Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293

Co nta cto :Co nta cto : digital@bl.fcen.uba.ar

Tesis de Posgrado

Uso de ácidos biliares comoUso de ácidos biliares comoprecursores sintéticos de pregnanosprecursores sintéticos de pregnanos

con aplicación en el estudio delcon aplicación en el estudio delmecanismo de hidroxilaciónmecanismo de hidroxilaciónbiológica en Carbono 14 debiológica en Carbono 14 de

cardenólidoscardenólidos

Deluca, Mónica Eva

1985

Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en CienciasQuímicas de la Universidad de Buenos Aires

Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.

This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis FedericoLeloir, available in digital.bl.fcen.uba.ar. It should be used accompanied by the correspondingcitation acknowledging the source.

Cita tipo APA:

Deluca, Mónica Eva. (1985). Uso de ácidos biliares como precursores sintéticos de pregnanoscon aplicación en el estudio del mecanismo de hidroxilación biológica en Carbono 14 decardenólidos. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_1905_Deluca.pdfCita tipo Chicago:

Deluca, Mónica Eva. "Uso de ácidos biliares como precursores sintéticos de pregnanos conaplicación en el estudio del mecanismo de hidroxilación biológica en Carbono 14 decardenólidos". Tesis de Doctor. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad deBuenos Aires. 1985. http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_1905_Deluca.pdf

UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES

"USO DE ACIDOS BILIARES COMO PRECURSORES SINTETICOS DE

PREGNANOS CON APLICACION EN EL ESTUDIO DEL MECANISMO DE

HIDROXILACION BIOLOGICA EN CARBONO 14 DE CARDENOLIDOS"

Directora de Tesis

Dra. ATicia M. Seres

Lugar de Trabajo

Departamento de Química Orgánica

MONICA EVA DELUCA

Tesis presentada para optar a1 títuTo de

DOCTOR EN QUIMICA

- 1985 ­

(:1QC\

Para Hugo y mis padres

con profundo cariño

y cada día por más razones

Deseo expresar mi gratitud

a 1a Dra. A1icia M. Seïdes, directora de

esta tesis, por su empeñoen mi formación

científica y su permanenteafecto.

Agradezco además:

A UMYMFOR(CONICET-FCEN)por 1a reaïización de las determinaciones instru­

mentaïes:

Dr. Gerardo Burton y Sr. Carlos G. Arabehety por 105 espectros de

RMN-lH y RMN-13C.

Sr. Jorge A. Aznárez por ios espectros de masa.

Lic. Juan B. Rodriguez por 1as cromatografias1iquido-1iquido de aita

resoiución.

A1 Dr. Eduardo G. Gros y a1 Dr. Gerardo Burton por e] apoyo brindado.

A1 Dr. Carios P. Lantos (Dto. Quimica Biológica, FCEN, UBA)por e] uso de]

contador de centeiïeo liquido Tracor Anaiytic Mark III.

A] Dr. I. Mizrahi (INTA, Casteiar), por las semi11as de D; purpurea.

A los Licenciados Dario Dolïer, Enrique Hughes y Jorge Pa1ermo por su amis­

tad, confianza y desinteresada c01aboraci6n.

A mis compañeros de laboratorio: Dra. Marta Maier, Lic. Marta Romero, Lic.

Patricia Eisenberg, Srta. Aiicia Arenaza y Lic. Jorge Pa1ermopor sus buenos

consejos y su ayuda diaria.

A mis compañeros del Departamento de Quimica Orgánica por su constante

cordiaiidad.

INDICE

pág.

Introducción . . . . . . . . . . . . ...... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..1

Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..28

Descripción de la labor realizada.

Sintesis de |21-14CI 3B-hidroxi-SB-pregn-8(l4)-en-20-ona y de

|21-14CI 3B-hidroxi-SB-pregnan-ZO-ona a partir de ácidos biliares . . . . ..37

Inoculación de los productos radiactivos a plantas de D. purpurea . . . . ..91

Espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear de 13€ aplicada a

derivados 56-esteroidales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..96

Descripción y discusión de los resultados obtenidos en los estudios

biosintéticos.....s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..103

Descripción y discusión de los resultados obtenidos en RMN-13€. . . . . . . . . . . ..115

Experimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..150

Resumen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..204

Bibliografia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..206

Indice de figuras...... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..213

Indice de tablas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..213

ABREVIATURAS USADAS

Ac : acetilo

CAB : cuarteto AB

CL : cadena lateral

DMF: dimetiïformamida

Hz : hertz

NLED: N-1itioeti1endiamína

Suc : succiniïo

Ts : p-toluensu1foni10

C1Ts : c1orur0 de p-toïuensuïfonilo

TsOH: ácido p-toïuensuïfonico

INTRODUCCION

Los esteroides que en humanosy animaies tienen 1a propiedad de ejercer

una acción especifica y eficaz sobre e] müscuio cardiaco se describen comoprin­

cipios cardioactivos o cardiotónicos. En ciertos casos de enfermedades cardiacas

una muy pequeña cantidad puede producir una estimuiación beneficiosa pues aumen­

ta 1a contractibilidad de] müscuio y disminuye 1a frecuencia de dichas contrac­

ciones, 10 que se traduce en una mayor eficiencia. Sin embargo una dosis excesi­

va causa 1a muerte.

La mayoria de ios miembros de] grupo son giicósidos de origen vegeta]. Una

hidróiisis separa ia porción giicosidica y iibera 1a genina o agiicona esteroi­

da].

Las geninas pueden ser de dos tipos conocidos como cardenóiidos y bufadie­

nóiidos.

Los cardenóiidos, comopor ejempio 1a digitoxina (1), son esteroides de

veintitrés átomos de carbono que tienen comocadena laterai un aniiio 1act6nico

de cinco miembrosa,B-insaturado (aniiio butenóiido)

La estereoquimica de] sistema de aniiios corresponde invariabiemente a 1a

de un ácido biliar en ios carbonos 8, 9, 10, 13 y 17 pero con unión cis entre

ios aniiios C y D y una función oxigenada en carbono 14 con orientación B (hi­

droxiio o epóxido). Se han aisiado también 5a y AS-derivadosl.

Los bufadienóiidos son esteroides de veinticuatro átomos de carbono cuya

cadena 1atera1 es un aniiio 1actónico de seis miembros dobiemente insaturado

(a-pirona). Estos compuestos, comopor ejemplo 1a bufaiina (2), también tienen

un hidroxiio en posición 14 o un epóxido entre 10s carbonos 14 y 15, en ambos

casos con configuración B,y Una unión cis entre ios aniiios A y B.

H H 2

Todos ios cardenóiidos existen comogiicósidos vegetaies, pero ios bufadie­

nóiidos son productos que se encuentran tanto en ei reino vegeta] comoanima] y

se presentan en forma giicosïdica o bien comoagiiconas.

Aunque1a actividad bioiógica descripta de un giicósido reside en 1a agii<

cona, e] hidrato de carbono ie confiere mayor soiubiiidad en agua y una mayor

difusión a través de membranassemipermeabies. Es por eiio que 1as agiiconas ii­

bres son menos potentes que sus derivados giicosidados. Esto no ocurre con ios

venenos de sapos, donde ias geninas esteroidaies 1ibres son más potentes que

cuando se las encuentra comoésteres de 1a suberiiarginina.

Las piantas de] género Digitalis, particuiarmente 1a D. purpurea, se usó

para 1a preparación de veneno para ias pruebas medievaies de ordalia. E1 empieo

de preparados de Digitalis en 1a terapia cardiaca fue introducido en 1785 por

Wiiiiam Nithering con un éxito espectacuiar.

Las Digitalis son piantas bianuaies de uno a dos metros de a1tura, que

pertenecen a 1a famiiia de 1as Escrofulariáceas. Sus fiores se disponen en es­

pigas que en aigunos casos miden más de 50 cm de 1argo. Debido a 1a semejanza

de ias fiores con ios dedaies que se utiiiZan para coser se las conoce vuigar­

mente con e] nombre de "dedaiera". Se encuentran principaimente en Europa cen­

tra] y en e] área de] Mediterráneo. En nuestro pais se puede ubicar 1a D pur­

purea en 1a zona cordiiierana comprendida entre e] lago Nahuei Huapi y e] 1ago

Argentino y procede de ios cuitivos hechos por ios jesuitas a fines de] sigio

XVII. Esta planta y 1a D. Zanata son ias utiiizadas casi exciusivamente para

1a obtención de ios giicósidos puros para usos medicinales.

Las investigaciones químicas de 1as sustancias cardioactivas de D. purpu­

rea comenzaron en Francia en e] siglo XIX. Recién en 1869 NativeHe2 obtuvo un

compuesto cristaiino que 1uego se conoció comodigitoxina. Su estudio quimico

y farmacoiógico se inició en e1 sigio XXpor Cioetta3 y Windaus4. Una hidróli­

sis ácida de digitoxina rindió 1a agiicona digitoxigenina (3) y tres molécuias

de digitoxosa (2,6-didesoxi-D-ribo-hexosa)(4).

(PHOCH2

OH

OH

H H

H H 3 CH3 4

6Posteriormente, Nindaus5 y Kraft aisiaron gitoxina (5) de D. purpurea y

en 1930 Smith7 obtuvo digoxina (6) de D. Zanata.

H

H

R H

R=A 5 R=A 6

R=H a R=H 7

H H H

A ¡1

Los tres giicósidos (digitoxina, digoxina y gitoxina) tienen estructura anu­

1ar simi1ar y están unidos a un trisacárido constituido por tres moïécuias de di­

gitoxosa a través de] carbono 3 de ias respectivas agiiconas (digitoxigenina (5),

digoxigenina (7) y gitoxigenina (8)).

Si bien estos tres g1icósidos descriptos resuïtan ser 105 mayoritarios en

piantas de Digitalis, posteriormente fueron aisïados de ias mismasotros com­

o a o 8 g g .puestos cardiotonicos minoritarios.

BIOSINTESIS DE CARDENOLIDOS. ANTECEDENTES.

La biosintesis de cardenóïidos ha sido investigada uti1izando piantas de]

género Digitalis, en particuiar D. Zanata y D. purpurea. Se rea1izaron además

aïgunos estudios comp1ementarios en Strophantus kombé.

La estructura esteroida] de Ios cardenóiidos sugiere que su biogénesis pue­

de estar intimamente re1acionada con 1a de 10s esteroïes, existiendo una dife­

rencia estructuraï importante entre ambosy que consiste en que 1a cadena 1ate­

ra] aiifática de 105 esteroles ha sido reemp1azada por un grupo butenóiido.

Dado que e] ácido mevaiónico (9) ha sido reconocido como precursor de] co­

1estero] (10)g en experiencias reaiizadas con tejido anima], Ramstadt y Bea]10

iniciaron los estudios intentando estabiecer si en e] caso de compuestoseste­

roidaies de origen vegeta] e] camino biosintético era simi1ar a1 encontrado en

animaies. Para eilo probaron 1a función que podria tener e] ácido mevaiónico en

1a biosintesis de gïicósidos cardiotónicos suministrando |2-14CI ácido mevaióni­

co a plantas de D. Zanata. Después de un periodo de tiempo adecuado, Ios autores

aisiaron un g1icósido radiactivo cuya hidróiisis producía digitoxigenina (3) ra­

diactiva e hidratos de carbono no radiactivos. Io que confirmaba e] carácter pre­

cursor de] ácido mevalónico de 1a porción esteroida] de estos compuestos.

Debido a que en animaies estaba bien estabiecido que e] coiesteroi se for­

maba por ciciación de] escuaieno (11) y que éste derivaba de seis moiécuias de

ácido mevaïónico, Leete y coiaboradoresu’12 asumieron comohipótesis de trabajo

que ios cardenóiidos se podrian formar en ias piantas por una secuencia anáioga

de reacciones. De ser asi, e] |2-14CI ácido mevaiónico produciría digitoxigeni­

na marcada en ios carbonos 1, 7, 15 y 22 (esquema 1), considerando que e] aniiio

butenóiido derivara de 1a cadena 1atera1 de un esteroide o triterpeno estrecha­

mente reiacionado con ei coiesteroi, por ruptura de 1a mismaentre ios carbonos

23 y 24.

a ' 4 *CH3C02H —-—-> --—-—->

14

Esguema1: Hipótesis sobre 1a distribución de 1a marcación en digitoxigenina

a partir de ácido mevaiónico.o ácido acético.

Para comprobar esta hipótesis fueron inocuiados ejempiares de D. purpurea

con [2-14C! ácido mevaiónico, aisiando posteriormente ia digitoxina provenien­

te de 1a experiencia. E1 giicósido fue hidroiizado y acetiiado obteniéndose

acetiidigitoxigenina (12) que fue sometida a una ozonólisis reductiva y poste­

rior degradación ta] como se indica en e] esquema 2.

23 *122

20 21

-—-—->

H

A“: ¡1 12

H 1

+ 533.

l02HÁa??? HCHO+ co2

(C-ZZ) C-23H ( >

Ac H13

Esguema2: Degradación de] ani110 butenólido de 1a digitoxigenina.

It

H

Coneste procedimiento los autores pudieron verificar que e] ácido 3B-ace­

toxi-14B-hidroxi-5s-androstán—17B-carboxi1ico (13)presentaba 1a mismaactividad

especifica que 1a aceti] digitoxigenina de partida, 10 que indicó que Ios carbo­

nos 21, 22 y 23 que forman parte de] aniiio butenóiido no poseían radiactividad.

La reacción de Schmidt sobre e] ácido etiánico anterior (13) rindió dióxido de

carbono no radiactivo, 10 cua] indicó que no habia actividad en e] carbono 20.

Este resuitado hizo resurgir dos antiguas teoriasl3’14 que sugerian que e]

aniiio butenóiido se formaba a partir de una o dos moiécuias de ácido acético,

probabiemente activadas como aceti] coenzima A, según se indica en e] esquema 3.

C)2P1

¡1

' AcS-CoA IE

H 10 a b ‘

O H2 02H

AcS-CoA

Esguema3: Teorias sobre 1a formación dei aniiio butenóiido.

——{> Teoria A —’ Teoria B

Teoria A: ruptura de 1a cadena 1atera1 de] coiesteroi entre ios carbonos 20 y 22

para dar un 20-ceto derivado (a) que reaccionaria con una moiécuia de

acetato dando un B-hidroxiácido (b).

)Teoria B: ruptura de 1a cadena iaterai de] coiesteroi entre ios carbonos 17 y 20

dando un ácido etiánico (c) que con una moiécuia de acetato daria un

B-cetoácido (d) que por descarboxiiación formaría un 20-ceto pregnano

10

(a) que reaccionaria comose indicó anteriormente.

Por e110 Leete y coïaboradores12 inocuïaron [1-14CI acetato de sodio (14)

a p1antas de D. purpurea y aislaron digitoxina radiactiva (ver esquema 1) que

degradaron como se indica en e] esquema 2. En este caso e] aniiio butenóïido pre­

sentaba un significativo valor de radiactividad que estaba 10ca1izada en 10s car­

bonos 20 y 23, mientras que Ios carbonos 21 y 22 resuitaron esenciaimente inac­

tivos.

Sin embargo e] origen de] aniïïo 1act6nico no estaba aün aciarado pues e]

resuïtado anterior no permitía descartar ninguna de 1as dos teorias antes pro­

puestas. Para 11egar a esclarecer cuá] de ios dos caminos era e] que rea1mente

seguia e] proceso biosintético inyectaron piantas de D. purpurea con |3'-14C|

ácido mevaïónico. Un pregnano formado a partir de este ácido resu1taria marcado

soiamente en 1as posiciones 18, 19 y 21 (indicado con ú-en ias fórmuias de] es­

quema 1). Comoera previsibIe 1a digitoxina aisiada dos semanas después era ra­

diactiva. Los estudios de degradación indicaron que 1a tercera parte de 1a acti­

vidad estaba 10caïizada en e] carbono 21,10 que descartaba ¡a posibiïidad de un

ácido etiánico comointermediario en e] proceso en estudio. De esta manera que­

daba e1iminada 1a teoria que postuïaba 1a ruptura entre 105 carbonos 17 y 20 de]

coïesteroï.

15Finalmente Gros y Leete degradaron compietamente 1a digitoxigenina ais1a­

da 1uego de una incubación con |2-14Cl ácido meva16nico en piantas de D. purpu­

11

rea. Encontraron que ias marcaciones estaban exciusivamente iocaiizadas en ios

carbonos 1, 7 y 15 (ver esquema 1) y que 1a radiactividad estaba igualmente di­

vidida entre esos carbonos.

Estos resuitados 11evaron a proponer que ios esteroides de plantas se bio­

sintetizan a partir de escuaieno siguiendo 1a mismaserie de reacciones metabó-'

iicas que aqueiias que conducen a esteroides animaies comoe] coiestero].

Las conciusiones anteriores se confirmaron por una parte con 1a experiencia

realizada por Tschesche y Lih'enweiss16 quienes administraron e] 3B-giucósido de

1a |21-14CI 3B-hidroxipregn-S-en-ZO-ona (pregnenoiona) (15)* a piantas de D. Za­

nata. Estos investigadores encontraron que ei 6%de 1a actividad suministrada

estaba en ios giicósidos cardenóiidos digitoxina, gitoxina, digoxina y xysmaio­

na (16).

OHH R

* Los compuestos mencionados 11evan un número correspondiente a su estructura

sin marcación isotópica. La mismase indica en cada caso en particuiar.

12

Por otro iado, Reichstein y coiaboradores17 rociaron |3-14CI ácido mevaióni­

co en hojas de D. Zanata. La digitoxina aisiada de ias mismas se hidroiizó y 1a

agiicona se degradó según un esquema similar a1 esquema 2, resultando marcada en

e] carbono 20 además dei sistema esteroida]. Finaimente Tschesche y Brassat18

determinaron que |21-14CI pregnenoiona presentaba incorporación en ios cardenó­

1idos.

En 1966 Caspi y coiaboradores19 inyectaron |4-14CI coiesteroi a piantas de

D. Zanata y aisiaron entre ios metaboiitos pregnenoiona radiactiva, demostran­

do asi 1a capacidad de ias piantas de metaboiizar coiesteroi.

En ese momento, uno de ios mecanismos que faitaba esciarecer era e] de ia

hidrogenación estereoespecifica de] dobie en1ace de 1a posición 5 conducente a

un sistema A/B cis. Una idea expuesta por Caspi y Lewis20 sugeria que 1a satu­

ración de1 alcohoi homoaiiiico (3B-hidroxi-A5) para rendir SB-pregnanoiona po­

dia proceder mediante una oxidación e isomerización a una A4-3-cetona que pos­

teriormente se reduciría mediante una cis adición de hidrógeno por 1a cara a dei

sistema. La evidencia en 1a que se apoyaban era que dado que e] coiestero] se

transformaba en pregnenoiona, esta üitima debia tener en 1a biosintesis de gii­

cósidos cardiotónicos en piantas un ro] anáiogo a1 que tiene en 1a formación de

hormonasesteroidaies en animaies. Por eiio Heftmanny coiaboradoresu’22 hicie­

ron un estudio de los metaboiitos radiactivos aisiados 1uego de 1a incubación de

|4-14C| pregnenoiona en piantas de D. Zanata pudiendo identificar pregn-4-en­

3,20-diona (progesterona)(17) y SB-pregnan-3,20-diona (18) radiactivas.

17 18

Este resuitado ios 11evó a suministrar |4-14CI progesterona, encontrando

con este compuesto una incorporación en cardenóiidos diez veces mayor que en e]

caso anterior. Estos resuitados demostraban que 1a progesterona era un precur­

sor más avanzado en e] camino biosintético hacia los giicósidos cardiotónicos.

A1 igua] que en 1a oportunidad anterior en este caso también se aisió SB-preg—

nan-3,20-diona radiactiva.

Para compietar ei problema de 1a saturación de] dobie eniace Caspi y

Hornby23 rociaron hojas de D. Zanata con |3a-3H, 4-14CI pregnenoiona. La digi­

toxina radiactiva aisiada no contenía tritio io que permitió conciuir que un

3-ceto derivado era intermediario en 1a ruta biosintética de pregnenoiona a

cardenóiidos.

Posteriormente Tschesche y coiaboradores24 demostraron que 1a 3B-hidroxi­

SB-pregnan-ZO-ona (19) y 1a SB-pregnan-3,20-diona eran precursores de digitoxi­

na, digoxina y gitoxina en piantas de D. Zanata

En 1967 Tschesche, Huipke y Schoïten25 trataron de acotar 1a etapa de] ca­

mino biosintético en que se produce 1a hidroxiiación. Supusieron que podria

14

realizarse sobre esteroides de] tipo 20-ceto pregnano, pero también existia 1a

posibiiidad de que fuese posterior a 1a construcción de] aniiio iactónico. Para

aclarar este punto suministraron [15,16-3HZI3B,14B-dihidroxi-SB-pregnan-ZO-ona

(20) a hojas cortadas de D. Zanata y aisiaron de ias mismas digitoxina radiac­

tiva. Este hecho permitió deducir que 1a hidroxiiación en carbono 14 ocurre an­

tes que 1a formación de] aniiio butenóiido.

H H H H19 20

Una vez aciarada esta etapa se sospechó que para 1a unión de ios dos átomos

de carbono requeridos para 1a construcción de] aniiio 1act6nico era necesaria

una hidroxiiación en carbono 21. Con e] fin de comprobarlo Tschesche, Becker y

6Hombach2 sintetizaron |3-3HI 38,146,21-trihidroxi-SB-pregnan-ZO-ona (21) y pro­

baron su comportamiento como precursor de cardenóïidos en piantas de D. Zanata.

H

HO H

21 22

15

En esta experiencia aisiaron cardenóiidos radiactivos, quedandode esta ma­

nera confirmada su participación comoprecursor.

Por otro 1ado, teniendo en cuenta e] contenido radiactivo de ias agïiconas

esteroidaies aisiadas 1uegode 1a inocuiación con |22-14C| digitoxigenina se de­

terminó que esta última se hidroxiiaba en posición 128 para rendir digoxigeni­

na, pero 1a hidroxiiación en carbono 16 para formar gitoxigenina se producía en

pequeña proporción.

En experiencias posteriores27 se demostró que por administración de 14B­

hidroxiprogesterona (22) a piantas de D. Zanata se obtiene un a1to rendimiento

de gitoxigenina pero bajo de digoxigenina.

Este conjunto de datos permitió suponer que 1a digoxigenina se forma pri­

mordiaimente por hidroxiiación de digitoxigenina. Por otro 1ado gitoxigenina se

biosintetiza mediante dos caminos alternativos: uno por hidroxiiación en carbo­

no 16 de digitoxigenina y e] otro a través de 1a hidroxiiación en carbono 16 de

un pregnano .

Paraieiamente con estas experiencias Heftmanny coiaboradores28 estudiaron

1a biosintesis de giicósidos cardiotónicos en piantas de] género Strophanthus

cuyos cardenóiidos difieren de 105 encontrados en Digitalis por presentar fun­

ciones oxigenadas en 1a posición 5.

E1 objetivo inicia] fue determinar si ios primeros pasos de] camino biosin­

, . . . . . 14tetico eran ios mismosen ias dos espec1es. Para e110 administraron |4- Cl pro­

16

gesterona (17) a hojas de S. kombéy aisiaron Iuego de una hidrólisis peripioge­

nina (23), estrofantidina (24) y estrofantidoi (25) radiactivas.

OH

H H

H HH 23 24

H

H

HH 25

Dado que, en animaies 1a transformación de AS-esteroides en anáiogos satu­

rados 5a o 58 procede via un A4-3-ceto intermediario, no resultaba sorprendente

que progesterona fuese intermediario en 1a biosintesis de cardenóiidos en pian­

tas de Digitalis. Pero ios cardenóiidos de Strophanthus son esteroides SB-hidro­

xiiados que no se presentan en animaies. Según 10s autores, este resuitado in­

dica que una A4-3-cetona, en este caso progesterona, es también un intermedia­

rio obiigatorio de 3,5-di01es. Deeiio conciuyeron que 1a biosintesis de estos

giicósidos en Digitalis y en Strophanthus procede aparentemente a través de ios

17

mismos intermediarios hasta 1a saturación de] dobie eniace.

En experiencias posterioreszg’30 utilizando e] mismoprecursor, |4-14CI

progesterona, aisiaron SB-pregnan-3,20-diona (18), 3B-hidroxi-Sa-pregnan-ZO-ona

(26), 36,58-dihidroxipregnan-ZO-ona (27) y 3B-hidroxi-53-pregnan-20-ona (19) ra­

diactivas.

26 27

Resuitó especiaimente sorprendente encontrar esteroides 5a en S. kombéya

que estos no se habian detectado anteriormente. Es por eiio que ios autores su­

ministraron [4-14CI 33-hidroxi-5a—pregnan-20-ona (26) y |4-14CI 38,58-dihidroxi­

pregnan-ZO-ona (27) a piantas de esa especie. Asi aisiaron varios productos ra­

diactivos, pero ninguno de eiios en cantidades apreciabies. E1 ünico que pudie­

ron identificar fue ei cardenóiido uzarigenina (28) que no habia sido identifi­

cado previamente en S. kombéy se encontraba raramente en otras especies de

Strophanthusla.

De esta manera se demostró 1a presencia de un cardenóiido con un hidrógeno

5a en esta especie.

18

Los aspectos más importantes de 1a hidroxiiación enzimática de carbonos se­

cundarios no activados en nücieos esteroidaies eran conocidos desde hacia varios

años. En tejidos animaies31, microorganismos32 y piantas33 e] hidroxiio entrante

asumia 1a estereoquimica de] hidrógeno saiiente.

En contraste con esto, e1 mecanismode hidroxiiación de carbonos terciarios

no activados no estaba ciaro y en aigunos casos 1a hidroxiiación ocurria con re­

tención y en otros con inversión de 1a configuración.

De este modo, 1a conversión de coiesteroi (10) en 20(S)-c01est-5-en-3B,20­

34 y 1a 14a-hidroxi1aci6n de este­dio] (ZOa-hidroxicoiesteroi) en tejido adrenai

roides de 19 y 21 átomos de carbono por microorganismos35 son ejempios de hidro­

xiiación con retención de configuración.

En cambio, 1a introducción de] hidroxiio 145 en cardenóiidos procede .con

inversión de configuración pues coiestero], pregnenoiona y progesterona, que son

precursores en su biosintesis, presentan una unión trans entre 105 aniiios C y D

(H-14a). En consecuencia, teniendo en cuenta este factor, si 1a hidroxiiación

19

ocurriera por ias vias conocidas deberia esperarse un producto con un hidroxiio

14a en 1ugar de 143. Dado que ios resuitados obtenidos no respondían a un camino

de hidroxiiación bioiógica norma], varios investigadores intentaron aciarario.

Caspi y coiaboradores36 propusieron mecanismos que podrian expiicar dicha

hidroxiiación (esquema 4). Su teoria se basaba en una hidroxiiación inicia] por

e] procedimiento convenciona] que introduciria un hidroxilo 14a (a). La posibi­

iidad de esta reacción se veía apoyada por e] aisiamiento de esteroides 14u-hi­

droxiiados de origen vegeta137’38.

E1 hidroxiio 14a se transformaria en un a1coh01 143 por un camino que se

podría explicar por conceptos quimicos. Propusieron para eilo dos mecanismos,

uno iónico y otro radica1ario.

E1 mecanismoiónico consistía en 1a deshidratación de] a1coho] terciario

con formación de un dobie eniace 14(15) (b) que debido a una oxidación por 1a

cara B de 1a moiécuia produciría un epóxido 148,153 (c). La presencia de epó­

xidos 146,153 en bufadienóiidos respaidaria indirectamente este punto de vista.

Finaimente 1a apertura reductiva de] epóxido por ataque a1 carbono 15 da­

ria e] aicohoi 146 (d).

Si 1a deshidratación de] a1coho] 14a (a) conduce a1 dobie eniace en posi­

ción 8(14) en 1ugar de 14(15) se podria apiicar ei mismo razonamiento.

E1 segundo mecanismoera via radicaies iibres y resuitaba iguaimente pro­

babie teniendo en cuenta que 1a biosintesis de cardenóiidos ocurre en ias “ho­

J.aslfi,18,20.

20

Esguema 4: Teoría de Caspi sobre 1a hidroxí1ación 148.

R- R

HIDROXILACION————-—>. BIOLOGICA NORMALH OH

a

R R

b e).

1B R/1R\RQ? ¿Emi-W?

1 \lR/“/«<PÉ%

e

MECANISMO MECANISMO POR

IONICO RADICALES LIBRES

21

Bajo la influencia de la luz solar, el alcohol 14a podria producir un oxi­

radical (e). Se sabe que estos radicales se reordenan dando ceto-radicales39

de distinto tipo (f3 g, h). El nuevo cierre del anillo podria ocurrir con in 7

versión, para dar el oxi-radical 14s (i) y finalmente el alcohol (d).

La hidroxilación inicial no estaria limitada al carbono 14 y podria ocu­

rrir en los carbonos 8 y 15. Estos compuestos se transformarian por mecanismos

similares al descripto.

Para analizar las posibilidades planteadas se administró |1—3H|14a-hidro­

xi-53-pregnan-3,20-diona (14a-hidroxiprogesterona) (29) junto con |4-l4cl pro­

gesterona (17) a plantas de D. Zanata, tratando de establecer si ambos isótopos

0 solamente el 14€ se incorporaban en digitoxina.

29

Una vez finalizado el ensayo la digitoxigenina aislada contenía 14€ pero

no tritio, lo que indicó que el sustrato propuesto (29) no era intermediario.

De todas formas los autores pensaron que otro 14a-hidroxi intermediario po­

dria estar involucrado en la formación de cardenólidos, por ejemplo en alguna

etapa posterior de la biosintesis.

22

En 1970 Tschesche voivió a piantear 1a posibiiidad de un intermediario con

un dobie eniace en posición 1424. Esta idea habia sido anaiizada por Caspi a]

proponer su mecanismo iónico, pero Tschesche supuso que 1a no incorporación de

14a-hidroxiprogesterona (29) 5610 descartaba una primera etapa de hidroxiiación

norma], pero no 1a participación de 1a mencionada oiefina.

Suministro ¡16,17-3H2| 3s-hidroxi-58-pregn-14-en-20-ona (30) a piantas de

D. Zanata, pero e] compuesto cardenóiido aislado de ias mismas no presentó ra­

diactividad.

30

Este resuitado compiementóei trabajo reaiizado por Caspi.

Finaimente, Canónica y colaboradores40 reaiizaron una experiencia que ter­

minó de definir 1a no participación de] carbono 15 en e] proceso de hidroxiia­

ción. Administraron ¡ZR-3H, 2-14CI ácido mevaiónico (9) a piantas de D. Zanata.

Este compuesto debia originar en 1a pianta un\intermediario 15a-tritio comoase

indica en e] esquema 5. E1 hidrógeno 158 de] 1anoster01 (31) se retiene en 1a

eiiminación de] metiio 14a (j) y se invierte en 1a hidrogenación de] doble en­

1ace (k). Por 10 tanto ei último precursor debia originar en 1a pianta progeste­

rona o derivados de ésta con tritio en 1a posición 15a.

23

02H

H3C ._.__....2H4OH

._._> ————) —-> CARDENOLIDOS

., . . . 3 . .Esguema 5: Formac1on de] intermediario 15a- H en organismos V1VOS.

E1 ácido mevaiónico inyectado tenia una reiación 3H/14C de 8,04 y 1a digi­

toxigenina aisiada de 6,34. Cuandose transformó 1a digitoxigenina (3) en 3e­

acetoxi-lS-oxodigitoxigenina (32) (esquema 6) dicha relación disminuyó a 4,18

indicando que e] tritio proveniente dei ácido mevaiónico se retenia durante 1a

conversión en cardenóiidos. Sin embargo 1a reiación era menor que en ei sustrato

iniciai, pero si se tiene en cuenta que e] colesteroi biosintetizado por 1a

pianta tenia una reiación de 6,64 , se puede atribuir 1a disminución observada

a 1a siguiente isomerización enzimática reversibie:

—9isopentenii pirofosfato dimetiiaii] pirofosfato

24

1) Ac20/C5H5N

+1 2) SOC12/C5H5N

H H AC H

Ac H

Esguema6: Transformación de digitoxigenina (3) en 33-acetoxi-15-oxodigitoxi­

genina (32).

Para estudiar 1a posibie participación de] hidrógeno 158 se administró

[153-3H, 4-14CI progesterona a plantas de D. Zanata. A1 aislarse 1a digitoxige­

nina se encontró que se mantenía 1a reiación entre ios isótopos y que por trans­

formación en 38-acetoxi-15-oxodigitoxigenina (esquema6), se perdia e] tritio

casi totaimente. Esto indica que e1 hidrógeno 158 no participa en e] proceso de

hidroxilación en e] carbono 14 a partir de progesterona.

25

Por último para confirmar los resultados suministraron a D. Zanata

|15a,158,21,21,21-3H5, 4-14CI pregnenolona. Dicho precursor administrado se

equilibró con hidróxido de sodio en metanol acuoso para eliminar el tritio del

carbono 21. El producto resultante presentó una relación 3H/14Cde 9,52.

La digitoxigenina aislada se degradó para obtener el ácido etiánico co­

rrespondiente que presentó una relación 3H/14Cde 9,52.

En consecuencia se puede concluir que los hidrógenos del carbono 15 no in­

tervienen en el mecanismo de hidroxilación en el carbono 14 lo que excluye la

participación de intermediarios con un hidroxilo, epóxido o doble enlace que

involucre el carbono 15.

Posteriormente Caspi y colaboradores41 estudiaron la posible participación

de una olefina (u olefinas) alrededor del carbono 8 y para ello suministraron

|8-3H, 4-14CI colesterol a plantas de D. Zanata.

Los autores aislaron digitoxigenina y digoxigenina con la mismarelación

isotópica del precursor suministrado. Deello dedujeron que la introducción del

hidroxilo ocurre sin pérdida del hidrógeno de carbono 8 de colesterol, quedando

eliminadas con esta observación las olefinas planteadas comointermediarios,

conclusión que es válida sólo si no hay migración de átomos de tritio durante

el proceso biosintético.

Sin embargo, paralelamente con estos trabajos Tschesche y Kleff42 supusie­

ron que en el proceso de hidroxilación 148 podria participar un doble enlace

8(14).

26

Administraron |7-3Hl SB-pregn-8(14)-en-3,20-diona (33), |7—3H| pregneno­

iona y |6-3H| 7-dehidroprogesterona (34) a piantas de D. Zanata.

33 34

E1 aisiamiento de ios metabolitos de 1a pianta y 1a caracterización de 10s

mismos indicó que 53-pregn—8(14)—en—3;20-dionay pregnenoiona son precursores

de digitoxina mientras que 1a 7-dehidroprogesterona no lo es.

Los autores se preguntaron cómo podia e] compuesto 33 transformarse en ei

derivado hidroxilado. Supusieron que una posibilidad era a través de un epóxido

en posición 8(14). Esta suposición se veia respaidada porque 1a adinerigenina

(35) (agiicona de un cardenóiido minoritario de Nerium oZeander L.) da por hi­

drogenación cataiitica 1a dihidrodigitoxigenina (36).

*1 ii ii ¡135 36

27

De esta forma se produce una hidroxi1acíón 14s a partir de un epóxido

8(14) por un camino químico.

Comoconsecuencia de] dato obtenido de incorporación de] compuesto 33

Tschesche43 desarroïïó 1a síntesis de1 epóxído 37 a fin de confirmar su teoría,

pero hasta e] momentono han aparecido pub11caciones sobre 105 resuïtados obte­

nidos por inocu1ación de] mismo.

37

OBJETIVOS

28

Los objetivos de] presente trabajo fueron:

- ESTUDIO DE 3B-HIDROXI-58-PREGN-8(14)-EN-20-ONA COMOPRECURSORBIOSINTETICO

DE GLICOSIDOS CARDENOLIDOS.

- SINTESIS DE ¡21-14c| 3B-HIDROXI-SB-PREGN-8(14)-EN-20-0NA Y DE ¡21-14cl

3B-HIDROXI-SB-PREGNAN-ZO-ONA A PARTIR DE ACIDOS BILIARES.

- ANALISIS DE LOS DATOS OBTENIDOS POR ESPECTROSCOPIA DE RESONANCIA MAGNETICA

NUCLEAR DE 13€ PARA DIFERENTES DERIVADOS SB-ESTEROIDALES.

29

De acuerdo a los resuitados descriptos anteriormente, 1a secuencia confir­

mada hasta e] momentopara e] camino biosintético de ios cardenóiidos en pian­

tas de] género Digitalis es 1a presentada en e] esquema 7.

409Una vez descartada 1a participación de ios hidrógenos de 1a posición 15

los intentos de determinar e] camino de hidroxiiación en posición 14 con orien­

tación B se basaron en 1a participación de un dobie eniace 8(14).

Ta] comose pianteó, 10s trabajos reaiizados sobre este tema introdujeron

resuitados contradictorios. Por un 1ado, Caspi y coiaboradores41 dedujeron que

1a hidroxiiación ocurre sin 1a pérdida de] hidrógeno de carbono 8 de coiesteroi,

con 10 que se eiiminaria 1a oiefina pianteada. Por otro 1ado, casi simu1tanea­

mente, Tschesche y Kieff42 aseguraron que SB-pregn-8(14)-en-3,20-diona (33) es

precursor de digitoxina.

Es decir que, con Ios datos existentes hasta e] momento, no sóio no era po­

sibie aclarar e] mecanismobiosintético de 1a hidroxiiación 14s, sino que ade ­

más no estaba asegurada 1a participación de] dob1e eniace 8(14). Por eiio e]

primer objetivo de] presente trabajo fue e1ucidar 1a posibie incorporación en

e] proceso biosintético de un intermediario con un doble eniace 8(14) y asi po­

der aciarar 1a disyuntiva pianteada.

Para eiio se sintetizó |21-14CI 3B-hidroxi—58-pregn-8(14)-en-20-ona (38).

A diferencia dei compuesto ensayado por Tschesche y Kleff (33) este producto

presenta una estructura esteroida] que se encuentra más próxima a 1a de 10s

cardenóiidos ya que, ta] como se puede observar en e] esquema 7, seria e] in­

Esguema7: Intermediarios conocidos de 1a biosïntesis de carden61idos

30

31

termediario inciuido entre ios compuestos 19 y 20.

Por otra parte se utilizó comocompuesto testigo |21-14CI 3B-hidroxi-56­

pregnan-ZO-ona.(19).

La inocuiación de ios dos sustratos (19 y 58) se efectuó en forma paraieia,

a1 igual que 1a extracción y procesamiento de ios cardenóiidos. De esta manera

1a correcta incorporación de] intermediario biosintético 19 resuitaria un ava]

para ios resuitados obtenidos con e] supuesto precursor 38.

32

Ta] comose pianteó previamente el segundo objetivo de] presente trabajo

era 1a sintesis de [21-14C| 3B-hidroxi-56-pregn-8(14)-en-20-ona (38) y de

|21-14cl 3s-hidroxi-SB-pregnan-ZO-ona (19).

Si bien existían varias posibiiidades para 1a elección de] materiai de

partida, se optó por desarroiiar ios caminossintéticos usando ácidos biiiares

comoprecursores.

Estos compuestos presentan un sistema tetraciciico esteroidai con unión

de aniiios A/B cis. Los cinco carbonos de 1a cadena 1atera1 corresponden en es­

tructura y en configuración de} carbono 20 a ios cinco primeros átomos de car­

bono de 1a cadena laterai de] coiesteroi. Todos ios ácidos biiiares naturaies

tienen un grupo hidroxiio en carbono 3 que está orientado hacia ei 1ado a de 1a

molécula. Tienen 1a misma orientación de 1a cadena 1atera1 y de 10s metiios an­

guiares que e] coiesteroi y también 1a misma fusión de aniiios B/C y C/D(trans).

Dentro de ios más comunes se encuentran los siguientes:

H HQ 02H 9 02H

H

ácido cóiico (39) ácido desoxicóiico (40)

33

02 H 02H

HO’ H “OH Hor H

ácido quenodesoxicólico (41) ácido litocólico (42)

De acuerdo a lo descripto se deduce que los ácidos biliares presentan:

a) La misma estereoquimica en carbono 5 (58) que los compuestos a sintetizar.

b) Una cadena lateral que podia ser degradada a la de un ácido etiánico por un

camino que involucrara como intermediario a un 20-ceto pregnan derivado.

ÓV El hidroxilo de carbono 3 cuya configuración podia ser invertida.

Q. V En el caso del ácido quenodesoxicólico (41), un hidroxilo en carbono 7 cuya

deshidratación podia originar el doble enlace 8(14) buscado.

Por un lado todos estos factores permitían preveer el desarrollo de inte­

resantes caminos sintéticos. Por otro lado, y también comofactor de decisión,

eran compuestos fácilmente accesibles en cantidad y cuyo costo permitía en este

caso el desarrollo de la labor planteada.

Teniendo en cuenta todo ello, se eligió el ácido quenodesoxicólico como

producto de partida para el compuesto 38 y el ácido litocólico (42) como pro —

ducto de partida para el 19.

Tal comose discutirá posteriormente,interesó desarrollar dichas sintesis

34

introduciendo 1a marcación isotópica en e] carbono 21 en ios pasos finaies de

las mismas. Esto impiicó una degradación de 1a cadena iaterai de] ácido biiiar

hasta una de] tipo ácido etiánico.

Interesaba también, por ios motivos expuestos en 1a página 114, desarro ­

11ar ios caminos sintéticos a través de un intermediario con cadena 1atera1

de] tipo 20-ceto pregnano (anterior en 1a degradación a1 ácido etiánico) que

permitiera en un futuro trabajo 1a eiongación de 1a misma.

Las modificaciones a introducir sobre ios ácidos 41 y 42 se resumen en e]

esquema 8.

35

N T N02H«DEGRADACION Y co s RUCCIO

DE LA CADENA LATERAL

INVERSIONDELA fl

CONFIGURACION HO" H “OH

‘ 4113

DESHI DRATACI ON E ISOMERI ZACION

DEL DOBLE ENLACE FORMADO

H H

38

02H ‘ lDEGRADACION Y CONSTRUCCION

DE LA CADENA LATERAL

INVERSIONDE LA H

CONFIGURACION HO" H

z 42

H H

1.9

Esguema 8: Esteroides de partida para 1a síntesis de 105 compuestos 19 y 38.

36

Los compuestos de partida, intermediarios y finaies utiiizados y obtenidos

en e] presente trabajo (saivo pocas excepciones) tenian 1a caracteristica comün

de ser derivados esteroidaies con fusión de aniiios A/Bcis. Debido a que estos

compuestos no son tan comunes en 1a naturaieza como sus isómeros A/B trans, no

se encontraban en 1iteratura demasiados datos de anáiisis por espectroscopia de

resonancia magnética nuciear de 13C. Es por eiio que, como una contribución que

en ese sentido se podia aportar, se asignaron ios espectros obtenidos para cada

uno de eiios. La necesidad en muchos casos de tener vaiores de asignación fide­

dignos correspondientes a espectros de compuestos patrones, requirió 1a sinte­

sis de aigunos derivados que no eran accesibles comerciaimente.

La correiación de ios datos obtenidos permitió e] anáiisis de 1a infiuen­

cia de diferentes configuraciones en e] carbono 3; 1a infiuencia de distintas

cadenas 1atera1es sobre e] sistema anuiar; ias diferencias en distintos deriva­

dos por 1a introducción de un sustituyente en e] carbono 7 y de un dobie eniace

en 1a posición 8(14). Dicho anáiisis permitió también 1a predicción de] confór­

mero favorecido para los ácidos biiiares en soiución.

DESCRIPCION DE LA

LABOR REALIZADA

SINTESIS DE

¡21-14c| 3B—HIDROXI-SB-PREGN-8(14)-EN-20-0NA

v DE ¡21-14| 3B-HIDROXI-SB-PREGNAN-ZO-ONA

A PARTIR DE ACIDOS BILIARES.

37

A continuación se discuten ios métodos sintéticos empïeados para ias si­

guientes secuencias:

A­

E­

F ­

Ensayos reaiizados para 1a degradación de 1a cadena 1atera1 de] ácido bi­

iiar a una cadena 1atera1 de] tipo ácido etiánico. Dichos ensayos se efec­

tuaron utiiizando comosustrato de partida e] ácido quenodesoxicóiico y se

apiicaron sin mayoresmodificaciones a] ácido iitocóiico.

Ensayos reaiizados para 1a inversión de 1a configuración de] carbono 3. Por

1as razones expuestas en 1a página 48 , se efectuaron sobre ios ésteres me­

tiiicos de ios ácidos litocólico o quenodesoxicóiico según e] caso.

Ensayos realizados para 1a deshidratación de] hidroxiio de carbono 7 e iso­

merización de] dobie eniace formado a 1a posición 8(14). Dichas pruebas se

efectuaron sobre e] ácido quenodesoxicóiico.

Ensayos reaiizados para 1a construcción de 1a cadena laterai de] tipo 20­

ceto pregnano a partir de 1a cadena de] tipo ácido etiánico obtenida segün

A. Dicho procedimiento, que debia permitir e] uso de pequeñas cantidades de

esteroide y reactivo, seria e] empieado para e] armado de 1a cadena iaterai

de ios dos productos (19 y 38) a utiiizar en 10s estudios biosintéticos.

Los ensayos se efectuaron sobre e] ácido 3B-hidroxiandrost-5-en-17B-carbo­

xiiico (75) dado que era un producto comerciaimente disponibie.

Sintesis totai de |21-I4C| 3B-hidroxi-SB-pregn-8(14)-en-20-ona (38).

Sintesis tota] de |21-14C| 33-hidroxi-SB-pregnan-ZO-ona (19).

38

A - DEGRADACION DE LA CADENA LATERAL

El objetivo de esta etapa era transformar la cadena lateral de un ácido bi­

liar en la cadena de los ácidos etiánicos (17B-C02H)pasando por una cadena in­

termediaria del tipo 20-ceto pregnano.

A1 - DEGRADACION DEL ACIDO BILIAR AL 20-CETO PREGNANO

La primera degradación de la cadena lateral de un ácido biliar apareció en

literatura en 192644y se basa en sucesivas oxidaciones de los carbinoles que

se obtienen por reacciones de Grignard a partir de los ésteres de ácidos colá­

nicos (a) y de sus homólogos inferiores (b) (esquema 9).

02CH3 02H

<-— <— <—b

Esguema9: Degradación-de Wieland de los ésteres de ácidos colánicos.

En 1970 Tschesche y colaboradore524, usando algunos datos anteriores45, mo­

dificaron favorablemente el esquema anterior y presentaron una nueva degradación

39

que fue apïicada, en ese caso, a un derivado de] ácido desoxicóïico (40).

Los estudios se iniciaron probando esta üïtíma variante sobre quenodeso­

xico1at0 de meti1o (43) (esquema 10).

02C H3

HO" H ‘OH 43

ÑÏMQCGHS

\Ac20/ACOH6H5

44 ' 45

NBS

AcO" H ‘OAc AcO' H ‘OAc46' 47

40

E1 rendimiento tota] obtenido sóio a1canzó 1,3 %. Si bien este vaior podia

eievarse mejorando ias condiciones de reacción en aigunos pasos, antes de ha­

cerio se decidió probar una tercera aiternativa (esquema 11). Este ensayo se

efectuó modificando ios grupos protectores indicados en 1a técnica origina]46

con e] fin de simp1ificar1a, adecuandoia a ias necesidades de] presente trabajo.)

02H 02H

ACZO

HC]

HO' H ‘oH Acor' H ‘oAc 4841

Pb(AcO)4 , CuSO4 , CSHSN

z’ ‘s

NLED

H0 H ‘OH 50 AcO" H “OAc49

Ac20/H61

1'

03 reactivo

' de JonesAcO’ H ‘OAC AcO' H ‘OAc

51 47

41

Esta üitima secuencia es 1a que finaimente se adoptó pues su rendimiento

tota] resuitó ser muy superior a1 de 1a anterior (aproximadamente 30%).

Se discuten a continuación ias adaptaciones reaiizadas.

- Obtención dei ácido 3a,7a-diacetoxi-58-coian-24-oico (_Q).

Se intentó efectuar 1a acetiiación de] ácido quenodesoxicóiico con ias téc­

nicas tradicionaies, usando anhídrido acético y piridina o mezcias de ácido acé­

tico y anhídrido acético. Sin embargoios resuitados no fueron satisfactorios

pues aün modificando en amboscasos ia temperatura y/o ias cantidades reiativas

de ios reactivos no se lograba acetiiar completamente e] hidroxiio de carbono 7.

Esto puso en evidencia 1a marcada diferencia estructura] que existe entre

ios dos hidroxiios de] ácido quenodesoxicóiico, ya que si bien ios dos grupos

tienen orientación a, debido a 1a reiación cie entre ios aniiios A y B, ei que

está unido a carbono 3 es ecuatoriai y expuesto mientras que e] unido a carbono

7 es axiai y queda semiprotegido.

42

Por e110, para iograr 1a acetiiación comp1eta se necesitó un medio más

enérgico de reacción. Se e1igi6 una mezcia de anhídrido acético y ácido cïorhi­

drico a ebu11ici6n con 1a que se iogró un e1evado rendimiento en e] producto

buscado.

- Obtención de] diacetato de 24-nor-58-c01-22-eno-3a,7a-di01 (g_).

La descarboxiiación oxidativa de ácidos carboxilicos por acción de] tetra­

acetato de piomo permite obtener una variedad de compuestos dependiendo de ias

. . . , _ 47 . .cond1c1ones experimentaies y de 1a estructura de] ac1do . Las cond1c1ones des­

criptas por ios autores indicaban e] empleo de benceno comosoivente en una

reacción cataiizada por: i) acetato de cobre, en cuya presencia ios ácidos car­

boxiiicos primarios se descarboxiian para formar a1quenos comoproducto prin­

cipai y ii) piridina que aceiera ei proceso de descarboxiiación.

Comoe] rendimiento obtenido en ias condiciones especificadas por los au­

tores no superó ei 42%, se variaron ias mismas para mejorario tai como se deta­

11a a continuación.

Dado que existían evidencias postuiando para esta reacción un mecanismo

en cadena por radicaies 1ibres, se repitió 1a experiencia en ias mismascondi­

ciones pero en 1a oscuridad, suponiendo que 1a 1uz podria afectar su desarroiio.

Sin embargoesta modificación no varió ios resultados obtenidos.

En 1a siguiente prueba se dup1ic6 1a cantidad de tetraacetato de piomouti­

1izado, agregándoio en porciones pequeñas y separadas por intervaios de aproxi­

43

madamente una hora. Este cambio se introdujo pensando que ta] vez e1 tiempo de

vida media de ios radicaiesintervinientes era menor que e] tiempo de reacción.

Con e110 se iogró modificar favorabiemente ei resuïtado obtenido.

En 1as siguientes pruebas se anaiizaron 1a temperatura y e] tiempo de reac­

ción. Los métodos presentados en iiteratura recomiendan en genera] para estas

reacciones usar 1a menor temperatura posibie con e] fin de evitar posteriores

oxidaciones de ios productos obtenidos, por acción de] tetraacetato de piomo.

Comoen este caso dichas reacciones 1atera1es no se presentaban, se descartó 1a

posibiïidad de usar soiventes de menor temperatura de ebu11ici6n. Por e] con

trario, en intentos para acrecentar e] rendimiento, se e1ev6 1a temperatura de

81°C a 110°C usando toiueno anhidro en 1ugar de benceno. Este cambio no intro­

dujo variaciones en los resu1tados anteriores.

Por otro 1ado, se ana1izó 1a posibiïidad de cambiar el tiempo de reacción

proiongando e] calentamiento después de haber finaïizado e] agregado de] reac ­

tivo. Se comprobó de esta manera por ccd que 1a reacción avanzaba formando pro­

ducto hasta un determinado momentoa partir de] cua] se ilegaba a un equiïi ­

brio.

Por üitimo, se probó continuar con e] caientamiento y e] agregado de por ­

ciones de reactivo durante varias horas. Se observó entonces por ccd que se 11e­

gaba a una cierta etapa a partir de 1a cua] frente a un importante agregado de

tetraacetato de piomo 5610 se producía una pequeña variación en 1a cantidad de

a1queno.

44

La introducción en 1a técnica origina] de ias modificaciones mencionadas

permitieron e1evar ei rendimiento a 60%.

E1 producto de 1a reacción estaba formado por una mezcia de 1a oiefina bus­

cada (49) y e] ácido de partida (48) que no habia reaccionado. Estos se separa­

ron por cromatografía en columna.

Los datos espectroscópicos dei a1queno coincidieron con ios de 1a iiteratu­

ra46 aunque ei punto de fusión de] producto puro resuitó superior.

- Obtención de] 24-nor-58-coi-20(22)-eno-3a,7a-dioi (gg).

La N-1itioeti1endiamina funciona comoun cataiizador en reacciones de iso­

merización de oiefinas. Beioeii y Fétizon46 usaron este reactivo para isomerizar

dobles eniaces de esteroides, de posición 22 a 20(22) y 10 hicieron segün un mé­

todo descripto previamente por Naru1a48’49.

Para 1a preparación de] reactivo se probaron dos técnicas. En un primer en­

sayo se agregó una soiución de butii iitio en hexano (previamente vaiorada) so­

bre etiiendiamina (secada primero con hidróxido de potasio y iuego con fiitros

moiecuiares), en atmósfera de nitrógeno. Cone] reactivo preparado de esta mane­

ra no se obtuvo e] resuitado deseado, ya que 1a reacción no ocurrió.

Dado que una de ias causas de] fracaso podia ser e] secado deficiente de 1a

etiiendiamina, notabiemente difici] de reaiizar, y teniendo en cuenta que 1a

reacción de 1a etiiendiamina con sodio es muylenta, se efectuó su secado por

tratamiento con sodio y caientamiento a refiujoso.

45

Por otro lado se decidió usar iitio metáiico en iugar de butii iitio para

preparar e] reactivo.

Con 1a N-1itioeti1endiamina sintetizada en ias nuevas condiciones se iogró

1a isomerización buscada con excelentes rendimientos.

- Obtención de diacetato de 24-nor-58-coi-20(22)-eno-3a,7a-dioi (¿1) x_ge

3a,7a-diacetoxi-SB-pregnan-20-ona (gg).

En ias condiciones fuertemente básicas de 1a reacción anterior se produce

1a saponificación de ios acetatos de ios carbonos 3 y 7. Por 10 tanto, una vez

aislado ei producto de 1a isomerización se voivieron a acetiiar ios hidroxiios

usando 1a técnica descripta para 1a obtención de] compuesto 48.

La ozonóiisis de] dobie eniace de 1a posición 20(22) de] esteroide rindió

1a cetona 47. Los resuitados iogrados efectuando e] ensayo a -60°C fueron ios

mismos que se consiguieron a 1a temperatura de un baño de hieio y sai (-12°C).

Tampocose observó diferencia entre ias dos técnicas probadas para 1a rup­

tura dei ozónido ya que tanto con agua oxigenada como con ei reactivo de Jones

ios rendimientos fueron ios mismos. Se eiigió entonces ei empleo dei reactivo

de Jones porque permitía una más rápida obtención de] producto fina].

46

A2 - DEGRADACION DEL 20-CETO PREGNANO AL ACIDO ETIANICO

La secuencia sintética desarroïïada se indica en e] esquema 12.

CtSjÉ PMACOM_—_>

AcO" '

Ac

¡1 (JIKC: Au:()' ¡1 ‘Í3flü:47 52

EtOH/H2504l02H

NaIO4<__H0" H "OR HO' H "OR

= H 55 R = H 53

= AC 56 R = AC 54

lKOH

CHZN2

l ÉÉ()2(:Ï13

HO' H ‘OH

47

La funcionaiización en carbono 21 de 1a cetona 47 se 11ev6 a cabo con te­

traacetato de piomoen una reacción cataiizada con trifiuoruro de boro en éter

y metano]51 para dar e] compuesto 52.

La ruptura de] eniace entre ios carbonos 20 y 21 se efectuó por tratamien­

to con periodato de sodiosz, previa iiberación de] hidroxiio de carbono 21. Pa­

ra eiio se reaiizó una hidrólisis ácida, comprobándose1uego dei tratamiento 1a

presencia de dos productos de reacción (53 y 54) que se separaron por cromato­

grafía en coiumna. E1 anáiisis por espectroscopia de RMN-lHdemostró que los

productos eran 3a,7a,21-trihidroxi-SB-pregnan-ZO-ona (53) y 7a-acetoxi-3a,21­

dihidroxi-SB-pregnan-ZO-ona (54) en una reiación de 1:16 respectivamente.

Dado que ios compuestos de 1a mezcla tenian 1ibre e] hidroxiio de carbono

21 y que e] grupo acetato de carbono 7 presente en uno de eiios no interferia

en 1a reacción de corte de 1a cadena 1atera1 con periodato, se procedió a efec­

tuar 1a misma sobre 1a mezcia ta] cua].

Se obtuvieron de esta manera Ios ácidos etiánicos 55 y 56. La saponifica­

ción de esta nueva mezcia y una posterior reacción de metiiación dió comoünico

producto e] éster 57.

48

B - INVERSION DE LA CONFIGURACION DEL CARBONO 3

Las sintesis de los compuestos 19 y 38 a partir de los ácidos litocólico

y quenodesoxicólico requería la inversión de la configuración del carbono 3 del

esteroide de partida. Existen varios métodos para realizar dicha inversión. En­

tre ellos se consideraron:

Bl - Inversión por oxidación y reducción

BZ- Inversión directa con azodicarboxilato de etilo

B3 - Inversión por una reacción de sustitución

Se analizarán a continuación los resultados obtenidos con cada uno de estos

métodos.

Bl - INVERSION POR OXIDACION Y REDUCCION

Involucra la reducción de 3-ceto derivados para obtener los alcoholes axia­

les correspondientes, usando un catalizador apropiado.

Esta técnica ha sido empleada con éxito en varios esteroidess3’54 pero pre­

senta como inconveniente que el rendimiento en el epimero 3B a partir del 3-ceto

' derivado depende del númeroy la posición de los otros grupos hidroxilo presen­

tes en la molécula. Por ejemplo, la proporción de los epimeros axiales formados,

54en general, disminuye cuando aumenta el número de hidroxilos

El ácido quenodesoxicólico tiene dos hidroxilos, en los carbonos 3 y 7, pero

en los proyectos preliminares de la sintesis se consideró que si se adoptaba este

método se podria realizar la deshidratación del hidroxilo de carbono 7 antes de

49

inversión de 1a configuración de] carbono 3. Teniendo en cuenta este detaiie se

decidió usar ácido 1itoc61ico como compuesto modeio ya que permitía tener con­

diciones similares a ias que se presentarian en 1a sintesis fina].

Los pasos seguidos fueron ios representados en ei esquema 13.

CHZN2 reactivode Jones

¡1CÏ’ ¡1 f1 5942

¿(//:í , PtO2 , AcOH

02CH3 02CH3

+

Ac H AcO" H

61 60

Esquema 13: Inversión por oxidación y reducción.

E1 ácido 1itoc61ico (42) se trató con diazometano para obtener e] éster me­

tiiico correspondiente (58) que posteriormente se oxidó con e] reactivo de Jones.

La cetona resultante (59) se redujo por hidrogenación cataiitica, pues es cono­

55cido que 1a reducción de 3-ceto derivados de 58-esteroides con hidruros, con­

duce a1 a1coho] con orientación a.

50

E1 anáiisis de] producto de 1a hidrogenación por ccd indicó 1a presencia

de una ünica mancha de Rf mayor que e] de 1a cetona de partida. E1 espectro IR

de] mismono presentó ias señaies correspondientes a hidroxiios iibres y fina]­

mente e] espectro de RMN-lHpermitió determinar que dicho producto era una mez­

cia de ios derivados 3a y 38 acetiiados (60 y 61) de] esteroide inicia] (58).

Pese a que ios autores obtenían ios aicohoies, en este caso 1a técnica condujo

a 1a mezcia de acetatos, que se formaron por reacción de] a1coh01 con e] soi­

vente de 1a reacción de hidrogenación (ácido acético y gotas de ácido ciorhí­

drico).

E1 estudio de 1a reiación de ios metiios anguiares en e] espectro de RMN-lH

permitió iiegar a 1a conciusión de que 1a reducción de 1a cetona dió una mezcla

prácticamente equimoiecuiar de ios dos epímeros, ios cuaies no pudieron ser se­

parados por cromatografía inciuso empieandodistintos sistemas de soiventes.

De todas maneras e] resuitado obtenido descartaba 1a posibiiidad de uso de]

método debido a que disminuía notoriamente e] rendimiento de 1a secuencia sinté­

tica.

BZ - INVERSION DIRECTA CON AZODICARBOXILATO DE ETILO

Esta segunda técnica probada permitía 1a inversión de configuración en un

soio paso de síntesis. Según Bose y coiaboradores56 ei uso de azodicarboxiiato

de etiio en presencia de ácido fórmico conducía,en aigunas horas y con buen ren­

dimiento, a 1a formación de un formi] derivado estéricamente puro cuya saponifi­

51

cación rendia e1 epimero de] aicohoi inicia].

Estos autores encontraron, sobre 1a base de pruebas hechas con varios sus­

tratos, que ios factores estéricos juegan un ro] importante en e] éxito de 1a

reacción. Cuandolos ésteres metiiicos de ios ácidos c61ico (39) y desoxicóiico

(40) se trataron en ias condiciones discutidas, 1a formiiación ocurrió 5610 en

carbono 3 con inversión de configuración, mientras que los grupos hidroxiio de

carbono 7 y 12 no se modificaron. Teniendo en cuenta este resuitado, se decidió

hacer 1a prueba sobre quenodesoxicoiato de meti10,ya que e] hidroxiio de carbo­

no 7 no interferiria en 1a reacción (esquema 14).

02CH3 02CH3

EtOzC-N=N-C0 Et2—————>HO. H .OH HC02H HC 2 H .OH

43 62

Esguema14: Inversión directa con azodicarboxiiato de etiio.

E1 método consiste en e] tratamiento a temperatura ambiente de una mezcia

de] aicohoi esteroidai, trifeniifosfina y azodicarboxilato de etiio en tetrahi­

drofurano, con un ácido como fórmico (ei usado en este caso) o benzoico.

Luego de repetir varias veces 1a reacción se pudo comprobar que e] rendi­

miento fina] en e] producto esperado no superaba e] 20%. Esto se debia a dos

52

factores. Por un 1ado, pese a modificaciones introducidas, Quedabagran parte

de] producto de partida sin reaccionar. Por otra parte, debido a 1a gran canti­

dad de óxido de trifeniïfosfina formado durante 1a reacción, 1a separación cro­

matográfica resuitaba muyengorrosa, dando comoresuitado pérdidas de] producto

buscado que contribuian a disminuir e] bajo rendimiento a1canzado.

En 1979 Chang57 señaió que sus intentos de hacer uso de esta reacción fue­

ron desafortunados. Por ejempio, 11evánd01a a cabo con co1ato de metiio (63) y

ácido fórmico,pudo obtener e] 3B-formi1 derivado luego de una tediosa separación

cromatográfica con 561o 15%de rendimiento. La apiicación dei método sobre ei

7a-acetoxi-3a,12a-dihidroxi-53-coian-24-oato de metiio (64)con ácido fórmico y

sobre e] 7a-acetoxi-3a-hidroxi-12-oxo-58-c01an—24-oato de metilo (65) con ácido

fórmico o ácido benzoico no dieron e] aicohoi invertido deseado.

H0' 02CH3 ozCH3

R10" H a0'32 H0" H “CAC

R1 = TSO R2 = H 66

Teniendo en cuenta estos resu1tados, se pensó en probar ios métodos ciási­

cos que efectúan 1a inversión por desplazamiento de un grupo tosiiatosg.

B3 - INVERSION POR UNA REACCION DE SUSTITUCION

Con e] fin de evaiuar 10s diversos procedimientos conocidos de este tipo,

Chang ios comparó, efectuando ias reacciones correspondientes sobre e] 3a-tosi­

1oxi-7a,12a-dihidroxi-SB-coian-24-oato de metiio (66). Asi conciuyó que, de ios

métodos anaiizados, e] más satisfactorio era e] que usaba dimetilformamida, por

ia simpiicidad ya sea de ios reactivos comode ias condiciones de reacción, ade­

más de 1a faciiidad de aisiamiento de] producto de 1a reacción y de] buen ren­

dimiento. E1 único inconveniente era 1a veiocidad de reacción.

Esta ha sido 1a tercera técnica probada. Se empieó comosustrato ei iitoco­

1ato de metiio y ios pasos desarroiiados figuran en e] siguiente esquema.

o20"‘¡3 02CH3

HC H T30" H

02CH3

Esguema15: Inversión por una reacción de sustitución.

54

I

Los factores que contribuyen a1 éxito de] proceso de inversión son:

—contro] apropiado de 1a temperatura,

- pureza de] tosi] derivado de] esteroide de partida,

- pureza de 1a N,N-dimetiiformamida.

En varias pubiicacioness7’58’59 consideran 1a temperatura óptima para 1a

reacción entre 77 y 81°C. Temperaturas mayores favorecen 1a formación de oiefi­

nas.

En io que respecta a1 grado de pureza de] reactivo, se indicó que 1a N,N­

dimetiiformamida Fisher con un contenido de agua de 0,08% era efectiva sin nece­

sidad de un secado previo sobre fiitros moiecuiares. En e] presente caso se des­

tiló 1a N,N-dimetiiformamida con benceno previamente secado sobre sodio, reco­

giéndose 1a fracción correspondiente a1 punto de ebu11ición de 1a misma. Esta

fracción se secó sobre tamices moiecuiares.

Comoalgunos autores aseguran que e] porcentaje de agua infiuye en ei tiem­

po de reacción, se hicieron dos pruebas simuitáneas: una con N,N-dimetiiformami­

da purificada como se indicó en e] párrafo precedente y otra con esa misma N,N­

dimetiiformamida a 1a que se agregó 1%de agua. Los resuitados de estas dos prue­

bas no indicaron diferencia iuego de] tiempo recomendadoen 1iteratura (80 hs).

Con ei objeto de determinar si ese tiempo de reacción recomendado era e]

adecuado se decidió efectuar aigunos ensayos cuyos resultados se resumen a con­

tinuación:

72 hs de reacción: desaparición de] tosi] derivado de partida

55

—> reacción completa

61 hs de reacción: desaparición de] tosii derivado de partida

—> reacción compieta

48 hs de reacción: desaparición de] tosii derivado de partida

—> reacción compieta

38 hs de reacción: presencia de] tosii derivado de partida

—> reacción incompleta

En todos ios casos se observó por ccd 1a presencia de dos manchas, una con

e] mismo Rf que e] reactivo de partida y otra con un Rf mayor. Estos productos

se separaron por cromatografía en coiumna de siiicagei y se anaiizaron por IR y

RMN-lH.Se conciuyó que 1a mancha superior era e] producto de eiiminación y 1a

mancha inferior e] tosi] derivado de partida o e] formi] derivado producto o una

mezcia de ambos ya que no se separaban. En este üitimo caso, en e] espectro de

RMN-lHse pudo ver rápida y fáciimente 1a presencia de ios grupos aromáticos,

1a seña] correspondiente a1 hidrógeno de] grupo formiio y 1as distintas señaies

correspondientes a ios metiios angulares de ambos compuestos.

Además,tomando como patrón e] espectro UVde] cioruro de p-toiuensuifoniio

y e] de] tosi1 derivado de partida,también se pudo monitorear por esta técnica

e] avance de 1a reacción.

Finaimente se determinó que una vez desaparecido e] tosiïato de partida,e1

formii derivado y 1a oiefina formados como productos de 1a reacción se encon­

traban en una reiación aproximada de 2:1.

56

Considerando 1os resuïtados obtenidos y 1os datos recopi1ados, e] ü1timo

de los métodos se consideró e] más conveniente.

57

C - DESHIDRATACION DEL HIDROXILO DE CARBONO 7 E ISOMERIZACION DEL DOBLE

ENLACE FORMADOA LA POSICION 8(14)

LAC, ¡1 \()P‘ LiCÏ' f1

Las pruebas se hicieron sobre ácido quenodesoxicóiico (41) ya que, saivo 1a

cadena iatera], presentaba ias mismascondiciones estructuraies que podria pre­

sentar e] futuro intermediario de 1a sintesis tota].

Las condiciones de deshidratación de 58-esteroides hidroxiiados en carbono

7 es un tema engorroso cuyo estudio se inició con ias primeras reacciones de

Bodecker en 192060. A partir de esa época y por varios años los investigadores

dedicados a1 tema dispusieron de técnicas poco adecuadas e insuficientes para

asegurar una correcta identificación de ios distintos productos obtenidos. Du­

rante mucho tiempo ios datos de puntos de fusión, de poderes rotatorios o de

microanálisis no permitieron aciarar ias dudas sobre 1a iocaiización de ios do­

b1es eniaces presentes en 1a moiécuia. Sumadoa este hecho, e] uso de sustratos

con dos o más hidroxiios iibres introducia una complicación adiciona] para 1a

caracterización de ios compuestosfinales.

58

Se presenta a continuación un breve resumen de 1a información bibiiográfi­

ca ana1izada antes de comenzar ios ensayos de deshidratación e isomerización,

con e] fin de mostrar 1a disparidad de criterios existente en e] momentode co­

menzar ias pruebas.

ANTECEDENTES BIBLIOGRAFICOS PARA AMBOS PASOS SINTETICOS

En 1935 Yamasaki61 estudió 1a deshidratación de] ácido cóiico (39) por tra­

tamiento con ácido ciorhidrico. Conciuyó que e1 producto obtenido en 1a deshi­

dratación presentaba un dob1e en1ace en 1a posición 7 y que éste se intercon­

vertia en ios isómeros con e] dob1e en1ace en 1as posiciones 8(9) y 8(14) por

acción de] ácido ciorhidrico en ácido acético a temperatura ambiente. Sus con­

ciusiones se basaron en una comparación de puntos de fusión con Ios de compues­

tos patrones, iuego de una aparentemente efectiva separación de ios isómeros por

maceración de] producto crudo con a1coho]. No deja de iiamar 1a atención 1a ni­

tidez en ios puntos de fusión que abarcaban intervaios pequeños (en generai 1°C)

y se asemejaban a ios vaiores verdaderos.

Posteriormente se describió en 1iteratura un estudio sobre 1a deshidrata­

ción de] ácido quenodesoxicóiico 11evado a cabo por e] mismo autor62.1ndicó que

se formaban en 1a reacción dos productos, uno de ios cuaies identificó comoe]

isómero con e] dobie en1ace en posición 7. Para confirmario hidrogenó este a1­

queno de punto de fusión 185°C y obtuvo un producto de punto de fusión 193°C

que consideró que era ácido iitocóiico (p.f. Ht62 185°C).

59

Ante este hecho cabe preguntar por qué e] autor caracterizó e] producto hi­

drogenado comoácido 1itoc61ico si existia entre éste y e] ácido iitocóïico 1a

misma diferencia de punto de fusión que entre dicho compuesto y e] esteroide de

partida. Además, e] autor no indicaba 1a cantidad de hidrógeno absorbido.

Respecto de] otro producto de 1a reacción, a1 que 11amó ácido apoquenodeso­

xicóiico, informó no haber determinado con exactitud 1a posición de] dob1e en1a­

ce.

En 1946 Devor y coiaboradores63,uti1izando ácido cóiico comomateria] de

partida, efectuaron 1a deshidratación con cioruro de zinc comoagente deshidra­

tante y ana1izaron e] soivente y 1a temperatura de reacción. Comoresu1tado de]

anáïisis cambiaron e] soïvente de 1a técnica origina] que era ácido acético por

acetona y consideraron e] método senciiio y efectivo. Según informaron, tanto

con ácido acético como con acetona obtenían ios mismos productos, aunque en rea­

Iidad desconocian cuáies eran. La ünica confirmación que hicieron fue que e]

producto obtenido só1o tenia un dob1e en1ace, conciusión a 1a que 11egaron ba ­

sándose en e] va10r de] equivaiente de neutraiización.

Simuitaneamente con ios trabajos de deshidratación descriptos surgieron

una serie de investigaciones tendientes a isomerizar los dobies enïaces a otras

posiciones con 1a idea de ac1arar 1as estructuras de 10s compuestos obtenidos.

Reichstein y coiaboradores64 hidrogenaron 3a-acetoxi-12a-hidroxi-53-co1-7-en­

24-oato de metiio (69) usando p1atino comocataiizador y señaiaron que el trata­

miento isomerizaba e] esteroide de partida pasando de] isómero con e1 dob1e en­

60

1ace en posición 7 a1 que 10 tiene en posición 8(14). Para confirmario compara­

ron ios vaiores de punto de fusión y de poder rotatorio, observando para ios mis­

mosdatos diferentes.

H9 3I\CÍ)J ¡1 69

También apreciaron que no disminuia e] punto de fusión mezcia dei isómero

A8(14) (a1 que 11amaron ácido apocóïico) con un estándar de dicho compuesto.

Este resultado se contrapone con 10 encontrado por Yamasaki62. Tai como se

indicó anteriormente, éste obtuvo ácido iitocóiico por deshidratación de] hidro­

xilo de carbono 7 de] ácido quenodesoxicóiico e hidrogenación de] A7 derivado

obtenido. Por 10 tanto, ias mismas condiciones de hidrogenación condujeron en un

caso a una isomerización de] dobie eniace formado y en otro a su hidrogenación.

Posteriormente Barton65 determinó que ios vaiores de poder óptico rotatorio

en ei campode ios ácidos biiiares insaturados permitían aciarar datos conflicti­

vos y aciarar 1a estructura de varias sustancias. Comoparte de sus conciusiones

señaió que en 1a serie de ios aiocoianos (5a) ia única dobie iigadura de 1a mo­

iécuia que resistía 1a hidrogenación cataiitica, en ácido acético y a temperatu­

ra ambiente, eraia correspondiente a1 isómero A8(14). En cambio en 1a serie de

ios coianos (58) era diferente; Ios A7 derivados se reordenaban en pequeña propor

ción a A (14)con este procedimiento. Según Barton, ios ácidos que figuraban en

61

7) 8(9)). , . ' . , 7

1a iiteratura comoy (A coienicos, son mezclas de ios isomeros Ay 6 (A

y A8(14).

Los conocimientos de] tema se ampiiaron en 1956 cuando Casteiis y Meakins66

desarroiiaron una técnica de oxidación de 10s dobies eniaces y estudio de ios

productos obtenidos por espectroscopia IR. Con este método se obtenían compues­

tos con caracteristicas espectroscópicas fáciimente reconocibies. Para logrario

trataban ei esteroide (con ios hidroxiios protegidos por benciiación) con tetró­

xido de osmio; e] compuesto resuitante se convertía en ei correspondiente dio]

por reacción.con hidruro de iitio y aluminio y finalmente se 10 oxidaba a1 com­

puesto carboniiico con tetraacetato de piomo. Asi,por ejempio, pudieron diferen­

ciar los siguientes esteroides teniendo en cuenta ias distintas señaies que pre­

sentaban en e] espectro IR ios derivados obtenidos.

ESTEROIDE INICIAL PRODUCTO FINAL BANDAS IR DEL PRODUCTO

9H19 9H19

2700 (d) 1725 (f)

«1705 (f)

I?

tiC)

8H17 8H17

1705 (f)

F2

62

ESTEROIDE INICIAL PRODUCTO FINAL BANDAS IR DEL PRODUCTO

9H19 9H19

1712 (f)

1735 (f)

R

Pianteado esquemáticamente e] confuso panoramaexistente en 1a iiteratura,

se describen a continuación ios ensayos iievados a cabo para iograr ambos pasos

sintéticos.

C1 - DESHIDRATACION DEL HIDROXILO DE CARBONO 7

Luego de 1a consideración de ios datos expuestos, se iniciaron ias pruebas

de deshidratación de] ácido quenodesoxicóiico utiiizando comoagente deshidratan­

te cioruro de zinc en acetona.

Cuando se anaiizaron ios productos de ia reacción por ccd se observaron va­

rias manchas de intensidad simiiar, entre ias que se encontraba 1a de] reactivo

de partida. Ante 1a compiejidad de 1a mezcia de productos obtenida y previendo

que e] hidroxiio de carbono 3 podria interferir en 1a reacción, se decidió pro­

tegerio con e] fin de evitar su posible deshidratación (esquema 16).

Ta] comose pianteó anteriormente, e] hidroxiio axiai de carbono 7 se en ­

cuentra estéricamente impedido para 1a entrada de sustituyentes voiuminosos,

mientras que e] grupo hidroxiio ecuatoriai de carbono 3 se encuentra más expues—

to. Esta diferencia estructura] permite 1a protección seiectiva de este üitimo.

63

OzCH3 02CH3

Suc20 CHZNZ

HO" H “OH SucU' H “OH

ZnC]2 , acetona

02CH3 02CH3

SucO' H SucO" H

Esguema 16: Deshidratación de] hidroxiio de carbono 7

La protección buscada se realizó por esterificación con anhídrido succi­

nic067. De esta forma se iogró una apreciabie mejora en e] rendimiento de 1a

reacción de deshidratación.

Finaimente se modificó 1a técnica origina] de deshidratación para iograr

1a conversión compieta de] a1coh01 de partida. Para eiio se incluyó una secuen­

cia de destiiaciones, efectuadas luego de] agregado de sucesivas porciones de

acetona, ta] comose indica en 1a parte experimenta] (pág. 172).

E1 anáiisis dei producto fina] por IR demostró 1a ausencia de hidroxiios

64

iibres. E1 espectro de RMN-IHde] mismo, presentó ias señales correspondientes

a dos pares de metiios anguiares cuyos valores de despiazamiento quimico coin­

cidian con ios indicados en tabias68 para 10s isómeros A7 y A8(14). Se observa­

ba también 1a seña] de] hidrógeno oiefinico de carbono 7. Estos datos corrobo­

raban 1a presencia de una mezcia de 10s dos aiquenos mencionados como producto

de 1a reacción.

Ademásde 1a técnica de deshidratación con cioruro de zinc, se probó 1a que

. , . . . , . , . 62 .empiea comoreactivo ac1do ciorhidrico en ac1do acetico . Esta variante se des­

cartó debido a su bajo rendimiento.

C2 — ISOMERIZACION DEL DOBLE ENLACE FORMADO DE POSICION 7 A 8(14)

'lll ()2(IPL3 ()2(:rt3CU fiSucO” H SUCU H

71 + 72 72

Se iievaron a cabo varios ensayos a fin de encontrar ias condiciones ópti­

mas para 1a isomerización de] dobie eniace de posición 7 a posición 8(14) dado

que, ta] comose describió anteriormente, ios resuitados obtenidos por otros au­

tores eran totaimente contradictorios.

65

Se efectuó 1a hidrogenación de 1a mezcia de 71 y 72 en diversas condiciones

surgidas de combinar ios dos tipos de cataiizadores recomendadosen diferentes

soiventes (ácido acético, acetato de etilo, mezclas de éstos, metanoi) y con di­

ferentes tiempos de reacción. Sin embargoe] tratamiento fue ineficaz en todos

ios casos ya que a] finaiizar la hidrogenación se obtenia 1a mezcla de isómeros

inicia].

Frente a estos resuitados se decidió buscar una técnica alternativa. Wilson

y coiaboradores69 encontraron que por tratamiento con dióxido de azufre iiquido

ocurre 1a migración de dobies eniaces en esteroides insaturados. En sus experi­

mentos, e] derivado acetiiado dei esteroide y e] dióxido de azufre iiquido se in­

troducian en tubos que iuego se se11aban, sin necesidad de una rigurosa exciu­

sión de 1a humedad. Estos se dejaban durante varias horas a una temperatura ade­

cuada.

Bajo ias condiciones descriptas pudieron comprobar que ios dobies eniaces

aisiados de cadena 1atera] y e] dobie eniace anuiar entre ios carbonos 5 y 6

eran estabies, en cambio ios que estaban entre ios carbonos 7 y 8 migraban a 1a

posición 8(14).

Se probó esta técnica iográndose resuitados satisfactorios. Sin embargo

fue necesario optimizar e] tiempo de reacción que para e] derivado de] ácido que­

nodesoxicóiico resuitó ser de 24 horas.

E1 espectro de RMN-lHde] producto indicó una compieta desaparición de]

. , 7 . .. - . . .isomero A (desapar1c1on de ias senaies de] hidrogeno oiefinico y de ios metiios

66

8(14) (angu1ares correspondientes) y 1a presencia de] isómero A vaïores de des­

p1azamiento químico de Ios metiïos anguïares coincidentes con 105 indicados en

tablasós).

67

D - OBTENCION DEL 20-CETO PREGNANO A PARTIR DEL ACIDO ETIANICO

Ta] comose p1anteó anteriormente, e] objetivo de esta etapa era 1a cons­

trucción de una cadena 1atera1 de] tipo 20-ceto pregnano a partir de] ácido

etiánico resuitante de] proceso de degradación. Durante esta modificación se in­

troduciría 1a marcación isotópica que finaimente quedaría localizada en e] car­

bono 21 de 1a moiécuia.

Esta conversión puede reaiizarse de varias formas diferentes. Una de ias

primeras que se anaiizó consistía en 1a reacción de] ácido etiánico correspon­

diente con meti] iitio70, pero no se tenía 1a certeza de poder usar condiciones

equimolecuiares de ácido a meti] iitio por 10 que en principio fue dejada de

1ado.

En trabajos más recientes, Cahiez y colaboradoresn’72 mostraron 1a utiii­

dad de 10s reactivos organomanganesianos en 1a síntesis de cetonas a partir de

haiuros de ácido, con 1a ventaja de empiear una reiación 1:1 de monoaiquiiman­

ganesiano (RMnI)a sustrato. Estos autores apiicaron 1a técnica en e] campo de

los esteroides73 y segün sus comentarios 1a reacción conducía a] producto con

rendimientos mejores que 10s obtenidos con métodos que usaban otros metaies co­

mo cadmio, zinc, aiuminio o mercurio. Además, e] reactivo ioduro de aiquiimanga­

neso era estabie a temperatura ambiente y comparado con ios compuestos aiquii­

iíticos o aiquiimagnésicos era más selectivo; 1a moiécuia de] sustrato podía te­

ner grupos formiioxi, acetoxi o carboníiicos que no eran atacados por e] reacti­

vo. Este üitimo hecho permitía, por ejempio, una acetiiación comoreacción de

68

protección de] hidroxiio de carbono 3.

Independientemente de estos comentarios,también se tuvo en cuenta que Mac

74Philiamy y Schoiz sintetizaron |21-14CI 3B-acetoxipregn-5-en-20-ona (76) con

e] método genera] para 1a preparación de cetonas desarroiiado por Giiman y Ne]­

son75 que empiea derivados organocádmicos. Este método se habia apiicado con

éxito en 1a sintesis de esteroides76 pero usando un gran exceso de reactivo de

Grignard. Los autores mejoraron 1a técnica y obtuvieron e] compuesto 76 con 50%

de rendimiento, empieando cantidades equimoiecuiares de ioduro de metiio y cio­

ruro de ácido.

Si bien esta adaptación podia servir a ios fines buscados en e] sentido que

1a relación esteroidezreactivo iograda era 1:1, ias cantidades con ias que tra­

bajaron ios autores y ias disponibles en e] presente trabajo diferian, por lo

menos, en un factor de 10.

Por otro 1ado, se debe tener en cuenta que los precursores a sintetizar

iban a ser utiiizados en estudios biosintéticos en los que interesa empiear com­

puestos con una e1evada actividad eSpecifica,10 que impiicaba 1a menor di1ución

posibie de] reactivo marcado.

Además,en especia] en 1a sintesis a partir de ácido quenodesoxicólico, e]

número de pasos impedía 11egar a1 ácido etiánico con una masa e1evada de produc­

to. Por io tanto era necesario condicionar ios procedimientos usados por ios au­

tores a ias necesidades de 1a presente sintesis.

Resumiendoestos datos se decidió probar ios dos üitimos métodos:

69

- Reacción con un monoaiquiimanganesiano

- Reacción con un diaiquiicadmio

Tai comose indicó anteriormente, se decidió usar para ios ensayos previos

un ácido comerciai. Se eiigió e] ácido 38-hidroxiandrost-5-en-17B-carboxiiico

(73) que sóio diferia de ios ácidos etiánicos a sintetizar en e] dobie eniace

de 1a posición 5 y en 1a ausencia de] dobie eniace de 1a posición 8(14), consi­

derándose que estas caracteristicas estructuraies no interferirian en ei desa­

rrollo de 1a reacción.

Para hacer cuaiquiera de ias dos pruebas eran necesarias dos etapas pre ­

vias: 1a protección de] aicohoi y 1a formación dei cioruro de ácido.

La serie de pasos ensayados figuran en ei siguiente esquema.

02H 02H

AcOH———>

H Ac73 74

c12(c0)2

OCI

Cd(CH3)2<_—Ac Ac

76' 75

Esguema17: Obtención de] 20-ceto pregnano a partir de] ácido etiánico.

- Obtención de] ácido 38-acetoxiandrost-5-en-17B-carboxí1ico (Zé)

Debido a que e] hidroxiío de carbono 3 no presentaba impedimento estérico

se utilizó una técnica de acetiiación senciiia. Se empieó una mezcla de anhídri­

do acético y piridina (1:1) y se desarroíió 1a reacción a temperatura ambiente.

Sin embargo no se obtuvo e] resuitado esperado ya que además de 1a esterifica­

ción, se formó ei anhídrido mixto (77) con e] grupo carboxiío de carbono 17.

Ac77

Ante este hecho se varió 1a proporción de 1a mezcía de reactivos, disminu­

yendo ía cantidad de anhídrido acético. E1 anáíisis por ccd indicó 1a presencia

de mezclas de productos entre ios que se encontraba, en aígunos casos, e] ácido

de partida.

Se cambió e] medio de reacción efectuando ía acetiíación con anhídrido acé­

tico y catáiisis de ácido clorhídrico, pero e] resuítado fue ei mismo.

Dado que e] anhídrido se obtenía muy fáciímente, se trató de reaíizar su

hidróíisis en condiciones suaves, empieando piridina acuosa a 90°C. Sin embargo

e110 no condujo a1 derivado necesario para 1a síntesis.

71

Finaimente se sometió e] compuesto 73 a un tratamiento con ácido acético

a refiujo durante 72 horas, iuego de ias cuaies se iogró 1a compieta transfor­

mación dei esteroide de partida en e] producto acetiiado 74.

- Obtención de] cioruro de 3B-acetoxiandrost-5-en-17B-carboxiiiio (Zé).

Para este paso se eiigió comohaiogenuro de ácido e] cioruro de oxaiiio.

Luego de suspender e] ácido etiánico en benceno anhidro, se agregó e] c10­

ruro de oxa1i10. Se obtuvo rápida y fáciimente e] cioruro de] ácido etiánico

con muy buen rendimiento.

E1 compuesto se usó sin purificación previa.

- thención de 3B-acetoxi-pregn-5-en-20-ona (3Q).

- Reacción con un monoaiguiimanganesiano.

Preparación de] reactivo:

CH3I + Mg ——-- CH3MgI

CH3MgI + MnI2 -—— CH3MnI + MgI2

E1 primer paso consistió en 1a preparación de] ioduro manganoso por reac­

ción directa de] iodo con manganeso en éter anhidro. Luego se preparó e] reacti­

vo de Grignard usando ioduro de metilo y iimaduras de magnesio en éter.

La reacción de intercambio de meta] se efectuó mezciando un equivaïente de

ioduro manganoso con un equivaiente de] reactivo de Grignard. La mezcia se rea­

1izó a -20°C apreciándose 1a aparición de una suspensión amariiia de ioduro de

72

metiimanganeso.

Desarroiio de 1a reacción:

La reacción se inició por agregado de una soiu­

ción bencénica de] cioruro de ácido a 1a suspensión etérea de ioduro de meti]­

manganeso.

Se hicieron varias pruebas, pero ios resuïtados no fueron Ios esperados ya

que 1a conversión a metiicetona dio rendimientos muy bajos. Estos no mejoraron

proiongando e] tiempo de reacción.

- Reacción con un diaiguiicadmio.

CH3I + Mg -—-— CH3MgI

2 CH3MgI+ CdC]2 -- Cd(CH3) + CIIMg2

Se preparó e] reactivo de Grignard con ioduro de metiio y iimaduras de mag­

nesio en éter anhidro. Luego de 2 horas de reacción, cuando 1a formación de]

reactivo se compietó, se agregó e] cioruro de cadmio finamente pulverizado y an­

hidro.

E] ioduro de metiio radiactivo se provee comerciaimente en tubos de vidrio

de aproximadamente 20 cm de iargo, divididos por 1a mitad con una débi] pared de

vidrio que se rompe en e] momento de 1a reacción. De esta manera se 1ibera e]

compuesto. Teniendo en cuenta e] condicionamiento que presentaba no sóio e] pe­

queño voiumen de ioduro de metiio sino también 1as caracteristicas particuiares

de] envase que lo contenía, 1a reacción se probó usando dos procedimientos dife­

rentes.

73

En un primer intento se preparó e] reactivo de Grignard en un tubo de di­

mensiones simiiares a ias de aquéiios en ios que se provee e] ioduro de metiio

radiactivo, pero sin 1a división en 1a mitad (figura lb). Se hizo esta prueba

con 1a idea de reaiizar 1a experiencia definitiva en e] mismorecipiente donde

venia envasado e] compuesto marcado. Una vez finaiizada 1a formación de] reac­

tivo, se 10 trasvasó con una jeringa a un baión que contenía e] cioruro de cad­

mio. En ese mismo baión, que estaba cerrado con un tapón de iátex, se inyectó

posteriormente e] cioruro de ácido esteroida].

Para 1a segunda prueba se diseñó e] equipo que se indica en 1a figura la.

La reacción de Grignard se desarroiió en ei tubo kitasato y durante e] trans­

curso de 1a misma se liberaria e] ioduro de metiio radiactivo encerrado en e]

tubo invertido. Debido a que durante ias pruebas no se empieó e] compuesto iso­

tópicamente marcado,se usó e] mismoequipo pero con un tubo invertido sin divi­

sión (figura lb). Una vez que se compietó 1a formación de] ioduro de metilmag­

nesio y actuando en atmósfera de nitrógeno, se sacó ei tubo invertido, se agre­

gó e] cioruro de cadmio y se tapó e] tubo kitasato con un tapón de vidrio. La

suspensión fina] se agitó para formar e] compuesto organocádmico y una vez for­

madose agregó e] cioruro de ácido esteroida] inyectándoio a través de] tapón

de 1átex de 1a saiida lateral de] tubo kitasato.

Este procedimiento es ei que finaimente se adoptó por e] rendimiento de

1a reacción con e] compuesto organocádmico y por 1a comodidad de] procedimien­

to empieado.

74

Figura 1! Equipo empleado para 1a preparación de 20-ceto pregnanos a partir

de los cïoruros de ácidos correspondientes.

75

La diferencia entre estas pruebas y los ensayos definitivos radicaba en

1a necesidad de iiberar e] ioduro de metiio radiactivo durante e] transcurso

de 1a reacción de Grignard. Por e110 en 1a siguiente experiencia se inició 1a

formación de] reactivo con 1a mitad de] haiogenuro de a1qui10 a usar. Despues

de media hora de iniciada 1a reacción, se enfrió 1a parte inferior de] tubo

kitasato a 1a temperatura de] aire iiquido y se agregó e] resto de] ioduro de

metiio. Se dejó que subiera 1a temperatura hasta aicanzar 1a ambiente y se con­

tinuó con 1a agitación. De esta manera se comprobó que e] resuitado era e] mis­

mo que ei que se habia obtenido cuando no se habia disminuido 1a temperatura

de] medio. Por 10 tanto, se podia usar este cambio de temperatura para faci1i—

tar e] contacto de] ioduro de metiio radiactivo con 1a mezcia de reacción sin

que se afectara e] resuitado fina] de] proceso.

Esta técnica se probó usando cantidades equiva1entes a ias que se empiea­

rian para ias sintesis de ias metiicetonas 19 y 38 iográndose rendimientos má­

sicos prácticamente iguaïes.

E - SINTESIS TOTAL DE I21-14CI 3B-HIDROXI-SB-PREGN-8(14)-EN-20-0NA

Sobre 1a base de ios datos anteriormente obtenidos 1a secuencia sintética

elegida fue 1a siguiente:

- Degradación de 1a cadena 1atera1 de] ácido biiiar a una cadena iaterai de]

tipo ácido etiánico.

Deshidratación de] hidroxiio de carbono 7 e isomerización de] dobie en1ace

formado a 1a posición 8(14).

Inversión de 1a configuración de] carbono 3.

Construcción de 1a nueva cadena 1atera1 de] tipo 20-ceto pregnano.

La primer etapa seria 1a degradación de 1a cadena iaterai para ilegar a 1a

de] ácido etiánico. La protección seiectiva de] hidroxiio de carbono 3 en pre­

sencia de] de carbono 7 es factible debido a1 impedimento estérico que presenta

este üitimo para 1a entrada de sustituyentes voiuminosos. Comoesa protección se­

1ectiva se habia probado previamente con e] hidroxiio de carbono 3 orientado ha­

cia e] 1ado a de 1a moiécuia, resuitaba conveniente deshidratar ei hidroxiio de

carbono 7 antes de invertir 1a configuración de] carbono 3. E1 último paso seria

e] armado de 1a cadena de tipo pregnano, con 1a consecuente introducción de 1a

marcación isotópica.

La secuencia sintética discutida anteriormente fue e1egida luego de reaii­

zar dos ensayos para ver si existia 1a posibiiidad de acortar ei camino sinté­

tico. E1 primero consistia en deshidratar e] hidroxiio de carbono 7 protegiendo

e] de carbono 3 con un grupo tosiiato. Esto evitaria 1a succiniiación, hidróii­

77

sis de] grupo succiniio iuego de deshidratar y posterior tosiiación en carbono

Pese a que ei grupo tosiio resulta ser un muybuen grupo saiiehte, se in­

tentó verificar 1a apiicabiiidad de esta variante. Se iievaron a cabo ias trans­

formaciones indicadas en ei siguiente esquema

02CH3 02CH3

CiTs

FiCÏ" ¡1 ‘ÏDÏi 135€), ¡1 .ÏJFJ

45

ZnCi2

acetona

02CH3

Esguema 18: Uso de un tosiiato como grupo protector para ia reacción de deshi­

dratación.

La tosiiación de] quenodesoxicoiato de metiio (43) se realizó con ia misma

técnica usada previamente para ei 1itocoiato de metiio (pág. 53 ) y con un ren­

dimiento iguaimente satisfactorio. La deshidratación posterior se hizo con cio­

ruro de zinc en ias condiciones determinadas anteriormente para ei compuesto

78

70 (pág. 63 ).

E1 espectro de RMN-lHdei producto fina] obtenido no presentaba 1a seña]

correspondiente a1 hidrógeno 7B pero tampoco presentaba 1as señaïes correspon­

dientes a hidrógenos sobre carbonos aromáticos o a1 hidrógeno de carbono 3 uni­

do a un hidroxiio ecuatoria]. En cambio se vieron varias señaies oïefinicas com­

piejas a 5,1 , 5,3 y 5,6 ppm. Por otro 1ado e] espectro IR no era e] de un este­

roide ni con hidroxilos 1ibres ni con grupos aromáticos.

Estos hechos permitieron confirmar que durante e] transcurso de 1a reacción

no sólo se habia deshidratado e] hidroxiio de carbono 7 sino que además se habia

e1iminado e] tosiiato, 10 que descartaba 1a posibi1idad de usario comogrupo

protector.

La otra variante consistía en invertir 1a configuración de] carbono 3 y em­

plear e] esteroide con e] hidroxilo con orientación B, protegido comoformil de­

rivado, comosustrato para 1a deshidratación.

Para analizar esta aiternativa se trató e] 3B-formoxi-58-c01an-24-oatode

metiïo (68) con c1oruro de zinc en acetona, en 1as condiciones de 1a reacción

de deshidratación (pág.63 ). E1 producto aisiado 1uego de dos horas de trata­

miento se anaïizó por ccd, comprobándose que e] reactivo de partida habia desa­

parecido y observándose fundamentaimente una mancha de Rf mayor. Esta mancha

coincidia con 1a de] producto 1atera1 de 1a reacción de inversión de configura­

ción (producto de 1a eïiminación de] grupo tosiiato) en distintos sistemas cro­

matográficos probados. Su espectro de RMN-13€no presentó 1a seña] de] carbono

79

3 sustituido en e con un formiato, pero en cambio tenia señaies de carbonos oie­

finicos a 156,17 , 132,32 , 128,65 y 124,22 ppm.

Este compuesto se hidrolizó con hidróxido de potasio en etano] a refïujo du­

rante dos horas y e] hidroiizado se metiió con diazometano. E1 espectro IR de]

esteroide sometido a este tratamiento no presentaba señaies de hidroxiios Iibres

y además e] análisis por ccd demostró que su Rf era e] mismo que ei de] compues­

to sin tratar.

Estos resuitados permitieron conciuir que e] grupo formiato no soportaba

ias condiciones de deshidratación.

Descartada 1a posibiiidad de introducir 1as dos modificaciones discutidas,

se comenzóe] trabajo de sintesis tota]. Se apiicaron ias reacciones que previa­

mente se habian probado sobre ios sustratos modeio (ácido quenodesoxicóiico y

ácido iitocóiico) encadenándose en 1a secuencia indicada en 1a página 76. Se dis­

cuten a continuación ias experiencias 11evadas a cabo para obtener 1a cetona 38.

E1 - DEGRADACION DEL ACIDO BILIAR AL ACIDO ETIANICO

Esta primera etapa de 1a sintesis se rea1izó ta] comose habia efectuado en

ios ensayos de degradación ya que tanto e] producto de partida comoe] fina]

eran ios mismos. Se obtuvo asi e] 3a,7a-dihidroxi-5B-androstan-17B-carboxi1ato

de metilo (57).

80

O CH02H 2 3

—->'—>'—>

E2 - DESHIDRATACION DEL HIDROXILO DE CARBONO 7 E ISOMERIZACION DEL DOBLE

ENLACE FORMADOA LA POSICION 8(14)

O2CH3 02CH3

Suc 0

HO' H OH SucO" H OH78

ZnC12 , acetona

O2CH3 02CH3

SucO' H SucO H80 79 + 80

81

La succinilación se realizó en las mismas condiciones que se habian usado

previamente y con rendimientos similares, pero en cambio la reacción de deshi­

dratación con cloruro de zinc no dio resultados satisfactorios. Su aplicación,

tal como se habia descripto para el compuesto 70, dejaba la mayor parte del al­

cohol sin reaccionar. Paulatinamente se fue aumentando la cantidad de agente

deshidratante y el tiempo de calentamiento. La evolución de la reacción se si­

guió por ccd observándose la aparición de dos manchas principales, una de mayor

y otra de menor Rf que el esteroide de partida. Cuando se comprobó la desapari­

ción de este último se consideró finalizada la reacción, extrayéndose los pro­

ductos de la misma. Se metiló la mezcla extraída y se determinó por IR y ccd

que se había producido una hidrólisis parcial de los grupos éster presentes, de­

bido a que el aumento de la cantidad de cloruro de zinc aumentó la basicidad del

medio de reacción lo suficiente comopara producir la hidrólisis mencionada.

Ademásse verificó que la reacción no habia concluido ya que parte del alcohol

de partida aün no se habia deshidratado.

Se repitió el proceso para determinar la cantidad de cloruro de zinc nece­

saria para realizar la deshidratación en el caso del ácido etiánico, que resultó

ser muchomayor que la necesaria para deshidratar el derivado del ácido biliar

(70).

Una vez optimizadas las condiciones para este nuevo sustrato, la mezcla de

productos aislada se metiló por tratamiento con diazometano. Estos productos,

tal comoocurrió en los ensayos previos, resultaron ser una mezcla de las ole­

82

finas con e] dobie eniace en ias posiciones 7 (79) y 8(14) (80). Fue necesario

por 10 tanto hacer 1a isomerización para transformar e] compuesto 79 en 80.

La técnica eiegida en ias etapas previas consistía en un caientamiento de

1a mezcia con dióxido de azufre (pág. 65). Sin embargo, un importante riesgo de

esta reacción radica en 1a expiosión dei tubo a1 ser ca1entado, con 1a conse ­

cuente pérdida de 1a muestra. Es por esto que, pensando en 1a trabajosa prepa­

ración de] esteroide, se decidió separar ias oiefinas para someter a 1a reacción

de isomerización soiamente e] compuesto insaturado en posición 7, minimizando de

esta forma ias posibies pérdidas. Comono se pudieron separar por ccd se recu­

rrió a 1a cromatografía iiquida de aita resoiución con 1a que se iogró ei obje­

tivo buscado.

En 10 que respecta a 1a reacción de isomerización, se debió modificar e]

tiempo de caientamiento ya que, segün pudo comprobarse por RMN-lH,un tratamien­

to de 24 horas como e] usado para e] derivado de] ácido quenodesoxicóiico (71)

resuitó insuficiente. La isomerización de] dobie eniace se compietó en 36 horas

con e] consecuente aumento en 1a cantidad de productos aiquitranosos obtenidos

como subproductos de 1a reacción. Este hecho ya habia sido informado en 1a iite­

ratura previamente.

E3 - INVERSION DE LA CONFIGURACION DEL CARBONO 3

OQCHg 02CH3

02CH3

E1 compuesto 80 se sometió a una reacción de saponificación con 1a cua] se

iiberó ei hidroxiio de carbono 3 que, 1uego de una metiiación con diazometano,

se tosiió con cioruro de p-toiuensuifoniio. E1 tratamiento con N,N-dimetiiforma­

mida invirtió 1a configuración de ese centro asimétrico. Para ios dos üitimos

pasos ias técnicas usadas fueron ias mismas que ias elegidas en ias pruebas pre­

vias (pág.53 ).

E1 producto resuitante de 1a reacción de inversión debió purificarse por

recristaiización, ya que por cromatografía de adsorción en siiicagei se producía

1a hidróliSis casi compieta de] éster de] ácido fórmico. Este fue e] resuitado

84

obtenido cuando se purificó e] formi] derivado (83) usando una columna cromato­

gráfica con e] adsorbente indicado y cioroformo comosolvente de eiución. E1 es­

teroide tratado de esta manera presentó en e] espectro IR una banda de tensión

o-n a 3400 cm'1 . Por otro 1ado, en ei espectro de RMN-lHno se observó 1a seña]

de] hidrógeno de] formiio a 8,07 ppm, pero se encontró 1a de] éster metiiico de]

ácido etiánico a 3,68 ppmindicando que este üitimo no se afectó por ei mencio­

nado procedimiento.

Teniendo en cuenta este resuitado, cuando se repitió este paso de sintesis

se purificó e] producto por recristaiización de metano].

E4 - OBTENCION DEL 20-CETO PREGNANO A PARTIR DEL ACIDO ETIANICO

02H

ACOH

¡XCF1 85

c12(co)2

Cd(EH

ÏOQH

H H84

ak l at

H2504/EtOH<5__________

F‘ ¡1 Au:87 86

li

85

E1 compuesto 83 se saponificó y e] ácido resuitante 84 se acetiió con ácido

acético a refiujo, tai comose habia determinado en ios ensayos previos.

La cantidad fina] de ácido acetiiado sóio alcanzó a 15 mg (0,04 mmoies) ios

que se sometieron a 1a reacción con dimetiicadmio.

Debido a 1a baja cantidad de ácido obtenida se desarroiió solamente 1a sin­

tesis radiactiva. Luego de 1a purificación de] producto crudo de reacción se se­

pararon 5 mg de 1a metiicetona 86 con una actividad especifica de 2,25x107 dpm/mg

u 8,05x109dpm/mm01 6 3,66 mCi/mmo].

E1 compuesto 86 se hidroïizó y e] aicohoi resuitante, iuego de 1a purifica­

ción correspondiente, mantuvo 1a actividad especifica anterior: 2,54x107 dpm/mg

u 8,02x109dpm/mm01.Este era e] producto fina] de una de ias sintesis y uno de

los esteroides a usar en los ensayos de inocuiación. Se indica a continuación e]

esquema completo para su preparación.

86Esguema 19:

COZH

‘ 41H0 H OH

O

SucÜ

COZCH3 COZCH3 OZCH3

::j:f;:Ï:Ï] + ::!Ïí;j:ij e' 7.9 .— 0 x s.H SucO 8 78

SucU' H SucU

87

F - SINTESIS TOTAL DE BB-HIDROXI-SB-PREGNAN-ZO-ONA

Para 1a sintesis de [21-14C| 3B-hidroxi-SB-pregnan-ZO-ona (19) se reaiizó,

a partir de] ácido 1itocóiico (42),una secuencia de reacciones anáioga a 1a des­

cripta para 1a sintesis de1 derivado de] ácido quenodesoxicóiico.

Los resuitados y rendimientos obtenidos fueron simiiares.

En todos ios casos en que 1os reactivos usados fueron ios mismos, 1a reia­

ción estequiométrica empieada se mantuvo aproximadamente igua].

E1 esquema de 1a sintesis compieta se encuentra en 1a página 90.

F1 - DEGRADACION DEL ACIDO BILIAR AL ACIDO ETIANICO

E1 ácido iitocóiico sóïo presenta un hidroxiio en carbono 3 y su protección

se pudo reaïizar en condiciones más suaves que 1as usadas previamente. Para e110

se trató e] esteroide con una mezcia de anhídrido acético y piridina durante 24

horas, a temperatura ambiente, Iográndose con este método una acetiiación com­

p1eta.

La descarboxiïación oxidativa se efectuó con tetraacetato de piomo y 1a mis­

ma catáiisis empIeada previamente (acetato de cobre y piridina). Esto condujo a1

acetato de 24-nor-58-c01-22-en-3u-01 (89).

E1 tratamiento con N-1itioeti1endiamina permitió isomerizar e] dobie en1a­

ce de 1a posición 22 a 1a 20(22). Comoera previsible, además de] despïazamiento

de] dob1e en1ace, e] medio básico de esta reacción hidr01izó e] éster de carbo­

no 3. Por este motivo se repitió 1a acetilación procediéndose nuevamente de 1a

88

manera indicada para ei caso de1 ácido iitocóiico y aislándose e] acetato de

24-nor-58-c01-20(22)-en-3a-01 (91) con óptimos rendimientos. La ozonóiisis de

1a oiefina rindió 1a 3a-acetoxi-SB-pregnan-20-ona (92).

En 1a etapa siguiente por acetoxiiación de 1a cetona con tetraacetato de

pïomo se obtuvo 1a 3a,21-diacetoxi-56-pregnan-20-ona (93) y una hidrólisis áci­

da condujo a 1a 3a,21-dihidroxi-SB-pregnan-ZO-ona (94).

En 1a sintesis descripta a partir de] ácido quenodesoxic61ico, 1a hidróii­

sis ácida conducía a una mezcia de compuestos, ya que e1 hidroxiio de carbono 7

se iiberaba sóio en una muypequeña proporción. Esto ob1igaba a reaiizar ios dos

pasos siguientes con ios dos productos (7a-hidroxi y 7a-acetoxi derivados) si­

muitaneamente. Ya que e] sustrato homóiogode esta sintesis no tenia 1a sustitu­

ción en carbono 7, esta dificuitad no se presentó y en ias condiciones de 1a hi­

dróiisis se obtuvo unicamente 1a a-hidroxicetona 94.

E1 tratamiento con periodato de sodio y una posterior metiiación con diazo­

metano permitió separar e] 3a-hidroxi-5B-androstan-17B-carboxi1ato de metiïo

(95) con e] que finalizaba 1a secuencia de degradación.

F2 - INVERSION DE LA CONFIGURACION DEL CARBONO 3

Por reacción de] compuesto 95 con cioruro de p-toïuensuifoniio se preparó

e] 3a-tosi1oxi-58-androstan-17B-carboxi1ato de metiio (96). E1 despiazamiento

de] grupo tosiiato de] carbono 3 con N,N-dimeti1formamida invirtió 1a configura­

ción de ese centro asimétrico formándose e] 36-formiioxi-58-androstan-17B-carbo­

89

xiïato de metiio (97).

E1 paso siguiente consistió en 1a saponificación de] compuesto 97 con e]

fin de iiberar e] ácido. Comosimuïtáneamente se desprotegió e] hidroxiio de

carbono 3, se procedió a reacetilar usando ácido acético a refiujo de acuerdo

con e] método e1egido en ios ensayos previos. Asi se obtuvo e] ácido 38-acetoxi­

5B-androstan-17e-carboxi1ico (99).

F3 - OBTENCION DEL 20-CETO PREGNANO A PARTIR DEL ACIDO ETIANICO

Se reprodujeron exactamente ias mismas condiciones usadas con una masa

equivalente de] reactivo de prueba (74) Iográndose en este caso un resuitado

simiiar. De esta manera se preparó primero 1a 3B-acetoxi-58-pregnan-20-ona (100)

y posteriormente e] mismo producto marcado en carbono 21 con 14€. E1 rendimien­

to fina] de ambas preparaciones fue similar. E1 compuesto radiactivo presentó

1a siguiente actividad especifica: 8,72x106 dpm/mgó 3,14x109dpm/mm016 1,42

mCi/mmo].

La hidróiisis ácida de estas cetonas condujo a 1a 3B-hidroxi-SB-pregnan­

20-ona (19) y 1a [21-14cl 3B-hidroxi-53-pregnan-20-ona cuya actividad especifi­

ca resuitó ser 10,12x106 dpm/mgó 3,22x109 dpm/mmoia 1,46 mCi/mmo]. Esta üiti­

ma fue usada en los ensayos de inocuiación.

90

\COZH 02H

———————e> -———————>

f Acd' H 89

H0" H 42 ACO 83 i0 // z/

e——— <—-—-—

H0, H 90AGO” H 92 C0” H 91

AcU'

HOCH2

A

ACOCH 0

H 93 HO/ H 94

02CH3 OZCH3 OZCH3

<+———————— <————-—-—

T30" H 96 H0, H 95HCOZ H 97

02H 02H o

———-—+ ———->

HO H 98 AcO H 99 ACO H 100

OfiaífifiAcO H H0 H 19

Esguema 20: Síntesis tota] de 3B-hidroxi-Ss-pregnan—20-ona

INOCULACION DE LOS PRODUCTOS RADIACTIVOS

A PLANTAS DE D. PURPUREA.

91

CRECIMIENTO DE LAS PLANTAS

Las semiiias se sembraron en almácigos que se mantuvieron húmedos constan­

temente. Después de 1a aparición de los cotiiedones, ias p1anticu1as se coioca­

ron en otro aimácigo para aisiarias de ias semiiias sin germinar y ubicarias

con una separación de 5 cm entre cada una.

Hasta ios 45 dias ias p1antas_recibieron 501 a través de un vidrio y en ese

momentose transpiantaron a macetas. E1 resto de] crecimiento se desarroiió a1

aire 1ibre.

ADMINISTRACION DE LOS PREGNANOS RADIACTIVOS (COMPUESTOS 19 Y 38).

Se usaron seis piantas de D. purpurea de tres meses. Cada pianta tenia en­

tre cuatro y seis hojas y en todas se observaban hojas pequeñas en etapa de cre­

cimiento.

Se eiiminó 1a tierra de 1a superficie de ias hojas con agua. Después que e]

agua se habia evaporado se 1impiaron ias hojas con un aigodón embebido en aceto­

na.

Se disoivieron 2 mg de |21-14CI 3B-hidroxi-SB-pregnan-ZO-ona (19) de acti­

vidad especifica 10,12x106 dpm/mg en 25 m1 de etano]. Se tomó 0,1 m1 de esa so­

iución para medir radiactividad y 1 m1 de 1a misma para inocular. Este üitimo se

evaporó a sequedad y e] residuo se disoivió en 600 u] de etanoi. Esta soiución

más concentrada se apiicó con un tubo capiïar de vidrio sobre 1a superficie de

ias hojas de tres piantas, tratando de distribuiria equitativamente y en forma

92

preferencia] sobre ias hojas más tiernas. E1 recipiente se 1av6 dos veces con

200 u] de etano] cada una, agregando 1as soiuciones de 1avado sobre 1a superfi­

cie de ias hojas de ias mismas piantas y en 1a misma forma.

Se pesó 1 mg de ¡21-14cl 3B-hidroxi-SB-pregn-8(14)-en-20-ona (38) de acti­

vidad especïfica 25,40x106 dpm/mgy se disoivió en 10 m1 de etano]. Se separaron

50 u] de esa soiución para medir radiactividad y 1 m1 de 1a misma se evaporó a

sequedad. E1 residuo obtenido se redisoivió en 400 u] de etano] y se ap1ic6 so­

bre 1a superficie de ias hojas de otras tres piantas en forma simiiar a1 caso

anterior. También se iavó e] recipiente dos veces con 200 u] de etano] cada vez,

agregando ias soiuciones de 1avado a 1a superficie de ias hojas de 1as piantas

inocuiadas con este precursor.

Los datos se encuentran resumidos en 1a tabia 1 de 1a página 103.

DURACION DE LAS EXPERIENCIAS

Las piantas inocuiadas fueron mantenidas a1 aire 1ibre, evitando que se mo­

jaran 1as hojas.

Los períodos de cada experiencia fueron de 4, 9 y 14 días.

A1 finaiizar cada periodo se extrajo 1a parte aérea de una de ias tres

piantas inocuïadas con |21-I4CI 3B-hidroxi-SB-pregnan-ZO-ona y de una de ias

tres inocuiadas con [21-14CI 3B-hidroxi-SB-pregn-8(14)-en-20-ona.

93

EXTRACCIONDEL MATERIALVEGETAL (Procedimiento generaT)

Una vez compIetado eI periodo correspondiente, se cortaron las hojas y se

Iavaron con etanoI en forma abundante. La soïución resuTtante de] Iavado de Ias

hojas de cada planta se coIocó en un matraz aforado de 100 m1 y se compIetó e]

vqumen con etanoI. Se tomó 1 m1 de esa squción para medir radiactividad.

Las hojas de Ia pIanta en estudio se cortaron en trozos pequeños y se tri­

turaron en un mortero. EI materia] vegeta] se extrajo seis veces con 15 m1 de

etanoI cada una, obteniéndose finaTmente un residuo fibroso de coIor pardo c1a­

ro. La soTución aicohólica se evaporó a sequedad y e] extracto se redisoIvió en

etanoI y se coiocó en un matraz aforado de 10 mI. Una vez compTetado e] vqumen

de] matraz , se tomó 0,5 m1 de Ia squción para medir radiactividad y eI resto

se concentró para su tratamiento posterior.

AISLAMIENTODE LOS CARDENOLIDOS(Procedimiento generaI)

A1 extracto vegeta] concentrado de cada pIanta se agregaron 4 mg de digito­

xina, 2 mg de digoxina y 2 mg de gitoxina.

La nueva mecha se purificó por ccd preparativa de siIicageI, usando para

eI desarroIIo de Ia misma una mecha de cIoroformo-etanoi (93:7). En estas condi­

ciones se separa Ia digitoxina con Rf=0,5 y Ia mezcia de digoxina y gitoxina con

Rf=Ó,3.

Se eIuyeron Ias dos zonas mencionadas de 1a pIaca y Ias dos soluciones re­

suitantes se coIocaron en dos matraces aforados de 25 m1 cada uno, enrasando a

94

v01umen con etano]. De cada uno de eïios se tomó una aiícuota de 3 m1 para medir

radiactividad.

Un voiumen medido de] resto de 1a soïución de] matraz que contenía 1a digi­

toxina se evaporó a sequedad y a1 residuo se agregó una cantidad adiciona] cono­

cida de digitoxina (ver tabïas 3 y 6 de 1as páginas 104 y 106).

La mezc1aasí preparada se recristaiizó con etano] acuoso hasta actividad

constante.

SEPARACIONDE DIGOXINAY GITOXINA (Procedimiento generai)

La soiución a1coh61ica que contenía 1a mezc1a de digoxina y gitoxina, obte­

nida Iuego del aislamiento de ios cardenóiidos radiactivos, se evaporó a seque­

dad. E1 extracto se rediso1vi6 en una pequeña cantidad de a1coh01 y se separó

por ccd preparativa usando c1oroformo-etan01 (85:5) comosoivente de desarroiïo.

Se e1uyeron 1as zonas de 1a pïaca que contenían ios giicósidos y ias soiu­

ciones se coiocaron en matraces aforados de 10 m1. Luego de enrasar con etano]

se tomó 1 m1 de cada uno para medir radiactividad.

Las soluciones se evaporaron a sequedad y a cada extracto se agregó una

cantidad conocida de] cardenóiido correspondiente (ver tabia 8 de 1a página 107).

Las dos mezc1as resuitantes se recristaiizaron de etanoi acuoso hasta acti­

vidad constante.

OBTENCION DE DIGITOXIGENINA

Se disoïvieron 26 mg de digitoxina (masa aisiada de 1a p1anta + masa agre­

95

gada para diiuir) en 10 m1 de metano]. Se agregaron 0,03 m1 de ácido suifürico

(c) y se caientó a reflujo durante 20 minutos.

E1 desarroiio de 1a reacción se siguió por ccd (solvente de desarrollo:

cloroformo-etanoi 95:5) observándose a ios 20 minutos 1a desaparición de digi­

toxina y 1a presencia de digitoxigenina comoproducto principa].

E1 extracto metanóiico se voicó sobre 20 m1 de agua y se extrajo con ace­

tato de etilo (2x40 mi). La fase orgánica se 1avó con 10 m1 de agua. Las solu­

ciones acuosas de lavado se reunieron y se separó 1a mitad para medir radiac­

tividad.

E1 extracto orgánico se secó, se utilizaron 8 m] para medir radiactividad

y e] resto se evaporó. E1 residuo obtenido se recristaiizó de etanoi acuoso

hasta actividad constante.

ESPECTROSCOPIA DE

RESONANCIA MAGNETICA NUCLEAR DE 13€

APLICADA A DERIVADOS SB-ESTEROIDALES

96

. . . . 13 .La espectroscopia de resonanc1a magnetica nuciear de C resuita una tec­

nica de muchautilidad para 1a eiucidación estructura] de compuestos orgánicos.

En especia] en e] campo de ios esteroides, un gran número de trabajos avaian

. . , . 77-85 . . . .dicha hipote51s . Sin embargo, es necesaria una con51derab1e cantidad de co­

rreiaciones entre vaiores de despiazamiento quimico antes de que sea posibie

predecir e] espectro de 13C de una dada estructura esteroidai, y es en ese sen­

tido que 1a comparación con anáiogos esteroidaies resuita de muchovaior.

En e] curso dei presente trabajo de sintesis de SB-pregnanos a partir de

ácidos biiiares, se efectuaron ios espectros de RMN-13C de ios compuestos sin­

tetizados. Comoios derivados 58-esteroida1es no son naturaies, en iiteratura

no existen demasiados datos para ellos. Por este motivo se consideró importante

1a contribución que se pudiera hacer, y orientado hacia este objetivo, fue ne­

cesaria 1a asignación de compuestos modelo aigunos deios cuaies resuitaron dis­

ponibies comerciaimente mientras que otros debieron ser sintetizados ta] como

se describe en 1a página 151.

Conestos compuestosestructuraimente relacionados fue posible efectuar

asignaciones satisfactorias de casi todos ios despiazamientos quimicos de ios

carbonos de ios compuestos estudiados.

La correiación de los datos obtenidos permitió anaiizar ei efecto produci­

do por cambios configuracionaies y funcionaies en carbono 3, por 1a introduc­

ción de un dob1e eniace en 1a posición 8(14) y por 1a presencia de diferentes

cadenas iateraies. Por otro 1ado, se pudo predecir ei confórmero favorecido que

97

adoptan en soiución ios ácidos biiiares.

Los datos de despiazamiento quimico para ios carbonos de ios productos es­

tudiados se presentan en 1as tabias 9 y 10. Las asignaciones correspondientes a

cada carbono se confirmaron por ei anáiisis de ios respectivos espectros de desa

copie seiectivo fuera de resonancia, por 1a técnica de ecos de spin con desaco­

pie aiternado (denominado comunmenteAPT: test de protones vecinales), por com­

paración con datos de compuestos modelo y por comparación con vaiores calcuïados

considerando ias regias semiempiricas de Beierbeck, Saunders y Ap Simon86. Estos

autores estabiecieron parámetros para 1a determinación de ios despiazamientos

quimicos en e] caso de hidrocarburos saturados, aicohoïes, aminas, cetonas y 019

finas, ap1icab1es a moiécuias ciciicas que existen en conformaciones rígidas fo;

mando ánguios diedros de 60°.

A continuación se indican ios parámetros usados en e] presente anáiisis y

1a forma en que, según Beierbeck y coiaboradores, deben ca1cu1arse ios vaiores

de despiazamiento quimico para cada carbono.

La resonancia de ios carbonos de] etano, de] carbono secundario de] propano,

de] carbono terciario de] isobutano y de] carbono cuaternario de] neopentano si;

ven comoreferencia para ios carbonos primarios, secundarios, terciarios y cua­

ternarios respectivamente.

Vaiores base: carbono primario: 5,9 ppm

carbono secundario: 16,1 ppm

98

carbono terciario: 25,2 ppm

carbono cuaternario: 27,9 ppm

A estos vaiores de referencia se adicionan incrementos que están asociados

con diferentes interacciones presentes en 1a molécuia y que se representan por

10 UI distintos parámetros que se definen a continuación.

Parámetros utiiizados para hidrocarburos

QE: interacciones sesgadas carbono-hidrógeno. Expresa 1as interacciones entre

hidrógenos 1,3-dipara1eios. Se ias nombróasi porque, en 1a práctica, esas

interacciones se presentan cuando existe una reiación sesgada entre e] hidró

geno unido a1 carbono anaiizado y e] carbono B a éste, que a su vez está uni

do a] segundo hidrógeno en cuestión.

Ó Ó interacciones sesgadas carbono-carbono. Indica ias interacciones entre hidró

genos unidos a un carbono a y a un carbono B a] carbono estudiado y que se

encuentran eniazados en una secuencia como1a siguiente: H(a)-C1(a)-C-C2(a)­

C2(B)-H(B). E1 requerimiento necesario para ubicar fáciimente esta interac­

ción es que exista una reïación sesgada carbono-carbono entre ios carbonos

C1(a) y C2(B) y que dichos carbonos no pertenezcan a1 mismo cicio.

|o, .. expresa 1a interacción que se produce cuando existe una reiación 1,3-dipara­

1e1a entre e] carbono estudiado y otro carbono de 1a moiécula, con 1a condi­

ción de que ambos no pertenezcan a1 mismo cicio.

Las siguientes figuras contribuyen a aciarar ias interacciones mencionadas,

indicándose con un punto e] carbono afectado. E1 cáicuio teórico de su despiaza­

99

miento quimico surge de incrementar su vaior base en 1a magnitud que se indica

en cada caso.

.>

H H H3 H H3 CH3

CH = 4,55 ppm CC = 1,85 ppm 6 = 2,56 ppm

Parámetros utiiizados para moiécuias con grupos hidroxiio.

Los parámetros debidos a 1a presencia de un grupo hidroxiio en 1a moiécuia

sóio se apiican en e] caso de aicohoies secundarios. E1 vaior base para e] caicu

10 teórico de] despiazamiento quimico de] carbono unido a1 hidroxilo es:

T.= 66,99 ppm , reempiazando éste a1 valor base antes mencionado.

QQ_: interacciones sesgadas oxigeno-carbono. Representa 1a interacción que apa­

rece cuando existe una reiación sesgada entre e] oxigeno y un carbono en

B a1 mismo.

flQ_YQQ_: interacciones sesgadas hidrógeno-oxigeno y carbono-oxigeno. Indica ias

interacciones que surgen comoconsecuencia de una reiación sesgada entre un

hidrógeno o un carbono unidos a1 carbono estudiado y e] oxigeno unido a un

carbono vecino.

XLQEL: señaia ias interacciones que se presentan cuando hay una relación y ses­

gada o Y anti entre e] carbono en estudio y e] oxigeno.

6(0H) : corresponde a ias interacciones que se deben a una reiación 6 sin-diaxia]

100

entre e] carbono anaiizado y ei oxigeno.

Las figuras siguientes muestran ios distintos casos junto con ei vaior co­

rrespondiente a cada interacción. Las iineas punteadas indican interacciones se;

gadas.

H H H H

H

T = 60,99 ppm 0C = 1,97 ppm H0 = 4,41 ppm

HMH WH

CO = 2528 ppm y(OH) = -1,28 ppm 6(0H) = 2,86 ppm

Parámetros utiiizados para moiécuias con grgpos carboniio.

Las figuras representan ios parámetros a utiiizar por ia presencia de gru­

pos carboniio en 1a moiécuia. E1 parámetro C = 212,19 ppm es e] vaior base que

se empiea para 1a determinación de] despiazamiento quimico dei carbono unido di­

rectamente a1 oxigeno. Las cantidades indicadas son ios incrementos de ios vaio­

res teóricos de ios despiazamientos de ios carbonos señaiados con un punto.

101

C = 212,19 ppm 8(CO) = 14,70 ppm

M?ysyn = -0,22 ppm Yanti = 5,15 ppm

Parámetros utilizados para molécu1as con dobïes en1aces.

Los parámetros T y Q son los va1ores base para e] cá1cu10 teórico de] des­

p1azamiento químico de 1os carbonos o1efïnicos terciarios y cuaternarios respeg

tivamente. E1 parámetro R es una corrección que se suma a1 va10r base T o Q si

e] segundo de 1os carbonos sp2 es cuaternario. Los parámetros B(01ef.) y y(o1ef)

se emplean para 1a determinación de 1os va1ores correspondientes a 1os carbonos

a1ï1icos y homoalïïicos respectivamente y no se usan si esos carbonos son sp3

cuaternarios o sp2.

Ü Í) JDT = 125,99 ppm Q = 137,80 ppm R = -8,47 ppm

ÜB(01ef.) = 3,86 ppm

Üy(oïef. syn) = 1,41 ppm

y(01ef. anti) = 5,23 ppm

102

DESCRIPCION Y DISCUSION

DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS

EN LOS ESTUDIOS BIOSlNTETICOS

Tabïa 1. Precursores administrados a p1antas de D. purpurea

COMPUESTO NUMERO ACTIVIDAD TOTAL MASA TOTAL

ADMINISTRADO DE PLANTAS ADMINISTRADA ADMINISTRADA

USADAS

¡21-14C| 3B-hidroxi-58- 3 8,19x105 dpm 81 ug

pregnan-ZO-ona

¡21-14c| 3B-hidroxi-5B- 3 26,00x105 dpm 102 ug

pregn-8(14)—en-20-ona

RESULTADOS OBTENIDOS EN LOS ENSAYOS DE ADMINISTRACION DE

131714cl 3B-HIDROXI-5B-PREGNAN-20-ONA

Tab1a 2. Aisïamiento de Ios cardenó1idos.

DURACION ACTIVIDAD RECUPERADA EXTRACTO AISLAMIENTO POR CCD (dpm)

DE LA POR LAVADO DE LAS ETEREO

EXPERIENCIA HOJAS (dpm) (dpm) DIGITOXINA DIGOXINA + GITOXINA

a) 4 días 2,03x105 5,49x104 2075 818

b) 9 días 1,89x105 5,22x1O4 1187 524

c) 14 días 2,25x105 6,92xIO4 1381 640

Tabla 3. RecristaTización de digitoxína hasta actividad constante.

104

DURACION MASA TOTAL ACTIVIDAD ACTIVIDAD ACTIVIDAD ESPECIFICA

DE LA DE TOTAL ESPECIFICA

EXPERIENCIA DIGITOXINA* CALCULADA' 1° REC. 2° REC. 3° REC.

días mg dpm dpm/mg dpm/mg

a) 4 54 1250 23,2 18,2 20,5 20,7

b) 9 60 880 14,7 12,0 13,6 13,5

c) 14 54 700 12,9 10,9 11,3 11,4

* MASATOTAL DE DIGITOXINA: masa de digitoxina aÍSTada de Ta pTanta +

masa de digitoxina agregada (ver página 109).

° ACTIVIDADESPECIFICA CALCULADA:1a actividad específica se caTcuTÓ te­

niendo en cuenta Ta masa tota] de digitoxina

(ver página 109).

RESULTADOS OBTENIDOS EN LOS ENSAYOS DE ADMINISTRACION DE

¡21-14cl 38-HIDROXI-SB-PREGN-8(14)-EN-20-0NA

Tabïa 4. Aisïamiento de 105 carden61idos.

105

DURACION ACTIVIDAD RECUPERADA EXTRACTO AISLAMIENTO POR CCD (dpm)

DE LA POR LAVADO DE LAS ETEREO

EXPERIENCIA HOJAS (dpm) (dpm) DIGITOXINA DIGOXINA + GITOXINA

d) 4 días 7,76x105 8,2Ox1o4 780 412

e) 9 días 7,40x105 9,64x104 683 459

f) 14 días 6,79x105 12,07x104 468 241

Tabïa 5. Separación de digoxina y gitoxina.

DURACION DE LA DIGOXINA GITOXINA

EXPERIENCIA AISLADA POR CCD AISLADA POR CCD

días dpm dpm

d) 4 169 188

e) 9 185 211

f) 14 107 98

106

TabIa 6. RecristaTización de digitoxina hasta actividad constante.

DURACION MASA TOTAL ACTIVIDAD ACTIVIDAD ACTIVIDAD ESPECIFICA

DE LA DE TOTAL ESPECIFICA

EXPERIENCIA DIGITOXINA* CALCULADA' 1° REC. 2° REC.

dias mg dpm dpm/mg dpm/mg

d) 4 35 686 19,6 13,7 O

e) 9 33 601 18,2 12,9 O

f) 14 34 412 12,1 8,1 0

* MASATOTALDE DIGITOXINA: masa de digitoxina aisIada de 1a pTanta +

masa de digitoxina agregada (ver página 109).

° ACTIVIDADESPECIFICA CALCULADA:Ta actividad especifica se caIcuIó te­

niendo en cuenta Ia masa tota] de digitoxina

(ver página 109).

TabIa 7. HidróIisis de Ia digitoxina groveniente de 1a experiencia d).

EXTRACCION DE LA DIGITOXIGENINA ACTIVIDAD ACTIVIDAD

ESPECIFICA ESPECIFICA

EXTRACTO ACUOSO EXTRACTO ORGANICO CALCULADA' 1° REC.

38 dpm 465 dpm 36,6 dpm/mg 0 dpm/mg

Tabia8.Recrista1izacióndedigoxinaygitoxinahastaactividadconstante.

DURACION

DELA

EXPERIENCIA

MASATOTAL

ACTIVIDADTOTAL

ACTIVIDADESPECIFICA

CALCULADA'

ACTIVIDADESPECIFICA

1°REC.

DIGOXINA*

DIGOXINA

GITOXINA

DIGOXINAGITOXINA

DIGOXINA

GITOXINA

m9

dpm

dpm/mg

dpm/mg

25 30 20

152 16696

169 19088

6,16,8 5,57,6 4,84,9

*MASATOTALDEDIGOXINAYGITOXINA:masadedigoxinaogitoxinaaisTadadeTapianta+masadedigoxina' ACTIVIDADESPECIFICACALCULADA:1aactividadespecificasecaicuióteniendoencuentaIamasatota]de

ogitoxinaagregada(verpágina109). digoxinaogitoxina(verpágina109).

¡_¡ O \1

108

DISCUSION DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS

De acuerdo a ios datos de Evans y Cowiey87 1a concentración de cardenóiidos

en piantas de D. purpurea presenta un incremento de 14,1 a 115,6 ug/g de pianta

fresca, durante ios primeros siete meses de crecimiento. Estos mismosautores in

dicaron que e] aumento es más pronunciado entre e] tercer y el cuarto mes de de­

sarr0110. Es por este motivo que se eiigió trabajar con p1antas comprendidas en

ese estadio para ias que 1a concentración de cardenóiidos varia, en esa etapa,

de 0,04 a 0,1 mg/g de pianta fresca. Las plantas preparadas para 1a experiencia

tenian un peso promedio de 5 g.

Por otra parte, se conoce que 1a época de mayor actividad metabóïica de 1as

piantas es 1a temporada estiva]. En nuestro caso, ias experiencias fueron reaii­

zadas en e] mes de mayo. Si bien no es e] periodo óptimo de producción de ios

giicósidos, Ios datos obtenidos de 1a inocuiación de |21-14CI 3B-hidroxi-58-preg

nan-20-ona (19) permiten deducir que este factor no impidió 1a correcta incorpo­

ración de] compuesto utiiizado comopatrón para ios ensayos, en ios 1apsos de

tiempo indicados.

Aunque se conocian 1as condiciones de germinación de ias semi11as y de cre­

cimiento de las piantas, se presentaron diferentes inconvenientes. Unode eiios

derivó de] bajo porcentaje de germinación de 1as semiïias, pese a 1as distintas

condiciones ensayadas para la misma y pudo deberse a que éstas tenian un tiempo

re1ativamente Iargo de almacenamiento. Por otro 1ado, no resuitó simpie mantener

todas las p1antas en estado óptimo de desarroiio. Muchas de e11as se marchitaban

109

a ios dos o tres meses de crecimiento, probabiemente a causa de que e] ciima en

e] que se estaban desarroiiando no era e] característico de ias zonas frias don­

de se ias encuentra naturalmente.

Los factores comentados condicionaron e] trabajo con un bajo número de pian

tas.

Dadoque 1a cantidad de giicósidos aisiada de cada experiencia era escasa

comopara proceder a recristaiizar, se diluyó con ios correspondientes cardenó­

lidos fríos y se efectuaron ias recristaiizaciones hasta actividad constante con

un vaior de actividad específica calcuiado, diferente de] verdadero. Empieando

este dato se pudo determinar 1a posibie participación de 10s precursores adminis

trados en e] camino metabóiico de ios giicósidos cardiotónicos. Por 10 tanto, de

acuerdo con 10 que se acaba de exponer, ios vaiores de actividad especifica cai­

cuiada que figuran en ias tabias 3, 6, 7 y 8 se establecieron usando 1a masa

agregada ya que ia proveniente de 1a planta es de un orden muy inferior.

Ta] como se observa en 1a tabla 3, se pudo 11egar a actividad constante por

recristaiización de 1a digitoxina proveniente de piantas inocuiadas con |21-I4CI

3B-hidroxi-56-pregnan-20-ona (19). Este hecho era previsibie ya que Tschesche y

coiaboradores24 habían demostrado su participación comoprecursor.

Comose ha indicado en 1a tabia 4, e] extracto etéreo proveniente de 1as

piantas inocuiadas con |21-14CI 3B-hidroxi-58-pregn-8(14)-en-20-ona (38) preseg

taba radiactividad. Las zonas cromatográficas correspondientes a digitoxina, di­

goxina y gitoxina separadas por ccd, con e] mismométodo que en e] caso anterior,

110

también tenian actividad.

De 1a misma forma en que se habia procedido con e] estándar, en este caso,

se recristaiizaron ios giicósidos tratando de obtener un vaior de actividad es­

pecifica constante. Pero, ta] comose muestra en ias tabias 6 y 8, ios valores

descendieron rápidamente a cero, 10 que demuestra 1a pérdida tota] de actividad

de ios cardenóiidos extraídos a ios 4, 9 y 14 dias.

Para confirmar este dato negativo, se hidrOIizó 1a digitoxina, para determi

nar 1a radiactividad presente en 1a porción esteroida]. Los datos correspondien­

tes, 1uego de 1a recristaïización de 1a agiicona, se encuentran en 1a tabia 7 y

demuestran una pérdida rápida de actividad.

La coincidencia de ambosresuïtados permitió conciuir que 1a radiactividad

de 1a fracción separada por ccd se encontraba asociada con otro producto presen­

te en e] extracto y que no correspondía a ios gïicósidos en estudio.

En consecuencia se puede conciuir que ios gïicósidos cardenóiidos digitoxi­

na, digoxina y gitoxina aisïados de las piantas inocuïadas con e] precursor pro­

puesto (38) no resuitaron activos. E110 significa un acuerdo con ios resultados

obtenidos por Caspi y coiaboradores41 que sostenían que un dobïe en1ace en ias

posiciones 7, 8(9) u 8(14) no eran 1a caracteristica estructura] precursora de

1a introducción de un hidroxiïo 148 en 1a moiécuia. Ademásindica una contrapo­

sición con Ïos resuitados de Tschesche42 que obtuvo una incorporación positiva

con un precursor que tenia un dob1e en1ace en 1a posición 8(14).

Caspi administró a piantas de D. Zanata una mezcïa de |8-3H| colestero] y

111

[4-14Cl coiesteroi cuya reiación 3H/MC era 12,1. A1 cabo de 1a experiencia pro­

cesó ias piantas y aisió digitoxigenina y digoxigenina que fueron diluidas con

compuestosauténticos y recrista1izadas hasta actividad especifica constante de

14 3 14C y reiación constante de H/ C. Los resuitados demostraron que 1a reiación

3H/MC de] coiesteroi de partida (12,5) se mantenía perfectamente 1uego de tres

recristaiizaciones de 1a digitoxigenina obtenida (12,5) y de una recristaiiza ­

ción de 1a digoxigenina (13,1). Esto ios 11ev6 a conciuir que 1a conversión bio­

sintética de |8-3HI coiesteroi en digitoxigenina y digoxigenina no invoiucraba

1a pérdida de] tritio de 1a posición 8. Por 10 tanto, 1a introducción dei hidro­

xilo 146 de ios cardenóiidos procedía sin pérdida de] hidrógeno de carbono 8 de

coiestero], 10 cuai exciuia 1a posibiiidad de participación de dob1es eniaces

centrados en esa posición.

En e] trabajo de Tschesche42 ios resuitados no aportan datos tan exactos

comoen e] anterior. Los autores afectüan tres ensayos:

1) coinyección de |7-3H| 53-pregn-8(14)-en-3,20-diona y I4-14C| progesterona.

2) coinyección de |7a-3HI pregnenoiona y [4-14CI pregnenolona

3) coinyección de |6-3H| A7-progesterona y |4-14CI progesterona.

Los autores informaron una pérdida dei 50%de actividad en tritio en ios

glicósidos aisiados 1uego de ias experiencias 1 y 2. Es evidente que no existe

en este caso una justificación rigurosa para esta pérdida, ya que eiios mismos

piantean que, si bien no pueden expiicaria, podria deberse a una diferente in­

corporación de los precursores o a errores en e] método de administración o de

112

trabajo. Lo que resuïta cierto es que Tschesche obtuvo una cierta incorporación

en contraposición a1 resuitado de] presente trabajo, donde 1a incorporación es

nu1a.

Noparece factibie que 1a diferencia en 1a estructura esteroida] de] aniïio

A entre ei precursor utiiizado por Tschesche (33) y e] compuesto administrado en

este caso (38) justifique ios resuitados. Si eiio fuera asi, cabría pensar que

e] precursor ensayado por Tschesche participa de un camino biosintético aiterna­

tivo. Dicho precursor, se encontraría pasos más atrás que e] empieado en las pre

sentes pruebas, dado que contiene e] grupo cetónico en carbono 3 que deberia ser

reducido a un 3B-hidroxi derivado. La participación en dicho camino a1ternativo,

que hasta e] momentose desconoce, permitiría expiicar en parte 1a pérdida de

tritio que tuvieron 10s autores en 1a experiencia 1. No ocurre 10 mismo con 1a

pérdida de tritio de 1a experiencia 2, dado que pregnenoiona se encuentra en e]

caminoprincipa]. Este último dato apoyaria factores o errores intervinientes de

otro tipo.

Tai comose ha planteado, estos caminos a1ternativos son factibles. Por

ejemplo, en e] caso de 1a biosintesis de gitoxina en piantas de Digitalis, hay

dos a1ternativas posibies, en una de e11as procede directamente a partir de un

pregnano y en 1a otra a partir de digitoxina.

Por otro lado, 11ama 1a atención que en ias sintesis de 10s compuestos 33

42,43y 37 descriptas por Tschesche se utiiice comométodo para 1a isomerización

de] doble en1ace de 1a posición 7 a 1a 8(14) una hidrogenación cataiitica con

113

paiadio en ácido acético, ya que anteriormente habia sido anaiizado por Barton65

que,en 1a serie de 10s derivados 58-esteroida1es,este tratamiento conducía a un

muy bajo porcentaje de isomerización. Los autores describen un 83,5% de rendi­

miento para e] mismo. Estas son ias condiciones que se intentaron en ei presen­

te trabajo para 1a isomerización de] A7 derivado (71) a1 A8(14) ( 72) y, ta] como

se aciaró anteriormente, no se pudo producir 1a reacción, inciuso variando con­

diciones de solvente y cataiizador.

. . 88 .En e] trabaJo efectuado por Maier , intentando esciarecer e] proceso de

construcción de] aniiio 1actónico en 1a biosintesis de ios giicósidos cardiotó­

nicos en estas mismaspiantas, se demostró 1a participación de intermediarios

con cadena laterai dei tipo B-hidroxiácido (n) y de ácido a,B-no saturado (o)

en un camino biosintético alternativo.

02H

02H

Es decir que se pianteó una ruta a1ternativa de ácidos norcoiánicos frente

a 1a de ios pregnanos demoStrada por diferentes autores y diagramada en e] esqug

ma 7, para 1a transformación in vivo de pregnenoiona en cardenóiidos.

En función de estos resuitados es que no se descarta ia posibiiidad de in­

ciusión, en esa ruta aiternativa, de un intermediario con un dobie eniace 8(14)

y con una cadena 1atera1 ya preparada para ciciar (compuesto 101).

114

02H

101

La síntesis de un compuesto de este tipo, cuyo posib1e pape] en esa ruta

a1ternatíva es de interés estudiar, es factíb1e por reacción de Reformatsky con

bromoacetato de etilo sobre un 20-ceto pregnano convenientemente sustituido. E1

camino desarro11ado en este trabajo para 1a degradación de 1a cadena 1atera1 de]

ácido bi1iar se realizó, por este motivo, obteniendo en los pasos intermedios

un derivado con una cadena 1atera1 preparada para esta reacción (compuesto 47).

DESCRIPCION Y DISCUSION

DE LOS RESULTADOS

OBTENIDOS EN RMN-13o

13

Figura2:CompuestoscuyosdatosdedesplazamientoquímicodeRMN-:Cseencuentrandeta11adosen1atabïa9.

O2CH3R4

¡R25_

¿a?

IX

No

ESTRUCTURAR1

1023B-hidroxi-58-co1an-24—oat0demetiïo

38-acetoxi-58-c01an—24-oatodemetiïo

61AOAcH

33-formi1oxi-58-co1an-24—oatodemet110

68AOCOHH 58AHOH3a-hidroxi-Ss-coïan-24-oat0demetiïo 60AHOAc3a—acetoxi-58-c01an-24-oatodemetilo

3a-tosi1oxí-SB-co1an-24-oatodemeti1o

67AHOTs

3a-formi10xi-58-co1an-24-oatodemetiïo

110AHOCOH

CH(CH3)(CH2)2C02CH33-oxo-58-co1an—24—oatodemet11o

115

N°ESTRUCTURA

100B 103B92B

104B 108B94B 93B

105C 109C97C 95C 96C

107D

OHOAc

OHOAC

OHOAc OCOH

R OHOAc

OHOAc

OHOTs

OHOAc

OHOAc

COCH COCH

3 3

3B—hidroxi-SB-pregnan-ZO-ona 38-acet0xi-56-pregnan-20—ona 3a-h1droxí-Ss-pregnan-20—ona 3u-acet0xi-58-pregnan-20—onaSB-pregnan—3,20-díona

38,21-dihidroxi-SB-pregnan-ZO-ona 3B,21-diacetoxi-SB-pregnan-ZO-ona 3a,21-d1hidroxi-5B—pregnan-20—ona 3a,21-d1acetoxi-58-pregnan—20—ona Ss-hidroxi-58—androstan-17s—carboxi1atodemet11o 38-acetoxi-SB-androstan—17B-carboxílatodemetí1o 38-formi1oxí-58-androstan-176-carboxi1atodemeti1o 3a-h1droxi-58-androstan-17B-carboxi1atodemetilo 3a-tosi1oxi-53-androstan—175-carboxiIatodemetiïo 3-oxo-58-androstan-17B-carboxi1atodemetiïo

¡.4 ¡.4 01

117Tab1a 9:

COMPUESTO

CARBONO 102 61 68 58 60 67

1 29,97 (30,69) 30,59 35,31 34,98 35,20

2 27,91 25,06 25,05 30,45 26,29 26,13

3 67.06 70,72 70,87 71,58 74,29 82,87

4 33,60 (30,78) 30,59 36,36 32,19 33,015 36,60 37,38 37,26 42,06 41,82 41,96

6 26,29 26,18 26,14 27,18 26,98 27,46

7 26,69 26,55 26,46 26,39 26,56 26,76

8 35,70 35,72 35,68 35,81 35,72 35,58

9 40,28 40,22 40,17 40,39 40,36 40,25

10 35,13 34,89 34,84 34,52 34,51 34,89

11 21,13 21,14 21,11 20,79 21,39 20,71

12 39,82 39,96 40,00 40,13 40,09 39,94

13 42,78 42,79 42,74 42,66 42,68 42,58

14 56,63 56,55 56,54 56,40 56,39 56,27

15 24,18 24,20 24,15 24,16 24,13 24,08

16 28,17 28,16 28,14 28,12 28,09 28,05

17 56,05 56,02 56,02 55,90 55,89 55,80

18 12,09 12,09 '12,08 12,00 12,01 11,97

19 23,87 23,84 23,77 23,35 23,29 23,03

20 35,35 35,36 35,31 35,31 35,24 35,58

21 18,28 18,30 18,29 18,24 18,23 18,19

22 31,08 31,09 31,04 30,99 (30,98) (30,89)

23 31,08 31,09 31,04 30,99 (30,72) (30,88)

24 174,38 174,41 174,31 174,50 174,07 174,19

CH3QOO 170,40 170,43

QH3COO 21,46 20,81

COOQH3 51,31 51,34 51,28 51,35 51,34 51,25HQOO 160,44

H3C-26H4-502- L 127,30 129,49134,62 144,00

118Tab1a 9.

COMPUESTO

CARBONO 110 59 19 100 105 92

1 34,36 36,89 30,00 (30,42) 35,72 35,15

2 26,19 36,81 27,92 24,83 30,83 26,30

3 73,76 212,12 66,86 70,31 71,62 74,38

4 32,06 42,06 33,46 (30,58) 36,73 32,36

5 41,72 44,06 36,36 37,11 42,39 42,15

6 26,85 25,61 26,00 25,99 27,48 27,09

7 26,49 26,47 26,32 25,26 26,72 26,76

8 35,62 35,11 35,70 35,48 35,96 35,50

9 40,27 40,48 39,82 39,70 40,72 40,84

10 34,81 34,64 35,70 34,73 34,86 34,72

11 20,71 21,04 21,00 20,94 21,18 21,50

12 39,95 39,85 39,29 39,06 39,52 39,45

13 42,51 42,54 44,36 44,11 44,38 44,06

14 56,26 56,18 56,78 56,55 56,88 56,52

15 24,04 23,99 24,52 24,25 24,73 24,49

16 27,98 27,95 22,89 22,73 22,86 23,40

17 55,81 55,76 63,99 63,61 64,05 64,20

18 11,87 11,90 13,52 13,28 13,36 13,52

19 23,14 22,46 23,87 23,63 23,43 23,45

20 35,14 35,32 209,62 208,80 209,72 209,70

21 18,09 18,10 31,49 31,31 31,55 31,62

22 (30,76) 30,75

23 (30,69) 30,75

24 173,72 173,94

CH3QOO 170,14 170,39

QH3COO 21,30 20,59

COOQH3 51,01 51,12

HQDO 160,01

119Tabla 9.

COMPUESTO

CARBONO 106 104 108 94 93 105

1 37,02 29,92 (30,55) 35,27 35,02 30,04

2 36,86 27,78 24,97 30,44 26,34 27,92

3 212,35 66,91 70,48 71,55 74,11 67,03

4 42,16 33,43 (30,71) 36,28 32,22 33,62

5 44,08 36,43 37,19 41,91 41,75 36,58

6 25,66 26,31 26,10 27,01 26,90 26,37

7 26,46 26,53 26,35 26,38 26,63 26,62

8 35,43 35,64 35,64 35,80 35,78 35,88

9 40,59 39,72 39,82 40,35 40,35 39,90

lO 34,83 35,17 34,89 34,56 34,60 35,26

11 21,11 21,02 20,43 20,70 21,40 20,99

12 38,98 39,00 38,91 38,90 38,85 38,69

13 44,08 45,08 44,96 44,99 44,91 44,32

14 56,44 56,88 56,86 56,74 56,80 56,13

15 24,32 24,55 24,49 24,50 24,51 24,52

16 22,84 23,02 22,88 22,99 22,89 23,86

17 63,55 59,40 59,38 59,33 59,33 55,44

18 13,35 13,56 13,29 13,50 13,26 13,56

19 22,53 23,81 23,74 23,26 23,26 23,86

20 208,79 210,21 203,49 210,04' 203,39 174,35

21 31,39 69,30 69,04 69,30 69,07

CH3QOO 169,99 169,91

170,43 170,23

QH3C00 21,06 20,4421,13 20,82

coogH3 51,07Hgoo

120

Tabïa 9.

COMPUESTO

CARBONO 109 97 95 96 107

1 (30,50) 30,56 35,47 35,09 37,09

2 24,92 24,98 30,62 26,29 36,97

3 70,61 70,74 71,76 83,09 212,61

4 (30,70) 30,56 36,54 33,15 42,235 37,20 37,15 42,15 42,10 44,15

6 26,13 26,13 27,19 27,61 25,81

7 26,34 26,29 26,55 26,82 26,52

8 35,73 35,73 36,09 35,89 35,66

9 39,85 39,94 40,62 40,46 40,80

10 34,83 34,88 34,72 34,46 34,89

11 20,86 20,87 20,76 20,69 21,01

12 38,30 38,52 38,67 38,51 38,45

13 44,27 44,20 44,31 44,20 44,15

14 56,00 55,90 56,04 55,85 55,7915 24,40 24,44 24,60 24,51 24,44

16 23,75 23,69 23,83 23,77 23,68

17 55,19 55,27 55,43 55,85 55,24

18 13,29 13,49 13,60 13,56 13,51

19 23,42 23,69 23,39 23,13 22,58

20 174,30 174,24 174,37 174,34 174,12

CH3QOO 170,54

QH3COO 21,39

COOQH3 51,06 51,10 51,10 51,16 51,13Hgoo 160,50

H3C-96H4-502- 126,92 130,19134,67 144,31

H3g—06H4—soz— 21,84

Figura3:Compuestoscuyosdatosdedespïazamiento

4.40

ESTRUCTURA

R1

químicodeRMN­

13C seencuentrandeta11adosen1atabïa10.

R1

02CH3

'OAc

49 50 51 47 52 57 78

OAC22OH20(22)

OAc20(22) OAc

OHOHOSucOH

díacetatode24-nor-58-c01-22-eno-3a,7a-d101 24-nor-SB-c01-20(22)—eno-3a,7a-dío1 diacetatode24-nor-5B—c01—20(22)-eno-3a,7a-d101 3a,7a-diacetoxi-53-pregnan-20-ona 3a,7a,21—triacetoxí-53-pregnan-20-ona 3a,7a-díh1drox1-53-androstan-17B—carboxi1at0demetíïo 7a—h1droxi—3a-metí1succínoxi—5B-androstan-17s-carboxi1a­

todemetilo

H N ¡_¡

No 80 81 82 83

ESTRUCTURA

OSuc

OHOTs OCOH

3a-met11succinoxi-SB-androst-8(14)-en-17B-carboxi1ato

demet110

3a-hidroxi-SB-androst-8(14)—en-17B-carboxi1atode me­

tilo

3a-tosi1oxi-53-androst-8(14)-en-17B-carbox11atode me­

ti1o

38-form11oxí-55-androst-8(14)—en-17B—carboxi1at0de

meti1o

122

12912.19.

COMPUESTO

CARBONO 49 50 51 47 52 57

1 (34,92) (35,39) (34,98) (34,81) (34,81) (35,41)2 26,81 30,66 26,82 26,78 26,74 30,71

3 74,11 71,94 74,08 73,94 73,94 71,81

4 (34,65) 39,77 (34,68) (34,60) (34,58) 39,635 41,08 41,56 41,06 40,87 40,81 41,53

6 31,34 34,59 31,33 31,24 31,19 34,93

7 71,18 68,52 71,15 70,99 71,00 68,33

8 37,92 39,87 37,97 37,86 37,86 39,84

9 34,13 33,13 34,37 34,09 34,03 32,99

10 (34,82) (35,13) (34,68) (34,90) (34,81) (35,14)11 20,66 20,59 20,67 20,65 21,39 20,50

12 39,40 38,55 38,42 38,53 38,20 38,15

13 42,62 43,73 43,74 44,10 44,70 44,16

14 50,41 49,93 50,68 50,61 50,77 50,00

15 23,59 23,70 23,58 23,78 23,85 (23,97)16 28,28 24,75 24,70 22,61 22,56 (23,77)

17 55,47 58,89 58,92 63,46 59,09 55,27

18 11,90 12,79 12,72 13,03 12,88 12,23

19 22,70 22,80 22,71 22,89 22,83 22,71

20 40,98 135,07 134,84 208,80 203,29 174,24

21 20,11 17,59 17,51 31,41 170,00

22 144,82 119,02 119,14

23 111,60 13,47 13,45

0H3902- 170,16 170,03 169,94 170,00170,37 170,24 170,26 170,33

003002— 21,50 21,41 21,48 20,4321,51 20,60

-0026H3 51,06

124

Tabïa 10.

COMPUESTO

CARBONO 78 80 81 82

1 (35,10) (35,89) (36,34) (35,73)2 26,67 26,92 30,91 26,91

3 74,64 74,36 71,40 82,76

4 (35,02) 31,77 . (36,00) 32,715 41,26 41,95 42,21 42,08

6 34,70 27,10 27,39 27,85

7 68,20 24,76 24,94 24,61

8 39,57 128,21 128,57 127,73

9 32,95 36,20 36,00 36,00

10 (35,25) (36,33) (36,34) (36,09)11 20,49 19,31 19,36 19,23

12 38,04 34,22 34,63 34,18

13 44,12 43,24 43,32 43,16

14 49,95 138,85 138,62 139,16

15 (23,95) 25,59 25,61 25,55

16 (23,75) 23,75 23,84 23,7217 55,20 56,26 56,29 56,17

18 13,22 19,74 19,77 19,69

19 22,64 23,48 23,62 23,25

20 174.15 173,83 174,06 173,78

—OZQ(CH2)ZQOZCH3 171,47 172,46 171,47 172,53

-OZC(QH2)2COZCH3 29,05 29,55 28,99 29,48

-02C(CH2)2COZQH3 51,61 51,65

4:0ng3 51,03 51,09 51,09

CH3-26H4-SOZ— 127,34 129,59

134,51 144,25

Tabïa 10.

COMPUESTO

CARBONO 83

1 (30,31)

2 25,66

3 70,72

4 (29,98)5 37,36

6 26,59

7 24,57

8 128,21

9 35,95

1o 36,59

11 19,65

12 35,66

13 43,32

14 138,99

15 25,66

16 24,04

17 56,34

18 19,76

19 23,83

20 173,96

-C02QH3 51,18

ngo- 160,56

125

126

ANALISIS DE LOS DATOS OBTENIDOS PARA DERIVADOS SB-ESTEROIDALES

SUSTITUIDOS EN CARBONO 3 Y CON DIFERENTES CADENAS LATERALES (TABLA 9).

Comoera previsibie, un cambio funciona] o configuracionai en carbono 3

mantiene prácticamente invariabie e] despIazamiento quimico de Ios carbonos de

10s anillos C y D y de 1a cadena Iaterai y modifica en e] orden de 2 a 6 ppm e]

de los carbonos 1 a 5.

A - INVERSION DE CONFIGURACION

Se estudió 1a infïuencia de] cambio de configuración de] carbono 3 por com­

paración de Ios datos obtenidos para Ios siguientes pares de compuestos:

- 3a-.y3B-hidroxi-SB-coïan-24-oato de metiio (58 y 102)

- 3a-y'3B-hidroxi-SB-pregnan-ZO-ona (103 y 19)

- 3a-yv36,21-dihidroxi-SB-pregnan-ZO-ona (94 y 104)

- 3a-.y3B-hidroxi-58-androstan-17B-carboxiIato de metiIo (95 y 105).

Los vaïores de despIazamiento quimico y Ias diferencias entre Tos vanres

anaIizados figuran en 1a tabIa 11.

Se observa que en todos Ios casos e] cambio de] isómero 3a a1 3B produce

un corrimiento a campos más aItos de Ios vaiores de resonancia de Ios carbonos

de] aniIIo A. Las diferencias son de aproximadamente 4,6 ppm para e] átomo de

carbono unido a1 oxígeno, 2-3 ppm para Ios carbonos B (2 y 4) y 5-6 ppm para

Ios carbonos y (1 y 5). Estos despIazamientos fueron observados también por

EngeIhard y coIaboradores81 para 3a y 3B coprostanoIes e interpretado en térmi­

127

Tabia 11. Diferencias en ios despiazamientos quimicos producidas por un

cambio configuracionai en e] carbono 3.

58 102 58 —>102 103 19 103 ->19

3a 3B 3a 3B

C-l 35,31 29,97 5,34 35,72 30,00 5,72

C-2 30,45 27,91 2,54 30,83 27,92 2,91

C-3 71,58 67,06 4,52 71,62 66,86 4,76

C-4 36,36 33,60 2,76 36,73 33,46 3,27

C-5 42,06 36,60 5,46 42,39 36,36 6,03

94 104 94 -‘104 95 105 95 —>105

3a 3B 3a 3B

C-l 35,27 29,92 5,35 35,47 30,04 5,43

C-2 30,44 27,78 2,66 30,62 27,92 2,70

C-3 71,55 66,91 4,64 71,76 67,03 4,73

C-4 36,28 33,43 2,85 36,54 33,62 2,92

C-5 41,91 36,43 5,48 42,15 36,58 5,57

nos de interacciones sesgadas.

Los compuestos con fusión de aniiios A/B cis pertenecientes a 1a serie 3B

tienen e] sustituyente de carbono 3 con orientación axial, mientras que en 1a se

rie 3a es ecuatoria] (figura 4). En esta üitima, e] hidrógeno 3B presenta inte­

racciones entre hidrógenos 1,3-diaxia1es con ios hidrógenos 15 y 58.

128

Figura 4

Dichas interacciones son las más importantes pues producen un desplazamien­

to quimico a campos más bajos dei orden de 4,5 ppm. Las mismas desaparecen en e]

isómero B para dar iugar, en este caso, a dos interacciones sesgadas OC(Cl-CZ­

C3-O3By C5-C4-C3-03B) que tienen también un efecto desprotector pero de menor

valor absoiuto (z 1,9 ppm). Por esta razón un cambio configuraciona] dei tipo

3a —>3Bproduce como efecto neto un despiazamiento de 1a seña] de] carbono 3 a

campos más altos.

E1 despiazamiento a campos más aitos también se observa para ios carbonos y

(1 y 5) como una consecuencia de] mismo efecto. Para estos carbonos ocurre un

cambio en ios parámetros hidroxiiados a1 variar 1a interacción y de anti a sesga

da, sin embargo 1a contribución a1 despiazamiento quimico provocada por cuaiquig

ra de estas interacciones es dei mismo signo y magnitud por 10 que e] aporte ne­

to resuitante es nuio.

Para ios carbonos s (2 y 4) e] cambio en 1a configuración de] carbono 3 con

129

duce a Ta pérdida de una interacción sesgada HO (z 4,41 ppm) (H4a-C4-C3-O3a y

H2a-C2-C3-03a) y a Ia aparición de una interacción sesgada C0 (z 2,28 ppm) (C5­

C4-C3-03B y C1-C2-C3-038) Io que trae como consecuencia un despTazamiento de 1as

señaies de Tos carbonos indicados a campos más altos.

La comparación de Ias interacciones que se modifican a1 pasar de Ta sustitu

ción 3a a Ta 3B permite justificar ei efecto pronunciado que afecta Tos despia­

zamientos quimicos de Tos carbonos y respecto de aqueITos que son vecinos a1 cen

tro donde se produjo Ta inversión.

A continuación se resumen ios cambios de interacciones y 1as diferencias de

vaTores en eTTos invqucradas.

INTERACCIONES PRESENTES INTERACCIONES PRESENTES

EN EL ISOMERO 3a EN EL ISOMERO 38

TIPO ENLACES VALOR TIPO ENLACES VALOR DIFERENCIA

INVOLUCRADOS INVOLUCRADOS TEORICA

C1 CH CI-HIB y C3-H3B 4,55 4,55

C2 HO H2a-C2-C3-03u 4,41 C0 C1-C2-C3-03B 2,28 2,13

C4 HO H4a-C4-C3-03a 4,41 C0 C5-C4-C3-O3B 2,28 2,13

C5 CH C5-H58 y C3-H3B 4,55 4,55

En derivados Sa-esteroidaTes e] cambio de configuración en e] carbono 3

produce variaciones con e] mismovaïor absoTuto pero de signo contrariogz’84

130

que aquéllas observadas para ios carbonos 1 a 5 de ios derivados Se. Este hecho

resuita previsible pues en 1a serie 5a ios sustituyentes de carbono 3 con orien­

tación a son axiaies y ios B ecuatoriaies.

B - 3-0X0 DERIVADOS

La oxidación de 1a función aicohóiica de carbono 3 a cetona produce sóio

una pequeña distorsión en 1a conformación de 1a moiécuia y ias caracteristicas

más importantes observadas se deben a factores electrónicos y estéricos. Se com

pararon ias cetonas con ios aicohoies correspondientes. Los compuestos anaiiza­

dos fueron:

- 58-pregnan-3,20-diona (106) con 3a-.y3B-hidroxi-SB-pregnan-ZO-ona (103 y 19)

- 3-oxo-58-c01an-24-oato de metiio (59) con 3a-.y3B-hidroxi-58-c01an-24-oato

de metiio (58 y 102)

- 3-0xo-53-androstan-17B-carboxi1ato de metiio (107) con 3a-.y3B-hidroxi­

53-androstan-17B-carboxiiato de metiio (95 y 105).

En e] siguiente cuadro se presentan ias diferencias observadas en ios vaio­

res de despiazamiento quimico para ios carbonos B y y respecto de] carboniio ,

originadas por ei cambio en e] grupo funciona].

131

01 CZ C4 05

106 37,02 36,86 42,16 44,08

105 ->106 1,30 6,03 5,43 1,69 3a0H -'3CO

19 ->106 7,02 8,94 8,70 7,72 3BOH*>3CO

59 36,89 36,81 42,06 44,06

58 d-59 1,58 6,36 5,70 2,00 3a0H ->3CO

102 ->59 6,92 8,90 8,46 7,46 380H ->3CO

107 37,09 36,97 42,23 44,15

95 ->107 1,62 6,35 5,69 2,00 3aOH*>3CO

105 -‘107 7,05 9,05 8,61 7,57 3BOH*>3CO

E1 grupo carboniio induce un despiazamiento sistemático a campos más bajos

en ias señales de ios carbonos 8 y y, siendo más importante en aqueiias prove­

nientes de 1a serie 3B que de 1a 3a

En ios derivados 3a-hidroxi1ados cada uno de ios carbonos B presenta dos in

teracciones H0 (O3-C3-C4-H4a , 03-C3-C4-H4B , O3»C3-C2-H2a y 03-C3-C2-H28). En

cambio ios carbonos s de ios derivados 3B-hidroxi1ados presentan soiamente una

interacción H0 (03-C3-C2-H23 y 03-C3-C4-H4B) y una interacción C0 (03-C3-CZ-C1 y

03-C3-C4-CS) de mucha menor importancia en 10 que concierne a su contribución a1

vaior absoiuto de] despiazamiento quimico.

Por 10 tanto, cuando se compara 1a diferencia entre ios vaiores de ios des­

piazamientos quimicos de cada uno de 10s epimeros con ios vaiores correspondien­

132

tes del compuesto carbonilico resulta de mayor magnitud enel caso del derivado

33-hidroxilado. El incremento teórico esperado seria:

3a0H -o 3C0: - CH - y(0H) + yanti = 1,89 ppm

380H -3CO: - y(0H) + yanti = 6,44 ppm

C - EFECTOS PRODUCIDOS POR EL CAMBIO DE LA CADENA LATERAL. CARACTERISTICAS

CONFORMACIONALES.

En la tabla 9 se puede observar que, para todos los compuestos estudiados

los carbonos 12, 13, 16, 17 y 18 son los más afectados por el cambio de la cade­

na lateral mientras que, tal comoera previsible, las señales del resto de los

carbonos no varian por encontrarse remotos al sitio de sustitución.

Cuando se comparan las señales de los carbonos 13 y 16 en esteroides del ti

po 20-ceto pregnano (compuestos 19, 92, 100, 103 y 106) con las de los 56-andros

tanos, se aprecia el efecto de desprotección producido por el sustituyente en

carbono 17.

20-ceto pregnano: 6C-13 = 44 ppm , 6C-16 = 23 ppm

58-androstano: 6C-13 = 41 ppm , 6C-16 = 20 ppm

La cadena lateral de los 20-ceto pregnanos adopta dos conformaciones prefe­

ridas que están en equilibrio por rotación alrededor del enlace C-17/C-2089’90,

pero aunque en una de ellas existe un eclipsamiento parcial entre el oxigeno y

el grupo metileno de carbono 16, éste no constituye un factor desestabilizante

. . 89 .. .. ., .de 1mportanc1a . Esta conclu51on surgio por comparac1on con el efecto de eclip­

133

samiento presente en 1a 2(ecuatoria1)-metiiciciohexanona donde e] mismoha sido

considerado insignificantegr.

La iguaidad en e] efecto y(C0) también se observó para esteroides con cade­

na de] tipo 21-hidroxi-20-ceto pregnano (compuestos 94 y 104), 21-acetoxi-20-ce­

to pregnano (compuestos 95 y 108) y 17B-carboxi1ato de metiio (compuestos 96 y

105 ).

La comparación de] despiazamiento quimico de] carbono 17 de todos ios com­

puestos estudiados indica que ios derivados de 20-ceto pregnanos presentan 1a

seña] despiazada a campos más bajos (6 = 64 ppm). Esta desprotección no sóio se

debe a1 grupo carboniio en B, sino también a 1a reiación 1,3-diaxia1 que existe

entre e] H-17 y ios hidrógenos de] carbono 21 que tiene iibre rotación92 (figu­

ra 5).

Cuando se introduce un hidroxiio en ei carbono 21 (compuestos 94 y 104) 1a

seña] de] carbono 17 se desplaza a campos más aitos (6 = 59 ppm). Esto ocurre en

parte por 1a desaparición de uno de ios hidrógenos de carbono 21, pero también

por 1a formación de un puente de hidrógeno intramoiecuiar entre e] hidroxiio de

carbono 21 y e] oxigeno de carbono 20. De esta manera se restringe 1a 1ibre ro­

tación entre estos dos carbonosgz, evitando asi una interacción tan efectiva co­

mo 1a que existe en e] caso en e] que hay iibre rotación.

E1 carbono 17 de ios 21-acetoxi derivados (compuestos 93 y 108) presenta

e] mismo vaior de desplazamiento quimico que e] de ios 21-hidroxi-derivados. En

este caso ya no hay posibiiidad de formación de un puente de hidrógeno intramo­

134

Figura 5: Conformación preferencia] de 1a cadena 1atera1 de 105 ZO-ceto pregna­

nos en soïución.

Figura 6: Conformación preferencia] propuesta para 1a cadena 1atera1 de 105

ácidos colánícos o derivados de Ios mismos en soïución.

135

1ecu1ar, pero es factibie que e] grupo acetato resuite Io suficientemente voiu­

minoso comopara impedir también una iibre rotación y una totaimente efectiva

interacción de tipo 1,3-diaxia1.

Los derivados de tipo ácido etiánico (compuestos 95, 96, 97, 106, 107 y

109) muestran un despïazamiento de] carbono 17 aün a campos más aitos (6 = 55

ppm) siendo 1a única infïuencia ejercida 1a correspondiente a 1a sustitución con

un carboxiiato de metiio.

Los derivados de ácidos colánicos (compuestos 58, 59, 60, 61, 67, 68, 102

y 110)presentan una situación reaimente diferente. La comparación con e] 58-an­

drostano indica una desprotección de] carbono 13 (6 = 42,6 ppm), simiïar a 1a

observada anteriormente, pero un importante despiazamiento de] carbono 16 a cam­

pos más bajos (6 = 28 ppm). En este caso ias diferencias observadas en 10s vaio­

res de despïazamiento quimico no se pueden expiicar soiamente por factores eiec­

trónicos pues de ser asi, ta] como se ha comentado antes, 1a cadena 1atera1 de­

beria infiuir sobre ambos carbonos de 1a misma manera. Resulta evidente que di­

cha diferencia surge comoconsecuencia de factores estéricos. Teniendo en cuenta

este hecho, se propuso que 1a cadena 1atera1 de los ácidos coiánicos o derivados

de eiios adoptan en soiución una conformación preferencia] (figura 6) simiiar a

1a que adoptan ios 20R-ester01es en soiución93. Esta conformación coincide con

e] rotámero favorecido para 1a cadena 1atera1 de] ácido cóiico en estado crista­

iino, segün se ha determinado por análisis de rayos X94. Una disposición prefe­

rida simiiar también se ha propuesto para e] coiestano en estado cristaiinog4.

136

En 1a disposición espacia] propuesta se presenta una interacción 1,3-diaxia1

entre e] hidrógeno de carbono 20 y e] hidrógeno B de carbono 16. Esta interación

seria responsabie de 1a desprotección del carbono 16 y de1consiguiente despiaza­

miento de su seña] a campos más bajos. Este despiazamiento resuita más importan­

te que ei que se observa en ios 20-ceto derivados debido a que 1a interacción

1,3-diaxia1 pianteada produce una desprotección mayor que e] efecto de un carbo­

niio en B con 1a orientación que presenta 1a cadena del pregnano.

Cuando se compara e] desplazamiento quimico de] carbono 13 de estos compues

tos con e] correspondiente a1 58=androstano también se observa un corrimiento a

campos más bajos pero mucho menor dado que, para ei carbono 13, se debe exciusi­

vamente a 1a sustitución en carbono 17.

E1 despiazamiento quimico de] carbono 16 en ios derivados de ácidos coiáni­

cos anaiizados es simiïar a1 observado para e] carbono 16 de ss-coiestanos77 y

SB-pregnanos77.

Es factibie que e] confórmero favorecido en soiución para estos compuestos

sea e] mismoque e] que presentan en sus estructuras cristaiinas y que, ta] como

ha sido demostrado por anáiisis de rayos X94, 1a disposición espacia] de sus ca­

denas lateraies tenga e] hidrógeno 20 anti con respecto a1 hidrógeno 17a. Por 10

tanto, existiría también una interacción 1,3-diaxia1 H-20/H-16que seria, en es­

te caso como en ios anteriores, 1a responsabie de] despiazamiento a campos más

bajos de] vaior de 1a resonancia dei carbono 16.

E1 vaior de] despiazamiento quimico para e] carbono 13 de estos compuestos

137

es coincidente con e] encontrado para ios ácidos coiánicos en estudio.

En e] siguiente cuadro se comparan ios valores de despiazamiento quimico de

estos carbonos para diferentes compuestos, pudiendo observarse 1a desprotección

sistemática que produce 1a interacción descripta en e] carbono 16 de 10s esteroi

des que 1a presentan.

C-13 C-16 INTERACCION

H20/H16

SB-colestan-3d-oi 43,1 28,7 SI

SB-colestan-3B-01 42,7 28,3 SI

5B-pregnano 42,3 28,3 SI

3s-hidroxi-58—pregnan-20-ona 44,4 22,9 NO

3o-hidroxi-SB-pregnan-ZO-ona 44,4 22,9 N0

33-acetoxi-58-pregnane20-ona 44,1 22,7 N0

3a—acetoxi-58—co1an-24-oato de metiio 42,7 28,1 SI

3-oxo-53-c01an-24-oato de metilo 42,5 28,0 SI

3a-hidroxi-58-co]an-24-oato de metilo 42,7 28,1 SI

3-oxo-SB-androstan-17B-carboxilato de meti- 44,2 23,7 NO

10

3B-hidroxi—58-androstan-17B-carboxi1ato de 44,3 23,9 NO

metiio

3a-hidroxi-58-androstan-17B-carboxi1ato de 44,3 23,8 N0

metiio

138

5En e] caso de] 3B-acetoxipregn-S-en-ZOR-oi9 se ha demostrado por cálcuios

qteóricos de energia de rotámeros96 y por RMN-lH97,9“ que 1a cadena 1atera1 adog

ta soiamente un confórmero favorecido con e] hidrógeno 17a casi anti a1 hidróge­

no 20. Esta conformación hace posibie una interacción entre e] hidrógeno 20 y ei

hidrógeno 168, que junto con un pequeño efecto y(OH) permiten expiicar ei despia

zamiento quimico de] carbono 16 (6 = 26 ppm).

Por otro 1ado, compuestos sin hidrógeno en e] carbono 20 como e] 38,20R-di­

hidroxi-Z3-norcoianato de metiio y su isómero 205 presentan 1a seña] de] carbono

5 . . . . ..16 a 23 ppm9 , un vaior que se puede atribu1r a 1a ausenc1a de 1a 1nteracc1on

discutida.

Hl ¡1

38-Acetoxipregn-S-en-ZOR-o]

Ac

B1

' 2 R1: CHZCOZCH3 y R2: OH

3B,20R-dihidroxi-23-norcoianato de metiio.

¡1 ¡1 R1: OH y R2= CHZCOZCH3

3B,208-dihidroxi-23-norc01anato de metiio.

139

La posibilidad de una interacción H-l7/H-21 en el confórmero propuesto

(figura 6) explica el desplazamiento a campos más altos del carbono 17 (6 =

56 ppm) cuando se lo compara con los 20-ceto derivados. Además, no se puede des

cartar un posible eclipsamiento parcial H-17/H-22 e interacciones de tipo CC

con el resto de la cadena lateral.

Se debe tener en cuenta que las interacciones mencionadas han sido descrip

tas para anillos de seis miembrosen conformaciones silla86 y en este caso se

está haciendo una extensión a partes aciclicas de las estructuras comoson las

cadenas laterales de los esteroides. A pesar de que ello no seria estrictamente

válido, es razonable predecir su aplicación en el confórmero favorecido en solu

ción ya que los datos obtenidos lo justifican ampliamente.

En el caso de la cadena lateral de compuestos esteroidales, la existencia

de un rotámero principal se debe a la restricción de la libre rotación alrede­

dor del enlace entre los carbonos 17 y 20 causada por una repulsión entre el

CH3-18y cualquier grupo unido al carbono 20. Esta interacción estérica debe

tener mayor energía que la mencionada antes entre el hidrógeno 20 y el hidróge­

no 16 B.

140

ANALISIS DE LOS DATOS OBTENIDOS PARA DERIVADOS 5B-ESTEROIDALES

SUSTITUIDOS EN LOS CARBONOS 3 Y 7 , Y CON DIFERENTES CADENAS LATERALES

(TABLA 10)

En Tos sistemas esteroidaies con fusión de aniTIOS A/B cis e] sustituyente

a de carbono 7 tiene orientación axial, de manera que 1a introducción de un hi­

droxiTo o un aceti10 en esta posición tiene un marcado efecto sobre aTgunos car

bonos a su a1rededor.

La introducción de un hidroxiïo en 1a mencionada posición infïuencia en

forma diferente a ambos carbonos B (6 y 8). En e] caso de] carbono 6 se presen­

ta una interacción entre e] hidrógeno 6a y e] hidroxiïo vecino (H0 = 4,41 ppm)

además de una interacción CO (C5-C6-C7-07a) de menor magnitud (2,28 ppm). Esto

da como resuïtado e] despTazamiento de 1a seña] a vaiores de] orden de 34,7 ppm,

ta] como ocurre en e] caso de los compuestos 50, 57 y 78 de 1a tabïa 10. Cuando

estas interacciones no existen e] desplazamiento quimico de] carbono 6 es de]

orden de 26,5 ppm como puede apreciarse en 1a tabTa 9.

Para e1 otro carbono B, e] hidroxiio en posición axia] introduce dos in­

teracciones CO (C9-C8-C7-O7a y C14-C8-C7-O7a ). E11as modifican su despIazamien

to quimico a un valor promedio para Tos compuestos 50, 57 y 78 de] orden de 39,7

ppm (tabTa 10) en comparación con e] valor promedio de 35,7 ppm (tabia 9) para

Tos que no 1a presentan.

La introducción de] hidroxilo axia] impiica 1a pérdida de dos interaccio­

141

nes entre hidrógenos 1,3-diaxia1es. E110 conduce a un despTazamiento de las se­

ñaTes de Tos carbonos 9 y 14 a campos más aTtos. Este efecto se ve incrementado

por 1a aparición de una interacción y(0H) sesgada (-1,28 ppm) en ambos casos.

ET cambio introducido se observa por comparación entre e] vaior de despTazamien

to quimico de estos carbonos en 10s compuestos de 1a tabla 9 (C-9: 40,25 ppm ;

C-14: 56,15 ppm) y Tos datos de Tos respectivos carbonos en Tos compuestos 50,

57 y 78 de 1a tabTa 10. La diferencia experimenta] obtenida, en promedio, fue

de 7,2 ppm para e] carbono 9 y 6,2 ppm para e] carbono 14.

E1 carbono 5 se encuentra en reTación y(0H) sesgada respecto de] hidroxiTo

de carbono 7, pero como e] enïace C-7/0-7 es para1e10 a1 enlace C-5/C-4, 1a hi­

droxiTación no introduce cambios en e] número de interacciones entre hidrógenos

1,3-diaxia1es de] carbono en cuestión. Es por eTTo que e] ünico cambio produci­

do en 1a seña] es un despiazamiento de 1,28 ppm a campos más aTtos. Esta predig

ción coincide con Tos resultados obtenidos.

TABLA COMPUESTO C-4 C-5 TABLA COMPUESTO C-4 C-5

1 58 36,36 42,06 2 50 39,77 41,56

1 103 36,73 42,39 2 57 39,63 41,53

1 94 36,28 41,91

l 95 34,54 42,15

FinaTmente 1a seña] de] carbono 4 muestra un despTazamiento a campos más

bajos por Ta infïuencia que e] sustituyente en 6 (¿(OH) = 2,86 ppm) produce en

142

estos sistemas A/B cis. Ta] como puede apreciarse en e] cuadro de 1a página an­

terior, 1a variación teórica se ve avaïada por ios datos comparativos de ios

compuestos 58, 103, 94 y 95 que no presentan 1a interacción, frente a Ios com­

puestos 50 y 57 que 1a presentan.

E1 anáïisis de ios vaiores de despïazamiento quimico de 10s carbonos 3 y 7

de ios compuestos de 1a tabia 10 indica una notoria diferencia entre ambos.

Cuandose anaiizan ias interacciones sesgadas para estos casos se obtienen re­

suitados compietamente distintos. En e] caso de] carbono 3, e] hidroxiïo con

orientación a es ecuatoria] y ei hidrógeno 38 interactúa con 10s hidrógenos di­

axiaies de ios carbonos 1 y 5. Este hecho contribuye a desplazar e] vaior base

para 1a seña] de un a1coho] secundario (60,99 ppm) a campos más bajos (2x4,55

ppm).

E1 hidroxiio en posición 7a es axial y en este caso tres interacciones 0C

(07a-C7-C8-C9 , 07a-C7-C8-C14 y 07a-C7-C6-C5) despiazan e] vaior base 3x1,97 ppm

también a campos más bajos.

De acuerdo a 1os cáicuios teóricos, 1a variación en ios despiazamientos

quimicos de estos dos carbonos debería ser de 3,19 ppm, siendo mayor e] corres­

pondiente a1 carbono 3. Los resuitados experimentaies son 10s siguientes:

COMPUESTO C-3 C-7 C3 - C7

50 71,94 68,52 3,42

57 71,81 68,33 3,48

143

La acetiIación de ambos hidroxi10s produce modificaciones simiIares en Ios

dos carbonos. Las diferencias observadas anteriormente se mantienen.

COMPUESTO C-3 C-7 C3 - C7

49 74,11 71,18 2,93

51 74,08 71,15 2,93

47 73,94 70,99 2,95

52 73,94 71,00 2,94

La acetiiación produce en 1os carbonos B un despIazamiento de sus señaIes

a campos más bajos, pero eI orden de magnitud no es simiIar en todos Ios casos.

Se ca1cu16 e] va1or promedio de] despIazamiento quimico para Ios carbonos 2, 4,

6 y 8 de Ios derivados diacetilados 49, 51, 47 y 52 y e] correspondiente a Ios

compuestos 50 y 57 con ambos hidroinOS Iibres.

tran Ios resu1tados.

En e] siguiente cuadro se mues­

C-2 C-4 C-6 C-8

VALOR PROMEDIO CON LOS HIDROXILOS ACETILADOS 26,79 34,63 31,28 37,90

VALOR PROMEDIO CON LOS HIDROXILOS LIBRES 30,69 39,70 34,76 39,86

DIFERENCIA ENTRE AMBOSVALORES 3,90 5,07 3,48 1,97

Se puede observar que e] carbono 4 es e] más afectado. La seña] de este

144

carbono se despiaza por 1a introducción de un acetiio en posición 3a pero es prg

babïe que coiabore a ese desplazamiento 1a presencia de] sustituyente voiuminoso

en carbono 7. Esto üitimo resuitaria comoconsecuencia de 1a unión cis entre los

aniiios A y B que provoca una proximidad espacia] entre e] carbono 4 y e1 aceti­

10 de posición 7a. Esta idea se veria apoyada por e] hecho de que pares de com­

puestos de 1a tabia 9, como por ejempio 58 y 60 , 103 y 92 ó 94 y 93 , con e]

hidroxiio 3a iibre y acetiiado, muestran para e] carbono 4 una diferencia de va­

iores de despïazamiento quimico prácticamente igua] a 1a de] carbono 2.

E1 carbono 8 presenta, por acetiiación de] hidroxiio de carbono 7, un cam­

bio mucho menor. Esto podría deberse a que e] ünico hidrógeno unido a1 carbono

analizado es axial y está orientado hacia e] lado B de 1a moiécuia, en dirección

opuesta a1 sustituyente axia] voïuminoso de carbono 7, produciéndose en este ca­

so una infiuencia estérica muchomenor.

145

EFECTO DE LA DESHIDRATACION DE UN HIDROXILO 7a Y LA INTRODUCCION DE

UN DOBLE ENLACE EN POSICION 8(14) (TABLA 10)

A continuación se discutirá el efecto producido comoconsecuencia de la des

hidratación de un hidroxilo a en carbono 7 para dar lugar a un doble enlace en

posición 8(14). En la presente sección las diferencias que se mencionarán entre

valores de desplazamiento quimico surgen de la comparación de los datos experi­

mentales correSpondientes a los compuestos 78 y 80, ya que la única diferencia

estructural entre amboses la involUCrada en estudio.

Eggert y Djerassi79 investigaron el cambio que origina en la resonancia de

los carbonos la introducción de un doble enlace en distintas posiciones del es­

queleto esteroidal. Compararonlos valores observados con los predichos usando

el conjunto de parámetros descriptos por Beierbeck y colaboradoresBG.

La introducción de un doble enlace en un sistema cíclico produce una dis­

torsión conformacional apreciable,y en moléculas policiclicas de anillos conden

sados la deformación se propaga a través de los mismos. El grado de transmisión

depende de la rigidez del anillo que contiene el doble enlace y de la cercanía

de los anillos condensados. En el esqueleto esteroidal la flexibilidad de los

cuatro anillos es muydiferente y por lo tanto, dobles enlaces en ciertas posi­

ciones producen una transmisión sustancia] de la distorsión, mientras que en

otras el efecto es muchomenor. Por esta razón Eggert y Djerassi indicaron que

en estructuras policíclicas comolos esteroides, no hay una buena correlación

146

entre aigunos valores observados y ios caïcuiados. Las mayores desviaciones ias

encontraron para e] caso de dobies eniaces en e] aniiio C, que está condensado

con un aniiio de cinco miembros. En particuiar, ios compuestos con e] dob1e en­

lace en posición 8(14) presentan diferencias no sóio en ios carbonos oiefinicos

sino también en ios aiiiicos (B) y homoaiiiicos (y). Esto justificaria ias difg

rencias encontradas entre ios datos experimentaies y ios teóricos que se deta­

11an a continuación.

La deshidratación de] hidroxiio en carbono 7 para dar 1a oiefina en posi­

ción 8(14) se puede enfocar como dos modificaciones simuïtáneas. Por un 1ado,

e] reempiazo de un hidroxiio por un hidrógeno y por e] otro, 1a introducción de]

dob1e eniace.

E1 carbono 6 es uno de ios más afectados pues, como consecuencia de] cambio,

pierde 1a interacción de] hidrógeno 68 con e] hidrógeno 86 (CH = 4,55 ppm) que

desaparece a] formarse e] dobie eniace. Ademásse descuenta para este carbono

una interacción de tipo H0 (4,41 ppm) y una C0 (2,28 ppm) que surgian por 1a prg

sencia de un hidroxiio en e] carbono vecino. Por üitimo, también se modifica 1a

señai por 1a presencia de] dobie eniace (y(01ef. anti)= 5,23 ppm). Estos facto­

res permiten ca1cu1ar un desplazamiento teórico de aproximadamente 6 ppm a cam­

pos más aitos, aunque en rea1idad e] observado fue aün mayor (7,6 ppm).

E1 hidrógeno 7a introduce una interacción de tipo 1,3-diaxia1 con e] hidró­

geno 9a. Para e] carbono 9,este efecto se compensa con 1a pérdida de una interag

ción equivaiente entre e] hidrógeno 9a y e] 14 que se eiimina a1 formarse e] do­

147

ble enlace. Por lo tanto, el desplazamiento de la señal del carbono en cuestión

se debe al cambio de una interacción con un hidroxilo en y (-1,28 ppm) por la

producida por una olefina en el carbono vecino (3,86 ppm). Esto hace previsible

un corrimiento teórico de la señal de 5,14 ppma campos más bajos y podria jus­

tificar el desplazamiento experimental observado de 3,25 ppmen el sentido pre­

visto.

El carbono 5 pierde la interacción que tenia con el hidroxilo en y (-1,28

ppm) y el carbono 4 en 6 (2,86 ppm). Esto explicaría el pequeño desplazamiento

del carbono 5 a campos más bajos (0,69 ppm) y el desplazamiento mayor del car­

bono 4 en sentido inverso.

La señal del carbono 13 no muestra cambios apreciables pese a estar direc­

tamente unido a uno de los carbonos sp2. Esto respaldaria lo indicado por las

reglas semiempiricas pues no está unido a hidrógenos y el parámetro B de olefi­

nas no se aplica a carbonos sp3 cuaternarios.

La señal del carbono 18, directamente unido al carbono 13, tiene un pronug

ciado corrimiento a campos más bajos (6,52 ppm). Este hecho puede deberse al

efecto desprotector de la olefina, que se manifiesta en el parámetro y de olefi­

nas con la disposición espacial particular observada en este caso, indicada teó­

ricamente comoanti.

Los valores de desplazamiento quimico de los carbonos 11 y 12 también se mg

difican por la introducción del doble enlace, pero en un orden de magnitud mucho

menor ya que, la relación de estos carbonos con el mismoes la indicada en las

148

regias semiempiricas comosyn (1,41 ppm). Este efecto compensa parciaimente 1a

pérdida,por parte de cada uno de estos carbonos,de una interacción entre hidró­

genos 1,3-diaxia1es (H-lls conHm8e H-12a con H-14). La suma de estos factores

justificaria e] despiazamiento fina] a camposmás aitos de ias dos señaies en

estudio, pero impediriajustificar 1a diferente variación que se presenta entre

ambos casos.

Los métodos utiiizados en e] presente trabajo para 1a asignación de ios des_

piazamientos quimicos de cada uno de ios carbonos de ios compuestos en estudio

no permitieron una asignación inequívoca de ios vaiores correspondientes para ios

carbonos 8 y 14, dado que ambos carbonos oiefinicos son cuaternarios.

. 79 . YDe acuerdo a datos de iiteratura Eggert aSigna el espectro dei coiest­

8(14)-eno (111) ei vaior de desplazamiento quimico más aito (141,9 ppm) a] car­

bono 14 y e] más bajo alcarbono 8 (126,7 ppm) Para eilo se basó en datos ebteni­

dos utiiizando reactivos de despiazamiento para 1a asignación de ios carbonos

oiefinicos de] 5a-C01est—8(14)-en-38—oi (112).

H 112

149

Coincidentemente, Tsuda y co1aboradores78 hacen e] mismo tipo de asignación

para e] coiest-8(14)-en-3B-01 (C-8: 126,1 ppm , C-14: 142,4 ppm). Se debe remar

car que ambosautores trabajan con derivados 53-esteroida1es.

En cambio, Tschesche y Fuhrer43 asignaron para 1a 3B-hidroxi-56-pregn­

8(14)-en-20-ona (38) y su derivado aceti]ado,en forma respectiva,1os siguientes

vaïores: 128,7 y 128,1 para e] carbono 14 y 139,5 y 139,7 para e] carbono 8, sin

ac1arar especificamente en qué metodoïogia basan su asignación.

Los compuestos anaïizados por Tschesche son derivados 58 a diferencia de

105 5a considerados anteriormente. Si bien es factib1e que 1a modificación A/B

trans a A/B cis produzca cambios conformacionaïes importantes, ios datos para

los autores están revertidos, pero son coincidentes.

Por otra parte, surgen discrepancias en 1a asignación realizada por Tsche­

sche en e] mismotrabajo para otros derivados esteroidaïes anteriormente descrip

tos por varios autores. Por ejempïo, en e] caso de progesterona,considera para e]

carbono 16 un desplazamiento quimico de 38,7 ppm que se encuentra fuera de ios

1imites de 1os va1ores normaïmente encontrados para este carbono en compuestos

de este tipo. Se piensa que ese dato se encuentra intercambiado con e] asignado

por e] autor para e] carbono 12 (24,4 ppm).

En e] presente trabajo, si bien no se puede determinar inequivocamente, se

asigna tentativamente 128,2 ppm para e] carbono 8 y 138,9 ppm para e] carbono

14.

EXPERIMENTAL

GENERALIDADES

Los puntos de fusión fueron determinados con un aparato Fisher-Johns y no

están corregidos.

Los espectros de absorción en el IR se realizaron utilizando dos espectro­

fotómetros Perkin-Elmer, modelo 421 o modelo 7103, dispersando la muestra en Nu­

jol.

Los espectros de RMN-lHse efectuaron a 100 MHzcon un espectrómetro Varian

XL-100-15 (salvo los casos indicados a 60 MHzcon un espectrómetro Varian A-60).

Los espectros de RMN-13€se realizaron con el equipo Varian XL-100-15 a 25,2 MHz

por el método pulsado con transformada de Fourier, utilizando una computadora

Varian 620/L-100 y una unidad de discos magnéticos Sykes 7000. El solvente em­

pleado fue cloroformo deuterado (Cl3CD) salvo en los casos en que se indique lo

contrario y se usó tetrametilsilano comoseñal de referencia interna. Los des­

plazamientos quimicos se expresaron en ppmy las constantes de acoplamiento (J)

en Hz. Las señales se indican comosingulete (s), doblete (d), triplete (t), mul

tiplete (m), banda ancha (b.a.). Los espectros de RMN-13C se hicieron con solu­

ciones 0,5-0,6 M , con un ancho de barrido de 5700 Hz usando pulsos de 45° y ve­

locidad de repetición de pulsos de 0,71 segundos. Los espectros totalmente desa­

coplados de protones son el resultado de acumular 10000-15000 pulsos y se obtu­

vieron por irradiación del espectro de 1Ha una frecuencia central de 3 ppm. Las

multiplicidades de las señales fueron determinadas por la técnica de ecos de

151

spin con desacopie a1ternado (APT: test de protones vecinaïesgg) utilizando una

secuencia de pulsos 90Ïx - 1 - 180Íy - T - FID (1 = 7 mseg) y cortando el desacg

pïador en e1 periodo entre dos puïsos.

Los compuestos 104 y 106 fueron adquiridos a Makor Chemicais Ltd.; 1os com­

puestos 58 y 107 se obtuvieron por meti1ación con diazometano de 105 ácidos co­

rrespondientes adquiridos a Makor Chemica1s Ltd. Los compuestos 19 y 103 se ais­

1aron desacetiiando ios compuestos 100 y 92 respectivamente mediante un calenta­

miento a refiujo con etanol y catáiisis ácida. E1 compuesto 108 se preparó por

acetiïación de] compuesto 104 con anhídrido acético y piridina a temperatura am

biente. E1 compuesto 110 se preparó por tratamiento de] compuesto 58 con ácido

fórmico en tetrahidrofurano a temperatura ambiente durante 20 hs. E1 compuesto

102 se obtuvo por saponificación (con hidróxido de potasio en etanoï) seguida de

tratamiento con diazometano de] compuesto 68.

Los espectros de masa se rea1izaron a 70 eV en un espectrómetro de masa

Varian-MAT CH7-A, comandado por una computadora Varian-MAT Data System 166, con

unidades de salida TRCTektronix 4010 e impresora Tektronix 4631. En todos ios

casos ios espectros se reaiizaron por introducción directa de las muestras.

Las mediciones de radiactividad se 11evaron a cabo en un espectrómetro de

cente11eo liquido Packard Tri-Carb 3003, o en un Tracor Anaiytic Mark III. Las

Las muestras se disoïvieron en una mezcia de 1 m1 de agua y 14 m1 de solución

cente11eadora que contenía 100 g de naftaïeno, 7,0 g de 2,5-difeni10xazo] (PPO)

y 300 mg de 1,4-bis-2-(4-meti1-5-feni10xa201i1)bemceno (dimetii-POPOP) por 1itro

152

de soïución en dioxano.

Las cromatografias en capa deigada anaiiticas se reaiizaron usando como

fase fija siiicagei G (Merck) y comoreveiadores vapores de iodo o soiución

acuosa de ácido suifürico a1 50%con posterior caientamiento a 110°C. Para ma­

yor resoiución se emp1earon p1acas cromatográficas comerciaïes de si1icage1 60

F254 sobre aiuminio (Merck).

Las cromatografias en capa deigada preparativas (1-2 mmde espesor) se efeg

tuaron utiiizando siïicageï PF254 (Merck), observándolas 1uego de desarroiiadas

a 1a 1uz u1travioieta (254 nm). Para mayor resoiución, en muestras radiactivas,

se utilizaron piacas cromatográficas comerciaies de siiicagei 60 F254 (Merck) de

0,25 mmde espesor.

Las cromatografias en columna se realizaron utiiizando comoadsorbente si­

1icage] Davison (malla 100-200).

Las cromatografias 1iquidas de aita resoiución se efectuaron en un cromato­

grafo iiquido Micromeritics modeïo 750, equipado con un detector de indice de

refracción modeio 771. Se utiiizó una coiumna Aitex U1trasphere ODS5 um (250 mm

x 10 mm,d.i.) para cromatografía en fase reversa. E1 sistema de soivente empiea

do fue metanoi-agua (9:1) con un fiujo de 2 m1/minuto.

E1 114CH3fue adquirido a The Radiochemica] Centre Ltd., Amersham, Inglate­

Los soiventes fueron evaporados a presión reducida. Las soluciones orgáni­

cas fueron secadas por tratamiento con suifato de magnesio anhidro.

153

Las reacciones de metiiación se reaiizaron disolviendo o suspendiendo 1a

muestra en metano] y agregando, gota a gota, una solución etérea de diazometa­

no hasta persistencia de] coior amariiio. La soiución amariiia se dejó tapada

y en reposo durante 20 minutos y, 1uego de eiiminar ei exceso de reactivo con

una corriente de nitrógeno, se evaporó e] soivente a presión reducida.

E1 reactivo de Jones se preparó disoiviendo 27 g de trióxido de cromo en

una mezcia de 23 m1 de ácido suifürico (c) y 100 m1 de agua.

Los soiventes de desarroiio para ccd anaiitica fueron: sistema 1: cioruro

de metiieno-metanoi-ácido acético 97:3:0,05, sistema 2: toiueno-acetato de eti­

10 95:5, sistema 3: cioruro de metiieno-metanoi 99:1, sistema 4: benceno-aceta­

to de etiio 4:1, sistema 5: cioroformo, sistema 6: cioruro de metiieno-metanoi

97:3, sistema 7: cioruro de metiieno-metanoi 95:5, sistema 8: cioruro de meti­

ieno-metanoi-ácido acético 95:5:0,05, sistema 9: benceno-acetato de etiio 96:4,

sistema 10: benceno-acetato de etiio 9:1, sistema 11: cioruro de metiieno-meta­

n01 98:2, sistema 12: cloruro de metiieno-metanoi-ácido acético 98:2:0,05, sis­

tema 13: cioruro de metiieno, sistema 14: cioruro de metiieno-metanoi 93:7, sis

tema 15: cioroformo-hexano 98:2.

Las técnicas experimentales utiiizadas para e] desarroiio de ios estudios

biosintéticos se encuentran descriptas en ias páginas 91-95.

154

A - DEGRADACION DE LA CADENA LATERAL

A1 - DEGRADACION DEL ACIDO BILIAR AL 20-CETO PREGNANO

- Acido 3a,7a-diacetoxi-58-c01an-24-oico (gg).

Método A:

50 mg de ácido quenodesoxicólico (41) se disoïvieron en 2 m1 de

piridina anhidra y se agregaron 0,5 m] de anhídrido acético. La mezc1a se man­

tuvo a temperatura ambiente y con agitación durante 16 hs. Finaïizado ese tiem­

po se comprobópor ccd (sistema: 1) que e] reactivo de partida habia desapare­

cido.

La mezcla de reacción se volcó sobre una soiución de ácido ciorhidrico (c)

en agua (1:1), se extrajo con éter etilico y se 1avó 1a fase orgánica hasta neu­

traïidad. La fase etérea se secó y por evaporación de] soivente se obtuvo un ja­

rabe. Dicho jarabe se sometió a una reacción de metiiación con diazometano por

1a técnica descripta. E1 análisis por espectroscopia infrarroja de] producto ob­

tenido indicó 1a presencia de grupos hidroxiio libres.

Método B:

Una mezcla de 50 mg de ácido quenodesoxicólico (41), 1 m1 de ácido

acético glaciai y 0,5 m1de anhidrido acético se mantuvo a reflujo y con agita­

ción durante 2 hs. E] anáïisis de dicha mezcïa por ccd (sistema: 1) indicó simi­

lares resuïtados a los obtenidos antes de] aisiamiento de] producto segün e] mé­

todo A.

155

Se duplicó e] tiempo de caientamiento pero no se observaron cambios.

Método C:

A 1a mezcia de reacción descripta en e] método B se ie agregó

0,1 m] de ácido ciorhidrico (c) comocataiizador. La soiución se mantuvo a re­

fiujo durante 4 hs a1 cabo de ias cuales se determinó por ccd (sistema: 1) que

1a reacción habia dado ios mismos resuitados que en los casos anteriores.

Una proiongación en e] tiempo de caientamiento a 8 hs no modificaba 10 ob­

servado.

Método D:

Una soiución de 1,5 g de ácido quenodesoxicóïico (41) en 20 m1 de

anhídrido acético y 0,15 m1de ácido ciorhidrico (c) se caientó a refiujo duran­

te 1,5 hs. Se voicó sobre hieio y se filtró e] precipitado obtenido. Dicho pre­

cipitado se recristaiizó de etano] acuoso aisiándose 1,6 g (88%) de] compuesto

48, homogéneopor ccd (sistema: 1). P.f. 200-203°C (iit100 : 206-208°C).

IR (cm'l): 3300-2600 (O-H), 174o (c=0, éster), 171o (c=o, ácido).

RMN-lH, ppm: 0,65 (s, 3H, CH3-18), 0,94 (s, 3H, CH3-19), 2,00 (s, 3H, CH3C02-),

2,20 (s, 3H, CH3C02-), 3,62 (s, 3H, -C02CH3), 4,50 (b.a., 1H, H-3),

4,80 (b.a., 1H, H-7).

EM, m/z (z): 356 (M - 2Ac0H, 11), 255 (M - 2Ac0H - CL, 10), 213 (M — 2Ac0H ­

aniiio D, 6), 145 (6), 78 (100).

- Diacetato de 24-nor-58-c01-22-eno-3a,7a-di01 (4 ).

A una soiución de 800 mg (1,68 mmoies) de ácido 3a,7a-diacetoxi-58-c01an­

156

24-oico (48) en 30 m1 de benceno anhidro mantenida a 50°C, se agregaron 80 mg de

acetato cüprico y 0,01 m1 de piridina anhidra y se lievó a ebu11ici6n con agita­

ción y en atmósfera de nitrógeno. Se adicionaron 2,2 g (4,45 mmoies) de tetra­

acetato de plomo en cuatro porciones separadas por intervaios de una hora. Se

mantuvo a refiujo una hora más y se fiitró e] sólido en suspensión. La soiución

resuitante, de coior verde, se 1avó con soiución acuosa de ácido cïorhidrico a1

5%para e1iminar e] acetato de cobre, luego con soiución acuosa de bicarbonato

de sodio a1 10%y finaimente con agua hasta neutraiidad. La fase orgánica se se­

có y por evaporación de] soivente se obtuvo un jarabe de c010r marrón que se pu­

rificó por cromatografía en coiumna de siiicagei usando tolueno comosoivente de

e1ución. Se aisïó e] compuesto 49 como un sóiido cristaïino (435 mg, 60%) homo­

géneo por ccd (sistema: 2) que se recristaiizó de metano]. P.f. 143-144°C

(Ht.46 :134°c).

IR (cm-1): 174o (c=o).

RMN-lH, ppm: 0,72 (s, 3H, CH3-18), 0,94 (s, 3H, CH3-19), 1,03 (d, J=6Hz, 3H,

CH3-21), 2,03 (s, 6H, CH3C02-), 4,65 (b.a., 1H, H-3), 4,85 (b.a.,

1H, H-7), 4,95 (m, 2H, GHz-23), 5,65 (m, 1H, CH-22).

EM, m/z (%): 370 (M - AcOH, 12), 310 (M - 2Ac0H, 89), 255 (M - 2Ac0H - CL, 100),

213 (M - 2Ac0H- aniilo D, 16), 145 (24).

13RMN- C: ver tabia 10,pág. 123.

157

24-Nor-56-c01-20(22)-eno-3a,7a-di01 gggl.

Método A:

a) Purificación de 1a etilendiamina: se secaron 100 m1de etiiendia­

mina sobre ientejas de hidróxido de potasio durante 24 hs y se destiió recogien­

dose 1a fracción de punto de ebuiiición 116°C. Esta fracción se guardó sobre fi]­

tros moiecuiares de 4 Á hasta ei momentode 1a reacción.

b) Ereparación de] reactivo: 16,9 m1de etiiendiamina se agitaron

en atmósfera de nitrógeno durante 10 minutos y se inyectaron ientamente y con a­

gitación 33 m1 de solución de buti] iitio en hexano (14%).

c) Desarroiio de 1a reacción: a1 reactivo preparado comose indicó

en b) se inyectaron 365 mg (0,85 mmoies) de 1a oiefina 49 disueitos en 1,5 m1 de

benceno anhidro. La mezcia se caientó a reflujo durante 20 minutos, se enfrió,

se diluyó con agua y se destiió a presión reducida para eliminar 1a etilendiami­

na excedente. E1 residuo se disoivió en 50 m1 de éter etiiico y 1a fase orgánica

se iavó con agua (3x50 m1), se secó y se evaporó.

Ta] comose discutió anteriormente, este método no dió e] resuitado espera­

do.

Método B:

a) Purificación de 1a etiiendiamina: se secaron 200 m1de etilendia­

mina sobre lentejas de hidróxido de potasio durante 24 hs y se destiió recogién­

dose 1a fracción de punto de ebuiiición 116°C. Esta fracción se guardó sobre so­

dio a temperatura ambiente durante 48 hs. Después de ese periodo se reflujó 1a

158

mezcla durante una hora recogiéndose sobre sodio la misma fracción de punto de e­

bullición 116°C.Todoel proceso (reflujo, destilación, reposo) se repitió tres

veces. Por último se destiló y se usó de inmediato.

b) Preparación del reactivo: se agitaron 7,9 ml de etilendiamina en

atmósfera de nitrógeno, calentando para mantener la temperatura entre 90 y 110°C.

Se agregaron 234 mg de alambre de litio en porciones pequeñasl Luego de cada agre­

gado la solución se coloreó de azul y después de un breve lapso de tiempo comen­

zó el desprendimiento de hidrógeno. El agregado de las sucesivas porciones de li­

tio se efectuó cuando el burbujeo se habia atenuado, independientemente del color

de la solución. Una vez terminado el agregado y desaparecido el color azul, la

temperatura se mantuvo entre 100 y 110°C durante 2 hs para completar la formación

del reactivo.

c) Desarrollo de la reacción: se calentó la solución anterior a 125­

130°C, se intensificó la corriente de nitrógeno y se agregó 1,2 g de la olefina

envuelta en un sobre de papel de filtro que se abrió adentro del balón con la

ayuda de una varilla. Se agitó durante 15 minutos a la temperatura indicada y

luego se volcó en un vaso con hielo picado. El producto se separó por extracción

con cloruro de metileno, se lavó la fase orgánica con agua hasta neutralidad y

se secó. Por evaporación del solvente se obtuvo un sólido blanco cristalino, ho­

mogéneopor ccd (sistema: 3) que se recristalizó con éter de petróleo para dar

825 mg (35%) de 50 . P.f. 177-178°C (lit.46 :178°C).

IR (cm'l): 3300 (O-H).

159

RMN-lH, ppm: 0,53 (S, 3H, CH3-18), 0,90 (s, 3H, CH3-19), 1,58 (d, J=6Hz, CH3-23),

1,61 (S, 3H, CH3-21), 3,60 (b.a., 1H, H-3), 3,80 (b.a., 1H, H-7),

5,20 (m, lH, CH-22).

RMN-13€:ver tabia 10,pág. 123.

EM, m/z (%): 346 (M, 45), 328 (M - H20, 31), 310 (M - 2H20, 20), 231 (M - H20 ­

aniiio D, 8), 213 (M - 2H20 - anillo D, 20), 87 (100).

- Diacetato de 24-nor-58-c01-20(22)-eno-3a,7a-dioi (EL).

Se disolvieron 500 mg de] compuesto 50 en 10 m1 de anhídrido acético y se

agregó 0,1 m1de ácido ciorhidrico (c). La soiución se calentó a reflujo con agi­

tación durante 1,5 hs y se volcó sobre hieio. Se filtró y secó e] precipitado ob­

tenido. Su recristalización de metano] rindió 560 mg (90%) de] acetato 51 , homo­

géneo por ccd (sistema: 2). P.f.: 130-131°C.

Los valores de Rf en ccd de ios isómeros 49 y 51 coinciden, pero reveiados

los cromatogramas con ácido suifürico y caior, ei isómero 49 da una mancha de

coior rojo 1adri110, mientras que 1a manchacorrespondiente a 51 es de coior ver­

de.

IR (cm‘l): 1745 (c=o).

RMN-lH, ppm: 0,52 (s, 3H, CH3-18), 0,93 (s, 3H, CH3-19), 1,58 (d, J=6Hz, CH3-23),

1,62 (s, 3H, CH3-21), 2,02 (s, 3H, CH3C02-), 2,06 (s, 3H, CH3C02-),

4,55 (b.a., lH, H-3), 4,85 (b.a., lH, H-7), 5,20 (m, 1H, CH-22).

RMN-13o: ver tabïa 10 , pág. 123.

160

EM, m/z (%): 430 (M, 1,3), 370 (M - ACOH, 12), 310 (M - 2Ac0H, 10), 253 (M ­

2Ac0H- anillo D, 17), 43 (100).

- 3a,7a-Diacetoxi-58-pregnan-20-ona (gg).

Método A:

Se disolvieron 500 mg del compuesto 51 en 10 ml de cloruro de me­

tileno (secado previamente sobre filtros moleculares). La solución se enfrió con

una mezcla de hielo y cloruro de sodio hasta alcanzar una temperatura aproximada

de -10°C. Se inició entonces un burbujeo de ozono a través de la solución, con­

tinuándose el mismohasta 5 minutos después de obtener una coloración celeste en

el medio de reacción. Se evaporó el solvente y el jarabe residual se disolvió en

10 ml de acetona. La ruptura del ozónido se efectuó a O°Cagregando reactivo de

Jones gota a gota y con agitación hasta persistencia del color marrón rojizo. La

mezcla se dejó a temperatura ambiente 5 minutos, se diluyó con agua (30 ml) y se

extrajo el producto con cloruro de metileno (2x50 ml). El extracto orgánico se

lavó y secó y se evaporó el solvente. El residuo obtenido se purificó por croma­

tografía en columna de silicagel usando como solvente de elución una mezcla de

tolueno y acetato de etilo (9:1). Se aislaron 385 mg (79%) de la cetona 47 , ho­

mogéneapor ccd (sistema: 4), que se recristalizaron con hexano. P.f. 140-141°C

(lit.100:133-134°C, éter-hexano).

1)IR (cm' : 1745 (C=0, éster), 1705 (C=0, cetona).

RMN-lH, ppm: 0,61 (s, 3H, CH3-18), 0,93 (s, 3H, CH3-19), 2,02 (s, 3H, CH3c02-),

161

2,04 (s, 3H, CH3C02-), 2,10 (s, 3H, CH-21), 4,55 (b.a., lH, H-3),3

4,85 (b.a., 1H, H-7).

13RMN- C: ver tabla 10, pág. 123.

EM, m/z (%): 358 (M - ACOH, 3), 298 (M - 2Ac0H, 5), 283 (M - 2Ac0H - CH 15),3,

255 (M - 2Ac0H - CL, 16), 213 (M - 2Ac0H - anillo D, 15), 43 (100).

Método B:

Se disolvieron 112 mgde] diacetato de 24,24-difeni1-58-cola­

20(22),23-dieno-3a,7a-dioi (46)(ver pág. 163) en 1 m1de ácido acético glacial.

Se enfrió 1a solución a 0°C y se agregaron 73 mg de trióxido de cromo. Se mantu­

vo con agitación a esa temperatura una hora y luego 15 hs a temperatura ambien­

te. E1 exceso de oxidante se e1iminó por agregado de 0,5 m1 de metano]. Se agre­

garon 20 m1 de agua y se extrajo con éter etílico (2x20 m1). E1 extracto orgáni­

co se 1avó, secó y por evaporación de] soivente se obtuvo un residuo que se pu­

rificó por cromatografía en coiumnade silicageï (soïvente de elución: toïueno y

toïueno-acetato de etiïo 95:5). Se obtuvieron 22 mg (28%) de 1a cetona 47 , cuyas

caracteristicas espectroscópicas coincidían con ias de] mismocompuestosinteti­

zado segün e] método A.

- Diacetato de 24,24-difeni1-56-c01-23-eno—3a,7a-di01(gg) y 3a-acetoxi­

24,24-difeni1-58-c01-23-en-7a-01 (gg).

En un baïón de dos bocas se colocaron 7,5 g (47,7 mmoles) de bromobenceno,

1 g (41,6 mmoïes) de magnesio ( previamente desengrasado con éter etílico anhi­

162

dro) y 13 ml de éter etílico anhidro. Se agitó la suspensión en atmósfera de ni­

trógeno y una vez consumido el magnesio, se agregó lentamente una solución de

1,07 g (2,63 mmoles) de 3a,7a-dihidroxi-58-colan-24-oato de metilo (43) en 15 ml

de benceno anhidro, gota a gota desde una ampolla compensadora. Se calentó a re­

flujo durante 3 hs y luego se volcó sobre una mezcla de 10 ml de agua y 7,5 ml

de ácido clorhídrico (c) a 0°C. Se separó la fase orgánica y la acuosa se extra­

jo con éter etílico (2x30 ml). Los extractos orgánicos reunidos se lavaron con

agua hasta neutralidad y se arrastraron con vapor de agua para eliminar el bife­

nilo. El residuo crudo de la destilación se extrajo con éter etílico; la solu­

ción se secó y se evaporó el solvente. El análisis del residuo por ccd (sistema:

7) demostró la presencia de dos compuestos principales, diferentes ambosdel és­

ter de partida. Este residuo se trató con 5 ml de ácido acético glacial y 2,5 ml

de anhídrido acético calentando a reflujo durante 2 hs. La solución se volcó so­

bre 20 ml de agua y se filtró el precipitado marrón obtenido, que posteriormente

se purificó por cromatografía en columnade silicagel (solvente de elución: clo­

ruro de metileno). Se aislaron asi 540 mg (37%) del compuesto 45 y 107 mg (7%)

del compuesto 44.

Datos espectroscópicos correspondientes al compuesto44:

IR (cm'l): 3050-3000 (C-H, aromático), 1730 (C=0), 1600 (C=C).

RMN-lH(60 MHz), ppm: 0,65 (s, 3H, CH3-18), 0,94 (s, 3H, CH3-19), 2,01 (s, 6H,

CH3C02-), 4,60 (b.a., 1H, H-3), 4,90 (b.a., 1H, H-7), 6,15 (m, lH,

163

CH-23), 7,05-7,50 (m, 10H, sistema aromático).

EM, m/z (%): 536 (M - ACOH, 20), 476 (M - 2Ac0H, 4), 461 (M - 2Ac0H - CH3, 3),

315 (M - AcOH - CL, 11), 255 (M - 2Ac0H - CL, 11), 193 (100).

Datos espectroscópicos correspondientes a1 compuesto 45 :

IR (cm-1): 3450 (0-H), 3050-3000 (C-H, aromático), 1730 (C=0), 1600 (C=C).

RMN-lH(60 MHz), ppm: 0,65 (s, 3H, CH3-18), 0,92 (s, 3H, CH3-19), 2,00 (s, 3H,

CH3C02-), 3,80 (b.a., 1H, H-7), 4,55 (b.a., lH, H-3), 6,10 (m, 1H,

CH-23), 7,05-7,50 (m, 10H, sistema aromático).

- Diacetato de 24,24-difeni1-58-c01a-20(22),23-dieno-3a,7a-dio] (gg).

A una solución de 200 mg (0,34 mmoles) de] compuesto 44 en 2,5 m1 de tetra­

cïoruro de carbono, se agregaron 63 mg (0,36 mmoïes) de N-bromosuccinimida. La

mezcïa se calentó a refiujo durante 15 minutos irradiando con una Iámpara de luz

visibïe de 500 Watts. Se enfrió y se filtró 1a succinimida 1ibre. E1 fiïtrado se

11evó a sequedad por evaporación de] soivente y e] residuo obtenido se disoïvió

en 2,5 m] de acetona. Luego de agregar 105 mg de ioduro de potasio, se dejó 48

hs a temperatura ambiente. Se filtró 1a sa] obtenida y en e] fiïtrado se redujo

e] iodo con bisulfito de sodio. Se evaporó e] solvente y e] residuo se purificó

por cromatografía en coiumnade siiicagel (soivente de eiución: benceno-acetona,

10011). Se aislaron 135 mg (68%) de] compuesto 46 , puro por ccd (sistema: 3).

1)_IR (cm_ . 3050-3000 (C-H, aromático), 1735 (C=0), 1600 (C=C).

RMN-lH, ppm: 0,54 (s, 3H, CH3-18), 0,91 (s, 3H, CH3-19), 2,00 (s, 3H, CH3C02-),

164

2,02 (s, 3H, CHC0 -), 4,55 (b.a., lH, H-3), 4,90 (b.a., lH,3 2

H-7), 7,00-7,50 (m, 10H, sistema aromático).

A2 - DEGRADACION DEL 20-CETO PREGNANO AL ACIDO ETIANICO

- 3a,7a,21-Triacetoxi-58-pregnan-20-ona (52).

Se disolvieron 200 mg (0,48 mmoies) de 3a,7u-diacetoxi-SB-pregnan-20-ona

(47) en 8 m1 de benceno anhidro. A 1a solución se agregaron 400 mg (0,90 mmoies)

de tetraacetato de piomo, 0,36 m1 de metano] y 1,12 m1 de eterato de trifiuoruro

de boro y 1a mezcla se mantuvo a temperatura ambiente durante 24 hs. Se volcó

sobre 50 m1 de agua y se extrajo e] producto con c10ruro de metileno (3x30 m1).

E1 extracto orgánico se 1avó con agua hasta neutraiidad y se secó. Por evapora­

ción de] soivente se obtuvo un jarabe que se recristalizó de etanol. Se aisiaron

162 mg (71%) de] compuesto 52 como un sóïido cristalino homogéneo por ccd (sis­

tema: 4). P.f. 156-157°C.

IR (cm-1): 173o (c=o, éster), 1710 (c=o, cetona).

RMN-lH, ppm: 0,66 (s, 3H, CH3-18), 0,94 (s, 3H, CH3-19), 2,04 (s, 3H, CHC0 -),3 2

2,06 (s, 3H, CH3C02-), 2,18 (S, 3H,-CH20COCH3),4,55 (b.a., lH,

H-3), 4,60 (CAB, J=17 Hz, 2H, -CH20C0CH3),4,90 (b.a., lH, H-7).13

RMN- C: ver tabia 10, pág. 123.

EM, m/Z (%): 416 (M - ACOH, 1), 403 (M - ACOH - CH 37), 356 (M - 2ACOH, 4),39

315 (M - ACOH- CL, 6), 296 (M - 3Ac0H, 2), 255 (M - 2Ac0H - CL,

165

100), 213 (M - 2Ac0H - anillo D, 5).

—3a,7a-Dihidroxi-SB-androstan-17B-carboxilato de metilo (ii).

a) Etanólisis de los acetatos de C-3 y C-21:

Se disolvieron 150 mg del com­

puesto 52 en 10 ml de etanol y se agregaron 0,2 ml de ácido sulfúrico (c). La

solución se calentó a reflujo durante 24 hs y se volcó sobre 30 ml de agua. Se

extrajo el producto con acetato de etilo (2x50 ml), el extracto orgánico se la­

vó con agua hasta neutralidad y se secó. Por evaporación del solvente se obtu­

vieron 118 mgde un residuo no cristalino.

b) Ruptura del enlace entre C-20 y C-21:

Se disolvieron 100 mg del jarabe

residual de la reacción anterior en 5 ml de metanol y se agregó una solución de

200 mg de periodato de sodio en 2 ml de agua. La mezcla se agitó a temperatura

ambiente observándose la paulatina aparición de un precipitado blanco cristali­

no. Luego de 3 hs de reacción se volcó sobre agua (50 ml) y se extrajo con ace­

tato de etilo (2x50 ml). El extracto orgánico se lavó con agua (2x30 ml), se se­

có y finalmente se evaporó el solvente obteniéndose 91 mg de producto.

c) gaponificación del acetato de C-7:

Se calentaron a reflujo 90 mgdel ja­

rabe obtenido según se indica en b) con 20 ml de solución de hidróxido de pota­

sio 3%en etanol, durante 4 hs. Se volcó la solución final sobre 30 ml de agua

166

fria (0°C) y se acidificó 1a mezcla por agregado de ácido cïorhidrico (c), gota

a gota. Se extrajo e] producto con acetato de etilo (2x50 mi), se 1av6 e] ex­

tracto con agua hasta neutralidad y se secó. Por evaporación de] solvente se

obtuvo un jarabe que se metiló con 1a técnica antes descripta. E1 producto me­

tilado se purificó por recristaiización con benceno-hexano, aislándose 68 mgde]

compuesto 57 como un sólido bianco cristaïino, que presentaba una soïa mancha

en ccd (sistema: 14). P.f. 149-151°c (lit.101: 152-154°c).

E1 rendimiento de] proceso globai (etanóiisis, ruptura, saponificación) fue

62%.

IR (cm-1): 3400 (0—H), 1735 (c=o).

RMN-lH,ppm: 0,66 (s, 3H, CH3-18), 0,91 (s, 3H, CH3-19), 3,50 (b.a., 1H, H-3),

3,68 (s, 3H, -C02CH3), 3,90 (b.a., 1H, H-7).

RMN-13€: ver tabïa 10, pág. 123.

EM, m/z (Z): 350 (M, 1), 332 (M - H20, 12), 314 (M - 2H20, 100), 299 (M - 2H20 ­

CH3, 85), 273 (M - HZO - CL, 24), 254 (M - 2H20 - HCOZCH 13), 2133’

(M - 2H20 - aniilo D, 57).

167

B -INVERSION DE LA CONFIGURACION DEL CARBONO 3

Bl - INVERSION POR OXIDACION Y REDUCCION

- 3-0xo-56-colan-24 oato de metiio (f2).

Se disolvieron 100 mg de litocolato de metiio (58) en 100 m1 de acetona con

5%de ácido acético. Se enfrió 1a solución a 0°C y se agregó e] reactivo de Jo­

nes gota a gota y con agitación hasta persistencia de] coior marrón rojizo. La

mezcla se mantuvo 5 minutos a temperatura ambiente y iuego de diïuir con 50 m1 de

agua, se extrajo con cioruro de metiieno (2x40 m1). E1 extracto orgánico se 1avó

con agua (30 m1), con solución acuosa de bicarbonato de sodio 5% (30 m1) y fina]­

mente con agua hasta neutraiidad. Por evaporación de] soïvente se obtuvo un re­

siduo que se purificó por cromatografía en coiumna de siiicagei ( solvente de eiu­

ción: cloruro de metiieno ) pues presentaba una pequeña impureza en e] origen. Se

obtuvieron 93,5 mg (94%) de 1a cetona 59 , que se recristaiizaron de etano].

P.f. 98-100°C.

IR (cm-1): 1740 (c=o, éster), 1710 (c=o, cetona).

RMN-lH, ppm: 0,70 (s, 3H, CH3-18), 0,93 (d, J=6Hz, 3H, CH —21), 1,04 (s, 3H,3

CH3-19), 3,69 (s, 3H, -C02CH3).

13RMN- C: ver tabïa 9 , pág.118.

168

- 3a-Acetoxi-58-c01an-24-oato de metilo (¿EDy 3B-acetoxi-58-c01an-24­

oato de metiio (gg).

Se disoivieron 100 mg de] compuesto 59 en 80 m1 de ácido acético y se agre­

garon 4 gotas de ácido ciorhidrico (c) y 30 mg de óxido de p1atino. La mezcla se

hidrogenó a temperatura ambiente y presión atmosférica durante 14 hs. Se filtró

y e] filtrado se voïcó sobre 50 m1 de agua. E1 producto se extrajo con acetato

de etilo (2x50 m1) y e] extracto orgánico se iavó con agua (40 mi), solución a­

cuosa de bicarbonato de sodio 5% (2x40 m1) y agua hasta neutra1idad. Luego de

secario se evaporó e] solvente aislándose 108 mg (97%) de 1a mezcia epimérica de

60 y 61 . Esta mezcia, que resuitó homogéneapor ccd (sistema: 5) se recristaii­

zó de etano]. P.f. 108-118°C.

IR (cm-1): 174o (c=o).

RMN-IH, ppm: 0,66 (s, CH3-18 de 60 y 61), 0,92 (d, J=6Hz, CH —21de 60 y 61 ),3

0,94 (s, CH3-19de 60), 0,98 (s, CH3-19de 61), 2,04 (s, CH3002-),

2,06 (s, CH3C02-), 3,68 (s, -COZCH3),4,70 (b.a., H-3 de 60), 5,40

(b.a., H-3 de 61).

BZ - INVERSION DIRECTA CON AZODICARBOXILATO DE ETILO

- 38-Formi10xi-7a-hidroxi-SB-c01an-24-oato de metilo (ÉED.

Se disolvieron 400 mg (0,99 mmoies) de quenodesoxicoïato de metiio (43) en

12 m1 de tetrahidrofurano anhidro y se agregaron 0,074 mi (1,96 mmoies) de ácido

169

fórmico y 524 mg de trifenilfosfina. Se agitó la mezcla a temperatura ambiente y

se adicionó, con un goteo lento, una solución de 0,45 ml de azodicarboxilato de

etilo en 2 ml de tetrahidrofurano anhidro. El sistema se mantuvo con agitación

durante 14 hs. Por evaporación del tetrahidrofurano a presión reducida se obtuvo

un jarabe que se purificó por cromatografía en columna de silicagel (solvente de

elución: tolueno). Se aislaron 96 mg (20%) de un producto homogéneopor ccd (sis­

tema: 6) que por recristalización de etanol dio p.f. 107-108°C.

IR (cm-1): 3500 (O-H), 1735 (c=0).

RMN-lH, ppm: 0,66 (s, 3H, CH3-18), 0,93 (d, J=6Hz, 3H, CH3-21), 0,97 (s, 3H,

CH3-19), 3,64 (s, 3H, -COZCH3),3,80 (b.a., lH, H-7), 5,25 (b a.,

1H, H-3), 8,05 (s, 1H, HC02-).

B3 - INVERSION POR UNA REACCION DE SUSTITUCION

- 3a-Tosiloxi-SB-colan-24-oato de metilo (gg).

A 150 mg (0,38 mmoles) de litocolato de metilo (58) disueltos en 5 ml de pi­

ridina anhidra, se agregó une solución de 320 mg (1,68 mmoles) de cloruro de

p-toluensulfonilo (recientemente recristalizado) en 2 ml de piridina anhidra. La

mezcla se mantuvo durante una noche a temperatura ambiente y luego se volcó sobre

una solución de 8 ml de ácido clorhídrico (c) en 10 ml de agua a 0°C. Se agitó du­

rante 5 minutos y se extrajo con cloruro de metileno. El extracto orgánico se la­

vó con agua hasta neutralidad y se secó. Por evaporación del solvente se obtuvo

170

un jarabe que se recristaïízó de metano]. Se aisïaron 177 mg (85%) de] compues­

to 67 comoun producto cristaïíno y homogéneopor ccd (sistema: 2).

P.f. 103,5-105°C.

IR (cm‘l): 173o (c=o), 1600 (c=c).

RMN-lH, ppm: 0,62 (s, 3H, CH3-18), 0,88 (s, 3H, CH3-19), 0,89 (d, J=5Hz, 3H,

CH3-21), 2,44 (s, 3H, Cfls-C6H4-), 3,68 (s, 3H, -C02CH , 7,30-7,803)

(m, 4H, sistema aromático).

RMN-13C:ver tabla 9 , pág. 117.

- 3B-Formioni-SB-coïan-24-oato de metilo (gg).

Se disolvieron 100 mg de] compuesto 67 en 5 m1 de N,N-dimetí1formamida y 1a

mezcïa se calentó en un tubo tapado a 76-78°C durante 48 hs. Se volcó 1a soïución

en agua y se extrajo con cïoruro de metíleno (2x30 m1). E1 extracto orgánico se

1avó repetidas veces con agua (8x50m1) y se secó. Por evaporación de] solvente

se obtuvo un residuo que se purificó por cromatografía en pïaca preparativa (sol­

vente de desarroïïo: toïueno-acetato de etiïo 96:4). Se aisïaron 57 mg (74%)de]

compuesto 68 , homogéneo por ccd (sistema: 9).

IR (cm‘l): 1735 (c=0).

RMN-lH, ppm: 0,66 (s, 3H, CH3-18), 0,91 (d, J=6Hz, 3H, CH3-21), 0,98 (s, 3H,

CH3-19), 3,68 (s, 3H, -COZCH3),5,15 (b.a., 1H, H-3), 8,09 (s, lH,

H002-).

RMN-13€: ver tabïa 9 , pág. 117.

171

C - DESHIDRATACION DEL HIDROXILO DE CARBONO 7 E ISOMERIZACION DEL DOBLE

ENLACE FORMADOA LA POSICION 8(14)

- 7a-Hidroxi-3a-meti1succinoxi-SB-co]an-24-oato de metilo (Z9).

A una solución de 260 mg (2,6 mmoies) de anhídrido succinico en 5 m1 de

piridina anhidra, se le agregaron 100 mg (0,25 mmoles) de quenodesoxicolato de

metilo (43). E1 sistema se caïentó a refiujo durante 45 minutos y se voïcó sobre

una solución de 5,5 m1 de ácido cïorhidrico (c) en 15 m1 de agua a 0°C, agi­

tando y macerando periódicamente durante 45 minutos. Se decantó 1a solución y

se disolvió e] sóiido en cioroformo. E1 extracto orgánico se 1avó con agua has­

ta neutraïidad y se secó. Por evaporación de] soivente se obtuvo un jarabe que

se metiló con 1a técnica antes descripta. E1 producto metiïado se recristaïizó

de metano] obteniéndose 93 mg (73%) de] compuesto 70 como un sólido b1anco cris­

talino , homogéneopor ccd (sistema: 7). P.f. 108-110°C

IR (cm-1): 3500 (0-H), 1735 (c=o).

RMN-lH, ppm: 0,65 (s, 3H, CH3-18), 0,90 (s, 3H, CH —19), 2,46 (s, 4H,3

-02CCHZCH2C02-), 3,62 (s, 3H, -C02CH3), 3,65 (s, 3H, -COZCH3),

3,85 (b.a., lH, H-7), 4,60 (b.a., 1H, H-3).

EM, m/z (%): 505 (M - CH3, 1), 502 (M - H20, 1), 388 (M - C H O5 8 20), 373 (M ­4,

C5H804 - CH3, 100), 370 (M - C5H 0 - HZO, 17), 346 (M - H8 4 0 '2

anillo D, 3), 255 (M - C H 0 - H5 8 4 O - CL, 16).2

172

3a-Metilsuccinoxi-58-c01—7-en-24-oato de metilo (gg) y 3a-metilsuccinoxi­

58-c01-8(14)-en-24-0ato de metilo (gg).

Método A:

Se disoivieron 150 mg (0,29 mmoies) de] compuesto 70 en 5 m1 de

acetona anhidra (secada sobre filtros moiecuïares) y se agregaron 210 mg (1,55

mmoies) de cioruro de zinc anhidro (secado por caicinación inmediatamente antes

de ser usado). Una vez mezclados los reactivos, se destiió parte de 1a acetona

hasta obtener un jarabe, se repuso nueva acetona anhidra en e] baión y se con­

tinuó con 1a destiiación. La secuencia de destilaciones y agregados de acetona

a] jarabe se repitió tantas veces comofue necesario hasta comprobar por ccd

(sistema: 5) 1a compïeta desaparición de 70 (para 150 mg de esteroide se nece­

sitan aproximadamentetres destiiaciones). A1jarabe fina], de coior amarilïo

ciaro, se agregaron 4 m1 de solución acuosa de ácido ciorhidrico 10%y se extra­

jo e] producto con cioruro de metiieno (2x50 m1). Se 1avó e] extracto orgánico

con agua hasta neutralidad y se secó. Por evaporación de] soivente se obtuvo un

residuo que se recristaiizó de metano], aislándose 115 mg (79%) de una mezcia

de los compuestos 71 y 72 que se comportó como homogénea por ccd (sistema: 5).

P.f. 86-90°C.

IR (cm'l): 1735 (c=o).

RMN-lH, ppm: 0,54 (s, CH3-18 de 71), 0,82 (s, CH3-19 de 72), 0,84 (s, CH3-18 de

72), 0,93 (d, J=6Hz, 3H, CH3-21), 0,94 (s, CH-19 de 71), 2,57 (S,3

-02CCH2CH2C02-),3,63 (S, -C02CH3), 3,65 (s, -C02CH3), 4,70 (b.a.,

173

H-3), 5,05 (b.a., H-7).

Los isómeros 71 y 72 no se separaron por ccd con varios sistemas de solven­

tes ensayados.

Método B:

Se disolvieron 100 mgde ácido 7a-hidroxi-3a-succinoxi-56-colánico

(70) en 0,5 ml de ácido acético glacial y a la solución incolora se le agregaron

1,5 ml de ácido clorhídrico (c). La suspensión blanca resultante se agitó a tem­

peratura ambiente durante 3 hs y se volcó sobre 25 ml de agua. Se extrajo con

acetato de etilo (2x50 ml), y el extracto orgánico se lavó con agua (3x50 ml) y

se secó. Se evaporó el solvente obteniéndose un residuo en el cual se observó

por ccd (sistema: 8) que la mayor parte del alcohol no habia reaccionado.

- 3a-Metilsuccinoxi-SB-col-8(14)-en-24-oato de metilo (gg).

a) Preparación del reactivo: se agregó ácido sulfúrico (c) gota a gota so­

bre bisulfito de sodio. El dióxido de azufre gaseoso desprendido se secó por pa­

saje sobre ácido sulfúrico (c) y se recogió en un tubo de vidrio refrigerado a

—60°C.Cuando el tubo contenía aproximadamente 3 ml de liquido, se lo cerró a la

llama.

b) Desarrollo de la reacción: en un tubo de vidrio Pyrex de 30 cm de largo,

0,9 cm de diámetro interno y 0,1 cm de espesor, se colocaron 100 mg de la mezcla

aproximadamente equimolecular de las olefinas 71 y 72 , que se obtuvo como pro­

ducto de la reacción de deshidratación con cloruro de zinc (pág. 172). Se enfrió

174

a -60°C el tubo cerrado conteniendo el dióxido de azufre liquido y se abrió. Se

volcó cuidadosamente el dióxido de azufre sobre la mezcla de olefinas contenida

en el otro tubo, enfriado también a -60°C. Se cerró el último tubo a la llama,

se lo colocó en un horno y se elevó la temperatura del mismo hasta 100°C en un

lapso de 40 minutos. Despues de 24 hs de calentamiento, se abrió el tubo a -60°C

trasvasándose la solución final de color marrón a un balón a 25°C donde rápida­

mente se evaporó el dióxido de azufre. Se lavó el tubo con cloruro de metileno

y se juntaron las soluciones de lavado en el balón, evaporándose posteriormente

el solvente. El jarabe residual se purificó por cromatografía en columnade si­

licagel (solvente de elución: cloruro de metileno). Se obtuvieron 75 mg (75%)

del compuesto 72 puro,que luego de una recristalización de etanol tuvo p.f. 128­

130°C.

IR (cm'l): 1735 (c=0).

RMN-lH, ppm: 0,82 (s, 3H, CH3-19), 0,85 (s, 3H, CH3-18), 0,94 (d, J=6Hz, 3H,

CH3-21), 2,58 (s, 4H, -02CCH2CH2C02-), 3,62 (s, 3H, -C02CH , 3,643)

(s, 3H, -C02CH3), 4,75 (b.a., 1H, H-3).

EM, m/z (%): 502 (M, 18), 387 (M - CL, 53), 370 (M - C5H804, 100), 355 (M - CL ­

32, 36), 255 (M - C5H804 - CL, 85).

175

D - OBTENCION DEL 20-CETO PREGNANO A PARTIR DEL ACIDO ETIANICO

- Anhídrido mixto acético y 38-acetoxiandrost-5-en-17B-carboxí1ico (ZZ).

método A:

Se suspendieron 50 mg de ácido 3B-hidroxiandrost-S-en-17B-carboxí­

íico (73) en 5 m1 de anhídrido acético y se agregaron 2 gotas de ácido cíorhí­

drico (c). Se caientó a reflujo durante una hora y se voicó sobre 50 m1 de agua.

Luego de agitar durante 10 minutos, se extrajo e] producto con cíoruro de meti­

]eno (2x40 m1). E1 extracto orgánico se 1avó con agua hasta neutraíidad, se se­

có y posteriormente se evaporó e] soívente. E1 residuo se recristaïizó de ben­

ceno-hexano, aislándose 58 mg (92%) de] compuesto 77 , que resultó homogéneo por

ccd (sistema: 12). P.f. 253-254°C.

IR (cm'l): 1805 y 1750 (c=o, anhídrido), 1735 (c=o, éster).

EM, m/z (%): 342 (M - AcOH, 99), 327 (M - AcOH - CH3, 22), 299 (M - AcOH - CH3C0,

17), 255 (M - AcOH- CL, 17), 43 (100).

Método B:

Se disoivieron 50 mgde ácido 3B-hidroxiandrost-S-en-17B-carboxí]i­

co (73) en 0,5 mi de piridina anhidra y se agregaron 0,5 m1 de anhídrido acético.

La mezcla se mantuvo a temperatura ambiente durante 24 hs y se voícó sobre 10 m1

de solución acuosa de ácido clorhídrico 10%. Luego de 10 minutos de agitación, se

extrajo con cïoruro de metileno (2x40 m1). E1 extracto orgánico se lavó con agua

hasta neutralidad, se secó y se evaporó e] soívente. E1 anáiisis por ccd (sistema

176

12) indicó más de un 50%de conversión de] ácido de partida (73) en e] anhídrido

mixto (77).

- Acido 3B-acetoxiandrost-5-en-17B-carboxi1ico (gg)

Se disoivieron 100 mgde ácido 3B-hidroxiandrost-S-en-17B-carboxi1ico (73)

en 10 m1 de ácido acético a 60°C. La soiución se caïentó a refiujo durante 72 hs

y se volcó sobre agua (50 m1). E1 producto se extrajo con cloruro de metiieno

(2x50 m1) y e] extracto orgánico se 1av6 con agua hasta neutraiidad y se secó.

Por evaporación de] solvente se obtuvieron 95 mg (84%) de] compuesto 74 que re­

suitó puro por ccd (sistema: 12). Se recristaiizó de etano] dando un p.f. 248­

250°C.

IR (cm-1): 3300-2400 (O-H, ácido), 1735 (C=0, éster), 1710 (C=0, ácido).

RMN-lH, ppm: 0,76 (s, 3H, CH3-18), 1,04 (s, 3H, CH3-19), 2,05 (s, 3H, CH3COZ-),

4,68 (b.a., 1H, H-3), 5,45 (m, lH, H-6), 9,90 (b.a., lH, -COZH).

RMN-13c (01300 + MeOD), ppm: 38,0 (c—1), 27,7 (c—2), 74,0 (c—3), 38,0 (c—4),

139,5 (0-5), 122,1 (C-6), 31,8 (c—7o C-8), 32,0 (c—8 o c—7), 49,9

(c-9), 36,9 (C-lO), 20,9 (0-11), 36,6 (c-12), 43,8 (c—13), 56,1

(c—14), 24,5 (c—15), 23,5 (C-16), 55,0 (c—17), 13,1 (C-18), 19,2

(c—19), 177,3 (0-20), 21,3 (983002-), 170,7 (083902—).

EM, m/z (z): 300 (M —Ac0H, 100), 285 (M —AcOH — CH3, 31), 213 (M —AcOH - ani­

110 D, 4).

177

- Cioruro de 3B-acetoxiandrost-S-en-17B-carboxi1iio (Zé).

Se suspendieron 180 mg de] compuesto 74 en 2 m1 de benceno anhidro y seagre­

gó una soïución de 1 m1 de cloruro de oxalilo en 2 m1 de benceno anhidro. Se dejó

tapado a temperatura ambiente y en reposo durante 2 hs. Se destiió a presión re­

ducida hasta sequedad y se compietó e] secado empieando aito vacio.

E1 compuestose utilizó sin posterior purificación.

IR (cm'l): 1795 (C=0, cioruro de ácido), 1735 (C=0, éster).

RMN-lH, ppm: 0,74 (s, 3H, CH3-18), 0,97 (s, 3H, CH -19), 1,97 (s, 3H, CHC02-),3 3

2,81 (t, J=9Hz, 1H, H-17), 4,55 (b.a., 1H, H-3), 5,30 (m, lH, H-6).

EM, m/Z (%): 318 (M - ACOH, 100), 303 (M - ACOH - CH 21), 267 (M - ACOH - CH ­3’ 3

CIH, 9), 255 (M - ACOH- CL, 10).

- 38-Acetoxipregn-S-en-ZO-ona (ai).

Método A:

a) Preparación de] ioduro de metiimagnesio: en un tubo de 20 cm de

iargo y 10 mmde diámetro con un esmeri] macho i 14/26, se colocaron 15 mg (0,63

mmoies) de magnesio (previamente desengrasado con éter etílico) y una barrita mag­

nética. Todo e] conjunto se secó en estufa a 110°C durante una hora. Se tapó e]

tubo con un tapón de iátex y se hizo vacio en su interior mediante una aguja que

atravesaba e] tapón. Una vez retirada 1a aguja, se inyectó 1 m1de éter etiiico

anhidro y 1uego 33 y] (0,53 mmoies) de ioduro de metilo ( secado sobre pentóxido

de fósforo durante 24 hs). Se agitó durante 24 hs a temperatura ambiente obte­

178

niéndose finalmente una solución turbia de color gris claro.

b) Preparación del ioduro manganoso 10¿z se colocaron en un tubo

550 mg de manganeso en polvo y 2,54 g de iodo. Se tapó el balón con un tapón de

látex y se hizo vacio en su interior mediante una aguja. Se inyectaron 10 ml de

éter etílico anhidro y se mantuvo a temperatura ambiente durante 15 hs. Después

de ese periodo se observó la desaparición del color metálico del manganesoy la

formación de un sólido de color rosado. Se inyectó nitrógeno y se extrajo el

éter etílico con una jeringa. Se hizo vacio en el interior del balón y se guar­

dó en la oscuridad.

c) Preparación del ioduro de metilmanganeso: se colocaron 170 mg

(0,55 mmoles) de ioduro manganoso y una barrita magnética en un balón que se ta­

pó con un tapón de látex. Se hizo vacio mediante una aguja y se colocaron 2 ml

de éter etílico anhidro. Se inyectó el reactivo de Grignard preparado según se

indica en a) y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 2 hs. Se diluyó

el reactivo formado con 2 ml de éter etílico anhidro.

d) Desarrollo de la reacción: a la solución recién preparada de

ioduro de metilmanganeso se agregaron 190 mg (0,50 mmoles) de cloruro de 3B-ace­

toxiandrost-S-en-17B-carboxililo (75) disuelto en 2 ml de benceno anhidro. La

mezcla se dejó a temperatura ambiente durante 18 hs y luego se volcó sobre 20 ml

de solución acuosa de ácido clorhídrico (4%). El producto se extrajo con cloro­

formo (2x30 ml) y el extracto se lavó con agua y se secó.

El residuo obtenido al evaporarse el solvente mostró por ccd (sistema: 13)

179

una muy baja conversión en e] compuesto buscado.

Método B:

Se empleó e] equipo que se indica en 1a figura lb de 1a página 74.

a) Preparación de] ioduro de metiimagnesio: se coiocaron 15 mg

(0,63 mmoies) de magnesio (previamente desengrasado con éter etiiico) en e] fon­

do de un tubo kitasato de aproximadamente 10 m1 de capacidad con un esmeri] I 10/

30. Se agregó una barrita magnética en e] interior de] tubo y se secó e] conjun­

to en una estufa a 110°C durante una hora.

A] mismo tratamiento de secado se sometió un tubo de vidrio de 20 cm de 1ar­

go y 10 mmde diámetro con esmeri] ï 14/26 (simiiar a los tubos en Ios que viene

envasado e] ioduro de metiio radiactivo), un adaptador de esmeri] ï 14/26 a i 10/

30 y una barrita magnética. Una vez que se compietó e] secado se siiiconaron los

esmeriles y se armó e] equipo como se indica en 1a figura 1b . En este equipo e]

diámetro de 1a barrita magnética superior es 1igeramente mayor que e] diámetro

interno de] esmeri] I 10/30. Ademáse] magnesio queda adentro de] tubo kitasato.

Se hizo vacio en e] interior de] equipo mediante una aguja que atravesaba

e] tapón de Ïátex de 1a salida iaterai de] tubo kitasato. Una vez retirada 1a a­

guja se inyectó a través de] mismo tapón una solución de 35 u] (0,56 mmoies) de

ioduro de metiio (secado sobre pentóxido de fósforo durante 24 hs) disuelto en

1 m1de éter etílico anhidro (destiiado sobre sodio e hidruro de iitio y a1umi­

nio inmediatamente antes de ser usado).

La mezcla se agitó durante una hora a temperatura ambiente.

180

b) Preparación de] dimetiicadmio: en un ambiente de nitrógeno an­

hidro, se destapó e] tubo kitasato y se colocó en 1a boca de] mismo un embudo

pequeño con esmeri] í 10/30. Se voicaron dentro de] tubo 220 mg (1,21 mmoies)

de cioruro de cadmio finamente puiverizado y secado en estufa a 110°C durante

24 hs. Se tapó ei tubo con un tapón con esmeri] I 10/30 siiiconado y se agitó

2 hs a temperatura ambiente.

c) Desarroiio de 1a reacción: se disoivieron 190 mg (0,50 mmoies)

de cioruro de 3B-acetoxiandrost-S-en-17B-carboxi1iio (75) en 2 m1 de benceno ag

hidro. La solución se inyectó en e] tubo kitasato a través de] tapón de látex

de su saiida Iaterai. La suspensión resuitante se agitó 18 hs a temperatura am­

biente y 1uego se caientó cuidadosamente a 50°C durante una hora.

Se sacó ei tapón de vidrio y se agregaron,gota a gota y enfriando, 0,5 m1

de ácido ciorhidrico (c) y 1uego 2 m1 de agua.

Se extrajo e] producto con cioruro de metiieno (2x20 m1) y se 1avó 1a fase

orgánica con agua hasta neutralidad, se secó y se evaporó a sequedad. E1 resi­

duo se purificó por cromatografía en columna de silicagei eiuyendo con ciorofor

mo. Se obtuvieron 70 mg (39%) del compuesto 76, homogéneo por ccd (sistema: 13).

Recristaiizado de etano1 dio p.f. 147-149°C.

IR (cm'l): 1735 (c=o, éster), 1705 (c=o, cetona), 1240 (c-o).

RMN-IH, ppm: 0,64 (s, 3H, CH3-18), 1,03 (s, 3H, CH3-19), 2,03 (s, 3H, CH3C02-),

2,14 (s, 3H, CH3-21), 4,60 (b.a., 1H, H-3), 5,42 (m, 1H, H-6).

EM, m/z (%): 298 (M - ACOH, 100), 283 (M - ACOH - CH 30).3’

181

E - SINTESIS TOTALDE I21-14C173B-HIDR0XI-58-PREGN-8(14)—EN-20-0NA

E1 - DEGRADACION DE LA CADENA LATERAL DEL ACIDO BILIAR AL ACIDO ETIANICO

Los compuestos correspondientes a esta primera etapa de 1a sintesis son 1os

que se indican a continuación y su preparación ya se detaiió previamente.

- Acido 3a,7a-diacetoxi-SB-colan-24-oico (48): método D, pág.155.

Diacetato de 24-nor-SB-c01-22-eno-3a,7a-di01 (49): pág.155.

24-Nor-58-c01-20(22)-eno-3a,7a-d101 (50): pág.157.

Diacetato de 24-nor-SB-c01-20(22)-eno-3a,7a-dio] (51): pág.159.

- 3a,7a-Diacetoxi-SB-pregnan-20-ona (47): método A, pág.160.

3a,7a,21-Triacetoxi-58-pregnan-20-ona (52): pág.164.

3a,7a-Dihidroxi-58-androstán-17B-carboxiIato de metilo (57): pág.165.

E2 - DESHIDRATACION DEL HIDROXILO DE CARBONO 7 E ISOMERIZACION DEL DOBLE

ENLACE FORMADOA LA POSICION 8(14)

- 7a-Hidroxi-3a-meti1succinoxi-53-androstan-17B-carboxi1ato de metiïo (gg).

Se disoivieron 220 mg de anhídrido succinico en 5 m1 de piridina anhidra y

a 1a soiución se agregaron 100 mg de 3a,7a-dihidroxi-SB-androstan-17B-carboxi13

to de metiïo (57). La mezcia se caientó a refiujo durante una hora y se volcó

sobre 20 m1 de soiución acuosa de ácido ciorhidrico 15%. Luego de 10 minutos de

agitación a temperatura ambiente, se extrajo e] producto con acetato de etiio

(3x50 m1). La fase orgánica se 1avó con agua hasta neutraiidad y se secó. Por

182

evaporación de] soivente se obtuvo un residuo que se suspendió en metano] y se

metiió con diazometano según 1a técnica antes descripta. E1 jarabe fina] se pu­

rificó por cromatografía en coiumnade siiicagei (soivente de e1ución: ciorofog

mo y cioroformo-etanoi 95:5). Se obtuvieron 99 mg (75%) de] compuesto 78, cris­

talino y homogéneopor ccd (sistema: 7). Se reCristaiizó de etano] resuitando

ser sumamentehigroscópico. P.f. 118-119°C.

IR (cm-1): 3400 (O-H), 1735 (c=o).

RMN-lH, ppm: 0,66 (s, 3H, CH3-18), 0,93 (s, 3H, CH3-19), 2,62 (s, 4H,

-02CCH2CH2C02-), 3,70 (s, 3H, -C02CH3), 3,72 (s, 3H, -C02CH3),

3,88 (b.a., lH, H-7), 4,60 (b.a., 1H, H-3).

RMN-13€: ver tabia 10, pág 124.

EM, m/z (%): 332 (M - C5H804, 15), 314 (M - C5H804 - H20, 100), 300 (M - C5H804­

CH30H, 7), 299 (M - C5H804 - H20 - CH3, 82), 255 (M - C5H804 ­

HZO - CL, 33), 254 (M - C5H804 - HZO - HCO CH 6).2 3’

- 3u-Meti1succinoxi-SB-androst-8(14)-en-17B-carboxi1ato de metiio (gg) x

3a-meti1succinoxi-SB-androst-7-en-17B-carboxi1ato de metiio (¿2).

Se disoivieron 100 mg de] compuesto 78 en 10 m1 de acetona anhidra (secada

sobre filtros moieculares). Se agregaron 400 mgde cioruro de zinc anhidro (fun

dido justo antes de ser usado) y 1a soiución resuitante se destiló hasta obtener

un jarabe (sin Iievar a sequedad). Se repusieron 10 m1 de acetona anhidra y se

volvió a destilar. E1 proceso se repitió 3 veces a1 cabo de ias cuaies, después

183

de reponer 10 m1 de acetona, se agregaron 400 mg de cioruro de zinc anhidro. La

secuencia de agregado de acetona y destiiación se repitió 5 veces más. E1 jara­

be amariiio fina] se trató con 10 m1 de soiución acuosa de ácido ciorhidrico

15%y e] producto se extrajo con acetato de etiio (2x50 m1). E1 extracto orgá­

nico se 1avó con agua hasta neutralidad y iuego de secario se destiió e] soiveg

te. E1 residuo se suspendió en metano] y se metiió con diazometano según 1a tég

nica descripta previamente. E1 esteroide metiiado se purificó por cromatografía

en coiumnade siiicagei (solvente de eiución: toiueno-acetato de etiio 9:1). Se

aislaron 77 mg (80%) de una mezcia de ias oiefinas 79 y 80 que no se pudo sepa­

rar por ccd.

Es conveniente seguir e] desarroilo de 1a reacción por ccd pues e] número

de secuencias de agregado de acetona y destiiación puede variar.

IR (cm-1): 1735 (c=o).

RMN-lH, ppm: 0,54 (s, CH3-18 de 79), 0,82 (s, CH3-19 de 80), 0,84 (s, CH3-18 de

80). 0,93 (S, CH3-19 de 79), 2,60 (s, -02CCH2CH2C02-),3,69 (s,

-C02CH3), 3,71 (s, -C02CH3),4,60 (b.a., H-3), 5,10 (b.a., H-7).

- 3a-Meti1succinoxi-SB-androst-8(14)-en-17B-carboxi1ato de metilo (gg).

a) Separación de 1a mezcia de oiefinas 79 v 80.

La mezcia de ias oiefinas 79 y 80 obtenida como resuitado de 1a reacción

de deshidratación con cioruro de zinc se separó por cromatografía iiquida de a1­

ta resolución utiiizando comosolvente metanoi-agua (9:1). Se empieó un fiujo de

184

3 mi/min y una presión de 16 Kpsi. Se coiectó e] compuesto 79 a ios 12,5 minu­

tos y e] compuesto 80 a ios 14 minutos.

b) Isomerización dei compuesto 79.

Se coiocaron 50 mg de] compuesto 79 en un tubo de vidrio Pyrex de 30 cm de

1argo y 0,1 cm de espesor enfriado a -10°C. Sobre e] sóiido se voïcaron 2 m1 de

dióxido de azufre a esa misma temperatura, preparado segün se indica en 1a pági

na 173. E1 tubo se cerró y se coiocó en un horno a temperatura ambiente. Luego

de 10 minutos se calentó e] horno ientamente hasta 100°C y se 10 mantuvo asi du

rante 36 hs. Se enfrió 1entamente 1a mezcia hasta -10°C, se abrió e] tubo y se

voicó su contenido en un baión donde rápidamente se evaporó e] exceso de reacti

vo. Se 1av6 e] tubo con cioroformo y las soiuciones de 1avado se juntaron en ei

baión. Se evaporó e] soivente y e] jarabe residuai se purificó por cromatogra­

fia en coiumna de siiicagei (soivente de eiución: toiueno—acetato de etiio 9:1).

Se obtuvieron 34 mg (68%) de 1a oiefina 80 que resuitó homogénea por ccd (sis­

tema: 10).

Las caracteristicas espectroscópicas y e] punto de fusión de los productos ais­

lados por ambos procedimientos eran ios mismos.

1IR (cm’ ): 1735 (c=o).

RMN-lH, ppm: 0,82 (s, 3H, CH3-19), 0,84 (s, 3H, CH3-19), 2,62 (s, 4H,

-02CCH2CH2C02-),3,69 (s, 3H, -c02cn3), 3,71 (s, 3H, -c020H3),

4,75 (b a., 1H, H-3).

185

RMN-13€:ver tabia 10, pág.124.

EM, m/Z (%): 446 (M, 3), 415 (M - CH30H, 3), 314 (M - C5H804, 96), 299 (M ­

C5H804 - CH3, 81), 255 (M - C5H804 - CL, 16), 57 (100).

- 3a-Hidroxi-58-androst-8(14)-en-17B-carboxilato de metiio (g¿).

Una mezcia de 100 mg de] compuesto 80 y 50 m1 de soiución de hidróxido de

potasio en etano] (2%) se caientó a refiujo durante 6 hs. Luego se voicó sobre

20 m1 de soiución acuosa de ácido cïorhidrico 20%y se extrajo e] producto con

acetato de etiio (3x50 m1). E1 extracto orgánico se 1av6 con agua hasta neutra­

lidad y se secó. Por evaporación de] soivente se aisió un residuo que se suspen

dió en 10 m1 de metano] y se metiió con diazometano segün 1a técnica descripta.

E1 sólido resuitante se purificó por ccd preparativa de siiicagei (solvente de

desarroiio: cioruro de metiieno-metanoi 98:2). Se obtuvieron 65 mg (87%) de]

compuesto 81, que resuitó homogéneopor ccd (sistema: 11). Por recristaiización

de metano] dio p.f. 126-127°C.

IR (cm'l): 3400 (O-H), 1735 (c=o).

RMN-IH,ppm: 0,81 (s, 3H, CH3-19), 0,83 (s, 3H, CH3-18), 3,60 (b.a., 1H, H-3),

3,69(S,3H,13

RMN- C: ver tabia 10, pág. 124.

EM, m/z (%): 332 (M, 20), 314 (M - H20, 100), 299 (M - H 0 - CH 91), 255 (M ­2 3’

HZO - CL. 10), 254 (M - H20 - HCOZCH 7).39

186

E3 - INVERSION DE LA CONFIGURACION DEL CARBONO 3.

- 3a-Tosi10xi-58—androst-8(14)-en-17B-carboxi1ato de metiio (gg).

Se disoivieron 50 mg de] compuesto 81 en 5 m1 de piridina anhidra y se agrg

garon 110 mgde cioruro de p-toluensuifoni1o (recientemente recristaïizado). La

soiución se mantuvoatemperatura ambiente durante 24 hs y 1uego se voïcó sobre

15 m1 de so]uci6n acuosa de ácido ciorhidrico 18%. E1 producto se extrajo con

cioroformo y 1a fase ciorofórmica se iavó con agua hasta neutralidad, se secó y

se destiió e] so1vente. E1 residuo se purificó por ccd preparativa (so1vente de

desarroiio: cioruro de metiieno). Se obtuvieron 54 mg (74%) de] compuesto 82

con p.f. 56-58°C

IR (cm-1): 173o (c=0), 1600 (c=c).

RMN-IH, ppm: 0,78 (s, 3H, CH3-19), 0,83 (s, 3H, CH3-18), 2,46 (s, 3H, Cfi3-CGH4-),

3,69 (s, 3H, -COZCH3),4,50 (b.a., 1H, H-3), 7,25-7,85 (m, 4H, sis­

tema aromático).

13RMN- C: ver tabia 10, pág. 124.

EM, m/Z (%): 314 (M - TSOH, 2), 43 (100).

- 3B-Formiioxi-SB-androst-8(14)-en-17B-carboxi1ato de metiio (gg).

Se disoivieron 50 mg de] compuesto 82 en 2,5 m1 de N,N-dimeti1formamida.

La soiución se mantuvo en un ba16n tapado a 75-76°C durante 50 hs. Se agregaron

25 m1 de agua y se extrajo e] producto con cloruro de metileno (2x50 m1). E1 e5

tracto orgánico se 1avó repetidas veces con agua (10x20 m1) y se secó. Por eva­

187

poración de] so1vente se obtuvo un jarabe que se recristaïizó de metano]. Se ai;

1aron 23,3 mg (63%) de] compuesto 83 como un só]ido cristaïino, homogéneo por

ccd (sistema: 5) de p.f. 150-152°C.

IR (cm'l): 173o (C=0).

RMN-lH, ppm: 0,86 (s, 6H, CH3-18 y CH3-19), 3,69 (s, 3H, -602CH3), 5,25 (b.a.,

1H, H-3), 8,07 (s, 1H, HC02-).

13 . ,RMN- C. ver tabïa 10, pag. 125.

EM, m/z (%): 360 (M, 82), 345 (M - CH3, 27), 314 (M - HCOZH, 73), 299 (M - CH ­3

HCOZH, 46), 255 (M - HC02H - CL, 11), 147 (100).

E4 - OBTENCION DEL 20-CETO PREGNANO A PARTIR DEL ACIDO ETIANICO

- Acido 3B-hidroxi-SB—androst-8(14)—en-17B-carboxï1ico (gg).

Se disoïvíeron 20 mg de] compuesto 83 en 20 m1 de so1uci6n de hidróxido de

potasio en etano] (2%). La soïución se caïentó a refïujo durante 2 hs y 1uego

se vo1có sobre 10 m1 de so]ución acuosa de ácido cïorhídríco 20%. E1 producto

se extrajo con acetato de eti1o (3x20 m1) y e] extracto orgánico se 1av6 con

agua hasta neutra1idad y se secó. Después de evaporar e] soïvente se aisïaron

17 mg (96%) de] compuesto 84 como un sólido cristaïino que se usó sin purifica

ción previa.

-1IR (cm ): 3500-2700 (O-H, ácido), 3300 (O-H, a1coh01), 1715 (C=0).

188

- Acido 3B-acetoxi-SB-androst-8(14)-en-17B-carboxi1ico (gg).

Se aceti1aron 16,5 mg de] compuesto 84 con 1a misma técnica indicada en 1a

página 176 para e] ácido 38-hidroxiandrost-S-en-17B-carboxi1ico (73). Se aisla­

ron 15,5 mg (83%) de] compuesto 85, homogéneo por ccd (sistema: 1), que se usó

sin purificar.

1IR (cm- ): 3400-2600 (0-H, ácido), 1730 (C=0, éster), 1715 (C=0, ácido).

RMN-lH,ppm: 0,83 (s, 3H, CH3-18), 0,85 (s, 3H, CH3-19), 2,06 (s, 3H, cn3c02-),

5,10 (b.a., lH, H-3).

- 121-14CI 3B-Acetoxi-58-pregn-8(14)-en-20-ona (g_).

a) Obtención de] cioruro de ácido.

Se suspendieron 15 mg de] ácido 85 en 0,5 m1 de benceno anhidro y se agre­

garon 0,5 m1 de cïoruro de oxaiilo. La solución resultante se dejó tapada y a

temperatura ambiente durante 2 hs. Se evaporó e] so]vente y se usó sin previa

purificación.

1)IR (cm' : 1790 (C=0, cïoruro de ácido), 1730 (C=0, éster).

b) Obtención de] 20-ceto pregnano.

Se empleó e] método B de 1a página 179 con 1as siguientes modificaciones.

E1 equipo empieado es e] que se indica en 1a figura 1a, con un tubo invertido

que contenía en su interior (protegido por un cierre de vidrio) 1 mCi de |14CI

ioduro de metilo de actividad especifica 58 mCi/mmo].

189

bl) Preparación de] ioduro de meti1magnesio radiactivo.

Se usaron 2 mg (0,08 mmo1es) de magnesio.

Una vez armado e] equipo y hecho vacio en su interior, se inyectó una so­

1ución de 1,7u1 (0,027 mmoies) de ioduro de metiio anhidro (secado sobre pen­

tóxido de fósforo) en 0,3 m1 de éter anhidro (secado sobre sodio e hidruro de

1itio y aiuminio y usado inmediatamente después de su destiiación).

La mezcia se agitó durante 45 minutos (1a reacción demoró aproximadamente

20 minutos en comenzar) y 1uego se enfrió sumergiendo e] fondo de] tubo kitasa­

to en aire 1iquido. Con ayuda de un imán externo, se movió 1a barrita magnética

ubicada en 1a parte superior de] equipo, goipeando ei cierre de vidrio hasta

romperlo. Mientras se mantenia congeiado e] fondo de] tubo kitasato, se fiameó

con una micr011ama e] tubo invertido durante 15 minutos para faci1itar e] con­

tacto de 0,017 mmo1esde ioduro de metilo radiactivo con e] medio de reacción.

Se retiró e] baño de aire 1iquido y se dejó que e] sistema aïcanzara 1a tempe­

ratura ambiente. Se continuó con 1a agitación durante una hora.

b2) Preparación de] dimetiicadmio radiactivo.

Se repitió e] procedimiento empïeado en e] método B parte b (pág.180 ) pero

con 18 mg (0,1 mmoi) de cioruro de cadmio.

b3) Reacción de] dimeti1cadmio radiactivo con e] cioruro de ácido.

Se ap1icó e] método B parte c (pág.180 ) pero usando 15 mg (0,04 mmoïes)

dei cioruro de 3B-acetoxi-SB-androst-8(14)-en-17B-carboxi1iio en 1ugar de] com­

190

puesto 75.

E1 producto fina] obtenido se purificó por ccd preparativa usando siiica­

ge] comoadsorbente (soivente de desarroiio: cioroformo-hexano 98:2). Se aisia

ron 5,05 mg (36%) de] compuesto 86 como un sóiido cristaïino homogéneo por ccd

(sistemas: 4, 5, 13 y 15).

Actividad especifica de] producto crudo: 1,97x107 dpm/mg.

Actividad especifica de] producto purificado: 2,25x107 dpm/mgo 8,05x109 dpm/

mmo] o 3,66 mCi/mmo].

IR (cm'1 ): 1735 (C=0, éster), 1710 (C=0, cetona).

RMN-lH, ppm: 0,80 (S, 3H, CH3-18), 0,86 (S, 3H, CH3-19), 2,04 (S, 3H, CH3C02-),

2,12 (s, 3H, CH3-21), 5,10 (b.a., 1H, H-3).

- 121-14cl 3B-Hidroxi-58-pregn-8(14)-en-20-ona (gg).

Se disoïvieron 4,9 mg de] compuesto 86 en 10.m1 de etano] y se agregaron

3 gotas de ácido sulfúrico (c). La mezcia se refiujó durante 24 hs y se voicó

sobre 30 m1 de agua. E1 producto se extrajo con acetato de etiio (3x30 m1) y

se 1av6 e] extracto orgánico con agua hasta neutralidad. Después de secario, se

evaporó e] soivente. E1 residuo se purificó por ccd preparativa usando siiica­

ge] comoadsorbente (soivente de desarroiio: cioroformo-etanoi 99:1). Se ob­

tuvieron 2,49 mg (58%) del compuesto 87 homogéneo por ccd (sistemas: 3 y 4).

P.f. 118-120°C (1it. 43 : 123°c).

Actividad especifica del producto purificado: 2,54x107 dpm/mgo 8.02x109 dpm/mmo].

191

IR (cm'l): 3350 (O-H), 1710 (c=o).

RMN-IH, ppm: 0,80 (s, 3H, CH -18), 0,83 (S, 3H, CH-19), 2,16 (s, 3H, CH-21),3 3 3

4,20 (b.a., 1H, H-3).

192

F - SINTESIS TOTAL DE |21-14CI 3B-HIDROXI-SB-PREGNAN-ZO-ONA

F1 - DEGRADACION DE LA CADENA LATERAL DEL ACIDO BILIAR AL ACIDO ETIANICO.

- Acido 3a-acetoxi-58-coian-24-oico (g_).

Se disoivieron 500 mg de ácido Titocóiico (42) en 3 m1 de piridina anhi­

dra y se agregaron 3 m1 de anhídrido acético. La soiución se dejó 24 hs a tem­

peratura ambiente y se voicó sobre ácido ciorhidrico acuoso (6 m1 de HC] (c)

en 40 m1 de agua). E1 producto se extrajo con acetato de etiïo (3x50 m1), se

Tavó e] extracto orgánico con agua hasta neutraïidad y se secó. Por evapora­

ción de] soivente se obtuvieron 560 mg de un producto puro por ccd (sistema:

12), que recristaiizado de etanol dio p.f. 165-166°C(Tit 103: 169°C).

-1)IR (cm : 3400-2700 (O-H), 1735 (C=O, éster), 1710 (C=0, ácido).

- Acetato de 24-nor-58-c01-22-en-3a-01 (gg).

Se trataron 800 mg (1,9 mmoles) de] ácido 88 con 2,4 g (5,4 mmoïes) de te­

traacetato de piomo en ias condiciones indicadas para e] compuesto 48 (pág.155 L

E1 extracto crudo resultante se purificó por cromatografía en coiumna de

siiicagei (soivente de e1uci6n: toiueno). Se obtuvieron 450 mg (63%) de] com­

puesto 89, homogéneopor ccd (sistema: 9). E1 producto recristaTizado de metano]

dio p.f. 83,5-85°C.

IR (cm-1): 173o (c=o).

RMN-lH, ppm: 0,68 (s, 3H, CH3-18), 0,94 (s, 3H, CH3-19), 1,03 (d, J=6Hz, 3H,

193

CH3-21), 2,04 (s, 3H, CH3C02-), 4,75 (b.a., lH, H-3), 4,90 (m, 2H,

CH2-23), 5,70 (m, 1H, CH-22).

EM, m/z (%): 372 (M, 2), 357 (M - CH3, 4), 317 (M - CL, 3), 312 (M - ACOH, 38),

297 (M - ACOH - CH 13), 257 (M - ACOH - CL, 100).3,

- 24-Nor-SB-c01-20(22)-en-3a-01 (g_).

a) Purificación de 1a eti1endiamina: se reaïizó con e] mismoprocedimiento

indicado en e] método B de 1a página 157.

b) Preparación de] reactivo: se hicieron reaccionar 334 mgde alambre de

litio con 11 m1 de etiiendiamina en 1a misma forma que se indica en 1a página

158.

c) Desarroiio de 1a reacción: se trataron 1,50 g de] compuesto 89 con e]

reactivo preparado según b) en 1as mismas condiciones señaladas en e] método B

de 1a página 158.

E1 sólido cristalino resuïtante se recristalizó de una mezcïa de etanol­

agua obteniéndose 1,17 g (88%) de] compuesto 90 que resultó homogéneo por ccd

(sistema: 6). P.f. 114-115°C.

IR (cm-1): 3300 (O-H).

RMN-lH, ppm: 0,52 (s, 3H, CH3-18), 0,93 (s, 3H, CH3-19), 1,58 (d, J=5Hz, 3H,

CH3-23), 1,62 (s, 3H, CH3-21), 3,65 (b.a., 1H, H-3), 5,25 (b.a.,

lH, CH-22).

194

EM, m/z (%): 330 (M, 14), 312 (M - H20, 2), 257 (M - H20 - CL, 4).

- Acetato de 24-nor-58-coi-20(22)-en-3a-oi (g¿).

Se disoivieron 500 mg del aicohoi 90 en 10 m1 de una mezcia de anhídrido

acético y piridina (1:1). E1 sistema se dejó a temperatura ambiente durante 24

hs y se voicó sobre 15 m1 de soiución acuosa de ácido ciorhidrico 20%. La mez­

cia se agitó durante 15 minutos y se extrajo con cioruro de metiieno (3x50 mi).

El extracto orgánico se 1avó con agua hasta neutralidad y se secó. Por evapora­

ción de] soivente se obtuvo un residuo que se recristaiizó de etanoi. Se aisla­

iaron 490 mg (87%) de] acetato 91, homogéneo por ccd (sistema: 9) y de p.f.

104-105°C.

IR (cm'l): 174o (c=o).

RMN-lH, ppm: 0,52 (s, 3H, CH3-18), 0,94 (s, 3H, CH3-19), 1,58 (d, J=6Hz, 3H,

CH3-23), 1,62 (s, 3H, CH3-21), 2,04 (S, 3H, CH3C02-), 4,70 (b.a.,

lH, H-3), 5,25 (m, 1H, CH-22).

EM, m/Z (Z): 372 (M, 77), 357 (M - CH3, 3), 312 (M - ACOH, 64), 297 (M - ACOH­

CH3, 97), 257 (M - ACOH- CL, 21), 82 (100).

- 3a-Acetoxi-585pregnan-20-ona (gg).

Se ozonoiizaron 500 mg de 1a oiefina 91 en ias mismas condiciones que se

indicaron para e] compuesto 51 (pág. 160).

195

E1 residuo fina] se purificó por cromatografía en coiumna de siiicagei

(soivente de eiución: toiueno-acetato de etiio 9:1). Se aisiaron 385 mg (80%)

de] compuesto 92 homogéneopor ccd (sistema: 5). P.f. 101-102°C (Iit.104 :101­

102°C).

IR (cm-1): 1740 (c=o, éster), 1705 (c=o, cetona).

RMN-lH, ppm: 0,61 (s, 3H, CH3-18), 0,95 (s, 3H, CH3-19), 2,04 (s, 3H, CH3C02-),

2,12 (s, 3H, CH3-21), 4,65 (b.a., 1H, H-3).

RMN-13€: ver tabla 9 , pág. 118.

EM, m/z (%): 360 (M, 1), 300 (M - ACOH, 67), 285‘(M - ACOH- CH3, 14), 257 (M ­

ACOH- CL, 11), 43 (100).

- 3a,21-Diacetoxi-SB-gregngg:20-ona (_g).

Se disoivieron 700 mg (1,94 mmoles) de] compuesto 92 en 30 m1 de benceno y

a 1a soiución se agregaron 1,6 g (3,64 mmoies) de tetraacetato de piomo, 1,4 m1

de metano] y 4,5 m1 de eterato de trifiuoruro de boro. La mezcla se trató con

e] mismo procedimiento que se indica en 1a página 164 para e] compuesto 47. E1

producto se extrajo con cioruro de metiieno y e] extracto orgánico se 1av6 con

agua hasta neutraiidad, se secó y se evaporó e] soivente. E1 residuo finai se

purificó por recristaiización de etano] obteniéndose 600 mg (73%) dei diacetato

93 comoun sóiido cristaiino homogéneopor ccd (sistema: 5). P.f. 95-96°C

(iit.1°4 : 97-98°C).

1IR (cm' ): 1740 (C=0, éster), 1710 (C=0, cetona).

196

RMN-lH, ppm: 0,64 (S, 3H, CH3-18), 0,94 (s, 3H, CH3-19), 2,04 (S, 3H, CH3COZ-),

2,18 (s, 3H, -CH20cocu3), 4,60 (CAB, J=20Hz, 2H, -CEZOCOCH3),4,65

(b.a., 1H, H-3).

13 ,RMN- C: ver tabia 9 , pag. 119.

EM, m/z (Z): 358 (M - ACOH, 4), 345 (M - CHZOCOCH3, 70), 343 (M - ACOH - CH3,

1), 257 (M - ACOH- CL, 93), 75 (100).

- 3a,21-Dihidroxi-SB-pregnagf20-ona (gg).

Se trataron 400 mg de] compuesto 93 en ias mismas condiciones de hidróii­

sis y extracción de] compuesto 52 indicadas en 1a parte a)de 1a página 165. E1

producto crudo se purificó por cromatografía en coiumnade siiicage] (soivente

de e1uci6n: cioruro de metiieno-metanoi 95:5). Se obtuvieron 230 mg (72%) de]

compuesto 94 como un producto cristalino y homogéneopor ccd (sistema: 7). P.f.

130-132°C (1it.104: 152,5-153,5°C).

1IR (cm_ ): 3300 (0-H), 1705 (C=0).

RMN-lH, ppm: 0,62 (S, 3H, CH3-18), 0,93 (S, 3H, CH3-19), 3,65 (b.a., 1H, H-3),

4,18 (b.a., 2H, —c520H).

RMN-13€: ver tabia 9 , pág. 119.

EM, m/Z (%): 334 (M, 1), 316 (M - H20, 1), 303 (M - CHZOH, 95), 301 (M - H20 ­

CH3, 2), 257 (M - H 0 - CL, 100).2

197

- 3a-Hidroxi-53-androstan-17B-carboxi1ato de metilo (gg).

Se trató 1,0 g (3,0 mmoies) de 1a a-hidroxicetona 94 con 2,0 g (9,3 mmoies)

de periodato de sodio de acuerdo con e] procedimiento indicado en 1a página 165.

parte b. Se aisió un sóiido que se metiió según 1a técnica descripta previamen­

te. Se obtuvieron 213 mg (91%) de] éster 95 que se recristaiizó de metano].

P.f. 144-147°C (Ht.105 : 142-146°C).

IR (cm-1): 3300 (O-H), 174o (C=0).

RMN-lH,ppm: 0,65 (s, 3H, CH3-18), 0,93 (s, 3H, CH-19), 3,60 (b.a., 1H, H-3),3

3,68 (s, 3H, -C02CH3).

RMN-13€:ver tab1a 9 , pág.120.

EM, m/z (Z): 316 (M - H20, 2), 302 (M - CH30H, 100), 287 (M - CH30H - CH 70),3’

275 (M - CL, 4), 257 (M - CL - H20, 4).

F2 - INVERSION DE LA CONFIGURACION DEL CARBONO 3.

- 3a-Tosiioxi-SB-androstan-17B-carboxi1ato de metilo (gg).

Se tosiiaron 140 mg de] éster 95 según 1a técnica descripta para e] compueg

to 81 en 1a página 186. E1 residuo se purificó por cromatografía en coiumna de

siiicagei (soivente de e1ución: cioroformo). Se obtuvieron 194 mg (95%) dei pro­

ducto buscado (96) que se recristalizó de metano] dando un p.f. 120-121°C.

1)IR (cm- : 1735 (C=0), 1600 (C=C).

RMN-lH, ppm: 0,64 (s, 3H, CH3-18), 0,91 (s, 3H, CH3-19), 2,46 (s, 3H, Cha-C6H4-)a

198

3,68 (S, 3H, -C02CH3), 4,45 (b.a., 1H, H-3), 7,30-7,80 (m, 4H, SÍS­

tema aromático).

13 ,RMN- C: ver tabia 9 , pag.120.

EM, m/z (Z): 316 (M - TSOH, 100), 301 (M - TSOH - CH3, 88), 284 (M - TSOH ­

CH3OH, 4), 257 (M - TSOH - CL, 37), 256 (M - TSOH - HCOZCH 26).3!

- 36-Formi1oxi-58-androstan-17B-carboxi1ato de metiïo (gg).

Se invirtió ia configuración de] carbono 3 de] compuesto 96 usando N,N-di­

metiiformamida en ias condiciones indicadas para e] compuesto 67 en 1a página

170 . E1 extracto crudo se purificó por cromatografía en coiumna de silicagei

(soïvente de eiución: toiueno-acetato de etiio 95:5). Se aisiaron 45 mg (61%)

de] producto formiiado 97. Por recristalización de etanoi dio p.f. 95-96°C.

RMN-lH, ppm: 0,66 (s, 3H, CH3-18), 0,99 (s, 3H, CH3-19), 3,68 (s, 3H, -C02CH3),

5,20 (b.a., 1H, H-3), 8,08 (s, 1H, HC02-).

RMN-13€:ver tabia 9 , pag.120.

EM, m/z (Z): 316 (M - HC02H, 100), 303 (M - CL, 4), 301 (M - HCO H - CH 41)2 3’

257 (M - HCOZH - CL, 12).

F3 - OBTENCION DEL 20-CETO PREGNANO A PARTIR DEL ACIDO ETIANICO.

- Acido BB-hidroxi-SB-androstan-17B-carboxi1ico (_g).

Se usó e] mismo método indicado en 1a página 187 para e] compuesto 83 con

lOO-mgde] éster 97. E1 residuo obtenido después de 1a extracción con acetato

199

de etiïo, se recristaïizó de etano] aisïándose 79 mg (90%) de] ácido 98 que

106dio p.f. 239-241°C (1it. : 226-228°C).

IR (cm-1): 3500-2700 (O-H, ácido), 3350 (0-H, a1coh01), 1720 (C=0).

RMN-lH,ppm: 0,88 (s, 3H, CH3-18), 1,02 (s, 3H, CH3-19), 4,30 (b.a., 1H, H-3).

EM, m/z (%): 302 (M - H20, 5), 287 (M - H 0 - CH2 3, 3), 45 (100).

—Acido 3B-acetoxí-53-androstan-17B-carboxí1ico (99).

Se acetiïaron 220 mg de] ácido 98 con ácido acético, empïeando 1a misma tég

niCa usada para e] compuesto 73 (página 176). E1 producto fina] se purificó por

cromatografía en co1umnade siïicageï (soïvente de e1uci6n: c10roformo). Se obtu

vieron 190 mg de] ácido 99 que se recrístaïizó de etano] dando p.f. 170-172°C.

RMP-lH, ppm: 0,73 (s, 3H, CH3-18), 0,95 (s, 3H, CH3-19), 2,07 (s, 3H, CH3COZ-),

5,10 (b.a., 1H, H-3).

- 33-Acetoxí-58-pregnan-20-ona (¿22).

a) Obtención de] c1oruro de ácido.

Se suspendieron 180 mg (0,50 mmoïes) de1 ácido 99 en 2 m1 de benceno anhi­

dro. Se agregó 1 m1 de c1oruro de oxa1i1o y se dejó tapado y a temperatura am­

biente durante 2 hs. Se evaporó e] solvente a sequedad y se usó sin previa pu­

rificacíón.

1).IR (cm' . 1795 (C=0, cïoruro de ácido), 1730 (C=0, éster).

200

b) Obtención de] 20-ceto pregnang.

Se hicieron reaccionar 190 mg (0,50 mmoles) de] cioruro de ácido prepara­

do según a) con dimetiicadmio, empieando 1a misma técnica utilizada para 1a sin

tesis de] compuesto 76 en e] método B de 1a página 179. E1 residuo aisiado se

purificó por cromatografía en coiumna de si1icage1 (soivente de e1ución: cloro­

formo). Se obtuvieron 73 mg (41%) de 1a metiicetona 100, pura por ccd (sistema:

5). Recristalizada de etano] dio p.f. 120-121°c (1it.107: 121°c).

IR (cm'l): 174o (c=o, éster), 1705 (c=o, cetona).

RMN-lH, ppm: 0,62 (s, 3H, CH3-18), 0,98 (s, 3H, CH3—19), 2,06 (s, 3H, CH3C02-),

2,12 (s, 3H, CH3-21), 5,10 (b.a., lH, H-3).

EM, m/z (%): 360 (M, 1), 300 (M - AcoH, 100), 285 (M - ACOH- CH3, 22), 257 (M ­

ACOH - CL, 11).

- 121-14CI 38-Acetoxi-SB-pregnan-20-ona (¿QQ).

a) Obtención de] cioruro de ácido.

Se preparó usando ias mismas cantidades y en 1as mismas condiciones que se

indicaron para 1a obtención del cioruro de ácido en 1a preparación de 1a metiicg

tona 100 no radiactiva.

b) Obtención de] 20-ceto pregnagg.

Se empieó e] equipo indicado en 1a figura 1a de 1a página 74.

bl) Preparación de] ioduro de metiimagnesio radiactivo.

Se apiicó 1a técnica indicada en 1a página 189 para 1a preparación de] io­

201

duro de metiimagnesio no radiactivo, con ias siguientes modificaciones.

Luego de armado e] equipo con ios 15 mg de magnesio en su interior y de

haber hecho vacio en e] sistema, se inyectó una soiución de 20 u] de ioduro de

metiio anhidro (secado sobre pentóxido de fósforo) en 1 m1 de éter anhidro (se­

cado sobre sodio y sobre hidruro de iitio y aiuminio y destiiado antes de usar).

Se mantuvo con agitación durante 30 minutos, 1apso durante e] cua] se consumió

parte de] magnesio y se formó una soiución de coior gris claro.

Se congeió e] medio de reacción sumergiendo e] fondo de] tubo kitasato en

aire iiquido. Con ayuda de un imán externo se movió 1a barrita magnética de 1a

parte superior de] equipo de tai modode romper e] cierre de vidrio de] tubo in

vertido que contenía e] ioduro de metiio radiactivo. Se inyectaron 13 ui de io­

duro de metiio no radiactivo y se caientó e] tubo invertido con una microiiama

durante 15 minutos. Se dejó 11egar e] sistema a temperatura ambiente y se conti­

nuó con 1a agitación durante 30 minutos. Finaiizado ese tiempo se habia consumi­

do prácticamente todo e] magnesio.

b2) Preparación de] dimetiicadmio radiactivo.

Se repitió e] método B parte b) de 1a página 180, empieando 1a misma can­

tidad de cioruro de cadmio moiido y anhidro (secado durante un dia a 110°C).

b3) Reacción de] dimetiicadmio radiactivo con e] cioruro de ácido.

Se empieó ei método B parte c) de 1a página 180 pero usando 180 mg dei c10­

ruro de 3B-acetoxi-SB-androstan-17B-carboxi1iio en lugar de] cioruro de ácido 75.

202

Se aisiaron 170 mg de producto sóïido cuya actividad específica era

8,90x106 dpm/mgy que se purificó por cromatografía en coïumna de si1icage1 (sol

vente de e1ución: cioroformo). Se obtuvieron 68 mg (41%) de] compuesto buscado

(100), homogéneopor ccd (sistema: 5). Por recristaiización de etanoi dio p.f.

07:119-120°c (1it.1 121°c).

Actividad especifica: 1°recrista1ización (etanoï): 8,75x106 dpm/mg6 3,15x109

dpm/mm01 6 1,43 mCi/mmo].

2°recrista1ización (etanoi): 8,72x106 dpm/mg6 3,14x109

dpm/mmo] 6 1,42 mCi/mmoi.

Las caracteristicas espectroscópicas fueron coincidentes con ias de] com­

puesto no radiactivo.

- I21-14CI 3B-Hidroxi-SB-pregnan-ZO-ona (¿3).

Se disoïvieron 5,0 mg de |21-14CI 3B-acetoxi-SB-pregnan-20-ona (100) en

10 m1 de etano] y se agregaron 3 gotas de ácido suifürico (c). La soiución se

ca1ent6 a refiujo durante 24 hs, se voïcó sobre 30 m1 de agua y se extrajo con

cloruro de metiïeno. E1 extracto orgánico se 1av6 con agua hasta neutraiidad y

se secó. Por evaporación de] soivente se obtuvo un residuo que se purificó por

ccd preparativa de siiicagei (soivente de desarroïïo: cloroformo-etanoi 98:2).

Actividad especifica: 10,12x106 dpm/mg6 3,22x109 dpm/mmo]6 1,46 mCi/mmo].

IR (cm-1): 3250 (O-H), 1700 (C=0).

RMN-lH, ppm: 0,62 (S, 3H, CH3-18), 0,97 (S, 3H, CH3-19), 2,11 (S, 3H, CH3-21),

203

4,13 (b.a., 1H, H-3).

EM, m/z (%): 318 (M, 57), 303 (M - CH3, 24), 300 (M - H20, 94), 285 (M - H20 ­

CH3, 30), 275 (M - CL, 5), 260 (M - CH3 - CL,12), 257 (M - H 0 ­2

CL, 21), 43 (100).

204

RESUMEN.

La biosintesis de los glicósidos cardenólidos ha sido estudiada en sus aspeg

tos primarios y se conoce muy poco acerca de la hidroxilación en posición 14 con

configuración B. Hubo varias hipótesis para este mecanismo que aün no ha sido

aclarado. Debidoa que existían datos contradictorios relacionados con la parti­

cipación de un doble enlace en posición 8(14), se decidió sintetizar e inocular

|21-14CI 3B-hidroxi-58-pregn-8(l4)-en-20-ona. Simultaneamente se desarrolló la

sintesis de [21-14C| 3B-hidroxi-SB-pregnan-ZO-ona, que es un precursor conocido

del camino biosintético de cardenólidos, con el fin de usarlo comocontrol en los

ensayos de inoculación en plantas del género Digitalis.

Para preparar ambos compuestos se usaron ácidos biliares comomaterial de

partida porque ademásde presentar las caracteristicas estructurales necesarias

para realizar las sintesis, resultaron ser materias primas económicasy fácilmen­

te accesibles. Sobre los esteroides de partida se efectuaron las siguientes modi­

ficaciones:

1) Degradación de la cadena lateral del ácido biliar a una cadena de tipo ácido

etiánico.

2) Inversión de la configuración del carbono 3.

3) Deshidratación del hidroxilo de carbono 7 e isomerización del doble enlace for

madoa la posición 8(14).(Esta modificación sólo se aplicó en una de las sin­

tesis).

205

4) Construcción de una cadena lateral de] tipo 20-ceto pregnano a partir de un

ácido etiánico.

E1 sustrato a investigar se administró a plantas de D. purpurea no siendo

incorporado por ias mismas.

Comofue notoria 1a falta de datos de RMN-13€de 1os compuestos 58-esteroi­

daïes sintetizados, se asignaron los espectros de una serie de esteroides de este

tipo que están estructuraimente re1acionados. Estos se obtuvieron comointermedia

rios en ios caminos de sintesis, se adquirieron comerciaimente o se prepararon es

pecialmente para e] estudio. Con los vaiores obtenidos se ana1izó 1a influencia

de los cambios configuracionaïes y funcionaies en e] carbono 3, de 1a introduc­

ción de un doble eniace en 1a posición 8(14) y de 1a presencia de diferentes cadg

nas Iateraies.

Í JuTLLLL/LK/Z¿9L—A\\ Mómca DQLmóh

BIBLIOGRAFIA

1

13

14

15

16

206

a. H. Lichti, C. Tammy T. Reichstein, HeZv. Chim. Acta, gg, 1933 (1956).

J.H. Russe11, 0. Schindïer y T. Reichstein, HeZv. Chim. Acta, gg, 1315

(1961).

b. P. Studer, S.K. Pavanaram, C.R. Gaviïanes, H. Linde y K. Meyer, HeZv.

Chim. Acta, gg, 23 (1963).

C.E. Nativelïe, J. Pharmacol., 2, 255 (1869).

M. Cïoetta, Arch. Exp. Path. Pharmacol., gg, 115 (1920).

A. Nindaus y C. Fraese, Ber. dtsch. chem. Ges., gg, 2503 (1925).

A. Hindaus y G. Schwarte, Ber. dtsch. chem. Ges., gg, 1515 (1925).

F. Kraft, Arch. Pharm., ¿59, 118 (1912).

s. Smith, J. Chem.Soc., 508 (1930).

Rodd's Chemistry of Carbon Cbmpounds(Editor: S. Coffey), Eïsevier Pub1í­

shing Company, Amsterdam, V01. 2 parte D.

P.A. Tavormina, M.H. Gibbs y J.N. Huff, J. Am. Chem. Soc., 1g, 4498

(1956).

E. Ramstadt y J.L. Bea], Chem. Ind. (London), 177 (1960).

E. Leete y H. Gregory, Chem. Ind. (London), 1242 (1960).

E. Leete, H. Gregory y E. Gros, J. Am. Chem. Soc., gl, 3475 (1965).

R. Tschesche, Fortschr. Chem.Org. Naturstofïï, lg, 131 (1955).

R. Tschesche, Angew. Chem., Z}, 727 (1961).

E. Gros y E. Leete, J. Am. Chem. Soc., gl, 3479 (1965).

R. Tschesche y G. Lí1ienweiss, Z. Naturforsch., 129, 265 (1964).

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

30

31

32

207

J.V. Euwy T. Reichstein, HeZv. Chim. Acta, 31, 711 (1964).

R. Tschesche y B. Brassat, Z. Naturfbrsch., gig, 894 (1966).

E. Caspi, D.0. Lewis, D.M. Piatak, K.V. Thimann y A. Winter, Experientia,

g, 506 (1966).

E. Caspi y D.0. Lewis, Science, 15€, 519 (1967).

H.H. Sauer, R.D. Bennett y E. Heftmann, Naturwissenschaften, gg, 226

(1967).

H.H. Sauer, R.D. Bennett y E. Heftmann, Phytochemistry, g, 1521 (1967).

R.D. Bennett, H.H. Sauer y E. Heftmann, Phytochemistry, Z, 41 (1968).

E. Caspi y G.M. Hornby, Phytochemistry, 1, 423 (1968).

R. Tschesche, R. Hombach, H. Scholten y M. Peters, Phytochemistry, 2,

1505 (1970).

R. Tschesche, H. Huipke y H..Sch01ten, Z. Naturfbrsch., ggg, 677 (1967).

R. Tschesche, R. Becker y R. Hombach, Z. Naturfbrsch., ggg, 1615 (1968).

R. Tschesche y R. Becker, Z. Naturfbrsch., 25g, 107 (1970).

H.H. Sauer, R.D. Bennett y E. Heftmann, Phytochemistry, Z, 1543 (1968).

H.H. Sauer, R.D. Bennett y E. Heftmann, Phytochemistry, g, 69 (1969).

H.H. Sauer, R.D. Bennett y E. Heftmann, Phytochemistry, g, 839 (1969).

M. Hayano en Oxygenases (Editor: 0. Hayaishi), Academic Press, N.Y., p.

182 (1962).

w. Charney y H.L. Herzog, Microbial Transfbrmations of Steroids, Academic

Press, N.Y., p. 18 (1967).

33

34

35

36

37

38

39

40

41

42

43

44

45

46

47

K.R. Varmay E. Caspi, Phytochemistry, g, 1539 (1970).

K.D. Roberts, L. Bandy y S. Lieberman, Biochemistry, g, 1259 (1969).

H. Charney y H.L. Herzog, Microbial Transfbrmations of Steroids, Academic

Press, N.Y., pp. 30, 31 (1967).

E. Caspi y D.0. Lewis, Phytochemistry, Z, 683 (1968).

K. Nakanishi, M. Koreeda, S. Sasaki, M.L. Chang y H.Y. Hsu, Chem. Commun.,

915 (1966).

M.N. Gaïbraith y D.H.S. Horn, Chem. Commun., 905 (1966).

K. Heusïer, J. Ka1voda, G. Anner y A. Wettstein, HeZv. Chim. Acta, 49,

352 (1963).

L. Canóníca, F. Ronchetti y G. Russo, Chem. Commun., 1675 (1970).

D.J. Aberhart, J.G. L1oyd-Jones y E. Caspi, Phytochemistry, 1g, 1065

(1973).

R. Tschesche y U. K1eff, Phytochemistry, lg, 2375 (1973).

R. Tschesche y w. Führer, Chem. 8er., 112, 2692 (1979).

Nieïand, Schïichting y R. Jacobi, Z. Physiol. Chem., l_l, 80 (1926).

Ch. Meystre, L. Ehmann, R. Neher y K. Miescher, HeZv. Chim. Acta, gg,

1252 (1945).

J.C. Beïoeí1, C. Esnauït, M. Fétizon y R. Henry, Steroids, 35 (2), 281

(1979).

R.A. Sheldon y J.K. Kochi en Organic Reactions (editor en jefe: N.G.

Dauben, John Niïey & Sons, Inc., vo]. 19, p. 279 (1972).

48

49

50

51

52

53

54

55

56

57

58

59

60

61

62

63

64

209

A.S. Naruïa y S. Dev, Tetrahedron Lett., gg, 1733 (1969).

A.S. Naru1a y S. Dev, Tetrahedron, gl, 1119 (1971).

L. Regge], S. Friedman y I. Nender, J. Org. Chem., gg, 1136 (1958).

J.D. Cocker, H.B. Henbest, G.H. Phi11ips, G.P. SIater y D.A. Thomas, J.

Chem. Soc., 6 (1965).

S. Nakanishí, J. Med. Chem., 1, 106 (1964).

J.T. Edward y J.M. Feland, cun. J. Chem., 33, 1311 (1966).

H. Danielsson, P. Eneroth, K. He11str6m y J. Sjüvall, J. Biol. Chem., ¿21,

3657 (1962).

L. Fieser y M. Fieser, Reagents fbr Organic Synthesis, John Wiïey and

Sons, Inc., Vo]. 1 (1967), p. 205.

A.K. Bose, B. La], N.A. Hoffman III y M.S. Manhas, Tbtrahedron Lett., lg,

1619 (1973).

F.C. Chang, J. Org. Chem., 4_4, 4567 (1979).

F.C. Chang, J. Am. Chem. 500., gg, 2906 (1958).

F.C. Chang, N.F. Woody N.G. H01ton, J. Org. Chem., gg, 1718 (1965).

F. Büdecker, Ber. Chem., á}, 1852 (1920).

K. Yamasaki, Z. Physiol. Chem., gg}, 10 (1935).

K. Yamasaki y K. Takahashi, Z. Physiol. Chem., ¿29, 21 (1938).

A.w. Devor y H.w. Mar1ow, J. Am. Chem. Soc., gg, 2101 (1946).

von E. Berner, A. Lardon y T. Reichstein, HeZv. Chim. Acta, gg, 1542

(1947).

65

66

67

68

69

70

72

73

74

75

76

77

78

79

80

210

D.H.R. Barton, J. Chem. Soc., 1116 (1946).

J. Caste1ïs y G.D. Meakins, Chem. Ind., 248 (1956).

E. Schwenk, B. Riege], R.B. Moffett y E. Stah], J. Am. Chem. 300., 65,

549 (1943).

N. Bhacca y D. Niïïiams, Applications of NMRSpectroscopy in Organic

Chemistry, Holden Day, San Francisco (1966), p. 20.

A.N.D. Hudge11, J.H. Turnbui] y W. Niïson, J. Chem. Soc., 814 (1954).

H.0. House y T.M. Bare, J. Org. Chem., 23, 943 (1968).

G. Cahiez, A. Masuda, D. Bernard y J.F. Normant, Tetrahedron Lett., 3175

(1976).

G. Cahiez, D. Bernard y J.F. Normant, Synthesis, 130 (1977).

G. Cahiez, Tetrahedron Lett., gg, 1239 (1981).

H.B. Mac Phiïïamy y C.R. Schoïz, J. Biol. Chem., 418, 37 (1949).

H. Gi1mawy J.F. Neïson, Rec. Trav. Chim., gg, 518 (1936).

w. Coïe y P.L. Juïian, J. Am. Chem. Soc., _Z, 1369 (1945)., gl, 1369

(1945).

J.w. B1unt y J.B. Stothers, Org. Magn., 2, 439 (1977)­

M. Tsuda, E.J. Parish y G.J. Schroepfer, J. Am. Chem. Soc., 44, 1282

(1979).

H. Eggert y C. Djerassi, J. Org. Chem., 4g, 5399 (1981).

H.T. Andrew Cheung, L. Brown, J. Boutagy y R. Thomas, J. Chem. Soc. Perkin

I, 1773 (1981).

82

83

84

85

86

87

88

89

90

91

92

93

94

211

G. Engeihardt, D. Zeigan y B. Schonecker, J. Prakt. Chemie, Band 320,

377 (1978).

H.J. Reich, M. Jauteiat, M.T. Messe, F.J. Weigert y J.D. Roberts, J. Am.

Chem. Soc., gl, 7445 (1969).

S.Q.A. Rizvi y J.R. Wi11iams, J. Org. Chem., 3g, 1127 (1981).

H. Eggert, C.L. Van Antwerp, N.S. Bhacca y C. Djerassi, J. Org. Chem.,

gl, 71 (1976).

H. Eggert y c. Djerassi, J. Org. Chem., gg, 3788 (1973).

H. Beierbeck, J.K. Saunders y J.N. Ap Simon, Can. J. Chem., 55, 2813

(1977).

F.J. Evans y P.S. Cowiey, Phytoohemistry, ll, 2971 (1972).

M.S. Maier, Estudio sobre rutas biosintéticas alternativas del anillo bu­

tenólido de cardbnólidos en Za planta D. purpurea, Tesis, Departamento de

Quimica Orgánica, Facuitad de Ciencias Exactas y Naturaies, Universidad

de Buenos Aires (1985).

K.M. Heiiman y C. Djerassi, J. Am. Chem. Soc., 81, 60 (1965).

w.L. Duax, J.F. Griffin y o.c. Rohrer, J. Am. Chem. Soc., 19;, 6705 (1981L

M.D. Cotteriii y M.J.T. Robinson, Tetrahedron, gg, 765 (1964).

M.D. Gonzaiez y G. Burton, Org. Magn. Reson., gg, 586 (1984).

E.N. Trachtenberg, C. Byon y M. Gut, J. Am. Chem. 500., gg, 6145 (1977).

C. Romers, C. A1tona, H.J.C. Jacobs y R.A.G. De Graaff, en Terpenoids

95

96

97

98

99

100

101

102

103

104

105

106

107

212

and Steroids, Specialist Periodical Reports, Roya] Society of Chemistry,

London, V01. 4 (1974).

M. Maier, A.M. Se1des y E.G. Gros, Resultados no publicados.

C. A1tona y H. Hirschmann, Tetrahedron, gg, 2173 (1970).

H. Lee, N.S. Bhacca y M.E. N01ff, J. Org. Chem., gl, 2692 (1966).

H. Lee y M.E. Wolff, J. Org. Chem., gg, 192 (1967).

C. Le Cocq y J. Lallemand, J. Chem. Soc., Chem. 60mm., fi, 150 (1981).

T. Kametani, K. Suzuki y H. Nemoto, J. Org. Chem., 31, 2331 (1982).

von H.P. Sigg y T. Reichstein, HeZv. Chim. Acta, gg, 1507 (1956).

F. Ducelïiez, Bull. Soc. Chim. Fr., l}, 815 (1913).

The Merck Index (Editor: M. Windholz), Merck & Co. Rahway, N.J., USA, 9°

edición, p 5392.

M.L. Lewbart y V.R. Mattox, J; Org. Chem., gg, 2001 (1963).

A. Lardon, Helv. Chim. Acta, 39, 597 (1947).

L. Ruzicka, P1.A. Plattner y G. Ba11a, HeZv. Chim. Acta, gg) 65 (1940).

R.E. Marker, 0. Kammy E.L. Nittle, J. Am. Chem. Soc., E2, 1841 (1937).

INDICE DE FIGURAS

pág.

Figura l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..74

Figura 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..115

Figura 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..121

Figura 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..128

Figura 5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..134

Figura 6 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..134

INDICE DE TABLAS

Tabla 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..103

Tabïa 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..103

Tabla 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..104

Tabla 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..105

Tabla 5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..105

Tab1a 6 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..106

Tabla 7 . . . . . . . . . . . . ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..106

Tabla 8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..107

Tabïa 9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..117

Tabïa 10 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..123

213