virologia ano lectivo 2010/11 técnicas diagnóstico virologia – parte i
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VirologiaAno Lectivo 2010/11
Técnicas Diagnóstico Virologia – Parte I
Testes imunológicos Baseiam-se em reacções antígeno-anticorpo:
Anticorpos – molécula solúvel produzida por plasmócitos durante
a reposta imune humoral, com capacidade de se ligar
especificamente a um epítopo de um antígeno.
Antigénio – qualquer substância ou molécula estranha capaz de
induzir uma resposta imune no hospedeiro e/ou capaz de se ligar
através do(s) seu(s) epítopo(s) a um anticorpo.
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 2
Anticorpo Cadeias de glicoproteícas :
Cadeias leves Cadeias pesadas
Região constante – local de activação de outros elementos dos S. Imune;
Região variável – local de ligação ao antigénio
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 3
AnticorpoTipos de anticorpos
PoliclonaisObtidos a partir de diferentes clones de células;
MonoclonaisObtidos a partir de um único clone de plasmócitos
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Classes de anticorpos no Homem
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Imunoglobulinas Características
IgG Principal Ig sérica Envolvida na activação do complemento e na opsonisação
IgM Primeiro Ac a ser produzido (fase aguda)Confinada aos vasos sanguíneos e tecidos inflamados
IgA Presente no soro, secreções e mucosasTem funções de opsonização.
IgD Encontra-se na membrana de linfócitos B, funcionando como receptor de antigénios.Funções pouco definidas.
IgE Desencadeia a liberação de histaminas dos mastócitos, basófilos e eosinófilos.Responsável pelas alergias. Confere protecção contra parasitas.
Antígeno
Epítopo
Região do antígeno que reage com o anticorpo
Possibilidade de reacções cruzadas
Pequenas alterações na estrutura do antígeno,
entre outras factores, podem afetar
profundamente a ligação com o anticorpo
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Aplicabilidade
Papel importante:
Tipo de amostra varia conforme o
que queremos pesquisar
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Diagnóstico
Monitorização
Tratamento
Técnicas de Imunologia
Reacções Imunoenzimáticas
ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent assay)
ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay)
Imunofluorescência
Imunocromatografia
ImunoHisto/Citoquímica
Análise Proteínas: Western Blot
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Reacções Imunoenzimáticas
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ELISA
Permite determinar a concentração do analito
Calcular curva de calibração – interpolar a concentração da molécula a quantificar
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Baseia-se numa reação imunoenzimática com detecção final por espectrofotometria
Tipos de ELISA
Sandwich
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 11
1. Poços revestidos com anticorpo especifico
2. Formação de complexos
3. Ac Secundário (conjugado com a enzima)
4. Adição do substrato
5. Medição por espectrofotometria
Tipos de ELISA
Indireto
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1. Poços revestidos com antígeno específico
2. Formação de complexos
3. Ac conjugado com enzima
4. Adição do substrato
5. Medição por espectrofotometria
Tipos de ELISA
Competitivo
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 13
1. Ac específicos incubados com a amostra
2. Adição dos complexos formados a placa revestida com Ag
3. Ac secundário
4. Adição do substrato
5. Medição por espectrofotometria
Quanto maior a concentração de analito menor a absorbância
ELISA
Método automatizado
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ELFA
Permite fazer um análise quantitativa Curva de calibração
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Reação imunoenzimática com detecção final por fluorescência.
ELFA
Teste, geralmente, automatizado onde é
necessário:
Um cone sensibilizado com Ag, serve,
tanto de fase sólida como sistema de
pipetagem
Uma barrete que contem os
reagentes necessários para a
realização da técnica
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Imunofluorescência
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Imunoflurescência
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Os Ac ou Ag especificos estão marcados com fluorocromos
O resultado é visualizado ao microscópio de fluorescência A luz UV excita os fluorocromos havem emissão de fluorescência
Fluorocromos mais usados Fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína – FITC) Rodamina
Imunoflurescência
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Dependendo da técnica pode-se fazer uma análise qualitativa ou semi-
quantitativa
Alta sensibilidade(fluorescência é mais intensa) e especificidade.
Tipos de Imunoflourecênca
Directa
Indirecta
Anti-complemento
Imunofluorescência Indireta
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Etapas
▫ Fixação (quando queremos
pesquisar Ac as laminas vêm
revestidas com o respectivo Ag);
▫ Ac primário
▫ Ac Secundário (marcado com um
fluorocromo);
▫ Reagente de contraste
Imunofluorescência anti-complemento
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Etapas
▫ Inactivação do complemento endógeno
▫ Formação do complexo antigénio-anticorpo
▫ Adição do complemento que se liga ao complexo formado
▫ Ac conjugado que se liga ao complemento
▫ Detecção por microscopia de fluorescência
Imunofluorescência
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Resultados
Permite localizar o analito
EX: Membrana celular
Análise com o corante de contraste
Imunofluorescência
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Resultados
Pesquisa de anticorpos: resultado positivo
(fluorescência verde)
Pesquisa de anticorpos: resultado negativo
Imunocromatografia
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Imunocromatografia
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 25
Teste qualitativo
Detecção antigénios virais ou anticorpos
Rápido e simples
Fase móvel: amostra diluida
Fase sólida: membrana revestida
Imunocromatografia
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Dispositivo com membrana revestida com Ag ou Ac nas zonas T e C
Utilização de Ac específicos marcados com partículas de látex
Ac secundários ligados à membrana – formação de complexos visíveis devido às partículas de látex
ImunoHisto/Citoquímica
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ImunoHisto/Citoquímica
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Imunologia e citologia ou histologia
Estudar a presença ou ausência antigénios (partículas virais, proteínas)
Diferenças de expressão de proteínas
Localização celular do antigénio
Método qualitativo (maior parte dos casos)
Quantificação relativa
ImunoHisto/Citoquímica
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 29
Método directo Ac primário marcado enzimaticamente reage directamente
com o antigénio
Método Indirecto Ac primário que se liga ao antigénio Ac secundário marcado enzimaticamente
Enzima (mais utilizada): peroxidase (PO)
ImunoHisto/Citoquímica
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Principio do método
PO+ H2O2+ Dador de electrões PO+ H2O2+ precipitado
ImunoHisto/Citoquímica
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 31
Passos importantes
Fixação (sol. Alcoólica)
Permeabilizar (detergente)
Ac primário
Ac secundário conjugado
Substrato com agente cromogénio
Corante de contraste
Imunohistoquímica
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 32
Imunohistoquímica
Imunocitoquímica
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 33
Imunocitoquímica
Análise Proteínas
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 34
Western Blot
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 35
SDS-PAGE (PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)
Western Blot
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 36
Blotting
Western Blot
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 37
Detecção
1. Bloqueio da
membrana
2. Ac primário
3. Ac secundário
conjugado
4. Detecção
Western Blot
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 38
Aplicação
VirologiaFonte: slideshare: aula02-tecnicas-diagnostico-virologia-parte-1&user_login=HugoSousa1
Técnicas Diagnóstico Virologia – Parte I