utjecaj neravnoteŽe Čimbenika oksidativnoga sustava na vaskularni endotelni faktor rasta · 2018....

I

PRIRODOSLOVNO-MATEMATIČKI FAKULTET BIOLOŠKI ODSJEK

Vlatka Brzović Šarić

UTJECAJ NERAVNOTEŽE ČIMBENIKA OKSIDATIVNOGA SUSTAVA NA

VASKULARNI ENDOTELNI FAKTOR RASTA

DOKTORSKI RAD

Zagreb, 2014.

II

FACULTY OF SCIENCE DIVISION OF BIOLOGY

Vlatka Brzović Šarić

OXIDATHIVE SYSTEM FACTOR IMBALANCE IMPACT ON VASCULAR

ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR

DOCTORAL THESIS

Zagreb, 2014.

I

Ovaj doktorski rad izrađen je u Kliničkoj bolnici „Sveti Duh“ - Klinika za očne bolesti i Zavod za medicinsko laboratorijsku dijagnostiku, te na Prirodoslovno-matematičkom fakultetu Biološki odsjek - Zavod za animalnu fiziologiju, pod vodstvom prof.dr.sc. Branimira Cerovskog i izv.prof.dr.sc. Domagoja Đikića, u sklopu Sveučilišnog poslijediplomskog doktorskog studija Biologije pri Biološkom odsjeku Prirodoslovno-matematičkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu.

II

Zahvala…..

………mojim mentorima prof.dr.sc. Branimiru Cerovskom i prof.dr.sc. Domagoju Đikiću na stručnoj pomoći, korisnim savjetima i podršci tijekom izrade ovog rada.

………svim liječnicima i sestrama Klinike za očne bolesti KB Sveti Duh u Zagrebu, a posebno vitreoretinalnim kirurzima doc.dr.sc.Damiru Bosnaru i mr.sc.Borni Šariću, za pomoć pri skupljanju kliničkog materijala.

………svim djelatnicama Zavoda za medicinsko laboratorijsku dijagnostiku KB Sveti Duh.

………mag.med.biok. Moniki Barberić u izradi laboratorijskog dijela rada. ………svim djelatnicima Biološkog odsjeka - Zavoda za animalnu fiziologiju na

Prirodoslovno-matematičkom fakultetu u Zagrebu pri eksperimentalnom dijelu izrade ovoga rada.

……….Peri Hrabaču dr.med., na stručnoj statističkoj obradi podataka. ……….suprugu Borni i sinu Bartolu, cijeloj mojoj obitelji na velikom strpljenju, podršci

i razumijevanju tijekom izrade i pisanja rada. ……….posebno, veliko hvala, mojim roditeljima koji su usadili u mene želju i volju za

„uvijek naprijed“.

III

Sveučilište u Zagrebu Doktorski rad Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek

UTJECAJ NERAVNOTEŽE ČIMBENIKA OKSIDATIVNOGA SUSTAVA NA VASKULARNI ENDOTELNI FAKTOR RASTA

Vlatka Brzović Šarić, dr.med.

Klinička bolnica „Sveti Duh“ Klinika za očne bolesti i Zavod za medicinsko laboratorijsku dijagnostiku; Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek, Zavod za animalnu

fiziologiju

Sažetak: Povezanost između unutarstanične hiperglikemije, promjene u oksidacijsko-redukcijskoj homeostazi, pojavnost oksidativnog stresa, smanjenje antioksidativne obrane i povećano stvaranje vaskularnoga endotelnog faktora rasta (VEGF), ključni su događaji u patogenezi proliferativne dijabetičke retinopatije (PDR). Ciljevi istraživanja: 1. Utvrditi koncentracije: VEGF-a, markera oksidativnog stresa i antioksidativnog sustava u staklastom tijelu i serumu. 2. Utvrditi korelaciju tih parametara u staklastom tijelu i serumu. 3. Temeljem rezultata korelativnog odnosa mjerenih pokusnih parametara, predvidjeti mogućnost dijagnostike retinopatičnih promjena mjerenjima serumskih vrijednosti. Metode istraživanja: ispitivane varijable mjerene su u uzorcima staklastog tijela i seruma bolesnika i eksperimentalnih životinja s izraženom proliferativnom dijabetičkom retinopatijom te u istim uzorcima bolesnika i eksperimentalnih životinja bez pojavnosti oksidativnog stresa, kao kontrola. Svi parametri analizirani su standardiziranim laboratorijskim metodama, a dobivene vrijednosti statistički obrađene. Korelacije podataka između promatranih skupina prikazane su Spearmanovim koeficijentima korelacije. Rezultati su pokazali povišene markere oksidativnog stresa u oku i u sistemskoj cirkulaciji, smanjen antioksidativni kapacitet u staklastom tijelu, te povišene vrijednosti u serumu kod dijabetičara s PDR-om. Zaključak: U dijabetičara, praćenjem serumskih parametara (lipidne peroksidacije, superoksid dismutaze i VEGF-a), moguće je indirektno procjenjivati oksidativni status unutar oka, a time i nastanak/napredovanje dijabetičke retinopatije i prije nego što promjene u oku postanu klinički očite. (Rad ima 124 stranice, 51 sliku, 51 tablicu, 223 literaturna navoda, jezik izvornika hrvatski)

Ključne riječi: oksidativni stres, vaskularni endotelni faktor rasta, proliferativna dijabetička retinopatija

Mentori: izv.prof.dr.sc. Domagoj Đikić i prof.dr.sc. Branimir Cerovski, dr.med.

Ocjenjivači: izv.prof.dr.sc. Asja Stipić Marković, prim.dr.med. izv.prof.dr.sc. Vesna Benković dr.sc. Mirko Hadžija, znanstveni savjetnik

IV

University of Zagreb Doctoral Thesis Faculty of Science Department of Biology

OXIDATHIVE SYSTEM FACTOR IMBALANCE IMPACT ON VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR

Vlatka Brzović Šarić, MD

Clinical Hospital "Sveti Duh" Department of Ophthalmology and Medical Laboratory of Diagnostics; Department of Animal Physiology, Faculty of Science, University of Zagreb

Summary: The relationship between intracellular hyperglycemia, changes in oxidative - reductive homeostasis, the onset of oxidative stress, reduction of antioxidant defense and increased production of VEGF are considered to be key events in the pathogenesis of diabetic retinopathy. Research goals: 1. To determine concentrations of: vascular endothelial growth factor, markers of oxidative stress and antioxidant system in the vitreous humor and serum. 2. To determine the correlation between these parameters in the vitreous and serum. 3. Based on the results of the correlation of the measured experimental parameters, predict the ability to diagnose retinopathy changes based on serum values. Research Methods: The examined variables were measured in samples of vitreous and serum of patients and experimental animals with pronounced proliferative diabetic retinopathy and of control group of patients and experimental animals without incidence of oxidative stress. All parameters were analyzed by standardized laboratory methods and the obtained values were statistically evaluated. Data correlations between observed groups were presented by the Spearman correlation coefficient. Results: The results showed elevated markers of oxidative stress in the eye and systemic circulation, reduced antioxidant capacity in the vitreous humor and increased antioxidant capacity in diabetic patients with PDR. Conclusion: In diabetic patients, monitoring of serum parameters (Lipid Peroxidation, Superoxide Dismutase and VEGF), can be used to indirectly evaluate the oxidative status inside the eye, and thus the formation/progression of diabetic retinopathy before clinical manifestation of changes in the eye.

(Thesis has 124 pages, 51 figures, 51 tables, 223 references, original in Croatian)

Keywords: oxidative stress, vascular endothelial growth factor, proliferative diabetic retinopathy

Supervisor: Domagoj Đikić, PhD, Associated professor Branimir Cerovski, MD, PhD, Professor Reviewers: Asja Stipić-Marković, MD, PhD, Associated professor Vesna Benković, PhD, Associated professor Mirko Hadžija, PhD

V

SADRŽAJ

1. UVOD ............................................................................................................ 1

1.1. CILJ I SVRHA ISTRAŽIVANJA................................................................ 2

1.2. HIPOTEZA .............................................................................................. 3

2. LITERATURNI PREGLED ............................................................................. 3

2.1. OKSIDATIVNI STRES ............................................................................. 3

2.1.1. Definicija i etiologija .......................................................................... 3

2.1.1.1. Slobodni radikali, reaktivne kisikove vrste ..................................... 4

2.1.1.2. Reaktivne dušikove vrste .............................................................. 6

2.1.1.3. Lipidna peroksidacija ..................................................................... 7

2.1.1.4. Antioksidansi ................................................................................. 9

2.1.2. Oksidativni stres u dijabetesu i dijabetičkoj retinopatiji ................... 12

2.2. VASKULARNI ENDOTELNI FAKTOR RASTA U OKU .......................... 18

2.2.1. Povijesni pregled, etiologija ............................................................ 18

2.2.2. Produkcija VEGF ............................................................................ 20

2.2.3. Receptori za vaskularne endotelne faktore rasta ........................... 20

2.2.4. VEGF u dijabetičkoj retinopatiji ...................................................... 23

2.2.5. Anti-VEGF terapija ......................................................................... 24

2.3. ŠEĆERNA BOLEST (DIABETES MELLITUS) ..................................... 25

2.3.1. Definicija, povijesni pregled, suvremeno značenje ......................... 25

2.3.2. Klasifikacija dijabetesa ................................................................... 26

2.3.3. Kronične komplikacije dijabetesa ................................................... 28

2.4. DIJABETIČKA RETINOPATIJA ............................................................. 29

2.4.1. Definicija i suvremeno značenje ..................................................... 29

2.4.2. Mikroskopska građa oka ................................................................ 29

VI

2.4.2.1. Mrežnica ...................................................................................... 30

2.4.2.2. Staklasto tijelo ............................................................................. 32

2.4.3. Klasifikacija dijabetičke retinopatije ................................................ 35

2.4.4. Strukturne promjene u dijabetičkoj retinopatiji ............................... 37

2.4.5. Dijagnostičke metode dijabetičke retinopatije ................................. 39

3. MATERIJALI I METODE .............................................................................. 45

3.1. ETIČKA NAČELA .................................................................................. 45

3.2. UZORCI U ISTRAŽIVANJU ................................................................... 45

3.2.1. Postupak pri odabiru uzorka ........................................................... 47

3.3. METODE ISTRAŽIVANJA I ISPITIVANI PARAMETRI .......................... 49

3.3.1. Određivanje produkata uznapredovale oksidacije proteina ........... 49

3.3.2. Određivanje lipidne peroksidacije ................................................... 50

3.3.3. Određivanje malondialdehida ......................................................... 51

3.3.4. Određivanje vaskularnoga endotelnog faktora rasta ...................... 52 .............................................................................................................................

3.3.5. Određivanje glutationa i oksidiranoga glutationa ............................ 52

3.3.6. Određivanje superoksid dismutaze ................................................ 53

3.4. STATISTIČKA OBRADA ....................................................................... 53

3.5. ISTRAŽIVANJE NA LABORATORIJSKIM ŽIVOTINJAMA .................... 54

3.5.1. Etička načela dijela eksperimenata koji su provedeni laboratorijskim životinjama ..................................................................................... 54

3.5.2. Eksperimentalne životinje ............................................................... 55

3.5.3. Model dijabetesa ............................................................................ 55

3.5.3.1. Prikupljanje uzoraka seruma i staklastog tijela ............................ 55

3.5.4. Statistička obrada rezultata u pokusu in vivo na aloksanskom modelu dijabetesa .......................................................................... 56

4. REZULTATI ISTRAŽIVANJA ....................................................................... 57

VII

4.1. REZULTATI ISTRAŽIVANOG UZORKA ............................................... 57

4.1.1. Vaskularni endotelni faktor rasta .................................................... 57

4.1.2. Produkti uznapredovale oksidacije proteina ................................... 60

4.1.3. Lipidna peroksidacija ...................................................................... 62

4.1.4. Malondialdehid ............................................................................... 64

4.1.5. Superoksid dismutaza .................................................................... 67

4.1.6. Glutation ......................................................................................... 70

4.1.7. Oksidirani glutation ......................................................................... 72

4.1.8. Glutation / oksidirani glutation ........................................................ 75

4.1.9. Korelacije ....................................................................................... 78

4.2. REZULTATI ISTRAŽIVANJA NA LABORATORIJSKIM ŽIVOTINJAMA………………………………………………………………..89

4.2.1. Produkti uznapredovale oksidacije proteina ................................... 89

4.2.2. Lipidna peroksidacija ...................................................................... 90

4.2.3. Malondialdehid ............................................................................... 92

4.2.4. Glutation ......................................................................................... 93

4.2.5. Superoksid dismutaza .................................................................... 94

4.2.6. Prikaz svih korelacija u ekperimentalnome laboratorijskome modelu ............................................................................................ 95

5. RASPRAVA ................................................................................................. 96 6. ZAKLJUČCI ............................................................................................... 109 7. LITERATURA ............................................................................................. 111

PRILOG 1: POPIS KRATICA I SIMBOLA………………………………………..125

ŽIVOTOPIS…………………………………………………………………………...127

1

1. UVOD

Dijabetes je bolest koja uzrokuje i povećava oksidativni stres (OS) na svim tjelesnim

razinama, uključujući i oko. Negativne posljedice dijabetesa u očima očituju se kroz povišen

očni tlak - glaukom, neovaskularizacije šarenice, zamućenje leće - katarakta, poremećaje u

rožnici, neurooptikopatije, ali najteža komplikacija je retinopatija (1). Dijabetička retinopatija

(DR) zahvaća 70 - 100% oboljelih od dijabetesa i danas je vodeći uzrok slabog vida i sljepoće

u svijetu. Smatra se da je u razvijenim zemljama 12% svih sljepoća uzrokovano dijabetesom,

i da je DR vodeći uzrok novonastale sljepoće među stanovništvom u dobi od 20 do 74 godine

(2). Osnovni promotor patoloških događanja je kronična hipeglikemija. Oksidativni stres

jedan je od glavnih uzroka metaboličkih promjena koje rezultiraju dijabetičkom retinopatijom.

Pretpostavlja se da su povezanost između hiperglikemije, promjene u oksidacijsko -

redukcijskoj homeostazi i pojavnost oksidativnog stresa, ključni događaji u patogenezi

dijabetičke retinopatije (3).

Unutarstanična hiperglikemija izravno djeluje u mitohondrijima i potiče stvaranje

superoksidnih aniona, aktivira metaboličke puteve: poliolski metabolički put, neenzimatsku

glikozilaciju bjelančevina, aktivaciju protein kinaze C (PKC) i heksozaminski metabolički put

koji indirektnim djelovanjem uvjetuju povećano stvaranje oksidativnog stresa. Biokemijski

niz sazdan od oštećenih makromolekula, viška stvorenih slobodnih radikala i oksidativnog

stresa izaziva funkcionalne i strukturne promjene složenih makromolekula, što uvjetuje

nastanak i razvoj dijabetičke retinopatije. Antioksidativna obrana u takvim uvjetima znatno je

smanjena (4).

Zbog kroničnog hiperglikemijskog podražaja, oksidativnog stresa i hipoksije, induciraju

se patološki učinci vaskularnog endotelnog faktora rasta (engl. vascular endothelial growth

factor, VEGF) u mrežnici. VEGF, točnije njegova izoforma VEGF165 povećava propusnost

krvnih žila mrežnice, uzrokuje propusnost krvnomrežnične barijere i razvoj edema u mrežnici.

Ključni je posrednik u angiogenezi koja ima važnu ulogu u nastanku proliferativne dijabetičke

retinopatije. VEGF stvaraju retinalne pigmentne epitelne (RPE) stanice, periciti, te endotelne

stanice neuroretinalnog sloja, kao odgovor na hipoksiju nastalu zbog gubitka kapilara i

formiranja mikroaneurizmi. Razina VEGF-a u staklastom tijelu i očnoj vodici znatno je

povišena kod proliferativne dijabetičke retinopatije (PDR) (5, 6). Studije upućuju na podatak

da su povišene vrijednosti VEGF-a u korelaciji sa stupnjem razvoja dijabetičke retinopatije (7,

8). Teško je točno odrediti koji su mehanizmi presudni za razvoj/napredovanje dijabetičke

2

retinopatije. Točan mehanizam kojim oksidativni stres pridonosi razvoju dijabetičkih

komplikacija još uvijek nije u potpunosti razriješen, iako znamo da oksidativni stres zbog

pretjerane produkcije reaktivnih kisikovih vrsta, a smanjene eliminacije antioksidativnim

obrambenim sustavima, dovodi do citopatogenetskih oštećenja.

1.1. CILJ I SVRHA ISTRAŽIVANJA

Hiperglikemija kao promotor narušene stanične homeostaze uvjetuje nastanak

oksidativnog stresa kroz povećano stvaranje slobodnih radikala i smanjenu antioksidativnu

obranu uz posljedično povećanu produkciju VEGF molekule. Korelacija te biokemijske

kaskade bit će istraživana unutar istog organizma, u dvama različitim medijima, serumu i

staklastom tijelu na modelu proliferativne dijabetičke retinopatije.

Temelj ovog istraživanja je eksperimentalno određivanje i procjenjivanje utjecaja

neuravnoteženih čimbenika oksidativnog i antioksidativnog sustava na produkciju VEGF-a te

utvrđivanje njihovih korelativnih međuodnosa unutar i između dvaju tjelesnih medija:

staklastog tijela i seruma u PDR-u.

Ciljevi istraživanja:

1. Odrediti koncentracije: VEGF-a, markera oksidativnog stresa (produkata

uznapredovale oksidacije proteina (AOPP), lipidne peroksidacije (LPO),

malondialdehida (MDA)), i markera antioksidativnog sustava (superoksid dismutaze

(SOD), glutationa (GSH), oksidiranoga glutationa (GSSG) te odnosa GSH/GSSG); u

staklastom tijelu i serumu bolesnika s PDR-om.

2. Utvrditi korelaciju tih parametara u staklastom tijelu i serumu.

3. Temeljem rezultata korelativnog odnosa i regresijske analize, mjerenih pokusnih

parametara, predvidjeti mogućnost rane dijagnostike retinopatičnih promjena

mjerenjima serumskih vrijednosti.

4. Nakon provedenog istraživanja na humanom modelu, odredit će se markeri

oksidativnog stresa (AOPP, LPO, MDA) i markeri antioksidativnog sustava (GSH i

SOD) na eksperimentalnome štakorskome modelu dijabetesa induciranog aloksanom,

te dobivene rezultate usporediti s rezultatima na humanome modelu.

3

1.2. HIPOTEZA

Zbog manje istraženosti molekularnih mehanizama u staklastom tijelu, a poznatih i

dokazanih korelacija VEGF-a i oksidativnog stresa u serumu kod dijabetičke proliferativne

retinopatije, mjerit će se i uspoređivati vrijednosti markera oksidativnog stresa,

antioksidativna aktivnost i vrijednosti VEGF molekule, istovremeno u serumu i staklastom

tijelu. Očekujemo povišene vrijednosti VEGF-a u uvjetima izraženog oksidativnog stresa,

povišene vrijednosti oksidacijskih proteina, a smanjene vrijednosti kapaciteta

antioksidativnog sustava, u oba istraživana medija. Također, predviđa se i pozitivna korelacija

mjerenih parametara između staklastog tijela i seruma.

Pozitivni korelativni odnosi praćenih parametara, istodobno uzetih iz seruma i

staklastog tijela, omogućit će procjenu stupnja oštećenja u mrežničnom tkivu i staklastom

tijelu, analizom uzoraka seruma. Tako bi se moglo pridonijeti prevenciji, ranoj dijagnostici, te

boljem liječenju ove komplikacije dijabetesa.

2. LITERATURNI PREGLED

2.1. OKSIDATIVNI STRES

2.1.1. Definicija i etiologija

Stanje u kojem dolazi do neravnoteže između prooksidansa i antioksidansa, u kojemu

su povećane koncentracije prooksidansa nazivamo oksidativnim stresom (9).

OS je stanje u kojem oksidacijski procesi prevladaju antioksidativne sposobnosti stanica

tkiva ili organizama. U ravnotežnim uvjetima, slobodni radikali razgrađuju se staničnim

antioksidansima, uz pomoć enzima kao što su npr. superoksid dismutaza (SOD), katalaza

(KAT) i glutation peroksidazea (Gpx-1) ili neenzimatski uz pomoć npr. glutationa (GSH)

(10). Opseg staničnog oštećenja nastalog kao posljedica OS ovisi o mehanizmu kojim je

izazvan, o stupnju zahvaćenosti molekula, o organskom sustavu koji je pogođen te trajanju.

Kronična prisutnost oksidativnog stresa posljedično dovodi do oštećenja bioloških

makromolekula (DNA, lipida, proteina, i ugljikohidrata), uzrokuje poremećaj homeostaze

4

unutar stanice, a posljedično onda i tkiva. Visoko izražen OS dovodi do teških oštećenja

staničnih struktura, što na kraju rezultira staničnom smrću (11).

2.1.1.1. Slobodni radikali, reaktivne kisikove vrste

Molekularni kisik nužan je za život aerobnih organizama, ali kad njegova

koncentracija u tkivima i organima postane veća od normalne, on postaje toksičan. Glavni

razlog toksičnosti kisika je njegovo svojstvo stvaranja reaktivnih kisikovih vrsta (RKV),

(engl. reactive oxygen species; ROS), koje zbog prisutnosti nesparenih elektrona nazivamo

slobodnim radikalima (12). Slobodni radikali su atomi ili skupine atoma koji posjeduju jedan

nespareni elektron u vanjskoj elektronskoj ljusci (13). Taj nespareni elektron je slobodna

valencija zbog čega slobodni radikali imaju veliku kemijsku reaktivnost i svoj negativni naboj

neutraliziraju u okolini. Nakon njihove inaktivacije nastaju nove radikalne molekule. Time

nastaje lavina lančane neenzimatske reakcije novih slobodnih radikala koja se multiplicira u

organizmu (Slika 1.). Imaju kratak poluživot (ms do μs) i reagiraju s raznovrsnim spojevima

(14, 15). Kemijske reakcije imaju važnu ulogu u nastanku navedenih molekula.

Slika 1. Prikaz mehanizma lančane reakcije slobodnih radikala.

Slobodni radikali doniraju ili kradu jedan elektron iz druge molekule, što dovodi do lančane reakcije koja aktivira stvaranje više slobodnih radikala

Preuzeto s www.cerefolin.com

Slobodni radikali nastaju u redukcijsko - oksidacijskim reakcijama tijekom patoloških

i normalnih fizioloških procesa. U mitohondrijima nastaju putem oksidativne fosforilacije

(16), u endoplazmatskom retikulumu prijenosom elektrona u sustavu citokroma P - 450 (17),

5

oksidacijom masnih kiselina u peroksisomima (18), u staničnim membranama metabolizmom

arahidonske kiseline (19) te fagocitozom (20). Slobodni radikali mogu nastati i tijekom

enzimatske oksidacije i autooksidacije različitih kemijskih spojeva poput tiola,

oksihemoglobina, pri čemu dolazi do redukcije molekularnog kisika i nastajanja superoksida

(21). U metaboličkim procesima, unutar stanica stvara se nekoliko jakih oksidansa:

superoksidni anion (O₂⁻), hidroksi radikal (OH•), te molekule koje direktno nisu slobodni

radikali, ali se lako pretvore u radikale pod specifičnim uvjetima u organizmu, to su: vodikov

peroksid (H₂O₂), hipokloritna kiselina (HClO), ozon (O3), singletni kisik (1O2) (Tablica 1.).

Sve navedene spojeve nazivamo spojevima RKV. Iznimno su reaktivni oksidansi i

mogu reagirati s molekulama proteina, DNA, lipida te ugljikohidrata što može rezultirati

poremećajima unutar staničnih membrana, inaktivacijom membranskih enzima, ubrzanom

proteolizom, poremećenim prijenosom signala unutar stanica, transformacijom stanica i

staničnom smrti (22, 23).

Tablica1. Reaktivni kisikovi spojevi

Slobodni radikali Molekule koje su prekursori slobodnih radikala

superoksidni O₂⁻ vodikov peroksid H₂O₂ hidroksilni OH• hipokloritna kiselina HClO peroksilni ROO• ozon O3 alkoksilni RO• singletni kisik 1O2 hidroperoksilni HO2•

Za vrijeme staničnog disanja, na unutarnjoj strani mitohondrija, molekularni kisik se

procesom oksidativne fosforilacije u sustavu citokrom C oksidaza reducira do vode. Za

vrijeme te reakcije, kao međuprodukt oslobađa se mala količina reaktivnih spojeva (9, 24).

Redukcijom jednog elektrona molekule kisika nastaje superoksidni anion (O2-).

6

U kiseloj sredini superoksidni anion veže proton i nastaje reaktivniji perhidroksilni

radikal (HO2-). Superoksidni anion se spontano ali i uz pomoć superoksid dismutaze (SOD) te

vodikovih iona, prevodi u vodikov peroksid. Iako vodikov peroksid nije radikal, jer nema

nesparenih elektrona, on je oksidans koji uz prisutnost prijelaznih metala, dvovalentnog iona

željeza (Fe2+) i jednovalentnog iona bakra (Cu+), može prihvatiti jedan elektron stvarajući

toksičan hidroksilni radikal (OH•). Hidroksilni radikal nastaje Fentonovom i Haber-

Weissovom reakcijom. U Fentonovoj reakciji, dvovalentni ion željeza reagira s vodikovim

peroksidom i prelazi u trovalentni ion željeza (Fe3+), pri čemu nastaje hidroksilni radikal i

hidroksilni ion. U Haber-Weissovoj reakciji superoksidni anion reagira s vodikovim

peroksidom, pri čemu, također nastaje hidroksilni radikal i hidroksilni ion. Hidroksilni radikal

izrazito je reaktivan radikal koji reagira sa svim vrstama biomolekula (25).

2.1.1.2. Reaktivne dušikove vrste

Uz reaktivne kisikove spojeve, veliku važnost imaju i reaktivne dušikove vrste (engl.

reactive nitrogen species, RNS), u koje ubrajamo dušikove slobodne radikale; dušikov oksid

(NO•) i dušikov dioksid (NO2•), te druge reaktivne spojeve dušika kao što su: dušična

(nitritna) kiselina (HNO2), peroksinitrit (ONOO-), alkilperoksinitrat (ROONO) (26, 27, 28).

NO ima ključnu ulogu u brojnim fiziološkim, ali i patološkim procesima.

Kontinuirano stvaranje NO-a u endotelnim stanicama krvnih žila dovodi do relaksacije glatkih

mišićnih stanica stijenka krvnih žila i vazodilatacije te se NO smatra jednim od najvažnijih

regulatora tonusa krvnih žila. Dokazano je da NO inhibira agregaciju trombocita i na taj način

sudjeluje u regulaciji protoka krvi (29). Aktiviranjem imunološkog sustava, posebice

makrofaga, povećava se količina stvorenog NO-a, nužnog za obranu organizma od različitih

patogenih uzročnika. Međutim, pretjerana stimulacija i hiperprodukcija NO-a mogu biti

uzrokom teških oksidativnih oštećenja organizma. Endogeni NO nastaje oksidacijom

aminokiseline L-arginina u L-citrulin, u endotelnim, živčanim i upalnim stanicama, pod

djelovanjem oksid sintetaze (NOS) (30). NOS u organizmu postoji u tri izoforme, 1.

endotelna NOS ili eNOS, 2. neuronalna NOS ili nNOS i 3.inducirana NOS ili iNOS.

Aktivnost NO-a određena je ravnotežom između njegove sinteze i razgradnje.

7

Povećana koncentracija superoksidnih aniona smanjuju aktivnost eNOS, no pod

utjecajem protein kinaze C (PKC) i nuklearnog faktora - NFB pojačava se ekspresija

inducirane NO sintaze (iNOS). Konačan je rezultat pojačano stvaranje promijenjenog NO-a.

Superoksidni anioni i povišena koncentracija promijenjenog NO-a dovode do povećanog

stvaranja peroksinitrata, jednog od najjačih oksidansa u tijelu, koji može potaknuti lipidnu

peroksidaciju (31). Potvrđena je negativna uloga dušikova oksida u oštećenim tkivima

tijekom kronične upale i septičkog šoka (32).

Dušikov oksid posjeduje prooksidativna, ali i antioksidativna svojstva. Dokazano je da veće

količine dušikova oksida štite lipide staničnih membrana od oštećenja, jer veće količine

stvorenog peroksinitrita s lipofilnim peroksilnim radikalima (ROO.) stvaraju relativno stabilni

alkil peroksinitrat (ROONO) koji može zaustaviti proces lipidne peroksidacije (29, 33).

2.1.1.3. Lipidna peroksidacija

Jedna od kemijskih reakcija koja dovodi do oštećenja stanica je lipidna peroksidacija

(LPO). To je složena lančana reakcija razgradnje (oksidacije) višestruko nezasićenih masnih

kiselina (engl. polyunsaturated fatty acid, PUFA) potaknuta RKV-om i RNS-om (34, 35).

LPO inducira poremećaj finih staničnih struktura; dovodi do promjena integriteta, fluidnosti,

propusnosti te posljedično funkcionalnog poremećaja biomembrana; također uzrokuje

promjene lipoproteina niske gustoće (LDL) u proaterogenične i proupalne forme, pri čemu se

stvaraju toksične stanične molekule (36). Studije upućuju na to da završni produkti LPO

mogu biti mutageni i kancerogeni (37). Reaktivni karbonilni spojevi, produkti LPO, mijenjaju

biološki vrlo važne molekule; proteine i DNA baze (38 - 40). Sve navedene promjene

narušavaju staničnu homeostazu i mogu uvjetovati nastanak stanične smrti, apoptozu stanica.

Dokazano je da se oksidacija lipida može odvijati kroz tri razdvojene reakcije; 1. oksidacija

posredovana slobodnim radikalima, 2. neovisna neenzimska oksidacija, 3. Enzimska

oksidacija (41).

1. Proces oksidacije lipida započinje reakcijom u kojoj visoko reaktivni oksidans, npr.

hidroksilni radikal ima dovoljno energije da izazove lipidnu peroksidaciju (42, 43); oduzima

atom vodika višestruko nezasićenoj masnoj kiselini, pri čemu nastaje alkilni, odnosno lipidni

radikal. Bilo koji spoj koji ima sposobnost oduzeti vodikov atom masnoj kiselini može

izazvati taj proces. Ako početak reakcije nije kontroliran obrambenim mehanizmima

(prisutnost antioksidanasa), započinje lančana reakcija koja može dovesti do uništenja okolnih

molekula. U procesu lipidne peroksidacije sudjeluju i ioni željeza. Nakon što je peroksidacija

8

započela, željezo potiče daljnji proces. Lipidni hidroperoksidi lako reagiraju s Fe2+ i Fe3+ pri

čemu nastaju alkoksi radikali i lipidni peroksilni radikali. Na taj način dolazi do grananja

lančane reakcije, lipidne peroksidacije (44, 45).

2. Neovisna neenzimska oksidacija, podrazumijeva reakciju oksidacije lipida bez udjela

slobodnih radikala. Singletni kisik i ozon oksidiraju lipide putem „ne - radikalnih“

mehanizama (46).

3. Enzimska oksidacija, odnosi se na oksidaciju proteina putem lipooksigenaze (engl.

lipoxygenase, LOX) i ciklooksigenaze (engl. cyclooxygenase, COX) (47). Npr. LOX izravno

oksidira fosfolipide i kolesterolske estere u slobodnim masnim kiselinama (48, 49).

Završni produkti lipidne peroksidacije su reaktivni aldehidi. To su 4 - hidroksialkenali

i drugi srodni α, β - nezasićeni aldehidi koji se smatraju „drugim toksičnim glasnicima“

primarnih slobodnih radikala (38). Iako se zovu „završni produkti lipidne peroksidacije“, oni

mogu u određenim uvjetima nastaviti lančanu reakciju oksidacijskog oštećenja. Budući da su

dugoživući, mogu se kretati od mjesta nastanka na udaljenija mjesta i djelovati na molekule

koje su udaljenije od mjesta početnog nastanka slobodnih radikala, bilo intracelularno ili

ekstracelularno.

Glavni produkti nađeni u biološkim uzorcima su heksanal, malondialdehid (MDA) i 4

- hidroksi - 2 - nonenal (HNE) te su stoga i najviše istraživani (50).

Hidroperoksidi su glavni primarni proizvodi LPO polinezasićenih masnih kiselina

posredovani slobodnim radikalima. Njihove razine u krvi čovjeka mjerene su u nekoliko

studija, koje upućuju na izrazito povišene vrijednosti hidroperoksida u oboljelih od

hiperlipidemije, ateroskleroze, dijabetesa, hemodijaliziranih bolesnika, u bolesnika s

moždanim udarom, kod multiple skleroze (51, 52).

Malondiadehid (MDA)

MDA je organski spoj kemijske formule CH2(CHO)2. U organizmu prevladava

njegova enolna forma. Reaktivni je aldehid i jedan je od mnogih reaktivnih elektrofila koji

može uzrokovati toksični stres stanice (53). MDA može stvarati kovalentne adukte s

proteinima, pokazujući izraziti afinitet prema lizinskom aminokiselinskom ostatku. Gvanin u

DNA molekuli također je ciljno mjesto napada MDA, što može stvarati mutagena oštećenja.

Koncentracija MDA u plazmi upućuje nas na oksidativni stres organizma, a koncentracija

MDA u pojedinom organu na oksidativni stres u tom organu. Poznato je danas mnogo metoda

za detekciju i mjerenje MDA. Metoda koja se najčešće koristi za određivanje koncentracije

9

MDA u biološkom uzorku je derivatizacija MDA s 2 - tiobarbituratnom kiselinom (TBA) pri

čemu MDA reagira s dva ekvivalenta TBA i nastaje MDA - (TBA)2 kompleks. Reakcija se

odvija u kiselim uvjetima i na visokoj temperaturi pri čemu nastaje crveni fluorenscentni

derivat MDA - (TBA)2 čija se koncentracija može izmjeriti spektrofotometrijski. MDA je

danas znanstveno prihvaćen marker oksidativnog stresa u cijelom svijetu (54, 55).

2.1.1.4. Antioksidansi

Antioksidansi su spojevi koji sprječavaju nastanak prooksidansa, uklanjaju

prooksidanse iz svoje okoline ili zaustavljaju njihove reakcije. Antioksidansi su sve tvari koje

mogu spriječiti ili smanjiti oksidaciju supstrata (56).

Budući da oksidativni stres predstavlja nerazmjer između povećanog stvaranja i/ili

narušenog uklanjanja RKV-a i RNS-a, antioksidantni obrambeni sustav stanice ima važnu

ulogu u opsegu sveukupnog djelovanja oksidativnog stresa. Aktivnost antioksidansa očituje se

u čišćenju slobodnih radikala i održavanju oksidacijsko-redukcijske homeostaze. Kao

odgovor na oksidativni stres antioksidansi se generiraju in situ - endogeni antioksidansi ili se

unose - egzogeni antioksidansi. Prema mehanizmu djelovanja u organizmu antioksidansi se

mogu podijeliti na: 1. preventivne, neenzimske antioksidanse, 2. enzimske antioksidanse i 3.

„hvatače“ slobodnih radikala (engl. scavengers) (57).

1. Preventivni, neenzimski antioksidansi sprječavaju stvaranje slobodnih radikala u

stanicama. To su molekule koje vežu ione metala, željeza i bakra (Fe2+ i Cu+) i na taj način

blokiraju Fentonovu reakciju (reakcija posredovana metalima, u kojoj iz superoksida i

vodikova peroksida u stanicama nastaje hidroksilni radikal, izrazito toksična molekula). U

preventivne antioksidanse ubrajamo specifične tkivne proteine: feritin, transferin, laktoferin,

albumin, L-arginin, metal-kelirajući proteini, koenzim Q10, itd. (58, 59).

2. Enzimski antioksidansi, izravno su uključeni u neutralizaciju RKV i RNS, katalitički

razgrađuju slobodne radikale. U tu skupinu antioksidansa ubrajamo: superoksid dismutazu

(SOD), katalazu (CAT), glutation peroksidazu (GPx) i glutation reduktazu (GRx) (59 - 64).

Superoksid dismutaza (SOD)

SOD je prva linija obrane protiv slobodnih radikala. Katalizira dismutaciju

superoksidnog aniona, radikala (O2• ˉ) u vodikov peroksid (H2O2) redukcijom (reakcija 1).

2O•- + 2H+→ H2O2 + O2 (reakcija 1)

10

Kod eukariota prisutna su tri izoenzimska oblika SOD:

1. Bakar, cink-ovisna SOD (CuZnSOD)

2. Mangan-ovisna SOD (MnSOD)

3. Ekstracelularna SOD (ECSOD)

Gen odgovoran za sintezu CuZnSOD kod čovjeka, nalazi se na 21. kromosomu (65).

CuZnSOD je pretežito citosolni enzim, homodimer sastavljen od dviju podjedinica, od kojih

svaka sadrži po jedan atom Cu2+ i jedan atom Zn2+. Aktivno mjesto enzima čine ioni bakra.

Uz bakar je vezana katalitička aktivnost enzima, dok cink stabilizira njegovu prostornu

konformaciju. U malim količinama nalazi se u staničnoj membrani, jezgri i mitohondrijima.

Dokazana je prisutnost tog enzima u svim tkivima, kao i u plazmi i eritrocitima. Posebice

visoku aktivnost pokazuje u jetri, bubrezima, srcu i nadbubrežnoj žlijezdi (66).

Gen za humanu MnSOD nalazi se na 6. kromosomu. U eukariotskim organizmima

prisutan je samo u matriksu mitohondrija. Taj je enzim homotetramer koji sadrži od 2 do 4

atoma mangana na aktivnim mjestima. Sintetizira se u citosolu (kodiran je genima u jezgri), a

u mitohondrij ulazi translacijom proenzima sa signalnom sekvencijom koja protein provodi u

mitohondrij. Kao i CuZnSOD, u velikim je količinama prisutan u jetri, bubregu, nadbubrežnoj

žlijezdi i srcu. Dokazano je da MnSOD ima kritičnu ulogu u obrani stanica od oksidacijskog

stresa, kao i u inhibiciji tumorogeničnosti (67).

ECSOD je tetramerni, slabo hidrofobni protein. Gen za humanu ECSOD nalazi se na

kromosomu 4q21 (68). Sadrži 4 atoma bakra i cinka po molekuli, s atomima Cu u aktivnom

mjestu. Prema svojim strukturnim značajkama pokazuje veliki afinitet za kisele

glikozaminoglikane (ponajprije heparin) za koje se veže izvanstanično. ECSOD sintetiziraju

fibroblasti, glija stanice, makrofagi, hondrociti i endotelne stanice. Enzim ima važnu ulogu u

moduliranju djelovanja dušikova oksida (NO•). NO• je slobodni radikal male molekulske

mase, hidrofobnog karaktera i relativne kemijske nestabilnosti. U visokim koncentracijama

pokazuje izravne toksične efekte u stanicama, i inhibira enzime u različitim dijelovima

stanice, uključujući mitohondrije i jezgru. Porast aktivnosti ECSOD uzrokuje intenzivnije

otklanjanje O2•-, čime se pozitivno djelovanje NO• u raznim staničnim procesima produžuje. S

druge strane, pri smanjenoj aktivnosti enzima, povećana koncentracija O2•- intenzivira

vezanje NO• i nastajanje peroksinitrita, koji je izrazito toksičan i oštećuje stanice (69).

11

Katalaza (KAT)

Jedan od najrasprostranjenijih antioksidativnih enzima je katalaza i nalazi se u svim

živim organizmima. Gen za katalazu nalazi se na 11. kromosomu. Sastavljena je od četiriju

identičnih podjedinica od kojih svaka sadrži atom željeza koji predstavlja aktivno mjesto

enzima. Osnovna uloga katalaze je razgradnja vodikova peroksida putem katalaznog (reakcija

2) i/ili peroksidaznog oblika reakcije (reakcija 3):

2H2O2 → 2H2O + O2 (reakcija 2)

H2O2 + RH2→ 2H2O + R (reakcija 3)

R je bilo koji od brojnih H-donirajućih supstrata (etanol, metanol, nitrit, kvinoni). Pri

fiziološkim koncentracijama H2O2 prevladava peroksidazni tip reakcije.

Katalazna aktivnost očituje se tek pri većim koncentracijama H2O2, što govori da je katalaza

isključivo odgovorna za razgradnju peroksida u uvjetima oksidacijskog stresa. Katalaza je

prisutna u svim tkivima sisavaca (70, 71).

Glutation peroksidaza (Gpx)

Glutation peroksidaza nalazi se u svim eukariotskim stanicama. Visoka aktivnost

prisutna je u mitohondrijima i citosolu. Katalizira reakciju redukcije H2O2 ili organskih

hidroperoksida u prisutnosti reduciranoga glutationa (GSH) (reakcija 4):

2GSH + H2O2 (ROOH) → GSSG + ROH + H2O (reakcija 4)

Sustav glutation peroksidaze odgovoran je za razgradnju najvećeg dijela H2O2 u stanici.

Glutation reduktaza uz pomoć NADPH regulira prijeko potreban reducirani glutation (GSH)

(reakcija 5):

NADPH+ + H+ + GSSG → NADP+ + 2GSH (reakcija 5).

Enzim je tetramer s četiri identične podjedinice, od kojih svaka sadrži po jedan atom selena u

obliku selenocisteina, a koji tvori aktivno mjesto enzima. U živim organizmima glavna uloga

Gpx je otklanjanje vodikova peroksida i ostalih organskih hidroperoksida u fiziološkim

koncentracijama u organizmu. Glutation peroksidaza prisutna je u četirima različitim

oblicima: citosolna Gpx (Gpx-1), fosfolipidna hidroperoksid Gpx (PHGpx), plazmatska Gpx

(pGpx) i gastrointestinalna Gpx (GI-Gpx). Različite izoforme enzima različito su raspoređene

po tkivima i pojedinim dijelovima stanice. Tkiva s najvećom količinom Gpx su jetra i bubrezi,

u umjerenoj količini prisutna je u srcu, plućima i mozgu, a malo je ima u mišićima (58 - 67,

72).

12

3. „Hvatači“ slobodnih radikala. Najbrojnija je skupina antioksidanasa, i s obzirom na

različite strukture i afinitete, ostvaruju i različite mehanizme djelovanja antioksidativne

zaštite. U tu skupinu ubrajamo: vitamine A, C, E, brojne biljne fenole, melatonin, transferin,

urati, bilirubin, ceruloplazmin, omega-3 i omega-6 masne kiseline, itd. (73). Najučinkovitiji

antioksidans te skupine je reducirani glutation (GSH). GSH je vjerojatno najpotentnija

obrambena molekula unutar stanice. Djeluje kao čistač RKV-a, modulira unutarstanična

redoks stanja i važna je komponenta aktivnosti enzima glutation peroksidaze (74, 75). GSH je

tripeptid koji se sastoji od glutaminske aminokiseline, aminokiseline cisteina i prolina. U

funkciji reduciranoga glutationa bitna je aktivnost sulfhidrilne SH skupne aminokiseline

cisteina. GSH aktivan je antioksidans koji u prisutnosti bilo kojeg oksidansa u organizmu

oslobađa atom vodika i time ga kemijski neutralizira. Pri tome se povezuju dva ostatka

reduciranoga glutationa u njegov složeni oblik koji se naziva oksidirani glutation (reakcija 6):

GSH + GSH → GSSG + H2 (reakcija 6).

Metabolizam reduciranoga glutationa (GSH) u organizmu je funkcijski organiziran, jer

postoji enzim glutation reduktaza koji obnavlja GSH iz GSSG (oksidirani glutation) preko

prenositelja atoma vodika u spoju NADPH (ranije spomenuta reakcija 5).

Neravnoteža između oksidansa i antioksidansa; odnosno oksidacijski stres može

prouzročiti ozbiljna oštećenja stanica koja mogu dovesti i do stanične smrti - apoptoze

stanice.

2.1.2. Oksidativni stres u dijabetesu i dijabetičkoj retinopatiji

Dijabetes je poremećaj metabolizma karakteriziran hiperglikemijom koja nastaje

nekontroliranom regulacijom glukoze. RKV i RNS su prepoznati kao uzročno - posljedična

veza između šećerne bolesti i komplikacija te bolesti. Povećano stvaranje slobodnih radikala i

smanjenje antioksidativnih potencijala koji dovode do viška RKV i oksidativnog stresa utječu

na razvoj te bolesti (76).

Istraživanja govore da su izvori oksidativnog stresa u dijabetesu samooksidacija

glukoze, pomicanje redoks ravnoteže, smanjenje koncentracije molekula niske molekularne

mase (antioksidansa) kao što su: reducirani glutation (GSH) i vitamin E u tkivima; te

oslabljena aktivnost antioksidativnih obrambenih enzima, kao što su superoksid dismutaza i

katalaza (77, 78). Kronična prisutnost oksidativnog stresa uzrokuje oštećenja bioloških

makromolekula DNA, lipida, proteina i ugljikohidrata. To ima važnu ulogu u patogenezi

13

dijabetičkih komplikacija kao što su neuropatija, nefropatija, vaskulopatija, kardiomiopatija,

retinopatija (4, 79).

Oksidativni stres u dijabetičkoj retinopatiji

Patogeneza dijabetičke retinopatije je složena i zbog toga još uvijek nedovoljno

razjašnjena. Pretpostavlja se da nastaje međudjelovanjem različitih biokemijskih mehanizama

i čimbenika koji postupno dovode do disfunkcije stanica, oksidativnog stresa, mijenjanja i

propadanja tkiva (72).

U usporedbi s bilo kojim drugim tkivom, mrežnica ima visok sadržaj polinezasićenih

masnih kiselina i najdinamičniji protok kisika i glukoze. Predstavlja metabolički vrlo aktivno

neuralno tkivo s iznimno velikom potrošnjom kisika od 6,5 cm3/min /g tkiva. Taj fenomen

čini mrežnicu i znatno osjetljivijom na oksidativni stres (80). Pretpostavlja se da su

povezanost između hiperglikemije, promjene u oksidacijsko - redukcijskoj homeostazi i

pojavnost oksidativnog stresa ključni događaji u patogenezi dijabetičke retinopatije. Studije

na animalnim modelima pokazale su da oksidativni stres pridonosi, ne samo razvoju

dijabetičke retinopatije, nego i tzv. modelu „metaboličkog fenomena memorije“, u kojemu

stanice pamte oštećenja nastala zbog akumulacije RKV-a i narušenih molekularnih građa (80

- 82). Iz svega navedenog slijedi da se, unatoč dobroj regulaciji glikemije, oštećenja se i dalje

događaju.

U mrežnici dijabetičkih štakora, uz visoke koncentracije glukoze inkubirane u

stanicama mrežnice, nađena je povišena razina superoksida i povećana koncentracija hidrogen

peroksida (82). Također, detektirane su promjene prouzročene izraženim RKV-om koje su se

očitovale kroz povišene vrijednosti membranske lipidne peroksidaze i izraženo oksidacijsko

oštećenje DNA. Marker oštećenja bio je 8-hidroksi-2-deoxyguanosine (8-OhdG) (83, 84).

Budući da oksidativni stres predstavlja nerazmjer između povećanog stvaranja i/ili narušenog

uklanjanja RKV-a, antioksidantni obrambeni sustav stanice ima važnu ulogu u opsegu

sveukupnog djelovanja oksidativnog stresa. Aktivnost antioksidativnih enzima očituje se u

čišćenju slobodnih radikala i održavanju oksidacijsko - redukcijske homeostaze. U dijabetesu,

antioksidativni enzimi kao što su: superoksid dismutaza, glutation reduktaza, glutation

peroksidaza i katalaze su smanjene. Nadalje, u stanici se nalazi jedan od najpotentnijih

unutarstaničnih antioksidansa GSH (85). Uklanja RKV i modulira unutarstanična redoks

14

stanja (86). Razine tog intracelularnog antioksidansa u mrežnici dijabetičara znatno su

smanjene. Osim antioksidativnih enzima i neenzimski antioksidansi poput vitamina C,

vitamina E i β-karotena, koji sudjeluju u regulaciju redoks homeostaze, također su sniženi

tijekom hiperglikemije (87).

Oksidativni stres, osim što stalno pridonosi makromolekularnim oštećenjima

pojačavajući proizvodnju RKV, također aktivira i druge metaboličke putove, signalne i

transkripcijske faktore, koji pridonose narušavanju stanične ravnoteže i poticanju razvoja

dijabetičke retinopatije.

Hiperglikemija pokreće razne biokemijske puteve koji dovode do oksidativnog stresa i

unutarstaničnih oštećenja. Intracelularno nakupljanje krajnjih produkata uznapredovale

glikozilacije (engl. advanced glycation end products, AGE) uzrokuju (88) povećanu aktivnost

poliolnog puta (89), aktivaciju protein kinaze C (PKC) (90) te povećanu aktivnost

heksozaminskog puta (91). Zbog poremećaja kisikove homeostaze povećana je aktivnost HIF-

a (engl. hypoxia inducible factor, HIF) te produkcija VEGF-a (92). Sve navedeno, su

mehanizmi koji sudjeluju u nastajanju oksidativnog stresa i uvjetuju napredovanje dijabetičke

retinopatije. Važno je naglasati da svi ti čimbenici ne djeluju odvojeno, nego da postoji

uzajamno čvrsto međudjelovanje.

Glikozilacija se odnosi na neenzimsku konjugaciju glukoze sa slobodnim

aminokiselinama bjelančevina (Maillardova reakcija). To je reakcija u kojoj karbonilna

skupina glukoze prvo reagira sa slobodnom amino skupinom bjelančevine tvoreći nestabilni

glikozilamin (Schiff-ova baza), koji kasnije Amadorijevom pregradnjom prelazi u stabilniji

fruktozil-lizin (Amadorijev spoj). Jednom stvoreni, Amadorijevi spojevi nizom kemijskih

pregradnji tvore heterogene polimere - završne proizvode glikozilacije, AGE. Glukoza

također procesom autooksidacije stvara glioksal i metilglikosal (reaktivni dikarbonilni šećeri)

koji dalje reagiraju s bjelančevinama tvoreći glikoksidacijske AGE proizvode. Nastanak AGE

mijenja strukturu bjelančevina što remeti normalnu funkciju (93). Više je patogenetskih

razina na kojima AGE sudjeluju u nastanku kasnih dijabetičkih komplikacija. 1. AGE se u

najvećoj mjeri stvaraju unutar stanice (endotelne stanice krvnih žila i neuroni), uzrokujući

promjene strukture i funkcije staničnih bjelančevina i nukleinskih kiselina. To su uglavnom

stanice koje ne trebaju inzulin za transport glukoze. 2. Izvanstanični produkti AGE dovode do

promjena unutar matriksa, kao i u interakciji između samih stanica. Osobito je važno vezanje

AGE na kolagen tipa IV u bazalnoj membrani, što mijenja molekulsku cjelovitost matriksa

povećavajući propusnost. Uznapredovalo glikoziliranje potiče promjene u strukturi

15

fibronektina i laminina koje se ogledaju u patološkim interakcijama s trombocitima. Te

abnormalnosti rezultiraju stvaranjem mikrotromba, te jačim lučenjem endotelnih faktora rasta

(VEGF) i vazokonstrikcijskih čimbenika (endotelin-1) (94). 3. Na monocite, makrofage i

endotelne stanice stvoreni AGE veže se za specifične receptore, receptore za AGE (RAGE).

Kompleks AGE/RAGE uzrokuje celularni stres koji se očituje otpuštanjem citokina (IL-1,

TNF-, TNF-), povećanim stvaranjem RKV i aktivacijom nuklearnog faktora kapa-B (NF-

B). NF-B normalno nalazimo u neaktivnom obliku u citosolu, u patološkim stanjima

(hiperglikemija, upala, zračenja), djelovanjem brojnih molekula (npr.interleukina-1) aktivira

se i prelazi u jezgru, gdje nadalje negativno djeluje (95). Pretpostavlja se da višak RKV-a

generiran putem AGE, vodi aktiviranju nuklearnog faktora NF-kB koji uzrokuje daljnja

oštećenja stanica. Uočeno je da se u mrežničnoj mikrovaskularizaciji, u dijabetesu, povećano

akumulira kompleks AGE/RAGE. Također, u kasnijim fazama retinopatije, AGE nepovratno

se formiraju i akumuliraju unutar stanica mrežničnih kapilara. Nastanak AGE uvjetuju i

oslabljeni vazodilatirajući odgovori na dušični oksid u krvožilnim stanicama mrežnice i na taj

način pokreću slijed događaja koji dovodi do apoptoze stanica kapilara mrežnice; također

putem aktivacije NF-kB i kaspaze-3. Nitracija proteina može inaktivirati mitohondrijske

proteine i proteine u citosolu, poremetiti stvaranje i funkcije proteina, povećati apoptozu, te u

konačnici dovesti do patoloških posljedica i oštećenja staničnih elemenata (96, 97).

Važan metabolički put u etiologiji dijebetičke retinopatije je i poliolni put. Poliolni put

uključuje pretvaranje glukoze u sorbitol, reakcija je katalizirana enzimom aldoza reduktaze.

Nastali sorbitol se pomoću sorbitol dehidrogenaze oksidira u oblik fruktoze. Povećanje

aktivnosti poliolnog puta u dijabetesu može povećati oksidativni stres, jer aldoza reduktaze

zahtijeva za svoju aktivnost NADPH, stoga povećana aktivnost poliolnog puta troši više

NADPH, natječući se s glutation reduktazom za NADPH. Takva kompeticija smanjuje

količinu NADPH za obnavljanje i rad unutarstaničnih antioksidansa, što uzrokuje

nagomilivanja RKV-a i daljnja stanična oštećenja (98).

Aktivacija protein kinaze C (PKC) smatra se također, jednim od glavnih puteva u

patogenezi dijabetičke retinopatije. Visoka razina glukoze, povećano oslobađanje RKV-a i

sinteza diacilglicerola povećavaju aktivnost PKC-a. PKC nadalje potiče produkciju brojnih

endotelnih čimbenika kao što su VEGF, IGF-1, TFG-β, ET-1, AT II; te aktivaciju NFB-a i

ekspresiju enzima NADPH-oksidaza. Stoga, aktivnost PKC može dovesti do različitih

promjena karakterističnih za dijabetičku retinopatiju, kao što su: povećana propusnost malih

krvnih žila, poremećaj u protoku krvi, promjena koncentracija hormona rasta i receptora

16

faktora rasta, poticanje neovaskularizacija, proliferacija endotela i apoptozu (99). Također,

aktivnost PKC uvjetuje i povećanu ekspresiju proupalnih gena, produkciju superoksidnih

aniona i nastajanje oksidativnog stresa. Uočeno je da je inhibicija aktivnosti PKC pomoću

aktivacije specifičnog inhibitora (LY53331) PKCβ dobar model za sprječavanje oksidativnog

stresa u dijabetesu (100, 101).

Hiperglikemija također potiče aktivaciju heksozaminskog metaboličkog puta, u kojem

se fruktoza-6-fosfat uz pomoć glutamina i fruktoza-6-fosfat aminotransferaze (GFAT)

pretvara u glukozamin-6-fosfat, koji se potom preko metabolita UDP-N-acetilglukozamina

(UDP-GlcNac) razgrađuje do završnih proizvoda proteoglikana, glikolipida i glikoproteina,

što istovremeno povećava ekspresiju gena za TGF- i PAI-1.

Gliceraldehid 3 fosfat dehidrogenaza (GAPDH) je višenamjenski protein s različitom

citoplazmatsko-membranskom i nuklearnom aktivnosti. Pod utjecajem RKV-a preusmjerava

sve glikolizirane metabolite na heksozaminski metabolički put i potiče proizvodnju UDP-N-

acetilglukozamina, što je podloga za mijenjanje intracelularnih čimbenika, uključujući i

transkripcijski faktor (88, 102). GAPDH se može mijenjati, izravnom glikozilacijom ili pod

utjecajem NO2, ali i pojačanom ekspresijom mangan SOD (MnSOD) (103). GAPDH, i

mehanizam djelovanja tog proteina, važan je u patogenezi dijabetičke retinopatije.

Oksidativni stres i mitohondrijska disfunkcija

Unutarstanična hiperglikemija povećava oksidaciju glukoze, a time raste i napon ili

voltažni gradijent mitohondrijskih membrana. Kada je kritični prag napona postignut, prijenos

elektrona unutar kompleksa III u lancu prijenosa elektrona je blokiran. Elektroni se

akumuliraju na koenzimu Q koji ih daruje molekularnom kisiku za stvaranje superoksidnih

aniona (103). Mitohondriji su glavni endogeni izvor superoksida. Višak proizvedenog

mitohondrijskog superoksida inicira kaskadu štetnih događanja putem proizvodnje vodikova

peroksida, hidroksilnih radikala i peroksinitrita, koji oštećuju makromolekule na mjestu ili u

blizini mjesta njihova formiranja (104). AGE, PKC, NFB i NADPH-oksidaza također potiču

stvaranje superoksidnih aniona i istodobno inaktiviraju enzime: GSH, superoksid dismutazu

(SOD) i katalazu uključene u antioksidativnu obranu. Nastali superoksidni anioni smanjuju

aktivnost eNOS, no pod utjecajem PKC-a i NFB-a pojačava se ekspresija inducirane NO

sintaze (iNOS). Konačan rezultat je pojačano stvaranje promijenjenog NO-a.

17

Superoksidni anioni i povišena koncentracija promijenjenog NO-a dovode do

povećanog stvaranja peroksinitrata, jednog od najjačih oksidansa u tijelu, koji oštećuje

deoksiribonukleinsku kiselinu (DNA). Oštećena DNA aktivira nuklearni enzim poli (DNA-

riboza) polimerazu koja utječe na gliceraldehid-3-fosfatdehidrogenazu, što ima za posljedicu

smanjenje koncentracije transportera za glukozu - GLUT4. Peroksinitrat utječe i na pojačano

stvaranje proupalnih citokina i adhezijskih molekula, važnih u nastanku endotelne disfunkcije

i vaskularnih komplikacija (102). Uočeno je da se razina AGE i superoksidnih aniona, uz

korelaciju s trajanjem dijabetesa, linearno povećava na kolagenu i bazalnoj membrani krvnih

žila (96).

Jedan od poremećaja uzrokovanih RKV-om u mitohondrijima je potiskivanje

obrambenih antioksidativnih sposobnosti, što uzrokuje pojačanu osjetljivost stanica mrežnice,

zbog oksidativnog stresa. Uočeno je da su SOD izoforma u mitohondrijima (MnSOD),

zajedno s GSH, smanjeni u dijabetesu, uz prisutnost velikih koncentracija glukoze

akumuliranih u mitohondrijima mrežnice (3). Mitohondrijska disfunkcija, također dovodi do

oštećenja mitohondrijske DNA. Oštećenja mitohondrijskih lipidnih membrana RKV-om

dovodi do propusnosti membrane i povećanog oticanja mitohondija. Unutarnji membranski

mitohondrijski prostor sadrži nekoliko topljivih proteina. Citokrom C koji se povećava u

dijabetesu, mogao bi imati važnu ulogu u apoptozi kapilarnih i mrežničnih stanica (Slika 2.).

18

Slika 2. Shematski prikaz utjecaja oksidativnog stresa, na metaboličke puteve i određene makromolekule u stanicama, važnih u razvoju dijabetičke retinopatije (3). 2.2. VASKULARNI ENDOTELNI FAKTOR RASTA U OKU

2.2.1. Povijesni pregled, etiologija

Isaac Michaelson 1948. godine iznosi da je u razvoju patološke angiogeneze ključni

događaj sinteza i oslobađanje angiogenog faktora pod nazivom "X Factor“ podrijetlom iz

ishemijskog tkiva (105). Godine 1971. Judah Folkman predstavlja ideju blokiranja

angiogeneze i antiangiogeni faktor, kao temeljno sredstva u liječenju raka (106). Godine

1983. Senger i suradnici pronalaze protein koji se izlučivao iz tumora zamorca, a bio je glavni

posrednik u angiogenezi. Zbog sposobnosti otkrivenog proteina, koja je dovodila do pojačane

„propusnosti“ krvnih žila, protein je dobio ime vaskularni faktor propusnosti (VPF) (107).

Godine 1989. Ferrara i suradnici identificirali su molekulu prisutnu u folikularnim stanicama

hiperglikemija ↓ SOD,GSH Antioksidati- vni enzimi

retinopatija

Poliolni put

Glukoza→ sorbitol→ fruktoza

AGE put

PKC put

Heksozaminski put

OKSIDATIVNI STRES

↑ ROS GSSG

Mitohondrijska disfunkcija: ↑ ROS, DNA oštećenje, membranska propusnost, citokrom C faktor ↓ MnSOD, GSH, obrambeni enzimi

↑ NF-кB, ROS, medijatori upale

↑ kaspaze

↑ apoptoza

↑VEGF

↑Neovaskularizacije

↑PlGF

19

hipofize goveda koja uvjetuje promjene i proliferaciju endotenih stanica, kao temelj nastajanja

novih krvnih žila i nazivaju je VEGF (108).

Daljnja istraživanja potvrđuju tezu da su VPF i VEGF isti proteini s dvama različitim

faktorima, koji uvjetuju stvaranje neovaskularizacija (109, 110). Godine 1992. dvije neovisne

studije upućuju na to da hipoksija sudjeluje u sintezi i porastu VEGF molekula (111, 112).

Nadalje, dokazi iz kliničkih studija potvrđuju ključnu ulogu VEGF-a u nastajanju

neovaskularizacija oka, dokazuju povezanost povišene razine VEGF-a, proliferacijske

retinopatije i dijabetesa (113, 114).

VEGF je protein koji ima važnu ulogu u procesima angiogeneze, tj. stvaranje novih

krvnih žila iz postojećih vaskularnih struktura, vaskulogeneze tj. „de novo“ formiranje krvnih

žila i limfangiogeneze (115, 116). VEGF je naziv za obitelj faktora rasta koji pripadaju

skupini trombocitnog faktora rasta (engl. platelet derived growth factor, PDGF). Faktori rasta

koji sudjeluju u patogenezi mrežnične angiogeneze su: VEGF, eritropoetin, inzulinu sličan

faktor rasta-1 (IGF-1), hepatocitni faktor rasta (HGF), angiopoietin i placentarni faktor rasta

(engl. placenta growth factor, PlGF) (5, 6).

VEGF skupina obuhvaća više različitih molekula: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C,

VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F. Na angiogenezu utječu: VEGF-A,-B,-D-E, te PlGF (117). Na

limfangiogenezu tj. stvaranje limfnih žila utječe VEGF-C. U razvoju i homeostazi neuralnih

stanica uključeni su VEGF-A, -B, i -C. Protein kodiran virusom (parapox virus) nalikuje na

VEGF i nazvan je VEGF-E (118). Sličan polipeptid nađen je i u otrovu nekih zmija i nazvan

je VEGF-F (117, 118). Glavni i najviše istražen faktor rasta je VEGF-A. Vrlo često ga

nazivamo samo VEGF (119). To je glikoziliran protein, 36 do 46 kDa, kodiran genom

VEGFA, smještenom u ljudi na kromosomu 6p21.3 (120). Sve izoforme proteina VEGF-A

sadrže peptidni signal za prepoznavanje VEGF-A receptora (kodiranog u prvih pet eksona). U

nekim izoformama, eksoni šest i sedam kodiraju heparin vezujuće jedinice, dok je u svim

izoformama prisutan ekson 8 preko kojega se kodiraju karboksilne terminalne jedinice za

prepoznavanje receptora. Različitim spajanjem mRNA nastaju različite izoforme VEGF. U

ljudi najčešće su opisivane izoforme VEGF121, VEGF121b, VEGF145, VEGF165, VEGF165b,

VEGF189, VEGF189b i VEGF206, a u glodavaca je nađena po jedna aminokiselina manje od

ljudske. U miša su najčešće opisivane 3 izoforme VEGF120, VEGF164 i VEGF188. Tri faktora

(SRp40, ASF/SF2 i SRp55) kontroliraju spajanje mRNA i nastanak VEGF-A, a pod utjecajem

su transformirajućeg faktora rasta (engl. transforming growth factor, TGF) i inzulinu sličnog

faktora rasta (engl. insulin-like growth factor, IGF). Izoforma VEGF165 najviše je povezana s

20

mrežničnim i koroidalnim neovaskularizacijama, zbog svojih snažnih bioloških i patoloških

sposobnosti. Treba naglasiti da VEGF165 ima važnu ulogu u patološkim neovaskularizacijama.

VEGF165 i VEGF121, su manje topljive molekule s naglašenijim difuzijskim sposobnostima, a

veće molekule VEGF189 i VEGF206 vezane su na membrane s autokrinim učinkom na stanice

(121 - 124).

2.2.2. Produkcija VEGF

Ishemija ili hipoksija uvjetuje povećanu produkciju VEGF. Tkivna hipoksija dovodi

do proizvodnje vezujućeg proteina nazvanog hipoksijom induciran faktor (HIF). HIF je

heterodimer, dvostruko spiralno zamotan protein koji se sastoji od dviju podjedinica:

konstitutivno-izražena HIF beta (HIFβ) podjedinice i faktorom rasta regulirane HIF alfa

(HIFα) podjedinice (125). U hipoksičnim stanicama HIFα ostaje stabilan, veže se s HIFβ,

nastaje dimer kao transkripcijski faktor (HIFα/β). Novostvoreni faktor veže se na VEGF gen i

inicira proces transkripcije. To vodi do stvaranja i akumuliranja mRNA VEGF molekule.

Posljedično povećano prepisivanje mRNA i smanjena degradacija mRNA na kraju dovodi do

nakupljanja međustaničnih VEGF molekula (126). Osim važne uloge u produkciji VEGF-a,

HIF je također odgovoran za povećanu produkciju eritropoetina u hipoksičnim stanica, što je

još jedna prilagodba na hipoksiju u tkivima (127). Niz drugih faktora transkripcije i

metaboličkih regulatora, kao što su ETS obitelj transkripcijskih faktora (128) i RKV (129),

mogu modulirati razinu ekspresije VEGF-a, kao i VEGF receptora.

Faktori rasta raznolika su skupina proteina s nekoliko zajedničkih obilježja. Većina faktora

rasta izlučuje proteine koji se vežu na površinske receptore: istih stanica (autokrino), u

neposrednoj blizini (parakrino) ili na udaljene (endokrine) stanice. Receptori faktora rasta

posjeduju unutarnju tirozin kinazu. Zbog njezine aktivnosti mijenja se unutarstanični signal

koji uzrokuje promjenu genske transkripcije. Faktori rasta, kao što im i samo ime govori

općenito potiču proliferaciju stanica.

2.2.3. Receptori za vaskularne endotelne faktore rasta

VEGF, vežući se za određene receptore, dimerizacijom i naknadnim prijenosom

signala uvjetuje nastanak angiogenih, odnosno limangiogenih promjena. VEGF ligandi vežu

se za tri osnovna receptora i dva koreceptora nazvanih neuropilini (NRP-1 i NRP-2) (130). Od

21

osnovnih receptora, VEGFR-1 i VEGFR-2 uglavnom su povezani s angiogenezom. Treći

primarni receptor, VEGFR-3, povezan je s limfangiogenezom (Tablica 2.).

Tablica 2. Vrste receptora za određene molekule VEGF i njihova osnovna aktivnost.

Receptor Aktivnost Molekule VEGF VEGFR1

Potiče razvoj (embriogeneze) angiogeneze

VEGF-A (VEGF) VEGF-B

VEGFR2

Posreduje većinu angiogenih učinaka VEGF

VEGF VEGF-C VEGF-D VEGF-E

VEGFR3

Potiče limfangiogenezu

VEGF-C VEGF-D

Endotelna VEGF ekspresija receptora varira među trima osnovnim receptorima;

VEGFR-2 je izražena na gotovo svim endotelnim stanicama, dok su VEGFR-1 i -3 selektivno

izraženi u različitim krvožilnim formacijama. Neuropilinski receptori (NP-1 ili NRP-1) i NP-2

(ili NRP-2) prikazuju veći afinitet vezanja različitih VEGF molekula, od primarnih receptora;

iako točne uloge NP-1 i NP-2 u angiogeneze nisu potpuno znane. Osim na površini endotelnih

stanica VEGF receptori mogu se naći i na tumorskim stanicama (106).

VEGFR1 ključni je receptor tijekom embriogeneze. Na taj receptor vežu se molekule

VEGF-A, ali mogu se vezati i molekule VEGF-B i PlGF (131). Pojavnost tog receptora ovisi

o fazi razvoja, fiziološkim i patofiziološkim uvjetima, te prisutnosti vrsta stanice. VEGFR2

posreduje u većini negativnih angiogenskih promjena, što uključuje: mikrovaskularnu

propusnost, endotelnu proliferaciju, migraciju endotelnih stanica te dugotrajni opstanak

endotelnih stanica s obiljem receptora za VEGF na površini (132). Također aktivacija i

signalizacija VEGFR2 može utjecati i na aktivaciju VEGFR1 (133, 134).

VEGFR3 potiče limfangiogenezu i nalazi se samo u limfnim endotelnim stanicama u

odraslih. Također postoje dokazi da VEGFR3 ima važnu ulogu u održavanju vaskularnog

integriteta modulirajući aktivnost VEGFR2. VEGFR3 aktivnost uočena je u stanicama

solidnih tumora, kao što je melanom. U tih tumora povišene su razine VEGF-C i VEGF-D,

što korelira s nađenim metastazama u okolnim limfnim čvorovima (135, 136).

Izraženiju pojavnost VGFR1 receptora nalazimo u monocitima i makrofagima,

VEGFR2 receptora u vaskularnim endotelnim stanicama, a VEGFR3 u limfnim endotelnim

22

stanicama. Dokazano je da se pojavnost navedenih receptora poklapaju, ali svaki od njih

pokazuje povećanu osjetljivost na određene uzroke (Slika 3.).

Slika 3. VEGF molekule i njihovi receptori. VEGF-B, PlGF vežu se za VEGFR1, NRP1/2 receptore; VEGF-A za VGFR1, VEGFR2 te NRP1/2; međusobnim djelovanjem aktiviraju fosforilaciju i aktivaciju signala, što uzokuje vaskulogenezu/angiogenezu. VEGF-C, VEGF-D vežući se za VEGFR3 potiču limfangiogenezu. (VEGF-B = eng. Vascular Endothelial Growth Factor- B, VEGF-A = eng. Vascular Endothelial Growth Factor- A, VEGF-C = eng. Vascular Endothelial Growth Factor- C, VEGF-D = eng. Vascular Endothelial Growth Factor- D, VEGF-E = eng. Vascular Endothelial Growth Factor- E, NRP1 = neuropilinski receptor tip 1, NRP2 = neuropilinski receptor tip 2, VEGFR1 = receptor za VEGF tip 1, VEGFR2 = receptor za VEGF tip 2, VEGFR3 = receptor za VEGF tip 3. Djelomično preuzeto s http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1471491411002097.

VEGF-signalni putevi aktiviraju se i reguliraju VEGF receptorima, koji se nalaze na

površini stanice vezani za membranu pod utjecajem aktivnosti tirozin kinaze. Pet vaskularnih

endotelnih faktora rasta, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGFD i VEGFE, vežu s različitim

afinitetom za tri VEGF receptora tirozin-kinaze (VEGFR) i dva NRP koreceptora te pokreću

homo-i heterodimer formaciju.

Vezanje VEGF sa srodnim VEGF receptorom u cis ili trans oblik na susjednim

stanicama potiče homo-ili heterodimerizaciju receptora. Posljedične promjene u građi

receptora dovode do izloženosti ATP veznog mjesta u području unutarstanične kinaze, što

uzrokuje aktivaciju tirozin kinaze automatski ili transfosforilacijom tirozinskog ostataka na

receptoru te daljnje provođenje signala. Tirozin fosforilacija strogo je regulirana putem

vaskulogeneza angiogeneza

limfangiogenezaa

stanična membrana

VEGF-E

23

defosforilacije fosfotirozin fosfataze (PTPs). Fosforilirani ostaci tirozina i ostaci karboksi-

terminal fosfotirozin aminokiselina, stvaraju vezna mjesta za unutarstanične signalne

posrednike sa SH2 područja, čime formiraju lanac signalizacije. Na kraju, cjelokupna

signalizacija rezultira aktivacijom niza kaskada, što pridonosi uspostavljanju bioloških

odgovora, kao što su: stanična proliferacija, migracija i organizacija u trima dimenzijama

(3D) za formiranje vaskularne cijev (137, 138) (Slika 4.).

Slika 4. Vezanje molekule faktora rasta i receptora, aktivacija tirozin kinaze, transfosforilacija; pokretanje signalizacije.

Djelomično preuzeto s http://www.kendricklabs.com/phosphotyrosine_western_blotting.htm

2.2.4. VEGF u dijabetičkoj retinopatiji

VEGF je važan čimbenik u razvoju proliferativne dijabetičke retinopatije, mijenjajući

propusnost retinalne kapilarne mreže, povećavajući fosforilaciju proteina koji su uključeni u

stvaranje jakih međustaničnih veza (zonula occludens) (139). Inducira aktivaciju mitogen-

aktiviranog proteina (MAP), što rezultira endotelnom proliferacijom. VEGF-stimulira

endotelne stanice za propuštanje matriks metaloproteinaza (MMP) i urokinazne, što dovodi do

razgradnje stanične opne i stanične migracije (140). Proliferacija i migracija endotelnih

stanica uvjetuje sintezu bazalnih membrana za novostvorene krvne žile. Stabilnost

novostvorenih kapilara postiže se pojačanom aktivnošću pericita i glatkih mišićnih stanica,

koje su regulirane PDGF faktorom rasta. VEGF izlučuje se unutar oka, iz retinalnih

pigmnetnih stanica, pericita, astrocita, Mullerovih stanica, stanica glije i endotelnih stanica.

Ekspresija VEGF molekule može biti povećana više od 30 puta u ishemijskim uvjetima (112,

113).

24

2.2.5. Anti-VEGF terapija

Zbog dokazane činjenice da VEGF djeluje na stvaranje neovaskularizacija, mnogo je

istraživanja provedeno kako bi se što više saznalo o mehanizmu nastanka i djelovanja VEGF-

a, u nadi da se, djelujući na određene momente, blokira nastanak i učinak VEGF-a te smanji

nastanak neovaskularizacija. Uočljiv je pozitivan učinak anti-VEGF molekula u procesima

vaskulogeneze i angiogeneze. VEGF molekula, odnosno njezina blokada, danas se postavlja

kao terapijski cilj.

Danas su u primjeni najraširenija anti-VEGF antitijela (ranibizumab, bevacizumab)

(141, 142) i inhibitori ekstracelularnog VEGF (pegaptanib sodium) (143). Inhibitor

transcelularne transkripcije (bevasiranib) je novostvorena molekula koja djeluje na VEGF

gen, blokirajući njegovu aktivnost. Učinjene su multicentrične probne studije o sigurnosti i

preliminarnoj učinkovitosti lijeka u bolesnika s dijabetičkom retinopatijom, odnosno

dijabetičkim makularnim edemom i lijek je uputio na pozitivan učinak, ali još uvijek nije u

širokoj primjeni (144). U posljednje vrijeme sve češće se spominju inhibitori VEGFR

ekspresije (aflibercept) (145). Istraživanje na animalnome modelu pokazalo je povoljan

učinak inhibitora intracelularne aktivacije signalne kaskade VEGF-a (midostaurin), ali

farmakodinamske studije upozorile su na neke negativne rezultate, temeljene na toksičnosti

midostaurina koje su se očitovale kroz mučninu, povraćanje i umor (146). Protein kinaza C β-

inhibitor (ruboxistaurin) je PKC beta izoforma - selektivnog inhibitora. To je lijek koji je

pokazao pozitivne učinke u liječenju težih oblika ne proliferativne dijabetičke retinopatije,

međutim lijek još uvijek nije dobio odobrenje za korištenje od USFDA (United States The

Food and Drug Administration) (147 - 149).

25

2.3. ŠEĆERNA BOLEST (DIABETES MELLITUS)

2.3.1. Definicija, povijesni pregled, suvremeno značenje

Dijabetes melitus (diabetes mellitus, DM) ili šećerna bolest kronični je poremećaj koji

zahvaća metabolizam ugljikohidrata, masti i bjelančevina. Karakteristično obilježje šećerne

bolesti je nepotpuni ili defektni odgovor izlučivanja inzulina, koji rezultira lošim

iskorištavanjem ugljikohidrata (glukoze) i posljedičnom hiperglikemijom. Posljedica

dugotrajne hiperglikemije u oboljelih osoba je progresivni razvoj specifičnih kasnih

komplikacija na malim i velikim krvnim žilama, živcima i bazalnim membranama različitih

tkiva i organa. Posebice važne komplikacije su na očima, bubrezima, perifernim i

autonomnim živcima te krvnim žilama srca, mozga i okrajina (150).

Najraniji opis ove bolesti zabilježen je na staroegipatskom Ebersovu papirusu iz

1550.g.pr.Kr. Također, na hinduističkim zapisima 400.g.pr.Kr. nalazi se opis dijabetičkog

sindroma karakteriziran „mokraćom slatkom kao med“. Arateus iz Kapadokije u 2.st.po.Kr.

prvi je spomenuo riječ dijabetes koja je označavala „rastapanje ili likvefakciju mesa i kostiju

u urinu“, te naveo njezine klasične simptome poliuriju, polifagiju i polidipsiju. Matthew

Dobson 1776. god., zagrijavanjem i isparavanjem urina te uočavanjem zaostalog kristalnog

materijala koji ima izgled i okus poput „smeđeg šećera“ dokazuje prisutnost šećera u urinu.

Godine 1797. John Rollo prvi je primijenio otkriće glukozurije u kvantitativnoj metaboličkoj

studiji. Postavio je sumnju na prekomjernu razinu šećera u krvi, koju su Wollaston i Chevreuil

potvrdili. Krajem 18.st. slijedio je niz eksperimenata radi boljeg razumijevanje osnovnih

metaboličkih procesa ljudske fiziologije. U 19. stoljeću Oskar Minkowski i Josef von Mering

svojim su eksperimentalnim pokusima na psima skrenuli pozornost na gušteraču kao žlijezdu

koja ima važnu ulogu u nastanku šećerne bolesti. Paul Langerhans je 1869.g. otkrio otočiće u

gušterači, koje je Gustave Leguesse 1893. g. nazvao Langerhansovim otočićima, a za koje se

smatralo da izlučuju neku tvar važnu za metabolizam ugljikohidrata. Taj je hipotetički

hormon 1909. g. Jean de Meyer nazvao inzulinom. Ubrzo zatim, 1921. g. Frederick Bantig i

Charles Best u Torontu su otkrili inzulin - hormon koji se stvara u beta stanicama

Langerhansovih otočića, te je 11. siječnja 1922. g. prvi bolesnik sa šećernom bolešću, 14-

godišnji Leonard Thompson, primio inzulin, što je dovelo do znatnog kliničkog poboljšanja

bolesti i obrata u liječenju i produljenju trajanja života oboljelih osoba. Primarnu strukturu

26

molekule inzulina riješio je Frederick Sanger 1955. god., što je omogućilo ciljano kemijsko

preoblikovanje molekule, čime su dobiveni pripravci inzulina visoke čistoće i slabe

antigeničnosti (151).

Diabetes mellitus najčešća je endokrinološka, metabolička bolest, a s obzirom na

široku paletu pratećih sistemskih komplikacija, predstavlja velik medicinski i javno

zdravstveni problem. Prema podacima Međunarodne dijabetičke federacije (engl.

International Diabetes Federation, IDF) za 2012. godinu, više od 371 milijun ljudi diljem

svijeta boluje od dijabetesa. Najveći broj dijabetičara je u životnoj dobi od 40 do 59 godina, a

183 milijuna ljudi živi s nedijagnosticiranim dijabetesom. 80% oboljelih pripadnici su nižeg i

srednjeg imovinskog statusa. U 2012. godini 471 milijun ljudi umrlo je od DM-a. Podaci

nadalje govore da je stopa smrtnosti u zemljama koje nedovoljno skrbe o tim bolesnicima

dvostruko veća, nego u razvijenim zemljama. Dijabetes nažalost ima tendenciju rasta.

Predviđa se da će učestalost dijabetesa u svijetu do 2030. godine porasti na više od 552

milijuna (152).

U Republici Hrvatskoj, prema podacima Centralnog zdravstvenog informacijskog

sustava (CEZIH) (153), u 2012. godini registrirano je 234,457 punoljetnih osoba s

dijagnozom dijabetesa. Od prijavljenih bolesnika njih 6,03% klasificirano je kao DM tip 1;

93,02%, DM tip 2; 0,87% kao drugi tip i 0.08% kao gestacijski dijabetes. Regulacija

glikemije bila je dobra (HbA1c<6,5%) u 26,91%, granično zadovoljavajuća

(6,5%<HbA1c<7,5%) u 36,23%, a loša (HbA1c>7,5%) u 36,86% bolesnika (154).

Diabetes mellitus danas je jedna od najčešćih kroničnih nezaraznih bolesti s vrlo

visokom prevalencijom i uzlaznim trendom u broju oboljelih u razvijenim zemljama. Njezine

kasne komplikacije glavni su uzrok povećanog morbiditeta i mortaliteta u oboljelih osoba, te

glavni razlog rastućeg opterećenja zdravstvenog proračuna troškovima dijabetesa (155).

2.3.2. Klasifikacija dijabetesa

Danas je u svijetu, pa tako i u Hrvatskoj, prihvaćena Klasifikacija šećerne bolesti

Svjetske zdravstvene organizacije (engl. World Health Organization, WHO) iz 1999. godine

(Tablica 3.) (156). Suvremena podjela dijabetesa temelji se na njezinoj etiologiji.

27

Tablica 3. Etiološka klasifikacija dijabetesa

Tip 1 (razaranje beta-stanica, obično vodi do potpunog nedostatka inzulina) autoimuni idiopatski Tip 2 (inzulinska rezistencija i/ili smanjeno lučenje inzulina) Ostali specifični tipovi nasljedni poremećaji beta-stanica nasljedni poremećaji djelovanja inzulina endokrinopatije bolesti gušterače lijekovi i kemikalije infekcije neuobičajeni oblici imunomodulirane bolesti drugi genetski sindromi trudnički dijabetes

Dijabetes tipa 1 i dijabetes tipa 2, dva su epidemiološki, etiološki i klinički najvažnija

oblika te bolesti. Dijabetes tipa 1 je rjeđi oblik bolesti, prisutan u 10-20% svih oboljelih.

Najčešći je u djece i adolescenata, iako se može javiti u svakoj životnoj dobi. Dijabetes tipa 2

znatno je češći oblik bolesti, prisutan u oko 80 do 90 % svih oboljelih, najčešće srednje i

starije životne dobi.

Dijabetes tipa 1 nastaje zbog udruženog djelovanja genetičkih, imunosnih i vanjskih

čimbenika koji dovode do razaranja beta stanica Langerhansovih otočića gušterače.

Mehanizmi odgovorni za destrukciju stanica otočića su: autoimuni procesi, genetička

osjetljivost i inzulti iz okoline; međusobno su isprepleteni i odgovorni za destrukciju stanica.

Danas znamo da ključnu ulogu u razvoju tog tipa dijabetesa, imaju autoimuni procesi, što

potvrđuje i prisutnost imunih biljega, protutijela, na pojedine elemente Langerhansovih

otočića i beta stanica u serumu čak 85 do 90 % tih bolesnika. Autoimuni procesi zbivaju se u

osoba s genetskom sklonošću, a na poticaj nekih čimbenika okoline, te je u tih osoba često

zapažena i povećana učestalost drugih autoimunih bolesti (Gravesova, Addisonova bolest,

Hashimotov tiroiditis, autoimuni gastritis). U ostalih 10 do 15 % bolesnika razvija se tzv.

idiopatski tip bolesti, bez dokaza autoimuosti (157).

28

Dijabetes tipa 2 heterogeni je poremećaj obilježen poremećajem sekrecije inzulina.

Sekrecija inzulina odgođena je ili relativno insuficijentna zbog viška glukoze te nesposobnosti

perifernog tkiva da odgovori na inzulin (rezistencija prema inzulinu). Inzulinska rezistencija

kao dio poremećaja pojavljuje se rano u tijeku bolesti i često je povezana s genetskom

predispozicijom i različitim čimbenicima okoline: pretilošću, smanjenom tjelesnom

aktivnošću, životnom dobi, trudnoćom i primjenom nekih lijekova. Dugotrajna hiperglikemija

i povišena razina slobodnih masnih kiselina također efektom „glukotoksičnosti” i

„lipotoksičnosti” smanjuju inzulinsku osjetljivost u perifernim tkivima, a nepovoljno djeluju i

na sekreciju inzulina u beta stanicama. Istovremeno s rezistencijom ili neovisno o njoj u tih se

bolesnika pojavljuju i poremećaji u sekreciji inzulina, bilo kao nesposobnost beta stanica da u

dovoljnoj mjeri povećaju produkciju inzulina, bilo kao poremećaji ritma njegova lučenja na

poticaj glukozom (158).

2.3.3. Kronične komplikacije dijabetesa

Kronične komplikacije dijabetesa posljedica su kronične hiperglikemije.

Hiperglikemija je promotor aktivnosti raznih mehanizama koji dovode do poremećaja i

komplikacija na velikim i malim krvnim žilama, živcima i bazalnim membranama različitih

tkiva izazivajući tako komplikacije na očima, bubrezima, perifernim i autonomnim živcima te

krvnim žilama srca, mozga i okrajina. Iako dijabetičke vaskularne komplikacije mogu

zahvatiti gotovo svaki organ u tijelu, histopatološke promjene zbog te bolesti ipak su

specifične za pojedine organe. Kronične komplikacije šećerne bolesti podijeljene su na

mikrovaskularne komplikacije, kao što su nefropatija, dijabetička retinopatija i neuropatija te

makrovaskularne komplikacije, kao što su koronarna arterijska bolest, cerebrovaskularna

bolest i bolest perifernih krvnih žila. Ostale su komplikacije dijabetičko stopalo, seksualna

disfunkcija, gastrointestinalne komplikacije te komplikacije na koži, kostima i zglobovima.

Kasne komplikacije šećerne bolesti glavni su uzrok povećanog morbiditeta i mortaliteta

oboljelih osoba. Nastanak i učestalost komplikacija ovise o tipu dijabetesa i životnoj dobi u

kojoj se pojavio, a povećavaju se s trajanjem bolesti i dobi bolesnika (159).

29

2.4. DIJABETIČKA RETINOPATIJA

2.4.1. Definicija i suvremeno značenje

Dijabetička retinopatija (DR) specifična je mikrovaskularna komplikacija šećerne

bolesti u oku zbog poremećaja građe malih krvnih žila mrežnice. Hiperglikemija je

metabolička oznaka dijabetesa i dovodi do izraženog staničnog oštećenja. Višak glukoze

pokreće lanac metaboličkih događaja koji kulminiraju hiperprodukcijom reaktivnih kisikovih

spojeva, odnosno povišenim stanjem oksidativnog stresa. Isti nastaju zbog povećane

aktivnosti poliolnog i heksozaminskog puta, povećanog stvaranja glikoziliranih bjelančevina -

AGE produkata i aktivacije protein kinaze C. Te metaboličke promjene rezultiraju mnoštvom,

tkivno specifičnih funkcionalnih oštećenja, povezanih s dijabetesom. Vaskulopatije su

središnji poremećaj.

Dijabetička retinopatija danas je jedan od vodećih uzroka slabog vida i sljepoće u

svijetu (160). Uvidom u provedene nacionalne studija, sljepoća je zabilježena u prosjeku od

4,8%, a slabiji vid u 23,9% bolesnika s dijabetesom tipa 2 liječenih inzulinom, nakon 10

godina trajanja dijabetesa. Bolesnici s dijabetičkom retinopatijom imaju 25 puta veću

vjerojatnost da postanu slijepi od ljudi koji nemaju taj metabolički poremećaj (161). Smatra se

da je u SAD-u i drugim razvijenim zemljama dijabetička retinopatija vodeći uzrok

novonastale sljepoće među stanovništvom u dobi od 20 do 74 godine (2). Dijabetička

retinopatija najčešće pogađa osobe tijekom njihova radnog razdoblja života izazivajući na taj

način invaliditet i smanjenje kvalitete života oboljelih, ali i velike financijske troškove za

nacionalne fondove (162).

2.4.2. Mikroskopska građa oka

Oko je parni organ smješten u očnim dupljama orbitama. Funkcija mu je da svjetlosne

informacije prenese na mrežnicu, gdje dolazi do pretvaranja fotona svjetlosti u neuralni kod.

Oko se sastoji od triju ovojnica: vanjska - sastoji se od rožnice (cornea) i bjeločnice (sclera);

srednja - sadrži krvne žile i sastoji se od žilnice (chorioidea), šarenice (iris) i zrakastog tijela

(corpus ciliare) i unutarnja - od mrežnice (retina) gdje su smješteni receptori (čunjići i

štapići), kao i drugi neuroni (Slika 5.).

30

Slika 5. Shematski prikaz anatomije oka. Djelomično preuzeto s http://www.optometrie.nl/over-ogen.

2.4.2.1. Mrežnica (retina)

Mrežnica je fotorecepcijski dio oka i neposredni je izdanak središnjeg živčanog

sustava. Izgleda kao tanka prozirna opna. Očnu šupljinu ispunjava staklasto tijelo (corpus

vitreum), sastavljeno uglavnom od vode. Staklasto tijelo ostvaruje napetost unutar oka,

odnosno oku daje tonus, a time uvjetuje da i mrežnica bude uvijek jednako napeta.

Funkcionalno, mrežnica je izgrađena iz triju temeljnih staničnih zona: sloj

fotoreceptora, sloj bipolarnih i sloj ganglijskih stanica i dvije sinaptičke zone između njih:

vanjski i unutarnji pleksiformni sloj. Od pet glavnih tipova retinalnih neurona, tri su

neposredno uključena u hijerarhijski prijenos vidnih informacija. To je sloj fotoreceptora ili

prvi neuron vidnog puta, bipolarne stanice ili drugi neuron vidnog puta i ganglijske stanice ili

1. vanjski očni mišić 2. bjeloočnica 3. žilnica 4. mrežnica 5. vidni živac 6. slijepa pjega 7. makula 8. krvna žila mrežnice

9. granična membrana prednjeg vitreusa 10. cilijarno tijelo 11. stražnja očna sobica 12. prednja očna sobica 13. zjenični otvor 14. šarenica 15. rožnica 16. leća

31

treći neuron vidnog puta. Dva preostala tipa su horizontalne i amakrine stanice koje služe kao

interneuroni u lokalnim neuronskim krugovima mrežnice (163).

Histološki, mrežnica je podijeljena u 10 slojeva, koje možemo lako analizirati

svjetlosnom mikroskopijom (Slika 6.).

Slika 6. Mikroskopska građa mrežnice (Hollwich)

1 - retinalni pigmentni epitel, 2 - sloj štapića i čunjića, 3 - vanjska granična membrana, 4 - vanjski nuklearni sloj, 5 - vanjski pleksiformni sloj, 6 - unutarnji nuklearni sloj, 7 - unutarnji pleksiformni sloj, 8 - sloj ganglijskih

stanica, 9 - sloj živčanih vlakana, 10 - unutarnja granična membrana. Preuzeto iz: Mikroskopska građa oka. U: Čupak K (ed.) Oftalmologija. Zagreb

Zbog složene građe i funkcionalno visoko diferentne aktivnosti, mrežnica je

metabolički vrlo aktivno neuralno tkivo s iznimno velikom potrošnjom kisika (6,5 cm3/min

/1g tkiva) i ukupnim mrežničnim protokom krvi od 44,0 ± 13,33 μL/min. Mrežnica ima

vlastiti sustav krvnih žila. Žilnica je tanka membrana sastavljena uglavnom od ogranaka

oftalmičke arterije i bogate kapilarne mreže u središnjem dijelu. Bruchovom membranom

priliježe uz retinalni pigmentni epitel. Vanjski slojevi mrežnice opskrbljuju se krvlju preko

kapilarnog sloja žilnice (lat. lamina choriocapillaris choroideae). Koriokapilaris je odgovoran

za prehranu prvog neurona. Građen je od guste mreže fenestriranih kapilara. Unutarnji slojevi

mrežnice opskrbljuju se preko mrežnične kapilarne mreže, sazdane od ogranaka središnje

mrežnične arterije (lat. arteria centralis retinae, ACR). Mrežnična kapilarna mreža odgovorna

32

je za prehranu drugog i trećeg neurona vidnog puta (163). Kapilarna mreža rjeđa je u

perifernim dijelovima mrežnice, a najgušća u području žute pjege (lat. macula lutea).

Centralni dio fovee promjera 300-500 m je bez kapilara. To je tzv. fovealna avaskularna

zona (FAZ). Mrežnične kapilare malog su promjera od 3,5 do 6 m. Građene su od endotelnih

stanica čvrsto poveznih okludentnim zonulama bazalnih membrana i pericita. ACR ulazi u

očnu jabučicu kroz završetak vidnog živca tzv. „glavu vidnog živca“ (lat. papila nervi optici,

PNO). Ulaskom u očnu jabučicu u PNO grana se u dva dihotomna ogranka, nazalni i

temporalni.

Dvije čvrste barijere dijele mrežnicu i unutarnji dio oka od krvi. To su unutarnja i

vanjska krvnomrežnična barijera (engl. blood - retinal barrier, BRB). Endotelne stanice,

okludentne zonule među endotelnim stanicama kapilara i ostalih krvnih žila mrežnice

predstavljaju unutarnju, a retinalni pigmentni epitel (RPE) vanjsku krvnomrežničnu barijeru.

Periciti svojim izdancima djelomično obuhvaćaju bazalnu membranu i dolaze u vezu s

endotelnim stanicama, imaju kontraktilnu funkciju, osiguravaju vaskularnu stabilnost i

kontroliraju proliferaciju endotelnih stanica. U mrežnici je odnos endotelnih stanica i pericita

1:1. U fiziološkim uvjetima funkcionalno i strukturno intaktne endotelne stanice i periciti

osiguravaju vaskularnu homeostazu. Krvožilni sustav mora biti netaknut kako bi se provodila

normalna metabolička funkcija.

2.4.2.2. Staklasto tijelo (corpus vitreum)

Staklasto tijelo (corpus vitreum) je hidrofilni, transparentni gel, sferičnog oblika koji

ispunjava 2/3 vitrealne šupljine, volumena 4 ml. Okruženo je psudomembranom tzv.

hijaloidejom, koja predstavlja kondenzaciju kolagenih fibrila. To je kortikalni dio staklastog

tijela ili vitreusa i daje staklastom tijelu formu, odnosno oblik (Slika 7.). Nuklearni dio

staklastog tijela sastoji se od temeljne supstancije vode (99%), a ostatak je mješavina

kolagenih vlakana (vlaknastih fibrilarnih struktura proteinske građe - vitrein ili vitrezin),

hijaluronske kiseline, hijalocita (mezenhimalne stanice), anorganske soli i lipida.

33

Slika 7. Nuklerani dio staklastog tijela čiste, prozirne, gelaste forme koji prianja uz prednji segment oka.

Preuzeto s http://www.oculist.net/downaton502/prof/ebook/duanes/pages/v7/v7c016.html

Prosječna koncentracija proteina zdravog staklastog tijela je 0,5 mg/mL. Sastoji se

uglavnom od albumina (60 do 70%). Ostale su komponente globulini, faktori koagulacije,

faktori komplemenata i proteini niske molekularne težine. Cilijarno tijelo osigurava stalnu

izmjenu tekućine, difuzijom, ultrafiltracijom i aktivnim transportom vodene tekućine u

prednjem dijelu oka. Proteini se mogu akumulirati u staklastom tijelu, lokalnim izlučivanjem

(npr. glikoprotein), filtracijom iz krvi (npr. albumini) ili difuzijom iz okolnih tkiva. Zbog

bliskog kontakta staklastog tijela (kortikalni dio staklastog tijela, hijaloideja) i unutarnjeg

sloja mrežnice (završni izdanci Müllerovih stanica, unutarnja granična membrana), fiziološka

i patološka stanja mrežnice utječu na koncentraciju proteina i biokemijski sastav staklastog

tijela. Taj kontakt dodatno je ojačan makromolekulama: fibronektina, laminina, kondroitina,

proteoglikana, kolagena (Slika 8.). Izmjena tvari između krvi i staklastog tijela odvija se samo

na površini i polagano, jer se hijaloideja ponaša kao difuzijska membrana. Metabolička

funkcija temelji se na difuzijskoj izmjeni tvari između susjednih tkiva. Staklovina opskrbljuje

mrežnicu glukozom i fosforom, a od nje dobiva CO₂ i mliječnu kiselinu. Različite

vitreoretinalne bolesti izazivaju promjene u cjelokupnom sastavu proteina unutar staklastog

tijela, osobito kad je krvnomrežnična barijera poremećena (164) .

34

Slika 8. Prikaz kontakta staklastog tijela (kortikalni dio staklastog tijela, hijaloideja) i unutarnjeg sloja mrežnice (završni izdanci Müllerovih stanica, unutarnja granična membrana).

Djelomično preuzeto s http://www.symptomaticvma.com/disease/symptomatic-vma/

Spomenuto je da prosječna koncentracija proteina u zdravom staklastom tijelu iznosi

0,5 mg/mL i sastoji se uglavnom od albumina (60 do 70 %). Fiziološka i patološka stanja

mrežnice utječu na koncentraciju proteina i biokemijski sastav staklastog tijela. U uvjetima

narušene krvnomrežnične barijere mijenja se biokemijski sastav staklastog tijela i

koncentracija proteina. U DR zabilježene su povišene koncentracije oksidiranih proteina.

Produkti uznapredovale oksidacije proteina (engl. Advanced oxidation protein

products, AOPP) naziv je za derivate oksidiranih proteina, najviše albumina, i sve se češće

opisuje kao novi marker oksidativnih oštećenja. Prvi ga je opisao Witko-Sarsat i sur. 1996.

god. (165).

AOPP nastaju tijekom oksidativnog stresa, putem aktiviranja kloriranih oksidanata,

uglavnom hipoklorne kiseline i kloramina (nastali posredovanjem mijeloperoksidaze u

aktiviranim neutrofilima). Ljudski albumin glavni je multi fukcionalni protein seruma, koji je

podvrgnut izmjenama u patološkim uvjetima. Glikooksidacijski procesi, neuravnotežen odnos

oksidansa i antioksidansa te prisutnost konstantne upale, npr. u dijabetesu, rezultiraju

izraženim oksidativnim stresom i povećanim stvaranjem AOPP molekula. S druge strane,

AOPP intenzivira metaboličke poremećaje kod dijabetesa i potiče napredovanje vaskularnih

komplikacija. Stoga, ne čudi spoznaja da su koncentracije AOPP-a znatno više kod dijabetesa,

posebice tipa 2 (dva puta), u odnosu prema zdravim osobama. Razina AOPP-a povezana je s

lošijom kontrolom glikemije, duljinom trajanja bolesti, dislipidemijom. AOPP je danas

prihvaćen kao marker oksidativnog stresa, a studije govore da bi trebalo razmisliti o uvođenju

AOPP-a kao markera za praćenje razvoja šećerne bolesti i njezinih komplikacija (166).

Kortikalni dio staklastog tijela

Mullerove stanice

35

2.4.3. Klasifikacija dijabetičke retinopatije

Danas je valjana ETDRS (engl. Early Treatment Diabetic Retinopathy Study)

klasifikacija dijabetičke retinopatije, preinačena prema prvoj klasifikaciji DR donešene na

skupu „Airlie House Symposium“ 1968. godine (167). Prema novoj klasifikaciji, DR se dijeli

na neproliferativnu i proliferativnu dijabetičku retinopatiju, te dijabetičku makulopatiju. Pri

tome različiti stadiji bolesti mogu postojati istovremeno, npr. teška neproliferativna

retinopatija i klinički značajan makularni edem.

1. Neproliferativna dijabetička retinopatija (NPDR) je rani stadij bolesti u kojem su

mikrovaskularne promjene ograničene samo na slojeve mrežnice. Klinički uočljive promjene

u tom stadiju su mikroaneurizme, intraretinalna točkasta, mrljasta i plamičasta krvarenja,

retinalni edem, tvrdi i meki „cotton wool" eksudati, venske abnormalnosti i intraretinalne

mikrovaskularne abnormalnosti (IRMA-e).

Prema izraženosti tih promjena NPDR se dijeli na četiri stupnja (Tablica 4.):

Tablica 4. Klasifikacija NPDR

I Blaga neproliferativna dijabetička retinopatija

- prisutnost barem jedne mikroaneurizme ili pojedinačnih mikroaneurizmi i točkastih intraretinalnih krvarenja.

II Umjereno teška neproliferativna dijabetička retinopatija

- umjeren broj mikroaneurizmi i intraretinalnih krvarenja u najmanje jednom, ali manje od četiri kvadranta, uz prisutnost pojedinih mekih eksudata, venskih i intraretinalnih mikrovaskularnih abnormalnosti. Rizik razvoja tog stupnja u PDR tijekom 5 godina je 33%.

III Teška neproliferativna dijabetička retinopatija

- prisutnost jedne od promjena: 1. izražena intraretinalna krvarenja i mikroaneurizme u sva četiri kvadranta, 2. venske abnormalnosti u dva ili više kvadranata ili 3. IRMA u najmanje jednom kvadrantu. Rizik razvoja u PDR tijekom 5 godina je 60%.

IV Vrlo teška neproliferativna dijabetička retinopatija - prisutnost dvije ili više promjena teške neproliferativne dijabetičke retinopatije, ali bez elemenata proliferativne bolesti; 75% očiju s tim stupnjem retinopatije tijekom jedne godine razvije PDR.

36

2. Proliferativna dijabetička retinopatija (PDR) je kasni stadij bolesti u kojem zbog

rasprostranjenih zona kapilarnih okluzija i posljedične ishemije mrežničnog tkiva dolazi do

razvoja novih krvnih žila na površini mrežnice i optičkom disku. Stvaraju se fibrovaskularne

membrane s tendencijom širenja prema staklovini. Nove krvne žile ili neovaskularizacije u

području optičkog diska (engl. new vessels on the disc, NVD) i na ostalim dijelovima

mrežnice (engl. new vessels elsewhere, NVE) izgledaju poput nježnih gusto razgranatih

grančica. Neovaskularizacije u svom razvojnom ciklusu prolaze tri faze: rast, fibrozu i

regresiju. U početku se pojavljuju nježne nove krvne žile s minimalno vezivnog tkiva.

Tijekom sazrijevanja novostvorene žile postupno se uvećavaju i granaju, a vezivo koje ih

obavija umnaža se stvarajući pritom tzv. fibrovaskularne membrane, koje se najčešće šire uz

površinu mrežnice ili izdižu u staklovinu. S vremenom se nove krvne žile povlače, a iza njih

ostaju slabo vaskularizirane, ali vrlo čvrste vezivne membrane. Prema prisutnosti i

uznapredovalosti tih promjena PDR se dijeli na dva stupnja (Tablica 5.).

Tablica 5. Klasifikacija PDR

I Rana proliferativna dijabetička retinopatija

- prisutnost proliferativnih promjena manjih od rizičnih II Visokorizična proliferativna dijabetička retinopatija

- prisutnost jedne od lezija:

NVD ≥ 1/3 - 1/2 površine optičkog diska NVD praćena krvarenjem u staklovinu i/ili preretinalnim krvarenjem NVE ≥ 1/2 površine optičkog diska praćena krvarenjem u staklovinu i/ili preretinalnim krvarenjem

37

2.4.4. Strukturne promjene u dijabetičkoj retinopatiji

Dugotrajno izlaganje visokim koncentracijama glukoze uzrokuje akutne i reverzibilne

promjene u staničnom metabolizmu te posljedično dugoročne i nepovratne promjene u

stabilnim makromolekula. Osim toga, i prije nego što se bolest otkrije, stanice mrežnice

reagiraju na hiperglikemičke uvjete mijenjajući metabolizam. Dijabetička retinopatija je

mikrovaskularna komplikacija dijabetesa u kojoj je primarno zahvaćena cirkulacija i stanice

neurosenzornog sloja mrežnice, koje se opskrbljuje krvlju iz središnje retinalne arterije.

Stijenka mrežničnih kapilara obložena je vezivnim tkivom - bazalna membrana, na koju

priliježu periciti i endotelne stanice. Periciti su vrsta glatkih mišićnih stanica. U izravnom su

kontaktu s endotelnim stanicama, imaju potpornu ulogu u stijenci kapilara i pomažu u

metaboličkoj ravnoteži endotelnih stanica. Te su funkcije osnova za pravilan i uravnotežen

rad mrežničnog kompleksa. Suradnjom s drugim stanicama mrežnice (astrocita i Müllerovih

stanice) periciti štite endotelne stanice i u uvjetima hiperglikemije. Dijabetičku retinopatiju

karakterizira gubitak pericita nakon čega slijedi porast propusnosti krvnih žila i progresivna

vaskularna okluzija.

Gubitak pericita rezultira praznim prostorom na stijenci mrežnične krvne žile.

Endotelne stanice pokušavaju popraviti nastalo oštećenje proliferacijom prema unutarnjoj

stijenci krvne žile. U toj fazi promjene se klinički ne mogu vizualizirati. Međutim, patološka

progresija bolesti rezultira pojavom kapilarnih okluzija, mrežničnih manjih krvarenja i

„žućkastih depozita“ (tvrdi lipidni eksudati). Tvrdi lipidni eksudati su biokemijski lipoproteini

podrijetlom iz plazme i lokalizirani najčešće u vanjskom pleksiformnom sloju mrežnice.

Rjeđe mogu biti smješteni i ispod mrežnice, izazivajući pritom degeneraciju fotoreceptora.

Kapilarne okluzije uzrokuju u pojedinim dijelovima mrežnice hipoksiju, koja je okidač za

propadanje staničnog vaskularnog integriteta (acelularne kapilare) i razvoj abnormalnih

mrežničnih kapilara. Kao odgovor na nastalu hipoksiju, funkcionalno očuvane kapilare oko

zona bez perfuzije postaju dilatirane i hipercelularne, stvarajući pojedinačne i/ili grupirane

mikroaneurizme, najranije klinički vidljive i za mrežnicu specifične lezije. Arteriolarna

okluzija čini još intenzivniju ishemiju mrežnice negoli kapilarna okluzija. Takva ishemija

izaziva akutni edem retinalnih aksona i očituje se bjelkastim opacifikacijama unutarnjih

slojeva mrežnice tzv. meki eksudati (engl. cotton wool), tamnim mrljastim krvarenjima, te

promjenama širine venskog lumena. Daljnjom progresijom ishemije kapilare u

korespodentnom ishemičkom području postaju dilatirane i urastaju u zone bez perfuzije

38

stvarajući intraretinalne mikrovaskularne abnormalnosti (IRMA-e), uz prisutnost venskih

dilatacija i abnormalnosti. Takve promjene jasan su znak ishemije i predisponirajući su faktori

za razvoj proliferativne dijabetičke retinopatije (168). Brojne stanice mrežnice, potaknute

opsežnom ishemijom, oslobađaju različite faktore rasta (VEGF, FGF, TGF-, IGF-1, PDGF) i

citokine (IL-1, IL-6, IL-8), čija se koncentracija u mrežnici i staklovini u hipoksičnim

uvjetima dramatično povećava (169, 170). Endotelne stanice mrežničnih venula i arteriola na

svojoj površini posjeduju mnogo receptora visokog afiniteta za pojedine faktore rasta, što u

hipoksičnim uvjetima dovodi do proliferacije endotelnih stanica i stvaranja novih krvnih žila.

Brzina razvoja novih krvnih žila razlikuje se među bolesnicima. U nekih se gusto razviju

tijekom samo nekoliko tjedana, dok u drugih rastu vrlo sporo i godinama ne napreduju. Nove

krvne žile ili neovaskularizacije prate i proliferacija i kontrakcija vezivnog tkiva, stvaranje

fibrovaskularnih membrana, te posljedično brojne komplikacije.

Zbog kronične hiperglikemije dolazi i do poremećaja u propusnosti krvnomrežnične

barijere, koja ima važnu ulogu u reguliranju homeostatskog mikrookoliša u mrežnici.

Krvnomrežnična barijera sastoji se od dvaju dijelova, vanjskog i unutarnjeg. Vanjski dio

krvnomrežnične barijere čine stanice retinalnog pigmentnog epitela čvrsto povezane

okludentnim zonulama, koje priliježu na vanjsku graničnu membranu (Bruchova membrana).

Bruchova membrana razdvaja senzorni dio mrežnice od RPE, propušta proteine malih

molekularnih masa, a u patološkim uvjetima i upalne stanice. Pigmnetni sloj mrežnice, koji je

jedinstven u organizmu, građen je u bazalnom dijelu od stanica koje oblikuju nabore bogate

mitohondrijima, što upućuje na njegovu ulogu u aktivnom transportu. Zbog svega navedenog,

slijedi da Bruchova membrana i RPE imaju važnu ulogu u transportu hranjivih tvari iz krvi u

vanjske dijelove mrežnice. Unutarnji dio krvnomrežnične barijere čine endotelne stanice

čvrsto vezane okludentnim zonulama u retinalnim kapilarama. Astrociti, Müllerove stanice i

periciti pridonose pravilnom funkcioniranju unutarnjeg dijela krvnomrežnične barijere.

Poremećajem unutarnje krvnomrežnične barijere na razini kapilarnog endotela i vanjske

krvnomrežnične barijere na razini retinalnog pigmentnog epitela dolazi do propuštanja

tekućine i sastojaka plazme u okolnu mrežnicu (171). Nekoliko je mogućih mehanizama

kojima se objašnjava poremećaj propusnosti krvnomrežničnih barijera, to su: 1. slabljenje i

otvaranje okludentnih zonula koje se nalaze između endotelnih stanica retinalnih kapilara, 2.

abnormalno propuštanje kroz same endotelne stanice nastankom fenestracija ili pojačanim

transportom staničnim vezikulama, 3. slabljenje i otvaranje okludentnih zonula koje se nalaze

između stanica retinalnog pigmentnog epitela. Zbog navedenih promjena stijenke krvnih žila

39

se zadebljavaju, postaju krute i sklone pucanju, a utječu i na sposobnost bazalnih membrana

da na sebe vežu razne oblike faktore rasta (VEGF, FGF, TGF-, IGF-1, PDGF). Kao

posljedica abnormalne propusnosti krvnomrežnične barijere dolazi do nakupljanja fluida i

sastojaka plazme unutar slojeva mrežnice i do nastanka mrežničnog edema. Morfološki

mrežnični edem može biti fokalni i difuzni. Fokalni edem je lokalizirano područje zadebljanja

mrežnice primarno izazvano propuštanjem iz mikroaneurizmi ili rjeđe iz intraretinalnih

mikrovaskularnih abnormalnosti. Difuzni edem izazvan je opsežnim propuštanjem iz

dilatiranih i abnormalno propusnih kapilara, te kroz retinalni pigmentni epitel.

Ishemija, hipoksija i sve prethodno opisane promjene na kraju dovode do nastanka

neovaskularizacija, što je osnovno obilježje proliferativne dijabetičke retinopatije. Te

novostvorene kapilare su krhke i imaju tendenciju krvarenju. Također mogu proliferirati u

staklasto tijelo oka, a njihova fibrozna proliferacija u/na mrežnici uzrokuje ožiljkaste

promjene i trakcije koje dovode do ablacije mrežnice s vitreoretinalnim fibrovaskulanim

proliferativnim membranama.

2.4.5. Dijagnostičke metode dijabetičke retinopatije

Dijagnoza DR postavlja se pažljivim kliničkim pregledom očne pozadine direktnom

i/ili indirektnom oftalmoskopijom, a funkcionalni status korioretinalnoga žilnog sustava

procjenjuje se primjenom fluoresceinske angiografije. U posljednjem desetljeću sve veću

važnost u dijagnostici mrežničnih bolesti i praćenju odgovora na liječenje imaju kolor

fotografija očne pozadine, optička koherentna tomografija i druge novije dijagnostičke

slikovne metode. Oftalmoskopija je promatranje očne pozadine, očnog dna ili fundusa oka.

Indirektna oftalmoskopija ili oftalmoskopija u obrnutoj slici danas je apsolutno

najraširenija metoda pregleda očne pozadine, koja je zbog svojih prednosti gotovo potpuno

potisnula direktnu oftalmoloskopiju. U kliničkoj praksi indirektna oftalmoskopija najčešće se

provodi pomoću biomikroskopa i jakih plus (60 do 90 D) bikonveksnih/asferičnih

nekontaktnih ili kontaktnih leća.

Kolor fotografija očne pozadine ima važnu ulogu u praćenju i stupnjevanju

mrežničnih promjena. Vizualizacija i zapis kolor fotografijom, očne pozadine, uvjetovali su i

nastanak standarda za stupnjevanje dijabetičke retinopatije, temeljenim na standardnim

fotografijama očne pozadine (Slika 9.)

40

Slika 9. Kolor fotografija urednog fundusa. Digitalna fundus kamera Carl Zeiss, arhiv KB Sv. Duh, Klinika za očne bolesti

Najpoznatiji način fotografiranja utemeljen je na modificiranoj Airlie House

klasifikaciji dijabetičke retinopatije i korišten u brojnim multicentričnim istraživanjima, tzv.

„zlatni standard” Early Treatment Diabetic Retinopathy Study (ETDRS) (172). Fotografiranje

je stereoskopsko i prema tom standardu potrebno je učiniti mnogo fotografija određenog polja

očne pozadine za procjenu DR-a. Drugi, i u praksi prihvatljiviji standard slikanja očne

pozadine i stupnjevanje DR-a je standard „EURODIAB IDDM“ Complications Study (170).

Utemeljen je na „zlatnom” standardu ETDRS i modificiranoj klasifikaciji dijabetičke

retinopatije Airlie House, ali stupnjevanje DR-a temelji se na samo dvjema standardnim

fotografijama u boji dobivenim slikanjem 2 standardna 45° polja fundusa (makularno polje i

disk/nazalno polje). Standard EURODIAB obuhvaća pet stupnjeva promjena: 0 - bez

retinopatije, 1 - blaga NPDR, 2 - umjereno teška NPDR, 3 - teška i vrlo teška NPDR, 4 -

stanje nakon laser fotokoagulacije u makuli i/ili po periferiji retine, 5 - PDR. Fotografije

fundusa u standardu EURODIAB nisu stereoskopske, stoga se makularni edem ne graduira

(Slika 10.). U oba standarda nalaz lošijeg oka određuje stupanj retinopatije.

žuta pjega (makula)

izlazište vidnog živca (PNO)

41

A B Slika 10. Prikaz proliferativne dijabetičke retinopatije kolor fotografijama A: prikaz centralnog područja stražnjeg pola s krvarenjima i edemom u makuli (zeleni krug), B: prikaz nazalnog dijela medioretine s neovaskularizacijama (crna strelica) i proliferiranim fibroznim tkivom ( crni krug). Digitalna fundus kamera Carl Zeiss, arhiv KB Sv. Duh, Klinika za očne bolesti

Fluoresceinska angiografija (FAG) metoda je kojom se ispituju krvotok mrežnice i

žilnice, kao i tkivne promjene u cijelom korioretinalnom kompleksu. FAG je osobita vrsta

angiografije, koja se koristi emisijskim fenomenom luminescencije intravenski injicirane boje

za razliku od ostalih angiografskih metoda koje su apsorpcijskog tipa. Osnova

luminiscencijskog fenomena temelji se na svjetlosno induciranoj, energetskoj ekscitaciji

elektrona molekule fluoresceina plavim svjetlom (465 do 490 nm) što dovodi do njihova

preskakanja u višu energetsku razinu. Iz pobuđenog stanja elektroni se vraćaju, prelaze

ponovno na nižu energetsku razinu te višak otpuštene energije emitiraju u obliku svjetlosne

energije valne duljine 520 do 530 nm, što nazivamo fluorescencijom i nalazi se u vidljivom

dijelu spektra. Pretraga se izvodi injiciranjem fluoresceina u sistemski krvotok najčešće putem

kubitalne vene. Fluorescein se veže za proteine plazme te krvotokom dolazi do oka.

Nakon injekcije kontrasta potrebno je od 8 do 12 sekundi da bi kontrast stigao do oka tzv.

period „ruka - oko“. Praćenjem dinamike faza punjenja te pražnjenja krvnih žila mrežnice i

korioretinalnog kompleksa u cjelini omogućava nam uočavanje patoloških procesa na očnoj

pozadini koji se očituju kao hipofluorescencije ili hiperfluorescencije. Hipofluorescencija

predstavlja vaskularni defekt punjenja krvnih žila ili blokadu fluorescencije. Vaskularni

defekt punjenja može nastati na razini mrežničnih krvnih žila (npr. okluzija središnje

retinalne arterije ili vene te njihovih ogranaka), na kapilarnoj razini (npr. šećerna bolest), na

razini krvnih žila vidnog živca (npr. ishemijska optička neuropatija, kolobom vidnog živca,

jamica vidnog živca) te na razini žilnice. Blokada fluorescencije može nastati kao posljedica

preretinalnih lezija (npr. preretinalno krvarenje, fibroza, mijelocitoza), intraretinalnih lezija

42

(npr. krvarenja, pigment, tvrdi eksudati, edem), subretinalnih lezija (npr. krvarenja, pigment,

upala, tekućina) te kao posljedica različitih depozita (npr. vitiliformna degeneracija, fundus

albipunctatus). Hiperfluorescencija nastaje zbog abnormalnost krvnih žila koja dovodi do

propuštanja fluoresceina iz krvnih žila (kapilarno, aneurizmatsko, neovaskularno) ili zbog

postojanja defekta retinalnog pigmentnog epitela, kroz koji postaje uočljivo pozadinsko

fluoresceiranje žilnice.

Nepropusnost stijenke mrežničnih krvnih žila i retinalnoga pigmentnog epitela, te

difuzna permeabilnost koriokapilarisa za molekule fluoresceina, specifične su histološke

atribucije koje čine temeljni postulat FAG-a. Taj postulat predstavlja ishodište za provedbu

pretrage, kao i interpretaciju nalaza (173) (Slika 11.).

A B

Slika 11. Angiografski prikaz vaskularnih abnormalnosti unutar zona izražene hipoksije. A: u proliferativnoj dijabetičkoj retinopatiji, B: u vrlo teškoj neproliferativnoj dijabetičkoj retinopatiji. Digitalna fundus kamera Carl Zeiss, arhiv KB Sv. Duh, Klinika za očne bolesti Fluoresceinska angiografija daje nam korisne informacije o integritetu

krvnomrežnične barijere, mrežničnim vaskularnim abnormalnostima te prikazuje topografske

odnose uočenih patohistoloških zbivanja s njihovom dinamikom u korioretinalnom

kompleksu. Kliničke indikacije za fluoresceinsku angiografiju su vaskularne okluzivne bolesti

(npr. okluzija središnje retinalne vene, okluzija središnje retinalne arterije), abnormalne krvne

žile (aneurizme, teleangiektazije), senilna makularna degeneracija (engl. age related macular

degeneration, ARMD), cistični makularni edem, dijabetička retinopatija, centralna serozna

retinopatija, upalne bolesti mrežnice, distrofije te tumori stražnjeg segmenta oka.

Optička koherentna tomografija (OCT) je neinvanzivna slikovna metoda koja

prikazuje poprečne slojeve mrežnice i optičkog živca s visokom rezolucijom od 3 do 10

mikrona. Temelji se na principima Michelsonove interferometrije. Metoda je analogna

43

ultrazvuku, ali se koristi svjetlosnim valom umjesto zvučnim. Signali se usklađuju te stvaraju

dvodimenzionalnu sliku morfološkog presjeka mrežnice. Niskokoherentno infracrveno svjetlo

putem fiberoptika dolazi do djelitelja snopa („beam splitter“). Jedan snop usmjeren je prema

retini, dok je drugi usmjeren prema referentnom zrcalu. Svjetlo koje putuje prema mrežnici

reflektira se od struktura u različitim slojevima mrežnice. Udaljenost između djelitelja snopa

te referentnog zrcala kontinuirano se mijenja. U trenutku izjednačavanja udaljenosti izvora

svjetla te mrežničnog tkiva i udaljenosti izvora svjetla te referentnog zrcala, reflektirano

svjetlo s mrežničnog tkiva te referentnog zrcala interferira. Interferencija se detektira te

prevodi signal (B-scan). Brojni se signali usklađuju te stvaraju dvodimenzionalnu sliku

morfološkog presijeka mrežnice. Optička koherentna tomografija upotrebljava se za

identifikaciju i praćenje makularnog edema, makularnih ruptura, makularnih cista,

vitreoretinalnih trakcija, epiretinalnih membrana, odvojenosti/odignuća retinalnoga

pigmentnog epitela te koroidalnih neovaskularizacija (Slika 12.). Daje kvantitativne

informacije o debljini slojeva makule (prikazane numerički te topografskim mapama) koje su

važne u praćenju progresije bolesti, odnosno učinkovitosti terapije kod makularnog edema te

koroidalnih neovaskularizacija. U prikazu makularnog edema vidljivo je difuzno zadebljanje

neurosenzornog sloja mrežnice s hiporeflektivnim prostorima koji odgovaraju cističnim

promjenama mrežnice. Epiretinalna membrana vidi se kao hiperreflektivni sloj iznad

unutarnjeg sloja mrežnice. OCT prikazuje hiperreflektivno zadebljanje retinalnoga

pigmentnog epitela često povezano s makularnim edemom. Subfovealno nakupljanje tekućine

prisutno kod centralne serozne retinopatije vidljivo je kao hiporeflektivan, homogeni, tamni

prostor ispod neurosenzornog sloja mrežnice (172, 173).

A B

Slika 12. Promjene u centralnom području makule prikazane optičkom koherentnom tomografijom. A: disgrupacija retinalnog pigmentnog epitela i cistični prostori unutar neurosenzornog sloja, B: atrofija retinalnog pigmentnog epitela i obilan edem unutar neurosenzornog sloja Optička koherenta tomografija Copernicus Optopol, arhiv KB Sv. Duh, Klinika za očne bolesti

44

Danas se sve više spominje i novija neinvazivna metoda u dijagnosticiranju

dijabetičke retinopatije, fundus autofluorescencija (FAF). Metoda se temelji na

autofluorescencama RPE-a i molekula nastalih zbog oksidativnih oštećenja u sloju

fotoreceptora, koje se akumuliraju u sloju RPE-a (npr. lipofuscin). RPE i okolne molekule

emitiraju svjetlost specifičnih valnih duljina, koje se inertpretiraju u aparatu i bilježe kao

dvodimenzionalna slika morfološkog presjeka mrežnice, s izmjeničnim hipodenznim i

hiperdenznim zonama.

FAF se koristi u identifikaciji i praćenju mnogih bolesti mrežnice. Mnoge studije

upućuju na korist te metode u praćenju promjena dijabetičke retinopatije, osobito

dijabetičkoga makularnog edema (174).

45

3. MATERIJALI I METODE

3.1. ETIČKA NAČELA

Ovo istraživanje odobrilo je Etičko povjerenstvo Kliničke bolnice „Sveti Duh“ 21.

lipnja 2012. Istraživanje je provedeno na Klinici za očne bolesti „Sveti Duh“ u skladu sa svim

propisanim i primjenjivim smjernicama. Cilj smjernica je osigurati pravilnu provedbu

istraživanja i sigurnost osoba koje su sudjelovale u ovom znanstvenom istraživanju

uključujući: Osnove dobre kliničke prakse, Helsinšku deklaraciju, Zakon o zdravstvenoj

zaštiti Republike Hrvatske (NN 121/03) (175) i Zakon o pravima pacijenata Republike

Hrvatske (NN 169/04) (176).

Svaki je ispitanik bio detaljno informiran o planu i svrsi istraživanja, te je svojim

potpisom potvrdio pristanak na sudjelovanje u istraživanju.

3.2. UZORCI U ISTRAŽIVANJU

U ovom istraživanju eksperimentalno smo određivali koncentracije VEGF-a u

uvjetima oksidativnog stresa i prisutnost antioksidativnih obrambenih mehanizama, te njihov

dinamički i fiziološki odnos unutar dvaju tjelesnih medija: staklastog tijela i seruma

prikupljenih od probranih bolesnika.

Mjerene su tri skupine parametara: (1) koncentracije faktora oksidativnog stresa, (2)

koncentracije antioksidativnih enzima, (3) vaskularni endotelni faktor rasta.

U istraživanje je bilo uključeno 88 osoba oba spola. Dijabetes i proliferativnu

dijabetičku retinopatiju imalo je 37 bolesnika, a skupina od 51 bolesnika bila je bez

metaboličkog poremećaja i činila je kontrolnu skupinu. Životna dob obiju skupina ispitanika

bila je između 27 i 84 godine. Dijagnoza dijabetesa tipa 2 temeljila se na kriterijima Svjetske

zdravstvene organizacije (156). Proliferativna dijabetička retinopatija klasificirana je prema

modificiranoj Airlie House klasifikaciji dijabetičke retinopatije (167). Kontrolnu skupinu

činili su bolesnici s anatomskim vitreoretinalnim poremećajima (ruptura makule, ablacija

retine, epiretinalne membrane) kojima je operativni zahvat bio jedina terapijska mogućnost.

Svi su bolesnici regrutirani i redovito kontrolirani na Klinici za očne bolesti „Sveti Duh“ u

Zagrebu.

46

Prije uključivanja u istraživanje svakom potencijalnom ispitaniku učinjen je detaljan

oftalmološki pregled sa svim potrebnim dijagnostičkim metodama.

Oftalmološka obrada je uključivala:

1. Pregled vidne oštrine: centralna vidna oštrina ispitana je pomoću standardnih optotipa na

udaljenosti od 6 metara (Snellenovi optotipi brojevi i optotipi slova), a izražena razlomkom i

dekadskim sustavom, pri čemu 6/6 = 1,0 označava normalnu vidnu oštrinu.

2. Mjerenje intraokularnog tlaka: nakon ukapavanja lokalnog anestetika i fluoresceina

(0,5% fluorescein-Na) u oba oka, Goldmann aplanacijskim tonometrom (Haag-Streit

Applanation Tonometer AT900®) izmjeren je očni tlak.

3. Pregled prednjeg segmenta oka: obavljen je na biomikroskopu s procjepnom svjetiljkom

(Haag-Streit: Slit Lamp BQ 900®).

4. Binokularni pregled očne pozadine: obavljen je nakon što su ukapane midrijatičke kapi

(0,5% tropicamid i 5% phenylephrine), na istom biomikroskopu indirektnom

oftalmoskopijom pomoću nekontaktnih i kontaktnih leća (VOLK SuperField NC, VOLK

Super 66 , VOLK SuperQuad 160, VOLK EquatorPlus )

5. Slikanje očne pozadine oba oka: na digitalnoj fundus kameri (Zeiss, VISUCAMlite Digital

Camera).

6. Fluoresceinska angiografija i optička koherentna tomografija: učinjena je kod ispitanika

koji su imali prozirne ili tek blaže izraženu inhomogenciju optičkih medija (Slika 13.,14.).

Nakon što su utvrđeni osnovni anamnestički podatci, opći status, detaljno proveden

oftalmološki pregled i dodatne dijagnostičke obrade, pomno su odabrani ispitanici za

istraživanje.

A B

Slika 13. Proliferativna dijabetička retinopatija s parcijalnim hemoftalmusom, trakcijskom ablacijom, fibroznim vitreoretinalnim proliferacijama, te pratećim vaskularnim abnormalnostima. A-kolor fotografija; B-fluoresceinska angiografija. Digitalna fundus kamera Carl Zeiss, arhiv KB Sv. Duh, Klinika za očne bolesti

47

A B

Slika 14. A: OCT prikaz trakcijskog efekta epiretinalne membrane. B: OCT prikaz cističnog makularnog edema u dijabetičkoj retinopatiji. Optička koherenta tomografija Copernicus Optopol, arhiv KB Sv. Duh, Klinika za očne bolesti

U istraživanje nisu bili uključeni bolesnici koji su prethodno liječeni intravitrealnom

steroidnom ili anti-VEGF terapijom, bolesnici koji su prethodno bili podvrgnuti

vitreoretinalnom operativnom zahvatu te bolesnici s drugim bolestima mrežnice (senilna

makularna degeneracija, okluzija središnje mrežnične arterije i/ili vene i ogranaka). Također u

istraživanje nisu bili uključeni bolesnici koji su na sistemskoj terapiji kortikosteroidima ili

citostaticima. Svi bolesnici s loše reguliranim kardiovaskularnim statusom, trudnice i žene u

kojih se sa sigurnošću nije mogla isključiti mogućnost trudnoće, također nisu bili uključeni u

ovo istraživanje.

3.2.1. Postupak pri uzimanju uzorka

Uzorci staklovine (1,5-2,0 ml) dobiveni su u Klinici za očne bolesti KB „Sv. Duh“,

standardom vitreoretinalnom aspiracijskom procedurom pars plana vitrektomijom. Zahvat je

obavljao isti vitreoretinalni kirurg s visoko specijaliziranim aparatom, vitrektomom „Acurus

800“ (Alcon, Forth Worth, TX) u operacijskoj dvorani s dodatnom specijaliziranom pratećom

opremom.

Pars plana vitrektomija naziv je kirurškog zahvata, kojim se obavljaju operacije na

stražnjem segmentu oka; staklovini i mrežnici (Slika 15.). Naziv dolazi od stražnjeg dijela

cilijarnog tijela, krajnjeg perifernog dijela mrežnice i bjeloočnice koji se naziva „pars plana“ i

48

ne koristi u funkciji vida. Nalazi se 3,5 mm posteriorno od limbusa rožnice. Pristup kroz pars

planu omogućuje najmanju mogućnost ozljede strukture oka.

Slika 15. Pars plana vitrektomija Djelomično preuzeto s http://www.allaboutvision.com/conditions/vitreoretinal-procedures.htm

Kirurški se oko otvara na tri mjesta, koja su od 3 do 5 mm udaljena od limbusa

rožnice, a otvori su transskleralne rupice, kroz koje se uvode „troakari“- uske metalne

cjevčice različitih promjera. Ovisno od očekivane zahtjevnosti kirurškog postupka biraju se

troakari malih (0,45 mm), srednjih (0,6 mm) ili najvećih promjera (0,9 mm). Te metalne

cjevčice služe kao uvodnici, jer se kroz njihov lumen u oko uvode instrumenti. Prvi troakar,

koji se gotovo u pravilu postavlja na skleri u donjem temporalnom kvadrantu stacionarne je

namjene, te služi isključivo za nadomještanje volumena sadržaja koji se uklanja iz oka i kroz

njega se uvodi infuzijska kanila. Kroz kanilu u oko se uvodi posebno pripremljena otopina,

različiti tekući kirurški alati (viskoelastici, teška voda) ali isto tako zrak i neki drugi -

ekspanzivni plinovi, kao i silikonsko ulje, radi postizanja endotamponade u oku. Druge dvije

sklerotomije otvaraju se u gornjim kvadrantima na pozicijama 2 - 3 h, te 9 - 10 h i kroz njih se

uvode troakari koji služe za kirurške manipulacije, uvođenje različitih instrumenata i hladnog

svjetla, kojim se osvjetljava unutrašnjost oka za vrijeme operacije.

Nakon postavljanja svih triju troakara, a prije bilo kakvih drugih manipulacija, osobito

prije nego što se u oko pusti otopina, uzimao se uzorak staklovine (1 - 2 ml). Kako se isti

uzorak ne bi razrijedio infuzijskom tekućinom, isprva se kroz infuzijsku kanilu propuštao

filtrirani zrak za supstituciju izgubljenog volumena. Staklovina se uklanjala posebnim nožem,

koji se uvodio kroz jedan od dvaju manipulativnih troakara, a ima dvostruku funkciju.

Istovremeno se nožem režu fibrile staklovine i aspirira se materijal u sterilnu špricu, kako bi

se sačuvao uzorak. Nakon uzete potrebne količine uzorka, isti se materijal nastavljao

vitrektom svjetlo

mrežnica

staklasto tijelo

49

sakupljati u kasetu za otpadne tekućine na aparatu, što je dio standardne kirurške procedure

(Slika 16.).

Uzorak je iz sterilne šprice prebačen u sterilnu „Eppendorf“ epruvetu s poklopcem i

poslan u laboratorij na daljnju obradu i pohranu.

U laboratoriju, u roku do sat vremena uzorci su centrifigirani (2800 × g na 4°C 20

min). Nakon centrifugiranja supernatanti staklastog tijela odvojeni su i pohranjeni u

začepljene epruvete na - 80°C do trenutka analize.

A B

Slika 16. Kirurški postupak- pars plana vitrektomija. A: prikaz uvedenih troakara /žuti čepići/. B: postupak aspiracije staklastog tijela.

Mikroskop Carl Zeiss, arhiv KB Sv. Duh, Klinika za očne bolesti

Uzorci venske krvi u količini od 4 ml, prikupljeni su od istih ispitanika na dan

operacije. Uzorci su jednokratno bili izvađeni uobičajenom metodom za laboratorijske

pretrage u epruvete s „crvenim čepom“ i nakon pola sata centrifugirani (3500 okr/ 10 min).

Nakon centifugiranja odvojen serum pohranjen je u začepljene epruvete na - 80°C do analize.

3.3. METODE ISTRAŽIVANJA I ISPITIVANI PARAMETRI

3.3.1. Određivanje produkata uznapredovale oksidacije proteina

Produkti uznapredovale oksidacije proteina (engl. Advanced oxidation protein

products, AOPP) su proteini nastali tijekom oksidativnog stresa, kroz reakciju kloriranih

oksidanasa s proteinima plazme. Za analizu je korišten kvanitativni ELISA test OxiSelect™

AOPP Assay Kit (Cell Biolabs, Inc., SAD). Svi uzorci seruma i staklastog tijela su

50

neposredno prije analize razrijeđeni otopinom za razrijeđivanje koja se nalazila u sklopu

pribora s reagensom.

Od tako pripremljenih uzoraka pipetirano je 200 µL, seruma i staklastog tijela u jažice

mikrotitarske ploče uz kontrole i standarde (kao kalibrator), koji su također prethodno

pripremljeni prema uputama proizvođača testa. Prema protokolu koji se nalazio u sklopu

pribora s reagensom, u sve jažice pipetirano je 10µL inicijacijske otopine, zatim je sve

zajedno lagano promiješano i inkubirano 5 minuta na rotacijskoj ploči. Nakon 5 minuta,

dodano je u svaku jažicu 20µL tzv.“stop otopine“ („Stop Solution“) te sve zajedno ponovno

promiješano. Nakon miješanja odmah su očitane apsorbancije na 340 nm, na

spektrofotometrijskom čitaču mikrotitarskih ploča, MRX (Dynex Technologies GmbH,

Njemačka). Količina AOPP određena je na temelju dobivenih apsorbancija, iz kalibracijske

krivulje koja je rađena na temelju koncentracija prethodno pripremljenog standarda i

dobivenih pripadajućih apsorbancija. Koncentracije AOPP prikazane su u µM.

3.3.2. Određivanje lipidnine peroksidacije

Lipidna peroksidacija složena je lančana reakcija razgradnje (oksidacije) višestruko

nezasićenih masnih kiselina koje nalazimo u sastavu svih bioloških membrana koje su jako

osjetljive na oksidativne učinke. Lipidna hidroperoksidaza kao produkt lipidne peroksidacije

kvantitativni je pokazatelj oksidacijskih oštećenja u patofiziološkim poremećajima.

ELISA pribor s reagensima, Lipid Hydroperoxide Assay (Cayman Chemical

Company, SAD) mjeri hidroperoksid izravno koristeći redoks reakcije s ionima željeza.

Test se temeljio na kvantitativnoj ekstrakcijskoj metodi, kojom se u kloroformu izdvojila

lipidna hidroperoksidaza. Takvim postupkom uklonile su se sve moguće interferencije

uzrokovane vodikovim peroksidom ili endogenim ionima željeza u uzorku i omogućena je

dostatna osjetljivost i pouzdanost testa za lipidnu peroksidaciju.

U sklopu ELISA pribora nisu se nalazile otopine kloroforma i metanola. Otopine

kloroforma i metanola morale su se prije uporabe deoksigenirati puštanjem mjehurića

nitrogena kroz otopine, 30 minuta. Potom je bilo potrebno ohladiti deoksigenirani kloroform

na 0°C i spremiti na led za ekstrakciju uzorka. Za daljnju analizu bilo je potrebno pomiješati

kloroform i metanol u omjeru 2:1.

51

Prije analize, prema uputama proizvođača, otopljeni su reagensi u sklopu pribora.

Zamrznuti uzorci, odmrzavali su se stajanjem na sobnoj temperaturi, te po potrebi dodatno

centrifugirali.

Za analizu je bilo potrebno 500 µL uzorka (seruma i staklastog tijela u odvojenim

staklenim epruvetama). U epruvete s uzorcima dodana je ista količina otopine „LPO Assay

Extract R“ (pripremljene prema uputama proizvođača) i 1 ml hladne otopine kloroforma te

zajedno promućkano. Mješavina je centrifugirana 1500 x g, 5 minuta na 0°C. Nakon

centrifugiranja pokupljen je sloj kloroforma oko 700 µL s dna epruvete, odvojen u drugu

epruvetu i pohranjen na led. Sloj kloroforma zapravo je ekstrakt uzorka koji se dalje koristio

kao uzorak u postupku testiranja.

Protokol testa

Pipetirano je 500 µL ekstrakta kloroforma i uzorka u označene epruvete, potom u

označene epruvete pipetirano je još 450 µL mješavine kloroform-metanol. Kromogen je

pripremljen miješanjem jednakih količina pripremljenih otopina proizvođača „ FTS Reagent 1

i 2“, te promućkan, misleći pritom na potrebnu količinu mješavine, s obzirom na to da je po

testu (za kontrole, supstrat i uzorke) bilo potrebno 50 µL mješavine dva reagensa (1 i 2)

kromogena.

Pipetirano je u svaku epruvetu 50 µL mješavine kromogena, pri čemu je došlo do pojave

ljubičaste boje. Promućkan je sadržaj svake epruvete i začepljen aluminijskom folijom. Potom

su ostavljene začepljene epruvete 5 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon 5 minuta, mjerena je

apsorbancija unutar svake epruvete na 500 nm koristeći se kivetom od 1 ml. Mješavina

kloroform-metanola koristila se kao slijepa proba. Za mjerenje apsorbancije LPO rabio se

spektrofotometar Spectro UVD-3500 (Labomed Inc, SAD).

Nakon mjerenja apsorbancija uzoraka i prethodno pripremljenih razrjeđenja standarda,

izračunata je srednja vrijednost apsorbancija za sve standarde i uzorke, te su očitane

vrijednosti s kalibracijske krivulje. Prema formuli koju je naveo proizvođač izračunali smo u

svakom uzorku koncentraciju LPO u µM.

3.3.3. Određivanje malondialdehid

Produkti lipidne peroksidacije određeni su mjerenjem koncentracije malondialdehida

(MDA), koji je jedan od glavnih proizvoda peroksidacije lipida. Malondialdehid reagira s

tiobarbiturnom kiselinom i proizvodi kromogen koji se može mjeriti spektrofotometrijski. Za

52

analizu je bilo potrebno 200 µL pripremljenog uzorka seruma ili staklastog tijela koje smo

pomiješali s 200 µL 8,1%-tne vodene otopine SDS-a, 1,5 mL 20%-tne vodene otopine octene

kiseline (pH 3,5) i 1,5 mL 0,81%-tne vodene otopine tiobarbiturne kiseline. Smjesa se

zagrijavala 60 minuta pri temperaturi od 95ºC. Ohlađenim uzorcima mjerila se apsorbancija

pri 532 nm i 600 nm spektrofotometrom Libro S22 (Biochrom, Ujedinjeno Kraljevstvo).

Ukupna apsorbancija odredila se po formuli Atotal = A532 - A600. Za stvaranje kalibracijske

krivulje koristio se niz poznatih koncentracija tetrametoksipropana, a koncentracija MDA

izračunata je iz baždarnog dijagrama. Koncentracije malondialdehida prikazane su u

nmol/mL.

3.3.4. Određivanje vaskularnog endotelnog faktora rasta

Vaskularni endotelni faktor rasta (VEGF, VEGF-165) izmjeren je u svim uzorcima

ELISA kitom VEGF (human), EIA kit (Enzo Life Sciences, SAD). Svi reagensi iz pribora

pripremljeni su prema uputama proizvođača. Uzorci su odmrznuti na sobnoj temperaturi te

razrijeđeni puferom koji je u sklopu ELISA pribora. Pribor je sadržavao mikrotitarske ploče s

monoklonskim antitijelima na ljudski VEGF imobiliziran na dnu jažica. Na monoklonska

antitijela veže se VEGF iz uzorka i standarda. Rekombinantni humani VEGF standard nalazio

se u sklopu pribora. Nakon kratke inkubacije, višak uzorka ili standarda se ispirao, zatim su se

dodala poliklonska antitijela na ljudski VEGF označena s enzimom hren peroksidaze. Tako

obilježena antitijela vezala su se na ljudski VEGF, vezan na dnu jažice. Nakon kratke

inkubacije, višak obilježenih antitijela se ispirao i dodao se supstrat. Supstrat je reagirao s

obilježenim antitijelima. Nakon kratke inkubacije, zaustavila se enzimska reakcija te se

pojavilo obojenje koje se očitavalo na 450 nm. Izmjerena optička gustoća je izravno

proporcionalna koncentraciji ljudskog VEGF u standardima ili uzorcima. Koncentracija

VEGF-a (pg/L) u uzorcima očitavala se iz kalibracijske krivulje na temelju izmjerenih

optičkih gustoća za svaki uzorak.

3.3.5. Određivanje glutationa i oksidiranoga glutationa

Koncentracija glutationa određena je modificiranom metodom koju je prvi opisao

Tietze (1969). Ukratko, u 96 pločica dodali smo 20 μL uzorka (seruma ili vitreusa),

53

prethodno tretiranog s 40 μL 0,035M HCl. U uzorak dodali smo 40 μL 10 mM 5-5'-dithiobis

[2]-nitrobenzojevom kiseline (DTNB, Ellman reagens). Dobivenu smjesu inkubirali smo 10

minuta. U tom vremenu DTNB je reagirao s GSH i stvarao kromogenske komplekse:

tionitrobenzoičnu kiselinu (TNB) i konjugirani glutation i tionitrobenzoičnu kiselinu (GS-

TNB). Apsorbanciju dobivenih kromogena izmjerili smo na 412 nm u/ili na ELISA plate

readeru (BIORAD) i zabilježili je kao A 0. U tu smjesu nadalje je dodano 100 μL reakcijske

smjese (9980 μL od 0,8 mM NADPH i 20 μL glutation reduktaze, 0,2 UML-1) i očitavala se

apsorbancija na 412 nm svake minute tijekom pet minuta. Rezultate smo izračunali iz

standardne krivulje razrjeđenja poznatih koncentracija reduciranoga glutationa (GSH).

Izmjerene vrijednost iskazane su, kako protokol nalaže, u mmol/mL. Oksidirani glutation

(GSSG) mjerili smo na isti način, samo smo u uzorak prije mjerenja dodali vinilpiridin, a

baždarna krivulja napravljena je od niza različitih koncentracija glutationa.

3.3.6. Određivanje superoksid dismutaze

Aktivnost SOD-a izračunava se iz postotka inhibicije reakcije oksidacije ksantina (ΔA

/ min ≈ 0025), koja stvara superoksid anion koji je supstrat za SOD enzim prisutan u

uzorcima. 25 μL nerazrijeđenog uzorka pomiješali smo s 1,45 mL reakcijske smjese

(citokrom C, 0,05 mm; Xantin, 1 mm pomiješana u omjeru 10:1 s dodatak DTNB). U

dobivenu mješavinu, dodano je 20 μL ksantin oksidaze 0,4 Umlˉ¹. Reakciju smo mjerili

tijekom 3 minute na 550 nm. Apsorbancija i postotak inhibicije izračunali su se iz

kalibracijske krivulje, napravljene s različitim razrjeđenjima SOD enzima. Vrijednosti SOD-a

iskazali smo u U/mL.

3.4. STATISTIČKA OBRADA

U obradi podataka koristili smo se softverskim paketom Statistica, verzija 12

(StatSoft, Inc. (2013) www.statsoft.com). Razina statističke značajnosti postavljena je na

0,05. Vrijednosti mjerenih varijabli nominalnom ili ordinalnom ljestvicom prikazali smo

kontingencijskim tablicama s brojem i udjelom ispitanika u svakoj kategoriji. Vrijednosti

varijabli mjerenih intervalnom ljestvicom prikazali smo deskriptivno, što je uključivalo

54

srednju vrijednost, standardnu devijaciju, 95% intervale pouzdanosti, medijan i interkvartilni

raspon.

Statističko testiranje odnosa među varijablama provelo se nakon testiranja normalnosti

razdiobe za varijable mjerene intervalnom ljestvicom. S obzirom na veličinu uzorka,

normalnost se testirala dvama uobičajenim testovima, Klogomorov-Smirnovljevim i Shapiro-

Wilkovim. Statističko testiranje provelo se hi-kvadrat testom za nominalne varijable.

Usporedba dviju skupina (kontrole i PDR skupine) provela se Mann-Whitneyevim testom za

ordinalne varijable i intervalne varijable koje ne slijede normalnu razdiobu, a Studentovim t-

testom za intervalne varijable koje slijede normalnu razdiobu. Usporedba intervalnih varijabli

među više od dvije skupina provela se s ANOVA (normalna razdioba) odnosno s Kruskal-

Wallis ANOVA (odstupanje od normalne razdiobe) testom. Korelacije među intervalnim

varijablama ispitala se Pearsonovom korelacijom (normalna razdioba), odnosno

Spearmanovom korelacijom (odstupanje od normalne razdiobe). Korelacije vezanih varijabli

(mjerenja različitih parametara u istog ispitanika) provela se Wilcoxonovim testom za parne

uzorke, uz pretpostavku odstupanja od normalnosti razdiobe, a Studentovim t-testom za parne

uzorke u slučaju normalne razdiobe.

3.5. ISTRAŽIVANJE NA LABORATORIJSKIM ŽIVOTINJAMA 3.5.1. Etička načela dijela eksperimenata koji su provedenni na laboratorijskim životinjama.

Istraživanje na laboratorijskim životinjama provelo se u skladu s etičkim principima,

koji vrijede u Republici Hrvatskoj, Zakonom o zaštiti životinja i Pravilnikom o uvjetima

držanja pokusnih životinja, posebnim uvjetima za nastambe i vrstama pokusa (NN 135/06,

NN 37/13, NN 55/13, NN 125/13), prema direktivi EU 2010/63/EU, te prema Vodiču za

držanje i korištenje laboratorijskih životinja (Guide for the Care and Use of Laboratory

Animals, DHHS Publ. (NIH) # 86–23 1985.; revised eight edition 2011.).

Pokus na laboratorijskim životinjama odobren je od Bioetičkog povjerenstva

Prirodoslovno-matematičkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu.

55

3.5.2. Eksperimentalne životinje

Za eksperimentalni dio istraživanja dijabetičke retinopatije upotrijebili smo štakorski

model dijabetesa induciranog aloksanom. Za utvrđivanje posljedica oksidativnog stresa u

staklastom tijelu i serumu, istraživanje je provedeno na srođenim albino štakorima soja Y-59,

starosti 3 do 4 mjeseca, mase 300 do 350 g iz uzgoja Zavoda za animalnu fiziologiju

Biološkog odsjeka Prirodoslovno-matematičkog fakulteta u Zagrebu. Životinje su držane u

kavezima, najviše do 5 životinja po kavezu i hranjene standardnom hranom za laboratorijske

životinje (4RF 21 Mucedola S.R.L., Italija), uz stalnu dostupnost vode.

3.5.3. Model dijabetesa

Dijabetes u štakora (N=5) izazvao se injiciranjem 0,5 mL vodene otopine aloksan-

monohidrata, jednokratno, u dozi od 120 mg/kg intraperitonealno, dok je kontrolna skupina

životinja (N=5) dobila isti volumen fiziološke otopine. Svaki se dan mjerila glukoza u krvi

svim životinja uređajem One Touch Ultra. U kontrolnih životinja, u prva dva dana

koncentracija glukoze u krvi iznosila je 5,5±0,1 mmol/L, dok je kod životinja tretiranih

aloksanskom otopinom, 48 sati nakon injiciranja otopine, koncentracija glukoze u krvi porasla

iznad 15 mmol/L. Drugi dan pokusa označen je kao prvi dan hiperglikemije (48 sati nakon

injiciranja aloksanske otopine).

3.5.3.1. Prikupljanje uzoraka seruma i staklastog tijela

Deset dana nakon nastanka hiperglikemije u tretiranih životinja, obje skupine, tretirana

i kontrolna skupina životinja anestezirane su intraperitonealnim injiciranjem otopine ketamina

(150 mg/kg) i ksilazina (15 mg/kg). Iz abdominalne vene prikupljeno je 15 ml krvi u BD

Vacutainer® tubice s EDTA. Nakon centrifugiranja 15 min, 2000 rpm odvojen je serum

kontrolnih i dijabetičkih životinja. Usmrćenim životinjama izolirana su oba oka iz kojih je

izdvojeno staklasto tijelo u posebne Eppendorf® tubice. Nakon centrifugiranja (10000 rpm,

15 minuta) staklastog tijela odvojen je supernatant staklastog tijela. Pripremljeni uzorci

seruma i staklastog tijela odmah su smrznuti na -80°C do analize.

56

Određivanje AOPP, LPO, MDA, GSH, SOD

U uzorcima seruma i staklastog tijela kontrolnih i dijabetičkih štakora, odmah nakon

odmrzavanja izmjereni su AOPP, LPO, MDA, GSH, SOD. Određivanje se provodilo prema

protokolima kao na humanim uzorcima. Protokoli određivanja opisani su u prvom dijelu

poglavlja Materijali i metode.

3.5.4. Statistička obrada rezultata u pokusu in vivo na aloksanskome modelu dijabetesa

Rezultati pokusa in vivo na laboratorijskim štakorima Y59 obrađeni su i analizirani

softverskim paketom Statistica 12 StatSoft, Inc. (2013) www.statsoft.com. Vrijednosti

mjerenih varijabli prikazane su deskriptivno intervalnom ljestvicom, koja je uključivala

tablični prikaz srednje vrijednosti, standardne devijacije, 95% intervale pouzdanosti, medijane

i interkvartilne raspone.

Statističko testiranje odnosa među varijablama provelo se nakon testiranja normalnosti

razdiobe za varijable mjerene intervalnom ljestvicom. Normalnost se testirala dvama

uobičajenim testovima, Klogomorov-Smirnovljevim i Shapiro-Wilkovim testom. Usporedba

intervalnih varijabli među više od dvije skupina provest će se ANOVA-om (normalna

razdioba), odnosno Kruskal-Wallis ANOVA-om (odstupanje od normalne razdiobe). Razina

statističke značajnosti postavljena je na 0,05. Korelacije među intervalnim varijablama

testirane su Spearmanovom korelacijom (odstupanje od normalne razdiobe).

57

4. REZULTATI ISTRAŽIVANJA 4.1. REZULTATI ISTRAŽIVANOG UZORKA

Ispitivani uzorak sastojao se od ukupno 88 osoba, raspoređenih u dvjema skupinama.

U kontrolnoj skupini (K) nalazila se 51 osoba, dok je u skupini proliferativne dijabetičke

retinopatije (PDR) bilo 37 osoba. Dob ispitanika kretala se od 27 do 84 godine starosti, s

prosjekom od 63,3 godine. Razlike u dobi među promatranim skupina bile su statistički

značajne (p=0,022, Mann-Whitneyev U test), pri čemu su ispitanici u kontrolnoj skupini bili

stariji (srednja vrijednost = 66,5 godina, medijan = 69 godina) od skupine PDR (srednja

vrijednost = 59,9 godina, medijan = 62,5 godina).

Prema spolu, skupine se nisu statistički značajno razlikovale (p=0,583, hi-kvadrat test) s

29,7% žena u skupini PDR i 35,3% žena u kontrolnoj skupini. Žene i muškarci nisu se

statistički značajno razlikovali prema dobi (p=0,163, Mann Whitneyev U test).

4.1.1. Vaskularni endotelni faktor rasta

Vrijednosti VEGF-a u kontrolnoj skupini niže su od vrijednosti u ispitivanoj PDR

skupini u staklastom tijelu i serumu. Rezultati statističkog testiranja pokazuju da su uočene

razlike između skupina statistički značajne i u staklastom tijelu, i u serumu (p<0,001) (Tablica

6.,7., Slika 17.).

Tablica 6. Vrijednosti VEGF-a (pg/mL) u staklastom tijelu, u kontrolnoj skupini (K) i skupini s proliferativnom dijabetičkom retinopatijom (PDR)

N Sr.V. SD DK Medijan GK Min Maks -95%IP +95% IP

K 49,0 190,0 200,1 65,0 101,0 198,0 18,0 725,0 132,5 247,5

PDR 37,0 1824,7# 1943,2 560,0 1520,0 1875,0 115,0 7875,0 1176,8 2472,6

N = broj opservacija; Sr.V. = srednja vrijednost; SD = standardna devijacija; DK = donji kvartil; GK = gornji kvartil; Min/Maks = najniža i najviša izmjerena vrijednost; -95%/+95% IP = intervali pouzdanosti; # skupina je statistički značajno različita u odnosu prema kontrolnoj skupini (p˂0,001, Mann-Whitneyev U test)

58

Tablica 7. Vrijednosti VEGF-a (pg/mL) u serumu, u kontrolnoj skupini (K) i skupini s proliferativnom dijabetičkom retinopatijom (PDR)

N Sr.V. SD DK Medijan GK Min Maks -95% IP +95% IP K 49,0 22,6 20,5 11,0 12,0 35,0 2,0 104,0 16,7 28,5

PDR 37,0 65,7# 125,2 25,0 35,0 45,0 5,0 760,0 23,9 107,4

N = broj opservacija; Sr.V. = srednja vrijednost; SD = standardna devijacija; DK = donji kvartil; GK = gornji kvartil; Min/Maks = najniža i najviša izmjerena vrijednost; -95%/+95% IP = intervali pouzdanosti; # skupina je statistički značajno različita u odnosu prema kontrolnoj skupini (p˂0,001, Mann-Whitneyev U test) a) staklasto tijelo b) serum

Kontrola PDR

Skupina

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

VEG

Fv [n

g/m

L]

Kontrola PDR

Skupina

0

100

200

300

400

500

600

700

800

VEG

Fs [n

g/m

L]

Slika 17. Vrijednosti VEGF-a u staklastom tijelu (a) i serumu (b), u kontrolnoj i PDR skupini.

Osim navedenih razlika između skupina, provedeno je i testiranje korelacija prema

spolu ispitanika i testiranje korelacija vrijednosti VEGF-a s dobi ispitanika (Tablica 8.).

Pronađena je pozitivna i statistički značajna korelacija dobi ispitanika i vrijednosti VEGF-a u

serumu u skupini PDR (p=0,021). Korelacija je grafički prikazana (Sl. 18.).

Tablica 8. Statistička značajnost i koeficijent korelacije (R) VEGF-a ovisno o dobi i spolu, u kontrolnoj skupini (K) i skupini s proliferativnom dijabetičkom retinopatijom (PDR).

Spol* Dob**

VEGFv VEGFs VEGFv VEGFs

K 0,705 0,682 0,816 (0,042) 0,876 (0,028)

PDR 0,153 0,506 0,860 (-0,032) 0,021# (0,368) * Mann-Whitneyev U test; ** Spearmanova korelacija

Koeficijent korelacije (R) prikazan u zagradi; #statistička značajnost p˂0,05.

59

Slika 18. Pozitivna korelacija dobi ispitanika i vrijednosti VEGF-a u serumu, u PDR skupini.

Razlike između vrijednosti VEGF-a u serumu i vrijednosti VEGF-a u staklastom tijelu

statistički značajno su različite za kontrolnu skupinu (p<0,001, Wilcoxonov test) i za

ispitivanu skupinu s dijabetičkom retinopatijom (p<0,001, Wilcoxonov test).

Tablica 9. prikazuje korelacije vrijednosti VEGF-a u staklastom tijelu i serumu, prema

ispitivanoj skupini. U skupini kontrola, koeficijent korelacije (R) je pozitivnog predznaka, tj.

moguće je zaključiti da rast vrijednosti VEGF-a u staklastom tijelu rezultira rastom

vrijednosti VEGF-a u serumu. U skupini PDR predznak korelacije je suprotan, tj. vrijednosti

VEGF-a u staklastom tijelu su inverzno korelirane s vrijednostima u serumu. Ni jedna od

dviju navedenih korelacija nije statistički značajna.

Tablica 9. Korelacija koncentracije VEGF-a između staklastog tijela i seruma

K R 0,234

p 0,105

PDR R -0,226

p 0,176 R= koeficijent korelacije; p= statistička značajnost; K= kontrolna skupina; PDR= skupina s proliferativnom

dijabetičkom retinopatijom

60

4.1.2. Produkti uznapredovale oksidacije proteina

Tablice 10., 11. i Slika 19. prikazuju vrijednosti AOPP-a u staklastom tijelu i serumu,

za kontrolnu i PDR skupinu. Iz tablica su uočljive više srednje vrijednosti u staklastom tijelu i

serumu ispitivane PDR skupine, što je statistički značajno za obje skupine (p<0,001,

Wilcoxonov test). Ne nalaze se statistički značajne razlike između kontrolne skupine i PDR

skupine u vrijednostima AOPP-a u staklastom tijelu (p=0,266), dok je ta razlika u serumu

statistički značajna (p=0,008).

Tablica 10. Vrijednosti AOPP-a (μM) u staklastom tijelu, u kontrolnoj skupini (K) i skupini s proliferativnom dijabetičkom retinopatijom (PDR)

N Sr.V. SD DK Medijan GK Min Maks -95% IP +95% IP

K 30,0 44,0 52,2 4,0 28,5 64,0 1,0 195,0 24,5 63,4

PDR 37,0 64,4 92,1 11,0 28,0 60,0 6,0 453,0 33,7 95,1 N = broj opservacija; Sr.V. = srednja vrijednost; SD = standardna devijacija; DK = donji kvartil; GK = gornji kvartil; Min/Maks = najniža i najviša izmjerena vrijednost; -95%/+95% IP = intervali pouzdanosti Tablica 11. Vrijednosti AOPP-a (μM) u serumu, u kontrolnoj skupini (K) i skupini s proliferativnom dijabetičkom retinopatijom (PDR)


K 31,0 239,1 77,7 162,0 248,0 310,0 94,0 362,0 210,6 267,6

PDR 37,0 427,9* 291,6 223,0 378,0 568,0 97,0 1358,0 330,6 525,1

N = broj opservacija; Sr.V. = srednja vrijednost; SD = standardna devijacija; DK = donji kvartil; GK = gornji kvartil; Min/Maks = najniža i najviša izmjerena vrijednost; -95%/+95% IP = intervali pouzdanosti; * skupina je statistički značajno različita u odnosu prema kontrolnoj skupini (p=0,008, Mann-Whitneyev U test)

61

Kontrola PDR

Skupina

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600AO

PP [u

M]

Slika 19. Vrijednosti AOPP-a u staklastom tijelu i serumu, u kontrolnoj i PDR skupini. Vrijednosti u serumu označene su zeleno. Unutar skupine kontrola i ispitivane skupine, nije bilo statistički značajnih razlika u

vrijednostima AOPP-a, s obzirom na dob i spol ispitanika (Tablica 12.).

Tablica 12. Statistička značajnost i koeficijent korelacije (R) AOPP-a ovisno o dobi i spolu, u kontrolnoj skupini (K) i skupini s proliferativnom dijabetičkom retinopatijom (PDR)

Spol* Dob**

AOPPv AOPPs AOPPv AOPPs

K 0,687 0,453 0,316 (-0,242) 0,471 (-0,176)

PDR 0,641 0,881 0,903 (0,022) 0,192 (-0,236) * Mann-Whitneyev U test; ** Spearmanova korelacija

Koeficijent korelacije (R) prikazan u zagradi

Tablica 13. prikazuje korelaciju vrijednosti AOPP-a u staklastom tijelu s vrijednostima AOPP

u serumu, za obje promatrane skupine. U kontrolnoj skupini koeficijent korelacije (R) je

pozitivnog predznaka, što odgovara (vrlo blagoj) pozitivnoj korelaciji u kontrolnoj skupini. U

ispitivanoj PDR skupini R je negativnog predznaka, tj. vrijednosti u staklastom tijelu inverzno

koreliraju s vrijednostima u serumu. Ipak, ni jedna od korelacija nije bila statistički značajna.

62

Tablica 13. Korelacija koncentracije AOPP-a između staklastog tijela i seruma

K R 0,047

p 0,801

PDR R -0,173


dijabetičkom retinopatijom 4.1.3. Lipidna peroksidacija

Tablice 14. i 15., prikazuju vrijednosti LPO-a u staklastom tijelu i serumu. U

kontrolnoj skupini vrijednosti u staklastom tijelu i serumu ne razlikuju se statistički značajno

(p=0,770), dok je razlika u PDR skupini značajna (p<0,001, Wilcoxonov test u oba slučaja).

Uočena je i statistički značajna razlika u razinama LPO-a između kontrolne i ispitivane PDR

skupine, u staklastom tijelu i serumu (p<0,001 u oba slučaja). Vrijednosti LPO-a prikazane su

i grafički (Slika 20.)

Tablica 14. Vrijednosti LPO-a (μM) u staklastom tijelu, u kontrolnoj skupini (K) i skupini s proliferativnom dijabetičkom retinopatijom (PDR)


K 51,0 29,3 15,8 16,0 25,0 39,0 9,0 78,0 24,9 33,7

PDR 37,0 143,3# 33,1 121,0 149,0 167,0 68,0 201,0 132,3 154,3 N = broj opservacija; Sr.V. = srednja vrijednost; SD = standardna devijacija; DK = donji kvartil; GK = gornji kvartil; Min/Maks = najniža i najviša izmjerena vrijednost; -95%/+95% IP = intervali pouzdanosti; # skupina je statistički značajno različita u odnosu prema kontrolnoj skupini (p˂0,001, Mann-Whitneyev U test) Tablica 15. Vrijednosti LPO-a (μM) u serumu, u kontrolnoj skupini (K) i skupini s proliferativnom dijabetičkom retinopatijom (PDR)


K 51,0 26,2 11,2 18,0 25,0 31,0 12,0 68,0 23,1 29,4

PDR 37,0 165,9# 34,5 145,0 169,0 195,0 59,0 214,0 154,4 177,4

N = broj opservacija; Sr.V. = srednja vrijednost; SD = standardna devijacija; DK = donji kvartil; GK = gornji kvartil; Min/Maks = najniža i najviša izmjerena vrijednost; -95%/+95% IP = intervali pouzdanosti; # skupina je statistički značajno različita u odnosu prema kontrolnoj skupini (p˂0,001, Mann-Whitneyev U test)

63

Kontrola PDR

Skupina

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240LP

O [u

M]

Slika 20. Vrijednosti LPO-a u staklastom tijelu i serumu, u kontrolnoj i PDR skupini. Vrijednosti u serumu označene su zeleno. Statistički značajnih razlika nije bilo u vrijednostima LPO-a, s obzirom na dob i spol

ispitanika, unutar kontrolne skupine i ispitivane PDR skupine (Tablica 16.).

Tablica 16. Statistička značajnost i koeficijent korelacije (R) LPO-a ovisno o dobi i spolu, u kontrolnoj skupini (K) i skupini s proliferativnom dijabetičkom retinopatijom (PDR)

Spol* Dob**

LPOv LPOs LPOv LPOs

K 0,424 0,236 0,266 (-0,195) 0,097 (0,289)

PDR 0,183 0,103 0,327 (-0,178) 0,150 (-0,260)

* Mann-Whitneyev U test; ** Spearmanova korelacija Koeficijent korelacije (R) prikazan u zagradi

Tablica 17. prikazuje korelaciju vrijednosti LPO-a u staklastom tijelu s vrijednostima LPO u

serumu. Korelacija je pozitivnog predznaka za obje promatrane skupine, a u slučaju ispitivane

PDR skupine je i statistički značajna. Stoga je ta korelacija dodatno prikazana grafikonom

koji slijedi iza tablice (Slika 21.).

64

Tablica 17. Korelacija koncentracije LPO-a između staklastog tijela i seruma

K R 0,215

p 0,131

PDR R 0,873

p <0,001 R= koeficijent korelacije; p= statistička značajnost; K= kontrolna skupina; PDR= skupina s proliferativnom


Slika 21. Pozitivna korelacija LPO-a u staklastom tijelu i serumu u PDR skupini. 4.1.4. Malondialdehid

Vrijednosti parametra MDA u staklastom tijelu i serumu prikazane su Tablicama 18. i

19. i Slikom 22. Razlike između vrijednosti u serumu i vrijednosti u staklastom tijelu su

statistički značajne, za kontrolnu (p<0,001) i za ispitivanu PDR skupinu (p=0,011,

Wilcoxonov test). Koncentracije MDA u staklastom tijelu statistički se značajno razlikuju

između kontrolne i PDR skupine (p=0,001), za vrijednosti u serumu to nije slučaj (p=0,381).

65

Tablica 18. Vrijednosti MDA (nmol/mL) u staklastom tijelu, u kontrolnoj skupini (K) i skupini s proliferativnom dijabetičkom retinopatijom (PDR)


K 28,0 56,6 43,5 15,2 51,1 82,5 7,2 184,3 39,8 73,5

PDR 21,0 94,9# 34,3 83,3 99,8 103,0 15,2 202,3 79,3 110,5 N = broj opservacija; Sr.V. = srednja vrijednost; SD = standardna devijacija; DK = donji kvartil; GK = gornji kvartil; Min/Maks = najniža i najviša izmjerena vrijednost; -95%/+95% IP = intervali pouzdanosti; # skupina je statistički značajno različita u odnosu prema kontrolnoj skupini (p=0,001, Mann-Whitneyev U test) Tablica 19. Vrijednosti MDA (nmol/mL) u serumu, u kontrolnoj skupini (K) i skupini s proliferativnom dijabetičkom retinopatijom (PDR)


K 48,0 126,8 59,8 67,3 147,2 173,5 4,0 208,3 109,4 144,1

PDR 34,0 152,8 65,6 132,2 146,0 175,9 0,0 394,6 129,9 175,7 N = broj opservacija; Sr.V. = srednja vrijednost; SD = standardna devijacija; DK = donji kvartil; GK = gornji kvartil; Min/Maks = najniža i najviša izmjerena vrijednost; -95%/+95% IP = intervali pouzdanosti

Kontrola PDR

Skupina

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

MD

A [n

mol

/mL]

Slika 22. Vrijednosti MDA u staklastom tijelu i serumu, u kontrolnoj i PDR skupini. Vrijednosti u serumu označene su zeleno.

Vrijednosti MDA u serumu unutar kontrolne skupine razlikovale su se po spolu

(p=0,043), a dodatno testiranje pokazalo je da su vrijednosti više u muškaraca (srednja

vrijednost 139,9 nmol/mL, medijan 158,7 nmol/mL) od onih u žena (srednja vrijednost 102,8

66

i medijan 99,8 nmol/mL). Uočena je i statistički značajna negativna korelacija vrijednosti

MDA u serumu u ispitivanoj skupini s dobi ispitanika (Tablica 20.). Korelacija je prikazana i

grafikonom (Slika 23.).

Tablica 20. Statistička značajnost i koeficijent korelacije (R) MDA ovisno o dobi i spolu, u kontrolnoj skupini (K) i skupini s proliferativnom dijabetičkom retinopatijom (PDR)

Spol* Dob**

MDAv MDAs MDAv MDAs

K 0,597 0,043# 0,782 (0,072) 0,392 (-0,156)

PDR 0,755 0,179 0,961 (-0,011) 0,018# (-0,427)

* Mann-Whitneyev U test; ** Spearmanova korelacija Koeficijent korelacije (R) prikazan u zagradi; #statistička značajnost p˂0,05.

Slika 23. Negativna korelacija vrijednosti MDA u serumu s dobi ispitanika, u PDR skupini.

67

Tablica 21. prikazuje korelacije vrijednosti parametra MDA u serumu i staklastom

tijelu za obje promatrane skupine. Uočena je negativna korelacija u kontrolnoj skupini, tj.

vrijednosti MDA u staklastom tijelu inverzno koreliraju s vrijednostima u serumu, a pozitivna

korelacija unutar PDR skupine, odnosno, rast vrijednosti MDA u staklastom tijelu, rezultira

rastom vrijednosti MDA u serumu. Korelacije nisu bile statistički značajne, stoga nisu

grafički prikazane.

Tablica 21. Korelacija koncentracije MDA između staklastog tijela i seruma

K R -0,257

p 0,187

PDR R 0,011


dijabetičkom retinopatijom 4.1.5. Superoksid dismutaza

Tablice 22., 23. i Slika 24. prikazuju vrijednosti SOD-a u staklastom tijelu i serumu za

kontrolnu i PDR skupinu. Razlike između vrijednosti u staklastom tijelu i vrijednosti u

serumu statistički su značajne i za kontrolnu i za PDR skupinu (p<0,001, Wilcoxonov test). U

kontrolnoj skupini vrijednosti u staklastom tijelu značajno su više od onih u serumu, dok je u

ispitivanoj PDR skupini taj odnos obrnut, odnosno vrijednosti su značajno više u serumu.

Uočljivo je da su vrijednosti SOD-a statistički značajno različite između promatranih

skupina, u staklastom tijelu i serumu (p<0,001).

Tablica 22. Vrijednosti SOD-a (U/mL) u staklastom tijelu, u kontrolnoj skupini (K) i skupini s proliferativnom dijabetičkom retinopatijom (PDR)


K 46,0 67,3 56,4 36,6 45,9 61,6 13,5 228,4 50,6 84,1

PDR 33,0 29,9# 12,2 18,8 30,9 38,5 5,0 56,7 25,6 34,3 N = broj opservacija; Sr.V. = srednja vrijednost; SD = standardna devijacija; DK = donji kvartil; GK = gornji kvartil; Min/Maks = najniža i najviša izmjerena vrijednost; -95%/+95% IP = intervali pouzdanosti; # skupina je statistički značajno različita u odnosu prema kontrolnoj skupini (p˂0,001, Mann-Whitneyev U test)

68

Tablica 23. Vrijednosti SOD-a (U/mL) u serumu, u kontrolnoj skupini (K) i skupini s proliferativnom dijabetičkom retinopatijom (PDR)


K 46,0 25,1 7,5 20,2 25,2 29,7 12,4 44,2 22,9 27,4

PDR 27,0 150,8# 96,9 98,4 122,7 161,7 61,6 514,4 112,4 189,1 N = broj opservacija; Sr.V. = srednja vrijednost; SD = standardna devijacija; DK = donji kvartil; GK = gornji kvartil; Min/Maks = najniža i najviša izmjerena vrijednost; -95%/+95% IP = intervali pouzdanosti; # skupina je statistički značajno različita u odnosu prema kontrolnoj skupini (p˂0,001, Mann-Whitneyev U test)

Kontrola PDR

Skupina

0

100

200

300

400

500

600

SOD

[U/m

L]

Slika 24. Vrijednosti SOD-a u staklastom tijelu i serumu, u kontrolnoj i PDR skupini. Vrijednosti u serumu označene su zeleno. U Tablici 24. prikazana je negativna i statistički značajna korelacija vrijednosti SOD-a u

serumu i dobi unutar ispitivane PDR skupine. Korelacija je prikazana i grafikonom (Slika

25.).

69

Tablica 24. Statistička značajnost i koeficijent korelacije (R) SOD-a ovisno o dobi i spolu, u kontrolnoj skupini (K) i skupini s proliferativnom dijabetičkom retinopatijom (PDR)

Spol* Dob**

SODv SODs SODv SODs

K 0,573 0,251 0,098 (0,307) 0,352 (0,179)

PDR 0,646 0,300 0,604 (0,100) 0,034# (-0,443)

* Mann-Whitneyev U test; ** Spearmanova korelacija Koeficijent korelacije (R) prikazan u zagradi; #statistička značajnost p˂0,05

Slika 25. Negativna korelacija vrijednosti SOD-a u serumu i dobi ispitanika u PDR skupini. Korelacije vrijednosti SOD-a u staklastom tijelu s vrijednostima SOD-a u serumu nisu bile

statistički značajne ni za jednu od dviju promatranih skupina ( Tablica 25.).

Tablica 25. Korelacija koncentracije SOD-a između staklastog tijela i seruma

K R 0,103

p 0,513

PDR R 0,033



70

4.1.6. Glutation

Tablice 26., 27. i Slika 26. prikazuju vrijednosti GSH u staklastom tijelu i serumu.

Razlike između vrijednosti parametara u serumu i staklastom tijelu statistički su značajne u

obje promatrane skupine (p<0,001, Wilcoxonov test). Vrijednosti GSH u staklastom tijelu,

između ispitivane i kontrolne skupine bile su statistički značajno različite (p<0,001), dok

razlike istih vrijednosti u serumu nisu bile statistički značajne (p=0,073).

Tablica 26. Vrijednosti GSH (μmol/mL) u staklastom tijelu, u kontrolnoj skupini (K) i skupini s proliferativnom dijabetičkom retinopatijom (PDR)


K 50,0 39,5 7,8 37,9 39,5 40,3 0,0 69,3 37,3 41,7

PDR 35,0 45,0# 11,7 39,9 40,8 43,2 37,6 80,0 41,0 49,0 N = broj opservacija; Sr.V. = srednja vrijednost; SD = standardna devijacija; DK = donji kvartil; GK = gornji kvartil; Min/Maks = najniža i najviša izmjerena vrijednost; -95%/+95% IP = intervali pouzdanosti; # skupina je statistički značajno različita (p˂0,001) u odnosu prema kontrolnoj skupini (Mann-Whitneyev U test) Tablica 27. Vrijednosti GSH (μmol/mL) u serumu, u kontrolnoj skupini (K) i skupini s proliferativnom dijabetičkom retinopatijom (PDR)


K 48,0 86,7 30,9 67,1 77,8 90,1 51,7 207,5 77,7 95,7


71

Kontrola PDR

Skupina

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220G

SH [u

mol

/mL]

Slika 26. Vrijednosti GSH u staklastom tijelu i serumu, u kontrolnoj i PDR skupini. Vrijednosti u serumu označene su zeleno. Unutar skupine kontrola i ispitivane PDR skupine, nije bilo statistički značajnih razlika u

vrijednostima GSH, s obzirom na dob i spol ispitanika (Tablica 28.).

Tablica 28. Statistička značajnost i koeficijent korelacije (R) GSH ovisno o dobi i spolu, u kontrolnoj skupini (K) i skupini s proliferativnom dijabetičkom retinopatijom (PDR)

Spol* Dob**

GSHv GSHs GSHv GSHs

K 0,712 0,207 0,584 (-0,098) 0,544 (-0,111)

PDR 0,695 0,541 0,712 (0,070) 0,777 (-0,062) * Mann-Whitneyev U test; ** Spearmanova korelacija

Koeficijent korelacije (R) prikazan u zagradi

Korelacija vrijednosti GSH u staklastom tijelu s vrijednostima u serumu je negativnog

predznaka za obje promatrane skupine. Vrijednosti GSH u staklastom tijelu su inverzno

korelirane s vrijednostima u serumu, u obje skupine. Ni jedna korelacija nije se pokazala

statistički značajnom (Tablica 29.).

72

Tablica 29. Korelacija koncentracije GSH između staklastog tijela i seruma

K R -0,243

p 0,098

PDR R -0,186


dijabetičkom retinopatijom 4.1.7. Oksidirani glutation

Tablica 30., 31. i Slika 27. prikazuju vrijednosti GSSG-a u staklastom tijelu i serumu,

za kontrolnu i PDR skupinu. U obje promatrane skupine vrijednosti se statistički značajno

razlikuju između staklastog tijela i seruma (p<0,001, Wilcoxonov test). Razlike u

vrijednostima GSSG-a u staklastom tijelu bile su statistički značajne između kontrolne i

ispitivane skupine (p=0,005), dok kod vrijednosti u serumu to nije bio slučaj (p=0,106).

Tablica 30. Vrijednosti GSSG-a (μmol/mL) u staklastom tijelu, u kontrolnoj skupini (K) i skupini s proliferativnom dijabetičkom retinopatijom (PDR)


PDR 35,0 20,3* 3,5 18,0 19,4 20,8 16,6 31,8 19,1 21,5 N = broj opservacija; Sr.V. = srednja vrijednost; SD = standardna devijacija; DK = donji kvartil; GK = gornji kvartil; Min/Maks = najniža i najviša izmjerena vrijednost; -95%/+95% IP = intervali pouzdanosti; * skupina je statistički značajno različita u odnosu prema kontrolnoj skupini (p=0,005, Mann-Whitneyev U test) Tablica 31. Vrijednosti GSSG-a (μmol/mL) u serumu, u kontrolnoj skupini (K) i skupini s proliferativnom dijabetičkom retinopatijom (PDR)



73

Kontrola PDR

Skupina

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90G

SS

G [u

mol

/mL]

Slika 27. Vrijednosti GSSG-a u staklastom tijelu i serumu, u kontrolnoj i PDR skupini. Vrijednosti u serumu označene su zeleno. U Tablici 32. vidljiva je statistički granično značajna razlika (p=0,057) u vrijednostima

GSSG-a u serumu u kontrolnoj skupini između muškaraca i žena. Muškarci su imali nešto

više vrijednosti (srednja vrijednost 34,0 μmol/mL i medijan od 31,8 μmol/mL) od žena

(srednja vrijednost 30,2 μmol/mL i medijan od 29,4 μmol/mL). Uočena je i pozitivna

korelacija dobi ispitanika i vrijednosti GSSG-a u serumu u ispitivanoj PDR skupini; što je

prikazano i grafički (Slika 28.).

Tablica 32. Statistička značajnost i koeficijent korelacije (R) GSSG-a ovisno o dobi i spolu, u kontrolnoj skupini (K) i skupini s proliferativnom dijabetičkom retinopatijom (PDR)

Spol* Dob**

GSSGv GSSGs GSSGv GSSGs

K 0,488 0,057 0,253 (-0,207) 0,372 (-0,162)

PDR 0,957 0,770 0,471 (0,136) 0,033# (0,445) * Mann-Whitneyev U test; ** Spearmanova korelacija

Koeficijent korelacije (R) prikazan u zagradi; #statistička značajnost p˂0,05

74

Slika 28. Pozitivna korelacija dobi ispitanika i vrijednosti GSSG-a u serumu, u PDR skupini. Tablica 33. prikazuje korelacije između vrijednosti GSSG-a u serumu i vrijednosti GSSG-a u

staklastom tijelu za obje promatrane skupine. Vrijednosti GSSG-a u staklastom tijelu su

inverzno korelirane s vrijednostima u serumu, u kontrolnoj skupini. Korelacije se nisu

pokazale statistički značajnima.

Tablica 33. Korelacija koncentracije GSSG-a između staklastog tijelu i seruma

K R -0,165

p 0,266

PDR R 0,082



75

4.1.8. Glutation / oksidirani glutation Tablice 34., 35. i Slika 29. prikazuju vrijednosti odnosa GSH/GSSG u staklastom

tijelu i serumu, za kontrolnu i PDR skupinu. U obje promatrane skupine vrijednosti između

staklastog tijela i seruma statistički značajno su se razlikovale (p<0,001, Wilcoxonov test).

Razlike u vrijednostima odnosa GSH/GSSG nisu bile statistički značajne, ni u staklastom

tijelu (p=0,996), ni u serumu (p=0,522), između kontrolne i PDR skupine.

Tablica 34. Vrijednosti GSH/GSSG (μmol/mL) u staklastom tijelu, u kontrolnoj skupini (K) i skupini s proliferativnom dijabetičkom retinopatijom (PDR)


PDR 35,0 2,2 0,2 2,1 2,1 2,3 1,9 3,0 2,1 2,3 N = broj opservacija (osoba); Sr.V. = srednja vrijednost; SD = standardna devijacija; DK = donji kvartil; GK = gornji kvartil; Min/Maks = najniža i najviša izmjerena vrijednost; -95%/+95% IP = intervali pouzdanosti Tablica 35. Vrijednosti GSH/GSSG (μmol/mL) u serumu, u kontrolnoj skupini (K) i skupini s proliferativnom dijabetičkom retinopatijom (PDR)


PDR 27,0 2,6 1,0 2,3 2,6 2,7 0,0 6,7 2,2 3,0 N = broj opservacija (osoba); Sr.V. = srednja vrijednost; SD = standardna devijacija; DK = donji kvartil; GK = gornji kvartil; Min/Maks = najniža i najviša izmjerena vrijednost; -95%/+95% IP = intervali pouzdanosti

76

Kontrola PDR

Skupina

0

1

2

3

4

5

6

7G

SH/G

SSG

Slika 29. Vrijednosti omjera GSH/GSSG u staklastom tijelu i serumu, u kontrolnoj i PDR skupini. Vrijednosti u serumu označene su zeleno. U serumu unutar PDR skupine uočena je statistički značajna negativna korelacija dobi

ispitanika i odnosa GSH/GSSG (Tablica 36. i Slika 30.).

Tablica 36. Statistička značajnost i koeficijenti korelacije (R) GSH/GSSG ovisno o dobi i spolu, u kontrolnoj skupini (K) i skupini s proliferativnom dijabetičkom retinopatijom (PDR)

Spol* Dob**

GSH/GSSGv GSH/GSSGs GSH/GSSGv GSH/GSSGs K 0,481 0,829 0,322 (0,181) 0,931 (-0,016)

PDR 0,226 0,978 0,415 (-0,154) 0,006# (-0,557) * Mann-Whitneyev U test; ** Spearmanova korelacija

Koeficijent korelacije (R) prikazan u zagradi; #statistička značajnost p˂0,05

77

Slika 30. Negativna korelacija dobi ispitanika i odnosa GSH/GSSG u serumu, u PDR skupini.

Tablica 37. i Slika 31. prikazuju korelacije odnosa GSH/GSSG u staklastom tijelu i odnosa

GSH/GSSG u serumu za obje promatrane skupine. Korelacija u ispitivanoj PDR skupini

pokazala se statistički granično značajnom (p=0,054).

Tablica 37. Korelacija koncentracije GSH/GSSG između staklastog tijela i serumu

K R 0,015

p 0,917

PDR R 0,388



78

Slika 31. Pozitivna korelacija odnosa GSH/GSSG u staklastom tijelu i serumu u PDR skupini. 4.1.9. Korelacija

U Tablicama 38. i 39. prikazane su sve moguće korelacije mjerenih parametara

između staklastog tijela i seruma, u obje promatrane skupine.

79

Tablica 38. Korelacije i statističke vrijednosti mjerenih varijabli između staklastog tijela i seruma u kontrolnoj skupini. koeficijenti korelacije (R) prikazani su iznad dijagonale, a statističke (p) vrijednosti ispod dijagonale

S t a k l a s t o t i j e l o S e r u m VEGF AOPP LPO MDA SOD GSH GSSG GSH/GSSG VEGF AOPP LPO MDA SOD GSH GSSG GSH/GSSG

Staklasto tijelo

VEGF / -0,047 0,161 0,007 -0,12 -0,15 -0,116 0,151 0,234 -0,017 0,097 -0,119 -0,027 0,022 0,139 -0,124

AOPP 0,807 / 0,053 -0,14 0,075 0,058 -0,23 0,238 -0,22 0,048 0,114 -0,122 -0,052 -0,092 -0,118 -0,045

LPO 0,269 0,78 / 0,176 0,045 0,017 -0,005 0,101 -0,073 -0,199 0,215 -0,046 0,168 -0,201 -0,032 -0,209

MDA 0,971 0,487 0,369 / -0,032 -0,131 -0,392 0,406 -0,326 0,296 -0,029 -0,257 0,105 0,012 -0,056 0,285

SOD 0,433 0,704 0,767 0,876 / -0,058 -0,132 0,143 0,021 -0,096 0,137 0,126 0,104 -0,239 -0,066 -0,218

GSH 0,309 0,763 0,909 0,508 0,702 / 0,605 -0,221 -0,048 0,089 -0,001 0,02 0,336 -0,244 -0,172 -0,141

GSSG 0,436 0,221 0,974 0,039 0,384 <0,001 / -0,837 -0,109 -0,159 0,073 0,156 0,225 -0,191 -0,165 -0,145

GSH/GSSG 0,311 0,206 0,488 0,032 0,342 0,127 <0,001 / 0,046 0,224 -0,169 -0,198 -0,003 <0,001 0,022 0,016

Serum VEGF 0,105 0,242 0,62 0,09 0,892 0,748 0,464 0,757 / 0,023 0,111 -0,124 -0,072 0,077 0,03 0,064

AOPP 0,927 0,801 0,284 0,126 0,622 0,635 0,393 0,226 0,903 / 0,127 -0,457 0,222 0,025 -0,077 0,224

LPO 0,508 0,55 0,131 0,884 0,365 0,994 0,619 0,247 0,446 0,497 / 0,03 0,301 -0,119 -0,129 -0,096

MDA 0,43 0,53 0,756 0,187 0,411 0,893 0,294 0,182 0,412 0,011 0,841 / 0,093 -0,239 -0,142 -0,319

SOD 0,86 0,794 0,265 0,611 0,513 0,024 0,136 0,985 0,64 0,247 0,042 0,543 / -0,627 -0,444 -0,418

GSH 0,882 0,635 0,17 0,95 0,113 0,099 0,2 0,999 0,611 0,897 0,421 0,102 <0,001 / 0,77 0,719

GSSG 0,358 0,541 0,83 0,779 0,669 0,247 0,266 0,884 0,843 0,686 0,384 0,335 0,002 <0,001 / 0,223

GSH/GSSG 0,41 0,818 0,153 0,141 0,151 0,346 0,332 0,917 0,674 0,233 0,518 0,027 0,004 <0,001 0,128 /

80

Tablica 39. Korelacije i statističke vrijednosti mjerenih varijabli između staklastog tijela i seruma u PDR skupini. koeficijenti korelacije (R) prikazani su iznad dijagonale, a statističke (p) vrijednosti ispod dijagonale

S t a k l a s t o t i j e l o S e r u m VEGF AOPP LPO MDA SOD GSH GSSG GSH/GSSG VEGF AOPP LPO MDA SOD GSH GSSG GSH/GSSG

Staklasto tijelo

VEGF / 0,01 -0,082 0,07 -0,175 -0,145 -0,132 -0,065 -0,242 -0,022 -0,046 -0,21 0,394 0,091 0,05 0,122

AOPP 0,953 / 0,06 -0,255 0,085 0,017 -0,093 -0,015 0,036 -0,173 -0,005 0,053 0,105 -0,071 -0,176 0,417

LPO 0,631 0,725 / 0,1 -0,044 0,202 0,392 -0,267 0,114 0,16 0,874 0,11 -0,003 -0,151 -0,27 -0,065

MDA 0,765 0,265 0,666 / -0,239 -0,16 0,335 -0,443 0,27 0,084 -0,093 0,011 -0,322 -0,055 0,035 -0,364

SOD 0,331 0,638 0,808 0,297 / -0,096 -0,194 -0,291 0,174 0,081 -0,098 0,415 0,033 0,116 0,127 0,243

GSH 0,406 0,921 0,244 0,488 0,597 / 0,824 -0,053 0,273 0,065 0,266 -0,023 -0,389 -0,187 0,01 -0,15

GSSG 0,45 0,597 0,02 0,138 0,28 <0,001 / -0,327 0,298 0,013 0,34 -0,039 -0,543 -0,144 0,082 -0,413

GSH/GSSG 0,713 0,934 0,121 0,044 0,1 0,763 0,055 / -0,465 0,131 -0,124 -0,22 0,548 0,027 -0,136 0,389

Serum VEGF 0,154 0,834 0,506 0,249 0,341 0,118 0,087 0,006 / 0,002 0,088 0,025 -0,356 -0,117 0,063 -0,19

AOPP 0,898 0,305 0,343 0,717 0,655 0,71 0,941 0,454 0,993 / 0,243 0,314 -0,068 0,275 -0,069 0,214

LPO 0,787 0,975 <0,001 0,689 0,588 0,123 0,046 0,479 0,609 0,147 / 0,141 0,06 0,087 -0,167 0,033

MDA 0,234 0,765 0,537 0,963 0,022 0,901 0,831 0,227 0,89 0,07 0,425 / 0,005 0,133 -0,175 0,41

SOD 0,042 0,602 0,987 0,179 0,88 0,055 0,005 0,005 0,075 0,736 0,766 0,979 / -0,027 -0,072 0,152

GSH 0,652 0,725 0,452 0,822 0,598 0,372 0,491 0,897 0,568 0,165 0,667 0,509 0,895 / 0,708 0,154

GSSG 0,804 0,379 0,173 0,886 0,565 0,963 0,696 0,516 0,761 0,733 0,406 0,382 0,721 <0,001 / -0,444

GSH/GSSG 0,545 0,03 0,749 0,125 0,264 0,475 0,04 0,055 0,352 0,283 0,871 0,034 0,45 0,442 0,02 /

81

Rezultati regresijskih korelacija, pomoću kojih temeljem vrijednosti parametara u serumu

predviđamo vrijednosti parametara u staklastom tijelu (serumski parametar smatramo

neovisnom varijablom, a parametar u staklastom tijelu smatramo zavisnom varijablom).

Slika 32. Regresijska analiza odnosa serumske GSH molekule i SOD-a u staklastom tijelu (p=0,898). Regresijski pravac (puna linija) s 95-postotnim inetervalima pouzdanosti (isprekidane linije), regresijska jednadžba, Pearsonov koeficijent korelacije (r).

Slika 33. Regresijska analiza odnosa LPO molekule u serumu i staklastom tijelu (p<0,001). Regresijski pravac (puna linija) s 95-postotnim inetervalima pouzdanosti (isprekidane linije), regresijska jednadžbai Pearsonov koeficijent korelacije (r).

82

Slika 34. Regresijska analiza odnosa serumske LPO molekule i molekule SOD-a u staklastom tijelu (p=0,975). Regresijski pravac (puna linija) s 95-postotnim inetervalima pouzdanosti (isprekidane linije), regresijska jednadžba i Pearsonov koeficijent korelacije (r).

Slika 35. Regresijska analiza odnosa serumske SOD molekule i molekule LPO u staklastom tijelu (p=0,482). Regresijski pravac (puna linija) s 95-postotnim inetervalima pouzdanosti (isprekidane linije), regresijska jednadžba i Pearsonov koeficijent korelacije (r).

83

Slika 36. Regresijska analiza odnosa VEGF molekule u serumu i staklastom tijelu (p=0,187). Regresijski pravac (puna linija) s 95-postotnim inetervalima pouzdanosti (isprekidane linije), regresijska jednadžba i Pearsonov koeficijent korelacije (r).

Slika 37. Regresijska analiza odnosa serumske VEGF molekule i LPO molekule u staklastom tijelu (p=0,571). Regresijski pravac (puna linija) s 95-postotnim inetervalima pouzdanosti (isprekidane linije), regresijska jednadžba i Pearsonov koeficijent korelacije (r).

84

Slika 38. Regresijska analiza odnosa serumske AOPP molekule i molekule LPO u staklastom tijelu (p=0,554). Regresijski pravac (puna linija) s 95-postotnim inetervalima pouzdanosti (isprekidane linije), regresijska jednadžba i Pearsonov koeficijent korelacije (r). Rezultati regresijskih korelacija mjerenih parametara u serumu (prvu varijablu smatramo

neovisnom, a drugu ovisnom).

Slika 39. Regresijske analiza odnosa serumskih VEGF i LPO molekula (p=0,749). Regresijski pravac (puna linija) s 95-postotnim inetervalima pouzdanosti (isprekidane linije), regresijska jednadžba i Pearsonov koeficijent korelacije (r).

85

Slika 40. Regresijska analiza odnosa serumskih AOPP i LPO molekula (p=0,341). Regresijski pravac (puna linija) s 95-postotnim inetervalima pouzdanosti (isprekidane linije), regresijska jednadžba i Pearsonov koeficijent korelacije (r).

Slika 41. Regresijska analiza odnosa serumskih AOPP i SOD molekula (p=0,147). Regresijski pravac (puna linija) s 95-postotnim inetervalima pouzdanosti (isprekidane linije), regresijska jednadžba i Pearsonov koeficijent korelacije (r).

86

Slika 42. Regresijska analiza odnosa serumskih SOD i LPO molekula (p=0,239). Regresijski pravac (puna linija) s 95-postotnim inetervalima pouzdanosti (isprekidane linije), regresijska jednadžba i Pearsonov koeficijent korelacije (r).

Slika 43. Regresijska analiza odnosa serumskih GSH i SOD molekula (p=0,092). Regresijski pravac (puna linija) s 95-postotnim inetervalima pouzdanosti (isprekidane linije), regresijska jednadžba i Pearsonov koeficijent korelacije (r).

87

Rezultati regresijskih korelacija, mjerenih parametara u staklastom tijelu (prvu varijablu

smatramo neovisnom, a drugu ovisnom).

Slika 44. Regresijska analiza odnosa LPO i VEGF molekula u staklastom tijelu (p=0,927). Regresijski pravac (puna linija) s 95-postotnim inetervalima pouzdanosti (isprekidane linije), regresijska jednadžba i Pearsonov koeficijent korelacije (r).

Slika 45. Regresijska analiza odnosa MDA i LPO molekula u staklastom tijelu (p=0,981). Regresijski pravac (puna linija) s 95-postotnim inetervalima pouzdanosti (isprekidane linije), regresijska jednadžba i Pearsonov koeficijent korelacije (r).

88

Slika 46. Regresijska analiza odnosa GSH i GSSG molekula u staklastom tijelu (p<0,001). Regresijski pravac (puna linija) s 95-postotnim inetervalima pouzdanosti (isprekidane linije), regresijska jednadžba i Pearsonov koeficijent korelacije (r).

89

4.2. REZULTATI ISTRAŽIVANJA NA LABORATORIJSKIM ŽIVOTINJAMA

U kontrolnih životinja koncentracija glukoze u krvi, tijekom prvog i drugog dana

pokusa iznosila je 5,5±0,1 mmol/L dok je kod životinja tretiranih aloksanskom otopinom

drugi dan pokusa (48 sati nakon injiciranja aloksanske otopine), izmjerena koncentracija

glukoze u krvi porasla, iznad 15 mmol/L. Stoga se drugi dan pokusa, označio kao prvi dan

hiperglikemije. Glukoza u krvi, mjerila se nadalje, u svih pokusnih životinja, petog dana i

desetog dana nakon nastanka hiperglikemije u tretiranih životinja. U kontrolnih životinja,

petog i desetog dana izmjerena koncentracija glukoze u krvi iznosila je 5,5 ± 0,2 mmol/L, a u

svih tretiranih životinja, petog i desetog dana izmjerena vrijednost glukoze bila je u rasponu

od 20,0 - 22,0 mmol/L.

Promatrani parametri analizirali su se 10 dana od induciranja aloksanske

hiperglikemije. Skupina životinja tretirana aloksanskom otopinom, označena je kao PDR

skupina.

4.2.1. Produkti uznapredovale oksidacije proteina Tablice 40., 41. i Slika 47. prikazuju vrijednosti AOPP-a u staklastom tijelu i

serumu, za kontrolnu i ispitivanu PDR skupinu. Iz tablica su uočljive niže vrijednosti u

serumu, što je statistički značajno za obje skupine. Ne nalaze se statistički značajne razlike

između kontrolne skupine i ispitivane PDR skupine u vrijednostima AOPP-a, ni u staklastom

tijelu ni u serumu.

Tablica 40. Vrijednosti AOPP-a (μM) u staklastom tijelu, u kontrolnoj skupini (K) i skupini s proliferativnom dijabetičkom retinopatijom (PDR) AOPP N Sr.V. SD DK Medijan GK Min Maks -95% IP +95% IP K 5,0 4035,0 4641,5 339,0 1680,0 7208,0 338,0 10610,0 1728,1 9798,1 PDR 5,0 4934,0 1811,5 4480,0 4557,0 5380,0 2626,0 7627,0 2684,7 7183,3 N = broj opservacija; Sr.V. = srednja vrijednost; SD = standardna devijacija; DK = donji kvartil; GK = gornji kvartil; Min/Maks = najniža i najviša izmjerena vrijednost; -95%/+95% IP = intervali pouzdanosti

90

Tablica 41. Vrijednosti AOPP-a (μM) u serumu, u kontrolnoj skupini (K) i skupini s proliferativnom dijabetičkom retinopatijom (PDR) AOPP N Sr.V. SD DK Medijan GK Min Maks -95% IP +95% IP K 5,0 330,2 188,4 163,0 397,0 473,0 99,0 519,0 96,3 564,1 PDR 5,0 324,0 38,8 315,0 331,0 335,0 266,0 373,0 275,8 372,2 N = broj opservacija; Sr.V. = srednja vrijednost; SD = standardna devijacija; DK = donji kvartil; GK = gornji kvartil; Min/Maks = najniža i najviša izmjerena vrijednost; -95%/+95% IP = intervali pouzdanosti

Slika 47. Vrijednosti AOPP-a u staklastom tijelu (A) i serumu (B) Kontrolna skupina staklasto tijelo (KV), ispitivana skupina staklasto tijelo (PDRV), kontrolna skupina serum (KS), ispitivana skupina serum (PDRS) . 4.2.2. Lipidna peroksidacija Tablice 42., 43. i Slika 48. prikazuju vrijednosti LPO-a u staklastom tijelu i

serumu za kontrolnu i ispitivanu PDR skupinu. Statistički je značajna razlika u razinama

LPO-a između kontrolne i ispitivane PDR skupine, u staklastom tijelu i serumu (p≤0,05 u oba

slučaja).

91

Tablica 42. Vrijednosti LPO-a (μM) u staklastom tijelu, u kontrolnoj skupini (K) i skupini s proliferativnom dijabetičkom retinopatijom (PDR) LPO N Sr.V. SD DK Medijan GK Min Maks -95% IP +95% IP K 5,0 50,4 33,9 25,0 41,0 65,0 19,0 102,0 8,3 92,5 PDR 5,0 265,2* 39,6 245,0 256,0 298,0 215,0 312,0 216,0 314,4 N = broj opservacija; Sr.V. = srednja vrijednost; SD = standardna devijacija; DK = donji kvartil; GK = gornji kvartil; Min/Maks = najniža i najviša izmjerena vrijednost; -95%/+95% IP = intervali pouzdanosti; * skupina je statistički značajno različita u odnosu prema kontrolnoj skupini (p≤0,05, Kruskal Wallis test) Tablica 43. Vrijednosti LPO (μM) u serumu, u kontrolnoj skupini (K) i skupini s proliferativnom dijabetičkom retinopatijom (PDR) LPO N Sr.V. SD DK Medijan GK Min Maks -95% IP +95% IP K 5,0 26,8 12,1 19,0 25,0 37,0 12,0 41,0 11,7 41,9 PDR 5,0 137,0* 23,8 123,0 126,0 156,0 112,0 168,0 107,5 166,5 N = broj opservacija; Sr.V. = srednja vrijednost; SD = standardna devijacija; DK = donji kvartil; GK = gornji kvartil; Min/Maks = najniža i najviša izmjerena vrijednost; -95%/+95% IP = intervali pouzdanosti; * skupina je statistički značajno različita u odnosu prema kontrolnoj skupini (p≤0,05, Kruskal Wallis test)

Slika 48. Vrijednosti LPO-a u staklastom tijelu (A) i serumu (B) Kontrolna skupina staklasto tijelo (KV), ispitivana skupina staklasto tijelo (PDRV), kontrolna skupina serum (KS), ispitivana skupina serum (PDRS); #skupina je statistički značajno različita od pripadajuće kontrolne skupine (p≤0.05)

92

4.2.3. Malondialdehid Tablice 44., 45. i Slika 49. prikazuju vrijednosti MDA u staklastom tijelu i serumu

za kontrolnu i ispitivanu skupinu. Koncentracije MDA u serumu statistički se značajno

razlikuju između kontrolne skupine i ispitivane skupine (p≤0,05), ali za vrijednosti u

staklastom tijelu to nije slučaj.

Tablica 44. Vrijednosti MDA (nmol/mL) u staklastom tijelu, u kontrolnoj skupini (K) i skupini s proliferativnom dijabetičkom retinopatijom (PDR)

MDA N Sr.V. SD DK Medijan GK Min Maks -95% IP +95% IP K 5,0 26,4 4,5 26,6 28,5 28,5 18,5 29,6 20,8 32,0 PDR 5,0 31,8 5,6 31,4 32,3 32,3 23,5 39,4 24,8 38,7 N = broj opservacija; Sr.V. = srednja vrijednost; SD = standardna devijacija; DK = donji kvartil; GK = gornji kvartil; Min/Maks = najniža i najviša izmjerena vrijednost; -95%/+95% IP = intervali pouzdanosti Tablica 45. Vrijednosti MDA (nmol/mL) u serumu, u kontrolnoj skupini (K) i skupini s proliferativnom dijabetičkom retinopatijom (PDR)

MDA N Sr.V. SD DK Medijan GK Min Maks -95% IP +95% IP K 5,0 44,5 21,4 41,2 46,6 48,2 13,3 73,2 17,9 71,0 PDR 5,0 93,38* 4,6 92,5 92,5 94,7 87,3 100,0 87,7 99,1 N = broj opservacija; Sr.V. = srednja vrijednost; SD = standardna devijacija; DK = donji kvartil; GK = gornji kvartil; Min/Maks = najniža i najviša izmjerena vrijednost; -95%/+95% IP = intervali pouzdanosti; * skupina je statistički značajno različita u odnosu prema kontrolnoj skupini (p≤0,05, Kruskal Wallis)

Slika 49. Vrijednosti MDA u staklastom tijelu (A) i serumu (B) Kontrolna skupina staklasto tijelo (KV), ispitivana skupina staklasto tijelo (PDRV), kontrolna skupina serum (KS), ispitivana skupina serum (PDRS); #skupina je statistički značajno različita od pripadajuće kontrolne skupine (p≤0.05)

93

4.2.4. Glutation

Tablice 46., 47. i Slika 50. prikazuju vrijednosti parametra GSH u staklastom tijelu i

serumu za kontrolnu i ispitivanu skupinu. Vrijednosti GSH u staklastom tijelu, između

ispitivane i kontrolne skupine bile su statistički značajno različite (p≤0.05), dok razlike istih

vrijednosti u serumu nisu imale statistički značaj.

Tablica 46. Vrijednosti GSH (μmol/mL) u staklastom tijelu, u kontrolnoj skupini (K) i skupini s proliferativnom dijabetičkom retinopatijom (PDR)

GSH N Sr.V. SD DK Medijan GK Min Maks -95%

IP +95%

IP K 5,0 0.480 0.116 0.425 0.467 0.572 0.321 0.613 0.335 0.625 PDR 5,0 0.043# 0.004 0.041 0.042 0.044 0.038 0.050 0.038 0.049 N = broj opservacija; Sr.V. = srednja vrijednost; SD = standardna devijacija; DK = donji kvartil; GK = gornji kvartil; Min/Maks = najniža i najviša izmjerena vrijednost; -95%/+95% IP = intervali pouzdanosti; * skupina je statistički značajno različita u odnosu prema kontrolnoj skupini (p≤0,05, Kruskal Wallis) Tablica 47. Vrijednosti GSH (μmol/mL) u serumu, u kontrolnoj skupini (K) i skupini s proliferativnom dijabetičkom retinopatijom (PDR) GSH N Sr.V. SD DK Medijan GK Min Maks -95% IP +95% IP K 5,0 0.017 0.006 0.014 0.019 0.022 0.007 0.023 0.009 0.025

PDR 5,0 0.011 0.003 0.009 0.0093 0.013 0.009 0.017 0.007 0.015 N = broj opservacija; Sr.V. = srednja vrijednost; SD = standardna devijacija; DK = donji kvartil; GK = gornji kvartil; Min/Maks = najniža i najviša izmjerena vrijednost; -95%/+95% IP = intervali pouzdanosti

Slika 50. Vrijednosti GSH u staklastom tijelu (A) i serumu (B) Kontrolna skupina staklasto tijelo (KV), ispitivana skupina staklasto tijelo (PDRV), kontrolna skupina serum (KS), ispitivana skupina serum (PDRS); #skupina je statistički značajno različita od pripadajuće kontrolne skupine (p≤0.05)

94

4.2.5. Superoksid dismutaza Tablice 48., 49. i Slika 51. prikazuju vrijednosti SOD-a u staklastom tijelu i

serumu za kontrolnu i ispitivanu PDR skupinu. Vrijednosti u staklastom tijelu značajno su

više od onih u serumu, u obje skupine. Uočljivo je da su vrijednosti SOD-a statistički

značajno različite između promatranih skupina, u serumu (p≤0.05).

Tablica 48. Vrijednosti SOD-a (U/mL) u staklastom tijelu, u kontrolnoj skupini (K) i skupini s proliferativnom dijabetičkom retinopatijom (PDR) SOD N Sr.V. SD DK Medijan GK Min Maks -95% IP +95% IP K 5,0 14,5 4,6 13,6 14,0 17,6 7,6 19,7 8,8 20,2 PDR 5,0 13,1 2,2 12,2 12,9 14,4 10,1 15,9 10,4 15,8 N = broj opservacija; Sr.V. = srednja vrijednost; SD = standardna devijacija; DK = donji kvartil; GK = gornji kvartil; Min/Maks = najniža i najviša izmjerena vrijednost; -95%/+95% IP = intervali pouzdanosti

Tablica 49. Vrijednosti SOD-a (U/mL) u serumu, u kontrolnoj skupini (K) i skupini s proliferativnom dijabetičkom retinopatijom (PDR) SOD N Sr.V. SD DK Medijan GK Min Maks -95% IP +95% IP K 5,0 0,5 0,1 0,4 0,5 0,5 0,3 0,6 0,3 0,6 PDR 5,0 0,75* 0,2 0,6 0,8 0,8 0,5 1,1 0,5 1,0 N = broj opservacija; Sr.V. = srednja vrijednost; SD = standardna devijacija; DK = donji kvartil; GK = gornji kvartil; Min/Maks = najniža i najviša izmjerena vrijednost; -95%/+95% IP = intervali pouzdanosti; * skupina je statistički značajno različita u odnosu prema kontrolnoj skupini (p≤0,05, Kruskal Wallis)

Slika 51. Vrijednosti SOD u staklastom tijelu (A) i serumu (B) Kontrolna skupina staklasto tijelo (KV), ispitivana skupina staklasto tijelo (PDRV), kontrolna skupina serum (KS), ispitivana skupina serum (PDRS); #skupina je statistički značajno različita od pripadajuće kontrolne skupine (p≤0.05)

95

4.2.6. Prikaz svih korelacija u ekperimentalnome laboratorijskome modelu

U Tablicama 50. i 51. prikazane su sve moguće korelacije mjerenih parametara, između staklastog tijela i seruma, u obje promatrane laboratorijske skupine.

Tablica 50. Korelacije mjerenih varijabli između staklastog tijela i seruma u kontrolnoj skupini.

S E R U M S T A K L A S T O T I J E L O

AOPP

LPO

MDA

GSH

SOD

AOPP

LPO

MDA

GSH

SOD

S E

R U

M

AOPP -0,7000 0,9000 0,5000 0,2000 0,1000 -0,3000 0,4104 -0,3000 0,7000

LPO 0,18812 -0,9000 -0,1000 0,5000 -0,1000 -0,2000 -0,4617 0,8000 -0,2000

MDA 0,037386* 0,037386* 0,2000 -0,1000 0,0000 0,1000 0,5643 -0,5000 0,5000

GSH 0,391002 0,872889 0,74706 0,1000 0,8000 -0,9000 -0,5643 0,1000 0,1000

SOD 0,74706 0,391002 0,872889 0,74706 -0,4000 -0,3000 0,2052 0,7000 0,7000

STA

KLA

STO

TIJ

ELO

AOPP 0,8729 0,8729 1,0000 0,1041 0,5046 -0,6000 -0,8208 0,0000 -0,5000

LPO 0,6238 0,7471 0,8729 0,0374* 0,6238 0,284757 0,5643 -0,2000 -0,2000

MDA 0,4925 0,4338 0,3217 0,3217 0,7406 0,088587 0,321723 -0,3591 0,6669

GSH 0,6238 0,1041 0,391 0,8729 0,1881 1,000000 0,74706 0,088587 0,0000

SOD 0,1881 0,7471 0,391 0,8729 0,1881 0,391002 0,74706 0,321723 1,000000

koeficijenti korelacije (R) prikazani su iznad dijagonale, a statističke (P) vrijednosti ispod dijagonale * statistički značajno različito (p≤0,05), Kruskal Wallis test

Tablica 51. Korelacije mjerenih varijabli između staklastog tijela i seruma u PDR skupini.

S E R U M S T A K L A S T O T I J E L O

AOPP

LPO

MDA

GSH

SOD

AOPP

LPO

MDA

GSH

SOD

S E

R U

M

AOPP 0,9000 -0,1026 -0,6000 0,1000 -0,6000 -0,6000 0,5643 -0,2052 0,3000

LPO 0,0373* 0,0513 -0,2000 -0,3000 -0,5000 -0,3000 0,4104 -0,3591 0,1000

MDA 0,8695 0,9347 0,1539 -0,5643 0,8208 0,6669 -0,2895 -0,8947 0,0513

GSH 0,2847 0,747 0,8048 -0,7000 0,3000 0,7000 -0,4617 -0,0513 -0,5000

SOD 0,8728 0,6238 0,3217 0,1881 -0,3000 -0,8000 0,5643 0,4617 0,6000

STA

KLA

STO

TIJ

ELO

AOPP 0,2848 0,391 0,0886 0,6238 0,6238 0,7000 -0,3591 -0,6156 0,1000

LPO 0,2848 0,6238 0,2189 0,1881 0,1041 0,5528 -0,8208 -0,3591 -0,6000

MDA 0,3217 0,4925 0,6366 0,4338 0,3217 0,2689 0,2847 -0,1316 0,8721

GSH 0,7406 0,5528 0,0403* 0,9347 0,4338 0,8728 0,5528 0,2689 -0,3591

SOD 0,6238 0,8729 0,9347 0,3910 0,2848 0,1881 0,0885 0,5528 0,2847

koeficijenti korelacije (R) prikazani su iznad dijagonale, a statističke (P) vrijednosti ispod dijagonale * statistički značajno različito (p≤0,05), Kruskal Wallis test

96

5. RASPRAVA

Dijabetička retinopatija najteža je očna komplikacija šećerne bolesti, koja se javlja u

70 - 100 % svih bolesnika s dijabetesom u dobi 20 do 74 godina i vodeći je uzrok sljepoće u

razvijenim zemljama (4, 177, 178).

Točan slijed biokemijskih događanja zbog kronične hiperglikemije, uloga

oksidativnog stresa i razvoj patoloških promjena koje vode do dijabetičke retinopatije i dalje

su nedovoljno razjašnjeni.

Proliferativnu dijabetičku retinopatiju (PDR) obilježava izražena hipoksija uzrokovana

mikrovaskularnim okluzijama u mrežnici koje potiču angiogenezu. Nove krvne žile su krhke i

porozne, rastu duž mrežnice i u staklasto tijelo. Klinički znakovi očituju se u venskim

dilatacijama, vaskularnim petljama, abnormalnim mikrovaskularizacijama i hemoragijama.

Glavno obilježje PDR-a su neovaskularizacije s ishodištem u mrežnici uz vrlo često prateće

fibrozne membrane, koje se protežu u staklasto tijelo. Zbog poroznosti novostvorenih krvnih

žila česta su krvarenja u staklastom tijelu, a zbog pratećeg trakcijskog učinka fibrovaskularnih

membrana, može doći i do raslojavanja unutar mrežnice (102, 159). Sve navedene promjene

uvelike ugrožavaju vid, a mogu dovesti i do sljepoće.

Istraživanja na molekularnoj razini upućuju na to da prisutnost trajne hiperglikemije

izravno i/ili posredno pokreće niz biokemijskih promjena kao što su: autooksidacija glukoze,

poliolski metabolički put, neenzimatska glikozilacija bjelančevina, aktivacija protein kinaze C

i heksozaminski metabolički put što sve izaziva ireverzibilne funkcionalne i strukturne

promjene složenih makromolekula, dijelova ekstracelularnog matriksa i nukleinskih kiselina

(179). Osim navedenih biokemijskih promjena, unutarstanična hiperglikemija uzokuje

prekomjernu proizvodnju slobodnih radikala i reaktivnih kisikovih vrsta, odnosno nastanak

oksidativnog stresa zbog smanjenja antioksidativne obrane i povećanja lipidne peroksidacije

(83).

Oksidativni stres, odnosno RKV djeluju na proteine, lipide i ugljikohidrate. Oksidirane

molekule uzrokuju daljnja oksidativna oštećenja koja dovode do strukturnih i funkcionalnih

promjena staničnih organela. Izražen oksidativni stres oštećuje i antioksidativnu obranu, što se

očituje kroz smanjenje endogenih „hvatača“ oksidansa i padom aktivnosti glutation reduktaze,

glutation peroksidaza, superoksid dismutaze i katalaze (79, 82). Sve navedene biokemijske

reakcije i oksidativni stres utječu na promjene vaskularnih stanica mrežnice (endotelne

stanice, periciti), kao i na astrocite, Müllerove stanice, fotoreceptore, bipolarne stanice,

97

amakrine stanice, ganglijske stanice i druge stanice neurosenzornoga mrežničnog sloja, što,

nadalje, ima važnu ulogu u razvoju dijabetičke retinopatije (3, 102).

Važno je naglasiti da mrežnica ima najveću potrošnju kisika, u usporedbi s ostalim

organima u tijelu. Mozak troši velike količine kisika, gotovo 20% od ukupnog unosa u tijelo,

ali zahtjevi mrežnice još su izraženiji. Naime, mrežnica troši 31 ml O2/mg tkiva na sat što je

dvostruko više od bubrega, koji je drugi organ po aktivnosti i potrošnji kisika (180). Imajući

tu činjenicu na umu zaključujemo da narušeni oksidativni procesi u mrežničnom tkivu, znatno

ugrožavaju staničnu homeostazu i pogoduju razvoju promjena. Mrežnica ima visok sadržaj

polinezasićenih masnih kiselina i ima najveći unos kisika i oksidirane glukoze, u odnosu

prema bilo kojem drugom tkivu, stoga taj fenomen čini mrežnicu vrlo ranjivom na oksidativni

stres (104). Zbog svega postoji jaka korelacija između hiperglikemije, promjena u redoks

homeostazi i oksidativnog stresa, ključnih događaja u patogenezi dijabetičke retinopatije.

U ovom istraživanju, analizirali smo parametre u dvama različitim tjelesnim medijima,

staklastom tijelu i serumu. Staklasto tijelo ispunjava 2/3 vitrealne šupljine. U volumenu od 4

ml temeljna supstancija je voda, a ostatak je mješavina kolagenih vlakana, hijaluronske

kiseline, hijalocita, anorganske soli, lipida, proteina (uglavnom albumina), faktora koagulacije

i faktora komplemenata. Proteini se mogu akumulirati u staklastom tijelu, filtracijom iz krvi

(npr. albumini) i/ili difuzijom iz okolnih tkiva. Zbog bliskog kontakta staklastog tijela i

unutarnjeg sloja mrežnice, fiziološka i patološka stanja mrežnice utječu na koncentraciju

proteina i biokemijski sastav staklastog tijela. Staklasto tijelo metabolički je vrlo aktivan

medij, stoga je apsolutno prihvaćena i njegova analiza u eksperimentalnim istraživanjima, kao

indiretnog pokazatelja događanja u mrežničnom tkivu (181). Mrežnica se zbog funkcionalne i

biokemijske kompleksnosti i anatomske nepristupačnosti ne može egzaktno analizirati u živih

organizama biopsijom mrežničnog tkiva.

Istraživanje se temeljilo na mjerenju koncentracija VEGF molekula, markera

oksidativnog stresa i enzima antioksidativnog sustava, u staklastom tijelu i serumu, kod

proliferativne dijabetičke retinopatije, kao dobrog primjera oksidativnog stresa i narušene

antioksidativne obrane. U studiju je bilo uključeno 37 bolesnika s proliferativnom

dijabetičkom retinopatijom, označenih kao ispitivana PDR skupina i 51 bolesnik bez

metaboličkog poremećaja, koji su činili kontrolnu skupinu.

98

Hipotezom istraživanja pretpostavili smo povišene vrijednosti VEGF-a u uvjetima

izraženog oksidativnog stresa, povišene vrijednosti oksidacijskih proteina, a smanjene

vrijednosti kapaciteta antioksidativnog sustava u oba istraživana medija.

Također, očekujući pozitivne korelacije mjerenih parametara između staklastog tijela i

seruma, predviđali smo mogućnost rane dijagnostike retinopatičnih promjena mjerenjima

serumskih vrijednosti.

Nakon uočenih pozitivnih korelativnih odnosa promatranih parametara između navedenih

uzoraka i signifikantnih pozitivnih korelacija između serumskih vrijednosti i vrijednosti u

staklastom tijelu, na humanome modelu, pristupilo se drugom dijelu istraživanja koji je

uključivao praćenje određenih parametara, na animalnom (štakorskom) eksperimentalnome

aloksanskome modelu dijabetesa.

Metaboličke abnormalnosti kod dijabetesa uzrokuju mitohondrijsku hiperprodukciju

superoksida. Povećana proizvodnja superoksida središnji je i glavni posrednik oštećenja tkiva,

što uzrokuje aktivaciju metaboličkih puteva koji su uključeni u patogenezu dijabetičkih

komplikacija. Rezultati istraživanja potvrđuju da ekspresija VEGF-a inducirana

hiperglikemijom i hipoksijom ima važnu ulogu u angiogenezi dijabetičke retinopatije. Brojne

stanice mrežnice, potaknute opsežnom ishemijom, izazivaju angiogenezu aktivirajući brojne

upalne čimbenike, među kojima su važni interleukini (IL-1,IL-6,IL-8). Povećana produkcija

reaktivnih kisikovih vrsta uzrokuje dugotrajne genetske promjene koje pokreću ekspresiju

gena uključenih u povećano oslobađanje različitih faktore rasta (VEGF, TGF-, IGF-1,

PDGF), čija se koncentracija u mrežnici i staklovini u hipeglikemičkim uvjetima dramatično

povećava (6, 168, 169). U hipoksičnim stanicama, aktiviranjem podjedinica HIF-a

(hipoksijom induciran faktor), nastaje njegov dimer kao transkripcijski faktor (HIFα/β).

Novostvoreni faktor veže se na VEGF gen i inducira proces transkripcije, što posljedično

dovodi do nakupljanja međustaničnih VEGF molekula.

Trenutačno ne postoje jasni podaci kojima se može opisati točan molekularni mehanizam

djelovanja slobodnih radikala na produkciju VEGF-a. Oksidativni stres, putem mnoštva

posrednika i aktiviranih puteva, djeluje na hiperprodukciju VEGF-a u dijabetičara. Samo

pojedini radovi prikazuju izravan utjecaj slobodnih radikala na signalne prenose uključene u

VEGF ekspresiju, npr. povećani utjecaj slobodnih radikala na MAPK (mitogen-activated

protein kinase), što u konačnici rezultira povećanom produkcijom VEGF-a (182).

99

Najvažniji predstavnik skupine VEGF faktora je VEGF-A, ključni regulator

angiogeneze koji utječe na stvaranje kolateralnih, novih krvnih žila i povećava permeabilnost

mikrovaskularija, i upravo je on bio analiziran.

U našem istraživanju, analizirajući deskriptivne vrijednosti VEGF-a, uočene su

povišene vrijednosti VEGF-a i u serumu i u staklastom tijelu, u skupini dijabetičara, u

usporedbi s kontrolnom skupinom, gdje su te vrijednosti bile niže. Statistički je potvrđena

razlika (p<0,001 Wilcoxonov test), i u staklastom tijelu i u serumu, unutar svake skupine

zasebno. Rezultati statističkog testiranja pokazuju da su razlike između skupina statistički

značajne i u staklastom tijelu i u serumu (p<0,001 Mann-Whitneyev U test). Analiza

korelacija vrijednosti VEGF-a u staklastom tijelu i serumu, u skupini dijabetičara imala je

negativan predznak, što znači da zbog povišenih vrijednosti VEGF-a u staklastom tijelu,

vrijednosti u serumu ne rastu. Kontrolna skupina imala je pozitivan predznak te korelacije.

Statistička značajnost u analizi tih korelacija nije potvrđena.

Naš rad, u suglasnosti je s istraživanjima Burgos i sur., Hernandez i sur., Simo i sur.

(7, 183, 184). Sve navedene studije, izvještavaju o visokim razinama VEGF-a u staklastom

tijelu kod bolesnika s proliferativnom dijabetičkom retinopatijom i sniženim vrijednostima u

serumu.

Sydorova i Lee, kao i Baharivand i sur. upućuju na povišene razine VEGF-a u

staklastom tijelu i serumu (8, 185). Mnogo je više provedeno studija u kojima se mjerio

VEGF samo u staklastom tijelu, kod dijabetičara s PDR-om, a bez usporedbe sa serumom.

Sve studije upućuju na znatno više vrijednosti VEGF-a u skupinama s PDR-om, nego u onim

kontrolnim (Aiello i sur., Zhou i Zhang, Funatsu i sur., Watanabe i sur., Malik i sur.) (186 -

190). Istraživanja potvrđuju znatno više vrijednosti VEGF-a u staklastom tijelu kod bolesnika

s PDR-om u odnosu prema kontrolnim skupinama. Taj podatak upućuje na biokemijsku

autonomnost oka kao organa, jer studije dokazuju da su VEGF molekule unutar oka najvećim

dijelom i stvorene u očnom tkivu. Zbog narušene krvnomrežnične barijere obilna je

ekstravazacija te molekule u staklasto tijelo. U hipoksičnim uvjetima, proizvodnja VEGF-a u

oku je povišena i do 30 puta, stvarajući se i u drugim stanicama mrežnice, a ne samo u

endotelu. Takva hiperprodukcija VEGF-a potiče stvaranje novih krvnih žila, vaskularnu

poroznost i edem, što nadalje mijenja stanice krvožilnoga mrežničnog sustava, stanice

neurosenzornog sloja i glije te pridonosi napredovanju retinopatije (12, 191).

Nadalje, je pronađena pozitivna i statistički značajna korelacija između dobi ispitanika

i vrijednosti VEGF-a u serumu u skupini PDR (p=0,021). Isti rezultat su dobili Mohan i sur.

100

kod dijabetičara u plazmi (192). To je činjenica koja upućuje na nove ciljeve istraživanja svih

čimbenika koji utječu na razvoj i progresiju dijabetičke retinopatije, a to su: trajanje

dijabetesa, loša regulacija glikemije, arterijska hipertenzija, nefropatija, hiperlipidemija i

drugo (pretilost, pušenje). Sve navedeno su stanja koja se intenziviraju starošću, uzrokuju

promjene na krvnim žilama, a posljedično i povećano izlučivanje VEGF-a. Istraživanje

Baharivand i sur. potvrđuju povišene vrijednosti VEGF-a, u staklastom tijelu i serumu kod

dijabetičara, ali uz niže vrijednosti u oba medija kod dijabetičara s neproliferativnom

dijabetičkom retinopatijom, s bolje reguliranom glikemija. Također upozoravaju na utjecaj

sistemskih lijekova (statini, ACE inhibitori) koji smanjuju vrijednosti serumske VEGF (185),

što može biti važno u tumačenju nižih serumskih vrijednosti u usporedbi s vrijednostima iz

staklastog tijela. Podatak iz našeg istraživanja, koji upozorava na izrazito visoku vrijednost

VEGF-a u serumu dijabetičara, može se objasniti postojanjem sistemskih, makrovaskularnih

poremećaja udruženih s dijabetesom (kardiovaskularne, cerebrovaskularne, periferne

vaskularne bolesti), trajanjem dijabetesa i glikemijskim vrijednostima, gdje se dodatno

generiraju molekule VEGF-a i na taj način utječu na povišene serumske koncentracije (193,

194).

Iako točan mehanizam, kojim oksidativni stres pridonosi razvoju komplikacija

dijabetesa, nije dovoljno razjašnjen, dobro je poznato da posljedice kroničnoga oksidativnog

stresa uključuju oštećenje bioloških makromolekula, poremećaj u homeostazi i generiranje

novih RKV-a, pridonoseći na taj način daljnjem oštećenju i razvoju komplikacija dijabetičke

retinopatije.

Danas se sve više razvijaju metode indirektnog mjerenja (procjenjivanja) razine

sekundarnih produkata oksidativno modificiranih molekula, jer je izravno mjerenje

oksidativnog stresa in vivo vrlo složeno i zahtjevno. Jedan od parametara za procjenu

oksidativnog stresa je i AOPP.

AOPP nastaje tijekom oksidativnog stresa, putem aktiviranja kloriranih oksidanata,

uglavnom hipoklorne kiseline i kloramina (nastali posredovanjem mijeloperoksidaze u

aktiviranim neutrofilima). Witko-Sarsat i Kural opisuju oksidirane molekule koje se

identificiraju kao proteini koji imaju križne spojeve s ditirozinom, a biokemijske analize u

plazmi opisuju AOPP kao molekulu s dvama UV vidljivim „vrhuncima“, apsorbancije 340

nm, visoke i niske molekularne težine (195, 196). Količina AOPP-a, mjerena u našem

istraživanju, temeljila se, također, na očitavanju dobivenih apsorbancija, iz kalibracijske

krivulje koja je rađena na osnovi koncentracija prethodno pripremljenog standarda i dobivenih

pripadajućih apsorbancija.

101

AOPP vrijednosti u našem istraživanju bile su statistički značajno više u staklastom

tijelu i serumu ispitivane PDR skupine, u usporedbi s kontrolnom skupinom (p˂0,001;

Wilcoxonov test). Nije nađena statistički značajna razlika između kontrolne skupine i

ispitivane PDR skupine u vrijednostima AOPP-a u staklastom tijelu, dok je ta razlika u

serumu statistički bila značajna (p˂0,008; Mann-Whitneyev U test). Podaci ovog istraživanja,

za serum, u suglasnosti su s provedenim manjim brojem studija. Pan i sur. upozoravaju na

povišene vrijednosti AOPP-a u serumu dijabetičara s dijabetičkom retinopatijom (197).

Baskol i sur. izvještavaju također o povišenim vrijednostima AOPP-a u serumu (bez

statističke značajnosti) kod oboljelih od dijabetesa koji nisu imali dijabetičku retinopatiju

(198). Nadalje, Kural i sur. upozoravaju na povišene vrijednosti AOPP-a u plazmi, kod

dijabetičara s dijabetesom tipa I, bez spominjanja prisutnosti dijabetičke retinopatije (195).

Tabak iznosi povišene vrijednosti AOPP-a u plazmi dijabetičara, ali pritom naglašava izrazito

povišene vrijednosti te molekule u dijabetičara s komplikacijama (199).

Rezultati navedenih studija pokazuju da oksidacija proteina počinje u ranim fazama

dijabetesa i raste s napredovanjem bolesti, a AOPP je potvrđen serumski biomarker za

procjenu oksidativnog stresa u dijabetesu (197 - 199).

Za razliku od svih dosadašnjih istraživanja, u našem radu prvi put se mjerio AOPP u

staklastom tijelu bolesnika s izraženom proliferativnom dijabetičkom retinopatijom. Stoga

naše rezultate mjerene u staklastom tijelu nemamo s čime usporediti. Vrijednosti AOPP-a u

staklastom tijelu ispitivane PDR skupine bile su više u usporedbi s kontrolnom skupinom.

Serumske vrijednosti AOPP-a bile su znatno više u usporedbi s vrijednostima staklastog tijela

i to u obje skupine. Obrazloženje tih podataka, ispitivanje korelativnih odnosa AOPP

molekule između seruma i staklastog tijela, kao i analiza te molekule unutar staklastog tijela u

skupini dijabetičara, zahtijeva dodatna istraživanja. U štakora uočene su različite vrijednosti

AOPP-a, mjerenog u staklastom tijelu i serumu, u usporedbi s ljudskim. Mjerene vrijednosti u

staklastom tijelu bile su znatno više u obje skupine, u usporedbi sa serumskim vrijednostima.

Statistički značajna korelacija dokazana je u serumu dijabetičkih štakora između AOPP-a i

LPO-a, što upućuje na prisutnost oksidativnog stresa i na eksperimentalnome modelu, ali

drugačije distribucije, u usporedbi s humanim modelom.

U evaluaciji oksidativnog stresa, osim produkata oksidiranih proteina, prihvaćena i

najviše primjenjivana je lipidna peroksidacija, odnosno mjerenje produkata lipidne

peroksidacije (malondialdehid, akrolein, konjugirani dieni, 4-hidroksi-2-nonenal).

Produkti lipidne peroksidacije u većim količinama imaju izrazito toksično djelovanje,

inhibiraju stanični rast, sposobni su modificirati lipoproteine.

102

Studije upozoravaju na važnost produkata LPO-a u razvoju vaskularnih bolesti, kao što su

ateroskleroza, dijabetes, neurodegenerativne bolesti (200).

Mrežnica ima visok sadržaj polinezasićenih masnih kiselina i najveći unos i protok

kisika i glukoze, u odnosu prema drugim tkivima, stoga taj fenomen čini mrežnicu

osjetljivijom na oksidativni stresa, od ostalih organa (201).

Lipidna hidroperoksidaza (LHP), kao produkt lipidne peroksidacije, kvantitativni je

pokazatelj oksidacijskih oštećenja višestruko nezasićenih masnih kiselina u patofiziološkim

poremećajima, stoga nam je ona bila marker za procjenu LPO-a.

U našem istraživanju vrijednosti LPO-a bile su statistički značajno povišene u

ispitivanoj skupini dijabetičara, u staklastom tijelu i serumu (p˂0,001; Wilcoxonov test).

Također je pokazana statistički značajna razlika u razinama LPO-a, između kontrolne i

ispitivane skupine, u staklastom tijelu i serumu (p˂0,001 u oba slučaja; Mann-Whitneyev U

test). Korelacija vrijednosti LPO-a u staklastom tijelu i serumu ima pozitivan predznak za

obje promatrane skupine, a za ispitivanu skupinu dijabetičara je i statistički značajna. To

upućuje, da kod dijabetičara aktivnost lipidne peroksidacije raste u serumu paralelno s rastom

u staklastom tijelu. Ovi rezultati našeg istraživanje su u suglasnosti s manjim brojem radova,

koji govore o pozitivnoj korelaciji lipidne peroksidacije, između seruma i staklastog tijela u

bolesnika s PDR-om (202, 203). Lipidna peroksidacija, kao marker oksidativnog stresa, više

je istraživana u krvnim pripravcima, nego u staklastom tijelu, kod dijabetičara.

Malondialdehid, bio je treći parametar kojim se procijenjivao stupanj oksidativnog stresa.

Endogeni MDA nastao oksidacijom višestruko nezasićenih masnih kiselina jedan je od

završnih produkata lipidne peroksidacije. Najštetniji je i jedan je od najčešćih produkata

proteinske oksidacije, a tvori komplekse koji se nalaze u stanicama različitih organa. Jedno od

ciljnih mjesta njegova djelovanja je gvanin u DNA, što može stvarati mutagena oštećenja

stanica. MDA reagira s proteinima krvnih žila te na taj način pridonosi i strukturalnim

promjenama vaskularija.

Rezultati ovog istraživanja pokazuju da su vrijednosti MDA u skupini dijabetičara u

staklastom tijelu i serumu više od vrijednosti u kontrola. Razlike između vrijednosti u serumu

i staklastom tijelu bile su statistički značajne, i za kontrolnu i za ispitivanu dijabetičku

skupinu (p=0,011, Wilcoxonov test).

Turk i sur. također upozoravaju na povišene vrijednosti tiobarbituratne kiseline

(indirektni pokazatelj MDA) u plazmi dijabetičkih bolesnika, s naglaskom na povišenije

vrijednosti u ispitanika s dijabetičkom retinopatijom, ali bez statističke značajnosti u

usporedbi s dijabetičarima bez mikroangiopatskih promjena (204). Vidya i sur. dokazali su

103

povišene serumske vrijednosti MDA u dijabetičara, MDA je bio povišen i u skupini s

dijabetičkom retinopatijom, ali i u skupini dijabetičara koji nisu imali razvijenu retinopatiju

(205). Saxena i sur. prvi put upućuju na povezanost lipidne peroksidacije i oblika dijabetičke

retinopatije, analizirajući trombocitnu tiobarbituratnu kiselinu u skupinama s

neproliferativnom i proliferativnom dijabetičkom retinopatijom. Povišene vrijednosti bile su

zabilježene u obje skupine, no više u onoj s proliferativnom dijabetičkom retinopatijom (206).

U našem radu vrijednosti parametra MDA u staklastom tijelu statistički značajno su se

razlikovale između kontrolne skupine i ispitivane PDR skupine (p=0,001). Za vrijednosti u

serumu to nije bio slučaj. Tim podatkom ponovno smo potvrdili osjeljivost očnog tkiva na

oksidacijske procese. Koncentracija MDA u plazmi/serumu upućuje na oksidativni stres

organizma, a koncentracija MDA u pojedinom organu na oksidativni stres u tom organu.

Daljnjim statističkim istraživanjem i analiziranjem uočeno je da se vrijednosti MDA u serumu

unutar kontrolne skupine razlikuju po spolu (p=0,043), tj. vrijednosti su više u muškaraca

(medijan 158,7 nmol/L), nego u žena (medijan 99,8 nmol/L). Lipidna je peroksidacija bez

obzira na metaboličke poremećaje uvijek prisutna i utječe na razgradnju višestruko

nezasićenih masnih kiselina, narušava cjelovitost staničnih membrana i naknadno oštećuje

biološke makromolekule produktima peroksidacije. Povećana lipidna peroksidacija povećava

rizik za razvoj ateroskleroze i drugih patoloških stanja. Podatak da je unutar kontrolne

skupine muškaraca detektirana povećana koncentracija MDA ukazuje na potrebu istraživanja

utjecaja sistemskih poremećaja (kardiovaskularni, metabolički, imunološki) na oksidacijske

procese u oba spola. Uočena je i statistički značajna negativna korelacija vrijednosti MDA u

serumu s dobi, kod dijabetičara. S obzirom na taj podatak, starenje i hiperglikemija su

poveznice. Prvu molekularnu teoriju ljudskog starenja predložio je Denham Harman, prije

više od 50 godina (207). Teorija je temeljena na oksidativnim oštećenjima zbog

hiperprodukcije slobodnih radikala, nastalih kao sporedni proizvodi metabolizma ili štetnih

utjecaja iz okoline, što s vremenom uzrokuje starenje na staničnoj, tkivnoj i organskoj razini

(208). Iako je ta teorija danas prihvaćena, ona je ipak nedostatna, pa se još raspravlja o

biološkim procesima starenja i specifičnostima molekularnih procesa, uključenih u starenje.

Naravno, dijabetes kao metabolička bolest je čimbenik koji pridonosi procesima oksidacije i

starenju. S obzirom na to da se dijabetes smatra epidemijskom bolešću, a životni vijek se

produljio, njihov međusobni odnos trebao bi biti predmetom daljnjih istraživanja.

Korelacijske vrijednosti MDA u staklastom tijelu i serumu bile su negativne za

kontrolnu skupinu, a pozitivne za ispitivanu PDR skupinu, ali bez statističke značajnosti.

104

U ovom istraživanju, povišene vrijednosti LPO-a i MDA u staklastom tijelu ispitanika s

proliferativnom dijabetičkom retinopatijom upozoravaju da višak slobodnih radikala uzrokuje

stanična oštećenja i time sudjeluje i pridonosi patogenezi dijabetičke retinopatije.

Kao i u ljudi, u pokusu na laboratorijskim štakorima uočene su statistički značajno povišene

vrijednosti LPO-a u staklastom tijelu i serumu u PDR skupini. Povišene vrijednosti MDA s

statističkim značajem nađene su u serumu. U staklastom tijelu vrijednosti su bile niže i bez

statističkog značaja.

Budući da oksidativni stres predstavlja nerazmjer između povećanog stvaranja i/ili

narušenog uklanjanja RKV-a, antioksidantni obrambeni sustav stanice ima važnu ulogu u

opsegu sveukupnog djelovanja oksidativnog stresa.

Aktivnost antioksidativnih enzima očituje se u čišćenju slobodnih radikala i

održavanju oksidacijsko-redukcijske homeostaze. U dijabetesu je smanjena antioksidativna

zaštita (superoksid dismutaza, glutation peroksidaza, katalaza). Istraživanja na životinjama, s

eksperimentalno izazvanim dijabetesom, potvrđuju smanjenje aktivnosti unutarstaničnih

antioksidativnih enzima, ali upozoravaju i na smanjene intraretinalne razine glutationa (3, 209

- 211).

Malobrojne analize antioksidativne obrane u staklastom tijelu dijabetičara s

proliferativnom dijabetičkom retinopatijom, su oprečne. Verdejo i sur., na temelju analize

superoksid dismutaze i katalaze govore o smanjenoj antioksidativnoj zaštiti u staklastom tijelu

kod dijabetičara s PDR-om (212). Mancino i sur. procjenjujući TAC (eng. total antioxidant

capacity) putem ORAC-a (eng. oxygen radical absorbance capacity) upozoravaju na smanjenu

antioksidativnu zaštitu u staklastom tijelu u skupini s PDR-om (202). Suprotno navedenim

istraživanjima iznosi Izuta, na temelju antioksidacijskog potencijala (engl. potential

antioxidant, PAO) i upućuje na povišene vrijednosti antioksidativne obrane u staklastom tijelu

(203). U svim navedenim studijama vrijednosti serumskih antioksidansa pozitivno su

korelirale s vrijednostima u staklastom tijelu kod bolesnika s PDR-om. Rezultati pojedinih

istraživanja mogu biti posljedica sveukupnog zajedničkog djelovanja raznih antioksidativnih

enzima. Stoga je i preporuka da se daljnja istraživanja više fokusiraju na pojedine

antioksidativne enzime u staklastom tijelu, kako bi se bolje evaluirali biokemijski mehanizmi

antioksidativne zaštite u staklastom tijelu kod dijabetičke retinopatije.

Reducirani glutation (GSH) je najpotentnija obrambena molekula unutar stanice. Može

djelovati kao čistač RKV-a i modulirati unutarstanična redoks stanja (213, 214). Pripada

skupini tzv.“hvatača“ oksidansa. Vrlo je važna molekula jer o njoj ovisi i aktivnost

unutarstaničnoga enzima glutation peroksidaze. GSH je djelatni antioksidans koji u prisutnosti

105

bilo kojeg oksidansa u organizmu oslobađa atom vodika i time ga kemijski neutralizira. Pri

tome se povezuju dva ostatka reduciranoga glutationa u njegov složeni oblik koji se naziva

oksidirani glutation (GSSG). Metabolizam reduciranoga glutationa u organizmu funkcijski je

organiziran, jer enzim glutation reduktaza obnavlja GSH iz GSSG-a preko prenositelja atoma

vodika u spoju NADPH.

Iz navedenog slijedi da je vrijedno istražiti GSH i GSSG molekule, te njihov

međusobni odnos u dijabetičkoj retinopatiji. Većina dostupne literature svjedoči o sniženim

vrijednostima i smanjenoj borbi GSH protiv oksidativnog stresa u dijabetičkoj retinopatiji

(215 - 217), iako je u različitim eksperimentalnim modelima hiperglikemije dokazana i

povišena koncentacija enzima odgovornih za stvaranje GSH u retini (218 - 220).

U našem istraživanju analizirali smo pojedinačno GSH i GSSG molekule te njihov

međuodnos (GSH/GSSG), s obzirom na poznato uzajamno djelovanje tih molekula.

Vrijednosti GSH u staklastom tijelu, u obje skupine, bile su niže od vrijednosti u

serumu. Razlike između vrijednosti u serumu i staklastom tijelu statistički su značajne u obje

promatrane skupine (p˂0,001 Wilcoxonov test). U staklastom tijelu vrijednosti GSH između

ispitivane PDR i kontrolne skupine bile su statistički značajno različite (p<0,001). Zabilježene

su više vrijednosti u staklastom tijelu PDR skupine. Razlike istog parametra u serumu između

obje skupine, nisu bile statistički značajne (p=0,073). Korelacija vrijednosti GSH u staklastom

tijelu i serumu imala je negativan predznak u obje skupine, što ukazuje da porast vrijednosti u

staklastom tijelu prati pad vrijednosti u serumu. Ni jedna korelacija nije se pokazala statistički

zanačajnom.

Pokus na eksperimentalnim štakorima slaže se s procjenom aktivnosti GSH na

humanome modelu; naime i tu smo uočili statistički značajne povišene vrijednosti GSH u

staklastom tijelu u skupini PDR.

Vrijednosti GSSG-a, kao i GSH, bile su niže od vrijednosti u serumu. Razlike između

vrijednosti parametara u serumu i staklastom tijelu statistički su značajne u obje promatrane

skupine (p˂0,001 Wilcoxonov test). Razlike u vrijednostima GSSG-a u staklastom tijelu bile

su statistički značajne između kontrolne i ispitivane skupine (p=0,005), dok kod vrijednosti u

serumu to nije bio slučaj (p=0,106). Uočili smo i statistički granično značajnu razliku u

vrijednostima GSSG-a u serumu u kontrolnoj skupini između muškaraca i žena.

Glutationski antioksidativni sustav važan je u oksidacijskim procesima. Nikotinamid

adenin dinukleotid fosfat odgovoran je za održavanje glutationskog ciklusa. GSH se obnavlja

iz GSSG-a preko prenositelja atoma vodika u spoju NADPH, a poznato je da u dijabetesu

106

aktivacija poliolnog puta dovodi do iscrpljenja NADPH, što rezultira smanjenjem

glutationskoga antioksidativnog kapaciteta. GSH uz prateće molekule i reakcije, unutar tog

ciklusa, mogu biti oštećene i glikozilacijskim reakcijama, što je dodatno potencirano loše

reguliranim glikemijama. Temeljni princip neenzimatske glikozilacije (Maillardova reakcija)

je sposobnost glukoze da sa slobodnim amino skupinama bjelančevina konjugira bez

posredovanja enzima, kroz kemijske reakcije stvara Amadorijeve spojeve, koji nizom

kemijskih pregradnji tvore - završne proizvode glikozilacije, AGE proizvodi. Glukoza također

procesom autooksidacije na kraju stvara glikoksidacijske AGE proizvode. Nastanak AGE

proizvoda, kroz oksidativne reakcije potiče stvaranje superoksidnih aniona i istovremeno

inaktiviranje enziskog ciklusa GSH (88, 93 - 95). Hiperglikemija u dijabetesu povezana je s

neenzimskom glikozilacijom i oksidativnim stresom. Sve navedeno narušava stanični rad i

izravno/neizravno troši i mijenja antioksidativni sustav.

Sveukupna mulifaktorijanost djelovanja na serumske vrijednosti GSH i GSSSG

molekula, objašnjava rezultat našeg istraživanja koji upućuje na pozitivu korelaciju dobi

ispitanika i vrijednosti GSSG-a u serumu u skupini dijabetičara. Brojne studije upozoravaju

na povezanost serumskih/plazmatskih antioksidativnih svojstava i sustavnih događanja unutar

dijabetesa (3, 103). Trajanje dijabetesa, glikemijska kontrola, hiperlipidemija, unos viška

kalorija, prehrana, stil života, starenje, čimbenici su koji dodatno utječu, unutar dijabetesa, na

antioksidativnu regulaciju. Zbog postojanja malobrojnih studija kod dijabetičara s

proliferativnom dijabetičkom retinopatijom, a ne nalaženjem podataka povezanosti GSSG-a i

dobi kod dijabetičara s PDR-om, vjerujemo da je vrijedno nadalje ispitati tu korelaciju, na

većem broju ispitanika, analizirajući pri tome i rizične sistemske čimbenike (trajanje

dijabetesa, glikemijska kontrola, hiperlipidemija, prehrana, stil života-tjelesna aktivnost).

Nadalje rezultati istraživanja su pokazali snižene vrijednosti odnosa GSH/GSSG u

staklastom tijelu u odnosu prema serumu, u obje promatrane skupine. Vrijednosti između

staklastog tijela i seruma statistički značajno su se razlikovale (p<0,001 Wilcoxonov test). I

uz taj odnos uočena je negativna korelacija dobi ispitanika i odnosa GSH/GSSG u serumu u

ispitivanoj PDR skupini. Taj podatak dodatno ukazuje na utjecaj multifaktorijalnih čimbenika

na antioksidativnu obranu, ali i potencira razmišljanja o budućim analizama kemijskih

reakcija unutar pojedinih enzima.

Antioksidativni enzim, koji smo nadalje istraživali je superoksid dismutaza (SOD).

SOD katalizira dismutaciju superoksidnih radikala u vodikov peroksid i kisik. U dijabetesu, u

mrežnici dokazana je oštećena antioksidativna aktivnost SOD enzima (221, 222). SOD djeluje

107

kao glavni protagonist obrane citotoksičnih učinaka superoksidnoga radikala i učinkovito štiti

tkivo mrežnice od RKV-a nastal(ih)og oksidacijom membranskih fosfolipida. SOD se stoga

smatra prvim korakom intracelularne antioksidativne obrane. MnSOD djeluje kao jedan od

glavnih mitohondrijskih čistača, a hipeglikemija umanjuje njegovu djelatnost.

U našem istraživanju vrijednosti SOD-a u staklastom tijelu bile su znatno niže u

skupini dijabetičara u odnosu prema vrijednostima unutar kontrolne skupine, za razliku od

seruma, gdje su vrijednosti SOD-a bile znatno više u skupini dijabetičara. Vrijednosti u

staklastom tijelu i vrijednosti u serumu, statistički su značajne za kontrolnu i ispitivanu

skupinu dijabetičara (p˂0,001 Wilcoxonov test) i za staklasto tijelo i serum. To upućuje da je

antioksidativna obrana SOD molekule unutar oka smanjena. Povišene serumske vrijednosti

SOD-a u dijabetičara možemo komentirati generiranjem antioksidativne zaštite i iz drugih

izvora (prehrana, suplementi).

Pokusom na laboratorijskim štakorima također smo upozorili na snižene vrijednosti

SOD-a u staklastom tijelu, a povišene vrijednosti u serumu, unutar ispitivane PDR skupine.

Statistička značajnost dokazana je između promatranih skupina, u serumu.

Malo je istraživanja koja analiziraju antioksidativni status u staklastom tijelu kod dijabetičara

s proliferativnom dijabetičkom retinopatijom i uspoređuju sa serumom/plazmom. Mrežnični

antioksidativni status do sada se više istraživao na eksperimentalnim životinjskim modelima,

u kojih je induciran dijabetes. Podaci tih studija upućuju na smanjene vrijednosti

antioksidativne zaštite, SOD-a, glutationa, glutation reduktaze, glutation peroksidaze i

katalaza unutar oka (207, 220). Rezultati našeg istraživanja također upućuju na poremećenu

antioksidativnu aktivnost unutar oka, što je u skladu s drugim istraživanjima, Verdejo i sur.,

Castorina i sur., Mancio i sur. (202, 212, 223). Isto tako, Izuta upozorava na povišene

vrijednosti antioksidanasa u staklastom tijelu, ali i u serumu (203).

Uzrok tih različitosti je redoks (oksidacijsko-redukcijsko) stanje, koje je prisutno u trenutku

uzimanja uzoraka za ispitivanje, a posljedica je trajanje dijabetesa, glikemijske kontrole,

hiperlipidemije, pretilosti, itd. Nadalje, svaki antioksidantni sustav može obavljati svoju

djelatnost različitim biokemijskim mehanizmima, različite učinkovitosti, s obzirom na

kemijski sastav i stadij bolesti.

Naši rezultati upućuju na povezanost hiperglikemije i granično ili beznačajno

povišenih vrijednosti GSH, GSSG-a i odnosa GSH/GSSG, ali i znatno sniženih vrijednosti

SOD-a u staklastom tijelu, kod bolesnika s proliferativnom dijabetičkom retinopatijom. Ove

razlike u vrijednostima antioksidativnih molekula potvrđuje prethodna razmišljanja. Malo je

takvih studija provedeno. Stoga, su potrebna daljnja istraživanja na humanim modelima koja

108

bi uključivala više ispitanika. Također bi bilo potrebno dobro definirati parametre koji bi se

ispitivali, tj. koncentrirati istraživanja na pojedine antioksidativne molekule i analizirati

njihove kemijske reakcije u različitim uvjetima, istovremeno unutar više različitih tjelesnih

medija.

109

ZAKLJUČCI

A. Evidentan je oksidativni stres u oku i sistemskoj cirkulaciji u bolesnika s dijabetesom

1. U staklastom tijelu dokazan je povećan oksidativni stres zbog registriranih viših razina

parametara: AOPP, LPO i MDA u odnosu na kontrolnu skupinu (p˂0,001 za LPO i

p=0,001 za MDA).

2. U perifernoj cirkulaciji, također je potvrđen povišen oksidativni stres, uslijed

izmjerenih viših vrijednosti AOPP-a, LPO-a i MDA (p=0,008 za AOPP i p˂0,001 za

LPO).

3. Aktivnost LPO-a, u oba tjelesna odjeljka, statistički je značajno veća u odnosu na

kontrolnu skupinu. Statistički je značajna pozitivna korelacija (p˂0,001) mjerenog

LPO-a između staklastog tijela i seruma, te bi određivanje LPO-a u perifernoj krvi

mogao poslužiti u procjeni očne aktivnosti, u dijabetesu.

B. Antioksidativna aktivnosti u oku prema nalazu SOD-a je smanjena a prema GSH

održana u bolesnika s dijabetesom

4. Statistički značajno smanjena je aktivnost antioksidativnog enzima SOD u staklastom

tijelu (p˂0,001), a povećana u perifernoj cirkulaciji (p˂0,001). SOD aktivnost u

staklastom tijelu statistički značajno pozitivno je korelirala s vrijednostima MDA u

perifernoj krvi (p=0,022).

5. GSSG aktivnost u očnom odjeljku statistički značajno pozitivno je korelirala s

vrijednostima LPO (p=0,046), a negativno s aktivnošću SOD-a (p=0,005) u perifernom

odjeljku.

C. VEGF je reaktivno lokalno povećan

6. Značajno je viša razina mjerenog VEGF-a lokalno (p˂0,001) u odnosu na perifernu

cirkulaciju (p˂0,001). To statistički značajno pozitivno korelira s povišenom aktivnosti

SOD-a u perifernoj cirkulaciji (p=0,042), i zabilježenu sniženu aktivnost SOD-a u

očnom mediju.

110

D. Promjene u animalnome modelu s dijabetesom u suglasnosti su s promjenama u ljudi

7. Uočavanjem viših razina AOPP-a, LPO-a i MDA dokazan je povećan oksidativni stres

u oku (p˂0,05). U perifernoj cirkulaciji, također je zabilježen povećan oksidativni stres

mjerenjem viših vrijednosti LPO-a i MDA (p˂0,05, za oba mjerena parametra).

8. Oksidativni parametar AOPP u lokalnom odjeljku je također bio povišene aktivnost ali

za razliku od ljudi vrijednosti u perifernoj cirkulaciji su bile niže.

9. Antioksidativna aktivnost SOD iste je dinamike kao kod ljudi dok je GSH aktivnost

bila snižena u oba odjeljka.

111

7. LITERATURA

1. Ugrinović N (2004) Oštećenja oka u dijabetesu. U: Čupak K (ed.) Oftalmologija. Zagreb, Nakladni zavod Globus, 888-893.

2. Moss SE, Klein R, Klein BEK (1998) The 14 year incidence of visual loss in a diabetic population. Ophthalmology 105: 998-1003.

3. Kowluru RA, Chan PS (2007) Oxidative Stress and Diabetic Retinopathy. Exp Diabetes Res 1-12.

4. Brownlee M (2005) The pathophysiology of diabetic complications. Diabetes 54: 1615-1625.

5. Folkman J, Klagsbrun M (1987) Angiogenic factors. Science 235: 442-447. 6. Shweiki D, Itin A, Soffer D, Keshet E (1992) Vascular endothelial growth factor

induced by hypoxia may mediate hypoxia-mediated angiogenesis. Nature 359: 843-845.

7. Simo R, Lecube A, Segura RM, Garcia AJ, Hernandez C (2002) Free insulin growth factor-I and vascular endothelial growth factor in the vitreous fluid of patients with proliferative diabetic retinopathy. Am J Ophthalmol 134: 376-382.

8. Sydorova M, Lee MS (2005) Vascular endothelial growth factor levels in vitreous and serum of patients with either proliferative diabetic retinopathy or proliferative vitreoretinopathy. Ophthalmic Res 37:188-190.

9. Sies H (1997) Oxidative stress: oxidants and antioxidants. Exp Physiol 82(2): 291-295.

10. Halliwell B (1994) Free radicals, antioxidants and human disease: curiosity, cause or consequence? Lancet 344: 721-723.

11. Bergendi L, Beneš L, Duračkova Z, Ferenčik M (1999) Chemistry, physiology and pathology of free radicals. Life Sci 65: 1865-1874.

12. Gutteridge JMC (1994) Biological origin of free radicals, and mechanisms of antioxidant protection. Chem Biol Interac 91: 113-140.

13. Buettner GR, Schafer FQ (2000) Free radicals, oxidants, and antioxidants. Teratology 62(4): 234.

14. Siems WG, Sommerburg O, Mayer H, Grune T (1998) Die wichigsten Radikalquellen in menchlichen Organismus. Pharm Ztg 143: 11-25.

15. Anderson D (1996) Antioxidant defences against reactive oxygen species causing genetic and other damage. Mutat Res 350: 103-108.

16. Lee HC, Wei YH (2000) Mitochondrial role in life and death oft he cell. J Biomed Sci 7: 2-15.

17. Fulton D, McGiff JC, Wolin MS, Kaminski P, Quilley J (1997) Evidence against cytochrome P450- derived reactive oxygen species as the mediator of the nitric oxide-independent vasodilator effect of bradykinin in the perfused heart of th rat. J Pharmacol Exp Ther 280(2): 702-709.

112

18. Crane D, Masters C (1984) On the role of catalase in the oxidation of tissue fatty acids. Arch Biochem Biophys 229: 104-111.

19. Caccese D, Pratico D, Ghiselli A, Natoli S, Piqnatelli P, Sanquiqni V, Iuliano L, Violi F (2000) Superoxide anion and hydroxyl radical release by collagen-induced platelet aggregation – role of arachidonic acid metabolism. Thromb Haemost 83: 485-490.

20. Knight JA (2000) Free radicals, antioxidants, and the immune system. Annal Clinic Lab Sci 30: 145-158.

21. Halliwell B (1995) Active oxigen in biochemistry. Blackie Academic&Professional, London.

22. Di Giulio C, Data PG, Lahiri S (1991) Chronic cobalt causes hypertrophy of glomus cells in the rat carotid body. Am J Physiol 261(1): 102-105.

23. Kehrer JP (2000) Cause-effect of oxidative stress and apoptosis. Teratology 62(4): 235-236.

24. Imlay JA, Fridovich I (1991) Assays of metabolic superoxide production in Escherichia coli. J Biol Chem 266: 6957-6965.

25. Halliwell B, Gutteridge JMC (1990) Role of free radicals and catalytic metal ions in human disease. Methods in Enzymology 186: 1-85.

26. Marks DB, Marks AD, Smith CM (1996) Oxygen metabolism and oxygen toxicity. Basic medical biochemistry: A clinical approach. Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore.

27. Selverstone VJ, Foot CS, Greenberg A, Liebman JF (1995) Active oxygen in biochemistry. Blackie Academic&Professional, London, Glasgow, New York, Tokyo 1995.

28. FehérJ, Csomós G, Vereckei A. Free radical reactions in medicine. Springer- Verlag, Plenium Press, Berlin, Heidelberg, New York, London 1994:43-58.

29. Halliwell B (1994) Oxygen and nitrogen are pro-carcinogenes. Damage to DNA by reactive oxygen, chlorine and nitrogen species: measurement, mechanism and the effects of nutrition. Mutat Res 443: 37-52.

30. Moncada S, Higgis A (1993) The L-arginine-nitric oxide pathway. New Eng J Med 329: 2002-2011.

31. Huie RE, Padmaja S (1993) The reaction of NO with superoxide. Free Rad Res Commun 18: 195-199

32. Halliwell B (1995) Oxygen radicals, nitric oxide and human inflammatory joint disease. Annal Rheumatic Dis 54: 505-510.

33. Halliwell B (1996) Oxidative stress, nutrition and health. Experimental strategies for optimization of nutritional antioxidant intake in humans. Free Rad Res 25: 57-74.

34. Esterbauer H, Schaur FJ, Zollner H (1991) Chemistry and biochemistry of 4-hydroxinonenal, malonaldehyde and related aldehydes. Free Radic Biol Med 11: 81-128.

35. Svingen BA, O'Neal FO, Aust SD (1978) The role of superoxide and singlet oxygen in lipid peroxidation. Photochem Photobiol 28: 803-809.

36. Greenberg ME, Li XM, Gugiu BG, Gu X, Qin J, Salomon RG, Hazen SL (2008) The lipid Whisker model of the structure of oxidized cell membranes. J Biol Chem 283: 2385-2396.

37. West JD, Marnett LJ (2006) Endogenous reactive intermediates as modulators of cell signaling and cell death. Chem Res Toxicol 19: 173-194.

113

38. Zarkovic N (2003) 4-hydroxynonenal as a bioactive marker of pathophysiological processes. Mol Aspects Med 24(4-5): 281-291.

39. Poli G, Biasi F, Leonarduzzi G (2008) 4-Hydroxynonenal-protein adducts: a reliable biomarker of lipid oxidation in liver disease. Mol Aspects Med 29: 67-71.

40. Uchida K (2003) 4-Hydroxy-2-nonenal: a product and modulator of oxidative stress. Prog Lipid Res 42: 318-343.

41. Niki E, Yoshida Y, Saito Y, Noguchi N (2005) Lipid peroxidation: mechanisms, inhibition, and biological effects. Biochem Biophys Res Commun 338: 668-676.

42. Blake D, Winyard PG (1995) Immunopharmacology of free fadical species. Academic Press, London.

43. Porter N (1984) Chemistry of lipid peroxidation. Methods Enzymol105: 273-283. 44. Armstrong D (1994) Free radicals in diagnostic medicine: a systems approach to

laboratory technology, clinical correlations, and antioxidant therapy. Plenium Press, New York, London.

45. Aikens J, Dix TA (1991) Perhydroxyl radical (HOO) initiated lipid peroxidation. The role of fatty acid hydroperoxides. J Biol Chem 266: 15091-1598.

46. Pryor WA, Houk KN, Foote CS, Fukuto JM, Ignarro LJ, Squadrito GL, Davies KJA (2006) Free radical biology and medicine: its's a gas, man! Am J Physiol Integr Comp Physiol 291: 491-511.

47. Schneider C, Pratt DA, Porter NA, Brash AR (2007) Control of oxygenation in lipoxygenase and cyclooxygenase catalysis. Chem Biol 14: 473-488.

48. Kuhn H (2005) Biologic relevance of lipoxygenase isoforms in atherogenesis. Expert Rev Cardiovasc Ther 3: 1099-1110.

49. Noguchi N, Yamashita H, Hamahara J, Nakamura A, Kuhn H, Niki E (2002) The specificity of lipoxygenase-catalyzed lipid peroxidation and the effects of radialscavenging antioxidants. Biol Chem 383: 619-626.

50. Halliwell B, Gutteridge JMC (1989) Free Radicals in Biology and Medicine. Clarendon Press, Oxford.

51. Ferretti G, Bacchetti T, Masciangelo S, Pallotta G (2008) Lipid peroxidation in hemodialysis patients: effect of vitamin C supplementation. Clin Biochem 41: 381–386.

52. Niki E (2009) Lipid peroxidation: physiological levels and dual biological effects. Free Radic Biol Med 47(5): 469-484.

53. Frankel EN, Neff WE (1983) Formation of malonaldehyde from lipid oxidation products. Biochim Biophys Acta 754: 264-70.

54. Del Rio D, Stewart AJ, Pellegrini N (2005) A review of recent studies on malondialdehyde as toxic molecule and biological marker of oxidative stress. Nutr Metab Cardiovasc Dis 15(4): 316-328. Review.

55. Marnett LJ (2002) Oxy radicals, lipid peroxidation and DNA damage. Toxicology 182: 219-222.

56. Halliwell B (1990) How to characterize a biological antioxidant. Free Radic Res Commun 9(1): 1-32. Review.

57. Matés JM, Pérez-Gómez C, Blanca M (2000) Chemical and biological activity of free radical 'scavengers' in allergic diseases. Clin Chim Acta 296(1-2): 1-15.

114

58. Droge W (2002) Free radicals in the physiological control of cell function. Review. Physiol Rev 82: 47-95.

59. Willcox JK, Ash SL, Catignani GL (2004) Antioxidants and prevention of chronic disease. Review. Crit Rev Food Sci Nutr 44: 275-295.

60. Pacher P, Beckman JS, Liaudet L (2007) Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease. Physiol Rev 87: 315-424.

61. Halliwell B (2007) Biochemistry of oxidative stress. Biochem Soc Trans 35: 1147-1150. 62. Young I, Woodside J (2001) Antioxidants in health and disease. J Clin Pathol 54: 176-

186. 63. Valko M, Rhodes CJ, Moncol J, Izakovic M, Mazur M (2006) Free radicals, metals and

antioxidants in oxidative stress-induced cancer. Mini-review. Chem Biol Interact 160: 1-40.

64. Valko M, Morris H, Cronin MTD (2005) Metals, toxicity and oxidative stress. Curr Med Chem 12: 1161-1208.

65. Zelko IN, Mariani TJ, Folz RJ (2002) Superoxide dismutase multigene family: a comparison of the CuZn-SOD (SOD1), Mn-SOD (SOD2), and EC-SOD (SOD3) gene structures, evolution, and expression. Free Radic Biol Med 33(3): 337-349. Review.

66. Marklund SL, Westman NG, Roos G, Carlsson J (1984) Radiation resistance and the CuZn superoxide dismutase, Mn superoxide dismutase, catalase, and glutathione peroxidase activities of seven human cell lines. Radiat Res 100(1): 115-123.

67. Oberley LW, Buettner GR (1979) Role of superoxide dismutase in cancer: a review. Cancer Res 39(4): 1141-1149.

68. Hendrickson DJ, Fisher JH, Jones C, Ho YS (1990) Regional localization of human extracellular superoxide dismutase gene to 4pter-q21. Genomics 8(4) :736-738.

69. Fattman CL, Schaefer LM, Oury TD (2003) Extracellular superoxide dismutase in biology and medicine. Free Radic Biol Med 35(3): 236-56. Review

70. Niikawa N, Fukushima Y, Taniguchi N, Iizuka S, Kajii T (1982) Chromosome abnormalities involving 11p13 and low erythrocyte catalase activity. Hum Genet (4): 373-375.

71. Vankayala SL, Hargis JC, Woodcock Iii HL (2013) How Does Catalase Release Nitric Oxide? A Computational Structure Activity Relationship Study. J Chem Inf Model

72. Bahorun T, Soobrattee MA, Luximon-Ramma V, Aruoma OI (2006) Free radicals and antioxidants in cardiovascular health and disease. Internet J Med Update 1: 1-17.

73. Pham-Huy LA, He H, Pham-Huy C (2008) Free radicals, antioxidants in disease and health. Int J Biomed Sci 4(2): 89-96.

74. Maher P, Lewerenz J, Lozano C, Torres JL (2008) A novel approach to enhancing levels cellular glutathione. J Neurochem 107(3): 690-700.

75. Zhang H, Forman HJ, Choi J (2005) Gamma-glutamyl transpeptidase in glutathione biosynthesis. Methods Enzymol 401: 468-83.

76. Vessby J, Basu S, Mohsen R, Berne C, Vessby B (2002) Oxidative stress and antioxidant status in type 1 diabetes mellitus. J Intern Med 251: 69-76.

77. Habib MP, Dickerson FD, Mooradian AD (1994) Effect of diabetes, insulin and glucose load on lipid peroxidation in the rat. Metabolism 43: 1442-1445.

115

78. Rahimi R, Nikfar S, Larijani B, Abdollahi M (2005) A review on the role of antioxidants in the management of diabetes and its complications. Biomed Pharmacother 59(7): 365-373.

79. Ceriello A, Motz E (2004) Is oxidative stress the pathogenic mechanism underlying insulin resistance, diabetes, and cardiovascular disease? The common soil hypothesis revisited. Arterioscler Thromb Vasc Biol 24(5): 816-823.

80. Chew EY, Ferris FL 3rd (2001) Nonproliferative diabetic retinopathy. U: Ryan SJ (ed.) Retina. 3rd edn. St Louis, Mosby, 1295-1308.

81. Kowluru RA (2003) Effect of reinstitution of good glycemic control on retinal oxidative stress and nitrative stress in diabetic rats. Diabetes 52(3): 818-823.

82. Kowluru RA, Abbas SN (2003) Diabetes-induced mitochondrial dysfunction in the retina. Invest Ophthalmol Vis Sci 44(12): 5327-5334.

83. Kowluru RA (2001) Diabetes-induced elevations in retinal oxidative stress, protein kinase C and nitric oxide are interrelated. Acta Diabet 38(4): 179-185.

84. Kowluru RA, Koppolu P (2002) Termination of experimental galactosemia in rats, and progression of retinal metabolic abnormalities. Invest Ophthalmol Vis Sci 43(10): 3287-3291.

85. Haskins K, Bradley B, Powers K, Fadok V, Flores S, Ling X, Pugazhenthi S, Reusch J, Kench J (2003) Oxidative stress in type 1 diabetes. Ann N Y Acad Sci 1005: 43-54.

86. Meister A (1988) Glutathione metabolism and its selective modification. J Biol Chem 263(33): 17205-17208.

87. Ford ES, Mokdad AH, Giles WH, Brown DW (2003) The metabolic syndrome and antioxidant concentrations: findings from the Third National Health and Nutrition Examination Survey. Diabetes 52(9): 2346-2352.

88. Beisswenger PJ, Howell SK, Smith K, Szwergold BS (2003). Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase activity as an independent modifier of methylglyoxal levels in diabetes. Biochim Biophys Acta 1637(1): 98-106.

89. Engerman RL, Kern TS, Larson ME (1994) Nerve conduction and aldose reductase inhibition during 5 years of diabetes or galactosaemia in dogs. Diabetologia 37(2): 141-144.

90. Koya D, King GL (1998) Protein kinase C activation and the development of diabetic complications. Diabetes 47(6): 859-866.

91. Du XL, Edelstein D, Rossetti L, Fantus IG, Goldberg H, Ziyadeh F, Wu J, Brownlee M (2000) Hyperglycemia-induced mitochondrial superoxide overproduction activates the hexosamine pathway and induces plasminogen activator inhibitor-1 expression by increasing Sp1 glycosylation. Proc Natl Acad Sci USA 97(22): 12222-12226.

92. Caldwell RB, Bartoli M, Behzadian MA, El-Remessy AE, Al-Shabrawey M, Platt DH, Liou GI, Caldwell RW (2005) Vascular endothelial growth factor and diabetic retinopathy: role of oxidative stress. Curr Drug Targets 6(4): 511-24. Review

93. Brownlee M, Cerami A, Vlassara H (1988) Advanced glycosylation end products in tissue and the biochemical basis of diabetic complications. N Engl J Med 318: 1315-1321.

94. Yamagishi S, Yonekura H, Yamamoto Y, Katsuno K, Sato F, Mita I, Ooka H, Satozawa N, Kavakami T, Nomura M, Yamamoto H (1997) Advanced glycation end products -

116

driven angiogenesis in vitro. Induction of the growth and tube formation of human microvascular endothelial cells through autocrine vascular endothelial growth factor. J Biol Chem 272: 8723-8730.

95. Schmidt AM, Hori O, Cao R, Yan SD, Brett J, Wautier JL, Ogawa S, Kuwatara K, Matsumoto M, Stern D (1996) RAGE: a novel cellular receptor for advanced glycation end-product. Diabetes 45: 77-80.

96. Stitt AW (2003) The role of advanced glycation in the pathogenesis of diabetic retinopathy. Exp Mol Pathol 75(1): 95-108. Review.

97. Mohamed AK, Bierhaus A, Schiekofer S, Tritschler H, Ziegler R, Nawroth PP (1999) The role of oxidative stress and NF-κB activation in late diabetic complications. Biofactors 2-3: 157-167.

98. Miwa K, Nakamura J, Hamada Y, Naruse K, Nakashima E, Kato K, Kasuya Y, Yasuda Y, Kamiya H, Hotta N (2003) The role of polyol pathway in glucose-induced apoptosis of cultured retinal pericytes. Diabetes Res Clin Pract 60(1): 1-9.

99. Palumbo EJ, Sweatt JD, Chen SJ, Klann E (1992) Oxidation-induced persistent activation of protein kinase C in hippocampal homogenates. Biochem Biophys Res Commun 187(3): 1439-45.

100. Wu Y, Wu G, Qi X, Lin H, Qian H, Shen J, Lin S (2006) Protein kinase C beta inhibitor LY333531 attenuates intercellular adhesion molecule-1 and monocyte chemotactic protein-1 expression in the kidney in diabetic rats. J Pharmacol Sci 101(4): 335-343.

101. Ohshiro Y, Ma RC, Yasuda Y, Hiraoka-Yamamoto J, Clermont AC, Isshiki K, Yagi K, Arikawa E, Kern TS, King GL (2006) Reduction of diabetes-induced oxidative stress, fibrotic cytokine expression, and renal dysfunction in protein kinase Cβ-null mice. Diabetes 55(11): 3112-3120.

102. Brownlee M (2005) The pathobiology of diabetic complications: a unifying mechanism. Diabetes 54(6): 1615-1625.

103. Beisswenger PJ, Drummond KS, Nelson RG, Howell SK, Szwergold BS, Mauer M (2005) Susceptibility to diabetic nephropathy is related to dicarbonyl and oxidative stress. Diabetes 54(11): 3274-3281.

104. Kowluru RA (2005) Diabetic retinopathy: mitochondrial dysfunction and retinal capillary cell death. Antioxid Redox Signal 7(11-12): 1581-1587. 105. Michaelson IC (1948). The mode of development of the vascular system of the retina

with some observations on its significance for certain retinal disorders. Trans Ophthalmol Soc UK 68:137-80.

106. Folkman J (1971) Review Tumor angiogenesis: therapeutic implications. N Engl J Med 285(21): 1182-1186.

107. Senger DR, Galli SJ, Dvorak AM, Perruzzi CA, Harvey VA, Dvorak HF (1983) Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science 219: 983-985.

108. Ferrara N, Henzel WJ (1989) Pituitary follicular cells secrete a novel heparin-binding growth factor specific for vascular endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun 161: 851-858.

117

109. Keck PJ, Hauser SD, Krivi G, Sanzo K, Warren T, Feder J, Connolly DT (1989) Vascular permeability factor, an endothelial cell mitogen related to PDGF. Science 246(4935): 1309-1312.

110. Leung DW, Cachianes G, Kuang WJ, Goeddel DV, Ferrara N (1989) Vascular endothelial growth factor is a secreted angiogenic mitogen. Science 246: 1306-1309.

111. Shweiki D, Itin A, Soffer D, Keshet E (1992) Vascular endothelial growth factor induced by hypoxia may mediate hypoxia-initiated angiogenesis. Nature 359: 843-845.

112. Miller JW, Adamis AP, Shima DT, D'Amore PA, Moulton RS, O'Reilly MS, Folkman J, Dvorak HF, Brown LF, Berse B, Yeo T-K, Yeo K-T (1994) Vascular Endothelial Growth Factor/Vascular Permeability Factor Is Temporally and Spatially Correlated with Ocular Angiogenesis in a Primate Model. Am J Pathol 145(3): 574-584.

113. Aiello LP, Avery RL, Arrigg PG, Keyt BA, Jampel HD, Shah ST, Pasquale LR, Thieme H, Iwamoto MA, Park JE, Nguyen HV, Aiello LM, Ferrara N, King GL (1994) Vascular endothelial growth factor in ocular fluid of patients with diabetic retinopathy and other retinal disorders. N Engl J Med 331: 1480-1487.

114. Duh E and Aiello LP (1999) Vascular endothelial growth factor and diabetes: the agonist versus antagonist paradox. Diabetes 48: 1899-1906.

115. Hoeben A, Landuyt B, Highley MS, Wildiers H, Van Oosterom AT, De Bruijn EA (2004) Vascular endothelial growth factor and angiogenesis. Pharmacol Rev 56(4): 549-80.

116. Jussila L, Alitalo K (2002) Vascular growth factors and lymphangiogenesis. Physiol Rev 82: 673-700.

117. Giacca M, Zacchigna S (2012) VEGF gene therapy: therapeutic angiogenesis in the clinic and beyond. Gene Ther 19(6): 622-629.

118. Lyttle DJ, Fraser KM, Fleming SB, Mercer AA, Robinson AJ (1994) Homologs of vascular endothelial growth factor are encoded by the poxvirus orf virus. J Virol 68(1): 84-92.

119. Carmeliet P, Jain RK (2011) Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature 473: 298-307.

120. Vincenti V, Cassano C, Rocchi M, Persico G (1996) Assignment of the vascular endothelial growth factor gene to human chromosome 6p21.3. Circulation 93: 1493-1495.

121. Potente M, Gerhardt H, Carmeliet P (2011) Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell 146: 873-887.

122. Adams RH, Alitalo K (2007) Molecular regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol 8: 464-478.

123. Olsson AK, Dimberg A, Kreuger J, Claesson-Welsh L (2006) VEGF receptor signalling-in control of vascular function. Nat Rev Mol Cell Biol 7: 359-371.

124. Arcondéguy T, Lacazette E, Millevoi S, Prats H, Touriol C (2013) VEGF-A mRNA processing, stability and translation: a paradigm for intricate regulation of gene expression at the post-transcriptional level. Nucleic Acids Res 41(17): 7997-8010.

125. Semenza GL (2000) HIF-1: using two hands to flip the angiogenic switch. Cancer Metastasis Rev 19(1-2): 59-65.

118

126. Levy AP, Levy NS, Goldberg MA (1996) Post-transcriptional regulation of vascular endothelial growth factor by hypoxia. J Biol Chem 271(5): 2746-2753.

127. Ferrara N (2004) Vascular endothelial growth factor: basic science and clinical progress. Endocr Rev 25(4): 581-611.

128. Randi AM, Sperone A, Dryden NH, Birdsey GM (2009) Regulation of angiogenesis by ETS transcription factors. Biochem Soc Trans 37(6): 1248-1253.

129. Ushio-Fukai M, Nakamura Y (2008) Reactive oxygen species and angiogenesis: NADPH oxidase as target for cancer therapy. Cancer Lett 266(1): 37-52.

130. Koch S (2012) Neuropilin signalling in angiogenesis. Biochem Soc Trans 40(1): 20-25. 131. Glass CA, Harper SJ, Bates DO (2006) The anti-angiogenic vascular endothelial growth

factor isoform, VEGF165b transiently increases hydraulic conductivity, probably through VEGF receptor 1 in vivo. J Physiol 527: 243-257.

132. Fleming SB, Caesar C, Vitali A, Makinen T, Alitalo K, Stacker SA (1999) Vascular endothelial growth factor (VEGF)-like protein from orf virus NZ2 binds to VEGFR2 and neuropilin-1. Proc Natl Acad Sci 96: 3071-3076.

133. Woolard J, Wang WY, Bevan HS, Qiu Y, Morbidelli L, Pritchard-Jones RO, Cui TG, Sugiono M, Waine E, Perrin R, Foster R, Digby-Bell J, Shields JD, Whittles CE, Mushens RE, Gillatt DA, Ziche M, Harper SJ, Bates DO (2004) VEGF165b, an inhibitory vascular endothelial growth factor splice variant: mechanism of action, in vivo effect on angiogenesis and endogenous protein expression. Cancer Res 64(21): 7822-7835.

134. Hoffmann U, Bogucki A, Manlius C, Wood J, Ballmer-Hofer K (2006) A VEGF-A splice variant defective for heparan sulfate and neuropilin-1 binding shows attenuated signaling through VEGFR-2. Cell Mol Life Sci 63: 2067-2077.

135. Joukov V, Pajusola K, Kaipainen A, Chilov D, Lahtinen I, Kukk E, Saksela O, Kalkkinen N, Alitalo K (1996) A novel vascular endothelial growth factor, VEGF-C, is a ligand for the Flt4 (VEGFR-3) and KDR (VEGFR-2) receptor tyrosine kinases. EMBO J 15: 290-298.

136. Veikkola T, Karkkainen M, Claesson-Welsh L, Alitalo K (2000) Regulation of angiogenesis via vascular endothelial growth factor receptors. Cancer Res 60(2): 203-212.

137. Yoshiji H, Kuriyama S, Ways DK, Yoshii J, Miyamoto Y, Kawata M, Ikenaka Y, Tsujinoue H, Nakatani T, Shibuya M, Fukui H (1999) Protein kinase C lies on the signaling pathway for vascular endothelial growth factor-mediated tumor development and angiogenesis. Cancer Res 59(17): 4413-4418.

138. Iljin K, Karkkainen MJ, Lawrence EC, Kimak MA, Uutela M, Taipale J, Pajusola K, Alhonen L, Halmekytö M, Finegold DN, Ferrell RE, Alitalo K (2001) VEGFR3 gene structure, regulatory region, and sequence polymorphisms. FASEB J 15(6): 1028-1036.

139. Antonetti DA, Barber AJ, Hollinger LA, Wolpert EB, Gardner TW (1999) Vascular endothelial growth factor induces rapid phosphorylation of tight junction proteins occludin and zonula occluden 1. A potential mechanism for vascular permeability in diabetic retinopathy and tumors. J Biol Chem 274(33): 23463-23467.

119

140. Witmer AN, Vrensen GF, Van Noorden CJ, Schlingemann RO (2003) Vascular endothelial growth factors and angiogenesis in eye disease. Prog Retin Eye Res 22(1): 1-29.

141. Heier JS, Antoszyk AN, Pavan PR, Leff SR, Rosenfeld PJ, Ciulla TA, Dreyer RF, Gentile RC, Sy JP, Hantsbarger G, Shams N (2006) Ranibizumab for treatment of neovascular age-related macular degeneration: a phase I/II multicenter, controlled, multidose study. Ophthalmology 113(4): 633

142. Scott IU, Edwards AR, Beck RW, Bressler NM, Chan CK, Elman MJ, Friedman SM, Greven CM, Maturi RK, Pieramici DJ, Shami M, Singerman LJ, Stockdale CR (2007) A phase II randomized clinical trial of intravitreal bevacizumab for diabetic macular edema. Ophthalmology 114(10): 1860-1867.

143. Gragoudas ES, Adamis AP, Cunningham ETJr, Feinsod M, Guyer DR (2004) Pegaptanib for neovascular age-related macular degeneration. VEGF Inhibition Study in Ocular Neovascularization Clinical Trial Group N Engl J Med 351(27): 2805-2816.

144. Gupta N, Mansoor S, Sharma A, Sapkal A, Sheth J, Falatoonzadeh P, Kuppermann BD, Kenney MC (2013) Diabetic Retinopathy and VEGF. Open Ophthalmol J 7: 4-10.

145. Do DV, Nguyen QD, Shah SM, Browning DJ, Haller JA, Chu K, Yang K, Cedarbaum JM, Vitti RL, Ingerman A, Campochiaro PA (2009) An exploratory study of the safety, tolerability and bioactivity of a single intravitreal injection of vascular endothelial growth factor Trap-Eye in patients with diabetic macular oedema. Br J Ophthalmol 93(2): 144-149.

146. Propper DJ, McDonald AC, Man A, Thavasu P, Balkwill F, Braybrooke JP, Caponigro F, Graf P, Dutreix C, Blackie R, Kaye SB, Ganesan TS, Talbot DC, Harris AL, Twelves C (2001) Phase I and pharmacokinetic study of PKC412, an inhibitor of protein kinase C. J Clin Oncol 19(5): 1485-1492.

147. PKC-DRS2 Group, Aiello LP, Davis MD, Girach A, Kles KA, Milton RC, Sheetz MJ, Vignati L, Zhi XE (2006) Effect of ruboxistaurin on visual loss in patients with diabetic retinopathy. Ophthalmology 113(12): 2221-2230.

148. The PKC-DMES Study Group (2007) Effect of ruboxistaurin in patients with diabetic macular edema: thirty-month results of the randomized PKC-DMES clinical trial. Archiv Ophthalmol 125(3): 318-324.

149. PKC-DRS2 Group, Aiello LP, Davis MD, Girach A, Kles KA, Milton RC, Sheetz MJ, Vignati L, Zhi XE (2006) Effect of ruboxistaurin on visual loss in patients with diabetic retinopathy. Ophthalmology 113(12): 2221-2230.

150. Metelko Ž, Granić M, Škrabalo Z (1997) Šećerna bolest. U: Vrhovac B, Bakran I, Granić M, Jakšić B, Labar B, Vucelić B (ed.) Interna medicina. 2. izdanje. Zagreb, Naprijed, 1365-1390.

151. Tattersall RB (2010) The history of diabetes mellitus. U: Holt RIG, Cockram CS, Flyvbjerg A, Goldstein BJ (ed.) Textbook of diabetes. 4th edn. Oxford-Hoboken-West Sussex, Wiley-Blackwell 3-23.

152. International Diabetes Federation., 2012. IDF Diabetes atlas. V edition. http://www.idf.org/diabetesatlas/5e/ Update 2012. Accessed September 28, 2013.

153. CEZIH. Central Health Information System. http://www.cezih.hr/ accessed 2013. 154. Poljičanin T, Metelko T, Kolarić V, Šekerija M, 2013. Report for 2012. National

120

Diabetes Registry CroDiab. 1-6. http://www.hzjz.hr/publikacije/crodiabreg2012.pdf 155. Kahn CR, Weir GC, King GL, et al (2005) Joslin´s Diabetes mellitus. Fourteenth

Edition. Chapter 1: 1-17. 156. World Health Organization (WHO) (1999) Report of a WHO Consultation. Definition,

diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. 1. Diagnosis and classification of diabetes mellitus. WHO/NCD/NCS/99.2. Geneva, WHO.

157. Miao D, Yu L, Eisenbarth GS (2007) Role of autoantibodies in type 1 diabetes. Front Biosci 12: 1889-1898. 158. Aganović I, Metelko Ž (2008) Šećerna bolest. U: Vrhovac B, i surad. Interna medicina. 4. izdanje. Zagreb, Naklada Ljevak, 1244-1264. 159. Amos AF, McCarty DJ, Zimmet P (1997) The Rising Global Burden of Diabetes and its

Complications: Estimates and Projections to the Year 2010. Diabetic Medicine 14: 7-85. 160. World Health Organization (2006) Prevention of blindness from diabetes mellitus.

Report of a WHO consultation in Geneva, Switzerland, 9-11 November 2005 161. Singh R, Ramasamy K, Abraham C, Gupta V, Gupta A (2008) Diabetic retinopathy: An

update. Indian J Ophthalmol 56(3): 179-188. 162. Kempen JH, O'Colmain BJ, Leske MC, Haffner SM, Klein R, Moss SE, Taylor HR,

Hamman RF; Eye Diseases Prevalence Research Group (2004) The Prevalence of Diabetic Retinopathy Among Adults in the United States. Arch Ophthalmol 122: 552-563.

163. Kolar G, Stirn-Kranjc B (2004) Mikroskopska građa oka. U: Čupak K (ed.) Oftalmologija. Zagreb, Nakladni zavod Globus, 59-71.

164. Sebag J. Vitreus: From Biochemistry to Clinical Relevance. Duane´s Clinical Ophthalmology on CD- ROM. Dostupno na: http://80.36.73.149/almacen/medicina/oftalmologia/enciclopedias/duane/pages/contents.html#top.

165. Piwowar A (2010) Advanced oxidation protein products. Part II. The significance of oxidation protein products in the pathomechanism of diabetes and its complications. Pol Merkur Lekarski 28(165): 227-230.

166. Witko-Sarsat V, Friedlander M, Capeillere-Blandin C, et al (1996) Advanced oxidation protein products as a novel marker of oxidative stress in uremia. Kidney Int 49: 1304-13.

167. Early Treatment Diabetic Retinopathy Study Research Group (1991) Grading diabetic retinopathy from stereoscopic color funds photographs - An extension of the modified Airline House classification. ETDRS report 10. Ophthalmology 98: 786-806.

168. Chew EY, Ferris FL 3rd (2001) Nonproliferative diabetic retinopathy. U: Ryan SJ (ed.) Retina. 3rd edn. St Louis, Mosby, 1295-1308.

169. Folkman J, Klagsbrun M (1987) Angiogenic factors. Science 235: 442-447. 170. Abu el Asrar AM, Maimone D, Morse PH, Gregory S, Reder AT (1992) Cytokines in the

vitreous of patients with proliferative diabetic retinopathy. Am J Ophthalmol 114: 731-736.

171. Runkle EA, Antonetti DA (2011) The blood-retinal barrier: structure and functional significance. Methods Mol Biol 686: 133-148.

121

172. Aldington SJ, Kohner EM, Meuer S, Klein R, Sjolie AK (1995) Methodology for retinal photography and assessment of diabetic retinopathy: the EURODIAB IDDM Complications Study. Diabetologia 38: 437-444

173. Vidović Jelinčić M, Brzović Šarić V, Šarić B (2011) Kliničke indikacije za primjenu fluoresceinske angiografije i optičke koherentne tomografije u dijagnostici korioretinalnih bolesti. Ophthalmol Croat 16(1-4): 39-44.

174. Pece A, Isola V, Holz F, Milani P, Brancato R (2010) Autofluorescence imaging of cystoid macular edema in diabetic retinopathy. Ophthalmologica 224(4): 230-235.

175. Zakon o zdravstvenoj zaštiti Republike Hrvatske (NN 121/03) Preuzeto http://narodne novine.nn.hr/clanci/sluzbeni/306294.html 176. Zakon o pravima pacijenata Republike Hrvatske (NN 169/04) Preuzeto http://narodnenovine. nn.hr/clanci/sluzbeni/2004_12_169_2953.html 177. Klein R, Myers CE, Lee KE, Gangnon R, Klein BE (2012) Changes in retinal vessel

diameter and incidence and progression of diabetic retinopathy. Arch Ophthalmol 130(6): 749-55.

178. Dwyer MS, Melton LJ 3rd, Ballard DJ, Palumbo PJ, Trautmann JC, Chu CP (1985) Incidence of diabetic retinopathy and blindness: a population-based study in Rochester, Minnesota. Diabetes Care 8(4): 316-322.

179. Giacco F, Brownlee M (2010) Pathogenesis of microvascular complications. U: Holt RIG, Cockram CS, Flyvbjerg A, Goldstein BJ (ed.) Textbook of diabetes. 4th edn. Oxford-Hoboken-West Sussex, Wiley-Blackwell 555-574.

180. Arden GB, Sivaprasad S (2012) The pathogenesis of early retinal changes of diabetic retinopathy. Doc Ophthalmol 124(1): 15-26.

181. Simó-Servat O, Hernández C, Simó R (2012) Usefulness of the Vitreous Fluid Analysis in the Translational Research of Diabetic Retinopathy. Mediators Inflamm 2012: 872-978.

182. Oshikawa J, Kim SJ, Furuta E, Caliceti C, Chen GF, McKinney RD, Kuhr F, Levitan I, Fukai T, Ushio-Fukai M (2012) Novel role of p66Shc in ROS-dependent VEGF signaling and angiogenesis in endothelial cell. Am J Physiol Heart Circ Physiol 302(3): 724-732. 183. Burgos R, Simo R, Audi L (1997) Vitreous levels of vascular endothelial growth factor are not influenced by its serum concentrations in diabetic retinopathy. Diabetologia 40: 1107-1109. 184. Hernandez C, Burgos R, Canton A, Garcia-Arumi J, Segura RM Simo R (2001) Vitreous

levels of vascular cell adhesion molecule and vascular endothelial growth factor in patients with proliferative diabetic retinopathy: a case-control study. Diabetes Care 24: 516-521.

185. Baharivand N, Zarghami N, Panahi F, Dokht Ghafari MY, Fard AM, Mohajeri A (2012) Relationship between vitreous and serum vascular endothelial growth factor levels, control of diabetes and microalbuminuria in proliferative diabetic retinopathy. Clin Ophthalmol 6: 185-191.

186. Aiello LP, Avery RL, Arrigg PG, Keyt BA, Jampel HD, Shah ST, Pasquale LR, Thieme H, Iwamoto MA, Park JE (1994) Vascular endothelial growth factor in ocular fluid of

122

patients with diabetic retinopathy and other retinal disorders. N Engl J Med 331: 1480-1487.

187. Zhou H, Zhang H (1997) A comparative study of vascular endothelial growth factor levels in the vitreous of patients with proliferative diabetic retinopathy. Zhonghua Yan Ke Za Zhi 33: 247-250.

188. Funatsu H, Yamashita H, Nakanishi Y, Hori S (2002) Angiotensin II and vascular endothelial growth factor in the vitreous fluid of patients with proliferative diabetic retinopathy. Br J Ophthalmol 86: 311-315.

189. Watanabe D, Suzuma K, Suzuma I, Ohashi H, Ojima T, Kurimoto M, Murakami T, Kimura T, Takagi H (2005) Vitreous levels of angiopoietin 2 and vascular endothelial growth factor in patients with proliferative diabetic retinopathy. Am J Ophthalmol 139: 476-481.

190. Malik RA, Li C, Aziz W, et al (2005) Elevated plasma CD105 and vitreous VEGF levels in diabetic retinopathy. J Cell Mol Med 9: 692-697.

191. Xin X, Rodrigues M, Umapathi M, Kashiwabuchi F, Ma T, Babapoor-Farrokhran S, Wang S, Hu J, Bhutto I, Welsbie DS, Duh EJ, Handa JT, Eberhart CG, Lutty G, Semenza GL, Montaner S, Sodhi A (2013) Hypoxic retinal Muller cells promote vascular permeability by HIF-1-dependent up-regulation of angiopoietin-like 4. Proc Natl Acad Sci U S A 110(36): 3425-3434.

192. Mohan N, Monickaraj F, Balasubramanyam M, Rema M, Mohan V (2012) Imbalanced levels of angiogenic and angiostatic factors in vitreous, plasma and postmortem retinal tissue of patients with proliferative diabetic retinopathy. J Diabetes Complications 26(5): 435-441.

193. Funatsu H, Yamashita H, Ikeda T, Mimura T, Eguchi S, Hori S (2003) Vitreous levels of interleukin-6 and vascular endothelial growth factor are related to diabetic macular edema. Ophthalmology 110(9): 1690-1696.

194. Bleda S, De Haro J, Varela C, Esparza L, Ferruelo A, Acin F (2012) Vascular endothelial growth factor polymorphisms are involved in the late vascular complications in Type II diabetic patients. Diab Vasc Dis Res 9(1): 68-74.

195. Kural A, Toker A, Seval H, Döventaş Y, Basınoğlu F, Koldaş M, Sağlam ZA (2011) Advanced glycation end–products and advanced oxidation protein products in patients with insulin dependent diabetes mellitus and first degree relatives. Bakırköy Tıp Dergisi 7(4): 130-135.

196. Witko-Sarsat V, Friedlander M, Nguyen Khoa T, Capeillère-Blandin C, Nguyen AT, Canteloup S, Dayer JM, Jungers P, Drüeke T, Descamps-Latscha B (1998) Advanced oxidation protein products as novel mediators of inflammation and monocyte activation in chronic renal failure. J Immunol 161(5): 2524-2532.

197. Pan HZ, Zhang H, Chang D, Li H, Sui H (2008) The change of oxidative stress products in diabetes mellitus and diabetic retinopathy. Br J Ophthalmol 2008 92:548-51.

198. Baskol G, Gumus K, Oner A, Arda H, Karakucuk S (2008) The role of advanced oxidation protein products and total thiols in diabetic retinopathy. Eur J Ophthalmol 18(5): 792-798.

123

199. Tabak O, Gelisgen R, Erman H, Erdenen F, Muderrisoglu C, Aral H, Uzun H (2011) Oxidative lipid, protein, and DNA damage as oxidative stress markers in vascular complications of diabetes mellitus. Clin Invest Med 34(3): 163-171.

200. Chapple SJ, Cheng X, Mann GE (2013) Effects of 4-hydroxynonenal on vascular endothelial and smooth muscle cell redox signaling and function in health and disease. Redox Biol 1(1): 319-331. Review

201. Anderson RE, Rapp LM, Wiegand RD (1984) Lipid peroxidation and retinal degeneration. Current Eye Research 3(1): 223-227.

202. Mancino R, Di Pierro D, Varesi C, Cerulli A, Feraco A, Cedrone C, Pinazo-Duran MD, Coletta M, Nucci C (2011) Lipid peroxidation and total antioxidant capacity in vitreous, aqueous humor, and blood samples from patients with diabetic retinopathy. Mol Vis 17: 1298-1304.

203. Izuta H, Matsunaga N, Shimazawa M, Sugiyama T, Ikeda T, Hara H (2010) Proliferative diabetic retinopathy and relations among antioxidant activity, oxidative stress, and VEGF in the vitreous body. Mol Vis 16: 130-136.

204. Turk HM, Sevinc A, Camci C, Cigli A, Buyukberber S, Savli H, Bayraktar N (2002) Plasma lipid peroxidation products and antioxidant enzyme activities in patients with type 2 diabetes mellitus. Acta Diabetol 39(3): 117-122.

205. Vidya D, Shekhar R, Prabodh S, Chowdary NVS, Joji Reddy MC Das M (2011) Oxidative Stress in Diabetic Retinopathy. Journal of Clinical and Diagnostic Research 5(5): 994-997.

206. Saxena S, Srivastava P, Khanna VK (2010) Elevated lipid peroxides induced angiogenesis in proliferative diabetic retinopathy. J Ocul Biol Dis Infor 3(3): 85-87.

207. Harman D (1956) Aging: a theory based on free radical and radiation chemistry. J Gerontol 11(3): 298-300.

208. Kaeberlein M (2013) Longevity and aging. F1000 Prime Rep 5: 5 (doi:10.12703/P5-5). 209. Haskins K, Bradley B, Powers K, Fadok V, Flores S, Ling X, Pugazhenthi S, Reusch J,

Kench J (2003) Oxidative stress in type 1 diabetes. Ann NY Acad Sci 1005: 43-54. 210. Kowluru RA, Kowluru V, Xiong Y, Ho YS (2006) Overexpression of mitochondrial

superoxide dismutase in mice protects the retina from diabetes-induced oxidative stress. Free Radic Biol Med 41:1191-1196.

211. Johnsen-Soriano S, Garcia-Pous M, Arnal E, Sancho-Tello M, Garcia-Delpech S, Miranda M, Bosch-Morell F, Diaz-Llopis M, Navea A, Romero FJ (2008) Early lipoic acid intake protects retina of diabetic mice. Free Radic Res 42: 613-617.

212. Verdejo C, Marco P, Renau-Piqueras J, Pinazo-Duran MD (1999) Lipid peroxidation in proliferative vitreoretinopathies. Eye 13:183-188.

213. Maher P, Lewerenz J, Lozano C, Torres JL (2008) A novel approach to enhancing levels cellular glutathione. J Neurochem 107(3): 690-700.

214. Zhang H, Forman HJ, Choi J (2005) Gamma-glutamyl transpeptidase in glutathione biosynthesis. Methods Enzymol 401: 468-83.

215. Galetović D, Bojić L, Bućan K, Karlica D, Lesin M, Znaor L (2011) The role of oxidative stress after retinal laser photocoagulation in nonproliferative diabetic retinopathy. Coll Antropol 35(3): 835-840.

124

216. Yildirim Z, Uçgun NI, Kiliç N, Gürsel E, Sepici-Dinçel A (2007) Antioxidant enzymes and diabetic retinopathy. Ann NY Acad Sci 1100: 199-206.

217. Bhatia S, Shukla R, Venkata Madhu S, Kaur Gambhir J, Madhava Prabhu K (2003) Antioxidant status, lipid peroxidation and nitric oxide end products in patients of type 2 diabetes mellitus with nephropathy. Clin Biochem 36(7): 557-562.

218. Obrosova IG, Drel VR, Kumagai AK, Szábo C, Pacher P, Stevens MJ (2006) Early diabetes-induced biochemical changes in the retina: comparison of rat and mouse models. Diabetologia 49(10): 2525-2533.

219. Johnsen-Soriano S, Garcia-Pous M, Arnal E, Sancho-Tello M, Garcia-Delpech S, Miranda M, Bosch-Morell F, Diaz-Llopis M, Navea A, Romero FJ (2008) Early lipoic acid intake protects retina of diabetic mice. Free Radic Res 42(7): 613-617.

220. Kowluru RA, Tang J, Kern TS (2001) Abnormalities of retinal metabolism in diabetes and experimental galactosemia VII. Effect of long-term administration of antioxidants on the development of retinopathy. Diabetes 50(8): 1938-1942.

221. Faraci FM, Didion SP (2004) Vascular protection: superoxide dismutase isoforms in the vessel wall. Arterioscler Thromb Vasc Biol 24(8): 1367-1373.

222. Santos JM, Mohammad G, Zhong Q, Kowluru RA (2011) Diabetic retinopathy, superoxide damage and antioxidants. Curr Pharm Biotechnol 12(3): 352-361.

223. Castorina C, Campisi A, Di Giacomo C, Sorrenti V, Russo A, Vanella A (1992) Lipid peroxidation and antioxidant enzymatic systems in rat retina as a function of age. Neurochem Res 17: 599-604.

125

POPIS KRATICA I SIMBOLA

ACE - enzim angiotenzin konvertaza (engl. angiotensin converting enzyme)

AGE - završni proizvodi glikozilacije (engl. advanced glycation endproducts)

AOPP - produkti uznapredovale oksidacije proteina (engl. advanced oxidation protein products)

AT II - angiotenzin II

BRB - krvno mrežnična barijera (engl. blood retinal barrier)

DCCT - Diabetes Control and Complications Trial Study

DM - Diabetes mellitus

DME - dijabetički makularni edem

DR - dijabetička retinopatija

eNOS - endotelna sintaza dušikova oksida (engl. endothelial nitric-oxide synthase)

ETDRS - Early Treatment of Diabetic Retinopathy Study

ET-1 - endotelin 1

EURODIAB - The EURODIAB IDDM Complications Study

FKG - laserska fotokoagulacija

Gpx - glutation peroksidaza

GSH - redicirani glutation

GSSG - oksidirani glutation

ICAM-1 - intracelularna adhezijska molekula 1 (engl. intracellular adhesion molecule 1)

IGF-1 - inzulinu sličan čimbenik rasta 1 (engl. insulin like growth factor 1)

IL - interleukin

iNOS - inducirana sintaza dušikova oksida

IV th - intravitrealno liječenje

IRMA - intraretinalna mikrovaskularna abnormalnost

K - kontrola

KAT - katalaza

LPO - lipidna peroksidacija

MDA - malondialdehid

NF-B - nuklearni čimbenik B (engl. nuclear factor B)

126

NO - dušikov oksid (engl. nitric oxide)

NPDR - neproliferativna dijabetička retinopatija

NV - neovaskularizacija

NVD - neovaskularizacija na optičkom disku (engl. new vessels on the disc)

NVE - neovaskularizacija na ostalim dijelovima retine (engl. new vessels elswhere)

OS - oksidativni stres

PAI-1 - inhibitor aktivatora plazminogena 1 (engl. plasminogen activator inhibitor 1)

PDR - proliferativna dijabetička retinopatija

PDGF - trombocitni čimbenik rasta (engl. platelet-derived growth factor)

PKC - protein kinaza C

PNO - glava vidnog živca, optički disk (lat. papila nervi optici)

ROS - reaktivni oblici kisika (engl. reactive oxygen species)

RPE - retinalni pigmentni epitel

SOD - superoksid dismutaza

SZO - Svjetska zdravstvena organizacija (engl. World Health Organization; WHO)

TGF-β - transformirajući čimbenik rasta beta (engl. transforming growth factor β)

TNF-α - čimbenik nekroze tumora α (engl. tumor necrosis factor α)

TLE - tvrdi lipidni eksudati

VEGF - vaskularni endotelni faktor rasta (engl. vascular endothelial growth factor)

WESDR - Wisconsin Epidemiologic Study of Diabetic Retinopathy

127

ŽIVOTOPIS

Vlatka Brzović Šarić rođena je 04. siječnja 1971. godine u Zagrebu, gdje je završila

osnovnu i srednju školu, te 1991. godine upisala studij medicine. Diplomirala 1998. na

Medicinskom fakultetu Sveučilišta u Zagrebu. Pripravnički staž obavila u Domu zdravlja

„Zaprešić” u Zaprešiću. 1999. godine položila državni stručni ispit i time stekla odobrenje

za samostalan rad na poslovima doktora medicine. Iste godine, započinje specijalizaciju iz

oftalmologije u Kliničkoj bolnici Rebro u Zagrebu. Tijekom specijalizacije, koja je trajala

četiri godine, završila stručni poslijediplomski studij iz oftalmologije. Također, kao

specijalizant aktivno sudjeluje na domaćim i međunarodnim kongresima i tečajevima

usavršavanja u području oftalmologije, posebno stražnjeg segmenta oka. Specijalistički

ispit položila je 2003. i stekla zvanje specijalista oftalmologije. Od tada radi kao liječnik,

specijalist oftalmolog na poslovima stražnjeg segmenta oka. U Poliklinici „Ghetaldus“

radila je od 2004 - 2009. u općoj oftalmološkoj ambulanti, u ambulanti za laser i

dijagnostiku (fluoresceinska angiografija). Od 2009. zaposlena u Kliničkoj bolnici “Sveti

Duh” u Klinici za očne bolesti, gdje nastavlja s radom u subspecijalističkoj ambulanti za

stražnji segment oka, ambulanti za dijagnostiku (fluoresceinska angiografija, optička

koherentna tomografija), ambulanti za neurooftalmologiju te izvodi ambulantne kirurške

zahvate laserom na mrežnici kao i intravitrealnu aplikaciju lijekova. Dolaskom na Kliniku

za očne bolesti KB Sveti Duh, nastavlja i intenzivira aktivnosti u znanstvenom i stručnom

području, posebice vezano za bolesti stražnjeg segmenta oka. Aktivno sudjeluje na

kongresima, poslijediplomskim tečajevima usavršavanja i izobrazbe liječnika 1.kategorije u

suradnji KB Sv. Duh i Medicinskog fakulteta u Osijeku, objavljuje radove te mentor je pri

izradi mnogih stručnih radova mladih oftalmologa.

Znanstveni poslijediplomski studij iz biomedicine na Prirodoslovno matematičkom

fakultetu, Odsjek za Biologiju, Sveučilišta u Zagrebu upisala je 2006. godine.

POPIS OBJAVLJENIH RADOVA:

Tojagić M, Stiglmayer N, Brzović V, Kalauz M (2001) Use of amniotic membrane in

reconstructive operative procedure in the palpebral and orbital region. Ophthalmol

Croat 10 (1-4): 3-10.

Šarić B, Brzović Šarić V, Vukas Z (2009) Liječenje dijabetičke retinopatije u

Hrvatskoj. Medix 80/81: 175-179.

128

Vidović Jelinčić M, Brzović Šarić V, Šarić B (2011) Kliničke indikacije za primjenu

fluoresceinske angiografije i optičke koherentne tomografije u dijagnostici

korioretinalnih bolesti. Ophthalmol Croat 16(1-4): 39-44.

Saric B, Brzovic Saric V, Motusic R, Predovic J (2014) Is the effect of intravitreal

triamcinolone acetonide on diabetic macular edema dose-dependent? Eur J

Ophthalmol 24(2): 221-227.

SUDJELOVANJE NA DOMAĆIM I MEĐUNARODNIM KONGRESIMA:

Brzović Šarić V, Vukojević N, Šarić B (2003) Osteom žilnice. Abstract of the 3rd of

Croatian Ophthalmolgical Society with International Participation. Ophthalmol Croat

11(1): 17.

Basioli N, Šarić B, Brzović Šarić V, Cerovski B, Paić E, Kaštelan S (2005) Tupa

trauma stražnjeg segmneta oka Berlinov edem- terapijski pristup (prikaz slučaja).

Abstract of the 5th Congress of the Croatian Ophthalmological Society with

International Participation. Ophthalmol Croat 14(1): 10.

Brzović Šarić V, Vukojević N, Šarić B (2007) Dijagnostika etiologije korioretinitisa.

Abstract of the 7th Congress of the Croatian Ophthalmological Society with


Brzović Šarić V, Šarić B, Bosnar D, Predović J, Bišćan F, Motušić R (2009)

Postoperative visual acuity relation to duration of macular hole. Abstract of the 9th

Congress of Croatian Ophthalmological Society with International Participation.

Ophthalmol Croat 18(1): 64.

Predović J, Šarić B, Brzović Šarić V , Bosnar D, Petrinović Dorešić J (2009)

Postoperative visual acuity in relation to macular hole duration in patient treated with

pars plana vitrectomy. Spectrum der augenheilkunde. Journal of the Austrian

Ophthalmic Society. Abstracts Alpe-Adria Kongress und Satellitensymposia. 05/2009:

376.

Bišćan F, Brzović Šarić V, Petrinović Dorešić J (2009) Chorioretinitis Diagnosis

Etiology. Spectrum der augenheilkunde. Journal of the Austrian Ophthalmic Society.

Abstracts Alpe-Adria Kongress und Satellitensymposia. 05/2009: 380.

Brzović Šarić V, Bišćan F, Šarić B, Predović J (2009) Eye symptoms- first signs of

systemic disease. Zbornik radova. Prvi kongres hrvatskih alergologa i kliničkih

129

imunologa s međunarodnim sudjelovanjem. Zagreb, Hrvatsko društvo za alergologiju i

kliničku imunologiju.

Šarić B, Brzović Šarić V, Bosnar D (2009) Transkonjunktivalna bešavna

vitreoretinalna kirurgija, jučer i danas. Abstract of the 9th Congress of Croatian

Ophthalmological Society with International Participation. Ophthalmol Croat 18(1):

66.

Bosnar D, Kuzmanović Elabjer B, Bušić M, Šarić B, Brzović Šarić V, Bjeloš

Rončević M, Miletić D (2009) Kasni recidiv punktatne unutarnje horoidopatije-prikaz

slučaja. Abstract of the 9th Congress of Croatian Ophthalmological Society with


Motušić R, Šarić B, Brzović Šarić V (2010) Iridocorneal endothelial syndrome- case

report. Abstract of the 10th Congress of Croatian Ophthalmological Society with

International Participation.

Vidović Jelinčić M, Šarić M, Brzović Šarić V, Stipić Marković A (2010) Allergic

Potential of Fluorescein. Abstract of the 10th Congress of Croatian Ophthalmological

Society with International Participation.

Predović J, Brzović Šarić V, Šarić B, Motušić R, Bišćan F (2010) Our experiences

with intravitreal triamconolone acetonide intravitreal application for diabetic macular

oedema. Abstract of the 10th Congress of Croatian Ophthalmological Society with


Kirinčić S, Vukojević N, Brzović Šarić V, Predović J (2010) Visual disorders in

patient with paraneoplastic syndrome- Case report. Abstract of the 10th Congress of

Croatian Ophthalmological Society with International Participation.

Brzović Šarić V, Šarić B (2010) Laser photocoagulation with CW technique. Abstract

of the 10th Congress of Croatian Ophthalmological Society with International

Participation 2010.

Šarić B, Brzović Šarić V (2010) Surgical treatment of iris melanoma. Abstract of the

10th Congress of Croatian Ophthalmological Society with International Participation.

Šarić B, Vukojević N, Brzović Šarić V (2010) Surgical treatment of choroidal

melanoma. Abstract of the 10th Congress of Croatian Ophthalmological Society with


130

Motušić R, Šarić B, Brzović Šarić V (2011) Planocelularni karcinom spojnice i

rožnice- prikaz slučaja. Abstract of the 11th Congress of Croatian Ophthalmological

Society with International Participation.

Bišćan F, Brzović Šarić V, Šarić B (2011) Cirkumskriptni hemangiom žilnice- prikaz

slučaja. Abstract of the 11th Congress of Croatian Ophthalmological Society with


Brzović Šarić V, Šarić B, Predović J (2011) Fluoresceinska angiografija melanoma

žilnice. Abstract of the 11th Congress of Croatian Ophthalmological Society with


Brzović Šarić V, Bosnar D (2011) Dijagnostičke i terapijske metode kod bolesti

stražnjeg segmenta oka: OCT,FAG i FKG retine. Poslijediplomski tečaj trajne

izobrazbe liječnika 1.kategorije. Sveučilište Josipa Jurja Strossmayera u Osijeku,

Medicinski fakultet Osijek i Klinička bolnica „Sv.Duh“ Zagreb.

Vidović Jelinčić M, Brzović Šarić V, Šarić B (2013) Presumed tuberculous

chorioiditis - case report. Abstract of the 13th Congress of Croatian Ophthalmological

Society with International Participation

Brzović Šarić V, Motušić R, Šarić B, Predović J (2013) Bilateral blindness with

significant recovery of visual functions - case report. Abstract of the 13th Congress of

Croatian Ophthalmological Society with International Participation

STRUČNO USAVRŠAVANJE / LICENCIRANI TEČAJEVI:

PHACO wet-lab tečaj / live surgery u organizaciji Hrvatskog društva liječnika za

kirurgiju katarakte i refraktivnu kirurgiju. Zagreb, 3-7. Veljače 2004.

Uveitis; Teaching course, Monte Carlo - Monaco, May, 2007.

Basic OCT; Instructional Course. Vienna, Austria 22-25. May 2008.

Advanced OCT; Instructional Course. Vienna, Austria 22-25. May 2008.

Intravitreal Application Of Drugs; Surgical Skills Training Course. Vienna, Austria

22-25. May 2009.

utjecaj neravnoteŽe Čimbenika oksidativnoga sustava na vaskularni endotelni faktor rasta · 2018....

Documents