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.f­i

•

Ao professor G. Cilento, oientista e

mestre, pela sua contribuição para minha

formação cient1fica, minha gratidão.

- .-....I

r

J:osseJ:0J:d oV

•

•

•

• '-

\.:"1 MEUS AGRADECIMENTOS

n ao Prof, F,. Krumholz, pelo apôioe solicitude de ~empre

ao Prof, E. Giesbrecht,

ao REGINALDO,

Lydiaa

f-,

Jacyraa

ao Raphael

" Sr. Joãoao

aos amigos

pela compreensão

..

..

ao Centro de Cálculo Numérico da U. S. P.

ao Setor de Matemática Aplicada do Depto. de F{sica da F.F.C.L-USP

ao Instituto de Estudos Brasileiros da U" S. P.

- , .

ao Conselho Nacional de Pesquis~s e a Fundaçao de Amparo a

Pesqulif;Jaj.,::do 'Estado fle:. são: l~ati~;o~;' :.~: p~:ha:.;.a4\Ídà:,.matéri:áal

..t,

•

•

Veiei encore des arbres et je connais leur rugueux,

de l'eau et j'éprouve sa saveu~~ Oes parfums d'herbe et d'étoiles,

la nuit, certains soirs ou le OQOur se détend, comment nierais-je

ce monde dont j' éprouvQ la puissance et le s forces? Pourtant tou-te la science de cette terre ne me donnera rien qui puisse m'ass~

rer que ce monde est à moi. Vous me ledécrivez et Yous m'appre-

j nez à le classer. .Vous énumérez ses lois et dana ma aoif de sa-

boir je consens qu'elles eoient vraies., ,

Vous demontez SGn meoa-,

, nisme et mon espoir s'accroit. Au terme dernier, voue m'apprenez

que cet univers prestigieux et.bariolé se réduit à l'atome et que,. '.' I' ..

l~atome lui meme se redu~t a l'electron. Tout ce~~ est bon et

j'atiJends que vous continuiez. Mais vous me parlez d'un.invisibl&, , , ,

systeme planetaire ou des electrons gravitent autour d 'un !JO.yau.

Vous ~'expliquez ce monde avec uno image. Je reconnaic alors que

vous en êtes venus à la poésie: je ne conna!trai jamais. Ai-je

.I_~.

le temps de m' en indignar? , .'Vous avez ·deJa ohangé de théorie.

Ainsi oette soience qui devait tout m'apprendre ~init dans l'hype­

these, cette lucidité sombre dans la métaphore, oette incerti­

tude de résout en 03uvre d' art ..

t.

albert oamus

....

íNDICEpágina

*'

•

".

I. INTRODUÇAO. • • • • • • • • • • . . . . • • • • • • • • • 1

A. Generalidades a respeito de complexos de transferência

. • • • • • • • • 4

• • • • • • • • •• • • •

~ . . . .4

•• 4• • • • •J

• •. . . .~. Teoria de Mulliken. • • • •

de carga. • • • • • • • • •

1. Introdução. • • • • • • •

8. Tra.tamento rtlatemático•••••••••••••••• 5

4. Teoria de Dewar. • • • • • • • • • • • • • • • •• 7

5. Modêlo e realidade ••••••••••••••••• 7

6. Complexos fracos •••••• • • • • • • • • • • • • 8

7. Importância bioqu!mica••• • • • • • • • • • •

.. lI. MATERIAIS E MÉTODOS.· • • • • · . . . . · . . . . . . . .8

10

A. Materiais lO

1. Preparação das soluções•••••••••••••

. . . . . . . . . ." . . .2. Lista de abreviações••••

1. Substâncias usadas. • 10

16

17

18

18• •

• •

• • • •

• • •

. . . .' .

• • •

· . . .• • •• c

· . . . .• • •

. . .3. Aparelhagens •••,

B. Metodos••••.••

•

~. Determinação espectrofotométrica da constante de

associação de complexos moleculares••••••••• 18~ ,

3. Determinaçao espectrofotom~tricada constante de

velocidade de uma reação de pseudo-primeira ordem a~

~. Determinação de parâmetros termodinâmicos e de

ativação. • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •• 24

... IIIe TRANSF~NCIA DE HIDROG~IO ENTRE AS FORMAS OXIDADAS E

REDUZIDAS DOS COENZIMAS PIRIDfNICOS E SEUS MODELOS. • • ·26

. .• • • • • • • •

• • • • • 26

. . 19• • •

• • • • •• • •• • • •

• • •• •. .A. Introdução.

B. Resultados ••

~

•

:J-. InteraçãO entre modelos • • • • • • • .. • • •

2. Interação entre os co~nzi~ •• ~ ••••••

3. Interação em sistemas mistos modêlo-coenzima.

,Pagina.J "~g-"

•• 35

• • • .35

C. Disoussão ••• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • .4~

IV. INTERAÇÃO INTERNA NOS COENZIMAS PIRIDÍNICOS. • • • • • •• 47

A. Introdução • • • • • • •

B. Resuitados •••••••

• • • • • • • • • • • • • • • •

• • • • • • • • • • • • • • • • •

ft..7

49

1. Interação entre um modê10 da forma ~dada e•

•

adenosina. • • • • • • • • • • • • • to • • • • • • • • A9

2. Interaçãt:> entre um mod~lo da forma oxidada e ADP ~ • 49

3. Efeito de fbsfatd~ sab~e substârtdias e sistemas

estu.dado~. • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 49

c. Discussão. • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • .. .60

•

•

..

v. HIDRATAÇÃO DAS FORMAS REDUZIDAS DOS OOENZIMAS PIRIDI-

NICOS E SEUS MODELOS • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 61

A. Intar04ução. • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 61

~. hftl~d06. • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • " • • 65

~. NatureEa"dos produtos fammado8 ••••••••••••65

1. Cinética.. • • • • • • • • • • • • . • • • • • • • • 70

a. Ensaios de substâncias estruturalmente re1~

cionadas a porções moleoulares do ooenzima. • •• 70

b. Ensaiosde amino-á,oidos, péptidos, proteinas

e substânoias relaeionadas • • • • • • • • • • .. • 77

o. Ensaios de substânoias relaoionadas à tiro-• 87

• 11"

.119

• • •

• • • •

• •

• • • • • •

• • • • • • • 120

. .• •

• • •

· ,• •

• •

• •

• • •

• • •

• • •

• •

• • • •

• • •

• •

• •

• • •

. . .xina

c. Discussão

VI. SUMÁRIO E CONCLUSÕES. • • • • • • • • • • • • •

VII. REPERmNOIAS BIBLIOGRÁFIOAS • •

•

,...

I, INTRODUÇÃO

...Os coenzimas piridinicos desempenham um papel fundamental relacio

, -• nad~ às suas propriedades de óxido-reduçãO. Assim, participam da cadeia re~

piratória, onde se situam, devido ao valor do potencial de óxido-redução do

par, logo no inicio, sendo os primeiros intermediários entre certos substr~

tos e o ibXigênio. Constituem-se também no primeiro local de sintese de ATP;

muito imD6~tante, presumivelmente em conexão com a funQÃ.o respiratória, é o

fat.o ,;de ·~.Ooenzimas pirid:lnidos intervirem nos sistemas de algumas. trans-t,' .;" •

*

•

R. ~2~I~-CNH --ll:~ 2 I I .,,~

/é(j .. • 6H 6H 'c"Íi 0'/H 1- H "1-- -

OH OH OH OH

(1)

....

.,

",-.

. , (Fornecendo-se a molecula os elementos de um 10n hidreto, resulta

a forma reduzida:

- NH2H H O I

Cf-NH2 . r· r (X} (2)1,(.°à /cH~-Q-f-o-f-O-CH2'.C."/

r(~ .....~/'H 6H·· OH H/,l(_~/~. I I 9 C

OH OH 6H 6HNote-se que o anel funcional é agora ur~a 1,4-dihidronicotinamida.

Empregam-se as designaç~es NAD+ e NADH, pa ra as formas (1) e (~)

ou seja, nic<rl;inamida..adenina-dinu,leótido e nicotinRm.ida-adenina-dinucleó-

tido reduzido. são ainda designadas+

por NADP e NADPH as f ormas em que,

em luga= da ribose, tem-se a ribose-2Lfosfato ligada à adenina.

Cálculos quanto-mec~~icos(l) estão de acôrdo com o fato da 'forma,

• oxidada ser um bom receptor de eletrons e a reduzida, um bom doador; isto

pode ser apreciado na tabela I, onde figuram as energias das orbitais mole'-

~ culares.

TABELA I

Energias das orbitais moleculares (em ~)-------"..-,-- --_.-------

Composto. 'EnéIJ:giadaeIil&1s altt;torbital molecular ocupada

Ehérgia;dà,.,mais'cbaixaorbital molecular vazia

-,.............._........--.--I-------_._-....-_...,,,.,~~- '_L

NADH

1,032

0,298

-0~356

-0,915

..~ .......--- ~"....__. --JI-- ~,__.__, . _

~ de grande utilidade, também, o trabalho com modelos dessas su­

bstâncias, cujos resultados podem ser comparados com os obtidos através do

uso dos próprios coenzimas, a fim de se chegar a conclusões a respeito dos

mecanismos pelos quais atuam êstes últimos.,

Assim, poàem-se representar esqutmaticamcnte os modelos das for-

mas oxidada e reduzida como sendo respectivamente

•

O/COR'

I I'N

Á

em que R,e freqtl.entemente uma cade ia alifática ou o radical benzila e RI

é freq~entemente o radical -NH2 "

Coloca-se como um obje·tivo interessante o exame da interação en-··

•

•

~

~

,.,

3

t~ê as formas oxidada e reduzida dos coenzima~ pirid1nicos e setis

modelos. Tendo sido ilá mencionada a capacidade receptora de elétrons

da farma oxidada e a doadora de elétrons da forma redu~idaJto~~~se

inta~ossante pesquisar a existência de uma possível compl~~ação por

transferência de carga entre essas formas. De fato, as indicações í1

', .,,"

• :,~ ~.= ;". t., ~; ";. .. ".•" '" l·~

?b.tidas podem fbrneder sugestões a respeito do estado de' transição

dêstes cd~~~~M~S9 especialmente nas reações de transhidrqgena9ãoi

No campo dos coenzimas pirid1nicos também se afigura de notá­

vel importância o estudo da interação entre as duas partes da molé" , -

cuIa do ooenzima, ist~ é. entre o anel pirid1nico e o anel adeninico.

De fato; tb~~icaill0rl~e, J de se esperar u~ ~~ieração do tipo t~an~

ferência de carga(l). O estudo dessa interação pode~ e~ 'r~p{~io,

fornecer resultados va.liosos sôbre a conf'iguração dO coenzJ ma: seja

na forma livre, como quando ligado ao apoenzima e também sôbre a na­

tureza das fô~ças responsáveis pela configuração. O exame dessas

questões constituiu-se em outro objetivo dêste trabalho.

Participam também os coenzimas piridlnicos de certàs re~ções

ainda h~o totalmente elucidadas, mas que são, presumivelmente, de

gr~de importância na s1ntese da primeira molécula de ATP na cadeia, ~

rQsp1ratoria. Entre estas, figura a formaçao de NADH-X por hidra-...

ta.~ao do NADH.

O estudo dessas hidrataç-ões compr€eYfde a teTcefta parte aêste

't1'6~alho•

..

,..

Ao

A~ ClEW,;g,ralida~.a re.s..Eeito de ,comJ?.lexos de transferencia de carga

1. Introdução

A interação entre esp~cies qu{micas ~ um fenômeno há lon-

go tempo conhecido; as energias envolvidas variam aproximadamente

de O a 10 kcal/mol e Portanto, não se trata de reações qu{micas;

entretanto, o comportamento do sistema não corresponde ao aditivo.

As fôrças que intervê~ nessas interações entre compostos~ ~ , .

sao as forças de van der Waals, as quais podem ter carater atrat1-

vo ou repulsivo.

As fôrças de van der W~ls são chamadas de indução quan­

do resultantes de uma interação de tipo dipolo- dipolo induzido e

de dispersa0 (de London) quando resultantes de interação do tipo

dipolo instantâLeo - dipolo induzido.

Em geral, a energia proveniente dêsses tipos de interações

varia com l/ Rn, onde R é a distância entre as part1culas e n tem

valores grandes, Isso indica que são fôrças que atuam sàmente a p~

quenas distâncias •...

Outras forças podem ser levadas em conta, tais como as re

sultantes de ponte de hidrogênio.

No entanto, pensou-se que essas fôrças não seria.m ainda

suficientes para explicar a energia da interação entre as mol~culas

consideradas.,

2~ Teoria de Mulliken

A fim de procurar encontrar uma formulação adequada para r~

presentar os Iatos atraves de um modêlo satisfatório, introduziu-se

um caráter quanto-mecânico ao quadro descritivo da situação.

Essa apresentação da explicação do que ocorre tem por base o poder

doador de elétrons, que" em geral, carac teriza um dos componentes,

do complexo molecular e o poder receptor de eletrons que carac-

teriza o outro dos componentes, uma vez que êsses compostos se for

...

~m geralmente na propôrção de 1:1. Foi Mtillikeri(a,5) ~üem sugef~

ü~ m6a~lo qtianto~ Medâti±cd descritivo dêsse tipo de cômposto~j tn"

~~6dti~itido O conceito a~ tráheferêndia de carga.

Um dompi~xd moieéuiár poderia §er descrito poi uma IU~çi~

de onda que se constituisse !ia contribuição de outras dlias: l.itná :tu.égie de 6nda descritiva dê um estado não ligadQ, em qu. as m61'e~~

/J:J: ·7r.

l~s se apróxima~iàm uma âa ôutra e permaneêariam p~~~imas pê1~

edntribijiçáo da$ atraç'~~Bá.a natureza cl~~s:fh-â ir ;1m$dü~tá füf1çàõt ,.

<teQp,d~t, ear·acterl.$tióade üinaestrutura ãativa, em qU$ um ~le'irób:

JeJl!'teneente a uma órbi tal dealt.a energia da môitc-ula dQaa.f)~aeerla

<;edido a uma Qrbital li-vrede baixa energia da innl.éoula re.(:)eptota.

~'sa se~nda estrutura seria estabilizada Pela erier~iaele~roet~"

t:tea de intetâção entr,e umc.áti.on e uin âh4on,obIIio '$e pods> eonsida

tat na caso mais ~era.l,e'f3eriad.e.nom:inadâ '''de transfet~ncia de• • .'" _." ~ :", ... _ 0'0 '". _.

c:~1"~a~ ii Compostos MS (i\tai-selrttuttiTI! déâse t:i!>'o sgoadmit~das .-emo colaborad'oras na est.abili·zaçâo d,o complexo áão conhecidos com'ó

tj6m'Plei:;~a de tranàferêneiáeleoarga.

3. Tt-atamento maiemático(4)

.~

Matematica.mentep'Ode"''See'sere:ver:

lY ~ é\ "V.+- b CfN o (-D} A) 1- (Di- t-\) 0n (\~ b<~ê\

~\r ::: cfG l.Y \V e Y"-cft "V lU" o (DI A) D A t (1)+ A-) - Di"TA-

N rep;res'entariaa função de o,nda.dex$.-eritiv~ dó e,s'ta:d'à tt'ü1.arJent-à~

de com:pJ;.e~0:lconstfu{da p-.el'a c6m~i'naç~ol:in'e~ das fUn<i~~ ~o ~ ~ i'

tlUE;;, como se pode ver pela eXPre'esã.om~temátiéo..,.co.~'esp'óndem ~es,;,;,

pé~ívatn'ent'e ào e:st-adQ!io3Mté~~o..ê ao ~et.atlo ,de ':tr@,~~~~l\~:i'ª' ~r

Ç(~:Sia~Cornos.e pode v'et' tanib~m 'na.aex'IU'esáÕes 'aoim'a .,'6 ..i<a.'~·'e.t ~. i

t.'â~to., a cunttibulçã'ç) da sef1tUnd'aest·~'iWra.êi·nsignificante e sabe...

":"'Se., reà:ilmen:t:e.,nej:aem 'dia., que a ·energ'i.a dees':t-abili2iaç~o r~sul­

tDi~t:eaa est'rUt.ura.da.t!iva é mui,t!'O 'pe'quena.•

6

Pode-se ter UDa outra função de onda, a partir das mesmas

iniciais onde

~-

b 'Vo (D,A)' onde, novaDente

•e

As :funQqes€1 de onda ~N e 't'E são caracter{sticas do

complexo e não existem para os compostos separadamente.

~E representaria um estado excitado. Poderia~ portanto,

perfeitamente, haver uma transição eletrônica "V N ~'YE ' envol

vendo uma energia dantes não existente. Essa energia daria ori­

gem a uma nova banda espectral denominada banda de transferência-•

'\

Pode-se calcular a energia associada a banda de transfe-

•

....rencia de cargao

S f Ao • d . t 't . ( 5) •e or aSSUIDl o o seguln e esquema energe lCO •E

de formação do complexo)

D

+ -D + A + e .

D+ + A- lA tI

E'. I.

I~ ft'11;I ~ , ..

IIIÔE(h~CT) E'Q

j.:J

IIIII EO /.lR ( energiai EI

}J

E~(1'o)!I J~l .i

-1-_ ,_ ... E

D+A

(D••!).. ç]j+••A-)

(D-t:. A-)

, -

...

A , •

onde se tem em ordenadas as energias correspondentes aldlferentes

estruturas assinaladas, o cálculo da energia da banda de transferêa

cia de carga pode ser efe~uado:

onde ID é o potencial de ionização do elétron mais energético doA

doador, A, a afinidade eletronica do receptor, Ej a energia de es

tabilização pela interação eletrostática entre o cátion D+ e o

ânion A_- ,~ a energia de in stabiiização do estado excitado pela

contribuição da estrutura naG ligada e RN a energia de estabiliz~

ção do estado fundamental pela ~ontribuição da estrutura de trans­

ferênctade carga.

'4. Teoria de Dewar

Em complexos orgânicos típicos, as orbitais do doador e do

7

_"" receptor são orbitais moleculares delocalizadas e a região de

entrosamento entre tais orbitais é delocalizada. Se se quer refe­

rir a uma ligação qu{mica entre os dois componentes do conplexo,e~

tão é necessário compreender que essa é uma ligação delocalizada e

não algo que possa ser representado através de una linha entre dois

átomos. Dewar e Lepley(6) formularam a conceituação acima atravésA ,

do emprego do metodo das orbitais moleculares e denomi~os coopl~

xos de "c omplexos 11' l~

5. Modêlo e Realidade(7)

o têrmo transferência de carga para descrever a ligação

i num complexo molecular tem o mesmo sentido que os termos estruturaA , É A ...e ressonancia para moleculas. um termo ligado a um modelo quanto-

~ -mec~nico particular e não a algo f\sicamente oiservável. Por outro

lado, quando usado para descrever uma banda de absorção eletrônica,

isto significa que grande quantidade de densidade eletrôniea é t~

•

ferida do doador para o receptor quando o complexo ;. excitado pela

luz •

6. Complexos Fracos

Com relação a complexos moleculares fracos, em que a dete~

minação da constante de estabilidade revela a existência de uma co~

plexação muito reduzida em relação \ esperada pela intensidade da

banda de absorção, Mulliken e Orgel(8) formularam a possibilidadQ

- ,-de complexaçao por contactos entre part1culas em soluça0, fundamen-

tando a explicação no fato de que no momento da colisão o valor da

integral de entrosamento SnA entre a orbital ocupada de mais alta

energia do doador e a orbital livre de mais baixa energia do recep­

tor superaria o valor da integral de repulsão de van der Waals,

Svdw , dada pelas orbitais ocupadas de mais alta energia do doador

e do receptor.

M'

Por outro lado, Murrell(9),

explica teoricamente tais co~

plexos, ou melhor, a intensidade de suas bandas, em parte pela pos­

sibilidade de ocorrência de maior mistura de estados de transferên-

cia de carga com estados excitados do doador ou do receptor do que

no estado fundamental. Quanto menor SDA (menou estável o complexo)A

maior a possibilidade deo estado de transferencia de carga intera-

gir com estados excitados do doador.

Melhor concordância pode ser obtida levando em conta que, , -o numero de moleculas de solvente envolvidas na solvataçao do com-

plexo é diferente do envolvido na solvatação dos componentes(lO).

7. Importância Bioqu{mica

Do ponto devista qu{mico, e, conseqffentemente, bioqu{mico,

pode-se imaginar que, se uma reação puder ocorr~r através da forma­

ção intermediária de um complexo de transferência de',.carga, isso P,2

der~ acarretar uma diminuição da energia livre de ativação; poder-

..

..

..,

, .... N

-se-iam tambem obter lní'ormaçoe.s valiosas com relaçao ao mecanismor . Ne estereoqulmlca da reaçao.

A existência de complexos de transferência de carga entre

partes constituintes de uma entidade molecular qualquer contribui,, A

tambem, para esclarecer a estrutura da dada entidade e que forças

atuam no sentido de manter e estabilizar essa estrutura •

9

11. MATERIAIS E MÉTODOS

A. Materiais

1. Substâncias usadas

l-Benzil-l,4-dihidronicotinamida (ClBCH)~ Fdi preparada Se

gundo o método de Mauzerall e Westheimer(11) •

10

;3= 7,3.-10 Â= 355 mp.

AI

Cloreto de l-benzil-3-carboxamido-pirid{nio (CIBO). Foi

preparado segundo o método de Karrer e Stare(12).

Cloreto de 1-benzil-3-acetil-pirid{nio (ABO). Foi prepara­

do segundo o método de CilentoÇ\~)

PF: 1890 C; descri to : 1890 C( 13 )

Ácido 3,5-dicloro-4-hidroxibenzóico (MBC1). Foi preparado

segundo o método de Gray e Jones(14)~

iCem NaOH 0,05 N) Â:= 280 IDf

•

Ácido 3,5-dibromo-4-hidroxibenzóico (MBBr). Foi preparado

segundo o método de Pope e Wood (15) •

E 0,05 N) := 15, 8 .ld~- "\.-~'285 lJ]jl..( em NaOH ",

Iodocaseina. A caseina foi iodada pelo método de Reinecke

e Turner( 16) •

A • ,

As seguintes substanc~as foram usadas apos recristaliza-

ção:Tirosina (de Eastman Organic Chemica.ls). Recrista1izada de

ácido acético aquoso.

~(em NaOH 0,05 N)

De Aldrich Chemica1 Co:

• 3,5-Dibromotirosina (DIB). Recrista1izada de ácido acJtico

aquoso.~ , . 3(18).:.' = 5,92.10 '" = 310 mu.I~em NaOH 0,05N) 1\ I

3,5-Diiodotirosina (DIT). Recrista1izada de ácido acJtico

aquoso.

~em NaOH;3(17)

0,05N) = 5,92.10 ~= 310 mr

3-Iodotirosina (MIT). Recrista1izada de ácido acJtico

aquoso.C 3 (19)'1:em NaOH 0,05M) = 3,98.10 ~= 305 rrr

Ácido 3,5-diiodo-4-hidroxibenzóico (MEl) (de Eastman Orga­

nic Chemicals), Recristalizado de acetona aquosa.

(em NaOR. 3

O,05N) = 14,0.10 ,,= 284 rorp-lodo-anisol (de British Drug Rouse). Recristalizado de etanól-

(em EtOH)

,-agua.

As seguíntes substâncias foram usadas sem posterior purificação:

De Sigma Chemica1s C~:

jI-Nicotinumida-adenina?dinUcleótido reduzido (~-NADH), 3(21)t = 6,22.10 ~= 340 ror

~-NicotinaIDida-adenina-dinucleótido-fosfato reduzido

( "-NADPH) •'l 3(21)e. == 6,22.10' ~= 340 T

. jS-Nicotinamida-adenina-dinuc1eótido (IS -NAD+).

Adenina

Xantina

Cafeina

Adenosina

Adenosina difosfato (ADP)

2-Desoxiglicose-6-fosfato (sal de sódio)

Arginina

Fenil~aJlina

Glu*atião

12

D-,L- e DL-triptofano

te H O)em z

Tironina (~)

E.Cem NaOH 0,05N)

3,5-Dibromotironina (T2

(Br)

~(em NaOH

. (17).0,05 N) = 3,33.103

. Â:;: 305 IDf'3,5-Dii~dotironina (Tz)

~em NaOH. 3( 17 )

Â=0,05N) = 3,33.10 305~

3,3' ,5-Triiodotironina (sal. ~ódico) (T;3)(17)

&:.. 4.66 •.103.

~em NaOHO,05N) = IÂ= 3.20 !Df'

Tiroxina (T 4 )

~(em NaOH 0,05N) Â= 325 ~

.t.

Tiroglobulina

Tris(hidroximetil) aminometanc (tris)

De Nutritional Biochemicals Co.:

Inositol

Glicose

Galactose

Frutose

Ribose

Metilglictsido

•

Glicose-l-fos!ato (sal de potássio)

Glicose-6-fosfato (sal de bário)

Galactose-6-fosfato (sal de bário)

Manose-6-fosfato (sal de bário)

Frutose-6-fosfato (sal de bário)

RiboSê-6-fosfato (sal de bário)

Ácido glutâmico

Glicilalanina ~ gliciiglicina

De Eastman Organic Chemicals :

Serina

Lisina

Prolina

Áoido aspártico

Ciste1na

Butilamina

2-Mercaptoetanol

Etilmercaptana

13

2-Bromofenol .,

~(em NaOH O.IN)

"

2-Iodofenol

lr(em EtOH) Â:: 280 TDf-

)

Ácido 4-hidroxibenzóico

De E. Merck A. G.:

Glicerol

Imidazol

Glicina

Â= 295 Y

....

. l'

Caseina

De Ki-Kion:

Sacarose

Ácido acético

Á • A •cido prop~on~co

De Mánm Research Labs :

Gliceraldeido

Ácido monoiodoacético

De Schwariz Labs. Inc.:

Frutose-2,6-difosfato (sal de bário)

De Paul Lewis Lo.bs Inc.:

Asparagina

De British Drug Rouse:

Ristidina

De R. M. Chemicals Co. :

Metionina

Etionina

De Armour Labs. ;

Albumina humana

Albumina bovina

'De PerLbex Inc.:

""-Globulina

De Q.E.E.L. :. '.UreJ.a

Existentes no laboratório:

íJlicerofosfato de sódio

Glicerofosfato de bário

Betaina

14

Iodobenzeno

~em H O)2

2-(24)= 6,60.10'

A

Foram ainda usados os seguintes reagentesinorganicos p.a.:

Monohidrogenofosfato de potássio,

Dihidrogenotosfato de potassio

Ácido clor{arico

Cloreto de sódiD

Perclorato de sódio

Suli'ato de sódio

Carbonato de sódio

Bicarbonato de sódio

Nitrato de potássio

Acetato de Sódio

..

..

16

2. ~is~a das ~brevia~ões usadas

CIBCH - l-benzil-3-carboxamido-l,4-dihidropiridina

CIBC - cloreto de l-benzil-3-carboxamido-piridinio

ABC - cloreto de l-benzil-3-acetil-pirid1nio

fi -NADH ou NADH - ft -nicotinamida-adeninadinucleótido reduzido

Ji-NADPH ou NlillPH-~-nicotinamida-adeninadinucleótido fosfatoreduzido

P-NAD + ou NAD +-fi-nicotinamida-adeninadinucleótido

NMN - nicotinamidamononucleótido

ADP-adenosinadifosfato

ATP-adenos.ina trifosfato

MBCl-~cido 3,5-dicloro-4-hidroxibenzóico

MBBr-ácido 3,5-dibromo-4-hidroxibenzóico

MEl - á~ido 3,5-diiodo-4-hidroxibenzóico

DIB - 3~5-dibromotirosina

DlT - 3,5-diiodotirosina

MlT - 3-iodotirosina

T - tironinao .

T (Br) - 3,5-dibromotironina2 .

T2

- 3,5~~iiodotironina

T3

. - 3 J 3' ,5-triiodct lronina

T4 - tiroxina

Tris - tris (hidrox2,metil) -aminometano

GPD - gliceraldeido-3-fosfato desbddDºgenase

..

17

.'-. Aparelhagens

Pràticamente todâs as medidase$pectrofotométricas foramA A

feitas com o emprego de um aparelho Beckman DU, o qual era termos

tatizado através de um "cyclotherm" circulando água por um "ther­

mospacer" situado lateralmente ao compartimento contendo as celas.,..

Ocasionalmente foram utilizados um espectrofotometro

Zeiss PMQ 11 e um Cary 14.. ,

Foram usadas celas de quartzo tampadas, de caminho otico,

I em e tambem celas de Thunberg.

As medidas de pH foram afetuadas em potenciômetros Me-

trohm, modelos E 148 e E 388•

•

•

·e.

18

,B. Metodos-

I 1. Preparação de soluções

As soluções de OlBOH foram preparadas agitando-~e o sól!

do triturado em almofari~ num frasco escuro contendo o solvente,

imediatamente antes do uso.~ A . •

As soluçoes das substanc1as empregadas tiveram sua concea

tração determinada por pesagem. Exceções encontram-se naquelas pa­

ra as quais é dada a absorptividade molar na primeira parte d~ste

capítulo: nesse caso, as conce~trações foram. determinadas espectr~

fotom~tricamente. A concentração da solução de etil-mercaptana foi

determinada por medida de volume. Finalmente, tiroglobulina teve

a concentração em DIT determinada espectrofotom~tricamente(25).

Tôdas as soluções cuja concentraçãã não foi determinada

por pesagem, especialmente quando se tratanade substâncias pouco

~olúvei~foram também preparadas por agitação num agitador mecâ­

nico.

Os açúcares fosforilados na forma de sal de bário tiveram

êsse íon removido por precipitação com sulf~to de sódio.

Pràticamente todo o trabalho foi efetuado em solução aqu~

sa de tampão tris.0,25M. Exceções ocorreram na determinação do pK~ . ~

da caseina iodada, quando se empregou tampao acetato e tambem car-

bonato/bicarbonato; também em algumas experiências em que a iodo­

caseina atuou cono catalisador, empregou-se tampão acetato e imida

zol. Ocasionalmente, conforme será visto~ foram empregados os ou­

tros tampões referidos.

2. Determinação espectrofotonétrica da constante de associação

de complexos molecular.s

Sejam dois reagentes que se associam em um complexo:

mA + nD _oa-c b-q c

19

, . :,; "onde A .e o receptor de eletrons, D e o doador de eletrons e C e o

complexo,

Se a concentração de A fôr ê, a de D fôr.,B,

plexo no equil{brio 2, tem-se a constante:

e a do com-

dK l= --------

Se a concentração de um dos reagentes, por exemplo, o re-,..l

ceptor, estiver em grande excesso em relaçao aó outro, a concentra-

ção do complexo será negligenciável em re~ação ao primeiro., Ter-se-á~

cK = - " J

am(b'" c)n

e, no caso em que os complexos se formam na proporção de 1:1 d~ re­

ceptore de doador:

K = c

a(b- c)(1), ou, rearranjando,

-l = K ,(b - c) -- K (2 )a. c

, .Do ponto de vista espectrofotometrlco admite-se que a va-

riação ocorrida no valor da absorbância é devida à formação do com-'r:"

plexo, isto é,

A +receptor Adoador Acomplexo

Pela lei de Lambert - Beer tem-se que

-t. d .. c, onde. A é a absorbância, t. é a absorp~

Q o caminho ótico em em e c á a concentração a'a

A ;::

tividade molar,d

substância em moles/I.

Portanto, para-," ~.um caminho otico de I em, a conoentraçao

do complexo., . ...•

sera: dada por:

20

c = I •A

• , p '. (3)

dade molar do doador no complexo, ou seja, a expressão no denom1n~

dor da equação (3) reflete a absorção devida ~ transferência de

,e a absorptividade molar d~ complexo,

..

onde

vidade molar do receptor no complexo, ,,e a

,e a absorpti-

absorptivi-

carga.

Substituindo a equação (3) na (2) tem-se:

1- =a

• I •••••• r. - K

, ,., d Pu·· .(26)quee aequaçao e J1mor1 ,

Benesi-Hildebrand(27).

,.,umª, variante da equaçao original de

reta

Portanto, mantendo-se fixo o valor de b, ou seja a concen

tração do doador e projetando-se l/a versus l/~A deve-se obter

uma reta cujo corte na ordenada representa o negativo da constante

de associação. É fácil ver que a partir da inclinação da

pode-se calcular o valor de f o•

Multiplicando a equação (3) por~, obtem-se uma expres­

são equivalente ~ equação de Foster e 001s.(28):

~ = Kb CE:c - ( EA + Eu,] - KAA (5)a

Nesse caso, o valor de K corresponde ao negativo da incli

-naçao da reta obtida projetando-se 6A/ a versus ••

•Na prática 'prepara-se uma série de soluções n~s quais a

concentração do componente em baixa ooncentração é mantida const~

te e se varia a do componente de alta concen~ração, alterando-se

assim a proporção de complexação e, portanto, "A.Pode-se ainda utilizar a equação de Cilento e Sanioto(29)"#v , .atraves do metodo das diluiçoes, que consiste no preparo de uma Un1

..

ca solução e no estudo da variação:.a.e absorbância ocasionada pela

adição de sucessivas quantidades de solvente.

Expressando a concentração em número de moles por litro

(n/v), assumindo-se as mesmas condições iniciais, ou seja, a con­

centração de um dos componentes é muito maior que a do outro, a

equação (1) fica:

vK = ------------

)nA nn nO-(-,-,----v v

~ ,sendo pois, nO o numero de moles do complexo, nA o numero de

.... . , ... ,les do receptor de eletrons e D» o numero de moles do doador

mo-

de-'eletrons ..• " .. ""

-: ..

Trabalhando-se numa região de comprimento de onda em que,

apenas o complexo absorva, ter-se-a:

A =v

, dondev

A ( 7)

Introduzindo (7) na equação (6) e rearranjando:

A nA D.n A"

n·A"K-- • - -K .• s:- ....

€O d v v e d vO

Multiplicando por EcdV

A

K·E'C· d .nA.nDv =

, tem-se:

obte~-se uma reta~. '\

•

Portanto, projetando-se'V versus 1ft A

cu~C? .coNé""-- na: ordenadc fornece -&:~.

Medidas em diferentes comprimentos de onda deverão resul-

tar em "retas de diferente inclinação e mesma interseoção no eixo

das o:r;denadas., , ~

Ainda e poss~vel aplioar a equaçao de Cilento e Sanioto

para o oasto em que eJiisto. absorção dos componentes, tomando o oui-

22

dado de subtrair o valor de absorção correspondente a cada diluição.

As retas foram sempre traçadas pelo método dos quadrados

mínimos.

3. Determinação espectrofotomjtrica da constante de velocidade

de uma reação de pseudo-primeira ordem(3o)

Um processo catalítico que se constitua numa reação de pri

meira ordem em relação ao reagente pode ser matemãticamente aborda-

do como se se tratasse de uma reação de primeira ordem; o mesmo ocor

re num processo não catalítico em que um dos reagentes se encontre

em tal excesso que sua concentração possa ser considerada constante.

Assim, na reação:

A B produtos,

A seria o reagente de cuja concentração a velocidade da reação de-

pende segundo uma equação de primeira ordem; B seria o catalizador

ou o reagente em excesso. A á Se a concentração de A fOrai e de B for à e se x a

variação da concentração de A no tempo t, pode-se escrever:

dx = kr ( a- x ) b- x) n,

d t

sendo kr a constante de velocidade da reação.

Levando em conta o que foi dito em relação a B e verifican

do-se que n = 1:

dx = k

r b (a- x),

dt

Integrando

a = kr bt ( g) a- x

Espectrofotometricamente, ume, vez que se tem a correspon-

dencia entre absorção e concentração, pode-se deduzir:

23

At = (a- x).d t(A) + b.d.I(B) + x.d.E(r) (10),

sendo At a absorbancia no tempo t.

Visto que AD (x= o, t = o) e Amo (x = a, t =.410 ),

podem ser expressas respectivamente como:

Alo = a.d.Ç(A) + b.d.t(B) (11) e

A a.d.e(p) b.d.t(B) (12),

de (10), (11) e (12), segue-se qur:

At A x a. t o At -.Ase

A substituição para o valor de x na equação (9) dá:

ln -------- = krbt'

ou seja,

ln (Aipo - At) = kr bt + ln (A40 - A0)

No caso em que se acompanha a reação no comprimento de onda

em que a substância reagente tem absorção máxima, caindo, portanto,

com o tempo, a equação fica:

ln (At - Amo) = krbt + ln (Ano - imo)

Portanto, para uma reação catalisada, projetando ln (At-

A410

) em função do tempo obter-se-á uma reta cujo coeficiente angu-

lar será - kr [cat J , de onde se pode calcular o valor de kr.

Se a reação ocorre também em ausência de cataliAador (rea-

ção "espontâned5, asse efeito pode ser descontado da reação catali-

sada, acompanhando-se simultãneamente a reação espontânea. De fato,

para co coeficiente angular da reação total jtem-se:

-At

m = kcat [oat J + kesp C outros catalizadores)

As retas foram traçadas-aplicando-se.o método dos quadra-

dos dos =imos, com o emprego de um computador eletrônico.

4. Determinação de parâmetros termodinâmicos e de ativação.

a. Estudo de complexos moleculares

Determinando a constante de associação de um complexo mole

cular a diferentes temperaturas e aplicando as relaçges conhecidas

da termodinâmica tem-se:

G = - RT ln. k (13)

T2 T1

= R ( ) ln 2 T2-T1 1

611-PG

1.15.= (15) T

(14)

Calcula-se assim a energia livrg, a entalpia e a entro

pia de formação do complexo.

b. Estudo cinético de uma reação

i. Energia de ativação

A energia de ativação é determinada medindo-se a velocida-

de de reação a diferentes temperaturas e empregando a equação de

Arrhenius.

ln

A projeção de

ficiente angular e -E

kr =

ln kr

./R, a

a + c RT

versus 1/T fornece uma reta cujo coe

donde se calcula E.

ii. Entalpia e entropia de ativação

A equação para a constante de velocidade estabelecido, pela

24

teoria do estado de transição e:

kT -ãH*/RT. e * S /R Kr = . e e

h

permitindo calcular a entropia de ativação da reação uma vez que,

para reações em solução, tem-se para a entalpia de ativação

H# = Ea- R T

25

onde Ea e a energia de ativação calculada pela equação de Arrhenius.

26

III. TRANSFERÊNCIA DE HIDROGÊNIO ENTRE AS FORMAS OXIDADA E REDUZIDA

DOS COENZIMAS PIRIDINICOS E SEUS MODELOS,

A, Introdução

A transferencia de hidrogénio entre as formas oxidade

reduzida dos coenzimas piridinicos tem sido exaustivamente estudada.

Do ponto de nota biológico a sua importância se manifesta no contrg-

le das quantidades de NADH e NADPH, uma vez que se atribàem dife

rentes funções a ambos os coenzimas; NADH teria importância pri-

mordial nas oxidações biológicas enquantoque o papel de NADPH se

ligaria fundamentalmente às biossinteses redutoras(31)

Assim sendo, todos os processos — in vitro ou in vivo-

que permitam detetar a oxidação de um coenzima piridlnicos em estado

reduzido as custas de outro em estado oxidado constituem-se poten-

cialmente em fonte de informações para o estudo do problema acima

referido.

O assim chamado processo de transhidrogenação pode ocorrer

enzimàticamente através de diferentes mecanismos.

Existem enzimas ou sistemas enzimáticos cuja função pri-

mordial e outra que não a de promover transferencia de hidrogênio de

um coenzima a outro, porém que podem, seaundàriamente9 catalizar

esse pro.lesso(32-35) Os cofatores atuando nessas transhidrogena-

çges são variados. e

São, porém, ao lado desses casos, conhecidos processos de

transbidrogenaçao enzimétiea nos quais ocorre uma transferencia dire

ta de hidrogénio entre os coenzimas piridfnicos. As enzimas que cata

Usam esta transferencia já foram detetadas em bacterias(36-41)

e em

vários órgãos de mamíferos(42-44)

Tem-se ciência ainda de ren5es de transhidrogenação pa-

cuja ocorrência e necessário o fornecimento de energia 45-56)' po

dendo esta ser formada por ATP ou outras vias, indicando a pos-

sibilidade da formação de compostos intermediários ricos em energia

•

ar

27

não fosforilados(49'51953). Isto abre perspectivas para se propor

mecanismos análogos em outros processos.

Quanto a proposição de que a mesma enzima esteja envolvida . nos processos energeticamente distintos, algumas evidências parece-t

sugerir que seria realmente esse o caso. Assim, por exemplo na redu

çgo de NADP* por NADH verificou-se que, tanto na reação depen-

dente de energia, como na não dependente, a transferência de hidro-

génio ocorre do lado A do NADH para o lado E do NADP(50-52,54,56)

Isso contribui para eliminar qualquer dúvida de que possa se tra-

tar da transferência de grupamento fosfato ou outro qualquer. Pede-

•

-se observar, também, q ue ambas as reações são inibidas por um an

ti-corpo especifico para una transhidrogenase pura ngo.dependente

de energia( 513'54), por triiodotironina e tiroxina(44946947950)

que ambas possuem energia de ativaçãdo relativamente alta(46'5°).

Essa mesma estereo-especificidadep descrita para reações

ocorrendo em mi*ocendrias, foi também verificada para a redução de

pendente de luz de NADP* por NADH por cromatforos de Rhodopseu-

domonas spheroides(56)

Outros estudos, ainda, indicam diferentes especificida-

des e intensidades das reações das diferentes transhidrogenases co-

nhecidas, em relaçZo a derivados de NAD+

Adsim, a transhidrogenase isolada de Pseudomonas fluores-

cens(36) catalisa a interconversn:

NADH + NADP,* IMMOt NAD* + NADPH (l)

e ainda as seguintes reaçe'es(7,58);

NADH + deamino-NAD* NAD* + deamino- NADH (2)

NADPH + deamin.o- NADP+ —) NADP* + deamirto - NADPH (3)

De ChromatiUM (55) foi isolada e purificada uma transhi-

drogenase que promove a transhidrogenaçge entre NADPH NAD+. Alem

dessa, efetua ainda as reações (2) e (3), podendo utilizar ainda

tionicotinardda-NAD+ e deamino-NADH. Essa enzima, assim como a

de Pseudomonas, catalisa ainda a redução de NMN, não usando ambas,

contudo, os 3-acetil derivados como substrato, ao contrário .da

transhidrogenase presente em tecidos animais que, além de promo-

ver as reações (1) e (2)(44) catalisa, ainda, as seguintes:

NADPH + 3 -acetil -NADP+ ---■ NADP+ + 3 -acetil -NADPH

NADPH + 3 -acetil -NAD+ NADP+ + 3 -acetil -NADH

NADH + 3 -acetil -NAD+ ----> NAD+ + 3 -acetii -NADH

NADH + tio - NAD+ NAD+ + tio- NADH

A transhidrogenase de tecidos animais não el no entanto,

capaz de reduzir NMN.

Através do exposto pode-se bem avaliar a contribuição para

o estudo da ação das transhidrogenases de um exame da interação en-

tre coenzimas piridfnicos e seus modelos, mesmo em ausencia de en-

zima, pois os resultados obtidos podem ser úteis para a compreensão

do mecanismo de ação das enzimas.

Anteriormente já fOra descrita a transferência de hidroge

nio entre as formas oxidada e reduzida(57-59)

, Estudou-se aqui a

comp/exaçao entre essas formas com vistas ao mecanismo da transfe-

rencia de hidrogênio nessastranshidrogenaçoes,

28

B. Resultados

1. Interação entre 01B0 e C1BCH

Foi estudada em meio aquoso tamponado (tris 0,25M, pH =7.0)

a interação entre as formas oxidada e reduzida dos modelos dos co

enzimas piridínicos.

A alteração espectral observada na solução de mistura na

região de comprimento de onda em que o íon de piridínio não absorve

e a absorção da dihidropiridina é pràticamente negligenciável encon

tra-se na figura 1. Verifica-se que há uma intensificação na cOr

da solução de mistura em relação ,aos componentes isolados, a qual

pode ser detetada mesmo visualmente. Esta alteração espectral) por

ser instantânea constitui indicação da presença de um complexo de

transferencia de carga.

A determinação da constante de estabilidade do complexo

foi efetuada pelas variantes de Fujimori e de Foster da equação de

Benesi- Hildebrand e -bambem pelo me-todo das diluições.

Os resultados podem ser apreciados na tabela II.

As figuras 2- 4 registram as projeções, segundo as equa-

çges mencionadas, dos resultados obtidos.

Pode-se deduzir que a extensão de complexação do C1BCH va

riou de 20 a 50%, aproximadamente, da. solução menos concentrada de

C1BC para a mais concentrada a temperatura ambienteede 10 a 40%a

temperatura mais alta.

Os parâmetros termodinâmicos foram avaliados de maneira

aproximada devido ao baixo valor da constante de estabilidade. Os

valores foram os seguintes:

29

21G = -0,834 kcal/mol, .6H = -4,83 kcal/mol e AS --72-13,4 cal/grau

30

•

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Pc1

Pia. 2 - Determinação espectrofctome'trioa da constante

de equilíbrio do complexo C1BC-C1BCH pela projeção de

Pujimorl à temperetura de 26,1°C. Á concentração de

C1BCH nas celas foi de 8,44,10-41,M e a de CIBO variou de

0,056 a 0,282 L 3eie: tampão tris 0,25M, pRs6,92

32

Pig, 3 - Determinação eepectrofotometrioa da oonetante

de equilíbrio do complexo 01.80-0120H pela projeção de

Mento e Sanioto à teaperatura de 23,0°0, À concentra

çãolde 01BCH na cela foi de 8,3,16"4M e a de C1BC va-

riou de 0,102 a 0,282 ML, Meie: tampão trio 0,25K, pHm

6,92 ,

33

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-tri''-'

10,0 20,0 30,0 t/AA44OmJJ

I 20,0 40,0 60,0 1/ÔA47, ,OmJJ

Pia. 4 ~ Det8~.O ••pectrofot~trloa4a oonstante 4...8001&9â040 parCIBO-

OlBOB ,.1& Foj.O~O". lu.~iIlor1, à t ••,.ratura 4•••,;°0 • A conoen'tratio a., OllOH

nu 081u toi d. e.l~lO-"K _ a 4. C1BO variou 4. 0,056 &- 0;288 M. Me1.o: tampãotris 0t2$ M; pH~6,92 •

.....;.

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À=440miJ/ .,/

'ü"' I ././~=470mlJ~ . / /~ I ~ .- i /,,"" .~/

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2. Interação entre NADI' e NADH

O estudo da mistura em solução aquosa tamponada (tris

0,25M, pH = 7,2) dos coenzimas piridinicos em suas formas oxidada

e reduzida indicou um aumento da absorção relativamente ;. soma das

absorbâncias dos componentes isolados, em região de comprimento de

onda em que a absorção da dihidropiridina já se torna desprezível.

O valor da constante de estabilidade foi determinado atra-

vés do método de Benesi-Hildebrand, utilizando-se as equações de

Fujimori e de Foster; o valor pràticamente nulo indica uma ten-

dencia menor a complexaçao dos coenzimas comparativamente aos mode

los.

Os resultados relativos ao estudo do sistema NAD+-NADH

podem ser apreciados na tabela III e nas figuras 5 e 6.

3. Interação entre NAD+-C1BCH, CIBO- NADH e ABC- NADH

Com o fim de esclarecer as razões estruturais da diferen-

ça de comportamento entre os coenzimas e seus modelos, foram feitos

estudos compreendendo a interação entre coenzimas e modelos.

Devido ao fato de ocorrerem reações entre os componentes

dos sistemas estudados(se) leituras foram feitas em tempos diferen

tes, extrapolando-se posteriormente o valor para o tempo zero.

Pôde-se verificar entre NAD+ e C1BOH, sempre nas condi-

coes experimentais já descritas, uma modificação espectral, resul-

tando, porem, nulo o valor da constante de equilíbrio de formação

do complexo (Tabela IV, figura 7).

O exame da complexação entre C1BC e NADH e ABC e NADH in-

dicou para ambos os sistemas um comportamento análogo quanto à in-

tensidade de interação, fornecendo para as constantes de estabili-

dade dos complexos, calculadas pelas formas já citadas, os valores

que se encontram na tabela IV(figuras8e 9).

35

36

Como se pode verificar, esses valores representam aproxi-

madamente a metade do valor da constante para o sistema C1BC-01BCH,

Nas condições experimentais usadas (tabela IV), a comple-

xaçg.o do NADH foi de 11 a 37% com C1BC e de 14 a 32% com ABC.

.J ',> ,.. ....

TABELA 111

, -Estudo espectrofotometrico da interaçao entre+ a,c b

NAD e NADH a pH = 7,18I I

e Temperatura I- K fdEquação(oe) (m u) 1/ moI' C

Fujimori 25~8 420 0,33 I 26,3.10

Fujimori 25,8 440 - ! -Fujimori 25~8 460 - -Foster 25~8 420 0,,29 I - (

iFujimori 48,,0 420 0,95 -Fujimori 48,0 440 - -,

I

Foster 48,0 420 , 0,93 -!,

..

a) A concentração de lfADH . ·:roi man<;ida da constante, tendo Sido 6,0 mM a 25,8~C e

5,4mB a 48,0~C; b) idem tabela lI; c) a solução original de N.AD+ :roi neutral,?_

zadà. p&la. adição de lCllCO'3 ":-em concentração igual ao dôbro da .concentração d~ NAD+;

d) idem tabela. 11; e) o m~todo empregado foi sempre o de Benesi-Hildebrand.

~

~: ") :~: ".', .'

À=460mlJ

20

•

~=440m~

10

À=420mp

/

_".. -..1~.... ._I ......_ .....

5,0

-'~10,o....~.,

!'ic. 5 - De't~ ••peen-ofotaétnoa ela ooUtante

de U8OC1.ac;ãO 40 par W>+....b.DH à te...ra:turad.. 25,8°0

pela pro~.9io 4. h'111Ol'i. J. oonooaVqão d. QDH ..

oeJ.u· toi 6t05~lO"JI e & a. UD+ ftri.on 4. O,Ul ..

O,SM .....10:: taapão tri. O,2õJl~ pB.'.18 •

.....-.,-------....----_....-------.....

r;-'zo....

,0 I 1,40""-

::LEo

(\J

cr.VC3

'" 1120

0,200 0,400 IlA420rnp. ,

Pia.., 8 ... De1;en1n*Ql&o ••PitctrotO't;OMtrioa da oouta.nt. de

- +. oU8CM~1açao elo par JUD -If.A.DH & ~pera"ura de 48,.0· a pala

praj:4agão 4. 'GiI'teI·" À coaoen~o 4. JWm DU ..lu .toi

ti"4~i.O""•& 4e IfAD" 'fU'1ou ele 0.108 • I," .. "1~ '~»ie 1;rie O.tt5Jl. __7,18 •

TABELA IV

.., • o" :. ",:.~

.~1$.~

't'.'f,

::i

Estudo es»ectrofotométrico da interação em sistemas mistos coenzima-modêlo à temperatura de 25,00C

~

,

a b -[forma reduzid~ (forma oxidadaJ Á K 'clSistema Equação pH~lmM (D,~ (1/trio1) • o I

NAD + - C1BCH11 -1 .

Fujimori 7,2 9,74.10 0,0945-0,221 420 - -o'

C1BC-NAl)H Fujimori 7,2 3,08 0,0606-0,303 410 1,9~2

4,0~10

C1BC-NADH Fu.jimori 7,2 3,08 0,0606-0,303 420 1,96 23,1.10

01BC-NADH FC'ster 7,2 3,08 0,0606-0,303 410 1,89 4,1.102

eJ.BC-NADH Foster 7,2 3,08 0,0606-0,303 420 1,91 23,0.10

ABC-NADH Fujimori 6,34 0,096-0,288 440 1,62 26,9 2,4.,10

,2

ABC-N.ADH Foster 6,9 6,34 0,096-0,288 440 1,35 2,7.10I ..

a) O método empregado foi Bemp1:'e o de Bensei-Hildebrand; b) :!dem tabela. II; c) :!dem tabela In; d) :tdem tabela. n.

);'.lo

(oI>,',,,"

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".-~.,

5,0

20,0

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~ #

l1a. 7"- Dew1"lldU9&o ....o1rofo1i 'ir1oa da co1JlJtan1e 4e ..

/ 8oo1a<;- 40 par'8J).-euc:m:à. t ~e 25.0°0 pela. pr0-

jeção de Puj1Jaori. J. ooace:n:traoão 4. 0lBCH nU oelU foi

.••:7.,.10-.... e a de Im+ variou de 0,016 a 0,211 K...1.: ....

pão tri,8 O.25K, pH·",a '"

\.\

1/0A

" =420mJ,l

10,0S,D

" =410mp

.....~_'__I_._.__..1. .1•. 1_.... .....

-

r

:11&. El - Det.~lI .,.pac't;t'O!'otoétrioa ela ooutaaie 4e

aasocj.&çáe do par O}.BC-~IADH à 'te.peratura 4••,0°0 J8la

pro~.~tio de :ru.~Utcr:L.. A ocmoentra~o 4. lUDJI-.. celu foi

3~oa.J.o~•• clá 'CJl.BC "I'&r1.1 4. 0,0601 & 0.101 L ..1.:taJlpãc. via O,2U:. pU.'.a ..

o

'1~ 10,0~

5,0

2,0

- ,Pia. 9 - De'tel"lliraaqao ..peetro.totoaetr1e& da cODStante de

equiÚbr10 40 ooapl_o~ à 'eaperatara de 25,0°0 p!

1& pzooj.~ de h3111or1• .l ooacG:traQio de UDB __ c.lu.......

foi 6.14 .10 ••• de ABa TR'iou de 0,096 a 0,888 M. "u.tapão t:ria O,25M, JR-7,p •

43

"',' - -... -; ~ .

44

C. Discussão

.do

da~

'-

A formação de complexo de transferência de carga por parte

íon de piridínio aqui descrita constitui-se em mais um exemplo

tendência dêsse anel para formar complexos(60-62).

Os baixos valores encontrados para as constantes de esta-.bilidade dos complexos estudados, comparativamente com complexos de

derivados de fiavinas, pode0 ser conpreendidos se se lembrar que a

orbital ocupada de mais alta energia nas dibidropiridinas é ainda

uma orbital ligante, enquanto que nas fIavinas trata-se de uma or­

bital antiligante(63), fato êsse que explica a grande facilidade

d€ formação de radicais e da auto-oxidação destae~ltimas.

à verificação espectral da complex8ção entre CIBC e ClBCH

, permite sugerir que as fôrças que atuam para essa complex8ção são,#>, entre outras, de transferencia de carga.

O fato de se constatar a existência da transferência de

~ carga entre NAD+ e NADH, obtendo-se, porém, para êsse sistema,

um valor nulo da constante de equilíbrio, vem demonstrar que, em_ A ,

relaçao aos modelos, os coenzimas manifestam nenor tendencia a com

plexação, revelando a influência da diferença estrutural entre os

componentes dos dois sistemas.

Os estudos com os sistemas mistos +NAD e ClBCH, CIBC e

NADH e ABC e NADH vêm elucidar que a maior relutância em comple-, +.

xar e devida ao NAD , fato esse cuja explicação pormenorizada se

constitui no tema do próximo capítulo dêste trabalho.

Os valores das constantes de estabilidade dos complexos

entrQ CLBC e NADH e ABC e NADH, quando se revelam como muito

,'" perto da metade da constante para o complexo entre CIBC e CIBCH,

sugerem a dificuldade estatística da complexação de NADH em com-N

_,~ paraçao com CIBCH.-' Uma vez q.ue se tem conhecimento da estrutura feohada do

A _NADH(21,64-66), onde b __f. t I t· t,_ a ase pu~n~ca se apresen a re a ~vamen e

paralela e proxima do anel dihidropiridfnico, pode-se concluir que

apenas um dos lados do anel se encontra desimpedido para interagir

através da transferência de carga com a outra entidade complexan-

te.

~ conhecido o fato de.que, tanto no processo enzimático. (Ao !>0-52 54 56) IV (59)de transh~droienaçao' " ,como no nao catalisado , o

hidrogênio transferido se encontra no carbono 4 do anel dihidropi-r IV' IV

rid~nico, antes e depois da reaçao. Mostrou-se poss~vel, entao,

estudar a coaplexação entre a forna reduzida e oxidada de uma me!

ma substância, pois os reagentes eram sempre regenerados.

45

A existência de ,uma complexação entre +NADH e NAD , NADPH

..~,

e NADP+ e l-n-propil-I,4-dihidronicotinamida e cloreto de l-n-pr~

pil-3-carboxamida pirid1nio foi descrita por Ludowieg e Levy( 67 )

,praticamente ao mesmo tempo em que eram publicados os nossos resul

tados( 68).

A admissão da possibilidade de interação, parcialmente por

fôrças de transferência de carga, entre as formas oxidada e redu­

zida dos coenzimas piridinicos e seus modelos e a conceituação deA • ."" ,que, para que haja esse t~po de ~nteraçao, torna-se necessaria uma

certa justaposig:lo entre ambos os anéis envolvidos, permite a s~

gestão de um mecanismo para o processo de transhidrogenaçã~enzi­

mático ou não, o qual poderia ocorrer v.ia a fornação intermediá­

ria de um complexo de transferência de carga. Essa formação inter-mediária poderia favorecer a reação.

Tratando-se da reação enzimática, uma vez aceito êsse me­

canismo e conhecendo-se a especificidade estérica da transhidrog~

nase envolvida pode-se propor a configuração absoluta dos dois co

enzimas na superf{cie da enzima.

Se os dois coenzimas interagem com a mesma esttreo-especi­

ficidade, então a formação intermediária do complexo indicaria que

os dois grupos carboxamida apontam em direções opostas. Assim}para

1

"".' 1_ '''..,._

a transhidrogenase simétrica de Kaplan(4 0 ) e -col~,levando em coa

ta também que a esttreO€specificidade é do tipo B, ter-se-ia:

-.-#t

Por outro lado, se os coenzimas envolvidos interagem com

estlreoespecificidade diferente, então a formação de complexo r!

quer que, os dois grupamentos -CONH2

apontem na ~esma direção. Ne!

se mesmo sentido, levando em conta que, na transhidrogenação entre. +(5~-52,54,56)'

NADH e NADP , a enzima catalisa a transferência de

hidrogênio da posição A do NADH para a posição B do NADP+ , ter-, .

-se-a.

:

47

IV. INTERAÇÃO INTERNA NOS COENZIMAS PlRIDfNICOS

A. Introdução

A simples construção de modelos para a estrutura normal

dos piridinodinucleótidos (com a ligação nicotinamida-ribose a-.,

través da configuração pdo açúc~) mostra que as bases pur!nica

e pirid1nica podem se aproximar, com possibilidade de coplanari­

dade e mesmo de justaposição, acarretando esta última uma estru­

tura fechada(69).

Diversos fatos indicam que os coe~z1mas p1rid1nicos, seja

na forma reduzida, como na oxidada, possuem uma tal estrutura.N + N

Os fatos em favor da confornaçao fechada para o NAD sao

os se~intes:

(i) a ação de pirofosfatase resulta numa hiper-cromicidade na

região de absorção máxima de adenina e do íon de pirid{nio (260­

-270 mp), indicativa da destruição de ponte de hidrogênio na es­

trutura original(21);

(ii) o estudo comparativo da adióão de cianeto em meio aquoso a

certos derivados substituidos do iOh de l-netilpiridlnio e de NAD+_ A A

mostra que a açao desse reagente sobre l-netil-3-etoxicarbonil-p1-ridlnio implica na hidrólise do ~ster; isto nãõ se passa no cor-

+ Nrespondente derivado de NAD • Uma explicaçao parcial para essas

observações constituir-se-ia no efeito estérico protetor promovido

pelo restante da molécula de NAD+ (7 0);

(1ii) elevando-se o pH observa-se o desaparecimento da fluorescên­

cia do derivado 5-amino-NAD+, indiC?ativo de que a remoção do pr,g,

ton do N1

da adenina (cujo pK é 3,7) favorece a interação entre

1 " "d r " 1 d f" (71)O ane p~r~ ~n~co e o ane a en~n~co ;

(iv) mais recentemente,? medidas de ressonância magnética nuclear

mostram deslocamentos químicos cuja interpretação se adequa bem

· :.

com a formulação de uma complexaçâointerna(69,72). Pôde-se mesmo

calcular os parâmetros termodinâmicos do complexo.

A natureza das fôrças atuando para a ~anutenção dessa es­

trutura deve variar, certamente, com o estado de oxidação; assim,

no que se refere à contribuição das fôrças de transferência de

car~a, esta só pode ser esperada no caso da forma oxidada. De fa­

to, a parte aden1nica da molécula dos coenzimas é boa doadora de

elétrons e, como tal, poderia interagir com o anel de pirid1nio

que é um bom receptor, mas não com o anel dihidropiridinico, que

é doador( 1) •

A interação interna em NAD+ poderia constituir-se numa

explicação da dificuldade que êsse coenzima manifesta em se com-plexar, quando comparado com CIBC.

Mostrou-se, por isso, interessante um exame de uma poss{­

vel interação por transferência de carga entre as partes compone~

tes de NAD+, isto é, entre ions de piridinio e- derivados aden{-

nicos.

B. Resultados

1. Interação entre CIBC e adenosina

-2A presença de CIBC 1,27.10 M altera a curva espectral

de absorção ultravioleta da adenosina na região de maiores compri-mentos de onda (fig. 10); nota-se a presença de uma nova banda de

absorção coo máxioo oculto. Os valores das constant~s de associa

ção determinados com base nessas alterações espectrais e em dife­

re~tes condições experimentais (figs. 11-14) acham-se na tabela..V.

A extensão de complexação da adenosina variou de 11 a 38%'\ '\

a temperatura ambiente. da mesma forma a temperatura mais alta..... , .

Pode-se observar que a constante de complexaçao e ba~a e

pràticamente não influenciada pela temperatura, fatos êst~ indi­

cativos de.variaç~o pequena ou nula nos parâmetros termodinâmicos

( 6.G = -0,4 kcal/mol, AH c:: -0,6 kcal/mol, 4 s f; O cal/grau)

2. Interação entre ClBC e ADP

A interação por transferência de carga entre ClBC e !DP

pode ser observada na figura 15.'\ rOs resultados relativos as medidas da constante de equi11-

brio encontram-se nas figuras 16 e 17 e na tabela VI.

, Verifica-se que a associação de ClBC,

com ADP e bem mais

pronunciada que com adenosina, tendo a extensão da complexação do

.ADP variado de 18 a 52%•

3. Efeito de fosfatos sôbre substâncias e sistemas estudados.'

quando

acima

fons de fosfato inorgânico aumentalll a absorção de (3 -NAD+

de 295 mp(73). No entanto, êsse efeito não se faz sentir, Á '+

se procura estuda-lo sobre as partes comp~nentes de NAD "

Acima de 300 mp, fosfato inorgânico (1,5M) não altera á

50

absorção de elBe, adenosina ou ADP isolados e nem dos sistemas

elBe - adenosina e elBe - .ADP.

A fim de eliminar a possibilidade de participação do açú­

car na interação com elBe, foi estudada a interação no sistema,., ,.

constatando-se a nao ocorrencia da mes-

mf, nas c ondições empregadas (elBe-2' IVglicose-l-fosfato 2,5.10 M em agua e em tampao tris

elBe - glicose - l-fosfato,

ma na região de 290-- 350

-21,25.10 M,

t

O,25M, pH = 6,87).

11" M1U". • ........ I E

A

0,100

0,050

51

3.2 C,;. 350

)•.1&... 10 - .I1JjJl)e'tt]~a d.e' abS~1~9ãa d,e UM eol:u.Qáo d~ â#lltr.aêSLM

4.1.10-1-. eu ~lIn98, 44 elBe V7...1()~;C.t des<mntada s.. ab­

~(;r9io do CUtC (l:1uu, ehe~} ti J. linha potttilbada :'epreN:l'l. '.-. '*'-:

1ia a absorçio ª-e WDt\ i!JoJtur~ ",1.10". de adenOlll:iJul....i~:

tuJio tr18 0.25., pEla;7jt18 ..

TABELA V

Estudo espectrofotométrico da interação entre CIBCa

e Adenosina

52

...... . . '" .. ...... •. _4 •

. ~. ____ -. ____._____ '. . . ...._~........... .. - ...

'" .~.;.. - ..

b metilpet'atutla c ,.( K dEquação pR (CC)(oe) CIDfA) (l/moI)

.lJnjJi~ 24,2 7,00 325e 2,05 21,7.10

Fujimori 24,2 7,00 330e 2,52 21,1.10

Fujimori 24,2 7,00 335e 1,97 21,1.10

Footer 24,2 7,00 325e • 2;34 21,6.10

Foster 24,2 7,00 330e 2,44 2: 1,2.10

Foster 24,2 7,00 335e 2,18 21,0.10,

Fujimori 25,0 7,18 325f 2,50 21,4.10:

Fujimori 25,0 7,18 330f 2,40 21,1.10

Foster 25,0 7,18 325 f 2,29 21,5.10

Foster 25,0 7,18 330f 2,22 21,2.10

Fujimori 43,1 7,00 325e 2,34 21,2.10

Fujimori 43,1 7,00 330e 2,18 21,1.10

Fujimori 43,1 7,00 335e 2,05 20,9.10

Foster 43,1 7,00 325e 1,97 21,4.10

Foster 43,1 7,00 330e 2,01 21,1.10

Foster 43,1 7,00 335e 1,80 21,0.10

Fujimori 43,6 7,25 325 f 2,41 21,3.10

Fujimori 43,6 7,25 330f 2,34 1,10.102

Foster 43,6 7,25 325f 2,05 21,5.10

Foster 43,6 7,25 33of 2,14 2; 1,1.10

- .- .-......_......o' • .-

.~ a) A cono~ntraçã.o da adenosina f'oi...:.manti~ f'~xa (7,OmM) e a de ClBg ~C?i va­

r~ada de 0,056 a 0,282)(,; b) o método empregade foi s~mpre o de Benesi-lIil­

debrand; c) tampão. '11;'is 0,25 M; d) 1dem tabela lI; e) experi~noia f'eit~

oom lAmpada de tunptAnio, f) experi3noia feita com lâmpada de merct1:rio.

1/0 A20.0

~ =325mIJ

À-330mJJ~=335mlJ

10,0

..-

10,0i

-~20,O~:.t

'u'm

- ,11.. 11 - DeteraiDaç&o ••"O'trofo't0M1rie& da oou1&nte de

eq1tllíbrio -para • lnteraoâo CJ.BC>0e4enoe1Da à teaperatura 4.

204 ,2°0~ projeção de Ju~1JlorL. ... ooaeen"r&9ão de a4enoe!

. na :nu oelu foi '7,O.J.O.... • a ile CUC T&r1ou4e 0.016 a

Q.882 li. iI.10: taapão v-1a OP_. JB-".OO·.

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- ...-,----_....__._._.----------_._---...

À:325mlJ

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0,200 0;400 ~lj A (mJJ):F.54 \ li' 12 .,.. ~~~!.'1Id.Jna.~ão ••,.,ctrof'()·t;o.etrica da cOI18tan'te M

,~títlü:lidade do o:oDl]i1exo C~eno$iD& à. t.aperatura d4!

25:tfOOC !i9 pH-7,la :pe1.a proje~ de;'08ter..... "elllL1ti ooDd1 ­

OÕ8$ er'xl'.eriDlfJn;tu;1S _io U _lil.. 4& tiaura 11 •

53

54

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e.Jt&b1.1.2(~. <lo elnlRl4!l.'l:l~ Cl.BO-.adttmoa1a& fi to_Pla.,..ia,", ••

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rbea'tai I' aão as 11..... da tiaum II •

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55

o

o

À=325m...

À=330 mJ.l

-..

0,200 0,400 âA

fl&~ 14. - DeteJ'llillaçÃo .apeotrototOllétrica da cGU'tallte ae...

8.'tabil1dde do coapJ.exc ClBC-e4__1aa a teaperatura de

43.6°0 • pa-'t26 pela pro~.oão a. ~o.ter. A8 deaa1. ,o0D41 ­

çõe. experiaenta18 aio &8 ...... aa tieura 11 •

c:C)

o..J

-1

-2

300À (m~)

325

Pie. 15 - "pe... loca:r1tme. da absOl'çáo de UM ao-- ~. ~luoao 4,1.10 • 4. jJ)P .. pre••ac;a ... 01BC J..8'.10 li.

d••contada a abaorção elo Cl.BC (cana ..ta).• .& curva

Jon'ti1 batla repreaa:ta a absorção de u.a moluçâo ....

4.1. lO·. 4.......1': tuQio tr1a 0.&511, pH-7,5 •

'.,~"':""".

~... .'\or

TAm·A VI

Estudo espectrofotométrico da interação emtrea

01BO e !DF

b Temperatura c d KEquação pH ~ E (O)

(°0) (m~) (l/moI).'

Fujimori 24,2 7,66 330 4,852

1,0.10

Fujimori 24,2 7,66 335 4,772

0,8.10

Foster 24,2 7,66 330 4,512

1,1.10

Foster 24,2 7,66 335 4,5120,8.10

•

Fujimori 26,0 7,25 330 3,882

1,2.10

Fujimori 26,0 7,25 335 3,6020,9.10

Foster 26,0 7,25 330 3,8621,2.10

Foster 26,0 7,25 335 3,792

0,9.10

.-.- -- .. - .. . -- - _.- .... . -a) A concentração de.ADP :r~~ mant;da fixa. (4,1 mM) _e .,a de 21B2..~?:~u ª,e ..

010564 a.. 0~282){ J .E) fdem tab~l!, V; c) d~ ta.bela. VJ ~) e~eri8nci~8

:r~it~s.com lam~~d~ de mer~ic; el., E:. (ct d ~ abs~rptivida.de molar ap!:.

~nt~ do compl~~ oaloulada pela ~qua9io empresa.da~ V\-..3

..

58

..

1,800

-eU,

"CCCO

1,000

À::330mlJ

"=335mlJ

0,200 0,400 liAPie. 16 - Detel'JI1MOÃo ••peot%'Ofoto1llÍtr1oa 4a constante ele

. as.oeiação do par ClBC-.l])P à teapera'ita'ade 24,2°c pela.. - ~

pro~.qao· de Poster. À eoncen't:Nç&o de .lDP~ celas toi

.,1.10....... a 4. ClBC variou de 0_056 .. 0,282 )( ...1':

taqio tri8 0,29, pUa'1.6& •

!-

~20,O

6

10,0

10,0

À=335mtJ

20,0

:ria. 17 - Detenl1J18.ção ••pec-trofo'to.atr1ca 4a constante de

"8oc1ac;ão do par ClBC-Al)P à teçeratura de 26,0°0 • pH=7,25,

pela p:r;ojeção de· hjiJllor1. As duais· ccm41;õe. exper1Mn-tai.••

são as aeeaaa da tipra 16 .•

seria explicável admitindo-se que fosfato interfe-

•F

C. Discussão

A observação aqui feita de que o 10n de pirid1nio comple­

xa com derivados aden1nicos pode , muito plausIvelmente ser esten­

dida ao próprio NAD+; levando um conta fatôres de natureza esta­

t{stica pode-se supor que essa complexação seja intra-molecular

no coenzima intacto, o que,p~r~3ua vez, constitui forte indica­

ção em favor da Donforoação fechada do coenzima•. , ~ N

Quanto a natureza das forças envolvidas na complexaçao,a

existência de uma nova banda de absorção claramente indica a ocor. -

rência de fôrças de transferência de carga. Entretanto, a contri-N ~ ,

buiçao dessas forças deve ser relativamente pequena. Presumivel-

mente, fôrças hidrofóbicas teriam importância: de fato, o valor

pràticamente nulo de t\ H vem indicar que a complexação é devida, N

essencialmente a um efeito entropioo, resultante da dessolvataçao

dos complexantes no instante da associação, tal como ocorre nas

interações hidrofóbicas.

No coenzima, como foi citado, haveria também contribuição~

de ponte de hidrogenio.

Em relação ao efeito de fosfato, pôde-se observar que êle

é exercido sôbre NAD+ mas não sÔbre os sistemas ClBC- adenosina

e CIBC - !DF. A ocorrência de um aumento de absorção apenas no C!

BO do P-NAD+

riria na conformação do coenzima, alterando-a de modo a adquirir

uma estrutura mais móvel, diminuindo o efeito hipocômico e aumen-~ .tando a tranBferenc~a de carga •

60

61

V. HIDRATAÇlO DAS FORMAS REDUZIDAS DOS COENZIMAS PIRIDfNICOS E SEUS

MODELOS

A. IntroduQ~o

,A instabilidade em meio acido da forma reduzida dos coenzi

. -mas pirid1nicos é de longa data conhecida(74-79). Desde Haas(8~)q~e

, ~

fui o primeiro a acompanhar espectrofotometricamente a reaçao, mui-

tos pesquisadores vêm estudando o problema, tentando isolar os pro-

dutos e elucidar o mecanismo do processo.

O t f · 1· d di· d t ;. 1 't . ( 81)om es a 1na 1 a e as ma s var1a as ecn1cas ana 1 1caà ,'. (82-84) A'espectrofotometr1cas , mais recentemente, de ressonancia magn~

(85 86) ~ " (8~tioa nuclear ' , dispersa0 otica rotatoria e dicroismo circulàrvem sendo aplicadas.

Anderson e Berkelhammer(81) foram os primeiros a isolar e

.'" analisar uma substância pura, a qual era o principal produto da re,!

ção. ~sse composto mostrou ser o resultado da adição de uma molécula" #OI r Ade agua a dupla ligaçao 5,6 do anel dihidropirid1nico da subtancia,.

modelo l-benzil-3-acetil-l,4-dihidropiridir.8.

Estudos mais recentes confirmam a posição da hidroxila para

a reação de modelos de NADH em meio ácido ou neutro conteudo ions

fosfato como sendo no carbono ~(a5,86). Segal e Stein,no~ entanto,

indicam a adição da hidroxila no O de CIBCH(88)5 •

A cinética da ação do 10n de hidrogênio e de ânions polibá-ricos, os quais catalisam a mesma reação para as substâncias modelos

l-benzil-l~dihidronicotinamida(a9) e l-proPil-l~ihtdronicotina-'

mida(9 0) indica que a velocidade de formação do primeiro produto de

rea~o depende da concentração da substância reagente segundo a equ~

ção de uma reação de primeira ordem. A reação seria de catálise áci

da geral, fato êsse verificável através de projeção de ~~nsted.

~ Alivisatos e cols. efetuaram aprofundado estudo cinético da_ (A _

açao do 10n fosfato sobre NADH e traçaram as equaçoes que desoreve-

riam farma~o e as subseqfientes transformações dos produtos(84).

..

61;,-

Recentes estudos, de Miles e coJs~ empreaiando o<;e(!tNADH,

llipoxantina -NADH e (a-NMNH acrescentaram ainda o efeito de epimeril'IfI , • ' Ao. ,.."zaçao do açucar 11gado a base quando as substanc1as sao tratadas

oom ácido ou fosfato(87).

Por outro lado é também há bastante tempo desccrito na li­

teratura um composto denominado NADH- X, cuja. . ~or.-a"~ "foi pela

primeira vez detetada com NADH, em presença da enzima gliceraldeido­

-3-fosfato desbidrogenase em tampão fosfato(91).

Em trabalhos posteriores, seus descobridores atribuiram a

essa substância, através de análise do seu sal de bário, de sua hi­

drogenação catalltica(92) e através do estudo em D20(93), a adição

de uma molécula de água a dupla ligação 5,6 do anel dihidropirid1-

nico.

De fato, o comportamento espeotral do NADH-X é bastante

análogo ao do produto ácido primário do NADH, desaparecendo em am­

bos os casos a banda de ~ ~ e intensifioando-se a absorção de

luz na região de 280-290 mp •

Não se trata certamente, da mesma substância, uma vez que

'"sao conhecidas diferenças essenciais entre ambas: (i) NADH-X pode, ++

ser reconvertido em NADH atraves de uma enzima, em presença de Mg

e ATP, enquanto que o produto ácido primário não pod~r4tii) NADH-X,

sustenta o crescimento de uma bacteria, a Hemophilus parainflüen -

zae(95); (iii) NADH-X pode ser convertido no produto ácido primá­

rio por a'ijaixamento do pH, sendo NADH-X sempre Q~tido em regiões de

H ' i d f' , 1" ( 94)P prox mas o 1S10 OglCO •

Outros autores descreveram posteriormente a formação de

NADH-X mesmo em ausência da enzima, bastando a presença de certos

ânions poli~uncionais tais como fosfato, pirofosfato, citrato(8à,

t (82,96) .' 'd 't· (96)arsena o , ou o amlno aCl o C1S e1na ~

Estudos cinéticos efetuados por Stock e cols.(82), através

de via espectrofotométrica levaram êsses" autores a sugerir a possi-

63

bilidade da formação de um intermediário contendo fosfato anteriormen

te à obtenção do NADH--X. Como esta última substânoia se forma ape-,

nas atraves da estrutura intaota do coenzima, sugeriram os autores que

o NADH- X re~ultaria da interação do amino grupo da adenina com a du-"

pIa ligação 5,6 da dihidropiridina.

A conclusão a que chegaram Stook e ools. foi atingida após, -um intensivo estudo sistematico em que foi testada a açao das mais d!

ferentes substânoias tais oomo ânions e cátions inorgânicos, moléculas

orgânicas e elementos sôbre NADH, NADPH, nícQtinamida mononucleot{do

reduzido e diversas substâncias modelos sintéticas.

Outras substâncias orgânicas, ainda, tais como ácidos fracos

(ácido sulfuroso, tiofenol, eto.) tiveram seu efeito sôbre NADH e mo­

delos estudado por Wallenfels e 001s.(97).

O estudo cinético de Alivisatos e 00Iaboradores(84) indica", , IV

como primeiro produto espectrofotometricamente observavel pela açao

de fosfato, o produto ácidq primário, sugerindo êsses autores a for­

mação preliminar de NADH-X oomo produto intermediário.

Em conclusão, a estrutura do NADH-X não está totalmente elu-" , " • #IVoidada. O mais provave~ e que essa molecula corresponde a ad~çao de

água à dupla ligação 5,6 da NADH; a diferença entre NADH-X ,e o produ­

to áoido primário de NADH consigt~~ia talv~no fato·de que, para-a. ~ .. -.,'-

formação dêste,há ainda ou.tra alteração na moléoula, qual seja a epim~

rização no C1 da ribose ligada ao anel dihidropirid!nico.

Com o intuito de oferecer uma oontribuição pará a elucidação

dos problemas acima mencionados, quais sejam, o da ação de ácido e o~A A A _

tras substancias sobre NADH e modelos e a formaçao e NADH-X, foi ef~

tuada uma

forma:

, .ser~e de estudos que podell ser esquematizada da seguinte

A ,

~ 1. Ensaios de substancias que representam uma parte da molecula

do coenzima, com o intuito de verifioar a possibilidade de auto-catá­

1ise ou de interação interna.

2. Ensaio de aminoácidos, péptidos e proteinas, a fim de veri­

ficar uma possível relação da eventual catálise com a configuração e a

sequência de amino ácidos na enzima GPD, uma vez que é conhecido que

o centro ativo daquela enzima possui uma série de grupamentos sulfi­

drila e que, quando a formação de NADH-X ocorre em aerobiose, a enz1

ma é inativada pela oxidação dos grupamentos -SH a dissulfeto(98).

3. Ensaio da tiroxina e compostos a ela relacionados, inclusive

proteinas iDdadas , em vista da observação preliminar, .

de que amino aCl;

•<

dos halogenados eram ativos como catalizadores •

65

B. Resultados

1. Natureza dos produtos formados

Os substratos estudados foram C1BCH, j3-NADH e, oca­

sionalmente, P-llADPH .. O produto dÊ3. reação catalisada foi identi­

ficado espectrofotometricamente com base na posição do máximo de

absorção (ao redor de 290mj2) e na absorptividade molar do pt'oduto

neste máximo (çêrca de 21.103).

Estudos das alterações espectrais ocorridas com ClBCH,

foram efetuados na presen~a de varios catali~adores em concentra-

ção suficientemente baixa, quando necessário, para permitir leit~

ras até 230-240mf na região do ultra-violeta. Essas alter~ções

corresponderam às esperadas para a perda da dupla ligação 5,6 da

dihidropiridina, na presença de açúcares fo~fori~ados~ e amino-á,

cidos em geral a tambem na presença de DIT, BIB, MEl, MIT e 2,6-

-dibromofen?l,. de maneira satisfatoriamente quantitativa. Na pr~

sença de To, Tz(Br), Tz ' T;s e T4 as mesmas alterações puderam ser

observadas de maneira qualitativa.

A tabela VII traz uma relação entre a queda de absor­

ção a 355mp e o aumento a 290mp.. Os quocientes observados (ao

redor de 3) indicam que a dupla CSC6 foi saturada,. Uma vez que

o catalisador foi empregado em quantidade subestequiométrica con­

clui-se como era de se esperar, que ocorreu adição de água.

A figura 18 ilustra as alterações espectrais sofridas

no correr do tempo par C1BCH em presença de DIT. Um espectro di­

ferencial é apresentado na ;~, figura 19.,

Deve-se notar, em v(sta da reatividade termioa e fot~

química de dihidroPiridinas(99), que se pode~ espe~ a ocorr~

cia concomitante da seguinte reação na catâlise por compostos

, ,halogenoaromaticos :

66

OH

"

Medidas condutométricas da reação entre CIBCH e 2,6-d!

bromofenol permitiram afastar essa hipótese.

TABEIA VII

, N

Estudo espectrofotometrico do produto formado pela açao de diversoscata1isadore.s sôbre C1BCH

.,

67

!

'I.

4

I tempo,I

A290 -I Cata1isador -6.A;) 55 + .àA290 apr.:ox1ínado

~55 (horas). . ·

fosfato inorgânico 0,486 1,337 lS ,75 4

glicose-6-P 0,217 0,380 1,75 4,

asparagina 0,217 0,504 2,32 4

histidina 0,265 0,606 : 2,29 4

· ,

glic11g1icina 0,221 0,579 2,62 .., . ·

cisteina 0,623 1,434 2 30 2,,

glutatião 0,542 1,072 1,.98 1,

2,6-dibromofeno1 0,536 1,452 2,71 21·

MBI 0,483 1,305 2,67 21

DIB 0,560 1,515 2,71 21

DIT 0,580 1,630 2,81 21

2-bromofenol 0,560 1,533 2,74 36·

2-iodofeno1 0,567 1,649 2,91 36

MIT 0,528 1,317 2,49 36· ,

ácido 4-hidroxi-benzóico 0,450 1,203 2,67 21,

T 0,609 ...1,60 ...2,6 40o · , , ,

T2

(Br) I 0,648 1,584 2,44 40,

T2 0,632 1,505 2,38 40

,

T3 0,836 0,8.39 1,00 40

·T4 0,712 1,180 I 1,66 40

I I I

0-'- - I - . . e .. o, •• --- . -- ..

"

4·

A

1,5

0,5

68

250 300 350 A(m~)-- "'" "!Ii>tIiFi«. 18 - EBpec'tro de ab~orç&o de 'WML soluça0 1••.10. de

CJ.:BCR .. preeenç& de Dn 0\1>5&.10-", descontada a abaoroáo

de DI!. Curva (I): espectro no tempo ser~; curva (IJ:): ..-

" ... -pectro apos cerca de 1 htU'M... .i~: topa" tris 0.25)( ,

69

•

1,5

1,0

•

0,5

O,O"'-~-----_·_--o+----------I

-0,5

,. 290 ~40 À (m~1PiI. 19 - Ee)eCtro diterenci&1 extraído da figura la (.~-(II~

..nos.-euna. (I) ). .

.........

70

2. ~i..l!étioa

, . -Para estudos cinetlcos as reaçoes foram acompanhadas porI . Aperlodos que var1aram de cerca de~30 minutos, no caso dos catalis~

• , A ,...

dores mais'atlvos, ate cerca de 48 horas. A concentraçao do sub~

-4trato foi usualmente 1,10 M.

A não ser em casos especificados de forma diferente, o

comprimento de onda da radiação usada nos estudos cinéticos foi a

correspondente ao ~ máximo do substrato.

a. Ensaios de substâncias estruturalmente relacionadas a porções

moleculares do coenzima

Procurou-se verificar um eventual efeito cata11tico de

compostos adeninicos, açúcares, açúcares fosforilados e outras su~

bstâncias também fosforiladas. Os resultados qualitativos encon­

tram-se na tabela VIII•.

Em vários casos foram efetuados estudos cinéticos; os

resultados são apresentados na tabela IX. As figuras 20 e 21 ilus-tram os resultados obtidos com fosfato: . inorgânico e glicose-l-fos-,fato a temperatura ~mbiente.

A energia de ativação para a reação catalisada por gli-cose-I-fosfato foi calculada através da projeção do logaritmo da

constante de velocidade em função do inverso da temperatura (figu­

ra 22), A entalpia e a entropia de ativação foram também calcula­

das (tabela X).

TABELA VIII

Resultados qual!tativos obtidos para a interação entre ClBCH e -J!

as substâncias abaixo relacionadas

..'- -.-~

--,

.-

Substância

adenina.

xantina

cafeina

adenosina

ADP

NADH

glicerol

inositol

glicose

galactose

frutose

ribose

metilglicéB ido

sacarose

gliceraldeido

glicerofosfato de sódio

glicerofosfato de bário

Concentração

(moles /-1)

0,04

0,026

0,03

0,03

0,03

0,03

0,03-

0,06

0,05

0,03

0,03

0,032

0,03

0,03

0,03

0,05

0,03

Resultado da interação

+

+

+

+

--------------------------._------------

72

TABELA IX

Determinação espectofotométrica -da constante de velocidadli·da .cattaJ..ise

de de:hidratáção de CIEOH por açúcares fosforiladosft e'~ fosfatos inorgân!

• oob à temperatUra de 24,5~ 0,5°0

kg

k h1 2

Oatalisador pK pH-1 -1 -1)(min ) (l.mol .min

inorgânico(aeroviose) 6 81e -23~34fosfato 7~46 4,58.10

~

A

6 81e 7,48 -23,70fosfato inorganico 5,07.10,

(anaerobi ose ) -,

6 13f -41,,04glicose-l-P 6,99 6,~5.10,

glicose-l-P c 6 13f -37 337,01 4,28.10 .

~ ~

glicose-1-p d6 13f .. -4

0~3977,05 3,03.10t

6 111' -42,40glicoee-6-P 7~26 7,90.10

~

6~11 7~26-4

1~422-desoxi-g1icosa-6-P 4 ~ 75 .10

6 1f7~26

-42,60ga1actose-6-P 8~55.10,

6 lf -34,02manose-6-P 7,32 1,17.10 ..,

6 111' 7~20-3

5~37frutose-6-P 2,02.10

~

frutose-2 ,6-di P 6 Jf 7,20 2,99.10-J· 5,34,

: ribose-5-P 6 lf 7,25 2,88.10-J· 8,52,

" .- ,

a) A..-oon.cent~a9ão-total-:roi..O,00511. A -concentração da :ro~ ácida foi calcul~a

pe1a-.equação de Handerson-lIasselbachJ b) a concentraçM-totol fo:1. O,075M.• AN N .....

concentraçao da forma nao dissociada. foi. calculada pela equaçao de Handerson-

-H8.8selba.chJ- o) a temperat'tU!a da experi~noil1 foi 46,4~C-; d) a. temperatUJ:'a.-~'. . o . .de. experi~ncia foi 11,6 C.; e) referOncb 100 f-·· f) refcr~noia 101 J g) kJ.. ~_constante de velocidade':'de :prim~ira.-oKem em relação.. ao subst:J:'ato- (k. =k"'::'~ .... •

'. . -""1 -J:i!JQÇ.~o

• (catalisad~~ ) J . h) k:z ~ Q. consta.nte d~ veloctit4de de segunda ordem da rea.-.

ÇM (k:z''''' l).ea;ã.o 7~l rca.talisa.do~).. A c01].centraç~ de catalisador eJlpret"gada nos c~oulos ~ a da forma não dissooia.da.

73·$i'J'fW'=je·_ -. _ecr::~. -"' ...

-1,5

I

,.... , ..,l,

~.

L~I -a

200 t' (",in)

~dLI.~M~ ~nl', $. ca~Lie-ill dlft id,d:t"a.'t.~Ü 4e c:JJBCil:t {.,l$\l'O.......}]lO!" to•.-

x ' :i!~~~to j!.:n·iln'it1~CO (O~O?~~ili:) @$f.. al1$Jf'l!)bi.lI)~m,l ~~ iA!ttll.pe:t'll;~ 4.& .:ts,56a..!... . ~ '1I1f .

I$''t!~i' lZ<llil~pl!li.(t t;:$':'l$ {i! !I':~~.[ilil" ;dl$ p:r~llil)Í4·$ lll>... i; :l!:fr,'ta <!J 'tl$daiEl J.iI',$ ()l"'~:tal! fi~~ :)~f,if}.lr~I:8ililJ,'~ttivl!&a iletdltJi''k~~tÜO da,~ ....

~~t;$ ~I~ '!t"'~J.Q~t!tIoC'~ lIl~l~::l1~C!il~lt,_& :!'fl't.:i. ,,1)'tr:inA. J~~>;l(jl .Q;JUW q.e 1l14t6.lÍÍ1 _ ~'~eil!i-l:~Il~?lamiio _ s~J.~", J, i~'Mta~1:;C ;Ç'.\l;l V'e1t~I~,Wf.lÍtJit t1Je~al)'ireflflim. ptll;,t·... caA1I. ~t~,

~~~:t.dJ~~ e",i. (~'..f:,,~j.,~~ dJ.i:i;~~~"t""$ do- JC1b·llfli.:r,ai;m:r.te &1~1!U" lb_ ~r&ía.Is p:M~ei1ii74lli.ur o '1I'iJ.l.W ~tp 'Gl.ofilif1 crl. .tl!l: !~.~.~~:%'~a!(~N:I'!!lfl~dlíf1 J:"t_ç;~1l!~!t;~onti&la$t"~ t' ,1t,100L1li:~l.r.1!;!!l;~~i~l~fl:b..nl!'1fft i'.lil! _ ti:U1!U:t-1:l:h O"· ...4tltlt1~j!~ ·;l.tt,:f:'!!l'JC"m\?:l!!l. JIWI~..@i;i "b"'1;!ilili"'!J;U ;ta k!e, lt 'llr~~-l·'f ")- 'I' ..,.- .....1 .....,.;t "'.... ;l·.~ ,;;;~, .,•.•;~!.!lI .A~ ~e"';,o...t··,·~,..... ..,,,, ~"~I 'l~" '!'C'''' io:l'~" I'*.t .!Io....;'I .....·I: '11<1.. .11", ....:,l·f;~ .. ·t"....~:~:~;•..•,:~1~~;~~~:~:!' ~~ 'k-:'1' ..4;""';':~~ .t.,'M"'L.flNL "'"']~ .....!!QlNI. ~~OiII;:,::ri<Y"",~ tHI.~. , ..ç~•."",.w.,,~ .....,i••~ ......~~il'J, ..~""~ ; ':;:"ü fQ.~ \to)'",." -......,,1).~H~~\tJ~

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"el.c~1.4d.. l'ar& lU. r-.çáo ae h1ê~tagio ~e C1.BCK (4.10....)

_tlIliA'tII4a. 11_ &UCOM..~~_:t;ajt;o {ótlOOõlI } à w....:raiaU'& a.2Ji,5iOC: eM ta.Cl~ tris 0,2.>11. :"~6~" '"

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II

0,5

ar~

C!)1- o

.J

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...3,400

:riaI" n ... lhlt~ão .,uverí1iutrrta1. da enezg,t. da la't:1~'açãoIV iIW ;;r

~'ft a Naça.o de h1d.ra:~il.9ao wt ClllCR ca'tali.aada. pc.'t'" e.l.lco-'

ae......l··...~osf...to It

:)

..

TABELA X

"lo '"f • -4\

, ,.. . ~ , -Oá)culo dos parametros de atlvaçao para a catalise de hidrataçao de ClBCH par glicose-l-fosfato

- -k a

T 1 JI.0;32Experiência ( -1 -1) log k

2 (oK)~. E = 14,0 kcal/mol

l.mol .min (oK-1 )a

.,

*ÕH = 13,4 kcal/mo1, \

1 7,33 0,8653 319,6 3,128 :f:~S =-21, O cal/grau

2 1,04 0,0163 297,7 3,359,

:3 0,397 -0,4016 284,2 3,519

Ia) k

2tem o mesmo significado que na tabela IX

~

.....f"

77

b. Ensaios de amino-ácidos, péptidos, proteinas e substâncias

relacionadas

Os resultados cinéticos fi~am nas tabelas -XIa, A •

e Xlb, sendo que nesta ultima aparecem as substanc~as conten-~

do enxofre. •As figuras 23-26 ilustram as experiências com gli-

cina, ácido aspártico, cisteina e 2-mercaptoetanol à temperã

tura ambiente.

A figura 27 apresenta o gráfico empregado para o, • ~ N • A

calculo da energia de at~vaçao na reaçao com ciste~na. Os par~

metros de ativação dessa reação encontram-se na tabela XII;

•

78

TABELA Xla

Determinação espectrofotométrica da constante de velocidade para a

interação entre CIBCH e (3 -NAD~ e as substâncias abaixo relacion~

das, em concentração total 0,05M, à temperatura de ?6,O ~ 0,5 0C

Substância

ácido propiônicoa

, . d .". a,baC1 o prop10nlCO

butilamina

, dd iA. aac o prop onlCo+butilamina .

betaina

glicina

1. . bg lCJ.na

serina

lisina

prolina

arginina

asparagina

ácido aspártico

ácido aspárticob

ácido glutâmico

fenilala1lina

D-triptofanoC

pH

6,99

7,25

7,25

6,98

7,02

6,97

6,96

7,00

6,98

7,22

7,01

6,91

7,12

6,97

7,19

-44,79.10

-51,08.10

-42,28.10 _

-43,56.10

-57,80.10

-42,45.10

-67,10.10

-44 51 lC!-, .-41,98.10

-42,11.10

-46,25.10

-48,06.10

-55,05.10

-46,00.10

-43,78.10

:1k

2

(1.mo1-1 .min-1)

4,38

"5,70. 10-"-"'T ,

4,56.15-3·

'.-3,42

1,56.10-3

f, 90.10-3.

-41,42.10

-J9,02.10

-3.'3,96.10

. -3.,22.10

-21,25.10

8,30.10-3.

-21,61,10

-;31,01.10

-21,20.10

7,55.10-3

-22,02.10

t continua na pág:LnQ s egl.linte )

"

..

79

(continuação d.a tabela na)

h o- i

Substância pHk

1k 2

, .-

(min-1 ) Çl.mo1-1 -:min-~),

D-triptofanob, d 7,0~-5 1,86.10-3

.5,04.10

L-triptofanob,~ - -6 -37,02 9,72.10 2,08.10

,

DL-triptofanob,f 7,01-5 1,53,10-3

1,38.10, ,

histidina 7;09 -4 -28,72.10 1,75.10, ,

histidinac 7 O~-5 -4, 3,36.10 6,72.10

, ,

glicilglicina 6.97-4 -25,70,10 1,23.10

\

glic11g1icinac 6,94 -5 -41,56.10 3,12.10, ,

g11cilalanina 7,02 -4 -34,16.10 ~ 8,32,10

albumina humanag 7,12 -55,50.10 -albumina bovinag 7,05 -58,63.10 --r

~-globu1inag 7 15 -54,02.10 -,

a) O~511 ~ a concen-'aoa.ção to:ta,l 4-3 subst~ncia. A con.centração da forma.. noodiss,2.'. .

eiada :roi caloulada. po1{:l. equa.ção.da Handerson-liasselbaoh, empregam.o-se __

pK • 4,57 (:t'e:rer*nei~ :J,02); b) ~xperi~ncia oQm ,J3 -NA:DHJ c) a ooncentI'l}ção-!)... - -~_.

4e triptof'ano f'Qi .1,01.10 .. IIJ d a. concen~r?-çao de :triptofano foi. 2,71..10 :-JIJ;

e) a oonoent1:'~ç~' d~ triptofano foi 4,5·6.10-~; e.) a concentração de trip-_..

tor!ano foi 9,0.10-3,., ~) solução saturada; h) kJ. tem o meSlllQ significa.do que

na tabela IX, i) ltz tem o mesmo significado flue na tabela IX.

..

..

...

1&'\

1:-020~ ~ o

8~

J.....e:c'--'

c:--0,40

200 t (min)

ao

- .,Pia. 2Z - DeterJlti.n&çao ·8.pectrofoto.rtrie& da. constante de

".elocida4e! para a reaçio de b.1lclrataQâo de C1BOB: (;~ ..lO-"')

ca"tal1.a4& por g11cina (O.OSJI) à temperatura. de 26.0()C om

tapão tr1s 0.29.. pB=7,2.l!5 •

f·

· "

~··. n .........._._-l-..··...._t._••__or:-.dl'!M_.._-.. t__t•.:II_,....·...·__. •-_......__.........,

100 200 t (min)Fi«.. 24 - Determinação espect'rofotolaétl'ica daecnstsnte de

'velocidade para a reação de. hid.:rataç&o de ClBCH ( ...l.10"" li)

"'... I , , '>cat.&l:lsada. por aCi""o ~a'pa1'"tico ~OfOS1W1,' a 't.m.pera'ttll"a de

25.5°<; .. taIB~o t.ris 0,25111, pH= '7,1. •

82

TABELA Xlb

•

Determinação espectrofotométrioa da constante de veloaidade para a int~

ração entre C1BCH e J;?-NADH e as substâncias abaixo relacionadasa

, à

temperatura de 26 ° + ° 5°C, - ,j

II I~

i hg

Substância pK I pH k 1k 2 I

i II

-1 (1.mo1-1 :'min-1)(min )

metionina 7,01 -4 -2- 5,06.10 1,01.10.~

etionina. 7,02. -4 -2- 6,53.10 1,31.10

-

cisteina 8":P5~ . 7,12 -2 -11,33.10 2,93.10

ci~te1na. 8,13-3. -1

8,25 7,00.10 3,05.10

cisteinab 8,13 7,07 -2 1,8.48,45.10 f

cisteinaC 8,13 7,09-3 -2 I4,12.10 8,96.10 I

1

cisteina.d 8 13 7,10 -4 -2 !, 8,10.10 1,78.10 I- I!

8 66e -2 -1 II

glutatião J 7,07 1,94.10 3,98.10I-

I glutatiâo 8,66 8,80 6,10.10-3 -1. .3 ,38.10

glutatiâo 8,66 9,13 4,20.10-3· -1 I3,31.10:,

2-meroapto-etano1 f 7,09 5 J 95.10-3-1

9,43 1,19.10 II

I 2-mercapto-etanol 9,43 9~33-3. -1

3,30.10 1~19.10

etilmereaptana 7,02-3 -2- 8,40.10 1,68.10

-- ._--_..- .- ,- --- .. .. .. ..- . -!a) T8d8os ae-expe1"13n:~~.:! f~r~ efetuadas e1llp.t'egando as aubstAncias em çoncentraçÃo

total 0,05 M; b) ~x:peri3ncia realizada a 46,00 0 J c) expeitnc1a realizada a~ - _... _. _... -- ". .. - --

!~,.O°c., ~) ~~eria~cia_co~ N~DB; e) referOncia ~03.J ~) r~t'e~8ncia 1041 g) o

e1~fioado d~ kJ. ~ o da tab~la IX; h) O ·significado de k2 ê o da tabela. IX.

-0,5

~-1,O

'8«'+-­~;

c:--1.rS '·

. -.':.:T;~'·:' ,-, ..... ;"''t~,:, .~ , ~," ,

40 ao t (min)

83

fig. 25 - 1)e'termiJla.çio ~pe.ctro,foto.ã'tl"ica da const,anU: de

V.loC1d8tdepar~ a intera~ eht:re CIBCH ( ...1~'10-4H) ecíst:ej,­

na (0,05") • ttOlp8l'lItu.ra. <te 2S .ooc em 'tupão t:ria O~15. t

pB:-7.09 •

.t-

'-06ifi 'U\

;--.,.fM

cr.8t

cc'"'-J

C,- -1,0

.,. .... .. ~

. 40 80. 120t (min)'1•• 2ô .. n.t.~Qão ••,..ttGtot""~lc&da .ou~t. 4....-.1""••:",",.'~ !entre OlBOR ( ..1.10-4.) 8 2,-Jlercaptoetanol (O,OS.) • temperatura de g5,OOO em tampio

trie O..25rt'1 .. pti='7 r 09 •

•

": '.~.::.' . .

\

(!)

o...J

0,5

0,0

-0,5

-to

....... .~.....,..,..,......,...~l._.ju..... !F. I. IlIiIIIIf

3,400

Ij

}tig. '1.' l>cl:'tilIt."ai..Dar~It:!.upe:rbeD~,Ll da anor~1~~ de ativaçã,.

~ a 1n~rsçãcj ent~~: OlBCH ~ oi~~e~

TABELA XII

Cálculo dos parâmetros de ativação para a interação entre ClBCH e cisteina-~, , I

ka

T 1/T.103

Ea = 16,Ok~molExperiência 2 log k2( . -1'" -1 (oK) (oK-1 )1.mo1.min )

o, I

*~H = 15,4 kca1/mo1,

1 1,84 0,2648 319,2 3,133 +~S = 17,2 o oal/grau

, .2 0,300 -0,5229 298,7 3,348

3 0,0897 -1,0472 285,2 3,540

I

i Ii I, :

a) o sigr..i.ficado de k 2 é o m9amo que na tabela IX

~. # <)

,-8'1

A ,

c. Ensaios de substancias relacionadas a tiroxina

Os resultados são apresentados nas tabelas XIII-XVII, pr~

curando-se agrupar em cada tabela os compostos estruturalmente mais,

relacionados. As figuras 28-33 apresentam alguns graficos represen-

tativos.

Nas tabelas XVIII-XXI figuram os resultados a respeito

da influência de diferentes fatôres, quais sejam, concentração (fi­

gura 34), pH, uréia 9M e fôrça iônica sôbre a atividade cata11tica

de DIT.

A energia de ativação para a reação oatalisada por DIT foi

calculada empregando-se o gráfico da figura 35 ( Ea =15,5 kcal/mol).

Duas proteinas contendo grupamentos iodofenólicos, tirogl~

bulina (figura 36) e caseina iodada foram estudadas (tabelas XXII e

XXIII) •

A influência do pH sôbre a atividade catal{tica da iôdo­

oaseina pode ser observada na figura 37.

O cálculo da energia de ativação da reação catalisado. ~ela

oaseina iodada foi efetuado utilizando-se o gráfioo da figura 38.

Os parâmetros de ativação para esta e outras reações catalisadas

por compostos pertencentes ao grupo aqui estudado encontram-se na,

tabela XXIV.

TABELA XIII

Determinação espectrofotométrica da constante de velocidade da catálise da

a

k n2

k m1pHpKCatalisador

hidratação de CIBCH e J1-NADH pelas substâncias abaixo relacionadas

temperatura de 2;,~. 1:: .0;,00-;-----------:------------,....----.-~----------_.

I g i Iconcentração

'..

'.(moles/I) -1(mín ) -1 -I(l.mol omin )

,.,

19,6

12,9

13,1

20,4

2.~, 4

11,0

18,1

31,6

39,5

25,1

I 0,284

241 2

.. ~

- •• # ,

6 o'" ., 0- 2, :"J.

-24,90.10, ,

. -46,02,10

I ,

-2­2,53.10

I I' i

-23,83.10

I 2-,~~:10 -

-2I 2,33:10II,

-21,59.10. , .

-2~,?A;l~

3,01.10-Z

6,84_10"3,

2,94.10- 4, . ,

. -2

I .3,19 :1?-2

/!

6~51 :10

1,19.10-Z• I

-45,59.10. ,

. -21;;40•10

6,81

6,85

... I,9,78 I

1,11

, - ,

'h6,4·

6,1

6,1.

'6, Ih

6,1

6,1

6,36

6,36

6,36, - .

6,3~

6,1.. . - I6,36-:

6,1

6,1

'6,1 j

· -2-1,53,10- , _ 5

4,61.10~ I J J ~

· _3.9,03.10

., ._2

4,4°.10· ,_2-

8,80.10, ..

1.93,10-3.-, ,

· -21,31.10- "',· -22,97.10

-35,4°·10

· ,. -2

1,10.10- ,

· -21,16.10,

· -21,02.10 .,

-3,5,04.10

, ' ,· -2

2,30.10· -2-

1,00.10-2­1,03.10

,· -3

1,28.10

M:BCl

M13Br

M:BBr

MBCl

M13Cl

MEl

MEl

DI13

D1B

D113

DIT

IJ113 a, o

2,4-triiodofeno1

2,6-dibromofenol..... - - - _.

"1.~.

r~,~

~___ o _ ....__._._••••• _ ..__.~_•• .. , ....._.. • .. , ._. _ __'_ ._.....,.~_""". ~

t--------~.-.-----_+_---.f__-----+------+------.-~

II

..

(contin't1a na pá.gina seguint~)

..

89

(continuação da tabela XIII)

~g

Concentraçao k m kn

1 2Catalisador pK pH :

(moles lI) ( -1 -1 -;min ) (l.mol Qmin

. , , , - ,

DIT -2 6,36 7,12 -I 28,81,10.10 4,62,10, - . '-~

, ,

DIT. -336,04,12.10 6,36 7,70 6,51 •10. . , , , . . , . ..

DIT~ -4 6,36 6,58_3

3,37.10 5,83.10 46,1, , ,- - ..

DITO 3~ 06.10-3 _1

2556,36 6,99 1,48.10. "., .

.o _3 _3DITJ. 2,42 •10 . 6,36 7,13 5,45 0 10 15,2

. . ~ , - ' . . .DIT a, b _;3

2,70.10-~ 0,5313,40 •10 6,36 7,11

l "- I._-- .--.~._.~ ...--=-~..~...... -..;~.---::- -_.__._.,- "_0 - o·.

a) ~:'5P!:ri~ncia feita',?,om NA:DH; ?) experi~ncia ~ed~da em Á -o'34~, 350 e ~'6~ mA J

~ c) ex:Pe:ri~ncia medida ~m Á. ::: '35~ e ~'6~ mAo ~ d) e~riência. Jledida em A= 40'6, 4~8-. -~ _. .... _.. . _. . - - . ,

e 410 m)l\'; e-).exp~ri~ncta. feita, a 45,OoCJ f) expe:riência fei~a a 12,0°0; g). .

o valoZ' na tabela é a. concentração total da s'Ubstância • A CDnc:elltZ'ação da torma.- -- - .- _..

ácida foi acaJ.culada pela equação de Handerson-Hasselbaoh; h) referênoia 105;. . - --

i) tomado igual ao de 2,6-dibromofenol; j) tomado igual ao de MB:Br; k) tomado_.. . --

igual a.o de DIT; ~) rQf~:ênc~a 17; m) k:t . tem o mesmo significa.do que na ta.­

bela IX; n) k 2 tem o mesmo significado que na.. taM"la 'IX.'

•

-

.- ,. w _Ul__.....: ....

-1,0

2 i"....- 'IU

·99

40 t (min):fiE. ,,'$ '. Di!iltf!'r1!i;nA~O tH;~3(;t?(}t.·Otf-ifr'i.M d&.. e()lu~tante d:e

"i!lloo:t-d(~{:& p$1*&!t. 1."tfa~!$o d~, l1:Ldl'ats,;.i(lo é.1,;: CJ.liGH ("l,~~)

'e~,w:i.f;~.1& IH;ll.·~a,--d~ib:l~~o1'~!tol (l.t,~·.~,le~) à. 'te.JiW~'t;,~l'a.

,..:t .I" r:nr.. .1.:: t}{~ ...... -i. ''''l!l'r~'";: ;,'l <Í" """'<i.lS. f.!; l'.ll,!t~j~ .....·I.lF\lt: ~4;!l:~'l«'1,;1 ~,"Coo"J.v ' ~m ·'*ü ...;;r.-........ "',"~A60a "'i·f!t-... {J!:-,~~t. .lUt:... 1 !l'''~'' (I;.

•

.... . "'..__' .....0 __.._$' ' _~~~'ô!I'lIfI;_..._...._..L_II"',,"' ..

-1,0W\ •...

~CII)

c:r:.8A 1:lJ

....~""c:

-2,0'

15 ·30 t (mio)J'1.c.. li'" D$t~nr1Jt~IUJ~ e5pec1;r.oot.Gt(~·~rlea4& co&"I1I't&»:te -de 1"~:

cidad.e para & reaçio 4'i1 h:.ldra.ta.çio de C1BCH (-'.1. ..10~) ea1i&1J.a-4a )pOr Del ('~40.10"'ZM) .. ie.jeratura ·dG 2e~$&.C eill ~pi(' 1ir:t.

O~R. 'P~"OS •

92

TABELA XIV

Determinação espectrofotométrica da constante de velocidade da catálise

de hidratação de CIBCH e fi - NADH pelas substâncias abaixo à temper~

tura de 25,5!o,5 °0.---_. --- ,-._-_..._-_ •.. _- __o -

c f gconcentração k

1k

2Catalisador(moles/I)

pK pH

(min-1) ( -11.mol .min)

.. -- __ o _.

------ ~_._-,...

-2 d . -20,3972-bromofenol 6,06.10 8,44 7,20 2,19.10

.'

-2 d -22-bromofenol 3,06.10 8,51 7,10 1,18.10 0,405'-,

-2 e -2MIT 2,40.10 8,60 6,80 1,87.10 0,812

MIT -2 8,20 7,00 -2 0,7002,20.10 1,45.10

MIT -28,20 7,69 -2 0,6672,73.10 1,39.10

a,b-2 -4MIT 2,43.10 8,20 7,12 3,57.10 0,0153

, .a) Experi~ncia fe?- ta .com NADB; b) e:x::Peri~ncia. feita com À= 350 e 360 m~ ;

c) o valor na ta.bela é a concentração total da substância • .A concentração .,. da

foma ácida foi calcula.da pela equaçã.o de Handerson-Ha.sse1bach; d) referên-"

cia 106; e) refer~ncia 19; f) o significado de k:L ~ o mesmo da tabela IX;

g) o signifioado de k2 é o mesmo da tabela IX.

.'

- -1,0ti'til'

,......"",fIJ

~ 8c[

I~ <.+­~

c- -2,0

40 80 t (min).1'1&. ao - Detera1D&ç*ao ee}ectrorot-eV1oa da eoJIIttalde .

Yeloc14ade JSft. & reação de hiar..taPo 4. CUCIB (-1.10 )

cat&l1.a4a por JII! (z.-.lO-~J() à 'teJI)er&'Qu'a 4e el.,sQo ..

Uqio tri8 O,2&M. pRlIII6.&O ...

-~

TABELA XV

Determinação espectrofotométrioa da constante de velocidad& para acat{lise de hidratação de CIBCH e j1-NADH pela substância abaixo re

lacionadas à temperatura de 26,0 :0,50

C

\'Ooncentração--f

kd

pH k:í 2catalisador

(moles/I) -11 -1 ....1)(min (l.mol .min

ácido~-hidroxi 0,05 7,22 -3 -2, 4,20.10 - 8,39.10benzoico

" " 0,05 7,85 3,3! .10-3 -26,63.10

" 0,05 -3 ,10.1" 6,84 5,60.10 - 1,1

" "a 0,05 -5 1,73.10-36,92 8,65.10

tirosina 4,59.10-3 7,82 -4 -22,13.10 4,65.10

rr -3 -4 -23,84..10 6,92 1,67~10 6,70.10

"-2 10,11 5,61.10~4 -21,99.10 6,70.10

tirohina -3 -4 0,2001,95.10 6,82 3,90~10

,

" 1,63.10-3 7,02 ,59.10~5 0,159

" 3,65.10-3- 7,9 -4 0,2208,03.10

tirptnaa. -4 7,01 6,27.10~6 -25,81.10 1,08.10! --

-- -- c-- - _'o. -- -- -- .-. .. -- .~ ..

a) Experitno1a com NADl.I; b) o valor na tabela. é a conoentra9ão t;otal de sU\>s­

ttno:ta.... A conoentração da foma 4cida.. foi c~lculada. p~la ~q,uaçã.o de. Handes­

.on-~a~selbach tomando-sep~a as substânoias o pK.indioado na ~efereAoia

l+.. (~~~T para tirosinD. ~. 9~55 para tironina; ~o) o~sign1ficado de k:16 o

mesmo da tabela. IX; a)" signifioado dei ~ _~ o mel'JllO da tabela IX.

.!

••

100 200 t(m'~)

T~l~~ie,ad.e :Par~, 8. re~çio <te .hid.~~1~Ç,i:, d~ ClJK:.H ( ...1 ".;LO..··4.1l)

eataliaad.a piJí" ·t:i.r~lí.~.a·(4••••::Uj·'·lt) Vi tft:ll~t'atau'a de ~28,OoC

em t.wnpio tria O;15t\, 9Q'"7, 8~L

TABELA XVI; 96

,

Determinação espectrofotométrica da constante de velocidade dada para acatálise de hidratação de Cl:BCH, ,fi -NADH e fl-NADPH pelas substâncias

abaixo relacionadas à temperatura de 26,0~ 0,5 0 C

Concentraçãof k g k h

1 2Cata1isador pH

( -1 -1 -1)(moles/I) min ) (l.mol .min

T2

(llr) -46~S5

-4 1,711,30.10 "~22.10

~2(:Br)-4

7~16-4

1~571,25.10 1~96.10

T2(:Br) -47~ 74

-4 1,261,36.10 1,71.10-4

6~77-4

l~ 78T 1~~0.10 2~14.102

-47~11

-4 4 t 61T .. 1,39.10 6~41.102

T ' -47~69 1~11.10-~ 4,,712 2~36.10

T ., -48~ 75

-43~002" 1,77.10 4~11.10

T .. -4S~ 94

-4 1,702 2~63.10 3~08.10

Ta -4 -5 -11,39.10 7~lS 6~53.10 4~70.10

2-4 -3

10~1T3 1,91.10 6,77 :J.~S6.10

-4 - - -T;3 1~97.10 7,20 2,56.10-'> 13,7

-4 7,75-3 15,5T3 1~57.10 2,03.10

Tb -4 -3 9,411,74 .10 6~76 1,58.10 .3

Ta -4 7~17-4 1,,01

32,OS.10 2,00.10

T4-5

6~SO-4 39,61,94.10 4~15.10

-5 7,06 -4 74,8TA 1,13.10 2 ~ 70.10" -5

7~02-4

58~6T4 2,01.10 4,00.10

a -57~15

-42S~6T4 . 2,25.10 1~78.10

Ta,o -5 6,99-4

17~54' 4~51.10 2,80.10

Tc,e -5 -359.0

4 .4 ,S4 .10 6,98 1,02.10 .

To,e -5 6,95-4 14,64 4,16.10

i2,33.10

_. ..

a) Experiência fe;ita com NADa; . b) experi~ncia feita em al1aerobiose.; c) ex:peri­

ência feita. a 38,00C; d) experiência fei.ta a 48,50 c; e) experiência , feita

com NADPR; f) o valor. na tabela ~ a concentração total da substancia.P-4 con­

centração de forma ácida foi cal.oulada pela,equagão de Handerson"-Hassalbach

t~m~n~o...se os valores de pX.na referência 11{9,29-para.T2(:Br} e T2 ; 8,45 para

T3 O 6,13 para T4); 8)-0 signifi~o de)~ ~ o memo da Tabela IX h) o si­

gnificado de k 2 ~ o mesmo da tabela IX.

-0,2

-0.4~

V\r--"\.ti')

4:.8

I:+-,,«ri

.5 -0,61

'4. st- Ileter!d.naçâo QB:c>ec"trQ1"oto!ft~·tr1~J:&di.. eo.natatl.tfJ da

.. .. ' 'j _.:I -1'0' A ".olt.l'.. ... ~ '1'1 'r.:ol!ft~ (âIIIl. "tA-4'A1)-VIS...",.'tl(~:(.,ti ....e J~~' a naçao ue .'n~i\.Y:I'ata,çao I;~,e C../"'PW;r\ --."-':Y .m

ca'talU.., per diiioooti1"9nj-JaJl. (1,M.1O-\) & t~lJpen11:J.1.'a d,e

2.'7,OO~~ ..~ tris Oa.i5M~ :JlTii'Jl:7~-1.1. .~

..

•

100 200 t(rnirl- ~

F'i8~ !3 "" Let~r.t\\i.na9aoes~ct..-o;fotOMt't:rlca, «14 c_stan'te 4e

v,eloeid~dé :PAne a reação d~ bt4n~çà:o de CreCR(...,)..lO.... )

cata1.is1lda ~ ttif.ttdotLro1DU&a (1,'.'_10-") à. 1;!lfftilpE!ntur~\

de 2.Yt oOe e. ta.,pio t.ri.s o,2IM. pJf'C7,20 t'

,.

TABELA XVII

Determinação espectrofotométrica da constante de velocidade para

a interação entre CIBCH e as substâncias abaixo relacionadas, aotemperatura de 2 5 ,0 ~ 0,5 C

Gonc.n'l.l."ltração k b k2

c

Substância 1pH -

(moles/I) (min-1 )-1 -1

, (1. moI .Dlin )

- .-

ácido monciôdo- ° 05a 7,06

-4Il~7,20.10,

aoético

iôdobenzeno-3

7,08-4 0,7781,02.10 . 6,38.10

p-iôdoanisQ1. -4 7,12 -4 1,092,55.10 2,78.10

-

a) A ooncentração na tabela 4 a total. A ooncentração da forma ácida foi

o~c~~da pela equação de Handerson-Hasselbach, empregando com pK • 3,12_.~ _. ~ ...... . ~ . - ~ - --

(refEl::~n~ia_~Ol).! b) ~ ~e~ ~ mesmo significado que na tabela IX; c)

k2 tem o mesmo significado que na tabela IX.

99

,.

100

TABELA XVIII

Efeito da variação de concentraçãõ sôbre a atividade oata1itica de DIT

na hidratação de CIBCH a pH = 7,00 e à temperatura de 24,5,:!:. 0,5 o C

concentração total a kb k

C 11 2

(moles / 1) (min-1 )-1 -1 I(l.mol •min )

-

-;3 -2 40,86,73.10 5,~3.10

3,38.10~ -2 45,82,88.10

-3 -2 41,81,55.10 1,~1.10

, --,---- _. II

ao) A concentração da forma &oida foi. calculada pela equação de Handerson­

-Hasselbach;b) kJ. tem O mesmo signifio~do que na tabela IX; c) k2tem o mesmo significado que na tabela IX.

TABELA XIX

Efeito da variação do pH sôbre a atividade catalitica •• DI!!! na

hidratação de CIBCH à temperatura de 23,5:, 0,5 °0• ·1

- a kb

kC

Concentraçao total 1 2

(moles /1)pH

(min-1 )-1 -1(l.mal .min )

-4 6,99 ;A~,12.10-3 45,68,84.10

-4 6,67 -2 57,68,8.4.10 1,67.10

-4 6,16 -2 50,08,50.10 2,61.10--

ao) Idem tabela XVIII; b) idem tabela mIl; o) idem tabela XVIII •.

, ..

,.

..

101

0,0

[o r T) =o

-1,0-.. li' [o I T]=1.55mM

. ~,~

~ ~Ir-

\..~,

c[o. r]=3.3.mM- -2,0

10 I T]= 6.73 mM

20 40 60 t (min)- , .l'1a. se - DeH1"IDi_oao ••peo'troto't..tne& da intluene1a 4& ft-

r:La.çÃo 4a concentr&9ão •• Dft .ôbre a ..-eloc1W. ·da reqão d•

. h1dra't&9ão de ClBOB. CC>Bd1,õe. ~r:J.-a~: CUICJI~·· =.t..lO-r.J

ui.:~ 'tr18 '0,2.511. "".00; tope:ratu:ra12.4.a4to ..

102

!rABELA XX

,.

Efeito de uréia 9M sôbre a atividade catalitica de DIT na hidratação

de OlBOH a pH = 7,43 e à temperatura de 24 ,51 0,5°0

Concentração totala b c

Á k 1 k 2

(moles /1) (mp.,) ( -1 ( -1 -1min ) l.mol .min )

,.

3,92.10-3. 400 -2 39,41,21.10

,

3,92.10-3. 402 -2 39,81,22.10

.,. " -. - -3

~.. -2 39,83,92.10 1,22.10

a) idem tabela XVIII J b) idem tabela XVIII; c) idem tabela XVIII.

TABELA XX]j

~feito da variação da fôrça iônica sôbre a atividade catalitica de

DIT na hidratação de 01BOH à temperatura de 25,0+ 0,5 0 0-... .~ a b

Concentraçao total' [tris] k 1k

2

(moles/I)pH

(moles/l) ( -1 -1 -1min ) (l.mol .min )

1,51.10-3 7,06 0,1~5-2 51,81,30.10

1,51.10-3. 7,03 0,066 -2 55 J 51,48.10

:

,

a) idem tabela XVIII J b) idem tabela XVIII J c) idem taDilla XVIII.

..

2,0

N!'

. .::JC

C)

.. o. ...J

1,5

••" " ...... 11

3,4

- - . .. ..,1'1&. a& - Deterwiaaçao ~tal da tt:II.erDa de at1-..çao

JIU'& a Nação ele h14n.tação 4. CUClr oatal1Md& JOrDD! •.

..

104.

TABELA XXII

Determinação espectrofotométrica da constante de velocidade da

catálise de hidratação dos substratos abaixo por tiroglobulinaa ,à

temperatura de 25,0 ~ 0,5 00

,.. b,c d eOoncentraçao

pHk

1k

2Substrato

(moles /1) (min-1) ( -1 -11.mol ..min )

01BOH -5 7,24-;3

49,68,0.10 2,60.10

ft-NADH -5 7,11 -49,4.10 8,74.10 12,3.

ft-NAD:PH -5 7,05 -4 14 55,6.10 6,38.10 ,

- -

a) Tadas aB soluções- ele tl'aba.lho e:l:aJIl O,lM ..~ :~C3; b) a. con~ntração .i!!,

dicada 9-- em t~rmos do nr.r pr~sente na solução, tendo...se 001

culado o ndme~o.de moles de DIr por .01. de proteina conforme indicado

na ref~rênciQ. 107; . c) o valor indicado na ta.bela. ~ ao concent:l;'ação. to"tal

de DIT. A. conoentragão da forma ácida ~o~ calculada pela equação de Ban­

dersQn-l{asselbach, assumindo~se })]( = 7,BJ (referencia 108); d) kJ.. -tOl.

o mesmo s1gn~:ti.cado que na "tabela IX; e) ~ tem o mesmo si§nifioado '=lue

na ta.bela IX.

-0,70

100 200 t(min)

106

.

lia. :56 - Detem 0-040 ••peo.V~o"o_tric&da coutante 4e

velocidade ]iMU'& • re&qÃo 4e hidfttaoão de ClBCB (<IIIIl.lO....)

ca't&l1eaaa por 1:1rocloba.luaa (....lO...~ _ nU) à teqcra-

tura d.2.5.000 e. taapio 'tr1e 0,2511. 1JiíI-':I.2," •

,.

106

TABELA XXIII

Determinação espectrofotométrica da constante de velocidade para ahidratação de CIFCR catalisada por, '1odocaseina, à temperatura de25,o:!:.O,5 0C •. o

--a dconcentração" A

ek

1k

2

(moles/I)pR

(mpJ ( -1 ( -1 -:;min ) l.mol • min .

-4 8,48 400 e 402 -4 7,477,50.10 7,37.10

-4 7,.93 400 402 1,52.10-.3. 6,057,22.10 .... --

-4 7,47 . '404"0 406 2 -3 6,077,00.10 ,57.10 .

· · -- .

1,61.10-3 7,17 400,40~'O 406 6,58.10-3 5,40-

-4 7,10 406 e 408 3 f 5 .10-~· 6,935,95.10· ·

-4 7,06 386 e 388 -~ 7,027,79.10 4,38.10 ,· . .

-4 7,00 402 e 404 3,25.10-3 5,987,38.10

-4 6,99 395 e 397-;3 7,027,16.10 3,9.5.10

. . ,

-4 6,46 393,395,397,-2 11,14,44.10 4,66.10

398 e 400

2,12.10-4 6,06 400 e 402 3,31.10-;3 16,1, b

-4 6,.97 400 e 402 -2 28,87,90.10 1,90.10

· -4 C7,10 400 e 402 -3 1,927,22.10 1,08.10

. - .. - -a) O valor na· "tabela 4 a concel1t:r'açio total de. DrT na solução.. Esta foi cal...

culada. aclmi~indo-se:~tedq. a. a'bsor~ão em -A" 310 m,A, em meio alcalino, d,!

vida ·ao DIT •. A concentração ~ fo:J:'lM 'eia~ fo'i cal cu1ada pela equ~9ão de

Randerson-Hasselbacb-'. O ,pR do grupa.mento fen6:l,ico '~o DIT na iodO'Cascina .

foi determinado·no.la~orat6rio,corTespondendo a 7,66; b) experiência fÓi- .

.:lia a 45,00C; o) ex:p'e:ri~ncia feitl\ a 12,0°0;' d) o si8nifioaclo êle "'1. ~ . o' ~mesmo da tabela IX; e) ° 6~~ifi~o de k, ê o mesmo que na tabela IX.

,.

--.

~'16~ '.'....E,.. .-oe 11.'.-'.:'~

6

70I I

o.....~....... ,." ..

o

pH

10'1

•./

1'1&.. s-r - Jatudo da jÍú'1u,!;l1ci& d.a. Ttlriação do pH

aôbr~ a ccm.et.lU1tft de yelocidade da :r-eaçsf) de hi­

dratação 4e CUCR oa:tIal1saU. :ter 1odocu.:i.na •

108

1,50

1,00· I,.

N.x

~ (!)o..J

I0,50 ,iIf

3,2 3,4

P1a. 58 - .De'te1"ld nação «Qer1Jl.DUJ. da .arcla de a,ti'Y.O

puoa'& reaçio de hUatação 4e ClBClI cdal1e84a tor ioclOoC!,

..1.M..,

•

..

~-,>- -.. r ....~ .~.,.-.~'C......... <ti ,. .... -.-

TABELA XXIV

C'lculo dos parâmetros de ativação para alguns dos sistemas estudados

109

-

SilitemaEa &ÓH* 6s*

(koal/ moI) (koal/mol) ( cal/_grau)

CIBCH (reação espontânea) 21,9 - -C1BCH- DIT 15,5 14,9 -9 16,

ClBCH- iodocaseina 14,7 14,1 -15 7,C1BCH- T... 11,5 ,10,9 ,., -6

I

..

110

c. Dif3cussão

o primeiro produto formado pela ação de ácidos min~rais, áci

do acético, :íons fosfato, sôbre 1,4··..dihidropirid:tnas revela-se como

sendo a adição de água à dupla ligação 5,6 com a hidroxila na posi­

ção 6(85,86).

Trata-se, portanto, de um efeito de oatálise ácida pelo pr~

tom e também de catálise ácida geral. Isso é confirmado pela elabor~

ção de um gráfico de Br~nsted(89) (figura 39) onde se verifica a rel~, ,

ção entre a constante de velocidade de catalise de diferentes subs-

tâncias e seu pK.

As substâncias estudadas neste trabalho atuam..

catalitica-

..

...

mente, fornecendo também o produto hidratado da dihidronícotinamida,

exceto, talvez, no caso das substâncias contendo grupamentos sulfi-. (,z.) ,..

drila, pois Stock e cols. postulam adiçao para o 2-mercaptoetanol.

Quanto aos amino ácidos comuns, exerceriam uma catálise de, , ,.

tipo acida geral, assim como a de outros acidos organicos conhecidos.

Cineticamente, as reações podem ser tratadas como sen~~ ic

"~~eudo-pri:tne.ira.,ofi~m em relação· ao ·substrato••N

O exame das constantes de velocidade das reaçoes estudadas

indica que os amino ácidos comuna, os péptidos, e as proteinas empre­

gadas possuem a propriedade de efetuar essa oatálise em muito pequ~

na escala; uma comparação com substâncias contendo separadamente os

grupos carboxila e amino indica ser a atividade dos amino ácidos de-o

pendente "somente do grupo carboxila (tabela X1a).

Exceções apreciáveis encontram-se nos amino ácidos e pépti-. ,dos contendo grupamento sulfidrila. A atividade destes e bastante

acentuada (tabela Xlb). Entretanto, parece que, nesse caso, a simples

presença do grupamento -SH não é suficiente para a efetUação de uma

catálise apreciável, uma vez que a constante de velocidade observada

para a etilmercaptana é várias vêzes inferior àquela para o 2-mer-

captoetanol,, ,.

ao passo que esta e apenas cerca da metade da observa-,

da tiara a cisteina, sendo esta. por sua vez. um pouco inferior a do

"

.. 111

•oDn, .T.

oÁcioo MOHOioOOAC{Tieo

IMIDAZOL Too.. ..OCISTElNA

HioROxiLAMiNA O f14'T. . °GLlCOSE-t-FWATO

ÁCioo PloPiôNico

H'oR6NIO

4,0

2,0

CIW.:.::C)

o..JI 0,0

..

..

o 4 8 pK

... JI:1c•. ai - Gráfico. 4e BrJaate4 para a C*~18e 4. à1dratação

4. Cl:BCH (ret.rincia 81). Pocl.... ver1tiO&l' o desvio de ua, , ,

81J1ple. "0·"1• .-0 de catãllse aolq cera! para WI& aeri. aec~toe ••tudacloa.

..

112

glutatião. ~stes fatos sugerem que a complexidade da molécula exerc~

ria uma certa influência sôbre o poder catalitico.

Os açúcares fosfarilados apresentam comportamento bastante

análogo ao do próprio fosfato inorgânico (tabela IX) .p~~ o qual já

foi demonstrado ser o produto formado uma 6-hidroxi-l,4,5,6-tetrabi-,

dropiridina. A ordem de grandeza das constantes de velocidade e a

mesma para tôdas as substâncias examinadas e, levando-se em conta o

gráfico de Br~nsted empregado, verifica-se que, tanto fosfato inorg!

nico, quanto os açúcares fosforilados apresentam algum desvio, suge­

rinfo uma influêhôia mais complexa do qUe apenas a de catálise ácida" , ,geral. Que o comportamento de todos os fosfatos e analogo e tambem de

se esperar examinando-se os resultados qualitativos registrados na

tabela VIII.• .... A

Nesta base/pode-se compreender que a decompos~çao espontanea

de NADH e NADPH seja parcialmente autocatalitica.A ,. ,

O exame do grupo de substancias com estrutura analoga a da

tiroxina indicou para estas também um efeito catalitico na hidrata­

ção pois foi verificado que a reação se process~a em extensão maior, ....

do que a correspondente a concentraçao do catalisador, o que exclue• lfIW ,..,,..,. • '

ad~çao do cata1isador, a nao ser na formaçao de um produto intermed~!

rio. O estudo com concentrações baixas de vários dos catalisadores

(tabela VII) revelou ser o produto espectralmente idêntico ao forma-do pela ação de ácidos e de fosfatos. Um exemplo encontra-se na figu-ra 18.

Um trabalho pormenorizado efetuado com substâncias que ~o­

ram desde o ácido p-hidroxibenzóico à tiroxina e a tiro globulina

permitiu estabelecer uma série de observações a respeito da ativad~

de cata11tica.

Verificou-se que essa atividade aumenta ao se passar de fe­

nóis não substitu1dos para orto~logenofenóiee dêstes para orto·

dihalogenofenóis (tabelas XIII-XV). ~ste fato seria de se esperar".., '. Aem funçao do propr~o pK das substancias, uma vez que se trata de c,ê:

..

113

tálise ácida geral. Porém o efeito não é apenas devido a êsse fator e

isto pode ser constatado pelo fato de que as constantes de velocidade'\ "\

crescem ao se passar da tirosina a tironina e desta a 3,5-dibromo-

tironina e 3,5-diiodotironina CODpostos êstes que possuem todos o

mesmo valor de pK para o grupamento fenólico (tabelnaXV e XVI ) O, • A A

anel aDomat~co interno exerce portanto influencia sobre a atividade

cata11tica, influência esta acentuada pela presença dos halogênios.

A complexidade estrutural responsável pelo efeito cataliti-

co fica ainda patenteada peloA

desvio que esse grupo de catalisado-

..

res apresenta am relação aos convencionais de catálise ácida no

gráfico de Br~nsted.

Em relação aos dihalogenofenóis pode-se observar que a

presença e a natureza de substituintes na posição para não influem

de maneira importante sôbre a velocidade da catálise, da mesma forma,,. ,. ( )como o numero atomico dos halogeniós em orto tabela XIII •

Ao menos no caso dos halogeno fenóis (mono - e di -) com um

anel aromático, o estudo a diferentes pHs (tabelas XIII e XIV) indi­

ca que a forma ativa deve ser a não dissociada.

Variações de concentração do catalisador, de pH, fôrça iôn!~ , ~ A

ca e a adiçao de ureia, nao alteram substancialmente a constante de

velocidade da reação catalisada pela forma fenólica de DIT (tabelas

XVIII- XXI). O estudo do primeiro fator vem mostrar ainda que a rea­

ção é de primeira ordem também em relação ao catalisador (figura 34).

O exame da atividade catalitica da tiroglobulina indicou

que esta proteina não exerce nenhum efeito excepcional sôbre CIBCH,

se se comparar a atividade da mesma concentração de grupamentos

diiodotirosila liga~os à proteina ou livres. No entanto, sôbre NADH

e sôbre NADPH, a ação de DIT incorporado à proteina parece ser mais

intensa (tabela XXII).

A atividade da caseina iodada é bem superior à da caseina;

entretanto, a iodocaseina não apresentou nenhum efeito exoepcional­

sôbre CIBCH se se comparare~ as mesmas concentrações de DIT quando

114

incorporado à proteina ou não (tabela XXIII).

A pHs abaixo de 6,5- parece ocorrer um aumento na ativi­

dade catalitica da iodocaseina (figura 37). Isto poderia ser causado

por um grupamento diiodotirosila mais ativo, talvez devido a um pK

mais baixo ou a uma nova eonformaçãó da proteina, resultante de uma

poss{vel protonação de um g~po imidà~ólico, em conseqtiência do au-; ~ ~ A

mento de acidez. Entretanto. uma eltibidaçao bastantt dlara deste po~

to ficou impossibilitade-em razão de dificuldades de caráter experi-mental.

Em relação à reatividade dos substratos empregados pôde-se

notar, observando as próprias ~oluçõ~s de contrôle, onde ocorria a

reação denominada "espontânea ll , qu~ a substância mod~lo é muito mais

reativa que os coenzimas naturais, sendo NADPH mais reativo do qUQ

NADH; êste último fato confirma resultado de Stock e cols(82).

Mecanismo das Reações

A cinética das reações estudadas indica que outros fatôres, ,

estruturais, alem da capacidade doadora de protons dos catalisadores,

interferem na atividade catalitica dos compostos relacionados a tir2

xina.

Um exemplo adicional ao já citado anteriormente é a dife­

rença de atividade catal1tica entre MIT e T;3,(tabelas XIV e XVI).

Sendo o carbono mais sujeito a um ataque eletrófilo o de

posição 5 na dihidroPiridina(82), o próton do catalisador se adici~

naria a êsse carbono, iniciando-se a formação de um ion de carbônio

na dihidropiridina e de um ânion fenolato. Estas entidad~s favore­

ceriam a formação de um co~plexo ativado relativamente estabilizado

por transferência da carga, o que redundaria em um abaixamento da

energia livre de ativação comparativamente com os catalisadores áci

dos convencionais.

Esse mecanismo encontra apôio na conhecida capacidade do

ion de carbônio formado pela adição da próton a l,4-dihidropirid1nas

tes da

tureza

""çao do

115

formar complexos de transferência de carga(109). são também oonheci­

dos complexos de transferência de carga em que diiodoferióis atuam o~"

mo doadores(62).

Entretanto, é muito provável que grande parte ~a estabiliz!!

complexo ativado, na oatálise porhalogenofenóis, seja de na­

entrópica, pela contribuição de fôrças hidrofóbicas result~

. ~ , ,l~bertaçao de moleculas de agua. De fato, ~abe-se que a diio-

dotirosina complexa melhor do que a tirosina oom o íon de piridínio

prinoipalmente devido a uma contribuição maior do termo ligado à en­

troPia(62). No presente trabalho, essa analogia existe quando se

comparam as entropias de ativação das reações catalisadas por DIT

e T4 oom as correspondentes a outros catalisadores, levando em con-N AI' Nta que a queda no valor da energia de ativaçao em relaçao a reaçao

espontânea é pràticamente a mesma em todos os casos (tabelas X, XII

e XXIV) •

A estabilização hidrofóbica poderia tornar mais difícil a, ""

segun~a fase, ou seja, o colapso do cation na es~era de solvataçao,

porém, presumivelmente, não ao ponto de tornar essa segunda fase a

etapa determinante da velocidade da reação. Além disso, é perfeita­

mente viável que o complexo ativado evolua para a formação de um in-termediário, o qual sofreria então, a hidrólise,

X

HO-<OtR'

X _)pr~d;oM9~c>

(íentaS

•

"

-Co

116

Deve-se notar l ainda, que existem outros mecanismos compa­

tíveis com a cin~tica observada. Num dêle~a primeira fase seria a

adição rápida e reversivel do p~óton ~odihidronicotinamida, seguida, °

de uma fase mais lental na qual o cation reage com HzO sob a infl~

ência do ânion do catalisador~

Conseguiu-se porém~ eliminar essa possibilidade com base

em resultado'de medidas de ressonância magnéo';ica nuclear( 85) I refe­

rentes à hidrataç<o de dihidrdpiridirlas em D2 0, sdb a catálise de

fosfato. Se se tratasse de adição rápida do pró~on, existiria um e­

quilíbrio entre o reagente e a forma protonada, permitindo, atr~­

vés de troca, incorporação de deutério e ~sse fato não se coaduna

com a observação de que todos os sinais devidos aos prótons do anelo A A

decaem s1multaneame~te e com a existencia de sinal do carbono 5 no

produto de reação.•

° complexo entre a dihidropiridina e o catalisador no esta-do de transição poderia fornecer um intermediário em que o ânion do

t ,\,.. , ja'ca alisador se adicionaria a posiçao 6 do a~el; casos analogos

f d °t (l~OlllJ,) -A t o t dO' o t b'"oram escr1 os .• ~s e 1n erme 1ar10, numa e apa su sequen-

te sofreria hidrólise,fornecendo o produto.hidratado.

Existem fortes indicações(lla,ll:Soo;lli4) de que êsse inter

mediário de adiç~o do catalisador pode sofrer oxidação quando o

catalisador e 2,6-diiodo-4-aminofenol. Isto, por sua vez, pode

servir de base a uma hipótese para um mecanismo de síntese de ATP

ao nível dos coenzimas piridlnicos.

No organismo, o papel do 2,6-diiodo-4-aminofenol de ati-.. °

var o oxigenio deveria ser exercid o pela tiroxina conjugada cem una

enzima que dispusesse de um grupamento -~'\

estericamente favo-,

ravel a uma atividade acoplada, ° produto oxidado formado tro-

cando o Bubstituinte em 6 por fosfato forneceria um composto com

-117

ligação fosfato rica em energia e êste, na presença de ADP, reagi­

ria, formando ATP.

A seqtf.ência proposta é apresentada na figura 40; ela mos­

tra analogias com a hipótese de Barltrop e cols (11'5), onde a ação

oxidante é atribuída a uma flavoproteina.

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ooen2i~s piridfnioos •

--CJ)

119

VI. SUMÁRIO E CONCLUSÕES

Estudos de sistemas contendo modelos dos coenzimas pirid1nioos

ou os próprios coenzimas mostram que existe uma interação entre as formas

oxidada e reduzida para a qual contribuem fôrças de transferência dt car­

ga. A extrapolação d~6tes result~dos a sistemas enzimáticos de tranehidr~

genases pode esclarecer~ em parte, a reatividade dos sistemas e forneç€ in

dicações s3bre a estereo-especificidade dos coenzimas no estado de ttens1.-

-çao.

A tendência do anel de pirid1nmo, da forma oxidada do coenzima,

paTa a complexação ~anifesta-se também em relação a derivados aden!~c08.

A extensão dêstes resultados, obtidos em sistemas modelos, ao próprio co­

enzima, apoiada em considerações estatísticas, leva a concluir a reSpeite

de uma estrutura .fechada para o NAD+, fato êste jáa apontado por outros

autores, inclusive para a forma reduzida.

Diversos autores atribuem à estrutura fechada a menor reativi­

dade do coenzima, quando comparada~ de modelos, em vários sistemas qu1mi­

cos. É possivel que esta seja, ao menos parcialmente a explicação da ma­

ior dificuldade de hidratação de NADH em relação ao seu modêlo, sob a ca-,

talise dos compostos estudados.

Essa catálise de hidratação e o destino do produto fo~ado. caso

-a reaçao ocorra "in vivo" tornalQ-se centro altamente sugestivo de espe-, (··n.~4)

culações uma vez q~e.foi também demonstrada em nosso laborator1o

a capacidade de o,o'-dihalogenofenois contendo amino grupo protonado em

para de catalisar a oxidação de CIB~H a qlBO e, provàvelmente, também

a oxidação dos intermediários na formação de produto hidratadce Essas

reações poderiam constituir-se em elementos para a elaboração de um e~

quema para a sintese da primeira molécula de ATP, na cadeia respirató-

ria.

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