univerzitet u niŠu prirodno-matematiČki ......vegetativna propagacija in vitro predstavlja oblik...
TRANSCRIPT
UNIVERZITET U NIŠU
PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET
DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU
Aleksandra I. Golubović
„Uticaj maltoze na indukciju aksilarnih pupoljaka
Micromeria pulegium (Benth.)“
MASTER RAD
Niš, 2016.
UNIVERZITET U NIŠU
PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET
DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU
„Uticaj maltoze na indukciju aksilarnih pupoljaka
Micromeria pulegium (Benth.)“
MASTER RAD
Kandidat: Mentor :
Aleksandra I. Golubović Dr. Dragana D. Stojičić,
Br. indeksa: 114 vanredni profesor
Niš, 2016.
UNIVERSITY OF NIŠ
FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS
DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY
„Influence of maltose on axillary bud induction
of Micromeria pulegium (Benth.)“
MASTER THESIS
Candidate: Menthor:
Aleksandra I. Golubović Dr. Dragana Stojičić
No. of index 114 Assistant professor
Niš, 2016.
Sažetak
Micromeria pulegium (Benth.) je endemična vrsta južnih Karpata. Prirodne populacije ove vrste
imaju mali broj jedinki i nastanjuju staništa koja su pod negativnim antropogenim faktorima, pa
se nameće potreba za pronalaženjem alternativnog načina njihovog gajenja i umnožavanja. Iz tog
razloga, ova vrsta je uvedena u kulturu in vitro. U ovom radu ispitivan je uticaj šećera maltoze
kao izvora energije u procesu regeneracije biljaka putem indukcije aksilarnih pupoljaka na
nodalnim eksplantatima M. pulegium in vitro. Definisani su uslovi pri kojima se formira najveći
broj aksilarnih pupoljaka, pri kojima se ostvaruje njihova najveća dužina, a takođe se ostvaruje i
najveći prinos biomase.
Ključne reči: Micromeria pulegium, mikropropagacija, maltoza, aksilarni pupoljci.
Abstract
Micromeria pulegium (Benth.) is an endemic species of the southern Carpathians. The natural
population of this species have a small number of individuals and populate habitats which are
exposed to negative anthropogenic factors so require finding out the new ways of growing and
multiplication. For this reason, this species was introduced into the culture in vitro. In this degree
essay, we examine the effect of sugar maltose, as a source of energy in the process of plant
regeneration through induction of axillary buds on nodal segments M. pulegium in vitro. The
conditions in which the largest number of axillary buds are formed on explants and in which their
maximum length is achieved, and also achieved the highest yield of biomass, are clearly defined.
Keywords: Micromeria pulegium, micropropagation, maltose, axillary buds.
Sadržaj:
1. UVOD 1
1.1. Vegetativna propagacija in vitro - opšte karakteristike 1
1.2. Faktori koji utiču na rast biljnih kultura in vitro 5
1.3. Opšte karakteristike familije Lamiaceae 7
2. CILJ RADA 8
3. MATERIJAL I METODE 9
3.1. Biljni materijal 9
3.2 Sterilizacija hranljive podloge, rastvora i laboratorijskog pribora 9
3.3. Hranljiva podloga 9
3.3.1. Hranljive podloge za indukciju aksilarnih pupoljaka 11
3.4. Merenje sveže i suve mase biljaka Micromeria pulegium 12
3.5. Statistička analiza 12
4. REZULTATI 13
4.1. Indukcija aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima M. pulegium 13
4.2. Uticaj maltoze na masu biljaka M. pulegium 19
5. DISKUSIJA 21
6. ZAKLJUČAK 23
7. LITERATURA 24
1. Uvod
1.1. Vegetativna propagacija in vitro – opšte karakteristike
Vegetativna propagacija in vitro predstavlja oblik vegetativnog razmnožavanja pomoću
koga se iz malih delova biljaka (embrioni, seme, pupoljci, apikalni meristem, kalus,
pojedinačne ćelije) na veštačkim hranljivim podlogama, u sterilnim uslovima regenerišu
nove biljke (Nešković i sar. 2003). Ovakav metod razmnožavanja biljaka naziva se
mikrorazmnožavanje (mikropropagacija) jer su biljni organi ili cele biljke milimetarskih
dimenzija (Pierik, 1987, Hartmann et al., 1990, Grbić, 2004).
Vegetativna propagacija obuhvata sledeće načine razmnožavanja:
1. Permanentna kultura pupoljaka - mikropropagacija.
2. Formiranje pupoljaka de novo - organogeneza.
3. Razviće embriona iz somatskih ćelija - somatska embriogeneza.
4. Razviće biljaka iz haploidne ćelije muškog i ženskog gametofita bez oplođenja -
androgeneza, odnosno ginogeneza.
5. Somatske ćelije mogu da se ponašaju kao polne ćelije, i da fuzijom daju novi
organizam - somatska hibridizacija.
Svi navedeni načini vegetativnog razmnožavanja in vitro predstavljaju gajenje kultura u
staklu ili prozirnim posudama (lat. in vitro – u staklu; biljke se gaje u prozirnim
posudama). In vitro kultura se bazira na totipotentnosti ćelija, tj. na njihovoj sposobnosti
da se in vitro diferenciraju, dele, i da regenerišu pojedine organe ili tkiva, pa i čitavu
biljku. Izolovani biljni delovi se postavljaju na odgovarajuće hranljive podloge gde dolazi
do dediferencijacije ćelija već diferenciranih tkiva, a potom i regeneracije celokupne
biljke.
Na ovaj način se osigurava brzo dobijanje velikog broja serija biljaka, koje su istovetne
po razvoju, rastu i genetičkom potencijalu vrste. Ovaj postupak predstavlja proces
kloniranja, jer sve proizvedene biljke predstavljaju kopije razmnoženog majčinskog
uzorka (Međedović 2003).
Mikopropagacija ima svojih prednosti ali i nedostataka. Prednosti su: omogućava
dobijanje zdravog, visokokvalitetnog sadnog materijala u kratkom vremenskom periodu;
proizvodnja se vrši u kontrolisanim uslovima; ne zavisi od godišnjih doba; štedi se na
prostoru i vremenu neophodnom za gajenje; koristi se mala količina inicijalnog biljnog
materijala, pa se ne moraju formirati veliki matičnjaci, a koeficijent multiplikacije ostaje
visok.
Nedostaci su: veliko početno ulaganje za opremanje laboratorije i potreba za visoko
kvalifikovanom radnom snagom (Vinterhalter, Vinterhalter, 1997).
Ovom metodom se mogu gajiti biljne vrste na standarnim sterilnim agarnim podlogama sa
makrometaboličkim i mikrometaboličkim elementima. Najčešće se koristi MS rastvor
mineralnih soli (Murashige, Skoog, 1962), sa odgovarajućim balansom fitohormona.
U ovoj metodi se za gajenje koriste isključivo izdanci stabla osovinskog porekla, znači
vršni i pazušni pupoljci. Mikropropagacija se zasniva na upotrebi egzogenih citokinina sa
ciljem da se aktiviraju postojeći pazušni pupoljci, tj. da izazovu izduživanje njihovih
internodija i formiranja listova, a zatim i novih pupoljaka u njihovom pazuhu
(Vinterhalter, Vinterhalter 1996).
Osnovna karakteristika mikropropagacije je da se kulture održavaju kao tzv. “kulture
izdanaka”, koje nemaju korenov sistem, sve dok se za njim ne ukaže potreba. Za
ožiljavanje koristi se podloga drugačijeg sastava, najčešće sa auksinima, a eksplantati u
ovoj fazi predstavljaju pojedinačne izdanke, koji nakon ožiljavanja predstavljaju
pojedinačnu, individualnu biljku.
U prvoj polovini 70-ih godina, metoda mikropropagacije počela je sa intenzivnim
korišćenjem na voćnim vrstama, posebno na jagodama i podlogama za razne vrste roda
Prunus (Vinterhalter, Vinterhalter 1996).
Mikropropagacija predstavlja ogroman uspeh u vegetativnom razmnožavanju biljaka, jer
omogućava veliku brzinu razmnožavanja, tokom cele godine, u laboratorijskim uslovima
u kojima je moguće obezbediti apsolutnu kontrolu uslova rastenja i zdravstvenog stanja
kultura. U kombinaciji sa eliminacijom virusa, putem kulture meristema, ona je ponudila
skoro savršeno rešenje za savremenu rasadničku proizvodnju.
Biljke proizvedene kontinualnom kulturom meristema i pupoljaka u potpunosti
zadržavaju svoja klonska svojstva i uopšte se ne razlikuju od biljaka proizvedenih
klasičnim postupcima. Po nizu parametara koji definišu kvalitet, biljke proizvedene
konvencionalnim putem mogu da budu inferiornije u odnosu na biljke iz epruveta.
Takođe postoje i suprotni rezultati, posebno kada je reč o proizvodnji virus-free podloga
(podloge bez virusa) različitih vrsta, kod kojih je primećeno opadanje sposobnosti
ožiljavanja nakon što su oslobađene virusa.
Varijabilnost koja je nastala tokom ili kao posledica korišćenja metode kulture in vitro
može biti korisna u selekciji i oplemenjivanju (Larkin and Scowcroft, 1981). Promene
koje su izazvane u kulturi in vitro i postaju nasledne označene su kao “somaklonalno
variranje”. Znači da “somaklonalno variranje” predstavlja rezultat promene genotipa, a ne
fenotipa.
Metode kulture in vitro dovode do različitih fenotipskih i epigenetskih promena,
nepoželjnih za klonsko razmnožavanje, jer je kasnije potrebno detaljno ispitati prirode i
uzroka svog nastanka. Mikropropagacija i regeneracija izdanaka predstavljaju osnovu za
istraživanje i uspešnu primenu genetičkog inženjeringa kod biljaka.
Kultura in vitro omogućava efikasnu zaštitu i obnovu genofonda ugroženih i retkih vrsta
biljaka. Takođe, ova tehnika ima velike mogućnosti u šumarstvu, farmaciji i hortikulturi
jer se bitno smanjuje pritisak na prirodne populacije biljaka koje su vrlo značajne za ove
privredne grane.
Mikropropagacija se primenjuje kod: brzog razmnožavanja novih genotipova, čuvanja
interesantnih genotipova, ubrzanja, skraćivanja ili dovršavanja postupaka selekcije i
oplemenjivanja, regeneracije izdanaka i celih biljaka u genetičkom inženjerstvu
(Vinterhalter, Vinterhalter 1996).
Predložena su dva sistema mikropropagacije i klonskog razmnožavanja. Jedan od sistema
predložio je Murashige (1974) i on obuhvata mikropropagaciju u užem smislu (samo iz
aksilarnih izdanaka), i sve sisteme u kojima se kao rezultat in vitro kultivisanja mogu
dobiti izdanci. Njegov sistem obuhvata tri faze in vitro multiplikacije biljaka. Prva faza
obuhvata dobijanje kulture bez očiglednih infekcija, tako da zadovoljavajući procenat
eksplantata preživljava u kulturi. Druga faza obuhvata adventivnu organogenezu izdanaka
ili embriona kao i stimulaciju indukcije aksilarnih izdanaka. Treća faza predstavlja
ožiljavanje izdanaka i presađivanje u zemljište.
Debergh i Maene (1981) su dali najprihvatljiviju podelu mikropropagacije u više faza:
Faza 0 predstavlja početnu fazu, koja uključuje sve postupke pre uvođenja biljke u
kulturu in vitro, tj. preparativne procedure. Sam naziv „nulta” potiče od toga što to nije
faza samog razmnožavanja, već se odnosi na postupke pažljivog prikupljanja, prenošenja i
čuvanja biljnog materijala.
Faza I predstavlja prvu fazu klonskog razmnožavanja. Ova faza obuhvata dobijanje
aseptične kulture izabranog biljnog materijala koji želimo klonirati, celokupnu sterilzaciju
materijala i pribora, kao i sterilizaciju i pripremanje hranljivih podloga.
Faza II za cilj ima produkciju kloniranih biljaka. Ova faza drugačije se naziva faza
razmnožavanja, jer u njoj dolazi do produkcije novih izdanaka ili meristema koji će biti
sposobni da nastave sa rastenjem i obrazuju kompletnu biljku. U ovoj fazi se obavezno
koriste biljni regulatori rastenja, koji stimulišu rastenje biljke u kulturi in vitro, naravno u
optimalnoj koncentraciji.
Faza III se zasniva na pripremi svega neophodnog za individualan rast biljaka, sposobnih
za fotosintezu i preživljavanje bez dodavanja ugljenih hidrata. Kod nekih biljaka vrši se
poseban tretman da biljke ne bi ostale malog rasta ili dormantne nakon prebacivanja u ex
vitro uslove. S obzirom na to ova faza podrazumeva zakorenjivanje izdanaka in vitro pre
nego što se prebace u zemlju.
Faza IV predstavlja pripremu i prenos biljaka za u prirodno okruženje. Ovaj prenos se
mora obaviti veoma pažljivo sa ne bi došlo do gubitka propagiranog materijala. Tako da
za biljke možemo reći da su uspešno adaptirane onda kada mlade biljke počnu stvarati
nove listove i korenove koji su funkcionalno prilagođeni za potrebe uslova spoljašne
sredine.
Zajedničko za oba sistema je: priprema, skupljanje i transport materijala; površinska
sterilizacija; postavljanje primarnih eksplantata in vitro; provera na zarazu; multiplikacija
izdanaka; izduživanje izdanaka; ožiljavanje izdanaka i adaptacija sadnica (Vinterhalter i
Vinterhalter 1996).
1.2. Faktori koji utiču na rast biljnih kultura in vitro
Faktori koji utiču na kulture in vitro prema načinu delovanja se dele na faktore hranljive
podloge i fizičke faktore. U faktore hranljive podloge spadaju: voda, agar, ugljeni hidrati,
mineralne soli, pH vrednost podloge, vitamini i organski aditivi, antibiotici i biljni
regulatori rastenja. Uspeh kulture ćelija, tkiva ili organa zavisi od sastava hranljive
podloge, tako da ona mora zadovoljiti nutritivne i fiziološke potrebe ćelija u kulturi.
Fizički faktori su svetlost i temperatura.
Voda
Za istraživačke ciljeve preporučuje se korišćenje destilovane vode, dok se za kulturu in
vitro koristi dejonizovana voda.
Agar
Agar predstavlja derivat morskih algi, koji se može koristiti kao gelirajući agens kod
većine hranljivih podloga. Za pravljenje hranljivih podloga koristi se 0,6 ili 0,7% agara.
Mineralne soli
Mineralne soli su važan faktor za sastav hranljive podloge. Optimalne koncentracije
mineralnih soli u hranljivoj podlozi osiguravaju maksimalnnu brzinu rastenja kulture.
Ugljeni hidrati
Za rast biljnih ćelija, tkiva i organa in vitro neophodno je da se sastavu hranljive podloge
doda neki od ugljenih hidrata, koji će predstavljati izvor energije. Najčešće se koristi
ugljeni hidrat saharoza u koncentraciji 2-3%. Sem saharoze mogu se koristiti glukoza i
fruktoza, dok je u ovom radu korišćen disaharid maltoza. Tokom autoklaviranja može
doći do delimične hidrolize ovog šećera pri čemu se u medijumu stvara glukoza. Ako se
hranljiva podloga „presteriliše” odnosno izloži suviše visokoj temperaturi i pritisku, onda
usled oksidacije ugljenog hidrata podloga može promeniti boju, tj. dolazi do
karamelizacije. Ugljeni hidrati imaju i fiziološke aktivnosti, zbog toga što regulišu
osmotski potencijal podloge. Kada se ugljeni hidrati dodaju u visokoj koncentraciji, oni
stimulišu androgenezu i somatsku embriogenezu kod raznih biljnih vrsta, a kod krompira
modifikaciju bočnih izdanaka u krtole.
Jedan od novijih pravaca razvoja in vitro kulture je „autotrofna mikropropagacija”, koja je
inicirana u Japanu. Obimna istraživanja (Kozai i sar., 1986-1991), pokazala su da kulture
u mikropropagaciji imaju sposobnost fotosinteze, koja je ograničena prisustvom ugljenih
hidrata u podlozi i niskom koncentracijom ugljendioksida u posudama kultura.
1.3. Opšte karakteristike familije Lamiaceae
Vrste koje pripadaju familiji Lamiaceae su kosmopolitskog rasprostranjenja. Ova familija
predstavljena je sa 200 rodova i oko 3500 vrsta. Od ukupnog broja vrsta iz familije
Lamiaceae, čak 84 vrste predstavljaju Balkanske endemite (Šilić, 1979). Najveći broj
rodova i vrsta naseljava Mediteran, Malu i centralnu Aziju. U flori Balkanskog poluostrva
zabeležena je 371 vrsta familije Lamiaceae. Na području Srbije zastupljeno je 147 vrsta
familije usnatica, kojima pripada i vrsta Micromeria pulegium.
M. pulegium pripada rodu Micromeria koji se prostire od mediteransko – makaronezijske
regije, sve do južne Afrike, Indije i Kine (Brӓuchler et al. 2008). Chater i Guinea (1972)
su objavili da rod obuhvata imeđu 70 i 90 vrsta rasprostranjenih u umerenom pojasu.
Biljne vrste roda Micromeria podeljene su u tri grupe (Boisser 1879): Pseudomelisa (M.
thymifolia, M. albanica, M. dalmatica i M. pulegium), Eumicromeria (M. croatica, M.
juliana, M. cristata, M. parviflora) i Cymularia.
Vrste iz ove familije mogu biti zeljaste ili drvenaste biljke, vrlo retko šiblje. Listovi su
naspramno raspoređeni i prosti. Cvetovi predstavljaju cimozne cvasti, vrlo retko se
javljaju pojedinačno. Nadzemni vegetativni organi poseduju žlezdane dlake, i imaju oblik
glavice ili žlezdane ljuspice (Tatić B., Blečić V., 2002).
Karakteristično za Lamiaceae je da sadrže eterična ulja vrlo različitog sastava, u vidu
aromatičnih alkohola, fenola, terpena, ketona i aldehida. I vrste roda Micromeria su dobro
poznate kao aromatične vrste, jer sadrže značajne količine etarskog ulja. Etarska ulja vrsta
iz roda Micromeria imaju značajna antioksidantna, antibakterijska i antifugalna dejstva
(Duru et al., 2004, Tošić et al. 2015). Zbog svojih dejstava koriste se u medicini,
farmaciji, kozmetičkoj industriji a neke vrste familije usnatica koriste se i kao začinske
biljke (Slavkovska et al. 2005). Predstavnici familije Lamiaceae su poznati u narodu. U
ovu familiju spadaju: trava iva, dobričica, mrtva kopriva, nana, lavanda, zalfija, ruzmarin,
bosiljak, vranilova trava, grčki origano, majčina dušica, timijan, miloduh, matičnjak,
srdačica.
2.CILJ RADA
Cilj rada bio je:
• da se korišćenjem različitih koncentracija šećera maltoze ispita mogućnost indukcije
razvića aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima Micromeria pulegium in vitro;
• da se ispita uticaj šećera maltoze na masu dobijenih pupoljaka;
• da se statistički obrade dobijeni podaci;
• da se izvedu zaključci i tumače rezultati u skladu sa literaturnim podacima.
3. Materijal i metode
3.1. Biljni materijal
Za eksperimentalni rad korišćeni su nodalni segmenti vrste Micromeria pulegium iz
uspostavljene kulture (Tošić et al. 2015). Eksplantati koji su korišćeni su bili približno
iste veličine. Na svaku podlogu postavljano je po 30 eksplantata.
3.2. Sterilizacija hranljivih podloga, rastvora i laboratorijskog pribora
Sterilizacija hranjive podloge i rastvora je izvršena u autoklavu na temperaturi od 120 °C
u trajanju od 30 minuta. Sav pribor je sterilisan suvom sterilizacijom u trajanju od 2 časa
na temperaturi od 160 - 180 °C. Radni prostor je tretiran UV lampom u trajanju od
najmanje 2 sata da bi se obezbedili sterilni uslovi za rad, dok je radna površina prebrisana
etil - alkoholom. Pincete i skalpeli su sterilisani kuvanjem u destilovanoj vodi 25 minuta,
nakon toga su uranjani u etil - alkohol i opaljivani na plamenu. Pribor se u toku rada često
menjao i sterilisao kako bi se sprečila kontaminacija (Vinterhalter i Vinterhalter, 1996).
3.3. Hranljiva podloga
Hranljiva podloga koja je korišćena u ovom radu je podloga Murashige, T. and Skoog, F.
(1962) – MS. Ova hranljiva podloga se sastoji iz makro i mikro mineralnih soli, organskih
dodataka.
Makro mineralne soli (mg/l)
NH4NO3 1650
KNO3 1900
CaCl2 × 2H2O 440
MgSO4× 7H2O 370
KH2PO4 170
Mikro mineralne soli (mg/l)
MnSO4 × 4H2O 22.3
ZnSO4× 7H2O 8.6
H3BO3 6.2
KJ 0.83
NaMoO4 × 2H2O 0.25
CuSO4 × 5 H2O 0.025
CoCl2 × 6 H2O 0.025
FeSO4 × 7H2O 27.8
Na2EDTA 37.3
Organski dodaci (mg/l)
vitamin B1 0.4
vitamin B6 0.5
nikotinska kiselina 0.5
glicin 2.0
mioinozitol 0.1 (g/l)
agar 7.0 (g/l)
ph vrednost podloge podešavana je na 5.8.
3.3.1. Hranljive podloge za indukciju aksilarnih pupoljaka
Da bi se ispitao uticaj šećera na indukciju aksilarnih pupoljaka, u osnovnu hranljivu
podlogu MS dodat je šećer maltoza, u koncentracijama: 0.5%, 1%, 3%, 5%. Kontrolna
podloga nije sadržala šećer. Korišćene podloge su prikazane u Tabeli 1.
Tabela 1. Sadržaj maltoze u hranljivim podlogama
Hranljiva
podloga
1 2 3 4 5
Maltoza
(%)
- 0.5 1 3 5
Za gajenje eksplantata korišćene su staklene teglice. Svaka od pripremljenih podloga je
razlivena u 3 staklene teglice. U svaku teglicu je postavljeno po 10 eksplantata, ukupno za
svaku podlogu po 30 eksplantata. Eksplantati su postavljani uspravno, bazalnim krajem
uronjeni u podlogu.
Kultura je gajena na temperaturi 21 ± 2 °C, sa fotoperiodom od 16 sati svetlosti i 8 sati
mraka, pri svetlosti fluorescentih belih cevi „Tesla” - Pančevo i gustinom fotonskog
fluksa od 50 µmol s-1m-2.
Eksplantati su rasli na različitim hranljivim podlogama četiri nedelje. Nakon tog perioda
je utvrđen broj aksilarnih pupoljaka po eksplantatu i na milimetrskom papiru je merena
dužina svakog pupoljka.
3.4. Merenje sveže i suve mase biljaka M. pulegium
Sveža masa biljaka izmerena je odmah nakon utvrđivanja broja pupoljaka i merenja
njihove dužine. Svež materijal, nakon merenja na analitičkoj vagi, je sušen na sobnoj
temperaturi, u papirnim kutijama nekoliko dana, a zatim je merena njegova suva masa.
Merenja su vršena sa preciznošću od 0,1 mg, na analitičkoj vagi, a nakon toga su podaci,
koji su dobijeni obrađeni statistički.
3.5. Statistička analiza
Obrada podataka je urađena statističko-grafičkim paketom Statgraphics, procedura
ANOVA i test LSD na nivou značajnosti p<0,05. Statistička analiza je urađena za svaki
parametar i u tabelama je predstavljena slovima. Statistički značajne razlike predstavljene
su različitim slovima, ista slova označavaju da tih razlika nije bilo.
4. Rezultati
4.1. Indukcija aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima M. pulegium
Eksplantati M. pulegium postavljeni su na podlogu bez šećera i sa različitim
koncentracijama šećera maltoze (od 0,5 - 5%). Nakon četiri nedelje došlo je do formiranja
velikog broja aksilarnih pupoljaka na svim eksplantatima bez obzira na primenjeni
tretman (Tab. 2). Tabela 2 prikazuje prosečan broj pupoljaka po eksplantatu i prosečnu
dužinu formiranih pupoljaka.
Tabela 2. Indukcija aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima M. pulegium
Maltoza (%)
Prosečan broj pupoljaka po eksplantatu
Prosečna dužina pupoljaka (mm)
1 0 2,47 ± 0,93a 4,93 ± 0,33a
2 0,5 4,84 ± 0,46b 6,41 ± 0,35ab
3 1,0 4,94 ± 0,66b 6,43 ± 0,48ab
4 3,0 5,93 ± 0,44b 6,88 ± 0,54b
5 5,0 6,09 ± 0,21c 6,07 ± 0,44ab
Eksplantati M. pulegium gajeni na MS podlozi bez šećera, bili su svetlo zelene boje,
listovi koji su bili u direktnom kontaktu sa podlogom imali su žućkaste obode zbog
početka nekroze tkiva (Sl. 1). Prosečan broj pupoljaka koji je formiran po eksplantatu na
ovoj podlozi iznosio je 2,47 a prosečna dužina pupoljaka bila je 4,93 mm, i to je najmanja
zabeležena vrednost u poređenju sa eksplantatima gajenim na ostalim hranljivim
podlogama (Tab. 2).
Slika 1. M. pulegium na hranljivoj podlozi bez šećera
Na MS podlozi sa 0,5% maltoze listovi M. pulegium bili su zelene boje, svetlije u odnosu na
listove biljaka gajenih na podlogama sa većom koncentracijom šećera (Sl. 2). Prosečan broj
formiranih pupoljaka po eksplantatu iznosio je 4,84, dok je prosečna dužina pupoljaka iznosila
6,41 mm (Tab. 2).
Slika 2. M. pulegium na MS podlozi sa 0,5% maltoze
Na pojedinim eksplantatima M. pulegium na MS podlozi sa 1% maltoze internodije su
različitih dužina malo svetlije zelene boje (Sl. 3, 4). Broj formiranih pupoljaka po
eksplantatu bio je 4,94, a prosečna dužina pupoljaka iznosila je 6,43 mm (Tab. 2).
Slika 3. M. pulegium na MS podlozi sa 1% maltoze
Slika 4. M. pulegium na MS podlozi sa 1% maltoze
Eksplantati na podlozi MS sa 3% maltoze bili su zelene boje, uglavnom žbunaste forme
(Sl. 5, 6). Prosečan broj pupoljaka po eksplantatu iznosio je 5,93. Prosečna dužina
pupoljaka iznosila je 6,88 mm, što predstavlja najveću prosečnu dužinu pupoljaka u
odnosu na eksplantate sa ostalih korišćenih podloga (Tab. 2).
Slika 5. M. pulegium na MS podlozi sa 3% maltoze
Slika 6. Eksplantat M. pulegium na MS podlozi sa 3% maltoze
Na MS podlozi sa 5% maltoze prosečan broj pupoljaka bio je najveći u poređenju sa
eksplantatima gajenim na ostalim hranljivim podlogama, i iznosio je 6,09, na ovoj podlozi
na eksplantatima je formirano statistički značajno više aksilarnih pupoljaka u odnosu na
eksplantate koji su gajeni na ostalim korišćenim podlogama. Prosečna dužina pupoljaka je
iznosila 6,07 mm (Tab. 2). Eksplantati su bili zeleni, žbunaste forme, što je prikazano na
slikama 7 i 8.
Slika 7. Eksplantat M. pulegium na MS podlozi sa 5% maltoze
Slika 8. M. pulegium na MS podlozi sa 5% maltoze
Na slici 9 prikazani su eksplantati M. pulegium gajeni na hranljivim podlogama sa
različitom koncentracijom maltoze. Uočava se značajna razlika između eksplantata
gajenih na podlozi bez šećera i sa 5 % maltoze (Sl. 9).
Slika 9. M. pulegium na hranljivim podlogama sa dodatkom različitih koncentracija
maltoze
Dobijeni rezultati predstavljeni su i u histogramu 1. Na hranljivoj podlozi bez maltoze obrazovan
je najmanji broj pupoljaka po eksplantatu, dok je najveća koncentracija maltoze doprinela
obrazovanju najvećeg broja pupoljaka. Najmanja prosečna dužina pupoljaka je zabeležena na
eksplantatima gajenim na podlozi bez maltoze, dok je najveća prosečna dužina pupoljaka
zabeležena kod eksplantata gajenih na podlozi sa 3% maltoze.
Histogram 1. Uporedni prikaz uticaja različitih koncentracija maltoze na broj i dužinu aksilarnih
pupoljaka M. pulegium
4.3. Uticaj maltoze na masu izdanaka M. pulegium
Osim uticaja šećera maltoze na broj i dužinu pupoljaka u ovom radu analiziran je i uticaj na masu
izdanaka M. pulegium (Tab. 3). Iz dobijenih rezultata se vidi da su najveću prosečnu svežu masu
imali izdanci gajeni na podlogama sa 3% i 5% maltoze a najmanju izdanci gajeni na podlozi bez
maltoze. Najviša vrednost prosečne suve mase dobijena je kod izdanaka gajenih na podlozi sa 5%
maltoze, dok je najniža vrednost prosečne suve mase dobijena kod izdanaka gajenih na podlozi
bez maltoze. Dobijeni rezultati prikazani su grafički u histogramu 2.
Tabela 3. Uticaj maltoze na masu biljaka M. pulegium
Maltoza (%)
Prosečna sveža masa
(mg)
Prosečna suva masa
(mg)
1 0 0,060 ± 0,018a 0,002 ± 0,001a
2 0,5 0,102 ± 0,017ab 0,005 ± 0,001b
3 1,0 0,149 ± 0,032bc 0,005 ± 0,001b
4 3,0 0,171 ± 0,011c 0,008 ± 0,001c
5 5,0 0,169 ± 0,006c 0,010 ± 0,001d
Histogram 2. Uporedni prikaz uticaja različitih koncentracija maltoze na svežu i suvu masu
izdanaka M. pulegium
5. Diskusija
Vrste roda Micromeria koriste se kao začini i u farmaceutske svrhe, zbog čega su u
naučnim radovima najčešće ispitivani hemijski sastav i antimikrobne aktivnosti njihovih
etarskih ulja. Ispitivane su vrste M. cristata (Tabanca et al., 2001; Stojanović et al., 2008),
M. thymifolia, M. albanica i M. dalmatica (Marinković et al., 2002), M. fruticulosa
(Gulluce at al., 2004; Formisano et al., 2007), M. juliana (Stojanović et al., 2006), M.
biflora (Mishra et al., 2010) i M. barbata (Bakkour et al., 2012).
Različite koncentracije šećera, saharoza, glukoza i fruktoza imaju pozitivne efekte na
indukciju aksilarnih pupoljaka u in vitro uslovima (Kagami, H., 1999). Rezultati različitih
istraživanja pokazuju da je saharoza najčešće najbolji izvor ugljenika u in vitro
razmnožavanju (Romano et al., 1995.).
U ovom radu je prikazan je uticaj različitih koncentracija šećera maltoze na razviće i
izduživanje aksilarnih pupoljaka M. pulegium. Na hranljivoj podlozi MS bez maltoze, na
kojoj su gajeni eksplantati M. pulegium došlo je do formiranja aksilarnih pupoljaka.
Prosečan broj pupoljaka bio je 2,47. Takođe i kod vrste Salvia brachyodon (Mišić et al.
2006) zabeleženo je formiranje aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima kada su
oni gajeni na MS hranljivoj podlozi bez šećera.
Dodavanjem maltoze u hranljivu podlogu, prosečan broj pupoljaka po eksplantatu, kao i
njihova prosečna dužina bila je veća u odnosu na kontrolnu podlogu. Slični rezultati
dobijeni su kod vrste Mentha piperita gde je dodavanje ugljenih hidrata imalo
stimulativan efekat. Kod vrste Mentha piperita dodavanje ugljenih hidrata doprinelo je
poboljšanju mikropropagacije i stimulaciji rastenja ove lekovite biljne vrste (Sujana and
Naidu, 2011)
Na eksplantatima gajenim na podlozi sa 0,5% maltoze došlo je do razvoja većeg broja
pupoljaka po eksplantatu u odnosu na kontrolu. Prosečan broj pupoljaka po eksplantatu
iznosio je 4,84 a takođe je i dužina pupoljaka bila veća u poređenju sa kontrolom
(6,41mm). Dalje povećanje koncentracije maltoze u hranljivoj podlozi delovalo je
stimulativno pa se kod eksplantata gajenih na podlogama sa 1-5% maltoze formirao veći
prosečan broj pupoljaka po eksplantatu, takođe njihova prosečna dužina je bila veća.
Međutim, kod biljne vrste Mentha piperita najveći broj izdanaka (27,6) indukovan je na
hranljivoj podlozi sa 4% fruktoze, dok je dodavanjem viših koncentracija glukoze i
maltoze zabeležen najmanji broj izdanaka (Sujana and Naidu, 2011).
Rezultati našeg istraživanja pokazuju da je dodavanjem najveće koncentracije maltoze
(5%) formiran najveći broj pupoljaka sa najvećom dužinom. Slični rezultati dobijeni su
kod Scutellaria racemosa i Scutellaria barbata gde je došlo do formiranja najvećeg broja
aksilarnih pupoljaka kada su oni gajeni na podlozi sa visokom koncentracijom ugljenih
hidrata (Brearley et al., 2014).
Takođe, kod vrste Stevia rebaundiana iz familije Asteraceae najveći broj izdanaka (21,4)
dobijen je na MS podlozi sa 4% fruktoze (Preeth D. and Naidu, 2011) što pokazuje da
šećer dovodi do bolje regeneracije biljnih vrsta i iz drugih familija.
U ovom radu analiziran je i prikazan uticaj različitih tretmana na biomasu Micromeria
pulegium. Najveću prosečnu svežu masu imali su eksplantati gajeni na podlozi sa 3%
maltoze, dok su najmanju imali eksplantati gajeni na MS podlozi bez šećera. Kod
eksplantata gajenih na podlozi sa najvećom koncentracijom maltoze (5%), zabeležena je
najveća prosečna suva masa, dok je njena najmanja vrednost zabeležena na MS podlozi
kojoj nije dodavana maltoza.
6. Zaključak
Gajenjem nodalnih eksplanatata na hranljivoj podlozi sa različitim koncentracijama
maltoze indukovan je veliki broj aksilarnih pupoljaka. Indukcija najvećeg broja aksilarnih
pupoljaka (6,09) dobijena je gajenjem nodalnih eksplantata na MS hranljivoj podlozi sa
najvećom koncentracijom maltoze (5%). Prosečna dužina aksilarnih pupoljaka bila je
najveća na eksplantatima gajenim na podlozi sa 3% maltoze.
U ovom radu najveću prosečnu svežu masu imali su eksplantati gajeni na hranljivim
podlogama sa 3 i 5% maltoze, statistički značajno veću od eksplantata gajenih na ostalim
podlogama. Najniže vrednosti su zabeležene kod eksplantata koji su rasli na MS podlozi
bez maltoze.
Najveća prosečna vrednost suve mase je zabeležena kod eksplantata gajenih na podlozi sa
najvećom koncentracijom maltoze (0,010 mg) a najmanja na podlozi bez šećera (0,002
mg).
Mikropropagacija Micromeria pulegium je tehnika kojom se može dobiti veliki broj
biljaka od male količine početnog biljnog materijala. Biljke dobijene u kulturi in vitro
možemo koristiti radi povećanja brojnosti ove vrste u prirodi i u cilju sprečavanja
nestanka ove endemične vrste.
7. Literatura
1. Bentham G (1829). Micromeria Bot Reg 15: t. 1282.
2. Boissier E. (1879): Flora Orientalis.vol. 4. Basel & Geneve, 568 – 575.
3. Bräuchler, C., Ryding, O. and Heubl, G. (2008): The genus Micromeria
(Lamiaceae), a synoptical update. Willdenowia 38: 363-410.
4. Brearley, T.A., Vaidya, B.N. and Joshee, N. (2014) Cytokinin, Carbon Source,
and Acclimatization Requirements for in Vitro Propagation of Scutellaria barbata
D. Don and Scutellaria racemosa Pers. American Journal of Plant Sciences, 5,
3662-3672.
5. Grbić, M. (2004): Vegetativno razmnožavanje ukrasnog drveća i žbunja -
proizvodnja sadnog materijala. Beograd: Ne & Bo
6. Gulluce, M., Sokmen, M., Sahin, F., Sokmen, A., Adiguzel, A., Ozer, H. (2004):
Biological activites of the essential oil and methanolic extracts of Micromeria
fruticosa (L) Druce ssp serpyllifolia (Bieb) PH Davis plants from the eastern
Anatolia region of Turkey, Journal of the Science of Food and Argicultre 84 (7):
735-741.
7. Duru, M., Öztürk, M., Uğur, A., Ceylan, Ö., 2004: The constituents of essential oil
and in vitro antimicrobial activity of Micromeria cilicica from Turkey. Journal of
48.−Ethnopharmacology, 94 (1): 43
8. Hartmann, H.D., Kester, D.E., Davies, F.T. (1990): Plant Propagation: Principles
and Practices, Prentice Hall, Englwood Cliffs, NJ
9. Kagami, H., 1999: Effect of Sugars on Rooting of Shoots of Japanese Persimmon
Propagated in vitro. - Plant Biotechnology 16(5): 371- 374.
10. Marinković, B., Marin, P.D., Soković, M., Duletić-Lausević, S&Vukojević, J.
(2003): Antigungal effect of the essential oil of two Micromeria (Lamiaceae)
species. Bocconea, 16 (2), 1113-1116.
11. Međedović, S., Ferhatović Dž. (2003): Klonska proizvodnja sadnica drveća i
grmlja. Bemust, Sarajevo
12. Mishra, R. K., Kumar, A., Shukla, A. C., Tiwari, P., Dikshit, A. ( 2010):
Quantitative and Rapid Antibacterial Assay of Micromeria biflora Benth. Leaf
Essential Oil Against Dental Caries Causing Bacteria Using Phylogenetic
Approach. Journal of Ecobiotechnology, 2(4), 22-26.
13. Murashige T. and Skoog F. (1962): A revised medium for rapid growth and
bioassays with tobaco tissue cultures. Phisiol. Plant. 15: 473-497.
14. Nešković, M., Konjević, R., Ćulafić, Lj., 2003: Fiziologija biljaka. Biološki
fakultet, Beograd.
15. Palić, I., 2009: Hemijska analiza i mikrobiološka aktivnost ekstrakata odabranih
vrsta roda Micromeria Bentham, PhD Dissertation, Prirodno – matematiĉki
fakultet, Univerzitet u Nišu.
16. Pierik R.L.M., (1987): In vitro culture of higher plants as a tool in the propagation
of horticultural crops. ISHS Acta Horticulturae 226: International Symposium on
Propagation of Ornamental Plants
17. Šilić C. (1979): Monographie der Gattungen Satureja L., Calamintha Miller,
Micromeria Benth., Acinos Miller und Clinopodium L. in der Flora Jugoslawiens,
Zemaljski Muzej BiH, Sarajevo, pp. 172 – 262.
18. Slavkovska V. , Couladis M., Bojovic S., Tzakou O., Pavlovic M., Lakusic B., and
Jancic R. (2005): Essential oil and its systematic significance in species of
Micromeria Bentham from Serbia and Montenegro. Pl. Syst. Evol. 255: 1–15.
19. Sujana, P., Naidu, C.V., (2011): Impact of Different Carbohydrates on High
Frequency Plant Regeneration from Axillary Buds of Mentha piperita (L.) – An
Important Multipurpose Medicinal Plant. Journal of Phytology 2011, 3(5): 14-18.
20. Tabanca, N., Kirimer, N., Demirci, F., Baser, KH. (2001): Composition and
antimicrobial activity of the essential oils of Micromeria cristata subsp. Phygia
and the enantiomeric distribution of borneol. J. Agric Food Chem. 49 (9), 4300- 3.
21. Tatić B., Blečić V. (1984): Sistematika i filogenija viših biljaka. Univerzitetski
udžbenik, Zavod za udžbenike i nastavna sredstva, Beograd, 314 - 316.
22. Tošić, S., Stojičić, D.,Stankov-Jovanović, V., Mitić, V., Mihajilov-Krstev, T.,
Zlatković, B., 2015. Chemical Composition, Antioxidant and Antimicrobial
Activities of Micropropagated and Native Micromeria pulegium (Lamiaceae)
Extracts. OXIDATION COMMUNICATIONS vol. 38 br. 1, str. 55-66.
23. Vinterhalter, D., Vinterhalter B., (1996): Kultura in vitro i mikropropagacija
biljaka. Axial, P.O., Beograd (15-54).
BIOGRAFIJA KANDIDATA
Golubović Aleksandra, rođena je u Leskovcu 24. novembra 1991. Godine 2006. završila je Osnovnu školu u Bojniku kao nosilac Vukove diplome. Srednju Medicinsku školu u Leskovcu završila je 2010. godine sa odličnim uspehom.
Po završetku srednje škole, 2010. godine, upisala je osnovne akademske studije na Prirodno-matematičkom fakultetu Univerziteta u Nišu, na Departmanu za biologiju i ekologiju. Osnovne studije završila je 2013. godine i time stekla zvanje “Biolog”. Iste godine upisuje master akademske studije na Departmanu za biologiju i ekologiju, Prirodno-matematičkog fakulteta u Nišu, odsek Biologija, koje završava 2016. godine.
Редни број, РБР: Идентификациони број, ИБР:
Тип документације, ТД: Монографска
Тип записа, ТЗ: текстуални / графички
Врста рада, ВР: мастер рад
Аутор, АУ: Александра Голубовић
Ментор, МН: Драгана Стојичић
Наслов рада, НР: „Утицај малтозе на индукцију аксиларних пупољака
Micromeria pulegium (Benth.)“
Језик публикације, ЈП: Српски
Језик извода, ЈИ: Енглески
Земља публиковања, ЗП: Р. Србија
Уже географско подручје, УГП: Р. Србија
Година, ГО: 2015.
Издавач, ИЗ: ауторски репринт
Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.
Физички опис рада, ФО:
(поглавља/страна/ 26 стр.; 9 слика; 3 табеле; 2 histograma.
Научна област, НО: Биологија
Научна дисциплина, НД: Биологија
Предметна одредница/Кључне речи, ПО: Micromeria pulegium,микропропагација
УДК 664.136:581.144+582.929
Чува се, ЧУ: Библиотека Важна напомена, ВН: Извод, ИЗ: Micromeria pulegium (Benth.) је ендемична врста јужних Карпата. Природне
популације ове врсте имају мали број јединки и настањују станишта која су под
негативним антропогеним факторима, па се намеће потреба за проналажењем
начина њиховог гајења и умножавања. Зато је ова врста уведена у културу in
vitro. У овом раду испитиван је утицај шећера малтозе као изора енергије у
процесу регенерације биљака путем индукције аксиларних пупољака на
нодалним експлантатима M. pulegium in vitro. Дефинисани су услови при којима
се формира највећи број аксиларних пупољака ,при којима се остварује њихова
највећа дужина,ат акође се остварује и највећи принос биомасе.
Датум прихватања теме, ДП: 09/09/15 Датум одбране, ДО:
Чланови комисије, КО: Председник:
T Др Tatјана Михаилов-Крстев
Члан: Др Бојан Златковић
Члан, ментор: Др Драгана Стојичић
ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ
НИШ
КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА
Accession number, ANO: Identification number, INO:
Document type, DT: Monograph
Type of record, TR: textual / graphic
Contents code, CC: Master thesis
Author, AU: Aleksandra Golubović
Mentor, MN: Dragana Stojičić
Title, TI: „Influence of maltose on the induction of axillary buds
Micromeria pulegiium (Benth.)“
Language of text, LT: Serbian
Language of abstract, LA: English
Country of publication, CP: Republic of Serbia
Locality of publication, LP: Serbia
Publication year, PY: 2015
Publisher, PB: author’s reprint
Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.
Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes)
26 p.; 9 pictures; 3 таb; 2 chart.
Scientific field, SF: Biology
Scientific discipline, SD: Biology
Subject/Key words, S/KW: Micromeria pulegium, Micropropagation
UC 664.136:581.144+582.929
Holding data, HD: Library
Note, N: Abstract, AB: Micromeria pulegium (Benth.) is an endemic species of the southern Carpathians. The natural
population of this species have a small number of individuals and populate habitats which are
exposed to negative anthropogenic factors so require finding out the new ways of growing and
multiplication. For this reason, this species was introduced into the culture in vitro. In this
degree essay, we examine the effect of sugar maltose, as a source of energy in the process of
plant regeneration through induction of axillary buds on nodal segments M. pulegium in vitro.
The conditions in which are the largest number of axillary buds are formed on explants and in
which their maximum length is achieved , and also achieved the highest yield of biomass, are
clearly defined
Accepted by the Scientific Board on, ASB: 09/09/15
Defended on, DE:
Defended Board, DB: President: phD Татјаna Mihailov-Krstev
Member: phD Bojan Zlatković
Member, Mentor: phD Dragana Stojičić
Прилог 5/2
ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ
НИШ
KEY WORDS DOCUMENTATION