18 – 24 nucleotides).

Có hai loại mồi đƣợc sử dụng cho chẩn đoán bệnh cây

Mồi chung (universal/degenerate primers): đƣợc thiết kế trên các vùng bảo thủ cao, có khả

năng phát hiện các đối tƣợng khác hẳn nhau (thƣờng các đối tƣợng của một chi, một họ).

Mồi đặc hiệu (specific primers): đƣợc thiết kế trên các vùng có thể phân biệt đƣợc loài, thậm

chí dƣới loài nhƣ chủng/nòi/type sinh học…

Có đƣợc các mồi tốt là bƣớc quan trọng nhất trong chẩn đoán bệnh cây. Có 2 cách để có thể

nhận đƣợc các mồi tốt.

Tham khảo và lựa chọn từ các nghiên cứu đã đƣợc công bố.

Tự thiết kế mồi.

9.7.3 Tự thiết kế mồi

Để tự thiết kế mồi dựa trên các chuỗi gen sẵn có trên Genbank, ngƣời ta cần sử dụng một

phần mềm có khả năng căn trình tự đa chuỗi (multiple sequence alignment), chẳng hạn

ClustalX, Bioedit. Ngay sau khi các chuỗi DNA đã đƣợc căn trình tự, chúng ta có thể thiết kế

các mồi chung hay mồi đặc hiệu tùy theo yêu cầu.

Các chú ý khi thiết kế mồi:

Độ dài mồi. Nên nằm trong khoảng 18-22 nucleotides. Độ dài này đủ dài để đảm bảo tính đặc

hiệu và đủ ngắn để mồi gắn đễ dàng vào khuôn.

Nhiệt độ tách chuỗi (Tm = Melting Temperature). Tm là nhiệt độ mà tại đó 1/2 số sợi DNA

kép tách thành sợi đơn. Tm của mồi nên nằm trong khoảng 52-58 OC.

Nhiệt độ gắn mồi (Ta = annealing temperature). Ta đƣợc tính dựa trên Tm. Ta quá cao làm

mồi khó gắn vào khuôn dẫn tới năng xuất PCR thấp. Ta quá thấp làm mồi dễ gắn không đặc hiệu

vào khuôn dẫn tới tạo các sản phẩm không đặc hiệu. Ta của 2 mồi xuôi và ngƣợc dòng nên

tƣơng đƣơng. Có nhiều cách tính Ta, dƣới đây là một công thức:

Ta = 0.3 x Tm(mồi) + 0.7 Tm (sản phẩm) – 14.9

Hàm lƣợng GC. Số các gốc G và C nên nămg trong khoảng 40-60%.

104

Chuỗi GC đầu 3’. Đầu tận cùng 3 ‗ nên là G hoặc C hoặc GC hoặc CG. Đầu 3‘ không nên

có nhiều hơn 3 gốc liên tục G/C.

Cấu trúc thứ cấp. Cấu trúc thứ cấp có thể hình thành trong cùng một mồi hoặc giữa 2 mồi.

Mồi chứa cấu trúc thứ cấp xấu thƣờng dẫn tới năng suất PCR bị giảm, thậm chí không có sản

phẩm. Tính ổn định của cấu trúc thứ cấp đƣợc đo bằng ΔG (là năng lƣợng cần để phá vỡ cấu

trúc thứ cấp, đƣợc tính từ các phần mềm thiết kế mồi). Các loại cấu trúc thứ cấp là:

Hairpins. Là cấu trúc thứ cấp hình thành trong nội bộ mồi. Giá trị ΔG của các hairpin đầu 3‘

không nên <-2 kcal/mol và của các hairpin ở giữa không nên <-3 kcal/mol.

Tự mồi (Self Dimer). Là cấu trúc hình thành giƣã các phân tử của cùng loại mồi. Giá trị ΔG

của các hairpin đầu 3‘ không nên <-5 kcal/mol và của các hairpin ở giữa không nên <-6

kcal/mol.

Tự mồi chéo (Cross Dimer). Là cấu trúc hình thành giƣã các phân tử của 2 mồi khác nhau

(cặp mồi trong phản ứng PCR). Giá trị ΔG của các hairpin đầu 3‘ không nên <-5 kcal/mol và

của các hairpin ở giữa không nên <-6 kcal/mol.

Các chuỗi lặp. Mồi không nên chứa nhiều chuỗi lặp kép (ví dụ TATATATA) hoặc chuỗi lặp

đơn (ví dụ TTTT) vì có thể gây ra hiện tƣợng bắt cặp nhầm (misprime). Trong một mồi, chỉ nên

có tối đa 4 chuỗi lặp. Các chuỗi lặp cũng không nên xuất hiện nhiều lần trong 1 mồi

Độ ổn định đầu 3 ‗. Tận cùng đầu 3‘ (khoảng 5 nucleotides) không nên chứa toàn gốc G

hoặc C vì có giá trị ΔG cao dễ dẫn tới bắt cặp không đặc hiệu vào khuôn. Trái lại nếu đầu 3‘

chứa quá nhiều gốc T hoặc A sẽ khó bắt cặp.

Vùng thiết kế mồi của khuôn. vùng thiết kế mồi của khuôn không nên chứa quá nhiều cấu

trúc thứ cấp. Nếu các cấu trúc thứ cấp này ổn định ở nhiệt độ gắn mồi thì mồi sẽ không thể bắt

cặp đƣợc.

9.7.4 Thiết kế mồi chung (degenerate primer)

Mồi chung là một mồi đƣợc thiết kế trên vùng bảo thủ. Nếu vùng bảo thủ là đồng nhất thì

mồi chung sẽ chỉ là một chuỗi mồi duy nhất. Nếu vùng bảo thủ chứa các vị trí sai khác thì mồi

chung thực chất là một hỗn hợp các mồi, mỗi mồi tƣơng ứng với một sai khác nucleotide.

Trong thiết kế mồi chung, ngƣời ta sử dụng các mã suy biến tại các vị trí sai khác, ví dụ R là

A hoặc G (số suy biến = 2); Y là C hoặc T (số suy biến bằng 2); N là A hoặc T hoặc G hoặc C

(số suy biến bằng 4). Số sai khác nucleotide tại mỗi vị trí của mồi đƣợc gọi là các số suy biến.

Tổng số mồi trong hỗn hợp sẽ bằng tích của tất cả các số suy biến tại mỗi vị trí. Để làm giảm số

lƣợng mồi trong hỗn hợp, ngƣời ta thƣờng sử dụng một nucleotide đặc biệt là inosine. Inosine có

thể ghép cặp với bất kỳ nucleotide nào trong số 4 nucleotide A, T, G, C.

105

Bảng 9-1 Mã suy biến trong thiết kế mồi chung

Viết tắt Nucleotide tƣơng ứng Số suy biến

R A hoặc G 2

Y C hoặc T 2

M A hoặc C 2

K G hoặc T 2

W A hoặc T 2

S C hoặc G 2

B C hoặc G hoặc T 3

D A hoặc G hoặc T 3

H A hoặc C hoặc T 3

V A hoặc C hoặc G 3

N A hoặc C hoặc G hoặc T 4

i Inosine 1

9.7.5 Ví dụ mồi chung

Một ví dụ mồi chung là mồi CIFor đƣợc thiết kế trên vùng bảo thủ của gen CI của các

potyvirus. Mồi này có trình tự là: 5‘-GGiVViGTiGGiWSiGGiAARTCiAC-3‘. Mồi CIFor có

khả năng phát hiện hầu hết các virus thuộc chi Potyvirus. Hình dƣới minh họa vị trí mồi trên bộ

gen virus, trình tự mồi cũng nhƣ trình tự chuỗi gen CI của một số virus đại diện tại vị trí mồi.

Mồi này đã xử dụng inosine tại các vị trí có số suy biến bằng 4, do vậy đã giảm số lƣợng mồi

đơn trong hỗn hợp mồi từ 524288 xuống còn 54 mồi.

Virus Trình tự nucleotide

Mồi CIFor (5’ – 3’) GGi VVi GTi GGi WSi GGi AAR TCi AC

Zucchini yellow mosaic virus GGA GCA GTG GGT TCT GGA AAA TCA AC

Dasheen mosaic virus GGT GCT GTC GGG TCT GGT AAG TCG AC

Potato virus A GGA GCA GTT GGT TCT GGC AAA TCA AC

Clover yellow vein virus GGG GCT GTT GGA TCA GGA AAA TCG AC

Lily mottle virus GGT GCT GTT GGA TCT GGA AAG TCG AC

Papaya ringspot virus GGA GCT GTT GGT AGT GGT AAA TCA AC

Lettuce mosaic virus GGT GGT GTC GGC TCC GGC AAG TCT AC

Potato virus Y GGA GCT GTT GGG TCT GGA AAG TCA AC

Maize dwarf mosaic virus GGA GCA GTC GGT TCG GGA AAA TCA AC

Sugarcane mosaic virus GGA GCT GTT GGA TCA GGA AAA TGC AC

Johnsongrass mosaic virus GGC AAC GTA GGA TCT GGG AAA TCA AC

Cocksfoot streak virus GGA CCG GTC GGT TCC GGT AAA TCG TC

Số suy biến 3 3 2 2 2

Tổng số mồi trong hỗn hợp mồi (dùng inosine)

3 x3 x 2 x 2 x 2 = 54

Tổng số mồi trong hỗn hợp mồi

(nếu không dùng inosine) 4x2x2x4x4x4x2x2x4x4x2x4 = 524288

HcPro VPg 6K1 P1 P3 CI NIb NIa CP 6K2

3‘ UTR 5‘ UTR

poly A

CIFor

106

9.8 CHẨN ĐOÁN DỰA VÀO RNA SỢI KÉP

Nhiều virus thực vật có bộ gen RNA. Các virus RNA sợi kép thƣờng có bộ gen phân đoạn,

trong đó số lƣợng và kích thƣớc các phân đoạn có thể có giá trị chẩn đoán vì đặc trƣng cho chi

(ví dụ nhƣ các reovirus). Các virus có bộ gen RNA sợi đơn cũng có thể chẩn đoán bằng kỹ thuật

này vì chúng hình thành các phân tử dsRNA là dạng trung gian trong quá trình tái bản. Ngoài ra,

nhiều virus hình thành các phân tử phụ gen nome (subgenome) và các phân tử này cũng tạo các

phân tử dsRNA có kích thƣớc đặc trƣng.

Về mặt kỹ thuật, chẩn đoán dsRNA của mẫu virus đƣợcthực hiện qua các bƣớc sau:

Chiết RNA hoặc acid nucleic tổng số từ mô cây

Tinh chiết dsRNA bằng cách cho dịch RNA hoặc acid nucleic tổng số vào cột chứa bột

cellulose (loại CF11, Whatman) với điều kiện nồng độ ethanol = 16.5%. Ở nồng độ

ethanol này, chỉ các phân tử dsRNA liên kết vào hạt cellulose. Tiếp theo, các loại acid

nucleic khác (ssRNA, DNA) bị loại bỏ khỏ cột bằng rửa với đệm chứa ethanol 16.5 %.

Cuối cùng, dsRNA đƣợc giải hấp thụ bằng đệm không chứa ethanol.

Phân tích kết quả bằng điện di polyacrylamid hoặc agarose

Kỹ thuật này phổ biến trong những năm 1990 nhằm chẩn đoán nhiều virus, đặc biệt các

virus trên cây có múi nhƣ CTV. Hiện nay, do kỹ thuật quá tốn công sức nên hầu nhƣ không

đƣợc sử dụng, ngoại trừ để phát hiện và xác định các virus mới.

Hình 9-4 Phát hiện bộ gen dsRNA của virus lùn sọc đen phƣơng Nam (Zhou et al., 2008)

9.9 CHẨN ĐOÁN DỰA VÀO HUYẾT THANH HỌC

9.9.1 Các khái niệm

Cơ sở của phƣơng pháp huyết thanh học là dựa vào sự tƣơng tác đặc hiệu giữa kháng

nguyên và kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên đó

a. Kháng nguyên (antigen)

Kháng nguyên thƣờng là các đại phân tử chứa protein hoặc polysaccharide. Kháng nguyên

phải có hai đặc tính quan trọng: (1) hoạt tính sinh miễn dịch tức khả năng kích thích động vật

máu nóng hình thành kháng thể đặc hiệu và (2) tính đặc hiệu tức khả năng liên kết với kháng

thể đặc hiệu tƣơng ứng. Một số chất có trọng lƣợng phân tử thấp nhƣ các amino acid, một số loại

polysaccharide... không có hoạt tính sinh miễn dich nhƣng lại có khả năng liên kết với kháng thể

107

đặc hiệu với kháng nguyên có chứa các chất này. Các chất đó đƣợc gọi là bán kháng nguyên

(hapten).

b. Nhóm quyết định kháng nguyên (epitope)

Trên bề mặt kháng nguyên có các vùng đặc biệt có chức năng cảm ứng hình thành kháng

thể và là vị trí liên kết kháng thể. Các vùng này đƣợc gọi là các nhóm quyết định kháng nguyên

(epitope).

Một nhóm quyết định kháng nguyên chỉ kích thích hệ miễn dịch của động vật máu nóng

hình thành một dòng phân tử kháng thể. Kháng nguyên chứa một nhóm quyết định kháng

nguyên gọi là kháng nguyên đơn giá, chứa nhiều nhóm quyết định kháng nguyên gọi là kháng

nguyên đa giá. Các epitope có thể đƣợc chia thành:

Epitope trình tự: chỉ phụ thuộc trình tự amino acid

Epitope hình thái: phụ thuộc vào cả cấu trúc không gian

Epitope liên tục: là một chuỗi amino acid liên tục

Epitope không liên tục: là các amino acid không liền nhau (trên chuỗi cấp 1) nhƣng do sự

gấp của protein nên xắp xếp gần nhau dẫn tới cùng nhau tạo thành 1 epitope

c. Kháng nguyên của virus

Đối với virus, nhìn chung bất kỳ một protein nào của virus cũng có thể đƣợc sử dụng làm

kháng nguyên. Tuy nhiên, loại kháng nguyên phổ biến nhất là protein vỏ virus. Kháng nguyên

vỏ protein virus có thể đƣợc tạo ra bằng: (i) tinh chiết phân tử virus từ cây nhiễm bệnh hoặc (ii)

biểu hiện vỏ protein trong tế bào vi khuẩn dùng công nghệ sinh học.

d. Kháng thể (antibody)

Sự hình thành kháng thể: Hệ thống miễn dịch của cơ thể động vật máu nóng bao gồm các

cơ quan có thẩm quyền miễn dịch và các tế bào có thẩm quyền miễn dịch. Các cơ quan có thẩm

quyền miễn dịch (tuyến ức, lách, tủy...) là nơi sản sinh, duy trì, biệt hoá và điều khiển sự hoạt

động của các tế bào có thẩm quyền miễn dịch. Các tế bào có thẩm quyền miễn dịch (chủ yếu

gồm 2 loại là lympho bào B và lympho bào C) tham gia vào quá trình đáp ứng miễn dịch của cơ

thể nhằm chống lại các tác nhân lạ xâm nhập. Có 2 kiểu đáp ứng miễn dịch:

Kiểu đáp ứng miễn dịch dịch thể: Khi kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể, bị đại thực bào

vây bắt, xử lý và trình diện cho lympho bào B. Lympho bào B đƣợc biệt hoá thành tế bào

plasma sản xuất ra kháng thể dịch thể. Kháng thể dịch thể tồn tại trong dịch cơ thể (huyết

tƣơng) và sẽ kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên.

Kiểu đáp ứng miễn dịch tế bào: Khi kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể, bị đại thực bào vây

bắt, xử lý và trình diện cho lympho bào T. Lympho bào T đƣợc biệt hoá thành lympho bào T

mẫn cảm kháng nguyên và chính bản thân chúng là kháng thể tế bào. Kháng thể tế bào tồn

tại trên bề mặt tế bào và cũng kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên.

Nhƣ vậy, theo nghĩa rộng, kháng thể là bất kỳ phân tử nào có khả năng liên kết đặc

hiệu với kháng nguyên. Tuy nhiên, kháng thể sử dụng trong chẩn đoán bằng kỹ thuật huyết

thanh học chính là các kháng thể dịch thể

Kháng thể dịch thể là các globulin miễn dịch (Immunoglobulin, Ig). Có 5 lớp Ig là

IgG, IgM, IgA, IgD và IgE nhƣng trong chẩn đoán huyết thanh học, thƣờng chỉ sử dụng IgG.

108

Cấu tạo của IgG (xem hình vẽ): gồm 4 phân tử polypeptid (2 chuỗi nặng, 2 chuỗi nhẹ)

liên kết với nhau bằng các cầu nối disulfide. Phân tử IgG có 3 vùng chức năng chính (có thể

tách đƣợc bằng một protease là papain)

Hai mảnh Fab (antigen binding fragment) giống nhau về cấu trúc và mang tính chất

kháng thể do chứa vị trí liên kết với kháng nguyên. Các mảnh Fab, khi đƣợc tách ra bằng

papain, sẽ vẫn giữ nguyên hoạt tính kháng thể nhƣng không thể tạo ra phản ứng kết tủa

hoặc phản ứng ngƣng kết.

Một mảnh Fc (cristallizable fragment) không có hoạt tính kháng thể nhƣng chứa nhóm

quyết định kháng nguyên của phân tử IgG do vậy khi tiêm phân tử IgG nguyên vẹn hoặc

chỉ cần mảnh Fc từ 1 loài (chẳng hạn thỏ) sang 1 loài khác (chẳng hạn dê) thì loài thứ 2

sẽ vẫn tạo ra kháng thể đặc hiệu kháng thể của loài thứ nhất (anti-antibody). Đây là cơ sở

cho các kiểu ELISA gián tiếp.

Hình 9-5 Cấu trúc kháng thể (Hull, 2002)

e. Kháng thể đơn dòng và kháng thể đa dòng

Kháng thể đơn dòng (Monoclonal antibody, MAb)

Là kháng thể đƣợc hình thành chỉ từ một dòng lympho bào B

Nhận biết và liên kết với chỉ 1 epitope

Sản xuất phức tạp

Kháng thể đa dòng (Polyclonal antibody, PAb)

Là một hỗn hợp của các kháng thể đơn dòng

Sản xuất đơn giản. Việc sản xuất bao gồm tiêm kháng nguyên (phân tử virus, protein

virus, protein vi khuẩn, nấm…) vào động vật máu nóng (nhƣ thỏ, dê, chuột…) và thu

kháng huyết thanh. Kháng huyết thanh sẽ chứa một hỗn hợp nhiều dòng kháng thể, mỗi

dòng đặc hiệu cho 1 epitope.

109

9.9.2 Sản xuất kháng thể đơn dòng

Các bƣớc chính để sản xuất kháng thể đơn dòng gồm

1. Gây miễn dịch trên chuột. Bƣớc này giống nhƣ sản xuất kháng thể đa dòng.

2. Dung hợp (lai) tế bào myeloma chuột và tế bào lá lách chuột đã gây miễn dịch.

Nuôi cấy một dòng tế bào myeloma chuột. Tế bào myeloma là một loại tế bào bạch cầu

bị ung thƣ nên có 2 đặc điểm: (1) không thể sản xuất kháng thể và (2) có thể sinh trƣởng

vô hạn định. Ngoài ra, vì chúng bị mất chức năng của gen HGPRT (hypoxantine guanine

phosphoribosyl transferase) nên không thể sống đƣợc trên môi trƣờng HTA

(Hypoxanthine Aminopterin Thymidine) vì aminopterin trong môi trƣờng ức chế một

đƣờng hƣớng sinh hóa liên quan đến biểu hiện gen HGPRT.

Tinh chiết tế bào lá lách của chuột đã gây miễn dịch. Dịch tế bào lá lách sẽ chứa lympho

bào B sản xuất kháng thể. Loại tế bào miễn dịch này có thời gian sống ngắn và không thể

sống đƣợc trên môi trƣờng nuôi cấy nhân tạo.

Dung hợp các tế bào lá lách với các tế bào myeloma nhờ PEG (polyethylene glycol) để

tạo ra các tế bào lai (hybridoma). Tế bào lai kết hợp đặc điểm của lympho bào B (tạo

kháng thể) và đặc điểm của tế bào myeloma (sinh trƣởng vô hạn định trên môi trƣờng

nhân tạo).

Nuôi cấy tế bào lai trong môi trƣờng chọn lọc. Môi trƣờng chọn lọc chứa HTA

(Hypoxanthine Aminopterin Thymidine) không cho phép sự sinh trƣởng của các tế bào

không lai.

3. Kiểm tra sự có mặt của Mabs trong dịch nuôi cấy của từng dòng tế bào lai bằng ELISA

4. Nuôi cấy phục hồi từng dòng tế bào lai có kháng thể mong muốn (ELISA +)

5. Tạo kháng thể từ các dòng tế bào lai có kháng thể mong muốn bằng invitro (trên môi

trƣờng nhân tạo hoặc in vivo (trong cơ thể chuột).

Hình 9-6 Sơ đồ sản xuất kháng thể đơn dòng

110

9.9.3 Kỹ thuật chẩn đoán Ouchterlony

Kỹ thuật Ouchterlony đƣợc còn đƣợc gọi là kỹ thuật ―Khuếch tán miễn dịch kép trong gel‖.

Đây là một trong các kỹ thuật huyết thanh học đƣợc sử dụng phổ biến trƣớc khi áp dụng kỹ thuật

ELISA. Nguyên lý của kỹ thuật rất đơn giản: ngƣời ta chế tạo các đĩa gel với các giếng gel. Ở

giếng giữa là kháng huyết thanh chứa kháng thể virus. Các giếng xung quanh sẽ nhỏ các mẫu

cần kiểm tra. Virus và IgG sẽ khuếch tán ra xung quanh giếng. Nếu kháng thể và virus là đồng

dạng của nhau thì chúng sẽ kết hợp tạo thành một vạch mờ (Hình)

Hình 9-7 Kỹ thuật Outerlony chẩn đoán virus. Các mẫu ABCDE là các mẫu dƣơng

9.9.4 Kỹ thuật chẩn đoán bằng ELISA

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) là một kỹ thuật chẩn đoán quan trọng và

phổ biến nhất hiện nay so với các kỹ thuật huyết thanh học khác. Trong bệnh cây, ELISA đƣợc

sử dụng chủ yếu để chẩn đoán virus và một số vi khuẩn. Một trong số các hãng nổi tiếng có bán

các kít ELISA chẩn đoán bệnh cây là Agdia (http://www.agdia.com/).

9.9.4.1 Vật liệu chính cho ELISA

Bản ELISA: bằng nhựa (polystyrene), 96 giếng, liên kết không đặc hiệu các loại protein

Các loại dung dich đệm: Đệm nghiền mẫu, đệm pha kháng thể, đệm rửa, đệm pha chất nền

(cơ chất).

Kháng thể các loại

Chất nền: nhiều loại, tùy thuộc enzyme, phổ biến nhất là NPP (nitrophenyl phosphate)

Enzyme: nhiều loại, cần cơ chất tƣơng ứng, phổ biến nhất là alkaline phosphatase (cơ chất

tƣơng ứng là NPP)

Máy đọc ELISA: là một loại thiết bị so màu vi phiến nhằm lƣợng hóa màu phản ứng.

Dụng cụ nghiền, chiết mẫu cây: chày, cối sứ…

9.9.4.2 Các kỹ thuật ELISA

Có rất nhiều kỹ thuật ELISA khác nhau. Dựa vào quan hệ của kháng thể liên kết enzyme

với kháng nguyên, ELISA có thể đƣợc chia làm 2 nhóm (xem hình) là:

Nhóm trực tiếp (direct ELISA): Kháng thể liên kết enzyme là kháng thể phát hiện kháng

nguyên (ví dụ các kỹ thuật I, VIII và IX trong sơ đồ).

111

Nhóm gián tiếp (indirect ELISA): Kháng thể liên kết enzyme không phải là kháng thể phát

hiện kháng nguyên (ví dụ các kỹ thuật II, III, IV, V, VI, VI trong sơ đồ).

ELISA cũng gồm rất nhiều kiểu khác nhau. Hai ví dụ đang đƣợc sử dụng là:

Kẹp kép kháng thể (double antibody sandwich = DAS) (tất cả các kỹ thuật ngoài trừ kỹ

thuật II trong sơ đồ)

Bẫy kháng nguyên trƣớc (plate-trapped antigen = PTA) nhƣ kỹ thuật II trong sơ đồ.

Hình 9-8 Các kỹ thuật ELISA khác nhau

9.9.4.3 Qui trình thử 2 kiểu phản ứng ELISA đại diện cho mỗi nhóm

a. Kỹ thuật ELISA trực tiếp kiểu kẹp kép kháng thể (DAS-ELISA)

Cố định IgG đặc hiệu virus vào bản ELISA: IgG đƣợc hoà trong dung dịch đệm phủ

(thƣờng là đệm carbonate) và đƣợc cho vào giếng với lƣợng 100 l/giếng. Bản ELISA đƣợc

ủ trong hộp ẩm ở 37 OC khoảng 2-4 giờ. Bản ELISA, thƣờng cấu tạo bằng polystirene có khả

năng liên kết không đặc hiệu với protein do vậy sẽ liên kết với các phân tử IgG (là protein

miễn dịch). Sau khi ủ, giếng đƣợc rửa bằng đêm rửa và nƣớc.

Cố định dịch cây vào bản ELISA: Nghiền mẫu cây đệm chiêt mẫu thành dịch cây. Dịch cây

đƣợc cho vào giếng với lƣợng100l/giếng. Bản ELISA đƣợc ủ ở 37 OC khoảng 2-4 giờ hoặc

qua đêm ở 4-6 OC. Nếu trong dịch cây có chứa virus thì virus sẽ liên kết đặc hiệu với IgG có

sẵn trong giếng còn protein của cây hoặc các virus khác sẽ không liên kết. Sau khi ủ, bản

ELISA đƣợc rửa nhƣ bƣớc 1.

Cố định IgG liên kết enzyme: Hoà IgG liên kết enzyme (IgG-E) trong đệm liên kết và cho

vào giếng với lƣợng 100 l/giếng. IgG này giống nhƣ IgG của bƣớc 1 nhƣng chỉ khác là nó

đƣợc liên kết từ trƣớc với 1 enzyme là Alkaline Phosphatase (AP). Bản ELISA đƣợc ủ và

rửa nhƣ bƣớc 1.

Cố định chất nền và đánh giá kết quả: Hoà chất nền trong đệm chất nền theo tỷ lệ 0.6

mg/ml) và cho giếng với lƣợng100 l/giếng. Chất nền ở đây là Nitrophenyl phosphate

(NPP). Bản ELISA đƣợc ủ ở nhiệt độ phòng trong hộp ẩm trong tối 60 phút. Phản ứng hoá

học ở đây là NPP sẽ bị thuỷ phân thành Nitrophenol phosphate dƣới sự xúc tác của enzyme

AP. Nitrophenol phosphate là chất có màu vàng, do vậy có thể nhận biết đƣợc bằng mắt hoặc

bằng máy đọc ELISA (máy so màu). Hiển nhiên, do nồng độ NPP đều giống nhau ở các

giếng nên giếng nào có màu vàng càng đậm chứng tỏ nồng độ enzyme càng cao tức nồng độ

virus trong mẫu thử càng cao. Có thể ngừng phản ứng thuỷ phân bằng cách bổ sung dung

dịch NaOH 3M với lƣợng 25-50 l/giếng.

112

b. Phản ứng ELISA gián tiếp kiểu bẫy kháng nguyên trước (PTA-ELISA)

1. Cố định dịch cây vào bản ELISA: Nghiền mẫu cây trong đệm phủ và cho 100l/giếng. ủ

bản ELISA qua đêm ở 4-6OC trong hộp ẩm. Sáng hôm sau, rửa 3 lần bằng đệm rửa. Protein

của cây và virus trong dịch cây (nếu có) sẽ liên kết không đặc hiệu vào thành giếng.

2. Cố định IgG thỏ đặc hiệu virus vào bản ELISA: Hoà IgG đặc hiệu virus trong đệm huyết

thanh và cho 100l/giếng. Ủ bản ELISA ở 37 OC 1-2 giờ trong hộp ẩm. Rửa bản ELISA nhƣ

bƣớc 1.

3. Cố định IgG đặc hiệu IgG thỏ liên kết AP vào bản ELISA: Hoà IgG đặc hiệu IgG thỏ liên

kết AP trong đệm liên kết và cho 100l/giếng. Ủ bản ở 37 OC 1-2 giờ. IgG liên kết AP thứ 2

này là IgG đƣợc tạo ra khi tiêm IgG của thỏ vào 1 loài động vật khác thỏ (chẳng hạn dê) nên

không liên kết với virus mà liên kết với IgG thỏ đặc hiệu virus ở bƣớc 2. Sau khi ủ, rửa bản

nhƣ bƣớc 1.

4. Cố định chất nền vào bản ELISA: Thực hiện tƣơng tự nhƣ ở DAS-ELISA.

9.10 CÁC KĨ THUẬT DOT BLOT

Nhiều kiểu dot blot đã đƣợc sử dụng để phát hiện virus. Các kỹ thuật này thực chất là các

dạng đơn giản hóa của western blot (lai protein) hoặc southern blot (lai DNA). Nhƣ vậy dựa vào

bản chất lai hóa, dot blot có thể gồm 2 nhóm:

Dựa trên western blot: Dịch cây chứa virus hoặc protein đƣợc cố định luôn lên màng mà

không cần tách bằng điện di polyacrylamid. Các bƣớc phát hiện tiếp theo về cơ bản giống

ELISA hoặc western blot.

Dựa trên southern blot: Dịch chiết DNA, sản phẩm cDNA, PCR/ RT-PCR đƣợc cố định lên

màng mà không cần tách trƣớc bằng điện di agarose. Các bƣớc phát hiện tiếp theo về cơ bản

giống nhƣ southern blot.

Hình 9-9 Phát hiện virus bằng kỹ thuạt dot blot miễn dịch (western blot, trái, Hull, 2002) và dot

blot lai DNA (southern blot, phải, Hsu et al., 2005)

113

9.11 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 9

1. Các cơ sở chẩn đoán bệnh virus

2. Chẩn đoán dựa vào triệu chứng (ƣu, nhƣợc điểm.

3. Chẩn đoán dựa vào huyết thanh học (đặc điểm kháng nguyên, kháng thể, epitope, phân biệt

kháng thể đơn dòng, đa dòng, đặc điểm bản ELISA, enzyme sử dụng trong ELISA, phân biệt

ELISA trực tiếp và gián tiếp, trình tự DAS-ELISA và PTA-ELLSA).

4. Chẩn đoán bằng PCR/RT-PCR (đặc điểm mồi chung, so sánh mồi chung mồi đặc hiệu, đặc

điểm một mồi tốt).

9.12 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH

1. Clark, M. F. & Adams, A. N. (1977). Characteristics of the microplate method of enzyme-

linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. Journal of General Virology

34, 475–483.

2. Ha, C. V., Revill, P. A., Harding, R. M., Vu, M. T. & Dale, J. L. (2008). Design and

application of two novel degenerate primer pairs for the detection and complete genomic

characterization of potyviruses. Archives of Virology 153, 25–36.

3. Hsu, Y. C., Yeh, T. J. & Chang, Y. C. (2005). A new combination of RT-PCR and reverse

dot blot hybridization for rapid detection and identification of potyviruses. Journal of

Virological Methods 128, 54–60.

4. Hull, R. (2002). Matthews's Plant Virology. Fourth edition: Academic Press.

5. Koenig, R. & Paul, H. L. (1982). Variants of ELISA in Plant Virus Diagnosis. Journal of

Virological Methods 5, 113-125.

6. Martin, R. R., James, D. & Levesque, C. A. (2000). Impacts of molecular diagnostic

technologies on plant disease management. Annual Review of Phytopathology. 38, 207–239

38, 207–239.

7. Mathews, R. E. F. (1993). Diagnosis of Plant Virus Diseases: CRC Press.

8. Mowat, W. P. & Dawson, S. (1987). Detection and identification of plant viruses by ELISA

using crude sap extracts and unfractionated antisera. Journal of Virological Methods 15 233-

247.

114

PHẦN II: CHUYÊN KHOA

115

Chƣơng 10. CÁC VIRUS THỰC VẬT Ở VIỆT NAM

10.1 TÓM TẮT NỘI DUNG

Chƣơng này tóm tắt lịch sử phát hiện virus thực vật ở Việt Nam và cung cấp danh sách các

virus đƣợc phát hiện cho tới nay (2010). Chƣơng này chỉ cung cấp thông tin mang tính chất

tham khảo cho ngƣời đọc.

10.2 CÁC VIRUS ĐƢỢC PHÁT HIỆN Ở VIỆT NAM

Bệnh virus đƣợc ghi nhận sớm nhất tại Việt Nam là bệnh chùn ngọn chuối, đƣợc phát hiện ở

Tây Nguyên trong những năm 60 (Vakili, 1969). Hiện nay, bệnh này đã đƣợc biết là do Banana

bunchy top virus (BBTV) gây ra.

Trong những năm 70, ở miền Bắc, đặc biệt ở các tỉnh trung du và miền núi, đã xuất hiện một

bệnh trên lúa gọi là bệnh vàng lụi với triệu chứng điển hình là cây lúa bị biến vàng, lùn, có thể

chết. Mặc dù tác nhân gây bệnh không thể đƣợc xác định tại thời điểm đó nhƣng bệnh đã đƣợc

cho là do virus gây ra vì bệnh có thể truyền qua rầy xanh đuôi đen (Nephotettix virescens) (Hà

Minh Trung, 1984).

Trong những năm 80, hai virus là Potato virus X (PVX) và Potato virus Y (PVY) nhiễm trên

khoai tây đã đƣợc xác đinh ở miền Bắc bằng kính hiển vi điện tử và ELISA (Vũ Triệu Mân,

1984). Trong cùng thời gian, các bệnh giống nhƣ bị nhiễm geminivirus (xoăn vàng lá/ngọn)

cũng đƣợc qua sát thấy trên một số cây trồng nhƣ khoai tây, thuốc lá và đặc biệt là cà chua. Các

thí nghiệm lan truyền cho thấy tác nhân gây bệnh truyền qua bọ phấn (Bemisia tabaci) và qua

ghép (Nguyễn Thơ, 1984).

Từ khoảng nửa cuối những năm 90 trở lại đây, do tăng cƣờng hợp tác nghiên cứu với các

phòng thí nghiệm virus trên thế giới, sự phát triển của công nghệ sinh học cũng nhƣ điều kiện

nghiên cứu đƣợc tăng cƣờng, nhiều virus thực vật đã đƣợc phát hiện và xác định ở Việt Nam.

Cho tới nay (2010), 52 virus thực vật thuộc 52 loài đã đƣợc xác định ở Việt Nam (bảng 10-1),

phần lớn đã đƣợc giải trình tự. Trong số này, đa số là các virus thuộc 2 chi Begomovirus (22

virus) và Potyvirus (18 virus). Đây cũng là 2 chi virus thực vật lớn nhất với mỗi chi chiếm

khoảng 20 % tổng số virus thực vật toàn thế giới. Ngoài ra, nhiều virus có ý nghĩa kinh tế, chẳng

hạn các virus gây bệnh trên lúa nhƣ bệnh lùn xoắn lá (Rice ragged stunt virus, RRSV), bệnh lúa

cỏ hay còn gọi là bệnh vàng lùn (Rice grassy stunt virus), bệnh lúa lùn sọc đen (southern rice

black streaked dwarf virus, SRBSDV) cũng mới đƣợc xác định chính xác.

Cần phải thấy rằng, số virus đƣợc phát hiện này chiếm một tỷ lệ nhỏ so với khoảng hơn 1000

virus thực vật đƣợc ghi nhận trên thế giới hiện nay. Trong khi đó, Việt Nam đã đƣợc chứng

minh là thuộc một trong các trung tâm đa dạng của nhiều virus, nhóm virus thực vật, chẳng hạn

nhƣ các begomovirus, một số potyvirus.

Do chẩn đoán bệnh virus dựa vào triệu chứng thƣờng khó, nhiều khi không thể nên trong

bảng 1, chỉ 52 virus đƣợc liệt kê do danh tính của chúng đã đƣợc xác định rõ với nguồn tham

khảo tin cậy. Chắc chắn rằng còn nhiều virus thực vật nữa hiện đang có mặt ở Việt Nam và chờ

đƣợc khám phá.

116

Bảng 10.1. Thành phần các virus thực vật đƣợc phát hiện tại Việt Nam tới 2010

TT Virus Viết tắt Chi Họ Ký chủ Tham khảo/mức

xác định*

1 Banana bunchy top virus BBTV Babuvirus Nanoviridae Chuối Bell et al., 2002;

Karan et al., 1994

2 Piper yellow mottle virus PYMoV Badnavirus Caulimoviridae Hồ tiêu, lá

nốt Giải trình tƣ?

3 Banana streak virus strain acuminata

Vietnam BSAcVNV Badnavirus Caulimoviridae Chuối

Lheureux et al.,

2007

4 Luffa yellow mosaic virus LYMV Begomovirus Geminiviridae Mƣớp Revil et al., 2003

5 Squash leaf curl China virus SLCCNV Begomovirus Geminiviridae Bí ngô, bầu

bí Revil et al., 2004

6 Corchorus yellow vein virus CoYVV Begomovirus Geminiviridae Rau đay Ha et al., 2006

7 Corchorus golden mosaic virus CoGMV Begomovirus Geminiviridae Rau đay Ha et al., 2008a

8 Kudzu mosaic virus KuMV Begomovirus Geminiviridae Sắn dây, đậu

tƣơng? Ha et al., 2008a

9 Clerodendrum golden mosaic virus ClGMV Begomovirus Geminiviridae Mò Ha et al., 2008a

10 Spilanthes yellow vein virus SpYVV Begomovirus Geminiviridae Cúc nút áo Ha et al., 2008a

11 Mimosa yellow leaf curl virus MiYLCV Begomovirus Geminiviridae Mimosa Ha et al., 2008a

12 Sida yellow vein Vietnam virus SiYVVNV Begomovirus Geminiviridae Ké hoa vàng Ha et al., 2008a

13 Erectites yellow mosaic virus ErYMV Begomovirus Geminiviridae Rau tàu bay Ha et al., 2008a

14 Ludwigia yellow vein Vietnam virus LuYVVNV Begomovirus Geminiviridae Rau mƣơng Ha et al., 2008a

15 Ludwigia yellow vein virus LuYVV Begomovirus Geminiviridae Rau mƣơng Ha et al., 2008a

16 Papaya leaf curl China virus PaLCuCNV Begomovirus Geminiviridae Thuốc lá, cà

chua Ha et al., 2008a

17 Lindernia anagallis yellow vein virus LaYVV Begomovirus Geminiviridae Lữ đằng Ha et al., 2008a

18 Alternanthera yellow vein virus AlYVV Begomovirus Geminiviridae Cúc (Zinha),

nhọ nồi Ha et al., 2008a

19 Tomato yellow leaf curl Kanchanaburi TYLCKaV Begomovirus Geminiviridae Cà chua, cà Ha et al., 2008a;

117

virus pháo DQ169054

20 Tomato leaf curl Vietnam virus ToLCVV Begomovirus Geminiviridae Cà chua Ha et al., 2008a;

Green et al., 2001

21 Tomato yellow leaf curl Vietnam virus TYLCVNV Begomovirus Geminiviridae Cà chua Ha et al., 2008a

22 Tomato leaf curl Dan Xa virus ToLCDXV Begomovirus Geminiviridae Cà chua Badwil et al., 2008

23 Tomato leaf curl Hainan virus ToLCHV Begomovirus Geminiviridae Cà chua, đu

đủ Giải trình tƣ

24 Tomato leaf curl Hanoi virus ToLCHanV Begomovirus Geminiviridae Cà chua Giải trình tƣ

25 Sida leaf curl virus SiLCV Begomovirus Geminiviridae Cối xay Ha et al., 2008a

26 Citrus tristeza virus CTV Closterovirus Closteroviridae Cây có múi Kiritani & Su, 1999

27 Cucumber mosaic virus CMV Cucumovirus Bromoviridae Bầu bí, cà

chua Revil et al., 2004

28 Southern rice black streaked dwarf

virus SRBSDV Fijivirus Reoviridae Lúa, ngô Giải trình tƣ

29 Rice yellow stunt virus (Rice transitory

yellowing virus) RYSV (RTYV) Nucleorhabdovirus Rhabdoviridae Lúa Giải trình tƣ

30 Rice ragged stunt virus RRSV Oryzavirus Reoviridae Lúa Giải trình tƣ

31 Banana bract mosaic virus BBrMV Potyvirus Potyviridae Chuối Rodoni et al., 1999

32 Bean common mosaic virus BCMV Potyvirus Potyviridae Đậu đỗ Ha et al., 2008c;

Hao et al., 2003

33 Chilli veinal mottle virus ChiVMoV Potyvirus Potyviridae Ớt Ha et al., 2008c

34 Chilli ringspot virus ChiRSV Potyvirus Potyviridae Ớt Ha et al., 2008c

35 Dasheen mosaic virus DsMV Potyvirus Potyviridae Khoai sọ, bán

hạ 3 thùy Ha et al., 2008c

36 Shallot yellow stripe virus SYSV Potyvirus Potyviridae Hành ta, tỏi

tây Ha et al., 2008c

37 Leek yellow stripe virus LYSV Potyvirus Potyviridae Hành ta, tỏi

tây Ha et al., 2008c

38 Onion yellow dwarf virus OYDV Potyvirus Potyviridae Tỏi tây Ha et al., 2008c

118

39 Papaya ringspot virus PRSV Potyvirus Potyviridae Đu đủ, bầu bí Bateson et al., 2002

40 Potato virus Y PVY Potyvirus Potyviridae Khoai tây, ớt Ha et al., 2008c

41 Sorghum mosaic virus SrMV Potyvirus Potyviridae Mía Ha et al., 2008c

42 Sugarcane mosaic virus SCMV Potyvirus Potyviridae Ngô, mía Ha et al., 2008c

43 Sweet potato feathery mottle virus SPFMV Potyvirus Potyviridae Khoai lang Ha et al., 2008c

44 Turnip mosaic virus TuMV Potyvirus Potyviridae Cải củ, cải bẹ Ha et al., 2008c

45 Zucchini yellow mosaic virus ZYMV Potyvirus Potyviridae Bầu bí Ha et al., 2008c

46 Telosma mosaic virus TelMV Potyvirus Potyviridae Hoa thiên lý Ha et al., 2008b

47 Basella rugose mosaic virus (Peace lily

mosaic virus)

BaRMV

(PeLMV) Potyvirus Potyviridae

Hoa lan ý,

mồng tơi Ha et al., 2008b

48 Wild tomato mosaic virus WTMV Potyvirus Potyviridae Cà độc dƣợc Ha et al., 2008b

49 Rice grassy stunt virus RGSV Tenuivirus Lúa Giải trình tƣ

50 Tobacco mosaic virus TMV Tobamovirus Virgaviridae Cà chua,

thuốc lá, ớt ELISA

51 Rice tungro bacilliform virus RTBV Tungrovirus Caulimoviridae Lúa Azzam et al., 2000

52 Rice tungro spherical virus RTSV Waikavirus Lúa ELISA

119

10.3 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH

1. Azzam, O., Arboleda, M., Umadhay, K.M., de los Reyes, J.B., Cruz, F.S., Mackenzie, A. and

McNally, K.L. (2000). Genetic composition and complexity of virus populations at tungro-

endemic and outbreak rice sites. Archives of Virology. 145(12):2643-57.

2. Bateson, M. F., Lines, R. E., Revill, P., Chaleeprom, W., Ha, C. V., Gibbs, A. J. & Dale, J. L.

(2002). On the evolution and molecular epidemiology of the potyvirus Papaya ringspot virus.

Journal of General Virology 83, 2575-2585.

3. Bell, K. E., Dale, J. L., Ha, C. V., Vu, M. T. & Revill, P. A. (2002). Characterisation of Rep-

encoding components associated with banana bunchy top nanovirus in Vietnam. Archives of

Virology 147, 695-707.

4. Blawida, R., Van, D.T. and Maiss, E. (2008). Transreplication of a Tomato yellow leaf curl

Thailand virus DNA-B and replication of a DNAß component by Tomato leaf curl Vietnam

virus and Tomato yellow leaf curl Vietnam virus. Virus Research. Volume 136, 1-2: 107-117

5. Green, S. K., Tsai, W. S., Shih, S. L., Black, L. L., Rezaian, A., Rashid, M. H., Roff, M. M.

N., Myint, Y. Y. & Hong, L. T. A. (2001). Molecular characterisation of begomoviruses

associated with leafcurl diseases of tomato in Bangladesh, Laos, Malaysia, Myanmar, and

Vietnam. Plant Disease 85.

6. Ha Viet Cuong, Coombs, S., Revill, P., Harding, R., Vu, M., and Dale, J. (2006). Corchorus

yellow vein virus, a New World geminivirus from the Old World. Journal of General

Virology 87: 997-1003.

7. Ha Viet Cuong, Steven Coombs, Peter Revill, Rob Harding, Man Vu and James Dale.

(2008a). Molecular characterization of begomoviruses and DNA satellites from Vietnam:

additional evidence that the New World geminiviruses were present in the Old World prior to

continental separation. Journal of General Virology. 89: 312-326.

8. Ha Viet Cuong, S. Coombs, P. A. Revill, R. M. Harding, M. Vu, J. L. Dale. (2008b). Design

and application of two novel degenerate primer pairs for the detection and complete genomic

characterization of potyviruses. Archives of virology. 153:25-36

9. Ha Viet Cuong, S. Coombs, P. A. Revill, R. M. Harding, M. Vu, J. L. Dale. (2008c).

Identification and sequence analysis of potyviruses infecting crops in Vietnam. Archives of

virology. 153:45-60

10. Hà Minh Trung. (1984). Bệnh hại lúa ở Việt Nam. Khoa học và kỹ thuật Nông nghiệp. Số

12: 540 - 546.

11. Hao, N. B., Albrechtsen, S. E. & Nicolaisen, M. (2003). Detection and identification of the

blackeye cowpea mosaic strain of Bean common mosaic virus in seeds of Vigna unguiculata

sspp. from North Vietnam. Australasian Plant Pathology 32, 505-509.

12. Karan, M., Harding, R. M. & Dale, J. L. (1994). Evidence for 2 Groups of Banana Bunchy

Top Virus Isolates. Journal of General Virology 75, 3541-3546.

13. Kiritani, K. & Su, H. J. (1999). Papaya ring spot, banana bunchy top, and citrus greening in

the Asia and Pacific region: Occurrence and control strategy. Jarq-Japan Agricultural

Research Quarterly 33, 23-30.

120

14. Lheureux, F., Laboureau, N., Muller, E., Lockhart, B.E.L. and Iskra-Caruana, M.L. 2007.

Molecular characterization of banana streak acuminata Vietnam virus isolated from Musa

acuminata siamea (banana cultivar. Archives of Virology. Volume 152, 7:1409-1416.

15. Nguyễn Thơ. (1984). Điều tra nghiên cứu bệnh virus trên cà chua, thuốc lá và khoai tây. Tạp

chí Khoa học Nông nghiệp của Đại học Nông nghiệp I.

16. Revill, P. A., Ha, C. V., Porchun, S. C., Vu, M. T. & Dale, J. L. (2003). The complete

nucleotide sequence of two distinct geminiviruses infecting cucurbits in Vietnam. Archives

of Virology 148, 1523-1541.

17. Revill, P. A., Ha, C. V., Lines, R. E., Bell, K. E., Vu, M. T. & Dale, J. L. (2004). PCR and

ELISA-based virus surveys of banana, papaya and cucurbit crops in Vietnam. Asia Pacific

Journal of Molecular Biology and Biotechnology 12, 27-32.

18. Rodoni, B. C., Dale, J. L. & Harding, R. M. (1999). Characterisation and expression of the

coat protein-coding region of banana bract mosaic potyvirus, development of diagnostic

assays and detection of the virus in banana plants from five countries in southeast Asia.

Archives of Virology 144, 1725-1737.

19. Vakili, N. G. (1969). Bunchy top disease of bananas in the central Highlands of South

Vietnam. Plant Disease Reporter 53, 634-638.

20. Vũ Triệu Mân (1984). Nghiên cứu bệnh virus khoai tây ở miền Bắc Việt Nam. Tạp chí Khoa

học Nông nghiệp của Đại học Nông nghiệp I.

121

Chƣơng 11. VIRUS DNA SỢI KÉP (PHIÊN MÃ NGƯỢC): HỌ CAULIMOVIRIDAE

11.1 TÓM TẮT NỘI DUNG

Chƣơng 11 tóm tắt đặc điểm phân loại, phân tử, sinh học của nhóm virus DNA phiên mã

ngƣợc (pararetrovirus) hại thực vật là họ Caulimoviridae. Chƣơng này cũng mô tả đặc điểm của

một virus quan trọng bậc nhất trên lúa và có có mặt ở Việt Nam là RTBV (rice tungro

bacilliiorm virus).

11.2 HỌ CAULIMOVIRIDAE

11.2.1 Phân loại

Họ gồm 6 chi phân biệt bởi tổ chức bộ gen và hình thái phân tử. Trong số các caulimovirus

có 2 virus quan trọng là CaMV (có ý nghĩa trong CNSH thực vật) và RTBV (là một trong số các

virus nguy hiểm nhất trên lúa).

Bảng 11-1 Phân loại các virus thuộc họ Caulimoviridae

Chi Loài điển hình Số loài Hình thái

Caulimovirus Cauliflower mosaic virus 8 Cầu

Cavemovirus Cassava vein mosaic virus 2 Cầu

Petuvirus Petunia vein clearing virus 1 Cầu

Soymovirus Soybean chlorotic mottle virus 3 Cầu

Badnavirus Commelina yellow mottle virus 18 Nhộng

Tungrovirus Rice tungro bacilliform virus 1 Nhộng

11.2.2 Đặc điểm phân tử virus (virion)

Hình thái. Phân tử virus không có vỏ bọc, có hình cầu hoặc hình nhộng tùy theo chi; chẳng

hạn các virus thuộc chi Caulimovirus có hình cầu còn virus thuộc chi Tungrovirus có hình

nhộng. Các virus có hình cầu gọi là các caulimovirus còn các virus có hình nhộng còn đƣợc gọi

là các badnavirus.

Acid nucleic. Bộ gen virus chỉ gồm một phân tử DNA genome sợi vòng kép (dsDNA), có kích

thƣớc từ 7,8 – 8,2 kbp. DNA genome không liên tục: trên một sợi có một điểm rời, còn trên sợi

còn lại có từ 1 đến 3 điểm rời tùy theo chi. Các điểm rời này là điểm gắn mồi trong quá trình tái

sinh virus.

Protein. Bộ gen virus có từ 1 đến 7 ORF tùy thuộc chi. Các protein có chức năng chung cho

tất cả họ là CP, aspatate protease, RT và RNAse H.

11.2.3 Tổ chức bộ gen và phƣơng thức tái sinh

Tổ chức bộ gen là đặc điểm chính để phân biệt các chi. Các gen virus đƣợc mã hóa trên một

sợi DNA (sợi +, theo chiều kim đồng hồ). Sau khi xâm nhập vào nhân tế bào ký chủ, các điểm

rời đƣợc gắn kín và bộ gen virus trở thành sợi vòng kép hoàn chỉnh (còn gọi là

122

minichromosome). Bộ gen virus tiếp theo đƣợc phiên mã theo kiểu bất đối xứng, tức là từ khuôn

sợi (-), nhờ DNA-dependent RNA polymerase của ký chủ để tạo ra phiên bản RNA (transcript)

có kích thƣớc lớn hơn genome. Phiên bản RNA có 2 chức năng: (1) làm khuôn cho quá trình

phiên mã ngƣợc để tạo sợi DNA của virus (sợi -, ngƣợc chiều kim đồng hồ) và (2) làm khuôn để

dịch mã gen virus.

11.2.4 Đặc điểm sinh học

Phần lớn các virus có phổ ký chủ hẹp. Các virus thuộc chi Petuvirus, Soymovirus và

Cavemovirus chỉ nhiễm cây hai lá mầm. Virus thuộc chi Tungrovirus (hiện có 1 đại diện duy

nhất là RTBV) chỉ nhiễm cây một lá mầm. Các virus thuộc chi Badnavirus nhiễm cả cây một và

hai lá mầm.

11.2.5 Các virus thuộc họ Caulimoviridae có ở Việt Nam

Hiện nay, mới có 2 virus thuộc họ này chắc chắn có ở Việt Nam là:

1. RTBV (cùng với RTSV) gây bệnh tungrovirus. Bênh mặc dù đã xuất hiện từ lâu tại Việt

Nam nhƣng chƣa có ghi nhận bệnh gây thành dịch ở Việt Nam.

2. BSAcVNV (Banana streak acuminata Vietnam virus). Đây là một virus mới đƣợc công bố

năm 2007. Virus đƣợc phân lập từ mẫu cây chuối Musa acuminata siamea ở Việt Nam.

Lúc đầu, virus đã đƣợc cho là do BSV (Banana streak virus) gây ra nhƣng sau khi giải

trình tự toàn bộ bộ gen (7801 bp), các tác giả đã phát hiện đây là một loài mới và đặt tên

là BSAcVNV (Lheureux et al., 2007)

11.3 RICE TUNGRO BACILLIFORM VIRUS

11.3.1 Tầm quan trọng

RTBV là một virus quan trọng bậc nhất trên lúa khắp thế giới. Bệnh có ở Việt Nam nhƣng

chƣa có công bố chính thức rằng bệnh đã gây thành dịch nghiêm trọng.

11.3.2 Virus

RTBV thuộc chi Tungrovirus, họ Caulimoviridae. Tên ―bacilliform‖ đƣợc đặt dựa trên hình

dạng của virus là có hình vi khuẩn hay hình nhộng, kích thƣớc phân tử ~ 130 x 30 nm.

RTBV, giống nhƣ các virus trong họ, là một pararetrovirus (có nghĩa là có bản chất bộ gen là

DNA nhƣng khi tái sinh phải qua một bƣớc trung gian là phiên mã ngƣợc từ DNA sang RNA).

Bộ gen virus là một phân tử DNA sợi vòng kép, kích thƣớc ~ 8 kb, chứa 2 vị trí không liên

tục là D1 và D2.

Trên bộ gen virus có 4 ORF đƣợc tổ chức theo chiều kim đồng hồ, mã hóa 4 protein có kích

thƣớc 24, 12, 194, và 46 kDa (đƣợc gọi là các protein P24, P12, P194 và P46). Các ORF 1, 2, 3

xắp xếp gần nhau và gối lên nhau.

P24 có chức năng chƣa rõ nhƣng có thể liên quan đến quá trình lắp ráp phân tử. Đáng chú ý là

ORF của protein này không có mã khởi đầu ATG (ở cả 3 khung) nhƣng lại đƣợc dịch từ mã thứ

2 ATT. ORF này cũng không có mã kết thúc.

P194 là protei quan trong nhất, chứa 4 vùng chức năng: CP (coat protein), aspartate protease,

RT (reverse transcriptase) và RH (RNase H).

123

P12 có chức năng tăng cƣờng dịch mã, đƣợc biểu hiện từ phân tử RNA nhỏ riêng (phân tử

này đƣợc cắt ra từ phân tử RNA lớn)

Hình 11-1 Hình thái phân tử và tổ chức bộ gen của RTBV (Hull, 1996)

11.3.3 Triệu chứng

RTBV khi nhiễm cùng với một virus RNA là RTSV (Rice tungro spherical virus) sẽ gây ra

một bệnh rất nghiêm trọng trên lúa gọi là bệnh tungro. Triệu chứng điển hình là cây lùn mạnh, lá

biến màu vàng, để nhánh giảm. Lá biến vàng bắt đầu từ chót lá. Lá bệnh có thể nhỏ, không cân

đối, có thể có các vệt màu nâu tối. Cây bị bệnh tungro có thể không trỗ bông, hoặc nếu trỗ thì hạt

cũng bị lép và biến màu

Cây bị nhiễm với chỉ RTBV triệu chứng nhẹ hơn còn cây bị nhiễm với chỉ RTSV có thể hơi

còi cọc nhƣng không biến vàng.

Hình 11-2 Cây lúa nhiễm các tổ hợp virus khác nhau và khả năng truyền virus qua rầy xanh đuôi

đen (Azzam et al., 2000)

124

11.3.4 Lan truyền

Ngoài tự nhiên virus truyền qua nhiều loài rầy xanh đuôi đen (Nephortettix spp.), trong đó

hiệu quả nhất là loài N. virescens. Tuy nhiên RTBV không thể tự lan truyền nhờ rầy đƣợc mà

phải nhờ sự hỗ trợ của virus RTSV. Điều này có nghĩa rầy chích hút trên cây chỉ nhiễm RTBV sẽ

không truyền virus. Rầy chích trên cây nhiễm hỗn hợp RTBV + RTSV sẽ truyền đƣợc virus.

Phƣơng thức truyền qua rầy là kiểu bán bền vững. Thời gian ẩn trong vector trung bình khoảng 3

ngày (thay đổi theo loài vector, điều kiện nhiệt độ). Thời gian tồn tại khả nhiễm chỉ vài ngày.

Virus không truyền qua tiếp xúc cơ học cũng nhƣ hạt giống và cây lúa là ký chủ tự nhiên duy

nhất của virus.

11.3.5 Phòng chống

Hiện không có biện pháp nào có thể trực tiếp chống virus. Các biện pháp có thể áp dụng đều

liên quan tới quản lý vector rầy xanh đuôi đen (dùng giống kháng rầy, thuốc hóa học…).

11.4 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 11

1. Đặc điểm họ Caulimoviridae (hình thái, tổ chức bộ gen và phƣơng thức tái sinh)

2. Virus RTBV (tầm quan trọng, tổ chức bộ gen, triệu chứng, lan truyền)..

3. Virus CaMV (tầm quan trọng, tổ chức bộ gen, triệu chứng, lan truyền).

4. Tại sao promoter của CaMV đƣợc sử dụng nhiều trong CNSH và các nguy cơ có thể khi sử

dụng promoter này trong công nghệ chuyển gen thực vật.

11.5 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH

1. Azzam, O., Arboleda, M., Umadhay, K. M., de los Reyes, J. B., Cruz, F. S., Mackenzie, A. &

McNally, K. L. (2000). Genetic composition and complexity of virus populations at tungro-

endemic and outbreak rice sites. Archives of Virology 12, 2643-2657.

2. Hass, M., Bureau, M., Geldreich, A., Yot, P. & Keller, M. (2002). Cauliflower mosaic virus:

still in the news. MOLECULAR PLANT PATHOLOGY 3, 419–429.

3. Hull, R. (1996). Molecular Biology of Rice tungro viruses. Annual Review of

Phytopathology 34, 275–297.

4. Hull, R. (2002). Matthews's Plant Virology. Fourth edition: Academic Press.

5. Hull, R., Geering, A., Harper, G., Lockhart, B. E. & Schoelz, J. E. (2005). Caulimoviridae.

In: Virus Taxonomy. VIIIth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses.

(C.M. Fauquet, M.A Mayo, J. Maniloff, U. Desselberger and L.A. Ball, eds).

Elsevier/Academic Press. London., 385 - 396.

6. Lheureux, F., Laboureau, N., Muller, E., Lockhart, B. E. L. & Iskra-Caruana, M. L. (2007).

Molecular characterization of banana streak acuminata Vietnam virus isolated from Musa

acuminata siamea (banana cultivar). Archives of Virology 152, 1409-1416

125

Chƣơng 12. VIRUS DNA SỢI ĐƠN: CHI BEGOMOVIRUS (HỌ GEMINIVIRIDAE)

12.1 TÓM TẮT NỘI DUNG

Chƣơng 12 mô tả tóm tắt đặc điểm phân loại, phân tử, sinh học của họ Geminiviridae, một

trong hai họ virus thực vật lớn nhất. Chƣơng này cũng mô tả chi tiết đặc điểm của các virus

thuộc chi Begomovirus - là chi virus quan trọng nhất của họ. Một số bệnh do begomovirus có ý

nghĩa kinh tế trên thế giới và Việt Nam cũng đƣợc mô tả, đặc biệt chi tiết đối với bệnh xoăn vàng

lá cà chua.

12.2 HỌ GEMINIVIRIDAE

Họ Geminiviridae là một trong 2 họ virus thực vật lớn nhất (cùng với họ Potyviridae). Số loài

đƣợc công nhận chính thức bởi ICTV năm 2009 là 218 loài (Bảng 1), chiếm khoảng 20% tổng số

loài virus thực vật. Từ ―Gemini‖ có nghĩa là ―sinh đôi hay cặp đôi‖, ám chỉ hình thái dạng cầu

kép của phân tử virus.

Các geminivirus có hình thái phân tử dạng hình cầu kép, có bộ gen DNA dạng vòng, sợi đơn,

kích thƣớc ~ 2.7 kb. Các geminivirus có thể có bộ gen đơn (monopartite) gồm 1 phân tử DNA

hoặc bộ gen kép (bipartite) nếu có 2 phân tử DNA genome.

Các geminivirus đƣợc phân loại trên cơ sở tổ chức bộ gen và vector truyền bệnh. Cho tới nay

(số liệu năm 2009 của ICTV), 4 chi trong họ đƣợc ghi nhận bao gồm: Mastrevirus, Curtovirus,

Topocuvirus và Begomovirus.

Bảng 12-1. Phân loại các virus họ Geminiviridae theo ICTV năm 2009

Nhiều geminivirus là các virus gây bệnh cây có ý nghĩa kinh tế. Một số ví dụ điển hình là:

MSV (Maize streak virus, chi Mastrevirus), gây bệnh khảm sọc ngô, rất phổ biến ở châu

Phi.

Các begomovirus (chi Begomovirus) gây bệnh khảm lá sắn ở châu Phi, tiểu lục địa Ấn

Độ, bệnh cuốn lá bông, và đặc biệt bệnh xoăn vàng lá cà chua khắp thế giới.

Chi Loài điển hình Bộ gen Vector Số loài

Mastrevirus Maize streak virus (MSV) Đơn Rầy lá 14

Curtovirus Beet curly top virus (BCTV) Đơn Rầy lá 7

Topocuvirus Tomato pseudo-curly top virus (TPCTV) Đơn Rầy than 1

Begomovirus Bean golden mosaic virus (BGMV) Đơn hoặc kép Bọ phấn 196

Tổng số 218

126

12.3 CHI BEGOMOVIRUS

12.3.1 Giới thiệu

Begomovirus là 1 trong 4 chi của họ Geminiviridae và là chi lớn nhất trong họ với tổng số

loài đƣợc công nhận bởi ICTV năm 2009 là 196 loài (trong tổng số 218 loài của họ).

Có thể thấy chi Begomovirus cũng là 1 trong 2 chi (cùng với chi Potyvirus, họ Potyviridae)

lớn nhất trong số các chi virus thực vật (chiếm ~ 20 tổng số virus).

Do số lƣợng virus rất nhiều, lại thƣờng gây bệnh với triệu chứng giống nhau trên một cây ký

chủ nên tên virus gây bệnh thƣờng thêm tên địa danh (nƣớc, tỉnh), ví dụ nhƣ Tomato leaf curl

Vietnam virus.

12.3.2 Hình thái phân tử

Hình thái phân tử (virion) của begomovirus giống nhƣ của các geminivirus khác, đều có

hình cầu kép. Phân tử virus thực chất là 2 hình cầu 20 mặt (icosahedron), mỗi mặt là 1 tam giác

đều với số đơn vị tam giác (T) trên mỗi mặt = 1, nối với nhau để tạo ra phân tử hình cầu đa diện

kép (gemini). Do nối với nhau nên 2 hình cầu này không hoàn thiện dẫn tới trên mỗi hình cầu chỉ

có 55 tiểu phần protein (protein vỏ) đƣợc xắp xếp thành 11 đơn vị hình thái, mỗi đơn vị gồm 5

tiểu phần protein (pentameric capsomer). Kết quả là toàn bộ phân tử có 110 tiểu phần và 22 đơn

vị hình thái.

Cần chú ý là đối với các begomovirus có bộ gen kép thì mỗi phân tử chỉ chứa 1 phân tử

DNA genome.

Hình 12-1 Hình thái phân tử geminiviruses. A, Phân tử Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV),

bar = 100 nm (Gafni, 2003). B, Mô hình phân tử Maize streak virus (MSV) (Zhang et al., 2001).

12.3.3 Đặc điểm bộ gen

Các begomovirus là các virus thực vật có bộ gen DNA sợi vòng đơn có kích thƣớc khoảng 2.6

– 2.8 kb. Chúng hoặc có bộ gen kép (bipartite) gồm 2 phân tử DNA gọi là DNA-A và DNA-B

hoặc có bộ gen đơn (monopartite) tƣơng đƣơng DNA-A.

Đối với các virus có bộ gen đơn thì DNA của chúng chứa 6 gen đƣợc tổ chức theo 2 chiều

ngƣợc nhau.

A B

127

Trên chiều kim đồng hồ (chiều virus) có 2 ORF là (i) V1 mã hóa vỏ protein (CP) có chức

năng chính là tạo vỏ phân tử virus, lan truyên qua vector, vận chuyển bộ gen virus vào và ra khỏi

nhân tế bào ký chủ và vận chuyển bộ gen virus giữa các tế bào; và (ii) V2 mã hóa protein V2 có

chức năng liên quan đến vận chuyển virus giữa các tế bào.

Trên chiều ngƣợc kim đồng hồ (chiều sợi tƣơng đồng virus) có 4 ORF là (i) C1 mã hóa

protein tái sinh hay còn gọi là protein Rep có chức năng chính là cắt - nối bộ gen virus tại một vị

trí đặc biệt ở vùng nguồn gốc tái sinh và tƣơng tác với protein ký chủ để tạo điều kiện thuận lợi

cho tái sinh virus, (ii) C2 mã hóa 1 protein hoạt hóa phiên mã (TrAP, transcriptional activator

protein), (iii) C3 mã hóa 1 protein tăng cƣờng tái sinh (REn, replication enhancer) và (iv) C4 mã

hóa protein C4 với chức năng liên quan đến phổ ký chủ và phát triển triệu chứng, ức chế hoạt

động câm gen của tế bào ký chủ.

Giữa 2 vùng gen mã hóa ngƣợc chiều nhau ở trên là một vùng liên gen không mã hóa IR

(intergenic region). Vùng IR chứa nguồn gốc tái sinh (ori = origin of replication) gồm (i) các

chuỗi lặp đảo (iteron) cần thiết cho sự nhận biết và gắn kết của protein Rep và (ii) một cấu trúc

kẹp tóc (hairpin) hay còn gọi là thân – thòng lọng (stem – loop), trong đó chuỗi TAATATTAC

trên vùng thòng lọng là giống nhau ở tất cả các begomovirus. Vị trí T7-C

8 của chuỗi này là nơi

protein Rep cắt và nối bộ gen begomovirus trong quá trình tái sinh.

Đối với các begomovirus có bộ gen kép thì DNA-A có tổ chức bộ gen và chức năng các gen

tƣơng tự nhƣ DNA-A của các begomovirus có bộ gen đơn (tên các ORF đƣợc thêm ký tự A vào

đằng trƣớc thành AV1, AV2, AC1, AC2, AC3 và AC4). Cần chú ý là tất cả các begomovirus ở

Tân thế giới (châu Mỹ) đều thiếu ORF AV2.

Phân tử DNA-B của chúng chỉ chứa 2 ORF đƣợc sắp xếp theo 2 chiều ngƣợc nhau. Trên

chiều kim đồng hồ có ORF BV1 mã hóa protein con thoi (NSP, nuclear shuttle protein) có chức

năng chính là vận chuyển bộ gen virus vào và ra khỏi nhân tế bào. Trên chiều ngƣợc kim đồng

hồ có ORF BC1 mã hóa protein vận chuyển (MP, movement protein) có chức năng vận chuyển

bộ gen virus giữa các tế bào ký chủ.

Ở vùng IR của DNA-A và DNA-B của các begomovirus có bộ gen kép có một chuỗi bảo thủ

cao (khoảng 150 nucleotide) giữa 2 phân tử gọi là vùng chung CR (common region). Vùng CR

chứa chuỗi ori. Sở dĩ có vùng chung này vì DNA-B không thể tự tái sinh mà phải cần sự nhận

biết và cắt – nối của protein Rep mã hóa trên DNA-A để tái sinh đƣợc trong tế bào ký chủ.

12.3.4 DNA vệ tinh của begomovirus

Có 2 loại phân tử DNA vệ tinh thƣờng đƣợc phát hiện có liên quan đến các begomovirus có

bộ gen đơn tại Cựu thế giới (Châu Á, Châu Phi, Châu Âu và Châu Uc). Các phân tử này đều có

bộ gen DNA sợi vòng đơn với kích thƣớc xấp xỉ ½ kích thƣớc bộ gen virus chủ. Các phân tử này

gồm 2 loại là:

Alphasatellite (trƣớc đây gọi là DNA-1). Loại phân tử vệ tinh này có đặc điểm cấu trúc giống

nhƣ DNA-1 của nanovirus nhƣ DNA sợi vòng đơn, kích thƣớc khoảng 1.2 kb, chứa 1 vùng ori,

mã hóa 1 protein tái sinh (Rep) theo chiều kim đồng hồ và 1 vùng giàu adenine. Alphasatellite có

thể tự tái sinh trong tế bào cây, đƣợc lắp ráp trong phân tử virus và nhờ virus để phát tán qua bọ

phấn. Tuy nhiên vệ tinh này không có vai trò trong tính gây bệnh của virus.

Betasatellite (trƣớc đây gọi là DNA-β). Loại phân tử vệ tinh này đã thu hút sự chú ý kể từ khi

Saunders et al. (2000) và Briddon et al. (2001) chứng minh rằng triệu chứng điển hình trên cây

ageratum (bệnh vàng gân cây ageratum) và cây bông (bệnh cuốn lá bông) chỉ có thể hình thành

khi Ageratum yellow vein virus (AYVV) và Cotton leaf curl virus (CLCV) cùng đƣợc lây nhiễm

128

với 1 phân tử DNA-β tƣơng ứng. Tuy nhiên vai trò của phân tử vệ tinh này đối với sự biểu hiện

triệu chứng bệnh không thống nhất. Nhiều begomovirus bộ gen đơn đã đƣợc chứng minh là có

thể tạo ra triệu chứng điển hình mà không cần sự có mặt của phân tử betasatellite chẳng hạn nhƣ

đối với Tobacco yellow leaf curl Yunnan virus (TYLCYNV)

Betasatellite có bộ gen DNA sợi vòng đơn, có kích thƣớc bằng 1 nửa của begomovirus (phần

lớn là 1350 nucleotides) và mã hóa trên sợi tƣơng đồng 1 protein là betaC1 (βC1) có kích thƣớc

điển hình 118 amino acids. Phân tử chứa 1 vùng giàu adenin và 1 vùng bảo thủ cao giữa các

phân tử betasatellite khác nhau gọi là vùng SCR (satellite conserve region). Trên vùng SCR có

một trình tự bảo thủ TAATATTAC giống nhƣ của begomovirus. Betasatellite đƣợc lắp ráp trong

phân tử virus, chỉ có thể tái sinh nhờ virus. Betasatllite có thể ức chế phản ứng phòng thủ của cây

và do đó có vai trò quan trọng trong tính gây bệnh của nhiều begomovirus có bộ gen đơn.

12.3.5 Tái sinh của begomovirus

Begomovirus, giống nhƣ các geminivirus khác, tái sinh trong tế bào thực vật theo cơ chế vòng

lăn (rolling circular mechanism). Cơ chế vòng lăn có thể đƣợc chia làm 2 pha và đƣợc thực hiện

trong nhân tế bào ký chủ (xem hình vẽ phần đại cƣơng)

1. Pha tổng hợp sợi DNA vòng đơn (bộ gen có mặt trong phân tử virus) thành sợi DNA vòng

kép khi bộ gen virus đƣợc chuyển vào nhân tế bào. Nhƣ vậy sợi kép sẽ gồm một sợi virus và

một sợi tƣơng đồng virus. Pha này vẫn chƣa đƣợc hiểu rõ.

2. Pha tái sinh theo cơ chế vòng lăn: Protein Rep (sau khi đƣợc tổng hợp) sẽ cắt sợi virus tại

chuỗi bảo toàn TATATTAC. Nhờ vật liệu cũng nhƣ enzyme DNA polymearase của tế bào,

sợi virus đƣợc tổng hợp liên tục trên sợi tƣơng đồng virus. Protein Rep lại tiếp tục cắt sợi

virus mới đƣợc tổng hợp tại chuỗi TATATTAC (cũng vừa mới đƣợc tổng hơp) thành một sợi

virus hoàn chỉnh dƣới dạng sợi đơn mạch thẳng. Protein Rep sau đó sẽ nối 2 đầu của mạch

thẳng để tạo ra bộ gen virus sợi đơn mạch vòng hoàn chỉnh.

Ngoài cơ chế vòng lăn, gần đây ngƣời ta còn phát hiện begommovirus thƣờng tái sinh theo cơ

chế gọi là ―tái sinh phụ thuộc tái tổ hợp‖ (Recombination dependent replication (RDR)). Cách tái

sinh này cho phép virus có thể tái tổ hợp dễ dàng khi nhiễm hỗn hợp trên một cây ký chủ.

12.3.6 Cơ chế gây bệnh của begomovirus

Tương tác với các yếu tố ký chủ liên quan đến bộ máy tái bản. Quá trình tái bản của

begomovirus xảy ra trong nhân tế bào, kể cả ở các tế bào không phân chia. Do vậy, sau khi

nhiễm vào tế bào, begomovirus phải khởi động bộ máy tái sinh của tế bào. Một trong các protein

của tế bào ký chủ thực vật điều khiển chu kỳ tế bào là pRBR (plant retinoblastoma-related

protein) - chịu trách nhiệm chuyển chu kỳ tế bào từ pha G1 sang pha S (pha tổng hợp). Protein

Rep của begomovirus đã đƣợc chứng minh tƣơng tác với pRBR của tế bào ký chủ, cho phép

khởi động lại chu kỳ tế bào để tạo điều kiện cho virus tái sinh.

12.3.7 Lan truyền của begomovirus

Tất cả các begomovirus lan truyền ngoài tự nhiên nhờ bọ phấn (B. tabaci) theo kiểu bền vững

tuần hoàn. Chƣa có bằng chứng chứng minh begomovirus nhân lên trong cơ thể bọ phấn.

129

Hình 12-2 Tổ chức bộ gen của begomovirus và DNA vệ tinh (Hà Viết Cƣờng, 2008)

12.3.8 Phòng trừ begomovirus

Phòng trừ begomovirus chủ yếu dựa vào 2 chiến lƣợc chính là là (i) phòng chống vector và

(ii) tạo cây kháng bệnh.

Phòng chống vector. Có nhiều kỹ thuật phòng trừ bọ phấn nhƣng đƣợc áp dụng tùy điều kiện:

Dùng giống kháng bọ phấn

Dùng thuốc hóa học.

Trồng cây trong nhà lƣới, nhà kính

Dùng bẫy hấp dẫn màu vàng hoặc bề mặt phản xạ (chỉ áp dụng có hiệu quả trong điều

kiện nhà lƣới)

Tạo giống kháng virus. Tính kháng begomovirus có thể đƣợc tạo ra nhờ 2 cơ chế: Tính

kháng từ cây và tính kháng từ tác nhân gây bệnh (PRD).

α satellite βC1

Rep

SCR

A-rich

β satellite

A-rich

C2 (TrAP)

V2

V1 (CP)

C4

C1 (Rep)

C3 (REn)

Begomovirus

(bộ gen đơn)

DNA genome

AV1

(CP)

AC3

(REn) AC2

(TrAP)

AC1

(Rep)

AC4

CR

BV1

(NSP)

CR

BC1

(MP)

AV2

Begomovirus

(bộ gen kép)

DNA-B

Begomovirus

(bộ gen kép)

DNA-A

130

Trên cây cà chua, ngƣời ta chƣa phát hiện thấy gen kháng R chống lại begomovirus trên cây

cà chua trồng (Lycopersicon esculentum) nhƣng một số gen kháng chống lại begomovirus đã

đƣợc phát hiện thấy trên một số giống cà chua dại (gọi là các gen Ty. Ví dụ Ty1 gen đƣợc phân

lập từ cây cà chua dại (Lycopersicon chilense) và là một gen kháng trội không hoàn toàn. Ty-1

dƣờng nhƣ tƣơng tác với các protein chịu trách nhiệm di chuyển của virus để tạo tính kháng. Ty-

1 đã đƣợc chuyển vào cà chua trồng để tạo giống cà chua kháng. Hiện nay, nhiều giống cà chua

kháng begomovirus là các giống kháng chuyển gen dùng gen kháng từ cây.

Gần đây nhiều giống cây (cà chua, bông, sắn) đang đƣợc thử nghiệm tạo tính kháng thông qua

cơ chế RNAi. Các gen thƣờng đƣợc sử dụng để tạo cấu trúc chuyển gen là CP hoặc Rep.

12.4 BỆNH DO BEGOMOVIRUS

Begomovirus gây nhiều bệnh quan trọng trên cây trồng. Các triệu chứng điển hình do

begomvirus gây ra bao gồm: Vàng gân, khảm biến vàng (kèm theo biến dạng lá), biến vàng lá,

lùn cây, xoăn lá. Một đặc điểm quan trọng là nhiều bệnh có thể do các begomovirus thuộc các

loài khác hay gây ra. Dƣới đây trình bày một số bệnh quan trọng trên thế giới và Việt Nam

12.4.1 Bệnh khảm lá sắn

Triệu chứng điển hình là lá bị khảm, biến dạng dữ dội, cây lùn. Bệnh khảm lá sắn là bệnh

nguy hiểm nhất trên cây sắn tại châu Phi do một số begomovirus có bộ gen kép gây ra nhƣ

ACMV (African cassava mosaic virus), EACMV (East African cassava mosaic virus), SACMV

(South African cassava mosaic virus). Ngoài châu Phi, bệnh cũng đƣợc phát hiện tại tiểu lục địa

Ấn Độ nhƣ ICMV (Indian cassava mosaic virus); SLCAM (Srilancan cassava mosaic virus). Ở

Việt Nam, chƣa phát hiện thấy bệnh. Vì bệnh có thể truyền qua hom sắn giống nên vấn đề kiểm

dịch bệnh này rất quan trọng do cây sắn là một cây công nghiệp có ý nghĩa kinh tế của Việt

Nam.

Hình 12-3 Bệnh khảm lá sắn tại châu Phi. B và E là triệu chứng bệnh; C là vector bọ phấn và F là

cây chuyển gen kháng bệnh (Legg & Fauquet, 2004).

12.4.2 Bệnh cuốn lá bông

Bệnh cuốn lá là một trong các bệnh nguy hiểm nhất tại các nƣớc trồng bông thuộc tiểu lục địa

Ấn Độ nhƣ Pakistan, Ấn Độ. Triệu chứng điển hình là cuốn lá và lùn cây. Ngoài ra trên lá bông

131

bệnh thƣờng biểu hiện triệu chứng phồng gân và mọc lá phụ. Ở châu Á, bệnh do ít nhất 5

begomovirus gây ra bao gồm Cotton leaf curl Alabad virus, Cotton leaf curl Bangalore virus,

Cotton leaf curl Gezira virus, Cotton leaf curl Kokhran virus, Cotton leaf curl Multan virus. Tất

cả các begomovirus gây hại trên bông ở châu Á đều là các virus có bộ gen đơn và đều cần một

phân tử betasatellite nhiễm kèm để tạo triệu chứng.

Bệnh cuốn lá bông đã đƣợc quan sát thấy tại miền Bắc Việt Nam. Tuy nhiên nguyên nhân gây

bệnh chƣa đƣợc xác định.

Hình 12-4 Triệu chứng bệnh cuốn lá bông tại Pakistan. Chú ý sự hình thành lá phụ ở mặt sau của

lá bông ở ảnh dƣới bên phải (Bridon & Markham, 2000)

12.4.3 Bệnh xoăn vàng lá cà chua

12.4.3.1 Tầm quan trọng

Bệnh xoăn lá cà chua đƣợc ghi nhận đầu tiên trên thế giới từ cuối những năm 40 tại Israel.

Hiện nay, bệnh xoăn vàng lá đã trở thành bệnh virus quan trọng nhất trên cây cà chua khắp thế

giới. Tại Việt Nam, bệnh xoăn vàng lá là bệnh virus nguy hiểm nhất trên cà chua.

12.4.3.2 Triệu chứng bệnh

Bệnh xoăn vàng lá xuất hiện triệu chứng trong vòng 2-4 tuần sau khi nhiễm bệnh và phát triển

đầy đủ triệu chứng trong vòng 2 tháng. Triệu chứng có thể thay đổi theo điều kiện môi trƣờng,

giai đoạn sinh trƣởng và điều kiện sinh lý của cây tại thời điểm nhiễm bệnh

Triệu chứng sớm nhất là lá cong xuống dƣới vào phía bên trong. Về sau, lá không có hình

dạng, nhỏ hẹp, biến vàng từ mép và chót lá lan vào giữa gân; lá cuốn cong lên phía trên thành

hình thuyền; lá non biến vàng mạnh, giòn và nhỏ hẹp. Triệu chứng biến vàng đặc biệt rõ ở các lá

non. Cuống lá có thể xoắn vặn. Cây lùn còi cọc, mọc nhiều cành nhánh nhỏ, đốt thân ngắn. Cây

nhiễm sớm thƣờng không ra quả do hoa bị rụng.

Chú ý quan trọng: Triệu chứng do các begomovirus khác nhau gây ra trên cà chua thƣờng

tƣơng tự nhau.

132

12.4.3.3 Tác nhân gây bệnh là một phức hợp nhiều virus

Trƣớc những năm 90, tác nhân gây bệnh xoăn vàng lá cà chua đã đƣợc xác định do các

begomovirus. Các begomovirus gây bệnh thƣờng đƣợc đặt tên theo cây ký chủ (tomato) và triệu

chứng, chủ yếu dƣới 2 dạng xoăn lá (leaf curl) và biến vàng (yellow), nên tên virus gây bệnh là

―Tomato yellow leaf curl virus‖ và tên các isolate virus gây bệnh thƣờng đƣợc kèm theo 1 từ chỉ

địa phƣơng nơi bệnh xuất hiện; ví dụ:

Tomato yellow leaf curl virus- Is (TYLCV-Is) phân lập từ Israel,

Tomato yellow leaf curl virus – Sar (TYLCV-Sar) phân lập từ đảo Sardinia –Ý

Tomato yellow leaf curl virus – Th (TYLCV-Th) phân lập từ Thái Lan…

Do có ít lựa chọn trong việc đặt tên, các tác giả cũng có xu hƣớng lấy chỉ triệu chứng xoăn lá

―leaf curl‖ để đặt tên virus mặc dù các virus này đều tạo triệu chứng biến vàng trên cà chua;

chẳng hạn:

Tomato leaf curl virus-Au (ToLCV-Au) phân lập từ Öc

Tomato leaf curl Guzarat virus (ToLCGV) phân lập từ tỉnh Guzarat (Pakistans)

Từ những năm 90 trở lại đây, sự tiến bộ của công nghệ sinh học đã cho phép giải trình tự toàn

bộ bộ gen virus và xác định danh tính virus một cách dễ dàng. Dựa vào các phân tích phân tử,

Ủy ban Phân loại Virus Quốc tế (ICTV) đã xác định ngƣỡng phân biệt loài begomovirus là 89 %

mức đồng nhất trình tự nucleotide của phân tử DNA-A. Chỉ tiêu này đã cho phép tách đƣợc

nhiều begomovirus, vốn đƣợc xem là các isolate khác nhau của cùng một virus gây bệnh xoăn

vàng lá cà chua, thành các virus phân biệt; ví dụ:

TYLCV-Sar trở thành Tomato yellow leaf curl Sardinia virus (TYLCSV)

TYLCV-Ch trở thành Tomato yellow leaf curl China virus (TYLCCNV)

TYLCV-Th trở thành Tomato yellow leaf curl Thailand virus (TYLCSV).

TYLCV-Is phân lập từ Israel, do quyền ƣu tiên, đƣợc công nhận là Tomato yellow

leaf curl virus (TYLCV).

Nhƣ vậy, tác nhân gây bệnh xoăn vàng lá cà chua đƣợc xem là một phức hợp nhiều

begomovirus khác nhau. Hiện nay, có khoảng 60 begomovirus gây bệnh xăn vàng lá cà chua

khắp thế giới. Hậu quả là, dựa trên triệu chứng quan sát, bệnh không thể đƣợc gán cho một loài

begomovirus cụ thể trừ phi danh tính của virus đã đƣợc xác định.

Nhiều begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua ở Cựu thế giới (Châu Á, Âu, Phi, Đại

Dƣơng) là các begogomovirus có bộ gen đơn và thƣờng đƣợc phát hiện kèm với các phân tử

DNA vệ tinh là alphasatellite và betasatellite.

12.4.3.4 Lan truyền

Tất cả các begomovirus lan truyền ngoài tự nhiên nhờ bọ phấn theo kiểu bền vững tuần hoàn.

Chƣa có bằng chứng chứng minh begomovirus nhân lên trong cơ thể bọ phấn. Bọ phấn dùng vòi

chọc vào mô mạch dẫn để hút dịch cây từ mạch phloem. Virus đƣợc hút qua vòi, tới diều, thấm

qua màng ruột vào xoang cơ thể, đạt tới tuyến nƣớc bọt và cuối cùng vào ống nƣớc bọt.

Nghiên cứu với TYLCV tại Israel cho thấy thời gian chích nạp và chích truyền tối thiểu của

bọ phấn là khoảng 15 – 20 phút. Kể từ khi bắt đầu chích nạp, virus đƣợc phát hiện có mặt ở

133

phần đầu sau khoảng 10 phút, ở ruột giữa sau khoảng 50 phút, ở xoang cơ thể sau khoảng 90

phút và ở tuyến nƣớc bọt sau khoảng 7 giờ. Thời gian từ khi virus đƣợc phát hiện thấy ở tuyến

nƣớc bọt tới khi bọ phấn có thể truyền đƣợc bênh là khoảng 1 giờ. Nhƣ vậy thời kỳ ẩn của

TYLCV trong cơ thể bọ phấn là khoảng 8 giờ.

Thí nghiệm với TYLCV cũng cho thấy, số lƣợng virus đƣợc tích lũy đạt cực đại (khoảng 600

triệu phân tử virus) nếu để bọ phấn chích nạp trên cây bệnh 12 giờ. Thời gian này đối với

TYLCSV là 24 giờ.

Sau thời gian chích nạp khoảng 1-2 ngày, virus có thể đƣợc duy trì trong cơ thể bọ phấn nhiều

tuần (3 tuần đối với TYLCSV) hoặc cả đời nhƣ đối với TYLCV.

Virus có thể truyền qua giao phối từ bọ phấn đực sang bọ phấn cái và ngƣợc lại. Đã có bằng

chứng cho thấy TYLCV có thể truyền qua trứng mặc dù tỷ lệ truyền bệnh của bọ phấn trƣởng

thành phát triển từ trứng mang virus là rất nhỏ. Trái lại, thí nghiệm với Tomato mottle virus

(ToMoV) cho thấy bọ phấn không truyền virus này qua trứng.

Một cá thể bọ phấn có thể truyền bệnh sau khi chích nạp 24 giờ mặc dù tỷ lệ truyền bệnh

không cao; tỷ lệ truyền bệnh đạt 100 % nếu sử dụng 5 – 15 bọ phấn. Bọ phấn cái truyền virus

hiệu quả hơn bọ phấn đực và hiệu quả truyền tốt nhất khi bọ phấn trƣởng thành ở 1 -2 tuần tuổi

và giảm dần theo thời gian sinh trƣởng của bọ phấn. Hiệu quả truyền virus giảm theo tuổi là do

lƣợng virus đƣợc chích nạp giảm.

12.4.3.5 Các begomovirus hại cà chua ở Việt Nam

Việt Nam là một trong các trung tâm đa dạng chính của begomovirus. Tuy nhiên, hiện nay

mới chỉ xác định đƣợc một số begomovirus sau gây bệnh trên cà chua:

Bảng 12-2 Các begomovirus hại cây trồng đƣợc phát hiện cho tới nay tại Việt Nam

TT Virus Khu vực

1 Tomato leaf curl Vietnam virus (ToLCVV) Cả nƣớc

2 Tomato yellow leaf curl Vietnam virus (TYLCVNV) Miền Bắc

3 Tomato yellow leaf curl Kanchanaburi virus (TYLCKaV) Miền Trung, miền Nam

4 Tomato leaf curl Dan Xa virus (ToLCDXV)* Miền Bắc

5 Tomato leaf curl Hainan virus (ToLCHV) Miền Bắc

6 Tomato leaf curl Hanoi virus (ToLCHanV) Miền Bắc

Ghi chú * ToLCDXV mới được ICTV phân loại lại, còn trong công bố ban đầu, virus này đã được các tác

giả phân loại không chính xác là Tomato yellow leaf curl Vietnam virus-DX1.

12.5 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 12

1. Đặc điểm chung họ Geminiviridae.

2. Đặc điểm chi Bgomovirus (hình thái, đặc điểm bộ gen, tái sinh, lan truyền).

3. Bệnh xoăn vàng lá cà chua (triệu chứng, bản chất tác nhân gây bệnh, lan truyền (thời

gian chích nạp, chích truyền, ẩn), phƣơng hƣớng phòng trừ).

134

12.6 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH

1. Fauquet, C. M. & Stanley, J. (2005). Revising the way we conceive and name viruses below

the species level: A review of geminivirus taxonomy calls for new standardized isolate

descriptors. Archives of Virology 150, 2151-2179.

2. Ghanim, M., Morin, S., Zeidan, M. & Czosnek, H. (1998). Evidence for transovarial

transmission of tomato yellow leaf curl virus by its vector, the whitefly Bemisia tabaci.

Virology 240, 295-303.

3. Gutierrez, C., Ramirez-Parra, E., Castellano, M. M., Sanz-Burgos, A. P., Luque, A. &

Missich, R. (2004). Geminivirus DNA replication and cell cycle interactions. Veterinary

Microbiology 98, 111-119.

4. Ha, C., Coombs, S., Revill, P., Harding, R., Vu, M. & Dale, J. (2006). Corchorus yellow vein

virus, a New World geminivirus from the Old World. Journal of General Virology 87, 997–

1003.

5. Ha, C., Coombs, S., Revill, P., Harding, R., Vu, M. & Dale, J. (2008). Molecular

characterization of begomoviruses and DNA satellites from Vietnam: additional evidence

that the New World geminiviruses were present in the Old World prior to continental

separation. Journal of General Virology 89, 312–326.

6. Mansoor, S., Briddon, R. W., Zafar, Y. & Stanley, J. (2003). Geminivirus disease complexes:

an emerging threat. TRENDS in Plant Science 8 128-134.

7. Moriones, E. & Navas-Castillo, J. (2000). Tomato yellow leaf curl virus, an emerging virus

complex causing epidemics worldwide. Virus Research 71, 123-134.

8. Nawaz-ul-Rehman, M. S. & Fauquet, C. M. (2009). Evolution of geminiviruses and their

satellites. FEBS Letters 583, 1825–1832.

9. Revill, P. A., Ha, C. V., Porchun, S. C., Vu, M. T. & Dale, J. L. (2003). The complete

nucleotide sequence of two distinct geminiviruses infecting cucurbits in Vietnam. Archives

of Virology 148, 1523-1541.

10. Rojas, M. R., Hagen, C., Lucas, W. J. & Gilbertson, R. L. (2005). Exploiting chinks in the

plant's armor: Evolution and emergence of geminiviruses. Annual Review of Phytopathology

43, 361-394.

11. Seal, S. E., vandenBosch, F. & Jeger, M. J. (2006). Factors influencing begomovirus

evolution and their increasing global significance: Implications for sustainable control.

Critical Reviews in Plant Sciences 25, 23-46.

12. Stanley, J., Bisaro, D. M., Briddon, R. W., Brown, J. K., Fauquet, C. M., Harrison, B. D.,

Rybicki, E. P. & Stenger, D. C. (2005). Geminiviridae. In Virus Taxonomy VIIIth report of

the International Committee on Taxonomy of Viruses, pp. 301 - 326. Edited by C. M.

Fauquet, M. A. Mayo, J. Maniloff, U. Desselberger & L. A. Ball. London:

Elsevier/Academic Press.

135

Chƣơng 13. VIRUS DNA SỢI ĐƠN (TIẾP): CHI BABUVIRUS (HỌ NANOVIRIDAE)

13.1 TÓM TẮT NỘI DUNG

Chƣơng 13 mô tả chi tiết đặc điểm phân loại, phân tử, sinh học của các virus họ Nanoviridae,

một trong 3 họ virus thực vật có bộ gen DNA. Chƣơng này cũng mô tả chi tiết đặc điểm của

BBTV (banana bunchy top virus) gây bệnh chùn ngọn chuối ở Việt Nam.

13.2 HỌ NANOVIRIDAE

13.2.1 Phân loại

Họ Nanoviridae chỉ gồm 6 thành viên hại thực vật đƣợc phân loại vào 2 chi là Nanovirus và

Babuvirus.

Bảng 13-1 Phân loại họ Nanoviridae

Virus Chi Ký chủ

Abaca bunchy top virus Babuvirus Musa

Banana bunchy top virus Babuvirus Musa

Cardamom bushy dwarf virus Babuvirus ?

Faba bean necrotic yellows virus Nanovirus Cây họ đậu

Subterranean clover stunt virus Nanoviru Cây họ đậu

Milk vetch dwarf virus Nanovirus Cây họ đậu

13.2.2 Đặc điểm phân tử virus (virion)

Hình thái. Virion có hình cầu đa diện đối xứng 20 mặt (icosahedral, T=1, 60 tiểu phần

protein), kích thƣớc 17-20 nm, không có vỏ bọc.

Acid nucleic. Bộ gen virus gồm 6 – 8 phân tử DNA sợi vòng đơn (ssDNA) tùy theo chi. Mỗi

virion chỉ chứa một phân tử DNA. Các phân tử DNA genome có kích thƣớc từ 977 - 1111 đến

nucleotid.

Protein. Virion chỉ chứa 1 loại protein là CP.

13.2.3 Tổ chức bộ gen và đặc điểm tái sinh

Các phân tử DNA genome có cấu trúc tƣơng tự nhau gồm một vùng không dịch mã (NCR =

non coding region) và vùng dịch mã. Vùng không dịch mã có trình tự nucleic acid giống nhau

cho tất cả các phân tử DNA genome của loài. Vùng không dịch mã chứa nguồn gốc tái sinh (ori),

trên đó là một cấu trúc thân – thòng lọng (stem-loop structure). Trên vùng dịch mã, mỗi phân tử

DNA genome đều chứa 1 ORF mã hóa cho một protein chức năng. Các protein này đƣợc mã hóa

theo cực (+) tức mã hóa trên sợi virus (chiều kim đồng hồ). Các protein của mỗi virus gồm:

M-Rep (major replication protein): chịu trách nhiệm tái sinh tất cả các phân tử DNA genome.

CP (coat protein): protein vỏ

136

Clink (cell-cycle link protein): protein tham gia quá trình biến đổi chu kỳ tế bào ký chủ theo

hƣớng có lợi cho sự tái sinh của virus.

MP (movement protein): protein vân chuyển.

NSP (nuclear shuttle protein) : protein con thoi tham gia vận chuyển DNA genome của virus

vào và ra khỏi nhân tế bào ký chủ.

Ngoài ra là các protein khác ký hiệu từ U1 – U5 với chức năng chƣa đƣợc xác định.

Các virus thuộc họ Nanoviridae tái sinh trong nhân tế bào theo cơ chế vòng lăn (rolling cicle)

tƣơng tự nhƣ các geminivirus. Ở trong nhân tế bào, phân tử DNA sợi đơn của virus chuyển thành

phân tử DNA trung gian dạng sợi kép. Đồng thời các protein của virus cũng đƣợc dịch mã thành

các protein chức năng, trong đó vai trò quan trọng đối với sự tái sinh của virus là M-Rep và

Clink. Clink tƣơng tác với protein ký chủ để khởi động và tăng cƣờng bộ máy tái bản DNA của

tế bào ký chủ. Trên phân tử DNA trung gian sợi kép, M-Rep sẽ cắt tại vị trí (T-A) của chuỗi

TAT/GTAT-AC trên vùng thòng lọng của cấu trúc thân-thòng lọng và quá trình tái sinh sẽ diễn

ra liên tục theo cơ chế vòng lăn nhờ DNA polymerase của tế bào. M-Rep lại tiếp tục cắt các sợi

DNA genome mới hình thành và nối chúng lại để tạo thành phân tử DNA genome hoàn chỉnh.

Hình 13-1 Tổ chức bộ gen của các virus thuộc họ Nanoviridae (Gronenborn, 2004)

13.2.4 Đặc điểm sinh học

Phạm vi ký chủ. Các virus, nhìn chung, có phạm vi ký chủ hep. Các virus thuộc chi Nanovirus

nhiễm chủ yếu cây họ đậu còn các virus thuộc chi Babuvirus nhƣ BBTV nhiễm trên cây họ

Musaceae (chuối).

Lan truyền. Tất cả các virus không truyền qua tiếp xúc cơ học hoặc qua hạt giống. Trong điều

kiện tự nhiên, virus lan truyền nhờ rệp muội (họ Aphididae) theo kiểu bền vững tuần hoàn. Đối

với BBTV, virus có thể lan truyền dễ dàng qua thân ngầm hoặc qua nuôi cấy mô.

137

13.3 BANANA BUNCHY TOP VIRUS (BBTV)

13.3.1 Tầm quan trọng

Bệnh chùn ngọn do BBTV là bệnh virus quan trọng nhất trên chuối. Bệnh đã từng là nguyên

nhân phá hủy nhiều khu vực trồng chuối tại Öc và một số nƣớc Nam Thái Bình dƣơng nhƣ Fiji.

Tại Việt Nam, bệnh khá phổ biến trên nhóm chuối tiêu nhƣng tầm quan trọng ít đƣợc chú ý.

Bệnh còn đƣợc gọi với các tên nhƣ chuối đực, chuối xẹ, chuối hủi.

13.3.2 Virus

BBTV có hình thái phân tử dạng hình khối đa diện, kích thƣớc 18 – 20 nm. BBTV có bộ gen

phân mảnh gồm ít nhất 6 phân tử DNA sợi vòng đơn, kích thƣớc mỗi phân tử ~ 1000 – 1100

nucleotides. Các đặc điểm bộ gen và tái sinh giống nhƣ các nanovirus khác (xem phần giới thiệu

họ Nanoviridae)

13.3.3 Triệu chứng

Triệu chứng bệnh chùn ngọn chuối rất điển hình và có giá trị chẩn đoán. Các triệu chứng bao

gồm:

Cây sinh trƣởng còi cọc, lùn dữ dội (đặc biệt nếu do truyền qua thân ngầm);

Lá cây bệnh có các sọc xanh đậm dài ngắn khác nhau chạy dọc gân lá. Gần gân chính,

các sọc này thƣờng cong lại dạng móc.

Lá bệnh thƣờng nhỏ, hẹp, dựng đứng; mép lá biến vàng, lƣợn sóng, có thể bị chết hoại.

Không ra buồng. Nếu nhiễm muôn thì vẫn có thể có quả nhƣng chất lƣợng quả kém

Hình 13-2 Bụi chuối bị bệnh chùn ngon (tại Gia Lâm) và triệu chứng trên lá

13.3.4 Lan truyền

BBTV lan truyền ngoài tự nhiên theo 2 cách:

Bằng 1 loài rệp muội là rệp chuối (Pentalonia nigronervosa) theo kiểu bền vững tuần hoàn.

Rệp có thời gian chích nạp 4 – 17 giờ, thời gian chích truyền tối thiểu 30 phút – 2 giờ; thời

gian ẩn 13 – 20 ngày. Hiệu quả truyền virus trong quần thể rệp khoảng 50 %.

138

Qua nhân giống vô tính. BBTV dễ dàng truyền qua thân ngầm từ cây mẹ sang cây con. Thậm

chí nhân giống chuối bằng invitro cũng rất dễ dàng lan truyền virus.

13.3.5 Phòng chống

Các biện pháp phòng chống bệnh có thể đƣợc áp dụng bao gồm:

Nhổ bỏ cây bệnh kết hợp dùng vật liệu giống sạch bệnh. Biện pháp này đã áp dụng thành

công tại Öc.

Áp dụng nghiêm ngặt biện pháp kiểm dịch đối với vật liệu giống giữa các vùng trong và

ngoài nƣớc.

Quản lý vector bằng thuốc hóa học hoặc sinh học.

13.4 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 13

1. Đặc điểm chung họ Nanoviridae (hình thái, đặc điểm bộ gen, tái sinh).

2. Bệnh chùn ngọn chuối (triệu chứng, bản chất tác nhân gây bệnh, lan truyền (thời gian chích

nạp, chích truyền, ẩn), phƣơng hƣớng phòng trừ).

13.5 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH

1. CABI (2006). Banana bunchy top virus. Crop Protection Compendium CD ROM

2. Gronenborn, B. (2004)). Nanoviruses: genome organisation and protein function. Veterinary

Microbiology 98 103–109.

3. Timchenko, T., Katul, L., Sano, Y., de-Kouchkovsky, F., Vetten, H. J. & Gronenborn, B.

(2000). The Master Rep Concept in Nanovirus Replication: Identification of Missing

Genome Components and Potential for Natural Genetic Reassortment. Virology 274, 189-

195.

4. Vetten, H. J., Chu, P. W. G., Dale, J. L., Harding, R., Hu, J., Katul, L., Kojima, M., Randles,

J. W., Sano, Y. & Thomas, J. E. (2005). Nanoviridae. In Virus Taxonomy VIIIth report of

the International Committee on Taxonomy of Viruses, pp. 343-352. Edited by C. M. Fauquet,

M. A. Mayo, J. Maniloff, U. Desselberger & L. A. Ball. London: Elsevier/Academic Press.

139

Chƣơng 14. VIRUS RNA SỢI ĐƠN CỰC DƯƠNG: CHI TOBAMOVIRUS (HỌ VIRGAVIRIDAE)

14.1 TÓM TẮT NỘI DUNG

Chƣơng 14 mô tả tóm tắt đặc điểm phân loại, phân tử của họ Virgavirridae cũng nhƣ chi quan

trọng nhất của họ là chi Tobamovirus. Các thành viên của họ là các virus RNA sợi đơn, cực (+).

Chƣơng này cũng mô tả chi tiết đặc điểm của TMV (Tobacco mosaic virus), một virus có ý

nghĩa lịch sử lớn.

14.2 HỌ VIRGAVIRIDAE

Các virus họ Virgaviridae đều là các virus RNA sợi đơn, cực (+) hại thực vật. Hiện tại họ này

đƣợc phân loại thành 6 chi với tổng số 43 loài, trong đó chi Tobamovirus chiếm số lƣợng lớn

nhất với 25 loài.

Bảng 14-1 Phân loại họ Virgaviridae

TT Chi Số phân

đoạn gen Loài điển hình Số loài

1 Furovirus 2 Soil-borne wheat mosaic virus 5

2 Hordeivirus 3 Barley stripe mosaic virus 4

3 Pecluvirus 2 Peanut clump virus 2

4 Pomovirus 3 Potato mop-top virus 4

5 Tobamovirus 1 Tobacco mosaic virus 25

6 Tobravirus 2 Tobacco rattle virus 3

Tổng 43

Các virgavirus đều có dạng hình gậy cứng, không có vỏ bọc, có cấu trúc đối xứng xoắn. Phân

tử virus chỉ có vỏ protein bao quanh lõi RNA genome. Các virgavirus có bộ gen RNA sợi đơn,

cực (+), có mũ Cap đầu 5‘ nhƣng không có đuôi polyA.

Ngoại trừ chi Tobamovirus có bộ gen gồm 1 phân tử RNA thì các chi còn lại đều có bộ gen

phân đoạn gồm 2 – 3 phân tử RNA. Các phân đoạn RNA nếu có đƣợc lắp ráp riêng rẽ.

14.3 CHI TOBAMOVIRUS

Là chi lớn nhất với 25 thành viên. Tobacco mosaic virus (TMV), thành viên điển hình của chi,

là một virus có ý nghĩa rất lớn trong lịch sử virus học và sinh học.

Phân tử virus hình gậy, kích thƣớc 300-310 nm x 18 nm. Các tobamovirus có bộ gen RNA sợi

đơn, cực (+), không phân đoạn, kích thƣớc ~ 6.3-6.5 kb. Trong quá trình tái sinh, các

tobamovirus tạo 2 phân tử phụ geome. Phân tử RNA genome và 2 phân tử phụ genome đều có

đầu 5‘ đƣợc mũ hóa, còn đầu 3‘ có cấu trúc thức cấp dạng tRNA và không có đuôi poly A.

Hình 14-1 Sơ đồ cấu trúc phân tử của các tobamovirus (Viralzone, 2009)

140

14.4 TOBACCO MOSAIC VIRUS (TMV)

14.4.1 Tầm quan trọng

TMV (virus khảm lá thuốc lá) thuộc chi Tobamovirus.

TMV là một virus có ý nghĩa lịch sử lớn trong sinh học và trong ngành virus học.

TMV là một trong các virus thực vật phân bố khắp thế giới, có phổ ký chủ rất rộng, có thể

nhiễm trên 200 loài cây thuộc 30 họ thực vật khác nhau. Các cây ký chủ quan trọng nhất của

TMV thuộc các họ: Solanaceae (họ cà)), Scrophulariaceae, Labiatae, Leguminosae (họ đậu),

Cucurbitaceae (họ bầu bí) và Alliaceae.

Tại Việt Nam, TMV là virus quan trọng nhất trên thuốc lá.

14.4.2 Virus

14.4.2.1 Hình thái phân tử

Phân tử TMV có hình gậy, kích thƣớc ~300 x 18 nm. Phân tử virus gồm 1 phân tử RNA

genome kích thƣớc ~ 6.4 kb đƣợc bao bọc bởi một lớp vỏ gồm ~ 2300 tiểu phần protein (mỗi

tiểu phần là một phân tử protein có kích thƣớc 158 amino acid (17.3 kD).

Giống nhƣ các virus hình gậy khác, phân tử TMV có cấu trúc đối xứng xoắn nhƣ sau:

Ba nucleotide trên phân tử RNA liên kết với 1 tiểu phần protein

Một đơn vị lặp hoàn hảo gồm 49 tiểu phần protein / 3 vòng xoắn và tạo ra độ dài 6.9 nm

(tổng độ dài phân tử ~ 300 nm)

Đƣờng kính phân tử là 18 nm còn đƣờng kính lõi rỗng là 4 nm

Cần chú ý là TMV có thể tự lắp ráp thành phân tử hoàn chỉnh từ 1 hỗn hợp các tiểu phần

protein và bộ gen RNA trong ống nghiệm.

Hình 14-2 Hình thái virion và cấu trúc của TMV

14.4.2.2 Đặc điểm vật lý

TMV có ngƣỡng pha loãng giới hạn là 10-6

- 10-7

, khả năng tồn tại trong chiết dịch cây bệnh

của virus là khoảng 1 tháng, nhiệt độ mất hoạt tính Q10 là 930C. Virus có khả năng tích luỹ trong

141

dịch cây bệnh với nồng độ rất cao (2 g/l). Virus rất mẫn cảm với tia Rơnghen và dễ dàng bị phân

huỷ ở ngƣỡng pH < 1 và pH > 11.

Trong tế bào cây ký chủ, đặc biệt là tế bào lông lá, TMA có thể hình thành nên thể vùi dạng

tinh thể lục giác cấu tạo bởi các phân tử virus xếp thành hàng, thành phiến.

Là virus thực vật bền nhất: virus tinh chiết (bảo quản ở 40OC) vẫn duy trì khả năng nhiễm

bệnh sau 50 năm; virus tồn tại lâu dài trong tàn dƣ và thuốc lá chế biến; virus trong mô giữ đƣợc

hoạt tính gây bệnh sau 30 phút sấy ở nhiệt độ 120OC.

Hình 14-3 Tinh thể virus TMV hình thành trong tế bào thuốc lá

14.4.3 Tổ chức bộ gen và tái sinh

TMV và các tobamovirus khác có bộ gen RNA sợi đơn, cực +, không phân đoạn, kích thƣớc ~

6.4 kb.

Tổ chức bộ gen của TMV và các tobamovirus khác tƣơng tự nhau. Tính từ trái qua phải, bộ

gen của TMV đƣợc tố chức nhƣ sau:

1. Một chuỗi không dịch mã đầu 5‘ (untranslated leader).

2. Bốn ORF là:

ORF1 mã hóa protein MET-Hel (126 kDa) có chức năng tạo mũ (methyltransferase) đầu

5‘ phân tử RNA và tháo xoắn (helicase) trong quá trình tái sinh virus.

ORF2 là 1 ORF lồng của ORF1. ORF 1 cùng với ORF2 đƣợc dịch mã theo cơ chế

―readthrough‖ để tạo 1 protein lớn là RdRp (183 kDa)

ORF3 mã hóa protein vận chuyển MP (30 kDa)

ORF4 mã hóa CP (17.5 kDa)

3. Một chuỗi không dịch mã đầu 3‘ có cấu trúc thứ cấp giống tRNA.

142

Trong quá trình tái sinh, TMV tạo 2 phân tử RNA phụ genome có chung đầu 3‘ với phân tử

RNA genome nhƣng có kích thƣớc ngắn hơn, tƣơng ứng gen MP và CP.

Phân tử RNA genome và 2 phân tử phụ genome đều đƣợc mũ hóa m7G5'ppp5'Gp (Cap) ở đầu

5‘ nhƣng không có đuôi polyA.

Hình 14-4 Tổ chức bộ gen chính và 2 phân tử phụ genome của TMV

Quá trình tái sinh của TMV đã đƣợc nghiên cứu kỹ và trải qua các bƣớc sau:

1. Phân tử virus xâm nhập vào tế bào chất nhờ tổn thƣơng cơ học.

2. Cởi áo một phần protein vỏ ở đầu 5‘ của phân tử virus.

3. Ribosome của tế bào ký chủ tiếp cận đầu 5‘ của RNA genome và tiến hành dịch mã 2

protein tái sinh là Met-Hel và RdRp. Trong quá trình dịch mã thì quá trình cởi áo cũng

đƣợc tiếp tục. Đây là cơ chế ―cởi áo cùng dịch mã‖ (co-traslational disassembly)

4. Hai protein MET-Hel và RdRp sử dụng sợi RNA genome (sợi +) để sao mã sợi RNA (-).

5. Tiếp theo, sợi RNA (-) này lại đƣợc dùng làm khuôn để tổng hợp sợi (+) và các phân tử

RNA phụ genome (có thể xem là các mRNA của protein MP và CP). Trên các phân tử

phụ genome này, các protein MP và CP đƣợc dịch mã.

6. MP kết hợp với sợi RNA (+) để di chuyển sang tế bào khác qua sợi liên bào theo cơ chế

nucleoprotein.

7. Các phân tử RNA sợi (+) và CP khi tích lũy đủ kích hoạt quá trình lắp ráp phân tử virus

mới.

8. Các phân tử virus cũng kết tụ lại để tạo các thể vùi (tinh thể) dạng lục giác trong tế bào

chất.

143

14.4.4 Triệu chứng

Triệu chứng của TMV có thể thay đổi theo chủng virus, cây ký chủ.

Trên cây thuốc lá, cây bệnh nhiễm hệ thống với triệu chứng điển hình là lá bị khảm rõ rệt

giống nhƣ da ếch. Triệu chứng đầu tiên xuất hiện trên lá non gồm các vùng xanh đậm, xanh nhạt,

vàng xen kẽ nhau. Lá phát triển kém, phiến lá nhỏ hẹp, mặt lá gồ ghề. Cây nhỏ chỉ bằng 1/2 - 1/4

lần so với cây khoẻ.

Trên cây ớt, virus TMV nhiễm hệ thống gây hiện tƣợng khảm lá, lùn cây. Đôi khi cây bệnh

xuất hiện các vết chết hoại ở phần cuống lá.

Trên cây cà chua: virus TMV gây hiện tƣợng đốm biến vàng, khảm lá; lá ít biến dạng hơn.

Hình 14-5 Triệu chứng do TMV gây ra trên thuốc lá (trái), ớt (giữa) và cà chua (phải)

14.4.5 Lan truyền

TMV là một trong các virus có khả năng lan truyền rất cao

Virus xâm nhập và lan truyền rất dễ dàng qua tiếp xúc cơ học (cọ xát lá, cắt tỉa, tiếp xúc của

rễ trong đất). Virus có thể lan truyền qua côn trùng miệng nhai (theo kiểu cơ học).

Thời kì tiềm dục của bệnh phụ thuộc vào điều kiện nhiệt độ. Ở nhiệt độ 300C là ~5 ngày, ở

nhiệt độ thấp hơn là 2 tháng, trung bình là 8 - 10 ngày.

TMV là một loại virus truyền qua hạt của nhiều loại cây (ví dụ hạt cà chua, thuốc lá). Tuy

nhiên, virus không tồn tại bên trong hạt giống mà bám ở bề mặt vỏ hạt.

TMV (và các tobamovirus khác) là virus thực vật cực kỳ bền vững (có thể đƣợc xem là ngoại

lệ duy nhất trong số các virus thực vật). TMVcó thể tồn tại rất lâu dài (hàng tháng tới hàng năm)

trên tàn dƣ cây bệnh trong đất. Thậm chí thuốc lá đã qua chế biến vẫn có thể truyền bệnh (virus

giữ đƣợc hoạt tính gây bệnh sau 30 phút sấy ở nhiệt độ 1200C).

14.4.6 Biện pháp phòng trừ

1. Sử dụng giống chống bệnh dựa trên tính kháng gen đối gen (nhƣ gen N trên thuốc lá, gen L

trên ớt), dựa trên tính kháng từ tác nhân gây bệnh PDR (ví dụ cây thuốc lá chuyển gen CP có

thể kháng rất tốt virus).

144

2. Sử dụng giống sạch bệnh: Chọn giống từ những ruộng không bị nhiễm bệnh; thu hoạch riêng

cây bệnh, cây khoẻ.

3. Sử lý hạt giống. Vì TMV có thể tồn tại ở vỏ hạt nên có thể hạn chế virus bằng xử lí hạt giống

với hóa chất. Ví dụ ngâm hạt trong dung dịch Na3PO4 10% trong 2 giờ; hoặc ngâm hạt trong

dung dịch Na3PO4 1% trong 15 phút, sau đó ngâm trong dung dịch NaOCl 0.53% trong 30

phút. Xử lý hạt với dung dịch HCl 20% cũng cho kết quả tốt.

4. Khử trùng dụng cụ thu hái bằng Formalin 4 %, rửa tay và dụng cụ bằng xà phòng, sữa.

5. Nhổ bỏ cây bệnh trên đồng ruộng, dọn sạch tàn dƣ cây bệnh và diệt côn trùng môi giới là sâu

ăn lá (truyền kiểu cơ giới).

14.5 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 14

1. Đặc điểm (hình thái, tổ chức bộ gen) của họ Tobamoviridae.

2. TMV (hình thái, tổ chức bộ gen và tái sinh, triệu chứng, lan truyền vầ phòng trừ).

14.6 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH

1. CABI (2006). Tobacco mosaic virus. Crop Protection Compendium CD ROM

2. Hull, R. (2002). Matthews's Plant Virology. Fourth edition: Academic Press.

3. Lewandowski, D. J. (2005). Tobamovirus. In Virus Taxonomy VIIIth report of the

International Committee on Taxonomy of Viruses, pp. 1009-1014. Edited by C. M. Fauquet,

M. A. Mayo, J. Maniloff, U. Desselberger & L. A. Ball. London: Elsevier/Academic Press.

4. Scholthof, K.-B. G. (2004). TOBACCOMOSAIC VIRUS: AModel System for Plant

Biology. Annual Review of Phytopathology 42, 13–34.

145

Chƣơng 15. VIRUS RNA SỢI ĐƠN CỰC DƯƠNG (TIẾP): CHI POTYVIRUS (HỌ POTYVIRIDAE)

15.1 TÓM TẮT NỘI DUNG

Chƣơng 15 mô tả tóm tắt đặc điểm phân loại, phân tử, sinh học của họ Potyviridae, một trong

hai họ virus thực vật lớn nhất. Chƣơng này cũng mô tả chi tiết đặc điểm phân loại, sinh học phân

tử, đặc biệt là vai trò của các protein, của chi Potyvirus - là chi virus thực vật có ý nghĩa kinh tế

bậc nhất trên thế giới và cũng là chi có số lƣợng virus lớn nhất trong họ. Tất cả các potyvirus

đƣợc phát hiện tới nay ở Việt Nam đều đƣợc đề cập với mức độ chi tiết tùy thuộc thông tin sẵn

có.

15.2 HỌ POTYVIRIDAE

Họ Potyviridae (tên có nguồn gốc từ Potato virus Y) là họ virus thực vật lớn nhất với trên

200 loài (Bảng 15-1). Tất cả thành viên trong học đều có bộ gen RNA sợi đơn, cực dƣơng, có

phân tử hình sợi mềm đƣờng kính 11-15 nm và dài 650 – 950 nm đối với nhóm có bộ gen đơn và

200-300 + 500-600 nm đối với các virus có bộ gen kép.

Hiện nay, các potyvirus đƣợc phân loại thành 6 chi trên cơ sở (i) tổ chức bộ gen, (ii) vector

lan truyền và (iii), so sánh trình tự. Đặc điểm bộ gen, mối quan hệ vector và số loài của các chi

đƣợc trình bày ở Bảng 15-1. Trong số 6 chi, chi Potyvirus là quan trọng nhất, cả về số lƣợng loài

cũng nhƣ các bệnh có ý nghĩa kinh tế mà chúng gây ra.

Các virus của 5 chi Potyvirus, Macluravirus, Ipomovirus, Rymovirus và Tritimovirus có bộ

gen không phân đoạn tức bộ gen chỉ gồm 1 phân tử RNA duy nhất nên gọi là virus có bộ gen

đơn. Các virus của chi còn lại, chi Bymovirus, có bộ gen kép gồm 2 phân tử RNA-1 và RNA-2.

Đối với các bymovirus, phân tử RNA-1 tƣơng đƣơng với 2/3 kích thƣớc tính từ đầu 3‘ còn phân

tử RNA-2 tƣơng đƣơng phần còn lại của bộ gen của các virus có bộ gen đơn.

Bảng 15-1. Phân loại họ Potyviridae (Berger et al. 2005)

Chi Loài chuẩn Bộ gen Vector Số loài

1. Potyvirus Potato virus Y (PVY) Bộ gen đơn Rệp (không bền vững) 197

2. Ipomovirus Sweet potato mild mottle virus

(SPMMV)

Bộ gen đơn Bọ phấn (không bền vững) 4

3. Macluravirus Maclura mosaic virus (MacMV) Bộ gen đơn Rệp (không bền vững) 4

4. Rymovirus Ryegrass mosaic virus (RGMV) Bộ gen đơn Nhện (bền vững tuần hoàn) 3

5. Tritimovirus Wheat streak mosaic virus

(WSMV)

Bộ gen đơn Nhện (bền vững tuần hoàn) 4

6. Bymovirus Barley yellow mosaic virus (BaYMV)

Bộ gen kép Nấm 6

Tổng 218

146

15.3 CHI POTYVIRUS

15.3.1 Giới thiệu

Chi Potyvirus là chi lớn nhất trong họ Potyviridae với khoảng 200 loài. Nhƣ vậy, cùng với

chi Begomovirus (họ Geminivirisdae), Potyirus là chi virus thực vật lớn nhất, chiếm khoảng 20%

tổng số virus thực vật.

Nhiều potyvirus là các tác nhân gây bệnh cây có ý nghĩa kinh tế. Ví dụ:

Papaya ringspot virus (PRSV) gây bệnh virus quan trọng nhất trên đu đủ và bầu bí.

Turnip mosaic virus (TuMV) hại cây rau họ thập tự và đƣợc xem là virus quan trọng thứ 2 trên cây rau khắp thế giới.

Bean common mosaic virus (BCMV) trên cây họ đậu.

Potato virus Y (PVY) trên cây khoai tây và các cây họ cà khác.

Plum pox virus (PPV) là virus qua trọng nhất trên cây quả hạch nhƣ đào, táo, lê, mận.

Trong tế bào cây, potyvirus thƣờng tạo các loại thể vùi đặc trƣng. Tất cả các potyvirus đều

hình thành thể vùi hình trụ trong tế bào chất. Thể vùi tế bào chất hình thành từ protein CI

(cytoplasmic inclusions (CI)). Các thể vùi CI này có hình dạng đặc trƣng (hình vòng bánh xe,

hình phiến…) cho potyvirus và do đó có giá trị chẩn đoán. Một số virus lại hình thành thể vùi

trong nhân gọi là thể vùi nhân (nuclear inclusion, NI). Thể vùi nhân đƣợc cấu tạo bởi 2 protein là

NIb và NIa. Một số virus cũng hình thành thể vùi trong nhân nhƣng hình dạng thể vùi không xác

định gọi là thể vùi vô định hình (amorphor inclusions, AI) đƣợc cấu tạo bởi protein HcPro.

Phần lớn virus trong họ có phổ ký chủ hẹp hoặc rất hẹp nhƣng một số ít lại có phổ ký chủ rất

rộng, nhiễm cả trên cây 1 và 2 lá mầm

Hình 15-1 Hình thái virion và thể vùi của potyvirus. Ảnh trái: phân tử PVY, bar = 100 nm (Shukla

et al., 1998). Hình phải: thể vùi tế bào chất của PVY trong tế bào thuốc lá (Arbatova et al. 1998).

15.3.2 Đặc điểm virion

Các potyvirus có phân tử hình sợi mềm đƣờng kính 11-15 nm và dài 650 – 950 nm. Mỗi

phân tử virion đƣợc cấu tạo từ 1700-2000 tiểu phần protein xắp xếp theo kiểu xoắn đối xứng

xung quanh phân tử RNA genome. Ngoài ra, phân tử virus còn có 1 protein gắn ở đầu 5‘ là VPg

(genome-linked protein, VPg). Thành phần phân tử bao gồm 95 % protein và 5% RNA.

A B

147

15.3.3 Tổ chức bộ gen

Tất cả các potyvirus có bộ gen là một phân tử RNA sợi đơn, cực dƣơng, kích thƣớc ~ 10 kb.

Tổ chức bộ gen của các potyvirus giống nhau, tính từ trái sang phải là:

Một vùng 5‘ không dịch mã (5‘UTR)

Một ORF đơn, lớn gọi là ORF chính (major ORF).

Một đầu 3‘ không dịch mã (3‘UTR), kết thúc bằng 1 đuôi poly-A.

Hình 15-2 Tổ chức bộ gen của các potyvirus (Shukla et al., 1998).

ORF chính mã hóa 1 polyprotein, sau khi dịch mã sẽ đƣợc xử lý thành khoảng 10 protein

chức năng

1. Protein P1

2. Protein bổ trợ (Helper component protein, HC-Pro)

3. Protein P3,

4. Protein 6K1,

5. Protein thể vùi tế bào chất (CI)

6. Protein 6K2

7. Protein VPg (genome-linked protein)

8. Protein NIa-Pro (major protease of small nuclear inclusion protein -NIa)

9. Protein NIb (large nuclear inclusion protein)

10. Protei vỏ (coat protein, CP)

Đối với các virus thuộc chi Bymovirus thì RNA-1 mã hóa các protein tƣơng tự P3, 6K1, CI,

6K2, NIa, NIb và CP, còn RNA-2 mã hóa 2 protein P1 và P2, trong đó P1 tƣơng tự HC-Pr còn

P2 tƣơng tự protein ―read through― của các furovirus và cần thiết để virus có thể truyền đƣợc qua

nấm.

15.3.4 Chức năng các protein

Chức năng của các protein của potyvirus đã đƣợc nghiên cứu khá kỹ. Hầu hết các protein của

potyvirus đều là các protein đa chức năng.

a. P1

1. P1 là 1 proteinase. P1 là vùng biến động nhất của bộ gen. P1 có hoạt tính protenase và sẽ tự

cắt liên kết P1/HC-Pro sau dịch mã để giải phóng P1.

148

2. P1 tương tác với RNA. P1 có khả năng liên kết với RNA của virus, do vậy nó có vai trò trong

quá trình vận chuyển virus

3. P1 tham gia ức chế phản ứng phòng thủ của tế bào ký chủ (thông qua cơ chế câm gen).

b. HC-Pro

1. HC-Pro cần thiết cho sự lan truyền qua vector. Vai trò này của protein Hc-Pro đƣợc thể hiện

qua cơ chế bắc cầu. HcPro đóng vai trò là 1 phân tử cầu nối, trong đó phần đầu N của nó

(thông qua motif bảo thủ cao KITC) sẽ liên kết với receptor ở bề mặt phía trong của vòi

aphid còn phần trung tâm của nó (thông qua motif PTK) sẽ liên kết với protein vỏ CP của

virion. Nhờ cầu nối này mà phân tử virus đƣợc giữ lại ở phần vòi chích của vector.

2. HC-Pro cần cho virus di chuyển hệ thống và di chuyển giữa các tế bào. HC-Pro là một

protein vận chuyển (MP) của potyvirus. HC-Pro làm tăng giới han ngăn chặn kích thƣớc SEL

(size exclusion limit) của sợi liên bào và do đó cho phép RNA của virus có thể di chuyển gữa

các tế bào.

3. HC-Pro có hoạt tính proteinase. Đầu C của HC-Pro có hoạt tính proteinase, cho phép nó tự

cắt khỏi liên kết giữa HC-Pro và P3.

4. HC-Pro cần cho qua tái bản (thông qua motif IGN).

5. HC-Pro có thể ức chế bộ máy câm gen của tế bào. Đây là một chức năng quan trọng của

potyvirus chống lại phản ứng phòng thủ của cây.

c. P3

P3 cũng là vùng biến động và ít đƣợc nghiên cứu chức năng. P3 đƣợc biết là qui định tính gây

bệnh của virus thông qua tƣơng tác với các protein khác của virus.

d. CI

1. CI là thành phần chính của phức hợp tái sinh virus. CI có hoạt tính helicase, hoạt tính liên

kết RNA, hoạt tính thủy phân ATP. Tất cả các hoạt tính này đều cần thiết cho CI tháo xoắn

cấu trúc trung gian sợi kép của RNA virus trong quá trình tái sinh.

2. CI cần cho sự di chuyển của virus gữa các tế bào . Quá trình di chuyển giữa các tế bào yêu

cầu năng lƣợng. Do CI có hoạt tính ATPase nên nó đảm nhiệm vai trò cung cấp năng lƣợng

cho quá trình vận chuyển virus qua các tế bào. Ngoài ra, CI tƣơng tác trực tiếp với

plasmodesmata và phức hợp ribonucleoprotein của virus để tạo điều kiện thuận lợi cho quá

trình di chuyển.

e. 6K1 và 6K2

6K1 tƣơng tác với P3 để qui định tính gây bệnh của virus. 6K2 là một protein mỏ neo giúp

liên kết phức hợp tái sinh virus vào mạng lƣới nội chất – nơi thực hiện quá trình tái sinh.

f. VPg

1. VPg chính là phần đầu N của NIa. VPg cũng là 1 protein cấu trúc vì ngoài protein CP, nó có

mặt trong phân tử virus. VPg lien kết vào đầu 5‘ của RNA của virus và bảo vệ phân tử RNA

khỏi bị phân hủy

2. VPg cần cho quá trình tái sinh bộ gen virus, di chuyển hệ thống của virus trong cây.

3. VPg tương tác với yếu tố khởi đầu dịch mã của tế bào nhƣ eIF4E và eIF(iso)4E, do đó cho

phép ribosome có thể tiếp cận RNA virus ngay sau khi tháo vỏ để thực hiện quá trình dịch

149

mã. Cần chú ý là potyvirus có bộ gen RNA sợi đơn cực (+), phân tử RNA genome của virus

không đƣợc mũ hóa nên quá trình dịch mã ORF trên bộ gen virus là một quá trình dịch mã

độc lập mũ Cap.

4. VPg là một protein Avr của potyvirus. Nhiều gen kháng của thực vật đối với potyvirus đã

đƣợc chứng minh là các gen lặn ví dụ nhƣ pvr1 (ớt), mo1 (rau diếp), sbm1 (đâu) và rym4/5

(lúa miến). Các gen này thực chất mã hóa yếu tố khởi đầu dịch mã eIF4E. Khi các gen này (ở

trạng thái đồng hợp tử) mang các đột biến phá vỡ tƣơng tác VPg – eIF4E sẽ dẫn tới kiểu hình

kháng.

g. NIa-Pro

NIa-Pro là phần đầu C của protein NIa. Nó là một protease chính của virus. Đầu C của NIa-

Pro có hoạt tính protease cho phép nó cắt các liên kết P3/6K1, 6K1/CI, CI/6K2, 6K2/VPg,

VPg/NIa-Pro, NIa-Pro/NIb và NIb/CP để giải phóng ra các protein chức năng đơn lẻ.

h. NIb

NIb là một RNA dependent RNA polymerase (RdRp). Đây là một chức năng quan trọng cho

phép bộ gen virus đƣợc tái bản từ sợi (+) sang sợi (-) và ngƣợc lại.

i. CP

1. CP của potyvirus đã đƣợc nghiên cứu rất kỹ. CP có thể đƣợc chia làm 3 phần (đầu N, trung

tâm và đầu C). Đầu N là phần nhô lên bề mặt phân tử virus, khá biến động về trình tự và

chứa các epitope đặc hiệu cho virus ở mức loài và mức chủng. Phần trung tâm và đầu C bảo

thủ hơn và mức biến động của 2 phần này tƣơng đƣơng mức biến động chung trên toàn bộ bộ

gen. Chính vì vậy, CP, đặc biệt phần đầu C và trung tâm thƣờng hay đƣợc sử dụng trong

đánh giá đa dạng virus.

2. CP có vai trò quan trọng trong lan truyền qua vector. Đầu N của CP chứa một motif bảo thủ

cao (DAG). Thông qua motif này, phân tử virus sẽ liên kết với Hc-Pro theo lý thuyết bắc cầu

để lan truyền qua vector rệp muội.

3. CP có vai trò quan trọng trong di chuyển hệ thống và di chuyển giữa các tế bào. CP (cùng

với Hc-Pro) là 2 protein vận chuyển (MP) của potyvirus. Cả 2 protein này đều làm tăng giới

hạn ngăn chặn kích thƣớc SEL của sợi liên bào và do đó cho phép virus di chuyển giữa các tế

bào.

4. CP là một protei cấu trúc tạo virion.

5. CP điều khiển qua trình tái sinh RNA virus

15.3.5 Tái sinh của potyvirus

Quá trình tái sinh của potyvirus (và các virus thực vật có bộ gen RNA) diễn ra trong tế bào

chất. Ngay sau khi xâm nhập vào tế bào chất của tế bào ký chủ (nhờ vector hoặc tiếp xúc cơ

học), quá trình tái sinh của potyvirus diễn ra theo các bƣớc sau:

1. Trong tế bào chất, phân tử virus tháo vỏ, giải phóng bộ gen virus (RNA sợi +).

2. Bộ máy dịch mã của tế bào sẽ dịch mã tạo polyprotein ngay trên khuôn RNA genome của

virus (RNA sợi +). Tiếp theo, polyprotein này đƣợc xử lý hậu dịch mã nhờ chính các vùng có

hoạt tính protease của polyprotein để tạo thành các protein chức năng

3. Các protein của virus và của tế bào ký chủ thực hiện quá trình tái bản. Quá trình tái bản yêu

cầu 2 protein chủ chốt của virus là RdRp (NIb) và helicase (CI). Các protein tham gia tái bản

150

cùng với RNA sợi (+) lắp ráp thành ―phức hợp tái sinh virus‖ ký hiệu là VRC (viral

replication complex) gắn trên màng lƣới nội chất. Trong quá trình này còn có sự tham gia

của một số protein khác nhƣ protein mỏ neo 6K2 của virus. Tại VRC, sợi RNA (-) sẽ đƣợc

tổng hợp trên sợi RNA (+).

4. Sợi (-) mới đƣợc tổng hợp ra lại dùng làm khuôn để tổng hợp nhiều sợi (+) mới.

5. Lắp ráp thành virion mới từ protein CP và sợi (+) đƣợc tổng hợp mới.

15.4 PAPAYA RING SPOT VIRUS (PRSV)

15.4.1 Tầm quan trọng

PRSV (virus đốm hình nhẫn đu đủ), thuộc chi Potyvirus, là virus nguy hiểm nhất, gây bệnh

đốm hình nhẫn trên đu đủ khắp thế giới. Tại Việt Nam, chỉ sau trồng khoảng 3-4 tháng, tỷ lệ

bệnh trên đu đủ đã rất cao. Không hiếm gặp các vƣờn đu đủ bị nhiễm 100% sau vài tháng trồng.

PRSV cũng là virus phổ biến trên bầu bí khắp thế giới. Tại Việt Nam, các nghiên cứu dựa vào

RT-PCR và ELISA cho thấy PRSV cũng là virus phổ biến nhất, gây bệnh khảm lá, trên cây bầu

bí. Các cây bị nhiễm bao gồm: bí ngô, dƣa chuột, bầu, bí xanh, các loại dƣa…

15.4.2 Virus

PRSV có hình thái và tổ chức bộ gen điển hình của 1 potyvirus. Phân tử virus hình sợi mềm,

dài 760-800 nm, đƣờng kính 12 nm.

Virus có 2 type: type P nhiễm trên đu đủ và type W nhiễm trên cây họ bầu bí. Hiện vẫn chƣa

có số liệu chứng minh liệu ở Việt Nam 2 type này có nhiễm chéo sang nhau không. Nghiên cứu

đa dạng dựa trên trình tự gen mã hóa vỏ protein của virus từ các mẫu thu thập khắp cả nƣớc năm

2003 cho thấy (i) không có sự khác biệt về trình tự giữa 2 type P và W ở Việt Nam (ii) có sự

khác biệt theo vùng địa lý, có nghĩa quần thể PRSV ở miền Bắc tách biệt với quần thể PRSV ở

miền Nam và (iii) đã có đột biến từ type W thành type P.

15.4.3 Triệu chứng

15.4.3.1 Trên đu đủ

1. Trên quả, virus gây đốm hình nhẫn và biến dạng quả. Các đốm lúc đầu trong ƣớt sau bị chết

hoại màu trắng bạc – trắng xám. Quả bị biến dạng, chất lƣợng giảm.

2. Trên cuống lá và thân có các sọc trong ƣớt, về sau cũng trở lên chết hoại

3. Trên lá, các triệu chứng là khảm lá, đốm biến vàng, biến dạng (lá co quắp, mất thùy, chỉ còn

trơ gân). Trên lá cũng có thể có các nốt phồng xanh đậm. Triệu chứng thƣờng dữ dội trên lá

non.

4. Cây bệnh thƣờng thấp và còi cọc.

5. Mùa đông, triệu chứng biểu hiện nặng hơn mùa hè.

15.4.3.2 Trên bầu bí

Trên cây bầu bí, triệu chứng khó đánh giá chính xác vì cây có thể bị nhiễm các virus khác.

Nhìn chung, trên cây bầu bí, PRSV (và các potyvirus) tạo triệu chứng khảm và biến dạng trên lá,

cây còi cọc, quả bị biến dạng

151

Hình 15-3 Triệu chứng bệnh trên đu đủ (CABI, 2006) và bầu bí (cây bí xanh tại Việt Nam)

15.4.4 Lan truyền

PRSV không truyền qua hạt giống đu đủ cũng nhƣ bầu bí. Virus truyền đƣợc bằng tiếp xúc cơ

học nhƣng đây không phải là con đƣờng lan truyền ngoài tự nhiên của virus.

Ngoài tự nhiên, virus lan truyền qua rệp muội theo kiểu không bền vững. Trên 20 loài rệp

muội có khả năng truyền virus.

15.4.5 Chẩn đoán

Trên đu đủ, PRSV có thể đƣợc chẩn đoán khá chính xác dựa theo triệu chứng. Tuy nhiên, trên

bầu bí, không thể chẩn đoán đƣợc bệnh vì nhiều virus bầu bí, đặc biệt là các potyvirus nhƣ

ZYMV, cũng tạo triệu chứng tƣơng tự.

Ngoài ra, PRSV cũng có thể đƣợc chẩn đoán bằng ELISA (virus có hoạt tính miễn dịch tốt)

và RT-PCR.

15.4.6 Phòng chống bệnh trên đu đủ

1. Trồng cây ở khu vực biệt lập và nhổ bỏ cây bệnh. Biện pháp đã áp dụng thành công ở một số

vùng thuộc Brazil. Chƣơng trình phòng chống kéo dài hơn 10 năm ở bang Espirito Santo

(Brazil) đã làm giảm áp lực bệnh trên đồng ruộng. Do hiệu quả của biện pháp, chính quyền

bang đã thông qua luật bắt buộc các chủ vƣờn phải nhổ bổ cây bệnh.

2. Trồng cây trong nhà lưới. Để ngăn chặn triệt để vector rệp, kỹ thuật này đã đƣợc áp dụng

thành công ở Đài Loan. Tuy nhiên hiệu quả kinh tế không cho phép áp dụng rộng rãi kỹ thuật

này.

3. Dùng chế phẩm EM. Sử dụng chế phẩm EM (Effective microorganisms), một hỗn hợp các vi

sinh vật có ích gồm vi khuẩn lên men lactic, nấm men, actinomycetes và các vi khuẩn quang

dƣỡng, đã làm giảm tỷ lệ bệnh ở Đài Loan. Cơ chế phòng chống có lẽ liên quan đến tính

kháng tạo đƣợc (Tsai, 1998).

152

4. Dùng giống kháng bệnh/chịu bệnh. Cây đu đủ trồng (Carica papaya) không có gen kháng

virus. Một số loài đu đủ dại có gen kháng nhƣng rất khó để chuyển đƣợc các gen kháng này

vào đu đủ trồng thông qua lai tạo. Trong những năm 80, các nhà khoa học đã tạo ra một số

giống chịu bệnh nhƣ giống Cariflora ở Mỹ, giống lai Tainung 5 ở Đài Loan. Các giống này

có chất lƣợng tốt và chịu đƣợc bệnh.

5. Bảo vệ chéo bằng chủng yếu. Để tạo khả năng bảo vện chéo, một chủng virus yếu (tạo triệu

chứng nhẹ) sẽ đƣợc lây nhiễm trƣớc trên cây để bảo vệ cây chống các chủng mạnh tại địa

phƣơng. Trong những năm 80, 90, các nhà khoa học Mỹ và Đài Loan đã tạo ra một chủng

yếu là HA 5-1 bằng cách gây đột biến 1 chủng mạnh của Hawai. Biện pháp đã đƣợc áp dụng

tại Đài Loan trong gần 10 năm tuy nhiên hiện nay ít đƣợc sử dụng do có quá nhiều trở ngại

(chi phí lớn, khả năng xuất hiện lại chủng mạnh, chủng yếu không thể bảo vệ cây trong điều

kiện lạnh, chủng yếu chỉ bảo vệ cây chống chủng mạnh có cùng nguồn gốc). Tại Hawai, mặc

dù chủng HA 5-1 bảo vệ cây rất tốt chống các chủng mạnh địa phƣơng (vì cùng nguồn gốc)

nhƣng biện pháp vẫn không thể áp dụng do nông dân không muốn nhiễm virus trên cây khỏe.

6. Sử dụng cây chuyển gen thông qua tính kháng PDR. Trong những năm 80, 90, các nhà khoa

học Mỹ (đại học Cornell) đã tạo thành công cây đu đủ chuyển gen mang gen CP của PRSV.

Hai giống đu đủ chuyển gen (Rainbow và Sun Up) có khả năng kháng rất tốt PRSV và đã

đƣợc thƣơng mại rộng rãi tại Mỹ. Kỹ thuật này đã và đang đƣợc áp dụng tại nhiều nƣớc nhƣ

Đài Loan, Thái Lan, Brasil, Mexico…. Hiện nay, dùng đu đủ chuyển gen mang gen virus là

biện pháp hiệu quả nhất để chống PRSV.

15.5 POTATO VIRUS Y (PVY)

15.5.1 Tầm quan trọng

PVY là một virus thuộc chi Potyvirus, đƣợc ghi nhận đầu tiên trên khoai tây từ 1931 và là một

trong các virus thực vật đƣợc nghiên cứu nhiều và đầy đủ nhất. PVY có phổ ký chủ rộng, đặc

biệt nguy hiểm trên cây họ cà. PVY đƣợc xem là virus quan trọng nhất trên khoai tây và trong

nhiều trƣờng hợp trên thuốc lá, ớt và cà chua.

15.5.2 Virus

PVY là loài chuẩn của chi Potyvirus, và giống nhƣ các potyvirus khác, có phân tử hình sợi

mềm, kích thƣớc 730-740 x 11-12 nm với ~ 6 % nucleic acid.

PVY là một trong các virus rất đa dạng về di truyền và tính gây bệnh. Về mặt lịch sử, dựa trên

phản ứng đối với cây ký chủ và chỉ thị (Nicotiana tabacum cv Samsun, Solanum tuberosum và

Physalis floridana), PVY đƣợc chia thành 3 chủng chính là PVYO, PVY

N và PVY

C .

1. Chủng PVYO xuất hiện khắp thế giới, tạo phản ứng siêu nhạy trên cây khoai tây mang gen

kháng Ny.

2. Chủng PVYC phân bố ở Öc, Ấn Độ và châu Âu, tạo phản ứng siêu nhạy trên cây khoai tây

mang gen kháng Nc.

3. Chủng PVYN

phân bố ở châu Âu, châu Phi và Nam Mỹ, gây chết hoại gân trên thuốc lá.

Gần đây, một số chủng mới gần gũi với chủng PVYN cũng đƣợc mô tả. Chẳng hạn, chủng

PVYN-Wilga có nguồn gốc từ chủng PVY

N phân lập từ khoai tây Ba Lan nhƣng tạo triệu

chứng nhẹ hơn; chủng PVYNTN

tạo vết đốm vòng chết hoại trên củ khoai tây.

153

Nhìn chung việc phân chia chủng PVY khá phức tạp vì các chủng thƣờng hay tái tổ hợp với

nhau. Mới đây (1998), dựa trên phân tích phân tử, các isolate PVY trên thế giới đƣợc chia thành

3 cụm phả hệ là:

1. PVYN bao gồm các mẫu virus khoai tây thuộc chủng PVY

N và PVY

NTN,

2. PVYO bao gồm các mẫu virus khoai tây tƣơng ứng với chủng PVY

O

3. PVYNP

bao gồm các mẫu virus không phải phân lập từ khoai tây (NP là viết tắt của non-

potato). Phần lớn các mẫu thuộc chủng PVYC.

15.5.3 PVY tại Việt Nam

Môt nghiên cứu dựa vào trình tự gen CP của 3 mẫu PVY Việt Nam (thu trên khoai tây và ớt )

năm 2008 cho thấy cả 3 mẫu này phân nhóm vào 3 cụm khác nhau ở trên, trong đó mẫu virus

phân lập từ cây ớt tại Đà Lạt phân nhóm vào cụm PVYNP

. Kết quả này chứng tỏ virus PVY tại

Việt Nam khá đa dạng và có thể đã xâm nhập vào Việt Nam bằng nhiều đƣờng khác nhau.

Hình 15-4 Ba nhóm phả hệ PVY trên thế giới và Việt Nam (in đậm)

AJ390290-[NUCLEOTIDEN/v951156-2]-UK-potato

PVY-[VN/P2]-Vietnam-potato

X68223-[Europe-H]-Hungary-potato

AF321554-[NUCLEOTIDEN]-Slovenia-potato

AJ133454-[NUCLEOTIDEN]-The Netherland-petunia

AJ535662-[NUCLEOTIDEN-Ca/H]-Hungary-pepper

M95491-Hungary

AY166866-[NUCLEOTIDEN-Tu660]-Canada potato

D12570-[T]-Japan-potato

AF255660-[NBR]-Brazil-potato

M22470-[N]-New Zealand-potato

X97895-[N-605]-Switzerland

S74813-[T13]

AJ390296-[NUCLEOTIDEN-NN-UK-N]-UK-potato

AJ390308--NUCLEOTIDEN-S-RBS96]-UK-potato

AF525081-Solanum palinacanucleotidehum

X12456-[N]-France-potato-ref.

U09509-[O]-Canada-potato

X68222-[O-US]-USA-potato

Z70238-[N-Wilga]-Poland-potao

Z70239-[O-LW]-Poland-potato

AF118153-[O]-India-eggplanucleotide

DQ157179-[N:O-OR1]-USA-potato

PVY-[VN/P1]-Vietnam-potato

AJ223593-[O-768]-Switzerland

AJ390305-[O-Des]-UK-potato

AF012028-[C-30]-Germany

AF463399-[MrNs]-USA-tobacco

X68224-[NsNr]-USA-tobacco

PVY-[VN/C10]-Vietnam-chilli

AJ303096-[PN-82]-Spain-pepper

AJ439544-[Son41]-France-Solanum nigrum

AJ005639-[P21-82]-Spain-pepper

AJ390307-[C-O-Tom]-Portugal-tomato

AF012027-[C-28]-Germany

AF012029-[C-45]-Germany

AJ303093-[Si15]-Italy-pepper

AJ303094-[K16.94]-Tunisia-pepper

AF237963-[nnp]-Italy-pepper

AJ303095-[Tu12.3]-Turkey-pepper

AJ439545-[LYE84.2]-Spain-tomato

100

99

67

88

100

64

82

99

98

92

100

98

76

69

61

100

97

93

92

80

80

77

74

100

PVYN

PVYO

PVYNP

(Non-potato)

154

15.5.4 Triệu chứng

Trên khoai tây, PVY thƣờng gây bệnh khảm hoặc khảm nhăn. Triệu chứng rất biến động phụ

thuộc chủng virus, giống cây, điều kiện thời tiết và cách nhiễm bệnh (bằng rệp hay từ củ). Các

triệu chứng thƣờng bắt gặp trên khoai tây bao gồm khảm, khảm nhăn, lùn, lá giòn, đốm chết hoại

gân (thƣờng ở lá phía dƣới), đốm vòng chết hoại trên củ.

Trên thuốc lá, ớt, cà chua, PVY thƣờng gây các triệu chứng đốm biến vàng, khảm, hoặc đốm

chết hoại trên gân. Nhìn chung lá cây bệnh ít bị biến dạng hơn so với khoai tây.

Hình 15-5 Các triệu chứng khảm, khảm nhăn, lùn, chết hoại lá và đốm vòng chết hoại trên khoai

tây do PVY (Kerlan, 2006; Hà Viết Cƣờng, 2005)

15.5.5 Lan truyền

PVY truyền dễ dàng qua củ khoai tây nhƣng không truyền qua hạt thật (hạt khoai tây, cà

chua, thuốc lá). Củ bệnh là một trong các nguồn bệnh quan trọng nhất trên khoai tây.

Khoảng 50 loài rệp muội có thể truyền PVY theo kiểu không bền vững. Trong số các loài rệp

này, rệp đào M. persicae là vector hiệu quả nhất.

Ngoài ra, nhiều cây ký chủ dại họ cà (thuộc các chi Datura, Solanum, Physalis) là nguồn bệnh

quan trọng đối với PVY.

155

15.5.6 Phòng chống

15.5.6.1 Đối với khoai tây

1. Tạo giống sạch bệnh: trồng khoai tây từ hạt, nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng, trồng ruộng giống tại

các khu vực biệt lập, điều tra và vệ sinh đồng ruộng (nhổ bỏ cây bệnh, ký chủ dại).

2. Phòng trừ vector. Mặc dù kém hiệu quả nhƣng có thể làm giảm mật độ vector.

3. Tạo giống kháng với gen kháng có ngồn gốc từ cây. Ba loại tính kháng trên khoai tây đã

đƣợc áp dụng là (i) kháng ngang, (ii) tạo phản ứng siêu nhạy và (iii) cực kháng. Tính kháng

ngang là tính kháng đa gen. Tính kháng tạo phản ứng siêu nhạy do một gen kháng chủ, trội là

Ny qui định. Dạng cực kháng cũng do một gen kháng chủ, trội là Ry qui định. Các gen qui

định khả năng cực kháng đều lấy từ khoai tây dại nhƣ Rysto từ S. stoloniferum và Ryadg từ S.

andigena.

4. Tạo giống kháng kiểu DPR. Tạo các giống mang gen của PVY (nhƣ CP, P1, NIb) cũng đã

đƣợc nghiên cứu. Cây chuyển gen CP thƣờng tạo ra kiểu hình dạng cực kháng. Ngoài ra, tạo

giống kháng thông qua cơ chế RNAi cũng đã và đang đƣợc nghiên cứu từ khoảng 10 năm trở

lại đây. Một số giống khoai tây chuyển gen kháng PVY đã đƣợc thƣơng mại hóa nhƣ giống

Russett Burbank và Shepody tại Mỹ.

15.5.6.2 Đối với thuốc lá

Trên thuốc lá, tạo giống kháng dùng cả gen kháng từ cây và từ virus là biện pháp chính để

chống lại PVY. Tuy nhiên giống mang gen kháng từ cây (ví dụ gen va) thƣờng bị giảm năng suất

và chất lƣợng thuốc. Vì vậy, tính kháng thông qua PDR thƣờng đƣợc chú ý hơn.

15.5.6.3 Đối với cà chua và ớt

1. Tạo giống kháng dựa vào gen kháng của cây. Nhiều gen kháng chủ (cả trội và lặn) chống

PVY đã đƣợc phát hiện trên cà chua và ớt. Ví dụ gen lặn pot-1 từ cây L. hirsutum, các gen

lặn pvr1, pvr2, pvr4 và pvr5 từ Capsicum annuum; các gen kháng trội Pvr4 từ C. annuum và

Pvr7 từ C. chinense. Các gen kháng lặn đặc biệt pvr2 đã đƣợc đƣa vào nhiều giống ớt ở châu

Âu và Mỹ. Gen kháng trội Pvr4 kháng đƣợc tất cả các chủng PVY cũng đƣợc đƣa vào giống

các giống ớt lai ở châu Âu.

2. Ngoài ra, các kỹ thuật canh tác nhƣ dùng bẫy dính màu vàng hoặc nhà lƣới đã đƣợc áp dụng

thành công trong một số trƣờng hợp đặc biệt (nơi áp lực bệnh không cao, mô hình canh tác

kiểu công nghiệp) nhƣ ở Israel để chống phát tán bệnh trên ruộng.

15.6 BEAN COMMON MOSAIC VIRUS (BCMV)

15.6.1 Tầm quan trọng

BCMV, thuộc chi Potyvirus, là một trong số các virus có ý nghĩa kinh tế nhất trên cây họ đậu.

Ngoài tự nhiên, BCMV chủ yếu nhiễm trên các cây đậu đỗ thuộc chi Phaseolus, đặc biệt là P.

vulgaris. Trên cây P. vulgaris, BCMV có thể làm giảm năng suất tới 60 %. Ngoài tự nhiên,

BCMV có thể lan truyền bằng nhiều loài rệp muôi (aphididae), và đặc biệt, có thể lan truyền qua

hạt giống. Do có khả năng truyền qua hạt nên tác động của BCMV đối với cây họ đậu có thể rất

lớn trên qui mô toàn cầu.

156

15.6.2 Virus

BCMV là một virus rất đa dạng về di truyền và phức tạp về phân loại. BCMV là một phức

hợp các virus gây bệnh trên cây đậu đỗ và có một hiện trạng phân loại rất dễ gây nhầm lẫn. Về

mặt lịch sử, các chủng BCMV nhiễm trên đậu đỗ đã đƣợc chia thành 2 nhóm phân biệt về mặt

huyết thanh học (serotype) là nhóm serotype A và nhóm serotype B. Trong những năm 90, nhiều

nghiên cứu, chủ yếu dựa trên đặc điểm phân tử đã phân loại lại BCMV. Hiện nay, BCMV chỉ

bao gồm các chủng thuộc nhóm serotype B và nhiều virus đậu đỗ (vốn trƣớc kia đƣợc xem là

các loài riêng biệt nhƣ Blackeye cowpea mosaic virus (BlCMV), Peanut stripe virus (PStV) và

Azuki bean mosaic virus (AzMV).

Các nghiên cứu phả hệ học cũng cho thấy BCMV và nhiều potyvirus nhiễm trên cây đậu đỗ

nhƣ soybean mosaic virus (SMV), bean yellow mosaic virus (BYMV) và cowpea aphid borne

mosaic virus (CABMV) cũng nhƣ nhiều potyvirus không nhiễm trên đậu đỗ nhƣ dasheen mosaic

virus (DsMV), passion fruit woodiness virus (PWV), South African passiflora virus (SAPV),

watermelon mosaic virus II (WMVII) và zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) phân nhóm với

nhau và hình thành nên một nhóm thuộc chi Potyvirus gọi là ―BCMV subgroup‖.

15.6.3 BCMV ở Việt Nam

Ở Việt Nam, mặc dù các cây đậu đỗ thƣờng biểu hiện triệu chứng giống nhƣ bị nhiễm BCMV

nhƣng cho tới nay, chỉ có 2 công bố về virus quan trọng này. Đầu tiên là một nghiên cứu dựa

trên phân tích ELISA và giải trình tự từ các mẫu hạt giống đậu đỗ thu thập ở miền Bắc Việt

Nam. Dựa trên nghiên cứu này, các tác giả (Ngô Bích Hảo et al., 2003) đã xác nhận sự có mặt

của BCMV trên hạt đậu (Vigna unguiculata) và cho thấy tỷ lệ hạt đậu nhiễm virus là từ 0,8 to

12,4 % . Nghiên cứu thứ 2 là các phân tích trình tự gen từ 9 mẫu virus phân lập từ các cây họ đậu

biểu hiện triệu chứng bệnh nhƣ đậu đen, đậu đỏ, đậu đũa, đậu tƣơng và muồng 3 lá (một cây che

phủ cà phê) thu thập tại nhiều tỉnh Việt Nam (Hà Viết Cƣờng et al., 2008).

Các nghiên cứu gần đây cho thấy vùng Đông Nam Á và đặc biệt Việt Nam là một trong

những trung tâm phát sinh và đa dạng của BCMV vì:

(i) BCMV đã đƣợc phát hiện thấy trên khá nhiều cây họ đậu nhƣ đậụ đen, đậu đỏ (P.

vulgaris), đậu đũa (V. unguiculata), đậu tƣơng (Glycin max) và muồng 3 lá (Crotalaria

anagyroides) – một cây che phủ cà phê tại Đắc Lắc.

(ii) Phần lớn các mẫu BCMV phân lập tại Việt Nam đã phân nhóm với 2 nhóm chủng chính là

chủng black eye cowpea mosaic (BlCM) và chủng peanut stunt virus (PSt)

(iii) Đặc biệt, 2 mẫu BCMV phân lập từ đậu đen (BCMV-VN-BB2-5) và đậu đũa (BCMV-

YB2) đã biểu hiện mực độ biến động trình tự gen rất cao, chẳng hạn thiếu các chuỗi epitope nằm

ở đầu amin của protein CP và trong phân tích phả hệ, chúng nằm ở vị trí trung gian giữa cụm

chứa tất cả các chủng/isolate BCMV và cụm chứa các potyvirus khác thuộc nhóm ―BCMV

subgroup‖.

(iv) Một phân tích phả hệ học mới đây nhất dựa trên so sánh trình tự khoảng 400 chuỗi

nucleotide mã hóa phần trung tâm và phần đầu carboxyl protein vỏ virus đại diện cho 34 loài

potyvirus thuộc nhóm ―BCMV subgroup‖ (Gibb et al., 2008) đã chứng minh rõ ràng rằng các

virus của nhóm này (kể cả BCMV) có nguồn gốc từ vùng Đông Nam Á, Nam Á, và khu vực

châu Đại dƣơng.

157

Bảng 15-2. Một số isolate BCMV ở Việt Nam đƣợc giải trình tự gen CP

TT Isolate Mã Gen Bank Ký chủ Địa phƣơng

1 BlCMV-VN/BB1 DQ925417 Đậu đen (Phaseolus vulgaris) Hòa Bình

2 BlCMV-VN/BB2-6 DQ925423 Đậu đen (P. vulgaris) Hòa Bình

3 BlCMV-VN/RB1 DQ925420 Đậu đỏ (P. vulgaris) Huế

4 BlCMV-VN/RB2 DQ925421 Đậu đỏ (P. vulgaris) Huế

5 BlCMV-VN/YB1 DQ925424 Đậu đũa (Vigna unguiculata) Vĩnh Phúc

6 PsTV-VN/SB1 DQ925418 Đậu tƣơng (Glycin max) Đắc Lắc

7 PsTV-VN/Ca1 DQ925419 Muồng 3 lá (Crotalaria anagyroides) Đắc Lắc

8 BCMV-VN/BB2-5 DQ925422 Đậu đen (P. vulgaris) Hòa Bình

9 BCMV-VN/YB2 DQ925425 Đậu đũa (V. unguiculata) Yên Bái

Hình 15-6 Mức đa dạng của BCMV ở Việt Nam (đƣợc in đậm).

L19474-BCMV-[US7] L19539-BCMV-[CH1]-Capsicum annum

L12740-BCMV-[US1] AF083559-BCMV-[NY 68-95]

S66252-BCMV-[NY15] S66251-BCMV-[NL1]

L15332-BCMV-[NL1] AY112735-BCMV-[NL1]-Phaseolus vulgaris

U37073-BCMV-[US3]-P. vulgaris U37072-BCMV-[US10]-P. vulgaris

DQ054366-BCMV-Australia Z15057-BCMV-[J8]

AY863025-BCMV-[RU1]-USA-P. vulgaris U37077-BCMV-[RU1]-P. vulgaris

L19472-BCMV-[NL2] AF361337-BCMV-[93/65]-South Africa-P. vulgaris

U37074-BCMV-[US4]-P. vulgaris AB012663-AzMV-[H]

U23564-DeMV-USA-Dendrobium superbum U60100-AzMV

AY575773-BlCMV-[TW]-Taiwan Y17823-BlCMV-[Florida]-cowpea

S66253-BlCMV-[W] AJ312438-BlCMV-[Y]-China-cowpea AJ312437-BlCMV-[R]-China-cowpea

BlCMV-VN/YB1 BlCMV-VN/BB2-6

BlCMV-VN/RB1 BlCMV-VN/BB1

BlCMV-VN/RB2 AF045065-BCMV-[GGSUS]-USA-Cyamopsis tetragonolaba

AF045066-BCMV-[GGSSA]-South Africa-C. tetragonolaba U37075-BCMV-[N17]-P. vulgaris

L21767-BCMV-[BR1]-Puerto Rico L11890-BCMV-[Mexican]

L19473-BCMV-[US5] AF200623-PStV-[SN-Nib2]-Thailand

AF073380-PStV-[T6-97]-Thailand-peanut Y11773-PStV-[T6]-Thailand-peanut

Y11771-PStV-[T3]-Thailand-peanut Y11776-PStV-[T1]-Thailand-peanut

Y11774-PStV-[T7]-Thailand-peanut Y11772-PStV-[T5]-Thailand-peanut

PStV-VN/SB1 PStV-VN/Ca1

AF063222-PStV-[Ts]-Taiwan-peanut AY968604-PStV-[Ts]-Taiwan-peanut

U34972-PStV-[Blotch]-China-peanut X63559-PStV-[Blotch]-China-peanut

U05771-PStV-[Blotch]-China-peanut AJ132143-PStV-[G]-China-Peanut

AJ132144-PStV-[W]-China-Peanut Y11775-PStV-[95/399] DQ367846-PStV[Hongan]-China-peanut AJ132157-PStV-[I14]-Indonesia-peanut Z21700-PStV-[370]-Indonesia-peanut AJ132155-PStV-[I12]-Indonesia-peanut AJ132156-PStV-[I13]-Indonesia-peanut AJ132147-PStV-[I2]-Indonesia-peanut AJ132146-PStV-[I1]-Indonesia-peanut AJ132149-PStV-[I5]-Indonesia-peanut

BCMV-VN/BB2-5 BCMV-VN/YB2

WVMV-AY656816 WMV-AY437609

SMV-AY216010 DsMV-AJ298033

CABMV-AF348210 BCMNV-U19287

ZYMV-AF127929 TelMV

EAPV-AB246773

99

99 88

97 84

66 63

99

95 97

91

72 94

52

99

72 57 99

79 96

87 92

58 99

99

99

89 82 99

69 92

87

77 78

79

75 65

54

82 87

85 76 69

99

99

99 96

92

51 50

0.05

“BCMV subgroup”

BCMV

BlCMV strain

PStV strain

158

15.6.4 Triệu chứng

BCMV tạo một số các triệu chứng phổ biến sau trên cây đâu: khảm thƣờng, khảm vàng, khảm

xanh (có các nốt phồng xanh đậm), lá thƣờng nhăn, có thể cuốn, cây còi cọc. Tuy nhiên triệu

chứng rất biến động phụ thuộc nhiều vào chủng virus, giống cây, giai đoạn phát triển, thời điểm

nhiễm và điều kiện ngoại cảnh.

Nếu cây nhiễm từ hạt thì các lá non đầu tiên bị đốm biến vàng và biến dạng.

Cây bệnh có ít quả, quả nhỏ, chín chậm; vỏ quả có các đốm màu xah đậm.

Một số chủng virus có thể tạo triệu chứng chết hoại màu nâu đen ở gân lá gọi là bệnh ―thối

đen‖. Triệu chứng này chỉ xuất hiệ trên các giống có gen kháng trội I. Vết chết hoại có thể phát

triển tới tới thân, rễ và đỉnh sinh trƣởng. Cây có thể chết nếu nhiễm sớm. Nếu nhiễm muộn, cây

vẫn sống nhƣng có thể chết từng phần.

Hình 15-7 Bệnh khảm lá do BCMV trên cây họ đậu Việt Nam (ảnh trái:đậu đen, ảnh giữa: muồng

3 lá, Hà Viết Cƣờng et al., 2008) và triệu chứng chết hoại gân của bệnh “thối đen” (CABI, 2006).

15.6.5 Lan truyền

15.6.5.1 Qua hạt giống/phấn hoa

BCMV là một virus nhiễm trên hạt (seed-borne) nhiều loại cây họ đậu, đặc biệt trên các giống

đậu P. vulgaris.

BCMV có khả năng truyền qua phấn hóa vì virus đã đƣợc phát hiện thấy trong hạt phấn.

BCMV có mặt ở nhiều bộ phận nhƣ lá đài (sepals), cánh hóa (petals), nhị (stamens) và nhụy

(pistils). Dịch chiết từ quả và phôi của hạt non có khả năng lây nhiễm rất cao. Cây bị nhiễm sớm

có tỷ lệ hạt nhiễm virus rất cao, có thể > 50%.

Thời điểm nhiễm bệnh ảnh hƣởng đến khả năng truyền qua hạt (seed-transmission). Cây bị

nhiễm ở giai đoạn lá thật đầu tiên thì tỷ lệ truyền qua hạt cao, có thể tới ~ 90%. Cây bị nhiễm ở

giai đoạn 3 lá thật thì tỷ hạt truyền virus giảm mạnh, chỉ còn 1%. Nếu cây bị nhiễm sau ra hoa

khoảng 1 tuần thì hạt không có khả năng truyền virus (mặc dù vẫn có thể bị nhiễm virus). Trong

159

một nghiên cứu khác, tỷ lệ hạt truyền virus đạt tối đa ở giai đoạn lá thật thứ nhất và hầu nhƣ

không có khả năng truyền qua hạt khi cây bị nhiễm bệnh khoảng 1 tháng sau trồng.

Lây nhiễm virus vào lá mầm dẫn tới biểu hiện bệnh cũng nhƣ khả năng truyền qua hạt đạt tối

đa.

Virus tồn tại chủ yếu ở phôi nhƣng cũng có thể ở các bộ phân khác của hạt. Virus có mặt ở vỏ

hạt nhƣng biến mất khi hạt khô. Virus không có mặt ở lá mầm.

Virus có khả năng tồn tại trên hạt rất lâu mà vẫn duy trì khả năng truyền bệnh. Có thí nghiệm

cho biết hạt vẫn có thể truyền bệnh sang cây con sau 30 năm Có thí nghiệm cho thấy hạt bảo

quản ở 2-4 oC sau 6 năm vẫn có khả năng truyền bệnh với tỷ lệ 3-4 %.

Hạt nhiễm virus nhìn chung không ảnh hƣởng đến sức nảy mầm nhƣng chất lƣợng hạt giảm

sút mạnh.

Truyền qua hạt là cách tạo sự nhiễm bệnh sơ cấp quan trọng nhất đối với đậu. Tuy nhiên khả

năng này cũng khác nhau tùy giống, chủng virus cũng nhƣ thời điểm cây mẹ bị nhễm bệnh.

15.6.5.2 Qua vector

BCMV lan truyền tự nhiên ngoài đồng ruộng bằng nhiều loài rệp muội theo kiểu không bền

vững. Nhiều loài rệp mặc dù không sống trên cây đậu nhƣng vẫn có khả năng truyền virus khi

chúng di chuyển tìm thức ăn.

Truyền qua rệp là cách truyền bệnh thứ cấp quan trọng trên đồng ruộng.

15.6.6 Chẩn đoán

Chẩn đoán dựa vào triệu chứng bệnh do BCMV không dễ vì triệu chứng đa dạng và cây họ

đậu bị nhiễm nhiều virus với triệu chứng tƣơng tự, đặc biệt các triệu chứng khảm lá.

Virus có thể đƣợc chẩn đoán bằng cây chỉ thị. Mƣời một giống đậu (P. vulgaris) có thể phân

biệt đƣợc 10 type gây bệnh (pathotypes) khác nhau

Virus có thể đƣợc chẩn đoán bằng ELISA dùng các kháng thể đơn dòng/đa dòng, đặc hiệu

loài thậm chí chủng. Virus cũng có thể đƣợc chẩn đoán bằng RT-PCR.

15.6.7 Phòng chống

Có thể phòng chống BCMV bằng một số các biện pháp nhƣ (i) trồng hạt khỏe, sạch virus, (ii)

trồng giống kháng, (iii) cải thiện điều kiện canh tác, và (iv) phòng chống vector. Trong các biện

pháp này, 2 biện pháp đầu (i) và (ii) là quan trọng nhất.

15.6.7.1 Trồng giống khỏe và sạch

Trồng giống khỏe và sạch virus đòi hỏi phải có một chƣơng trình sản xuất hạt giống đƣợc

kiểm soát nghiêm ngặt. Ruộng giống thƣờng đƣợc trồng tại khu vự biệt lập (có mật độ rệp thấp,

ít hoặc không có cây ký chủ là nguồn bệnh của BCMV). Ruộng giống đƣợc chăm sóc tốt. Cây

đƣợc kiểm tra sự có mặt của virus thƣờng xuyên bằng ELISA. Vệ sinh đồng ruộng để loại bỏ cây

bệnh trong vụ và giữa các vụ. Hạn chế vector bằng thuốc hóa học hoặc các kỹ thuật thích hợp.

Hạt giống phải đƣợc xác nhận chất lƣợng thông qua kiểm tra sự có mặt của virus bằng các kỹ

thuật thích hợp nhƣ ELISA.

160

15.6.7.2 Tạo giống kháng bệnh

Đối với cây họ đậu, nhiều gen kháng và giống kháng BCMV đã đƣợc xác định và ứng dụng.

Các gen kháng BCMV này tuân theo quan hệ gen đối gen và có thể chia làm 2 nhóm là các gen

kháng lặn và gen kháng trội.

Gen kháng lặn. Các yếu tố khởi đầu dịch mã eIF của cây ký chủ luôn cần cho quá trình dịch

mã và qua đó là quá trình gây bệnh của virus. Các đột biến trên gen mã hóa eIF4E đã đƣợc xác

định là nguồn các gen kháng lặn quan trọng ở nhiều loài cây chống virus. Quan hệ của các gen

kháng này với virus tuân theo qua hệ gen-đối-gen. Gen không độc tƣơng ứng của các potyvirus

chính là VPg.

Trên cây đậu (P. vulgaris), bốn gen kháng lặn, bc-1, bc-2, bc-3 và bc-u, đã đƣợc xác định là

các gen kháng lặn chống BCMV và BCMNV (Bean common mosaic necrosis virus). (Chú ý ký

hiệu alle của các gen này: ví dụ gen bc-1 và bc-12 là alle của nhau, bc-2 và bc-22 là alle của

nhau…). Trong số 4 gen kháng lặn này, bc-1, bc-2, bc-3 qui định tính kháng đặc hiệu chủng còn

bc-u là gen kháng không đặc hiệu chủng. Bản thân bc-u tự nó không kháng đƣợc BCMV nhƣng

nó cần thiết để các gen kháng lặn khác tạo ra tính kháng.

Gen kháng trội. Trên cây họ đậu, một gen kháng trội là gen I đã đƣợc xác định. Gen I thuộc

nhóm gen kháng NB. Tuy nhiên cây chỉ mang gen kháng I thì không chống đƣợc các chủng

BCMV gây chết hoại. Để có tính kháng tốt với các chủng này, cây cần kết hợp cả gen kháng I và

các gen kháng lặn.

Hiện nay, nhiều giống đậu kháng BCMV kết hợp cả gen kháng trội I và các gen kháng lặn

bc đã đƣợc tạo ra tại Trung tâm Nông nghiệp Nhiệt đới Quốc tế (CIAT:

http://www.ciat.cgiar.org/Paginas/index.aspx)

15.7 SUGARCANE MOSAIC VIRUS (SCMV) VÀ SORGHUM MOSAIC VIRUS

(SRMV)

15.7.1 Các potyvirus hại họ hòa thảo

Có 6 potyvirus nhiễm trên cây hòa thảo họ Graminae nhƣ mía, ngô, lúa miến (sorghum) và

các cây cỏ hòa thảo khác là SCMV, SrMV, MDMV (Maize dwarf mosaic virus), JGMV

(Johnsongrass mosaic virus), ZeMV (Zea mosaic virus) và PenMV (Pennisetum mosaic virus).

Các virus này tạo thành một nhóm gọi là ―SCMV sub-group‖.

1. JGMV có phân bố hẹp, chỉ ở Öc, Mỹ, Nigeria. Virus không truyền qua hạt.

2. MDMV có phân bố địa lý rộng hơn (có thể khắp thế giới) và nhiễm tự nhiên trên các cây

ngô, cỏ Johnsongrass và lúa lúa miến. Tuy nhiên danh tính của virus rất dễ gây nhầm lẫn vì

nhiều bệnh virus đƣợc cho là do MDMV gây ra thực chất là do SCMV. Virus có thể truyền

qua hạt ngô với tỷ lệ rất thấp (0.007% to 0.4%).

3. SrMV phát hiện thấy ở Mỹ và nhiều nƣớc châu Á. Virus chỉ gây bệnh trên lúa miến và mía.

4. ZeMV phát hiện thấy trên ngô ở Israel năm 2000.

5. PenMV phát hiện thấy trên cỏ trắng (Pennisetum centrasiaticum) ở phía Bắc Trung Quốc

năm 2003.

6. SCMV là virus phân bố khắp thế giới, nhiễm tự nhiên trên nhiều loài cây họ Gramineae. Hai

chủng SCMV mới cũng đƣợc báo cáo gây bệnh trên cây không phải họ Graminae là cây cọ ở

Colombia, cây chuối sợi abaca và cây hoàng tinh (Maranta arundinacea) ở Philippines.

161

15.7.2 SCMV và SrMV tại Việt Nam

Ở Việt Nam, bệnh khảm lá ngô đã đƣợc quan sát thấy từ lâu. Các nghiên cứu gần đây đã phát

hiện đƣợc 2 potyvirus hại họ hòa thảo là SCMV và SrMV.

SCMV gây bệnh khảm lá ngô, mía và hoàng tinh. Đây là bệnh virus phổ biến nhất trên ngô và

mía ở Việt Nam. Phân tích phả hệ dựa vào trình tự gen CP cho thấy virus ở Việt Nam khá đa

dạng, phân nhóm với các mẫu có nguồn gốc ký chủ khác nhau thuộc nhiều khu vực địa lý là châu

Mỹ, châu Âu và châu Á. Đặc biệt 3 mẫu SCMV phân lập từ mía ở Việt Nam tạo thành một nhóm

riêng biệt (nhóm IV) chia sẻ chung tổ tiên với tất cả các mẫu SCMV trên thế giới.

SrMV gây bệnh khảm lá mía. Trên mía, không thể phân biệt đƣợc triệu chứng khảm lá do

SrMV và SCMV gây ra. Phân tích phả hệ cũng cho thấy SrMV của Việt Nam phân nhóm với các

mẫu SrMV có nguồn gốc phía Nam Trung Quốc.

Hình 15-8 Bệnh khảm lá do SCMV trên mía (trái), ngô (giữa) và hoàng tinh (phải) tại Việt Nam

Bảng.15-3 Một số isolate SCMV và SrMV đƣợc giải trình tự gen CP

TT Isolate Mã GenBank Ký chủ Địa điểm

1 SCMV-VN/AR1 DQ925432 Hoàng tinh Hà Nội

2 SCMV-VN/M1 DQ925426 Ngô Hòa Bình

3 SCMV-VN/M2 DQ925429 Ngô Hà Tây

4 SCMV-VN/SC1 DQ925431 Mía Yên Bái

5 SCMV-VN/SC2 DQ925427 Mía Hòa Bình

6 SCMV-VN/SC3 DQ925430 Mía Bắc Giang

7 SCMV-VN/SC4 DQ925428 Mía Hà Nội

8 SrMV-VN/SC5 DQ925433 Mía Hòa Bình

9 SrMV-VN/SC6 DQ925434 Mía Hà Tây

162

Hình 15-9 Phân tích phả hệ dựa trên gen CP của các mẫu SCMV và SrMV thu tại Việt Nam (đƣợc

in đậm) với các mẫu thế giới.

AJ310106-[DY]-China-maize

AJ310107-[JS]-China-maize

AJ310110-[HB]-China-maize

AJ297628-[HZ]-China-maize-Ref.

AY639645-China-maize

AY149118-[SD]-China-maize

AF494510-China-maize

AY042184-[Beijing]-China-maize

AY569692-[XS]-China-maize

X98167-[Borsdorf]-Germany-maize

AJ006202-[G96]-Germany

X98169-[Hoendstedt]-Germany-maize

AM110759-[Sp]-Spain-maize

X98168-[Boetzingen]-Germany-maize

AJ006200-[G952]-Germany

AY195610-[Mx]-Mexico-maize

X98165-[Seehausen/S26]-Germany-maize

X98166-[Seehausen/S288]-Germany-maize

AJ006201-[Bg]-Bulgaria-maize

AJ310105-[GD]-China-maize

SCMV-VN/AR1

AJ310104-[YH]-China-sugarcane

AJ310102-[LP]-China-sugarcane

AJ310103-[XgS]-China-sugarcane

AY222743-[Abaca]-Philippines-Musa textilis

SCMV-VN/M1

AY630923-[UT6TH]-Thailand-sugarcane

AY629310-[UT6.2]-Thailand-sugarcane

AY629311-[UD7TH]-Thailand-sugarcane

AY629312-[SBC2TH]-Thailand-maize

SCMV-VN/M2

SCMV-VN/SC1

DQ315495-[BR11]-Brazil

DQ315494-[BR10]-Brazil

DQ315489-[BR01]-Brazil

DQ315497-[BR14]-Brazil

DQ315492-[BR08]-Brazil

DQ315493-[BR09]-Brazil

DQ315498-[BR15]-Brazil

DQ315496-[BR13]-Brazil

DQ315491-[BR06]-Brazil

DQ315490-[BR02]-Brazil

DQ369960-[KhzL66]-Iran-sugarcane

DQ438949-[KhzQ86]-Iran-sugarcane

U57357-[E]-USA-sugarcane

AY836523-[E]-USA-sugarcane

AF006737-[USFL]-USA-sugarcane

AY953351-[D]-China-sugarcane

U57355-[B]-USA-sugarcane

U57356-[D]-USA-sugarcane

AF006738-[SA]-South Africa-sugarcane

U57354-[A]-USA-sugarcane

AF006736-[USLA]-USA-sugarcane

D00948-[SC]-Australia-sugarcane

AY241923-India

AF006732-[Nambour 2]-Australia-sugarcane

AF006733-[Nambour 7]Australia-sugarcane

AF006730-[Isis 5]-Australia-sugarcane

AF006734-[Brisbane]-Australia-sugarcane

AJ278405-[A/Brisbane]-Australia-sugarcane

AF006735-[Bundaberg]-Austrlaia-sugarcane

AF006728-[Isis 3]-Australia-sugarcane

AF006729-[Isis 2]-Australia-sugarcane

AF006731-[Isis 7]-Australia-sugarcane

SCMV-VN/SC4

SCMV-VN/SC2

SCMV-VN/SC3

AJ310197-[XoS]-China-sugarcane-Ref.

AJ310194-[XgS]-China-sugarcane

AJ310198-[YH]-China-sugarcane

AJ310195-[LP]-China-sugarcane

SrMV-VN/SC5

SrMV-VN/SC6

AJ310196-[LH]-China-sugarcane

U57360-[SCM]-USA-sugarcane

U57358-[SCH]-USA-sugarcane

U07219-SCH

U57359-[SCI]-USA-sugarcane

MDMV-AJ001691-CP.SEQ

PenMV-AY642590-CP.SEQ

ZeMV-AF228693-CP.SEQ

JGMV-Z26920-CP.SEQ

78 99

58 90

100

100

100

100 100

99 100

52 55

52

86

100

59 100

68 99

57

58

100

100

99

99

94

88

75

64

58

100

66

58

100

100

99

93

88

80

62

58

62

62

83

100

94

93

74

93

71

100

57 92

100

76

80

70

60

0.05

Mía

China, Vietnam

Mía

Iran USA

China South Africa

India Australia

Brazil

Mía Vietnam

Mía

USA

Mía, ngô, chuôi, hoàng

tinh

China

Thailand Vietnam

Philippines Mexico

Germany Bulgaria Spain

SCMV

SrMV

IV

III

I

II

I

II

Nhóm “SCMV sub-

group”

163

15.8 ONION YELLOW DWARF VIRUS (OYDV), LEEK YELLOW STRIPE VIRUS

(LYSV) VÀ SHALLOT YELLOW STRIPE VIRUS (SYSV)

15.8.1 Các virus hành tỏi

Cây họ hành tỏi (Alliace) có thể bị nhiễm nhiều loại virus RNA thuộc các chi Carlavirus,

Allexivirus và Potyviruses. Trong số các virus hành tỏi, các potyvirus có ý nghĩa kinh tế nhất.

Năm 1993, Van Dijk đã thực hiện một khảo sát dựa trên gần 6000 mẫu hành tỏi khắp thế giới

và xác định đƣợc 4 potyvirus là LYSV (Leek yellow stripe virus), OYDV (Onion yellow dwarf

virus), SYSV (Shallot yellow stripe virus) và WoYSV (Welsh onion yellow stripe virus). Các

nghiên cứu tiếp theo của Tsuneyoshi et al. (1998) và van de Vlugt et al. (1999) đã kết luận lại

WoYSV chỉ là một chủng của SYSV.

Trên cây hành tỏi, các potyvirus tạo các triệu chứng gồm còi cọc, lá có các đốm hoặc đốm sọc

biến màu từ vàng rất nhạt tới rõ. Tất cả 3 virus trên đều tạo triệu chứng tƣơng tự nhau nên triệu

chứng ít có giá trị chẩn đoán. Tất cả các virus hành tỏi đều truyền qua củ giống và rệp muội theo

kiểu không bền vững. Vì các cây hành tỏi thƣờng đƣợc trồng từ củ giống nên củ giống nhiễm

virus là cách lan truyền quan trọng nhất của các virus này.

15.8.2 OYDV, LYSV và SYSV tại Việt Nam

Dựa vào trình tự gen CP, cả 3 potyvirus là OYDV, LYSV và SYSV đều đã đƣợc phát hiện

thấy trên các cây hành ta (shallot) và tỏi tây (leek) tại Việt Nam.

OYDV đã đƣợc phát hiện trên cây tỏi tây còn SYSV và LYSV đƣợc phát hiện trên hành ta và

tỏi tây.

Các cây này biểu hiện triệu chứng còi cọc với các đốm sọc vàng trên lá. Nhiễm hỗn hợp 2

virus (SYSV và LYSV) cũng phổ biến.

Hình 15-10 Các potyvirus trên hành ta và tỏi tây ở Việt Nam

164

15.9 TURNIP MOSAIC VIRUS (TUMV)

15.9.1 Giới thiệu

Turnip mosaic virus (TuMV) đƣợc đánh giá là virus có tầm quan trọng hàng thức 2 (sau

Cucumber mosaic virus, CMV) trên cây rau khắp thế giới. TuMV là potyvirus duy nhất nhiễm

trên cây rau họ thập tự. TuMV có phổ ký chủ cực kỳ rộng, nhiễm ít nhất 318 loài thuộc 43 họ

cây 2 lá mầm. Virus cũng nhiễm cả trên một số cây 1 lá mầm.

Dựa trên tính gây bệnh trên cây cải thuộc 2 chi Brassica và Raphanus, các isolate của TuMV

đƣợc chia thành 2 nhóm ―pathotypes‖ hay ―host types‖ ký hiệu là BR và B. Các isolate TuMV

nhóm BR nhiễm cả trên cải Brassica và Raphanus còn nhóm B chỉ nhiễm cây cải chi Brassica. .

Phân tích phả hệ dựa trên toàn bộ bộ gen virus lại chia các isolate TuMV khắp thế giới thành 4

nhóm là basal-B, basal-BR, Asian-BR và world-B (basal ám chỉ virus thuộc nhánh xuất phát từ

gốc trên cây phả hệ).

15.9.2 TuMV ở Việt Nam

TuMV đã đƣợc phát hiện thấy trên cây cải củ và cải bẹ tại nhiều tỉnh. Cây nhiễm bệnh còi

cọc, biểu hiện triệu chứng khảm lá điển hình. Trên cây cải bẹ bị nhiễm nặng, lá có thể bị chết

hoại.

Phân tích phả hệ dựa trên gen CP cho thấy các mẫu TuMV Việt Nam phân nhóm với nhóm

―world-B‖ – là nhóm rất đa dạng, đƣợc phân lập từ khắp nới trên thế giới. Đặc biệt 4/5 mẫu

TuMV Việt Nam có qua hệ gần gũi với các isolate từ Đông Á (Bắc Trung Quốc, Nhật Bản và

Triều Tiên).

Hình 15-11 TuMV trên cây cải củ (hàng trên) và cải bẹ (hàng dƣới) ở Việt Nam

165

Bảng 15-4 Một số isolate TuMV tại Việt Nam đƣợc giải trình tự gen CP

TT Isolate Mã Genbạnk Cây Địa điểm

1 TuMV-VN/Rs1 DQ925459 Cải củ (Raphanus sativus) Đắk Lắc

2 TuMV-VN/Rs2 DQ925463 Cải củ (R. sativus) Lai Châu

3 TuMV-VN/Bj1 DQ925460 Cải bẹ (Brassica juncea) Đăk Lăc

4 TuMV-VN/Bj2 DQ925461 Cải bẹ (B. juncea) Hòa Bình

5 TuMV-VN/Bj3 DQ925462 Cải bẹ (B. juncea) Lai Châu

Hình 15-12 Phân tích phả hệ các mẫu TuMV từ Việt Nam (in đậm) và thế giới dựa trên gen CP

AB180015-CHZH33

AB180016-CHZH34

AB180025-HZ6

AB180008-CHsE1

AB076504-2J

AB076502-K1J

AB105135-TU-2RI

AB076551-CHN4

AB076552-CHN5

AF394602-TW

AB076549-CHN2

AB076550-CHN3

AB076487-ST19J

AB093625-C42J

AB076499-ON16J

AB180019-CHZJ25

AB180013-CHZC21

AB180014-CHZC22

AB179995-CHHH29

AB179996-CHHH30

AB179997-CHHZ3

AB076545-NPL3

AB093623-DMJ TuMV-VN/Rs1-R. sativus

TuMV-VN/Bj2-B. juncea

AB180027-RADI

AB188983-DNK4

AB105134-TU3 TuMV-VN/Bj3-B. juncea

AB180011-CHYK56

AB180009-CHYK19

AB180010-CHYK20

AB180021-CHZJ27

AB180000-CHK55

TuMV-VN/Rs2-R. sativus

AB180026-CQS1

AB180007-CHSC2

AB076553-HJIS

AY090660-CHN12

AB180012-CHZC1

AB180022-HBI2

AB188987-GBR8

AB189017-NLD2

AB189001-GRC17

AB188989-GBR30

AB093605-KEN1

AB188988-GBR27

AB188990-GBR31

AB188991-GBR32

AB188992-GBR36

AB188993-GBR38

AB194796-UK1

AB188994-GBR50

AB189003-GRC31

AB188998-GRC2

AB188999-GRC6

AB189000-GRC12

AB093604-PV376Br

AB188979-DEU5

AB093612-NZ290

AB093610-CDN1

D10927-Q-Ca

AB093609-USA1

AB188972-CZE4

AB188982-DNK3

AB076531-PV0054

AB188986-FRD1

AB189016-NLD1

AB093611-BZ1

AB188985-FRA2

AB189002-GRC18

AB189004-GRC32

AB188977-DEU1

AB189020-POL4

AB188973-CZE5

AB189018-POL1 TuMV-VN/Bj1-B. juncea

AB188995-GBR51

AB093608-CZE1

AB093606-RUS1

AB188981-DNK2

AB093607-RUS2

AB188975-CZE18

AB189021-PRT1

AB180018-CHZJ23

AB076555-HZ4

AB180017-CHZH36

AB093627-HRD

AB179990-CH6

AB179994-CHBJ2

AB179993-CHBJ1

AB179992-CH8

AB179991-CH7

AB180020-CHZJ26

AB076520-Rn98

AB093601-Cal1

AB093600-ITA7

AB188978-DEU4

AB093603-PV0104

AB189014-ITA8

AB093614-CP845J

AB093613-KYD81J

AB189006-GRC42

AB189007-GRC43

AB188984-ERU1D

AB093599-A64

AB093598-Al

AB189005-GRC41

AB189008-GRC44

AB189013-ITA6

AB189012-ITA5

AB189010-ITA3

AB189011-ITA4

ScMV-AJ316084

JYMV-AB027007

100

100

63

100

71

100

100

100

100

87

100

100

95

91

66

99

99

99

99

95

88

62

90

80

89

82

89

79

62

75

73

70

66 85

87

61

65

63

62

93

99

74

63

51

77

74

80

100

0.05

Wo

rld-B

A

sia

n-B

R B

asal-B

R B

sal-B

East Asia China Korea Japan

Vietnam

166

15.10 DASHEEN MOSAIC VIRUS (DSMV)

DsMV là một potyvirus thuộc nhóm phụ ―BCMV subgroup‖. DsMV là virus quan trọng nhất

trên cây họ ráy (Araceae) khắp thế giới, đặc biệt là vùng nhiệt đới và á nhiệt đới. Virus lan

truyền ngoài tự nhiên qua củ giống và nhiều loài rệp muội theo kiểu không bền vững. Một đặc

điểm phân tử khác biệt của DsMV so với các potyvirus khác là vùng đầu N của gen CP chứa

nhiều chuỗi lặp gồm các amino acid trung tính nhƣ G, T, P, N (ví dụ một chuỗi lặp hoàn hảo

GGGNNTNNTPPANNTTT).

Nhiều cây họ Ráy nhiễm bệnh là cây trồng nhƣ khoai môn, khoai sọ (Colocasia esculenta) và

cây cảnh. Trên cây bệnh, DsMV thƣờng tạo các triệu chứng: khảm lá, khảm dọc gân kiểu ―lông

chim‖ và biến dạng lá.

Tại Việt Nam, DsMV mới đƣợc xác định bằng giải trình tự gen CP từ 2 mẫu là khoai sọ và

bán hạ 3 thùy (Typhonium trilobatum) – một cây dƣợc liệu và là một ký chủ mới của virus (Hà

Viết Cƣờng et al., 2008).

Hình 15-13 Bệnh do DsMV trên cây họ Ráy

Hàng trên (từ trái sang phải): Khảm dạng ―lông chim‖ trên Môn hồng diệp (Philodendron

sp.), khảm sọc giữa gân trên Môn xanh (Philodendron oxycardium), khảm trên Môn trƣờng sinh

(Dieffenbachia sp.) (CABI, 2006)

Hàng dƣới (trái sang phải): Khảm dạng ―lông chim‖ trên khoai sọ và khảm thông thƣờng trên

cây bán hạ 3 thùy ở Việt Nam.

167

15.11 SWEET POTATO FEATHERY MOTTLE VIRUS (SPFMV)

Sweet potato feathery mottle virus (SPFMV) cùng với Sweet potato chlorotic stunt virus

(SPCSV; chi Crinivirus, họ Closteroviridae) và Sweet potato mild mottle virus (SPMMV; chi

Ipomovirus, họ Potyviridae) là 3 virus chính trong tổng số khoảng 20 virus nhiễm trên khoai lang

toàn thế giới.

Đầu tiên, dựa vào đặc tính huyết thanh học và triệu chứng, SPFMV đƣợc chia thành 2 chủng

là chủng RC (russet crack) gây triệu chứng nứt và hóa bần củ và chủng C (common) không gây

triệu chứng trên củ. Gần đây hơn, dựa trên phân tích gen CP, các isolate của SPFMV chia làm 4

cụm phả hệ tƣơng đƣơng 4 chủng là RC, C, O và EA (East Africa).

Tại Việt Nam, SPFMV mới đƣợc phát hiện gần đây trên 2 mẫu khoai lang ở Huế và Bắc

Giang. Cây bệnh biểu hiện triệu chứng khảm và biến dạng. Phân tích phả hệ dựa vào gen CP của

2 mẫu này thấy chúng thuộc chủng Đông Phi (EA). Đáng chú ý là cụm 2 mẫu Việt Nam này nằm

ở vị trí gốc của cả cụm chủng EA.

Hình 15-14 Triệu chứng bệnh do SPFMV trên khoai lang Việt Nam

Hình 15-15 Cây phả hệ dựa trên gen CP của các mẫu SPFMV Việt Nam và các mẫu thế giới

Chủng RE

Chủng O

Chủng RC

Chủng C

AJ781786-EA-Unj1-Tanzania

AJ010702-EA-Nam3-Uganda

AY518938-RC-Spain1RC

AJ781781-EA-BkB1-Tanzania

AY459593-EA-85

AJ010704-EA-Nam1-Uganda

AJ781783-EA-Mis1-Tanzania

AJ781784-EA-Tar1-Tanzania

AJ010700-Mad-Madagaska

AY459597-EA-Putisrabe-Madagasc

SPFMV-1091-CP.SEQ

AY523551-RC-Zambia-Zambia

AY459599-EA-Portugal-Portugal

AY459600-EA-Carnar3-Spain

SPFMV-1214-CP.SEQ

AF015541-O-K2-Korea

AJ010705-O-Nig3-Nigeria

S43450-RC-RC-USA

AF015540-RC-K1-Korea

D86371-RC-S-Japan

AJ515378-RC-Eg1-Egypt

AJ515379-RC-Eg9-Egypt

AY459591-C-51

AJ781778-C-Au4-Australia

AJ781779-C-Au5C-Australia

AJ010702-Nam3-Uganda

AY459601-C-MD1

AM076411-Ita1-Italia

U96625-C-6-Argentina

71

53

99

90

89

79

58

76

66

59

55

52

76

74

97

7797

73

78

99

168

15.12 ZUCCHINI YELLOW MOSAIC VIRUS (ZYMV)

ZYMV, đƣợc phát hiện đầu tiên ở Ý năm 1973, đang là một trong số các virus quan trong

hàng đầu trên cây họ bầu bí khắp thế giới. Virus phân bố ở ít nhất 50 quốc gia kể cả các khu vực

biệt lập về địa lý nhƣ các hải đảo. Virus khá đa dạng, gồm nhiều chủng, nhóm phả hệ khác nhau.

Virus có phổ ký chủ tƣơng đối hẹp, chủ yếu gây hại trên các cây họ bầu bí. ZYMV tạo triệu

chứng đặc trƣng là khảm lá, biến dạng lá, nốt phồng xanh đậm trên lá, quả; quả biến dạng, cây

lùn. Nhìn chung, triệu chứng do ZYMV gây ra giống với các potyvirus khác trên họ bầu bí và do

đó ít có giá trị chẩn đoán.

Virus lan truyền ngoài tự nhiên bằng nhiều loài rệp muội theo kiểu không bền vững. Virus

cũng truyền qua hạt. Tuy nhiên khả năng truyền qua hạt không cao và không phải tất cả các loài

cây họ bầu bí đều có thể truyền đƣợc (chƣa thấy có công bố cho thấy ZYMV truyền qua dƣa

(Cucurbita melo) và dƣa chuột (Cucumis stivus). Các nghiên cứu cho thấy tỷ lệ hạt truyền virus

thay đổi từ 0.05 – 5 %.

ZYMV có khả năng phát tán rất mạnh. Lý do là (i) virus có thể truyền qua hạt (mặc dù tỷ lệ

không cao) và (2) quan trọng hơn là virus có thời gian tồn tại khả nhiễm khá lâu mặc dù virus

đƣợc truyền theo kiểu không bền vững. Tỷ lệ rệp truyền virus vẫn có thể tới 1 % sau khi chích

nạp 30 giờ (đối với rệp đào), 10-20 giờ (đối với rệp bông).

Về phòng chống: Biện pháp phòng chống ZYMV hiện nay là sử dụng giống kháng mang gen

kháng Zym. Ngoài ra, dùng cây chuyển gen CP (mức protein) hoặc thông qua công nghệ RNAi

cũng đã và đang đƣợc nghiên cứu.

Hình 15-16 Triệu chứng do ZYMV trên cây bí ngồi (Desbiez & Lecoq, 1997)

Tại Việt Nam, ZYMV đã đƣợc phát hiện thấy trên một số cây nhƣ dƣa chuột, bí ngô, bầu.

Phân tích gen CP của một số mẫu ZYMV Việt Nam cho thấy các kết quả thú vị là:

(i) Tất cả các mẫu không phân nhóm với nhóm I là nhóm gồm rất nhiều các isolate có nguồn

gốc từ khắp nơi trên thế giới,

(ii) Có một isolate nằm trong nhóm II là nhóm chỉ có nguồn gốc từ Singapore và đảo

Reunion thuộc Pháp

(iii) Các isolate còn lại cùng với một số isolate có nguồn gốc từ phía Nam Trung Quốc hình

thành nhóm III. Đây là nhóm nằm ở vị trí gốc nhất của cây.

Kết quả này cho thấy Việt Nam và phía Nam Trung Quốc là trung tâm đa dạng của virus

này (Hà Viết Cƣờng et al., 2008).

169

Bảng 15-5 Một số mẫu ZYMV tại Việt Nam đƣợc giải trình tự gen CP

TT Isolate Mã GenBank Ký chủ Địa điểm

1 ZYMV-VN/Cs1 DQ925449 Dƣa chuột (Cucumis sativus) Sơn la

2 ZYMV-VN/Cm1 DQ925448 Bí ngô (Cucurbita moschata) Sơn La

3 ZYMV-VN/Cm2 DQ925450 Bí ngô (C. moschata) Hòa Bình

4 ZYMV-VN/Cm3 DQ925447 Bí ngô (C. moschata) Vĩnh Phúc

5 ZYMV-VN/Bh1 DQ925451 Bí xanh (Benincasa hispida) Hồ Chí Minh

Hình 15-17 Cây phả hệ của các mẫu ZYMV Việt Nam và thế giới dựa trên gen CP

AJ420014-[Austria 6]-Austria-Cucurbita pepo

AJ459956-[H272-8]-Hungary-C. pepo

AJ459955-[H272-6]-Hungary-C. pepo

AJ459954-[H266-2]-Hungary-C. pepo

AJ251527-[10]-Hungary-Cucumis sativus

AJ420013-[Austria 5]-Austria-C. pepo

AJ420018-[Slovenia 1]-Slovenia-C. pepo

AJ420019-[Berlin 1]-Germany-C. pepo

AY188994-B

M35095-[NAT]-Israel-C. sativus

AB127936-[Pak]-Pakistan-Lageneria siceneria

AB004641-[M]-Japan

AB063251[-M39]-Japan-Cucumis melo

AF513550-[Shangyu]-China- Cucurbita moschata

AY074809-[Beijing]-China

AY611021-China-C. moschata

AF513551-[Ningbo 2]-China-C. moschata

AY074810-[Ningbo]-China-C. melo

AJ316229-[WG]-China-Benicasa. hispida

D13914-[Florida]-USA-C. .moschata

AF127933-[NUCLEOTIDE1]-Taiwan-C. sativus AB188115-[Z5-1]-Japan-C. sativus

AB188116-[Z5-1/2002]-Japan-C. sativus

AJ420020-[Italy 1]-Italy-C. pepo

D00692-[Connecticut]-USA

L31350-[California]-USA-C. .moschata

AJ307036-[CU]-China-C. sativus

AY611022-[99/90]-China-C. melo

AY611024-[99/246]-China-squash

AY279000-[KR-PS]-Korea-C. .moschata

AF486822-[Dongyang]-China-C. .moschata

AF062518-[CU]-Korea-C.sativus

AY597207-[Hefei]-China

AY611023-[193/90]-China-squash

AY278998-[KR-PA]-Korea-C. moschata

AF486823-[Hainan]-China-B. hispida

AB004640-[169]-Japan-C. melo

AF127930-[TW-CY2]-Taiwan-L. cylindrica

AF127934-[TW-PT5]-Taiwan-Momordica charanucleotideia AJ316227-[P]-China-C. moschata

AJ316228-[SG]-China-L. cylindrica

AF127931-[TW-TC1]-Taiwan-C. maxima

AF127929-[TW-TN3]-Taiwan-L. cylindrica

AJ429071-[A]-Korea-Altheae rosea

AF435425-[Hangzhou]-China-C. moschata

AY611026-[HN-01]-China-C. lanatus

AF127932-[TW-TNML1]-Taiwan-C. melo

AY995216-New Zealand-zucchini

L29569-[Reunion]-Reunion Island-M. charanucleotideia

AF014811-[Singapore]-Singapore-C. sativus

ZYMV-VN/Cm3

AF513552-[Shandong]-China

AY074808-[Shanxi]-China-C. moschata

ZYMV-VN/Bh1

ZYMV-VN/Cm1

ZYMV-VN/Cs1

ZYMV-VN/Cm2

AY611025-[BJ-03]-China-C. lanatus

AJ515911-[WM]-China-C. lanatus

AJ515907-[SXS]-China-C. moschata

AJ515908-[MM]-China-C. melo

EAPV- AB246773

DsMV- AJ298033

BCMV- AJ312437

CABMV-AF348210

BCMNV-U19287

WVMV-AY656816

WMV- AY437609

SMV- AY216010

96 100

100

84 99

93

52

100

87

100

72

97

76

65

87

69

100

100

100

99

66

62

79

99

99

69

98

73 77

99

89 92

98

94 97

90

81

86

100

99

52 93

96

100

97 99

0.05

I

III

II

ZYMV

Nhóm phụ BCMV

Thế giới

Vietnam

China

Vietnam Reunion,

Singapore

170

15.13 CHILLI VEINAL MOTLE VIRUS (CHIVMV) VÀ CHILLI RINGSPOT VIRUS

(CHIRSV)

ChiVMV là một potyvirus hại ớt, đƣợc phát hiện đầu tiên tại Malaysia năm 1979 trên cơ sở

triệu chứng, hình thái phân tử, lan truyền, đặc tính vật lý và huyết thanh học. Virus không truyền

qua hạt giống, truyền bằng rệp theo kiểu không bền vững.

Triệu chứng điển hình nhất trên ớt là là khảm gân xanh. Tuy nhiên, virus cũng gây một loạt

các triệu chứng khác nhƣ biến dạng lá, cây còi cọc. Nhìn chung, chẩn đoán ChiVMV trên đồng

ruộng rất khó do triệu chứng biến động mạnh theo giống, giai đoạn sinh trƣởng và thời điểm

nhiễm bệnh của cây. Ngoài ra, cây ớt có thể bị nhiễm nhiều loại virus khác nhau dẫn tới triệu

chứng biểu hiện rất phức tạp.

Các nghiên cứu thực hiện bởi Trung tâm Rau Châu Á cho thấy ChiVMV cực kỳ phổ biến trên

ớt tại nhiều nƣớc Châu Á, đặc biệt tại Đông Nam Á.

Tại Việt Nam, ChiVMV là virus phổ biến nhất trên ớt. Hầu hết các mẫu ớt biểu hiện triệu

chứng bệnh virus đều nhiễm ChiVMV.

Một potyvirus thuộc một loài mới cũng đƣợc phát hiện tại Việt Nam và đƣợc đặt tên là Chilli

ringspot virus (ChiRSV) dựa trên triệu chứng. ChiRSV mới chỉ đƣợc phát hiện thấy trên 2 mẫu

ớt tại Tháp Chàm và Điện Biên Phủ và không phải là virus phổ biến.

Nhƣ vậy, trên cây ớt tại Việt Nam hiện có 3 potyvirus đã đƣợc phát hiện là ChiVMV,

ChiRSV và PVY, trong đó ChiVMV là virus phổ biến nhất.

Bảng 15-6 Các mẫu potyvirus trên ớt tại Việt Nam đƣợc giải trình tự

TT Isolate Mã GenBank Địa điểm

1 PVY-VN/C10 DQ925436 Đà Lạt

2 ChiVMV-VN/C1 DQ925440 Hà Nội

3 ChiVMV-VN/C2 DQ925441 Hà Nội

4 ChiVMV-VN/C3 DQ925442 Hà Nội

5 ChiVMV-VN/C4 DQ925443 Hà Nội

6 ChiVMV-VN/C5 DQ925444 Hồ Chí Minh

7 ChiVMV-VN/C6 DQ925446 Vĩnh Phúc

8 ChiVMV-VN/C7 DQ925445 Huế

9 ChiRSV-VN/C8 DQ925438 Ninh Thuận

10 ChiRSV-VN/C9 DQ925439 Điện Biên Phủ

Hình 15-18 Bệnh do ChiVMV trên ớt và thuốc lá

171

15.14 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 15

1. Đặc điểm họ Potyviridae (phân loại, hình thái, quan hệ vector, bản chất bộ gen)

2. Đặc điểm chi Potyvirus (hình thái, tổ chức bộ gen và tái sinh, chức năng protein HcPro, CI,

VPg, NIb, CP).

3. PRSV (tầm quan trọng, triệu chứng, lan truyền, phòng chống).

4. PVY (tầm quan trọng, triệu chứng, lan truyền, phòng chống).

5. BCMV (tầm quan trọng, triệu chứng, lan truyền, phòng chống).

6. Các giả thuyết có thể về nguồn gốc của ZYMV, BCMV, PVY, SCMV/SrMV

15.15 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH

1. Adams, M. J., Antoniw, J. F. & Beaudoin, F. (2005a). Overview and analysis of the

polyprotein cleavage sites in the family Potyviridae. Molecular Plant Pathology 6, 471-487.

2. Adams, M. J., Antoniw, J. F. & Fauquet, C. M. (2005b). Molecular criteria for genus and

species discrimination within the family Potyviridae. Archives of Virology 150, 459-479.

3. AVRDC. (1993). Vegetable Research and Development in Southeast Asia: The AVNET

Final Report.

4. Bateson, M. F., Lines, R. E., Revill, P., Chaleeprom, W., Ha, C. V., Gibbs, A. J. & Dale, J. L.

(2002). On the evolution and molecular epidemiology of the potyvirus Papaya ringspot virus.

Journal of General Virology 83, 2575-2585.

5. Berger, P. H., Adams, M. J., Barnett, O. W., Brunt, A. A., Hammond, J., Hill, J. H., Jordan,

R. L., Kashiwazaki, S., Rybicki, E., Spence, N., Stenger, D. C., Ohki, S. T., Uyeda, I., van

Jaayen, A., Valkonen, J. & Vetten, H. J. (2005). Potyviridae. In Virus Taxonomy VIIIth

report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Edited by C. M. Fauquet, M.

A. Mayo, J. Maniloff, U. Desselberger & L. A. Ball. London: Elsevier/Academic Press.

6. Berger, P. H., Wyatt, S. D., Shiel, P. J., Silbernagel, M. J., Druffel, K. & Mink, G. I. (1997).

Phylogenetic analysis of the Potyviridae with emphasis on legume-infecting potyviruses.

Archives of Virology 142, 1979-1999.

7. CABI (2006a). Bean common mosaic virus. Crop Protection Compendium CD ROM

8. CABI (2006b). Papaya ring spot virus. Crop Protection Compendium CD ROM

9. CABI (2006c). Potato virus Y. Crop Protection Compendium CD ROM

10. Chen, J., Chen, J. P. & Adams, M. J. (2002). Characterisation of potyviruses from sugarcane

and maize in China. Archives of Virology 147, 1237-1246.

11. Desbiez, C., Wipf-Scheibel, C. & Lecoq, H. (2002). Biological and serological variability,

evolution and molecular epidemiology of Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV, Potyvirus)

with special reference to Caribbean islands. Virus Res 85, 5-16.

21. Ha Viet Cuong, S. Coombs, P. A. Revill, R. M. Harding, M. Vu, J. L. Dale. (2008b). Design

and application of two novel degenerate primer pairs for the detection and complete genomic

characterization of potyviruses. Archives of virology. 153:25-36

172

22. Ha Viet Cuong, S. Coombs, P. A. Revill, R. M. Harding, M. Vu, J. L. Dale. (2008c).

Identification and sequence analysis of potyviruses infecting crops in Vietnam. Archives of

virology. 153:45-60

12. Hao, N. B., Albrechtsen, S. E. & Nicolaisen, M. (2003). Detection and identification of the

blackeye cowpea mosaic strain of Bean common mosaic virus in seeds of Vigna unguiculata

sspp. from North Vietnam. Australasian Plant Pathology 32, 505-509.

13. Kreuze, J. F., Karyeija, R. F., Gibson, R. W. & Valkonen, J. P. T. (2000). Comparisons of

coat protein gene sequences show that East African isolates of Sweet potato feathery mottle

virus form a genetically distinct group. Archives of Virology 145, 567-574.

14. Mink, G. I., Vetten, J., Ward, C. W., Berger, P. H., Morales, F., Myers, J. R., Silbernagel, M.

J. & Barnett, O. W. (1994). Taxonomy and Classification of Legume-Infecting Potyviruses -

a Proposal from the Potyviridae Study-Group of the Plant-Virus Subcommittee of ICTV.

Archives of Virology 39, 231-235.

15. Revill, P. A., Ha, C. V., Lines, R. E., Bell, K. E., Vu, M. T. & Dale, J. L. (2004). PCR and

ELISA-based virus surveys of banana, papaya and cucurbit crops in Vietnam. Asia Pacific

Journal of Molecular Biology and Biotechnology 12, 27-32.

16. Shukla, D. D., Ward, C. W., Brunt, A. A. & Berger, P. H. (1998). Potyviridae family.

Description of plant viruses No. 366. AAB (Association of Applied Biologists).

17. Tomimura, K., Spak, J., Katis, N., Jenner, C. E., Walsh, J. A., Gibbs, A. J. & Ohshima, K.

(2004). Comparisons of the genetic structure of populations of Turnip mosaic virus in West

and East Eurasia. Virology 330, 408-423.

18. Tsuneyoshi, T., Matsumi, T., Natsuaki, K. T. & Sumi, S. (1998). Nucleotide sequence

analysis of virus isolates indicates the presence of three potyvirus species in Allium plants.

Archives of Virology 143, 97-113.

19. van der Vlugt, R. A. A., Steffens, P., Cuperus, C., Barg, E., Lesemann, D. E., Bos, L. &

Vetten, H. J. (1999). Further evidence that shallot yellow stripe virus (SYSV) is a distinct

potyvirus and reidentification of Welsh onion yellow stripe virus as a SYSV strain.

Phytopathology 89, 148-155.

20. Van Dijk, P. (1993). Survey and Characterization of Potyviruses and Their Strains of Allium

Species. Neth J Plant Pathol 99, 1-48.

173

Chƣơng 16. VIRUS RNA SỢI ĐƠN CỰC ÂM: RHABDOVIRUS

16.1 TÓM TẮT NỘI DUNG

Chƣơng 16 mô tả phân loại và các đặc trƣng phân tử của họ Rhabdoviridae, đại diện cho

nhóm các virus RNA, sợi đơn, cực âm Chƣơng này cũng đề cập đến một virus gây bệnh vàng lụi

(vàng lá) lúa, một bệnh đã từng gây thành dịch ở miền Bắc trong những năm 70 và đang tái xuất

hiện trên lúa tại nhiều tỉnh miền Bắc.

16.2 HỌ RHABDOVIRIDAE

Tổng số loài rhabdovirus đƣợc công nhận bởi ICTV cho tới năm 2009 là 51. Các

rhabdovirus (họ Rhabdoviridae, bộ Mononegavirales) đƣợc phân loại chính thức vào 6 chi và

một số chƣa phân loại đến chi. ―Rhabdo‖ có nguồn gốc từ từ Hy Lạp ―rhabdos‖ có nghĩa là ―hình

gậy‖ ám chỉ phân tử virus có hình nhộng (gậy ngắn).

Các rhabdovirus gây hại thực vật chỉ thuộc 2 chi Nucleorhabdovirus và Cytorhabdovirus,

còn lại là các virus động vật.

Trong số các rhabdovirus hại động vật, Rabies virus (gây bệnh dại) là nguy hiểm nhất.

Trong số các rhabdovirus hại thực vật, Rice yellow stunt virus (RYSV) – chi Nucleorhabdovirus

gây bệnh vàng lụi lúa là virus quan trọng nhất.

Bảng 16-1. Phân loại họ Rhabdoviridae (bộ Monogavirales) theo ICTV (2009)

TT Chi Loài điển hình Ký chủ Số loài

1 Cytorhabdovirus Lettuce necrotic yellows virus Thực vật 9

2 Nucleorhabdovirus Potato yellow dwarf virus Thực vật 9

3 Vesiculovirus Vesicular stomatitis Indiana virus Động vật 10

4 Ephemerovirus Bovine ephemeral fever virus Động vật 3

5 Lyssavirus Rabies virus Động vật 11

6 Novirhabdovirus Infectious hematopoietic necrosis virus Động vật 4

7 Chưa phân loại Động vật 5

Tổng số 51

16.2.1 Hình thái, cấu trúc phân tử và tổ chức bộ gen

Các rhabdovirus là các virus có bộ gen RNA, sợi đơn, không phân mảnh, cực âm, kích

thƣớc 11-15 kb, chiếm khoảng 1-2% khối lƣợng phân tử virus.

Bộ gen virus chứa ít nhất 5 ORF không liên tục theo chiều từ đầu 3‘ – 5‘ (chú ý RNA của

virus là cực âm) theo thứ tự sau: 3‘-N-P-M-G-L-5‘. Các ORF đƣợc phiên mã thành mRNA và

dịch mã độc lập thành các protein cấu trúc sau:

N: protein nucleoprotein. Bên trong tế bào, N đóng vai trò cân bằng giữa quá trình phiên mã

các gen virus và tái sinh bộ gen virus do tác động đến sự nhận biết các dấu hiệu phiên mã.

L: protein lớn (large protein). L là một RdRp.

M : protein tạo protein nền (matrix protein). M còn đƣợc ký hiệu là M1. M đóng vai trò điều

khiển quá trình phiên mã của virus, ức chế phiên mã của ký chủ, ảnh hƣởng đến sự gây bệnh.

174

P: protein đƣợc phosphryl hóa (phosphorylated protein). P còn đƣợc ký hiệu là M2. P là một

cofactor của protein L và do đó cần thiết cho quá trình tái sinh của virus.

G: protein đƣợc glycosyl hóa (glycosylated protein). G lắp ráp thành trimer để tạo thành gai

vỏ. Có chức năng quan trọng trong xâm nhập tế bào, tƣơng tác với vector.

Ngoài ra, ở đầu 3‘ và 5‘ của bộ gen virus có lần lƣợt 2 chuỗi leader và trailer.

Các rhabdovirus nhìn chung có cấu trúc phân tử phức tạp, thuộc nhóm có vỏ bọc. Phần lớn

các rhabdovirus có hình con nhộng nhƣng một số có hình viên đạn (hình nhộng nhƣng với một

đầu phẳng hơn). Các rhabdovirus có kích thƣớc khá lớn, dài 100 – 430 nm và đƣờng kính 40 –

100 nm.

Về cấu trúc chi tiết, các phân tử protein N liên kết chặt với phân tử RNA genome theo kiểu

đối xứng xoắn để tạo thành phân tử ribonucleoprotein (RNP). Phân tử RNP lại liên kết với

protein L và P để tạo thành phức hợp nucleocapsid. Phức hợp này ngập trong một lớp protein

nền đƣợc cấu tạo bởi protein M. Toàn bộ cấu trúc trên lại đƣợc bao bọc bởi một lớp màng kép

lypid chứa các gai vỏ nhô lên bề mặt và đƣợc cấu tạo bởi các protein G (glycoprotein). Mỗi một

gai vỏ là một trimer gồm 3 phân tử protein G lắp ráp thành.

Hình 16-1 Cấu tạo và tổ chức bộ gen của rhabdovirus hại thực vật

16.2.2 Quá trình tái sinh của virus

Các rhabdovirus thực vật xâm nhập vào tế bào ký chủ thực vật nhờ vector côn trùng (một số

có thể qua tổn thƣơng cơ học) còn các rhabdovirus động vật xâm nhập vào tế bào theo hình thức

nhập bào (endocytosis). Ngay sau khi xâm nhập vào tế bào, virus sẽ thực hiện quá trình tái sinh.

Quá trình tái sinh của các rhabdovirus về cơ bản giống nhau gồm 2 pha sớm và pha muộn. Tuy

nhiên vị trí của quá trình này có khác nhau : các rhabdovirus động vật và cytorhabdovirus thực

vật thực hiện quá trình tái sinh tại tế bào chất còn của nucleorhabdovirus thực vật lại thực hiện

quá trình này trong nhân.

Quá rình tái sinh của nucleorhabdovirus hại thực vật đƣợc thực hiện qua các bƣớc sau:

175

1. Ngay sau khi xâm nhập vào tế bào, phân tử virus gắn vào mạng lƣới nội chất và giải phóng

phức hợp nucleocapsid (gồm RNA-N-L-P) vào tế bào chất.

2. Phức hợp nucleocapsid xâm nhập nhân tế bào nhờ các dấu hiệu nhập nhân NLS có mặt ở

phân tử N, L và P.

3. Tại nhân tế bào, quá trình phiên mã sơ cấp (pha sớm) xảy ra : protein L của virus (là một

RdRp) phiên mã các mRNA của các protein sớm (N, L, P) của virus trên khuôn RNA virus.

Các mRNA này đƣợc vận chuyển ra tế bào chất để dịch mã thành các protein N, L, P.

4. Tiếp theo, các protein N, L, P lại đƣợc vận chuyển trở lại nhân và bắt đầu quá trình phiên mã

thứ cấp (pha muộn) tổng hợp tất cả các mRNA của virus cũng nhƣ bắt đầu quá trình tái bản

bộ gen (tổng hợp RNA sợi (+) => làm khuôn để tổng hợp sợi (-) là sợi virus ; bản thân sợi (-)

lại làm khuôn để tổng hợp mRNA virus).

5. Tại màng trong của nhân, các protein virus cảm ứng để hình thành cấu trúc viroplasms chứa

protein N, P, L của virus. Viroplasm là nơi thực hiện quá trình tái sinh và lắp ráp các thành

phần virus.

6. Vào giai đoạn cuối của quá trình tái sinh, protein M sẽ liên kết và gấp xoắn các phân tử

nucleocapsid (RNA-N-P-L) mới đƣợc lắp ráp. Phức hợp nucleocapsid-M sẽ nảy chồi qua

màng trong của nhân để hình thành phân tử virus hoàn chỉnh và tụ tập tại vùng ngoại vi của

nhân (khoảng không giữa màng trong và màng ngoài của nhân)

16.3 RICE YELLOW STUNT VIRUS (RYSV)

16.3.1 Giới thiệu

Bệnh vàng lùn ―rice yellow stunt disease‖ hay còn đƣợc gọi là bệnh vàng tạm thời ―rice

transitory yellowing disease‖ đã đƣợc phát hiện thấy tại nhiều nƣớc trồng lúa thuộc khu vực châu

Á và Đông Nam Á từ những năm 60. Tại Việt Nam, bệnh vàng tạm thời còn đƣợc dịch là bệnh

vàng lá di động.

Hai mẫu virus đƣợc gọi là Rice yellow stunt virus (RYSV) gây bệnh vàng lùn và Rice

transitory yellowing virus (RTYV) gây bệnh vàng tạm thời đã đƣợc giải trình tự toàn bộ bộ gen.

So sánh trình tự của 2 virus này đã chứng tỏ chúng chỉ là thành viên của cùng 1 loài (Hiraguri et

al., 2009). Vì vậy chúng ta sẽ sử dụng tên RYSV để chỉ tác nhân gây bệnh.

Tại Trung Quốc, bệnh vàng lùn đã gây thành dịch tại nhiều tỉnh phía Nam trong những năm

60 và 70 nhƣ Đài Loan (1960 – 1962, 1973 – 1980), Quảng Đông (1964-1966, 1979), Phúc Kiến

(1966, 1969, 1973), Chiết Giang (1970 – 1973). Tại Việt Nam, trong cùng thời gian, 1 bệnh

biến vàng trên lúa gọi là bệnh “vàng lụi‖ do rầy xanh đuôi đen truyền đã gây thành dịch tại

nhiều tỉnh phía Bắc, đặc biệt tại các tỉnh miền núi.

Mặc dù mẫu bệnh vàng lụi của Việt Nam không đƣợc lƣu giữ nhƣng đối chiếu bệnh vàng lùn

của Trung Quốc và bệnh vàng lụi của Việt Nam thấy có nhiều điểm tƣơng đồng nhƣ: (i) triệu

chứng giống nhau, (ii) sự xuất hiện các vụ dịch cùng thời gian, tại các khu vực gần gũi về mặt

địa lý, (iii) cùng vector rầy xanh đuôi đen, (iv) sự có mặt của 1virus hình viên đạn trên mẫu bệnh

Việt Nam

Trong các năm 2009, 2010, một bệnh vàng lá lúa đã gây thành dịch nghiêm trọng tại một số

địa phƣơng miền Bắc nhƣ Hà Tây, Bắc Giang. Kiểm tra bằng RT-PCR và giải trình tự cho thấy

tác nhân gây bệnh là RYSV.

176

16.3.2 Virus

RYSV có hình viên đạn, dài 180–210 nm, đƣờng kính 94 nm. Virus có bộ gen RNA sợi đơn,

cực âm, không phân mảnh, kích thƣớc ~ 14 kb.

Virus có 1 chuỗi nucleotide khoảng 203 nucleotide gọi là leader ở đầu 3‘, một chuỗi 181

nucleotide gọi là trailer ở đầu 5‘. Virus mã hóa 7 protein, theo thứ tự từ trái sang phải là N-P-3-

M-G-6-L. Tuy nhiên chỉ có 5 protein cấu trúc có mặt ở phân tử virus là N, P, M, G, L (giống nhƣ

ở các rhabdovirus khác).

Hình 16-2 Sơ đồ tổ chức bộ gen của RYSV

16.3.3 Triệu chứng bệnh

Lá biến vàng, đẻ nhánh giảm, cây lùn.

Hai đến ba tuần sau cấy, cây bệnh điển hình có 1 – 2 lá phía dƣới bị biến vàng sau

chuyển màu vàng sáng hoặc vàng cam. Cuối cùng, các lá này trở nên nhăn, héo.

Trên giống mẫn cảm, cây bị lùn và đẻ nhánh giảm mạnh, trỗ bông giảm hoặc không trỗ.

Cây nhiễm sớm biểu hiện triệu chứng rõ nhƣng cây nhiễm muộn có thể không biểu hiện

triệu chứng. Trƣờng hợp nặng, cây có thể chết trƣớc khi trỗ.

Trong điều kiện nhà kính, cây bệnh biểu hiện khả năng phục hồi triệu chứng tốt hơn

ngoài đồng ruộng. Sau khi biểu hiện triệu chứng vàng lá điển hình thì cây bệnh dần phục

hồi thậm chí không biểu hiện triệu chứng. Thông thƣờng, các dảnh ―trông bình thƣờng‖

có thể hình thành từ 1 cây bị bệnh. Vì lý do này nên bệnh mới đƣợc đặt tên là ―biến vàng

tạm thời – transitory yellowing‖.

Hinh 16-3 Bệnh vàng lụi lúa tại miền Bắc năm 2010 do RYSV

16.3.4 Lan truyền

Virus RYSV thuộc nhóm gây hại ở bó mạch phloem. Trong tế bào nhiễm bệnh, các phân tử

virus tập trung ở ngoại vi nhân (giữa màng trong và màng ngoài nhân).

Ký chủ thực vật tự nhiên duy nhất của virus là lúa. Sau khi thu hoạch, virus tồn tại trên lúa

chét hoặc trong vector rầy xanh.

RYSV -AB011257, kích thước 14042 nucleotides

N P 3 M G 6 L Trailer Leader

3’ 5’

177

RYSV lan truyền theo kiểu bền vững tái sinh (nhân lên trong vector), mặc dù không truyền

qua trứng, bằng 3 loài rầy xanh trên lúa là: Nephotettix nigropictus, N. cincticeps và N. virescens

Thí nghiệm so sánh hiệu quả truyền của 3 loài rầy (Inoue, 1978) cho thấy:

Hiệu quả truyền bệnh cao nhất là của N. nigropictus, tiếp theo là N. cincticeps và thấp nhất là

của N. virescens. Thí nghiệm của các tác giả khác cũng cho kết quả tƣơng tự.

Nhìn chung, đối với rầy N. nigropictus, hiệu quả truyền của rầy đực cao hơn rầy cái; còn đối

với 2 loài rầy còn lại thì không có sự khác biệt đáng kể.

Theo Chiu et al. (1965), Chiu & Jane (1967), khi nghiên cứu cả 3 loài:

Khoảng 41 – 62 % cá thể rầy có khả năng truyền virus

Thời gian chích nạp của đa số (>50%) rầy là 1 vài giờ. Nếu tăng thời gian chích nạp lên 1

ngày thì 90 % rầy có khả năng truyền. Thời kỳ ẩn trong vector 3 – 34 ngày nhƣng thƣờng 9 –

16 ngày.

Thời gian chích nạp thay đổi từ 5 - 10 phút, 5 – 10 giờ, 24 giờ sẽ làm tăng tƣơng ứng hiệu quả truyền từ 28 %, 45 %, 88 %.

Thời kỳ ủ bệnh trong cây 2 – 4 tuần

Nghiên cứu với rầy N. nigropictus, Hsieh (1969) cho biết:

Nhiệt độ < 16 oC hoặc > 38 oC, rầy không có khả năng truyền virus

Trong khoảng nhiệt độ 20 – 36 oC, nhiệt độ càng cao thì thời gian ẩn càng rút ngắn.

Theo Chen (1979), Chen & Chiu (1980):

Cho rầy chích nạp trên lá biến vàng hay trên giống mẫn cảm thì hiệu quả truyền tƣơng ứng là

28.8 % và 34.4 %. Còn khi cho rầy chích nạp trên lá đã phục hồi hoặc trên giống kháng thì hiệu quả truyền chỉ tƣơng ứng 3.3 % và 9%.

Rầy đực và rầy cám có khả năng truyền virus hiệu quả hơn rầy cái.

Mỗi rầy mang virus có thể truyền bệnh cho 3 cây lúa/ ngày

Khi nhiễm virus, rầy có khả năng truyền cả đời.

Virus ảnh hƣởng bất lợi đến rầy: làm rầy cám có thể chết trƣớc khi khi trƣởng thành, giảm số trứng đẻ, rút ngắn vòng đời

Bảng 16-2 So sánh khả năng truyền RYSV của 3 loài rầy xanh trên lúa

Chỉ tiêu Tham khảo N. nigropictus N. cincticeps N. virescens

Hiệu quả truyền (%) Inoue (1978) 35 - 75 27 - 59 0 - 5

Chiu et al. 1968) 41 - 65 25 - 36 47

Thời giân ẩn (ngày)

Inoue (1978) 7 - 17 7 - 22 17 -25

Chiu et al. 1968) 9 - 16 25 - 34

Hsieh (1970) 4 - 20 4 - 20

Thời gian tồn tại khả nhiễm (ngày) Inoue (1978) 30 28 10

Ghi chú: các số liệu của Chiu et al. và Hsieh được dẫn theo Ou (1985).

16.3.5 Phòng trừ

Biện pháp phòng trừ hiện tại:

178

Bảo vệ mạ, đặc biệt vụ mùa

Điều tra ruộng thƣờng xuyên, nhổ bỏ cây bệnh

Kiểm soát vector rầy xanh đuôi đen

Chọn tạo giống kháng rầy, kháng virus

16.4 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 16

1. Đặc điểm họ Rhabdoviridae (phân loại, hình thái, quan hệ vector, bản chất bộ gen). So

sánh điểm khác biệt cơ bản của các rhabdovirus thực vật với các virus thực vật và động

vật khác

2. RYSV (tầm quan trọng, triệu chứng, đặc điểm bộ gen, lan truyền, phòng chống).

16.5 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH

1. Hà Viết Cƣờng, Lê Văn Hải và Vũ Triệu Mân (2010). Xác định tác nhân gây bệnh vàng

lá lúa tại tỉnh Bắc Giang vụ mùa năm 2010. Tạp chí BVTV. Số 4: 8-12.

2. Hull, R. (2002). Matthews's Plant Virology. Fourth edition: Academic Press.

3. Hibino, H. (1996). Biology and epidemiology of rice viruses. Annual Review of

Phytopathology 34, 249-274.

4. Hiraguri, A., Hibino, H., Hayashi, Shimizu, T.T., Uehara-Ichiki, T., Omura, T. & Sasaya, T. (2009). Complete sequence analysis of rice transitory yellowing virus and its comparison to rice yellow stunt virus. Archives of Virology. 155:243–245

5. Inoue, H. (1978). Transmission efficiency of rice transitory yellowing virus by the green plant hoppers, Nephotettix spp. (Hemiptera: Cicadellidae). Applied Entomology and

Zoology. 14:123-126

6. Jackson, A. O., Dietzgen, R. G., Goodin, M. M., Bragg, J. N. & Deng, M. (2005).

Biology of Plant Rhabdoviruses. Annual Review of Phytopathology 43, 623–660.

7. Ou, S.H. (1985). Rice Diseases. Second Edition, p. 23-25 & 48-49. Commonwealth Mycological Institute Publication. Kew, Surrey, UK.

8. Shikata, E. & Chen, M.J. (1969) Electron microscopy of rice transitory yellowing virus. Journal of Virology. 3:261–264

9. Shikata, E. (1972). Rice transitory yellowing virus. Description of Plant Viruses. CMI/AAB No 100.

179

Chƣơng 17. VIRUS RNA SỢI ĐƠN CỰC ÂM (TIẾP): TOSPOVIRUS

17.1 TÓM TẮT NỘI DUNG

Chƣơng 17 mô tả phân loại và các đặc trƣng phân tử của họ Bunyaviridae, đại diện cho nhóm

các virus RNA, sợi đơn, cực âm và lƣỡng cực. Chƣơng này cũng đề cập đến một virus gây hại

phổ biến trên nhiều loài cây khắp thế giới là TSWV (tomato spotted wilt virus).

17.2 HỌ BUNYAVIRIDAE

Họ này gồm 95 loài đƣợc phân loại vào 5 chi trong đó 4 chi hại động vật và chỉ có 1 chi hại

thực vật là Tospovirus. Các bunyavirus hại động vật (ví dụ Hantaan virus gây bệnh sốt xuất

huyết Hataan) đều lan truyền qua vector côn trùng.

Các bunyavirus có virion hình khối đa diện, kích thƣớc 80 – 120 nm. Phân tử virus có vỏ

bọc. Vỏ có mấu nhỏ cấu tạo bằng glycoprotein. Bộ gen virus gồm 3 phân tử RNA sợi đơn cực (-)

hoặc lƣỡng cực lý hiệu là L (large), M (medium) và S (small) có tổng kích thƣớc từ 11 – 19 kb.

Tất cả 3 phân tử đều đƣợc lắp ráp trong 1 phân tử virus. Các nucleotide ở 2 đầu của mỗi phân tử

RNA bảo thủ trong mỗi chi nhƣng khác nhau giữa các chi. Trình tự ở các đầu này bổ sung nhau

nên có thể bắt cặp với nhau tạo phân tử RNA mạch vòng giả.

Bảng 17-1. Phân loại họ Bunyaviridae theo ICTV (2009)

TT Chi Loài điển hình Ký chủ Số loài

1 Hantavirus Hantaan virus Động vật 23

2 Nairovirus Dugbe virus Động vật 7

3 Orthobunyavirus Bunyamwera virus Động vật 48

4 Phlebovirus Rift Valley fever virus Động vật 9

5 Tospovirus Tomato spotted wilt virus Thực vật 8

Tổng số 95

17.3 CHI TOSPOVIRUS

Hiện có khoảng 8 tospovirus hại thực vật đã đƣợc ghi nhận, trong đó virus điển hình và có ý

nghĩa kinh tế là Tomato spotted wilt virus (TSWV).

Các tospovirus đều lan truyền ngoài từ nhiên nhờ bọ trĩ theo kiểu bền vững tái sinh.

Các tospovirus hại thực vật có hình thái phân tử và tổ chức bộ gen giống các bunyavirus khác

hại động vật. Chúng có phân tử hình cầu, kích thƣớc từ 80 – 120 nm. Phân tử có vỏ bọc, vỏ có

mấu nhỏ cấu tạo bằng glycoprotein nhô lên trên bề mặt. Tất cả các tospovirus có bộ gen phân

mảnh gồm 3 phân tử RNA sợi đơn cực (-) hoặc lƣỡng cực ký hiệu là L (large), M (medium) và S

(small) có tổng kích thƣớc từ 11 – 19 kb. Tất cả 3 phân tử đều đƣợc lắp ráp trong 1 phân tử virus.

180

Các nucleotides ở 2 đầu của mỗi phân tử RNA bảo thủ trong mỗi chi nhƣng khác nhau giữa

các chi. Trình tự ở các đầu này có thể bắt cặp với nhau tạo phân tử RNA mạch vòng giả.

17.4 TOMATO SPOTTED WILT VIRUS (TSWV)

17.4.1 Tầm quan trọng

Tomato spotted wilt virus (TSWV) (virus đốm héo cà chua) là virus quan trọng nhất của chi

Tospovirus.

TSWV phân bố khắp thế giới và là virus thực vật có phổ ký chủ lớn nhất, nhiễm hơn 940 loài

cây thuộc 8 họ cây một lá mầm và 90 họ cây hai lá mầm.

TSWV gây thiệt đáng kể trên một loạt các cây trồng quan trọng nhƣ lạc, đậu đỗ, khoai lang,

thuốc lá, đu đủ, cà chua, ớt và nhiều cây cảnh.

17.4.2 Virus

17.4.2.1 Hình thái

Virion có hình khối đa diện (hình cầu), kích thƣớc từ 80 – 120 nm. Phân tử có vỏ bọc. Vỏ có

mấu nhỏ cấu tạo bằng glycoprotein (kích thƣớc 5-10 nm), phần cuống mấu nằm chìm trong một

lớp màng kép lipid (dày khoảng 5 nm) có nguồn gốc từ màng tế bào ký chủ (vector hoặc cây).

Bên trong lớp vỏ là lõi virus gồm 3 phân tử RNA dạng mạch vòng giả do 2 đầu của mỗi phân

tử có thể tự bắt cặp. Các phân tử RNA genome này liên kết với các phân tử protein N

(nucleoprotein). Các phân tử RNA genome liên kết protein N này đƣợc gọi là các phân tử RNP

(Ribonucleocapsid). Ngoài ra phần lõi phân tử virus cũng chứa một số lƣợng nhỏ protein L (là

RdRp của virus).

Cần chú ý là các phân tử ribonucleocapsid này có khả năng xâm nhiễm nếu đƣợc đƣa vào tế

bào. Trái lại chỉ các phân tử virion nguyên vẹn (có vỏ bọc và mấu) mới có khả năng truyền qua

vector bọ trĩ.

Phân tử virus chứa khoảng 65% protein, 20% lipid, 7% carbohydrate và 5% RNA.

Hình 17-1 Hình thái và cấu trúc phân tử TSWV

181

17.4.3 Tổ chức bộ gen và tái sinh

Tổ chức bộ gen của TSWV giống nhƣ của các tospovirus khác gồm 3 phân tử RNA sợi đơn

cực (-) hoặc lƣỡng cực ký hiệu là L (large), M (medium) và S (small) có tổng kích thƣớc ~ 17

kb, cụ thể là:

Sợi L: 8897 nucleotides, có cực (-), chứa 1 ORF lớn, mã hóa protein L trên sợi đối virus

Sợi M: 4821 nucleotides, lƣỡng cực, chứa 2 ORF mã hóa 3 protein là NSm trên sợi virus

và Gc (G2) và Gn (G1) trên sợi đối virus. NSm là viết tắt của ―Non-structural protein on

M segment‖ có nghĩa là protein phi cấu trúc đƣợc mã hóa trên sợi M.

Sợi S: 2916 nucleotides, lƣỡng cực, chứa 2 ORF mã hóa 2 protein là NSs trên sợi virus

và N trên sợi đối virus. NSm là viết tắt của ―Non-structural protein on S segment‖ có

nghĩa là protein phi cấu trúc đƣợc mã hóa trên sợi S.

Tất cả 3 phân tử RNA genome đều đƣợc lắp ráp trong 1 phân tử virus.

Hai đầu của mỗi phân tử RNA genome có trình tự bổ sung khoảng 65 – 70 nucleotides dẫn tới

chúng có thể tự bắt cặp từ đầu mút 5‘ và 3‘ trông giống ―cán chảo‖. Hậu quả mặc dù các phân tử

genome là mạch thẳng nhƣng chúng tạo cấu trúc dạng ―vòng giả‖. Tám nucleotides ở đầu mút 5‘

và 3‘ của trình tự bổ sung này bảo thủ ở cả 3 phân tử. Đây là một đặc điểm giống nhau của các

virus có bộ gen RNA sợi âm, phân đoạn ở nhiều họ khác nhƣ tenuivirus, reovirus.

Hình 17-2 Sơ đồ quá trình tái sinh của TSWV

17.4.4 Chức năng protein

Phân tử virus (virion) của TSWV và các tospovirus có 4 protein cấu trúc là G1, G2, N và L.

G1 và G2 là các protein liên kết với đƣờng nên còn gọi là glycoprotein hình thành nên các gai

mấu trên bề mặt phân tử virus. G1 và G2 cũng đƣợc ký hiệu Gn hoặc Gc tùy thuộc vị trí của nó ở

đầu amin hay đầu carboxyl của chuỗi polyprotein trên sợi RNA M. Các glycoprotein này có vai

trò quan trọng trong lan truyền qua vector bọ trĩ: chúng liên kết với các receptor bề mặt của ruột

giữa bọ trĩ

182

Protein N là các nucleoprotein đƣợc mã hóa trên sợi RNA S. Protein N sẽ liên kết với các sợi

RNA của virus để tạo thành các phân tử nucleocapsid.

Protein L là một protein có kích thƣớc lớn (L= large) và đƣợc mã hóa trên sợi RNA L. Protein

L là một RdRp của virus chịu trách nhiệm tái bản RNA và phiên mã tạo mRNA. Protein L có

mặt ở phần lõi (bên trong virion), nhƣng số lƣợng ít hơn nhiều so với protein N.

Virus cũng mã hóa 2 protein phi cấu trúc là NSm đƣợc mã hóa trên sợi RNA M và NSs đƣợc

mã hóa trên sợi RNA S. NSm có vai trò trong di chuyển giữa các tế bào của phân tử virus qua

sợi liên bào (kích thƣớc các tospovirus quá lớn để có thể di chuyển tự do qua sợi liên bào). NSs

có chức năng ức chế phản ứng phòng thủ của tế bào ký chủ qua cơ chế câm gen.

17.4.5 Triệu chứng

TSWV gây ra nhiều triệu chứng khác nhau. Các triệu chứng này thay đổi theo giống cây ký

chủ, trạng thái sinh lý cây ký chủ (tuổi, điều kiện dinh dƣỡng và môi trƣờng). Các chủng virus

không khác nhau nhiều về đặc tính gây bệnh mà chủ yếu khác nhau về đặc trƣng phân tử và

huyết thanh học. Nhìn chung, triệu chứng ít có giá trị chẩn đoán bệnh do TSWV và các

tospovirus khác.

Trên cà chua. Các triêu chứng chính là: các đốm hoặc sọc chết hoại trên lá, cuống lá, thân,

đỉnh sinh trƣởng; lá nhăn, hóa màu nâu đồng thau; cây nhỏ và còi cọc. Trên quả, hàm lƣợng

carotene và sắc tố giảm; quả chín có các đốm màu vàng hoặc đỏ nhạt (đốm ma). Đôi khi, triệu

chứng chỉ thấy trên quả.

Trên ớt (ngọt). Triệu chứng chủ yếu là cây còi cọc và biến vàng. Lá có thể có đốm chết hoại,

đốm vòng, hoặc khảm. Trên thân có các sọc chết hoại kéo tới chồi đỉnh. Trên quả chín có các

đốm vòng đồng tâm hoặc các sọc chết hoại.

Hình 17-3 Một số bệnh do TSWV gây ra trên cà chua, thuốc lá và lạc

183

17.4.6 Lan truyền

TSWV lan truyền ngoài tự nhiên bằng nhiều loài bọ trĩ thuộc 2 chi Frankliniella và Thrips (họ

Thripidae, bộ Thysanoptera) theo kiểu bền vững tái sinh. Tám loài bọ trĩ đƣợc biết là vector của

TSWV bao gồm Frankliniella occidentalis, F. fusca (bọ trĩ thuốc lá), F. intonsa (bọ trĩ hoa), F.

schultzei (bọ trĩ bông), F. bispinosa, Thrips palmi (bọ trĩ dƣa), Thrips tabaci (bọ trĩ hành) và T.

setosus. Trong số các loài này, F. occidentalis có thể đƣợc coi là vector quan trọng nhất. Từ năm

1980, sự phát tán nhanh chóng của loài bọ trĩ này khắp thế giới đã tạo điều kiện để virus phân bố

rộng hơn.

TSWV truyền bằng bọ trĩ theo kiểu bền vững tái sinh khá đặc biệt. Chỉ bọ trĩ non tuổi 1 và

tuổi 2 mới có thể chích nạp virus và chỉ giai đoạn tuổi 2 và trƣởng thành mới có khả năng truyền

virus. Đối với F. occidentalis, thời gian chích nạp và chích truyền khoảng 60 phút và thời gian

ẩn trung bình 3 – 7 ngày. Virus duy trì khả năng lây nhiễm cả đời nhƣng chƣa có bằng chứng

cho thấy virus truyền qua trứng.

Cả 2 loại protein bề mặt là Gn và Gc đều cần cho sự lan truyền của virus qua vector, trong đó

Gc giúp virus bám vào thành ruột trong qua trình chích nạp.

TSWV không truyền qua hạt giống.

17.4.7 Phòng chống

Biện pháp phòng chống TSWV hiện nay là kết hợp 3 biện pháp:

1. Phòng chống vector bọ trĩ. Tuy nhiên vì bọ trĩ hiện đã kháng hầu hết các loại thuốc trừ

sâu nên việc phòng chống vector bọ trĩ cực kỳ khó.

2. Phòng chống cỏ dại. Do TSWV có phổ ký chủ cực kỳ lớn nên cỏ dại cũng là nguồn

bệnh rất quan trọng.

3. Sử dụng giống kháng. Hiện nay, chỉ có một số ít gen kháng TSWV đã đƣợc xác định, ví

dụ gen SW5. Ngoài ra, dùng giống kháng mang gen kháng từ virus nhƣ vùng mã hóa và

không mã hóa của gen N và NSm cũng đang đƣợc thử nghiệm.

17.5 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 17

1. Đặc điểm virus họ Bunyaviridae (phân loại, hình thái, bản chất bộ gen). So sánh điểm khác

biệt cơ bản của các tospovirus với các virus thực vật và động vật khác

2. TSWV (tầm quan trọng, triệu chứng, đặc điểm bộ gen, lan truyền, phòng chống).

17.6 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH

1. Hull, R. (2002). Matthews's Plant Virology. Fourth edition: Academic Press.

2. Moritz, G., Kumm, S. & Mound, a. (2004a). Tospovirus transmission depends on thrips ontogeny. Virus Research 100 143–149.

3. Moritz, G., Kumma, S. & Moundb, L. (2004b). Tospovirus transmission depends on thrips

ontogeny. Virus Research 100, 143–149.

4. Rosello, S., Diez, M. J. & Nuez, F. (1996). Viral diseases causing the greatest economic losses tomato crop. I. The Tomato spotted wilt virus. Scientia Horticuhurae 67 117- 150.

5. Whitfield, A. E., Ullman, D. E. & German, T. L. (2005). Tospovirus-Thrips Interactions.

Annual Review of Phytopathology 43, 459–489.

184

Chƣơng 18. CÁC VIRUS RNA SỢI KÉP: HỌ REOVIRIDAE

18.1 TÓM TẮT NỘI DUNG

Chƣơng 18 mô tả phân loại và các đặc trƣng phân tử của họ Reoviridae, đại diện cho nhóm

các virus RNA sợi kép, có bộ gen phân đoạn, cùng đƣợc lắp ráp trong một virion. Chƣơng này

cũng đề cập đến 2 reovirus rất quan trọng đối với sản xuất lúa của Việt Nam là RRSV (Rice

ragged stunt virus) và SRBSDV (Southern rice black streaked dwarf virus).

18.2 HỌ REOVIRIDAE

18.2.1 Phân loại

Các virus thuộc họ Reoviridae (đƣợc gọi chung là các reovirus) là một nhóm các virus rất đa

dạng về ký chủ. Trong số 15 chi virus thì tới 11 chi hại động vật, 1 chi hại nấm và 3 chi hại thực

vật là Phytoreovirus, Oryzaevirus và Fijivirus. Các reovirus hại thực vật đều gây hại cây một lá

mầm, phần lớn họ hòa thảo, đặc biệt lúa. Chúng đều lan truyền ngoài tự nhiên bằng rầy theo kiểu

bền vững tái sinh. Nhiều reovirus hại thực vật là các virus quan trọng trên lúa, chẳng hạn ở Việt

Nam là virus lùn xoắn lá (RRSV) và virus lùn sọc đen phƣơng Nam (SRBSDV) gây bệnh lúa lùn

sọc đen mới đƣợc phát hiện năm 2009 ở miền Bắc.

Cho tới 2009, đã có 84 reovirus đƣợc ghi nhận trên thế giới, trong đó có 14 virus hại thực

vật thuộc các chi Fijivirus, Phytoreovirus và Oryzaevirus (Bảng 18-1)

Bảng 18-1 Phân loại họ Reoviridae (các reovirus đƣợc ghi nhận đến 2009)

TT Chi Loài chuẩn (gạch chân) Ký chủ Số loài

1 Cardoreovirus Eriocheir sinensis reovirus Động vật (biển) 1

2 Mimoreovirus Micromonas pusilla reovirus Động vật (biển) 1

3 Orbivirus Bluetongue virus Động vật 22

4 Rotavirus Rotavirus A Động vật 5

5 Seadornavirus Banna virus Động vật 3

6 Aquareovirus Aquareovirus A Động vật biển 7

7 Coltivirus Colorado tick fever virus Động vật 2

8 Cypovirus Cypovirus 1 Động vật (côn trùng) 16

9 Dinovernavirus Aedes pseudoscutellaris reovirus

10 Idnoreovirus Idnoreovirus - 1 Động vật (cô trùng) 5

11 Mycoreovirus Mycoreovirus 1 Nấm 3

12 Orthoreovirus Mammalian orthoreovirus Động vật 5

13 Phytoreovirus

Wound tumor virus,

Rice dwarf virus,

Rice gall dwarf virus Thực vật 3

14 Fijivirus

Fiji disease virus

Garlic dwarf virus

Maize rough dwarf virus

Mal de Rio Cuarto virus

Nilaparvata lugens reovirus

Oat sterile dwarf virus Pangola stunt virus

Rice black streaked dwarf virus

Southern rice black streaked virus

Thực vật 9

15 Oryzavirus Rice ragged stunt virus,

Echinochloa ragged stunt virus Thực vật 2

185

18.2.2 Hình thái

Virion của các reovirus đều có hình cầu đa diện đối xứng (icosahedral), kích thƣớc từ 60 –

80 nm. Lớp vỏ protein đƣợc cấu tạo thành 1, 2 hoặc 3 lớp đồng tâm. Dựa vào cấu trúc lớp vỏ,

các reovirus đƣợc chia làm 2 nhóm (Hình):

(i) Có gai tƣơng đối lớn (spike) trên trên bề mặt (ví dụ chi Fijivirus, Oryzavirus, Cypovirus,

Orthoreovirus, Aquareovirus, Idnoreovirus và Mycoreovirus)

(ii) Không có gai (ví dụ chi Phytoreovirus, Rotavirus, Orbivirus, Coltivirus và

Seadornavirus)

Hình 18-1 Cấu trúc của một số reovirus đại diện

18.2.3 Tổ chức bộ gen

Các reovirus là các virus RNA có bộ gen phân đoạn gồm là 10 – 12 phân tử RNA sợi kép

mạch thẳng. Tất cả các phân tử RNA này đều đƣợc lắp ráp trong một virion. Đầu 5‘ của sợi (+)

của mỗi phân tử RNA sợi kép đƣợc mũ hóa (Cap). RNA virus thiếu một chuỗi polyadenine ở đầu

3‘.

18.2.4 Protein

Virion chứa ít nhất 3 protein có hoạt tính enzyme liên quan đến tổng hợp RNA và tạo mũ:

RNA dependent RNA polymerase (RdRp) với vai trò kép: là 1 enzyme phiên mã

(transcriptase) tổng hợp sợi (+) = mRNA trên khuôn RNA sợi kép hoặc là 1 enzyme

tái sinh (replicase) tổng hợp sợi (-) trên khuôn sợi (+)

Transmethylase: tạo mũ (cap) đầu 5‘ của RNA

Helicase: tháo xoắn phân tử RNA sợi kép

Virion chứa ít nhất 3 protein chính liên quan đến cấu tạo vỏ protein (major capsid proteins)

Virion cũng chứa một số protein phụ với chức năng chƣa rõ.

Các protein có kích thƣớc 15 – 155 kDa và chiếm 80-85% khối lƣợng virion

186

18.3 RICE RAGGED STUNT VIRUS (RRSV)

18.3.1 Tầm quan trọng

RRSV (chi Oryzavirus) gây bệnh lúa lùn xoắn lá hại ở khắp các nƣớc trồng lúa châu Á, đặc

biệt vùng Đông Nam Á. Tƣơng tự bệnh lúa cỏ, trong những năm 70, bệnh lùn xoắn lá đã gây ra

nhiều vụ dịch tại một số nƣớc nhƣ Indonesia, Philippin, Ấn Độ.

Hiện nay, bệnh ―lùn xoắn lá‖ do RRSV, cùng với bệnh lúa cỏ do RGSV, đang là một trong

hai bệnh virus nguy hiểm và phổ biến nhất trên lúa ở miền Nam Việt Nam. Bệnh cũng đã xuất

hiện ở Miền Bắc năm 2009.

18.3.2 Hình thái phân tử

RRSV có hình cầu đai diện đối xứng icosahedral, đƣờng kính phân tử đầy đủ ~ 65 nm. Phân

tử có 2 lớp vỏ với các gai khá lớn cấu tạo bởi 5 tiểu phần protein (p9) (pentamer). Lớp vỏ trong

có T= 2 còn lớp vỏ ngoài có T = 12.

,

Hình 18-2 Sơ đồ virion của RRSV (hàng trên) và ảnh EM (hàng dƣới) cho thấy virion hình cầu với

mấu gai (trái) và 2 lớp vỏ (phải), thanh bar 50 nm (Shikita, 1979; Milne, 1982)

18.3.3 Đặc điểm bộ gen

RRSV có bộ gen phân đoạn gồm10 phân tử RNA sợi kép mạch thẳng. Tất cả các phân tử

RNA này đều đƣợc lắp ráp trong một virion.

Các phân tử RNA genome của RRSV đƣợc ký hiệu từ S1 đến S10 (hay Seg1 đến Seg10), có

tổng kích thƣớc ~ 26 kb.

Các phân tử RNA genome của RRSV đều chứa 1 ORF lớn (chiếm gần hết kích thƣớc mỗi

phân tử), ngoại trừ S4 chứa 2 ORF.

187

Hình 18-3 Tổ chức bộ gen của RRSV

Các protein mã hóa trên 3 phân tử S3, S8 và S9 là các protein cấu trúc chính của phân tử

virus (với các protein tƣơng ứng là P3, P8B vafP9). Bộ gen của RRSV mã hóa 14 protein, trong

đó ít nhất có 6 protein cấu trúc là P1, P2, P3, P4A, P8B và P9. Vị trí và chức năng của các

protein này trình bày ở Bảng 18-2.

Bảng 18-2 Đặc điểm bộ gen và chức năng protein của RRSV

Phân

đoan

Kích thƣớc

(bp)

Protein Chức năng

S1 3849 P1 Gai vỏ (spike B)

S2 3810 P2 Protein vỏ của lớp vỏ trong

S3 3699 P3 Protein vỏ chính của lớp vỏ trong

S4 3823 P4A (Pol) và P4B RdRP (P4A) còn P4B chƣa rõ

S5 2682 P5 (Cap) Enzyme tạo mũ (cap) và guanintransferase

S6 2157 P6 Chƣa rõ

S7 1938 NS7 Protein phi cấu trúc, chƣa rõ chức năng

S8 1814 P8, P8A và P8B Protease (P8, P8A); Protein vỏ chính của lớp vỏ ngoài (P8B)

S9 1132 P9 Protein gai vỏ ngoài (spike A), đặc hiệu vector

S10 1162 NS10 Protein phi cấu trúc, chƣa rõ chức năng

18.3.4 Phạm vi kí chủ

Phạm vi kí chủ của RRSV rất hẹp, chỉ gây hại tự nhiên trên lúa Oryza spp.

18.3.5 Triệu chứng bệnh

Bệnh lùn xoắn lá (hay là bệnh lùn táp lá, ragged stunt disease) biểu hiện 5 triệu chứng đặc

trƣng là (i) cây lùn, (ii) bộ lá xanh đậm, cứng, (iii) lá xoắn vặn một chiều, đặc biệt phần chót lá,

(iv) một bên mép lá (ở các lá bị xoắn vặn hoặc đang phục hồi) bị rách táp dạng chữ V (ragged)

và có thể lan sâu vào gân chính, (v) có các sọc phồng màu trắng sáp chạy dọc gân lá, bẹ lá và đặc

biệt nhiều ở phần cuống lá (tiếp giáp giữa phiến lá và bẹ lá). Trong số các triệu chứng này, táp lá

(ragged) đƣợc xem là đặc trƣng nhất của bệnh.

Trong cây bệnh, phân tử virus hình thành rất nhiều trong tế bào chất của tế bào nhu mô và tế

bào ống rây của mạch dẫn phloem. Trong tế bào chất của các tế bào này, vị trí sinh sản và lắp ráp

188

phân tử virus hình thành một cấu trúc gọi là ‗viroplasms‘ dạng sợi thƣờng bắt màu đậm dƣới

kính hiển vi điện tử (Hình 18-4) trongg cây, vị trí có nhiều virus nhất là các sọc phồng trắng

dạng sáp. Các sọc phồng là sự sinh sản quá mức cả về kích thƣớc và số lƣợng của các tế bào nhu

mô của mạch phloem

Hình 18-4 Một số triệu chứng điển hình của bệnh lúa lùn xoắn lá do RRSV (3 hình đầu, Hà Viết

Cƣờng, 2009). Hình ngoài cùng bên phải là một phần tế bào chất của tế bào nhu mô mạch phloem

tại vị trí nốt phồng với “viroplasm” màu đậm chứa đầy các phân tử virus (Hibino, 1979)

18.3.6 Lan truyền

Virus không truyền qua hạt giống, hạt phấn và tiếp xúc cơ học.

Vector duy nhất của virus RRSV là rầy nâu Nilaparvata lugens. Rầy truyền virus theo kiểu

bền vững tái sinh nhƣng không truyền qua trứng rầy.

Rây nâu N. lugens thƣờng gây hại trên các giống lúa nhiễm rầy nâu, với mật độ cao có thể gây

cháy rầy. Cây lúa nhiễm rầy chuyển mầu vàng rồi chết. Rầy trƣởng thành cánh dài xâm nhập vào

ruộng lúa và đẻ trứng trên các bẹ lá hoặc ở các gân lá. Trứng đẻ có nắp rộng và dẹt. Thời gian

trứng là 7-9 ngày, rầy có 5 tuổi. Giai đoạn rầy non kéo dài 13-15 ngày. Rầy non tuổi một có mầu

trắng, các tuổi sau có mầu nâu. Rầy trƣởng thành có 2 loại: cánh ngắn và cánh dài.

Rầy nâu có đặc điểm truyền RRSV tƣơng tự nhƣ đối với truyền RGSV. Khả năng truyền

virus không có sự khác biệt rõ ràng giữa rầy đực và rầy cái, giữa rầy cánh dài và cánh ngắn. Tuy

nhiên, rầy non có khả năng truyền virus cao hơn với thời gian ẩn ngắn hơn rầy trƣởng thành.

Thời gian chích nạp tối thiểu là 3 giờ. Thời gian ẩn của virus trong vector từ 2 -33 ngày, trung

bình 9 ngày. Thời gian chích truyền tối thiểu là 1 giờ. Triệu chứng trên cây biểu hiện trong vòng

10-36 ngày sau lây nhiễm. Trung bình khoảng 40 % (trong phạm vi 6-76%) rầy truyền đƣợc

virus RRSV. Rầy có thể duy trì khả năng truyền virus từ 1 – 4 tuần hoặc tới khi chết.

18.3.7 Chẩn đoán

Có thể chẩn đoán bệnh bằng 3 biện pháp

Chẩn đoán dựa vào triệu chứng. Nhìn chung bệnh lùn xoắn lá tạo triệu chứng khá đặc trƣng

nên có thể chẩn đoán dễ dàng dựa trên triệu chứng với mức độ tin cậy cao. Các triệu chứng quan

trọng là (i) cây lùn, (ii) bộ lá xanh đậm và cứng, (iii) lá xoắn vặn đặc biệt phần chót lá; (iv) một

189

bên mép lá rách táp, viền vết rách biến vàng, chỗ rách táp thƣờng có dang chữ V, (iv) có nhiều

sọc phồng màu trắng sáp dọc gân lá, bẹ phiến lá và đặc biệt nhiều ở phần tiếp giáp gữa lá và bẹ

lá. Tuy nhiên bệnh có thể rất khó phân biệt với bệnh lùn sọc đen do virus lùn sọc đen phƣơng

Nam gây ra. Điểm chủ yếu để phân biệt 2 bệnh là ở bệnh lùn sọc đen có các sọc phồng ở thân.

Chẩn đoán bằng ELISA. Virus RRSV có hoạt tính miễn dịch tốt. Nhiều nguồn kháng thể virus

hiện sẵn có (IRRI, Nhật Bản, Việt Nam) giúp chẩn đoán bệnh dễ dàng. Tuy nhiên khi chẩn đoán

virus RRSV bằng ELISA cần chú rằng kháng thể đặc hiệu phân tử RRSV có thể tạo phản ứng

ELISA rất mạnh đối với rầy nâu cái mang trứng không nhiễm virus (có thể do kháng thể của

RRSV đã phản ứng với protein của trứng rầy).

Chẩn đoán bằng RT-PCR. Nhiều bộ mồi đặc hiệu virus RRSV hiện cũng sẵn có để chẩn đoán

bệnh.

18.3.8 Phòng chống

Hiện chƣa có công bố tại Việt Nam về đặc tính kháng nhiễm của các giống lúa đối với virus

RRSV. Tƣơng tự đối với bệnh lúa cỏ (do RGSV), chiến lƣợc phòng chống bệnh tại Việt Nam, do

vậy, vẫn chủ yếu dựa vào các biện pháp quản lý vector rầy nâu nhƣ:

Dùng giống kháng rầy

Sử dụng thuốc hóa học phòng trừ rầy

Né rầy di cƣ mang virus bằng điều chỉnh thời vụ trồng (biện pháp đã đƣợc áp dụng khá

hiệu quả tại đồng bằng sông Cửu Long).

Ngoài ra, quy hoạch lại mùa vụ theo hƣớng chấm dứt việc rải vụ quanh năm, giảm cơ cấu 3

vụ lúa nhằm giảm áp lực nguồn bệnh và môi giới truyền bệnh.

Khi cây lúa đã bị nhiễm bệnh thì tiêu huỷ kịp thời nguồn bệnh để tránh lây lan.

18.4 SOUTHERN RICE BLACK-STREAKED DWARF VIRUS (SRBSDV)

18.4.1 Tầm quan trọng

SRBSDV (chi Fijivirus) gây bệnh lúa lùn sọc đen (bệnh lùn lụi) là một virus mới đƣợc xác

định đầu tiên năm 2008 tại các tỉnh phía Nam Trung Quốc nhƣ Quảng Đông, Hải Nam. Tiếp

theo, tại Việt Nam, virus đã đƣợc xác định đầu tiên ở vụ mùa năm 2009 tại nhiều tỉnh miền Bắc

và đang là 1 tác nhân gây bệnh nguy hiểm trên lúa, đặc biệt trong vụ mùa ở miền Bắc và Bắc

Trung Bộ. Theo thống kê của Cục BVTV, vụ mùa năm 2010 , bệnh LSĐ đã phát sinh gây hại tại

28 tỉnh/thành miền Bắc và Bắc Trung Bộ với tổng diện tích bị nhiễm tính là 24.000 ha, trong đó

diện tích phải nhổ tỉa là 9.000 ha và phải tiêu hủy là 1.700 ha.

Chú ý phân biệt một virus tƣơng tự (nhƣng không phát hiện thấy ở Việt Nam) cũng gây ra

bệnh lùn sọc đen là Rice black streaked dwarf virus (RBSDV):

Tên virus tiếng Việt Tên virus tiếng Anh Bệnh

Virus lúa lùn sọc đen Rice black streaked dwarf virus (RBSDV)

Lúa lùn sọc đen

Virus lúa lùn sọc đen phƣơng Nam Southern rice black streaked dwarf virus (SRBSDV)

190

18.4.2 Hình thái phân tử

Virus SRBSDV là một fijivirus nên có các đặc điểm hình thái tƣơng tự nhƣ đối với các

fijivirus khác. Virus có dạng hình cầu đa diện đối xứng icosahedral, đƣờng kính phân tử đầy đủ ~

70 nm. Phân tử có 2 lớp vỏ, trên bề mặt vỏ ngoài có 12 gai loại A (A spike) ngắn gắn trên 12

đỉnh của hình đa diện icosahedral. Vỏ ngoài dễ bị phân hủy để lộ ra lớp vỏ trong cũng mang 12

gai loại B (B spike) trên 12 đỉnh của hình đa diện. Lớp vỏ trong có T= 2 còn lớp vỏ ngoài có T =

13.

Trong tế bào, các phân tử virus thƣờng kết tụ thành thể vùi xếp thành lớp (Hình 18-5).

Hình 18-5. Thể vùi virus và phân tử virus SRBSDV trong tế bào cây bị bệnh lùn sọc đen tại Việt

Nam năm 2009

18.4.3 Đặc điểm bộ gen

Cấu trúc bộ gene của virus LSĐ phƣơng Nam (SRBSDV) gồm 10 phân đoạn RNA sợi kép

(dsRNA) và mã hóa cho các protein chức năng khác nhau. Vì là một virus mới nên tất cả các gen

của virus này đều chƣa đƣợc xác định chức năng. Dựa trên một virus gần gũi là virus LSĐ

(RBSDV) và các fijivirus khác, chức năng một số protein của virus LSĐ phƣơng Nam có thể

đƣợc dự đoán và tóm tắt ở Bảng 18-3.

Bảng 18-3 Đặc điểm bộ gen và dự đoán chức năng các protei của virus SRBSDV (Wang et al., 2010)

Phân

đoan

Kích thƣớc

(bp)

Protein Chức năng

S1 4500 VP1 RdRp

S2 3815 VP2 Protein vỏ của lớp vỏ trong

S3 3618 VP3 Chƣa rõ chức năng

S4 3571 VP4 Chƣa rõ chức năng

S5 3167 VP5 Chƣa rõ chức năng

S6 2651/+2 VP6 Ức chế phản ứng phòng thủ kiểu câm gen của cây

S7 2176 VP7 (a, b) Tạo cấu trúc ống liên quan đến vận chuyển?

S8 1928 VP8 Protein vỏ của lớp vỏ trong

S9 1899/+1 VP9 (a, b) Chƣa rõ chức năng

S10 1797/+1 VP10 Protein vỏ của lớp vỏ ngoài

191

18.4.4 Triệu chứng

Trên lúa. Bệnh lùn sọc đen do virus LSĐ (RBSDV) hay virus LSĐ phƣơng Nam (SRBSDV)

gây ra đều tạo các triệu chứng đặc trƣng sau: (i) cây bị lùn đặc biệt khi nhiễm sớm, (ii) không

trỗ bông hoặc nếu trỗ thì chỉ trỗ một nửa với hạt bị biến màu nâu đen, (iii) bộ lá xanh đậm, cứng,

(iv) lá, đặc biệt phần chót lá, có thể xoắn vặn nhƣng thƣờng không bị rách táp, (v) có nhiều sọc

phồng trắng sau chuyển màu nâu đến đen chạy dọc gân lá, bẹ lá và thân cây, (vi) cây bị bệnh

nặng nhổ lên dễ dàng.

Hình 18-6. Triệu chứng bệnh LSĐ trên lúa ở miền Bắc vụ mùa năm 2009. Lá lúa bị xoắn vặn (a, b,

c), trỗ không thoát với hạt bị bị biến màu nâu (a). Có các nốt phồng màu trắng chạy dọc gân của lá

(d), phiến lá (d), thân (e). Các nốt phồng lúc đầu trắng sau chuyển màu nâu đến đen (e, f).

Trên ngô. Cây ngô nhiễm virus LSĐPN biểu hiện một số triệu chứng sau (Hình 18-7): (i)

các nốt phồng màu trắng sáp trên gân dƣới của lá và gân lá bao bắp, (ii) lá ngọn thƣờng xoắn

vặn, rách táp mép lá, (ii) cây lùn rõ rệt so với cây khỏe.

Hình 18-7. Triệu chứng bệnh LSĐ trên ngô ở miền Bắc năm 2010.

18.4.5 Lan truyền

Vì các reovirus gây hại trên lúa không truyền qua hạt giống cũng nhƣ tiếp xúc cơ học nên khả

năng truyền qua vector rầy đã đƣợc chú ý. Nghiên cứu của các nhà khoa học Trung Quốc với 3

loài rầy là rầy lƣng trắng (Sogatella furcifera), rầy nâu (Nilaparavata lugens) và rầy nâu nhỏ

(Laodelphax striatellus) cho thấy cả rầy lƣng trắng và rầy nâu nhỏ đều có khả năng truyền

a b c f e d

192

SRBSDV từ lúa sang lúa với hiệu quả truyền rất cao (100 % cây nhiễm bệnh với chỉ 3 – 4

rầy/cây). Tuy nhiên, chỉ có rầy lƣng trắng mới có khả năng truyền SRBSDV từ lúa sang ngô.

Nghiên cứu này cũng cho thấy rầy nâu không thể truyền đƣợc SRBSDV.

Tại Việt Nam, đã có một số nghiên cứu về biến động quần thể cũng nhƣ khả năng di cƣ của

rầy trên lúa. Các nghiên cứu của Viện BVTV cho thấy trong những năm gần đây, quần thể rầy

trên lúa miền Bắc đã có sự thay đổi đáng kể. Tỷ lệ rầy nâu chiếm khoảng gần 70 % vào năm

1981 đã giảm xuống còn khoảng gần 30 % vào năm 2007. Trái lại, quần thể rầy lƣng trắng đã

tăng từ khoảng 35 % (1981) lên tới trên 70 % (năm 2007). Đặc biệt, rầy nâu nhỏ đã tái xuất hiện

vào tháng 5-6 năm 2008 tại nhiều tỉnh miền Bắc nhƣ Hƣng Yên, Hải Dƣơng, Thái Bình và Bắc

Ninh.

18.4.6 Chẩn đoán

Có thể chẩn đoán bệnh bằng 2 biện pháp:

Chẩn đoán dựa vào triệu chứng. Nhìn chung bệnh LSĐ phƣơng Nam tạo triệu chứng khá đặc

trƣng nên có thể chẩn đoán dễ dàng dựa trên triệu chứng với mức độ tin cậy cao. Các triệu chứng

quan trọng là (i) cây lùn, (ii) bộ lá xanh đậm và cứng, (iii) lá xoắn vặn đặc biệt phần chót lá; (iv)

có sọc phồng màu trắng sáp dọc gân lá, bẹ phiến lá và đặc biệt ở thân, (v) cây bệnh nhổ lên dễ

dàng. Tuy nhiên bệnh có thể rất khó phân biệt với bệnh lùn xoắn lá. Điểm chủ yếu để phân biệt

2 bệnh là ở bệnh lùn sọc đen có các sọc phồng ở thân. Bệnh ở vụ xuân, triệu chứng thƣờng

không điển hình, đặc biệt đầu vụ.

Chẩn đoán bằng RT-PCR. Các mồi đặc hiệu virus đã sẵn có tại nhiều đơn vị nghiên cứu và

quản lý tại Việt Nam.

18.4.7 Phòng chống

Hiện chƣa có công bố tại Việt Nam về đặc tính kháng nhiễm của các giống lúa đối với virus

LSĐ phƣơng Nam. Tƣơng tự đối với bệnh virus hại lúa, chiến lƣợc phòng chống bệnh tại Việt

Nam, do vậy vẫn chủ yếu dựa vào các biện pháp quản lý vector rầy. Trong điều kiện miền Bắc,

các biện pháp nên đƣợc áp dụng là:

Dùng giống kháng rầy.

Dùng thuốc hóa học, sinh học phòng trừ rầy; bảo vệ mạ và cây lúa ít nhất tới làm đòng.

Tiêu hủy nguồn bệnh để làm giảm áp lực nguồn bệnh và tránh lây lan.

18.5 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 18

1. Đặc điểm họ Reoviridae (phân loại, hình thái, quan hệ vector, bản chất bộ gen).

2. RRSV (tầm quan trọng, triệu chứng, đặc điểm bộ gen, lan truyền, phòng chống).

3. SRBSDV (tầm quan trọng, triệu chứng, đặc điểm bộ gen, lan truyền, phòng chống)

18.6 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH

1. Ha, V. C., Nguyen, V.H., Vu, T.M. and Matsumoto, M. (2009). Rice dwarf disease in North

Vietnam in 2009 is caused by southern rice black-streaked dwarf virus (SRBSDV). Bulletin of the Institute of Tropical Agriculture, Kyushu University. Vol. 32, No. 1: 85-92.

193

2. Hibino, H. (1996). Biology and epidemiology of rice viruses. Annual Review of

Phytopathology 34, 249-274.

3. Hogenhout, S.A., Ammar, E.D., Whitfield, A.E. and Redinbaugh, M.G. (2008). Insect Vector

Interactions with Persistently Transmitted Viruses. Annual Review of Phytopathology.

46:327–59.

4. Milne, R.G., del Vas M., Harding, R.M., Marzachi, R. and Mertens, P.P.C. (2005). Genus

Fijivirus. In: Fauquet, C.M., Mayo, M.A., Maniloff, J., Desselberger, U. and Ball, L.A. (eds).

Virus taxonomy. Eighth report of the international committee on taxonomy of viruses.

Elsevier Academic Press, San Diego, pp 534–542.

5. Ou, S.H. (1985). Rice Diseases. Second Edition, p. 23-25 & 48-49. Commonwealth

Mycological Institute Publication. Kew, Surrey, UK.

6. Zhang, H.M., Yang, E.J., Chen, J.P. and Adams, M.J. (2008). A black-streaked dwarf disease

on rice in China is caused by a novel fijivirus. Archives of Virology. 153:1893–1898.

7. Zhou, G.H., Wen, J.J., Cai, D.J., Li, P., Xu, D.L. and Zhang, S.G. (2008). Southern rice

black-streaked dwarf virus: A new proposed Fijivirus species in the family Reoviridae.

Chinese Science Bulletin. Vol. 53. No. 23: 3677-3685.

8. Upadhyaya,N.M. and Mertens, P.P.C. (2005) Genus Oryzavirus. In Virus Taxonomy, Eighth

Report of ICTV. Ed. Fauquet, C.M., Mayo, M.A., Maniloff, J., Desselberger, U. and Ball, L.A. 550-555.

194

Chƣơng 19. VIRUS RNA SỢI KÉP (TIẾP): CHI TENUIVIRUS

19.1 TÓM TẮT NỘI DUNG

Chƣơng 19 mô tả phân loại và các đặc trƣng phân tử của virus chi Tenuivirus, đại diện cho

nhóm các virus RNA sợi kép, có bộ gen phân đoạn và có hình thái phân tử không hoàn chỉnh.

Chƣơng này cũng đề cập đến 1 tenuivirus quan trọng đối với sản xuất lúa của Việt Nam là

RGSV (Rice grassy stunt virus).

19.2 CHI TENUIVIRUS

Các tenuivirus là các virus RNA có hình thái phân tử dạng tràng hạt. Phân tử virus đƣợc gọi là

nucleoprotein gồm các phân tử RNA genome liên kết với protein vỏ (đƣợc gọi là nucleocapsid).

Các tenuivirus là các virus có bộ gen phân đoạn, gồm 4 – 6 phân tử RNA sợi kép tùy theo

loài, có kích thƣớc từ ~ 1.3 – 9 kb.

Hiện nay, có 6 tenuivirus đƣợc ghi nhận trên thế giới (Bảng 19-1). Các tenuivirus đều gây

bệnh trên cây họ hòa thảo, mỗi virus chỉ lan truyền bằng 1 loài rầy theo kiểu bền vững tuần hoàn

hoặc bền vững tái sinh. Trong số các virus này, hiện chỉ có virus lúa cỏ (RGSV) đã đƣợc phát

hiện ở Việt Nam.

Bảng 19-1 Phân loại chi Tenuivirus (loài chuẩn: Rice stripe virus)

Loài virus Viết tắt

Echinochloa hoja blanca virus EHBV

Maize stripe virus MsPV

Rice grassy stunt virus RGSV

Rice hoja blanca virus RHBV

Rice stripe virus RSV

Urocholoa hoja blanca virus UHBV

19.3 RICE GRASSY STUNT VIRUS (RGSV)

19.3.1 Tầm quan trọng

RGSV gây hại ở khắp các nƣớc trồng lúa châu Á, đặc biệt vùng Đông Nam Á. Trong những

năm 70, bệnh đã gây ra nhiều vụ dịch tại một số nƣớc nhƣ Indonesia, Philippin, Ấn Độ

Tại Việt Nam, virus gây bệnh trên lúa với một số tên gọi khác nhau nhƣ bệnh ―lại mạ‖, ―lúa

cỏ‖, ―vàng lùn‖. Hiện nay, bệnh ―vàng lùn‖ do RGSV gây ra là một trong hai bệnh virus (cùng

với bệnh lùn xoắn lá) nguy hiểm và phổ biến nhất trên lúa ở miền Nam Việt Nam.

19.3.2 Hình thái phân tử

Giống nhƣ các teinuivirus khác, RGSV có hình thái phân tử (virion) dạng sợi tràng hạt, đƣờng

kính 6 – 8 nm, không có vỏ bọc. Hầu hết các phân tử virus ở dạng khép vòng với chu vi 200-

2400nm (trung bình 950-1350 nm).

195

Hình 19-1 Phân tử virus RGSV có dạng tràng hạt khép vòng (Hibino, 1986)

19.3.3 Đặc điểm bộ gen

Bộ gen của RGSV có tổng kích thƣớc là 25 kb, gồm 6 phân đoạn RNA sợi kép, mạch

thẳng khác nhau đƣợc kí hiệu là RNA1, RNA2, RNA3, RNA4, RNA5 và RNA6 theo thứ tự

giảm dần.

Tất cả 6 phân đoạn RNA của virus đều lƣỡng cực (ambiense). Trên mỗi phân đoạn mã hóa 2

protein ngƣợc chiều nhau. Chỉ một số protein của virus đã đƣợc biết chức năng bao gồm:

pC1 mã hóa protein tái bản RdRp của virus

pC5 mã hóa protein N là protein vỏ (capsid)

p6 mã hóa protein NCP (non-capsid protein) là một protein hình thành nhiều trong tế bào

cây lúa bị bệnh.

Hình 19-2 Tổ chức bộ gen của RGSV

19.3.4 Phạm vi kí chủ

Phạm vi kí chủ của RGSV rất hẹp, chỉ gây hại trên lúa Oryza spp.

196

19.3.5 Triệu chứng bệnh

Cây lúa bị nhiễm bệnh, đặc biệt ở giai đoạn mạ, bị lùn mạnh, đẻ nhiều nhánh, lá nhỏ hẹp dựng

đứng xếp xít vào nhau giống búi cỏ nên bệnh đƣợc gọi là bệnh ―lúa cỏ‖. Lá bệnh biến màu lục

nhạt hoặc vàng nhạt, thƣờng có các đốm nâu – đen nhỏ.

Lá bệnh có thể vẫn giữ màu xanh nếu bón đủ đạm.

Cây bệnh không trỗ bông hoăc trỗ rất kém, hạt bị lép hoặc biến màu nâu – đen.

Cây nhiễm muộn thì lá biến vàng, hạt bị biến dạng.

Thí nghiệm chậu vại cho thấy: tùy theo giống, năng suất có thể giảm 70 – 100% khi nhiễm

sau trồng 1 – 1.5 tháng.

Hình 19-3 Triệu chứng bệnh lúa cỏ do RGSV tại Cần Thơ

19.3.6 Lan truyền

Virus không truyền qua hạt giống, hạt phấn và tiếp xúc cơ học.

Virus lan truyền bằng rầy nâu Nilaparvata spp., trong đó quan trọng nhất là rầy nâu N. lugens.

Rầy truyền virus theo kiểu bền vững tái sinh nhƣng không truyền qua trứng rầy.

Rây nâu N. lugens thƣờng gây hại trên các giống lúa nhiễm rầy nâu, với mật độ cao có thể gây

cháy rầy. Cây lúa nhiễm rầy chuyển mầu vàng rồi chết. Rầy trƣởng thành cánh dài xâm nhập vào

ruộng lúa và đẻ trứng trên các bẹ lá hoặc ở các gân lá. Trứng đẻ có nắp rộng và dẹt. Thời gian

trứng là 7-9 ngày, rầy có 5 tuổi. Giai đoạn rầy non kéo dài 13-15 ngày. Rầy non tuổi một có mầu

trắng, các tuổi sau có mầu nâu. Rầy trƣởng thành có 2 loại: cánh ngắn và cánh dài.

Khả năng truyền virus không có sự khác biệt rõ ràng giữa rầy đực và rầy cái, giữa rầy cánh

dài và cánh ngắn. Tuy nhiên, rầy non có khả năng truyền virus cao hơn với thời gian ẩn ngắn hơn

rầy trƣởng thành. Rầy nâu có thời gian chích nạp tối thiểu là 1 giờ, thời gian ẩn của virus trong

vector khoảng 5-28 ngày. Sau thời gian ẩn, rầy bắt đầu truyền virus với thời gian chích truyền tối

thiểu 9 phút. Triệu chứng bệnh biểu hiện rõ sau khi nhiễm virus khoảng 10-20. Rầy nâu mang

virus có thể truyền bệnh cho đến lúc chết.

197

19.3.7 Chẩn đoán

Có thể chẩn đoán bệnh bằng 3 biện pháp:

Chẩn đoán dựa vào triệu chứng. Nhìn chung bệnh lúa cỏ tạo triệu chứng khá đặc trƣng nên có

thể chẩn đoán dựa trên triệu chứng với mức độ tin cậy cao. Các triệu chứng quan trọng là (i) lùn,

(ii) lá biến màu xanh nhợt, nhỏ hẹp, dựng đứng, (iii) đẻ nhiều nhánh xếp xít vào nhau, (iv) lá có

các đốm nâu – đen nhỏ. Tuy nhiên, khi bệnh nhiễm muộn, việc chẩn đoán dựa theo triệu chứng

sẽ khó hơn.

Chẩn đoán bằng ELISA. Virus RGSV có hoạt tính miễn dịch tốt. Nhiều nguồn kháng thể

virus hiện sẵn có (IIRRI, Nhật Bản, Việt Nam) giúp chẩn đoán bệnh dễ dàng. Cần chú ý kháng

huyết thanh đặc hiệu phân tử RGSV phản ứng yếu với Rice stripe virus (RSV) nhƣng không

phản ứng với Maize stripe virus (MsPV) hoặc Rice hoja blanca virus (RHBV).

Chẩn đoán bằng RT-PCR. Nhiều bộ mồi đặc hiệu virus RGSV hiện cũng sẵn có để chẩn đoán

bệnh.

19.3.8 Phòng chống

Hiện chƣa có công bố tại Việt Nam về đặc tính kháng nhiễm của các giống lúa đối với virus

RGSV. Chiến lƣợc phòng chống bệnh tại Việt Nam, do vậy vẫn chủ yếu dựa vào các biện pháp

quản lý vector rầy nâu nhƣ:

Dùng giống kháng rầy

Sử dụng thuốc hóa học phòng trừ rầy

Né rầy di cƣ mang virus bằng điều chỉnh thời vụ trồng (biện pháp đã đƣợc áp dụng khá

hiệu quả tại ĐB sông Cửu long).

Ngoài ra, quy hoạch lại mùa vụ theo hƣớng chấm dứt việc rải vụ quanh năm, giảm cơ cấu 3

vụ lúa nhằm giảm áp lực nguồn bệnh và môi giới truyền bệnh.

Khi cây lúa đã bị nhiễm bệnh thì tiêu hủy kịp thời nguồn bệnh để tránh lây lan.

19.4 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 19

4. Đặc điểm chi Tenuivirus (phân loại, hình thái, quan hệ vector, bản chất bộ gen).

5. RGSV (tầm quan trọng, triệu chứng, đặc điểm bộ gen, lan truyền, phòng chống).

19.5 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH

1. Haenni, A.L., de Miranda, J.R., Falk, B.W., Goldbach, R., Mayo, M.A., Shirako, Y. and

Toriyama, S. (2005). Genus Tenuivirus. In: Virus Taxonomy, Eighth Report of ICTV. Ed.

Fauquet, C.M., Mayo, M.A., Maniloff, J., Desselberger, U. and Ball, L.A. 717-723.

2. Hibino, H. (1996). Biology and epidemiology of rice viruses. Annual Review of

Phytopathology 34, 249-274.

3. Hogenhout, S.A., Ammar, E.D., Whitfield, A.E. and Redinbaugh, M.G. (2008). Insect Vector

Interactions with Persistently Transmitted Viruses. Annual Review of Phytopathology.

46:327–59.

4. Ou, S.H. (1985). Rice Diseases. Second Edition, p. 23-25 & 48-49. Commonwealth

Mycological Institute Publication. Kew, Surrey, UK

198

Chƣơng 20. PHYTOPLASMA

20.1 TÓM TẮT NỘI DUNG

Chƣơng 20 mô tả tóm tắt lịch sử nghiên cứu cũng nhƣ các đặc điểm khái quát nhất (bản chất,

phân loại, lan truyền, tính chất gây bệnh) của một nhóm tác nhân gây bệnh thực vật đặc biệt: là

vi khuẩn nhƣng lại có nhiều đặc điểm bệnh học giống virus.

20.2 GIỚI THIỆU

Vào năm 1967, các nhà khoa học Nhật Bản đã phát hiện ra một nhóm tác nhân gây bệnh có

đặc điểm cấu trúc giống nhƣ Mycoplasma (Mycoplasma - Like Organism, MLO) là nguyên nhân

gây ra nhiều bệnh biến vàng cây trồng mà trƣớc đó hầu hết các nhà khoa học đều cho rằng

nguyên nhân có lẽ do virus. Hiện nay tất cả các tác nhân MLO gây bệnh trên thực vật đƣợc gọi là

Phytoplasma.

Bản chất thực sự của Phytoplasma chỉ đƣợc khám phá vào cuối những năm 1980 và đầu

những năm 1990 do áp dụng các công cụ phân tích phân tử. Các phân tích dựa trên chuỗi gen mã

hóa tiểu phần 16S RNA ribosome và chuỗi gen mã hóa tiểu phần protein của ribosome đã cho

thấy Phytoplasma (vào thời điểm đó vẫn đƣợc gọi là MLO) thuộc nhóm dịch khuẩn bào

(mollicustes). Tiếp theo, các phân tích dựa vào phản ứng trùng hợp chuỗi (PCR) dùng các cặp

mồi đặc hiệu chuỗi gen 16S RNA cũng nhƣ phân tích đa hình các các đoạn cắt giới hạn RFLP

các sản phẩm PCR đã cho phép phát hiện và xác định nguyên nhân của hàng trăm bệnh cây là do

Phytoplasma gây ra.

20.3 ĐẶC ĐIỂM

Phytoplasma là loại vi khuẩn hại thực vật đặc biệt, có 3 đặc điểm quan trọng sau:

(i) Chúng không thể nuôi cấy đƣợc trên môi trƣờng nhân tạo (đây là lý do tại sao phần lớn

các nghiên cứu về Phytoplasma thƣờng đƣợc thực hiện bởi các nhà virus học).

(ii) Chúng thiếu lớp vách tế bào. Tế bào của chúng chỉ đƣợc bao bọc bởi một lớp màng tê bào,

bên trong là các cơ quan tử tƣơng tự nhƣ của vi khuẩn. Do không có lớp vách rắn chắc bên ngoài

nên tế bào Phytoplasma có dạng vô định hình, thay đổi từ hình cầu (với đƣờng kính trung bình từ

200µm đến 800µm), hình ovan, hình sợi, hình ống. Kích thƣớc bộ gen của Phytolasma thay đổi

từ 530 kilobases tới 1130 kilobases.

(iii) Chúng tồn tại ở tế bào mạch phloem (chủ yếu ở tế bào mạch rây).

Hình 20-1 Tế bào phytoplasma trong tế bào mạch rây ký chủ (Lee et al., 2000)

199

20.4 PHÂN LOẠI

Hiện nay, theo khóa phân loại vi khuẩn của Bergey (2004), Phytolasma đƣợc xếp vào chi

Candidatus Phytoplasma (Ca. Phytoplasma), Bộ Acholeplasmatales, Lớp Mollicutes, Ngành

Firmucutes, Giới Vi khuẩn (Bacteria). Trên cơ sở so sánh chuỗi DNA ribosome 16S (16S

rDNA) bằng kỹ thuật RFLP hoặc giải trình tự gen, các loài Ca. Phytoplasma đƣợc xếp vào ít

nhất 16 nhóm phả hệ (ký hiệu là 16SrI...16SrXIV), mỗi nhóm có tên riêng, chẳng hạn nhóm

16SrI là nhóm Aster yellowing (Biến vàng cây cúc).

Bảng 20-1 Phân loại phytoplasma dựa trên đặc điểm RNA ribosome 16S

Nhóm

16Sr Tên nhóm Loài

16SrI Aster yellows Ca. Phytoplasma asteris, Ca. Phytoplasma japonicum

16SrII Peanut witch's broom Ca. Phytoplasma aurantifolia

16SrIII X-disease Ca. Phytoplasma pruni

16SrIV Coconut lethal yellowing Ca. Phytoplasma palmae, Ca. Phytoplasma castaneae, Ca. Phytoplasma cocosnigeriae

16SrV Elm yellows Ca. Phytoplasma ziziphi, Ca. Phytoplasma vitis, Ca. Phytoplasma

ulmi

16SrVI Clover proliferation Ca. Phytoplasma trifolii

16SrVII Ash yellows Ca. Phytoplasma fraxini

16SrVIII Luffa witch's-broom Ca. Phytoplasma luffae

16SrIX Pidgeon pea witch's broom Ca. Phytoplasma phoenicium

16SrX Apple proliferation Ca. Phytopalsma Mali, Ca. Phytoplasma pyri, Ca. Phytoplasma

prunorum, Ca. Phytoplasma spartii, Ca. Phytoplasma rhamnii, Ca.

Phytoplasma allocasuarinae

16SrXI Rice Yellow Dwarf Ca. Phytopalsma oryzae

16SrXII Stolbur Ca. Phytoplasma solani, Ca. Phytoplasma australiense

16SrXIII Mexican periwinkle

virescence Chưa xác định

16SrXIV Bermuda white leaf Ca. Phytoplasma cynodontis

16SrXV Hibiscus witch's-broom Ca. Phytoplasma brasiliense

20.5 TRIỆU CHỨNG

Do làm biến đổi cân bằng phytohormon trong cây nên Phytoplasma thƣờng gây ra một số

triệu chứng đặc trƣng nhƣ:

1. Diệp hóa (phyllody): các bộ phận của hoa (cánh hoa) phát triển thành cấu trúc giống nhƣ lá.

2. Lục hóa (virescence): thay vì có màu sắc bình thƣờng, hoa phát triển sắc tố lục.

3. Chổi phù thủy (witches’-broom): sự phát triển quá mức chồi bên, chồi phụ + lóng kéo dài bất thƣờng (nhƣng mảnh).

4. Chùn ngon, chùn hoa

5. Cây còi cọc, lùn

200

6. Lá biến màu (vàng, đỏ).

20.6 LAN TRUYỀN

Phytoplasma lan truyền chủ yếu nhờ côn trùng chích hút họ Cicadellidea (rầy lá) và

Fulgoridea (rầy thân) theo kiểu bền vững tái sinh.

Phytoplasma không lan truyền qua hạt giống nhƣng có thể lan truyền dễ dàng qua vật liệu

giống đƣợc nhân giống vô tính (hom giống, củ giống, thân ngầm).

Phytoplasma không lan truyền qua lây nhiễm nhân tạo bằng tiếp xúc cơ học dùng dịch chiết

cây bệnh nhƣng truyền dễ dàng qua chiết, ghép và tơ hồng.

20.7 PHÒNG CHỐNG

Do phytoplasma truyền qua vector rầy và quan nhân giống vô tính nên các chiến lƣợc chính

để phòng trừ phytoplssma thƣờng dùng hiện nay là:

- Kiểm soát vector rầy bằng biện pháp hóa học, sinh học.

- Nhổ bỏ, tiêu hủy tàn dƣ cây bệnh càng sớm càng tốt.

- Không dùng những cây bị bệnh dù đã lớn làm hom giống. Có thể xử lý hom giống bằng

nƣớc nóng 54oC trong 40 phút (kinh nghiệm của Đài Loan đối với bệnh phytoplasma trên

mía).

- Không vận chuyển trao đổi hom giống từ các vùng bị bệnh tới các vùng trồng mới, tổ

chức sản xuất và kiểm tra các giống sạch bệnh

20.8 CA. PHYTOPLASMA ASTERIS

Đây là phytoplasma phổ biến khắp thế giới và quan trọng nhất trên thực vật. Phytoplasma hại

khoảng 300 loài cây thuộc 48 họ. Hai cây ký chủ quan trọng nhất là cà rốt và rau diếp. Năng suất

cây giảm thay đổi theo cây ký chủ (nặng nhất trên cà rốt: thƣờng giảm 10 -25 %, có thể tới 90%).

Phytoplasma lan truyền bằng nhiều loài rầy lá, quan trọng nhất là Macrosteles quadrilineatus.

Phytoplasma cũng truyền qua ghép và tơ hồng.

Hình 20-2 Triệu chứng chổi phù thủy và rễ tóc do Ca. Phytoplasma asteris gây ra trên cà rốt, tre

201

20.9 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 20

1. Lịch sử nghiên cứu và phát hiện Phytoplasma

2. Các đặc điểm chính của phtoplasma (bản chất, phân loại, tính chất gây bệnh)

3. Phóng chống phytoplasma

4. Bệnh do Ca. Phytoplasma asteris.

20.10 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH

1. Bertaccini, A. (2007). Phytoplasmas: diversity, taxonomy, and epidemiology. Front Biosci

12, 673-689.

2. Christensen, N. M., Axelsen, K. B., Nicolaisen, M. & Schulz, A. (2005). Phytoplasmas and

their interactions with hosts. Trends Plant Sci 10, 526-535.

3. Lee, I. M., Gundersen-Rindal, D. E., Davis, R. E., Bottner, K. D., Marcone, C. & Seemuller,

E. (2004). 'Candidatus Phytoplasma asteris', a novel phytoplasma taxon associated with aster

yellows and related diseases. Int J Syst Evol Microbiol 54, 1037-1048.

4. Lee, I. M., Davis, R. E. & Gundersen-Rindal, D. E. (2000). Phytoplasma: phytopathogenic

mollicutes. Annu Rev Microbiol 54, 221-255.

5. Weintraub, P. G. & Beanland, L. (2006). Insect vectors of phytoplasmas. Annu Rev Entomol

51, 91-111.

6. Weintraub, P. G. & Wilson, M. R. (2010). Control of Phytoplasma Diseases and Vector. In

Phytoplasma: Genomes, Plant Hosts and Vectors Edited by P. G. Weintraub & P. Jones:

CABI.

202

Chƣơng 21. VIROID

21.1 TÓM TẮT NỘI DUNG

Chƣơng 21 mô tả tóm tắt lịch sử nghiên cứu cũng nhƣ các đặc điểm khái quát nhất (bản chất,

cấu trúc phân tử, phân loại, tái sinh, lan truyền, tính chất gây bệnh) của một nhóm tác nhân gây

bệnh thực vật đặc biệt: chỉ là một phân tử RNA rất nhỏ nhƣng có thể gây bệnh rất giống virus.

21.2 GIỚI THIỆU

Vào năm 1922, một bệnh lạ trên khoai tây đã đƣợc quan sát thấy trên cây khoai tây. Cây bệnh

biểu hiện triệu chứng cây thấp nhỏ, lá hẹp, chót lá thót nhọn và quan trọng nhất là củ bệnh dài,

nhỏ hẹp, vỏ củ nhẵn, có nhiều mắt. Cây bệnh truyền dễ dàng qua tiếp xúc (kể cả qua dụng cụ

nhiễm bệnh), qua hạt và phấn hoa. Trong vòng 40 năm tiếp theo, tác nhân gây bệnh đã đƣợc qui

cho 1 virus thực vật. Tiếp theo, ngƣời ta chứng minh rằng tác nhân gây bệnh có hệ số sa lắng

thấp, mẫn cảm với ribonuclease nhƣng không mẫn cảm với deoxyribonuclease, phenol,

chloroform, n-butanol và ethanol. Các đặc điểm trên chứng tỏ tác nhân gây bệnh là một phân tử

RNA nhỏ. Khi bản chất sinh hóa của tác nhân gây bệnh đƣợc làm rõ thì thuật ngữ ―viroid‖ đƣợc

đề xuất vào năm 1971 để phân biệt các tác nhân gây bệnh là các phân tử RNA nhỏ không có vỏ

protein với các tác nhân gây bệnh là virus. Bệnh trên củ khoai tây đã đƣợc đặt tên là bệnh ―củ

hình thoi‖ (Potato spindle tuber viroid – PSTVd).

Các bệnh tiếp theo đƣợc phát hiện với nguyên nhân tƣơng tự là bệnh lùn cây cúc

(Chrysanthemum stunt viroid, CSVd) và bệnh vẩy vỏ cây có múi (Citrus exocortis viroid,

CEVd).

Cho tới nay, hơn 30 bệnh viroid đã đƣợc phát hiện thấy trên thực vật, phần lớn trên cây trồng

có ý nghĩa kinh tế nhƣ khoai tây, cà chua, cọ, nho, cây có múi, bơ, đào, táo, lê, hoa cúc…

21.3 ĐỊNH NGHĨA VIROID

Viroid là các phân tử RNA sợi vòng đơn, không có vỏ protein, tự tái sinh trong tế bào ký chủ

thực vật. Một số là tác nhân gây bệnh nhƣng một số không tạo triệu chứng nhiễm bệnh trên cây.

21.4 CẤU TRÚC VIROID

Cấu trúc sơ cấp. Ở dạng cấu trúc sơ cấp, viroids là 1 phân tử RNA sợi đơn, dạng vòng, kích

thƣớc từ 246 - 375 nt.

Cấu trúc thứ cấp. Nhìn tổng thể, viroid có dạng hình gậy xoắn nhƣng về cấu trúc thứ cấp chi

tiết, phân tử gồm 3 dạng khác nhau.

Dạng 1, đặc trƣng cho họ Pospoviroidae, có cấu trúc hình gậy. Phân tử viroid trở thành dạng

sợi kép, trên đó gồm các đoạn bắt cặp hoàn hảo (đoạn xoắn kép) xen kẽ với các đoạn không bắt

cặp (đoạn thòng lọng). Phân tử đƣợc chia làm 5 vùng chức năng theo thứ tự từ trái sang phải là:

Vùng đầu trái TL (terminal – left), vùng qui định tính gây bệnh P (pathogenic), vùng trung tâm C

(central), vùng biến động V (variable) và vùng đầu phải TR (terminal – right). Vùng trung tâm C

chứa một vùng bảo thủ gọi là vùng bảo thủ trung tâm CCR (central conserved region) liên quan

đến tái sinh viroid.

Dạng 2, đặc trƣng cho họ Avsunviroidae, có cấu trúc gần hình gậy. Phân tử viroid cũng có

dạng sợi kép gồm các đoạn bắt cặp hoàn hảo (đoạn xoắn kép) xen kẽ với các đoạn không bắt cặp

203

(đoạn thòng lọng). Tuy nhiên, ở đầu trái của phân tử có 2 cấu trúc kẹp tóc (hairpin). Ngoài ra, 2

thành viên của họ này là Chrysanthemum chlorotic mottle viroid (CChMVd) và Peach latent

mosaic viroid (PLMVd) có cấu trúc phân nhánh phức tạp ở gần đầu trái của phân tử. Các viroid

họ Avsunviroidae thiếu vùng bảo thủ trung tâm CCG nhƣng chứa một vùng tạo cấu trúc thứ cấp

giống nhƣ đầu búa và có hoạt tính enzyme (tự cắt) gọi là ribozyme đầu búa (hammerhead

ribozyme)

Hình 21-1 Cấu trúc viroid. A) hình dạng chung của viroid. B) phân tử viroid dƣới kính hiển vi điện

tử. C) cấu trúc dạng hình gậy của các pospiviroid. D) cấu trúc dạng gần hình gậy của các

avsunviroid.

21.5 DANH PHÁP VÀ PHÂN LOẠI

21.5.1 Danh pháp viroid

Các viroid đƣợc đặt tên giống nhƣ virus, tuy nhiên từ cuối cùng là ―viroid‖. Ví dụ:

- Potato spindle tuber viroid (PSTVd)

- Avocado sunblotch viroid (ASBVd)

A

B

C

D

204

21.5.2 Phân loại viroid

Dựa vào cấu trúc phân tử và quan hệ chuỗi nucleic acid (ngƣỡng đồng nhất trình tự 75%), các

viroid hiện nay đƣợc phân loại thành 2 họ Avsunviroidae và Pospiviroidae.

Các thành viên thuộc họ Avsunviroidae có khả năng tự cắt các multimers đƣợc tạo ra trong

quá trình tái sinh và không có vùng bảo thủ trung tâm (central conserved region (CCR)).

Các thành viên của họ Pospiviroidae không có có khả năng tự cắt các multimers đƣợc tạo ra

trong quá trình tái sinh và có một vùng bảo thủ trung tâm (central conserved region (CCR)).

Các loài trong mỗi họ đƣợc xác định chủ yếu dựa trên mức độ tƣơng đồng chuỗi RNA.

Ngƣỡng phân biệt loài là 90% mức đồng nhất chuỗi RNA.

Các chi đƣợc phân biệt trên cơ sở sự có mặt hay không có mặt và đặc điểm của vùng bảo thủ

trung tâm (CCR).

Bảng 21-1 Phân loại viroid (ICTV, 2009)

Họ Chi Loài chuẩn Số loài

Avsunviroidae

Avsunviroid Avocado sunblotch viroid 1

Elaviroid Eggplant latent viroid 1

Pelamoviroid Peach latent mosaic viroid 2

Pospiviroidae

Apscaviroid Apple scar skin viroid 10

Cocadviroid Coconut cadang-cadang viroid 4

Coleviroid Coleus blumei viroid 1 3

Hostuviroid Hop stunt viroid 1

Pospiviroid Potato spindle tuber viroid 9

31

21.6 TRIỆU CHỨNG, CƠ CHẾ GÂY BỆNH VÀ LAN TRUYỀN

21.6.1 Triệu chứng

Triệu chứng bệnh viroid nhìn chung tƣơng tự triệu chứng do virus gây ra. Triệu chứng thay

đổi theo loài/chủng viroid, loài/giống cây ký chủ, và cả điều kiện môi trƣờng. Nhìn chung, một

trong các triệu chứng phổ biến nhât của bệnh viroid là ―còi cọc‖ (stunt) có nghĩa cây thấp nhỏ.

21.6.2 Cơ chế gây bệnh

RNA của viroid có thể có các đoạn tƣơng đồng với RNA của ký chủ dẫn tới (i) viroid có thể

bắt cặp với mRNA của ký chủ và ức chế quá trình vận chuyển, dịch mã của các mRNA này hoặc

(ii) tƣơng tác với quá trình điều khiển biểu hiện gen ký chủ thông qua cơ chế câm gen. Ngoài ra,

viroid cũng đƣợc chứng minh là có thể tƣơng tác với protein ký chủ để cảm ứng gây bệnh

21.6.3 Lan truyền

Viroid lan truyền qua tiếp xúc cơ học, ghép, vật liệu giống là chủ yếu.

205

21.7 TÁI SINH CỦA VIROID

Viroid tái sinh theo cơ chế vòng lăn (rolling-circle) và gồm 2 phƣơng thức:

21.7.1 Phƣơng thức bất đối xứng (asymmetric)

Đây là cách tái sinh của các viroid họ Pospivirodae. Phân tử RNA genome mạch vòng, cực

(+), dạng monomer của viroid đƣợc phiên mã bởi RdRp của ký chủ để tạo ra sợi cực (-) dạng

oligomer. Trên khuôn sợi cực (-), sợi cực (+) cũng dạng oligomer đƣợc tổng hợp. Tiếp theo, với

sự tham gia của yếu tố ký chủ (HF, host factor), sợi cực (+) dạng oligomer sẽ đƣợc cắt để tạo

thành sợi cực (+) dạng monomer và đƣợc nối lại thành mạch vòng.

21.7.2 Phƣơng thức đối xứng (symmetric)

Đây là cách tái sinh của các viroid họ Avsunvirodae. Phân tử RNA genome mạch vòng, cực

(+), dạng monomer của viroid đƣợc phiên mã bởi RdRp của ký chủ để tạo ra sợi cực (-) nhƣng

đƣợc cắt luôn bởi ribozyme đầu búa của viroid để tạo dạng monomer và đƣợc nối lại ngay để tạo

thành sợi mạch vòng cực (-). Phân tử sợi mạch vòng, cực (-) này đƣợc dùng làm khuôn để tổng

hợp sợi (+) và cũng đƣợc cắt và nối ngay thành sợi mạch vòng, cực (+) dạng monomer.

Hình 21-2 Sơ đồ tái sinh của viroid (Daros et al., 2006)

21.8 POTATO SPINDLE TUBER VIROID (PSTVD)

Tác nhân: Potato spindle tuber viroid (PSTVd), họ Pospiviroidae

Bệnh: củ khoai tây hình thoi

Tầm quan trọng: có thể giảm 25 % năng suất

Ký chủ: Khoai tây (chính); cũng nhiễm tự nhiên trên nhiều cây họ cà khác

Triệu chứng: củ: nhỏ, dài nhiều mắt; cây: lùn, đẻ nhiều nhánh

Phân bố: khắp thế giới

Lan truyền: dễ dàng qua tiếp xúc cơ học; côn trùng miệng nhai; có thể qua phấn hoa

Hình 21-3 Bệnh củ khoai tây hình thoi

206

21.9 COCONUT CADANG-CADANG VIROID (CCCVD)

Tác nhân: Coconut cadang-cadang viroid (CCCVd), họ Pospiviroidae

Bệnh: cadang-cadang trên cây cọ

Tầm quan trọng: nguy hiểm nhất trên cọ tại Philippin (30+ triệu cây cọ đã chết vào 1982)

Ký chủ: Cọ

Triệu chứng: kéo dài hàng năm. Quả tròn, nhỏ; đốm biến vàng trên lá, không hình thành hoa,

cây còi cọc.

Phân bố: Philippin

Lan truyền: Chƣa rõ. Bằng thực nghiệm, viroid có thể truyền qua phấn hoa, hạt, dụng cụ thu

hái.

21.10 AVOCADO SUNBLOTCH VIROID (ASBVD)

Tác nhân: Avocado sunblotch viroid (ASBVd), họ Avsunviroidae

1. Tầm quan trọng: giảm năng suất từ 30 – 95% tùy giống

2. Ký chủ: Cây bơ là ký chủ tự nhiên duy nhât

3. Triệu chứng: cây thấp nhỏ; quả nhỏ, có nhiều vết biến màu nhƣ bị bỏng nắng

4. Phân bố: châu Mỹ, châu Âu, Öc, châu Á (Israel)

5. Lan truyền: chủ yếu qua ghép; cây con làm gốc ghép trồng từ hạt cây nhiễm bệnh (tỷ lệ

truyền qua hạt có thể tới 95%).

21.11 CÂU HỎI ÔN TẠP CHƢƠNG 21

1. Lịch sử nghiên cứu viroid

2. Bản chất viroid (định nghĩa, cấu trúc sơ cấp, thứ cấp, tái sinh)

3. Phân loại và danh pháp viroid.

4. Đặc điểm gây bệnh và lan truyền

5. Potato spindle tuber viroid

21.12 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH

1. Daròs, J.-A., Elena, S. F. & Flores, R. (2006). Viroids: an Ariadne‘s thread into the RNA

labyrinth. EMBO reports 7, 593–598.

2. Diener, T. O. (2003). Discovering viroids—a personal perspective. Nature Review

Microbiology 1, 75–80.

3. Flores, R., Hernandez, C., Alba, A. E. M. ı. d., Daros, J.-A. & Serio, F. D. (2005). VIROIDS

AND VIROID-HOST INTERACTIONS. Annu Rev Phytopathol 43, 117–139.

4. Góra-Sochacka, A. (2004). Viroids: unusual small pathogenic RNAs. Acta Biochimica

Polonica 51, 587–607.

5. Hull, R. (2002). Matthews's Plant Virology. Fourth edition: Academic Press.

207

PHẦN 3: THỰC HÀNH

208

Bài 1. ĐIỀU TRA BỆNH VIRUS

Mục đích

Giúp sinh viên biết đƣợc triệu chứng bệnh virus ngoài đồng ruộng

Biết cách điều tra đồng ruộng

Biết cách thu thập và bảo quản mẫu bệnh virus

Nội dung

Điều tra một bệnh ngoài đồng ruộng theo yêu cầu của giáo viên (bệnh sẽ thay đổi theo

thực tế đồng ruộng)

Thu thập mẫu: Mỗi nhóm thu 10 mẫu bệnh virus trên 10 loại cây trồng khác nhau. Các

mẫu cần thu thập trƣớc buổi thực tập 1-2 ngày, bảo quản trong hộp ẩm, túi ẩm, hoặc

trồng lại trong cốc nhựa (đối với mẫu cây nhỏ) để đảm bảo mẫu vẫn còn tƣơi khi mang

đến phòng thực hành. Giáo viên sẽ hƣớng dẫn phân biệt các mẫu tại phòng thực tập. Xem

bảng gợi ý mẫu bệnh virus/cây trồng sẵn có tại miền BắcViệt Nam.

Xử lý khô mẫu bằng silicagel để bảo quản lâu dài

Vật liệu

Silicagel tự chỉ thị, giấy thấm, lọ có nắp hoặc ống falcon loại 50 mL.

Yêu cầu cụ thể đối với sinh viên

Lớp chia nhóm (5 sinh viên/nhóm)

Mỗi nhóm thực hiện tất cả các nội dung trên và viết báo cáo riêng

Báo cáo

o Trình bày trên word

o Tên nhóm và các thành viên

o Về điều tra bệnh:

– Tên bệnh, tên cây ký chủ (giống nếu có), giai đoạn sinh trƣởng, địa điểm,

ngày điều tra, thu mẫu. Tham khảo tài liệu dịch bệnh cây để biết phƣơng

pháp điều tra.

– Kết quả điều tra:

– Tỷ lệ bệnh (%), cần kèm dung lƣợng mẫu

– Mô tả triệu chứng điển hình (kèm ảnh minh họa)

– Nhận xét chung về tình hình bệnh

– Tham khảo 2-3 tài liệu để mô tả khoảng ½ trang về virus gây bệnh (hình

thái, phân loại, đặc điểm bộ gen, bệnh gây ra trên cây, quan hệ vector).

o Về thu thập mẫu bệnh:

– Lập bảng ghi tên mẫu bệnh thu thập gồm cây, tên bệnh và tên virus (dự

đoán). Đối chiếu với hƣớng dẫn của giáo viên

209

Bảng hƣớng dẫn tìm cây và bệnh virus (Chú ý có thể tìm cả các cây trồng và cây dại

khác nếu phát hiện thấy triệu chứng giống bị nhiễm virus)

TT Cây Virus

1 Lúa SRBSDV, RRSV, RYSV

2 Ngô SCMV (Sugar cane mosaic potyvirus), SRBSDV

3 Hoa loa kèn LMoV (Lily mottle potyvirus)

4 Hoàng tinh SCMV

5 Dâu tằm MRSV (Mulberry ring spot nepovirus)

6 Chuối tiêu BBTV (Banana bunchytop babuvirus)

7 Chuối ta CMV (Cucumber mosaic cucumovirus)

8 Đu đủ PRSV

9 Bí ngô PRSV, SLCCNV (Squash leaf curl China begomovirus)

10 Dƣa chuột, bầu… PRSV, ZYMV (Zucchini yellow mosaic potyvirus)

11 Đậu tƣơng, sắn dây KuMV (Kudzu mosaic begomovirus)

Sắn dây KuMV (Kudzu mosaic begomovirus)

12 Đậu đỗ khác BCMV (Bean common mosaic potyvirus)

13 Cà chua Begomoviruses

14 Ớt ChiVMoV (Chilli veinal mottle potyvirus)

15 Khoai sọ DsMV (Dasheen mosaic potyvirus)

16 Khoai tây PVY (Potato virus Y)

PVX (Potato virus X)

17 Hành, tỏi OYDV (Onion yellow dwarf potyvirus), LYSV (Leek yellow

stripe potyvirus), SYSV (Shallot yellow stripe poyvirus)

18 Lữ đằng Begomovirus

19 Hoa ngũ sắc Begomovirus

20 Nhọ nồi Begomovirus

210

Bài 2. LÂY NHIỄM NHÂN TẠO VIRUS BẰNG TIẾP XÖC CƠ HỌC

Mục đích

Sinh viên biết cách lây nhiễm nhân tạo bệnh virus bằng tiếp xúc cơ học

Nội dung

Tự trồng cây thí nghiệm.

Mang cây thí nghiệm đến phòng thực tập để lây nhiễm

Tự theo dõi và đánh giá kết quả lây nhiễm

Yêu cầu cụ thể đối với sinh viên

Lớp chia nhóm (5 sinh viên / nhóm)

Mỗi nhóm thực hiện các nhiệm vụ cụ thể sau

o Trồng cây thí nghiệm: Trƣớc ngày thí nghiệm khoảng 1 tuần, gieo các hạt đậu

tƣơng và bầu bí vào cốc nhựa nhỏ (loại cốc nhựa uống nƣớc dùng 1 lần) và mua

đu đủ con.

Đậu tƣơng: 10 hạt / 5 cốc

Bầu bí: 10 hạt/5 cốc

o Mua cây thí nghiệm: mỗi nhóm mua 3 cây đu đủ con. Các cây đƣợc trồng vào túi

bầu trồng cây

o Mang cây thí nghiệm tới phòng thực tập và thực hiện lây nhiễm theo hƣớng dẫn

của giáo viên.

o Lây PRSV trên đu đủ, bầu bí, cây chỉ thị (rau muối hoặc thuốc lá)

o Lây KuMV trên đậu tƣơng

o Viết báo cáo

Báo cáo

Trình bày trên word

Tên nhóm và các thành viên

Kết quả lây nhiễm sau 3 ngày, 7 ngày, 14 ngày (Ghi triệu chứng quan sát thấy + ảnh).

Trình tự lây bệnh nhân tạo bằng tiếp xúc cơ học

Thao tác

Nghiền lá bệnh bằng chày và cối sứ sạch trong đệm phosphate 0.1 M, pH 7.5 theo tỷ lệ 1

g mô lá/2 ml đệm; lọc qua vải lọc hoặc giấy lọc (chú ý giữ lạnh dịch nghiền trên đá)

Thổi bột carborandum 600mesh lên lá cây cần lây

Dùng ngón tay hoặc tăm bông tẩm dịch virus và lƣớt nhẹ trên lá từ cuống đến chót, chú ý

không quá mạnh

Rửa ngay lá lây bằng nƣớc. Đánh dấu lá đã lây bằng bút viết kính

Theo dõi kết quả sau 1 - 2 tuần

211

Bài 3. PHÁT HIỆN VIRUS BẰNG ELISA

Mục đích

Sinh viên biết sử dụng kỹ thuật ELISA để chẩn đoán virus thực vật

Nội dung

Tự thu thập mẫu bệnh ngoài đồng ruộng

Thực hiện phản ứng ELISA gián tiếp kiểu PTA-ELISA (Plate Trapped Antigen - ELISA)

để phát hiện virus PRSV

Yêu cầu cụ thể đối với sinh viên

Lớp chia nhóm (5 sinh viên / nhóm)

Mỗi nhóm thực hiện phản ứng PTA-ELISA trên 4 mẫu để phát hiện PRSV gồm:

– Mẫu đu đủ bệnh (đối chứng dƣơng): 1 mẫu

– Mẫu bầu bí (bất kỳ cây học bầu bí biểu hiện triệu chứng khảm): 2 mẫu

– Mẫu đu đủ khỏe (đối chứng cây khỏe): 1 mẫu

Báo cáo

Trình bày trên word

Tên nhóm và các thành viên

Kết quả ELISA đối với các mẫu

Qui trình chẩn đoán bệnh virus bằng kỹ thuật PTA-ELISA

Chuẩn bị

1. Dụng cụ: chày cối sứ sạch, tube 1,5ml, pipet, giấy thấm, bản ELISA, hộp nhựa

2. Các đệm ELISA: Đệm nghiền mẫu (đệm carbonate), đệm rửa (đệm PBS-T), đệm pha kháng

thể (đệm PBS-T- ovalbumin), đệm cơ chất (chất nền).

3. Hai loại kháng thể: IgG thỏ đặc hiệu PRSV, IgG chuột/dê đặc hiệu IgG thỏ liên kết enzyme

Alkaline Phosphatase (AP)

4. Chất nền Nitrophenyl phosphate (NPP), dạng viên hoặc bột.

Thực hiện phản ứng

1. Cố định dịch cây vào bản ELISA: Nghiền mẫu cây trong đệm nghiền mẫu và cho 100

l/giếng. Ủ bản ELISA qua đêm ở 4-6OC trong hộp ẩm (hoặc 2- 4 giở ở 37

oC). Rửa bản 3

lần bằng đệm rửa (PBS-T). Protein của cây và virus trong dịch cây (nếu có) sẽ liên kết không

đặc hiệu vào thành giếng.

2. Cố định IgG thỏ đặc hiệu virus vào bản ELISA: Hoà IgG đặc hiệu virus trong đệm PBS-T-

ovalbumin và cho 100 l/giếng. Ủ bản ELISA ở 37 OC 2-4 giờ trong hộp ẩm. Rửa bản

ELISA nhƣ bƣớc 1.

3. Cố định IgG đặc hiệu IgG thỏ liên kết AP vào bản ELISA: Hoà IgG đặc hiệu IgG thỏ liên

kết AP trong đệm PBS-T-ovalbumin và cho 100 l/giếng. Ủ bản ELISA ở 37 OC 2-4 giờ

trong hộp ẩm. IgG liên kết AP thứ 2 này là IgG đƣợc tạo ra khi tiêm IgG của thỏ vào 1 loài

212

động vật khác thỏ (chẳng hạn chuột hoặc dê) nên không liên kết với virus mà liên kết với IgG

thỏ đặc hiệu virus ở bƣớc 2. Sau khi ủ, rửa bản nhƣ bƣớc 1

4. Cố định chất nền và đánh giá kết quả: Hoà chất nền trong đệm chất nền theo tỷ lệ 0.6

mg/ml) và cho giếng với lƣợng 100l/giếng. Chất nền ở đây là Nitrophenyl phosphate (NPP).

Bản ELISA đƣợc ủ ở nhiệt độ phòng trong hộp ẩm trong tối 60 phút. Phản ứng hoá học ở đây

là NPP sẽ bị thuỷ phân thành Nitrophenol phosphate dƣới sự xúc tác của enzyme AP.

Nitrophenol phosphate là chất có màu vàng, do vậy có thể nhận biết đƣợc bằng mắt hoặc

bằng máy đọc ELISA (máy so màu). Hiển nhiên, do nồng độ NPP đều giống nhau ở các

giếng nên giếng nào có màu vàng càng đậm chứng tỏ nồng độ enzyme càng cao tức nồng độ

virus trong mẫu thử càng cao. Có thể ngừng phản ứng thuỷ phân bằng cách bổ sung dung

dịch NaOH 3M với lƣợng 25-50 l/giếng.

213

Bài 4. PHÁT HIỆN VIRUS BẰNG PCR/RT-PCR

(Tùy thuộc điều kiện)

Mục đích

Sinh viên biết sử dụng kỹ thuật PCR/RT-PCR để chẩn đoán virus thực vật

Nội dung

Tự thu thập mẫu bệnh ngoài đồng ruộng

Thực hiện phản ứng PCR để phát hiện begomovirus hoặc RT-PCR để phát hiện virus

RYSV. Loại virus có thể thay đổi theo thực tế đồng ruộng.

Yêu cầu

Lớp chia nhóm (5 sinh viên / nhóm)

Mỗi nhóm thực hiện phản ứng PCR hoặc RT-PCR trên một mẫu thu thập ngoài đồng

ruộng

Nội dung

Chiết DNA hoặc RNA tổng số từ mẫu cây

Thực hiện phản ứng PCR hoặc RT-PCR

Kiểm tra kết quả phản ứng bằng điện di agarose

Qui trình chẩn đoán begomovirus bằng PCR dùng mồi chung

Mồi phát hiện

Begomovirus là các virus có bộ gien DNA sợi vòng đơn, kích thƣớc khoảng 2.6 – 2.8 kb.

Sử dụng một cặp mồi chung (degenerate primers) BegoAFor1 và BegoARev1 đƣợc thiết kế ở

vùng bảo thủ của phân tử DNA-A để phát hiện begomovirus (ví dụ trên cây cà chua bị bệnh xoăn

vàng lá). Sản phẩm của phản ứng ~ 1.2 kb. Vị trí mồi trình bày ở Hình 1.

Hình 1. Sơ đồ tổ chức bộ gen của begomovirus và vị trí cặp mồi chung

Chiết DNA tổng số t mô cây

Chuẩn bị

1. Đệm chiết (đệm CTAB, Cetyl trimethylammonium bromide)

2. Chloroform: Isoamylalcolhol (24:1)

3. β Mercaptoethanol (BME)

4. Ethanol 70%

5. 2-Propanol

6. Đệm TE (Tris EDTA)

214

7. Chày, cối sứ (hoặc tube 1.5 mL và chày nhựa): rửa sạch ngâm trong dung dịch NaOH 3M

(1 ngày), rửa lại bằng nƣớc cất rồi hấp vô trùng.

8. Tube 1,5ml

9. Bút viết kính

10. Pipet (1000, 200) và tip

11. Máy li tâm để bàn (15000 g)

12. Bể nhiệt

Quy trình chiết

1. Ủ đệm chiết CTAB (cứ 1 mẫu chiết cần 1ml đệm) đã bổ sung BME (với tỉ lệ 1ml đệm

CTAB :10 μL BME) trong bể nhiệt ở nhiệt độ 60oC trong 30 phút.

2. Lấy 0,1 g mô lá bệnh nghiền với 1 ml CTAB bằng chày cối sứ (nghiền đến khi dung dịch

thu đƣợc là một thể đồng nhất). Chuyển dịch nghiền vào tube 1,5 ml. Ủ ở 65 oC trong 10

phút ở bể nhiệt.

3. Li tâm 13000 g trong 5 phút, thu dịch trên tủa (700 μL) cho vào tube mới

4. Cho Chloroform: Isoamylalcolhol (24 :1) vào tube với tỉ lệ thể tích tƣơng đƣơng. Đảo đều tube.

5. Li tâm 13000 g trong 5 phút, thu dịch trên tủa (600 μL).

6. Lặp lại các bƣớc 4, 5 thêm một lần nữa và thu dịch trên tủa (400 μL).

7. Cho thể tích tƣơng đƣơng (400 μL) 2-propanol lạnh vào tube. Đảo đều tube và để lạnh (-

20 oC) 30 phút.

8. Li tâm 13000 g trong 15 phút. Loại bỏ dịch phía trên, thu lấy cặn DNA tổng số.

9. Rửa cặn bằng Ethanol 70% hai lần (mỗi lần 0.7 – 1 mL)

10. Làm khô cặn DNA bằng cách mở nắp tube, để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút (trong buồng cấy).

11. Hòa cặn trong 20-50 μL nƣớc cất 2 lần vô trùng hoặc đệm TE và bảo quản dich DNA ở -

20 oC

Thực hiện phản ứng PCR

Cho vào mỗi tube PCR loại 0.5 mL các thành phần sau:

Thành phần Thể tích cần lấy (μL)

Dd H2O 19.3

Đệm PCR (10X) 2.5

dNTPs (10 mM mỗi loại) 0.5

Mồi xuôi dòng: BegoAFor1 (20 μM) 1.0

Mồi ngƣợc dòng: BegoARev1 (20 μM) 1.0

DNA polymerase (Taq) (5U/ μL) 0.2

DNA tổng số 0.5

Tổng thể tích 25

Cho vào máy PCR và thực hiện phản ứng PCR với điều kiện phản ứng sau:

215

Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kỳ

Khởi đầu biến tính 92 4 phút 1

Các chu kỳ tổng hợp

92 35 giây

30 50 35 giây

72 1 phút

Kết thúc 72 5 phút 1

Qui trình chẩn đoán RYSV gây bệnh vàng lụi lúa bằng RT-PCR dung mồi chung

RYSV là một virus có bộ gen RNA sợi đơn, cực âm, không phân mảnh, kích thƣớc ~ 14 kb.

Sử dụng cặp mồi đặc hiệu RY-L-F2 và RY-L-R2 thiết kế trên gen L (large) (Hình 2) để phát hiện

virus bằng RT-PCR trên mẫu cây lúa bị bệnh vàng lụi.

Mồi phản ứng

Hình 2. Tổ chức bộ gen RYSV và vị trí cặp mồi đặc hiệu

Chiết RNA tổng số t mô cây

Chuẩn bị

1. Đệm chiết (đệm CTAB)

2. LiCl 10 M

3. Chloroform: Isoamylalcolhol (24:1)

4. β Mercaptoethanol (BME)

5. Ethanol 70%

6. Chày, cối sứ (hoặc tube 1.5 mL và chày nhựa): rửa sạch ngâm trong dung dịch NaOH 3M

(1 ngày), rửa lại bằng nƣớc cất rồi hấp vô trùng.

7. Tube 1,5ml

8. Bút viết kính

9. Pipet (1000, 200) và tip

10. Máy li tâm để bàn (15000 g)

11. Bể nhiệt

Quy trình chiết

1. Ủ đệm chiết CTAB (cứ 1 mẫu chiết cần 1ml đệm) đã bổ sung BME (với tỉ lệ 1ml đệm

CTAB :10 μL BME) trong bể nhiệt ở nhiệt độ 60 oC trong 30 phút.

2. Lấy 0,1 g mô lá bệnh nghiền với 1ml CTAB bằng chày cối sứ (nghiền đến khi dung dịch

thu đƣợc là một thể đồng nhất). Chuyển dịch nghiền vào tube 1,5 ml. Ủ ở 65 oC trong 10

phút ở bể nhiệt.

3. Li tâm 13000 g trong 5 phút, thu dịch trên tủa (700 μL) cho vào tube mới

216

4. Cho Chloroform: Isoamylalcolhol (24 :1) vào tube với tỉ lệ thể tích tƣơng đƣơng. Đảo

đều tube.

5. Li tâm 13000 g trong 5 phút, thu dịch trên tủa (600 μL).

6. Lặp lại các bƣớc 4, 5 thêm một lần nữa và thu dịch trên tủa (400 μL).

7. Cho ¼ thể tích LiCl 10 M (100 μL) vào tube. Đảo đều tube và để lạnh (-20 oC) 30 phút.

8. Li tâm 13000 g trong 15 phút. Loại bỏ dịch trên tủa, giữ lại cặn RNA tổng số.

9. Rửa cặn RNA bằng Ethanol 70 % hai lần (mỗi lần 0.7 – 1 mL)

10. Làm khô cặn RNA bằng cách mở nắp tube, để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút (trong buồng cấy).

11. Hòa cặn trong 20-50 μL nƣớc cất 2 lần vô trùng hoặc đệm TE và bảo quản dịch RNA ở -

80 oC

Thực hiện phản ứng PCR

Cho vào mỗi tube PCR loại 0.5 mL các thành phần sau:

Thành phần Thể tích cần lấy (µl)

H2O 15. 5

Dream Taq Buffer 5X 2.0

dNTPs 0.3

Mồi RY-L-F2 0.3

Mồi RY-L-R2 0.3

Reverse Aid enzyme (fermentas) 0.3

Dream Taq enzyme (Fermentas) 0.3

RNA tổng số 1

Tổng 20

Cho vào máy PCR và thực hiện phản ứng RT-PCR với điều kiện sau

Nhiệt độ ( oC) Thời gian Số chu kỳ

Tổng hợp cDNA 50 30 phút 1

Khởi đầu biến tính 92 4 phút 1

Các chu kỳ tổng hợp

92 35 giây

30 50 35 giây

72 1 phút

Kết thúc 72 5 phút 1

Kiểm tra kết quả PCR hoặc RT-PCR bằng điện di agarose

Chuẩn bị

1. Pha đệm điện di TAE 1x từ dung dịch gốc (TAE 5x): lấy 100 ml TAE 5x cho vào cốc đong,

bổ sung thêm 400 ml nƣớc cất, lắc đều.

217

2. Chuẩn bị bản gel: Cân 1g agarose cho vào trong lọ, bổ sung 100 ml TAE 1x, lắc đều và cho

vào lò vi sóng để hoà tan agarose (khoảng 3 phuts). Sau khi agarose đã tan hoàn toàn, bổ

sung 2 µl Ethidium Bromide, lắc đều, để lọ ở nhiệt độ phòng. Khi dung dịch agarose 1% nằm

trong khoảng 50oC thì đổ vào khay gel đã đặt sẵn lƣợc (dày khoảng 0.6 cm). Để khay gel ở

nhiệt độ phòng khoảng 30 phút để đông gel.

3. Chuẩn bị mẫu điện di: Lấy các tube 0,5 ml sạch, đánh số thứ tự. Cho vào mỗi tube 2 µl đệm

cài gel (Loading Dye) 6x và 10 µl sản phẩm PCR hoặc RT-PCR. Trộn đều và ly tâm nhanh

(spin) trong 5 giây.

Điện di

1. Sau 30 phút để khay gel ở nhiệt độ phòng thì tiến hành rút lƣợc (cầm chính giữa lƣợc, rút đều

tay để không vỡ giếng).

2. Đặt cả khay gel vào bể điện di, đổ dung dịch đệm TAE 1x phủ ngập gel (gel ngập sâu

khoảng 1mm).

3. Dùng pipet cho tất cả mẫu điện di (12 µl) vào giếng. Chú ý: (i) luôn cho thang DNA (DNA

marker) vào bản gel (thƣờng là giếng đầu tiên) và (ii) thao tác phải cẩn thận để tránh tràn

mẫu.

4. Cắm nguồn điện cho máy điện di ở hiệu điện thế 100 V trong 30 phút.

5. Sau khi điện di, đặt bản agarose lên máy soi gel (phát tia UV) và quan sát các băng DNA

hình thành và so sánh với thang DNA để đánh giá kết quả. Chụp ảnh nếu cần thiết.