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Untersuchung des Einflusses organischer Lösungsmittel und

umweltrelevanter Schadstoffe auf das Wachstum und die zelluläre

Fettsäurezusammensetzung von

Thauera aromatica, Geobacter sulfurreducens und

Desulfococcus multivorans

I n a u g u r a l d i s s e r t a t i o n

zur

Erlangung des akademischen Grades

doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)

an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät

der

Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald

vorgelegt von

Ilka Duldhardt

geboren am 26. April 1977

in Schkeuditz

Greifswald, den 23.12.2008

Dekan: Prof. Dr. Klaus Fesser

....................................................................................................................

1. Gutachter : Prof. Dr. Frieder Schauer

....................................................................................................................

2. Gutachter: Prof. Dr. Matthias Boll

....................................................................................................................

Tag der Promotion: 06.04.2009

„Alle Dinge sind Gift und nichts ist ohne Gift;

allein die Dosis macht, dass ein Ding kein Gift ist.“

(Lehrsatz nach Paracellsus)

Inhaltsverzeichnis

4

Inhaltsverzeichnis

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 7

1. EINLEITUNG 9

1.1 Lipophile organische Verbindungen in der Umwelt 9

1.2 Toxizität – Effektive Konzentration – (Q)SAR 10

1.3 Wirkung lipophiler organischer Verbindungen auf bakterielle Membranen 11

1.4 Korrelation zwischen Hydrophobizität organischer Verbindungen und

deren membrantoxischer Wirkung 13

1.5 Membrantoxische Wirkung von organischen Lösungsmitteln 14

1.6 Adaptation von Mikroorganismen an organische Schadstoffe und

Lösungsmittel 15

1.6.1 Zellmembran – Membranfluidität und Membranstabilität 16

1.6.2 Anpassungsmechanismen von Mikroorganismen an lipophile organische

Verbindungen auf Ebene der Zellmembran 20

1.6.2.1 cis-trans-Isomerisierung ungesättigter Phospholipidfettsäuren 21

1.6.2.2 Änderung der Phospholipidkopfgruppen, Steigerung der Phospholipid-

synthese und Änderung der Membranproteinkonzentration 21

1.6.2.3 Änderung des Sättigungsgrades der Membran 22

1.6.2.4 Änderung des Anteils verzweigter Fettsäuren oder des Verzweigungs-typs 24

1.7 Ziel der Arbeit 26

2. MATERIAL UND METHODEN 27

2.1 Mikroorganismen 27

2.2 Zusammensetzung der verwendeten Kulturmedien und Lösungen 27

2.2.1 Flüssigmedium zur Kultivierung von Thauera aromatica 27

2.2.1.1 Phosphat-Puffer-System (Lösung A) 27

2.2.1.2 Mineralsalzlösung (Lösung B) 28

2.2.1.3 Spurenelementelösung (Widdel et al., 1983) 28

2.2.1.4 Vitaminstammlösung 29

2.2.1.5 Elektronendonor 29

2.2.1.6 Elektronenakzeptor 30

2.2.2 Flüssigmedium zur Kultivierung von Geobacter sulfurreducens 30

2.2.2.1 Mineralsalzlösung 30

2.2.2.2 Selenit-Wolframat-Stammlösung (DSMZ Medium 385) 31

2.2.2.3 Bicarbonatlösung 31

2.2.2.4 Spurenelementelösung 31



2.2.2.7 Elektronenakzeptor 33

2.2.3 Flüssigmedium zur Kultivierung von Desulfococcus multivorans 33

2.2.3.1 Mineralsalzlösung 34

2.2.3.2 Bicarbonatlösung 34

2.2.3.3 Spurenelementelösung SL 10 34



2.2.3.6 Reduktionsmittel 36

2.2.4 Lösungen und Puffer 36

2.2.4.1 Lösung für die Trockengewichtsbestimmung 36

2.2.4.2 Lösungen für die ATP-Messung 36

2.2.4.3 Lösung für die Fettsäurebestimmung 37

Inhaltsverzeichnis

5

2.3 Zellkultivierung 37

2.3.1 Kultivierung von T. aromatica unter nitratreduzierenden Bedingungen 37

2.3.2 Kultivierung von T. aromatica in Anwesenheit von Luftsauerstoff 38

2.3.3 Kultivierung von G. sulfurreducens unter fumaratreduzierenden

Bedingungen 38

2.3.4 Kultivierung von D. multivorans unter sulfatreduzierenden Bedingungen 39

2.4 Toxizitätstests 39

2.5 Bestimmung von Wachstumsparametern 40

2.5.1 Bestimmung der Optischen Dichte 40

2.5.2 Bestimmung des Trockengewichts 41

2.5.3 Bestimmung der ATP-Konzentration 41

2.5.4 Bestimmung des Proteingehalts 43

2.6 Bestimmung der zellulären Fettsäurezusammensetzung 44

2.6.1 Lipidextraktion 44

2.6.2 Derivatisierung 44

2.7 Instrumentelle Analysemethoden 45

2.7.1 Hochleistungsflüssigchromatographie 45

2.7.2 Gaschromatographie 46

2.7.3 Headspace-Gaschromatographie –Quantitative Bestimmung der BTEX-

Verbindungen 46

2.7.4 Gaschromatographie/Massenspektrometrie 48

2.8 Chemikalien 49

3. ERGEBNISSE 52

3.1 Toxizitätstests 52

3.1.1 Einfluss verschiedener organischer Lösungsmittel auf das Wachstum von

Thauera aromatica mit Natriumbenzoat als C- und Energiequelle unter

denitrifizierenden Bedingungen 52

3.1.1.1 Einfluss aliphatischer Alkanole auf das Wachstum von T. aromatica unter


3.1.1.2 Einfluss von BTEX-Verbindungen auf das Wachstum von T. aromatica unter


3.1.1.3 Einfluss von (chlor-) phenolischen Verbindungen auf das Wachstum von T. aromatica

unter denitrifizierenden Bedingungen 60

3.1.2 Einfluss von (chlor-) phenolischen Verbindungen auf das Wachstum von

Thauera aromatica in Anwesenheit von Luftsauerstoff 67


Geobacter sulfurreducens 69


Desulfococcus multivorans 72

3.1.5 Quantitative Struktur-Wirkungs-Beziehung (QSAR) für die getesteten

Mikroorganismen 76

3.2 Änderung der zellulären Fettsäurezusammensetzung anaerob kultivierter

Mikroorganismen nach Inkubation mit organischen Lösungsmitteln 79

3.2.1 Änderung der zellulären Fettsäurezusammensetzung von T. aromatica 79

3.2.2 Änderung der zellulären Fettsäurezusammensetzung von

G. sulfurreducens 84

3.2.3 Änderung der zellulären Fettsäurezusammensetzung von D. multivorans 88

4. DISKUSSION 94

4.1 Prüfung der Toxizität 95

4.1.1 Einfluss der Testsubstanzen auf die Substratverwertung von T. aromatica

Inhaltsverzeichnis

6

und D. multivorans 98

4.1.2 Einfluss der Testsubstanzen auf den Biomasseertrag und ATP-Gehalt

während der Verwertung von Benzoat durch T. aromatica unter anaeroben

Bedingungen 99

4.1.3 Einfluss der Testsubstanzen auf das Wachstum von T. aromatica unter

aeroben Bedingungen am Beispiel von (chlor-) phenolischen

Verbindungen 101

4.1.4 Verwertung der organischen lipophilen Testsubstanzen während der

Prüfung auf Toxizität 102

4.2 Änderung der zellulären Fettsäurezusammensetzung anaerob kultivierter

Mikroorganismen nach Inkubation mit organischen Lösungsmitteln 103

4.2.1 Anpassung von T. aromatica und G. sulfurreducens an lipophile, organische

Substanzen - Änderung des Sättigungsgrades 104

4.2.2 Anpassung von D. multivorans an die Anwesenheit lipophiler, organischer

Substanzen 107

5. ZUSAMMENFASSUNG 113

6. ANREGUNGEN FÜR WEITERE UNTERSUCHUNGEN 116

7. LITERATUR 117

8. ANHANG 133

8.1 Berechnung der Volumina leicht-flüchtiger BTEX-Verbindungen 133

8.2 Henry-Koeffizienten 133

8.3 Berechnung der theoretischen Membrankonzentration 134

8.4 Änderung des zellulären Fettsäurespektrums von T. aromatica als

Reaktion auf die Anwesenheit von BTEX-Verbindungen, aliphatischen

n-Alkanolen und verschiedenen (Chlor-) Phenolen 135

8.5 Änderung des zellulären Fettsäurespektrums von G. sulfurreducens als

Reaktion auf die Anwesenheit von BTEX-Verbindungen und

(Chlor-) Phenolen 137

8.6 Änderung des zellulären Fettsäurespektrums von D. multivorans als

Reaktion auf die Anwesenheit von BTEX-Verbindungen, aliphatischen

n-Alkanolen und verschiedenen (Chlor-) Phenolen 141

8.7 Endkonzentrationen – BTEX-Verbindungen 144

8.8 Endkonzentrationen – n-Alkanole 145

8.9 Endkonzentration – (Chlor-) Phenole 145

Abkürzungsverzeichnis

7


Abb. Abbildung

A. dest. Aqua destillata

ATP Adenosintriphosphat

BTEX Benzol, Toluol, Ethylbenzol, Xylol

4-CP 4-Chlorphenol

Cti Enzym: Cis-trans-Isomerase

d lat. dies (Tag)

DDT Dichlordiphenyltrichlorethan

DSMZ Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH

2,4-DCP 2,4-Dichlorphenol

EC engl. Effective Concentration (Effektive Konzentration),

Chemikalienkonzentration, die einen meßbaren Effekt auslöst

EC50 Chemikalienkonzentration, die bei 50 % der untersuchten

Organismen einen meßbaren Effekt verursacht (EC50)

EDTA engl. ethylenediamine tetraacetic acid (Ethylendiamintetraessig-

säure)

et al. lat. et alii (und andere)

FAME engl. fatty acid methyl ester (Fettsäuremethylester)

FA engl. fatty acid (Fettsäure)

FID Flammenionisationsdetektor

GC Gaschromatografie

GC/MS Gaschromatografie/Massenspektroskopie

h lat. hora (Stunde)

HPLC engl. high performance liquid chromatography (Hochleistungs-

flüssigkeitschromatografie)

LD engl. letale dose (tödliche Dosis)

LD 50 Chemikalienkonzentration, die 50 % der untersuchten Organismen

abtötet

log P Logarithmus des Verteilungskoeffizienten einer chemischen Ver-

bindung in einem standardisierten Octanol-Wasser-Gemisch

LOEC Chemikalienkonzentration, die bei den untersuchten Organismen

einen minimalen Effekt auslöst


8

MATC Chemikalienkonzentration, die von den untersuchten Organismen

maximal toleriert wird

Min Minute

mM Millimolar

µ Wachstumsrate

NOEC Chemikalienkonzentration, die keinen meßbaren Effekt auslöst

nm Einheit der Wellenlänge

OD optische Dichte

pH lat. pondus hydrogenii, negativer dekadische Logarithmus der

Protonenkonzentration

PLFA engl. phospholipid fatty acid (Phospholipidfettsäure)

ppm engl. parts per million (Teilchen pro Million)

QSAR engl. quantitative structure-activity relationship (Quantitative Struktur-

Wirkungs-Beziehung)

rpm engl. rotation per minute (Umdrehung pro Minute)

Tab. Tabelle

T

m

Phasentransitionstemperatur

SAR engl. structure-activity relationship (Struktur-Wirkungs-Beziehung)

I. Einleitung

9

1. Einleitung

1.1 Lipophile organische Verbindungen in der Umwelt

In ihrer natürlichen Umgebung werden Mikroorganismen ständig mit organischen

Substanzen konfrontiert, die sie vielfach auch als Nährstoffe nutzen können. Eine

besondere Bedeutung kommt dabei der Gruppe der lipophilen organischen

Verbindungen zu, die sich durch ihre starke Strukturheterogenität auszeichnet. Die

unter natürlichen Bedingungen weit verbreiteten lipophilen Verbindungen werden

beim Zerfall biogener Matrix frei und gelangen so in Form pflanzlicher, tierischer oder

mikrobieller Naturstoffe in die Umwelt.

Mit Beginn der Industrialisierung und Technisierung wurden jedoch in zunehmendem

Maße synthetisch hergestellte oder modifizierte organische lipophile Verbindungen in

die Umwelt eingetragen (Sikkema et al., 1995). Im Gegensatz zu wasserlöslichen

Verbindungen, die in der Regel leichter angreifbar und diffusibel sind, neigen

lipophile organische Verbindungen dazu, in geringem Maße bioverfügbar zu sein und

sich in Nahrungsketten anzureichern.

Mit der Entdeckung zahlreicher Folgen für die Natur, insbesondere für den

Menschen, und der Entwicklung eines zunehmenden Umweltbewußtseins in den

letzten Jahrzehnten, das sich auch in der Politik widerspiegelte, wurden deutschland-

bzw. europaweit zahlreiche Richtlinien erlassen, die u. a. die großtechnische

Produktion gefährdender organischer Verbindungen wie beispielsweise (poly-)

chlorierte Biphenyle (PCB), Dichlordiphenyltrichlorethan (DDT) oder Lindan (γ-

Hexachlorcyclohexan) einschränkten und die Entsorgung belasteter Abfälle regeln.

Zudem gewann die Sicherung und Sanierung von Altlasten zunehmend an

Bedeutung (Becher, 1997; Netzeva et al., 2007). Hierbei rückte u. a. das natürliche

mikrobielle Abbaupotential in Böden und Gewässern in den Mittelpunkt zahlloser

Studien, wobei im Verlaufe der Untersuchungen eine Vielzahl unterschiedlichster,

aerober Mikroorganismen isoliert und identifiziert werden konnte, die in der Lage

sind, verschiedenste organische Verbindungen unter oxischen Bedingungen zu

transformieren, zu metabolisieren oder zu immobilisieren. Sauerstoff übernimmt

dabei nicht nur die Rolle des terminalen Elektronenakzeptors sondern wird vielfach

als Kosubstrat bei Abbauvorgängen selbst in die Schadstoffe integriert. Da

Sauerstoff unter natürlichen Bedingungen in Habitaten wie Grundwasserleitern oder

wassergesättigten Bodenschichten aufgrund geringer O

2

-Transportgeschwindigkeit

I. Einleitung

10

bei gleichzeitig hoher Sauerstoffzehrung jedoch limitiert ist, richtete sich die

Aufmerksamkeit zunehmend auf den Schadstoffabbau unter anoxischen

Bedingungen. Trotz der Abwesenheit von Sauerstoff sind zahlreiche Mikro-

organismen befähigt, lipophile organische Verbindungen unter der Nutzung

alternativer Elektronenakzeptoren wie NO

3

-

, SO

4

2-

, Fe

3+

, Mn

4+

oder CO

2

zu

transformieren oder zu metabolisieren. Obwohl gezeigt werden konnte, dass sowohl

aerobe als auch anaerobe Mikroorganismen unter geeigneten Bedingungen

prinzipiell zum Schadstoffabbau befähigt sind, wurde jedoch auch deutlich, dass der

mikrobielle Abbau von lipophilen organischen Verbindungen u. a. dadurch limitiert

werden kann, dass die eingesetzten Verbindungen toxisch auf die Mikroorganismen

wirkten (Ooyama & Foster, 1965; Pelz & Rehm, 1971; Sikkema & De Bont, 1991).

1.2 Toxizität – Effektive Konzentration – (Q)SAR

Bei der Untersuchung der Toxizität von Chemikalien kann zwischen akuter,

subakuter (subchronischer) und chronischer Toxizität unterschieden werden, wobei

die Einteilung auf der Einwirkdauer der Chemikalie auf die untersuchten Organismen

basiert. Während die akute Toxizität die Giftwirkung beschreibt, die nach einmaliger

Verabreichung auftritt, stellt die subakute bzw. die chronische Toxizität die

Giftwirkung dar, die nach Verabreichung über einen Zeitraum von 1-3 Monaten bzw.

nach mehr als 6 Monaten auftritt (www.umweltlexikononline.de).

Die akute Toxizität wird dabei in der Regel durch die Bestimmung der Chemikalien-

konzentration ermittelt, die 50 % der untersuchten Organismen abtötet (LD 50) oder

die bei 50 % der untersuchten Organismen einen messbaren Effekt (EC50)

verursacht. Im Gegensatz zur akuten Toxizität werden zur Bestimmung subakuter

oder chronischer Giftwirkungen zumeist die Konzentrationen der Chemikalien

ermittelt, die keinen Effekt (NOEC) bzw. einen minimalen Effekt (LOEC) hervorrufen

oder aber es wird die maximal tolerierbare toxische Konzentration erfasst (MATC).

Ende 2006 verabschiedeten der Europäische Rat und das Europaparlament ein

neues Chemikalien-Managementsystem (REACH) zum Schutz der Gesundheit und

Umwelt. Eines der Ziele von REACH besteht darin Alternativen zu Tierversuchen zu

entwickeln, die zur Risikobewertung von Chemikalien eingesetzt werden können.

Eine wichtige Rolle spielen dabei modellbezogene Methoden wie z.B. Struktur-

Wirkungsbeziehungen (SAR) oder quantitative Struktur-Wirkungs-beziehungen

(QSAR), die auf (quantitative) Beziehungen zwischen der chemischen Struktur eines

www.umweltlexikononline.de).

I. Einleitung

11

Moleküls und seiner pharmakologischen, physikalischen, toxikologischen,

biologischen bzw. ökologischen Wirkung verweisen. In der Regel enthalten sie

mathematische Modelle, die die Wirkung von Substanzen – wie beispielsweise die

Toxizität – anhand von Substanzeigenschaften beschreiben, wobei die

Eigenschaften physikochemischer, elektronischer und/oder sterischer Natur sein

können. (Q)SAR’s ermöglichen somit Aussagen bzw. Voraussagen über die

potentielle Toxizität bekannter aber auch unbekannter Substanzen, was von

erheblicher Bedeutung für die Chemikalien ist, zu denen bisher nur wenige oder

keine experimentellen Daten vorliegen und die nicht in großem Maßstab industriell

produziert werden (1-10 t /Jahr, Netzeva et al., 2007).

1.3 Wirkung lipophiler organischer Verbindungen auf bakterielle

Membranen

Die Einflussnahme chemischer Verbindungen auf zelluläre Funktionen und das

Wachstum von Bakterien sind oftmals an die Fähigkeit der Verbindungen gekoppelt,

sich im Lipidanteil der Zellmembran anzureichern (Heipieper et al., 1994; Sikkema et

al., 1994,1995). Besonders lipophile Verbindungen tendieren somit dazu, sich in der

Membran zu lösen und dort zu akkumulieren, was innerhalb des Zellorganells zu

strukturellen und funktionellen Veränderungen führt (Sikkema et al., 1992, 1994,

1995). Die Verteilung organischer Substanzen in der Membran wird durch die

physikochemischen Eigenschaften der Substanzmoleküle bzw. durch eine Vielzahl

verschiedener Umgebungsfaktoren wie Temperatur, Ionenstärke des umgebenden

Mediums beeinflusst (Antunes et al., 1989, 1990; Sikkema et al., 1995).

Eine wichtige Rolle spielt dabei aber auch die Zusammensetzung der Membran.

Sowohl der Gehalt an Membranlipiden als auch der an Membranproteinen

entscheiden darüber, wie gut sich organische Substanzen in der Zellmembran lösen,

wie am Beispiel von Dichlordiphenyltrichlorethan (DDT) und 2,2-bis(p-Chlorphenol)-

1,1,1-trichlorethylen (DDE) gezeigt werden konnte (Donato et al., 1997). Demnach

kann die Modifikation der Membranzusammensetzung die Verteilung der

organischen Verbindung in der Membran massiv verändern bzw. beeinflussen

(Denich et al., 2002; Weber & De Bont, 1996; Sikkema et al., 1995).

Dass besonders die Zusammensetzung der Glycerophospholipide das Lösungs-

verhalten organischer Verbindungen beeinflußt, zeigten Antunes et al. (1984, 1985,

1986, 1987). Sie demonstrierten, dass sich die organischen Verbindungen Malathion,

I. Einleitung

12

Parathion, Lindan (γ-Hexachlorcyclohexan) bzw. DDT (Dichlordiphenyltrichlorethan)

um so besser in Membranen lösten, je kürzer die Acylketten der

Glycerophospholipide waren (siehe Tab. 1)

Aber auch die Anwesenheit von Hopanoiden und Carotinoiden, die in der Membran

eine höhere Packungsdichte der Phospholipide verursachen, führt dazu, dass das

Volumen, in das sich Xenobiotika innerhalb der Membran einlagern können,

verringert wird (Donato et al., 1997b).

Tab. 1: Verteilungskoeffizienten verschiedener hydrophober Verbindungen zwischen einer Membran

und einer wässrigen Phase, in Abhängigkeit von der Membranzusammensetzung, nach Sikkema et

al., 1995

Verteilungskoeffizient in der Membran Organische

Verbindung DMPC

a

DPPC

b

DSPC

c

Referenzen

Malathion 225 135 48 Antunes et al., 1987

Parathion 1950 650 270 Antunes et al., 1984

Lindan 2450 600 50 Antunes et al., 1985

DDT 336000 180000 88000 Antunes et al., 1986

a. DMPC dimyristoylphosphatidylcholin,

b.

DPPC dipamitoylphosphatidylcholin,

c.

DSPC distearoylphosphatidylcholin

Die Tendenz lipophiler organische Substanzen, sich im Lipidanteil von Zyto-

plasmamembranen zu akkumulieren, wird zudem wesentlich durch deren physiko-

chemische Eigenschaften bestimmt, wobei der Hydrophobizität der Substanzen eine

entscheidende Rolle zukommt.

Schon Overton (1896) und Meyer (1899) entwickelten unabhängig voneinander die

Hypothese, nach der sich narkotisch wirksame Substanzen wie z.B. Anästhetika im

Fettgewebe anreichern bzw. nach der die narkotische Wirkung von Anästhetika

durch deren Effekte auf die Zellmembran hervorgerufen wird. Im Verlaufe ihrer

Forschungen konnten sie einen engen Zusammenhang zwischen der Wirksamkeit

von Anästhetika und deren Löslichkeiten in Olivenöl zeigen (zitiert in Sikkema et al.,

1995).

Um zu ermitteln, wie gut sich Substanzen in der Zytoplasmamembran lösen und dort

akkumulieren, ist eine quantitative Bestimmung der Substanzen in der Membran

nötig. Auf die direkte Quantifizierung von organischen Lösungsmitteln in nativen

Membranen wird meist verzichtet, da sie technisch sehr aufwendig ist und in

I. Einleitung

13

Abhängigkeit von der Membranzusammensetzung und -geometrie sehr stark variiert

(Sikkema et al., 1994). Anstelle dessen wird mit künstlich zusammengesetzten bzw.

gereinigten Membransystemen gearbeitet (Denich et al., 2002).

Noch häufiger wird allerdings auf die Bestimmung von Verteilungskoeffizienten der

jeweiligen Substanzen in zweiphasigen Modellsystemen zurückgegriffen. Dabei

handelt es sich um standardisierte Gemische, die zumeist aus einer wässrigen

Phase und einer zweiten organischen Phase, bestehend aus Octanol oder Decanol

bzw. Olivenöl, zusammengesetzt sind (Leo et al., 1971; Verschuren, 1986; Neumann

et al., 2005). Abhängig von der molekularen Struktur und der Größe einzelner

Molekülanteile erfolgt die Verteilung zwischen der wässrigen und organischen Phase

(McKarns et al., 1997).

Von allen Modellsystemen stellte sich das standardisierte 1:1-Gemisch aus Octanol

und Wasser als eines der geeignetsten heraus (Lieb & Stein, 1986). Die dafür

ermittelten Verteilungskoeffizienten verschiedener Substanzen korrelierten gut mit

den Verteilungskoeffizienten, die in einem standardisierten E. coli-Phospholipid-

membran-Puffer-Gemisch ermittelt wurden (Sikkema et al., 1994; Heipieper et al.,

1992, 2007). Dearden (1985) kam zu dem Schluss, dass der Verteilungskoeffizient

einer Substanz zwischen Octanol und Wasser der wichtigste Parameter in Bezug auf

seine biologische Aktivität sei.

1.4 Korrelation zwischen Hydrophobizität organischer Verbindungen und

deren membrantoxischer Wirkung

Die Hydrophobizität bzw. die Lipophilizität einer Substanz wird als Logarithmus des

Verteilungskoeffizienten der Verbindung (log P

o/w

-Wert) definiert, der in einem

standardisierten 1:1-Gemisch aus Octanol und Wasser ermittelt wurde (Hansch et

al., 1963; Hansch & Fujita, 1964; Leo, 1993; Sikkema, 1992, 1994, 1995). Die im

Standard-Octanol-Wasser-Gemisch ermittelten Verteilungskoeffizienten bzw. die log

P

Octanol/Wasser

-Werte der Substanzen korrelieren gut mit deren biologischen Effekten,

wobei Substanzen, deren log P

Octanol/Wasser

-Wert zwischen 1 und 4 liegt, besonders

toxisch auf Mikroorganismen wirken (Laane et al., 1987; Rezessy-Szabo et al.,1987;

Osborn et al., 1990; Sierra-Alvarez & Lettinga, 1991; Sikkema et al., 1994; Heipieper

et al., 2007).

I. Einleitung

14

Weniger lipophile Substanzen, wie z.B. Methanol und Ethanol, deren log P

Octanol/Wasser

-Werte unterhalb von 1 liegen, wirken erst in sehr hohen Konzentrationen

toxisch auf Mikroorganismen (Heipieper et al., 1994; Weber & De Bont, 1996). Liegt

der log P

Octanol/Wasser

über einem Wert von 4, sind die Substanzen aufgrund ihrer

niedrigen Wasserlöslichkeit in zu geringem Maße verfügbar, um noch toxisch auf

Mikroorganismen wirken zu können (Inoue & Horikoshi, 1991; Vermue et al., 1994;

Neumann et al., 2005; Heipieper et al., 2006). Flüssige organische Substanzen mit

einem log P

Octanol/Wasser

> 4 können aus diesem Grund als zweite inerte Phase in

Biotranformationsreaktionen eingesetzt werden, wobei sie dort als Reservoir für

toxische Verbindungen dienen (Laane, 1987; Neumann et al., 2006).

Für Substanzen mit einen log P

Octanol/Wasser

-Wert, der zwischen 1 und 4 liegt, zeigte

sich ein linearer Zusammenhang zwischen ihrer Hydrophobizität und ihrer Wirkung

auf Mikroorganismen. Diese Substanzen wirken schon in geringen Konzentrationen

toxisch, wobei ihre Wirkung umso stärker ist, je hydrophober sie sind bzw. je größer

ihre log P

Octanol/Wasser

-Werte sind.

1.5 Membrantoxische Wirkung von organischen Lösungsmitteln

Wie schon im vorangegangen Kapitel erwähnt, stellt die Zellmembran eines der

Hauptangriffspunkte für organischer Verbindungen dar (Sikkema et al., 1992, 1994,

1995). Die Substanzen akkumulieren sich besonders im hydrophoben Teil der

Membran. Dort stören sie die intermolekularen Wechselwirkungen (van der Waals-

Kräfte, hydrophobe Wechselwirkungen) zwischen einzelnen Lipiden bzw.

Lipidfettsäuren und rufen damit eine deutliche Erhöhung der Membranfluidität bzw.

eine Abnahme der Membranviskosität hervor. Die sich einlagernden

Lösungsmittelmoleküle beeinflussen zudem die Ordnung und Packungsdichte der

Membranlipide (Weber & De Bont, 1996; Denich et al., 2002) und verursachen ein

Anschwellen der Membran, infolge dessen es zu Rupturen des Organells kommt

(van der Meer, 1984; Antunes et al., 1989,1990).

Von weitaus zentralerer Bedeutung für die Membranphysiologie ist der Fakt, dass die

Anreicherung von Lösungsmittelmolekülen zu einer deutlichen Erhöhung der

Membranpermeabilität führt (De Smet et al., 1978; van der Meer, 1984; Sikkema et

al., 1992, 1994, 1995). Die erhöhte Durchlässigkeit der Membran bewirkt einen

Austritt von Ionen (K

+

, PO

4

3-

), kleineren Molekülen (ATP) und Makromolekülen (RNS,

I. Einleitung

15

Proteinen, Phospholipiden) aus den Zellen (Jackson & de Moss, 1965; Lambert &

Hammond, 1973; Heipieper et al., 1991; Diefenbach et al., 1992; Isken & De Bont,

1998).

Infolge der erhöhten Membranpermeabilität kommt es – verursacht durch einen

verstärkten Flux von Protonen zurück in die Zelle – zum Zusammenbruch des

Energiehaushaltes der Zellen, da der Aufbau von Membranpotential (ΔΨ) bzw.

Protonengradienten (ΔpH) teilweise oder vollständig gehemmt wird. (Bowles &

Ellefson, 1985, Sikkema et al., 1992). Zudem kann dabei der Abfall des

intrazellulären pH-Wertes erfasst werden (Huang et al., 1985; Terracciano & Kashet,

1986).

Neben eingeschränkten Lipid-Lipid-Interaktionen werden ebenfalls Wechsel-

wirkungen zwischen Lipiden und integralen bzw. assoziierten Membranproteinen

(ATPasen, Transferasen, Zweikomponentensysteme) beeinflusst, was wiederum zu

einer Änderungen der Proteinkonformation führen und einen Funktionsverlust der

Proteine bewirken kann (Sikkema et al., 1995; Casal et al., 1998; Isken & De Bont,

1998; Denich et al., 2002).

1.6 Adaptation von Mikroorganismen an organische Schadstoffe und

Lösungsmittel

Mikroorganismen besitzen eine ausgeprägte metabolische und strukturelle

Flexibilität, die es ihnen ermöglicht, sich an unterschiedlichste Stresssituationen wie

beispielsweise die Änderungen des pH-Wertes, der Temperatur, der

Salzkonzentration, der Nährstoffkonzentration oder aber der Anwesenheit von

organischen Lösungsmitteln anzupassen. Schon Inoue und Horikoshi (1989) zeigten,

dass einige Mikroorganismen in der Lage sind, sich an die Anwesenheit sehr hoher

Lösungsmittelkonzentration zu adaptieren.

In der bestehenden Literatur sind zahlreiche Anpassungsreaktionen aerober

Bakterien an Lösungsmittelstress beschrieben. Dazu zählen u. a. die Veränderungen

der Zellmorphologie, Anpassungen innerhalb des zellulären Energiestatus, aktive

Exkretion von Lösungsmittel, Transformationsreaktionen bzw. die Metabolisierung

von Xenobiotika. Zudem können strukturelle Änderungen der Zellumhüllung und die

damit verbundenen Änderungen von Oberflächeneigenschaften beobachtet werden

(Neumann, 2006; Heipieper et al., 2007; Abb. 1).

I. Einleitung

16

Abb. 1: Mögliche mikrobielle Anpassungs-

strategien an membranaktive Lösungsmittel,

(vgl. Sikkema et al, 1995; Isken & DeBont,

1997, Isken & Heipieper, 2002)

(I.) Morphologische Änderungen

(II.) Änderungen des zellulären Energiestatus

(III.) Änderung der Membranfluidität

(IV.) Änderung der Zellwand und der äußeren

Membran (V.) Änderung der Zelloberflächen-

eigenschaften (Oberflächenladung und -hydro-

phobizität) (VI.) Transformation oder Abbau des

organischen Lösungsmittels (VII.) Aktive

Exkretion der organischen Verbindung

(VIII.) Veränderung der Membranproteine

Im Folgenden werden nur mögliche Änderungen der Zellmembranen als

Adaptationsmechanismen an organische lipophile Verbindungen etwas detaillierter

besprochen. Die weiteren mikrobiellen Anpassungsstrategien wurden ausführlich in

den Publikationen von Sikkema et al. (1995), Isken et al. (1998), Neumann (2006)

und Heipieper et al. (2007) erläutert.

1.6.1 Zellmembran – Membranfluidität und Membranstabilität

Seit Einführung des „fluid Mosaic“-Modells 1972 durch Singer und Nicolson, welches

die Zytoplasmamembran als dynamische Struktur beschreibt – bestehend aus einer

Phospholipid-Doppelschicht als primärem Strukturelement und darin eingebetteten

Proteinen, die sich frei innerhalb der Doppelschicht bewegen können – gab es

Versuche, die Fluidität der Membran zu bestimmen. Die Parameter, die am ehesten

zu einer Beschreibung der Fluidität herangezogen werden können, sind Ordnung,

Packungsdichte und Permeabilität der Membran (Weber & De Bont, 1996; Denich et

al., 2002).

Um den Ordnungsgrad von Membranen und somit indirekt auch deren Fluidität zu

beschreiben, nutzt man die Bestimmung der Phasentransitionstemperatur (T

m

).

Dabei handelt es sich um die Temperatur, die aufgewandt werden muss, um eine

Membran von einer lamellaren Gel-Phase, in der die Fettsäureketten geordnet und

Anpassungs-

strategien

an organische

Lösungs-

mittel

I. Einleitung

17

dicht gepackt vorliegen, in eine lamellare liquid-kristalline Phase zu überführen, in

der die Acylketten (Fettsäureketten) ungeordnet vorliegen und somit keine hohe

Packungsdichte zulassen (Weber & De Bont, 1996; Heipieper et al., 2007).

Die Phasentransitionstemperatur und somit auch die Fluidität werden maßgeblich

durch die Phospholipide bzw. Phospholipidzusammensetzung beeinflusst. So führt

die Zunahme der Kettenlänge der Fettsäuren zu einer deutlichen Vermehrung der

Interaktionen (van der Waals-Kräfte) zwischen den Fettsäureketten. Folglich muss

mehr Energie aufgewendet werden, um die Interaktionen zwischen den

Fettsäureketten zu unterbrechen und die Unordnung innerhalb der Membran zu

erhöhen: somit steigt T

m

an (siehe Tab. 2).

Im Gegensatz dazu bewirkt die Einführung von cis-Doppelbindungen bzw. die

Einlagerung von anteiso-verzweigten Fettsäuren eine Erniedrigung der T

m

(siehe

Tabelle 2), da Doppelbindungen zur Ausbildung von starren Knicken in den

Fettsäuremolekülen führen bzw. Verzweigungen eine dichte Packung der Ketten

behindern. Infolgedessen kommt es zu deutlich schwächer ausgeprägten

hydrophoben Wechselwirkungen zwischen den Acylketten und dementsprechend ist

weniger Energie nötig, um die Ordnung im System zu verringern.

Tab. 2: Transitionstemperaturen (T

m

) verschiedener Phospholipidfettsäuren

Fettsäure T

m

[°C]

n-C14:0

a

53,9

n-C15:0

a

52,5

n-C16:0

a

63,1

n-C17:0

a

61,3

n-C18:0

a

69,6

n-C16:1

cis, Δ9

b

0

n-C16:1

trans Δ9

b

33,0

iso-C15:0

a

51,7

iso-C17:0

a

60,2

anteiso-C15:0

a

23,0

anteiso-C17:0

a

36,8

a

nach Kaneda et al., 1991

b

nach Neumann, 2006

Die Phasentransitionstemperatur wird jedoch nicht nur durch die Fettsäureketten

sondern auch durch die Art der polaren Phospholipidkopfgruppen beeinflusst. So

I. Einleitung

18

zeigt beispielsweise Phosphatidylglycerin eine geringere T

m

als Phosphatidyl-

ethanolamin: ungeachtet einer gleichen Fettsäureausstattung (siehe Tab. 3).

Die Phasenumwandlung findet eher in einem bestimmten Schmelzbereich als an

einem scharf abgegrenzten Schmelzpunkt statt, denn, obwohl die Fluidität der

Doppelschicht am Schmelzpunkt beträchtlich zunimmt, steigt sie auch oberhalb von

T

m

langsam weiter.


m

) von wässrigen Phospholipid-Suspensionen nach Vance et al.,

1998

Phospholipide T

m

[°C]

Di-14:0-Phosphatidylethanolamin 51

Di-16:0-Phosphatidylethanolamin 63

1-18:0, 2 18:1

Δ9

-Phosphatidylethanolamin 3

Di-14:0-Phosphatidylglycerin 23

Di-16:0-Phosphatidylglycerin 41

In eukaryontischen Organismen bewirken Substanzen wie Cholesterol oder

Ergosterol eine Verbreiterung des Schmelzbereiches. Unterhalb von T

m

führen sie zu

einer Unordnung in der Membran, da sie eine dichte Packung der Acylketten

verhindern. Oberhalb der T

m

verhindern sie aufgrund ihre Größe und ihrer geringen

Flexibilität eine zu starke Entropiezunahme in der Membran (Weber & De Bont,

1996; Vance et al., 1998). Anstelle der Steroide, die nur in Eukaryonten

nachgewiesen werden, können in prokaryontischen Lebewesen Hopanoide

vorkommen.

Wie bereits erwähnt, ist die Fluidität der Membran eng mit der Packung der

Membranlipide verknüpft, die wiederum von der effektiven Geometrie der

Lipidmoleküle abhängt (Israelachivilli et al., 1976, 1977; Gruner et al., 1985). Die

Geometrie von Lipiden und somit auch ihre Packung lässt sich mit Hilfe des

dimensionslosen Packungsparameters (v*l)/a ermitteln, wobei a die Wasser-

Kopfgruppen-Grenzfläche, l die Länge und v das Volumen der Acylketten definieren

(Cullis & de Kruijff, 1979; Hazel et al., 1990; Weber & De Bont, 1996).

Anhand dieses Parameters lassen sich Lipide in konische, zylindrische und

umgekehrt konische Lipide einteilen (siehe Abb. 2). Die Lipide, deren

Packungsparameter zwischen 0,5-1 liegt, zeigen die Form eines Zylinders. Liegt der

Packungsparameter bei > 1, besitzt das entsprechende Glycerophospholipid die

I. Einleitung

19

Hexagonal Typ IIBilayerHexagonal Typ I

oder Micellar

Konfiguration

der

Phospholipide

> 1,00,5 – 1,0< 0,5

Packungs-

parameter

(v*l)/a

• kleine Kopfgruppen

• Anstieg ungesättigter

oder verzweigter

Fettsäuren

• große Kopfgruppen

• einzelne Acylkette

• kurze Acylketten

Faktoren, die die

Packungs-

geometrie

beeinflussen

Molekülform

Hexagonal Typ IIBilayerHexagonal Typ I

oder Micellar

Konfiguration

der

Phospholipide

> 1,00,5 – 1,0< 0,5

Packungs-

parameter

(v*l)/a

• kleine Kopfgruppen

• Anstieg ungesättigter

oder verzweigter

Fettsäuren

• große Kopfgruppen

• einzelne Acylkette

• kurze Acylketten

Faktoren, die die

Packungs-

geometrie

beeinflussen

Molekülform

Form eines Konus. Eine solche Form tritt auf, wenn das Glycerophospholipid eine

kleine Kopfgruppe aufweist, wie z.B. Ethanolamin, Cholin und Serin, oder aber wenn

es ungesättigte oder verzweigte Acylketten trägt (Cullis & de Kruijff; 1979; Hazel et

al., 1990; Weber & De Bont, 1996; Denich et al., 2002). Die Form eines umgekehrten

Konus (Packungsparameter < 0,33) tritt gewöhnlich nicht bei Glycerophospholipiden

mit 2 Acylketten auf. Sind jedoch die Acylketten sehr kurz (6-8 C-Atome) und die

Kopfgruppe sehr groß, kann das Glycerophospholipid die Form eines umgekehrten

Konus annehmen (Hazel et al., 1990; Denich et al., 2002).

Während zylinderförmige Glycerophospholipide als „bilayer-bildende“ Lipide

bezeichnet werden, zählt man Lipide mit konischer bzw. umgekehrt konischer Form

zu den „nicht-bilayer-bildende“ oder nicht-lamellare Lipide (siehe Abb. 2).

Jede biologische Membran muss sowohl bilayer-bildende als auch nicht-bilayer-

bildende Lipide enthalten, denn nur dadurch kann gewährleistet werden, dass sich

Krümmungen oder Wölbungen der Membran ausbilden. Somit kann eine optimale

Packung der Membranlipide niemals nur durch einen einzigen Lipidtyp erreicht

werden (Cullis & de Kruijff, 1979; Wieslander et al., 1980; Rilfors et al., 1984).

Abb. 2: Molekülform ver-

schiedener Phospho-lipide

und ihre korrespondierende

polymorphe Lipidphase,

nach Weber & De Bont, 1996

Dementsprechend ist ein ausgewogenes Verhältnis zwischen bilayer- und nicht-

bilayer-bildenden Lipiden entscheidend für die Aufrechterhaltung der strukturellen

und funktionellen Integrität der Membran (Denich et al., 2002), wobei

I. Einleitung

20

Mikroorganismen die Tendenz aufweisen, hexagonale Strukturen (H

II

) zu bilden

(Weber & De Bont, 1996).

Zudem wird vermutet, dass Membranareale, die vorrangig nicht-lamellaren Lipide

enthalten, bei Zellteilung, Membranfusion, Endo- bzw. Exocytoseprozessen und bei

Transportvorgängen von Proteinen und Lipiden zwischen den Monolayern von

Bedeutung sind (Cullis & de Kruijff, 1979; Siegel et al., 1986; Lindblom & Rilfors,

1989; Seddon et al., 1990; Norris et al., 1992; Denich et al., 2002).

Neben der Lipidgeometrie wird die Packung der Lipide in der Membran durch den

Anteil von Wasser, Proteinen und Kohlenhydraten in der Membran, aber auch durch

den pH-Wert des umgebenden Mediums, die Temperatur und die Anwesenheit

zweiwertiger Kationen beeinflusst (Cullis & de Kruijff, 1979; Rilfors et al., 1984;

Seddon et al., 1990).

1.6.2 Anpassungsmechanismen von Mikroorganismen an lipophile organische

Verbindungen auf Ebene der Zellmembran

In zahlreichen Studien konnte gezeigt werden, dass Interaktionen zwischen

Membranen und organischen Verbindungen die Phasentransitionstemperatur und

somit die Fluidität von Membranen beeinflussen (Eliasz et al., 1976; van der Meer,

1984; Weber & De Bont, 1996; Sikkema et al., 1995). Als Reaktion auf die

Anwesenheit lipophiler, organischer Verbindungen zeigen Mikroorganismen

zahlreiche Adaptationsmechanismen bezüglich ihrer Membranlipide und -proteine,

mit deren Hilfe sie in der Lage sind, den Effekten, die durch die Anreicherung

lipophiler Substanzen innerhalb der Zytoplasmamembran verursacht wurden,

entgegenzuwirken (Weber & De Bont, 1996). Diese Anpassungsmechanismen

ermöglichen die weitestgehende Wiederherstellung bzw. die Erhaltung der

Membranfluidität und des Ordnungsgrades der Membranlipide. Aufgrund der

Modifikation der Membranzusammensetzung kann es zu einer verminderten

Aufnahme der Lösungsmittel in die Membran und somit zu einer Reduktion der

Lösungsmittelkonzentration kommen, was zu einer Minderung der Toxizität führt

(Keweloh et al., 1990; Weber & De Bont, 1996).

Zu den häufigsten Mechanismen, die aerob lebende Mikroorganismen nutzen, um

ihre Zellmembranen an die Anwesenheit lipophiler, organischer Verbindungen

anzupassen, zählen u. a.: (I.) cis-trans-Isomerisierung ungesättigter Phospholipid-

fettsäuren, (II.) Änderung der Phospholipid-Kopfgruppen, (III.) Änderung der

I. Einleitung

21

Membranproteinkonzentration, (IV.) Erhöhung der Phospholipidbiosynthese, (V.)

Änderung des Sättigungsgrades der ungesättigten Phospholipidfettsäuren und (VI.)

Änderung des Anteils verzweigter Fettsäuren oder des Verzweigungstyps (Rosas et

al., 1980; Isken & De Bont, 1998; Denich et al., 2003; Heipieper et al., 2007).

1.6.2.1 cis-trans-Isomerisierung ungesättigter Phospholipidfettsäuren

Ein Mechanismus, der verschiedenen Pseudomonas- und Vibrio-Stämmen eine

Anpassung der Membranfluidität an wechselnde Umweltbedingungen ermöglicht,

stellt eine Isomerisierungsreaktion dar, bei der die Doppelbindung einfach

ungesättigter Phospholipidfettsäuren von der cis- in die entsprechende trans–

Konfiguration überführt wird (Diefenbach et al., 1992; Keweloh & Heipieper, 1996;

Isken & De Bont, 1998; Heipieper et al., 1992, 2003, 2007). Die Umwandlung der

Fettsäure-Isomere wird durch die Cis-trans-Isomerase (Cti) katalysiert, ein Enzym,

das konstitutiv im Periplasma der Bakterien lokalisiert ist und für die Reaktion weder

Energie noch Kofaktoren benötigt (Diefenbach et al., 1992, 1994; Holtwick et al.,

1997; Junker et al., 1999; Heipieper et al., 2003; von Wallbrunn et al., 2003).

Aufgrund der voneinander abweichenden räumlichen Anordnung der Atome im

Fettsäuremolekül ergeben sich unterschiedliche physikochemische Eigenschaften

der beiden Isomere cis und trans (Weber & De Bont, 1996).

Die cis-trans-Isomerisierung und der damit verbundene Anstieg des trans-cis-

Verhältnisses der ungesättigten Fettsäuren konnte bisher sowohl in Anwesenheit von

membranaktiven Lösungsmitteln wie Toluol, Styrol, Phenol aber auch in Gegenwart

von Antibiotika (Polymyxin, Nigericin), Schwermetallen (Cd

2+

und Zn

2+

) oder als

Antwort auf Hunger, Hitzestress bzw. osmotischen Stress beobachtet werden (Booth,

1985; Guckert et al., 1986; Heipieper et al., 1991, 1992, 1994, 1995, 1996; Isken et

al., 1997).

1.6.2.2 Änderung der Phospholipidkopfgruppen, Steigerung der

Phospholipidsynthese und Änderung der Membranproteinkonzentration

Die Modifikationen der Phospholipidkopfgruppenzusammensetzung, wie sie als

Reaktion auf die Zugabe von Lösungsmitteln bereits mehrfach beschrieben wurden,

führen mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit zu einer Änderungen der Oberflächen-

ladungen, der Ordnung und der Fluidität der Membran (Weber, 1994, 1996; Pinkart &

White, 1997; Ramos et al., 1997, 2002). So konnte in den beiden

lösungsmitteltoleranten Stämmen P. putida S12 und P. putida DOT-T1E, in deren

I. Einleitung

22

Membranen vorrangig Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylglycerol und

Cardiolipin als Phospholipidkopfgruppen nachweisbar waren, nach der Inkubation mit

Toluol eine Erhöhung des Cardiolipingehaltes bzw. eine Verminderung des

Phosphatidylethanolamingehaltes bestimmt werden (Weber, 1994, 1996; Ramos et

al., 1997, 2002).

Währenddessen baute P. putida IDAHO, ein weiterer lösungsmitteltoleranter Stamm,

in Gegenwart von o-Xylol anstelle von Phosphatidylglycerol verstärkt Phosphatidyl-

ethanolamin in seine Membranen ein. Phosphatidylethanolamin ist im Gegensatz zu

Phosphatidylglycerol kleiner; erlaubt aber stärkere Wechselwirkungen zwischen

Fettsäuren. Ein verstärkter Einbau von Phosphatidylethanolamin führt somit zu einer

Erhöhung des Schmelzpunktes der Membran. Zusätzlich dazu wurde nach Zugabe

von o-Xylol (200 ppm) ein Anstieg des Gesamtphospholipidfettsäuregehaltes

nachgewiesen. Die verstärkte Biosynthese der Phospholipidfettsäuren versetzten

den lösungsmitteltoleranten Stamm offenbar in die Lage, entstandene Schäden

durch das Xenobiotikum relativ schnell zu beheben (Pinkart & White, 1997).

Einen Anstieg einfach ungesättigter Fettsäuren, der eine Erhöhung der

Membranfluidität und eine Verringerung des Ordnungsgrades der Membran-

phospholipide zur Folge hatte, wurde für Zellen von E. coli nach Kultivierung mit

Ethanol bzw. Phenol gezeigt. Um der Erhöhung der Membranfluidität

entgegenzuwirken, bauten die Zellen verstärkt Proteine in ihre Membranen ein,

womit sich das Verhältnis von Proteinen zu Lipiden erhöhte (Dombeck & Ingram,

1984; Keweloh et al., 1990). Ein dosisabhängiger Anstieg des Proteingehaltes in der

Zytoplasmamembran war ebenfalls in den Zellen von Zymomonas mobilis

nachweisbar, die in Gegenwart von Ethanol gewachsen waren (Carey & Ingram,

1983).

1.6.2.3 Änderung des Sättigungsgrades der Membran

Um die Effekte, die durch Änderungen der Wachstumstemperatur oder durch

organische lipophile Substanzen in der Membran verursacht werden, kompensieren

zu können, verändern Mikroorganismen das Verhältnis zwischen gesättigten und

ungesättigten Fettsäuren ihrer Membranlipide, welches auch als Sättigungsgrad

bezeichnet wird (Marr & Ingraham, 1962; Ingram, 1976, 1977; Ingram & Buttke,

1984). Die Änderung des Sättigungsgrades stellt einen der wichtigsten zellulären

Adaptationsmechanismen von Mikroorganismen dar, welcher es den Organismen

I. Einleitung

23

ermöglicht, die Fluidität ihrer Membran aufrecht zu erhalten (Ingram, 1976, 1977;

Isken & De Bont, 1998). Die Stabilisierung der Membranfluidität wird auch als

„homeoviskose Adaptation“ bezeichnet (Sinensky, 1974).

Um der fluidisierenden Wirkung apolarer lipophiler Substanzen wie Benzol, Toluol,

Styrol entgegenzuwirken, zeigen zahlreiche Mikroorganismen eine Erhöhung des

Sättigungsgrades, analog zu einer Anpassung an höhere Wachstumstemperaturen

(Weber et al., 1993; Sikkema et al., 1995; Pinkart, 1996). Die Erhöhung des

Sättigungsgrades der Membranlipide ist hierbei auf eine Zunahme gesättigter

Fettsäuren zurückzuführen. Im Unterschied zu ungesättigten Fettsäuren,

ermöglichen die geradlinig angeordneten Acylketten eine höhere Packungsdichte der

Fettsäuremoleküle in der Membran. Aufgrund der wesentlich stärkeren Interaktionen

müssen deutlich höhere Temperaturen bzw. höherer Konzentration lipophiler,

organischer Lösungsmittel aufgewandt werden, um die Interaktionen zwischen den

Fettsäureketten zu unterbrechen und die Unordnung innerhalb der Membran zu

erhöhen.

Im Gegensatz zu der bisher betrachteten Erhöhung des Sättigungsgrades, reagieren

einige Mikroorganismen auf die Anwesenheit relativ polarer organischer

Verbindungen, wie z.B. Aceton, Dimethylsulfoxid oder aber kurzkettiger aliphatischer

Alkanole wie Ethanol, mit einer Verminderung des Sättigungsgrades (Ingram, 1976,

1977). So konnte beispielsweise eine Verminderung des Sättigungsgrades, die auf

dem Anstieg einfach ungesättigter Fettsäuren und dem Abfall der gesättigten

Fettsäuren basiert, in Gegenwart von Ethanol u. a. bei Acinetobacter calcoaceticus,

Comamonas testosteroni, Escherichia coli, einigen Lactobacillus-Arten, sowie

einzelnen Hefen nachgewiesen werden (Ingram, 1976, 1977; Buttke & Ingram

1978a, b; Uchida, 1975a, b; Beaven et al., 1982; Mishra & Prasad,1989 a, b; Kabelitz

et al., 2003; Loffhagen et al., 2005).

Andererseits wird ebenfalls über eine Erhöhung des Sättigungsgrades in

Anwesenheit von Ethanol berichtet (Rigomier et al., 1980). Während die Erhöhung

des Sättigungsgrades in Anwesenheit kurzkettiger Alkohole eher dazu dient um die

steigenden Unordnung der Membranlipide und somit die steigenden Membranfluidität

entgegenzuwirken, die durch die eingelagerten Lösungsmittelmoleküle ausgelöst

werden, ermöglicht die Zunahme ungesättigter Fettsäuren eine Einflussnahme auf

die Stabilität der Membrandoppelschicht (Weber & De Bont, 1996).

I. Einleitung

24

1.6.2.4 Änderung des Anteils verzweigter Fettsäuren oder des Verzweigungs-

typs

Mikroorganismen, insbesondere Gram-positive Bakterien, können relativ große

Anteile verzweigter Fettsäuren in ihren Membranlipiden enthalten (Kaneda, 1991;

Russell & Fukunaga, 1994). Methylverzweigungen treten sehr häufig am zweiten C-

Atom (iso-Verzweigung) oder dritten C-Atom (anteiso-Verzweigung) ausgehend vom

Methylterminus auf. Sie lassen ähnlich wie cis-Doppelbindungen ungesättigter

Fettsäuren nur eine geringe Packungsdichte der Acylketten zu, was in Membranen,

die verstärkt verzweigte Fettsäuren enthalten, zu einer erhöhten Membranenfluidität

führt (Kaneda, 1991; Russell & Fukunaga, 1994).

Aber obwohl Methylverzweigungen, verglichen mit cis-Doppelbindungen unge-

sättigter Fettsäuren zu einem relativ geordneten Zustand der liquid-kristallinen Phase

führen, verursachen sie einen relativ ungeordneten Zustand der Gelphase (Russell,

1995). Aufgrund der Eindringtiefe der beiden Termini der Verzweigungen in die

Kohlenwasserstoffumgebung wirken sich anteiso-Verzweigungen wesentlich

störender aus als iso-Verzweigungen (MacDonald et al., 1983, 1985; Russell, 1995).

Allerdings liegen bislang nur wenige Informationen über zelluläre Mechanismen vor,

die Mikroorganismen, die vorrangig verzweigte Fettsäuren aufweisen, eine

Anpassung an Lösungsmittel ermöglichen. Bisher konnte sowohl eine Ab- bzw.

Zunahme verzweigter Fettsäuren als auch eine Änderung der Verzweigungstypen als

Reaktion der entsprechenden Mikroorganismen auf die Anwesenheit organischer

Lösungsmittel erfasst werden. So wurde nach Applikation von Ethanol bzw. nach

Zugabe von DDT zu Zellen von Bacillus subtilis bzw. Bacillus stearothermophilus

eine Verminderung des Anteils verzweigter Fettsäuren innerhalb des

Gesamtfettsäuregehaltes festgestellt (Rigomier et al., 1980; Donato et al., 1997).

Im Gegensatz dazu erfassten Tsitko und Mitarbeiter (1999) in fructosekultivierten

Zellen von Rhodococcus opacus nach Zugabe unterschiedlicher lipophiler,

organischer Lösungsmittel einen Anstieg 10-methylverzweigter Fettsäuren bei

gleichzeitiger Verminderung ungesättigter Fettsäuren. Ebenfalls eine Erhöhung der

verzweigten Fettsäuren wurde u. a. in Zellen von Bacillus cereus oder des extrem

lösungsmitteltoleranten Staphylococcus haemolyticus in Anwesenheit von Ethanol

und Propanol bzw. Toluol ermittelt (Kates et al., 1962; Nielsen et al., 2005).

Außer der Verschiebung des Anteils verzweigter Fettsäuren innerhalb der

Gesamtfettsäuren kann auch eine Verschiebung zwischen den beiden Ver-

I. Einleitung

25

zweigungstypen erfasst werden. So zeigten beispielsweise die Zellen von

Arthrobacter chlorophenolicus in Anwesenheit von Phenol, 4-Chlorphenol und 4-

Nitrophenol eine Abnahme anteiso-verzweigter bzw. relativ dazu eine Zunahme iso-

verzweigter Fettsäuren (Unell et al., 2007).

I. Einleitung

26

1.7 Ziel der Arbeit

Aufgrund ihres weiten industriellen Anwendungsspektrums kommen organische

Lösungsmittel seit Beginn der industriellen Revolution in verstärktem Maße in der

Umwelt vor. Mit der Entdeckung der Folgen, die sich daraus für Mensch und Natur

ergeben, rückte das mikrobielle Abbaupotential in Wasser und Boden in den letzten

Jahrzehnten in den Blickpunkt der Forschung. Da unter natürlichen Bedingungen die

Anwesenheit von Sauerstoff in kontaminierten unterirdischen Habitaten oftmals

limitiert ist, richtet sich die Aufmerksamkeit zunehmend auf den Schadstoffabbau

unter anoxischen Bedingungen. Dabei gelang es, zahlreiche Mikroorganismen zu

isolieren, die die Fähigkeit zum Schadstoffabbau unter anaeroben Bedingungen

besitzen. Aber trotz der prinzipiellen Fähigkeit zum Schadstoffabbau wurde auch

klar, dass der mikrobielle Abbau sowohl unter oxischen als auch unter anoxischen

Bedingungen auch durch die toxische Wirkung der Schadstoffe begrenzt wird.

Während jedoch zahlreiche Berichte über die Wirkungen organischer Verbindungen

auf Mikroorganismen, die unter oxischen Bedingungen kultiviert wurden bzw. deren

Anpassungsmechanismen an organische Lösungsmittel bzw. Schadstoffe existieren,

liegen nur wenige Informationen für fakultativ anaerobe bzw. obligat anaerobe

Bakterien vor. Aus diesem Grund bestand eines der Ziele der vorliegenden

Dissertation in einer systematischen Untersuchung des Effektes verschiedener

umweltrelevanter organischer Verbindungen auf ausgewählte, unter anaeroben

Bedingungen kultivierte Mikroorganismen. Dazu wurde u. a. der Einfluss der BTEX-

Verbindungen (Benzol, Toluol, Ethylbenzol, Xylol), der aliphatischen n-Alkanole (n-

Butanol, n-Hexanol, n-Octanol) bzw. der (chlor-) phenolischen Verbindungen

(Phenol, 4-Chlorphenol, 2,4-Dichlorphenol), auf das Wachstum und die Physiologie

ausgewählter Mikroorganismen unter anaeroben Bedingungen untersucht.

Stellvertretend für die drei großen anaeroben Stoffwechselgruppierungen der

Denitrifizierer, Fe

3+

-Reduzierer und Sulfatreduzierer wurden dazu die drei

Testorganismen Thauera aromatica, Geobacter sulfurreducens und Desulfococcus

multivorans ausgewählt.

Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, nach möglichen Anpassungsmechanismen

fakultativ bzw. obligat anaerob lebender Mikroorganismen an organische

Lösungsmittel bzw. Schadstoffe zu suchen, wobei das Hauptaugenmerk dabei auf

mögliche Modifikationen der zellulären Fettsäurezusammensetzung gelegt wurde.

II. Material und Methoden

27

2. Material und Methoden

2.1 Mikroorganismen

Im Zuge dieser Untersuchungen wurde mit drei unterschiedlichen Bakterienstämmen

gearbeitet, die in der Lage sind, in unter anaeroben Bedingungen unter der Nutzung

alternativer Elektronenakzeptoren zu wachsen (Tab. 4). Alle verwendeten Stämme

wurden von der Deutschen Stammsammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen

(DSMZ) erworben.

Tab. 4: Übersicht über die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Mikroorganismen

Organismus DSMZ-Nummer weitere Angaben

Thauera aromatica

DSM 6984

entspricht Thauera aromatica K172

fakultativer Anaerobier

Geobacter sulfurreducens

DSM 12127 fakultativer Anaerobier


DSM 2059 obligater Anaerobier

2.2 Zusammensetzung der verwendeten Kulturmedien und Lösungen

2.2.1 Flüssigmedium zur Kultivierung von Thauera aromatica

Zur Kultivierung von T. aromatica wurde ein Mineralsalzmedium (Tschech & Fuchs,

1987) verwendet, das sich aus einem Phosphat-Puffer-System (Lösung A) und einer

Mineralsalzlösung (Lösung B) zusammensetzte. Dem Medium wurden zudem

Spurenelemente, Vitamine, ein Elektronendonor (Kohlenstoff- und Energiequelle)

bzw. ein Elektronenakzeptor zugegeben.

2.2.1.1 Phosphat-Puffer-System (Lösung A)

Für die Inkubationsversuche mit T. aromatica wurde ein Phosphatpuffer (pH 7,2)

verwendet.

KH

2

PO

4

0,816 g

K

2

HPO

4

5,920 g

A. dest. ad 1000 ml

47 ml der Pufferlösung wurden in 120-ml-Serumflaschen gefüllt, 15 Minuten mit N

2

gespült, mit teflonbeschichteten Gummistopfen und anschließend mit Metall-

bördelkappen verschlossen und anschließend bei 120°C autoklaviert.


28

100 ml der Spurenelementelösung wurde in 240-ml-Serumflaschen gefüllt, 30

Minuten mit N

2

gespült, mit Gummistopfen und Bördelkappen verschlossen und

anschließend bei 120°C autoklaviert.

2.2.1.2 Mineralsalzlösung (Lösung B)

Neben dem Phosphatpuffer enthielt das Medium, das für die Inkubationsversuche

genutzt wurde eine Mineralsalzkomponente. Von der Mineralsalzlösung wurde eine

Stammlösung hergestellt. Diese setzte sich folgendermaßen zusammen:

100 ml der Stammlösung wurden in 240-ml-Serumflaschen gefüllt, 30 Minuten mit N

2

gespült, mit teflonbeschichteten Gummistopfen und Bördelkappen verschlossen und


2.2.1.3 Spurenelementelösung (Widdel et al., 1983)

Die Spurenelementelösung wurde analog zu der von der DSMZ empfohlenen

Spurenelementelösung-SL10 (Medium 320, Clostridium-cellulovorans-Medium;

Widdel et al., 1983) hergestellt. Die Lösung setzt sich wie folgt zusammen:

FeCl

2

x 4 H

2

O 750 mg

CoCl

2

x 6 H

2

O 95 mg

CuCl

2

x 2 H

2

O 1 mg

H

3

BO

3

3 mg

MnCl

2

x 4 H

2

O 50 mg

Na

2

MoO

4

x 2 H

2

O 18 mg

NiCl

2

x 6 H

2

O 12 mg

ZnCl

2

35 mg

HCl (25%, 7,7M) 5 ml

A. dest. ad 495 ml

CaCl

2

x 2 H

2

O 1,600 g

MgSO

4

x 7H

2

O 13,200 g

NH

4

Cl 35,000 g

A. dest. ad 400 ml


29

100 ml der Spurenelementelösung wurden in 240-ml-Serumflaschen gefüllt, 30

Minuten mit N

2

gespült, mit Gummistopfen und Bördelkappen verschlossen und


2.2.1.4 Vitaminstammlösung

Da T. aromatica ein vitaminabhängiges Wachstum aufweist, musste der Mineral-

salzlösung eine Vitaminstammlösung im Verhältnis 5 ml/l zugegeben werden. Die

eingesetzte Stammlösung wurde in Analogie zu der Vitaminstammlösung von

Pfennig (1978) hergestellt. Sie setzt sich folgendermaßen zusammen:

100 ml der Vitaminstammlösung wurden in 240-ml-Serumflaschen gefüllt, 30 Minuten

mit N

2

gespült, mit Gummistopfen und Bördelkappen verschlossen. Wegen der

Hitzeempfindlichkeit der enthaltenen Substanzen wurde die Vitaminstammlösung

unter anaeroben Bedingungen sterilfiltriert (Spritzenvorsatzfilter Qualilab, VWR, 0,22

µm CM-Membran).

2.2.1.5 Elektronendonor

Als C- und Energiequelle (Elektronendonor) für das Wachstum von T. aromatica

wurde Natriumbenzoat in einer Endkonzentration von 5 mM eingesetzt. Dazu wurde

eine wässrige Natriumbenzoatstammlösung (250 mM) hergestellt. 100 ml der

Natriumbenzoatstammlösung wurden in 240-ml-Serumflaschen gefüllt. Nachdem die

p-Aminobenzoesäure 50,0 mg

Biotin 20,0 mg

Cobalamin 50,0 mg

Folsäure 20,0 mg

α-Liponsäure 50,0 mg

Nicotinamid 25,0 mg

Nicotinsäure 25,0 mg

Pantothensäure 50,0 mg

Pyridoxamin-HCl 10,0 mg

Riboflavin 50,0 mg

Thiamin-HCl x 2 H

2

O 50,0 mg

A. dest. ad 1000 ml


30

Lösung 30 Minuten mit N

2

gespült wurde, wurden die Flaschen mit Gummistopfen

und Bördelkappen verschlossen und anschließend bei 120°C autoklaviert.

2.2.1.6 Elektronenakzeptor

Als Elektronenakzeptor wurde Kaliumnitrat verwendet, das in einer Endkonzentration

von 20 mM eingesetzt wurde. Zu diesem Zwecke wurde eine 1 M Kaliumnitrat-

stammlösung hergestellt. 100 ml der wässrigen Kaliumnitratstammlösung wurden in

240-ml-Serumflaschen gefüllt, anschließend 30 Minuten mit N

2

gespült, mit

Gummistopfen und Bördelkappen verschlossen und im Anschluss daran bei 120°C

autoklaviert.

2.2.2 Flüssigmedium zur Kultivierung von Geobacter sulfurreducens

G. sulfurreducens wurde ebenfalls in einem mit Bicarbonat gepufferten Medium

kultiviert, das neben der Mineralsalzlösung eine Bicarbonatlösung, Spurenelemente,

Vitamine, einen Elektronenakzeptor und einen Elektronendonor enthielt.

2.2.2.1 Mineralsalzlösung

Das Mineralsalzmedium, das in Analogie zu dem von der DSMZ empfohlenem

Kulturmedium für G. sulfurreducens (DSMZ-Medium 826) hergestellt wurde, setzte

sich folgendermaßen zusammen:

KCl 0,1 g

Na

2

HPO

4

* 2 H

2

O 0,75 g

NH

4

Cl 1,5 g

Resazurin 0,5 ml

Selenit-Wolframat-Stammlösung 1,0 ml

A. dest. ad 1000 ml

46,5 ml der Mineralsalzlösung wurden in 120-ml-Serumflaschen gefüllt, für 15 min

mit einem Mix aus den beiden Gasen N

2

und CO

2

, die im Verhältnis 80 % : 20 %

gemischt waren, gespült. Anschließend wurden die Flaschen mit teflonbeschichteten

Gummistopfen und Bördelkappen verschlossen und bei 120°C autoklaviert.


31

2.2.2.2 Selenit-Wolframat-Stammlösung (DSMZ Medium 385)

Da die Zellen von G. sulfurreducens eine Bedürftigkeit nach den Spurenelementen

Selenit und Wolframat aufweisen, war es nötig, dem Medium eine Selenit-Wolframat-

Stammlösung zuzugeben, die folgendermaßen hergestellt wurde:

Na

2

SeO

3

* 5 H

2

O 2,0 mg

Na

2

Wo

4

* 2 H

2

O 4,0 mg

A. dest. ad 10 ml

1 ml dieser Lösung wurde zu 99 ml einer 12,5 mM NaOH-Lösung gegeben. Wie

unter Abschnitt 2.3.1 beschrieben, wurde 1 ml dieser Stammlösung der

Mineralsalzlösung zugegeben.

2.2.2.3 Bicarbonatlösung

Um eine Stabilisierung des pH-Wertes der Mineralsalzlösung während der

Kultivierung zu gewährleisten, wurde das Medium mit einer Bicarbonatlösung

versetzt, die sich wie im Anschluß beschrieben, zusammensetzte:

NaHCO

3

6,25 g

A. dest. ad 100 ml

100 ml der wässrigen Stammlösung wurden in 240-ml-Serumflaschen gefüllt,

anschließend 30 Minuten mit CO

2

gespült, mit Gummistopfen und Bördelkappen

verschlossen und im Anschluß daran bei 120°C autoklaviert.

2.2.2.4 Spurenelementelösung

Die Spurenelementelösung wurde analog zu einer von der DSMZ empfohlenen

Spurenelementelösung (Medium 141, Methanogenium-Medium, Balch & Wolfe,

1976) hergestellt. Die Lösung setzt sich wie folgt zusammen:

CaCl

2

x 2 H

2

O 0,100 g

CoSO

4

x 7 H

2

O 0,180 g

CuSO

4

x 5 H

2

O 0,010 g

FeSO

4

x 7 H

2

O 0,100 g

H

3

BO

3

0,010 g


32

KAl(SO

4

)

2

x 12 H

2

O 0,020 g

MgSO

4

x 7 H

2

O 3,000 g

MnSO

4

x 2 H

2

O 0,456 g

NaCl 1,000 g

Na

2

MoO

4

x 2 H

2

O 0,010 g

Na

2

SeO

3

* 5 H

2

O 0,300 mg

NiCl

2

x 6 H

2

O 0,025 g

Nitrilotriessigsäure 1,500 g

ZnSO

4

x 7 H

2

O 0,180 g

A. dest. ad 1000 ml

100 ml der wässrigen Stammlösung wurden in 240-ml-Serumflaschen gefüllt,

anschließend 30 Minuten mit N

2

gespült, mit Gummistopfen und Bördelkappen

verschlossen und im Anschluss daran bei 120°C autoklaviert.


Aufgrund der Vitaminbedürftigkeit von G. sulfurreducens musste der Mineral-

salzlösung eine Vitaminstammlösung im Verhältnis 10 ml/1 l Medium zugegeben

werden. Die von der DSMZ empfohlene Vitaminstammlösung (Medium 461) setzte

sich wie folgt zusammen:


Biotin 2,0 mg

Ca-Pantothenat 5,0 mg

Cobalamin 0,1 mg

Folsäure 2,0 mg

Pyridoxin-HCl 10,0 mg

Liponsäure 5,0 mg


Riboflavin 5,0 mg

Thiamin-HCl x 2 H

2

O 5,0 mg

A. dest. ad 1000 ml


33


mit N

2


Hitzeempfindlichkeit der enthaltenen Substanzen wurde die Vitaminstammlösung


µm CM-Membran).


Als Elektronendonor bei der Kultivierung von G. sulfurreducens wurde Natriumacetat

in einer Endkonzentration von 5 mM eingesetzt. Dazu wurde eine wässrige

Stammlösung mit einer Konzentration von 0,5 M hergestellt. Jeweils 100 ml der

wässrigen Stammlösung wurden in 240-ml-Serumflaschen gefüllt, anschließend 30

Minuten mit N

2

gespült, mit Gummistopfen und Bördelkappen verschlossen und im

Anschluss daran bei 120°C autoklaviert.

2.2.2.7 Elektronenakzeptor

Natriumfumarat, das bei der Kultivierung von G. sulfurreducens als

Elektronenakzeptor diente, wurde in einer Endkonzentration von 25 mM dem

Medium zugegeben. Zu diesem Zweck wurde eine wässrige Stammlösung mit einer

Konzentration von 1,25 M hergestellt. Nachdem die Lösung – jeweils 100 ml in 240-

ml-Serumflaschen – 30 Minuten mit N

2

gespült wurde, wurden die Serumflaschen mit

Gummistopfen und Bördelkappen verschlossen und im Anschluss daran bei 120°C

autoklaviert.

2.2.3 Flüssigmedium zur Kultivierung von Desulfococcus multivorans

Bei der Kultivierung von D. multivorans wurde ein mit Carbonat gepuffertes Mineral-

salzmedium (Widdel, 1980) genutzt. Dem Medium wurden zudem noch

Spurenelemente, Vitamine und ein Reduktionsmittel zugesetzt. Während der

Elektronenakzeptor (Sulfat) schon in der Mineralsalzlösung enthalten war, musste

der Elektronendonor noch nachträglich zugegeben werden.


34

2.2.3.1 Mineralsalzlösung

Das genutzte Medium setzte sich wie folgt zusammen:

CaCl x 2 H

2

O 0,15 g

KCl 0,50 g

KH

2

PO

4

0,20 g

MgCl

2

x 6 H

2

O 1,30 g

NaCl 7,00 g

Na

2

SeO

3

2,00 µg

Na

2

SO

4

3,00 g

NH

4

Cl 0,30 g

Resazurin 1,00 mg

A. dest. ad 870 ml

43,5 ml der Mineralsalzlösung wurden in 120-ml-Serumflaschen gefüllt und 15

Minuten lang mit einem Gemisch aus 80 % Stickstoff und 20 % Kohlendioxid gespült.

Die Flaschen wurden im Anschluß daran mit teflonbeschichteten Gummistopfen und

Bördelkappen verschlossen und bei 120°C autoklaviert.

2.2.3.2 Bicarbonatlösung

Um den pH-Wert der Mineralsalzlösung während der Kultivierung zu stabilisieren,

wurde der Lösung Bicarbonat in einer Endkonzentration von 60 mM zugegeben.

Dazu war es nötig, eine Bicarbonatstammlösung (600 mM) herzustellen. 100 ml der

wässrigen Stammlösung wurden in 240-ml-Serumflaschen gefüllt, anschließend 30

Minuten mit CO

2

gespült, mit Gummistopfen und Bördelkappen verschlossen und im

Anschluß daran bei 120°C autoklaviert.

2.2.3.3 Spurenelementelösung SL 10

Die Spurenelementelösung wurde, wie unter Abschnitt 2.1.3 beschrieben, analog zu

der von der DSMZ empfohlenem Spurenelementelösung-SL10 (Medium 320,

Clostridium-cellulovorans-Medium, Widdel et al., 1983) hergestellt.


35


Aufgrund der Vitaminbedürftigkeit von D. multivorans musste der Mineralsalzlösung

eine Vitaminlösung im Verhältnis 10 ml/1 l Medium zugegeben werden. Die von der

DSMZ empfohlene Vitaminstammlösung (Medium 461) setzte sich wie folgt

zusammen:


Biotin 2,0 mg

Ca-Pantothenat 5,0 mg

Cobalamin 0,1 mg

Folsäure 2,0 mg

Pyridoxine-HCl 10,0 mg

Liponsäure 5,0 mg


Riboflavin 5,0 mg

Thiamin-HCl x 2 H

2

O 5,0 mg

A. dest. ad 1000 ml


mit N

2


Hitzeempfindlichkeit der enthaltenen Substanzen wurde, die Vitaminstammlösung


µm CM-Membran).


Bei der Kultivierung von D. multivorans wurde ebenfalls Natriumbenzoat als C- und

Energiequelle in den Endkonzentrationen von 17 bzw. 4 mM eingesetzt. Dazu wurde

jeweils eine wässrige Stammlösung mit einer Konzentration von 1,7 M bzw. 0,25 M

hergestellt. Jeweils 100 ml der wässrigen Stammlösungen wurden in 240-ml-

Serumflaschen gefüllt, anschließend 30 Minuten mit N

2

gespült, mit Gummistopfen

und Bördelkappen verschlossen und im Anschluß daran bei 120°C autoklaviert.


36

2.2.3.6 Reduktionsmittel

Um eventuell noch enthaltene Sauerstoffreste aus der Lösung zu entfernen, war es

nötig, das Medium zu reduzieren. Als Reduktionsmittel wurde Natriumsulfid in

wässriger Stammlösung (170 mM) in einer Endkonzentration von 1,7 mM eingesetzt.

Die Stammlösung hatte folgende Konzentration:

Na

2

S * 9H

2

O 4 g

A. dest. ad 100 ml

50 ml der Stammlösung wurden in 120-ml-Serumflaschen gefüllt und danach 15

Minuten mit Stickstoff gespült. Die mit Teflon beschichteten Gummistopfen und

Bördelkappen verschlossenen Flaschen wurden bei 120°C autoklaviert.

2.2.4 Lösungen und Puffer

2.2.4.1 Lösung für die Trockengewichtsbestimmung

Im Verlaufe der Ermittlung des bakteriellen Trockengewichts wurde auf einen

Ammoniumacetatpuffer (50 mM, pH-Wert 6,5) zurückgegriffen:

Ammoniumacetat 3,85 g

A. dest. ad 1000 ml

Anschließend wurde so lange Essigsäure zugegeben, bis die Lösung einen pH-Wert

von 6,5 aufwies.

2.2.4.2 Lösungen für die ATP-Messung

Während der Präparation zur Bestimmung der zellulären ATP-Konzentration wurden

sowohl eine Perchlorsäurelösung als auch eine Kaliumhydroxidlösung eingesetzt.

Die beiden verwendeten Lösungen setzen sich wie folgt zusammen:


37

Perchlorsäurelösung: Perchlorsäure 1,3 M

EDTA 0,023 M

Kaliumhydroxidlösung: KOH 0,72 M

KHCO

3

0,16 M

2.2.4.3 Lösung für die Fettsäurebestimmung

Im Rahmen der Bestimmung der zellulären Phospholipidfettsäurezusammensetzung

wurde auf einen Kaliumhydrogenphosphatlösung (50 mM, pH-Wert 7) zurück-

gegriffen:

KH

2

PO

4

6,8 g

A. dest. ad 1000 ml

Der pH-Wert der Lösung wurde anschließend durch die Zugabe von KOH-Plätzchen

auf einen pH-Wert von 7 eingestellt.

2.3 Zellkultivierung

2.3.1 Kultivierung von T. aromatica unter nitratreduzierenden Bedingungen

T. aromatica wurde in 120-ml-Serumflaschen mit 50 ml Mineralsalzmedium kultiviert.

Das Medium setzte sich dabei wie folgt zusammen:

KH

2

PO

4

/ K

2

HPO

4

-Puffer (Lösung A) 47 ml

Mineralsalzlösung (Lösung B) 0,3 ml

Spurenelementelösung SL-10 0,5 ml

Vitaminstammlösung 0,25 ml

Natriumbenzoatstammlösung (0,25 M) 1 ml

Kaliumnitratstammlösung (1 M) 1 ml

Die einzelnen Stammlösungen wurden mit sterilen Einwegspritzen (Fa. VWR)

appliziert, die zuvor mit Stickstoff gespült wurden. Als Inokulum wurden 20 h alte,

logarithmisch wachsende Zellen von T. aromatica genutzt. Im Medium wurde ein


38

Zelltiter eingestellt, der bei einer Wellenlänge von 560 nm einer Optischen Dichte von

0,03 entsprach. Die Bakterien wurden bei 30°C unter Schütteln (ca. 180 rpm) in

einem Schüttler der Infors-AG (Bottmingen, Schweiz) inkubiert.

2.3.2 Kultivierung von T. aromatica in Anwesenheit von Luftsauerstoff

Als Inokulum dienten logarithmisch wachsende T. aromatica-Zellen einer ca. 20 h

alten anaerob gewachsenen Kultur, die mittels eines Zentrifugationsschrittes (10000

rpm, 10 Minuten, bei 4°C) geerntet wurden. Der Überstand wurde verworfen. Das

Zellpellet wurde in KH

2

PO

4

/K

2

HPO

4

-Puffer (Lösung A) resuspendiert.

Die resuspendierten Zellen wurden anschließend in 250-ml-Flaschen mit Mininert-

Ventilen (Fa. Alltech) kultiviert, die 50 ml Mineralsalzmedium enthielten.

Das Medium setzte sich dabei wie folgt zusammen:

KH

2

PO

4

/K

2

HPO

4

-Puffer (Lösung A) 48 ml

Mineralsalzlösung (Lösung B) 0,3 ml



Natriumbenzoatstammlösung (0,25 M) 1 ml

Im Medium wurde ein Zelltiter eingestellt, der bei einer Wellenlänge von 560 nm

einer Optischen Dichte von 0,3 entsprach. Die Bakterien wurden bei 30°C unter

Schütteln (180 rpm) inkubiert (Schüttler: Infors-AG, Bottmingen, Schweiz).

2.3.3 Kultivierung von G. sulfurreducens unter fumaratreduzierenden

Bedingungen

Die Kultivierung von G. sulfurreducens fand in 120-ml-Serumflaschen mit 50 ml

Mineralsalzmedium statt. Das Medium setzte sich wie folgt zusammen:

Mineralsalzlösung 46,5 ml

NaHCO

3

- Lösung (0,6 M) 1 ml

Spurenelementelösung (DSMZ-Medium 320) 0,5 ml

Vitaminstammlösung (DSMZ-Medium 461) 0,5 ml


39

Natriumacetat (0,5 M) 0,5 ml

Natriumfumarat (1,25 M) 1 ml

Die Applikation der einzelnen Stammlösungen zur Mineralsalzlösung erfolgte dabei

ebenfalls mit N

2

-gespülten, sterilen Einwegspritzen (Fa. VWR). Als Inokulum dienten

ca. 24 h alte, logarithmisch wachsende Zellen von G. sulfurreducens. Im Medium

wurde ein Zelltiter eingestellt, der bei einer Wellenlänge von 560 nm einer Optischen

Dichte von 0,03 entsprach. Die Inkubation der Mikroorganismen erfolgte bei 34°C

unter Schütteln (ca. 100 rpm) in einem Schüttler der Infors-AG (Bottmingen

Schweiz).

2.3.4 Kultivierung von D. multivorans unter sulfatreduzierenden Bedingungen

D. multivorans wurde in 120-ml-Serumflaschen mit 50 ml Mineralsalzmedium

kultiviert. Das Medium setzte sich dabei folgendermaßen zusammen:

Mineralsalzlösung 43,5 ml

NaHCO

3

- Lösung 5 ml



Natriumbenzoat (1,7 M bzw. 0,25 M) 0,5 ml bzw. 0,8 ml

Na

2

S*9 H

2

O–Stammlösung (0,17 M) 0,5 ml

Die einzelnen Stammlösungen wurden mittels steriler Einwegspritzen (Fa. VWR), die

vor ihrer Nutzung mit Stickstoff gespült wurden, zur Mineralsalzlösung gegeben.

Als Inokulum dienten logarithmisch wachsende Zellen von ca. 4 Tage alten D.

multivorans-Kulturen. Im Medium wurde ein Zelltiter eingestellt, der bei einer

Wellenlänge von 560 nm einer Optischen Dichte von 0,05 entsprach. Die

Organismen wurden bei 34°C unter Schütteln (ca. 100 rpm) in einem Schüttler der

Infors-AG (Bottmingen Schweiz) kultiviert.

2.4 Toxizitätstests

Dazu wurden die Mikroorganismen derart kultiviert, wie unter Abschnitt 2.3

beschrieben. Im Verlaufe der exponentiellen Wachstumsphase erfolgte die Zugabe


40

der Lösungsmittel unter sterilen Bedingungen in unterschiedlichen Konzentrationen.

Um das Wachstum der Mikroorganismen zu prüfen, war es nötig, Kontrollansätze

ohne Lösungsmittel mitzuführen. Nach Zugabe der Testsubstanzen wurde

regelmäßig die Optische Dichte (560 nm) bestimmt. Anhand der erfassten

Messdaten konnten Wachstumsraten errechnet werden.

x

1

= Optische Dichte zum Zeitpunkt 1

x

2

= Optische Dichte zum Zeitpunkt 2

t

1

= Zeitpunkt 1

t

2

= Zeitpunkt 2

Im Vergleich zu den mitgeführten Wachstumskontrollen, die nicht mit Lösungsmittel

inkubiert wurden, war es möglich die relativen Wachstumshemmungen in

Abhängigkeit von den eingesetzten Lösungsmittelkonzentrationen zu ermitteln.

µ

1

= Wachstumsrate der Mikroorganismen, die mit Lösungsmittel inkubiert wurden

µ

0

= Wachstumsrate der Mikroorganismen, die nicht mit Lösungsmittel inkubiert

wurden

2.5 Bestimmung von Wachstumsparametern

2.5.1 Bestimmung der Optischen Dichte

Das Bakterienwachstum wurde mittels Extinktionsmessung bestimmt. Dabei wurde

die Optische Dichte bei einer Wellenlänge von 560 nm an einem Spektral-

photometer (Perkin-Elmer UV/VIS, Spectrometer Lambda 2S) erfasst. Wurden

Optische Dichten von 0,6 überschritten, wurden die Proben mit 0,9 %iger NaCl-

Lösung verdünnt. Enthielt das Nährmedium den Redox-Indikator Resazurin, musste

die Probe vor der Messung mittels Dithionit entfärbt werden. Dazu wurde etwa eine

Spatelspitze Dithionit zu 1 ml Probe zugegeben und gemischt.

µ

1

(+ Toxin)

relative Wachstumshemmung (%) = --------------------- x 100

µ

0

(Kontrolle)

ln x

2

- ln x

1

Wachstumsrate µ (h

-1

) = -----------------

t

2

– t

1


41

2.5.2 Bestimmung des Trockengewichts

Die Bestimmung des Trockengewichts erfolgte mittels einer Methode nach Widdel

(1980). Dazu wurden 30 ml Bakterienkultur, deren Optische Dichte vor Beginn der

Messung bestimmt wurde, mittels Zentrifugation geerntet. Die Überstände der

abzentrifugierten Bakterienkulturen konnten verworfen werden. Die Zellpellets

wurden in 0,5 ml Ammoniumacetatpuffer (50 mM, pH-Wert 6,5) resuspendiert und in

für 24 h bei 80°C getrocknete, abgewogene Wägegefäße überführt und

abzentrifugiert. Anschließend wurden die Zellpellets noch zweimal mit 0,5 ml

Ammoniumacetatpuffer gewaschen und dann bis zum Erreichen der

Gewichtskonstanz bei 80°C im Trockenschrank getrocknet. Beim Erhitzen zerfällt der

Ammoniumacetatpuffer in NH

3

und Essigsäure, die vollständig verdampfen.

Nach der Trocknung wurden die Proben bis zu ihrer Abkühlung im Exsikkator

gelagert, im Anschluss erneut gewogen und aus der Gewichtsdifferenz das

Trockengewicht bestimmt. Die Bestimmung wurde immer im Dreifachansatz

durchgeführt. Neben den Kulturen mit Bakterien wurde eine Kontrolle ohne Zellen

mitgeführt.

2.5.3 Bestimmung der ATP-Konzentration

Die quantitative Bestimmung von ATP erfolgte mittels Biolumineszenzmessung.

Hierbei wird die Fähigkeit des Enzyms Luciferase genutzt, die Adenylierungsreaktion

von freiem ATP mit Luciferin zu katalysieren, wobei das Enzym eine hohe Spezifität

für ATP aufweist. Die so aktivierte Verbindung wird nun in Gegenwart von Mg

2+

durch

molekularen Sauerstoff zu Oxoluciferin oxidiert, was neben der Bildung anderer

Produkte zu einer Freisetzung eines Lichtquants führt (Biolumineszenz). Die Menge

an emittiertem Licht ist proportional zur enthaltenen ATP-Konzentration und kann im

Luminometer erfasst werden.

Für den Zellaufschluss wurden 500-µl-Proben, die in sterile eisgekühlte 1,5 ml

Reaktionsgefäße überführt wurden, mit 250 µl gekühlter (4°C) Perchlorsäure-Lösung

(1,3 M + 23 mM EDTA) versetzt, sorgfältig gemischt, 15 min bei 4°C inkubiert und

anschließend 7 min bei 4°C und 16000 g zentrifugiert. Nach dem

Zentrifugationsschritt wurden 500 µl der Überstände in sterile, eisgekühlte 1,5 ml-

Reaktionsgefäße überführt, mit 300 µl KOH-Lösung (0,72 M + 0,16 M KHCO

3

)


42

versetzt und 7 min bei 16000 g und 4°C zentrifugiert. Im Anschluss daran wurden die

Überstände in 1,5 ml Eppendorfgefäße überführt und bei -20°C gelagert.

Nach dem Auftauen wurde der pH-Wert der Proben bestimmt. Lag der pH-Wert nicht

in einem Bereich zwischen 6,6 - 6,9, wurde er mittels Zugabe von KOH bzw.

Perchlorsäure eingestellt. Anschließend wurden die Proben erneut 10 min bei 4°C

und 10000 g zentrifugiert.

Der ATP-Nachweis erfolgte mit Hilfe eines kommerziell erworbenen Kits (Quantitative

Monitoring ATP-Kit SL, Biothema AB, Handen, Schweden), der alle benötigten Puffer

und Lösungen enthielt.

Die ATP-Konzentration der Proben wurde über einen internen ATP-Standard mit

einer Konzentration von 10 nM ermittelt. Die Messung aller Proben erfolgte in

Dreifachbestimmung auf Schwarz-Weiß-Mikrotiterplatten (96 well-black-white-plate),

wie in Tabelle 4 beschrieben.

Tab. 5: Auflistung der Reaktionsansätze für die Bestimmung der ATP-Konzentration

Reagenzien Leerwert Versuchsansatz Versuchansatz mit

internem Standard

Probe [µl] - 20 20

ATP-Standard [µl] 125 - 125

Puffer [µl] 75 180 55

Luciferase-Luciferin-Mischung [µl] 50 50 50

Die Zugabe des ATP-Monitoring-Reagenz und des Tris-Puffers erfolgte automatisch

unmittelbar vor der Messung im Spektralfluorometer (Wallac Victor 1420 Multilabel

Counter, Perkin Elmer).

Die erhaltenen Werte wurden bei der Berechnung der ATP-Konzentration wie folgt

berücksichtigt:

C

Standard

* I

1

C

x

= * VF

I

2

– I

1


43

C

x

ATP [M]

C

Standard

ATP-Konzentration-Standard 0,00001 M

I

1

Lichtintensität Probe

I

2

Lichtintensität Probe mit internem ATP-Standard

VF Verdünnungsfaktor

Die vom Hersteller angegebene Nachweisgrenze zur ATP-Detektion (10

-11

-10

-6

M

ATP) wurde in Experimenten untersucht und bestätigt.

2.5.4 Bestimmung des Proteingehalts

Die Bestimmung der Proteinkonzentration erfolgte entsprechend der Methode nach

Bradford (1976). Sie beruht auf einer Reaktion von Coomassie-Brilliantblau-

Gebrauchslösung-250 mit Protein, infolgedessen es zu einer Verschiebung des

Absorptionsmaxiums des Farbstoffes von 465 zu 595 nm kommt.

Für die Bestimmung wurde den entsprechenden Kulturen je 1 ml Probe entnommen,

welche in sterile Eppendorfgefäße gefüllt und abzentrifugiert wurden. Die Überstände

konnten verworfen werden. Die Zellpellets wurden in 1 ml 0,9 % iger NaCl-Lösung

resuspendiert.

Um die Proteinkonzentration ermitteln zu können, war es nötig, Proteinstandards

(Bovines-Serum-Albumin: 1, 2,5, 5, 10, 15, 20 µg/ml) mitzuführen, anhand derer eine

Eichkurve ermittelt wurde.

Zu 80 µl Probe bzw. Standard wurden 170 µl Coomassie-Brilliantblau-

Gebrauchslösung gegeben (Fa. Bio-Rad Laboratories GmbH), die vor der Messung

durch einen Verdünnungsschritt mit A. dest. (im Verhältnis 1:5) hergestellt wurde.

Nach Zugabe der Coomassie-Brilliant-Blau-Gebrauchslösung erfolgte die Messung

der Absorption in Mikrotiterplatten im Spektralphotometer (Wallac Victor

2

1420

Multilabel Counter, Perkin Elmer) bei einer Wellelänge von 595 nm.

Um statistisch abgesicherte Ergebnisse zu erhalten, wurden alle Bestimmungen

dreifach durchgeführt. Die Proteinkonzentration der Proben konnte anhand der

mitgeführten Kalibrationskurve erfasst werden.


44

2.6 Bestimmung der zellulären Fettsäurezusammensetzung

2.6.1 Lipidextraktion

Zur Präparation der zellulären Fettsäuren war es nötig, die Zellen 20 min bei 10000

rpm abzuzentrifugieren. Während die Überstände verworfen wurden, mussten die

Zellpellets, nachdem sie in 2 ml Kaliumphosphatpuffer (50 mM, pH 7, Abschnitt

II.2.6) resuspendiert wurden, in neue Eppendorfgefäße (2 ml) überführt und erneut

10 min bei 13000 rpm zentrifugiert werden. Danach wurden die Überstände

vorsichtig abgenommen. Bei nicht sofortiger Aufarbeitung wurden die so erhaltenen

Pellets bei -20°C gelagert

Die Lipidextraktion erfolgte nach einer leicht modifizierten Methode von Bligh und

Dyer (1959). Die in 0,5 ml A. dest resuspendierten Zellen wurden in 10-ml-

Zentrifugenröhrchen überführt, mit 1 ml Methanol und 1,75 ml Chloroform versetzt

und 3 min auf dem Vibromix geschüttelt. Anschließend erfolgte eine erneute Zugabe

von 0,5 ml A. dest.

Nach erneutem Durchmischen auf dem Vibromix (30 s) erfolgte eine zehnminütige

Zentrifugation bei 1000 g (Heraeus Sepatech Contifuge 17RS, 3000 rpm).

Anschließend wurde die Chloroform-Phase in HPLC-Fläschchen überführt und mit

Hilfe von Stickstoff abgedampft.

2.6.2 Derivatisierung

Um die schwer flüchtigen Fettsäuren gaschromatographisch detektieren zu können,

müssen diese von ihrer polaren Kopfgruppe abgespaltet und zu den jeweiligen

Methylestern derivatisiert werden. Dazu wurde eine abgewandelte Vorschrift von

Morrison und Smith (1964) genutzt.

Zu diesem Zwecke war es nötig, die Lipidextrakte in den HPLC-Fläschchen mit 0,6

ml des Methylierungsmittels Bortrifluorid (BF

3

) zu versetzen und für 15 min im

Trockenschrank bei 80°C zu inkubieren. Später wurden 0,3 ml A. dest. und 0,5 ml n-

Hexan zu den Ansätzen gegeben und für 60 s auf dem Vibromix geschüttelt.

Anschließend wurde die Hexanphase mit den enthaltenen Fettsäuremethylestern

(FAME) entnommen und in GC-Fläschchen überführt. Nach Abdampfen der

Hexanphase wurden die Rückstände in 0,2 ml n-Hexan gelöst und bis zu ihrer

Analyse bei -20°C gelagert.


45

2.7 Instrumentelle Analysemethoden

2.7.1 Hochleistungsflüssigchromatographie

Die Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) ermöglicht eine relativ schnelle

Analyse wässriger Proben. Sie erlaubt eine Auftrennung von Substanzgemischen mit

anschließender quantitativer Analyse.

Die Methodik wurde einerseits genutzt, um während der Inkubation die Abnahme gut

wasserlöslicher Substrate zu verfolgen (1.). Zudem konnten mit Hilfe von HPLC-

Messungen die Konzentration der zu testenden, wasserlöslichen, toxischen

Verbindungen im zeitlichen Verlauf der Toxizitätstests erfasst werden (2.). Dabei

wurden folgende mobile Phasen verwendet:

Acetonitril Formiat (40 mM) (1.)

isokratisch (16 min) 20 % 80 %

Methanol Phosphorsäure (0,1 % w/v) (2.)

bei t = 0 min 10 % 90 %

bei t = 14 min 100 % 0 %

Die Messungen erfolgten mittels eines Gerätesystems der Firma Shimadzu, welches

mit einem Photodiodenarray-Detektor ausgestattet ist. Dieser Detektortyp ermöglicht

nach Auftrennung von Substanzgemischen, die Aufnahme von UV-Spektren der

einzelnen Verbindungen. Durch den Vergleich aufgezeichneter UV-Spektren mit

Spektren mitgeführter Standardsubstanzen ist eine Substanzidentifizierung möglich.

Die Substanzquantifizierung einzelner Verbindung erfolgte über mitgeführte, externe

Standards. Die Untersuchungen wurden unter Verwendung folgender

Geräteparameter durchgeführt:

Pumpe: LC-20AB

Detektor: SPD-M20A (DAD)

Integrator: LCsolution

Säule: LiChroCART® 125-4 RP-18-encapped, 5 µm (VWR)

Flussrate: 1 ml/min


46

2.7.2 Gaschromatographie

Die Gaschromatographie wurde vorwiegend zur Bestimmung der zellulären

Fettsäure-Zusammensetzung genutzt. Dafür wurde das mit einem FID ausgestattete

GC-System 6890 N (Fa. Agilent) eingesetzt. Die Identifizierung fand anhand von

Retentionszeiten mitgeführter Fettsäuremethylesterstandards statt. Die

Untersuchungen wurden unter Verwendung folgender Konfigurationen durchgeführt:

Säule: Varian CP7488 CP-SIL 88 for FAME

0,25 mm x 50 m x 0,20 µm Filmdicke

Trägergas: Helium

Injektor: splitlos (240°C)

Detektor: FID (270°C)

Injektion: 1 µl splitlos

Temperaturprogramm: 2 min 40°C,

40 – 220°C: 8°C/min,

15 min 220°C

Druckprogramm: 2 min 27,7 psi,

27,7 – 45,7 psi: 0,82 psi/min,

15,55 min 47,7 psi

2.7.3 Headspace-Gaschromatographie –Quantitative Bestimmung der BTEX-

Verbindungen

Zur quantitativen Bestimmung leicht flüchtiger Verbindungen wurde die Headspace-

Gaschromatographie genutzt. Mit dieser Methode können neben Gasproben auch

flüssige Probengemische, die leicht flüchtige Komponenten enthalten, untersucht

werden. Liegen solche flüssige Probengemische vor, werden die enthaltenen

flüchtigen Komponenten durch eine Erhöhung der Temperatur in den Gasraum

ausgetrieben. Anschließend können Proben aus dem Gasraum entnommen und

gaschromatographisch aufgetrennt werden. Wie auch bei der Gaschromatographie

erfolgt dann die Substanzidentifizierung durch Vergleiche der Retentionszeiten mit

mitgeführten Standardverbindungen


47

Um die Konzentration der leicht flüchtigen BTEX-Verbindungen im Verlaufe des

Inkubationszeitsraums zu prüfen, wurden den zu untersuchenden Inkubations-

ansätzen jeweils 1 ml Kulturflüssigkeit entnommen und in heliumgespülte 20-ml-

Reaktionsgefäße überführt. Zum Abstoppen möglicher Abbaureaktionen wurden die

Reaktionsgefäße direkt nach der Probenahme bei -20°C eingefroren. Die

Konzentrationsbestimmung erfolgte mittels eines Gerätessystems der Firma Hewlett-

Packard mit folgender Ausstattung bzw. folgenden Parametern:

Autosampler: HP7694 (Hewlett-Packard)

Autosamplerprogramm: Ofen: 70°C, Schleife: 80°C, Transferverbindung: 90°C,

Equilibrierungszeit:30 min,

GC-Zyklus: 25 min,

Schleifenfüllzeit: 0,2 min,

Schleifenequilibrierungszeit: 0,05 min

Injektionszeit: 1 min

Gaschromatograph: HP6890 (Hewlett Packard)

Säule: HP-5 (J & W Scientific, USA)

0,32 mm x 30 m x 0,25 µm

crosslinked, 5 % Phenyl-Methyl-Siloxan

Injektor: split/splitlos (250°C)

Trägergas Helium (2 ml/min)

Injektion: 1 µl mit Split (Ratio 5:1, Splitfluß 10 ml/min)


40°C-90°C: 5°C/min

90°C-250°C: 20°C/min,

2 min 250°C,

Detektor: FID (280°C)


48

2.7.4 Gaschromatographie/Massenspektrometrie

Die Kopplung von Gaschromatographie und Massenspektrometrie wurde zur

Bestimmung der zellulären Fettsäurezusammensetzung genutzt. Dabei war es

möglich, Fettsäuremethylester (FAME) durch Vergleiche aufgezeichneter

Massenspektren mit denen mitgeführter Standardsubstanzen (Bacterial Acid Methyl

Esters) unter Berücksichtigung ihrer Retententionszeiten zu identifizieren. Lagen

keine Vergleichssubstanzen vor, wurden die bei der Massenspektrometrie

entstandenen, substanzspezifischen Fragmentierungsmuster mit

Fragmentierungsmustern vorliegender Massenspektrenbibliotheken (NIST)

verglichen. Die Untersuchungen wurden dabei an einem Gerätesystem der Firma

Hewlett-Packard (Willmington, USA), unter Verwendung folgender Parameter

durchgeführt.

Gaschromatograph: GC 6890

Massenspektrometer: HP 5973

Säule: BPX-5 Säule (SGE, Darmstadt, Deutschland)

0,32 mm x 30 m x 0,25 µm Filmdicke

Poly (5 % Diphenyl / 95 % Dimethylsiloxan)

Injektor: split / splitlos (280°C)

Trägergas: Helium (5,49 psi)

Injektion 1 µl split (1:1)


70 - 150°C: 20°C/min,

150°C-210°C: 2°C/min,

1 min 210°C,

210°C-300°C: 20°C/min

Quellentemperatur: 230°C

Transferlinetemperatur: 300°C

Die Fettsäuren wurden nach dem folgenden System A:BΔD benannt, wobei A die

Kettenlänge des Fettsäurerückgrats, B die Anzahl der Doppelbindungen und D die

Position der Doppelbindung ausgehend vom Carboxylende des Fettsäuremoleküls

angibt. Die Präfixe i- bzw. ai kennzeichnen die iso- bzw. anteiso-Isomere der

Fettsäuremoleküle.


49

2.8 Chemikalien

Nachfolgend sind alle Substanzen aufgelistet, die speziell für diese Versuche genutzt

wurden.

Substanzen Firma Reinheitsgrad

Acetonitril J. T. Baker reinst

p-Aminobenzoesäure Aldrich 99 %

Ammoniumacetat Merck 98 %

Benzol Merck 99 %

Biotin Sigma puriss

Borontrifluorid Merck reinst

n-Butanol Merck 99,5 %

CaCl

2

x 2 H

2

O Merck 99,5%

Chloroform Merck reinst

4-Chlorphenol Merck > 99 %

CoCl

2

x 6 H

2

O Merck > 99 %

CoSO

4

x 7 H

2

O Aldrich reinst

CuCl

2

x 2 H

2

O Merck 99 %

CuSO

4

x 5 H

2

O Aldrich 98 %

2,4-Dichlorphenol Merck > 98 %

Ethylbenzol J. T. Baker puriss

FeCl

2

x 4 H

2

O Fluka > 99 %

FeSO

4

x 7 H

2

O Merck 99,5 %

Folsäure Merck 98 %

Formiat Merck reinst

H

3

BO

3

Merck 99,8 %

HCl Merck puriss

n-Hexan J. T. Baker 95 %

n-Hexanol Merck reinst

K

2

HPO

4

Merck 99 %

KAl(SO

4

)

2

x 12 H

2

O Aldrich 98 %

KCl Merck 99,5 %

KH

2

PO

4

Merck 99,5 %


50

KHCO

3

Merck 99 %

KNO

3

J. T. Baker 99,7 %

KOH Merck puriss

α-Liponsäure Aldrich 98 %

Methanol Merck reinst

MgCl

2

x 6 H

2

O J. T. Baker 98,5 %

MnCl

2

x 4 H

2

O Merck > 99 %

MgSO

4

x 7 H

2

O Merck > 98 %

MnSO

4

x 2 H

2

O Merck > 99 %

Na

2

HPO

4

* 2 H

2

O Merck 99,5 %

Na

2

MoO

4

x 2 H

2

O Merck 99,5 %

Na

2

S * 9H

2

O Sigma > 99 %

Na

2

SeO

3

Fluka > 95 %

Na

2

SO

4

Merck > 99 %

Na

2

WO

4

* 2 H

2

O Fluka > 99,5 %

NaCl J. T. Baker 99,5 %

NaHCO

3

Merck 99,7 %

Natriumazetat Riedel-deHäen 99 %

Natriumbenzoat Fluka > 99 %

Natriumfumarat Merck > 99 %

NH

4

Cl Merck > 99,8 %

NiCl

2

x 6 H

2

O Merck mind. 98 %

Nikotinamid Merck > 99%

Nikotinsäure Fluka 99,5 %

Nitriolotriessigsäure Merck > 99 %

n-Octanol Merck > 99 %

ortho-Phosphorsäure Merck 99 %

Pantothensäure Sigma 98 %

Perchlorsäure Merck puriss

Phenol Merck > 99 %

Pyridoxamine-HCl Sigma 98 %

Resazurin Aldrich puriss

Riboflavin Sigma 98 %

Thiamin-HCl x 2 H

2

O Merck > 99 %


51

Toluol Merck 99 %

Vitamin B

12

Sigma 99 %

Xylol Merck 95 %

ZnCl

2

Fluka > 98 %

ZnSO

4

x 7 H

2

O Merck > 99,5 %

III. Ergebnisse

52

3. Ergebnisse

3.1 Toxizitätstests

Im Rahmen dieser Untersuchungen sollte geprüft werden, inwieweit verschiedene

organische Substanzen, darunter aliphatische Alkanole (n-Butanol, n-Hexanol, n-

Octanol), BTEX-Verbindungen (Benzol, Toluol, Ethylbenzol, Xylol) und (chlor-)

phenolische Verbindungen (Phenol, 4-Chlorphenol, 2,4-Dichlorphenol), das

Wachstum anaerob wachsender Bakterien beeinflussen.

Als Testorganismen wurden dazu die drei Bakterienstämme Thauera aromatica DSM

6984, Desulfococcus multivorans DSM 2059 und Geobacter sulfurreducens

DSM12127 ausgewählt. Jeder dieser drei Bakterienstämme nutzt unter anaeroben

Bedingungen einen anderen terminalen Elektronenakzeptor und repräsentiert somit

einen unterschiedlichen anaeroben Stoffwechseltypus. Die Kultivierung der drei

Testorganismen erfolgte unter standardisierten Bedingungen. Die Testsubstanzen

wurden im Verlauf der logarithmischen Wachstumsphase in unterschiedlichen

Konzentrationen zu den Mikroorganismen gegeben. Mit Hilfe der Optischen Dichten

konnten Wachstumsraten bestimmt werden, anhand derer es möglich war, die

relativen Wachstumsinhibitionen zu erfassen bzw. die Konzentrationen zu

bestimmen, die eine 50 %ige Wachstumshemmung der Testorganismen

verursachten. Diese so genannten Effektiven Konzentrationen ermöglichten später

die Einschätzung der Substanztoxizität.


Thauera aromatica mit Natriumbenzoat als C- und Energiequelle unter

denitrifizierenden Bedingungen

Während der Untersuchungen wurde T. aromatica in einem Mineralsalzmedium mit

Natriumbenzoat (5 mM) und Kaliumnitrat (20 mM), die als C- und Energiequelle bzw.

als Elektronenakzeptor dienten, kultiviert. Die Wachstumskontrolle – ohne Zusatz

organischer Lösungsmittel – zeigte dabei eine maximale Wachstumsrate von µ =

0,22 h

-1

, was einer Verdopplungszeit von 4 h und 30 min entsprach. Die Zugabe der

zu testenden organischen Verbindungen erfolgte in der Mitte der logarithmischen

Wachstumsphase.

III. Ergebnisse

53

3.1.1.1 Einfluss aliphatischer Alkanole auf das Wachstum von T. aromatica

unter denitrifizierenden Bedingungen

Aufgrund besserer Dosierbarkeit wurden n-Butanol, n-Hexanol bzw. n-Octanol als

acetonische Stammlösungen (10 M n-Butanol, 7,5 M n-Hexanol bzw. 6 M n-Octanol)

zu den Kulturen von T. aromatica gegeben. Die Endkonzentrationen der zu

prüfenden Substanzen im Kulturmedium sind dem Anhang (Abschnitt 7.4.2.) zu

entnehmen. Nach Zugabe der aliphatischen Alkohole zeigten die Zellen weiterhin

exponentielles Wachstum, wenn auch im Vergleich zur Wachstumskontrolle mit

reduzierten Wachstumsraten (Abb. 3).

n-Octanol [mM]

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8

Wa

ch

stu

m [ %

d

er K

on

tro

lle

]

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Zeit [h]

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

OD

560 n

m

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

A

B

Abb. 3: Effekt von n-Octanol auf das Wachstum von T. aromatica, anaerob kultiviert mit Benzoat (5

mM) und Nitrat (20 mM)

A: Optische Dichten Kontrolle ohne n-Octanol, 0,05 mM, 0,1 mM, 0,2 mM,

0,3 mM, 0,5 mM, 0,7 mM n-Octanol. Der Pfeil markiert den Zeitpunkt, zu dem n-Octanol

zu den Kulturen von T. aromatica gegeben wurde.

B: Relative Wachstumsinhibition. Die gestrichelte Linie zeigt die n-Octanol-Konzentration, die eine 50-

%ige Wachstumsinhibition von T. aromatica nach sich zieht (EC50).

Anhand der ermittelten Wachstumsraten war es möglich, die durch die

verschiedenen Konzentrationen der Testsubstanzen ausgelöste Wachstums-

hemmung, relativ zu den mitgeführten Wachstumskontrollen, die ohne aliphatische

Alkanole inkubiert wurden, zu bestimmen. Es konnte parallel zu den steigenden

Konzentrationen der zugeführten Alkohole eine zunehmende Wachstumshemmung

der T. aromatica-Zellen festgestellt werden (siehe Abb. 3B).

III. Ergebnisse

54

Neben n-Octanol verursachten auch die beiden weiteren untersuchten aliphatischen

Verbindungen eine entsprechende Wachstumshemmung des Denitrifizierers. Es

stellte sich allerdings dabei heraus, dass im Vergleich zu den beiden längerkettigen

Alkanolen n-Hexanol bzw. n-Octanol wesentlich höhere n-Butanol- Konzentrationen

eingesetzt werden mussten, um das Wachstum von T. aromatica einzuschränken

(Abb. 4).

n-Octanol, n-Hexanol [mM]

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Wa

ch

stu

m [%

d

er K

on

tro

lle

]

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

n-Butanol [mM]

0 10 20 30 40 50 60

n-Octanol

n-Hexanol

n-Butanol

Abb. 4: Relative Wachstumshemmung von T. aromatica, anaerob kultiviert, mit Benzoat (5 mM) und

Nitrat (20 mM), ausgelöst durch verschiedene Konzentrationen von n-Butanol, n-Hexanol,

n-Octanol. Die gestrichelte Linie zeigt die Testsubstanzkonzentration, die eine 50-%ige

Wachstumsinhibition von T. aromatica nach sich zieht (EC50).

Während mindestens 21 mM n-Butanol benötigt wurden, um das Wachstum von T.

aromatica um 50 % zu inhibieren, waren bereits 0,23 mM n-Octanol – also etwa

1/100 der n-Butanolkonzentration – ausreichend, um eine vergleichbare Wachstums-

Inhibition zu erreichen.

III. Ergebnisse

55

Tab. 6: Effektive Konzentrationen aliphatischer Alkanole, ermittelt für anaerob kultivierte Zellen von T.

aromatica in Anwesenheit von Nitrat (20 mM) und Benzoat (5 mM).

Substanzen log P Effektive Konzentrationen (EC50)

[mM]

n-Butanol 0,88 21,0 (± 2,60)

n-Hexanol 1,87 1,61 (± 0,10)

n-Octanol 2,92 0,23 (± 0,02)

Je langkettiger und damit hydrophober die getesteten Alkanole waren, desto

toxischer wirkten die aliphatischen Alkanole auf die Zellen von T. aromatica. Mit

Zunahme der Kettenlänge der Aliphaten um je eine C

2

H

4

–Gruppe verminderte sich

der EC50-Wert für T. aromatica jeweils um einen Faktor von etwa 10. Um denselben

wachstumshemmenden Effekt auszulösen, waren somit zehnfach niedrigere

Konzentrationen des längerkettigen Alkanols ausreichend.

3.1.1.2 Einfluss von BTEX-Verbindungen auf das Wachstum von T. aromatica

unter denitrifizierenden Bedingungen

Auch hier wurden die Zellen derart kultiviert, wie im Abschnitt 2.3.1 erläutert. Nach

Zugabe von Benzol, Toluol, Ethylbenzol bzw. Xylol in unterschiedlich hohen

Konzentrationen (Endkonzentrationen siehe Abschnitt 8.4.1) während der

logarithmischen Wachstumsphase wuchsen die Zellen exponentiell weiter –

allerdings mit reduzierten Wachstumsraten. Wie am Beispiel von Benzol dargestellt,

reagierten die Zellen von T. aromatica auf die Zugabe der BTEX-Verbindungen –

analog zu den steigenden Konzentrationen der Monoaromaten – mit einer

zunehmenden Wachstumshemmung (Abb. 65).

III. Ergebnisse

56

Benzol [mM]

0 1 2 3 4 5 6

Wa

ch

stu

m [%

d

er K

on

tro

lle

]

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Zeit [h]

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

OD

5

60

n

m

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

A B

Abb. 5: Effekt von Benzol auf das Wachstum von T. aromatica, anaerob kultiviert mit Benzoat (5 mM)

und Nitrat (20 mM)

A: Optische Dichten Kontrolle ohne Benzol, 1,15 mM, 2,3 mM, 3,4 mM, 3,9

mM, 4,6 mM, 5,8 mM Benzol. Der Pfeil markiert den Zeitpunkt, zu dem Benzol zu den

Kulturen von T. aromatica gegeben wurde.

B: Relative Wachstumsinhibition. Die gestrichelte Linie zeigt die Benzol-Konzentration, die eine 50-


Die Zellen zeigten sich gegenüber den einzelnen BTEX-Verbindungen

unterschiedlich sensibel. Im Vergleich zu Benzol wurde das Wachstum des

Denitrifizierers durch weitaus geringere Konzentrationen von Toluol, Ethylbenzol und

Xylol gehemmt (Abb. 6).

III. Ergebnisse

57

BTEX [mM]

0 1 2 3 4 5 6

Wa

ch

stu

m [%

d

er K

on

tro

lle

]

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Benzol

Toluol

Ethylbenzol

Xylol


Nitrat (20 mM), ausgelöst durch verschiedene Konzentrationen von Benzol, Toluol,

Ethylbenzol, Xylol. Die gestrichelte Linie zeigt die Testsubstanzkonzentration, die eine 50-%ige

Wachstumsinhibition von T. aromatica nach sich zieht (EC50).

Die Toxizität der BTEX-Verbindungen wurde – wie auch die Hydrophobizität –

anscheinend durch die Zahl der Substituenten des Benzolringes entscheidend

beeinflusst. Im Gegensatz zu Benzol, mussten wesentlich geringere Konzentrationen

von Toluol (einfach methylierter Benzolring) bzw. Xylol (doppelt methylierter

Benzolring) eingesetzt werden, um das Wachstum des Denitrifizierers zu hemmen.

Andererseits schien aber nicht nur die Zahl sondern auch die Kettenlänge der

Substituenten die Wirkung der Testsubstanzen zu beeinflussen. So waren im

Vergleich zu Ethylbenzol etwa doppelt so hohe Toluolkonzentrationen bzw. 6-fach

höhere Benzolkonzentrationen nötig um eine 50-%ige Hemmung des Wachstums

von T. aromatica auszulösen.

III. Ergebnisse

58

Tab. 7: Effektive Konzentrationen der BTEX-Verbindungen, ermittelt für anaerob kultivierte Zellen von

T. aromatica in Anwesenheit von Nitrat (20 mM) und Benzoat (5 mM).


[mM]

Benzol 0,88 3,40 (± 0,07)

Toluol 1,87 1,10 (± 0,03)

Xylol 3,12 0,42 (± 0,01)

Ethylbenzol 3,15 0,58 (± 0,04)

Der wachstumshemmende Effekt der einzelnen Substanzen auf die Zellen des

Denitrifizierers konnte nicht nur anhand der Wachstumsraten verfolgt werden, die auf

der Bestimmung der Optischen Dichten basierten, sondern spiegelte sich auch in den

Änderungen des Proteingehaltes pro Kulturvolumen wider - wie hier am Beispiel

Benzol dargestellt (siehe Abb. 7).

Abb. 7: Änderung des Proteingehaltes von T. aromatica, nach anaerober Kultivierung, mit Benzoat (5

mM) und Nitrat (20 mM), nach Zugabe von Benzol in unterschiedlichen Konzentrationen. 0 h,

2 h, 6 h, 8 h nach Zugabe von Benzol

Während sich der Proteingehalt in der Wachstumskontrollkultur, die ohne Benzol

inkubiert wurde, innerhalb von 8 Stunden in etwa vervierfachte, konnte in den

Kulturen, zu denen Benzol zugegeben wurde, eine wesentlich geringere Zunahme

Benzol [mM]

0 1 2 3 4 5 6 7

Pro

te

in

[m

g/l]

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

III. Ergebnisse

59

des Proteingehaltes pro ml Kulturvolumen erfasst werden. Acht Stunden nach

Benzolzugabe war zudem bei höheren Konzentrationen des Lösungsmittels eine

Abnahme des Proteingehaltes pro Kulturvolumen messbar, die vermutlich auf

Zelllysis zurückzuführen ist.

Da T. aromatica in der Lage ist Toluol als Wachstumssubstrat zu nutzen, wurde die

Konzentration von Toluol über den Zeitraum der Untersuchung geprüft. Im

Untersuchungszeitraum – 8 - 10 Stunden nach der Toluolzugabe - konnte keine

Abnahme der Toluolkonzentration erfasst werden. Da erst bei einer Probennahme zu

einem weitaus späteren Zeitpunkt (27 h nach Toluolzugabe) eine Abnahme der

Toluolkonzentration sichtbar war, wurde auf die Darstellung der Daten verzichtet.

III. Ergebnisse

60

3.1.1.3 Einfluss von (chlor-) phenolischen Verbindungen auf das Wachstum

von T. aromatica unter denitrifizierenden Bedingungen

Im Rahmen dieser Untersuchungen wurden die Zellen von T. aromatica wie im

Abschnitt 2.3.1 beschrieben, inkubiert. Um zu prüfen, inwiefern (chlor-) phenolische

Verbindungen das Wachstum von T. aromatica unter anaeroben Bedingungen in

Anwesenheit von Nitrat hemmten, wurden Phenol, 4-Chlorphenol bzw. 2,4-

Dichlorphenol in wässrigen Stammlösungen (Phenol 531 mM, 4-Chlorphenol 200mM,

und 2,4-Dichlorphenol 6,13 mM) zugegeben. Die eingestellten Endkonzentrationen

können dem Abschnitt 7.4.3. entnommen werden.

Ähnlich wie nach Zugabe steigender Konzentrationen der BTEX- Verbindungen bzw.

von aliphatischen Alkanolen, zeigten die Zellen von T. aromatica in Anwesenheit

unterschiedlich hoher Phenol-, 4-Chlorphenol- bzw. 2,4-Dichlorphenolkonzen-

trationen eine konzentrationsabhängige Reduzierung ihrer Optischen Dichten bzw.

der Wachstumsraten (Abb. 8).

Zeit [h]

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

OD

5

60

nm

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

Phenol [mM]

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Wa

ch

stu

m [%

d

er K

on

tro

lle

]

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

A

B

Abb. 8: Effekt von n-Octanol auf das Wachstum von T. aromatica, anaerob kultiviert mit Benzoat (5

mM) und Nitrat (20 mM)

A: Optische Dichten in Anwesenheit von Phenol; Kontrolle ohne Phenol, 1,1 mM, 2,1

mM, 4,3 mM, 8,5 mM, 10,6 mM Phenol. Der Pfeil markiert den Zeitpunkt, zu dem

Benzol zu den Kulturen von T. aromatica gegeben wurde. Der Pfeile markiert den Zeitpunkt, an dem

Phenol zu den Kulturen gegeben wurde.

B: Relative Wachstumsinhibition. Die gestrichelte Linie zeigt die Phenolkonzentration, die eine 50-


III. Ergebnisse

61

Die Zellen zeigten ähnlich wie bei n-Alkanolen und BTEX-Verbindungen festgestellt

unterschiedlich sensibel gegenüber den einzelnen (Chlor-) Phenolen. Im Vergleich

zu Phenol wurde das Wachstum von T. aromatica durch weitaus geringere

Konzentrationen von 4-Chlorphenol bzw. 2,4-Dichlorphenol gehemmt (Abb. 9). Dabei

wurde festgestellt, dass die Toleranz des Denitrifizierers gegenüber den (chlor-)

phenolischen Verbindungen gut mit den Hydrophobizitäten der getesteten

Verbindungen korrelierte (siehe Tab. 8). Im Falle der (chlor-) phenolischen

Verbindungen sank die Toleranz des Denitrifizierers, je stärker die Moleküle

halogeniert waren bzw. je höher der log P

O/W

-Wert (die Hydrophobizität) der

Verbindung lag.

Phenol [mM]

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Wa

ch

stu

m [%

d

er K

on

tro

lle

]

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Chlorphenole [mM]

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0

Phenol

4-Chlorphenol

2,4-Dichlorphenol


Nitrat (20 mM), ausgelöst durch verschiedenen Konzentrationen von 2,4-Dichlorphenol, 4-

Chlorphenol bzw. Phenol. Die gestrichelte Linie zeigt die Testsubstanzkonzentration, die eine 50-


Während 2,4-Dichlorphenol das Zellwachstum von T. aromatica schon bei etwa bei

0,17 mM halbmaximal hemmt, mussten, um einen vergleichbaren Effekt zu erzielen,

mindesten die 3,3-fach höhere Konzentration von 4-Chlorphenol bzw. die 14-fach

stärkere Dosis von Phenol eingesetzt werden (Tab. 8).

III. Ergebnisse

62

Tab. 8: Effektive Konzentrationen (chlor-) phenolischer Verbindungen ermittelt für anaerob kultivierte

Zellen von T. aromatica in Anwesenheit von Nitrat (20 mM) und Benzoat (5 mM).


[mM]

Phenol 1,45 2,40 (± 0,52)

4-Chlorphenol 2,40 0,56 (± 0,03)

2,4-Dichlorphenol 3,20 0,17 (± 0,01)

Neben den bereits gezeigten Wachstumshemmungen, wurde der Verbrauch der

Kohlenstoff- und Energiequelle Natriumbenzoat durch T. aromatica innerhalb des

Untersuchungszeitraums bestimmt. Die quantitative Erfassung von Natriumbenzoat

erfolgte, wie im Abschnitt 2.7.1 erläutert, mittels HPLC. Natriumbenzoat, das bei

einer Retentionszeit von 9,02 min eluierte, konnte anhand der Retentionszeit und des

UV/VIS-Spektrums eines mitgeführter Standards identifiziert werden.

Innerhalb der ersten 11-12 Stunden nach Inkubationsstart sank die Benzoat-

ausgangskonzentration (ursprünglich 5 mM) ab, so dass bei Zugabe der zu

testenden organischen Verbindungen noch durchschnittlich etwa 2,9-3,3 mM des

Substrates in den Kulturüberständen vorlagen. Diese Konzentrationen wurden als

Ausgangskonzentrationen für die Berechnungen der Benzoatumsatzraten in

Anwesenheit unterschiedlicher Schadstoffe herangezogen.

Nach Zugabe der (chlor-) phenolischen Testsubstanzen sank der Benzoatgehalt in

den Überständen der Kulturen, die mit einer der organischen Testverbindung

inkubiert wurden, deutlich langsamer als in den Überständen der

Wachstumskontrolle. Die Geschwindigkeit, mit der T. aromatica Benzoat dabei

umsetzte, sank in Abhängigkeit von der Konzentration der zugesetzten organischen

Verbindungen.

III. Ergebnisse

63

Zeit [h]

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

Be

nzo

at [m

M]

0

1

2

3

4

5

OD

5

60

n

m

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

Zeit [h]

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Be

nzo

at [m

M]

0

1

2

3

4

5

0 mM Phenol

1,1 mM Phenol

2,1 mM Phenol

3,2 mM Phenol

8,5 mM Phenol

10,6 mM Phenol

A

B

Abb. 10: Verwertung des Elektronendonors Benzoat durch T. aromatica, anaerob kultiviert, mit

Benzoat (5 mM) und Nitrat (20 mM) unter Schütteln, bei 30°C

A: während des Wachstums von T. aromatica ohne Zugabe einer Testsubstanz, Optische Dichte,

Benzoat

B: während des Wachstums von T. aromatica in Anwesenheit von Phenol in unterschiedlichen

Konzentrationen mit Nitrat (20 mM).

Während die Wachstumskontrollen ohne phenolische Substanzen Benzoat mit einer

maximalen Rate von 0,41 mM/h umsetzten, so dass 18-20 Stunden nach

Kultivierungsbeginn kein Benzoat mehr in Kulturüberständen nachgewiesen werden

konnte (Siehe Abb. 10A), zeigten die Kulturen, die mit den Testsubstanzen inkubiert

wurden, deutlich reduzierte Umsatzraten des Wachstumssubstrates (Siehe Abb. 10

Tab.9).

III. Ergebnisse

64

Tab. 9: Vergleich der Benzoatumsatzraten von T. aromatica, anaerob kultiviert, mit Benzoat (5 mM)

und Nitrat (20 mM) unter Schütteln, bei 30°C; 8 h nach Zugabe von Phenol, 4-Chlorphenol, 2,4-

Dichlorphenol in unterschiedlichen Konzentrationen.

Phenol [mM] 0 2,1 4,3 6,4 10,6

Benzoatumsatzrate [mM/h] 0,410 0,26 0,23 0,08 0,02

relativer Umsatz Benzoat [%] 100 63 56 20 5

4-Chlorphenol [mM] 0 0,28 0,56 0,78 1,17

Benzoatumsatzrate [mM/h] 0,430 0,161 0,161 0,079 0


2,4-Dichlorphenol [mM] 0 0,12 0,15 0,21 0,31

Benzoatumsatzrate [mM/h] 0,408 0,169 0,093 0,015 0


8 Stunden nach Zugabe der Testsubstanzen zu den nichtadaptierten Zellen von T.

aromatica, die wie unter Abschnitt: 2.3.1. beschrieben kultiviert wurden, lag der

durchschnittliche Ertrag der Wachstumskontrolle in batch-Kultur bei ca. 0,42 g

Trockengewicht / g Benzoat. Als Ausgangspunkt für die Bestimmung wurde dabei der

Zugabezeitpunkt der (chlor-) phenolischen Verbindungen gewählt.

Nach 8-stündiger Inkubation mit Phenol bzw. 4-Chlorphenol oder 2,4-Dichlorphenol

wurde geprüft, wie sich die unterschiedlichen Konzentrationen der Verbindungen auf

den Ertrag auswirkten. Dabei wurde konnte ermittelt werden, dass Phenol, das im

Kulturmedium in unterschiedlichen Endkonzentrationen wurde, erst nach

Überschreiten einer Konzentration > 4,3 mM eine Abnahme des Ertrages

verursachte.

Ein ähnliches Bild ergab sich auch nach Inkubation mit 4-Chlorphenol, das in

unterschiedlichen Endkonzentrationen (siehe Abschnitt 8.9) eingesetzt wurde. Erst

nach Überschreiten einer Endkonzentration von 0,56 mM 4-Chlorphenol (EC50)

konnte eine Abnahme des Ertrages bestimmt werden.

Eine Abnahme der Biomasseerträge wurde auch in Abhängigkeit der eingesetzten

2,4-Dichlorphenolkonzentration erfasst. Im Gegensatz zu Phenol und 4-Chlorphenol

führten jedoch bereits 2,4-Dichlorphenol-Konzentrationen, die unterhalb der

Effektiven Konzentration (0,17 mM) lagen, zu einer wenn auch geringfügigen

Abnahme des Ertrages. Wurden die Biomasseerträge gegen die theoretischen

III. Ergebnisse

65

Membrankonzentrationen der (chlor-) phenolischen Verbindungen (Berechnung

siehe Kapitel 8.3). aufgetragen, wurde festgestellt, dass die Biomasseerträge

unabhängig von dem untersuchtem (Chlor-) Phenol abnahmen sobald eine

theoretische Membrankonzentration von 25-30 mM überschritten wurde (Abb. 11).

theoretische Membrankonzentration [mM]

0 10 20 30 40 50 60 70

Bio

ma

ss

e-E

rtra

g [g

T

G/g

B

en

zo

at]

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

Abb. 11: Wachstumserträge von T. aromatica, anaerob kultiviert, mit Benzoat (5 mM) und Nitrat (20

mM) unter Schütteln, bei 30°C, nach Applikation von Phenol , 4-Chlorphenol und 2,4-

Dichlorphenol , in unterschiedlichen Konzentrationen. Ausgehend von der Konzentration der

(Chlor-) Phenole in wässriger Lösung konnte die theoretische Membrankonzentration der

Verbindungen nach Sikkema et al., 1994, ermittelt werden. Eine Abnahme der Wachstumserträge des

Denitrifizierers konnte oberhalb einer theoretischen Membrankonzentration der Substanzen von >25-

30 mM (grau unterlegter Bereich) erreicht werden.

Bei einem Wachstum mit 5 mM Natriumbenzoat und 20 mM Kaliumnitrat wiesen die

Zellen von T. aromatica eine durchschnittliche ATP Konzentration von 4-5 nmol/mg

Trockengewicht auf. Nach Zugabe der (Chlor-) Phenole konnte in Abhängigkeit der

eingesetzten Konzentration der jeweiligen Testsubstanz eine Änderung der ATP-

Konzentration festgestellt werden. Mit steigender Phenolkonzentration wurde eine

deutliche Verringerung der ATP-Konzentration registriert. Während Phenol im

Konzentrationsbereich zwischen 0-2,4 mM (EC50= 2,4 mM) nur eine leichte

Abnahme der ATP-Konzentration von etwa 10 % verursachten, wurde nach Zugabe

III. Ergebnisse

66

von Phenol in Konzentrationen über 2,4 mM eine starke Reduktion sichtbar (Abb.

12).

Phenol [mM]

0 2 4 6 8 10 12

% A

TP

-G

eh

alt

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

4-Chlorphenol [mM]

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4

2,4-Dichlorphenol [mM]

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35

Abb. 12: Änderung des zellulären ATP-Gehaltes in T. aromatica, anaerob kultiviert mit Benzoat (5

mM) und Nitrat (20 mM) unter Schütteln, bei 30°C; nach 8-stündiger Inkubation mit Phenol , 4-

Chlorphenol und 2,4-Dichlorphenol , in Abhängigkeit von deren Konzentration.

Bei der Untersuchung der zellulären ATP-Konzentration in Abhängigkeit der

eingesetzten 4-Chlorphenolkonzentration wurde festgestellt, dass sich die ATP-

Konzentration im Bereich 0 - 0,56 mM 4-Chlorphenol (EC50= 0,56 mM) nur um etwa

20% verringerte. Erst bei 4-Chlorphenolkonzentrationen > 0,56 mM wurde eine

deutliche Verminderung der ATP-Konzentration erfasst.

Zellen von T. aromatica, die mit 2,4-Dichlorphenol versetzt wurden, zeigten schon bei

2,4-Dichlorphenol-Konzentrationen, die unterhalb der EC50 (EC50 = 0,17 mM) lagen

eine starke Verminderung ihrer zellulären ATP-Konzentration.

Um einen Abbau der phenolischen Verbindungen durch T. aromatica innerhalb des

Untersuchungszeitraumes auszuschließen, wurden 2, 4, 6, und 8 Stunden nach

III. Ergebnisse

67

Zugabe der Verbindungen Proben aus den Kulturüberständen entnommen und die

Konzentrationen der jeweiligen Substanz mittels HPLC bestimmt (siehe Abschnitt

2.7.1.). Im Verlaufe des Untersuchungszeitraumes (8 h) konnten jedoch keine

Änderungen der Phenol-, 4-Chlorphenol- bzw. der 2,4-Dichlorphenolkonzentrationen

in den Kulturüberständen festgestellt werden.

3.1.2 Einfluss von (chlor-) phenolischen Verbindungen auf das Wachstum von

Thauera aromatica in Anwesenheit von Luftsauerstoff

T. aromatica ist in der Lage Natriumbenzoat sowohl unter nitratreduzierenden

Bedingungen als auch unter aeroben Verhältnissen unter Nutzung von Luftsauerstoff

als terminalen Elektronenakzeptor, zu verwerten. Um zu prüfen, ob bzw. welchen

Einfluss terminale Elektronenakzeptoren auf die Sensitivität des Bakteriums

gegenüber Lösungsmitteln haben, wurden die Toxizitätstests mit den (chlor-)

phenolischen Verbindungen unter aeroben Bedingungen wiederholt. Dazu wurden

die Zellen, wie im Abschnitt 2.3.2 beschrieben, inkubiert. Nach Erreichen eines

Zelltiters, der einer Optischen Dichte von 0,4 entsprach, wurden Phenol, 4-

Chlorphenol bzw. 2,4-Dichlorphenol in ansteigenden Konzentrationen zugegeben.

Während die Zellen der Kontrollkultur, zu den keine Lösungsmittel zugegeben

wurden, mit einer maximalen Wachstumsrate von µ = 0,13 h

-

wuchsen, was in etwa

einer Verdopplungszeit von 7 h, 42 min entsprach, zeigten die Zellen, die mit (chlor-)

phenolischen Verbindungen inkubiert wurden, in Abhängigkeit der Test-

substanzkonzentration eine deutliche Verminderung ihrer Wachstumsraten. Die unter

aeroben Bedingungen ermittelten Effektiven Konzentrationen für 4-Chlorphenol und

2,4-Dichlorphenol unterschieden sich nur geringfügig von den EC50-Werten die unter

anaeroben Bedingungen bestimmt wurden waren (Abb. 13 und Tab. 10).

III. Ergebnisse

68

(Chlor-) Phenol [mM]

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

Wa

ch

stu

m [%

d

er K

on

tro

lle

]

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Abb. 13: Einfluss von Phenol (Kreis), 4-Chlorphenol (Dreieck) und 2,4-Dichlorphenol (Quadrat) auf

das Wachstum von T. aromatica, aerob (ungefüllte Zeichen) bzw. anaerob unter Nutzung von Nitrat

(20 mM) kultiviert (gefüllte Zeichen), mit Benzoat (5 mM) bei 30°C unter Schütteln (180 rpm).

Allerdings zeigten sich die Zellen von T. aromatica gegenüber Phenol in

Anwesenheit von Luftsauerstoff wesentlich empfindlicher. Waren unter anoxischen

Verhältnissen mindestens 2,4 mM Phenol nötig, um das Wachstum von T. aromatica

um 50 % zu inhibieren, so reichte unter aeroben Bedingungen schon in etwa eine 5,5

fach geringere Dosis aus um einen ähnlichen Effekt zu erzielen (siehe Abb. 12 und

Tab. 10).

Tab. 10: Effektive Konzentrationen (chlor-) phenolischer Verbindungen ermittelt für aerob kultivierte

Zellen von T. aromatica in Anwesenheit von Benzoat (5 mM).


[mM]

Phenol 1,45 0,426 (± 0,1)

4-Chlorphenol 2,40 0,611 (± 0,07)

2,4-Dichlorphenol 3,20 0,114 (± 0,02)

III. Ergebnisse

69


Geobacter sulfurreducens

Im Rahmen der Inkubationsversuche wurden die Zellen von G. sulfurreducens, wie

unter Abschnitt 2.3.3. beschrieben, in einem Mineralsalzmedium in Anwesenheit von

Acetat (5mM) kultiviert. Als Elektronenakzeptor diente Fumarat, das in einer

Endkonzentration von 25 mM zu dem Flüssigmedium zugesetzt wurde. Im ersten

Drittel der logarithmischen Wachstumsphase wurden die Testsubstanzen pur

(Benzol, Toluol, Ethylbenzol, Xylol) oder als wässrige Stammlösungen (531 mM

Phenol, 200 mM 4-Chlorphenol, 6,13 mM 2,4-Dichlorphenol) in unterschiedlichen

Konzentrationen zu den Kulturen von G. sulfurreducens gegeben. Die eingesetzten

Konzentrationen sind Abschnitt 7.4 zu entnehmen. Die Zellen der

Wachstumskontrolle, die ohne Testverbindungen inkubiert wurden, wuchsen mit

einer Wachstumsrate von etwa µ = 0,14 h

-

. Die Zellen, die mit den Testsubstanzen

inkubiert wurden, wuchsen ebenfalls exponentiell weiter, reagierten aber in

Abhängigkeit von den Testsubstanzkonzentrationen mit einer Verminderung ihrer

Verdopplungszeiten bzw. ihrer Wachstumsraten, wie hier am Beispiel von Benzol

dargestellt (Abb.14).

Benzol [mM]

0 1 2 3 4 5 6

Wa

ch

stu

m [%

d

er K

on

tro

lle

]

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Zeit [h]

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

OD

5

60

n

m

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

A

B

Abb. 14: Wachstum von G. sulfurreducens, anaerob kultiviert mit Acetat (5 mM) und Fumarat (25 mM)

in Anwesenheit von Benzol in unterschiedlichen Konzentrationen

A: Optische Dichten Kontrolle ohne Benzol, 1,07 mM, 2,15 mM, 3,22 mM,

3,68 mM, 4,29 mM, 5,36 mM Benzol. Der Pfeil markiert den Zeitpunkt, zu dem Benzol zu

den Kulturen von G. sulfurreducens gegeben wurde.

B: Relative Wachstumsinhibition. Die gestrichelte Linie zeigt die Benzol-Konzentration, die eine 50-

%ige Wachstumsinhibition von G. sulfurreducens nach sich zieht (EC50).

III. Ergebnisse

70

Ebenso wie Benzol verursachten steigenden Konzentrationen von Toluol,

Ethylbenzol und Xylol eine zunehmende Wachstumshemmung der Geobacter-Zellen.

Die für Benzol und Toluol erfassten EC50-Werte, lagen deutlich höher als die EC50-

Werte, die für Ethylbenzol und Xylol ermittelt wurden. Diese beiden Substanzen

führten bereits bei Konzentrationen unterhalb von 0,4 mM zu einer 50%igen

Wachstumsinhibition (Tab. 11).

Nach Zugabe (chlor-) phenolischer Verbindungen konnte ebenfalls eine

konzentrationsabhängige Wachstumshemmung von G. sulfurreducens festgestellt

werden. Ähnlich wie T. aromatica, reagierten die Zellen von G. sulfurreducens

zunehmend empfindlicher auf die phenolischen Verbindungen je stärker chloriert

bzw. je hydrophober diese waren. So lagen die EC50-Werte für 4-Chlorphenol (EC50

= 0,97 mM) und 2,4-Dichlorphenol (EC50 = 0,21 mM), die für Geobacter unter

fumaratreduzierenden Bedingungen bestimmt wurden, etwa um das 8- bzw. 33-fache

niedriger als die EC50-Werte für Phenol (EC50 = 7,60 mM) (siehe Abb. 15, Tab. 11).

Phenol [mM]

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Wa

ch

stu

m [%

d

er K

on

tro

lle

]

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Chlorphenole [mM]

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

Abb. 15: Relative Wachstumshemmung von G. sulfureducens, anaerob kultiviert, mit Acetat (5 mM)

und Fumarat (25 mM), ausgelöst durch verschiedenen Konzentrationen von Phenol, 4-

Chlorphenol und 2,4-Dichlorphenol, 8h nach Zugabe.

III. Ergebnisse

71

Tab. 11: Effektive Konzentrationen verschiedener organischer, umweltrelevante Lösungsmittel und

Schadstoffe; ermittelt für anaerob kultivierte Zellen von G. sulfurreducens in Anwesenheit von Acetat

(5 mM) und Fumarat (25 mM) unter Schütteln, bei 34°C.


[mM]

Monoaromaten

Benzol 2,13 3,70 (± 0,02)

Toluol 2,48 1,20 (± 0,01)

Ethylbenzol 3,03 0,28 (± 0,01)

Xylol 3,17 0,35 (± 0,01)

(Chlor-)Phenole

Phenol 1,45 7,60 (± 0,12)

4-Chlorphenol 2,40 0,79 (± 0,07)

2,4-Dichlorphenol 3,20 0,21 (± 0,02)

Auf die Bestimmung der EC50 der n-Alkanole für G. sulfurreducens mußte leider aus

zeitlichen Gründen verzichtet werden.

III. Ergebnisse

72



Für die Untersuchungen wurden die Zellen von D. multivorans in einem

Mineralsalzmedium mit Sulfat (25 mM) als terminalen Elektronenakzeptor kultiviert,

wie unter Abschnitt 2.3.4. beschrieben. Als Elektronendonor diente Natriumbenzoat,

das dem Flüssigmedium in einer Endkonzentration von 4 mM zugegeben wurde. Die

Zugabe der verschiedenen organischen Lösungsmittel erfolgte analog zu den

anderen Mikroorganismen im ersten Drittel der logarithmischen Wachstumsphase.

Die Zellen wuchsen nach Zugabe der Testsubstanzen weiter, reagierten aber in

Abhängigkeit von den Konzentrationen der jeweiligen Testsubstanz mit einer

Reduktion ihrer Wachstumsraten, während die Zellen der Wachstumskontrolle mit

einer max. Wachstumsrate von µ = 0,028 h

-

(Verdopplungszeit von 35 h und 42 min)

weiter wuchsen, wie nach Zugabe von n-Hexanol zu den Zellen von D. multivorans

demonstriert wurde (siehe Abb. 16).

n-Hexanol [mM]

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Wach

stu

m [%

d

er K

on

tro

lle]

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

Zeit [d]

0 1 2 3 4 5 6

OD

560n

m

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

A

B

Abb. 16: Wachstum von D. multivorans, anaerob kultiviert mit Benzoat (4 mM) und Sulfat (25 mM) in

Anwesenheit von n-Hexanol in unterschiedlichen Konzentrationen

A: Optische Dichten Kontrolle ohne n-Hexanol, 1,0 mM, 3,0 mM, 6,0 mM, 9,0

mM n-Hexanol. Der Pfeil markiert den Zeitpunkt, zu dem n-Hexanol zu den Kulturen von D.

multivorans gegeben wurde.

B: Relative Wachstumsinhibition. Die gestrichelte Linie zeigt die n-Hexanolkonzentration, die eine 50-

%ige Wachstumsinhibition von D. multivorans nach sich zieht (EC50).

III. Ergebnisse

73

Bei der Untersuchung der Wirkung aliphatischer Verbindungen, wurde wie bei T.

aromatica deutlich, dass mit steigender Hydrophobizität der alphatischen n-Alkanole,

die mit der Zunahme der Kettenlänge der Moleküle einhergeht, geringere

Konzentrationen ausreichten, um das Wachstum des Sulfatreduziers zu hemmen.

Die längerkettigeren und somit hydrophoberen Alkanole n-Hexanol und n-Octanol

hemmten das Wachstum des Sulfatreduzierers in vielfach geringeren

Konzentrationen als n-Butanol (siehe Tab. 12). Im Vergleich zu dem relativ gut

wasserlöslichen, kurzkettigen n-Butanol genügten in etwa 10- bzw. 100-fach

niedrigere Konzentrationen der beiden Verbindungen, um das Wachstum von D.

multivorans um 50 % einzuschränken.

Auch gegenüber den BTEX-Verbindungen reagierten die Zellen des Sulfat-

reduzierers unterschiedlich empfindlich. Auch hier korrelierten die

Wachstumshemmungen wiederum mit den Substanzhydrophobizitäten. Um das

Wachstum des Sulfatreduzierers durch Xylol oder Ethylbenzol um 50 % zu

inhibieren, waren währenddessen mit 0,45 mM bzw. 0,44 mM bereits 9-10-fach

niedrigere Konzentrationen ausreichend (siehe Abb 17 A und B, Tab. 12).

Benzol, Toluol [mM]

0 1 2 3 4 5 6 7

Wa

ch

stu

m [%

d

er K

on

tro

lle

]

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Ethylbenzol, Xylol [mM]

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7

Wa

ch

stu

m [%

d

er K

on

tro

lle

]

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

A

B

Abb. 17: Relative Wachstumshemmung von D. multivorans, anaerob kultiviert, mit Benzoat (4 mM)

und Sulfat (25 mM) unter Schütteln, bei 34°C, ausgelöst durch A: Benzol, Toluol, in

verschiedenen Konzentrationen, 4 Tage nach Lösungsmittelzugabe. B: Ethylbenzol, Xylol,

in verschiedenen Konzentrationen, 4 Tage nach Lösungsmittel-zugabe. Die gestrichelte Linie zeigt die

Lösungsmittelkonzentration, die eine 50-%ige Wachstumsinhibition von D. multivorans nach sich zieht

(EC50).

Das Zellwachstum des Sulfatreduzierers wurde ebenfalls durch alle drei getesteten

(chlor-) phenolischen Verbindungen gehemmt. Die ermittelten EC50-Werte

III. Ergebnisse

74

unterschieden sich jedoch von denen, die für die anderen beiden Bakterienstämme

ermittelt wurden.

Wie bei den anderen Mikroorganismen war jedoch ein Anstieg der Substanztoxizität

mit zunehmendem Halogenierungsgrad bzw. mit zunehmender Hydrophobizität der

Substanzen feststellbar.

Tab. 12: Effektive Konzentrationen verschiedener organischer, umweltrelevante Lösungsmittel und

Schadstoffe; ermittelt für anaerob kultivierte Zellen von D. multivorans in Anwesenheit von Benzoat (4

mM) und Sulfat (25 mM) unter Schütteln, bei 34°C.


[mM]

aliphatische Alkanole

n-Butanol 0,88 70,0 (± 8,5)

n-Hexanol 1,87 6,40 (± 0,14)

n-Octanol 2,92 0,62 (± 0,04)

Monoaromaten

Benzol 2,13 4,50 (± 0,42)

Toluol 2,48 1,58 (± 0,11)

Ethylbenzol 3,03 0,44 (± 0,06)

Xylol 3,17 0,45 (± 0,06)

(Chlor-) Phenole

Phenol 1,45 8,5 (± 0,93)

4-Chlorphenol 2,40 0,96 (± 0,03)

2,4-Dichlorphenol 3,20 0,12 (± 0,02)

Der Einfluss der organischen Testsubstanzen auf die Zellen des Sulfatreduzierers

wurde auch in Anwesenheit einer höheren Elektronendonorkonzentration (Benzoat-

endkonzentration von 17 mM) untersucht. Allerdings konnten dabei keine

signifikanten Änderungen der Effektiven Konzentrationen (EC50) beobachtet werden.

Lediglich die Effektiven Konzentrationen (EC50) von Benzol und Chlorphenol, die für

D. multivorans in Anwesenheit hoher und niedriger Konzentrationen des

Elektronendonors ermittelt wurden, wichen etwas voneinander ab. Wurden die Zellen

des Sulfatreduzierers mit der höheren Konzentration des Elektronendonors inkubiert,

III. Ergebnisse

75

wurde das Wachstum des Mikroorganismus bereits durch 3,7 mM Benzol bzw. 0,65

mM 4-Chlorphenol halbmaximal gehemmt.

Die quantitative Erfassung der Kohlenstoff- und Energiequelle Benzoat während des

Wachstums durch Zellen von D. multivorans erfolgte wie unter Abschnitt 2.7.1.

erläutert, mittels HPLC. Im Vergleich zu den Zellen von T. aromatica, die wesentlich

schneller wuchsen, baute die Zellen von D. multivorans Benzoat erheblich langsamer

ab. Erst 144 h nach Inkubationsbeginn war in den Kulturüberständen der

Wachstumskontrollen, die ohne hemmende Substanzen inkubiert wurden, kein

Benzoat mehr nachweisbar. Um die Umsatzraten nach Zugabe der Testsubstanzen

besser miteinander vergleichen zu können, wurde der Zugabezeitpunkt der

Testsubstanzen als t

0

definiert. Zu diesem Zeitpunkt lagen im Durchschnitt noch etwa

2,5-2,7 mM Benzoat im Kulturmedium vor.

Während die Zellen der Wachstumskontrolle Benzoat dabei weiter mit einer

maximalen Abbaurate von ca. 0,036 - 0,039 mM/h umsetzten, zeigten Zellen des

Sulfatreduzierers, die zusätzlich mit einer der organischen Testsubstanzen inkubiert

wurden, in Abhängigkeit der eingesetzten Testsubstanzkonzentrationen eine

Veränderung ihrer maximalen Natriumbenzoatumsatzraten. Wie nachfolgend am

Beispiel von Ethylbenzol gezeigt wird, konnten dabei analog zu reduzierten

Wachstumsraten nach Zugabe steigender Testsubstanzkonzentrationen eine

Reduktion der Benzoatumsatzgeschwindigkeit beobachtet werden (Tab. 13).

Tab. 13: Vergleich der Benzoatumsatzraten von D. multivorans, kultiviert mit Benzoat (4 mM) und

Sulfat (25 mM), unter Schütteln, bei 34°C; 4d nach Zugabe von Ethylbenzol in unterschiedlichen

Konzentrationen

Ethylbenzol [mM] 0 0,29 0,385 0,472 0,617

max. Benzoatumsatzrate [mM/h] 0,036 0,026 0,016 0,007 0

relativer Benzoatumsatz /h [%] 100 72 44 20 0

Wachstum [ % der Kontrolle] 100 89 67 41 0

III. Ergebnisse

76

3.1.5 Quantitative Struktur-Wirkungs-Beziehung (QSAR) für die getesteten

Mikroorganismen

Mit Hilfe der ermittelten Effektiven Konzentrationen (EC50) war es möglich, für alle

drei untersuchten Mikroorganismen eine Quantitative Struktur-Wirkungsbeziehung zu

erstellen, die einen Zusammenhang zwischen der Hydrophobizität der getesteten

Chemikalien und deren toxischer Wirkung erkennen ließ. Dazu wurden die

ermittelten Effektiven Konzentrationen (EC50) halblogarithmisch gegen die

Hydrophobizitäten (log P-Werte), die jeweils den Tabellen 6, 8, 11, 12 entnommen

werden können, in einem Diagramm aufgetragen (siehe Abb. 18).

Anhand der sich daraus ergebenden negativen Korrelation zeigte sich, dass die

untersuchten Substanzen in Abhängigkeit von der Substanzhydrophobizität jedoch

relativ unabhängig von den Substanzklassen toxisch auf die Mikroorganismen

wirkten. Mit zunehmender Substanzhydrophobizität (steigendem log P-Wert) reichten

wesentlich geringere Substanzkonzentrationen aus, um das Wachstum von T.

aromatica, G. sulfurreducens bzw. D. multivorans zu hemmen.

Für alle drei Mikroorganismen wurde ein log-P

O/W

-abhängiges QSAR-Modell

bestimmt, das folgende generelle Form aufwies:

Log (1/EC50)= - a log P

O/W

+ b

Die Modelle (Tab. 14) unterscheiden sich hinsichtlich ihres Anstiegs a und der

Nullstelle b. Auf eine statistische Auswertung wurde verzichtet, da die Zahl der

untersuchten Verbindungen zu gering ist, um eine aussagekräftige, vollständig

abgesicherte Analyse zu erlauben.

Die Korrelation von T. aromatica unterschied sich allerdings von denen der anderen

beiden Bakterienstämme. T. aromatica tolerierte unabhängig von der

Substanzhydrophobizität vergleichsweise hohe Konzentrationen der BTEX-

Verbindungen, reagierte aber empfindlicher auf (chlor-) phenolische Verbindungen

und n-Alkanole(Abb. 18).

III. Ergebnisse

77

log P

Octanol/Wasser

0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5

EC

5

0 [m

M]

0,1

1

10

100

1000

log P

Octanol/Wasser

0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5

EC

5

0 [m

M]

0,1

1

10

100

1000

log P

Octanol/Wasser

0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5

EC

5

0 [m

M]

0,1

1

10

100

1000

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

A

2.

4.

5.

6.

8.

9.

10.

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

B

C

Abb. 18: Quantitative Struktur-Wirkungsbeziehung (QSAR) von BTEX-Verbindungen, n-Alkanolen und

(chlor-) phenolischen Verbindungen für T. aromatica (A), G. sulfurreducens (B) und D. multivorans (C);

1. n-Butanol, 2. Phenol, 3. n-Hexanol, 4. Benzol, 5. 4-Chlorphenol, 6. Toluol, 7. n-Octanol, 8 Xylol, 9.

Ethylbenzol, 10. 2,4-Dichlorphenol

III. Ergebnisse

78

Tab. 14: Quantitative Struktur-Wirkungsbeziehung (QSAR) für BTEX-Verbindungen, n-Alkanole und

(chlor-) phenolische Verbindungen, ermittelt für T. aromatica, D. multivorans, G. sulfurreducens

Organismen

QSAR n r

(Chlor-) Phenole und

n-Alkanole

Log(1/EC50)= 0,831 log P – 2,303 6 0,972

T. aromatica

BTEX-Verbindungen Log(1/EC50)= 0,865 log P – 1,878 4 0,963

G. sulfurreducens

a

Log(1/EC50)= 0,872 log P - 2,239 7 0,936

D. multivorans

Log(1/EC50)= 0,979 log P - 2,594 10 0,979

a.

ohne n-Alkanole

n Anzahl der Datenpunkte

r Korrelationsfaktor

III. Ergebnisse

79

3.2 Änderung der zellulären Fettsäurezusammensetzung anaerob

kultivierter Mikroorganismen nach Inkubation mit organischen

Lösungsmitteln

In den vorangegangen Kapiteln wurde beschrieben, welchen Einfluss die

verschiedenen Lösungsmittel auf das Wachstum einzelner anaerob wachsender

Bakterien hatten. Innerhalb der folgenden Experimente sollte geprüft werden, ob

bzw. inwieweit die untersuchten drei Mikroorganismen in der Lage sind, sich an den

durch Lösungsmittel ausgelösten Streß anzupassen. Zu diesem Zweck wurde die

zelluläre Fettsäurezusammensetzung der Bakterien in Anwesenheit von organischen

Lösungsmitteln untersucht.

3.2.1 Änderung der zellulären Fettsäurezusammensetzung von T. aromatica

Das zelluläre Fettsäurespektrum von T. aromatica-Zellen, die unter anaeroben

Bedingungen mit Benzoat (5 mM) und Nitrat (20 mM) kultiviert wurden, enthielt

vorrangig Hexadecanoat (Palmitinsäure, C16:0), cis-Hexadecenoat (Palmito-

leinsäure, C16:1cis-Δ9) und cis-Octadecenoat (cis-Vaccensäure, C18:1cis- Δ11), die

zusammen mehr als 98 % des Gesamtfettsäuregehaltes der Zellen ausmachten.

Octadecanoat (Stearinsäure, C18:0) konnte nur in Spuren nachgewiesen werden.

Fettsäuren

cis-16:1

n-16:0

cis-18:1

n-18:0

% A

nte

il a

m G

es

am

t-F

A-G

eh

alt

0

10

20

30

40

50

60

Abb. 19: Fettsäurespektrum von T. aromatica, anaerob kultiviert mit Benzoat (5 mM) und Nitrat (20

mM) bei 30°C, nach 20 h.

III. Ergebnisse

80

Somit entsprach das im Verlaufe dieser Studie erfasste zelluläre Fettsäure-spektrum

in etwa dem von Anders et al. (1995) beschriebenen Spektrum von T. aromatica-

Zellen. Jedoch wiesen die Zellen von T. aromatica, die Benzoat als C- und

Energiequelle nutzten, im Gegensatz zu den von Anders et al. (1995) mit Phenol

kultiviert Zellen, einen geringeren Anteil von Hexadecanoat (C16:0) auf. Zudem

wurde in benzoatkultivierten Zellen keine Dodecanoat (C12:0) gefunden.

Als Indikator für eine Anpassungsreaktion wurde der so genannte Sättigungsgrad der

zellulären Fettsäuren gewählt, der das Verhältnis zwischen gesättigten und unge-

sättigten Fettsäuren beschreibt. Unter den gewählten Kultivierungsbedingungen lag

der Sättigungsgrad der zellulären Fettsäuren unbehandelter, logarithmisch

wachsender Zellen von T. aromatica im Durchschnitt bei etwa 0,47 (± 0,027).

Wie sich im Verlaufe dieser Untersuchung herausstellte, reagierte T. aromatica auf

die Anwesenheit der Testverbindungen mit einer allmählichen Erhöhung des

Sättigungsgrades (siehe Abb. 20). Um zu prüfen, in welchem Zeitrahmen die

Erhöhung des Sättigungsgrades stattfand, wurden die Fettsäurespektren von T.

aromatica-Kulturen, die in Anwesenheit von Phenol (Endkonzentration 2,1 mM) bzw.

ohne Phenol inkubiert wurden, über einen Zeitraum von 23 h nach Phenolzugabe

erfasst und miteinander verglichen. Dabei wurde festgestellt, dass der

Sättigungsgrad der Kontrollzellen, auch nach Übergang in die stationäre

Wachstumsphase, nur geringfügig um einen Wert von 0,5 schwankte.

Währenddessen wurde in den Zellen, die mit Phenol versetzt wurden, im Verlaufe

der ersten 15 Stunden nach Phenolzugabe eine Zunahme des Sättigungsgrades um

ca. 0,125 erfasst. Eine Verlängerung der Inkubationszeit führte nicht zu einer

weiteren Erhöhung des Sättigungsgrades.

Die Ursache für den Anstieg des Sättigungsgrades lag in der Erhöhung des relativen

Anteils der gesättigten Fettsäure Hexadecanoat (C16:0) und der Abnahme der

beiden ungesättigten Fettsäuren (C16:1 und C18:1), wie am Beispiel der Reaktion

von T. aromatica nach Applikation von Phenol bzw. Benzol deutlich wird (Abb. 21).

Das Ausmaß der Reaktion hing dabei wesentlich von den jeweiligen Substanzen

bzw. deren Konzentrationen ab. Die Daten zu den Änderungen der zellulären

III. Ergebnisse

81

Fettsäurezusammensetzung nach Zugabe der unterschiedlichen Testsubstanzen

wurden in den Tabellen 8.4.1 und 8.4.2 im Abschnitt 8 zusammengefasst.

Zeit [h]

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

Sättig

un

gsg

rad

0,40

0,45

0,50

0,55

0,60

0,65

0,70

Abb. 20: Änderung des Sättigungsgrades von T. aromatica, anaerob kultiviert mit Benzoat (5 mM) und

Nitrat (20 mM), nach Zugabe von Phenol. Sättigungsgrad der Kontrollzellen, die ohne Phenol

inkubiert wurden; Sättigungsgrad der Zellen, die mit Phenol (Endkonzentration 2,1 mM) inkubiert

wurden

% Anteil vom Gesamt-FA-Gehalt

0 10 20 30 40 50 60

Fe

tts

äu

re

n

cis-16:1

n-16:0

cis-18:1

n-18:0

0 mM Phenol

1,1 mM Phenol

2,1 mM Phenol

4,3 mM Phenol

6,4 mM Phenol

% Anteil vom Gesamt-FA-Gehalt

0 10 20 30 40 50 60

Fe

tts

äu

re

n

cis-16:1

n-16:0

cis-18:1

n-18:0

0 mM Benzol

1,2 mM Benzol

2,2 mM Benzol

4,6 mM Benzol

5,7 mM Benzol

A

B

Abb. 21: Einfluss von Phenol (A) bzw. Benzol (B) auf das zelluläre Fettsäurespektrum von

T. aromatica, anaerob kultiviert mit Benzoat (5 mM) und Nitrat (20 mM), 8 h nach Zugabe von Phenol

und Benzol in unterschiedlichen Konzentrationen

III. Ergebnisse

82

Mit Zunahme der Konzentrationen der zugeführten Testsubstanzen konnte ein

Anstieg des Sättigungsgrades um durchschnittlich 27-57 % ermittelt werden.

Dabei zeigte die maximale Erhöhung des Sättigungsgrades in Abhängigkeit von der

untersuchten Testverbindung sobald eine bestimmte Wachstumshemmung erreicht

wurde. In Anwesenheit (chlor-) phenolischer Verbindungen bzw. von n-Hexanol und

n-Octanol wurde die maximale Erhöhung des Sättigungsgrades erreicht, wenn das

Wachstum von T. aromatica um mehr als 50 % inhibiert wurde, wie auch am Beispiel

von Phenol zuerkennen ist (siehe Abb. 22). Im Vergleich dazu zeigte T. aromatica in

Gegenwart von Benzol und Toluol die maximale Erhöhung des Sättigungsgrades

sobald das Zellwachstum um 25-50 % gehemmt wurde (siehe Abb. 23).

Bei einer Erhöhung der Lösungsmittelkonzentrationen darüber hinaus, trat in der

Regel keine weitere Erhöhung des Sättigungsgrades auf.

Phenol [mM]

0 1 2 3 4 5 6 7

Wach

stu

m [%

d

er K

on

tro

lle]

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Sättig

un

gsg

rad

0,45

0,50

0,55

0,60

0,65

0,70

0,75

0,80

0,85

Abb. 22: Effekt von Phenol auf den Sättigungsgrad der zellulärer Fettsäuren von T. aromatica,

anaerob kultiviert mit Benzoat (5 mM) und Nitrat (20 mM), 8 h nach Zugabe von Phenol in

verschiedenen Konzentrationen; Wachstum und Sättigungsgrad. Die gestrichelte Linie zeigt

die Phenol-Konzentration, die eine 50 %ige Wachstumsinhibition von T. aromatica nach sich zieht

(EC50).

III. Ergebnisse

83

Benzol [mM]

0 1 2 3 4 5

Wach

stu

m [%

d

er K

on

tro

lle]

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Sättig

un

gsg

rad

0,45

0,50

0,55

0,60

0,65

0,70

0,75

0,80

0,85

Abb. 23: Effekt von Benzol auf den Sättigungsgrad der zellulärer Fettsäuren von T. aromatica,

anaerob kultiviert mit Benzoat (5 mM) und Nitrat (20 mM), 8 h nach Zugabe von Benzol in

unterschiedlichen Konzentrationen; Wachstum und Sättigungsgrad. Die gestrichelte Linie

zeigt die Phenol-Konzentration, die eine 50 %ige Wachstumsinhibition von T. aromatica nach sich

zieht (EC50).

III. Ergebnisse

84

3.2.2 Änderung der zellulären Fettsäurezusammensetzung von G. sulfur-

reducens

Das Fettsäurespektrum von Zellen von G. sulfurreducens, die unter anaeroben

Bedingungen in Anwesenheit von 5 mM Acetat und 25 mM Fumarat wuchsen,

beinhaltete vorrangig Hexadecanoat (Palmitinsäure, C16:0) und cis-Hexadecanoat

(Palmitoleinsäure, C16:1cis-Δ9), die zusammen mehr als 80 % des gesamten

Fettsäuregehaltes ausmachten. Daneben konnten geringe Menge von Tetradecanoat

(Myristinsäure, C14:0), 13-Methyltetradecanoat (iso C15:0), cis-Hexadecenoat

(C16:1cis-Δ11), cis-Octadecenoat (cis-Vaccensäure, C18:1cis-Δ11), Ocatdecanoat

(Stearinsäure, C 18:0) bzw. Spuren von 12-Methyltetradecanoat (anteiso-C15:0)

bzw. Pentadecanoat (C15:0) nachgewiesen werden (Abb. 24).

0

10

20

30

40

50

60

n-1

4:0

i-1

5:0

ai-1

5:0

n-1

5:0

n-1

6:1

Δ

9

n-1

6:1

Δ

11

n-1

6:0

n-1

8:1

Δ

11

n-1

8:0

Fettsäuren

%A

nte

il a

m G

es

am

t-F

A-G

eh

alt

Abb. 24: Zelluläre Fettsäurezusammensetzung von G. sulfurreducens, anaerob kultiviert mit Acetat (5

mM) und Fumarat (25 mM), bei 34°C, unter Schütteln (100 rpm).

10-Methylhexadecanoat, eine Fettsäure, die u. a. als Indikator für die Anwesenheit

von G. metallireducens dient, wurde nicht nachgewiesen. Der Sättigungsgrad

ungestresster, logarithmisch wachsender G. sulfurreducens-Zellen lag unter den

gewählten Kulturbedingungen und bei Vernachlässigung der verzweigten Fettsäuren,

die nur einen geringen Anteil am gesamten Gesamtfettsäuregehalt ausmachten, bei

durchschnittlich 0,75 (± 0,1).

III. Ergebnisse

85

Wie am Beispiel von Phenol und Benzol (Abb. 25 und 26) deutlich wird, konnte nach

Zugabe der Testverbindungen Veränderungen innerhalb des Fettsäurespektrums

festgestellt werden. In Kulturen von G. sulfurreducens, die in Anwesenheit der

Testverbindungen wuchsen, war eine deutliche Zunahme des Anteils der gesättigten

Fettsäuren zu verzeichnen. Die Erhöhung wurde dabei im Wesentlichen durch die

relative Zunahme von Hexadecanoat (C16:0) verursacht, dessen Anteil um ca. 15 %

stieg. Parallel dazu wurde eine Verminderung des Anteils der ungesättigten

Fettsäuren relativ zum Gesamtfettsäuregehalt festgestellt. Die Ursachen dafür lag in

der relativen Abnahme von Hexadecenoat (C16:1, cis Δ9, Palmitoleinsäure), deren

Anteil um ca. 15 % sank.

Diese Veränderung der zellulären Fettsäurezusammensetzung zog eine Erhöhung

des Sättigungsgrades nach sich. In Abhängigkeit von der jeweiligen zugesetzten

Substanz bzw. deren Konzentrationen erhöhte sich der Sättigungsgrad der zellulären

Fettsäuren der Zellen, die mit den Testsubstanzen inkubiert wurden, verglichen mit

dem Sättigungsgrad der Kontrollzellen, die nicht mit Lösungsmitteln inkubiert wurden,

maximal um einen Faktor von 1,5-2.

Der Erhöhung des Sättigungsgrades der zellulären Fettsäuren waren ähnlich wie bei

T. aromatica Grenzen gesetzt. Je nach Testverbindung wurde die maximale

Änderung des Sättigungsgrades bei unterschiedlichen Substanzkonzentrationen

bzw. Wachstumshemmungen verzeichnet .So konnte nach Zugabe relativ hoher

Konzentrationen von Phenol, Toluol und 2,4-Dichlorphenol eine weniger starker

Anstieg des Sättigungsgrades erfasst werden. Nach Inkubation mit Ethylbenzol, Xylol

bzw. 4-Chlorphenol in hohen Konzentrationen stieg der Sättigungsgrad jedoch weiter

an.

Die genauen Änderungen der zellulären Fettsäurezusammensetzung bzw. der

Änderung des Sättigungsrades von G. sulfurreducens nach Zugabe der

verschiedenen Testsubstanzen sind in Abschnitt 8.5 zusammengefasst.

III. Ergebnisse

86

0 10 20 30 40 50 60

n-14:0

i-15:0

n-16:1 Δ9

n-16:1 Δ11

n-16:0

n-18:1 Δ11

n-18:0

Fe

tts

äu

re

n

% Anteil am Gesamtfettsäuregehalt

0 mM Phenol

2,1 mM Phenol

6,4 mM Phenol

8,5 mM Phenol

10,6 mM Phenol

13,25 mM Phenol

15,9 mM Phenol

A

Phenol [mM]

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Wach

stu

m [%

d

er K

on

tro

lle]

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Sättig

un

gsg

rad

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

1,2

1,3

1,4

1,5

B

Abb. 25: Einfluss von Phenol in unterschiedlichen Konzentrationen auf das Fettsäurespektrum von

G. sulfurreducens, anaerob kultiviert mit Acetat (5 mM) und Fumarat (25 mM), 8 h nach Zugabe von

Phenol; A: Änderung im Fettsäurespektrum (ohne anteiso-C15:0 und C15:0) B: Änderung des

Sättigungsgrades der zellulären Fettsäuren von G. sulfurreducens, anaerob kultiviert mit Acetat (5

mM) und Fumarat (25 mM),

III. Ergebnisse

87

0 10 20 30 40 50 60

n-14:0

i-15:0

n-16:1 Δ9

n-16:1 Δ11

n-16:0

n-18:1 Δ11

n-18:0

Fe

tts

äu

re

n


0 mM Benzol

1,1 mM Benzol

2,1 mM Benzol

3,2 mM Benzol

3,7 mM Benzol

5,4 mM Benzol

A

Benzol [mM]

0 1 2 3 4 5

Wach

stu

m [%

d

er K

on

tro

lle]

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Sättig

un

gsg

rad

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

B

Abb. 26: Einfluss von Benzol in unterschiedlichen Konzentrationen auf das Fettsäurespektrum von

G. sulfurreducens, anaerob kultiviert mit Acetat (5 mM) und Fumarat (25 mM), 8 h nach Zugabe von

Benzol; A: Änderung im Fettsäurespektrum (ohne anteiso-C15:0 und C15:0) B: Änderung des

Sättigungsgrades der zellulären Fettsäuren von G. sulfurreducens, anaerob kultiviert mit Acetat (5

mM) und Fumarat (25 mM),

III. Ergebnisse

88

3.2.3 Änderung der zellulären Fettsäurezusammensetzung von D. multivorans

Im Gegensatz zu den beiden anderen Bakterienstämmen wurde das Fettsäure-

spektrum des Sulfatreduzierers D. multivorans von den anteiso-verzweigten

Fettsäuren C15:0 anteiso, C17:0 anteiso, C17:1cis Δ10 anteiso dominiert. Sie

machten zusammen mit Hexadecanoat (Palmitinsäure; C16:0) ca. 80 % des

Gesamtfettsäuregehaltes aus. Zudem konnten Tetradecanoat (Myristinsäure; C14:0),

cis-Hexadecenoat (Palmitoleinsäure; C16:1 cis Δ9), Octadecanoat (Stearinsäure,

C18:0) in geringen Konzentrationen und Spuren von Pentadecanoat (C15:0), iso-

Pentadecanoat (C15:0 iso), iso-Hexadecanoat (C16:0 iso) bzw. Octadecenoat (cis-

Vaccensäure; C18:1 cis Δ11) nachgewiesen werden (Abb. 27).

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

n-1

4:0

i-1

5:0

ai-1

5:0

n-1

5:0

i-1

6:0

cis-1

6:1

Δ9

n-1

6:0

ai-1

7:1

Δ1

0

ai-1

7:0

n-1

7:0

cis-

18

:1

Δ1

1

n-1

8:0

Fettsäuren

% A

nte

il a

m G

es

am

t-F

A-G

eh

alt

Abb. 27: Die zelluläre Fettsäurezusammensetzung von D. multivorans nach Kultivierung unter

anaeroben Bedingungen mit Benzoat (4 mM) und Sulfat (25 mM), bei 34°C, unter Schütteln.

Im Vergleich zu den beiden anderen untersuchten Mikroorganismen lag der

prozentuale Anteil der ungesättigten Fettsäuren (C17:1cis Δ10 anteiso, C16:1 cis Δ9,

C18:1 cis Δ11) in ungestressten wachsenden Zellen mit durchschnittlich 16 % (± 2,1)

relativ niedrig. Im Gegensatz dazu machten die anteiso-verzweigten Fettsäuren

C15:0 anteiso, C17:0 anteiso, C17:1cis Δ10 anteiso in ungestressten wachsenden

Zellen mit einem durchschnittlichen Wert von 60 % (± 3) einen wesentlich höheren

Anteil am Gesamtfettsäuregehalt aus.

III. Ergebnisse

89

Da die ungesättigten Fettsäuren im Unterschied zu anteiso-verzweigten Fettsäuren

selbst nach Zugabe der Testsubstanzen nur einen sehr geringen Anteil am

Gesamtfettsäuregehalt ausmachten (siehe Abb. 27), wurde anstelle des

Sättigungsgrades der zellulären Fettsäuren das Verhältnis zwischen gesättigten

unverzweigten Fettsäuren (C14:0, C15:0, C16:0, C18:0) und anteiso-verzweigten

zellulären Fettsäuren (C15:0 anteiso, C17:0 anteiso, C17:1cis Δ10 anteiso) als

Indikator für eine Anpassungsreaktion gewählt.

Wie am Beispiel von Benzol dargestellt wird, reagierten die Zellen von D. multivorans

nach Zugabe von BTEX-Verbindungen in Konzentrationen, die das Wachstum des

Mikroorganismus um weniger als 20 % hemmten, mit einer Abnahme der anteiso-

verzweigten Fettsäuren um durchschnittlich 6-10 %, während sich der Anteil der

gesättigten unverzweigten Fettsäuren um ca. 7-10 % erhöhte (Abb. 31A). Infolge-

dessen wurde ein Anstieg des Verhältnisses der gesättigten unverzweigten zu

anteiso-verzweigten Fettsäuren um etwa 0,2-0,4 festgestellt (Abb. 31B).

Die Inkubation von D. multivorans in Anwesenheit von Benzol in Konzentrationen, die

eine Wachstumsinhibition zwischen 20-60 % auslösten, führte zu einer allmählichen

Zunahme von C15:0 anteiso und C17:0 anteiso Fettsäuren. Parallel dazu wurde eine

Abnahme der gesättigten unverzweigten Fettsäuren insbesondere von Hexa-

decanoat (C16:0) registriert. Dies führte zu einer Abnahme des Verhältnisses der

gesättigten unverzweigten zu anteiso-verzweigten Fettsäuren.

Erfolgte darüber hinaus eine Zugabe von Benzol in noch höheren Konzentrationen

(> 4,1 mM), reagierten die Zellen mit einer dramatischen Erhöhung ihrer gesättigten

unverzweigten Fettsäuren bzw. einem massiven Abfall der anteiso-verzweigten

Fettsäuren, was zu einem starken Anstieg der Ratio von gesättigten unverzweigten

zu anteiso-verzweigten Fettsäuren führte.

Vergleichbare Reaktionen der Zellen wurden ebenfalls nach Zugabe von Toluol,

Ethylbenzol bzw. Xylol erfasst. Aber im Gegensatz zu Benzol und Toluol, fielen die

Änderungen, die in Anwesenheit der beiden hydrophoberen Testverbindungen

Ethylbenzol und Xylol verursacht wurden wesentlich stärker aus (Abschnitt 8.6).

III. Ergebnisse

90

0 10 20 30 40 50

n-14:0

ai-15:0

cis-16:1,Δ9

n-16:0

ai-17:1Δ10

ai-17:0

n-18:0

Fe

tts

äu

re

n


0 mM Benzol

1,1 mM Benzol

2,1 mM Benzol

3,7 mM Benzol

4,3 mM Benzol

6,0 mM Benzol

6,4 mM Benzol

A

Benzol [mM]

0 1 2 3 4 5 6

Wach

stu

m [%

d

er K

on

tro

lle]

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Ve

rh

ältn

is

g

es

ättig

te

u

nve

rzw

eig

te

F

A /

an

te

is

o

-ve

rzw

eig

te

F

A

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

B

Abb. 28: Einfluss von Benzol in unterschiedlichen Konzentrationen auf das zelluläre

Fettsäurespektrum von D. multivorans; A: Änderung des zellulären Fettsäurespektrums; B: Änderung

des Verhältnisses gesättigter unverzweigter und anteiso-verzweigter Fettsäuren. relative

Wachstumsinhibition und Sättigungsgrad.

III. Ergebnisse

91

Wurden die Zellen von D. multivorans statt dessen mit (chlor-) phenolischen

Verbindungen inkubiert, wie am Beispiel von Phenol dargestellt (siehe Abb. 28),

wurde völlig unerwartet ein Abfall des Anteils der unverzweigten gesättigten

Fettsäuren und parallel dazu eine relative Zunahme der anteiso-verzweigten

Fettsäuren erfasst.

So führte die Inkubation der Zellen des Sulfatreduzierers mit Phenol in

Konzentrationen bis 6,4 mM, die eine Verminderung des Wachstums um bis zu 30 %

verursachte, zu einer deutlichen Verringerung der unverzweigten gesättigten

Fettsäuren um ca. 18-20 %. Analog dazu wurde eine relative Erhöhung der anteiso-

verzweigten Fettsäuren von ca. 60 % auf etwa 79 % am Gesamtfettsäuregehalt

ermittelt. Die Zunahme der anteiso-verzweigten Fettsäuren beruhte dabei auf einem

wesentlich erhöhten Anteil von C17:1 Δ10 anteiso, die Abnahme der unverzweigten

gesättigten Fettsäuren auf einem verminderten Anteil von Hexadecanoat (C16:0).

Auch nach Zugabe der beiden Chlorphenole konnte ein ähnliches Verhalten erfasst

werden. Allerdings waren die Änderungen weniger deutlich als nach Zugabe von

Phenol. So fiel die Erhöhung des Anteils der anteiso-verzweigten Fettsäuren mit

einer Zunahme um 5-8 % schwach aus. Auch die Verminderung der unverzweigten

gesättigten Fettsäuren um einen Wert von ca. 6 % war weniger stark als nach

Applikation von Phenol.

Wurden die Zellen von D. multivorans darüber hinaus mit Phenol in Konzentrationen

> 6,4 mM inkubiert, wurde eine Verminderung des Anteils der anteiso-verzweigten

Fettsäuren um etwa 24 % ermittelt, während der Anteil der gesättigten unverzweigten

Fettsäuren am Gesamtfettsäuregehalt um ca. 26 % stieg.

Nachdem das Wachstum der Zellen um mehr als 75 % gehemmt wurde, stieg der

prozentuale Anteil der gesättigten unverzweigten Fettsäuren massiv an, während der

Anteil der anteiso–verzweigten Fettsäuren drastisch fiel (siehe Abb. 30A).

III. Ergebnisse

92

0 10 20 30 40 50

n-14:0

ai-15:0

cis-16:1,Δ9

n-16:0

ai-17:1Δ10

ai-17:0

n-18:0

Fe

tts

äu

re

n


0 mM Phenol

2,1 mM Phenol

4,3 mM Phenol

6,4 mM Phenol

8,5 mM Phenol

10,6 mM Phenol

15,9 mM Phenol

A

Phenol [mM]

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Wach

stu

m [%

d

er K

on

tro

lle]

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Ve

rh

ältn

is

g

es

ättig

te

, u

nve

rzw

eig

te

F

A/

an

te

is

o-ve

rzw

eig

te

F

A

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

B

Abb. 29: Einfluss von Phenol in unterschiedlichen Konzentrationen auf das zelluläre

Fettsäurespektrum von D. multivorans; A: Änderung des zellulären Fettsäurespektrums; B: Änderung

des Verhältnisses gesättigter unverzweigter und anteiso-verzweigter Fettsäuren. relative

Wachstumsinhibition und Sättigungsgrad.

III. Ergebnisse

93

Nach Applikation von n-Butanol zu den Zellen von D. multivorans war eine Reaktion

vergleichbar zu den (Chlor-) Phenolen feststellbar. Auch hier zeigten die Zellen des

Sulfatreduzierers bei geringen Butanolkonzentrationen (ca. 10 mM) eine Abnahme

der gesättigten unverzweigten Fettsäuren bzw. eine Zunahme der anteiso-

verzweigten Fettsäuren. Bei Zugabe von n-Butanol in höheren Konzentrationen (> 10

mM) konnte – vergleichbar mit den phenolischen Verbindungen – eine Umkehrung

der Reaktion registriert werden.

Währenddessen reagierten die Zellen auf die Zugabe von n-Hexanol in geringen

Konzentrationen (1 mM) mit einer Zunahme der gesättigten unverzweigten

Fettsäuren bzw. mit einer Verminderung der anteiso-verzweigten Fettsäuren. Erfolgte

die Applikation von n-Hexanol in höheren Konzentrationen (3-6 mM) wurde – ähnlich

wie bei den BTEX-Verbindungen – eine Abnahme der gesättigten unverzweigten

Fettsäuren bzw. eine Verminderung der anteiso-verzweigten Fettsäuren festgestellt.

Wurde n-Hexanol darüber hinaus in noch höheren Konzentrationen zugegeben,

zeigte sich wie zuvor bei den anderen Testverbindungen wieder eine massive

Zunahme der gesättigten unverzweigten Fettsäuren bzw. wurde eine Verminderung

der anteiso-verzweigten Fettsäuren erfasst.

IV. Diskussion

94

4. Diskussion

Da bisher nur wenige Informationen darüber vorliegen, wie sich organische Lösungs-

mittel auf fakultativ oder obligat anaerobe Bakterien auswirken, wurde im Rahmen

dieser Arbeit der Einfluss verschiedener umweltrelevanter organischer Schadstoffe

und Lösungsmittel auf das Wachstum ausgewählter Bakterien unter anaeroben

Kultivierungsbedingungen untersucht. Stellvertretend für die drei großen

Stoffwechselgruppierungen der Denitrifizierer, Fe

3+

-Reduzierer und Sulfatreduzierer

wurden die drei Testorganismen Thauera aromatica, Geobacter sulfurreducens und

Desulfococcus multivorans ausgewählt. Dabei fiel mit T. aromatica und D.

multivorans die Wahl auf zwei Mikroorganismen, die an Abbauvorgängen

organischer Lösungsmittel und Schadstoffe beteiligt sind. T. aromatica ist in der

Lage, eine Vielzahl verschiedener organische Verbindungen so z.B. Butanol, Phenol

und Toluol unter Verbrauch von Nitrat zu mineralisieren (Tschech & Fuchs et al.,

1987; Anders et al., 1995; Heider et al., 1998; Breining et al., 2000; Schink et al.,

2000; Widdel & Rabus, 2001; Boll et al., 2002). D. multivorans besitzt u. a. die

Fähigkeit, γ-Hexachlorcyclohexan (Lindan) und n-Butanol unter sulfatreduzierenden

Bedingungen umzusetzen (Boyle et al., 1999; Badea et al., 2008). G. sulfurreducens,

dessen Genom komplett sequenziert vorliegt, wurde aufgrund seiner nahen

Verwandtschaft zu Geobacter metallireducens und anderen Geobacter-Spezies zu

den Untersuchungen herangezogen (Lovley et al., 2003; Methe et al., 2003). G.

sulfurreducens ist jedoch nicht in der Lage, monoaromatische Substanzen wie

Benzoat oder Phenol unter Fe

3+

-reduzierenden Bedingungen zu metabolisieren

(Caccavo et al., 1994).

Im Kapitel 3 konnte gezeigt werden, wie sich die Anwesenheit von BTEX-

Verbindungen, (chlor-) phenolischen Verbindungen und aliphatischen Alkanolen auf

das Wachstum der drei Bakterienstämme auswirkte. Im folgenden Teil sollen die

gewonnen Daten zur Toxizität der Testverbindungen in Bezug auf die drei

untersuchten Testorganismen bzw. deren Anpassungsmechanismen an die

eingesetzten Verbindungen mit bereits vorliegenden Daten aus der Literatur

verglichen bzw. diskutiert werden.

IV. Diskussion

95

4.1 Prüfung der Toxizität

Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmals der Einfluss verschiedener umwelt-

relevanter organischer Lösungsmittel auf das Wachstum von drei ausgewählten

anaeroben Bakterienstämmen systematisch untersucht.

Dabei wurde ein Testsystem genutzt, das bereits für aerobe Bakterien erfolgreich

etabliert wurde (Ingram, 1976; Keweloh et al., 1989; Heipieper et al., 1995; Kabelitz

et al., 2003). Es beruht auf der Ermittlung der relativen Wachstumsinhibition anhand

von errechneten mikrobiellen Wachstumsraten. Die Berechnung der Wachstums-

raten basiert dabei auf Änderungen der Optischen Dichten, die für die Mikro-

organismen nach Zugabe der Testverbindungen über einen entsprechenden

Zeitraum ermittelt wurde. Ein Vergleich der Wachstumsraten mit den Wachstums-

raten mitgeführter Kontrollansätze, die ohne Testsubstanz inkubiert wurden,

ermöglichte die Bestimmung der relativen Wachstumsinhibition.

Die ermittelten Wachstumsraten von T. aromatica, G. sulfurreducens und

D. multivorans lagen dabei deutlich unter denen bisher getesteter aerober Bakterien.

Trotzdem gelang es – ähnlich wie bei Escherichia. coli (Keweloh et al., 1989)

Pseudomonas putida (Heipieper et al., 1995) und Acinetobacter calcoaceticus

(Kabelitz et al., 2003) – die Wachstumsraten bei Einsatz unterschiedlicher

Testsubstanzkonzentrationen zu vergleichen. Mittels der dabei erfassten Effektiven

Konzentrationen (EC50), also den Testsubstanzkonzentrationen, die zu einer

50 %igen Hemmung des Wachstums der Testorganismen führten, war es möglich,

die akute (narkotische) Toxizität der Testverbindungen zu beschreiben und

Vergleiche zwischen den einzelnen Testorganismen zu ziehen.

Obwohl der Ausdruck „narkotische Toxizität“ eher auf höhere Lebensformen wie

Fische, Reptilien oder Säuger Bezug nimmt, wurde eine direkte Beziehung zwischen

der Toxizität und dem log-P

o/w

-Wert bisher ebenfalls bei verschiedenen niederen

Lebensformen wie Protozoen (Schultz et al., 1998), Algen (Lu et al., 2001; Cronin et

al., 2004), filamentösen Pilzen (Hage et al., 2001), Hefen und Bakterien (Ingram,

1976; Liu et al., 1982; Oikawa et al., 1985; Heipieper et al., 1995; Ren & Frymier,

2002; Kabelitz et al., 2003; Wei et al., 2004) erfasst. Allerdings lagen bisher keine

näheren Angaben zu anaeroben Mikroorganismen vor.

Essentiell für die Beschreibung einer solchen Struktur-Wirkungs-Beziehung ist die

Tatsache, dass die chemische und/oder biologische Aktivität einer chemischen

Verbindung maßgeblich von deren chemischer Struktur bzw. deren Eigenschaften

IV. Diskussion

96

bestimmt wird (McKarns et al., 1997; Ren & Frymier, 2002). Auch bei den drei

getesteten Mikroorganismen zeichneten sich Unterschiede bezüglich der ermittelten

EC50-Werte bereits innerhalb der einzelnen Substanzklassen ab. Mit zunehmender

Kettenlänge der aliphatischen Alkanole, mit dem sich erhöhendem Chlorierungsgrad

der (Chlor-) Phenole oder der Zunahme unpolarer Substituenten am aromatischen

Ring bzw. eine zunehmenden Kettenlänge der Substituenten, die jeweils eine

Erhöhung der Substanzhydrophobizität nach sich ziehen, reichten deutliche

geringere Konzentrationen der Verbindungen aus, um das Wachstum der

Mikroorganismen zu hemmen.

Bei dem Vergleich der ermittelten EC50-Werte aller Testsubstanzen zeigte sich, dass

die drei untersuchten Mikroorganismen unabhängig von den Substanzklassen

zunehmend sensibler auf die Testsubstanzen reagierten, je hydrophober die

Substanzen waren. Im Verlauf der Untersuchungen gelang es somit erstmals, für

jeden der drei Mikroorganismen eine Beziehung zwischen der Hydrophobizität, der

verschiedenen getesteten umweltrelevanten Lösungsmittel und deren (membran-)

toxischer Wirkung zu zeigen. Bei allen drei untersuchten Stämmen korrelierten die

erfassten EC50-Werte negativ mit den log-P

O/W

-Werten der Substanzen.

Vergleichbare Zusammenhänge bzw. Modelle liegen bereits für einige Bakterien vor,

bei denen es sich in der Regel um Aeobierer handelte bzw. die in Anwesenheit von

Luftsauerstoff wuchsen (Liu et al., 1982; Oikawa et al., 1985; Tang et al., 1992;

Heipieper et al., 1995; Ren & Frymier, 2002; Kabelitz et al., 2003; Wei et al., 2004).

Dabei wurde der Effekt unterschiedlichster Substanzklassen wie beispielsweise

Alkane, Alkanole, Amine, Aromaten oder Phenole untersucht (Heipieper et al., 1995;

Isken & De Bont, 1998; Ren & Frymier, 2002; Kabelitz et al., 2003). Die

verschiedenen QSAR sind jedoch schwierig mit einander zu vergleichen, denn sie

beruhen auf verschiedenen Testsystemen. So existieren außer dem System, das auf

den mikrobiellen Wachstumsraten basiert, noch weitere Systeme, die auf der

Änderung von Biolumineszenz beruhen. Zudem werden oftmals neben der

Hydrophobizität zusätzliche Substanzeigenschaften hinzugezogen, um die Toxizität

der Substanz zu beschreiben (siehe Review Lessigiarska et al., 2005). Dies lässt

Vergleiche nur im beschränkten Maße zu.

Beim Vergleich mit existierenden QSAR für Acinetobacter calcoaceticus bzw.

Pseudomonas putida, die ebenfalls anhand von mikrobiellen Wachstumsraten erstellt

IV. Diskussion

97

wurden, zeigte sich, dass die im Zuge dieser Arbeit ermittelten EC50-Werte für T.

aromatica, G. sulfurreducens und D. multivorans generell etwas niedriger lagen als

die EC50-Werte, die für Acinetobacter calcoaceticus bzw. Pseudomonas putida

bestimmt wurden (Tab. 15).

Lediglich die für D. multivorans ermittelten EC50-Werte von n-Butanol, Phenol,

n-Hexanol und Benzol lagen etwas höher als die EC50-Werte für A. calcoaceticus

bzw. P. putida. Hierbei ist jedoch zu bedenken, dass einige Lösungsmittel, wie z.B. n-

Butanol, Produkte mikrobieller Biosynthesen sind, und unter natürlichen

Bedingungen ständig in geringen Konzentrationen in der Umwelt vorkommen und

durchaus von D. multivorans mineralisiert werden können.

Tab. 15: Korrelation zwischen Hydrophobizität (log P

Octanol/Wasser

-Werte) und der Toxizität (EC50-

Werte) organischer Testsubstanzen auf verschiedene anaerob, fakultativ anaerob bzw. aerob

gewachsene Bakterien.

a.

Heipieper et al., 1995;

b.

Kabelitz et al., 2003;

c.

Ren & Frymier, 2002

Als wesentlich schwieriger und weniger eindeutig erwiesen sich Vergleiche mit

anderen existierenden QSAR. Ähnlichkeiten wurden zu Toxizitäts-Assays festgestellt,

die auf der Basis von Biolumineszenz arbeiteten (Ren und Frymier, 2002).

Substanzen log P

o/w

EC50 [mM]

T. aro

matica

G. su

lfu

rred

ucen

s

D. m

ultivo

ran

s

P. p

utid

a

a

A. calco

aceticu

s

b

Pseu

do

mo

nas

Sh

k1

C

n-Butanol

0,88 20 - 70 30,1 52,1 37,0

Phenol 1,45 2,4 7,6 8,5 7,9 - 5,1

n-Hexanol

1,87 2 - 6,4 5,8 6 2,0

Benzol 2,13 3,4 3,6 4,5 4,1 - 2,6

4-Chlorphenol 2,40 0,56 0,97 0,96 2,1 - 0,16

Toluol 2,73 1,1 1,2 1,6 2,4 - 1,01

n-Octanol

2,92 0,2 - 0,62 1,1 0,8 0,54

Xylol 3,12 0,42 0,35 0,45 0,7 - 0,54

Ethylbenzol 3,15 0,58 0,28 0,44 0,7 - 0,54

2,4-Dichlorphenol 3,20 0,17 0,21 0,12 0,4 - 0,18

IV. Diskussion

98

Um die Korrelation zwischen Hydrophobizitäten der untersuchten Substanzen und

deren toxischer Wirkungen auf die einzelnen Testorganismen näher zu beschreiben,

wurde für für jede der untersuchten drei Spezies ein mathematisches Modell

bestimmt. Mit Hilfe dieser Gleichungen wird es gegebenfalls in Zukunft möglich sein

Vorraussagen über die potentielle toxische Wirkung bekannter aber auch

unbekannter Substanzen in Hinsicht auf die drei Anaerobier zu treffen

4.1.1 Einfluss der Testsubstanzen auf die Substratverwertung von T. aromatica

und D. multivorans

Die beide Organismen T. aromatica und D. multivorans sind in der Lage, Benzoat als

C- und Energiequelle zu nutzen. Um zu prüfen welchen Einfluss die Applikation von

organischen Lösungsmitteln auf die Verwertung von Benzoat hatte, wurde die

Benzoatkonzentration vor und nach der Zugabe der Testverbindungen mittels HPLC

bestimmt. Dabei stellte sich heraus, dass der maximale Benzoatumsatz expontiell

wachsender Zellen von T. aromatica in etwa um das zehnfache höher lag als der von

D. multivorans.

Nach Zugabe der Testverbindungen wurde bei beiden Organismen parallel zu den

verminderten Wachstumsraten der Abbauraten des Wachstumssubstrates

(Natriumbenzoat) erfasst. Die Verringerung des Substratumsatzes erfolgte dabei in

Abhängigkeit von der eingesetzten Konzentration der Testsubstanzen.

Die Verwertung des Wachstumssubstrates wird nach Zugabe der Testsubstanzen

vermutlich in zwei Punkten negativ beeinflußt: Zum einen verursacht die

zunehmende Anreicherung der Testsubstanz in der Zytoplasmamembran eine

erhöhte Membranpermeabilität. (De Smet et al., 1978; van der Meer, 1984; Sikkema

et al., 1992, 1994, 1995). Aufgrund der erhöhten Durchlässigkeit der Membran

kommt es zum verstärkten Rückstrom von Protonen in die Zellen, was zu einen

Abfall des intrazellulären pH-Wertes und zu einen Zusammenbruch des

transmembranen pH-Wert-Gradienten führt (Terracciano & Kashket, 1986). Die

Unfähigkeit der Zellen zur Aufrechterhaltung ihres intrazellulären pH-Wertes,

beeinflusst die Aktivität zahlreicher Enzyme (Poolman et al., 1987; Sikkema et al.,

1995). Zudem hat der Zusammenbruch des transmembranen pH-Wert-Gradienten

negative Auswirkungen auf die Protonenmotorischen Kraft und auf die

Energieeffizienz (Sikkema et al., 1995; Isken & De Bont, 1998).

IV. Diskussion

99

Außer den direkt durch die Lösungsmittel und Schadstoffe ausgelösten Effekten

stellen Anpassungsreaktionen der Mikroorganismen, die mit der Modifikation der

Membranen-PLFA-Zusammensetzung verbunden sind, einen weiteren Aspekt dar,

der die Verwertung des Wachstumssubstrates beeinflusst. Die Veränderung der

Membranen-PLFA-Zusammensetzung, die der Aufrechterhaltung der

biophysikalischen Eigenschaften der Membran dient, kann als ein Mechanismus

interpretiert werden, der dazu beiträgt die Permeabilität der Phospholipid-

doppelschicht zu modifizieren (Zhang et al., 2008). Eine solche Modifikation

verursacht eine generelle Senkung der Membranpermeabilität gegenüber

hydrophoben Verbindungen (Sikkema et al., 1995; Weber & De Bont, 1996; Isken,

2000; Zhang et al., 2008). Allerdings können lösungsmitteladaptierte Zellen auch

eine geringere Affinität gegenüber hydrophilen Substraten zeigen, wie am Beispiel

von P. putida S12 demonstriert wurde (Isken, 2000).

Somit kommt es infolge der vorübergehenden Unfähigkeit zur Regulation des

intrazellulären pH-Wertes und der damit eventuell verbundenen sinkenden Aktivitäten

der Enzyme des Benzoatabbaus bzw. durch eingeschränkten Benzoattransports zu

einer Verminderung des Benzoatumsatzes bzw. zu einer sinkenden Affinität der

Zellen gegenüber dem Wachstumssubstrat. In Abhängigkeit der gewählten

Testsubstanzkonzentrationen fielen die Effekte, die sich in der Hemmung des

mikrobiellen Wachstums widerspiegelten, unterschiedlich stark aus.

4.1.2 Einfluss der Testsubstanzen auf den Biomasseertrag und ATP-Gehalt

während der Verwertung von Benzoat durch T. aromatica unter anaeroben

Bedingungen

Am Beispiel von T. aromatica wurde gezeigt, wie sich die Anwesenheit (chlor-)

phenolischer Substanzen auf die Biomasseerträge und die zellulären ATP-

Konzentrationen nicht adaptierter Zellen auswirkte. Bei geringen Konzentrationen der

(chlor-) phenolischen Verbindungen wurde unabhängig vom eingesetzten (Chlor-)

Phenol ein relativ konstanter Biomasseertrag von etwa 0,42 [g TG/g Benzoat]

ermittelt. Die Wachstumsraten lagen jedoch im Vergleich zu den Kontrollkulturen

ohne Testsubstanz niedriger. Erst nachdem im wässrigen Medium (Chlor-)

Phenolkonzentrationen erreicht waren, die einer theoretischen

Membrankonzentration von ca. 25-30 mM entsprachen, wurde eine Abnahme der

IV. Diskussion

100

Biomasseerträge erfasst, wobei die Erträge nach Zugabe sehr hoher (Chlor-)

Phenolkonzentrationen bis auf einen Wert von 0 sanken.

Viele experimentelle Studien zu Wachstumserträgen verschiedener Mikro-

organismen bestätigen einen direkten proportionalen Zusammenhang zwischen

vorhandenen zellulären ATP-Konzentrationen und den Zellerträgen (Madigan, 2000).

Wurden die Kulturen von T. aromatica nach Zugabe von (Chlor-) Phenolen in

unterschiedlichen Konzentrationen miteinander verglichen, zeigten sich deutliche

Unterschiede in den unter diesen Bedingungen vorliegenden ATP-Konzentrationen.

In Übereinstimmung mit den verminderten Biomasseerträgen wiesen die Zellen von

T. aromatica nach Zugabe (chlor-) phenolischer Verbindungen eine Reduktion der

zellulären ATP-Konzentration auf.

Dass Lösungsmittel, wie beispielsweise Toluol, einen negativen Einfluss auf den

Biomasseertrag haben, wurde mehrfach gezeigt (Aono et al., 1992; Abe et al., 1995;

Ramos et al., 1997; Isken et al., 1999; Neumann et al., 2006). So berichteten Isken

et al. (1999) darüber, dass bei der Kultivierung toluoladaptierter Zellen von P. putida

S12 in Anwesenheit von Toluol eine Abnahme des Biomasseertrages registriert

wurde. Die Gegenwart von Toluol schien aber keine Auswirkungen auf die

Wachstumsraten zu haben. Der Einfluss von Toluol auf die spezifische

Wachstumsrate des Organismus wurde allerdings im Verlauf einer kontinuierlichen

Kultivierung der Zellen unter C-Limitation nachgewiesen. Ähnliche Ergebnisse

zeigten auch Neumann et al. (2006) für den lösungsmitteltoleranten Stamm P. putida

DOT-T1E.

Während sich die Abnahme der maximalen Wachstumsrate in Gegenwart lipophiler

organischer Verbindungen mit einem Absinken der Affinität des Mikroorganismus

gegenüber dem Wachstumssubstrat begründet lässt, sind die Ursachen für die

Verminderung der Biomasseerträge, wie sie sowohl bei T. aromatica als auch bei

P. putida S12 erfasst wurden, vielschichtiger. Die Anreicherung lipophiler Verbindung

in der Membran und die damit einhergehende Erhöhung der Membranpermeabilität

führten zu einer zunehmenden Verschwendung der protonenmotorischen Kraft (Δp)

und damit zu einer Ineffizienz des Energiestoffwechsels. Andererseits verursachen

die zahlreichen zellulären Anpassungsmechanismen, wie beispielsweise die

verstärkte Phospholipid-(Fettsäure-) Synthese oder die Synthese detoxifizierender

Enzyme, die dazu dienen sollen die Integrität und Funktionalität der Zellen

IV. Diskussion

101

aufrechtzuerhalten, einen zusätzlichen Energieverbrauch (De Bont, 1998; Isken & De

Bont, 1998; Isken et al., 1999; Isken & Heipieper 2002).

Die Verminderung der Biomasseerträge, die – unabhängig von der untersuchten

Substanz – ab einer theoretischen Membrankonzentration von 25-30 mM einsetzte,

deutet zudem darauf hin, dass die Abnahme der Erträge weniger von der

Molekülstruktur der Testverbindung, sondern vielmehr von dessen Konzentration in

der Membran abhängt. Dies deckt sich mit dem Befund von Isken et al. (1999), die

eine Verminderung der Biomasseerträge in Abhängigkeit von der vorliegenden

Testsubstanzkonzentration in der Membran des lösungsmitteltoleranten Stammes

P. putida S12 beschrieben.

4.1.3 Einfluss der Testsubstanzen auf das Wachstum von T. aromatica unter

aeroben Bedingungen am Beispiel von (chlor-) phenolischen Verbindungen

Dass gegebenenfalls auch der Wechsel des Elektronenakzeptors zu einer Änderung

der Sensitivität der Mikroorganismen gegenüber organischen Verbindungen führen

kann, wurde am Beispiel von T. aromatica nach Zugabe (chlor-) phenolischer

Verbindungen demonstriert. T. aromatica ist in der Lage, Benzoat sowohl unter

nitratreduzierenden Bedingungen als auch in Anwesenheit von Sauerstoff

abzubauen. Der Wechsel des Elektronenakzeptors von Nitrat zu Sauerstoff zieht

dabei die Nutzung eines alternativen Benzoatabbauweges nach sich (Schühle et al.,

2003). Nach dem Wechsel des Elektronenakzeptors von Nitrat zu Sauerstoff wuchs

T. aromatica, bedingt durch die Anpassung an den neuen Elektronenakzeptor und

die damit verbundene Induktion eines alternativen Benzoatabbauweges, deutlich

langsamer als unter nitratreduzierten Bedingungen.

Bei der Untersuchung der wachstumshemmenden Wirkung der (chlor-) phenolischen

Verbindungen in Anwesenheit von Luftsauerstoff wurden bei allen drei Verbindungen

Unterschiede bezüglich der Effektiven Konzentrationen festgestellt. Die für

4-Chlorphenol und 2,4-Dichlorphenol bestimmten Effektiven Konzentrationen, die für

T. aromatica unter aeroben Kultivierungsbedingungen ermittelt wurden,

unterschieden sich nur wenig von denen, die unter anaeroben Bedingungen erfasst

worden waren. Währenddessen reagierte T. aromatica auf Phenol in Anwesenheit

von Sauerstoff wesentlich empfindlicher als unter anaeroben Bedingungen. Warum

die Zellen nach Phenolzugabe unter aeroben Bedingungen deutlich empfindlicher

IV. Diskussion

102

reagierten, darüber lässt sich jedoch nur spekulieren. Um diese Frage zu

beantworten, bedarf es weiterer Untersuchungen.

4.1.4 Verwertung der organischen lipophilen Testsubstanzen während der

Prüfung auf Toxizität

Eine mögliche Anpassungsreaktion von Mikroorganismen gegenüber Schadstoffen

besteht darin, die Konzentration toxisch wirkender Verbindungen aktiv zu minimieren,

indem diese – ähnlich wie einige Antibiotika – zu weniger toxische Verbindungen

umgesetzt oder metabolisiert werden (Isken & De Bont, 1998). Die Verringerung der

Toxinkonzentration infolge von biologischem Abbau oder Transformationsreaktionen

würde eine Minderung der Wachstumsinhibition nach sich ziehen (Ferrante et al.,

1995; Paje et al., 1997). Da einzelne Testverbindungen von den untersuchten

Mikroorganismen durchaus metabolisiert werden können, wurden die

Konzentrationen der Testsubstanzen im untersuchten Zeitraum bestimmt. Dabei

wurden die Konzentrationen der (chlor-) phenolischen Substanzen mittels HPLC, die

der BTEX-Verbindungen gaschromatographisch ermittelt.

Im untersuchten Zeitraum (8-10 Stunden nach Zugabe der Substanzen bei

G. sulfurreducens bzw. 6 Tage nach Zugabe der Substanzen bei D. multivorans)

konnten weder bei G. sulfurreducens noch bei D. multivorans signifikante

Änderungen der Testsubstanzkonzentrationen beobachtet werden. Selbst bei den

Zellen von T. aromatica, die in der Lage sind, einige der eingesetzten Verbindungen

(z. B. Phenol, Toluol) unter anaeroben Bedingungen zu mineralisieren (Tschech et

al., 1987; Heider et al., 1998; Breining et al., 2000; Schink et al., 2000; Widdel &

Rabus, 2001; Boll et al., 2002), konnte im Untersuchungszeitraum (6-8 Stunden nach

Zugabe der Testsubstanzen) keine Abnahme der Testsubstanzkonzentration

bestimmt werden. Erst bei Probenahmen zu späteren Zeitpunkten konnte im Falle

von Toluol eine Reduktion ermittelt werden. Diese Beobachtung deckt sich mit

Resultaten anderer Untersuchungen, bei denen im Verlaufe einer Simultaninkubation

von T. aromatica-Zellen mit Benzoat und Toluol (1 mM) erst 16 h nach Zugabe von

Toluol eine Verwertung des Lösungsmittels erfasst wurde (Altenschmidt et al., 1992).

Eine C-Kataboliten-Repression in Anwesenheit leichter metabolisierbarer Substrate

kann somit nicht ausgeschlossen werden. Allerdings liegen bisher keine

detaillierteren Informationen für T. aromatica vor (Breining et al., 2000).

IV. Diskussion

103

Aber auch wenn der biologische Umsatz von Lösungsmitteln einigen Bakterien eine

Toleranz gegenüber spezifischen Substraten vermitteln sollte, so kann er aufgrund

seiner hohen Spezifität nur eine untergeordnete Rolle spielen und kommt als

alleiniger Hauptmechanismus für die Toleranz gegenüber einer Vielzahl von

Lösungsmitteln nicht in Frage (Isken & De Bont, 1998).

4.2 Änderung der zellulären Fettsäurezusammensetzung anaerob

kultivierter Mikroorganismen nach Inkubation mit organischen

Lösungsmitteln

Mikroorganismen werden unter Umweltbedingungen häufig mit Lösungsmitteln

konfrontiert. Diese Substanzen akkumulieren sich in der Membran, beeinflussen die

physikochemischen Eigenschaften der Doppelschicht und können, ähnlich wie starke

Temperaturänderungen, eine Erhöhung oder Verminderung der Membranfluidität

verursachen (Weber & De Bont, 1996; Denich et al., 2002). Mikroorganismen sind

jedoch bestrebt, diesem Effekt entgegenzuwirken, da ihnen ansonsten ein Verlust

der strukturellen und funktionellen Integrität der Membran und somit der Zelltod droht

(Isken & De Bont, 1998).

Die Änderung der Membranzusammensetzung spielt dabei eine immense Rolle. Die

auch als homeoviskose Adaptation bezeichnete Modifikation der Membran

ermöglicht eine weitestgehende Wiederherstellung bzw. die Erhaltung der Membran-

fluidität und -stabilität und zieht damit eine Änderung der Verteilung der organischen

Verbindungen in der Membran nach sich (Sinensky, 1979; Sikkema et al., 1995;

Weber & De Bont, 1996; Denich et al., 2002). Abhängig von den physikochemischen

Eigenschaften der getesteten Substanzen, den eingesetzten Substanzdosen und der

Inkubationsdauer, reagierten die drei untersuchten Organismen mit der Änderung

ihrer zellulären Fettsäurezusammensetzung. Da Fettsäuren vorrangig als

Phospholipide in Membranen vorkommen, muss die Veränderung der zellulären

Fettsäurezusammensetzung zwangsläufig zu veränderten Membranzusammen-

setzungen bzw. -eigenschaften führen. Das wiederum bedeutet, dass alle drei

untersuchten Mikroorganismen in der Lage waren, ihre Membranen in Anwesenheit

organischer Verbindungen zu modifizieren.

IV. Diskussion

104

4.2.1 Anpassung von T. aromatica und G. sulfurreducens an lipophile,

organische Substanzen - Änderung des Sättigungsgrades

T. aromatica und G. sulfurreducens, deren Fettsäurespektren von gesättigten und

ungesättigten Fettsäuren dominiert wurden, zeigten sowohl nach Zugabe von BTEX-

Verbindungen als auch nach Zugabe (chlor-) phenolischer Verbindungen bzw. nach

Zugabe aliphatischer Alkanole einen Anstieg des Sättigungsgrades der zellulären

Fettsäuren. Die Erhöhung des Sättigungsgrades in Anwesenheit organischer

Substanzen ist ein weit verbreiteter Anpassungsmechanismus, der Mikroorganismen

die Aufrechterhaltung ihrer Membranfluidität ermöglicht (Russell et al., 1984; Isken &

De Bont, 1998).

Durch die Einlagerung lipophiler organischer Verbindungen in die Membrandoppel-

schicht kommt es zu einer Verminderung der Packungsdichte der Phospholipide.

Gleichzeitig werden Wechselwirkungen zwischen den einzelnen Phospholipiden

gestört, was zu einer Erhöhung der Membranfluidität führt (Simon et al.,1982; Weber

& De Bont, 1996). Der Einbau von Phospholipiden mit gesättigten Fettsäuren in die

Zellmembran kompensiert den fluiditätserhöhenden Effekt der Lösungsmittel. Die

linearen gesättigten Acylketten erlauben eine dichtere Packung und wesentlich

stärker ausgeprägte hydrophobe Wechselwirkungen zwischen den Acylketten.

Bakterielle Membranen, die bevorzugt gesättigt Fettsäuren enthalten, durchlaufen

somit erst bei deutlich höheren Lösungsmittelkonzentrationen einen Übergang von

der lamellaren Gel-Phase in die lamellare liquid-kristalline Phase, in der die

Acylketten ungeordnet vorliegen, als Membranen, die hauptsächlich ungesättigte

Fettsäuren enthalten.

Sowohl bei T. aromatica als auch bei G. sulfurreducens wurde eine Änderung der

zellulären Fettsäurezusammensetzung in Abhängigkeit der Konzentrationen der

zugesetzten Testsubstanzen erfasst. Je höher die Konzentration der Testsubstanzen

im Kulturmedium, umso mehr erhöhten beide Organismen den Anteil der gesättigten

Fettsäuren. Die maximale Änderung des Sättigungsgrades in den Zellen von T.

aromatica wurde erreicht, sobald das Wachstum im Vergleich zur

Wachstumskontrolle um durchschnittlich 50 % gehemmt wurde. In Anwesenheit von

Substanzkonzentrationen, die das Wachstum von T. aromatica stärker hemmten,

nahm der Sättigungsgrad weniger stark zu. Vergleichbar dazu konnte auch für die

Zellen von G. sulfurreducens nach Lösungsmittelzugabe eine

Konzentrationsabhängigkeit demonstriert werden. Allerdings nahm der

IV. Diskussion

105

Sättigungsgrad der zellulären Fettsäuren erst nicht mehr zu, nachdem

Wachstumshemmungen von mehr als 75 % erreicht wurden. Diese Beobachtungen

machen deutlich, dass eine Erhöhung des Anteils gesättigter Fettsäuren und die

damit verbundene Zunahme des Sättigungsgrades in Abhängigkeit von den

Testsubstanzkonzentrationen nur in einem begrenzten Rahmen ablaufen können.

Die Anreicherung einer lipophilen organischen Substanz in der Membran geht mit

einer Entropieerhöhung innerhalb der Doppelschicht einher und verursacht den

Verlust der Barrierefunktion der Membran – die Membranpermeabilität steigt.

Infolgedessen kommt es zur Verschwendung der protonenmotorischen Kraft und

damit in zunehmendem Maße eine Ineffizienz der Energiekonservierung nach sich

zieht (Sikkema et al., 1994, 1995, Isken & De Bont, 1998). Die Erhöhung des

Sättigungsgrades der zellulären Fettsäuren ist jedoch nur über eine energieintensive

Neusynthese gesättigter Fettsäuren möglich (Russell et al., 1984) und somit vom

Energiestatus der Zellen abhängig (Neumann et al., 2006). Der

energieverbrauchenden de novo-Synthese gesättigter Fettsäuren sind somit

Grenzen gesetzt. Aus diesem Grund konnte eine Erhöhung des Sättigungsgrades in

den Zellen von E. coli bzw. den Zellen des phenolabbauenden P. putida P8 auch nur

dann beobachtet werden, wenn die Zellen wuchsen (Keweloh et al., 1991;

Diefenbach et al., 1992).

Außer der Abhängigkeit von der Testsubstanzkonzentration konnten für beide

Bakterienstämme unterschiedlich starke Änderungen des Sättigungsgrades

gegenüber den verschiedenen Testsubstanzen gezeigt werden. Nach Zugabe von n-

Butanol bzw. der unpolaren BTEX-Verbindungen fiel die Erhöhung des

Sättigungsgrades in den Zellen von T. aromatica wesentlich geringer aus als in

Anwesenheit der (Chlor-) Phenole, von n-Hexanol oder n-Octanol. In Gegenwart der

(Chlor-) Phenole bzw. der beiden längerkettigen n-Alkanole (C

6

und C

8

) musste

demzufolge vergleichsweise mehr Energie für die de novo Synthese der gesättigten

Fettsäuren (hauptsächlich Hexadecansäure) aufgewendet werden. So führten schon

vergleichsweise niedrigere Konzentrationen (chlor-) phenolischer Verbindungen bzw.

der längerkettigen n-Alkanole (C

6

– C

8

) zu einer Wachstumshemmung von T.

aromatica.

Bei G. sulfurreducens, dessen Wachstumskontrolle einen wesentlich höheren

Sättigungsgrad aufwies als die Zellen von T. aromatica, zeigte sich eine starke

Erhöhung des Sättigungsgrades nach Zugabe aller Substanzen. Aber in Gegenwart

IV. Diskussion

106

von Benzol, Xylol und den phenolischen Verbindungen fiel der Anstieg des

Sättigungsgrads besonders stark aus. Eine klare Unterscheidung wie bei

T. aromatica konnte hier jedoch nicht getroffen werden.

Die Ursachen für das unterschiedliche Verhalten der Zellen gegenüber den

verschiedenen Verbindungen sind dabei in der unterschiedlichen Fettsäure-

zusammensetzung der Phospholipide der beiden Mikroorganismen, aber auch in den

unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften der Testsubstanzen zu sehen

(Antunes, 1989, 1990, 1994, 1995; Sikkema, 1995). Aufgrund ihres unpolaren

Charakters reichern sich BTEX-Verbindungen bevorzugt im hydrophoben Teil der

Membrandoppelschicht an (Simon et al., 1982; Weber & De Bont, 1996) und stören

dort die Wechselwirkungen zwischen den Acylketten, was zu einer Verminderung der

Packungsdichte und zu einer Erhöhung der Membranfluidität führt. Aliphatische

Alkanole und (Chlor-) Phenole hingegen weisen einen eher amphiphilen Charakter

auf. Studien zur Einlagerung aliphatischer Alkanole in künstlichen Membranen

(Dimyristolphosphatidylcholin) ergaben, dass sich die terminalen Hydroxylgruppen

der Alkanole nahe der Wasser-Lipid-Grenzfläche verankern, was eine Erhöhung der

Unordnung im Glycerolrückgrat der Lipide nach sich zieht. Die aliphatischen Ketten

der Alkanole hingegen lagern sich zwischen den Fettsäureketten der Phospholipide

an und stören dort die van der Waals-Kräfte zwischen den Acylketten (Westermann

et al., 1988; Weber & De Bont, 1996). Ähnliche Resultate konnten auch für andere

amphiphile Substanzen wie Benzylalkohol und Cannabinoide beobachtet werden

(Pope et al., 1986; Yang et al., 1992). Im Gegensatz zur Einlagerung unpolarer

Verbindungen führt die Insertion amphiphiler Verbindungen nahe der polaren

Kopfgruppen zu einer Ausdehnung der Kopfgruppenregion. Parallel dazu kommt es

in Abhängigkeit der Kettenlänge der aliphatischen Alkohole zu gestörten

Interaktionen zwischen den Acylketten, was eine Erhöhung der Membranfluidität

verursacht. Während Alkanole mit einer Kettenlänge zwischen 4 - 10

Kohlenstoffatomen einen Anstieg der Membranfluidität (Verringerung der

Lipidordnung) und eine Verminderung der Membranenstabilität verursachen, führt die

Einlagerung kurzkettiger n-Alkanole (< C

4

) neben der Erhöhung der Membranfluidität

zu einem Anstieg der Membranstabilität.

Am Beispiel von T. aromatica konnte außer einer Lösungsmittel-

konzentrationsabhängigen Änderung des Sättigungsgrades eine zeitliche Änderung

IV. Diskussion

107

der zellulären Fettsäurezusammensetzung gezeigt werden. Nach der Applikation von

Phenol wurde im Gegensatz zur Wachstumskontrolle ein Anstieg des

Sättigungsgrades erfasst. Erst 15 h nach Phenolzugabe wurde der maximale Wert

erreicht. Danach war keine weitere Erhöhung des Sättigungsgrades mehr zu

beobachten. Verglichen mit der cis-trans-Isomerisierung, die unabhängig von der

Fettsäureneusynthese abläuft und mit der einige Pseudomonaden- und Vibrio-Arten

ihre Membranfluidität kurzfristig regulieren (Heipieper et al., 2003), stellt die

Änderung des Sättigungsgrades, wie sie für T. aromatica ermittelt wurde, einen eher

langwierigeren Prozess dar.

4.2.2 Anpassung von D. multivorans an die Anwesenheit lipophiler,

organischer Substanzen

Das zelluläre Fettsäurespektrum von D. multivorans war – im Gegensatz zu den

beiden anderen untersuchten Mikroorganismen – weniger durch einen hohen Anteil

ungesättigter Fettsäuren, sondern vielmehr durch einen hohen prozentualen Anteil

anteiso-verzweigter Fettsäuren gekennzeichnet, was charakteristisch für einige

dissimilatorische Sulfat- bzw. Schwefelreduzierer ist. Besonders in Bakterien, die der

Gattung Desulfovibrio angehören, aber auch bei Vertretern der Gattungen

Desulfomicrobium bzw. Desulfomonas, machen verzweigtkettige Fettsäuren einen

großen Teil der zellulären Fettsäuren aus (Makula et al., 1974, 1975; Ueki et al.,

1979; Kaneda, 1991; Vainshtein et al., 1992; Feio et al., 1998). Während in diesen

Gattungen iso-verzweigte Fettsäuren (iso-C15:0 und iso-C17:0) häufig vorkommen

(Vainshtein et al., 1992), enthält D. multivorans relative hohe prozentuale Anteile von

anteiso-C15:0-, anteiso-C17:0- und anteiso-C17:1-Fettsäuren. Allerdings weisen

einzelne Arten der Gattung Desulfovibrio, verglichen mit D. multivorans, einen

ähnlich hohen Anteil an anteiso-C15:0 auf. Zu diesen Vertreten gehören neben

Desulfovibrio gigas u. a. auch D. alcoholovorans, D. carbinolicus, D. fructusovorans

und D. giganteus. In diesen Bakterien macht 12-Methyltetradecansäure (anteiso-

C15:0) ca. 30-54 % des Gesamtfettsäuregehalts aus (Vainshtein et al., 1992).

Vergleichbar mit einem hohen Gehalt ungesättigter Fettsäuren gestattet der hohe

Anteil anteiso-verzweigter Fettsäuren diesen Mikroorganismen eine Anpassung an

niedrige Wachstumstemperaturen. Ähnlich wie cis-Doppelbindungen ungesättigter

Fettsäuren lassen anteiso-Verzweigungen keine hohe Packungsdichte der

IV. Diskussion

108

Acylketten zu (Kaneda, 1991; Russell & Fukunaga, 1994). Dies reflektiert sich sowohl

in den Schmelzpunkten ungesättigter Fettsäuren als auch in denen der anteiso-

verzweigten Fettsäuren. Diese liegen niedriger als die der korrespondierenden

gesättigten, unverzweigten Fettsäuren. Ein hoher prozentualer Anteil von

ungesättigten oder anteiso-verzweigten Fettsäuren in der Membran ermöglicht den

entsprechenden Mikroorganismen somit die Aufrechterhaltung der Membranfluidität –

auch bei niedrigen Temperaturen (Kaneda et al., 1983).

Aufgrund der Tatsache, dass ungesättigte Fettsäuren in D. multivorans nur einen

geringen prozentualen Anteil des Gesamtfettsäuregehalts ausmachen, spielte die

Änderung des Sättigungsgrades der zellulären Fettsäuren, wie sie zuvor bei

G. sulfurreducens und T. aromatica demonstriert wurde, als Reaktion auf die Zugabe

organischer Lösungsmittel und Schadstoffe nur eine untergeordnete Rolle.

Ebenso wenig reagierte D. multivorans, der iso-verzweigte Fettsäuren nur in Spuren

enthielt, in Anwesenheit organischer Lösungsmittel und Schadstoffe mit einer

verstärkten Bildung von iso-Fettsäuren, wie sie beispielsweise bei Arthrobacter

chlorophenolicus ermittelt wurde (Unell et al., 2007). Arthrobacter chlorophenolicus -

ein Gram-positive Mikroorganismus - weist als Reaktion auf die Zugabe von Phenol,

4-Chlorphenol und 4-Nitrophenol verstärkt iso-verzweigter Fettsäuren auf, während

der Anteil anteiso-verzweigter Fettsäuren sinkt. Iso-Methylverzweigung lassen

aufgrund der geringeren Eindringtiefe der Methylverzweigung deutlich mehr

Interaktionen mit benachbarten Fettsäureketten zu als anteiso-Methylverzweigungen,

was eine dichtere Packungen der Acylketten erlaubt (MacDonald et al., 1983, 1985;

Russell, 1995). Folglich sind wesentlich mehr Energie bzw. mehr

Lösungsmittelmoleküle als bei anteiso-Verzweigungen nötig, um die van der Waals-

Kräfte zwischen den Fettsäureketten zu stören und die Unordnung innerhalb der

Membran zu erhöhen. Dies wird sehr deutlich bei der Betrachtung der

Schmelzpunkte von Fettsäuren (Tab. 1). Die Schmelzpunkte von iso-verzweigten

Fettsäuren entsprechen in etwa denen von unverzweigten, gesättigten Fettsäuren

und liegen deutlich höher als die der entsprechenden anteiso-verzweigten

Fettsäuren.

IV. Diskussion

109


m

) verschiedener Phospholipidfettsäuren nach Kaneda, 1991

Fettsäure T

m

[°C]

n-C15:0

52,5

iso-C15:0

51,7

anteiso-C15:0

23,0

n-C17:0

61,3

iso-C17:0

60,2

anteiso-C17:0

36,8

Bei D. multivorans wurde in Abhängigkeit der applizierten Testverbindungen bzw.

deren Konzentrationen jedoch eine Verschiebung des Verhältnisses zwischen

unverzweigten, gesättigten und anteiso-verzweigten Fettsäuren festgestellt. Auf die

Zugabe von BTEX-Verbindungen bzw. n-Hexanol, in Konzentrationsbereichen, die

unterhalb der EC50 lagen, reagierten die Zellen von D. multivorans mit einem Abfall

der anteiso-verzweigten Fettsäuren. Sie reagierten somit auf diese Lösungsmittel wie

Bacillus subtilis bzw. Bacillus stearothermophilus nach Zugabe von Ethanol bzw.

DDT (Rigomier et al., 1980; Donato et al., 1997). Parallel zur Verminderung des

Anteils der anteiso-verzweigten Fettsäuren wurde eine Erhöhung des Anteils der

unverzweigten, gesättigten Fettsäuren festgestellt, was zu einem Anstieg des

Verhältnisses unverzweigter, gesättigter und anteiso-verzweigter Fettsäuren führte.

Die Zunahme des Anteils der unverzweigten, gesättigten Fettsäuren ermöglicht eine

höhere molekulare Ordnung der Acylketten, und gestattet somit deren dichtere

Packung innerhalb der Membran, was zu einer Senkung der Membranpermeabilität

führt.

Im Gegensatz dazu wurde als Reaktion auf die Applikation (chlor-) phenolischer

Verbindungen bzw. n-Butanols in Konzentrationsbereichen, die unterhalb der EC50

lagen, ein Abfall des Verhältnisses zwischen unverzweigten, gesättigten und anteiso-

verzweigten Fettsäuren erfasst. Dieser Abfall war bedingt durch die Erhöhung des

Anteils anteiso-verzweigter Fettsäuren und die Abnahme der unverzweigten,

gesättigten Fettsäuren, wobei die Erhöhung des Anteils anteiso-verzweigter

Fettsäuren u. a. auf einem Anstieg der 14-Methylhexadecensäure (anteiso-C17:1)

basierte. Paradoxerweise würde die prozentuale Erhöhung der anteiso-verzweigten

Fettsäuren am Gesamtfettsäuregehalt eine Zunahme der Membranfluidität nach sich

IV. Diskussion

110

ziehen. Denn ähnlich wie cis-Doppelbindungen ungesättigter Fettsäuren lassen

anteiso-verzweigte Fettsäuren aufgrund ihrer Methylverzweigungen nur eine geringe

Packungsdichte der Acylketten zu (Kaneda, 1991; Russell & Fukunaga, 1994).

Eine Erhöhung des Anteils anteiso-verzweigter Fettsäuren und der damit verbundene

Anstieg der Membranfluidität in Anwesenheit organischer Lösungsmittel bzw.

Schadstoffe wurde, wie bereits im Kapitel 1.6.2.4 dargestellt, durchaus bei einigen

anderen Mikroorganismen, wie beispielsweise dem extrem lösungsmitteltoleranten

Staphylococcus haemolyticus, nachgewiesen (Nielsen et al., 2005). Leider war für

den entsprechenden Stamm keine konzentrationsabhängige Änderung der zellulären

Fettsäuren beschrieben. Bei Acinetobacter calcoaceticus in Anwesenheit kurzkettiger

Alkanole (C1-C6) bzw. bei pyruvatverwertenden Zellen von Comamonas testosteroni

ATCC 17454 war ebenfalls eine Erhöhung der Membranfluidität nach Inkubation mit

Ethanol, Phenol, 2,4-Dichlorphenol bzw. 2,4-Dinitrophenol nachweisbar (Kabelitz et

al., 2003; Loffhagen et al., 2005). Allerdings wurde bei diesen beiden

Mikroorganismen eine Verminderung des Sättigungsgrades erfasst.

Die Insertion anteiso-verzweigter Fettsäuren nach Zugabe (chlor-) phenolischer

Verbindungen bzw. von n-Butanol (C

4

) würde zwar in zunehmendem Maße zu einem

Fluiditätsanstieg der Membran führen; bewirkt jedoch auch deren

Phasenstabilisierung. Um die Stabilität der Zytoplasmamembran nach Zugabe

amphiphiler Verbindungen, die sich mit ihrem polaren Anteil bevorzugt in der

Phospholipidkopfgruppenregion einlagern, aufrechtzuerhalten, reagierte

D. multivorans mit dem verstärkten Einbau raumfordernder anteiso-verzweigte

Fettsäuren wie beispielsweise 14-Methylhexadecensäure (anteiso-17:1) in die

Zytoplasmamembran. Der Einbau verzweigter Fettsäuren, die partiell noch

ungesättigt sind, führt – ähnlich wie der Einbau ungesättigte Fettsäuren – zum

verstärkten Auftreten von non-bilayer-formenderLipiden in der Membran (Hazel &

Williams, 1990; Jurado et al., 1991; Weber & De Bont, 1996). Gerade non-bilayer-

formende Lipide spielen eine wichtige Rolle bei Interaktion mit Membranproteinen.

Sie ermöglichen aufgrund ihrer raumgreifenden Struktur einen optimalen Kontakt

zwischen Membranlipiden und Proteinoberflächen (Epand, 1998; Fyfe et al., 2001).

Es ist somit nicht auszuschließen, dass D. multivorans die Fluidität seiner

Zytoplasmamembran über andere Mechanismen, wie beispielsweise über eine

Erhöhung des Membranproteingehaltes bzw. die verstärkte Einlagerung von

Hopanoiden, verringert. Andererseits muss eine erhöhte Membranfluidität nicht

IV. Diskussion

111

zwangsläufig den Zelltod nach sich ziehen, wie anhand mehrerer Mikroorganismen

belegt werden konnte, die trotz unterschiedlicher Membranfluidität in der Lage waren

zu wachsen (Jackson & Cronan, 1978; Silvius et al., 1979; Melchior, 1982; Russell &

Fukunaga, 1990). Eine Wachstumshemmung konnte erst dann beobachtet werden,

als der größte Anteil der Membranlipide in der Gelphase vorlag (Hazel & Williams,

1990).

Bei einer Wachstumsinhibition von D. multivorans um mehr als 75 % konnte eine

massive Abnahme der anteiso-verzweigten Fettsäuren und parallel dazu eine relative

Erhöhung der unverzweigten, gesättigten Fettsäuren verzeichnet werden. Da

verzweigte Fettsäuren ausschließlich nur durch Neusynthese und unter Verbrauch

von Energieäquivalenten gebildet werden können, hängt die Aufrechterhaltung der

Fluidität bzw. der Phasenstabilität der Membran vom Energiehaushalt der

Bakterienzelle ab (Kaneda, 1991; Russell, 1995). Wie aber am Beispiel von

T. aromatica nach Zugabe (chlorierter) Phenole demonstriert werden konnte, sinkt

die zelluläre ATP-Konzentration massiv in Anwesenheit organischer Lösungsmittel.

Eine ausreichenden Versorgung mit Energieäquivalenten ist jedoch essentiell für die

Modifikation der Zellmembran-PLFA-Zusammensetzung; für die Synthese von

anteiso-Fettsäuren und für eine funktionierende Aminosäuresynthese, da α-

Ketosäuren als Startermolküle für die Synthese verzweigter Fettsäuren werden

genutzt. Deren Ursprünge liegen in den verzweigten Aminosäuren Valin, Leucin (iso-

Fettsäuren) und im Falle von anteiso-Fettsäuren in Isoleucin (Kaneda, 1991; Russell,

1995).

Trotz ihrer Fähigkeit sich an Lösungsmittel anzupassen, erwiesen sich die drei

anaeroben Bakterienstämme, die im Rahmen dieser Arbeit untersucht wurden,

generell als weniger tolerant gegenüber BTEX-Verbindungen, (chlor-) phenolischen

Verbindungen und aliphatischen Alkanolen als die bisher untersuchten aeroben

Bakterienstämme.

Ein wesentliches Kriterium, das die Toleranz gegenüber Lösungsmitteln beeinflusst,

ist die spezifische Rate, mit der die Organismen wachsen. Die Wachstumsraten der

bisher untersuchten aeroben Bakterien (Pseudomonas-Arten µ = 0,3-0,8 h

-

) liegen

deutlich über denen der in dieser Arbeit untersuchten anaeroben Mirkoorganismen.

IV. Diskussion

112

Da Anpassungsreaktionen, wie die Änderung des Sättigungsgrades, zum Teil an

Wachstumsprozesse gekoppelt ablaufen (Keweloh et al., 1996), ermöglichte das

Wachstum mit einer höheren Wachstumsrate den bisher untersuchten aeroben

Mikroorganismen eine rasche Reaktion auf ihre Umwelt.

Beim Vergleich der Wachstumsraten parallel zur Lösungsmitteltoleranz der drei

untersuchten Anaerobier wird jedoch deutlich, dass das Überleben von

Mikroorganismen mittels vieler Nachkommen nur eine mögliche Selektionsstrategie

sein kann. Theoretisch sollte D. multivorans mit einer Wachstumsrate von µ = 0,03

h

-1

wesentlich empfindlicher auf Lösungsmittel reagieren als T. aromatica oder

G. sulfurreducens, die sich mit Wachstumsraten von µ = 0,22 h

-1

bzw. 0,14 h

-1

vermehrten. Allerdings toleriert D. multivorans teilweise deutlich höhere

Lösungsmittelkonzentrationen als die beiden anderen untersuchten

Bakterienstämme.

Im Gegensatz zu Mikroorganismen, die sich ihr Überleben aufgrund höherer

Vermehrungsraten sichern, investieren Mikroorganismen, die sich mit einer geringen

spezifischen Wachstumsrate vermehren, wesentlich mehr Energie in ihren

Erhaltungsstoffwechsel. Dies gewährleistet, dass es ihnen auch ohne schnelle

Vermehrung möglich ist, sich an wechselnde bzw. widrige Umweltbedingungen

anzupassen.

V. Zusammenfassung

113

5. Zusammenfassung

Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmals die Einflussnahme verschiedener

organischer, umweltrelevanter Schadstoffe und Lösungsmittel (Benzol, Toluol,

Ethylbenzol, Xylol, n-Butanol, n-Hexanol, n-Octanol, Phenol, 4-Chlorphenol und 2,4-

Dichlorphenol) auf das Wachstum der drei anaeroben Mikroorganismen Thauera

aromatica, Geobacter sulfurreducens und Desulfococcus multivorans systematisch

untersucht. Die dabei erzielten Ergebnisse lassen sich wie folgt zusammenfassen:

1. Trotz der vergleichsweise geringen Wachstumsraten der drei anaeroben Mikro-

organismen war es möglich, die akute (narkotische) Toxizität der oben genannten

Testverbindungen mittels eines Testsystems zu bestimmen, das bereits für aerobe

Bakterien etabliert wurde.

2. In Abhängigkeit von den eingesetzten Konzentrationen der Lösungsmittel wurde

eine Beeinflussung des mikrobiellen Wachstums festgestellt. Je höhere

Lösungsmittelkonzentrationen im Medium vorlagen, desto stärker wurde das

Wachstum der Mikroorganismen gehemmt. Anhand der ermittelten Effektiven

Konzentrationen (EC50), also der Konzentration der Testverbindungen, die zu

einer 50 %igen Wachstumsinhibition der Mikroorganismen führte, war es möglich

die akute (narkotische) Toxizität der Testverbindungen zu beschreiben und

Vergleiche zwischen den einzelnen Testorganismen zu treffen.

3. Für alle drei untersuchten Spezies wurde eine Quantitative-Struktur-Wirkungs-

Beziehung beschrieben. Dabei wurde für jeden der drei Organismen erstmals die

Abhängigkeit der Substanztoxizität von der Substanzhydrophobizität demonstriert.

Je hydrophober die untersuchten Lösungsmittel waren, d.h. je höher deren log-

P

O/W

-Werte lagen, desto geringere Konzentrationen waren nötig, um das

Wachstum der drei untersuchten Mikroorganismen zu hemmen. Im Rahmen der

QSAR wurde für alle drei Mikroorganismen ein mathematisches Modell erstellt.

4. Beim Vergleich mit existierenden Literaturdaten zeigte sich, dass T. aromatica, G.

sulfurreducens und D. multivorans generell etwas sensitiver auf die untersuchten

Lösungsmittel bzw. Schadstoffe reagierten, als die bisher mit diesem Testsystem

untersuchten aeroben Mikroorganismen.

V. Zusammenfassung

114

5. Beim Vergleich der ermittelten EC50-Werte zeigte sich, dass D. multivorans, der

von den drei untersuchten Organismen die geringste Wachstumsrate aufwies,

weitaus höhere Konzentrationen der getesteten Verbindungen tolerierte, als die

beiden anderen Organismen. Zudem zeigte sich T. aromatica gegenüber (Chlor-)

Phenolen und n-Alkanolen sensitiver als gegenüber BTEX-Verbindungen.

6. Parallel zur Hemmung des mikrobiellen Wachstums zeigten T. aromatica bzw. D.

multivorans in Abhängigkeit von den vorliegenden Testsubstanzkonzentrationen

eine Verminderung der Umsatzraten ihres Wachstumssubstrates Benzoat. Dies

spiegelte sich in der Reduktion des Proteingehaltes und der Zellzahlen wieder.

7. Bei T. aromatica wurde in Abhängigkeit von den applizierten (Chlor-) Phenol-

konzentrationen eine Verminderung der zellulären ATP-Konzentrationen und

Biomasseerträge erfasst.

8. Auf den Wechsel des Elektronenakzeptors von Nitrat zu Sauerstoff reagierte T.

aromatica mit einer Reduktion der Wachstumsrate. Die unter aeroben

Bedingungen für T. aromatica erfassten EC50-Werte für 4-Chlorphenol und 2,4-

Dichlorphenol unterschieden sich nur wenig von denen, die unter anaeroben

Bedingungen bestimmt wurden. Auf Zugabe von Phenol reagierten die Zellen von

T. aromatica, unter aeroben Bedingungen wesentlich sensitiver.

9. T. aromatica und G. sulfurreducens, deren zelluläre Fettsäurespektren durch einen

hohen Anteil von C16:0 und C16:1 gekennzeichnet waren, reagierten auf die

Anwesenheit lipophiler Substanzen, mit einer Änderung des Sättigungsgrades der

zellulären Fettsäuren. In Abhängigkeit von den vorliegenden Testsubstanz-

konzentrationen wurde eine Zunahme des Sättigungsgrades erfasst, wobei ein

Maximum erreicht wurde wenn eine etwa 50 %ige (T. aromatica) bzw. 75 %ige (G.

sulfurreducens) Wachstumshemmung der Organismen vorlag.

10. Außer der konzentrationsabhängigen Änderung der zellulären Fettsäurezu-

sammensetzung, wurde für die Zellen von T. aromatica nach Zugabe von Phenol

eine zeitabhängige Änderung Fettsäurezusammensetzung ermittelt. In Zellen, die

mit Phenol inkubiert wurden, wurde bis 15 Stunden nach Phenolzugabe ein

Anstieg des Sättigungsgrades verzeichnet. Während der Sättigungsgrad der

Wachstumskontrolle, die ohne Phenol inkubiert wurde, auch nach Übergang in die

stationäre Wachstumsphase nur geringfügig schwankte.

V. Zusammenfassung

115

11. Das zelluläre Fettsäurespektrum von D. multivorans wurde dominiert von anteiso-

verzweigte Fettsäuren (C15:0 anteiso, C17:0 anteiso, C17:1cis Δ10 anteiso) und

unverzeigten gesättigten Fettsäure. Ungesättigte bzw. iso-verzweigte Fettsäuren

spielten nur eine untergeordnete bzw. keine Rolle. Als Indikator für eine

Anpassungsreaktion wurde das Verhältnis zwischen gesättigten, unverzweigten

Fettsäuren (C14:0, C15:0, C16:0, C18:0) und anteiso-verzweigten Fettsäuren

(C15:0 anteiso, C17:0 anteiso, C17:1cis Δ10 anteiso) gewählt.

12. Als Reaktion auf die Applikation von BTEX-Verbindungen bzw. n-Hexanol in

Konzentrationen, die das Wachstum von D. multivorans weniger als 50%

hemmten, wurde ein Anstieg des Verhältnisses zw. unverzweigten, gesättigten

und anteiso-verzweigten Fettsäuren erfasst. Währenddessen bewirkte die

Applikation (chlor-) phenolischer Verbindungen bzw. n-Butanols in

Konzentrationen, die unterhalb der EC50 lagen, einen Abfall dieses Verhältnisses.

13. Wurde das Wachstum von D. multivorans um mehr als 75 % gehemmt, zeigte

sich unabhängig von den untersuchten Lösungsmittel eine massive Abnahme der

anteiso-verzweigten Fettsäuren und parallel dazu eine Erhöhung der

unverzweigten, gesättigten Fettsäuren.

VI. Anregungen für weitere Untersuchungen

116

6. Anregungen für weitere Untersuchungen

Um zu prüfen inwieweit die Wachstumsrate der Mikroorganismen die Toleranz

gegenüber Lösungsmittel beeinflusst, sollten weitere Untersuchungen mit

autochtonen Mikroorganismen folgen.

T. aromatica zeigte sich in Anwesenheit von Luftsauerstoff in etwa um das 5-Fache

sensibler gegenüber Phenol als unter anoxischen Bedingungen. Die Effektiven

Konzentrationen der beiden Chlorphenole, die in Anwesenheit von Luftsauerstoff

bestimmt wurden, unterschieden sich dagegen nur geringfügig von denen, die in

unter anoxischen Bedingungen ermittelt wurden. Als eine mögliche Ursache für die

geringere Phenoltoleranz unter oxischen Bedingungen könnte die Bildung von

Phenoxyradikalen in Betracht gezogen werden, wie sie von Selassie et al. (1998)

oder Hansch et al. (2000) vorgeschlagen wurden. Selassi et al. (1998), die den

Einfluss von 37 verschiedenen phenolischen Verbindungen auf murine

Leukämiezellen untersuchten, unterschieden in Abhängigkeit der jeweiligen

Substituenten zwei Wirkprinzipien: Bei Phenolen mit Substituenten, die die

Elektronendichte im Ringsystem verringern, wie z. B. Halogenatome, wird die

Toxizität maßgeblich durch die Hydrophobizität bestimmt. Die Toxizität von Phenolen

mit Substituenten, die die Elektronendichte im Ring erhöhen, wie z.B. Alkylgruppen,

ist abhängig von der möglichen Bildung von Radikalen bzw. der Reaktion der

gebildeten Radikale. Um die Frage zu klären, ob bei T. aromatica ähnliche

Mechanismen vorliegen, sollte geprüft werden, wie sich weitere phenolische

Verbindungen auf das Bakterium auswirken. Dabei sollten Phenole mit möglichst

unterschiedlichen Substituenten – sowohl solche, die die Elektronendichte im

Ringsystem verringern, als auch solche, die sie erhöhen – unter oxischen bzw.

anoxischen Bedingungen getestet werden.

Darüber hinaus ergeben sich noch weitere Fragestellungen in Bezug auf eine

mögliche Beteiligung der Phospholipidkopfgruppen an den Anpassungs-

mechanismen anaerober Mikroorganismen. Ferner sollte geprüfte werden, wie sich

die Zugabe von Lösungsmitteln auf den Proteingehalt der Cytoplasmamembran bzw.

der äußeren Membran auswirkt.

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VIII. Anhang

133

8. Anhang

8.1 Berechnung der Volumina leicht-flüchtiger BTEX-Verbindungen

V

zuzugebendes LM

= Volumen [ml] des zuzugebenden Lösungsmittels

ρ

LM

= Dichte des Lösungsmittels [mg/ml]

κ

Medium/Gasph

= Henry-Koeffizient (siehe 8.2)

m

LM im Medium

= im Medium erwünschte Menge an Lösungsmittel [mg]

V

Medium

= Mediumvolumen [ml]

V

Gasph.

= Volumen der Gasphase [ml]

8.2 Henry-Koeffizienten

Substanzen Henry-Koeffizienten

25°C

a.

30°C 34°C

Benzol 0,25 0,27 0,32

Toluol 0,27 0,34 0,40

Ethylbenzol 0,33 0,45 0,56

Xylol 0,27

b.

0,34

b.

0,40

b.

a.

nach Staudinger et al., 1996

b.

Mittelwert der Henrykoeffizienten von o, p, m-Xylol

ρ

LM

1

*

Κ

Medium/Gasp

h.

*

m

LM im Medium

V

Medium

*

V

Gasph

+ m

LM im Medium

V

zuzugebendes LM

=

VIII. Anhang

134

8.3 Berechnung der theoretischen Membrankonzentration

Substanz

log P

O/W

a.

log P

M/P

b.

P

M/P

b.

Konzentration

[mM] in

wässriger

Lösung

theoret.

Membran-

konz.

[mM]

c.

Phenol 1,45 0,767 5,8 0 0

1.1 6

2.1 12

6.4 38

10.6 63

4-Chlorphenol 2,4 1,688 48,75 0 0

0.56 27

0.8 39

1.2 59

0 0

2,4-Dichlorphenol 3,2 2,464 291,07 0 0

0.09 26

0.15 43

0.21 61

0.31 89

a.

log P

O/W

errechnet nach Rekker & De Kort (1979)

b.

log P

M/P

und P

M/P

errechnet nach Sikkema et al., (1994)

c.

Ermittelung der theoret. Membrankonzentration nach Heipieper et al., (1995)

VIII. Anhang

135

8.4 Änderung des zellulären Fettsäurespektrums von T. aromatica

als Reaktion auf die Anwesenheit von BTEX-Verbindungen,

aliphatischen n-Alkanolen und verschiedenen (Chlor-) Phenolen

Fettsäuren

Substanz

Konzen-

tration in

wässriger

Phase [mM]

C16:0

C16:1cis

C 18:0

C18:1cis11

Sättigungs-

grad

BTEX-Verbindungen

Benzol 0 32 50 0 18 0,477

1,2 36 46 1 17 0,589

2,2 38 46 1 15 0,643

3,4 37 47 1 15 0,619

3,9 33 49 1 16 0,522

4,6 33 49 2 16 0,529

5,7 35 45 2 18 0,585

6,9 33 47 5 15 0,613

Toluol 0 33 47 < 1 20 0,504

0,2 35 45 1 19 0,558

0,5 37 45 2 16 0,638

0,7 36 44 3 17 0,640

0,9 35 44 3 17 0,635

1,1 33 45 3 18 0,567

1,4 32 46 4 18 0,560

1,8 32 47 3 18 0,538

Xylol 0 31 49 0 20 0,449

0,16 33 49 1 17 0,51

0,24 34 48 2 16 0,558

0,33 36 47 1 16 0,58

0,40 31 47 7 16 0,599

0,57 32 44 6 18 0,609

0,65 32 44 7 18 0,629

Ethylbenzol: Einfluss konnte nicht geprüft werden

Aliphatische Alkanole

n-Butanol 0 31 49 0 20 0,446

10 32 48 0 20 0,476

15 33 47 0 20 0,501

20 35 46 0 19 0,532

30 37 45 0 18 0,579

50 37 46 0 17 0,587

n-Hexanol 0 31 49 0 19 0,453

0,5 33 48 0 19 0,486

1 34 46 0 20 0,512

1,5 34 48 0 18 0,523

2 36 47 0 17 0,557

3 40 42 0 18 0,663

5 40 44 0 17 0,654

8 38 42 0 20 0,606

VIII. Anhang

136

n-Octanol 0 31 49 0 20 0,449

0,2 30 45 2 23 0,471

0,4 32 42 5 21 0,587

0,6 34 37 11 18 0,818

0,7 33 40 8 19 0,695

0,8 34 38 10 18 0,786

0,9 34 39 9 18 0,760

(Chlor-)Phenole

Phenol 0 33 49 < 1 18 0,503

1,1 36 50 0 14 0,563

2,1 39 47 0 14 0,643

3,2 41 43 1 15 0,707

4,3 43 44 2 11 0,810

6,4 38 46 1 15 0,630

7,4 35 46 2 17 0,587

4-Chlor- 0,00 34 50 0 16 0,519

phenol 0,40 37 45 1 17 0,615

0,48 40 45 1 14 0,702

0,56 41 44 1 14 0,741

0,72 39 45 1 15 0,670

0,80 36 46 2 16 0,622

0,96 36 46 1 17 0,585

1,20 36 46 2 16 0,618

0,00 34 50 <1 16 0,519

2,4-Dichlor- 0 31 51 0 18 0,446

phenol 0,03 32 50 0 18 0,471

0,06 33 50 0 17 0,494

0,09 34 49 0 17 0,515

0,12 36 48 0 16 0,560

0,18 41 45 0 14 0,685

0,25 36 48 0 16 0,564

0,31 34 48 0 18 0,515

VIII. Anhang

137

8.5 Änderung des zellulären Fettsäurespektrums von G. sulfurreducens als

Reaktion auf die Anwesenheit von BTEX-Verbindungen und (Chlor-) Phenolen

Fettsäuren

Ko

nzen

tra

tio

n in

wäs

srig

er P

ha

se

(m

M)

µ in

%

C14

:0

i-C

15:0

ai-C

15:0

C15

:0

cis C

16:1Δ

9

cis C

16:1Δ

11

C16

:0

cis C

18:1 Δ

11

C18

:0

gesä

ttig

te F

A

un

ges

ättig

te F

A

Sättig

un

gsg

rad

Benzol

0 100 3 4 0 0 49 3 36 3 2 41 55 0,745

1,07 92 3 5 0 0 44 2 43 2 1 47 48 0,979

2,15 82 4 5 0 0 41 1 46 2 2 52 44 1,182

3,22 64 5 4 0 0 36 1 49 1 3 57 38 1,500

3,68 57 6 4 0 0 37 1 48 2 2 56 40 1,400

5,36 0 3 3 0 1 38 1 41 6 7 52 45 1,156

Toluol

0 100 2 4 0 0 51 3 36 2 1 39 56 0,696

0,20 103 2 5 0 0 46 3 41 2 1 44 51 0,863

0,41 102 2 4 0 0 45 3 43 1 1 46 49 0,939

0,61 100 4 5 0 0 43 2 41 3 2 47 48 0,979

0,82 87 4 5 1 0 41 2 42 3 3 49 46 1,065

1,02 75 4 4 1 1 40 2 42 2 4 51 44 1,159

1,25 10 3 4 0 0 41 2 44 2 3 50 45 1,111

Xylol

0 100 3 5 0 0 52 3 34 1 1 38 56 0,679

0,18 94 4 5 0 0 45 2 41 2 1 46 49 0,939

0,29 85 5 6 0 0 45 2 39 2 1 45 49 0,918

0,36 38 4 5 0 0 45 2 38 3 3 45 50 0,900

0,56 0 3 4 0 0 34 1 41 6 11 55 41 1,341

Ethylbenzol

0 100 4 4 0 0 49 2 33 3 3 40 54 0,741

0,07 100 4 4 0 0 47 2 38 3 2 44 52 0,846

0,15 95 4 6 0 1 44 2 40 2 1 46 48 0,958

0,22 90 4 5 0 0 44 2 40 2 3 47 48 0,979

0,29 40 5 4 0 0 40 2 41 3 5 51 45 1,133

0,44 0 6 3 1 1 35 1 38 5 9 54 41 1,317

VIII. Anhang

138

Fettsäuren

Ko

nzen

tra

tio

n in

wäs

srig

er P

ha

se

(m

M)

µ in

%

C14

:0

i-C

15:0

ai-C

15:0

C15

:0

cis C

16:1Δ

9

cis C

16:1Δ

11

C16

:0

cis C

18:1 Δ

11

C18

:0

gesä

ttig

te F

A

un

ges

ättig

te F

A

Sättig

un

gsg

rad

Phenol

0 100 3 5 0 0 48 2 35 1 2 40 51 0,768

2,1 91 4 5 0 0 44 2 41 2 2 47 48 0,979

6,4 57 5 5 1 0 40 1 42 2 3 50 43 1,163

8,5 46 5 7 1 0 39 1 41 2 3 49 42 1,167

10,6 29 5 8 1 0 38 1 43 1 2 50 40 1,250

13,25 12 6 7 1 0 37 1 42 2 3 51 40 1,275

15,9 7 5 5 1 0 38 1 42 3 4 51 42 1,214

4-Chlorphenol

0 100 3 4 0 0 52 2 36 2 1 40 56 0,714

0,4 76 3 4 0 0 51 2 37 2 1 41 55 0,745

0,6 65 3 3 0 0 47 2 41 2 1 45 51 0,882

1 33 3 3 0 0 46 2 41 2 2 46 50 0,920

1,2 32 3 4 1 0 43 1 43 3 2 48 47 1,021

1,4 25 4 4 0 0 40 1 44 3 3 51 44 1,159

1,6 18 4 4 0 0 36 1 46 3 6 56 40 1,400

2,4-Dichlorphenol

0 100 3 5 0 0 51 3 35 1 1 39 55 0,709

0,06 87 3 4 0 0 50 2 37 3 1 41 55 0,745

0,12 71 3 3 0 0 44 2 43 3 2 48 49 0,980

0,15 64 4 4 0 0 44 2 43 0 2 49 46 1,065

0,18 57 4 3 0 0 38 2 45 3 2 51 43 1,186

0,25 43 5 4 0 0 38 0 47 4 2 54 42 1,286

0,31 21 4 4 0 0 41 1 43 5 2 49 47 1,043

VIII. Anhang

139

Toluol [mM]

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

Wa

ch

stu

m [%

d

er K

on

tro

lle

]

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

Sä

ttig

un

gs

gra

d

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

1,2

1,3

1,4

1,5

Abb. 30 Einfluss von Toluol auf den Sättigungsgrad der zellulären Fettsäuren von G. sulfurreducens,

anaerob kultiviert mit Acetat (5 mM) und Fumarat (25 mM), 8 h nach Zugabe von Toluol, in

unterschiedlichen Konzentrationen. relative Wachstumsinhibition und Sättigungsgrad

Ethylbenzol [mM]

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4

Wa

ch

stu

m [%

d

er K

on

tro

lle

]

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

Sä

ttig

un

gs

gra

d

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

1,2

1,3

1,4

1,5

Abb. 31 Einfluss von Ethylbenzol auf den Sättigungsgrad der zellulären Fettsäuren von G.

sulfurreducens, anaerob kultiviert mit Acetat (5 mM) und Fumarat (25 mM), 8 h nach Zugabe von

Ethylbenzol, in unterschiedlichen Konzentrationen. relative Wachstumsinhibition und

Sättigungsgrad

VIII. Anhang

140

2,4-Dichlorphenol [mM]

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30

Wa

ch

stu

m [%

d

er K

on

tro

lle

]

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Sä

ttig

un

gs

gra

d

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

1,2

1,3

1,4

1,5

Abb. 32 Einfluss von 2,4-Dichlorphenol auf den Sättigungsgrad der zellulären Fettsäuren von G.

sulfurreducens, anaerob kultiviert mit Acetat (5 mM) und Fumarat (25 mM), 8 h nach Zugabe von 2,4-

Dichlorphenol, in unterschiedlichen Konzentrationen. relative Wachstumsinhibition und

Sättigungsgrad

VIII. Anhang

141

8.6 Änderung des zellulären Fettsäurespektrums von D. multivorans als Reaktion

auf die Anwesenheit von BTEX-Verbindungen, aliphatischen n-Alkanolen und

verschiedenen (Chlor-) Phenolen

Fettsäuren

Ko

nzen

tratio

n in

wässrig

er P

has

e

(m

M)

µ in

%

C14:0

i-C

15:0

ai-C

15:0

C15:0

i-C

16:0

cis C

16:1 Δ

9

C16:0

cis, ai-C

17:1

Δ

10

ai-C

17:0

C17:0

cis C

18:1 Δ

11

C18:0

gesättig

t

un

gesättig

t

ai-verw

eig

t

Ratio

sat u

nv

erzw

/

ai-verzw

eig

t

Ratio

sat u

nv

erzw

/

ai ve

rzw

eig

t +

un

gesättig

t

Benzol

0 100 1 0 38 0 2 5 29 11 10 0 0 3 34 16 60 0,571 0,531

1,07 89 3 1 31 0 1 7 35 10 8 0 0 3 42 16 49 0,849 0,747

2,15 80 2 0 31 0 2 7 35 10 9 0 0 4 41 17 50 0,833 0,729

3,68 51 3 1 32 1 2 6 29 11 10 0 0 7 39 17 52 0,750 0,670

4,29 37 2 1 34 1 2 4 25 10 13 0 0 9 37 14 57 0,650 0,605

5,98 3 3 1 35 1 2 4 28 8 10 0 0 9 41 13 53 0,775 0,719

6,44 0 3 1 35 0 2 4 30 7 10 0 0 9 42 11 52 0,807 0,749

Toluol

0,00 100 2 1 38 1 2 4 29 10 9 0 1 2 34 15 57 0,596 0,548

0,20 98 3 1 34 1 1 5 36 9 7 1 1 2 43 15 50 0,860 0,768

0,82 74 3 1 30 1 2 6 33 11 8 0 1 4 41 18 49 0,837 0,732

1,02 70 2 1 31 1 2 5 31 10 11 0 1 4 38 16 52 0,731 0,655

1,25 56 2 1 31 1 2 4 32 10 10 0 2 5 40 16 51 0,784 0,702

1,64 24 3 1 29 1 2 3 27 8 11 4 3 8 43 14 48 0,896 0,796

Ethylbenzol

0,00 100 2 1 37 1 2 4 29 11 10 0 1 2 34 16 58 0,586 0,540

0,07 94 2 1 35 1 2 5 33 10 8 0 1 3 39 16 53 0,736 0,661

0,22 87 3 1 34 1 2 4 36 7 7 1 1 4 45 12 48 0,938 0,849

0,29 78 2 1 36 1 2 4 36 6 7 0 1 3 42 11 49 0,857 0,778

0,44 34 2 1 35 1 2 2 26 8 13 1 3 6 36 13 56 0,643 0,590

0,58 0 4 1 19 3 1 6 34 3 6 0 9 14 55 18 28 1,964 1,279

Xylol

0,00 100 1 0 37 1 2 4 28 12 12 0 1 2 32 17 61 0,525 0,485

0,18 97 2 0 30 0 2 6 38 10 8 0 1 3 43 17 48 0,896 0,782

0,29 101 2 1 32 1 2 5 36 9 8 0 0 4 43 14 49 0,878 0,796

0,36 96 3 1 33 1 2 5 34 8 8 1 0 4 43 13 49 0,878 0,796

0,56 82 3 1 35 1 2 3 30 9 10 0 1 5 39 13 54 0,722 0,672

0,65 38 1 1 38 1 2 4 27 9 12 0 0 5 34 13 59 0,576 0,540

0,74 0 1 1 16 1 2 3 40 7 13 0 1 15 57 11 36 1,583 1,425

VIII. Anhang

142

Fettsäuren

Ko

nzen

tratio

n in

wässrig

er P

has

e

(m

M)

µ in

%

C14:0

i-C

15:0

ai-C

15:0

C15:0

i-C

16:0

cis C

16:1 Δ

9

C16:0

cis, ai-C

17:1

Δ

10

ai-C

17:0

C17:0

cis C

18:1 Δ

11

C18:0

gesättig

t

un

gesättig

t

ai-verw

eig

t

Ratio

sat u

nv

erzw

/

ai-verzw

eig

t

Ratio

sat u

nv

erzw

/

ai ve

rzw

eig

t +

un

gesättig

t

n-Butanol

0 100 2 1 39 1 2 5 26 13 8 0 1 2 31 19 60 0,517 0,470

10 102 2 1 43 1 2 5 22 13 9 0 0 3 28 18 65 0,431 0,400

30 87 3 0 36 1 2 5 25 11 11 0 0 5 34 16 58 0,586 0,540

60 67 4 1 30 2 2 5 32 9 7 0 0 7 45 14 46 0,978 0,882

100 31 3 1 37 2 2 5 29 11 7 0 1 2 36 17 55 0,655 0,590

n-Hexanol

0 100 2 1 38 1 2 5 28 11 8 0 2 2 33 18 57 0,579 0,516

1 101 2 1 36 1 2 4 33 7 5 0 5 3 39 16 48 0,813 0,684

3 93 2 1 42 1 2 3 34 5 7 0 0 2 39 8 54 0,722 0,684

6 67 2 1 40 1 2 4 28 6 10 0 0 5 36 10 56 0,643 0,600

9 25 4 1 28 2 2 5 36 8 5 0 0 10 52 13 41 1,268 1,130

VIII. Anhang

143

Fettsäuren

Ko

nzen

tratio

n in

wässrig

er P

has

e

(m

M)

µ in

%

C14:0

i-C

15:0

ai-C

15:0

C15:0

i-C

16:0

cis C

16:1 Δ

9

C16:0

cis, ai-C

17:1

Δ

10

ai-C

17:0

C17:0

cis C

18:1 Δ

11

C18:0

gesättig

t

un

gesättig

t

ai-verw

eig

t

Ratio

sat u

nv

erzw

/

ai-verzw

eig

t

Ratio

sat u

nv

erzw

/

ai ve

rzw

eig

t +

un

gesättig

t

Phenol

0 100 2 1 40 1 1 4 27 11 8 1 1 3 34 16 59 0,576 0,531

2,1 87 1 0 42 1 1 5 24 13 10 0 0 2 28 18 65 0,431 0,400

4,3 82 1 0 42 1 1 4 16 19 13 1 1 2 21 24 74 0,284 0,266

6,4 67 1 0 44 0 1 3 11 27 10 0 1 1 13 31 81 0,160 0,153

8,5 50 1 0 42 1 1 4 14 25 8 0 1 4 20 30 75 0,267 0,250

10,6 32 2 0 40 0 0 3 21 19 8 0 0 7 30 22 67 0,448 0,429

13,7 20 3 0 35 1 0 3 27 12 10 0 0 8 39 15 57 0,684 0,650

15,9 11 3 0 26 3 0 2 38 7 8 0 0 13 57 9 41 1,390 1,326

4-Chlorphenol

0 100 2 0 40 1 1 3 28 10 10 1 1 3 35 14 60 0,583 0,547

0,4 74 2 0 45 1 2 3 24 12 9 0 0 2 29 15 66 0,439 0,420

0,8 47 1 0 42 1 1 4 23 14 10 0 0 4 29 18 66 0,439 0,414

1,2 18 1 0 44 1 1 3 25 11 10 0 0 5 32 14 65 0,492 0,471

1,8 2,5 1 1 46 1 2 3 24 11 9 0 0 3 29 14 66 0,439 0,420

1,9 0 4 0 20 1 2 2 42 5 11 0 0 13 60 7 36 1,667 1,579

2,4 0 2 0 17 0 1 0 41 5 20 0 0 14 57 5 42 1,357 1,357

2,4-Dichlorphenol

0 100 2 1 43 1 1 3 27 9 8 0 0 4 34 12 60 0,567 0,540

0,06 97 2 1 50 1 1 3 22 11 7 0 0 2 27 14 68 0,397 0,380

0,12 46 2 1 44 1 1 4 25 12 9 0 0 2 30 16 65 0,462 0,435

0,18 36 2 0 39 1 3 5 24 13 9 0 0 4 31 18 61 0,508 0,470

0,25 0 3 1 31 3 1 3 29 10 9 0 0 10 45 13 50 0,900 0,849

0,31 0 3 1 34 2 0 4 32 10 7 0 0 7 44 14 51 0,863 0,800

VIII. Anhang

144

8.7 Endkonzentrationen – BTEX-Verbindungen

Benzol Toluol Ethylbenzol Xylol

Konz.

[mM] in

der

wässrig

en

Phase

Vol.

[µl]

pro 120

ml

Konz.

[mM] in

der

wässrig

en

Phase

Vol.

[µl]

pro 120

ml

Konz.

[mM] in

der

wässrig

en

Phase

Vol.

[µl]

pro 120

ml

Konz.

[mM] in

der

wässrig

en

Phase

Vol.

[µl]

pro 120

ml

0 0 0 0 0 0 0 0

1,2 7 0,2 1,8 0,2 1,5 0,2 1,5

2,3 14 0,5 3,6 0,25 2,3 0,25 2,2

3,4 21 0,7 5,4 0,3 3,1 0,3 3,0

3,9 24 0,9 7,2 0,35 3,8 0,4 3,7

4,6 28 1,1 9 0,4 4,6 0,5 4,5

5,7 35 1,4 11 0,5 5,3 0,6 5,2

6,9 42 1,8 14,5 0,6 6,1 0,7 6,0

- - 2,3 18

-

-

- -

T. aro

matic

a

- - 2,7 21,6

-

-

- -

0 0 0 0 0 0 0 0

1,1 7 0,2 1,8 0,1 0,91 0,2 1,8

2,2 14 0,4 3,6 0,15 2 0,3 3,0

3,2 21 0,6 5,4 0,2 3 0, 4 3,7

3,7 24 0,8 7,2 0,3 4 0,6 5,7

4,3 28 1,0 9 0,4 6 0,65 6,6

5,4 35 1,3 11 0,5 8 0,7 7,5

G. su

lfu

rre

du

cen

s

6,4 42 2,0 14,5 0,7 10 0,9 9,4

0 0 0 0 0 0 0 0

1,1 7 0,2 1,8 0,1 0,9 0,2 0,9

2,2 14 0,4 3,6 0,15 1,8 0,3 1,8

2,5 16 0,6 5,4 0,2 3 0, 4 3,0

3,2 21 0,8 7,2 0,3 4 0,6 3,7

3,5 23 1,0 9 0,4 5,3 0,65 5,7

3,7 24 1,3 11 0,5 6 0,7 6,6

4,3 28 2,0 14,5 0,7 8 0,9 7,5

5,4 35

- - - - - -

6,0 39

- - - - - -

D. m

ultivo

ran

s

6,4 42

- - - - - -

VIII. Anhang

145

8.8 Endkonzentrationen – n-Alkanole

n-Butanol n-Hexanol n-Octanol

10 M 7,5 M 6 M

Konz. [mM]

Volumen [µl]

50 ml

Konz. [mM]

Volumen [µl]

50 ml

Konz. [mM]

Volumen [µl]

50 ml

0 0 0 0 0 0

10 50 1 6,7 0,1 0,8

20 100 2 13,3 0,2 1,7

30 150 3 20 0,3 2,5

40 200 4 27 0,4 3,3

50 250 5 33 0,5 4,2

60 300 6 40 0,6 5,0

80 400 7 47 0,7 5,8

100 500 8 54 0,8 6,6

- - 9 60 0,9 7,5

8.9 Endkonzentration – (Chlor-) Phenole

Phenol 4-Chlorphenol 2,4-Dichlorphenol

531 mM 200 mM 6,13 mM

Konz. [mM]

Volumen [ml]

50 ml

Konz. [mM]

Volumen [ml]

50 ml

Konz. [mM]

Volumen [ml]

50 ml

0 0 0 0 0 0

1,1 0,10 0,2 0,05 0,06 0,50

2,1 0,20 0,4 0,10 0,09 0,75

3,2 0,30 0,6 0,15 0,15 1,250

4,3 0,40 0,8 0,20 0,18 1,50

5,3 0,50 1,0 0,25 0,21 1,75

6,4 0,60 1,2 0,30 0,25 2,00

7,4 0,70 1,4 0,35 0,31 2,50

8,5 0,80 1,6 0,40 - -

9,6 0,90 1,8 0,45 - -

10,6 1,00 1,9 0,50 - -

13,3 1,25 - - - -

15,9 1,50 - - - -

21,3 2,00 - - - -

146

Danksagung

Die vorliegende Arbeit wurde unter der wissenschaftlichen Leitung von Dr. H-J.

Heipieper im Department Bioremediation des Helmholtz-Zentrums für Umweltforschung

Leipzig – Halle in enger Kooperation mit der Arbeitsgruppe für Angewandte und

Spezieller Mikrobiologie des Institutes für Mikrobiologie und Molekularbiologie der

Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald unter der Leitung von Prof. Dr. F. Schauer

angefertigt.

Die letzten Zeilen sollen all denjenigen gelten, die mich während der gesamten Zeit

unterstützt haben.

Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Frieder Schauer für die freie Überlassung des

Themas, für die fachliche Betreuung, die zahlreichen anregenden und aufschluss-

reichen Diskussionen - trotz der großen Entfernung.

Ebenso danke ich Dr. Hermann Heipieper für die Überlassung des Themas und seine

fachliche Unterstützung.

Dr. Ivonne Nijenhuis vom Departenment Isotopenbiogeochemie, danke ich sehr für ihre

Einführung in die Welt der Anaerobier, ihre unermüdliche Diskussionsfreude, ihr

kritisches Hinterfragen und die Möglichkeit unter hervorragenden Arbeitsbedingungen

im Lab. 206 zu arbeiten.

Ein ebenso großer Dank an Dr. Grit Neumann, die mir durch ihre wertvollen

Anmerkungen und Kommentare besonders in der letzten Arbeitsphase sehr geholfen

hat.

Sehr großer Dank gilt Dr. Norbert Loffhagen, Dr. Claus Härtig und Dr. Lukas Wick vom

Department für Umweltmikrobiologie für die produktiven und inspirierenden

Diskussionen. Mein Dank gilt gleichermaßen ihren Mitarbeiterinnen Fr. K. Lange, Fr. J.

Reichbach, Fr. B. Würz für ihre die theoretische und praktische Unterstützung.

Ein großes Dankeschön geht an Petra Bombach, Aina Bouvier, Stefan Feisthauer, Dr.

Anko Fischer, Janett Fischer, Dr. Kathleen Haase, Susan Herter, Claudia Hoffman-

147

Jähniche, Gwenaël Imfeld, Nadja Kabelitz, Dr. Reimo Kindler, Kevin Kuntze, Fabricio

Lecce, Paula Martinez, Anja Offelder, Michael Siegert, Dr. Anne Westendorf, Dr.

Andreas Zehnsdorf – Vielen Dank für Eure Hilfe und Inspiration.

Des Weiteren gilt mein Dank Kerstin Ethner, Ines Mäusezahl, Elvira Knaak, Uwe

Kappelmeyer und Hans-Günther Militsch und all die nicht genannten Mitarbeiter der

Departments Bioremediation, Isotopenbiogeochemie und Umweltmikrobiologie, ohne

die das Arbeiten im Labor undenkbar, unmöglich und auch weniger lustig gewesen

wäre.

Besonders danke ich Julia Gäbel für ihre Hilfe, ihr großes Interesse und Engagement

während ihrer Tätigkeit als HIWI und der sich anschließenden Diplomarbeitsphase.

Vielen, vielen Dank auch an Annette Schmidt für ihr grammatikalisches Gespür, ihre

wertvollen Tipps und Anmerkungen während der Korrekturphase.

Ebenso danke ich Lukasz Chrzanowski.

Mein ganz besonderer Dank gilt meinen Eltern und meiner Schwester, ohne deren

Unterstützung, Zuspruch und Verständnis dies alles nicht machbar gewesen wäre. Ihr

habt an mich geglaubt. Ihr habt mir Mut gemacht. Danke!

148

Erklärung

Hiermit erkläre ich, daß diese Arbeit bisher von mir weder an der Mathematisch-

Naturwissenschaftlichen Fakultät der Ernst-Moritz-Arndt-Unversität Greifswald noch

einer anderen wissenschaftlichen Einrichtung zum Zwecke der Promotion eingereicht

wurde.

Ferner erkläre ich, daß ich die Arbeit selbstständig verfasst und keine anderen als die

darin angegebenen Hilfsmittel benutzt habe.

149

Präsentationen bei Symposien und Workshops

04. 2007 VAAM-Jahrestagung, Osnabrück, Titel: “Effect of organic

compounds towards anaerobic bacteria.“ (Vortrag)

07. 2006 International and European Symposium of Environmental

Biotechnology, Leipzig, Titel: „Toxic effect of organic

compounds on cells of Thauera aromatica K172 grown

under denitrifying conditions.” (Poster)

04. 2006 AXIOM-Virtual Institute Spring School: “Microbial Activity

at Biogeochemical Gradients”, Titel: “Toxicity of organic

compounds on anaerobic grown cells of Thauera

aromatica.” (Poster)

03. 2006 VAAM-Jahrestagung, Jena, Titel: “Toxicity of organic

compounds on the anaerobic grown cells of Thauera

aromatica K172.” (Poster)

Publikationen

Duldhardt I., Nijenhuis I., Schauer F. Heipieper H. (2007) Anaerobically grown

Thauera aromatica, Desulfococcus multivorans, Geobacter sulfurreducens are

more sensitive towards organic solvents than aerobic bacteria. Appl. Microbiol.


Publikationen in Vorbereitung

Ilka Duldhardt, Julia Gaebel, Lukasz Chrzanowsky, Ivonne Nijenhuis, Klaus Härtig,

Frieder Schauer, and Hermann J. Heipieper : Adaptation of anaerobically grown Thauera

aromatica, Geobacter sulfurreducens, Desulfococcus multivorans to organic solvents on

the level of membrane fatty acid composition

150

Lebenslauf

Ilka Duldhardt

Kolmstraße 23

04299 Leipzig

Telefon: 0341 / 1268738

E-mail: [email protected]

Persönliche Daten

Geburtstag: 26. April 1977

Staatsangehörigkeit: deutsch

Familienstand: ledig

Berufserfahrung

09. 2007 - arbeitssuchend

03. 2008 - Firma EuroGene GmbH, Leipzig, Anpassungs-

qualifizierung für Arbeiten an molekularbiologisch

ausgerichteten Arbeitsplätzen, Praktikum im Department

Umweltmikrobiologie

09. 2007 - 12. 2007 Helmholtz-Zentrum für Umwelt-forschung GmbH – UFZ,

Leipzig, Wissenschaftlicher Mitarbeiter im Department

Bioremediation, Thema: „ Analyse der Wasserstoffisotopen-

Fraktionierung während der Mineralisierung von Toluene

durch Thauera aromatica in An- und Abwesenheit von 4-

Chlorphenol“

06. 2004 - 08. 2007 Helmholtz-Zentrum für Umweltforschung GmbH – UFZ,


Bioremediation, mit dem Ziel einer Promotion

01. 2004 - 05. 2004 Helmholtz-Zentrum für Umweltforschung GmbH – UFZ,


Bioremediation, Thema: „Biotransformation von alicyclischen

Verbindungen durch filamentöse Pilze“

mailto:[email protected]

151

10. 2003 - 12. 2004 Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Greifswald, Studentische

Hilfskraft am Institut für Mikrobiologie und Molekularbiologie,

Thema: „Biotransformation von alicylischen Verbindungen

durch filamentöse Pilze“

Studium und Schule

09. 1998 – 09. 2003 Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Greifswald,

Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät

Studium der Biologie

Schwerpunkte:

Angewandte Mikrobiologie-Biotechnologie

Biochemie

Ökologie

Diplomarbeit im Institut für Mikrobiologie und

Molekularbiologie, Titel: „Biotransformation von ali-cyclischen

Verbindungen durch Hefen“

Abschluss: Diplom-Biologin

08. 1995 – 07. 1998 Medizinische Berufsfachschule am Klinikum der

Universität Leipzig, Berufsausbildung zur Medizinisch-

technischen Laboratoriumsassistentin

08. 1991 – 06. 1995 Ehrenberg-Gymnasium, Delitzsch

Abschluss: Allgemeine Hochschulreife

Besondere Kenntnisse und Qualifikationen

Fremdsprachen: Englisch, sehr gute Kenntnisse

EDV: sehr gute Kenntnisse in Windows/MS-Office (Word, Excel,

Power Point), GC-Software (CHEM-Station), HPLC-

Software (Lab-Solution)

untersuchung des einflusses organischer lösungsmittel und ... · tab. tabelle tm...

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