vecteurs de clonage année universitaire 2012/2013 dr. ouldjaoui ahmed
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Vecteurs de Clonage
Année universitaire 2012/2013 DR. OULDJAOUI AHMED
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A. DéfinitionsUn vecteur est une séquence d'ADN permettant la propagation, la sélection, la modification d'une séquence d'ADN d'intérêt. En bref l'étude et la manipulation d'une séquence d'ADN isolée.
Le clonage est l'action d'isoler et d'insérer dans un vecteur un fragment d'ADN d'intérêt pour le multiplier à l'identique.
L'ADN génomique est le support physique de l'ensemble des gènes de la cellule.
l'ADN complémentaire (ADNc) est la copie en ADN des ARNm.
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B. Utilité
● Permet de conserver une séquence d'ADNdonnée.
● Permet de la multiplier pour en accroître laquantité.
● Permet de la modifier pour y introduire desmutations, délétions.
● Permet de la réintroduire dans des cellules.
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C. Principes
● Un Vecteur Circulaire
Linéaire
● Une Cellule hôte Procaryote
Eucaryote
●Un fragment d'ADN ADN génomique d'intérêt. ADNc
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I - Propriétés des vecteurs de clonage
• capables de réplication autonome dans une cellule hôte donnée
(origine de réplication de type procaryotique et/ou eucaryotique)
• possèdent un polylinker ou site multiple de clonage
•Possèdent des propriétés permettant la sélection de la cellule hôte (résistance ATB)
•supportent l’insertion d’un fragment d’ADN plus ou moins grand.
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II – Principes généraux d’utilisation d’un vecteur
- Préparation du vecteur
- Préparation de l’ADN à insérer
- Réalisation d’un recombinant
- Incorporation à l’hôte
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1. Obtention de l’ADN recombinant
+ traitementPAL
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2. La ligation (ligature...)
Une enzyme, la ligase, est capable de lier de façon covalente deux molécules d’ADN en une.
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3.Différents vecteurs pour différentes utilisations
VECTEURS HOTE INSERT (Kb)
Plasmides Bactérie 10
Phage lambda Bactérie 25
Cosmide Bactérie 45
Phage P1 Bactérie 100
BAC (bacterial artificial chromosome)
Bactérie 300
YAC (yeast artificial chromosome) Levure 1000
Taille maximum approximative du fragment d’ADN qui peut être cloné dans chaque vecteur
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4. Les plasmides comme vecteurs de clonage
Molécule d’ADN de taille réduite, d'origine bactérienne
Molécule d’ADN circulaire – taille 2kb à 5kb
Peut accepter jusqu’à 10kb d’ADN exogène
Peut être considérée comme un minichromosome capable de réplication autonome
Confère la résistance à un ou plusieurs antibiotiques= sélection
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5. Les classes de plasmides
5.1. Les plasmides de première génération :Ce sont les premiers à avoir été utilisés en génie génétique. Ce sont des plasmides à l’état naturel, non modifiés au laboratoire. Il s’agit des plasmides suivants :
• ColE1• RSF 2124• pSC 101
5.2. Les plasmides de deuxième génération : Ce ne sont pas des plasmides naturels mais résultent de plusieurs transformations : plasmides "artificiels".La série la plus importante de ces plasmides est la série pBR 312 à pBR 322. Le plasmide pBR 322 est constitué de 4,4 Kb et possède deux gènes de résistance : un pour la tétracycline (TcR), l’autre pour l’amplicilline (ApR). il possède, en plus, 20 sites uniques pour les endonucléases de restriction dont 11 localisés sur les deux gènes de résistance.
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Carte du plasmide pBR322
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pUC8 ACGAATTCCCGGGGATCCGTCGACCTGCAGCCAAGCTTGGCACTG
Polylinker
pUC 9 ACGCCAAGCTTGGCTGCAGGTCGACGGATCCCCGGGAATTCACTG
Polylinker
polylinkers de pUC8 et pUC9
5.3. Les plasmides de troisième génération :La famille pUC : Ont une taille qui avoisine 2,6 Kb et ayant intégré les gènes de résistance à l’ampicilline (ApR) et lacZ. Un polylinker identique à celui duphage M13 est associé à lacZ. Les différents pUC (de pUC8 à pUC19) ne différent que par le nombre de nucléotides et l’emplacement du polylinker
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Les plasmides comme vecteur de clonage
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De type procaryotique (bactéries):
Cas d’un vecteur plasmidique: l’ADN est introduit dans les bactéries traitées spécialement le plus souvent par choc thermique ou par choc électrique.
6. Introduction de l’ADN recombinant dans les cellules
hôtes
électroporateur
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6.1. Identification des clones intéressantsDans ce cas les bactéries transformées avec le
vecteur ne possédant pas ou possédant l’insert sont sélectionnées un criblage est nécessaire
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AmpR
TetRAmpR
TetS
Clone intéressant
6.2. Criblage des clones intéressants
pBR322
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6.3. Criblage -screening- des clones intéressantsTest blanc-bleu (α-complémentation)
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LES PHAGESLES PHAGESVirus de bactérie-infectieux : Rendement +++Virus de bactérie-infectieux : Rendement +++
• • λλ : 48 Kb: 48 Kb • • Les phages et les bactéries hôtes sont Les phages et les bactéries hôtes sont généralement mutées pourgénéralement mutées pour éviteréviter le cycle de le cycle de LysogénieLysogénie au profit du cycle au profit du cycle lytiquelytique.. • • Grande partie non essentielleGrande partie non essentielle
VECTEURSVECTEURS2 Types :2 Types :• • Insertion (Insertion (λλ zap, gt CHARON cDNAzap, gt CHARON cDNAFaible capacité ≤Faible capacité ≤ 10 Kb10 Kb• • Délétion : substitutionDélétion : substitution• • (Charon, EMBL, DASH, FIX…)(Charon, EMBL, DASH, FIX…)Partie non essentielle « stuffer » est Partie non essentielle « stuffer » est délétée et remplacée : ≤délétée et remplacée : ≤ 25 Kb25 Kb• • Sélection spi.Sélection spi.
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7. Les phages comme vecteurs de clonage
Phage = virus de bactéries
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De type procaryotique:
Cas d’un vecteur phagique
7.1. Introduction de l’ADN recombinant dans les cellules hôtes
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8. Les cosmides comme vecteurs de clonage
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9. Les YACs comme vecteurs de clonage
YAC : Yeast Artificial
chromosome
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10. Bacterial Artificial Chromosomes BAC
7.4kb
● parA, parB and repE sont des genes requis pour la stabilité du BAC.● OriS est une origine de réplication● CM : gène de résistance au chloramphenicol
● Avantages :– Grande capacité d'insertion– Facilité de manipulation (comme plasmide)– Hôte bactérien– Copie unique– Pas (peu) de réarrangement
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III - APPLICATIONS DES VECTEURS- Clonage et amplification d’une
séquence d’ADN
- Création des banques d’ADN génomiques et d’ADNc
- Introduction d’un gène dans des cellules, des plantes ou des organismes (animaux transgéniques)
- Production d’ARN
- Production de protéines codées par les gènes insérés
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Banques d’ADN
-Banques d’ADN génomique
- Banques de cDNA
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Principe du clonage (cas d’une banque génomique)
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Banque (librairie) d’ADN génomique
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Comment définir si une banque est suffisamment grande pour espérer trouver un fragment d’intérêt?Calcul afin de définir la probabilité de trouver une séquence donnée dans une banque.
N=In(1-P)/In(1-f) N=In(1-P)/In(1-f)
N: nombre de recombinants N: nombre de recombinants P: probabilité désiréeP: probabilité désiréef: proportion de génome dans un seul f: proportion de génome dans un seul recombinantrecombinant
Ex: Ex: 99% de probabilité 99% de probabilité d’avoir une d’avoir une séquence représentée dans une banque séquence représentée dans une banque de fragments de de fragments de 17kb 17kb d’un génome d’un génome eucaryote eucaryote (3.10(3.1099pb)pb)N= In(1-0.99)/In(1-N= In(1-0.99)/In(1-(1,7.10(1,7.1044/3.10/3.1099))=8,1.10))=8,1.105 5 coloniescolonies
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Banque d’ADNc
Le problème ici est l’obtention de clone dit « full length ».
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Obtention de l’ADN de l’organisme donneur
A partir de l’ARN:
Principe de la "reverse
transcription":
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Production de protéinesUtilisation de vecteur
d’expression
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Production de protéines humaines à but thérapeutique
- Facteur VIII de la coagulation dans l’hémophilie A
- Hormone de croissance
- Insuline
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Exemple de l’insuline
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-Bactéries : E. Colipremier hôte utilisénombreux vecteurs plasmidiques connus
et utilisablesculture en masse dans les fermenteurstaux d’expression élevés (plusieurs g de
protéine/litre)MAIS secrètent mal les protéines : éclatement des bactéries
-pas de modifications post-traductionnelles
-Levure saccharomyces cerevisiaemodifications post traductionnelles
MAIS pas de secrétion, moins bon rendement
-Cellules CHO (chinese hamster ovary)culture de masse en bioréacteurs,
protéines complexesMAIS cher et rendement plus faible
CELLULES HÔTES
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Transfert et clonage du gène de l’insuline
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MERCI POUR VOTRE
ATTENTION