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VII Simposium-Taller “Producción y Aprovechamiento del Nopal en el Noreste de México”

Facultad de Agronomía, UANL y Museo Bernabé de las Casas. Mina, Nuevo León, México.

Octubre 24 y 25, 2008

EVALUACIÓN DE LOS EFECTOS DEL EXTRACTO DE Nopalea cochenillifera EN LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA In vitro

Leticia A. Háuad-Marroquín, C. Córdova-Puente, A. Rangel-Llanas, S. García-

González, L. R. González Laboratorio de Química y Manejo Integral de Recursos Naturales

C. Rodríguez-Padilla

Laboratorio de Inmunología y Virología Facultad de Ciencias Biológicas UANL

RESUMEN El Nopal es una cactácea endémica del continente americano perteneciente a los géneros Opuntia y Nopalea. Su aprovechamiento en México se inició con las antiguas civilizaciones mesoamericanas, que llamaron nopalli, nochtli al nopal. Lo usaron en su alimentación, medicina, utilería doméstica, religión, magia y política. El escudo de la Gran Tenochtitlán ostentaba airosamente un nopal. El fruto de los nopales, la tuna, eran corazones sangrantes, alimento de los dioses. Y en los huertos cultivaban la cochinilla (Dactylopius cacti) uno de los más preciados insectos de donde se obtuvieron colorantes. Dentro de la enorme diversidad biológica presente en México se encuentra su flora, de ella destacan numerosas plantas con propiedades terapéuticas. El uso y aprovechamiento de cactáceas han sido reportados desde la época prehispánica. Entre las diferentes familias estudiadas a través de la fotoquímica destaca el género Opuntia y Nopalea cochenillifera de gran interés medicinal que posee metabolitos secundarios como: taninos, alcaloides, flavonoides, arabinosa, galactosa, ácido galacturónico, ramnosa y xilosa. Se determinó la actividad biológica de los extractos de Nopalea cochenillifera contra las bacterias Escherichia coli, Salmonella sp., y Candida albicans, y se analizaron los compuestos químicos presentes en el Opuntia a fin de determinar la actividad de cada extracto. De los extractos analizados resultó tener una actividad antimicótico interesante de cerca del 90% de citotoxicidad el precedente de la extracción clorofórmica y hexánica. Palabras clave: nopal, Opuntia, Nopalea cochenillifera, actividad biológica, extractos, Escherichia coli, Salmonella sp., Candida albicans

SUMMARY The prickly pear or cactus pear is an endemic cactus of the American continent belonging to the Opuntia and Nopalea genders. The cactus pear uses in Mexico began with the old Meso-American civilizations and was called nopalli, or nochtli. It was used as food, medicine, domestic utilities, in religion, magic and in politics. The shield of the Great Tenochtitlán showed a prickly pear gracefully on it. The prickly pear fruit was related to a bleeding hearts, and as a god’s food. In the orchards they cultivated the cochineal (Dactylopius cacti) one of the most valuable insects, from which they obtained different colorants. In Mexico the flora as enormous biological diversity, there are a high number of plants with therapeutic properties. The cactus pear uses have been reported from prehispanic times. Among the different cactus families studied through photochemistry, the prominent genders were Opuntia and



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Nopalea cochenillifera whit great medicinal interest. These genders possess secondary metabolits as: tannins, alkaloids, flavonoids, arabinose, galactose, galacturonic acid, ramnose and xilose. The extracts biological activities from Nopalea cochenillifera were tested against Escherichia coli, Salmonella sp., and Candida albicans. The chemical compounds present in Opuntia were analyzed in order to determine the activity of each extract too. The analyzed extracts showed an antifungal activity reaching up to 90% of cytotoxicity (from the chloroformic and hexanic extraction). Key Words: Cactus pear, Opuntia, Nopalea cochenillifera, biological activity, extracts, Escherichia coli, Salmonella sp, and Candida albicans.

INTRODUCCION Los seres humanos se exponen diariamente a una gran variedad de sustancias, y algunos de estos compuestos pueden ocasionar respuestas biológicas cuyas características dependen de su biotransformación en el organismo, dando como resultado diversas enfermedades. A través de la historia se ha descrito el uso de plantas para diversas enfermedades. Particularmente en la década se ha incrementado el interés por el estudio potencial terapéutico de productos naturales de origen vegetal.

Los cactus pertenecen a la subfamilia opuntioideae y abarcan más de 200 especies por todo el mundo, 114 de las cuales se encuentran en México. Tal es el caso del nopal (Nopalea), cuya especie, la encontramos en México y América Central. El Nopal es utilizado para el consumo humano, forraje para ganado, entre otros. Las pencas del cactus, contienen generalmente cerca del 92% de agua, 4-6% de carbohidratos, 1% de proteína, 0.2% grasa, 1% de minerales, vitamina C y caroteno. La especie Nopalea se ha utilizado para diversas causas, enfermedades reumáticas, diarrea, analgésico, dolor de dientes, antiinflamatorio, entre otros. La Nopalea cochenillifera ha demostrado, que inhibe la infección al tipo1 del virus herpes. A pesar de estas características biológicas, la validación de algún tipo de antibiótico de la Nopalea cochenillifera, contra especies bacterianas no se ha divulgado aun.



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Por lo anterior, se inicia una línea de investigación, con el propósito de conocer la actividad antimicrobiana de los extractos de Nopalea cochenillifera, frente a los microorganismos causantes de diversos padecimientos.

MATERIALES Y MÉTODOS Para la realización del estudio se seleccionaron los siguientes microorganismos: Salmonella sp., Escherichia coli (ATCC25922) y Candida albicans (Cepa 32354), los microorganismos tienen como referencia la American Type Cultura (Rockville, MD). Las muestras de Nopalea cochenillifera frescos y deshidratados se obtuvieron de la plantación de la empresa MAD Industrias, ubicadas en Villa de García, Nuevo León. Obtención de los extracto de Nopalea cochenillifera Los cladodios frescos de Nopalea cochenillifera fueron cortados en pequeños trozos hasta obtener 1000g de muestra y colocados en un MEM (Matraz Erlenmeyer) de 6 litros, se maceraron con los siguientes solventes (grado reactivo) de polaridad creciente; hexano (CTR), cloroformo (CTR) y etanol (CTR) durante 7 días cada uno. Despues de 7 días, los extracto se evaporaron en rotavapor (Büchi Vac V-500), hasta sequedad. Los cladiodos deshidratados (previamente molidos) se pesaron (60g de muestra) y se colocaron en 3 extractores tipo Soxhlet (Pyrex No. 3740-L, 55/50) y se dejaron durante 7 días cada uno. Al término del tiempo cada extracto se evaporo en un rotavapor. A los extractos obtenidos se le realizarón pruebas químicas sencillas para la identificación de flavonas, flavononas, flavonoles, xantonas, oxhidrilos fenólicos, saponinas y sapogeninas. Además de cromatografía en silica gel en capa delgada. Posteriormente se cultivó Candida albicans en agar YM, se incubó 24h a 37°C, se tomó una colonia y se resuspendió en caldo YM, se ajustó la cantidad de levaduras a 1x103 células/mL en una cámara de Nuebauer. La suspensión de levaduras se depositó en alícuotas de 50 µL de extracto en placas de 96 pozos de fondo plano donde previamente se agregaron 50 µL de caldo YM y se incubaron de 21-24h a 37°C. Posteriormente se adicionaron 10 µL a cada pozo de MTT a una concentración final de 0.5 mg/mL y se incubó el cultivo por 4h. Después de 4h agregaron 50 µL de amortiguador de lisis celular a todos los pozos y se incubó de 16-21h. Se evaluaron las densidades ópticas resultantes de la solubilización del formazán a 570 nm en el lector de microplacas (Gómez-Flores R., et al., 1995). Se cultivó Escherichia coli y Salmonella sp., en agar de Muller-Hilton, se incubó 24h a 39°C, se tomo una colonia y se resuspendió en caldo ICC, se ajusto la cantidad de bacterias a 2x103 células/mL. La suspensión de bacterias se depositó en alícuotas de 50 µL de extracto en placas de 96 pozos de fondo plano, donde previamente se agregaron 50 µL de caldo ICC y se incubaron por 6h a 37°C. Se miden las



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densidades ópticas resultantes de la solubilización del formazán a 570 nm en el lector de micro placas (Gómez-Flores R., et al., 1995). Se adicionaron 10 µL a cada pozo de MTT a una concentración final de 0.5 mg/mL, Se le agregaron 50 µL de amortiguador de lisis celular a todos los pozos. Después de las evaluaciones de densidad óptica, se realizo un análisis estadístico de los resultados obtenidos. Cabe señalar que los resultados estadísticos fueron expresados como la media ± S. E. M. y el nivel de significancia del tratamiento fue evaluado mediante la prueba t de Student a un 95% de confianza *(P ≤ 0.05) y 99% de confianza **(P ≤ 0.01).

RESULTADOS En las pruebas químicas con extracto de Nopalea cochenillifera a temperatura ambiente se encontró que todos los extractos hexánicos, clorofórmicos y etanólicos, de Nopalea cochenillifera a temperatura ambiente resultaron negativos para las pruebas de alcaloides y saponinas (Dragendorff). Por otro lado los extractos hexánicos y etanólicos a temperatura ambiente resultaron negativos para la presencia de flavonoides. Mientras que para el extracto clorofórmico de Nopalea cochenillifera a Temperatura ambiente resultó positivo para flavonoides. Sin embargo, los extractos que resultaron positivo para la presencia de oxhidrilos fenólicos (taninos) fueron el extracto hexánico y etanólico El extracto hexánico de Nopalea cochenillifera a temperatura ambiente resulto ser negativo para los oxhidrilos fenólicos (taninos). Las pruebas químicas de Nopalea cochenillifera en soxhlet observamos que todos los extractos hexánico, clororfórmico y etanólico de Nopalea cochenillifera resultaron ser negativos para las pruebas de alcaloides y saponinas. Mientras que el extracto clorofórmico de Nopalea cochenillifera resulto positivo para flavonoides; pero los extractos hexánico y etanólico de Nopalea cochenillifera resultaron negativos para flavonoides. Por otro lado los extractos hexánicos, clorofórmicos y etanólicos, resultaron positivos presentando oxhidrilos fenólicos (taninos), con la prueba de cloruro férrico en etanol. Después de haber evaluado por diferentes métodos cualitativos los principales componentes de Nopalea cochenillifera, debemos de analizar los datos obtenidos en la determinación del efecto antibiótico sobre Salminella sp., Escherichia coli y Candida albicans. Efecto de los extractos sobre la actividad biológica de Escherichia coli Los resultados de la actividad antibiótica del extracto hexánico de Nopalea cochenillifera en soxhlet se reportó un efecto citotóxico de 11.74% a una concentración de 500µg/mL p ≤ 0.05 (Figura 1). El efecto antibiótico del extracto



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hexánico de Nopalea cochenillifera a temperatura ambiente en una concentración de 500 µg/mL mostró una citotoxicidad de 4.79% p ≤ 0.05 (Figura 1).

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Figura 1. Efecto de los extractos de Nopalea cochenillifera en soxhlet (A) y

temperatura ambiente (B) comparados con el solvente (vehículo) sobre la viabilidad de Escherichia coli.

El extracto de cloroformo en Soxhlet de Nopalea cochenillifera a una concentración de 250 µg/mL fue de 16% con un p ≤ 0.05 (Figura 2). Por otro lado el efecto antibiótico del extracto clorofórmico de Nopalea cochenillifera a temperatura ambiente reportó un efecto de citotoxicidad de 12.38%, 5.96%, 7.51%, 10.14% y 0% a concentraciones de 3.9 µg/mL, 7.8 µg/mL, 31.2 µg/mL y 50 µg/mL respectivamente (p ≤ 0.05 para todos los casos) (Figura 2).

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temperatura ambiente (B) comparados con el solvente (vehículo) sobre la viabilidad de Escherichia coli.

En los extracto etanólico en soxhlet de Nopalea cochenillifera se obtuvieron 6.22% de citotoxicidad a una concentración de 3.9 µg/mL (Figura 3). Por otra parte se observo 0% de citotoxicidad a concentraciones de 7.8µg/mL, y 31.2µg/mL, así mismo reportándose un valor máximo de 37.72% de citotoxicidad a



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una concentración de 500µg/mL. Mientras que a concentraciones de 125µg/mL y 250µg/mL el índice de citotoxicidad es 15.51% y 12.30% respectivamente (Figura 3). El efecto antibiótico de el extracto de etanólico de Nopalea cochenillifera a temperatura ambiente fue de 19.14% de citotoxicidad a una concentración de 3.9µg/mL disminuyendo su actividad antibiótica a una concentración de 125µg/mL en un 0% de citotoxicidad. Se incremento la citotoxicidad hasta un 13.82% a una concentración de 250 µg/mL y de 44.35% a concentración de 500 µg/mL (Figura 3).

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Figura 3. Efecto de los extractos de Nopalea cochenillifera en soxhlet (A) y temperatura ambiente (B) comparados con el solvente(vehículo) sobre la viabilidad de Escherichia coli.

Efecto de los extractos sobre la actividad biológica de Salmonella sp. El Efecto de los extractos hexánicos de Nopalea cochenillifera en soxhlet se reportaron de la siguiente manera 15.17% de citotoxicidad a una concentración de 31.2 µg/mL y 1.67% a una concentración de 500 µg/mL, (p ≤ 0.01 para los dos valores) (Figura 4). Para concentraciones de 3.9, 7.8, 15.6, 62.5, 125 y 250 µg/mL muestran un porcentaje de citotoxicidad de 23.1%, 29.13%, 30.35%, 30.34%, 31.27% y 26.26% (p ≤ 0.05 para todos los valores) (Figura 4). Los resultados del efecto antibiótico del extracto hexánico de Nopalea cochenillifera a temperatura ambiente se observó un 14.02%, 9.61% y 0% a concentraciones de 3.9, 15.6 y 250 µg/ml respectivamente con (p ≤ 0.01). Por otro lado se muestran los siguientes resultados con (p ≤ 0.05 para cada uno), un % de citotoxicidad de 13.67%, 13.80%, 10.17%, 3.24% y 1.33%, con concentraciones de 7.8, 31.2, 62.5, 125 y 500 µg/mL respectivamente (Figura 4).



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temperatura ambiente (B) comparados con el solvente (vehículo) sobre la viabilidad de Salmonella sp.

El efecto antibiótico del extracto clorofórmico de Nopalea cochenillifera en soxhlet fue de 14.62%, 13.21%,y 16.35% a concentraciones de 3.9 µg/mL, 7.8 µg/mL, 31.2 µg/mL y 250 µg/mL respectivamente ( p ≤ 0.05 para todos los valores) (Figura 5).

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El extracto clorofórmico de Nopalea cochenillifera sobre Salmonella sp., a temperatura ambiente reportó un 18.12%, 18.15%, 9.58% y 15.66% a concentraciones de 15.6 µg/mL, 62.5 µg/mL,125 µg/mL y 250 µg/mL ( p ≤ 0.05 para todos los valores) (Figura 5). Los resultados obtenidos de los extractos de etanol de Nopalea cochenillifera en soxhlet fueron de 4.52 %, 20.77% y 19.71% a concentraciones de 15.6, 125 y 250 µg/mL (p ≤ 0.05 para todos los valores) (Figura 6)



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El extracto de etanol de Nopalea cochenillifera. a temperatura ambiente reportó 14.19%, 25.78% y 25.53% de citotoxicidad a concentraciones de 7.8µg/mL, 125 µg/mL y 250 µg/mL respectivamente (p ≤ 0.05 para todos los valores) (Figura 6).

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Efecto de los extractos sobre la actividad biológica de Candida albicans El efecto antimicótico del extracto hexánico de Nopalea cochenillifera a temperatura ambiente a concentraciones de 125, 250 y 500 µg/mL se evalúo una citotoxicidad de 11.37%, 9.87% y 14.10% respectivamente.(p ≤ 0.05 para todos los valores) (Figura 7).

Mientras que el efecto antimicótico para el extracto hexánico de Nopalea cochenillifera en soxhlet se obtuvo un porcentaje de citotoxicidad de 6.95% a una concentración de 7.8 µg/mL (p ≤ 0.05). Por otro lado a concentraciones de 31.2, 62.5, 125, 250 y 500 µg/mL mostraron 64.56%, 65.14%, 47.13%, 53.15% y 26.94% de citotoxicidad respectivamente con (p ≤ 0.01 para cada uno de los valores) (Figura 7).

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temperatura ambiente (B) comparados con el vehículo (hexano) sobre la viabilidad de Candida albicans.



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El efecto del extracto clorofórmico de Nopalea cochenillifera a temperatura ambiente, se observó un porcentaje de citotoxicidad de 0.939% con un (p ≤ 0.05) a una concentración de 500 µg/mL. y 9.62% de citotoxicidad a una concentración de 250 µg/mL con (p ≤ 0.01) (Figura 8).

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Los extractos clorofórmicos de Nopalea cochenillifera en soxhlet a una concentración de 3.9 µg/mL se observó un 18.19% de citotoxicidad con (p ≤ 0.05). A concentraciones de 31.2, 62.5, 125, 250 y 500 µg/mL, se evaluó el efecto de citotoxicidad de 59.79%, 58.25%, 53.42%, 53.22% y 60.42% respectivamente y todos estos resultados con un (p ≤ 0.01) (Figura 8). Los extractos etanólicos de Nopalea cochenillifera a temperatura ambiente sobre el hongo Candida albicans se obtuvieron los siguientes porcentajes de citotoxicidad, 16.01%, 11.44%, 14.82%, 6.08%, 5.78% y 13.64% a las concentraciones de 3.9, 7.8, 15.6, 31.2, 62.5, 125 µg/mL. (p ≤ 0.05 para todos los valores) (Figura 9).

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Los resultados del extracto etanólico de Nopalea cochenillifera en soxhlet con las concentraciones de 7.8, 15.6 y 500 µg/mL se observó los suficientes porcentajes de citotoxicidad 20.34%,16.82% y 5.95% respectivamente con (p ≤ 0.05 para cada uno) (Figura 9). Mientras que para las concentraciones de 3.9, 31.2, 62.5, 125 y 250 µg/mL el porcentaje de citotoxicidad fue de 20.98%, 2.42%, 3.18%, 3.23% y 11.75% respectivamente con (p ≤ 0.01 para cada uno) (Figura 9).

DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES Los resultados obtenidos podrían validar la actividad biológica del nopal contra entidades infecciosas. Principalmente para Candida albicans ya que como pudimos ver tiene un 60.42% de citotoxicidad en los extractos clorofórmicos por soxhlet de Nopalea cochenillifera; además la misma situación se presenta con un 65% de citotoxicidad en los extractos hexanicos. De la misma manera, se visualizan, los efectos del extracto de la Nopalea cochenillifera en Escherichia coli con porcentajes del 37.63 y 44.35% que son de interés mencionarlos. Por consiguiente, los resultados de las pruebas biológicas sugieren fuertemente la actividad biológica que presenta el extracto de Nopalea cochinillifera, dada la selectividad encontrada con los microorganismos de estudio. Por todo lo anterior, se recomienda la continuación de este proyecto y la búsqueda de nuevos métodos de extracción que permitan una mayor actividad biológica del extracto.

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