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Aus dem Institut für
Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der
Tierärztlichen Hochschule Hannover
___________________________________________________________________________
Untersuchung zur Pharmakokinetik der Methylxanthine
Theophyllin und Theobromin hinsichtlich der
Dopingrelevanz beim Pferd
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von
Sophie Koppe (geb. Richers) aus Berlin
Hannover 2007
Wissenschaftliche Betreuung: Universitätsprofessor Dr. M. Kietzmann
1. Gutachter: Universitätsprofessor Dr. M. Kietzmann
2. Gutachter: Universitätsprofessor Dr. Dr. h.c. E. Deegen
Tag der mündlichen Prüfung: 25.05.2007
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 13
2 LITERATURÜBERSICHT 14
2.1. Definition von Doping 14
2.2. Bestimmungen 16
2.3. Methylxanthine 18
2.3.1. Vorkommen 18
2.3.2. Wirkung 19
2.3.3. Theophyllin 27
2.3.4. Theobromin 30
2.4. Pharmakokinetische Grundlagen 32
2.5. Pharmakokinetische Parameter 39
3 MATERIAL UND METHODE 45
3.1. Aufbau des Experiments und Vers uchsplanung 45
3.1.1. Versuchstiere und Haltungsbedingungen 45
3.1.2. Testsubstanzen 46
3.1.3. Vorversuch 47
3.1.4. Hauptversuch 47
3.1.5. Aufbereitung der Proben und Aufbewahrung 48
3.2. Analytik 49
3.2.1. Chemikalien 49
3.2.2. Instrumente 50
3.2.3. Methodenentwicklung 51
3.2.4. Aufarbeitung der Urinproben 55
3.2.5. Aufarbeitung der Plasmaproben 56
INHALTSVERZEICHNIS
3.3. Validierung der Methode 58
3.3.1. Selektivität und Spezifität 58
3.3.2. Linearität 58
3.3.3. Nachweisgrenze 60
3.3.4. Bestimmungsgrenze 61
3.3.5. Richtigkeit 61
3.3.6. Präzision 62
3.3.7. Stabilität 63
3.3.8. Wiederfindung 64
3.4. Pharmakokinetische Auswertung 65
4 ERGEBNISSE 66
4.1. Ergebnisse der Analysemethoden
4.1.1. Massenspektren der zu analysierenden Substanzen und
ihrer internen Standards 66
4.1.1.1. Massenspektrum von Theophyllin und 1,3-15N2- Theophyllin 66
4.1.1.2. Massenspektrum von Theobromin und D6- Theobromin 67
4.1.1.3. Massenspektrum von Coffein und D3- Coffein 69
4.1.1.4. Massenspektrum von Paraxanthin 70
4.2. Ergebnisse der Validierung 71
4.2.1. Selektivität 71
4.2.2. Linearität 74
4.2.3. Nachweisgrenze (LOD) 77
4.2.4. Bestimmungs-/Quantifizierungsgrenze (LOQ) 78
4.2.5. Richtigkeit 79
4.2.6. Präzision 83
4.2.7. Stabilität 85
4.2.8. Wiederfindung 87
INHALTSVERZEICHNIS
4.3. Ergebnisse des Hauptversuches 88
4.3.1. Plasma 88
4.3.1.1. Theophyllin und Metaboliten nach intravenöser Applikation 88
4.3.1.2. Theophyllin und Metaboliten nach oraler Applikation 91
4.3.1.3. Theobromin und Metaboliten nach intravenöser Applikation 94
4.3.2. Pharmakokinetische Berechnungen 96
4.3.2.1. Pharmakokinetik von Theophyllin nach intravenöser Applikation 96
4.3.2.2. Pharmakokinetik von Theophyllin nach oraler Applikation 97
4.3.2.3. Pharmakokinetik von Theobromin nach intravenöser Applikation 99
4.3.3. Urin 101
4.3.3.1. Theophyllin und Metaboliten nach intravenöser Applikation 101
4.3.3.2. Theophyllin und Metaboliten nach oraler Applikation 104
4.3.3.3. Theobromin und Metaboliten nach intravenöser Applikation 107
4.3.4. Pharmakodynamische Effekte von Theophyllin und Theobromin 109
4.3.4.1. Herzfrequenz 109
4.3.4.2. Atemfrequenz 109
4.4. Berechnung effektiver und irrelevanter Plasma- und Urinkonzentrationen 109
4.4.1. Berechnung effektiver und irrelevanter Plasma- und Urinkonzentrationen von
Theophyllin 111
4.4.2. Berechnung effektiver und irrelevanter Plasma- und Urinkonzentrationen von
Theobromin 112
4.5. Ausscheidungszeiten 113
4.5.1. Ausscheidungszeiten von Theophyllin nach intravenöser Applikation 113
4.5.2. Ausscheidungszeiten von Theophyllin nach oraler Applikation 114
4.5.3. Ausscheidungszeiten von Theobromin nach intravenöser Applikation 115
INHALTSVERZEICHNIS
5 DISKUSSION 116
5.1. Eignung der Aufarbeitungs- und Analysemethode (HPLC/MS/MS) zur
Quantifizierung von Theophyllin und Theobromin im Plasma und Urin 116
5.2. Ausscheidungsverhalten von Theophyllin und Theobromin 118
5.3. Bewertung der Ergebnisse 129
6 ZUSAMMENFASSUNG 130
7 SUMMERY 132
8 LITERATURVERZEICHNIS 134
9 TABELLENVERZEICHNIS 148
10 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 153
11 ANHANG 158
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
µmol Mikromol
Abb. Abbildung
AC Adenylatcyclase
APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionisation
ATP Adenosintriphosphat
AUC Fläche unter der Konzentrations-Zeit-Kurve (area under the curve)
bzw. beziehungsweise
C Konzentration
ca. circa
Ca++ Calcium
cAMP cyclisches Adenosinmonophosphat
CL Clearance
CO2 Kohlendioxid
D Gesamtdosis
DIR Direktorium für Vollblutzucht und Rennen
EHSLC European Horserace Liaison Committee
EPC effektive Plasmakonzentration
ESI Electro Spray Ionisation
F Bioverfügbarkeit
f Freiheitsgerade der linearen Kalibration
FAL Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft
FEI Fédération Équestre International
FN Fédération National
g Gramm
ºC Grad Celsius
h Stunde
H+ Proton
H2O Wasser
HCl Salzsäure
HPLC High Performance Liquid Chromatography
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
HQC High Quality Control Standard
HVT Hauptverband für Traber-Zucht und -Rennen e.V.
HWZ Halbwertszeit
IPC irrelevante Plasmakonzentration
i.v. intravenös
k10 Eliminationsgeschwindigkeitskonstante
k12 Transferkonstante, Übertritt vom zentralen ins periphere
Kompartiment
k21 Transferkonstante, Übertritt vom peripheren ins zentrale
Kompartiment
ka Resorptionskonstante
ke Eliminationskonstante
kel Eliminationskonstante
kg Kilogramm
KGW Körpergewicht
KM Körpermasse
l Liter
LC Liquid Chromatography
ln natürlicher Logarithmus
LOD Limit of Detection
LOQ Limit of Quantification
LPO Leistungsprüfungsordnung der FN
LQC Low Quality Control Standard
λ Hybridkonstante
M Konzentration
Mg++ Magnesium
m/z Masse zu Ladung Verhältnis
mg Milligramm
mmol Millimol
min Minute
ml Milliliter
MQC Midrange Quality Control Standard
MS Massenspektrometrie
ng Nanogramm
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
n.n. nicht nachweisbar
n.m. not measured (nicht gemessen)
p.a. post applicationem
p.a. pro analysi
PDE Phosphordiesterase
PK/PD pharmakokinetisch/pharmakodynamisch
Q Organdurchblutung
QCS Quality Control Standard
Qx Summe der Abweichungsquadrate
R2 Korrelationskoeffizient
Sb totale Präzision, interday repeatability
SF Sicherheitsfaktor
SW Tagespräzision, intraday repeatability
SxO Reststandardabweichung
Rss Verhältnis von Harn- zu Plasmakonzentration im Steady State
t Zeit
t1/2 Halbwertszeit
tA Ausscheidungszeit
Tab. Tabelle
TINV t-Wert der t-Verteilung
V Verteilungsvolumen
Vdβ Verteilungsvolumen im Pseudo-Steady State
Vss Verteilungsvolumen im Steady State
WADA World Anti-Doping Agency
x Mittelwert
z.B. zum Beispiel
EINLEITUNG
1 EINLEITUNG
Zur Zeit gilt im Pferdesport eine sogenannte „Nulllösung“, das heißt, dass bis auf wenige klar
definierte Ausnahmen jeglicher Nachweis einer körperfremden Substanz oder ihrer
Metaboliten im Blut oder Urin eines Pferdes am Wettkampftag als Einsatz unerlaubter Mittel
und damit als Verstoß gegen die Dopingregeln gilt (KIETZMANN et al., 2006a; KLUGE,
2002). Das bedeutet, dass neben tatsächlich verbotenerweise zur Leistungsbeeinflussung
eingesetzten Stoffen auch Therapeutika bei nicht ausreichend lang angesetzter Karenzzeit bis
zur nächsten Wettkampfteilnahme zur positiven Medikationskontrolle / Dopingkontrolle
führen können. Durch diese sogenannte „Nulllösung“ wird die wettkampfnahe Behandlung
von Sportpferden sehr schwierig, da erhebliche Unterschiede in Dosierung, Nachweisgrenzen
und Pharmakokinetik der einzelnen Wirkstoffe und Ausscheidungsverhalten der Pferde keine
Aussage über einheitliche Karenzzeiten erlauben. Um unabsichtliches Doping besser
vermeiden und trotzdem eine adäquate Therapie der Sportpferde gewährleisten zu können, hat
das European Horserace Scientific Liaison Committee (EHSLC) ein europaweites Projekt
begründet, in dem pharmakokinetische Untersuchungen unter standardisierten Bedingungen
stattfinden. Die ermittelten Daten dienen in einem PK/PD-Modell nach TOUTAIN und
LASSOURD (2002) zur Berechnung unwirksamer Wirkstoffkonzentrationen im Plasma und
im Urin.
Das Ziel dieser Arbeit bestand in der Erarbeitung und Validierung einer geeigneten
Analysemethode zur Quantifizierung von Methylxanthinen im Urin und im Plasma von
Pferden sowie der Berechnung der Eliminationskinetik von Theophyllin nach intravenöser
und oraler Verabreichung sowie von Theobromin nach intravenöser Gabe.
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LITERATURÜBERSICHT
2 LITERATURÜBERSICHT
2.1. Definition von Doping
Laut UNGEMACH und NÜRNBERGER (1999) ist Doping „die Verabreichung von
Substanzen an Mensch und Tier mit dem Ziel der Beeinflussung der natürlichen und aktuellen
Leistungsfähigkeit bei sportlichen Wettkämpfen“.
Es werden verschiedene Formen des Dopings unterschieden, wobei man grundsätzlich
„positives Doping“ mit dem Ziel der Leistungssteigerung und „negatives Doping“ mit dem
Ziel der Leistungsverminderung voneinander trennen muss. Neben dem „Doping auf Sieg“
mit leistungssteigernden Mitteln wie Stimulanzien (akutes Doping auf Sieg), die kurz vor dem
Start appliziert werden (SCHOENE, 1996), oder der Gabe von Anabolika (chronisches
Doping auf Sieg) hat im Pferdesport vor allem das „paradoxe Doping auf Sieg“ und das
„Doping auf Wiederherstellung der eigentlichen Leistungsfähigkeit“ Bedeutung
(UNGEMACH und NÜRNBERGER, 1999; DEBACKERE, 1989). Unter „paradoxem
Doping auf Sieg“ versteht man die Verabreichung zum Teil sehr geringer Mengen von
Sedativa an nervöse oder ängstliche Pferde, um diese startfähig zu machen (SCHOENE,
1996). Das „Doping auf Wiederherstellung der eigentlichen Leistungsfähigkeit“ ist beim
Pferd ebenfalls verbreitet (UNGEMACH 1985). Der Mensch darf einen Wettkampf unter
Schmerzmittel- oder Antibiotikawirkung bestreiten, da man davon ausgeht, dass der Athlet
diese Entscheidung selbst trägt. Dies ist aus Tierschutzgründen im Pferdesport nicht erlaubt.
Nach den Dopingbestimmungen besteht zum Zeitpunkt des Wettkampfes kein Unterschied
zwischen Therapie und Doping, deshalb ist jede Arzneitherapie zur Wiederherstellung der
normalen Leistungsfähigkeit während des Wettkampfes verboten (UNGEMACH 1985).
Grundlage hierfür ist das Tierschutzgesetz, welches in § 3 Absatz 1 verbietet, Tieren außer in
Notfällen Leistungen abzuverlangen, denen sie offensichtlich nicht gewachsen sind, oder die
ihre Kräfte übersteigen und das in Absatz 1b auch ausdrücklich die Verabreichung von
Dopingmitteln verbietet (BUNDESMINISTERIUM FÜR VERBRAUCHERSCHUTZ,
ERNÄHRUNG UND LANDWIRTSCHAFT, 2001). Ausnahmen bilden lediglich Impfungen,
Entwurmungsmittel, Immuninducer, Homöopathika sowie einige Desinfektionsmittel.
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LITERATURÜBERSICHT
Paragraph 11 des Tierschutzgesetzes verbietet auch das sogenannte „physikalische Doping“.
Damit sind Maßnahmen gemeint, die nicht durch Verabreichung chemischer Substanzen zur
Leistungsbeeinflussung führen, sondern die zum Beispiel durch Anbringen von spitzen
Gegenständen oder durch elektrische Reize die Schmerzempfindlichkeit des Pferdes
verstärken. Unter „Doping mit körpereigenen Substanzen“ versteht man vor allem das
Blutdoping und die Verabreichung von Erythropoetin (MÜLLER, 1999). Diese Form des
Dopings spielt beim Pferd, im Gegensatz zum Menschen, aufgrund seiner unter Belastung
physiologischen Erythrozytenfreisetzung aus der Milz, eher eine untergeordnete Rolle
(UNGEMACH und NÜRNBERGER, 1999). Unter „negativem Doping“ bzw. „Doping auf
Niederlage“ versteht man eine Leistungsverschlechterung des Pferdes zum Beispiel durch
Verabreichung von Sedativa oder ähnlichem (UNGEMACH und NÜRNBERGER, 1999).
Eine große Problematik stellt das „unabsichtliche Doping“ im Pferdesport dar. Wenn ein zur
Therapie einer akuten Erkrankung eingesetztes Arzneimittel dopingrelevante
Nebenwirkungen hat, nach perkutaner Anwendung ein Wirkstoff auch systemisch
nachzuweisen ist, oder ein Wirkstoff dopingrelevante Metaboliten bildet, kann es zu positiven
Dopingbefunden kommen, ohne dass jemand vorsätzlich gehandelt hat. Das größte Problem
hierbei sind häufig unbekannte Absetzfristen von Arzneimitteln, bzw. die individuell sehr
unterschiedlichen Eliminationszeiten, bedingt durch verschiedene Stoffwechselleistungen des
Organismus und eventuell nicht bedachte Wechselwirkungen zwischen zusammen
verabreichten Arzneimitteln (UNGEMACH, 1985; TOBIN und WOOD, 1989). Früher wurde
durch sogenannte Maskierungsmittel versucht, den Nachweis von verbotenen Substanzen zu
erschweren (SCHOENE, 1996; KLUGE, 2002). Dies hat aber heutzutage aufgrund der sehr
empfindlichen Nachweisverfahren kaum noch Relevanz. In Tab.1 sind die verschiedenen
Dopingformen nochmals aufgeführt.
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LITERATURÜBERSICHT
▫ Doping auf Sieg (akute, chronische, paradoxe Form) ▫ Doping auf Wiederherstellung der normalen Leistungsfähigkeit positives Doping ▫ Doping mit körpereigenen Substanzen ▫ Physikalisches Doping _________________________________________________________________________ ▫ Doping auf Niederlage negatives Doping __________________________________________________________________________ ▫ unabsichtliches Doping ▫ Maßnahmen zur Erschwerung des Dopingnachweises
Tab.1: Dopingformen nach UNGEMACH und NÜRNBERGER (1999)
2.2. Bestimmungen
Das Direktorium für Vollblutzucht und Rennen unterteilt die sogenannten Mittel in fünf
Listen: Liste I sind die erlaubten Substanzen wie Impfungen, Liste II enthält Substanzen, für
die ein Grenzwert besteht, und Liste III enthält Antiinfektiva, deren Einsatz bei
Dokumentation im Medikamentenbuch und Deklaration bei Probenentnahme erlaubt ist. Die
unerlaubten Mittel werden in den Listen IV und V geführt, wobei die Liste IV Doping-
Substanzen enthält und die Liste V alle Substanzen, welche nicht in einer der Listen I bis IV
aufgeführt sind (DIREKTORIUM FÜR VOLLBLUTZUCHT UND RENNEN e.V., 2002).
Der Rennbahntierarzt hat eine strenge Dokumentationspflicht und muss jegliche
Verabreichung mit genauer Indikation im Medikamentenbuch eintragen. Dadurch besteht die
Möglichkeit eines wettkampfnahen therapeutischen Einsatzes von zum Beispiel Antibiotika.
Die Liste der verbotenen Substanzen der Deutschen Reiterlichen Vereinigung unterteilt alle
Substanzen in drei Klassen: Die erste Klasse enthält die Dopingsubstanzen, also Substanzen
welche geeignet sind, die Leistung des Pferdes zu beeinflussen, wobei für einige Hormone
und Theobromin eine Grenzwertregelung besteht.
Die zweite Klasse beinhaltet die verbotenen Arzneimittel. Das sind therapeutisch eingesetzte
Arzneimittel, deren Einsatz aber während des Wettkampfes verboten ist. Auch in dieser Liste
gilt für manche Substanzen ein Grenzwert.
16
LITERATURÜBERSICHT
Die dritte Klasse listet Ausnahmen auf. Das sind Impfstoffe, Antiendoparasitika,
Paraimmunitätsinducer, Insektenschutzmittel und Desinfektionsmittel (DEUTSCHE
REITERLICHE VEREINIGUNG e.V., 2004).
Diese unterschiedlichen Bestimmungen zeigen auf, dass im Renn- und Turniersport
unterschiedliche Regeln gelten:
Der Rennbahntierarzt hat eine strenge Dokumentationspflicht und muss jegliche
Verabreichung mit genauer Indikation im Medikamentenbuch eintragen. Es besteht dadurch
aber die Möglichkeit des wettkampfnahen therapeutischen Einsatzes von Stoffen der Liste III.
Diese Möglichkeit hat der Tierarzt auf nationaler Ebene nicht. Er muss die Medikation so
wählen, dass keine Substanz, außer den Ausnahmen, am Wettkampftag nachweisbar ist, sonst
darf er das Pferd nicht starten lassen.
Auf internationaler Ebene besteht nach dem Regelwerk der FEI wiederum die Möglichkeit
des wettkampfnahen Einsatzes bestimmter Therapeutika, wenn diese vom Mannschaftstierarzt
deklariert und vor Anwendung genehmigt worden sind.
Die Pferdesportverbände führen neben den Wettkampfkontrollen auch Trainingskontrollen
durch, die je nach Verband und Bundesland im WADA-akkreditierten Labor am Institut für
Biochemie der Sporthochschule Köln oder in der Abteilung für Dopinganalytik im
Veterinärmedizinischen Analysezentrum in Geesthacht untersucht werden.
Im Jahre 2006 wurden im Auftrag der deutschen Pferdesportverbände im Institut für
Biochemie der Sporthochschule Köln 1462 Analysen durchgeführt. Davon wurden 22 Proben
positiv getestet und 26 Substanzen nachgewiesen. Die Auflistung ist in Tab.2 tabellarisch
dargestellt (www.dshs-koeln.de).
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LITERATURÜBERSICHT
gesamt positiv Substanzen Wirkstoff
Trainingskontrollen120 2 2 1x Flunixin
1x Morphin Wettkampfkontrollen
1342 20 24 1x Acepromacin 1x Ambroxol 2x Betamethason 1x Boldenon 1x Clenbuterol 2x Dembrexin 1x Diclofenac 1x Flunixin 1x Koffein 1x Kokain 1x Lidocain 2x Methocarbamol 1x Morphin 1x Oxyphenbutazon 1x Pentobarbital 4x Phenylbutazon 1x Theophyllin 1x Xylazin
Summe 1462 22 26
Tab.2: Zusammenfassung der 2006 im Institut für Biochemie der Sporthochschule Köln im Auftrag der Pferdesportverbände durchgeführten Analysen
2.3. Methylxanthine
2.3.1 Vorkommen
Die Methylxanthine Coffein (1,3,7-Trimethylxanthin), Theophyllin (1,3-Dimethylxanthin)
und Theobromin (3,7-Dimethylxanthin) zählen zu den ältesten Genuß- und Arzneimitteln und
kommen natürlicherweise in mehreren Pflanzen vor. Die Kaffeebohne enthält Coffein,
Spuren von Theobromin (LEHMANN u. MARTINOD 1967) und in geringen Mengen
Theophyllin (ca. 5 mg/kg) (FRANZKE et al., 1968). In Teeblättern lassen sich Theophyllin
(ca. 15 mg/kg), Coffein und Theobromin nachweisen. Kakaobohnen enthalten Theobromin
(bis zu 3%) und Coffein. Das in Abb.1 mit aufgeführte Paraxanthin (1,7-Dimethylxanthin) ist
ein Metabolit von Coffein und Theophyllin und kommt nicht in Pflanzen vor.
18
LITERATURÜBERSICHT
Coffein: Theophyllin: Theobromin: Paraxanthin:
Abb.2: Strukturformeln der Methylxanthine
2.3.2. Wirkung
Pharmadynamische Wirkung
Zentrale Wirkungen
Zentral wirken Methylxanthine erregend, besonders im Bereich der Großhirnrinde
(SAWYNOK u. YAKSH, 1993; LÖSCHER, 2006). Dies geschieht laut FREY et al. (2002)
durch Dämpfung mediothalamischer Strukturen, Stimulation der Großhirnrinde sowie
Erregung autonomer Zentren des Gehirns. Die Erregung der Großhirnrinde führt zur
allgemeinen Steigerung der psychischen und motorischen Funktionen. Kaffee bzw. Coffein in
den üblichen Dosierungen von ca. 50-200 mg bewirkt, dass bei müden Personen die
Ermüdung aufgehoben und die Leistungen gesteigert werden, bei ausgeruhten Personen ist
allerdings keine Leistungssteigerung zu erzielen (MUTSCHLER, 1996; CHOU, 2003). Laut
STAMFORD (1989) bewirkt Coffein eine Verzögerung des Eintrittes der Müdigkeit und eine
Erhöhung der Unruhe. In höheren Dosierungen oder bei parenteraler Applikation soll es auch
zur Stimulation des Stammhirnes und somit zur direkten Stimulation der autonomen Zentren
für Atmung und Kreislauf kommen (LÖSCHER, 2006). ELDRIDGE et al. (1983) konnten bei
ihrer Studie nach intracerebroventriculärer Applikation von Theophyllin nicht die gleichen
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LITERATURÜBERSICHT
stimulierenden respiratorischen Effekte wie nach intravenöser Verabreichung von
Theophyllin beobachten. RALL (1993) erklärt die Steigerung des Atemminutenvolumens
durch die Methylxanthine durch eine Erhöhung der CO2-Empfindlichkeit. Laut
WETTENGEL (1998) zeigt sich diese zentrale atemstimulierende Wirkung nur bei
Theophyllin.
Die Kontraktion von Hirngefäßen und die Senkung des Liquordruckes durch Methylxanthine
werden in der Humanmedizin zur Therapie von vasomotorischen Kopfschmerzen genutzt
(MUTSCHLER, 1996). In hohen bis toxischen Dosen können sie allerdings zu Krämpfen
führen (LÖSCHER, 2006). Laut MUTSCHLER (1996) besitzt Theobromin diese
zentralerregenden Effekte praktisch nicht.
STAHLE et al. (1991) erklären anhand ihrer Studien den stärker ausgeprägten
zentralnervösen Effekt von Coffein, im Gegensatz zu Theophyllin, durch eine stärkere
Penetration von Coffein in das Gehirn, bedingt durch eine geringe Plasmaproteinbindung.
Periphere Wirkungen
Peripher bewirken die Methylxanthine über Relaxation der Bronchialmuskulatur eine
Bronchodilatation (SAWYNOK u. YAKSH, 1993; LÖSCHER, 2006). Sie ist bei Theophyllin
am stärksten ausgeprägt. Allerdings konnte von MAGNUSSEN (1986) gezeigt werden, dass
Theophyllin im Vergleich mit den β2-Sympathomimetika ein eher schwacher
Bronchodilatator ist. Theophyllin steigert außerdem die mucoziliäre Clearence, verbessert die
Zwerchfellskontraktionskraft und senkt den pulmoarteriellen Mitteldruck (WETTENGEL,
1998).
Theophyllin hat bereits bei Plasmakonzentrationen von 5-10 mg/l eine protektive Wirkung
gegenüber bronchokonstriktorischen Stimuli wie Histamin (WETTENGEL, 1998). Außerdem
hemmt es die T-Lymphocytenanhäufung im Lungengewebe und verhindert die Migration der
eosinophilen Granulozyten durch Hemmung der Interleukin-5-Freisetzung (MARKHAM u.
FAULDS, 1998; MUTSCHLER, 1990). Am Herzen stimulieren die Methylxanthine alle
Herzfunktionen (SAWYNOK u. YAKSH, 1993; LÖSCHER, 2006). Am stärksten ist die
Steigerung der Kontraktilität des Herzmuskels, also die positiv inotrope Wirkung
(MUTSCHLER, 1996). Außerdem führen Methylxanthine zur Zunahme des coronaren
Blutflusses (WETTENGEL, 1998) und zur Coronargefäßerweiterung (MUTSCHLER, 1996).
Dies, zusammen mit der peripheren Vasodilatation, erklärt die verstärkte Organdurchblutung
(RALL, 1980). Theophyllin ist dem Coffein hinsichtlich der therapeutisch ausnutzbaren
Effekte Broncholyse und Herzstimulation deutlich überlegen (LÖSCHER, 2006).
20
LITERATURÜBERSICHT
Methylxanthine führen zu einer Verstärkung der Lipolyse (LÖSCHER, 2006; MUTSCHLER,
1996; STAMFORD, 1989; DODD et al., 1993; GRAHAM et al., 1994). Laut MUTSCHLER
(1996), LÖSCHER (2006) und GRAHAM et al. (1994) verstärken Methylxanthine auch die
Glycogenolyse. STAMFORD (1989) und DODD et al. (1993) hingegen gehen davon aus,
dass Coffein die Glycogenolyse reduziert.
Erhöhte Nierendurchblutung und Gefäßerweitung erklären den diuretischen Effekt der
Methylxanthine (SAWYNOK u. YAKSH, 1993). Laut MUTSCHLER (1996) können sie als
schwache bis maximal mittelstarke Diuretika eingestuft werden.
Außerdem stimulieren sie die Magensaftsekretion (LÖSCHER, 2006) und hemmen die
Mastzelldegranulation (MUTSCHLER, 1996). Laut WETTENGEL (1998) und MARKAM
und FAULDS (1998) sind im Konzentrationsbereich von 5000-10000 ng/ml antientzündliche
und immunmodulierende Effekte nachweisbar.
Die unterschiedlichen Hauptwirkungen der verschiedenen Methylxanthine sind in Tab. 3
zusammenfassend dargestellt.
Wirkung Coffein Theophyllin Theobromin
zentrale Erregung +++ ++ - Herzstimulation + +++ ++ Broncho- und Vasodilatation ++ +++ +++ Stimulation der Skelettmuskulatur +++ ++ + Diurese + +++ ++ Tab.3: Pharmakodynamische Wirkungen der Methylxanthine (LÖSCHER, 2006)
Als unerwünschte Wirkungen können Tachycardie, Extrasystolen sowie gastrointestinale
Störungen durch Erhöhung der Magensaftsekretion auftreten. Coffein löst im Magen lokale
cholinerge Reflexe und die Freisetzung von Gastrin aus (MUTSCHLER, 1996). Daneben
kann es zu zentralnervösen Erregungszuständen kommen, weshalb die Anwendung bei
epileptischen Patienten besonderer Vorsicht bedarf (LÖSCHER, 2006). In der Humanmedizin
wird von der Verabreichung von Methylxanthinen in der Stillzeit abgeraten. In Tierversuchen
zeigten sich teratogene Wirkungen (MUTSCHLER, 1996). Während großer körperlicher
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LITERATURÜBERSICHT
Anstrengungen besteht eine erhöhte Gefahr von Dehydration aufgrund der
Herzfrequenzerhöhung und der gesteigerten Diurese (STAMFORD, 1989).
Beim Pferd kann es bereits bei Dosierungen von 10-30 mg/kg zur Tachycardie,
Tachyarrhytmie, Blutdruckabfall, Muskelrigidität und Muskelzittern, Unruhe bis hin zu
Krämpfen kommen (LÖSCHER, 2006).
CURRY et al. (1985) konnten die cardiovaskulären Folgen einer experimentellen
Theophyllinintoxikation bei Hunden effektiv mit α-Agonisten behandeln. BIBERSTEIN et al.
(1984) berichten von intravenöser Verabreichung von β-Antagonisten als effektivste Therapie
des Blutdruckabfalls bei Theophyllinintoxikationen.
Wechselwirkungen
Methylxanthine verstärken die Wirkung von Digitalispräparaten und β2-Sympathomimetika
(LÖSCHER, 2006). Coffein greift in die Stoffwechselvorgänge der Leber ein, die für die
Bildung von Gerinnungsfaktoren verantwortlich sind (KLÖCKING, 1996). Die Wirkungen
von Adenosin und von Benzodiazepinen werden abgeschwächt (NEHLIG et al., 1992).
Cimetidin, synthetische Methylxanthine, Tuberculoseimpfstoff, Gyrasehemmer und
Makrolidantibiotika verzögern die Biotransformation von Theophyllin und führen so zu einer
verstärkten und verlängerten Wirkung des Theophyllins. Barbiturate und Carbamazetin
erniedrigen den Theophyllinplasmaspiegel (MUTSCHLER, 1996). Bei gleichzeitiger
Anwendung von Aciclovir muss die Theophyllindosis vermindert werden. Coffein hat eine
entzündungshemmende Wirkung und unterstützt auch die antiinflammatorische Wirkung
einiger Cyclooxygenasehemmer, ohne selbst die Prostaglandinsynthese zu hemmen
(VINEGAR et al., 1976).
Molekulare Wirkungsmechanismen
Die Wirkungen der Methylxanthine werden durch verschiedene Mechanismen erklärt. Da die
therapeutischen Plasmakonzentrationen von Theophyllin oder Coffein im Bereich von 10-50
µmol/l liegen, wird die kompetitive Hemmung der Adenosinrezeptoren, die im
Konzentrationsbereich von 10-100 µmol/l nachgewiesen wurde, als der
Hauptwirkungsmechanismus angesehen (DUNWIDDIE und MASINO, 2001; FREDHOLM,
1980; DODD et al. 1993; RALL, 1982; NEHLING et al., 1992; SAWYNOK u. YAKSH,
1993). Andere Autoren erklären die Wirkung durch die Hemmung der Phosphordiesterase
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LITERATURÜBERSICHT
und dem dadurch bedingten Anstieg der intrazellulären Konzentration von cyclischem
Adenosinmonophosphat. Desweiteren führen Methylxanthine zur Calciummobilisation aus
dem Sarkoplasmatischen Reticulum und verhindern deren Rückspeicherung. Aufgrund der
benötigten Plasmaspiegel von 0,1-1 mmol/l, scheinen die beiden letztgenannten
Wirkungsmechanismen von untergeordneter Bedeutung zu sein.
Adenosin- Rezeptor- Blockade
Adenosin-Rezeptoren gehören zu den P1- Purinozeptoren mit den Subtypen A1, A2 und A3
(SAWYNOK u. YAKSH, 1993; MUTSCHLER, 1996; DALY et al., 1983). A1- und A2-
Rezeptoren werden aufgrund ihrer unterschiedlichen Stärke auf die Adenosin-Analoga
unterteilt. A1 wird nochmals in A1a und A1b nach der nötigen Agonistenkonzentration und A2
in A2a und A2b nach der unterschiedlichen Affinität zu N-Ethylcarboxamidadenosin an
verschiedenen Stellen unterschieden. A3 wird als Rezeptor beschrieben, der den Calciumfluss
reguliert, wobei hierbei Adenosin die Aktivität von Ionenkanälen ohne Wirkung auf die
cAMP-Konzentration beeinflusst (SAWYNOK u. YAKSH, 1993). Nach RALEVIC und
BURNSTOCK (1998) wird heute eine Einteilung der Adenosin-Rezeptoren in die vier
Subtypen A1, A2A, A2B und A3 durchgeführt. A1-Rezeptoren sind an Gil/2/3 oder an G0-Proteine
gekoppelt, A2A- Rezeptoren an GS, Golf oder an G15/16, A2B-Rezeptoren ebenfalls an GSoder an
Gq/11 und A3-Rezeptoren an Gi2/3 oder an Gq/11-Proteine (LELIEUR, 2004). Für die Rezeptoren
A1, A2A und A3 konnten bereits spezifische Agonisten und Antagonisten synthetisiert werden
(KLOTZ, 2000). Die Kopplung an die Phosphorlipase C zeigt sich bei allen Adenosin-
Rezeptoren. Die Aktivierung der Phophorlipase C führt zur Hydrolyse von
Phophatidylinositol-4,5-Diphosphat (PIP2), wodurch Diacylglycerol (DAG) und Inositol-
1,4,5-Triphosphat (IP3) entstehen. Dies führt zur Aktivierung der Proteinkinase C und zu
einer Erhöhung des intrazellulären Calcium-Spiegels. Außerdem haben die Adenosin-
Rezeptoren Einfluss auf die Regulation der Adenylatcyclase. Die A1- und A3-Rezeptoren
bewirken eine Inhibition und die A2A- und A2B- Rezeptoren hingegen eine Stimulation der
Adenylatcyclase und haben auf diese Weise Einfluss auf den intrazellulären Gehalt an cAMP
(LELIEUR, 2004).
Adenosin ist an der Blutdruckregulation im Gehirn und an der Niere beteiligt, am Schlaf-
Wach-Rhythmus sowie sehr wahrscheinlich an der Induktion und Aufrechterhaltung des
Schlafes. Außerdem hat Adenosin eine thrombocytenaggregationshemmende Wirkung
(MUTSCHLER, 1996).
23
LITERATURÜBERSICHT
Die autoregulatorische Steigerung der Coronardurchblutung ist ebenfalls adenosinvermittelt.
Sauerstoffmangel im Myocard bewirkt eine unzureichende Resynthese von ATP, was
wiederum zu einer Zunahme von Adenosin führt, welches eine Dilatation der Coronargefäße
bewirkt (MUTSCHLER, 1996; GROTHE, 1990).
Wird durch Adenosin über die A1-Rezeptoren am Herzen die Adenylatcyclase gehemmt,
öffnen sich die Kalium-Kanäle im Sinusknoten, das Membranruhepotential nimmt zu und die
Herzfrequenz sinkt. Adenosin hat eine negativ chronotrope Wirkung. Am AV-Knoten werden
durch Adenosin die Calcium-Kanäle blockiert, was zu einem negativ dromotropen Effekt
führt. An den Herzkammern hat Adenosin keine Wirkung.
Methylxanthine schwächen durch Blockade der Adenosin-Rezeptoren die Wirkung von
Adenosin ab (DUNWIDDIE und MASINO, 2001), und führen so am Herzen zu positiv
chronotropen und positiv dromotropen Effekten (MUTSCHLER, 1996).
Adenosin wirkt vasokonstriktorisch an den Vasa afferentia. Die Blockade des Adenosin-
Rezeptors durch Methylxanthine führt zu einer Mehrdurchblutung der Niere mit einer
Durchblutungssteigerung des Nierenmarks. Der Widerstand der Vasa afferentia sinkt stärker
als der der Vasa efferentia, somit steigt die glomeruläre Filtrationsrate. Die Wirkung beruht
zumindest teilweise auf einer vermehrten Primärharnbildung. Die verstärkte Durchblutung
des Nierenmarks verhindert zusätzlich die Aufrechterhaltung des dort normalerweise hohen
Konzentrationsgradienten. Das führt zu einer verstärkten Diurese (MUTSCHLER, 1996).
Wird die adenosinvermittelte Inhibition der Lipolyse durch Coffein antagonisiert, soll dies zu
einer Erhöhung der freien Fettsäuren im Blut führen (DODD et al., 1993).
Die kompetetive Adenosin-Rezeptor-Blockade durch Methylxanthine findet laut SAWYNOK
u. YAKSH (1993) im Konzentrationsbereich von 10-100 µmol/l statt und liegt damit im
Bereich der erreichbaren Plasmaspiegel. Theophyllin ist ein geringgradig potenterer
Antagonist als Coffein, und beide Methylxanthine weisen eine geringe
Rezeptorsubtypenselektivität auf.
Konzentrationen von 10-300 µmol/l blockieren Adenosin-Effekte prä- und postsynaptisch im
zentralen sowie im peripheren Nervensystem. A3-Rezeptoren sind auf ähnliche
Methylxanthin-Konzentrationen sensibel, intrazelluläres Andenosin ist nicht methylxanthin-
sensibel (SAWYNOK u. YAKSH, 1993). Laut DODD et al. (1993) bewirken bereits
Plasmakonzentrationen von 40 µmol/l eine 50 %ige Blockierung der Adenosin-Rezeptoren.
24
LITERATURÜBERSICHT
Phosphodiesterase- Hemmung
Viele Reaktionen im Organismus laufen über „second messenger“ ab: Der „erste Bote“ (zum
Beispiel ein Hormon) bindet an einen speziellen Hormonrezeptor an der Plasmamembran.
Diese Bindung führt zur Stimulierung des membrangebundenen Effektorenzyms
Adenylatcycase. Dieses Enzym katalysiert intrazellulär die Umwandlung von
Adenosintriphosphat (ATP) zu cyclischem Adenosinmonophosphat (cAMP). Dieser „second
messenger“ cAMP steuert über allosterische Interaktionen die Aktivität von sekundären
Effektorenzymen, die wiederum bestimmte Proteine in der Zelle phophorylieren und dadurch
biologische Wirkungen auslösen (KALSON et al., 1994). Das intrazelluläre Enzym
Phosphodiesterase (PDE) baut cAMP wieder ab. Stoffe, die die PDE hemmen, bewirken
durch Verhinderung der Spaltung von cAMP, dass der intrazelluläre cAMP-Spiegel hoch
bleibt und führen somit zu einer Verlängerung und Intensivierung der cAMP-Wirkung
(STRYER, 1990a).
Über diesen Wirkmechanismus führen die Methylxanthine zu ähnlichen Effekten wie die β-
Sympathomimetika, welche durch Stimulation der Adenylatcyclase die cAMP- Konzentration
erhöhen. Es resultieren Relaxation der glatten Gefäß- und Bronchialmuskulatur, Stimulation
der Herzfunktionen und Verstärkung der Lipolyse (LÖSCHER, 2006; MUTSCHLER, 1996;
STRYER, 1990b; VOET und VOET, 1994). Die Erhöhung der cAMP-Konzentration in den
Thrombocyten hemmt viele Plättchenfunktionen, wodurch Theophyllin
aggregationshemmend wirken kann (KLÖCKING, 1996). Phosphodiesterasen werden je nach
Substratspezifität und subzellulärer Lokalisation in elf Unterfamilien unterteilt. Coffein und
Theophyllin inhibieren sowohl Ca++-abhängige als auch unspezifische, freie und
membrangebundene Phosphodiesterasen im Zentralen Nervensystem. Da sie nicht nur die
PDE III hemmen, die für die cardialen Effekte verantwortlich gemacht wird, ergeben sich die
vielen extracardialen Wirkungen (SPONER, 1996). Eine ungefähr 50%ige PDE-Hemmung
durch Coffein wird bei 480-750 µmol/l und durch Theophyllin im Bereich von 350-1000
µmol/l beobachtet (SAWYNOK u. YAKSH, 1993). DODD et al. (1993) geben für eine
50%ige PDE-Hemmung durch Methylxanthine eine Plasmakonzentration von ca. 1000 µmol/l
an. FREDHOLM (1985) gibt Plasmakonzentrationen von > 1000 mol/l zur vollständigen
PDE-Hemmung an. Laut DALY et al. (1983) werden für diese Hemmung lediglich
Konzentrationen von 500-1000 µmol/l erfordert.
Also ist dieser Wirkmechanismus vor allem im Konzentrationsbereich von 100-1000 µmol/l
relevant und therapeutische Konzentrationen von 10-50 µmol/l können nicht ausschließlich
25
LITERATURÜBERSICHT
über diesen Weg zu ihrem Effekt führen. Die PDE-Hemmung ist zu einem gewissen
Prozentsatz an der Wirkung beteiligt und ist eventuell für die Toxizität mitverantwortlich
(SAWYNOK u. YAKSH, 1993).
Mobilisation von Calcium
Der Effekt von Coffein auf den Calciumhaushalt der Zelle wurde zuerst am Skelettmuskel
untersucht (BIANCHI, 1961; NEHLIG et al., 1992). Bei Untersuchungen im Labor ließ sich
durch Coffein die Kontraktion erhöhen und bei höheren Konzentrationen trat eine
Dauerkontraktion auf. Die Kontraktion resultiert aus der Zunahme des intrazellulär
verfügbaren Ca++, da Coffein die Freisetzung von Ca++ aus dem Sarkoplasmatischen
Retikulum fördert und die Rückspeicherung hemmt (JOHNSON und INESI, 1969).
Außerdem soll Coffein eine Erhöhung der Sensibilität der Myofilamente für Calcium
bewirken ( DODD et al., 1993).
Dies geschieht im Konzentrationsbereich von ca. 1000-2500 µmol/l und trägt somit nur bei
höheren Konzentrationen zur Wirkung der Methylxanthine bei und ist eventuell
mitverantwortlich für die Toxizität der Methylxanthine (SAWYNOK u. YAKSH, 1993;
KATZ et al., 1977). FREDHOLM (1995) hält einen Einfluss der Calciummobilisation auf die
Gesamtwirkung der Methylxanthine für nahezu ausschließbar, da er die nötigen
Konzentrationen im millimolaren Bereich angibt. DALY (1993) gibt die nötigen
Konzentrationen mit 1-10 mmol/ l an. Laut DODD et al. (1993) werden invitro für die Ca++-
Mobilisation und die Verhinderung der Rückspeicherung lediglich Konzentrationen von 500-
750 µmol/l benötigt.
Bei Konzentrationen von 200-2000 µmol/l kann Coffein laut SAWYNOK u. YAKSH (1993)
nur durch Verbesserung der Ca++-induzierten Ca++-Ausschüttung indirekt die Calcium-
Konzentration erhöhen.
Benzodiazepin – Antagonismus
Anhand von In-vitro-Versuchen an Ratten- und Menschengehirnen konnten MARANGOS et
al. (1979) eine kompetitive Hemmung der Diazepamwirkung durch Theophyllin, Theobromin
und Coffein nachweisen. Die Hemmwirkung durch Coffein ist stärker als die von Theophyllin
und Theobromin und zeigte sich bei Konzentrationen von 500-700 µmol/l. Dies bestätigen
auch klinische Studien von MATTILA et al. (1982). Auch BOULANGER (1982) stufte die
Methylxanthine als Benzodiazepinantagonisten ein. Laut NEHLIG et al. (1992) binden
26
LITERATURÜBERSICHT
Methylxanthine an Benzodiazepinrezeptoren, ihre Affinität zu diesen ist aber im Vergleich zu
Adenosinrezeptoren sehr schwach.
Auswirkungen auf den Noradrenalinabbau
Coffein und Theophyllin verstärken die Noradrenalinwirkungen an Blutgefäßen. Sie hemmen
die Wiederaufnahme von Noradrenalin in das Neuron und den Abbau der Katechol-O-
Methyltransferase (KALSNER, 1971; KALSNER et al, 1975). Laut NEHLIG, DAVAL und
DEBRY (1992) induzieren Coffein und Theophyllin eine Zunahme der
Noradrenalinsyntheserate und vermindern die Dichte der β-Adrenorezeptoren im Gehirn. Dies
tritt bei Konzentrationen von 150 µmol/l auf und wird an den Wirkungen der Methylxanthine
auf das Gefäßsystem beteiligt sein. Laut DODD et al. (1993) und ROBERTSON et al. (1978)
verursacht Coffeinaufnahme bei nicht coffeingewöhnten Menschen eine Erhöhung der
Plasmacatecholamine.
2.3.3. Theophyllin
1888 entdeckte Albrecht Kossel das Theophyllin als Bestandteil des Tees (WETTENGEL,
1998). Aber erst nachdem die industrielle Herstellung von Theophyllin rund um die
Jahrhundertwende möglich wurde, konnte es als Reinsubstanz genutzt werden. Zunächst
wurde es allerdings lediglich als Diuretikum eingesetzt. Die bronchospasmolytische Wirkung
entdeckte 1922 der Arzt S. R. Hirsch. Seine auf seinen Studien begründete Empfehlung,
Theophyllin zur Asthmatherapie einzusetzen, fand allerdings lange Zeit keine Beachtung.
Auch Veröffentlichungen der Ärzte Herrmann und Aynesworth 1936 zum erfolgreichen
Einsatz von Theophyllin beim Status asthmaticus hatten zunächst kaum Auswirkungen auf
die Anwendung in der Asthmatherapie (WETTENGEL, 1998).
Durchsetzen konnte sich Theophyllin erst nach der Entwicklung von Retard-Präparaten in den
70er Jahren und weiteren Studien, die den therapeutischen Stellenwert als
Asthmatherapeutikum zusätzlich begründeten. In den 80er Jahren wurde das Theophyllin von
den topischen Steroiden als Basisasthmatherapeutikum verdrängt. Inzwischen ist der
kombinierte Einsatz in der Asthmatherapie, gerade bei der Behandlung der schwereren
Verlaufsformen, wieder üblich (WETTENGEL, 1998).
27
LITERATURÜBERSICHT
Physikalisch- chemische Eigenschaften
Theophyllin (1,3-Dimethylxanthin bzw. 1,3-Dimethyl-2,6(1H,3H)-purindion) hat eine
Molmasse von 180,16 und die Summenformel C7 H8 N4 O2 (MERCK INDEX, 2001). 1 g löst
sich in 120 ml Wasser, besser in heißem Wasser (PHARMAZEUTISCHE STOFFLISTE,
2006), 80 ml Ethanol oder 110 ml Chloroform (MERCK INDEX, 2001). Theophyllin zersetzt
sich in verdünnten Mineralsäuren, Ammoniak und Alkalihydroxid-Lösungen
(PHARMAZEUTISCHE STOFFLISTE, 2006). Durch die heterozyklisch gebundenen N-
Atome reagieren die Methylxanthine schwach basisch, Theophyllin hat einen pKa-Wert von
8,77 (MERCK INDEX, 2001). Theophyllin ist weißes, geruchloses, bitter schmeckendes,
kristallines Pulver mit einem Schmelzpunkt bei 270°C. Die Strukturformel wird in Abb.1
gezeigt.
Pharmakokinetik
Nach oraler Applikation ist die Resorption von Theophyllin aus dem Magen-Darmtrakt des
Menschen und auch des Hundes nahezu vollständig (OGILVIE, 1978). TSE und SZETO
(1981) geben die orale Absorption beim Hund mit > 90% an, MC KIERNAN et al. (1981) mit
91%. Die Bioverfügbarkeit wird mit 80-90% und das Verteilungsvolumen mit 0,6 l/kg
angegeben (LÖSCHER et al., 2006b; MC KIERNAN et al., 1981). BOURAOUI et al. (1994)
ermittelten bei Kaninchen ein Verteilungsvolumen von 0,79 l/kg. LOEFFLER et al.(2000b)
konnten bei Hunden eine Bioverfügbarkeit nach oraler Verabreichung von 73% nachweisen.
Die Plasmahalbwertzeit nach intravenöser Applikation liegt bei Hunden bei 5 Stunden
(LOEFFLER et al., 2000b) bzw. 3,8-6,4 Stunden (TSE und SZETO, 1981), und nach oraler
Verabreichung bei 4,3-7,5 Stunden (TSE und SZETO, 1981). LOEFFLER et al. (2000b)
ermittelten in ihrer Studie kürzere Halbwertzeiten von 3,2 Stunden nach oraler Applikation.
Laut LÖSCHER (2006) ist die Halbwertzeit tierartlich sehr unterschiedlich. Er gibt sie beim
Hund mit 6 Stunden, beim Schwein mit 11 Stunden und beim Pferd mit 10-17 Stunden an.
Methylxanthine werden hauptsächlich in der Leber durch oxidative Demethylierung,
Kohlenstoff-Oxidation und Acetylierung metabolisiert. Theophyllin kann zu den
Monomethylxanthinen 3- bzw. 1-Methylxanthin demethyliert und weiter zu
Harnsäurederivaten oxidiert werden oder durch Ringspaltung direkt zu Uracilderivaten
hydriert und oxidiert werden (ARNAUD 1987). Nach TANG- LUI und RIEGELMAN (1981)
werden ca. 90% des verabreichten Theophyllins per Ringoxidation und N-Demethylierung zu
1,3-Dimethylharnsäure, 3-Methylxanthin und 1-Methylharnsäure verstoffwechselt. Rund 10%
28
LITERATURÜBERSICHT
des aufgenommenen Theophyllins werden unverändert über die Niere ausgeschieden
(OGILVIE, 1978).
Aus Theophyllin kann im Organismus Coffein gebildet werden. Nach TANG-LIU u.
RIEGELMAN (1981) werden beim Menschen ca. 6% des verabreichten Theophyllins zu
Coffein metabolisiert, bevor dieses vor der renalen Ausscheidung weiter verstoffwechselt
wird. Diese endogene Coffeinsynthese konnte auch bei Pferden beobachtet werden (TODI et
al., 1999). STAHLE et al. (1991) konnten in ihren Studien diesen Metabolismus von
Theophyllin zu Coffein bei Ratten nicht nachweisen. Eine Synthese von Coffein aus
Theobromin oder Paraxanthien konnte nicht beobachtet worden.
Die letale Dosis 50 liegt beim Hund bei 290 mg/kg KM und bei Katzen bei 800 mg/kg KM
(SUTTON, 1981).
Therapeutischer Einsatz
Laut MUTSCHLER (1990) ist Theophyllin in der Humanmedizin im Stufenplan der
Asthmatherapie bei schweren bis sehr schweren Symptomen vorgesehen, wobei der
therapeutische Plasmaspiegel im Bereich von 6000-12000 ng/ml liegt. Humanmedizinisch
sind neben Theophyllin als Injektionslösung und als Retardpräparate auch Formen des
wasserlößlichen Ethyldiaminkomplexes (Aminophyllin) und Theophyllin- Natriumglycinat
im Handel (LÖSCHER, 2006).
Zulassungssituation in der Veterinärmedizin
In der Veterinärmedizin ist zur Zeit kein Präparat mit dem Hauptwirkstoff Theophyllin
zugelassen.
Die Dosierung von Theophyllin zur Behandlung von Bronchialasthma und anderen
Indikationen für Bronchodilatation wird mit 5-6 mg/kg Körpergewicht intravenös und bis zu
10 mg/kg Körpergewicht oral angegeben. Pferde sollen initial 10 mg/kg appliziert bekommen
und anschließend als Erhaltungsdosis 5 mg/kg täglich über 10 bis 14 Tage (LÖSCHER,
2006).
29
LITERATURÜBERSICHT
2.3.4. Theobromin
Theobromin wurde 1842 erstmals von Woskresensky isoliert (ARNAUD, 1984). Früher
wurde es als Diuretikum und Herzstimulanz genutzt, bis es von neueren, wirksameren
Präparaten ersetzt wurde ( BOOTH, 1977).
Physikalisch- chemische Eigenschaften
Theobromin (3,7-Dimethylxanthin) hat genau wie Theophyllin eine Molmasse von 180,16
und die Summenformel C7 H8 N4 O2 (MERCK INDEX, 2001). Theobromin ist eine schwache
Base (pKs1 < 1) und eine schwache Säure (pKs2 = 10). Ein Gramm Theobromin löst sich in
2000 ml Wasser, in 150 ml kochendem Wasser oder in 2220 ml 95%igem Alkohol. In Ether,
Benzol oder Chloroform ist Theobromin fast unlöslich (PHARMAZEUTISCHE
STOFFLISTE, 2006). Bei der Komplexbildung mit Natriumacetat oder Natriumsalicylat
entsteht ein stark hygroskopisches Pulver, welches CO2 aus der Luft adsorbiert. Auch
Theobromin ist ein weißes, geruchloses kristallines Pulver allerdings mit einem
Schmelzpunkt bei 357°C (MERCK INDEX, 2001). Die Strukturformel wird in Abb.1 gezeigt.
Pharmakokinetik
Aus dem Gastrointestinaltrakt von Säugetieren wird Theobromin schnell und gut resorbiert.
Es passiert aufgrund seiner hydrophoben Eigenschaften biologische Membranen gut und
verteilt sich in sämtliche Körperkompartimente. So passiert es die Plazentaschranke und
penetriert in die Milch. Die Penetration der Blut-Hirn-Schranke erfolgt ebenfalls, allerdings in
geringerem Ausmaß als bei Coffein (SNYDER et al., 1981).
Theobromin wird genau wie Theophyllin hauptsächlich in der Leber metabolisiert. Die
Ausscheidung erfolgt auch bei Theobromin überwiegend renal. Im Harn sind beim Menschen
nach Theobrominaufnahme die Metaboliten 7-Methylxanthin (28-30%), 3-Methylxanthin (14-
21%) und 7-Methylharnsäure sowie 11-12% unverändertes Theobromin enthalten (CORNISH
und CHRISTMAN, 1957). Im Harn von Ratten fanden ARNAUD und WELSCH (1979) nach
Theobrominverabreichung ursprüngliches Theobromin (49%), 6-Amino-5-[N-
Formylmethylamino]-1-Methyluracil (36%), 7-Methylxanthin (7%), 7-Methylharnsäure (4%),
3,7-Dimethylharnsäure (3%) sowie geringe Mengen Dimethylallantoin und N-
Methylharnstoff.
30
LITERATURÜBERSICHT
Therapeutischer Einsatz
Theobromin findet heute als Medikament keine Anwendung mehr.
Durch den Theobromingehalt der Kakaobohne und ihren Einsatz in der Futtermittelindustrie
sowie als Bestandteil von Schokolade kommt dem Theobromin eher eine Bedeutung als
Ursache von Vergiftungen zu. Während des zweiten Weltkrieges wurden dem Viehfutter
häufig kakaohaltige Abfälle zugemischt, um den Energiegehalt des Futters preiswert zu
erhöhen (LAMBERT et al., 1985). Dies führte zu zahlreichen Intoxikationen (DROLET et al.,
1984; SUTTON, 1981). Ebenso wird in der Literatur über Vergiftungen von Haustieren durch
die Aufnahme von Schokolade berichtet (SUTTON, 1981; DROLET et al., 1984;
STRACHAN und BENNET, 1994; DECKER und MYERS, 1972).
Die letale Dosis beim Hund wird von STACHAN und BENNETT (1994) mit 100 mg/kg
Körpergewicht reinem Theobromin angegeben. Dunkle Schokolade mit einem hohen
Kakaoanteil kann bis zu 630 mg Theobromin pro 100 g enthalten, so dass ein kleiner Hund
nach dem Verzehr von zwei Tafeln dunkler Schokolade bereits Theobromin in letaler Dosis
zu sich genommen hat. Der LD 50- Wert bei Katzen liegt bei ca. 200 mg/kg (SUTTON,
1981).
Zulassungssituation in der Veterinärmedizin
Weder in der Veterinär- noch in der Humanmedizin ist zur Zeit ein Präparat mit dem
Hauptwirkstoff Theobromin zugelassen.
31
LITERATURÜBERSICHT
2.4. Pharmakokinetische Grundlagen
Die Wirkung eines Arzneimittels ist das Ergebnis zahlreicher komplexer Vorgänge im
Organismus, die in die pharmazeutische, die pharmakokinetische und in die
pharmakodynamische Phase unterteilt werden können (MUTSCHLER, 1996). Die
pharmazeutische Phase umfasst den Zerfall bzw. das Auflösen des verabreichten Pharmakons
in einen resorptionsfähigen Zustand und hängt somit vor allem mit der Galenik des
Arzneimittels zusammen. Zur pharmakokinetischen Phase gehören alle Einflüsse des
Organismus auf das Arzneimittel (FICHTL et al., 1996). Sie umfasst die Resorption, die
Verteilung, den Metabolismus (Biotransformation) und die Exkretion (Ausscheidung) eines
Pharmakons (KOCH und RITSCHEL, 1986). Die pharmakodynamische Phase beinhaltet alle
Wirkungen des Pharmakons auf den Organismus.
Resorption:
Unter der Resorption eines Pharmakons versteht man dessen Aufnahme in die Blutbahn, über
die es dann im Organismus verteilt wird (MUTSCHLER, 1996). Wie schnell und vollständig
ein Arzneimittel resorbiert wird, hängt neben vielen Faktoren vor allem von seinen
physikalisch-chemischen Eigenschaften, von der Teilchengröße, der Applikationsart und des
Applikationsortes, von der verwendeten Arzneiform, der Größe der Resorptionsfläche, dem
Maß der Zerstörung durch z.B. Darmenzyme und der Interaktion mit andern Arzneimitteln ab
(BENET et al., 1996; KOCH und RITSCHEL, 1986). Bei der intravasalen Applikation
entfällt die Resorption, da das Pharmakon direkt in die Blutbahn verbracht wird. Aufgrund
dessen ist der Wirkungseintritt bei der intravasalen Applikation am schnellsten.
Verteilung:
Ist ein Pharmakon in die Blutbahn gelangt, wird es mit dem Blut in alle Organe des Körpers
transportiert. Nach DOST (1968) erstreckt sich die Verteilung eines Stoffes auf das Plasma,
den Extra- und Intrazellularraum und auf die Anreicherung in bestimmten Geweben.
Stoffeigenschaften wie Lipophilie, Molekülgröße, Plasma- und Gewebsproteinbindung
beeinflussen die Verteilung. Ein Pharmakon ist bestrebt die Blutbahn zu verlassen, um sich
anhand des Konzentrationsgefälles im gesamten Körper gleichmäßig zu verteilen. Aufgrund
dessen wird das Arzneimittel schneller in die stärker durchbluteten Gewebe verteilt als in die
weniger gut durchbluteten. Dies gleicht sich nach Erreichen des Verteilungsgleichgewichts
wieder aus. Der Austritt des Stoffes aus der Blutbahn geschieht auf ähnlichem Wege wie der
32
LITERATURÜBERSICHT
Eintritt. Allerdings variieren die Bedingungen, wie z.B. das Konzentrationsgefälle, stark in
Abhängigkeit des Gewebes oder der Körperflüssigkeit. Neben den bereits oben aufgeführten
Faktoren ist auch die Bindung an Plasmaproteine bedeutsam, die eine Abgabe an das Gewebe
deutlich verringert.
Unter funktionellen Gesichtspunkten kann der gesamte Organismus in verschiedene
Verteilungsräume (Kompartimente) eingeteilt werden. Zum Intrazellularraum (75%) gehören
die intrazelluläre Flüssigkeit und die intrazellulären festen Zellbestandteile. Zum
Extrazellularraum (25%) gehören das intravasale Plasmawasser, die Flüssigkeit im
Intestinum, sowie diejenige im festen Bindegewebe und die transzellulären Flüssigkeiten.
Hinsichtlich ihrer Verteilung und Anreicherung auf die verschiedenen Kompartimente lassen
sich Arzneimittel in drei verschiedene Gruppen aufteilen: Stoffe, die sich nur im Plasma
verteilen, solche die sich nur im Plasma und im restlichen Extrazellularraum verteilen und
Stoffe, die sich sowohl im Extra- als auch im Intrazellularraum verteilen (MUTSCHLER,
1996).
Biotransformation:
Die Metabolisierung von Fremdstoffen erfolgt vor allem in der Leber, aber zum Teil auch in
anderen Organen wie dem Darm, der Niere, der Lunge oder der Milz (KOCH und
RITSCHEL, 1986). Sie hat den Zweck, Stoffe in eine ausscheidbare Form zu bringen. Dazu
werden die Stoffe von Enzymen in einer Phase-I-Reaktion meist zunächst oxidativ, reduktiv
oder hydrolytisch verändert, um die Polarität zu erhöhen und besser chemische Bindungen
eingehen zu können (FRAIGLE, 1981). Anschließend werden sie in einer Phase-II-Reaktion
an einen körpereigenen Stoff gekoppelt, um damit ausgeschieden werden zu können.
Manche der durch Biotransformation entstehenden Stoffe sind weiterhin wirksam, werden
erst durch die Biotransformation wirksam oder haben sogar schädliche Wirkungen. Andere
Stoffe wiederum behindern ebenfalls auszuscheidende Stoffe bei der Ausscheidung oder
beschleunigen diese. Diese Mechanismen können die Wirksamkeit mancher Arzneimittel
stark verändern und müssen als Neben- oder Wechselwirkungen beachtet werden
(MUTSCHLER, 1996).
Ausscheidung:
Die Ausscheidung eines Pharmakons erfolgt entweder in unveränderter Form oder als
Metabolit. Das Hauptausscheidungsweg ist renal über den Urin. Desweiteren kann ein Stoff
biliär und intestinal über die Faezes oder pulmonal über die Ausatemluft ausgeschieden
33
LITERATURÜBERSICHT
werden. Eine Ausscheidung über die Milchdrüse, die Haut und den Speichel oder Schweiß
sind ebenfalls möglich, quantitativ allerdings von untergeordneter Rolle (BENET et al.,
1996).
Die renale Ausscheidung von Stoffen kann je nach Löslichkeit, Proteinbindung und pka- Wert
und pH-Wert des Urins in Form von glomerulärer Filtration, tubulärer Rückresorption sowie
als aktive tubuläre Sekretion erfolgen. Durch die glomeruläre Filtration wird in der Niere ein
Ultrafiltrat des Plasmas abgepresst. Auf diesem Weg gelangen freie, nicht proteingebundene
Stoffe in den Primärharn. Die tubuläre Rückresorption der Stoffe erfolgt durch passive
Diffusion. Daher ist diese durch den pH-Wert des Urins zu verändern. Ansäuerung oder
Alkalisierung des Urins kann dazu führen, dass ein Pharmakon überwiegend in der
nichtionisierten Form vorliegt, somit nicht rückresorbiert und dadurch schneller
ausgeschieden wird (KAMERLING und OWENS, 1994). Bei der tubulären Sekretion werden
Stoffe durch aktiven Transport ausgeschieden. Starke Säuren und Basen werden auf diesem
Weg ausgeschieden. Eine Proteinbindung beeinflusst die tubuläre Sekretion nicht.
Stoffe mit einem Molekulargewicht von über 500 Dalton werden meist über die Galle
ausgeschieden. Sie treten entweder durch Diffusion oder durch aktiven Transport aus der
Leberzelle in die Gallenkapillare über. Die pulmonale Ausscheidung erfolgt nur per Diffusion
anhand des Konzentrationsgefälles zwischen Blut und Atemluft.
Basierend auf gemessenen Plasmakonzentrationen erfolgen pharmakokinetische
Berechnungen unter Verwendung verschiedener Modellvorstellungen:
Kinetik 0. Ordnung:
Hierbei wird pro Zeiteinheit eine konstante Menge eine Pharmakons resorbiert oder
eliminiert. Die Größe der Änderung erfolgt dabei unabhängig von der Ausgangskonzentration
(FORTH et al., 1996). Es wird pro Zeiteinheit eine konstante Menge resorbiert oder eliminiert
bis schließlich das gesamte Depot resorbiert/ eliminiert ist (KOCH und RITSCHEL, 1986).
Ein solcher Verlauf kommt dann vor, wenn der aufnehmende (z. B. ein aktiver
Transportmechanismus) bzw. ausscheidende (z.B. ein Enzym) Mechanismus gesättigt ist.
34
LITERATURÜBERSICHT
t
M
Abb.3: Resorption nach einer Kinetik 0. Ordnung (FREY, 2002)
M = Konzentration t = Zeit
Kinetik 1. Ordnung:
Bei einer Kinetik 1. Ordnung wird ein Pharmakon proportional seiner jeweiligen
Konzentration resorbiert oder eliminiert (KOCH und RITSCHEL, 1986). Trägt man die
Menge im Depot (M) gegen die Zeit (t) auf, erhält man eine Exponentialkurve, die sich
n,
er Menge im Depot) kann diese Kurve in eine Gerade umgewandelt werden (FREY, 2006;
.
asymptotisch der Nulllinie nähert. Durch Logarithmierung der Ordinate (der Konzentratio
d
KIETZMANN, 1983)
t
M
Abb.4: Lineare Darstellung einer Resorption nach einer Kinetik 1. Ordnung (MUTSCHLER, 1996)
M = Konzentration t = Zeit
35
LITERATURÜBERSICHT
1
10
log M
t
Abb.5: Halblogarithmische Darstellung einer Resorption nach einer Kinetik 1. Ordnung
(MUTSCHLER, 1996)
M = Konzentration
4). Dabei
ird der Organismus in einzelne Verteilungsräume (Kompartimente) unterteilt, die kinetisch
betrachtet werden und in denen jeweils die Wirkstoffkonzentration identisch ist
OCH und RITSCHEL, 1986). Je nach Applikationsart, Verteilungsverhalten,
artimentmodelle
ngewendet werden (KIETZMANN, 1983).
Kinetik nach i.v. Injektion:
ravenöser Applikation im Körper als in
t = Zeit
Pharmakokinetische Modelle:
Zur Beschreibung der Konzentrationsverläufe von Wirkstoffen werden in der
Pharmakokinetik häufig Kompartiment-Modelle verwendet (DYKE und SAMS, 199
w
als einheitlich
(K
Metabolisierungs- und Eliminationsverhalten können Ein- oder Mehrkomp
a
Ein-Kompartiment-Modell /
Hierbei wird angenommen, dass sich ein Stoff nach int
einem einzigen Kompartiment gleichmäßig verteilt (DERENDORF, 2002).
Abb.6: Ein-Kompartiment-Modell nach intravenöser Applikation 1 = zentrales Kompartiment K 10 = Eliminationsgeschwindigkeitskonstante
36
LITERATURÜBERSICHT
Folgt die Elimination dabei einer Kinetik 1. Ordnung, lässt sich die Abnahmegeschwindigkeit
des Plasmaspiegels berechnen und ergibt nach Integration die Exponentialfunktion:
t = C0 · e -kel · t
rade mit der Gleichung:
C = ln C0 – kel · t
Geschwindigkeit der Elimination.
wei-Kompartiment-Modell / Kinetik nach i.v. Injektion:
esem Modell geht man davon aus, dass sich der Stoff nach intravenöser Verabreichung
it unterschiedlicher Geschwindigkeit in die verschiedenen Kompartimente verteilt. Man
s timent, welches sich kinetisch wie das Transportorgan Blut
e ripheres Kompartiment (DERENDORF, 2002). Laut BAGGOT (1978)
sc t d s rmakokinetik der meisten Therapeutika am besten.
C
Bei logarithmischer Umformung erhält man eine Ge
ln kel = Eliminationskonstante C0, Ct = Plasmaspiegel zur Zeit t bzw. Ausgangskonzentration
Die Steigung der Geraden ist ein Maß für die
Z
Bei di
m
unter cheidet das zentrale Kompar
verhält und in pe
be hreib ie es Modell die Pha
Abb. 7: Zwei-Kompartiment-Modell nach intravenöser Applikation
1 = zentrales Kompartiment 2 = peripheres Kompartiment
12 = Transferkonstante für den Transport von 1 nach 2 21 = Transferkonstante für den Transport von 2 nach 1 K 10 = Eliminationsgeschwindigkeitskonstante
KK
37
LITERATURÜBERSICHT
Bei halblogarithmischer Darstellung der Plasmakonzentrationen fallen diese zunächst rasch
bfallenden Geraden zu liegen. Es zeigt sich ein
n n.
ie Gleichung für die Plasmakonzentrationskurve lautet wie folgt:
C =
C = Plasmakonzentration
C1 und Cz = Ordinatenabschnitte C und C = C0
ab, um später auf einer weniger stark a
biexpo entieller Phasenverlauf der Gerade
D
tzt eCeC ⋅−⋅− ⋅+⋅ λλ2
11
1 2
λ 1 und λ z = Hybridkonstanten
ohl Verteilungs- als auch
Hybridkonstanten sind Geschwindigkeitskonstanten, in die sow
Eliminationsvorgänge einfließen.
λ 1 charakterisiert vorwieg λ zend die Verteilungsgeschwindigkeit, vorwiegend die
inetik bei einmaliger oraler Gabe:
ei oraler Verabreichung laufen Resorption, Verteilung und Elimination parallel zueinander
Eliminationsgeschwindigkeit,.
K
B
ab. Bei einem diese Situation beschreibenden Modell muss ein Eingangskompartiment
hinzugefügt werden, welches das Substanzdepot enthält (MUTSCHLER, 1996).
Abb. 8: Zwei-Kompartiment-Modell nach einmaliger oraler Applikation
0 = Eingangskompartiment
K 01 Resorptionsgeschwindigkeitskonstante K 10 Eliminationsgeschwindigkeitskonstante
1 = zentrales Kompartiment
==
38
LITERATURÜBERSICHT
Abb. 9: Drei-Kompartiment-Modell nach einmaliger oraler Applikation
Funktion gibt die Gleichung für die Kurvenverläufe für Resorption,
limination und gleichzeitige Resorption und Elimination linear und halblogarithmisch
r 10):
=
0 = Eingangskompartiment 1 = zentrales Kompartiment 2 = peripheres Kompartiment K 01 = Resorptionsgeschwindigkeitskonstante K 10 = Eliminationsgeschwindigkeitskonstante K 12 = Transferkonstante für den Transport von 1 nach 2 K 21 = Transferkonstante für den Transport von 2 nach 1
Die sogenannte Bateman-
E
wiede (BATEMAN, 19
( )tktkel
el
eekkkC ⋅−⋅− −⋅
−⋅ 1
1
10 C
.
2.5. Pharmakokinetische Parameter
):
ls Bioverfügbarkeit (F) wird das Ausmaß und die Geschwindigkeit bezeichnet, mit der ein
m freigesetzt, resorbiert und am Wirkort verfügbar ist. Somit
erabreichten Arzneimittels nahezu 100%. Nach
xtravasaler Verabreichung beträgt die Bioverfügbarkeit weniger als 100% (FICHTL et al.,
Bioverfügbarkeit (F
A
Wirkstoff aus einer Arzneifor
beträgt die Bioverfügbarkeit eines intravenös v
e
1996).
Stellvertretend für die nicht messbare Konzentration am Wirkort, wird die Bioverfügbarkeit
durch Konzentrationsmessung im Plasma oder Urin ermittelt. Diese Methode ist nicht für
39
LITERATURÜBERSICHT
topisch angewendete Stoffe zulässig, da diese nicht über den Blutweg zu ihrem Zielorgan
elangen.
it ermittelt, indem zunächst der Wirkstoff intravasal
erabreicht wird, um so die volle Bioverfügbarkeit zu erhalten. Anschließend wird die gleiche
achdem die Flächen unter den beiden Plasma-Konzentratrions-
rve / AUC), die das Maß für die Konzentration im Organismus
l den, kann die Bioverfügbarkeit wie folgt berechnet werden (KOCH
nd RITSCHEL, 1986):
g
Praktisch wird die Bioverfügbarke
v
Dosis extravasal verabreicht. N
Kurven (Area under the cu
darstel en, berechnet wur
u
F = 100..viAUC⋅xAUC [%]
zentration- Zeit- Kurve bei extravasaler Applikation AUC . = Fläche unter der Konzentration- Zeit- Kurve bei intravenöser Applikation
aß für die Ausscheidungsgeschwindigkeit eines Stoffes. Sie
asmavolumen, welches pro Zeiteinheit von dem Stoff gereinigt
wird wie folgt berechnet:
F = Bioverfügbarkeit AUCx = Fläche unter der Kon
i.v.
Clearance (CL):
Die Clearence ist ein M
bezeichnet das virtuelle Pl
wird. Die Gesamtkörper-Clearance
CL = AUC
D [ml/min]
CL = Gesamtkörper-Clearance D = Dosis AUC = Fläche unter der Konzentration- Zeit- Kurve
Wird ein Stoff ausschließlich durch ein Organ eliminiert, entspricht die Gesamtkörper-
learance der Organ-Clearance. Ist jedoch, wie in den meisten Fällen, mehr als ein Organ an
Clearances zusammen (SAMS, 1992):
C
der Eliminierung des Arzneimittels beteiligt, setzt sich die Gesamtkörper-Clearance aus den
verschiedenen Organ-
40
LITERATURÜBERSICHT
CL = CLr + CLh + CLx [ml/min]
CL = Gesamtkörper-Clearance CLr = renale Clearance CLh = hepatische Clearance CLx = sonstige Clearance
Die Organ-Clearance lässt sich wie folgt berechnen:
CLorgan = Q · E [ml/min]
CLorgan = Organ- Clearance Q = Organdurchblutung
E = Extraktionsquotient = ( )
arteriell
venösarteriell
ccc −
Für die hepatische Clearance ergibt sich demnach:
CLh = Qh · Eh [ml/min] CLh = hepatische Clearance
Qh = Leberdurchblutung otient der Leber
unktion berechnen:
Eh = Extraktionsqu Bei der hepatischen Clearance lassen sich zwei Gruppen von Arzneimitteln unterscheiden:
Stoffe, die perfusionslimitiert eliminiert werden, sogenannte „high clearance drugs“, deren
Extraktionsquotient über 0,8 liegt und die bei einer Leberpassage nahezu vollständig aus dem
Blut eliminiert werden. Dagegen stehen die kapazitätslimitiert eliminierten Stoffe, die „low
clearance drugs“ mit einem Extraktionsquotienten unter 0,2 bei deren Ausscheidung die
Enzymkapazität der Leber der geschwindigkeitsbestimmende Faktor ist (MUTSCHLER,
1996).
Die renale Clearence lässt sich neben der oben aufgeführten Funktion auch durch folgende
F
( )P
U
CCLr =
ateurineflowrC ⋅ [ml/min]
r CU = Pharmakon- Konzentration im Urin CP = Pharmakon- Konzentration im Plasma
urine flow rate = Umfang der Harnbildung
CL = renale Clearance
41
LITERATURÜBERSICHT
Mit dieser Funktion lässt sich ein Zusammenhang zwischen Urinkonzentration und
Plasmakonzentration eines Stoffes herstellen. Demnach müsste man theoretisch von der
nzentra die Plasmakonzentration schließen können. Dies ist aber durch
Sammlung des Urins in der Blase und Absetzen verschieden großer Urinmengen sehr
ngenau. Die renale Clearance unterliegt außerdem Beeinflussungen durch Veränderungen
Ur r wiederum durch Faktoren wie Ernährung oder intensive körperliche
tren rden kann (UNGEMACH und NÜRNBERGER, 1999; WOOD et
l., 1990). Im Anschluss an intensives Training oder einen Wettkampf kann der Urin-pH
urch vermehrte Ausscheidung von sauren Stoffwechselprodukten absinken, was sich
ngsgrad von Arzneimitteln auswirken könnte, so dass saure Stoffe
ortional zur Clearence. Die Halbwertzeit wird meist
½ =
Urinko tion auf
u
des in-pH, welche
Ans gung verändert we
a
d
wiederum auf den Ionisieru
langsamer ausgeschieden und alkalische Stoffe durch den erhöhten Ionisationsgrad nicht
rückresorbiert und somit schneller ausgeschieden werden (UNGEMACH und
NÜRNBERGER, 1999; SCHOENE, 1996; SAMS, 1996).
Halbwertzeit (t ½ )
Die Eliminations- oder Plasmahalbwertzeit ist die Zeit, in der die Plasmakonzentration auf die
Hälfte des ursprünglichen Wertes abfällt (MUTSCHLER, 1996; DERENDOERF et al., 2002;
KIETZMANN, 1983). Es gilt allgemein, dass eine Substanz ca. 5 Halbwertszeiten benötigt,
um zu etwa 97% ausgeschieden zu sein (KAMERLING und OWENS, 1994). Laut KLAUS
und HAPKE (1994) benötigt ein Stoff zur völligen Ausscheidung beim Pferd ca. 70
Halbwertzeiten. Nach FREY (2002) ist die Halbwertzeit proportional zum
Verteilungsvolumen und umgekehrt prop
graphisch aus Plasmaspiegelkurven ermittelt, lässt sich aber bei Kenntnis der
Eliminationsgeschwindigkeitskonstanten ( kel ) wie folgt errechnen:
elk2lnt [h]
t ½ = Halbwertzeit ln2 = 0,693 kel = Eliminationsgeschwindigkeitskonstanten
a die Halbwertzeit von der Clearance und dem Verteilungsvolumen abhängt, kann die
albwertzeit auch anders errechnet werden:
D
H
42
LITERATURÜBERSICHT
t ½ = Cl
Vd⋅2ln [h]
t ln
½ = Halbwertzeit 2 = 0,693
indung wenig in das umliegende Gewebe
iffundiert, hat ein geringes Verteilungsvolumen, welches nicht wesentlich größer ist als das
P men (SAMS, 1996). Ein Stoff, der sich im Fettgewebe anreichert, hat ein sehr
ohes, das Gesamtvolumen des Körpers übersteigendes Verteilungsvolumen, da die
rhältnis zur verabreichten Gesamtmenge ist
Z 1983). Multipliziert man die Konzentration im Blut mit dem
hält man die Substanzmenge im Organismus als reale Größe.
Praktische Bedeutung hat das Verteilungsvolumen durch seine Beeinflussung der
Plasmakonzentration (BAGGOT 1978).
Unter der Annahme, dass sich der gesamte Organismus wie ein Verteilungsraum verhält, lässt
sich das initiale Verteilungsvolumen (Vc) bei rascher intravenöser Injektion wie folgt
errechnen:
Vc =
Vd = Verteilungsvolumen Cl = Clearance
Verteilungsvolumen (V):
Das Verteilungsvolumen beschreibt als fiktive Größe das Flüssigkeitsvolumen, welches
erforderlich wäre, um die gesamte im Körper befindliche Arzneistoffmenge in gleicher
Konzentration zu lösen, in der sie im Blut vorliegt (GLADKE und VON HATTENBERG,
1977). Es ist somit ein Maß für die Gewebegängigkeit eines Arzneimittels. Ein Stoff, der zum
Beispiel aufgrund von starker Plasmaproteinb
d
lasmavolu
h
Konzentration im Blut sehr gering im Ve
(KIET MANN,
Verteilungsvolumen, er
0CD [l]
Vc = initiales Verteilungsvolumen des zentralen Kompartiments D = applizierte Dosis C0 = Anfangskonzentration
Nachdem sich das Pharmakon gleichmäßig in die Gewebe verteilt hat, wird ein
Verteilungsvolumen im Steady State (Vss ) erreicht, welches man wie folgt berechnen kann:
43
LITERATURÜBERSICHT
Vss = cpc
cp Vk
⋅⎟⎞
+ [l/kg] k ⎟
⎠⎜⎜⎝
⎛1
k cp = Transferkonstante, Übertritt vom zentralen ins periphere Kompartiment k = Transferkonstante, Übertritt vom peripheren ins zentrale Kompartiment
Vss = Verteilungsvolumen im Steady State pc Vc = initiales Verteilungsvolumen des zentralen Kompartiments
Durch die Ausscheidung des Wirkstoffes aus dem zentralen Kompartiment sinkt in diesem die
Konzentration. Durch den entstandenen Konzentrationsgradienten diffundiert nun umgekehrt
der Stoff vom peripheren ins zentrale Kompartiment. Dieser Zustand wird als Pseudo-Steady-
State bezeichnet. Die Konzentration fällt linear ab und kann über die Hybridkonstante (β)
beschrieben werden. Das Verteilungsvolumen der Eliminationsphase ( βdV ) kann wie folgt
berechnet werden (DERENDORF et al., 2002):
ββCLVd = [l/kg]
= Verteilungsvolumen der Eliminationsphase βdV CL = Clearance β = Hybridkonstante
44
MATERIAL UND METHODE
3 MATERIAL UND METHODE
3.1. Aufbau des Experiments und Versuchsplanung
Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der E ationskinetik der Methylxanthine
Theophyllin und Theobrom erden.
Dazu wurde Pferden im Ins Tierzu lt für Landwirtschaft
(FAL) in Mariensee Theophyllin intravenös, Theophyllin oral bzw. Theobromin intravenös
verab cht un gne nterval sowohl - als auch Urinproben entnommen.
Diese Proben wurden im Institut für Biochemie der Deutschen Sporthochschule in Köln
sowohl auf die Konzentration der verabreichten Substanz als auch ihrer Metaboliten
untersucht. Hierzu wurde eine Methode zur Analyse und Quantifizierung optimiert und
valid . Die nen akonze ationen wurden anschließend im Institut für
harmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
d Haltungsbedingungen
h standen insgesamt 13 Wallache unterschiedlichen Alters und Gewichts
mit freiem Paddock-
durch die vorangegangenen pharmakokinetischen
tudien sehr gut darauf konditioniert, bei Betreten des mit frischem Stroh eingestreuten
ntanurin abzusetzen, was die Einhaltung der gewünschten
t, dass keinem der Pferde innerhalb der letzten drei Wochen ein Medikament
erabreicht worden war. Direkt vor Versuchsbeginn wurden alle Probanden auf einer Zurich
ru-Test AG 500 Viehwaage (Messbereich bis 2000 kg) gewogen, damit die Medikamente
limin
in bei Pf
titut für cht der Bundesforschungsansta
rei d in geei ten Zeiti len Blut
iert gemesse Plasm ntr
P
pharmakokinetischen Berechnungen unterzogen.
3.1.1. Versuchstiere un
Für den Tierversuc
zur Verfügung.
Die Pferde waren in einem festen Herdenverband in Laufstallhaltung
und Weidegang untergebracht. Heulage und Wasser stand jederzeit ad libitum zur Verfügung.
Die Pferde waren regelmäßig entwurmt und gegen Tetanus, Equines Herpesvirus und Equine
Influenza geimpft. Alle Pferde waren
S
Laufstalles Spo
Urinentnahmezeitpunkte ermöglichte. Vor Versuchsbeginn wurden die Pferde einer
klinischen Allgemeinuntersuchung unterzogen, die bei keinem Probanden eine Auffälligkeit
zeigte. Um Wechselwirkungen mit anderen Medikamenten ausschließen zu können, wurde
sichergestell
v
T
45
MATERIAL UND METHODE
genau dosiert werden konnten. Angaben zu Gewicht, Rasse und Alter der Pferde sind der
abelle 4 zu entnehmen. T
Pferd Rasse Geschlecht Alter Gewicht [Jahre] [kg]
1 Warmblut Wallach 10 680 2 Warmblut Wallach 10 644 3 Warmblut Wallach 10 622 4 Warmblut Wallach 10 680 5 Vollblut Wallach 11 458 6 Vollblut Wallach 7 582 7 Warmblut Wallach 10 674 8 Warmblut Wallach 10 630 9 Warmblut Wallach 10 658
10 Warmblut Wallach 11 640 11 Warmblut Wallach 10 648 12 Warmblut Wallach 10 660 13 Warmblut Wallach 10 638
Tab.4: Rasse, Geschlecht, Alter und Gewicht der Versuchspferde
3.1.2. Testsubstanzen
THEOPHYLLIN:
Zur intravenösen Applikation wurde Solosin® Infusionslösungskonzentrat der Firma Aventis
harma gewählt. Eine Ampulle enthält 15 ml mit 624 mg Theophyllin.
, dass auch keine Theobrominlösung zur intravenösen Verabreichung
P
Zur oralen Applikation wurde im Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der
Tierärztlichen Hochschule Hannover eine 4 %ige sterile Lösung hergestellt, da kein
Handelspräparat zur Verfügung stand.
THEOBROMIN:
Aufgrund der Tatsache
im Handel erhältlich war, wurde diese ebenfalls als 4 %ige sterile Lösung im Institut für
Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
hergestellt.
46
MATERIAL UND METHODE
3.1.3. Vorversuch
Zur Überprüfung der Durchführbarkeit, zur Ermittlung sinnvoller Probenentnahmezeitpunkte
sowie der nötigen Probenentnahmedauer und Feststellung der zu erwartenden
die Substanz einem jeweils zufällig ausgewähltem Pferd verabreicht und im
nschluss daran Blut- und Urinproben entnommen. Der genaue Ablauf der Probenentnahme
ird unter 3.1.4. b ieser kompl tversuch üb de.
ediglich der Zei in dem en entnommen wurden, wurde im Hauptversuch von 60
Stunden auf 108 Stunden nach pplik n The und Stund
intravenöser Gabe von Theobrom verlänger
3.1.4. auptversu
Eine Viertelstunde vor Versuchbeginn wurd
Desinfektion mit 70%igem Alkohol im Punktionsbereich, in die Vena jugularis sinister ein
Venenverweilkatheter (Braunüle MT®, Firma Braun, Melsungen) gelegt. Über diesen
Kath wurde vo pplikation Testsubs eine Lee in
beschichteten Monovetten® (Sa t) entnom n. Danach urde der K heter mit einem
Mandrin (Vasofix erschlosse Ebenso w n Leer-U roben du Auffange n
Spontanurin nach Hereinführen in den Laufstall genommen.
Um eine Verschleppung der Testsubstanz durch Nutzung des gleichen Venenverweilkatheters
zur Substanzapplikation und Probenentnahme zu verhindern, wurde den Pferden, denen die
Testsubstanz intravenös verabreicht werden sollte, auch in die Vena jugularis dexter ein
ene rwei atheter gele
uhewerte der Herz- und
temfrequenz erfasst.
vor in sterile Einwegspritzen aufgezogene, nach dem jeweiligen Körpergewicht
nn intravenös über den dafür gelegten
enenverweilkatheter appliziert. Hierbei wurden genau wie bei der oralen Verabreichung
Konzentrationsbereiche der Analyten sowie zur Entwicklung einer geeigneten
Untersuchungsmethode im Labor wurde ein Vorversuch durchgeführt.
Dafür wurde
A
w eschrieben, da d ett für den Haup ernommen wur
L traum, Prob
oraler A ation vo ophyllin auf 168 en nach
in t.
H ch
e den Pferden, nach Rasur und mehrfacher
eter r A der tanz r-Blutprobe mit Lithium-Hepar
rsted me w at®) v n. urde rinp rch n vo
V nve lk gt.
Vor Verabreichung der Substanzen wurden bei den Pferden die R
A
Die kurz zu
berechnete Testsubstanzmenge, wurde zu Versuchsbegi
V
Einmalhandschuhe getragen, um eine Verschleppung zu verhindern.
47
MATERIAL UND METHODE
Die Blutproben innerhalb der ersten drei Stunden wurden über den Venenverweilkatheter
entnommen, danach wurde dieser zur Schonung der Vene entfernt und die weiteren Proben
durch Venenpunktion mit einer Einmalkanüle (1,2 x 40mm/ 18 G1,5“) gewonnen.
THEOPHYLLIN THEOPHYLLIN THEOBROMIN
Die Entnahmezeitpunkte der Blut- und Urinproben nach intravenöser und oraler
Theophyllinverabreichung sowie nach intravenöser Gabe von Theobromin sind Tab.5 zu
entnehmen.
intravenöse Applikation orale Applikation intravenöse Applikation Blut Urin Blut Urin Blut Urin
Proben-Nr.: Zeit [h] Zeit [h] Zeit [h] Zeit [h] Zeit [h] Zeit [h] 1 0 0 0 0 0 0 2 0,033 1 0,08 0,5 0,033 1 3 0,08 3 0,16 1,5 0,08 3 4 0,166 6 0,33 3 0,166 6 5 0,25 9 0,66 6 0,25 9 6 0,33 12 1 9 0,33 13 7 0,5 15 3 11 0,5 24 8 0,75 24 6 13 0,75 28 9 1 28 9 15 1 36
10 2 32 12 24 2 48 11 3 36 24 30 3 72 12 5 48 30 48 5 96 13 7 54 48 54 7 120 14 9 60 54 60 9 144 15 12 60 72 13 168 16 15 72 96 24 17 24 96 108 28 18 28 108 36 19 32 48 20 36 72 21 48 96 22 54 120 23 60 144 24 168
Tab. 5: Entnahmezeitpunkte von Blut- und Urinproben im Hauptversuch
36 m ® entnommen. Dies
0 Minuten zentrifugiert
(Zentrifuge Rotana IS, Hettich). Anschließend wurde das Plasma gleichmäßig auf zwei 10ml
3.1.5. Aufbereitung der Proben und Aufbewahrung
Pro Entnahmezeitpunkt wurden jeweils l Blut mit vier Monovetten
wurde innerhalb einer halben Stunde nach Entnahme bei 1000g 1
48
MATERIAL UND METHODE
fassende, deutlich gekennzeichnete Glasgefäße mit Plastikschraubdeckel verteilt. Diese
im ühls rank bei –20°C
eingefroren.
astikbeche aufg l fassende
Plastikbecher mit Schraubverschluss überfü Urinproben wurden umgehend bei
°C im Kühlschrank gekühlt und anschließend bei –20°C eingefroren, um zusammen mit den
orenen Zustand nach Köln transportiert zu werden.
Coffein, wasserfrei, M % Sigma- Aldrich Chemie, Steinheim
n, w sserfr
Sigma- Aldrich Chemie, Steinheim
nheim
D3-Coffein
Köln 1993
Laborsynthese des Institutes für Biochemie,
Köln 2003
,3-15N2-Theophyllin Cambridge Isotope Laboratories Inc.,
Andover, USA
aborchemie- Handels GmbH,
St. Augustin
lland
dt
li-Q- ass emie, Köln
isessig, p.a. Merck, Darmstadt
wurden sofort bei 4ºC K ch gelagert und spätestens am Abend
Die in sauberen Pl rn efangenen Urinproben wurden direkt in 100 m
hrt. Auch die
4
Plasmaproben im gefr
3.2. Analytik
Die Analytik wurde im Institut für Biochemie an der Deutschen Sporthochschule Köln
durchgeführt.
3.2.1. Chemikalien
inimum 99
Theobromi a ei, Minimum 99% Sigma- Aldrich Chemie, Steinheim
Theophyllin, wasserfrei, Minimum 99%
Paraxanthin, wasserfrei, Minimum 99% Sigma- Aldrich Chemie, Stei
Laborsynthese des Institutes für Biochemie,
D6-Theobromin
1
Aceton KMF, L
Acetonitril J.T. Baker, Deventer, Ho
Ammoniumacetat Merck, Darmsta
Wasser, reinst (Mil W er) Institut für Bioch
E
49
MATERIAL UND METHODE
Methanol, destilliert Institut für Biochemie, Köln
atriumhydroxid, p.a. KMF, Laborchemie- Handels GmbH,
St. Augustin
rotease aus Rinderpancreas, Typ1 Sigma- Aldrich Chemie, Steinheim
N
P
Salzsäure, 32%ig KMF, Laborchemie- Handels GmbH,
St. Augustin
3.2.2. Instrumente
Die Quantifizierung der Proben des Vor- und Hauptversuches und die Validierung wurden
mittels Flüssigkeitschromatographie und Tandem-Massenspektrometrie durchgeführt. Hierfür
wurde eine HPLC der Agilent Technologies LC 1100 Serie gewählt, gekoppelt mit einem
Perkin Elmar Sciex API 3200 LC/MS/MS-System und unter folgenden Bedingungen
angewendet:
HPLC Agilent Series 1100 LC:
Säule: Nucleodur C18 Pyramid, (70 x 4 mm; Partikelgröße 5µm), Machery
und Nagel
Eluenten: A : Ammoniumacetat (5mM) in H2O und 0,1% Essigsäure,
B : Acetonitril
Gradienten: 5% Acetonitril → 50% Acetonitril in 5 Minuten,
50% Acetonitril → 100% Acetonitril in 6 Minuten;
Reinigung mit 100% Acetonitril für 1 Minute, Reequilibrierung mit 5%
Acetonitril für 2 Minuten
Flussrate: 800µl/min
Injektionsvolumen: 10 µl
Massenspektrometer:
Ionenquelle: ESI bei 550 °C
Ionisationseinstellung: positiv
Aquistionseinstellung: Multiple Reaction Monitoring (MRM)
senergie: optimiert für jedes Produktion
Kollisionsgas: Stickstoff (N2), 2,5x 10-5 torr
Kollision
50
MATERIAL UND METHODE
3.2.3. Methodenentwicklung
Herstellung der Standardlösungen:
Vor der Aufarbeitung wurden die zur quantitativen Bestimmung notwendigen Standard-
Lösungen hergestellt. Mit den Internen Standards wurde anschließend ebenso verfahren. Zur
Ermittlung des geeigneten Lösungsmittels wurden die Methylxanthine in den verschiedenen
Lösungsmitteln 0,06 molare Salzsäure, destillierter Methanol, Milli-Q-Wasser und 0,05
olare Natronlauge gelöst: Zuerst wurde eine Lösung in Methanol versucht. Sie gelang nur
wurde als Mischstandard aus stickstoffmarkiertem Theophyllin
,3-15N2-Theophyllin), deuteriertem Coffein (D3-Coffein) und deuteriertem Theobromin (D6-
heobromin) hergestellt. Als Interner Standard für Paraxanthin wurde ebenfalls das markierte
6-Theobromin ca.
alb so groß war wie die Intensitäten der anderen internen Standards, wurde bei der
m
unvollständig. Erst nach Zugabe von 32%iger HCl und Verbringung in ein 50°C warmes
Ultraschallwasserbad lösten sich die Analyten rückstandsfrei. Jedoch kristallisierte die
Lösung bei Erreichen der Raumtemperatur wieder. Die beste Löslichkeit bestand bei 0,05
molarer Natronlauge, jedoch war die Stabilität der Analyten in diesem Lösungsmittel nicht
ausreichend. Als am besten geeignet erwies sich schließlich die Lösung in Milli-Q-Wasser.
Die Standardlösung wurde als Mischstandard mit den Methylxanthinen Theophyllin, Coffein,
Theobromin und dem möglichen Metaboliten Paraxanthin hergestellt. Dazu wurden jeweils
10 mg dieser Substanzen per Feinwaage eingewogen und in Milli-Q-Wasser gelöst und so
eine 0,1%ige Stammlösung hergestellt. Aus dieser 100µg/ml Stammlösung wurde durch 1:10
Verdünnung die Arbeitslösung mit der Konzentration von 10 µg/ml hergestellt.
Auch der Interne Standard
(1
T
Theophyllin genutzt. Da die massenspektrometrische Signalintensität für D
h
Herstellung des internen Mischstandards die Konzentration von D6-Theobromin verdoppelt.
Es wurden also je 10 mg des D3-Coffeins und des markierten Theophyllins und 20 mg des D6-
Theobromins per Feinwaage eingewogen und ebenfalls in 100 ml Milli-Q-Wasser gelöst. Aus
dieser Stammlösung wurden dann durch Verdünnungen Arbeitslösungen mit der
Konzentration von 10 µg bzw. 20µg/ml hergestellt.
Beide Lösungen wurden sowohl zur Quantifizierung der Urin- als auch der Plasmaproben
genutzt.
51
MATERIAL UND METHODE
Überprüfung der Messmethode:
Zur Überprüfung der Messmethode des LC/MS/MS-Systems musste als erstes das sogenannte
Tuning des HPLC-Gerätes erfolgen. Dabei werden die Substanzen anhand ihrer spezifischen
Ionenübergänge in die einzelnen Ionenfragmente identifiziert und konnten anhand dieser im
Computersystem des Gerätes gespeichert werden. Per Direkteinlass wurden anschließend die
n aus beiden Stoffen handelte. Um dieses Problem zu lösen, wurden alle weiteren
nenübergänge der beiden Stoffe verglichen. Als einziger Unterschied erwies sich der
erhält man die
1 ml Methanol konditioniert und mit 1 ml Milli-Q-Wasser
equilibriert, bevor 50 µl des Internen Mischstandards per Hamilton-Spritze auf die Säule
Kollisionsenergie und die Linsensysteme des Massenspektrometers für jeden einzelnen
Analyten optimiert.
Im Rahmen dieser Untersuchungen wurde festgestellt, dass der Ionenübergang in die beiden
Hauptfragmente, der die substanzspezifische Identifikation ermöglichen soll, bei Theophyllin
und Paraxanthin identisch ist. Somit ließ sich bei einer Probe anhand dieses Ionenüberganges
181.0/124.0 nicht eindeutig ersehen, ob es sich um Theophyllin, Paraxanthin oder eine
Kombinatio
Io
Ionenübergang 181.0/55.0, welcher nur beim Paraxanthin auftrat. Also konnte Paraxanthin
anhand dieser Fragmentierung identifiziert und quantifiziert werden. Theophyllin musste
deshalb durch die Differenzmethode quantifiziert werden. Das bedeutet, dass man die
Intensität des gemeinsamen Ionenübergangs als Summe der beiden Analyten betrachtet. Von
der errechneten Summenkonzentration subtrahiert man die Paraxanthinkonzentration, welche
aus der Intensität des einzelnen Ionenübergangs errechnet wurde. Somit
Theophyllinkonzentration.
Ermittlung der geeigneten Urinaufarbeitung:
Zur Optimierung der Analytenausbeute wurden bei der Methodenentwicklung der
Urinaufarbeitung zunächst verschiedene Festphasenextraktionen angewandt und deren
Ergebnisse miteinander verglichen. Aus verschiedenen vorangegangenen Untersuchungen
war bereits bekannt, dass eine Flüssig-Flüssig-Extraktion bei Methylxanthinen wenig ergiebig
ist. Zum Vergleich wurden Oasis® HBL 3cc (60mg) Extraction Cartridges der Firma Waters,
C 18-Ionentauschersäulen Chromabond® 6ml/ 500mg, octadecyl- modifiziertes Kieselgel und
selbsthergestellte PAD-Säulen eingesetzt.
Beide C 18 Säulen wurden mit
52
MATERIAL UND METHODE
aufgetragen wurde. Im Anschluss daran wurden die 2 ml mit unterschiedlichen Mengen der
Standardlösung versetzten Urinproben zugegeben. Die Säulen wurden anschließend mit
einem Wasser-Methanol-Gemisch (95:5) gewaschen und mit 1 ml Methanol eluiert. Das Eluat
wurde am Rotationsverdampfer eingeengt, anschließend mit 100µl LC-Puffer (80%
Ammoniumacetat, 20% Acetonitril und 0,1% Eisessig) angelöst und in die Messgefäße für die
HPLC überführt.
Die PAD-Säulen wurden durch Einhängen von Pasteurpipetten in eine Halterung, Einlegen
einer kleinen Glaskugel in die Pipettenmündung und anschließendem Aufbringen von ca. 2ml
uilibriert und konditioniert wurde durch
weimaliges Waschen mit Milli-Q-Wasser. Der Interne Standard und die 2 ml Urinproben
1 ml Aceton, das Eluat
benfalls am Rotationsverdampfer eingeengt und in 100 µl LC-Puffer gelöst in Messgefäße
xtraktionsergebnis zeigten die Oasis®-Säulen, aber da die Ausbeute und das
viel besseren Ausbeute, reduzierte aber die Störpeaks noch nicht
etzte Messschwankungen konnten durch Intensivierung der Reagenzgläserwaschschritte
1 ml 6-molare Salzsäure zugegeben und wiederum fünfmal mit Wasser
nd zum Schluss zweimal mit einem Methanol-Aceton-Gemisch gespült. Die LC-MS-
hromatogramme zeigten weniger Störpeaks, so dass die Interpretation der Analytenpeaks
produzierbar und präzise war.
einer Polystyrolharzlösung selbsthergestellt. Eq
z
wurden wie bei den anderen Säulen aufgetragen und anschließend mit ca. 2 ml Milli-Q-
Wasser gewaschen. Eluiert wurde bei diesen Säulen zweimal mit
e
überführt.
Das beste E
deutliche Vorhandensein von Störpeaks noch nicht zufriedenstellend waren, wurde die
Methode weiter modifiziert. Die Konditionierung und Equilibrierung wurden auf jeweils 2 ml
erhöht, das Urinprobenvolumen auf 2,5 ml erhöht, der Waschschritt nach Aufbringen der
Probe auf zweimal 1 ml Methanol-Wasser-Gemisch verdoppelt und anstatt mit Methanol
wurde dreimal mit 0,5 ml Aceton eluiert und in 120 µl LC- Puffer angelöst.
Dies führte zu einer sehr
ausreichend. Dies gelang erst durch mehrfaches Zentrifugieren der Urinprobe während der
Aufarbeitung: Einmal 10 Minuten bei 1800 U/min vor Auftragen der Probe auf die Säule und
noch ein zweites Mal nach dem Anlösen in LC-Puffer, so dass nur der Überstand in das
Messgefäß überführt wurde.
L
deutlich reduziert werden. Die Reagenzgläser wurden nach Gebrauch einmal mit der Bürste
und viermal ohne Bürste mit heißem Wasser gewaschen, dann mit je 1 ml 6-molarer
Natronlauge für eine Stunde bei 100°C gekocht. Anschließend wieder fünfmal mit Wasser
gespült, danach wurde
u
C
re
53
MATERIAL UND METHODE
Der Einfluss von unterschiedlichen pH-Werten wurde wie folgt untersucht: Von sechs
rinproben der gleichen Konzentration wurden zwei mit 1-molarer Salzsäure auf einen sauren
von 12 eingestellt. Zwei Proben blieben unverändert bei dem
hysiologischen pH-Wert von ca. 8. Danach wurden alle Proben nach oben aufgezeigtem
n wurden vor Aufbringen auf die Säulen mit 500µg einer Proteaselösung (aus
inderpancreas, Typ 1, 5mg/ml) versetzt, eine Stunde im 50°C -warmen Wasserbad inkubiert
rstand wurde
nschließend auf die Oasis®-Säule überführt. Die weitere Aufarbeitung verlief genau wie bei
ich zwischen der Festphasenextraktion und der von BEAUDRY et al. (2006)
ublizierten Direktinjektion von Pferdeplasma nach Proteinfällung mit Methanol und
entrifugation in die HPLC zeigte eine wesentlich bessere Empfindlichkeit bei der
estphasenextraktion.
U
pH-Wert von 2,5 und zwei Proben durch 1-molare Kaliumhydroxidlösung auf einen
alkalischen pH-Wert
p
Schema aufgearbeitet und gemessen. Es zeigten sich keine gravierenden Unterschiede, weder
bei der Ausbeute noch beim biologischen Untergrundrauschen in den einzelnen Ionenspuren.
Ermittlung der geeigneten Plasmaaufarbeitung
Für die Plasmaprobenaufarbeitung wurde zunächst die Aufarbeitung der Urinproben
übernommen und zur Optimierung der Ausbeute weiter modifiziert.
Um den Einfluss von Proteinbindungen der Methylxanthine im Plasma auf die
Substanzausbeute bei der Aufarbeitung zu untersuchen, wurden folgende Versuchsreihen
verglichen:
Die ersten zwölf Proben wurden genau wie die Urinproben aufgearbeitet, und die zweiten
zwölf Probe
R
und anschließend 10 Minuten bei 1800 U/min zentrifugiert. Nur der Übe
a
den ersten zwölf Proben.
Die Auswertung zeigte eine fast doppelt so hohe Theophyllin-, Theobromin- und
Paraxanthinausbeute bei den Proben mit Proteindenaturierung im Gegensatz zu der
Probenreihe ohne Proteolyse. Somit wurde die Proteindenaturierung in die
Plasmaprobenaufarbeitung übernommen.
Ein Vergle
p
Z
F
54
MATERIAL UND METHODE
3.2.4. Aufbereitung d
Für die Aufarbei enextraktion dienten Oasis®- Säulen 3cc
(60mg) als Absorbens.
Die Urinproben wurden aufgetaut und pro Probe wurden 2,5 ml per Pipette entnommen und
in ein Reagenzspitzglas überführt. Ansch
(10µg/ml) d h wurde die Probe 10 Minuten bei
1800 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Die Oasis®- Säulen 3cc (60mg) wurden mit 2
ml Me i Der Überstand der
zentrifugierten P liquotiert und zweimal mit 1 ml eines
Meth wurden Spitzgläser in die
Reagenzgla um das Probeneluat aufzufangen.
Eluiert wurde dreim Anschluss wurde das Eluat am
Rotationsverda be wurde schließlich mit 120µl
Ammoniumac bei 1800 Umdrehungen pro Minute
zentrifugiert, der Überstand in HPLC-Probengefäße überführt und zur Messung in die HPLC
verbrach
Die Aufarbeitu enfassend dargestellt.
Die beschriebene Aufarbeitung wurde zur Quantifizierung von Proben mit Konzentrationen
bis zu 10.000ng er analytischen Säule und des Detektors
ei Konzentrationen über 10.000 ng/ml zu vermeiden, wurde die Aufarbeitung wie folgt
terner
ischstandard wurde von 50 µl auf 100 µl erhöht und anstatt in 120 µl wurde das eingeengte
luat in 250µl Ammoniumacetatpuffer gelöst. Ebenso wurde mit der Kalibrationsreihe
erfahren.
er Urinproben
tung der Urinproben mittels Festphas
ließend wurde 50 µl Interner Mischstandard
azugegeben und die Probe gevortext. Danac
thanol kondit oniert und mit 2 ml Milli-Q-Wasser equilibriert.
robe wurde nun auf die Säulen a
anol-Milli-Q-Wasser-Gemisches (10:90) gespült. Hiernach
shalterung der Unterdruckkammer gestellt,
al mit jeweils 0,5 ml Aceton. Im
mpfer eingeengt. Die trockene Pro
etatpuffer angelöst, erneut 10 Minuten
t.
ng der Urinproben wird in Abb.9 zusamm
/ml angewendet. Um eine Sättigung d
b
modifiziert: Es wurden lediglich 1 ml statt 2,5 ml der Probe aufgearbeitet, die Menge in
M
E
v
55
MATERIAL UND METHODE
Probenvorbereitung (Konzentrationsbereich bis 10.000ng/ml)
↓ 2,5 ml Urin in ein Reagenzspitzglas
↓ + 50 µl Interner Mischstandard [10µl/ml]
mittels Hamiltonspritze, schütteln (Vortex)
↓ Zentrifugation : 10 min bei 1800 U/min
Überstand dekantieren, Sediment verwerfen ↓
®Waters Oasis HLB 3cc (60mg) Extraction Cartridges:
mit 2 ml Methanol konditionieren mit 2 ml Milli-Q-W sser equilibrieren a
2, n 5 ml des Urinprobenüberstandes auf die Säule überführemit 2 x 1 ml Methanol/Wasser (10/90)spülen
mit 3 x 0,5 ml Aceton eluieren
Eluat in Reagenzspitzgläsern auffangen ↓
Elua gen t am Rotationsverdampfer einen↓
Subst sen, rat in 120 µl Ammoniumacetatpuffer anlöschütteln (Vortex)
↓ Zentrifugation : 10 min bei 1800U/min
↓ Überstand mit Pasteur plervials überführen pipetten in Autosam
10µl in das HPLC/MS/MS injizieren
Abb.9: Pferdeurin mittels
H is 10.000 ng/ml
.2.5. Aufbereitung der Plasmaproben
lasmaproben erfolgte wie die der Urinproben mit der Modifikation der
roteindenaturierung:
Probenaufarbeitung zum Nachweis von Methylxanthinen imPLC/MS/MS im Konzentrationsbereich b
3
Die Aufarbeitung der P
P
56
MATERIAL UND METHODE
Probenvorbereitung (Konzentrationsbereich bis 10.000ng/ml)
↓ 2,5 ml Plasma in ein Reagenzspitzglas
↓ + 50 µl Interner Mischstandard [10 µl/ml]
mittels Hamiltonspritze, schütteln (Vortex)
↓ + 100µl einer 0,5%igen Proteaselösung (P 4630 Typ 1)
↓ Inkubation für 60 Min. bei 50 °C im Wasserbad
↓ Zentrifugation : 10 min bei 1800 U/min
Überstand dekantieren, Sediment verwerfen ↓
Waters Oasis®HLB 3cc (60mg) Extraction Cartridges:
mit 2 ml Methanol konditionieren mit 2 ml Milli-Q-Wasser equilibrieren
2,5 ml des Plasmaprobenüberstandes auf die Säule überführen mit 2 x 1 ml Methanol/Wasser (10/90)spülen
mit 3 x 0,5 ml Aceton eluieren
Eluat in Reagenzspitzgläsern auffangen ↓
am Rotationsverdampfer einengen Eluat ↓
Substrat in 120 µl Ammoniumacetatpuffer anlösen, schütteln (Vortex)
↓ Zentrifugation : 10 min bei 1800U/min
↓ Überstand mit Pasteurpipetten in Autosamplervials überführen
10µl in das HPLC/MS/MS injizieren
ich bis 10.000 ng/ml
Abb.10: Probenaufarbeitung zum Nachweis von Methylxanthinen im Pferdeplasma mittels
HPLC/MS/MS im Konzentrationsbere
Auch diese Aufarbeitung wurde im Konzentationsbereich über 10.000ng/ml entsprechend der
Urinproben verändert.
57
MATERIAL UND METHODE
3.3. Validierung der Methode
Da jede experimentelle Messung mit Fehlern behaftet ist, soll mit der Validierung der
Eignungsnachweis einer Methode für den vorgesehenen Zweck erbracht werden. Nachfolgend
ufgeführte Kriterien sind in dieser Studie in die Validierung eingegangen:
3.3.1. Selektivität und Spezifität
Unter der Selektivität versteht man deren Fähigkeit, verschiedene Substanzen
unterscheiden zu können. Bei der HPLC/MS/MS-Methode ist dies durch unterschiedliche
etentionszeiten der Analyten und ausreichende Trennung von coeluierten Störpeaks im
at
ie Spez iges Erfassen und Identifizieren einer Substanz
falls in der zu untersuchenden Probe
vorkommender Substanzen. Dazu mussten aus dem Product-Ion-Scan einer Substanz
charakteristische Ionenübergänge a onitoring
(MRM) aufgezeichnet und mit den atrixproben
vergli
Zur B ivität und Sp Proben, denen
die Analyten zugesetzt wurden, verglic die Analyten
a- oder Urininhaltstoffen (Spezifität) und mit ausreichender
ng
erschiedlichen Mengen der Analyten gespikt. Diese Konzentrationen müssen den
a
einer Methode
R
Chrom ogramm gekennzeichnet.
ifität einer Methode ist deren eindeutD
ohne Störung oder Verfälschung anderer, eben
usgewählt und mittels multile Reaction M
entsprechenden Ionenspuren von Leerm
chen werden.
estimmung der Selekt ezifität wurden Leermatrixproben mit
hen. Es konnte festgestellt werden, dass
ohne Verfälschung durch Plasm
Trennu und ohne gegenseitige Störung im Chromatogramm darzustellen sind.
3.3.1. Linearität
Die Linearität beschreibt den mathematischen Zusammenhang von Konzentration des
Analyten und der Signalstärke/Detektorantwort.
Für die Überprüfung der Linearität wurden an drei unterschiedlichen Tagen Kalibrierreihen
sowohl für Plasma als auch für Urin erstellt, wobei jede Konzentration doppelt aufgearbeitet
und dann gemessen wurde. Pro Kalibriergerade wurden mindestens fünf Leermatrixproben
mit unt
58
MATERIAL UND METHODE
gesamten Konzentrationsbereich abdecken (DIN 38402 A51, 1986). Da sich der
alibrierbereich der Analyten über vier Zehnerpotenzen erstreckte, wurde bei beiden Matrices K
die Linearität im niedrigen, mittleren und im hohen Bereich überprüft. Die gewählten
Konzentrationen sind in den Tabellen 6 und 7 aufgeführt.
PLASMA Konzentration von Coffein, Theobromin
und Theophyllin in ng/ml
Kalibrationsgerade I 0,20,60,100,300,600,1000
Kalibrationsgerade II 100, 2000, 4000, 6000, 8000, 10000
K atalibr ionsgerade III 10000, 20000, 30000, 40000, 50000
trationen von Coffein, Theobromin und Theophyllin im Plasma zur eraden
Tab.6: Verwendete KonzenErstellung der drei Kalibrationsg
URIN Konzentration von Coffein, Theobromin,
Theophyllin und Paraxanthin in ng/ml
Kalibratio sg ran e de I 0,25, 50, 100, 250, 500, 1000
Kalibrationsgerade II 1000, 2000, 4000, 6000, 8000, 10000
Kalibrationsgerade III 1000, 2500, 5000, 10000, 20000, 30000
Tab.7: Verwendete Konzentrationen von Coffein, Theobromin, Theophyllin und Paraxanthin im i Kalibrationsgeraden
in nd des Internen Standards (D3-Coffein, 1,3-15N2-Theophyllin
rde visuell auf Ausreißer und
inearität untersucht (U.S. DERPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES,
nte Einbezug der Geradensteigung wurde auf die gemessende Konzentration
zurückgerechnet. Diese sogenannte „back calculation“ durfte dabei um maximal 15%, an der
maximal 20% vom theoretischen Wert abweichen (EHSLC
Urin zur Erstellung der dre
Aus dem Integral der erhaltenen Peakflächen der Analyten (Coffein, Theophyllin,
Theobromin und Paraxanth ) u
und D6-Theobromin) wurde der Quotient gebildet und gegen die Konzentration der
Kalibratoren aufgetragen. Die entstandene Kalibiergerade wu
L
1999). U r
unteren Bestimmungsgrenze um
2002).
59
MATERIAL UND METHODE
3.3.3. Nachweisgrenze
Die Nachweisgrenze (Detektionsgrenze, limit of detection, LOD) stellt die niedrigste
Konzentration dar, bei der sich der Analyt noch qualitativ bestimmen lässt, indem ein sicher
vom Untergrundrauschen der Blankproben abzugrenzendes Instrumentensignal zu erkennen
xO =
ist. Die Ermittlung dieser Nachweisgrenze wird anhand der Kalibrierkurvenmethode nach
DIN 32645 durchgeführt. Dazu wird aus den Residuen der linearen Regression zuerst die
Reststandardabweichung SxO aus der Summe der Abweichungsquadrate Qx und den
Freiheitsgeraden der linearen Kalibration f berechnet:
f
Qx S
SxO = Standardabweichung Qx = Summe der Abweichungsquadrate f = Freiheitsgerade der linearen Kalibration
Mit Hilfe dieser Standardabweichung SxO und dem Mittelwert x aller
Kalibrationskonzentrationen kann das Konfidenzintervall für den Merkmalswert Null
errechnet werden.
VB0 = SxO · t f ,α · 11 2
++xQ
xn
VB0 = Konfidenzintervall für den Merkmalswert Null
x = Mittelwert t wurde aus statistischen Tabellen entnommen und errechnet: f,α
αt f,α = TINV ( ; f )
INV = t-Wert der t-Verteilung unter den Bedingungen der Freiheitsgeraden (f) sowie der T
Fehlerwahrscheinlichkeit (α ).
Mit Hilfe der Steigung a der linearen Regressionsgeraden wurde die Nachweisgrenze (LOD)
mit einer Fehlerwahrscheinlichkeit von α wie folgt errechnet:
LOD = α
0VB
LOD = Nac
hweisgrenze α = Fehlerw rscheinlichkeit ah
60
MATERIAL UND METHODE
3.3.4. Bestimmungsgrenze
Die Best e (Quantifizierungsgrenz fication, LOQ) ist die
iedrigste Konzentration, bei der eine quantitative Aussage über den Analyten noch möglich
en dem mittleren
essergebnis und dem erwarteten Referenzwert dürfen dabei nicht mehr als 20 % betragen
HSLC, 2002).
Zur Bestimmung der LOQ wurden fünf Plasmap onzentration 100 ng/ml
Coffein, Theobromin und Theophyllin an drei unter en Tagen aufgearbeitet und
chromatographisch-massenspektometrisch quantifizier ung der LOQ im Urin
wurde mit Urinproben der Konzentrationen 50 ng/m offein, Theophyllin
und Paraxanthin und 100 ng/ml der Substanz Theobrom
ie Richtigkeit gibt die Abweichung des gemessenen Mittelwertes von dem erwarteten
eferenzwert an. Um diese zu überprüfen, wurden jeweils fünf Blankproben beider Matrices
n (low quality control standard, LQC), einer mittleren (midrange quality
ontral standard, MQC) und mit einer hohen (high quality control standard, HQC)
lwert aller fünf Konzentrationen eines Konzentrationsbereiches (A) und die
immungsgrenz e, limit of quanti
n
ist (DIN 32645, 1994). Die Abweichungen der Konzentration zwisch
M
(E
roben mit der K
schiedlich
t. Bei Bestimm
l der Substanzen C
in ebenso verfahren.
3.3.5. Richtigkeit
D
R
mit einer niedrige
c
Konzentration innerhalb des Konzentrationsbereiches des jeweiligen Analyten gespikt,
aufgearbeitet und quantifiziert (EHSLC, 2002).
Zur Errechnung der relativen Abweichung des gemessenen Wertes von dem erwarteten Wert
wird der Mitte
theoretische Konzentration (B) zueinander in Beziehung gesetzt und wie folgt berechnet:
RE (%)= ( )⎥⎦⎤
⎢⎣⎡ ⋅
− 100B
BA
Im niedrigen Konzentrationsbereich sind Abweichungen von den zu erwarten Ergebnissen
von maximal 20 % und in den mittleren und hohen Konzentrationsbereichen von maximal
5% zulässig.
ie gewählten Konzentrationen sind in den Tabellen 8 und 9 aufgeführt:
1
D
61
MATERIAL UND METHODE
Substanz Konzentration
[ng/ml]
Coffein 100, 1000, 10000
T 1heobromin 00, 1000, 10000
Theophyllin 100, 1000, 10000
Tab.8: Eingesetzte Konzentrationen zur Überprüfung asma
Substanz
der Richtigkeit im Pl
Konzentration
[ng/ml]
Coffein 50, 100, 2000
Theobromin 100, 2500, 20000
Theophyllin 50, 2500, 20000
Paraxanthin 50, 250, 1000
Tab.9: Eingesetzte Konzentrationen zur Überprüfung der Richtigkeit im
ie Präzision beschreibt die Übereinstimmung von wiederholten Messungen von Proben
leicher Konzentration. Man unterscheidet die Wiederholpräzision (SW) (Tagespräzision,
bility) und die Zwischenpräzision (Sb) (totale Präzision, interday
epeatability).
MITT, 2000):
Urin
3.3.6. Präzision
D
g
intraday repeata
r
Zur Bestimmung der Präzision wurden pro Analyt in beiden Matrices je 5 LQCs, 5 MQCs
und 5 HQCs an drei unterschiedlichen Tagen aufgearbeitet, gemessen und
chromatographisch-massenspektrometrisch quantifiziert. Die Variation durfte im niedrigen
Konzentrationsbereich maximal 20% und im mittleren und hohen Konzentrationsbereich
maximal 15% betragen (EHSLC 2002).
Die Wiederholpräzision (SW) und der Zwischenpräzision (Sb) wurden anhand folgender
Funktion berechnet (HERBOLD und SCH
62
MATERIAL UND METHODE
( )∑
∑ ⋅ TagesserieTagesserie Sf 2
SW = Tagesserief
Sb = ( )
TagefgesamtTagesserie XX∑ − 2
Su
bstanz Konzentration
[ng/ml]
Coffein 100, 1000, 10000
Theobromin 100, 1000, 10000
Theophyllin 100, 1000, 10000
Paraxanthin 100, 1000 Tab.10: Eingesetzte Konzentrationen zur Überprüfung der Präzision im Plasma
Substanz Konzentration
[ng/ml]
Coffein 50, 100, 2000
Theobromin 100, 2500, 20000
Theophyllin 50, 2500, 20000
Paraxanthin 50, 250, 1000 Tab.11: Eingesetzte Konzentrationen zur Überprüfung der Präzision im Urin
.3.7. Stabilität
m die Stabilität der Analyten in der jeweiligen Matrix für den gesamten Zeitraum des
Proben des Hauptversuches
3
U
Versuches, der Probenlagerung und des Probentransportes sowie des Zeitraumes der Analyse
zu beweisen, wurden pro Matrix jeweils zwölf LQCs und zwölf HQCs hergestellt. Davon
wurden jeweils sechs sofort im Anschluss aufgearbeitet und quantifiziert. Die jeweils anderen
sechs Proben wurden unter den gleichen Bedingungen wie die
63
MATERIAL UND METHODE
über einen Zeitraum von 12 Wochen bei –20°C gelagert. Nach Ablauf dieser Zeit wurden sie
benfalls aufgearbeitet und quantifiziert.
Die gewählten Konzentrationen sind in Tabelle 12 aufgeführt:
Matrix
e
Konzentration
[ng/ml]
Urin 100, 1000
Plasma 100, 1000
Tab.12: Konzentrationen von Coffein, Theobromin, Theophyllin und Paraxanthin in den Matrices Urin und Plasma für den Stabilitätstest
3.3.8. Wiederfindung
Die Wiederfindung beschreibt den prozentualen Anteil des Analyten, der nach allen
Aufarbeitungsschritten noch wiedergefunden werden kann.
Zur Bestimmung der Wiederfindung wurden pro Matrix jeweils zweimal sechs Proben
aufgearbeitet und gemessen. Bei der Sequenz der ersten sechs Proben wurde der Analyt wie
gewohnt am Anfang dazu gegeben und der Interne Standard erst nach dem
Rotationsverdampfer bei der Überführung in die Vials. Bei der Sequenz der zweiten sechs
Proben wurde sowohl der Analyt als auch der Interne Standard erst bei der Überführung in die
Vials dazu gegeben.
Die Berechung der Wiederfindung erfolgte nach folgender Funktion:
Wiederfindung [%] =
( )
( )
( )
( )127Pr*
61Pr*
−⎥⎥⎦
⎤
⎢⎢⎣
⎡
−⎥⎥⎦
⎤
⎢⎢⎣
⎡
obenAreaArea
MW
obenAreaArea
MW
ISTD
Analyt
ISTD
Analyt
·100
64
MATERIAL UND METHODE
3.4. Pharmakokinetische Auswertung
ie pharmakokinetischen Berechnungen erfolgten bei intravenöser Applikation von
nem Zwei-Kompartiment-Modell und nach oraler
erabreichung von Theophyllin nach einem Ein-Kompartment-Modell mit dem Programm
inNonlin® 4.1 (Pharsight, Mountain View California, USA).
D
Theophyllin und Theobromin nach ei
V
W
65
ERGEBNISSE
4 ERGEBNISSE
4.1. Ergebnisse der Analysemethoden
.1.1. Massenspektren der zu analysierenden Substanzen und ihrer internen Standards
nalyten
ach folgenden Retentionszeiten mit dem charakteristischen Produktion registriert:
.1.1.1. Massenspektrum von Theophyllin und 1,3-15N2- Theophyllin
heophyllin hat, wie Abb. 11 zeigt, unter den beschriebenen Bedingungen eine Retentionszeit
die Quantifizierung
ufgezeichnet.
4
Unter den im Kapitel 3.2. beschriebenen Gerätebedingungen werden die einzelnen A
n
4
T
von 3,28 Minuten und wird mit dem Produktion m/z 181.0 → 124.0 für
a
60 80 100 120 140 160 180m/z, amu
20%
40%
60%
80%
100%
Rel
. Int
. (%
)
181
124
69 96
9454
Abb. 11: ESI-Produktionenspektrum und Strukturformel von Theophyllin
66
ERGEBNISSE
Die Retentionszeit von 1,3-15N2-Theophyllin bei 3,29 Minuten und das charakteristische
Produktion m/z 183.0 → 125.0 sind in Abb. 12 dargestellt.
60 80 100 120 140 160 180m/z, amu
20%
40%
60%
80%
100%
Rel
. Int
. (%
)
183
125
9770
1,3-15N2-Theophyllin wurde als interner Standard sowohl für die Bestimmung von
Theophyllin als auch für den Metaboliten Paraxanthin im Urin und Plasma eingesetzt.
4.1.1.2. Massenspektrum von Theobromin und D6- Theobromin
Theobromin wird mit einer Retentionszeit von 2,91 Minuten und dem charakteristischen
Produktion m/z 181.0 → 138.0 unter den genannten Bedingungen detektiert. Das ESI-
Produktionenspektrum und die Strukturformel von Theobromin sind in Abb. 13 aufgeführt.
54
Abb. 12: ESI-Produktionenspektrum von 1,3-15N2-Theophyllin
67
ERGEBNISSE
60 80 100 120 140 160 180m/z, amu
20%
40%
60%
80%
100%R
el. I
nt. (
%)
181
67 138108 163110 1226953 83
Abb.13: ESI-Produktionenspektrum und Strukturformel von Theobromin
bb. 14 zeigt D6-Theobromin, den internen Standard zu Theobromin im Urin und Plasma,
elches nach einer Retentionszeit von 2,86 Minuten mittels des Produktions m/z 187.0 →
44.0 registriert wird.
A
w
1
60 80 100 120 140 160 180m/z, amu
20%
40%
R
60%t. (%
80
100%187
%
)
105
16911472
el. I
n
70 14412553 116
Abb.14: ESI-Produktionenspektrum von D6-Theobromin
68
ERGEBNISSE
69
4.1.1.3. Massenspektrum von Coffein und D3- Coffein
Coffein weist unter den entsprechenden Bedingungen eine Retentionszeit von 3,80 Minuten
auf und wird im Massenspektrometer mit dem Produktion m/z 195.0 → 138.0 registriert. Abb.
15 zeigt das ESI-Produktionenspektrum und die Strukturformel.
60 80 100 120 140 160 180 200
m/z, amu
20%
40%
60%
80%
100%
Rel
. Int
. (%
)
195
138
110123
ESI-Produktionenspektrum und Strukturformel von Coffein
69 83
Abb. 15:
D3-Coffein, welches als interner Standard für Coffein im Plasma und Urin eingesetzt wurde,
weist eine Retentionszeit von 3,78 Minuten auf. Seine Registrierung erfolgt
massenspektrometrisch über das Produktion m/z 198.0 → 141.0, wie in Abb. 16 dargestellt
wird.
ERGEBNISSE
ERGEBNISSE
70
60 80 100 120 140 160 180 200m/z, amu
20%
40%
60%
80%
100%198
141
el. I
113866953 126
Rnt
. (%
Abb.16: ESI-Produktionenspektrum von D3-Coffein
4.1.1.4. Massenspektrum von Paraxanthin
Paraxanthin zeigt eine Retentionszeit von 3,29 Minuten und wird im Massenspektrometer mit
dem Produktion m/z 181.0 → 55.0 aufgezeichnet, wie Abb. 17 zeigt.
)
60 80 100 120 140 160 180m/z, amu
20%
60%
80%
100%181
67 138163
9612255
40%
Rel
. Int
. (%
)
9469 83
124
uktionenspektrum und Strukturformel von Paraxanthin
Abb.17: ESI-Prod
70
ERGEBNISSE
4.2. Ergebnisse der Validierung
4.2.1. Selektivität
Die Analyten konnten bei ausreichender Trennung und ohne Verfälschung von fremden, in
der Probe vorkommenden Matrixinhaltstoffen erfasst werden.
Lediglich die Unterscheidung von Theophyllin und Paraxanthin gelang zunächst nicht, da sie
eine nahezu identische Retentionszeit und beide das Produktion m/z 181.0→ 124.0 aufwiesen.
Nach weiteren Untersuchungen fand sich als einziges Unterscheidungsmerkmal das
Produktion m/z 181.0→ 55.0, welches nur bei Paraxanthin dedektierbar war. Somit mu
llin und
Paraxanthin angesehen werden, und die Quantifizierung über die Differenzmethode erfolgen.
as bedeutet, dass wenn in Proben das Produktion m/z 181.0→ 55.0 keinen Peak zeigt, davon
usgegangen werden kann, dass der Peak des Produktions m/z 181.0→ 124.0 allein durch
hervorgerufen wird. Ist jedoch ein Peak des Produktions m/z 181.0→ 55.0
orhanden, muss hierüber die Paraxanthinkonzentration quantifiziert werden und von der über
en Peak des Produktions m/z 181.0→ 124.0 als Summenkonzentration von Theophyllin und
araxanthin ermittelten Wertes abgezogen werden.
den Abbildungen 18 und 19 sind beispielhaft Chromatogramme von Theobromin und
araxanthin im Urin dargestellt. Es wird jeweils ein Chromatogramm einer Leerurinprobe und
iner Pro onzentration von 100 ng Analyt pro 1ml Urin gezeigt.
sste
der Peak des Produktions m/z 181.0→ 124.0 als ein Summenpeak von Theophy
D
a
Theophyllin
v
d
P
In
P
eines e be mit der K
71
ERGEBNISSE
Abb.18: HPLC/MS/MS- Chromatogramme von Leerwerturinproben zu den entsprechenden
Retentionszeiten von Theobromin und Paraxanthin.
Abb.19: HPLC/MS/MS-Chromatogramme von Urinproben, denen 100 ng Theobromin
respektive Paraxanthin pro ml Urin zugesetzt wurden, zu den entsprechenden Retentionszeiten.
Die Abbildungen 20 und 21 zeigen Chromatogramme von Plasmaproben. Hier werden
zunächst Chromatogramme von Leerplasmaproben und anschließend Chromatogramme von
jeweils mit 100 ng/ml Plasma dotierten Coffein- bzw. Theophyllinproben dargestellt.
72
ERGEBNISSE
Abb.20: HPLC/MS/MS- Chromatogramme von Leerwertplasmaproben zu den entsprechenden
Retentionszeiten von Coffein und Theophyllin
Abb.21: HPLC/MS/MS–Chromatogramme von Plasmaproben, denen 100 ng Coffein
respektive Theophyllin pro ml Plasma zugesetzt wurden, zu den entsprechenden Retentionszeiten.
73
ERGEBNISSE
4.2.2. Linearität
lasma:
a wurden Theophyllin, Theobromin und Coffein in den Bereichen von 20 bis 1000
its in den Vorversuchen zeigte, dass mit keiner höheren Plasmakonzentration
ieses Metaboliten zu rechnen ist.
Die Abweichungen der geme ten Konzentrationen der Analyten betrug
an allen Messtagen im niedrigsten trationsbereich weniger als 20% und in den
höheren Konzen
Als Beispiel für die Linearität der Analyten im Plasma sind in Abbildung 22 und 23 jeweils
eine Kalibrationsgerade von Coffein und Theobromin im Konzentrationsbereich von 20 bis
l Plasm tellt.
P
Im Plasm
ng/ml, von 1000 bis 10000ng/ml sowie von 10000 bis 50000 ng/ml überprüft. Die Linearität
von Paraxanthin im Plasma wurde lediglich in dem Bereich von 20 bis 1000 ng/ml untersucht,
da sich bere
d
ssenen von den erwarte
Konzen
trationsbereichen weniger als 15%.
1000 ng/m a darges
y = 0.0058x - 0.0126R2 = 0.9991
0
1
2
3
4
5
7
6
st./I
S)
0 200 400 600 800 1000
Quo
tient
(Sub
bb.22: Kalibrationskurve mit Angabe der Kalibrationsgleichung und des
Messpunkte vor
Konzentration [ng/ml]
A Korrelationskoeffizienten für Coffein im Plasma; je Konzentrationsstufe liegen zwei
74
ERGEBNISSE
4
4.5
y = 0.0040x + 0.0087R2 = 0.9987
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
0 200 400 600 800 1000
Konzentration [ng/ml]
Quo
tient
(Sub
st./I
S)
: Kalibrationskurve mit Angabe der Kalibrationsgleichung und des Korrelationskoeffizienten für Theobromin im Plasma; je Konzentrationsstufe
Urin:
Bei der Prüfung der Kalibrationskurven konnte für Coffein im Konzentrationsbereich von 25
bis 1000 ng/ml ohl im reich von 25 bis 1000 ng/ml, als auch von 1000
bis 30000 ng/m raxanthin im zentrationsbereich von 25 bis 1000 ng/ml die
Linearität angenommen werden. Die Linearität von Theobromin konnte weder in den
iedrigen noch in den hohen Konzentrationsbereichen bestätigt werden, so dass in diesem Fall
erdeutlichten anhand des F- Tests, dass diese signifikant kleinere Varianzen beim
uadratischen Regressionsmodell aufwiesen, als es bei der linearen Regression der Fall war.
bbildung 24 und 25 zeigen beispielhaft je eine Kalibrationskurve von Theophyllin und
heobromin eines Messtages.
Abb.23 liegen zwei Messpunkte vor
, für Theophyllin sow Be
l und für Pa Kon
n
das quadratische Regressionsmodell gewählt wurde. Die Untersuchungen der Residuen
v
q
A
T
75
ERGEBNISSE
y = 0.0160x + 0.1451R2 = 0.9996
14
16
18
6
8
10
12
Quo
tient
(Sub
st./
0
2
4
0 200 400 600 800 1000 1200
n ation [ng/ml]Konze tr
Abb rve der Kalibrationsgleichung und des
Korrelationskoeffizienten für Theophyl in; je Konzentrationsstufe liegen zwei Messpunkte vor
.24: Kalibrationsku mit Angabe lin im Ur
y = -1E-07x2 + 0.01x9963
+ 10.773R2 = 0.
0
50
100
150
0
50
0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000Konzentration [ng/ml]
Quo
tient
(t./
IS)
bb.25: Kalibrationskurve mit Angabe der Kalibrationsgleichung und des
Korrelationskoeffizienten für Theobromin im Urin; je Konzentrationsstufe liegen zwei Messpunkte vor
20
2
Subs
A
76
ERGEBNISSE
Die Abweichungen der gemess en er onzentrationen betrugen auch im
Urin an allen Messtagen bei Coffein, Theobr Theophyllin und Paraxanthin im
niedrigsten Konzentrationsbereich weniger als 20% und in den höheren
Konzentrationsbereichen weniger als 15%.
4.2.3. Na isgrenze (L
lasma:
LOD) für
heophyllin, Theobromin, Coffein und Paraxanthin im Plasma werden in Tabelle 13
aufgeführt.
N (LOD
enen von d warteten K
omin,
chwe OD)
P
Die nach Kapitel 3.3.3. ermittelten Nachweisgrenzen (limit of detection,
T
achweisgrenze ) ml] [ng/
Theophyllin 13
Theobromin 15
Paraxanthin 9 2
Coffein 4 1
Tab.13: Nachweisgrenzen von Theophyllin, Theobromin, Coffein und Paraxanthin im Plasma
rin:
Die ittelten Nachweisgrenzen für Theophyllin, Theobromin, Coffein und Paraxanthin im
rin sind T elle 14 zu entnehme
Nach enze (LOD)
U
erm
U ab n.
weisgr [ng/ml]
Theophyllin 20
Theobromin 26
Paraxanthin 32
Coffein 33
Tab.14: Nachweisgrenzen von Theophyllin, Theobromin, Coffein und Paraxanthin im Urin
77
ERGEBNISSE
4.2.4. Bestimmungs-/Quantifizierungsgrenze (LOQ)
Plasma:
Die nach Kapitel 3.3.4. ermittelten Bestimmungs- bzw. Quantifizierungsgrenzen (limit of
B r ze (LOQ)
quantification, LOQ) für Theophyllin, Theobromin, Coffein und Paraxanthin im Plasma
werden in Tabelle 15 aufgeführt.
estimmungsg en [ng/ml]
Theophyllin 100
Theobromin 100
Paraxanthin 100
Coffein 100 Tab.1 eophyllin, Theobromin, Coffein und Paraxanthin im
Pla
rin:
ttelten Paraxanthin
Urin sind Tabelle 16 zu entnehmen.
Besti ze
5: Bestimmungsgrenzen von Thsma
U
Die ermi Bestimmungsgrenzen für Theophyllin, Theobromin, Coffein und
im
mmungsgren (LOQ) [ng/ml]
Theophyllin 50
Theobromin 100
Paraxanthin 50
Coffein 50
Tab.16: Bestimmungsgrenzen eophyllin, Theobromin, Coffein und Paraxanthin im Urin
von Th
78
ERGEBNISSE
4.2.5. Richtigk
lasma
Die Tabellen 17, 18, 19 und 20 enthalten die Ergebnisse der Überprüfung der Methode auf
Richtigkeit. In den Tabellen ist jew er Mittelwert der gemessenen Konzentrationen aus 5
Einzelbestimmungen und die relative Abweichung aufgelistet.
Die ative Abw ng betrug i eren Konzentrationsbereich weniger als 20% und in
den oberen Konzentrationsbereich eniger als 1 . Allerdings waren am dritten Tag
sowohl bei Coffein als auch bei Theobromin bei einer Konzentration von 100 ng/ml relative
bweichungen knapp oberhalb von 20% erkennbar.
eit
P
eils d
rel eichu m unt
en w 5%
A
Mittelwert der erwartete gemessenen Relative
Tag Konzentrationen T - heophyllin Abweichung
[ng/ml] Konzentrationen RA [%] [ng/ml]
100 100,3 0,3 1000 1 1049,7 5,0
10000 10127,5 1,3 100 116,6 16,6
1 1000 2 008,0 0,8 10000 10000,4 0 100 109,0 9,0 1000 3 998,2 -0,28
10000 10358,0 3,6
Tab.17: Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Theophyllin im Plasma
79
ERGEBNISSE
Mittelwert der
erwartete gemessenen Relative
Tag Konzentrationen Theobromin- Abweichung
[ng/ml] Konzentrationen RA [%] [ng/ml]
100 95,0 -5,0 1 1000 996,6 -0,3 10000 10098,0 1,0 100 91,6 -8,4 2 1000 1039,5 4,0 10000 9739,6 -2,6 100 127,4 27,4 3 1000 976,7 -2,3
5,610000 1056,8
Tab.1 Ergebnisse der Überprüfung der R igkeit vo eobromin im Plasma
M ert der
8: icht n Th
ittelw erwartet senen Relative e gemes
Tag Konzentrationen Paraxanthin- Abweichung [ng/ml] Konzentrationen RA [%]
[ng/ml]
100 92.9 -7.1 1 1000 990.0 -1.0 100 88.7 -11.3 2 1000 1025.9 2.6 100 108.1 8.1
0.11000 3 1001.4
Tab.1 Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Paraxanthin im Plasma
M ert der
9:
ittelw erwa ssenen Relative rtete geme
Tag Konzentrationen Coffein- Abweichung
[ng/ml] Konzentrationen RA [%] [ng/ml]
100 105,1 5,1 1 1000 967,2 -3,3 10000 9554,6 -4,5 100 96,6 -3,4 2 1000 1138,9 13,9 10000 10555,3 5,6 100 121,2 21,2 3 1000 1062,6 6,3 10000 10172,2 1,7
Tab.20: Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Coffein im Plasma
80
ERGEBNISSE
Urin:
Die Überprüfung der Methode auf Richtigkeit im Urin wurde für die Konzentrationen 50,
2500 und 20000 ng/ml Urin bei Theophyllin, Theobromin, Paraxanthin und Coffein bestätigt.
ie entsprechenden Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen 21, 22, 23 und 24 aufgeführt.
Im lag lativ eich i allen Substanzen im niedrigen
Konzentrationsbereich unter 20% und in höheren Konzentrationsbereichen unter 15%.
M ert der
D
Urin die re e Abw ung be
ittelw
erwa senen elative rtete gemes R
Tag Konzentrationen Theophyllin- eichung Abw
[ng/ml] Konzentrationen RA [%] [ng/ml]
50 47,0 -6,0 1 2500 2285,7 -8,6 20000 19150,9 -4,3 50 43,7 -12,4 2 2500 2402,8 -3,9 20000 18510,0 -7,5 50 43,2 -13,6 3 2500 2568,2 2,7 20000 20400,3 2,0
Tab.21: Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Th llin im eophy Urin
Mittelwert der
erwartete gemessenen Relative
Tag Konzentrationen Theobromin- Abweichung
[ng/ml] Konzentrationen RA [%] [ng/ml]
100 98,3 -1,7 1 2500 2460,7 -1,6 20000 19254,9 -3,7 100 114,8 14,8 2 2500 2505,3 0,2 20000 18504,1 -7,5 100 118,3 18,3 3 2500 2631,5 5,3 20000 20497,8 2,5
ab.22: Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Theobromin im Urin T
81
ERGEBNISSE
Mittelwert der
erwartete gemessenen Relative
Tag Konzentrationen Paraxanthin- Abweichung
[ng/ml] Konzentrationen RA [%] [ng/ml]
50 55,1 10,3 1 250 228,4 -8,7 1000 935,0 -6,5 50 41,9 -16,2 2 250 248,2 -0,7 1000 1021,2 2,1 50 54,4 8,8 3 250 246,9 -1,3 1000 1040,0 4,0
Tab.23: Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Paraxanthin im Urin
M
ittelwert der
erwa geme Relative rtete ssenen
Tag Konzentra Cof Abw g tionen fein- eichun
[ng/ml] Konzentrationen RA [%] [ng /ml]
50 58 1,1 6,2 1 100 103,1 3,1 20000 1975 -18,4 ,3 50 55,8 11,7 2 100 87,9 -12,1 2000 1973 -0 9,6 1,2 50 44 -1,8 0,3 3 100 98,2 -1,8 20000 19051,0 -4,8
Tab.24: Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Coffein im Urin
82
ERGEBNISSE
4.2.6. Präzision
Plasma
e Ergebnisse der Präzisionsberechnung der
traday- und der Präzi A ma aufgeführt. Sowohl die
Intra ls a day lagen bei allen Substanzen innerhalb der
bweichungsgrenze vo 20% im 1 nzentrationsbereich.
ophyllin Theobromin
In den folgenden Tabellen 25 und 26 sind di
In Interday- sion der vier nalyten im Plas
day- a uch die Inter -Präzision
A n niedrigen und 5% im hohen Ko
The
erwartete Intrad nterday Intraday I ay ay I nterd
K Präz Präzision Präzision ision onzentrationen ision Präz
[ng/ml] [% [%] [%] [%] ]
100 1 7,5 9,8 19,3 5,5
1000 9, 2,7 6,8 3,2 0
10000 8 1,8 3,8 4,4 ,0
Tab.25: Intraday- und Interdaypräzision von Theophyllin und Theobromin im Plasma
Coffein Paraxanthin
erwartete Intraday Interday Intraday Interday
Konzentrationen Präzision Präzision Präzision Präzision
[ng/ml] [%] [%] [%] [%]
100 15,8 11,7 14.79 10.58
1000 7,3 5,0 5.4 1.8
10000 10,8 8,4 n.m. n.m.
Tab.26: Intraday- und Interdaypräzision von Coffein und Paraxanthin im Plasma
83
ERGEBNISSE
Urin:
Die Ergebnisse der Präzision für die Quantifizierung von Theophyllin und Theobromin sowie
anthin und Coffein im Urin sind den unten aufgeführten Tabellen 27 und 28 zu
Theophyllin Theobromin
von Parax
entnehmen.
erwartete Intraday y erwartete Intraday Interday Interda
Ko Prä nzentrationen Präzision Präzision nzentrationen zision Präzision Ko
[ng/ml] [%] [%] [ng/ml] [%] [%]
50 8,2 4,6 100 3,2 9,7
2500 8,3 9 2500 6,9 3,5 5,
20000 14,9 20000 16,8 5,2 5,2
Intraday- und Interdaypräzision von Theophyllin und Theobromin im Urin
Paraxanthin Coffein
Tab.27:
erwartete Intraday Interday erwartete Intraday Interday
Konzentrationen Präzision Präzision Konzentrationen Präzision Präzision
[ng/ml] [%] [%] [ng/ml] [%] [%]
50 9,1 14 50 14,2 13,3 ,8
250 7 100 13,3 13,0 ,4 4,6
1000 14,9 20000 8,1 2,1 5,6
Ta - und Interdaypräzision von Coffein und Paraxanthin im Urin
b.28: Intraday
84
ERGEBNISSE
85
, Theobromin und Paraxanthin sind innerhalb des Zeitraums von 28 Tagen stabil.
on geltenden Abweichung
15% im hohen Konzentrationsbereich liegt.
it den jeweiligen Konzentrationen am Tag 0 und am Tag 28 sind in der folgenden Tabelle
4.2.7. Stabilität
Plasma:
Theophyllin
Die Ergebnisse und der Vergleich der Messdaten mit Hilfe des U-Tests lassen darauf
schließen, dass Coffein zwar nach einem Zeitraum von 28 Tagen einen Substanzverlust
aufweist, dieser jedoch innerhalb der für die Richtigkeit und Präzisi
von 20% im niedrigen Konzentrationsbereich und
Die Ergebnisse der Stabilitätsprüfung von Theophyllin, Theobromin, Paraxanthin und Coffein
m
29 dargestellt.
Tag 0 Tag 28 erwartete Mittelwert der Mittelwert der
Analyt Konzentrationen gemessenen gemessenen Abweichung
Konzentrationen Konzentrationen [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [%]
100 100,0 98,5 -1,5
Theophyllin 1000 977,5 970,8 -0,7
100 97,3 97,4 0,1
Theobromin 1000 1066,3 984,8 -7,6
100 82.62 79.94 -3.2
Paraxanthin 1000 996.36 907.92 -8,9
100 95,4 78,8 -17,2
Coffein 1000 953,9 901,7 -5,5
Tab.29: Stabilitätsdaten von Theophyllin, Theobromin, Paraxanthin und Coffein im Plasma
Urin:
ERGEBNISSE
Die Ergebnisse der Stabilitätsuntersuchungen der Substanzen im Urin sind in der folgenden
Tabelle 30 aufgeführt.
Tag 0 Tag 28
erwartete Mittelwert der lwert der Mitte
Analyt Konzentrationen gemessenen gemessenen Abweichung
Konzentrationen onzentrationen K
[ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [%]
100 96,7 100,7 -3,9
Theophyllin 1000 1051,0 1001,5 -4,7
100 100,3 98,0 -2,3
Theobromin 1000 1134,2 982,7 -13,6
100 104,3 103,3 -1,0
Paraxanthin 1000 946,9 896,6 -5,3
100 89,0 92,1 3,4 Coffein 1000 943,2 1134,2 4,7
Tab.30: Stabilitätsdaten von Theophyllin, T min, Paraxanthin und Coffein im Urin
Diese Ergebnisse verdeutlichen unter Berücksi ng des U-Tests, dass sowohl Coffein und
Theobromin, als auch Theophyllin und Par in in einem Zeitraum von 28 Tagen
geringgradige Konzentrationsveränderungen aufweisen. Diese Abweichungen liegen jedoch
innerhalb der Messungenauigkeit, so dass tabilität dieser Substanzen für diesen
Zeitraum angenommen werden kann.
heo
cht
ax
ein
bro
igu
anth
e S
86
ERGEBNISSE
4.2.8. Wiederfindung
Plasma:
Die Ergebnisse der Berechnung der Wiederfindung der Substanzen Theophyllin, Theobromin,
Paraxanthin und Coffein im Plasma sind in Tabelle 31 beschrieben.
Mittlere Substanzen Wiederfindungsrate [%]
Theophyllin 90,2
Theobromin 84,9
Paraxanthin 90,2
Coffein 100,0 T Wiederfindungsraten von Theophyllin, Theobromin, Paraxanthin unab.31: d Coffein im
Plasma
rin:
Mittlere
U
Die Wiederfindungsergebnisse der Analyten im Urin sind der Tabelle 32 zu entnehmen.
Substanzen Wiederfindungsrate [%]
Theophyllin 96,1
Theobromin 93,4
Paraxanthin 95,9
Coffein 92,4
Tab.32: Wiederfindungsraten von Theophyllin, Theobromin, Paraxanthin und Coffein im Plasma
87
ERGEBNISSE
4.3. Ergebnisse des Hauptversuches
4.3.1.
In Anlehnung an den Hauptversuch gliedert sich die Untersuchung der Plasmaproben in drei
ischen der applizierten
Substanz sowie den entstandenen Metaboliten unterschieden wird.
8.834 ng pro ml Plasma gemessen werden. Wie
allen Pferden
ml Plasma nicht unterschritten. In Abb.
6 sind die Plasmakonzentrationsverläufe von Theophyllin aller Pferde dargestellt.
anthin erst nach zwei Stunden gemessen werden. Die gemessenen
Coffeinplasmakonzentrationen der Pferde 2 und 4 blieben unterhalb der ermittelten
ierun Wert
oberhalb d ale
offeinplasmakonzentration von 1.283 ng/ml wies Pferd 5 nach zwei Stunden auf. Abb. 27
nd 28 zeigen die gemittelten Plasmakonzentrationsverläufe von Paraxanthin und Coffein und
Theophyllin, Abb. 29 das prozentuale Verhältnis von Theophyllin und Paraxanthin. Die
Einzelwerte der Theophyllin-, Paraxanthin- und Coffeinplasmakonzentrationen aller Pferde
sind in den Tabellen 43, 44 und 45 im Anhang aufgeführt.
Plasma
Abschnitte (Kapitel 4.3.1.1. bis Kapitel 4.3.1.3), in denen jeweils zw
4.3.1.1. Theophyllin und Metaboliten nach intravenöser Applikation
Nach intravenöser Verabreichung von Theophyllin konnten im Plasma maximale
Theophyllinkonzentrationen von 5.165 bis
aus Abbildung 26 ersichtlich, wurden diese bei allen Pferden innerhalb der ersten zwei bis
fünf Minuten erreicht. In den darauffolgenden zehn Minuten fielen die Konzentrationen
zunächst stark ab, um dann bei den Pferden 1, 2, 4, 5 und 6 nochmals geringgradig
anzusteigen, bevor sie nach 30 Minuten langsam kontinuierlich abnahmen. Bei
wurde innerhalb des Probenentnahmezeitraumes von sechzig Stunden die
Quantifizierungsgrenze von 100 ng Theophyllin pro
2
Im Plasma ließen sich außerdem die Metaboliten Paraxanthin und Coffein nachweisen.
Theobromin hingegen konnte nicht detektiert werden.
Die maximalen Paraxanthinkonzentrationen von 370 bis 868 ng/ml wurden bei den Pferden 1,
2, 3, 4 und 6 nach zwei Minuten gemessen. Lediglich bei Pferd 5 konnten die höchste
Konzentration von Parax
Quantifiz gsgrenze von 100 ng/ml. Bei den Pferden 1 und 3 konnte jeweils nur ein
er Quantifizierungsgrenze gemessen werden. Die maxim
C
u
88
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
0 10 20 30 40 50 60 70
Stunden nach Applikat
Kon
zent
ratio
n Th
eoph
yllin
[ng/
ml]
Pferd 1 Pferd 2 Pferd 3 Pferd 4 Pferd 5 Pferd 6
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
0 0.2 0.4 0.6
ion
0.
m
8 1 1.2
Abb. 26 : Plasmakonzentrationsverläufe von Theophyllin bei sechs Pferden nach ein aliger intravenöser Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht, Ausschnittsvergrößerung zeigt den Konzentrationsverlauf innerhalb der ersten Stunde
89
ERG
EBN
ISSE
ERGEBNISSE
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
0 10 20 30 40 50 60 70
Stunden nach Applikation
Kon
zent
ratio
n [n
g/m
Paraxanthin- Mittelwerte
Coffein- MittelwerteTheophyllin- Mittelwerte
Abb. 27: Gemittelter Plasmakonzentrations uf von Theophyllin und den Metaboliten Paraxanthin und Coffein (Theobro wurde nicht nachgewiesen)
verlamin
0
100
200
300
400
500
600
0 10 20 30 40 50 60 7
Stunden n
0
pplikation
Kon
zent
ratio
n [n
g/
ach A
m Paraxanthin- MittelwerteCoffein- MittelwerteLOQLOD
Abb.28: Gemittelter Plasmakonzentrationsv der Metaboliten Paraxanthin und Coffein nach intravenöser Applikation von g Theophyllin sowie der Quantifizierungsgrenze (LOQ) un chweisgrenze (LOD)
erl 4 m
d de
auf g/k
r Na
90
ERGEBNISSE
91
0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%
100%
0 0.08 0.25 0.5 1 3 7 12 24 32 48 60
Zeit [h]
Theophyllin Paraxanthin Theobromin Coffein
Abb. 29: Prozentuales Verhältnis von Theophyllin und dem Metaboliten Paraxanthin und Coffein im Plasma nach intravenöser Applikation von 4 mg/kg Körpergewicht im Mittel bis zum Erreichen von LOQ (es wurde kein Theobromin nachgewiesen)
4.3.1.2. Theophyllin und Metaboliten nach oraler Applikation
Die maximalen Plasmakonzentrationen von The
zwischen 1.791 ng/ml und 3.483 ng/ml. Der
Konzentration variiert von vierzig Minuten bis zwölf Stunde
wurde von zwei Pferden nach 60 Stunden, von dr
Pferd erst nach 108 Stunden unterschritten.
Auch nach oraler Applikation konnte der Me
maximalen Konzentrationen lagen zwischen
40 Minuten und 12 Stunden erreicht. Ab 48 Stunde
die Werte aller Pferde die Quantifik
Coffein war lediglich in Spuren im Bere
Theobromin konnte nicht nachgewiesen werden.
ophyllin nach oraler Verabreichung lagen
Zeitraum des Erreichens der maximalen
n. Die Quantifizierungsgrenze
ei Pferden nach 96 Stunden und von einem
tabolit Paraxanthin nachgewiesen werden. Die
157 ng/ml und 370 ng/ml und wurden zwischen
n nach der Verabreichung unterschritten
ationsgrenze für Paraxanthin von 100ng/ml.
ich der Nachweisgrenze von 14 ng/ml erkennbar.
Die Einzelwerte d ind in
en Tabellen 46 und 47 im Anhang aufgeführt. Abb. 30 zeigt die
akonzentrationsverläufe aller sechs Pferde, Abb. 31 die gemittelten Plasm
d
er Theophyllin- und Paraxanthinplasmakonzentrationen aller Pferde s
ERGEBNISSE
Plasmakonzentrationsverläufe von Theophyllin und Paraxanthin und Abb. 32 deren
prozentuales Verhältnis.
0
500
1000
1500
2000
2500
0 20 40 60 80 100 120
Stunden nach Applikation
Kon
zent
ratio
n [n
g/m
Theophyllin- MittelwerteP
rlau
The
araxanthin- Mittelwerte
Abb. 30: Gemittelter Plasmakonzentrationsve f von Theophyllin und Paraxanthin im Plasma nach oraler Applikation von 4 m ewicht im Mittel bis zum Erreichen von LOQ (es wurde kein in und kein Coffein nachgewiesen)
g/kg Körpergobrom
0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%
100%
0 0.16 0.66 3 9
Ze24 48 60
]it [h
Theophyllin Paraxanthin Theobromin Coffein
Abb. 31: Prozentuales Verhältnis von Theophyl d dem Metaboliten Paraxanthin im Plasma nach oraler Applikation von g Körpergewicht im Mittel bis zum Erreichen von LOQ (es wurde kein in und kein Coffein nachgewiesen)
lin ung/k
obrom 4 mThe
92
0
5 0 0
1
1 0 0 0
1 5 0 0
2 0 0 0
2 5 0 0
3 0 0 0
3 5 0 0
4 0 0 0
0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 2 0
S tu n d e n n a c h A p p lik a t io n
Kon
zent
ratio
n [n
g/m
l]
P fe rd 1 P fe rd 2 P fe rd 3 P fe rd 4 P fe rd 5 P fe rd 6
0
5 0 0
1 0 0 0
1 5 0 0
2 0 0 0
2 5 0 0
3 0 0 0
3 5 0 0
4 0 0 0
0 5 1 0 1 5 2 0 2 5
Abb. 32: Plasmakonzentrationsverläufe von Theophyllin nach einmaliger oraler Applikation von 4mg Theophy gewicht, Ausschnittsvergrößerung zeigt die ersten 25 Stunden nach Applikation
93
ERG
EBN
ISSE
3 0
llin pro kg Körper
ERGEBNISSE
4.3.1.3. he in te i ö p
W n u m n d im Pla nze nen der
ein lnen de W zw en ng nd 2 an und wurden zwischen
zw und inu ach ave V eich erre De zent sverlauf
f ach initialer Maximalkonzentration bei Pfer 1, 4, 5 und 6 ab, u ann zehn
M en n der ika kon rlic gsa eite
und 3 weicht der Verlauf wie folgt ab: Die Pl akonzentrationen schwanken innerhalb der
ersten zwanzig Minuten stark zwischen hohen
im rla n ferde kontinuierlic a o ati erli
ie Werte der Pferde 1, 2 und 5 unterschreiten bereits nach 96 Stunden die
isen über
en Probenentnahmezeitraum von 168 Stunden Theobrominplasmakonzentrationen oberhalb
er Quantifizierungsgrenze auf. Wie die prozentuale Darstellung in Abb. 33 zeigt, läßt sich
im Plasma lediglich Theobromin
br inap werden. Die Einzelwerte der
r inpl in Tab. 48 im Anhang aufgeführt.
T obrom und Metaboli n nach ntraven ser Ap likation
ie der Abbildu g 34 z entneh en ist, ahmen ie max alen smako ntratio
ze Pfer erte isch 5.715 /ml u 12.40 ng/ml
ei 45 M ten n intr nöser erabr ung icht. r Kon ration
ällt n den den stark m d
inut ach Appl tion tinuie h lan m w r abzufallen. Bei den Pferden 2
asm
und niedrigen Werten, um danach ähnlich wie
Ve uf der a deren P h langs m an K nzentr on zu v eren.
D
Quantifizierungsgrenze, die des Pferdes 6 nach 144 Stunden. Die Pferde 3 und 4 we
d
d
nach intravenöser Verabreichung von Theobromin
nachweisen. Coffein, Theophyllin und Paraxanthin konnten nach intravenöser
Theo om plikation nicht nachgewiesen
Theo om asmakonzentrationen aller Pferde sindb
0%10%2030%40%50%60%70%80%9
100%0%
%
0 0.08 0.25 0.5 1 3 7 13 28 48 96 144
Zeit [h]
Theophyllin Paraxanthin Theobromin Coffein
Abb. 33: Prozentuales Verhältnis von Theobr
omin und Metaboliten im Plasma nach intravenöser Applikation von 4 mg/kg Körpergewicht im Mittel (es wurde kein Theophyllin, kein Paraxanthin und kein Coffein nachgewiesen)
94
0
2000
4000
6000
8000
10
12
14
Kon
zent
ratio
n [n
g/m
l]
000
000
000
0 2 0 60 80 120 140 180
S tu n d en n ach A p p tio n0 4 100
lika160
P ferd 1 P fe rd 2 P fe rd 3 P fe rd 4 P fe rd 5 P fe rd 6 0
2000
0 0.4
Abb. 34: Plasmakonzentrationsverläufe von Theobromin nach einmaliger intravenöser Applikation von 4 mg Theobro kg Körpergewic Ausschnittsvergrößerung gt die erste Stunde nach Applikation
95
ERG
EBN
ISSE
ht,
4000
00
00
00
00
00
60
80
100
120
140
0.2 0 .6 0 .8 1 1.2
min pro zei
ERGEBNISSE
4.3.2. Pharmakokinetische Berechnungen
4.3.2.1. Pharmakokinetik von Theophyllin nach intravenöser Applikation
Die Berechnung der pharmakokinetischen Parameter für Theophyllin nach intravenöser
Verabreichung erfolgte anhand eines Zwei-Kompartiment-Modells, da aufgrund der in Abb.
5 dargestellten halblogarithmischen Darstellung der gemittelten
lasmakonzentrationsverläufe des Theophyllins von einem biexponentiellen Phasenverlauf
ausgegangen werden konnte.
3
P
1
10
100
1000
10000
0 10 20 0 50 60
Z
30 4
eit [h]
Kon
zent
ratio
n [n
g/m
l]
MittelwertLOQLOD
bb.35: Halblogarithmische Darstellung der gemittelten Theophyllinkonzentrationsverläufe im r
ie Ergebnisse der pharmakologischen Berechnungen durch das Programm WinNonlin® 4.1
lle 33 dargestellt.
APlasma nach einmaliger intravenöser Applikation von Theophyllin, sowie deQuantifizierungsgrenze (LOQ) und der Nachweisgrenze (LOD)
D
(Pharsight, Mountain View California, USA) sind in Tabe
96
ERGEBNISSE
Para- Einheit Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Mittel- Standard-
meter 1 2 3 4 5 6 wert abweichung
AUC [ng/ml*h] 87652 80682 49055 53372 89035 74065 72310 17249
α [h-1] 2.64 3.17 31.95 4.33 38.75 15.02 15.98 15.83
β [h-1] 0.04 0.06 0.07 0.05 0.04 0.06 0.05 0.01
α 0,5 [h] 0.3 0.2 0.1 0.2 0.1 0.1 0.2 0.1
β 0,5 [h] 16.6 12.6 10.1 14.5 15.6 12.3 13.6 2.4
C max [ng/ml] 8808 6657 16149 4941 11786 10323 9777 3975
CL [ml/h/kg] 45.6 49.6 81.5 74.9 44.9 54.0 58.4 15.8
MRT [h] 23.5 17.9 14.5 20.7 22.5 17.6 19.4 3.4
Vss [ml/kg] 1071.2 890.1 1180.4 1548.4 1008.9 949.5 1108.1 237.9
Tab.33: Pharmakokinetische Daten bis zur Quantifizierungsgrenze nach einmaliger intravenöser Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht
nter der Kurve (area under the curve) = Hybridkonstante Verteilungsphase = Hybridkonstante der Eliminationsphase
0,5 = Halbwertzeit für die Eliminationsphase
ax = maximale Konzentration
AUC = Fläche uαβα 0,5 = Halbwertzeit für die Verteilungsphase βC mCL = Clearance MRT = mittlere Verweildauer eines Moleküls im Organismus Vss = Verteilungsvolumen im Steady State
4.3.2.2. Pharmakokinetik von Theophyllin nach oraler Applikation
Die Berechnungen der pharmakokinetischen Parameter für Theophyllin nach oraler
Applikation wurde anhand eines Ein-Kompartiment-Modells durchgeführt, da die in Abb. 36
gezeigte halblogarithmische Darstellung der gemittelten Plasmakonzentrationen von
Theophyllin sich monoexponentiell verhielt.
Die Ergebnisse der pharmakokinetischen Berechnungen sind in Tabelle 34 zusammengefasst.
97
ERGEBNISSE
98
1
10
100
1000
0 20 40 60 80 100 120
Zeit [h]
Kon
zent
ratio
n [n
g/m
l]10000 Theophyllin- Mittelwerte
LOQLOD
Abb.36: Halblogarithmische Darstellung der gemittelten Theophyllinkonzentrationsverläufe im Plasma nach einmaliger oraler Applikation von Theophyllin, sowie der
Nachweisgrenze (LOD)
Pferd Pferd Mittel- Standard-
Quantifizierungsgrenze (LOQ) und der
Para- Einheit Pferd Pferd Pferd Pferd
meter 1 2 3 4 5 6 wert abweichung
AUC [ng/ml*h] 56495 40490 84566 66423 79068 41928 61495 18517
K01 HL [h-1] 3.37 1.03 0.95 2.09 0.12 2.25 1.64 1.16
K10 HL [h-1] 13.86 6.76 21.44 11.52 17.49 14.17 14.21 5.02
CL [ml/h/kg] 70.8 98.8 47.3 60.2 50.6 95.4 70.5 22.2
Tmax [h] 9.08 3.29 4.48 6.28 0.86 7.1 5.18 2.93
Cmax [ng/ml] 1794 2964 2366 2738 3029 1449 2390 648
Kel [h-1] 0.04 0.05 0.04 0.05 0.03 0.03 0.04 0.01
Tab.34: Pharmakokinetische Daten bis zur oraler Applikation von 4 mg Theoph
AUC = Fläche unter der Kurve (area under the curve)K01 HL = Halbwertszeit der ResorptionskonstanteK10 HL = Halbwertszeit der EliminationskonstanteCL = Clearance Tmax = Zeit bis zum Erreichen der maximaCmax = maximale KonzentrationKel = Eliminationskonstante
Quantifizierungsgrenze nach einmaliger yllin pro kg Körpergewicht
n n
len Konzentration (Cmax)
ERGEBNISSE
Aus den ermittelten Parametern lässt sich zusätzlich die orale Bioverfügbarkeit (F) von
Theophyllin bestimmen. Sie wird über das Verhältnis der Flächen unter den Kurven nach
intravenöser (AUC i.v.) und nach oraler (AUC oral) Verabreichung wie folgt berechn
et:
100..
⋅⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛=
vi
oral
AUCAUC
F [%]
Die orale Bioverfügbarkeit von Theophyllin wurde mit 85% errechnet.
4.3.2.3. Pharmakokinetik von Theobromin nach intravenöser Applikation
Zur Berechnung der pharmakokinetischen Parameter des intravenös verabreichten
Theobromins wurde, aufgrund des in Abb. 37 dargestellten biexponentiellen Verlaufes der
halblogarithmischen Darstellung der Plasmakonzentrationsmittelwerte, ein Zwei-
Kompartiment-Modell gewählt. Die Ergebnisse der pharmakokinetischen Berechnungen sind
in Tabelle 35 zusammengefasst.
1
10
100
1000
10000
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Zeit [h]
Kon
zent
ratio
n [n
g/m
l]
Theobromin- MittelwerteLOQLOD
Abb.37: Halblogarithmische Darstellung der gemittelten Theobrominkonzentrationsverläufe im Plasma nach einmaliger intravenöser Applikation von Theobromin, sowie der Quantifizierungsgrenze (LOQ) und der Nachweisgrenze (LOD)
99
ERGEBNISSE
Para- Einheit Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Mittel- Standard-
meter 1 2 3 4 5 6 wert abweichung
AUC [ng/ml*h] 28895 111380 94570 131372 90244 97882 92391 34500
α [h-1] 23.72 0.08 0.13 5.68 23.53 6.2 9.89 10.96
β [h-1] 0.2 0.02 0.02 0.02 0.04 0.03 0.06 0.07
α 0,5 [h] 0.1 9.1 5.2 0.1 0.1 0.1 2.2 3.8
β 0,5 [h] 3.5 30.9 25.1 29.1 18.5 21.3 21.4 9.9
C max [ng/ml] 20382 6585 5174 5626 18911 6397 8539 5827
CL [ml/h/kg] 138.4 35.9 42.3 30.5 44.3 40.9 55.4 41.0
MRT [h] 4.9 23.2 28.9 41.8 26.5 30.5 25.9 12.1
Vss [ml/kg] 680.6 834.5 1221.7 1272.1 1174.5 1247 1071.7 250.3 Tab.35: Pharmakokinetische Daten bis zur Quantifizierungsgrenze nach einmaliger
intravenöser Applikation von 4 mg Theobromin pro kg Körpergewicht
UC = Fläche unter der Kurve (area under the curve) = Hybridkonstante Verteilungsphase = Hybridkonstante der Eliminationsphase 0,5 = Halbwertzeit für die Verteilungsphase 0,5 = Halbwertzeit für die Eliminationsphase max = maximale Konzentration L = Clearance RT = mittlere Verweildauer eines Moleküls im Organismus ss = Verteilungsvolumen im Steady State
AαβαβCCMV
100
ERGEBNISSE
101
ten im Urin Theophyllin und
l. Theobromin konnte nicht nachgewiesen werden.
izierungsgrenze von 50 ng Theophyllin pro ml
ten Probenentnahmezeitraum in Konzentrationen
ungsgrenze von 50 ng pro ml Urin nachzuweisen. Die höchsten
chen 745 ng/ml und 2.980 ng/ml und wurden
rei bis zwölf Stunden gemessen. Die Einzelwerte der
- und Paraxanthinurinkonzentrationen aller Pferde sind in den Tabellen 49 und 50
Anhang aufgeführt. Das prozentuale Verhältnis von Theophyllin und Paraxanthin wird in
Abb. 39 veranschaulicht. In Abb.38 werden die Theophyllinkonzentrationsverläufe aller
Pferde im Urin nochmals graphisch dargestellt.
4.3.3. Urin
4.3.3.1. Theophyllin und Metaboliten nach intravenöser Applikation
Nach intravenöser Verabreichung von Theophyllin konn
Paraxanthin nachgewiesen werden. Coffein war in Spuren erkennbar, die Werte überschritten
aber nicht die Bestimmungsgrenze von 50 ng pro ml Urin, somit kann Coffein nicht sicher
quantifiziert werden. Die gemittelten rein rechnerischen Coffeinkonzentrationen lagen alle
unter der Detektionsgrenze von 14 ng/m
Theophyllin wies maximale Konzentrationen von 21.636 ng/ml bis 93.373 ng/ml auf. Diese
wurden nach drei bis neun Stunden im Anschluss an die Injektion erreicht. Im weiteren
Verlauf fielen die Konzentrationen zunächst rasch ab, danach sanken sie langsam und
kontinuierlich. Über den Zeitraum der Urinprobenentnahmen von 60 Stunden fiel bei keinem
Pferd die Urinkonzentration unter die Quantif
Urin. Auch Paraxanthin war über den gesam
über der Bestimm
Paraxanthinurinkonzentrationen lagen zwis
ähnlich dem Theophyllin nach d
Theophyllin
im
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
90000
100000
0 10 20 30 40 50 60 70
Stunden nach Applikation
Kon
zent
ratio
n [n
g/m
l]
Pferd 1 Pferd 2 Pferd 3 Pferd 4 Pferd 5 Pferd 6
Abb. 38: Urinkonzentrationsverläufe von Theophyllin nach einmaliger intravenöser Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht
102
ERG
EBN
ISSE
ERGEBNISSE
0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%
100%
0 1 3 6 9 12 15 24 28 32 36 48 54 60Zeit [h]
Theophyllin Paraxanthin Theobromin Coffein
Abb. 39: Prozentuales Verhältnis von Theophyllin und Paraxanthin im Urin nach intravenöser
Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht im Mittel bis zum Erreichen von LOQ (es wurde kein Theobromin und kein Coffein nachgewiesen)
103
ERGEBNISSE
104
gemessen. Die Konzentrationen stiegen bei allen
Pferden innerhalb dieser ersten Stunden stark an, um danach wieder stark abzufallen. Nach
zwanzig Stunden stellte sich der Konzentrationsabfall deutlich langsamer dar. In dem
Zeitraum der Probenentnahmen unterschritten lediglich die Konzentrationen der letzten
beiden Proben von Pferd 1 die Quantifizierungsgrenze von 50 ng Theophyllin pro ml Urin.
Diese Werte befanden sich jedoch noch oberhalb der Nachweisgrenze.
Wie auch nach intravenöser Verabreichung von Theophyllin konnte im Urin der Metabolit
Paraxanthin sicher nachgewiesen und quantifiziert werden. Coffein war auch bei diesen
Proben in Spuren erkennbar, die Konzentrationen erreichten aber nicht die
Quantifizierungsgrenze und überschnitten im Mittel nicht die Detektionsgrenze von 33 ng/ml.
Theobromin konnte nicht nachgewiesen werden.
Maximale Paraxanthinkonzentrationen zwischen 842 ng/ml und 1864 ng/ml konnten in einem
von drei bis elf Stunden nach der Verabreichung gemessen werden. Die
sgrenze von 32 ng/ml wurde im Verlauf des Probenentnahmezeitraums von allen
Pferden unterschritten.
den Tabellen 51 und 52 heophyllin
Theophyllinkonzentrationsverläufe aller Pferde im Urin nochmals graphisch dargestellt.
4.3.3.2. Theophyllin und Metaboliten nach oraler Applikation
Nach oraler Verabreichung von 4mg Theophyllin pro kg Körpergewicht wurden im Urin
maximale Theophyllinkonzentrationen von 16.365 ng/ml bis 41.256 ng/ml innerhalb der
ersten drei bis elf Stunden nach Applikation
Zeitraum
Detektion
Die Einzelwerte der Theophyllin- und Paraxanthinurinkonzentrationen aller Pferde sind in
im Anhang aufgeführt. Das prozentuale Verhältnis von T
und Paraxanthin wird in Abb. 41 veranschaulicht. In Abb. 40 werden die
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
0 20 40 60 80 100 120
Stunden nach Applikation
Kon
zent
ratio
n [n
g/m
l]
Pferd 1 Pferd 2 Pferd 3 Pferd 4 Pferd 5 Pferd 6
Abb. 40: Urinkonzentrationsverläufe von Theophyllin nach einmaliger oraler Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht
105
ERG
EBN
ISSE
ERGEBNISSE
0%10%20%30%
80%
40%50%60%70%
90%100%
0 1.5 6 11 15 30 54 72 108
Zeit [h]
Theophyllin Paraxanthin Theobromin Coffein
bb.41: Prozentuales Verhältnis von Theophyllin und Paraxanthin im Urin nach oraler Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht im Mittel bis zum Erreichen von LOQ (es wurde kein Theobromin und kein Coffein nachgewiesen)
A
106
ERGEBNISSE
4.3.3.3. Theobromin und Metaboliten nach intravenöser Applikation
Abb.43 zeigt den Theobrominkonzentrationsverlauf im Urin nach intravenöser Applikation
mg Theobrom Die maximalen Konzentrationen schwanken
zwischen 65.771 ng/ml und 94.889 ng/ml. Sie werden nach drei bis neun Stunden erreicht.
ach diesem anfänglichen starken Anstieg fallen die Konzentrationen zunächst rasch wieder
ung von
heobromin im Urin dedektiert werden. Das prozentuale Verhältnis der im Urin
2
ie Einzelwerte der Theobrominurinkonzentrationen aller Pferde sind in der Tabelle 53 im
rt. In werden die Theobrominkonzentrationsverläufe aller Pferde im
rin nochmals graphisch dargestellt.
von 4 in pro kg Körpergewicht.
N
ab. Dieser Konzentrationsabfall stellt sich in der Folgezeit langsamer dar. Die
Quantifizierungsgrenze von 100 ng/ml wird bei vier der sechs Pferde bereits während des
Probenentnahmezeitraumes von 168 Stunden unterschritten.
Weder Theophyllin, Coffein noch Paraxanthin konnten nach intravenöser Verabreich
T
dedektierbaren Substanzen nach intravenöser Applikation von Theobromin wird in Abb. 4
gezeigt.
D
Anhang aufgefüh Abb. 43
U
0%
100%
50%60%70%80%90%
10%20%30%40%
1 3 6 9 13 24 28 36 48 72 96 120 144 168
Zeit [h]
Theophyllin Paraxanthin Theobromin Coffein
: nis von Theobromin und Metaboliten im Urin nach intravenöser Applikation von 4 mg Theobromin pro kg Körpergewicht im Mittel bis zum Erreichen von LOQ (es wurde kein Theophyllin, kein Paraxanthin und kein Coffein nachgewiesen)
Abb.42 Prozentuales Verhält
107
0
00
00
00
00
00
00
00
00
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
100000
0 20 40 60 0 0 140 180
St en nach Appli on
Kon
zent
ratio
n [n
g/m
l]
160
Pferd 1 P ferd 2 P ferd 3 P ferd 4 P ferd 5 P ferd 6
8
und1 0
kati120
000
00000000
den
10002000
300040005000600070008000900000001
0 10 5 20
Abb. 43: Urinkonzentr bromin nach einmaliger intravenöser pli o on 4 mg Theobromin gewicht, Aus ni er ße g gt die ersten 28 Stun nac pp ati
108
ERG
EBN
ISSE
25 30
pro kg Körper
5 1
Apon
kati n vh A lik
ationsverläufe von Theorunsch ttsv grö zei
ERGEBNISSE
4.3.4. Pharmakodynamische Effekte von Theophyllin und Theobromin
ikante Herzfrequenzsteigerung beobachtet
erden.
.3.4.2. Atemfrequenz
Keines der Pferde zeigte während der drei Versuchsabschnitte signifikante Veränderungen der
Atemfrequenz.
.4. Berechnung effektiver und irrelevanter Plasma- und Urinkonzentrationen
OUTAIN un harmakodynamik-
odell, anhand dessen aus den ermittelten pharmakokinetischen Parametern effektive und
relevante Plasma- und Urinkonzentrationen berechnet werden können.
Die effektive Plasmakonzentration
4.3.4.1. Herzfrequenz
Direkt im Anschluss an die intravenöse Applikation von Theophyllin und Theobromin zeigten
sich bei einigen Pferden geringgradige Erhöhungen der Herzfrequenz. Nach oraler
Applikation von Theophyllin konnte keine signif
w
4
4
T d LASSOURD (2002) entwickelten ein Pharmakokinetik-/P
M
ir
(EPC) pro Dosierungsintervall wird unter
Be cht er u d v r u c h
folgender Gleichung berechnet:
rücksi igung d Dosier ng (D), er Bio erfügba keit (F) nd der Clearan e (CL) nac
EPC = Cleara
arkeitBioverfügbDosierung ⋅ g/m
die
leichung bei intravenöser Verabreichung wie folgt vereinfacht werden:
nce [µ l]
Da bei intravenöser Applikation die Bioverfügbarkeit gleich 1 zu setzen ist, kann
G
ClearanceDosierung [µg/ml] EPC =
109
ERGEBNISSE
Die irrelevante Plasmakonzentration (IPC) lässt sich aus der EPC unter Annahme eines
icherheitsfaktors (SF) wie folgt berechnen: S
IPC = SF
EPC [µg/ml]
er eingesetzte Sicherheitsfaktor soll individuelle Schwankungen ausgleichen und die
eisten. Er ergibt sich aus dem Faktor 50, der die Umrechnung der
tor 10, welcher die Variationen innerhalb der
icherheitsfaktor (SF) = 500.
ie irrelevante Urinkonzentration
D
Validität der Daten gewährl
EPC in die IPC darstellt und dem Fak
Tierpopulationen berücksichtigen soll. Somit beträt der S
D (IUC) wird nun anhand der IPC und der Rss (Ratio Steady
e folg
ss
State) wi t berechnet:
IUC = IPC · Rss [ng/ml]
Rss (Ratio Steady State) stellt das Urin-/ Plasmakonzentrationsverhältnis im Steady State dar
und errechnet sich wie folgt:
R = rationsmakonzentttlichePladurchschnitionnkonzentrattlicheUridurchschni
Die durchschnittliche Urinkonzentration errechnet sich durch Addition der
Urinkonzentrationen, die in dem Zeitraum angenommenen Dosierungsintervalls liegen
und anschließender Division durch die Anzahl der addierten Konzentrationen.
Die hnitt e ko ra D ch ch r ziehu er
maximalen Plasmakonzentration (Cma ), der Eliminationskonstanten (β) und des
Dosierungsintervalls (τ) nach KIETZMANN (1983) wie folgt:
des
durchsc lich Plasma nzent tion (C ) erre net si unte Einbe ng d
x
CD = τβ ⋅
mC [ng/ml] ax
110
ERGEBNISSE
4.4.1. Berechnung effektiver und irrelevanter Plasma- und Urinkonzentrationen
von Theophyllin
mik-Modells von TOUTAIN und
ASSOURD (2002). Dabei fanden die in Kapitel 4.4. beschriebenen Formeln Anwendung.
ie Ergebnisse sind in Tab. 36 und 37 aufgeführt.
Para- Einheit Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Mittel- Standard-
Die Berechnung der irrelevanten Plasma- und Urinkonzentrationen von Theophyllin erfolgte
mit Hilfe des Pharmakokinetik-/Pharmakodyna
L
D
meter w abwei g1 2 3 4 5 6 ert chun
EPC (12 h g/ml] 7303 6723.1 4087.9 4447.4 7418.9 6171.6 ) [n 6025.3 1437.1
IPC (12 h) [ng/ml] 14.6 13.4 8.2 8.9 14.8 12.3 12.0 2.9
IUC (12 h) [ng/ml] 15.9 39.9 16.3 19.9 10.6 15.3 19.6 10.4
Tab.36: Irrelevante Plasma- und Urinkonzentrationen von Theophyllin nach TOUTAIN und LASSOURD (2002) in einem Dosisintervall von 12 Stunden
Para- Einheit Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Mittel- Standard-
meter 1 2 3 4 5 6 wert abweichung
EPC (24 h) [ng/ml] 3651.7 3361.5 2043.9 2223.7 3709.4 3085.8 3012.7 718.6
IPC (24 h) [ng/ml] 7.3 6.7 4.1 4.5 7.4 6.2 6.0 1.4
IUC (24 h) [ng/ml] 14.6 35.7 13.4 18.9 105.1 13.7 33.6 36.1
Tab.37: Irrelevante Plasma- und Urinkonzentrationen von Theophyllin nach TOUTAIN und LASSOURD (2002) in einem Dosisintervall von 24 Stunden
111
ERGEBNISSE
4.4.2. Berechnung effektiver und irrelevanter Plasma- und Urinkonzentrationen
von Theobromin
Par Einheit Pferd Pferd Pferd Pf Pferd Pferd Mittel Standard-
Die Berechnung der irrelevanten Plasma- und Urinkonzentrationen von Theobromin erfolgte
mit Hilfe des Pharmakokinetik-/Pharmakodynamik-Modells von TOUTAIN und
LASSOURD (2002). Dabei fanden die in Kapitel 4.4. beschriebenen Formeln Anwendung.
Die Ergebnisse sind in Tab. 38 und 39 aufgeführt.
a- erd -
meter 1 2 3 4 5 6 wert abweichung
EPC (1 [ng/ml 2222 8568 274 1010 6942 5283 h) ] .7 .4 7 .0 4.8 .5 7 .6 7106 653.9 2 .7
IPC [ng/m 4. 1 1 2 1 1 (13 h) l] 4 7.1 4.5 0.2 3.9 5.1 1 54.2 .3
IU g/m 29 3 4 6 1 4C (13 h) [n l] .9 3.7 4.3 5.0 6.8 9.5 3 169.9 .8
ab.38: Irrelevante Plasma- und Urinkonzentrationen von Theobromin nach TOUTAIN
Para- Einheit Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Mittel- Standard-
T und LASSOURD (2002) in einem Dosisintervall von 13 Stunden
meter 1 2 3 4 5 6 wert abweichung
EPC (24 h) [ng/ml] 1204.0 4641.2 3940.1 5473.5 3760.5 4078.0 3849.5 1437.4
IPC (24 h) [ng/ml] 2.4 9.3 7.9 10.9 7.5 8.2 7.7 2.9
IUC (24 h) [ng/ml] 27.3 30.0 41.1 57.0 15.9 44.1 35.9 14.5
Tab.39: Irrelevante Plasma- und Urinkonzentrationen von Theobromin nach TOUTAIN und LASSOURD (2002) in einem Dosisintervall von 24 Stunden
112
ERGEBNISSE
4.5. Ausscheidungszeiten
ie Ausscheidungszeiten aus dem Plasma wurden anhand der folgenden Funktion berechnet
D
(KIETZMANN, 1983):
tA = β
GrenzeCC lnln max − [h]
tA = Ausscheidungszeit Cmax = maximale Konzentration im Plasma CGrenze = Konzentrationsgrenze (IPC, LOQ oder LOD) β = Eliminationskonstante 4.5.1. Ausscheidungszeiten von Theophyllin nach intravenöser Applikation
Die Berechnung der Ausscheidungszeiten von
Theophyllin aus dem Plasma wurden bis zum
rreichen der Nachweisgrenze (LOD), und der Quantifizierungsgrenze (LOQ) sowie bis zum
rreichen der irrelevanten Plasmakonzentration (IPC) unter Berücksichtigung der
osierungsintervalle von 12 und 24 Stunden durchgeführt. Grundlage der Berechnungen sind
aufgefü
E
E
D
die in Tabelle 32 aufgeführten Daten. In der folgenden Tab. 40 sind die Ergebnisse
hrt.
Para- Einheit Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Mittel- Standard-
meter 1 2 3 4 5 6 wert abweichung
tA LOQ [h] 112.0 70.0 72.7 78.1 119.3 77.3 88.2 21.6
tA LOD [h] 163.0 104.0 101.8 118.9 170.3 111.3 128.2 30.4
tA IPC (12h) [h] 160.1 103.5 108.4 126.5 167.0 112.2 129.6 27.5
tA IPC (24h) [h] 177.4 115.1 118.3 140.1 184.4 123.7 143.2 30.6
Tab.40: Ausscheidungszeiten von Theophyllin aus dem Plasma nach intravenöser Applikation von 4 mg/kg Körpergewicht bis zum Erreichen von LOQ, LOD bzw. der IPC (nach einem Dosierungsintervall von 12 bzw. 24 Stunden)
113
ERGEBNISSE
4.5.2. Ausscheidungszeiten von Theophyllin nach oraler Applikation
Die Berechnungen der Ausscheidungszeiten von Theophyllin nach oraler Applikation wurden
nach der oben angegebenen Formel bis zum Erreichen der Nachweis- und der
Quantifizierungsgrenze durchgeführt, und sind in Tab. 41 aufgeführt. Die benötigten
pharmakologischen Daten sind Tab. 35 entnommen.
Para- Einheit Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Mittel- Standard-
meter 1 2 3 4 5 6 wert abweichung
tA LOQ [h] 81.3 71.1 83.6 72.5 114.6 96.2 86.5 16.4
tA LOD [h] 132.3 111.9 134.6 113.3 182.6 164.2 139.8 28.3
Tab.41: Ausscheidungszeiten von Theophyllin aus dem Plasma nach oraler Applikation von 4 mg/kg Körpergewicht bis zum Erreichen von LOQ und der LOD
114
ERGEBNISSE
4.5.3. Ausscheidungszeiten von Theobromin nach intravenöser Applikation
Die Berechnung der Ausscheidungszeiten von Theobromin aus dem Plasma wurden wie beim
Theophyllin bis zum Erreichen der Nachweisgrenze (LOD) und der Quantifizierungsgrenze
(LOQ), sowie bis zum Erreichen der irrelevanten Plasmakonzentration (IPC) unter
Berücksichtigung der Dosierungsintervalle von 13 und 24 Stunden durchgeführt. Anhand der
in Tabelle 35 aufgeführten pharmakokinetischen Parameter konnten diese Werte berechnet
werden. In der folgenden Tab. 42 sind die Ergebnisse aufgeführt.
Para- Einheit Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Mittel- Standard-
meter 1 2 3 4 5 6 wert abweichung
tA LOQ [h] 26.6 210.1 198.1 201.6 131.1 138.6 151.0 69.7
tA LOD [h] 36.1 305.0 292.9 296.4 178.5 201.9 218.5 104.1
tA IPC (13h) [h] 42.2 298.3 294.5 281.5 180.4 201.8 216.5 98.9
tA IPC (24h) [h] 45.3 329.0 325.1 312.2 195.8 222.2 238.3 110.1
Tab.42: Ausscheidungszeiten von Theobromin aus dem Plasma nach intravenöser Applikation von 4 mg/kg Körpergewicht bis zum Erreichen von LOQ, LOD bzw. der IPC (nach einem Dosierungsintervall von 13 bzw. 24 Stunden)
115
DISKUSSION
5 DISKUSSION
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, mittels pharmakologischer Studien an jeweils sechs
Pferden und anschließender quantitativer Untersuchungen der Plasma- und Urinproben
Aussagen über das Ausscheidungsverhalten der Methylxanthine Theophyllin und Theobromin
nach intravenöser und oraler Applikation machen zu können. Anhand der ermittelten Daten
sollte geprüft werden, ob konkrete Aussagen über Nachweisfristen und Ausscheidungszeiten
von Theophyllin und Theobromin im Plasma und im Urin von Pferden gemacht werden
können, und wie sich dies hinsichtlich der Dopingrelevanz beim Pferd auswirkt.
Dazu wurden nach Optimierung und Validierung der Analysemethode die Plasma- und
Urinproben quantitativ analysiert und die Ergebnisse anschließend pharmakokinetischen
Berechnungen unterzogen. Durch Einbringen der berechneten Daten in das PK/PD-Modell
von TOUTAIN und LASSOURD (2002) konnten die effektiven Plasmakonzentrationen
(EPC), die irrelevanten Plasmakonzentrationen (IPC) und daraus schließlich die irrelevanten
Urinkonzentrationen (IUC) berechnet werden.
5.1. Eignung der Aufarbeitungs- und Analysemethode (HPLC/MS/MS) zur
Quantifizierung von Theophyllin und Theobromin im Plasma und Urin
Die Grundlage der in dieser Arbeit angewendeten Analysemethode für Theophyllin und
Theobromin im Pferdeplasma und -urin bildete eine Routinemethode, die im Institut für
Biochemie der Deutschen Sporthochschule Köln im Rahmen der Dopinganalytik polarer
Substanzen angewendet wird.
Die im Vorversuch entnommenen Plasma- und Urinproben wurden mittels dieser Methode
untersucht. Dabei zeigte sich, das diese Methode weiter modifiziert werden musste, um die
gewünschte Empfindlichkeit zu erreichen.
ls interne Standards wurden ein am Stickstoffatom markiertes Theophyllin (1,3-15N2-A
Theophyllin) sowie deuteriertes Theobromin (D6-Theobromin) und Coffein (D3-Coffein)
gewählt.
116
DISKUSSION
Als am besten geeignetes Lösungsmittel für die Standardlösungen erwies sich Milli-Q-
Wasser. Bei der Herstellung der internen Standardlösungen musste die D6-Theobromin-
m ca. 10% steigern. Diese Ergebnisse stimmen weitestgehend mit den Angaben von KELLY
ichtigkeit, Präzision, Ermittlung der
uantifizierungsgrenze (LOQ) und der Detektionsgrenze (LOD) sowie Wiederfindung und
Konzentration aufgrund der nur halb so großen Signalintensität von D6-Theobromin im
Gegensatz zu den restlichen internen Standards verdoppelt werden, um eine gut zu
integrierende Peakfläche zu erhalten. Beim sogenannten Tuning des HPLC- Gerätes zeigte
sich, dass der Ionenübergang 181.0/ 124.0 bei Theophyllin und Paraxanthin identisch ist und
somit diese Stoffe über die Differenzmethode anhand des nur bei Paraxanthin
nachgewiesenen Ionenüberganges 181.0/ 55.0 quantifiziert werden mussten.
Als geeignete Säule für die Plasma- und Urinaufarbeitung erwies sich die Oasis® HBL 3cc
(60mg) Extraction Cartridges der Firma Waters. Das im Konzentrationsbereich bis 10000
ng/ml verwendete Volumen von 2,5 ml Urin bzw. Plasma führte zu einer guten Ausbildung
und Integration des Messsignals. Um einer Sättigung der analytischen Säule und des
Detektors vorzubeugen, wurde das Probenvolumen bei Konzentrationen über 10000 ng/ml auf
1 ml reduziert. Um die bei der Urinaufarbeitung zunächst beobachteten und durch
Matrixbestandteile verursachten Störpeaks zu verhindern, wurden die Urinproben vor
Aufbringen auf die Säule zentrifugiert. Die in die Plasmaaufarbeitung eingefügte
Proteindenaturierung führte bei Theophyllin und Theobromin zu einer nahezu doppelt so
hohen Substanzausbeute. Bei Coffein ließ sich die Ausbeute durch die Proteolyse lediglich
u
und LAMBERT (1978), GREEN et al. (1983), INGVAST-LARSSON et al. (1992) und
CHOU et al. (2001) überein, die für Theophyllin eine Proteinbindung von rund 20% bei
Pferden angeben. INGVAST-LARSSON et al. ermittelten allerdings 1989 in einer anderen
Studie eine Plasmaproteinbindung von lediglich 12% für oral verabreichtes Theophyllin. Für
Coffein wird eine Proteinbindung von 2 bzw. 12% angeben. Die von KELLY und
LAMBERT (1978) für Theobromin veröffentliche Proteinbindung von lediglich 3% im
Pferdeplasma deckt sich mit den anhand dieser Studie ermitteln Daten nicht.
Sowohl die Methode zur Aufarbeitung von Plasma als auch die Methode zur Aufarbeitung
von Urin wurden einer Validierung nach den Vorgaben der EHSLC (2002) unterzogen, um
die Eignung der in dieser Studie entwickelten Analysemethode zu beweisen. Die Validierung
umfasste die Parameter Selektivität, Linearität, R
Q
Stabilität.
117
DISKUSSION
Die zur Überprüfung der Selektivität untersuchten Chromatogramme zeigten, dass im Bereich
der Retentionszeiten der Analyten sowie der internen Standards keine Störpeaks erschienen.
Die Substanzen konnten somit ohne Verfälschung von fremden Matrixstoffen dargestellt
werden. Die Kriterien für die Linearität, Richtigkeit und Präzision wurden im Plasma bei
Theophyllin, Theobromin und Coffein anhand von drei Kalibrationskurven über den Bereich
ischen 29 ng/ml und 1.000 ng/ml im Plasma und 32 ng/ml
und 30.000 ng/ml belegt worden.
war im Rahmen der Validierungskriterien ebenfalls sowohl im
rin als auch im Plasma gegeben.
von 20 ng/ml bis 50.000 ng/ml untersucht und erfüllt. Für Paraxanthin war dies nur im
Bereich von 20 ng/ml bis 1.000 ng/ml nötig und konnte ebenfalls bestätigt werden. Im Urin
konnte die geforderte Linearität, Richtigkeit und Präzision bei Theophyllin über drei
Kalibrationskurven im Bereich von 25 ng/ml bis 30.000 ng/ml belegt werden und bei
Paraxanthin und Coffein im relevanten Konzentrationsbereich von 25 ng/ml bis 1.000 ng/ml
ebenfalls. Bei Theobromin wurden über Anwendung eines quadratischen Regressionsmodells
die Kriterien erfüllt.
Die Ergebnisse belegen somit, dass die Methoden geeignet sind, Theophyllin im
Konzentrationsbereich von 13 ng/ml bis 50.000 ng/ml im Plasma und von 20 ng/ml bis
30.000 ng/ml im Urin nachzuweisen. Dies gilt für Theobromin im Plasma von 15 ng/ml bis
50.000 ng/ml und im Urin von 26 ng/ml bis ebenfalls 30.000 ng/ml. Für die Metaboliten
Paraxanthin ist dies im Bereich zw
und 30.000 ng/ml im Urin und bei Coffein im Bereich von 14 ng/ml bis 50.000 ng/ml und im
Urin zwischen 33 ng/ml
Die im Plasma für Theophyllin und ihre Metaboliten ermittelten Quantifizierungsgrenzen
liegen mit 100 ng/ml höher als die im Urin für diese Substanzen berechneten
Bestimmungsgrenzen von 50 ng/ml. Für Theobromin gilt die Quantifizierungsgrenze von 100
ng/ml sowohl im Plasma als auch im Urin. Die Ursache hierfür liegt neben den
Matrixunterschieden in den Validierungskriterien der Leitlinien der EHSLC (2002)
begründet, nach denen die Validierungskriterien bei jeder Substanz einzeln erfüllt sein
müssen.
Die Stabilität der Analyten
U
5.2. Ausscheidungsverhalten von Theophyllin und Theobromin
Die im Plasma ermittelten Maximalkonzentrationen von Theophyllin nach intravenöser
Applikation von 4 mg/kg Körpergewicht lagen mit 5.165 - 8.834 ng/ml (Mittelwert ±
118
DISKUSSION
Standardabweichung = 7.167 ng/ml ± 1.348 ng/ml) deutlich höher als die nach oraler
Applikation gleicher Menge. Diese Maximalkonzentrationen lagen zwischen 1.791-3.483
ng/ml (Mittelwert ± Standardabweichung = 2.805 ng/ml ± 648 ng/ml). Nach intravenöser
Verabreichung von 4 mg/kg Körpergewicht Theobromin konnten maximale
Plasmakonzentrationen von 5.715 ng/ml – 12.402 ng/ml (Mittelwert ± Standardabweichung =
8.379 ng/ml ± 2.717 ng/ml) ermittelt werden. Die Maximalwerte wiesen in den drei
Versuchsreihen große Schwankungen zwischen den einzelnen Probanden auf. Zu ähnlichen
Ergebnissen kamen LÖFFLER et al. (2000a), welche nach intravenöser Gabe von 5 mg/kg
Theophyllin an Hunde durchschnittliche Konzentrationen von 8.882 ng/ml und nach oraler
Verabreichung von 10 mg/kg gemittelte Konzentrationen von 7.657 ng/ml im Plasma
nachwiesen. MC KIERNAN et al. (1981) ermittelten im Anschluss an intravenöse
Applikation von 9,4 mg/kg Körpergewicht Theophyllin an Hunde etwas geringere
aximalkonzentrationen von 13.800 ng/ml und nach oraler Verabreichung der gleichen
n konnte bei zwei Pferden bereits nach 60 Stunden kein
M
Dosierung von 3.600 ng/ml im Plasma. Im Gegensatz dazu lagen bei der Studie von TSE und
SZETO (1982) die Plasmakonzentrationen nach intravenöser und oraler Verabreichung im
Verhältnis zur verabreichten Dosierung im gleichen Konzentrationsbereich. Nach
intravenöser Applikation von Theobromin an Hunde in einer Dosierung von 5 mg/kg
Körpergewicht ermittelte LOEFFLER (2000) deutlich höhere
Theobrominplasmakonzentrationen von etwa 42 µg/ml ± 11 µg/ml.
Nach intravenöser Applikation von Theophyllin konnten bei allen Pferden die maximalen
Plasmakonzentrationen innerhalb der ersten 5 Minuten gemessen werden. Die Zeit bis zum
Erreichen der maximalen Konzentration im Plasma nach oraler Applikation betrug im Mittel
5,18 Stunden ± 56%. Bei LOEFFLER et al. (2000a) wurde die maximale
Plasmakonzentration nach oraler Gabe im Mittel nach 4,8 Stunden erreicht. Alle Pferde
wiesen bei der letzten Blutprobenentnahme 60 Stunden nach der intravenösen Verabreichung
noch Plasmakonzentrationen oberhalb der Quantifizierungsgrenze (LOQ) von 100 ng/ml auf.
Im Anschluss an die orale Applikatio
Theophyllin mehr im Plasma quantifiziert werden. Bei den anderen vier Pferden war dies
nach 72 bzw. 96 Stunden der Fall.
Die in dieser Studie ermittelte orale Bioverfügbarkeit für Theophyllin von 85% deckt sich
weitestgehend mit den Angaben in der Literatur. LOEFFLER et al. (2000b) ermittelten für
Theophyllin bei Hunden eine orale Bioverfügbarkeit von 73%, LÖSCHER (2006) gibt diese
119
DISKUSSION
mit 80-90% an, TSE und SZETO (1981) mit > 90% und MC KIERNAN et al. (1981) mit
91%.
Die Resorptionsrate und Resorptionsgeschwindigkeit nach oraler Applikation hängen neben
der oralen Bioverfügbarkeit vor allem von der Konkurrenzsituation im Gastrointestinaltrakt
ab. Gleichzeitige Nahrungsaufnahme wirkt sich auf die Resorptionsgeschwindigkeit meist
hemmend aus. Auch das Flüssigkeitsvolumen, mit dem ein Stoff peroral zugeführt wird, die
Wasserlöslichkeit, welche Voraussetzung für den Transport mit dem Magen-Darm-Inhalt ist
und die Partikelgröße wirken sich auf die Resorption aus. Lipophile Pharmaka werden nach
fettreicher Nahrung schlechter resorbiert, da sie sich im Fett anreichern. Stark lipophile und
somit wenig wasserlösliche Stoffe wiederum können durch fettreiche Nahrung besser
resorbiert werden, da der Stoff durch die Verteilung im Fett und dessen Emulgierung durch
rt werden. Über das
die Galle eine größere Oberfläche erhält (FORTH et al., 1996). Des weiteren kann eine
reduzierte orale Bioverfügbarkeit durch einen ausgeprägten first-pass-Effekt bedingt sein.
Bereits bei der Mukosapassage kann ein Stoff enzymatisch verände
Pfortadersystem gelangt ein aus dem Gastrointestinaltrakt resorbierter Stoff zunächst in die
Leber. Dort kann dieser bereits vor Gelangen in den großen Kreislauf metabolisiert und
ausgeschieden werden (FORTH et al., 1996). Genauere Angaben über das Vorhandensein
eines first-pass-Effektes bei Theophyllin konnten anhand der Literatur nicht ermittelt werden.
Auffällig war, dass es bei allen Pferden nach intravenöser Applikation von Theophyllin und
Theobromin während des Konzentrationsabfalls im Plasma immer wieder zu geringgradigen
Anstiegen der Konzentration kam. Dies lässt einen enterohepatischen Kreislauf, also die
erneute Resorption eines über die Gallenflüssigkeit in den Darm gelangten Stoffes, vermuten.
Dieser wurde aber lediglich für Coffein beschrieben (ARNOUD, 1993). Laut FORTH et al.
(1996) werden Stoffe mit einer Molekülmasse unter 300 allerdings bevorzugt mit dem Harn
ausgeschieden. Eine andere Erklärung wäre ein „Recyclingprozess“ von Theophyllin und
Theobromin. Wird bereits über den Urin oder den Kot ausgeschiedenes Theophyllin als
Futtermittelverunreinigung wieder aufgenommen, wird es recycelt. Da die Pferde dieser
Studie neben dem uneingeschränkten Zugang zu Heu, Stroh und Gras auch unkontrolliert
Harn und Kot absetzen konnten, erscheint ein Recyclingprozess als Erklärung der
wiederholten Plasmakonzentrationsanstiege plausibel.
Sowohl nach intravenöser als auch nach oraler Verabreichung von Theophyllin war nach
kurzer Zeit der Metabolit Paraxanthin im Plasma nachweisbar. Die maximalen
120
DISKUSSION
Konzentrationen nach intravenöser Applikation lagen im Mittel bei 580 ng/ml (± 39%) und
wurden nach zwei Minuten bis zwei Stunden erreicht. Nach oraler Gabe wurden die höchsten
Plasmakonzentrationen von gemittelt 230 ng/ml (± 31%) in der Zeit von 40 Minuten bis 12
Stunden erreicht. LOEFFLER (2000) konnte weder nach intravenöser noch nach oraler
erabreichung von Theophyllin an Hunde Paraxanthin im Plasma nachweisen.
von Theophyllin konnten TANG-LIU und RIEGELMAN (1981) aber auch lediglich
al. (2000a) wiesen nach
travenöser Theobrominapplikation und KAISER (2006) nach oraler
Parameter, die für intravenös appliziertes Theophyllin und
Theobromin anhand eines Zwei-Kompartiment-Modells und für oral verabreichtes
Theophyllin anhand eines Ein-Kompartiment-Modells berechnet wurden, entsprechen
weitestgehend den Angaben in der Literatur. Die ermittelte Eliminationshalbwertzeit nach
intravenöser Applikation von Theophyllin beträgt im Mittel 13,6 Stunden (± 21%) und nach
oraler Applikation 18,1 Stunden (± 23%). Dies entspricht in etwa den Angaben von
V
Coffein konnte in der vorliegenden Studie nach beiden Applikationsarten von Theophyllin
lediglich in Spuren nachgewiesen werden. Die Konzentrationen lagen nach intravenöser Gabe
bis auf wenige Ausnahmen unter der Quantifizierungsgrenze von 100 ng/ml und nach oraler
Applikation im Bereich der Nachweisgrenze von 14 ng/ml im Plasma. Dies deckt sich mit den
Angaben in der Literatur. TANG-LIU und RIEGELMAN (1981) wiesen in ihrer Studie einen
Metabolismus von Theophyllin zu Coffein beim Menschen nach. Nach ihren Untersuchungen
werden rund 6% des mehrfach oral verabreichten Theophyllins zu Coffein metabolisiert,
bevor dieses vor der renalen Ausscheidung weiter verstoffwechselt wird. Nach einmaliger
Gabe
Spuren von Coffein nachweisen. Laut LOEFFLER (2000) ist nach Theophyllinapplikation bei
Hunden im Plasma Coffein nicht nachweisbar. MC KIERNAN et al. (1981) untersuchten in
ihrer Studie die Metaboliten nicht.
Theobromin konnte weder nach intravenöser noch nach oraler Applikation von Theophyllin
nachgewiesen werden.
Nach intravenöser Verabreichung von Theobromin waren im Plasma lediglich sehr geringe
Spuren von Coffein und Theophyllin erkennbar, die im Bereich der Nachweisgrenzen von 14
ng/ml für Coffein und 13ng/ml für Theophyllin lagen. Paraxanthin konnte nach intravenöser
Theobrominapplikation nicht nachgewiesen werden. LOEFFLER et
in
Theobrominverabreichung ebenfalls lediglich Theobromin im Plasma nach. Demzufolge
scheint keine quantifizierbare Metabolisierung des Theobromins zu Paraxanthin, Theophyllin
oder Coffein stattzufinden.
Die pharmakokinetischen
121
DISKUSSION
LÖSCHER (2006), der diese als tierartlich sehr unterschiedlich und für Pferde mit 10-17
Stunden angibt. LOEFFLER et al. (2000b) ermittelten in ihrer Studie eine
Eliminationshalbwertzeit von 5 Stunden nach intravenöser und von 3 Stunden nach oraler
Verabreichung. Diese Werte sind mit den hier ermittelten schlecht vergleichbar, da es sich bei
den Probanden bei LOEFFLER et al. (2000b) um Hunde und in dieser Studie um Pferde
handelt. Die Clearance nach intravenöser Applikation von Theophyllin beträgt im Mittel 58,4
ml/h/kg (± 27%), nach oraler Verabreichung 70,5 ml/h/kg (± 31%) und nach intravenöser
Applikation von Theobromin 55,4 ml/h/kg (± 74%). KAISER (2006) ermittelte für oral
verabreichtes Theobromin bei Pferden eine durchschnittliche Clearance von 67,2 ml/h/kg (±
29%). Das in dieser Studie ermittelte Verteilungsvolumen von Theophyllin beträgt 1,1 l/kg.
MC KIERNAN et al. (1981) geben dies mit 0,67 l/kg an, GREENBLATT und SHADER
(1985) mit 0,4 l/kg.
ie Theophyllinkonzentration im Plasma beträgt nach intravenöser Applikation in dieser
er
or ng/ml (± 146%) und
ach 108 Stunden noch 27.6 ng/ml (± 86%) im Plasma nachweisbar. Leitet man aus den
lasma die LOQ
nterschritten wird. Diese gemessenen Werte liegen bei Theophyllin nur undeutlich unter der
nach KIETZMANN (1983) für Theophyllin berechneten Ausscheidungszeiten bis zur LOQ
ikation. Die für
Theobromin n unden nur
eringgradig unter den gemessenen.
Urin konnten nach intravenöser Applikation Maximalkonzentrationen von 21.636 ng/ml
is 93.373 ng/ml und nach oraler Verabreichung Maximalkonzentrationen von 18.287 ng/ml
bis 41.256 ng/ml nachgewiesen werden. Theobromin ließ sich im Urin in
Maximalkonzentrationen von 65.771 ng/ml bis 94.889 ng/ml nachweisen. Diese im
Verhältnis zu den Plasmakonzentrationen sehr viel höheren Urinkonzentrationen belegen die
Anreichung des Theophyllins im Urin. Bei dem physiologischen Plasma-pH-Wert von 7,36
bis 7,44 liegt Theophyllin zu 96% und Theobromin zu 99,7% in der ionisierten Form vor.
D
Studie bei d letzten Blutprobenentnahme nach 60 Stunden im Mittel noch 373,5 ng/ml (±
aler Applikation sind nach 96 Stunden im Mittel noch 8565%). Nach
n
Verlaufskurven der Plasmakonzentrationen die Zeit ab, bei der die Quantifizierungsgrenze
von 100 ng/ml unterschritten wird, ergibt sich, dass nach intravenöser Theophyllingabe im
Mittel nach 71,5 ± 19 Stunden und nach oraler Verabreichung im Mittel nach 79,8 ± 20
Stunden im Plasma die LOQ unterschritten wird. Für Theobromin nach intravenöser Gabe
lässt sich ableiten, dass nach durchschnittlich 156 ± 18 Stunden im P
u
von 88 ± 22 Stunden nach intravenöser und 86 ± 17 Stunden nach oraler Appl
Stach KIETZMANN (1983) berechneten Werte liegen mit 151 ± 70
g
Im
b
122
DISKUSSION
Diese wird stark glomerulär filtriert. Im alkalischen Milieu des Pferdeurins mit einem pH-
Wert von 7,6-9,0 (SAMS, 1992; KRAFT und DÜRR, 1991) bzw. von 6,8-8,4 laut SCHÄFER
(1999) sinkt die Ionisationsrate auf bis zu 85% bei Theophyllin und auf 99,0% beim
Theobromin. Lediglich die 15% bzw. die 1% des glomerulär filtrierten Theophyllins bzw.
Theobromins, welche jetzt in nicht-ionisierter Form vorliegen, können tubulär rückresorbiert
werden. LOEFFLER (2000) ermittelte nach intravenöser und oraler Verabreichung von
Theophyllin an Hunde im Verhältnis zu dieser Studie doppelt so hohe Urinkonzentrationen
und eine erheblich geringere Zeitspanne, in welcher Theophyllin in Urin nachweisbar ist. Dies
lässt sich auch durch den sauren Urin des Hundes erklären. Im pH-Wert-Bereich zwischen
5,5-7,0 liegt Theophyllin zu 99% in der ionisierten Form vor, so dass eine tubuläre
Rückresorption nahezu ausgeschlossen werden kann.
Die starken interindividuellen Schwankungen der Urinkonzentrationen von ± 67% nach
intravenöser T
rheblichen E ussrate. Eine
rhöhte Urinflussrate führt zu einer geringeren tubulären Rückresorption und einer
esteigerten Clearance (GRAMATTE, 2002). Die renale Clearance unterliegt außerdem
edliche Flüssigkeitsaufnahme begründet sein. Da es sich bei diesem Versuch um
intravenöser und ± 34% nach oraler Theophyllinverabreichung und von ± 16% nach
heobromingabe resultieren aus verschiedenen Ursachen.
E influss auf die Konzentration eines Stoffes im Urin hat die Urinfl
e
g
Beeinflussungen durch Veränderungen des Urin-pH, welcher wiederum durch Faktoren wie
Ernährung und körperliche Belastung verändert werden kann. Laut TOBIN (1986) kann der
Urin-pH aufgrund von körperlicher Anstrengung auf Werte von unter 5 sinken. Auch
aufgrund von Hungerzuständen kann der Urin-pH absinken (SCHÄFER, 1999).
Vergleichende Untersuchungen des Urin-pH-Wertes in Abhängigkeit von der Fütterung von
WOOD et al. (1990) zeigten, dass dieser bei Weidepferden durchschnittlich um 0,5 höher
liegt als bei Stallpferden. Da Theophyllin und Theobromin nur im geringen Maße tubulär
rückresorbiert werden, führt eine gesteigerte Urinflussrate zu einer verminderten
Urinkonzentration dieser Stoffe (SAMS, 1992; DELBEKE und DEBACKERE, 1991). Eine
unterschiedlich ausgeprägte Harnproduktion kann außerdem durch Stress oder
unterschi
eine „dirty“-Studie handelt, können weder unterschiedliche körperliche Belastung,
individueller Stress noch unterschiedliche Flüssigkeitsaufnahme der Pferde ausgeschlossen
werden, und werden somit zum Teil eine Ursache der interindividuellen Schwankungen der
Ergebnisse sein. Laut DYKE und SAMS (1994) hätte der gesamte Urin der Probanden über
die Versuchsdauer gesammelt werden müssen, um über die Harnproduktion eine genauere
Aussage über die Substanzmenge im Urin und somit genaue Angaben zur Ausscheidungsrate
123
DISKUSSION
der Substanzen machen zu können. Auch Nierenerkrankungen der Probanden könnten die
Nierenfunktionen und somit die Harnproduktion beeinträchtigen. Da die Kreatininwerte der
Pferde untersucht wurden und sich im Normbereich befanden, erscheint diese Ursache
allerdings sehr unwahrscheinlich.
Sowohl nach der intravenösen als auch nach der oralen Verabreichung von Theophyllin war
der Metabolit Paraxanthin im Urin nachweisbar. Die maximalen Konzentrationen nach
intravenöser Applikation lagen im Mittel bei 1.375 ng/ml (±60%) und wurden nach drei bis
zwölf Stunden erreicht. Nach oraler Gabe wurden die höchsten Urinkonzentrationen von
gemittelt 1.388 ng/ml (±27%) in der Zeit von drei bis elf Stunden erreicht. Coffein war in
Spuren erkennbar, die Werte überschritten aber nicht die Bestimmungsgrenze von 50 ng pro
ml Urin, und Theobromin wurde nicht nachgewiesen. LOEFFLER (2000) wies weder nach
travenöser noch nach oraler Verabreichung von Theophyllin an Hunde Paraxanthin im Urin
unter identischen Bedingungen das Ausscheidungsverhalten von
in
nach.
Nach intravenöser Applikation von Theobromin konnten weder Theophyllin, Coffein noch
Paraxanthin sondern ausschließlich Theobromin im Urin detektiert werden. KAISER (2006)
wies ebenfalls nur Theobromin nach oraler Applikation von Theobromin an Pferde im Urin
nach. Vergleicht man nach Verabreichung verschiedener Methylxanthine die prozentualen
Verhältnisse der im Urin nachweisbaren Substanzen, so lässt sich am Metabolitenmuster
eindeutig auf die verabreichte Muttersubstanz schließen. Da sich die Metaboliten der
einzelnen Stoffe im Urin nach intravenöser und oraler Verabreichung nur unwesentlich
unterscheiden, sind in den folgenden Abbildungen zur Veranschaulichung lediglich die
prozentualen Verhältnisse nach intravenöser Applikation dargestellt.
KAISER (2006) untersuchte
Coffein nach intravenöser und oraler sowie von Theobromin nach oraler Verabreichung. Sie
ermittelte das in Abb. 44 dargestellte Metabolitenmuster, welches deutlich zeigt, dass nach
Coffeinapplikation neben dem Coffein auch Paraxanthin, Theophyllin und Theobromin im
Urin nachzuweisen sind.
124
DISKUSSION
0%
20%
90%
100%
40%
50%
60%
70%
80%
30%
10%
0 1 3 6 9 13 24 28 36 48 72 96
Zeit [h]
Theophyllin Paraxanthin Theobromin Coffein
sen werden.
Abb. 44: Prozentuales Verhältnis von Coffein, Theobromin, Theophyllin und Paraxanthin im Urin nach intravenöser Applikation von 4 mg Coffein pro kg Körpergewicht im Mittel bis zum Erreichen der LOQ dargestellt (nach KAISER, 2006)
In Abbildung 45 ist das prozentuale Metabolitenmuster im Urin nach Applikation von
Theophyllin dargestellt. Es können neben dem hauptsächlich detektierten Theophyllin
lediglich bis zu 5% Paraxanthin und weder Coffein noch Theobromin nachgewie
Abbildung 46 zeigt das prozentuale Metabolitenmuster im Urin nach Applikation von
Theobromin. Hier wird ausschließlich Theobromin im Urin nachgewiesen.
125
DISKUSSION
100%
20%
30%
60%
90%
70%
80%
40%
50%
0%
10%
0 1 3 6 9 12 15 24 28 32 36 48 54 60
Zeit [h]
Theophyllin Paraxanthin Theobromin Coffein
Abb. 45: Prozentuales Verhältnis von Coffein, Theobromin, Theophyllin und Paraxanthin im Urin nach intravenöser Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht im Mittel bis zum Erreichen der LOQ dargestellt
70%80%90%
100%
60%
0%10%20%30%40%50%
1 3 6 9 13 24 28 36 48 72 96 120 144 168Zeit [h]
Theophyllin Paraxanthin Theobromin Coffein
Abb. 45: Prozentuales Verhältnis von Coffein, Theobromin, Theophyllin und Paraxanthin im Urin nach intravenöser Applikation von 4 mg Theobromin pro kg Körpergewicht im Mittel bis zum Erreichen der LOQ dargestellt
126
DISKUSSION
Die nach dem Pharmakokinetik-/Pharmakodynamik-Modell von TOUTAIN und LASSOURD
(2002) berechneten irrelevanten Plasmakonzentrationen von Theophyllin in einem
Dosisintervall von 12 Stunden betrugen 12 ng/ml (± 24%) und in einem Dosisintervall von 24
Stunden 6 ng/ml (± 24%). Die irrelevanten Urinkonzentrationen von Theophyllin in einem
Dosisintervall von 12 Stunden lagen bei 20 ng/ml (± 53%) und in einem Dosisintervall von 24
Stunden bei 34 ng/ml (± 107%). Anhand dieser Werte zeigt sich, dass sowohl die irrelevante
42%) und in
inem Dosisintervall von 24 Stunden bei 36 ng/ml (± 40%). Da für die LOQ von Theobromin
ppm im Pferdefutter. Da bei Nachweis von Theobromin aufgrund des
derartiger Untersuchungen keine sicheren Informationen
ur Streuung der Gesamtpopulation gewinnen lassen und somit eine allgemeingültige
Aussage nicht möglich ist. Nimmt man jedoch an, dass die ermittelte Streuung der Ergebnisse
Plasmakonzentration als auch die irrelevante Urinkonzentration von Theophyllin im Bereich
der in dieser Studie ermittelten Nachweisgrenzen dieses Stoffes im Plasma bzw. im Urin
liegen. Wird also mit der hier beschriebenen Methode Theophyllin im Plasma oder Urin
nachgewiesen, kann eine pharmakologische Wirkung von Theophyllin nicht ausgeschlossen
werden.
Das gleiche gilt für Theobromin. Für Theobromin wurden irrelevante Plasmakonzentrationen
in einem Dosisintervall von 12 Stunden von 14 ng/ml (± 37%) und in einem Dosisintervall
von 24 Stunden von 8 ng/ml (± 37%) errechnet. Die irrelevanten Urinkonzentrationen von
Theobromin in einem Dosisintervall von 12 Stunden lagen bei 40 ng/ml (±
e
im Plasma 15 ng/ml und im Urin 26 ng/ml ermittelt wurde, kann auch bei einem
Theobrominnachweis im Plasma oder Urin anhand dieser Untersuchungsmethode eine
pharmakologische Wirkung nicht ausgeschlossen werden. Dem entgegen steht der
international geltende Grenzwert von 2000 ng Theobromin pro ml Urin. Da es weder in der
Human- noch in der Veterinärmedizin zugelassene Theobrominpräparate gibt, sind die
Hauptursachen von Theobrominnachweisen bei Pferden Futtermittelkontaminationen. Diese
sind laut HAYWOOD et al. (1990) und HARKINS et al. (1998) aus produktionstechnischen
Gründen nicht generell zu vermeiden. Nach der Anlage 1 der Futtermittelverordnung vom
7.03.2005, zuletzt geändert am 02.11.2006, ist die Verwendung von Kakaoschalen im
Rahmen der Tierernährung statthaft und es gilt nach Anlage 5 eine Höchstmengenbegrenzung
von 300
Metabolitenmusters im Urin sicher zwischen Theobromin und Coffein als verabreichte
Muttersubstanz unterschieden werden kann, ist diese Grenzwertregelung sinnvoll.
Betrachtet man die Streuung der Ausscheidungszeitenergebnisse bei nur jeweils sechs
Pferden, wird klar, dass sich anhand
z
127
DISKUSSION
dieser Studie den Durchschnitt der Gesamtpopulation widerspiegelt, könnte anhand zu
rrechnender Konfidenzintervalle eine Abschätzung der Ausscheidungszeit erfolgen
. Setzt man z.B. den für die Ausscheidungszeit von Theophyllin bis
um Erreichen der LOD ermittelten Wert von 128 Stunden gleich 100 Zeiteinheiten, so kann
unter 192 Stunden liegt. Eine
icherheit von 99,9% kann für eine Ausscheidungszeit von 180 Zahleneinheiten, also 230
Stunden, erwartet werden.
eine Sicherheit von 95% bzw. 99,9% bieten.
e
(KIETZMANN, 2006a)
z
anhand der Standardabweichung von 24 % errechnet werden, dass die Ausscheidungszeit bei
95% der Gesamtpopulation unter 150 Zahleneinheiten, also
S
Nach KIETZMANN (2006a) kann davon ausgegangen werden, dass die Annahme einer
Standardabweichung von 50% des Mittelwertes ein ausreichend hohes Maß an Sicherheit
bietet. Die auf dieser Basis abgeleitete Karenzzeit, die das Doppelte oder Dreifache der
errechneten Ausscheidungszeit beträgt, würde
50
100
150
200
250
300
ober
es K
onfid
enzi
nter
vall
99,9 % 99 %
95 %
Mittelwert = 100
00 10 20 30 40 50
Standardabweichung in der Stichprobe
Abb. 47: Konfidenzintervalle (nur oberer Grenzbereich angezeigt) für eine ermittelte
cherheit Ausscheidungszeiten bis zum
grenze von 384 Stunden für intravenös appliziertes Theophyllin und
Kenngröße (z.B. Ausscheidungszeit, angenommen mit einem Mittelwert von 100 Zeiteinheiten) in Abhängigkeit von der Streuung der Stichprobe (nach KIETZMANN, 2006a)
Somit ergeben sich für die Gesamtpopulation, bei maximal angenommener
Standardabweichung von 50%, mit 99,9%iger Si
Erreichen der Nachweis
von 654 Stunden für intravenös verabreichtes Theobromin.
128
DISKUSSION
5.3. Bewertung der Ergebnisse
Mit dieser Studie wurde eine geeignete Analysemethode für den Nachweis von Theophyllin,
heophyllin ist in der Veterinärmedizin nicht als Therapeutikum zugelassen ist, und somit ist
rechneten irrelevanten
zu ahnden.
Theobromin, Paraxanthin und Coffein im Blutplasma und Urin von Pferden entwickelt und
validiert. Diese kann in der Routinediagnostik zum einheitlichen Nachweis von
Methylxanthinen in der Dopinganalytik genutzt werden.
Durch die Ermittlung der irrelevanten Plasma- und Urinkonzentrationen von Theophyllin und
Theobromin nach TOUTAIN und LASSOURD (2002) sollte geprüft werden, ob die
Festlegung eines Grenzwertes für Theophyllin im Plasma und/oder Urin möglich und sinnvoll
ist.
T
auch kein Handelspräparat für Pferde erhältlich. Ein Einsatz von Theophyllin wäre daher nur
auf der Basis einer Umwidmung im Rahmen eines Therapienotstandes möglich.
Die anhand des Modells von TOUTAIN und LASSOURD (2002) be
Plasma- und Urinkonzentrationen von Theophyllin lagen nach einem Dosierungsintervall von
12 Stunden unter der Nachweisgrenze und in einem Dosierungsintervall von 24 Stunden im
Bereich der Nachweisgrenze von 13 ng/ml im Plasma bzw. von 20 ng/ml im Urin. Somit ist
bei Nachweis von Theophyllin im Plasma oder im Urin eine pharmakologische Wirkung nicht
auszuschließen. Während für Theobromin international ein Grenzwert von 2000 ng/ml Urin
besteht, ist von der Einführung eines Grenzwertes für Theophyllin im Pferdeplasma oder
Pferdeurin abzuraten und jeglicher Nachweis von Theophyllin als dopingrelevant zu
interpretieren und
129
ZUSAMMENFASSUNG
6 ZUSAMMENFASSUNG
Sophie Koppe (2007):
nsichtlich der Dopingrelevanz beim Pferd
iel der vorliegenden Arbeit war, neben der Optimierung und Validierung einer geeigneten
rden, die Untersuchung
von Theophyllin und Theobromin.
en mit angeschlossenem Tandemmassenspektometer. Die
alidierung umfasste die Kriterien Selektivität, Linearität, Richtigkeit, Präzision, Stabilität
ng/ml für Theobromin. Die Detektionsgrenzen im Plasma
gen bei 13 ng/ml für Theophyllin, 15 ng/ml für Theobromin, 14 ng/ml für Coffein und 29
rmittelt.
alig 4
ravenös verabreicht und anschließend über einen
eitraum von 60 bis 108 Stunden Plasma- und Urinproben entnommen.
inprobenentnahmen von 60 Stunden fiel bei
einem Pferd die Urinkonzentration unter die Quantifizierungsgrenze von 50 ng Theophyllin
ze erkennbar, Theobromin
Untersuchungen zur Pharmakokinetik der Methylxanthine Theophyllin und
Theobromin hi
Z
Analysemethode zur Detektion und Quantifizierung von Theophyllin und Theobromin sowie
der Metaboliten Paraxanthin und Coffein im Plasma und Urin von Pfe
des pharmakokinetischen Verhaltens
Die Validierung und Messung der Plasma- und Urinproben erfolgte auf einem
Hochflüssigkeitschromatograph
V
und Wiederfindung. Die Quantifizierungsgrenzen für Theophyllin, Theobromin, Paraxanthin
und Coffein betrugen im Plasma 100 ng/ml und im Urin 50 ng/ml für Theophyllin,
Paraxanthin und Coffein und 100
la
ng/ml für Paraxanthin. Im Urin wurden Nachweisgrenzen von 20 ng/ml für Theophyllin, 26
ng/ml für Theobromin, 33 ng/ml für Coffein und 32 ng/ml für Paraxanthin e
In drei Versuchsabschnitten wurden jeweils sechs Pferden einmalig 4 mg/kg Körpergewicht
Theophyllin intravenös, einmalig 4 mg/kg Körpergewicht Theophyllin oral bzw. einm
mg/kg Körpergewicht Theobromin int
Z
Nach intravenöser Applikation von Theophyllin lagen die Maximalkonzentrationen von
Theophyllin im Plasma in einem Bereich von 5.165 bis 8.834 ng/ml und im Urin bei 21.636
bis 93.373 ng/ml. Über den Zeitraum der Ur
k
pro ml Urin. Es wurde sowohl im Plasma als auch im Urin der Metabolit Paraxanthin
nachgewiesen, Coffein war in Spuren im Bereich der Nachweisgren
wurde nicht nachgewiesen.
130
ZUSAMMENFASSUNG
Nach oraler Verabreichung von Theophyllin konnten Maximalkonzentrationen von
in Höhe von 16.365
is 41.256 ng/ml gemessen werden. Lediglich bei einem Pferd sank die Urinkonzentration
renze
öser Applikation nur der Metabolit Paraxanthin
obromin lagen die Maximalkonzentrationen von
heobromin im Plasma bei Werten von 5.715 bis 12.402 ng/ml und im Urin bei 65.771 bis
on 8 Stu den fi bei keinem
. Es
auch im Urin weder Theophyllin, Paraxanthin noch Coffein in
uantifizierbarer Menge nachgewiesen. Somit kann anhand des nachweisbaren
n erden. Wird
rden
eophyllin appliziert worden.
hnungen
002)
echnungen wurden sogenannte irrelevante Plasma- und
rinkonzentrationen ermittelt, bei denen eine Wirkung von Theophyllin auf den Organismus
ante Plasmakonzentration in einem
. im Bereich der Nachweisgrenzen von Theophyllin in den
in im
ußerdem kann aufgrund der erheblichen interindividuellen Streuung und geringen Anzahl
Theophyllin
phyllin im Plasma oder im Urin sollte als dopingrelevant gelten
nd entsprechend geahndet werden.
Theophyllin im Plasma in Höhe von 1.791 bis 3.483 ng/ml und im Urin
b
innerhalb des Probenentnahmezeitraumes von 108 Stunden unter die Quantifizierungsg
von 50 ng/ml. Es wurde wie nach intraven
nachgewiesen.
Nach intravenöser Applikation von The
T
94.889 ng/ml. Über den Zeitraum der Urinprobenentnahmen v 16 n el
Pferd die Urinkonzentration unter die Nachweisgrenze von 26 ng Theobromin pro ml Urin
wurde sowohl im Plasma als
q
Metabolitenmusters eindeutig auf die verabreichte Muttersubstanz geschlosse w
lediglich Theobromin nachgewiesen, ist reines Theobromin verabreicht worden. We
Theophyllin und Paraxanthin nachgewiesen, ist Th
Die ermittelten Ergebnisse wurden anschließend pharmakokinetischen Berec
unterzogen und mit Hilfe des PK-/PD-Modells nach TOUTAIN und LASSOURD (2
quantitativ verknüpft. Durch diese Ber
U
ausgeschlossen werden kann. Die ermittelte irrelev
Dosisintervall von 12 Stunden lag bei 14 ng/ml und die irrelevante Urinkonzentration bei 40
ng/ml, und somit unter bzw
verschiedenen Matrices. Daraus lässt sich schließen, dass jeder Nachweis von Theophyll
Plasma oder im Urin anhand der beschriebenen Analysemethode als positiver Dopingbefund
zu betrachten ist. Deswegen erscheint die Einführung eines Grenzwertes für Theophyllin nicht
sinnvoll.
A
von Probanden keine absolut sichere Aussage über die Ausscheidungszeiten von
und Theobromin gemacht werden.
Jeglicher Nachweis von Theo
u
131
SUMMARY
7 SUMMARY
Sophie Koppe (2007):
he methylxanthines theophylline and
vance in horse-doping
ethod for the analysis detection
f horses and to investigate the pharmacokinetic behaviour of
affeine and theobromine.
of samples was made by using a high performance liquid
hromatograph (HPLC) with connected tandem-mass-spectrometer. Validation contained the
it of
eobromine, paraxanthine and caffeine was fixed at 100
g/ml in plasma and at 50 ng/ml in urine for theophylline, paraxanthine and caffeine. For
eobromine it was fixed at 100 ng/ml. The limit of detection was found at 13 ng/ml for
9 ng/ml for
he limit of detection was found at 20 ng/ml for theophylline,
t 26 ng/ml for theobromine, at 33 ng/ml for caffeine and at 32 ng/ml for paraxanthine.
body
theobromine at a single
ns of theophylline in
lasma after intravenous administration ranged between 5165 and 8834 ng/ml.
centrations in urine ranged between 21636 and 93373 ng/ml. 60
a ons o all si horses were not below limit of
uantification. In plasma and urine the metabolites paraxanthine and caffeine were detectable.
eobromine was not
aximum concentrations of theophylline in plasma after oral administration ranged between
791 and 3483 ng/ml. Maximum concentrations of theophylline in urine ranged between
Investigation of pharmacokinetic mechanisms of t
theobromine with respect to its rele
Aim of this study was to optimize and validate a suitable m
and quantification of theophylline, theobromine and the metabolites paraxanthine and caffeine
in blood and urine samples o
c
Validation and measurement
c
criteria selectivity, linearity, accuracy, precision, stability and recovery. The lim
quantification for theophylline, th
n
th
theophylline, at 15 ng/ml for theobromine, at 14 ng/ml for caffeine and at 2
paraxanthine in plasma. In urine t
a
Theophylline was administered to six horses at a single intravenous dose of 4 mg/kg
weight, theophylline at a single oral dose of 4 mg/kg body weight, or
travenous dose of 4 mg/kg body weight. Maximum concentratioin
p
Maximum theophylline con
hours after administration urine concentr ti f x
q
But caffeine concentrations were mainly around limit of detection. Th
detectable.
M
1
132
SUMMARY
16365 and 41256 ng/ml. 108 hours after administration the urine concentration of only one
fter administration of theobromine its maximum concentrations in plasma ranged between
ours after
orses were still above limit of detection. No
etabolites could be detected in plasma and urine.
ected
ication of theobromine can be submitted, and
heophylline and paraxanthine in plasma or urine, application of
eophylline can be submitted.
pharmacokinetic/pharmacodynamic approach of
OUTAIN and LASSOURD (2002) to calculate the irrelevant plasma and urine
ntration, irrelevant plasma concentration and irrelevant
rine concentration by the pharmacokinetic/pharmacodynamic model of TOUTAIN and
ne the irrelevant plasma concentration (at 14
l of 2 hou are elow
. Therefore it is concluded that any detection of theophylline
plasma or urine by this method has to be considered as a positive result of dopingtest. That
al
ariability. It must be concluded that a prediction about excretion times of theophylline and
ible.
les should be considered as relevant for
d appropriately.
horse was below limit of quantification. In plasma and urine the metabolite paraxanthine was
detectable.
A
5715 and 12402 ng/ml and in urine between 65771 and 94889 ng/ml. 168 h
administration all urine concentrations of the six h
m
Using the pattern of metabolites the parent substance can be concluded. If there is det
almost sole theobromine in plasma or urine, appl
if there is detected t
th
Afterwards the results were integrated into a
T
concentrations where caffeine has no effect on the organism anymore.
Calculation of effective plasma conce
u
LASSOURD (2002) showed that for theophylli
ng/ml) and urine concentration (at 40 ng/ml) at a dosing interva 1 rs b
respectively at limit of detection
in
is why an establishment of a selected cut-off value for therapeutics seems not to be acceptable
for theophylline.
In addition a considerable variance of measured data demonstrates the interindividu
v
theobromine based on this data by a small number of probands is not reliably poss
Any detection of theophylline in plasma or urine samp
doping and should be punishe
133
LITERATURVERZEICHNIS
8 LITERATURVERZEICHNIS ALY, Z. H. (1981): Untersuchungen über Coffein und Theobromin bei Schafen: III. Mitteilung: Verfütterung von Kakaoschalen. Zbl. Vet. Med. A, 28, 711-719 ARNAUD, M. J. (1984):
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TABELLENVERZEICHNIS
9 TABELLENVERZEICHNIS
Dopingformen nach UNGEMACH und NÜRNBERGER (1999)
Tab. 2:
Tab. 4:
Tab. 6: in und Theophyllin im
Plasma zur Erstellung der drei Kalibrationsgeraden
Tab. 7:
Eingesetzte Konzentrationen zur Überprüfung der Richtigkeit im Plasma
Eingesetzte Konzentrationen zur Überprüfung der Richtigkeit im Urin
Tab. 10: Eingesetzte Konzentrationen zur Überprüfung der Präzision im Plasma
Tab. 11: Eingesetzte Konzentrationen zur Überprüfung der Präzision im Urin
Tab. 12: Konzentrationen von Coffein, Theobromin, Theophyllin und Paraxanthin in
den Matrices Urin und Plasma für den Stabilitätstest
Tab. 13: Nachweisgrenzen von Theophyllin, Theobromin, Coffein und Paraxanthin im
Plasma
Tab. 1:
Zusammenfassung der 2006 im Institut für Biochemie der Sporthochschule
Köln im Auftrag der Pferdesportverbände durchgeführter Analysen
Tab. 3: Pharmakodynamische Wirkungen der Methylxanthine (LÖSCHER, 2006)
Rasse, Geschlecht, Alter und Gewicht der Versuchspferde
Tab. 5: Entnahmezeitpunkte von Blut- und Urinproben im Hauptversuch
Verwendete Konzentrationen von Coffein, Theobrom
Verwendete Konzentrationen von Coffein, Theobromin, Theophyllin und
Paraxanthin im Urin zur Erstellung der drei Kalibrationsgeraden
Tab. 8:
Tab. 9:
148
TABELLENVERZEICHNIS
Tab. 14: Nachweisgrenzen von Theophyllin, Theobromin, Coffein und Paraxanthin im
Urin
in, Coffein und Paraxanthin
im Plasma
Bestimmungsgrenzen von Theophyllin, Theobromin, Coffein und Paraxanthin
a
Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Theobromin im Plasma
Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Paraxanthin im Plasma
Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Coffein im Plasma
Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Theophyllin im Urin
Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Theobromin im Urin
Tab. 23: Urin
Intraday- und Interdaypräzision von Theophyllin und Theobromin im Plasma
Intraday- und Interdaypräzision von Coffein und Paraxanthin im Plasma
Intraday- und Interdaypräzision von Theophyllin und Theobromin im Urin
Intraday- und Interdaypräzision von Coffein und Paraxanthin im Urin
Tab. 15: Bestimmungsgrenzen von Theophyllin, Theobrom
Tab. 16:
im Urin
Tab. 17: Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Theophyllin im Plasm
Tab. 18:
Tab. 19:
Tab. 20:
Tab. 21:
Tab. 22:
Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Paraxanthin im
Tab. 24: Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Coffein im Urin
Tab. 25:
Tab. 26:
Tab. 27:
Tab. 28:
149
TABELLENVERZEICHNIS
Tab. 29: Stabilitätsdaten von Theophyllin, Theobromin, Paraxanthin und Coffein im
offein im
Urin
Tab. 31: Coffein
im Plasma
Tab. 32:
wicht
ab. 35: Pharmakokinetische Daten bis zur Quantifizierungsgrenze nach einmaliger
cht
konzentrationen von Theophyllin nach TOUTAIN
und LASSOURD (2002) in einem Dosisintervall von 12 Stunden
ab. 37
nem Dosisintervall von 24 Stunden
h TOUTAIN
ab. 39: Irrelevante Plasma- und Urinkonzentrationen von Theobromin nach TOUTAIN
Plasma
Tab. 30: Stabilitätsdaten von Theophyllin, Theobromin, Paraxanthin und C
Wiederfindungsraten von Theophyllin, Theobromin, Paraxanthin und
Wiederfindungsraten von Theophyllin, Theobromin, Paraxanthin und Coffein
im Plasma
Tab. 33: Pharmakokinetische Daten bis zur Quantifizierungsgrenze nach einmaliger
intravenöser Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körperge
Tab. 34: Pharmakokinetische Daten bis zur Quantifizierungsgrenze nach einmaliger
oraler Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht
T
intravenöser Applikation von 4 mg Theobromin pro kg Körpergewi
Tab. 36: Irrelevante Plasma- und Urin
T : Irrelevante Plasma- und Urinkonzentrationen von Theophyllin nach TOUTAIN
und LASSOURD (2002) in ei
Tab. 38: Irrelevante Plasma- und Urinkonzentrationen von Theobromin nac
und LASSOURD (2002) in einem Dosisintervall von 13 Stunden
T
und LASSOURD (2002) in einem Dosisintervall von 24 Stunden
150
TABELLENVERZEICHNIS
Tab. 40: Ausscheidungszeiten von Theophyllin aus dem Plasma nach intravenöser
OD
den)
Tab. 41: eophyllin aus dem Plasma nach oraler Applikation
von 4 mg/kg Körpergewicht bis zum Erreichen von LOQ und der LOD
Tab. 42: Theobromin aus dem Plasma nach intravenöser
Applikation von 4 mg/kg Körpergewicht bis zum Erreichen von LOQ, LOD
bzw. der IPC (nach einem Dosierungsintervall von 13 bzw. 24 Stunden)
Tab. 43:
Mittelwert und Standardabweichung der sechs Pferde
Tab. 44: einmaliger intravenöser
kg Körpergewicht einschließlich
Tab. 45: ach einmaliger intravenöser Applikation
t einschließlich Mittelwert und
Tab. 46:
von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht einschließlich Mittelwert und
Tab. 47:
von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht einschließlich Mittelwert und
Tab. 48: akonzentrationen von Theobromin nach einmaliger intravenöser
Applikation von 4 mg Theobromin pro kg Körpergewicht einschließlich
Mittelwert und Standardabweichung der sechs Pferde
Applikation von 4 mg/kg Körpergewicht bis zum Erreichen von LOQ, L
bzw. der IPC (nach einem Dosierungsintervall von 12 bzw. 24 Stun
Ausscheidungszeiten von Th
Ausscheidungszeiten von
Plasmakonzentrationen von Theophyllin nach einmaliger intravenöser
Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht einschließlich
Plasmakonzentrationen von Paraxanthin nach
Applikation von 4 mg Theophyllin pro
Mittelwert und Standardabweichung der sechs Pferde
Plasmakonzentrationen von Coffein n
von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewich
Standardabweichung der sechs Pferde
Plasmakonzentrationen von Theophyllin nach einmaliger oraler Applikation
Standardabweichung der sechs Pferde
Plasmakonzentrationen von Paraxanthin nach einmaliger oraler Applikation
Standardabweichung der sechs Pferde
Plasm
151
TABELLENVERZEICHNIS
Tab. 49: Urinkonzentrationen von Theophyllin nach einmaliger intravenöser
Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht e
Mittelwert und Standardabweichung der sechs Pferde
inschließlich
Tab. 51: Urinkonzentrationen von Theophyllin nach einmaliger oraler Applikation von
4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht einschließlich Mittelwert und
Tab. 52:
Körpergewicht einschließlich Mittelwert und
Standardabweichung der sechs Pferde
Tab. 53:
ichung der sechs Pferde
Tab. 50: Urinkonzentrationen von Paraxanthin nach einmaliger intravenöser
Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht einschließlich
Mittelwert und Standardabweichung der sechs Pferde
Standardabweichung der sechs Pferde
Urinkonzentrationen von Paraxanthin nach einmaliger oraler Applikation von
4 mg Theophyllin pro kg
Urinkonzentrationen von Theobromin nach einmaliger intravenöser
Applikation von 4 mg Theobromin pro kg Körpergewicht einschließlich
Mittelwert und Standardabwe
152
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
10 ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abb. 1:
Abb. 3:
Ein- Kompartiment- Modell nach intravenöser Applikation
Abb. 7:
Abb. 9: ittels
PLC/MS/MS im Konzentrationsbereich bis 10.000 ng/ml
Abb. 10:
bb.11: ESI-Produktionenspektrum und Strukturformel von Theophyllin
bb. 12: ESI-Produktionenspektrum von 1,3-15N2-Theophyllin
Abb. 13: ESI-Produktionenspektrum und Strukturformel von Theobromin
Abb. 14: ESI-Produktionenspektrum von D6-Theobromin
Abb. 15: ESI-Produktionenspektrum und Strukturformel von Coffein
Strukturformeln der Methylxanthine
Abb. 2: Resorption nach einer Kinetik 0. Ordnung (FREY, 2002)
Resorption nach einer Kinetik 1. Ordnung (MUTSCHLER, 1996)
Abb. 4: Halblogarithmische Darstellung einer Resorption nach einer Kinetik
1. Ordnung (MUTSCHLER, 1996)
Abb. 5:
Abb. 6: Zwei- Kompartiment- Modell nach intravenöser Applikation
Zwei- Kompartiment- Modell nach einmaliger oraler Applikation
Abb. 8: Drei- Kompartiment- Modell nach einmaliger oraler Applikation
Probenaufarbeitung zum Nachweis von Methylxanthinen im Pferdeurin m
H
Probenaufarbeitung zum Nachweis von Methylxanthinen im Pferdeplasma
mittels HPLC/MS/MS im Konzentrationsbereich bis 10.000 ng/ml
A
A
153
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abb. 16: ESI-Produktionenspektrum von D3-Coffein
bb. 18: HPLC/MS/MS- Chromatogramme von Leerwerturinproben zu den
entsprechenden Retentionszeiten von Theobromin und Paraxanthin.
HPLC/MS/MS-Chromatogramme von inprobe denen ng
t xa ro z t z tsp en
Retentions iten.
Abb. 20: /M - at e L rtpl obe den
rec R ns on in eop
Abb. 21: /M –C tog von Plasma , d 0 ng in
kti op ro sma zugesetzt wurden, zu den
rec R ns
Abb. 22: ra rv ng K on ung es
la ef n f ei asm on ions iegen
Messpunkte
Abb. 23: rat rve nga r K ons ung es
elat eff n f eob im a; zent sstufe
n z ess vo
bb. 24: Kalibrationskurve mit Angabe der Kalibrationsgleichung und des
tufe
bb. 25: Kalibrationskurve mit Angabe der Kalibrationsgleichung und des
Korrelationskoeffizienten für Theobromin im Urin; je Konzentrationsstufe
liegen zwei Messpunkte vor
Abb. 17: ESI-Produktionenspektrum und Strukturformel von Paraxanthin
A
Abb. 19: Ur n, 100 Theobromin
respek ive Para nthin p ml Urin ugesetz wurden, u den en rechend
ze
HPLC S/MS Chrom ogramm von eerwe asmapr n zu
entsp henden etentio zeiten v Coffe und Th hyllin
HPLC S/MS hroma ramme proben enen 10 Coffe
respe ve The hyllin p ml Pla
entsp henden etentio zeiten.
Kalib tionsku e mit A abe der alibrati sgleich und d
Korre tionsko fiziente ür Coff n im Pl a; je K zentrat stufe l
zwei vor
Kalib ionsku mit A be de alibrati gleich und d
Korr ionsko iziente ür Th romin Plasm je Kon ration
liege wei M punkte r
A
Korrelationskoeffizienten für Theophyllin im Urin; je Konzentrationss
liegen zwei Messpunkte vor
A
154
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
A akonzentrationsverläufe von T llin ch n
li v p n g y kg
Körpergewicht, Ausschnittsv rößerung zeigt den Konzentrationsverlauf
innerhalb der ersten Stunde
Abb. 27: ittelter Plasm entr ver n T ylli den Metaboliten
Abb. 28: ittelter Plasm verlauf der M
Coffein ntra er Applikation von 4 mg/kg Theophyllin sowie der
tifi gsg (LO d d hw nze )
Abb. 29: ntu erh von phy nd d etab Para n im
a nach intravenöser Applikatio g Körp icht i ttel
m Erreichen von LOQ
Abb. 30: ittelter Plasma zentr sverl on T ylli Parax n im
a nach oraler Applikation von 4 g K gewi Mit zum
chen LOQ
g/kg Körpergewicht im Mittel bis zum
Erreichen von LOQ
bb. 32: Plasmakonzentrationsverläufe von Theophyllin nach einmaliger oraler
Applikation von 4mg Theophyllin pro kg Körpergewicht,
Ausschnittsvergrößerung zeigt die ersten 25 Stunden nach Applikation
bb. 33: Prozentuales Verhältnis von Theobromin und Metaboliten im Plasma nach
intravenöser Applikation von 4 mg/kg Körpergewicht im Mittel
bb. 26 : Plasm heophy bei se s Pferde nach
einma ger intra enöser A plikatio von 4 m Theoph llin pro
erg
Gem akonz ations lauf vo heoph n und
Paraxanthin und Coffein
Gem akonzentrations etaboliten Paraxanthin und
nach i venös
Quan zierun renze Q) un er Nac eisgre (LOD
Proze ales V ältnis Theo llin u em M oliten xanthi
Plasm n von 4 m /kg ergew m Mi
bis zu
Gem kon ation auf v heoph n und anthi
Plasm mg/k örper cht im tel bis
Errei von
Abb. 31: Prozentuales Verhältnis von Theophyllin und dem Metaboliten Paraxanthin im
Plasma nach oraler Applikation von 4 m
A
A
155
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abb. 34: Plasmakonzentrationsverläufe von Theobromin nach einmaliger intravenöser
ka n 4 eo p örpergewic
h r z erste Stunde nach Applikation
Abb. 35: ische Darstellung der ge
ophy onze onsverläufe im Plasma nach einm intra er
likati on T hyllin wie ant ungs e (LO d der
Abb. 36: ische Darstellung der g
phy onzentrationsv fe i a nach einm orale
likati on T yllin wie d ant ungs e (LO d der
Abb. 37: loga ische Darstellung der gemittelten
obrom onze onsv fe im ma nach einm r intra er
likat n T omin, sowie der Quantifizierungsgrenze (LOQ) und
ach grenz OD)
bb. 38: Urinkonzentrationsverläufe von Theophyllin nach einmaliger intravenöser
Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht
bb. 39: Prozentuales Verhältnis von Theophyllin und Paraxanthin im Urin nach
intravenöser Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht im
Mittel bis zum Erreichen von LOQ
bb. 40: Urinkonzentrationsverläufe von Theophyllin nach einmaliger oraler
Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht
bb. 41: Prozentuales Verhältnis von Theophyllin und Paraxanthin im Urin nach
oralerApplikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht im Mittel bis
zum Erreichen von LOQ
Appli tion vo mg Th bromin ro kg K ht,
Aussc nittsverg ößerung eigt die
Halblogarithm mittelten
The llink ntrati aliger venös
App on v heop , so der Qu ifizier grenz Q) un
Nachweisgrenze (LOD)
Halblogarithm emittelten
Theo llink erläu m Plasm aliger r
App on v heoph , so er Qu ifizier grenz Q) un
Nachweisgrenze (LOD)
Halb rithm
The ink ntrati erläu Plas alige venös
App ion vo heobr
der N weis e (L
A
A
A
A
156
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abb. 42: ntu erh on Theobro d liten im Urin nach
intravenöser Applikation von 4 mg Theobromin kg K ge
b Er v
Abb. 43: on tion ufe he aliger intravenöser
ika n 4 heo n p örpergewich
chnittsvergr z er St nac ikat
Abb. 44: nt er vo in ro eo und
an Urin nach intravenös lika on offe kg
erg t im l b Er de da t
Abb. 45: ntuales Verh von in, rom heo und
ant Urin nach intravenös lik on heop
g K gew M is z reic er LO arges
:
obromin
Erreichen der LOQ dargestellt
bb. 47: Konfidenzintervalle (nur oberer Grenzbereich angezeigt) für eine ermittelte
Kenngröße (z.B. Ausscheidungszeit, angenommen mit einem Mittelwert von
100 Zeiteinheiten) in Abhängigkeit von der Streuung der Stichprobe
(KIETZMANN, 2006)
Proze ales V ältnis v min un Metabo
pro örper wicht im
Mittel is zum reichen on LOQ
Urink zentra sverlä von T obromin nach einm
Appl tion vo mg T bromi ro kg K t,
Auss ößerung eigt die sten 28 unden h Appl ion
Proze uales V hältnis n Coffe , Theob min, Th phyllin
Parax thin im er App tion v 4 mg C in pro
Körp ewich Mitte is zum reichen r LOQ rgestell
Proze ältnis Coffe Theob in, T phyllin
Parax hin im er App ation v 4 mg T hyllin
pro k örper icht im ittel b um Er hen d Q d tellt
Abb. 46 Prozentuales Verhältnis von Coffein, Theobromin, Theophyllin und
Paraxanthin im Urin nach intravenöser Applikation von 4 mg The
pro kg Körpergewicht im Mittel bis zum
A
157
ANHANG
11 ANHANG
Konzentrati n h d o i e n P
und Coffein im Pla a nac intra öser Applikation von Theophyllin und
Theobromin und oraler Verabreichung von Theophyllin
Zeit nach
onen vo Theop yllin un Theobr min sow e den M tabolite araxanthin
sm h ven
Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Mittel- Sta - ndardAppl on ikati 1 2 3 4 5 6 wert abweichung
[h] [ [ [ [ [ [ [ [ng/ml] ng/ml] ng/ml] ng/ml] ng/ml] ng/ml] ng/ml] ng/ml]
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7 6 1 .033 8834.4 7027.3 818.5 4024.7 6120.4 8038.6 977.3 716.80 8 5 4 5 5 1 .08 140.2 193.0 145.0 165.0 4316.9 5678.7 439.8 443.80 5 5 4 3 3 4 45 1174.0 .166 798.9 869.4 179.3 099.3 415.7 805.4 28.00 5 5 3 4 4 4 46 8 78.25 162.5 906.5 701.1 125.7 425.4 715.5 72. 3.4 0 6 4 3 2 2 3 4 1 .33 561.2 408.6 385.6 749.5 964.8 950.4 003.3 395.80.5 5 5 3 2 4003.3 3 639.6 364.4 611.1 206.6 914.2 41 12 23.2 51.7
0 4 4 2 2 3 3 36 2 80.75 463.0 471.0 872.1 563.1 901.2 852.9 87. 2.2 1 3 3843.0 2 2437.6 3 4194.2 438.7 854.0 614.3 33 0 6497. 7.9 2 3282.2 3688.9 2429.0 2500.2 3546.9 2957.0 3067.4 529.9 3 268.8 4507.2 2188.1 2359.6 3925.2 4278.6 3 3421.2 983.8 5 2779.2 3345.6 1914.3 2416.2 4113.9 3353.5 2987.1 781.3 7 2682 037.6 2811.0 .9 3300.4 1947.1 1521.0 3 2550.0 679.5 9 2 2408.6 2181.6 335.4 2341.8 1726.7 1637.1 2105.2 337.4
12 2326.4 1375.8 1610.8 1323.9 2219.0 1937.7 1798.9 427.6 15 1518.9 2258.1 1388.4 766.9 1884.1 1536.8 1558.9 500.6 24 1240.6 1159.4 755.0 931.1 935.0 848.3 978.2 185.7 28 1107.1 1139.2 662.5 734.6 1065.8 835.8 924.2 205.9 32 945.3 780.0 514.2 549.9 1095.7 889.0 795.7 228.5 36 946.0 795.7 464.4 549.7 335.1 1163.1 709.0 314.6 48 651.1 391.0 205.0 402.8 621.9 200.6 412.1 194.6 54 337.8 313.8 238.3 230.4 597.2 182.4 316.6 148.8 60 521.3 157.2 170.3 193.7 754.9 443.7 373.5 241.9
Tab.43: Plasmakonzentrationen von Theophyllin nach einmaliger intravenöser
Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht einschließlich Mittelwert
und Standardabweichung der sechs Pferde
158
ANHANG
Zeit nach Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Mittel- Standard-
Applikation 1 2 3 4 5 6 wert abweichung[h] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml]
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.033 868.0 476.6 428.6 369.3 324.4 459.3 487.7 194.8 0.08 535.2 256.4 201.4 235.3 227.1 417.7 312.2 133.7 0.166 342.7 345.2 198.5 345.2 224.5 306.3 293.7 65.9 0.25 281.1 427.2 193.2 329.0 265.6 310.2 301.0 77.5 0.33 374.3 272.5 170.9 333.0 145.6 412.3 284.8 108.7 0.5 394.8 316.4 223.1 263.7 310.5 216.0 287.4 67.4
0.75 287.0 373.6 311.4 157.7 329.3 378.7 306.3 81.0 1 214.0 269.0 247.6 142.8 239.4 685.5 299.7 193.9 2 142.4 213.6 145.4 271.5 870.9 166.0 301.6 283.1 3 291.3 246.6 125.6 300.8 279.5 262.1 251.0 64.5 5 242.7 205.1 94.9 259.1 212.9 413.7 238.1 103.5 7 0.0 239.8 108.1 290.7 255.5 146.5 173.4 109.5 9 477.2 133.7 111.8 304.4 237.4 n.n. 210.8 167.7
12 242.6 183.1 102.4 282.0 n.n. n.n. 135.0 120.8 15 112.3 159.8 130.3 245.0 180.2 n.n. 138.0 81.8 24 139.0 62.2 n.n. 132.7 n.n. 88.7 70.4 61.5 28 n.n. n.n. n.n. 40.3 140.7 n.n. 100.8 63.6 32 n.n. n.n. n.n. n.n. 173.6 n.n. 28.9 70.9 36 46.7 54.1 n.n. n.n. 8.9 196.5 51.0 75.1 48 430.6 n.n. n.n. n.n. n.n. 87.8 86.4 172.2 54 n.n. 1n.n. n.n. n.n. 78.1 n.n. 29.7 72.7 60 154.0 n.n. n.n. n.n. 51.5 n.n. 34.2 62.2
Tab.44: Plasmakonzentrationen von Paraxanthin nach einmaliger intravenöser
Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht einschließlich Mittelwert
und Standardabweichung der sechs Pferde
159
ANHANG
Zeit nach Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Mittel- Standard-
Applikation 1 2 3 4 5 6 wert abweichung[h] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml]
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.033 153.4 n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. 25.6 62.6 0.08 n.n. n.n. 14.3 n.n. n.n. 228.5 40.5 92.3 0.166 n.n. .4 .7 n.n.n. 32 n.n. 80 n. 18.9 33.0 0.25 30.9 n. . 11 8 n.n. n n.n. 7. 314.5 77.2 124.9 0.33 n.n. n n n .n. .n. n .n. .n. n.n. 0 0 0.5 n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. 0 0
0. n n n n.n. 1 1875 .n. .n. .n. 9.8 0.7 3 72.6 3.41 n.n. n.n. n.n. 62.0 n.n. 992.3 175.7 400.8 2 n.n. n.n. n.n. n.n. 1283.2 n.n. 213.9 523.9 3 38.3 n.n. n.n. n.n. 1177.8 84.8 216.8 472.0 5 n.n. n.n. 16.6 n.n. 14.5 306.6 56.3 122.8 7 n.n. 15.1 n.n. n.n. 27.2 22.0 10.7 12.3 9 17.1 n.n. n.n. 15.7 34.2 n.n. 11.2 13.9
12 67.8 17.7 24.2 14.8 35.9 n.n. 26.8 23.3 15 36.6 n.n. 17.7 28.0 25.3 16.0 20.6 12.5 24 45.1 n.n. 25.7 33.0 24.2 47.3 29.2 17.2 28 23.2 19.6 n.n. n.n. 92.6 46.2 30.3 35.0 32 17.8 n.n. n.n. n.n. 224.1 31.8 45.6 88.4 36 n.n. 15.1 22.1 16.0 140.0 238.8 72.0 96.4 48 36.0 40.1 15.4 n.n. n.n. n.n. 15.2 18.7 54 46.0 22.5 n.n. n.n. 217.6 n.n. 47.7 85.2 60 76.9 n.n. 15.5 n.n. 59.2 180.8 55.4 69.2
Tab.45: Plasmakonzentrationen von Coffein nach einmaliger intravenöser Applikation von
4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht einschließlich Mittelwert und
Standardabweichung der sechs Pferde
160
ANHANG
Zeit nach Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Mittel- Standard-
A 1 6 pplikation 2 3 4 5 wert abweichung[h] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ ng/ml] [ng/ml]
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 203.6 1 2 1 3 6 8 7 58.4 2 0 3 8 .08 33. 80. 3.8 72. 52. 09.0 .16 385.0 319.8 244.1 79.3 1824.8 168.2 503.5 656.2 0 2947.3 247.4 .33 392.8 413.4 602.8 472.9 846.1 1035.8 0.66 562.6 1248.2 1439.7 1354.9 3483.0 236.8 1387.5 1133.0
1 674.0 2019.4 1502.6 1522.5 2896.5 286.5 1483.6 935.3 3 1064.5 3464.2 1717.8 1803.9 3041.9 1066.6 2 1 026.5 008.96 1169.8 2174.9 1892.0 2419.8 1912.4 1791.1 1 422.1 893.39 2412.5 2053.2 2090.8 2730.5 2029.5 1570.9 2147.9 392.1
12 1599.3 1130.5 2949.4 2660.4 1625.3 920.5 1814.2 818.9 24 1110.4 692.9 1349.9 1021.8 1481.5 690.6 1057.9 327.7 30 634.3 422.1 1101.8 692.3 956.0 568.0 729.1 253.3 48 461.7 177.1 411.7 233.7 718.0 405.3 401.2 191.0 54 221.7 173.6 349.2 373.4 396.8 170.4 280.8 103.8 60 237.4 53.1 337.1 66.8 378.0 152.6 204.2 136.6 72 183.4 69.8 223.3 80.2 174.8 103.6 139.2 63.0 96 48.8 13.2 56.9 14.1 335.6 41.3 85.0 124.1
108 18.9 35.8 20.3 81.3 36.7 n.n. 32.2 27.6
Plasmakonzentrationen von Theophyllin nach einmaliger oraler Applikation von
4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht einschließlich Mittelwert und
Standardabweichung der sechs Pferde
Tab.46:
161
ANHANG
Zeit nach Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Mittel- Standard-
A 4 pplikation 1 2 3 5 6 wert abweichung[h] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ ng/ml] [ng/ml]
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0. n n n n 10 n 1 4 08 .n. .n. .n. .n. 0.2 .n. 6.7 0.90.16 n.n. n.n. n.n. 39.3 171.8 36.3 41.2 66.6 0.33 n.n. n.n. 99.4 79.4 301.7 n.n. 80.1 117.2 0. 66 n.n. n.n. 138.8 59.9 369.5 29.1 99.6 142.0
1 n.n. 175.1 201.9 100.1 286.2 99.2 143.8 99.2 3 95.4 74.2 231.4 125.8 94.3 151.0 128.7 57.1 6 n.n. 106.1 120.3 170.5 230.8 96.7 120.7 77.4 9 176.8 132.7 130.7 198.8 225.6 156.7 170.2 37.6
12 215.7 114.4 215.9 201.1 252.5 42.4 173.7 79.1 24 187.4 58.9 86.2 100.3 128.6 n.n. 93.6 63.4 30 96.2 n.n. 78.8 31.8 108.6 n.n. 52.6 48.4 48 n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. 0 0 54 n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. 0 0 60 n.n. n.n. 27.1 74.0 n.n. n.n. 16.9 30.0 72 n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. 0 0 96 n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. 0 0
108 n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. 0 0 Tab.47: Plasmakonzentrationen von Paraxanthin nach einmaliger oraler Applikation von
4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht einschließlich Mittelwert und
Standardabweichung der sechs Pferde
162
ANHANG
Zeit nach Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Mittel- Standard-
A 2 pplikation 1 3 4 5 6 wert abweichung[ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [h] [ng/ml]
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0. 124 8346.5 45 46 106 61 7780.7 32 033 02.7 14.3 63.6 28.2 28.6 52.90.08 7 3 5 5 5 500.0 333.2 698.3 715.2 5082.3 4304.7 272.3 1419.4 0 .166 6135.8 7651.1 3910.7 3609.0 5558.9 5041.5 5317.8 1493.2 0. 087.2 813.4 25 6505.5 3996.2 5 3806.6 2 3861.5 4345.1 1281.4 0. 5212.5 33 6851.2 4992.5 3167.8 1753.2 3382.2 4227 1811 0 5293.1 .5 5126.2 3701.4 3575.4 3241.4 2838.4 3963 1013
0 4541.2 .75 8831.0 6565.9 2626.2 3658.4 3443.2 4 944.3 2331.51 4386.7 6052.0 5779.6 2622.2 3306.5 3085.4 4205.4 1448.4 2 1928.3 7566.3 3886.7 3414.6 3193.0 3761.9 3958.5 1900.7 3 3192.9 5838.6 4970.0 2321.5 2319.3 2623.8 3544.3 1500.9 5 2360.5 3814.9 3152.7 2667.4 3880.1 1725.4 2933.5 846.1 7 1 1 3 2287.8 640.2 3592.7 2040.8 540.9 171.5 2379.0 833.3 9 1276.0 3791.6 2 3 1 323.2 357.2 889.4 2869.8 2 584.5 938.0
13 1 2 1 4 2 1 006.3 494.2 935.7 144.9 1534.3 2139.2 209.1 078.024 1 1 1 2 1 1 1 109.9 407.1 393.8 138.4 962.7 578.3 598.3 385.2 28 7 9 1 2 1 1 1 18.3 12.4 190.9 093.2 093.8 637.4 274.3 506.4 36 9 8 779.7 6 5 7 7521.3 30.8 71.2 81.1 72.6 9.4 119.6 48 357.5 744.5 333.9 432.4 499.6 476.4 474.1 147.5 72 12.6 180.0 127.8 233.0 208.1 173.5 1 172.5 46.0 96 27.8 77.5 59.1 21.6 29.4 174.0 64.9 57.6
120 n.n. n.n. n.n. 30.6 277.4 n.n. 51.3 111.4 144 n.n. n.n. 16.1 n.n. n.n. 283.1 49.9 114.4 168 n.n. n.n. 125.9 127.3 n.n. n.n. 42.2 65.4
Tab.48: Plasmakonzentrationen von Theobromin nach einmaliger intravenöser Applikation
von 4 mg Theobromin pro kg Körpergewicht einschließlich Mittelwert und
Standardabweichung der sechs Pferde
163
ANHANG
Konzentrationen von Theophyllin und Theobromin sowie des Metaboliten Paraxanthin
i ac av A io
Verabreichung von Theophyllin
Zeit nach
m Urin n h intr enöser pplikat n von Theophyllin und Theobromin und oraler
Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Mittel- Standard- Appl on ikati 1 2 3 4 5 6 wert ab gweichun
[h] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml]
0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 14093.3 10409.2 12153.3 9235.0 9159.9 16555.4 11934.4 2945.3 3 24597.4 16633.4 19152.6 16306.3 21188.4 21636.3 19919.1 3190.1 6 20004.7 34175.6 93372.7 36982.0 21844.1 21005.7 37897.5 28126.1 9 21352.8 48508.4 45959.3 15952.6 16237.1 15300.2 27218.4 15674.4
12 19560.0 27523.5 21311.4 13665.1 19033.4 14606.0 19283 5012 15 1 1 1 1 7649.1 8992.8 16282.1 5500.0 8144.6 14230.8 16800 1783 24 11419.0 15686.0 1 1 1 1948.5 5235.0 6892.5 8113.7 13215.8 3303.4 28 1 1 1 1 1 2160.8 0965.6 0471.3 2359.4 6035.6 8871.6 1 1810.7 2425.7 32 10011.9 9329.4 9349.4 10400.1 10029.4 6818.0 9323.0 1296.9 36 383.7 8544.4 12823.0 9200.7 9620.0 5009.4 9 9096.9 2500.5 48 5094.3 3326.3 5973.4 4152.5 4501.7 3998.3 4507.7 924.5 54 3 4859.1 2693.8 135.5 2359.6 2966.2 5083.1 3516.2 1159.3 60 2782 616.5 1692.6 .2 1838.3 953.7 2657.1 4 2423.4 1267.2
Tab.49: Urinkonzentrationen von Theophyllin nach einmaliger intravenöser Applikation von
4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht einschließlich Mittelwert und
Standardabweichung der sechs Pferde
164
ANHANG
Zeit nach Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Mittel- Standard- Applikation 1 2 3 4 5 6 wert abweichung
[h] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml]
0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 560.4 402.9 454.6 258.1 383.6 579.1 439.8 119.7 3 1389.3 972.3 2979.2 900.0 744.8 866.5 1308.7 847.5 6 1464.6 1218.5 2116.4 751.7 624.6 701.1 1146.2 578.6 9 1251.6 911.1 903.3 555.4 385.0 622.6 771.5 311.7
12 839.8 892.4 424.7 966.6 628.7 522.1 712 219 15 532.2 312.5 1061.2 722.9 458.8 575.5 610 259 24 401.8 657.6 344.8 976.8 189.5 230.8 466.9 299.4 28 552.9 434.0 491.5 859.5 675.9 370.6 564.1 178.6 32 395.1 297.5 308.2 480.3 367.5 248.9 349.6 82.5 36 422.9 237.3 328.5 412.1 216.2 279.4 316.0 87.5 48 146.5 160.6 677.5 183.6 66.7 24.8 209.9 236.9 54 107.4 74.4 50.8 242.7 165.5 86.1 121.2 71.1 60 112.1 78.5 76.9 183.7 216.7 96.2 127.3 58.8
Tab.50: Urinkonzentrationen von Paraxanthin nach einmaliger intravenöser Applikation von
4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht einschließlich Mittelwert und
Standardabweichung der sechs Pferde
165
ANHANG
Zeit nach Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Mittel- Standard- Applikation 1 2 3 4 5 6 wert abweichung
[h] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml]
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.5 71.4 85.1 2112.9 533.9 12744.8 132.1 2613.4 5024.6 1.5 9960.9 7167.7 28413.3 12419.8 12343.8 5120.2 12571.0 8277.4 3 18287.4 11711.5 32806.7 17828.1 41256.3 7551.1 21573.5 12902.0 6 16817.7 18457.9 34106.2 21418.5 32812.8 16358.8 23328.7 8055.4 9 15180.2 23981.4 29340.2 28723.9 27037.0 16365.1 23438 6233
11 12264.5 24569.9 30674.1 26663.9 27477.9 13565.7 22536 7717 13 10651.6 20288.3 26937.0 18662.0 22427.9 12871.8 18639.8 6049.7 15 8828.5 17889.0 21021.4 17470.0 21662.3 11851.1 16453.7 5107.1 24 5898.2 7900.3 20402.5 12603.4 10849.0 11975.3 11604.8 5007.9 30 5449.2 7417.2 11587.2 9299.6 11498.5 11062.9 9385.8 2510.0 48 2361.1 2708.7 9667.2 3327.4 7505.1 3180.0 4791.6 3037.1 54 1427.9 1736.1 3802.4 2776.2 3035.9 3446.6 2704.2 942.2 60 942.8 1521.1 4780.4 502.2 4599.3 739.5 2180.9 1973.3 72 177.3 844.2 1461.3 223.3 1783.4 965.6 909.2 645.4 96 49.4 323.0 557.5 178.5 441.2 321.6 311.9 181.1
108 34.5 133.7 511.1 135.7 256.0 129.7 200.1 167.8 Tab.51: Urinkonzentrationen von Theophyllin nach einmaliger oraler Applikation von
4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht einschließlich Mittelwert und
Standardabweichung der sechs Pferde
166
ANHANG
167
Zeit nach Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Mittel- Standard- Applikation 1 2 3 4 5 6 wert abweichung
[h] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml]
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.5 n.n. n.n. 49.2 n.n. 468.7 40.2 93.0 169.2 1.5 337.2 133.7 923.4 262.6 313.8 281.0 375.3 253.5 3 1311.3 330.8 1262.0 567.7 729.9 303.8 750.9 405.3 6 856.6 842.4 1456.6 801.0 270.8 816.4 840.6 343.2 9 495.0 367.3 1123.6 1006.0 1286.8 1053.6 889 337
11 378.4 425.4 1864.0 1236.0 949.3 1786.4 1107 588 13 374.6 598.3 1218.9 1143.3 483.4 1414.9 872.2 400.4 15 363.8 710.7 542.6 580.2 1004.0 1483.6 780.8 369.6 24 119.1 237.6 433.8 506.5 115.8 524.1 322.8 172.3 30 178.3 217.5 188.9 332.8 250.0 471.0 273.1 102.0 48 67.0 107.6 390.1 96.1 62.6 167.8 148.6 113.4 54 129.2 51.0 82.3 37.6 n.n. 143.6 73.9 50.5 60 50.5 n.n. 36.9 n.n. 156.1 49.2 48.8 52.3 72 n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. 96.0 16.0 35.8 96 n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. 42.1 7.0 15.7
108 n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. 0 0 Tab.52: Urinkonzentrationen von Paraxanthin nach einmaliger oraler Applikation von
4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht einschließlich Mittelwert und
Standardabweichung der sechs Pferde
ANHANG
168
Zeit nach Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Mittel- Standard- Applikation 1 2 3 4 5 6 wert abweichung
[h] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml]
0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 22273.4 10020.9 41224.0 36589.8 33901.0 58824.6 33805.6 16658.0 3 42932.0 66981.5 94889.0 71394.7 65771.8 67199.0 68194.7 16549.1 6 74184.2 93563.2 71217.4 86119.8 51056.6 55081.5 71870.4 16700.2 9 89278.9 42795.9 59565.6 83857.8 35619.1 44578.8 59282.7 22591.0
13 34893.4 35778.3 36331.0 69942.7 33943.6 43899.7 42465 13924 24 25759.8 16667.6 34007.1 18309.4 29235.4 18988.1 23828 6953 28 15536.6 17069.5 25530.4 21890.2 15781.0 18719.9 19087.9 3927.2 36 10808.6 1042.2 16925.8 11609.6 15232.7 10729.5 11058.1 5525.4 48 7095.7 1087.6 8139.0 9861.5 10231.3 4354.8 6795.0 3511.0 72 4767.5 3283.9 3781.0 1475.1 7240.9 13357.0 5650.9 4224.4 96 1055.0 1445.2 1749.5 1395.5 2990.6 5166.6 2300.4 1555.4
120 653.8 245.3 1191.7 390.3 277.0 1798.5 759.4 618.2 144 5443.6 181.9 280.2 63.6 87.3 1060.9 1186.2 2118.4 168 890.6 70.6 55.6 37.0 53.2 475.8 263.8 350.5
Tab.53: Urinkonzentrationen von Theobromin nach einmaliger intravenöser Applikation von
4 mg Theobromin pro kg Körpergewicht einschließlich Mittelwert und
Standardabweichung der sechs Pferde
Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation
„Untersuchung der Pharmakokinetik der Methylxanthine Theophyllin und Theobromin
hinsichtlich der Dopingrelevanz beim Pferd“
selbstständig verfasst habe.
Bei der Anfertigung wurden folgende Hilfen Dritter in Anspruch genommen:
1. Institut für Biochemie der Deutschen Sporthochschule Köln
2. Institut für Tierzucht der Forschungsanstalt für Landwirtschaft (FAL) in Mariensee
Ich habe keine entgeldliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten
(Promotionsberater oder andere Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat von mir
unmittelbar oder mittelbar entgeldliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die im
Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen.
Ich habe die Dissertation an folgendem Institut angefertigt:
1. Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Stiftung Tierärztliche
Hochschule Hannover
Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen
Zweck zur Beurteilung eingereicht.
Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach besten Wissen vollständig und der
Wahrheit entsprechend gemacht habe.
Sophie Koppe Hannover,27.02.2007
DANKSAGUNG
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Manfred Kietzmann für die Überlassung des
Themas und die humorvolle und freundliche Art, Fragen zu beantworten, Probleme zu
beseitigen und immer für die richtige Motivation zu sorgen.
Mein Dank gilt ebenfalls den Mitarbeitern des Instituts für Biochemie der Deutschen
Sporthochschule Köln, insbesondere Prof. Dr. W. Schänzer und Dr. Marc Machnik, Dr. Sven
Guddat, Herrn Andreas Thomas, Herrn Michael Bredehöft und den vielen anderen für die
stets freundliche und aufmunternde Art, mir mit Rat und Tat zur Seite zu stehen.
Ich danke weiterhin Herrn Dr. Michael Düe von der Reiterlichen Vereinigung e.V. für die
Organisation der Versuchspferde und die gute Unterstützung.
Mein Dank gebührt auch Herrn Prof. Dr. Dr. Franz Ellendorf der FAL Mariensee für die
Überlassung der Versuchspferde sowie insbesondere Herrn Jonny Meier und Herrn Heinrich
Wassmann für die sehr freundschaftliche und tatkräftige Unterstützung im Stall.
Ebenso bedanke ich mich bei Herrn Dr. Frank Niedorf für die Unterstützung bei der
statistischen Auswertung der Ergebnisse und bei Herrn Hans Herbert Bohr aus dem Institut
für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule Hannover.
Ich danke ganz besonders meinem Mann, meiner Familie, meiner Kollegin Britta
Kreutzberger und den vielen Freunden, die alle direkt oder indirekt zum Gelingen dieser
Arbeit beigetragen und mich stets unterstützt haben.
Nicht zuletzt danke ich meinen Mitdoktorantinnen Maren und Simone für die stete Hilfe und
Unterstützung.