Virusneutralizace v Virusneutralizace v diagnostice diagnostice chřipkové infekcechřipkové infekce

Martina HavlíčkováMartina Havlíčková

Chřipka-Chřipka-nejpoužívanější testynejpoužívanější testy

• KFR rutinně zavedená ve většině laboratoří, typově specifická, výborné zkušenosti u pandemie

• HIT pouze některá pracoviště, subtypově a variantně specifický

• VNT dostupný zpravidla jen v NRL citlivější než HIT, reaguje širší spektrum protilátek než u HIT• ELISA , IF• SRHT specifický test, pouze pro některé účely ve

vakcinologii

komerční sety, u IF nutná zkušenost s hodnocením

stanoveny parametry pro práh pozitivity/protekci

VirusneutralizaceVirusneutralizace• Měří celé spektrum protilátek, které mají

neutralizační schopnosti• Proto je citlivější než HIT a KFRALE:• Nutnost práce s živým virem• Virus musí mít dobré růstové vlastnosti v tkáňové

kultuře – TCID50 minimálně 10-4

• Test musí být optimálně vyvážen, vzhledem k jisté nestabilitě kultivačního systému není příliš robustní

• Nezbytný systém standardních pozitivních i negativních kontrol

Různé metodikyRůzné metodiky

• Očkování na buněčný monolayer• Očkování přímo do suspenze buněk

– tento dvojí přístup nemusí být stejně citlivý, především co do výše infekčního titru viru, který je pro reakci použit

• Redukce plaků• Reakci významně ovlivňuje i kvalita a složení příslušného

kultivačního média

• Vizualizace výsledků:– ELISA in situ– Hemaglutinace

• oba přístupy porovnatelné, HA jednodušší a rychlejší– Mikroskopické posouzení inhibice hemadsorpce– Posuzování CPE není u chřipky vhodné– Redukce plaků – pro širší využití nevhodné, striktně závislé na na

schopnosti´použitého viru plakovat

Metodika používaná v NRLMetodika používaná v NRL• Adaptována dle Rowe a spol. 1999

– Inaktivovaná a vytitrovaná séra byla smíchána s virem v koncentraci 2x103

TCID50

– 2 hodiny inkubace při 37°C v 5% CO2 atmosféře

– Přidána buněčná suspenze v koncentraci 350 000 buněk /ml– Inkubace 48 hodin– HA test pro hodnocení replikace viru/inhibice

replikace

Vyvažovánítestu

Porovnání geometrických průměrů titrů protilátek proti viru Porovnání geometrických průměrů titrů protilátek proti viru pandemic H1N1 2009 v akutním a rekonvalescentním vzorku pandemic H1N1 2009 v akutním a rekonvalescentním vzorku séra pomocí tří základních sérologických metod – KFR, HIT a séra pomocí tří základních sérologických metod – KFR, HIT a VNT u 40 pacientů s PCR prokázanou infekcíVNT u 40 pacientů s PCR prokázanou infekcí

1,4 6,1 5,1

25,2

115,1

50,2

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

140,0

HIT VNT CFT

I

II

číslo HIT VNT izolace A(H1N1) IgA IgM IgG82048/82265 20/80 80/640 pozit. A Sw 256/256 hraniční/neg neg/neg poz/poz81978/82238 0/40 0/160 pozit. A Sw 0/64 neg/poz neg/neg poz/poz81614/82156 0/40 10/320 pozit. A Sw 16/32 neg/neg neg/neg poz/poz81159/81339 0/0 0/10 negativní 0/0 neg/neg hraniční/poz poz/poz81556/82015 40/>20 <640/320 negativní 32/32 poz/poz poz/hraniční poz/poz90135/90135 10/40 0/160 negativní 32/32 neg/neg neg/neg poz/poz82177/82282 0/0 10/40 pozit. A Sw 0/0 neg/poz neg/neg poz/poz81480/81560 0/0 10/80 pozit. A Sw 0/64 hraniční/poz neg/neg poz/poz

KFR

• k provedení reakce je nejvhodnější virus s vysokým TCID50, aby test měl dostatečnou robustnost

• existuje více systémů testu, více médií a protokolů

• při vhodném nastavení jsou porovnatelné• interpretace testu velmi záleží na nastavení

kontrol, vyšetření každého vzorku ve dvojici je nutné

• korelace mezi HIT titrem a VNT titrem není pevná• i relativně nízké titry v HIT (1:20) mohou mít ve

VNT vysoký titr (1:80-1:160)• nízké VNT titry (1:10-1:20) nejsou pravděpodobně

vždy specifické a tvoří pouze pozadí reakce• protektivní titr ve VNT – 1:80…. spíše 1:160• nutné stanovit, ani v metodice WHO není

deklarován

Úskalí a nesnázeÚskalí a nesnáze• Dynamika jednotlivých testů nemusí být

ve shodě, protože každým měříme odlišné spektrum protilátek

• V případě výrazné diskrepance mezi nálezy (např. výtěr PCR pozitivní, HIT nebo KFR negativní, ) lze situaci zpravidla verifikovat pomocí VNT

• IgM a IgA protilátky – doplňující význam, negativita nálezu v žádném případě nevylučuje proběhlou či probíhající infekci

Kdy je VNT vhodná aneb co od Kdy je VNT vhodná aneb co od vyšetření očekáváme?vyšetření očekáváme?

– potvrzení již stanovené diagnózy (PCR pozitivita ve výtěru)

– alespoň částečné vodítko pro terapii??– diferenciálně diagnostický údaj??– momentální stav protilátek proti danému viru

(variantě) – sérologický přehled) – Citlivé zhodnocení vývoje protilátek ve dvojici

séra– Vyšetřování v pandemické situaci, průkaz

protilátek proti novému viru