univerzitet u beogradu · 2020. 1. 17. · Članovi komisije 1. prof. dr miroslav dramićanin,...

UNIVERZITET U BEOGRADU

FIZIČKI FAKULTET

Lea I. Lenhardt

PARALELNA FAKTORSKA ANALIZA FLUORESCENTNIH SVOJSTAVA VIŠEKOMPONENTNIH SISTEMA

doktorska disertacija

Beograd, 2014

UNIVERSITY OF BELGRADE

FACULTY OF PHYSICS

Lea I. Lenhardt

PARALLEL FACTOR ANALYSIS OF THE FLUORESCENT PROPERTIES OF

MULTICOMPONENT SYSTEMS

Doctoral Dissertation

Belgrade, 2014

Članovi komisije

1. Prof. Dr Miroslav Dramićanin,

Naučni savetnik Instituta za nuklearne nauke Vinča,

redovni profesor Fizičkog fakulteta Univerziteta u Beogradu

2. Prof. Dr Ljubiša Zeković,

redovni profesor Fizičkog fakulteta Univerziteta u Beogradu.

3. Prof. Dr Ivan Belča,

vanredni profesor Fizičkog fakulteta Univerziteta u Beogradu.

4. Prof. Dr Milorad Kuraica,

redovni profesor Fizičkog fakulteta Univerziteta u Beogradu.

Datum odbrane

(dan, mesec, godina)

Doktorska disertacija urađena je pod rukovodstvom mentora prof. dr Miroslava D.

Dramićanina, naučnog savetnika INN „Vinča“ i redovnog profesora Fizičkog fakulteta

Univerziteta u Beogradu i prof. dr Ljubiše Zekovića redovnog profesora Fizičkog

fakulteta Univerziteta u Beogradu. Iskreno se zahvaljujem profesoru Dramićaninu na

nesebičnoj podršci i velikoj pomoći koju mi je pružio tokom postdiplomskih studija, kao i

na velikom doprinosu svojim sugestijama i idejama prilikom realizacije doktorske

disertacije u svim njenim fazama. Posebnu zahvalnost dugujem i profesoru Zekoviću, na

veoma korisnim savetima i podršci.

Zahvaljujem se prof. dr Rasmus Bro-u, redovnom profesoru Fakulteta prirodnih nauka

Univerziteta u Kopenhagenu, na podršci, velikoj pomoći i stručnim savetima prilikom

izrade ove disertacije.

Posebno se zahvaljujem dr Ivani Zeković, istraživaču saradniku INN „Vinča“, na

neprocenjivoj pomoći, stručnim savetima i podršci pruženoj tokom izrade disertacije.

Takođe bih želela da se zahvalim svim kolegama koji su na bilo koji način doprineli

procesu izrade ove teze.

Na kraju bih želela da se zahvalim svojoj porodici, prijateljima i Acku na nesebičnoj

pomoći i podršci.

Lea Lenhardt

PARALELNA FAKTORSKA ANALIZA FLUORESCENTNIH SVOJSTAVA

VIŠEKOMPONENTNIH SISTEMA

Sažetak

Kombinacija optičkih spektroskopskih tehnika i odgovarajućih metoda za analizu i

modeliranje spektralnih podataka se pokazala kao veoma obećavajuća tehnika za

karakterizaciju i analizu organskih i neorganskih kompleksnih sistema. Razumevanje

fizičkih fenomena koji se javljaju u kompleksnim sistemima predstavlja bitan preduslov

za primenu spektroskopskih tehnika u različitim oblastima nauke. U ovoj tezi su izmerene

fluorescentne karakteristike četiri kompleksna sistema: tri organska (rastvor vode i

aminokiselina, med i tkivo dojke) i jedan neorganski (kompleksni sistem fosfora na bazi

retkih zemalja). Dobijeni fluorescentni podaci su modelirani primenom paralelne

faktorske analize. Izgrađeni modeli su omogućili definisanje fluorescirajućih komponenti

(fluorofora) prisutnih u sistemima, pri čemu je model kao rezultat dao čiste spektre svake

pojedinačne fluorofore, kao i njihove relativne koncentracije u svakom od uzoraka

sistema. U neorganskom sistemu i rastvoru aminokiselina broj fluorofora i njihove

koncentracije su unapred bile poznate i na taj način je testirana uspešnost modela kao i

njegova sposobnost predikcije prisustva i koncentracija fluorofora u nepoznatim

uzorcima. Pokazano je da je dobijeni model veoma uspešan, sa odstupanjem od samo

0.036% od stvarne koncentracije kod neorganskog sistema. Za sistem meda, model je

pokazao da je u sistemu prisutno 6 fluorofora i dobijeni su čisti spektri svake od njih kao

i njihove relativne koncentracije u svakom pojedinačnom uzorku. Dalje analize spektara

meda su ukazale da je na osnovu koncentracija fluorofora moguće odrediti botaničko

poreklo meda. Spektri meda su zatim analizirani metodom glavnih komponenata kao i

diskriminantnom analizom parcijalno najmanjih kvadrata. Rezultati su pokazali veliku

uspešnost primene metode fluorescentne spektroskopije za klasifikaciju i autentifikaciju

uzoraka meda. Proračunom modela tkiva dojke je ustanovljeno da postoje 4 dominantne

fluorofore. Utvrđeno je da je na osnovu njihovih koncentracija moguće sa tačnošću od

100% odrediti vrstu promena na tkivu (benigno ili maligno). Rezultati su potom poređeni

sa rezultatima analize potpornih vektora primenjenih na neobrađene spektre, na osnovu

kojih je pokazano da se sa istim podacima ne može dobiti podjednako uspešan model

(greška klasifikacije 35.71%). Međutim, pokazano je da se primenom drugog režima

merenja spektara i određenom aritmetičkom manipulacijom podataka mogu dobiti modeli

istog kvaliteta. Dobijeni rezultati u ovoj tezi su pokazali da fluorescentna spektroskopija

u kombinaciji sa multivarijantnim analizama ima veliki potencijal u karakterizaciji,

modeliranju i analizi višekomponentnih sistema.

Ključne reči: višekomponentni sistemi, fluorescentna spektroskopija, paralelna faktorska

analiza, analiza glavnih komponenata

Naučna oblast: Fizika

Uža naučna oblast: Primenjena fizika

UDK broj: 543.42:535.33(043.3)

PARALLEL FACTOR ANALYSIS OF THE FLUORESCENT PROPERTIES OF

MULTICOMPONENT SYSTEMS

Abstract

The combination of optical spectroscopic techniques and appropriate methods for

analysis and modeling of spectral data proved to be a very promising technique for the

characterization and analysis of organic and inorganic complex systems. Understanding

of physical phenomena that occur in complex systems is an essential prerequisite for the

application of spectroscopic techniques in various fields of science. Fluorescence

characteristics of four complex systems: three organic (solution of water and amino acids,

honey and breast tissue) and one inorganic (a complex system of phosphorus-based rare

earth) were measured in this thesis. The obtained fluorescence data were modeled using

parallel factor analysis. The constructed models have enabled definition of the fluorescing

components (fluorophores) present in the system, wherein the model as a result gave pure

spectra of the individual fluorophore as well as their relative concentrations in each

sample of the system. In the inorganic system and solution of amino acids, the number of

fluorophores and their concentrations were known in advance, and thus the performance

of the model was tested as well as its ability to predict the presence and concentrations of

fluorophores in the unknown samples. It was shown that the resulting model is very

successful, with a deviation of only 0.036% of the actual concentration in inorganic

systems. For the system of honey, the model showed that 6 fluorophores are present in

the system and their pure spectra were obtained, as well as their relative concentrations

in each sample. Further analysis of the spectra of honey have demonstrated that based on

the concentrations of the fluorophores the botanical origin of honey can be determined.

Spectra of honey were then analyzed using principal component analysis and discriminant

partial least squares. Results have shown great success in application of fluorescence

spectroscopy methods for classification and authentication of honey samples. Based on

calculated model of the breast tissue it was determined that there are four dominant

fluorophores. It was estabilshed that based on their concentrations it possible to determine

the type of change in the tissue (benign or malignant) with an accuracy of 100%. The

results were then compared with the results of support vector machine analysis applied to

the raw spectra, from which it was shown that using the same data successful model can

not be obtained (classification error 35.71%). However, it has been shown that with

application of measuring spectra in another mode and using specific arithmetic

manipulation of the data, models of the same quality may be obtained. The results

obtained in this thesis have shown that fluorescence spectroscopy in combination with

multivariate analysis has great potential in the characterization, modeling and analysis of

multi-component systems.

Key words: multi-component systems, fluorescent spectroscopy, parallel factor analysis,

principal component analysis

Scientific field: Physics

Major in: Applied Physics

UDC number: 543.42:535.33(043.3)

SADRŽAJ

1. UVOD ...................................................................................................................................................... 1

2. MULTIVARIJANTNA ANALIZA ........................................................................................................ 3

2.1 BILINEARNI MODELI – PCA I PLS ....................................................................................................... 3 2.1.1 PCA ............................................................................................................................................ 3 2.1.2 PLS ............................................................................................................................................. 5 2.1.3 Diskriminantna analiza parcijalno najmanjih kvadrata – PLS-DA ........................................... 5 2.1.4 Primena PCA i PLS metoda u fluorescentnoj spektroskopiji ..................................................... 6

2.2 METODA ZA ANALIZU VIŠEDIMENZIONALNIH PODATAKA - PARAFAC ................................................ 6 2.2.1 Trodimenzionalni PARAFAC model ............................................................................................ 8 2.2.2 PARAFAC model u notaciji Kronecker proizvoda .................................................................... 14 2.2.3 PARAFAC model u tenzorskoj notaciji ..................................................................................... 14 2.2.4 PARAFAC model u vektorskoj i Kronecker notaciji ................................................................. 14 2.2.5 PARAFAC model u notaciji Khatri-Rao proizvoda ................................................................... 15 2.2.6 Rotaciona sloboda i unikatnost trodimenzionalnih PARAFAC modela .................................... 17

2.3 PARAFAC ALGORITAM .................................................................................................................... 18 2.3.1 Tehnike optimizacije ................................................................................................................. 19 2.3.2 PARAFAC algoritam naizmenično najmanjih kvadrata ........................................................... 22 2.3.3 Inicijalizacija PARAFAC – ALS ................................................................................................ 25 2.3.4 Proračun skorova novih uzoraka ............................................................................................. 26 2.3.5 Tretiranje matrica kojima nedostaju podaci ............................................................................ 28 2.3.6 Uslovljavanje nenegativnosti ................................................................................................... 29 2.3.7 Validacija i dijagnostika PARAFAC modela ............................................................................. 31 2.3.8 Test-set i unakrsna validacija ................................................................................................... 33 2.3.9 Odabir broja komponenti modela ............................................................................................ 36 2.3.10 Grafik svojstvenih vrednosti faktora ...................................................................................... 36 2.3.11 Split-half analiza .................................................................................................................... 38 2.3.12 Analiza ostatka ....................................................................................................................... 39 2.3.13 Predprocesiranje podataka .................................................................................................... 41 2.3.14 Vizuelizacija rezultata ............................................................................................................ 42

2.4 METODA POTPORNIH VEKTORA ......................................................................................................... 43

3. FLUORESCENTNA SPEKTROSKOPIJA ....................................................................................... 48

3.1 ELEKTROMAGNETNO ZRAČENJE I NJEGOVA INTERAKCIJA SA MOLEKULIMA ...................................... 48 3.1.1 Interakcija elektromagnetnog zračenja i molekula .................................................................. 49 3.1.2 Molarni koeficijent apsorpcije ................................................................................................. 50 3.1.3 Apsorpcija i energetska stanja ................................................................................................. 51 3.1.4 Tipovi elektronskih prelaza kod molekula ................................................................................ 53

3.2 LUMINESCENCIJA .............................................................................................................................. 54 3.2.1 Interna konverzija .................................................................................................................... 55 3.2.2 Fluorescencija .......................................................................................................................... 56 3.2.3 Unutarsistemski prelazi ............................................................................................................ 58 3.2.4 Fosforescencija i neradijativna relaksacija ............................................................................. 58 3.2.5 Eksterna konverzija i gašenje usled sudara ............................................................................. 58 3.2.6 Kvantni prinos i intenzitet fotoluminescencije ......................................................................... 59 3.2.7 Ekscitacioni i emisioni spektri ................................................................................................. 59

3.3 LUMINESCENTNI MATERIJALI ............................................................................................................ 60 3.3.1 Organski luminescentni uzorci - fluorofore .............................................................................. 60 3.3.2 Neorganski luminscentni materijali ......................................................................................... 65

3.4 UREĐAJ ZA MERENJE FLUORESCENCIJE ............................................................................................. 73

3.4.1 Izvor elektromagnetnog zračenja ............................................................................................. 74 3.4.2 Monohromator ......................................................................................................................... 76 2.4.3 Detektor ................................................................................................................................... 78 3.4.4 Merenje luminescentnih spektara i vremena života pobuđenog stanja .................................... 80

4. MATERIJALI I METODE .................................................................................................................. 85

4.1 PRIPREMA UZORAKA ......................................................................................................................... 85 4.1.1 Rastvor vode i aminokiselina ................................................................................................... 85 4.1.2 Med .......................................................................................................................................... 86 4.1.3 Tkivo dojke ............................................................................................................................... 86 4.1.4 Neorganski materijali............................................................................................................... 87

4.2 MERENJE FLUORESCENTNIH SPEKTARA ............................................................................................ 88 4.2.1 Ekscitaciono-emisione matrice (EEM) .................................................................................... 91 4.2.2 Sinhroni fluorescentni spektri .................................................................................................. 92 4.2.3 Emisioni spektri i vreme života ................................................................................................ 92

4.3 ANALIZA I MODELIRANJE DOBIJENIH SPEKTARA ................................................................................ 93 4.3.1 Priprema podataka za analizu ................................................................................................. 93 4.3.2 Proračun i analiza PARAFAC modela ...................................................................................... 96 4.3.3 Proračun i analiza PCA modela .............................................................................................. 97 4.3.4 Proračun i analiza PLS-DA modela ......................................................................................... 98 4.3.5 Proračun i analiza SVM modela .............................................................................................. 99 4.3.6 Proračun zapremine spektralnih domena ................................................................................ 99

5. REZULTATI I DISKUSIJA ............................................................................................................... 101

5.1 RASTVOR VODE I AMINOKISELINA .................................................................................................. 102 5.2 MED ............................................................................................................................................... 106

5.2.1 Analiza EEM-a ....................................................................................................................... 106 5.2.2 Analiza sinhronih fluorescentnih spektara ............................................................................. 114 5.2.3 Analiza infracrvenih spektara ................................................................................................ 120

5.3 KANCER DOJKE ............................................................................................................................... 122 5.3.1 PARAFAC analiza EEM-a ...................................................................................................... 122 5.3.2 SVM analiza EEM-a i sinhronih spektara .............................................................................. 127

5.4 KOMPLEKSNI SISTEMI FOSFORA NA BAZI RETKIH ZEMALJA ............................................................. 132

6. ZAKLJUČAK ..................................................................................................................................... 137

7. LITERATURA .................................................................................................................................... 141

8. PRILOG .............................................................................................................................................. 150

PRILOG A ............................................................................................................................................. 150 A.1 Kronecker, Hadamard i Khatri-Rao proizvod ........................................................................... 150 A.2 Koncept linearnosti modela ...................................................................................................... 153 A.3 Rang i k-Rang matrice .............................................................................................................. 154 A.4 Singularna dekompozicija matrice ........................................................................................... 156

8. BIOGRAFIJA ..................................................................................................................................... 158

IZJAVA O AUTORSTVU....................................................................................................................... 160

IZJAVA O ISTOVETNOSTI ŠTAMPANE I ELEKTRONSKE VERZIJE DOKTORSKOG RADA

.................................................................................................................................................................. 161

IZJAVA O KORIŠĆENJU ..................................................................................................................... 162

1

1. Uvod

Razumevanje i modeliranje fizičkih procesa i interakcija u kompleksnim sistemima

predstavlja osnovni preduslov za praktičnu primenu spektroskopskih metoda u raznim

oblastima nauke poput fizike, biologije, medicine, biohemije itd. Kompleksni sistemi

predstavljaju veliki izazov za ispitivanje i analizu usled prisustva više komponenata u

sistemu kao i njihove međusobne interakcije. Iz tog razloga svaki kompleksan sistem

ima svoj specifični „fingerprint“ spektar zbog prisustva više komponenata koje utiču na

njegove optičke osobine. Upravo ova karakteristika predstavlja osnovu građenja

jedinstvenog modela kompleksnog sistema. Uređaji koji se danas koriste za

spektroskopska merenja su sofisticirani i precizni, i daju kvalitetne rezultate merenja

(velika osetljivost, visoka rezolucija, itd.). Međutim, njihova analiza i interpretacija

predstavlja svojevrstan izazov u cilju efikasne ekstrakcije najznačajnijih informacija iz

velike grupe podataka.

Poslednjih decenija optičke spektroskopske tehnike su pokazale da imaju ogroman

potencijal primene u različitim oblastima nauke. Važno je istaći da su pomenute metode

brze i imaju potencijal da budu neinvazivne, a samim tim i veću mogućnost primene u

odnosu na standardne metode. Takođe, ekspanzija primene ovih tehnika je uslovila

razvoj odgovarajućih statističkih i matematičkih alata za obradu dobijenih

spektroskopskih podataka. To je dovelo do povećanja primene spektroskopskih metoda

u raznim naučnim oblastima poput: industrije [He et al. 2003], farmacije [Kauppinen et

al. 1993], ispitivanja hrane [Munck et al. 1998], zaštite životne sredine [Silverman

1993] i biohemije [Plugge and van der Vlies 1993].

Jedna od najrazvijenijih i dosta primenjivanih tehnika za optičku karakterizaciju

kompleksnih sistema je fluorescentna spektroskopija. Prednost ove metode su pored

brzine i pouzdanosti, visoka senzitivnost [Li et al. 2003]. Veliku primenu ova metoda je

našla u oblasti medicine, biologije, prehrambene industrije itd. [Karoui et al. 2007a,

Lenhardt et al. 2014, Zeković et al. 2012, Alfano et al. 1987, Dramićanin et al. 2005,

Dramićanin et al. 2012, Sterenborg et al. 2012, Lenhardt et al. 2013, Zeković et al.

2014]. Uočeno je da postoji linearna veza između signala fluorescencije uzorka i

1. Uvod

2

koncentracije određene supstance u njemu. Ovaj fenomen je omogućio pravljenje

predikcionih modela na osnovu promene amplitude signala. Međutim, merenjem samo

jednog fluorescentnog spektra pokazano je da se ne obuhvata celokupna kompleksnost

sistema jer često postoji više fenomena koji utiču na signal. Iz tog razloga se kod

višekomponentnih sistema primenjuju složenije fluorescentne spektroskopske tehnike,

ekscitaciono-emisione matrice (EEM) i sinhrona fluorescentna spektroskopija, sa ciljem

da se detektuje najveći mogući broj spektralnih karakteristika ispitivanog sistema.

Analizom dobijenih EEM odgovarajućim multivarijantnim metodama moguće je

izdvojiti uticaj pojedinačnih supstanci unutar merenog sistema, odrediti njihovu

relativnu koncentraciju, izdvojiti pojedinačne spektre svake susptance koja fluorescira u

posmatranom sistemu itd. Multivarijantna tehnika koja se najčešće koristi u ove svrhe je

paralelna faktorska analiza (eng. PARAllel FACtor Analysis - PARAFAC). Oblasti u

kojima je ova metoda imala veliki doprinos su biologija i medicina. Razlog ovome je

autofluorescencija bioloških uzoraka o kojoj će kasnije biti više reči. PARAFAC analiza

EEM fluorescentnih spektara se pokazala uspešnom na raznim poljima primene [Bro

1997] kao što je klasifikacija i karakterizacija Sherry sirćeta [Callejón et al. 2012],

analiza šećera [Bro 1999], analiza jogurta [Christensen et al. 2005] itd.

U ovoj disertaciji će biti detaljno objašnjena primena paralelne faktorske analize

(PARAFAC) za modeliranje dobijenih spektroskopskih podataka četiri kompleksna

sistema: rastvor vode i aminokiselina, med, kancer dojke i kompleksni sistem fosfora na

bazi retkih zemalja. Osim navedene analize fluorescentni spektri će biti analizirani i

drugim statističkim metodama: analiza glavnih komponenata, diskriminantna analiza

parcijalno najmanjih kvadrata i analiza potpornih vektora. Rezultati ovih analiza će biti

upoređivani sa rezultatima PARAFAC metode i istraživaće se koje metode imaju veću

uspešnost u analizi spektralnih podataka kompleksnih sitema. Ideja ovog rada je bila

ispitivanje potencijala fluorescentne spektroskopije za analizu, karakterizaciju i

modeliranje kompleksnih sistema.

3

2. Multivarijantna analiza

Ova teza se bavi problematikom iz oblasti fluorescentne spektroskopije i analize i

modeliranja podataka dobijenih tom metodom. Karakterstično za ovu metodu jeste

mnogo veći broj varijabli u odnosu na broj merenih uzoraka, slučaj u kome nam je

onemogućena primena standardnih statističkih metoda za obradu podataka. Umesto njih

neophodno je koristiti metode specijalno razvijene za obradu i analizu

višedimenzionalnih podataka. Multivarijantna analiza se bazira na činjenici da je za

opisivanje kompleksnih problema neophodno više parametara. Stoga se korišćenjem i

kombinovanjem više varijabli može izvući više informacija vezanih za posmatrani

sistem.

Kada je u pitanju spektroskopija, umesto snimanja samo jednog ili više pikova koji nas

zanimaju, snimaju se celi spektri ili površine koji se zatim koriste za evaluaciju

određenog sistema. Spektroskopski podaci dobijeni na taj način se uglavnom sastoje od

stotina varijabli, koje su generalno visoko korelisane. Klasične statističke metode ne

mogu efikasno obrađivati ovaj tip podataka, dok metode multivarijantne analize

pristupaju ovakvim podacima ekstrakcijom linerno nezavisnih latentnih varijabli iz

originalnog seta međusobno korelisanih podataka. Dve osnovne metode koje se

primenjuju u praksi su: metoda glavnih komponenata (eng. Principal Component

Analisys (PCA)) i regresija metodom najmanjih kvadrata (eng. Partial Least Squares

(PLS) regression). PCA i PLS su bilinearni modeli bazirani na linearnoj dekompoziciji

originalnih podataka u novi set glavnih komponenti ili latentnih varijabli, respektivno

(koncept linearnosti modela je detaljnije objašnjen u prilogu A.2). Ove tehnike su se

pokazale kao jako robusne, pri čemu omogućavaju lakšu detekciju netipičnih uzoraka

(eng. Outlier) i dobro izlaze na kraj sa mogućim šumovima i artefaktima u podacima

[Bro 2003.].

2.1 Bilinearni modeli – PCA i PLS

2.1.1 PCA


4

Ova metoda je osnovni alat za multivarijantnu i eksploratornu analizu podataka koja je

u samom začetku bila razvijena za primenu u psihometriji početkom dvadesetog veka, a

tek mnogo kasnije počela je da se primenjuje na druge vrste podataka.

Osnovni princip PCA metode se može sumirati sledećom formulom

X = 𝐒 ∙ 𝐋T + 𝐄 (1.1)

gde je X ulazna matrica sa originalnim izmerenim podacima (svaki red odgovara

merenom uzorku, dok svaka kolona odgovara merenom parametru odnosno varijabli)

koja se dekomponuje na dve matrice: skor matricu S (eng. score matrix) i loading

matricu L (eng. loading matrix) pri čemu one zajedno izražavaju glavne varijacije u

podacima, ostavljajući sve nesistemske doprinose u ostatku E (slika 2.1). Na ovaj način

podaci iz matrice X su transformisani u set međusobno ortogonalnih komponenti.

Proizvodi vrednosti svakog skora i vektora opterećenja se nazivaju glavnim

komponentama (eng. Principal Components (PC's)). Vrednost skora predstavlja poziciju

uzoraka za svaku odgovarajuću glavnu komponentu. Vektori opterećenja se mogu

posmatrati kao novi koordinatni prostor varijabli, odnosno kao pravci svake glavne

komponente na osnovu originalnih ulaznih parametara. Kada su spektralni podaci u

pitanju, u idealnom slučaju skor vrednosti predstavljaju koncentracije određenih

supstanci u uzorku dok vektor opterećenja predstavlja spektralni profil posmatranog

sistema.

Slika 2.1 – Grafički prikaz PCA analize.


5

Izdvajanjem samo bitnih varijacija u novi set glavnih komponenata dolazi do bitnog

smanjenja dimenzionalnosti početnih podataka, pri čemu se uklanjaju razni šumovi i

tretiraju postojeće kolinearnosti pristutne u podacima. PCA modeli i dalje nose

informacije visokodimenzionalnih početnih podataka, ali u komprimovanom formatu.

Stoga, cilj linearne dekompozicije u multivarijantnoj analizi je istovremena analiza svih

prikupljenih podataka, što omogućava obradu velikih setova podataka i sagledavanje

uticaja svih parametara istovremeno. Zavisno od ishoda analize može se lako smanjiti

dimenzionalnost početnih podataka radi lakše evaluacije rezultata i boljeg fokusa na

bitne informacije u sistemu.

2.1.2 PLS

Drugi osnovni alat u multivarijantnoj analizi je PLS regresija. Ova metoda se zasniva na

dekompoziciji ulazne matrice X sličnoj dekompoziciji primenjenoj kod PCA metode.

Međutim, za razliku od PCA, PLS modeli su razvijeni za korelaciju dva seta podataka,

X i y, što je opisano sledećom jednačinom

𝑦 = 𝐗 ∙ 𝑏 + 𝑒 (1.2)

X matrica sadrži više izmerenih parametara, b nosi informaciju o regresionim

koeficijentima izračunatih u kalibracionoj rutini, dok y predstavlja jednu ili više

varijabli ili kvalitativnih parametara, za koje želimo da budu prediktovani na osnovu

matrice X. Ovaj metod regresije se sastoji iz dva bloka i simultano se odvija analiza dva

seta podataka pri čemu se dekompozicija X matrice odvija uzimajući sve vreme u obzir

y. Ova analiza se najčešće koristi u spektroskopiji za korelaciju spektra sa određenim

fizičkim ili hemijskim parametrom, poput koncentracije neke određene supstance u

uzorku.

2.1.3 Diskriminantna analiza parcijalno najmanjih kvadrata – PLS-DA

Diskriminantna analiza parcijalno najmanjih kvadrata (eng. Partial Least Squares

Discriminant Analisys – PLS-DA) predstavlja metodu za građenje linearnih


6

diskriminantnih (klasifikacionih) modela. Ova tehnika je bazirana na PLS regresiji i

pokazala se kao korisna za primenu kod visoko dimenzionalnih podataka. Kao što je

prethodno opisano PLS model transformiše početni set podataka u manji set koji se

sastoji od usrednjenih, linearnih, latentnih parametara (eng. Latent variable – LV). U

slučaju PLS-DA modeliranja, klasna pripadnost svakog uzorka se uzima kao zavisna

varijabla koju želimo da model predvidi. Ovakvi modeli se uglavnom koriste za

klasifikaciju novih nepoznatih uzoraka. Za validaciju PLS-DA modela se najčešće

koriste različite vrste unakrsne validacije ili test setovi. U ovoj tezi je bio korišćen

metod preklapanja (eng. venetian blinds), koji odabira svaki s-ti uzorak iz početnog seta

podataka i deli ga na s podsetova tako da svaki uzorak bude jednom izostavljen iz test

seta.

2.1.4 Primena PCA i PLS metoda u fluorescentnoj spektroskopiji

Multivarijantne analize su našle široku primenu u oblasti fluorescentne spektroskopije

za građenje bilinearnih modela u cilju evaluacije merenih spektara. Ovakvi modeli se

često koriste za klasifikaciju, karakterizaciju i predikciju kvalitativnih i procesnih

parametara raznih sistema. Oblast u kojoj se najčešće koriste jeste prehrambena

industrija i medicina [Dufour & Riublanc 1997, Dufour et al. 2000, Dufour et al. 2001,

Herbert et al. 1999, Mazerolles et al. 2001]. Razlog ovome je postojanje fenomena

autoflurescencije bioloških uzoraka. Jedna od osnovnih karakteristika biolških sistema

jeste njihova kompleksnost i iz tog razloga je nekad nemoguće dobro opisati sistem

bilinearnim modelom već je neophodno uzeti u obzir više dimenzija. U tom slučaju se

koriste metode za modeliranje i analizu višedimenzionalnih podataka.

2.2 Metoda za analizu višedimenzionalnih podataka - PARAFAC

Opisani bilinearni modeli se koriste za analizu podataka organizovanih u

dvodimenzionalne matrice, gde najčešće redovi predstavljaju uzorke, a parametri

kolone. Pojam analize višedimenzionalnih podataka se odnosi na multivarijantnu

analizu koja se vrši na matricama dimenzionalnosti većoj od dva. U daljem opisu

analize višedimenzionalnih podataka fokus će biti na primeni paralelne faktorske


7

analize (eng. Parallel Factor Analisys – PARAFAC) na podatke dobijene merenjem

fluorescentnih spektara organizovanih u tri dimenzije, trodimenzionalne matrice, koje

sadrže kao informaciju u jednom slučaju intenzitet fluorescencije u funkciji uzorka,

talasne dužine ekscitacije i talasne dužine emisije i u drugom u funkciji uzorka, talasne

dužine emisije i vremena života.

Višedimenzionalna analiza podrazumeva analizu višedimenzionalnih podataka. Kada se

izmeri EEM fluorescentnog spektra za više uzoraka, ovi podaci se mogu organizovati u

trodimenzionalnu matricu veličine I x J x K, gde I predstavlja broj izmerenih uzoraka, a

J i K broj talasnih dužina na kojima je izmerena emisija i ekscitacija, respektivno. Za

obradu ove vrste podataka neophodna je primena višedimenzionalne analize.

Problematika višedimenzionalne analize nije vezana samo za algoritam i dobijanje

dobrog modela već postoje još neka tehnička pitanja na početku i tokom same analize

koja se moraju rešiti. Prvo podaci moraju biti dobro izmereni da bi dalja analiza imala

smisla, a zatim treba da se reše problemi "outlier"-a (uzoraka koji su izdvojeni od

ostatka grupe), podataka koji nedostaju i prisutnost raznih smetnji u samim podacima

(šum, rasejanje, artefakti). Kada su podaci dobro pripremljeni i obradjeni za samu

analizu najbitnija stvar jeste definisanje problematike odnosno fenomena koji treba da

se analizira.

Radi boljeg razumevanja ideje i nastanka višedimenzionalne analize ukratko je u daljem

tekstu dat istorijski pregled razvoja ovih metoda. Naučnik Raymond Cattell je objavio

prve radove koji su se bavili metodama analize višedimenzionalnih podataka [Cattell

1944, Cattell 1952]. Turstonov (eng. Thurstone) princip parsimonije navodi da je

potrebno naći jednostavnu strukturu koja opisuje podatke u matrici ili njenu korelišuću

matricu uz pomoć faktora [Thurstone 1935]. Za simultanu analizu više matrica

odjednom, Cattell je predložio princip "paralelnih proporcionalnih profila" [Cattell

1944]. Princip "paralelnih proporcionalnih profila" govori da treba naći set zajedničkih

faktora koji se mogu fitovati (prilagoditi) sa različitim dimenzionalnim težinskim

faktorima koji odgovaraju za više matrica istovremeno. U principu to predstavlja isti

problem kao i traženje zajedničkog seta faktora za trodimenzionalnu matricu. Da

citiramo Cattell-a:


8

„Čini se da princip parsimonije ne treba da pita "Koji je najjednostavniji set faktora

koji reprodukuju ovu korelacionu matricu?" već "Koji set faktora je najviše parsimon

istovremeno za tu i druge matrice posmatrane zajedno?"

Stoga cilj višedimenzionalne analize podrazumeva pronalaženje najmanje različitih

faktora za sve matrice posmatrane zajedno. Jedan od najznačajnijih Cattell-ovih radova

je rad u kome definiše višedimenzionalne matrice [Cattell 1952]. PARAFAC model prvi

put se spominje u radu naučnika Harshman-a 1970. godine gde je prvi put predstavljen

ovaj trodimenzionalni model [Harshman 1970]. Osnovna ideja iza tog modela je bila da

se koriste isti faktori za opisivanje varijacija u više matrica istovremeno, ali sa različitim

težinskim koeficijentima specifičnim za svaku matricu. To je upravo i bila osnovna ideja

"paralelnih proporcionalnih profila" koje je Cattell predložio. PARAFAC [Carroll 1970,

Harshman 1970] metoda je takođe kao i PCA razvijena za rešavanje problema u oblasti

psihometrije i tek mnogo kasnije je adaptirana kao metoda multivarijantne analize za

analizu spektroskopskih podataka [Geladi 1989, Ross 1991, Russell 1988, Smilde

1991]. Međutim krajem sedamdesetih godina 20. veka razvijane su druge i slične

metode faktorske analize, koje su bile korišćene za evaluaciju trodimenzionalnih

podataka [Ho 1978, Marchiarullo 1982, Sanchez 1986].

2.2.1 Trodimenzionalni PARAFAC model

U cilju razumevanja ove metode, prvo će detaljnije biti objašnjeno na koji način su

trodimenzionalne matrice organizovane i koji se novi termini uvode u tom slučaju.

Kako bi se najlakše opisale trodimenzionalne matrice prvo treba poći od

dvodimenzionalnih. Dvodimenzionalni podaci se tipično predstavljaju

dvodimenzionalnom matricom gde kolone predstavljaju izmerene parametre, dok redovi

odgovaraju merenim uzorcima (slika 2.2).


9

Trodimenzionalni podaci se predstavljaju u obliku trodimenzionalne matrice (oblik

kvadra) (slika 2.3). U ovom slučaju redovi i kolone se "menjaju" terminom slices

(preseci) koji se odnosi na slice-ove nastale presecanjem matrice u različitim pravcima,

što je grafički prikazano na slici 2.4. Svaki horizontalni slice odgovara merenom

uzorku, a svaki vertikalni i frontalni slice prikazuje podatke za određeni izmereni

parametar prvog i drugog tipa, respektivno (u slučaju podataka fluorescencije vertikalni

bi odgovarali određenim talasnim dužinama emisije, a frontalni talasnim dužinama

ekscitacije). Ove matrice ne moraju biti uređene po predstavljenom pravilu, ali je to

postala praksa radi lakše analize i interpretacije rezultata.

PARAFAC se može smatrati ekstenzijom PCA metode na podatke višeg reda. Ona

podrazumeva dekompoziciju početne matrice na trilinearne komponente tri loading

vektora, često opisanih kao jedan skor vektor i dva loading vektora (u slučaju više

dimenzionalnih podataka dekompozicija je proširena na kvadrolinearnost,

kvintilinearnost itd.). Deo početne matrice koji nije opisan komponentama predstavlja

ostatak. Kod savršenog modela suma komponenata (model) objašnjava sve sistemske

varijacije u matrici i ostavlja samo šum u ostatku.

Slika 2.2 – Podaci organizovani u

dvodimenzionalnu matricu.

Slika 2.3 – Podaci organizovani u

trodimenzionu matricu.


10

Slika 2.4 – Preseci trodimenzionalne matrice.

PARAFAC model se može predstaviti pomoću više tipova notacija. Iako će u daljem

objašnjenju biti korišćena opšte poznata i uobičajena notacija, za opis ovog modela se

takođe mogu koristiti i neke manje uobičajene notacije poput Kronecker, Khatri-Rao i

tenzorskog proizvoda [Prilog A.1].

PARAFAC model se ovde uvodi generalizacijom singularne dekompozicije matrice

[Prilog A.4]. Dvodimenzionalni model matrice X (I × J), sa elementima matrice xij, na

osnovu dekompozicije singularnom vrednošću sveden na R komponenata predstavljen

je u zbirnoj notaciji


11

𝑥𝑖𝑗 = ∑𝑎𝑖𝑟

𝑅

𝑟=1

𝑔𝑟𝑟𝑏𝑗𝑟 + 𝑒𝑖𝑗; 𝑖 = 1,… , 𝐼; 𝑗 = 1,… , 𝐽 (1.3)

gde su A (I × R), sa elementima air , i B ( J × R), sa elementima bjr , obe ortogonalne

matrice, a G=daig(g11,...,gRR) je dijagonalna matrica odnosno singularna vrednost ili

core matrica koja sadrži R najvećih singularnih vrednosti matrice X u opadajućem

redosledu, dok eij su ostatci. Prethodna jednačina predstavljena u matričnoj notaciji

postaje

𝐗 = 𝐀𝐆𝐁′ + 𝐄 (1.4)

gde E sadrži elemente eij. Vrednosti grr se mogu apsorbovati u air ili bjr ili obe. To

dovodi do sledeće formulacije modela

𝐗 = 𝐀𝐁′ + 𝐄 (1.5)

gde su nazivi matrica ostali isti iako matrice A i B u jednačini 1.4 i 1.5 neće biti iste

zbog dodavanja uticaja grr vrednosti jednoj od njih. Ovaj model se takođe može napisati

i na sledeći način

𝑥𝑖𝑗 = ∑𝑎𝑖𝑟

𝑅

𝑟=1

𝑏𝑗𝑟 + 𝑒𝑖𝑗 (1.6)

Za trodimenzionalnu matricu X (I × J × K) sa elementima xijk, jednačina 1.6 se može

generalizovati za PARAFAC model

𝑥𝑖𝑗𝑘 = ∑𝑎𝑖𝑟

𝑅

𝑟=1

𝑏𝑗𝑟𝑐𝑘𝑟 + 𝑒𝑖𝑗𝑘 (1.7)

gde je R broj komponenata odnosno faktora korišćenih za građenje PARAFAC modela,

dok je eijk ostatak koji sadrži u sebi sve nerazjašnjene varijacije. Grafički prikaz modela

je dat na slici 2.5.


12

Slika 2.5 – Grafički prikaz PARAFAC modela.

Model predstavljen jednačinom 1.7 je trilinearni model: sa dva fiksirana seta parametara

(na primer a i b), dok je xijk izražen kao linearna funkcija preostalih parametara (na

primer c seta parametara). Model u jednačini 1.7 može biti izražen i na sledeći način

ako se uvede skalirajući parametar grrr:

𝑥𝑖𝑗𝑘 = ∑𝑔𝑟𝑟𝑟𝑎𝑖𝑟

𝑅

𝑟=1

𝑏𝑗𝑟𝑐𝑘𝑟 + 𝑒𝑖𝑗𝑘 (1.8)

Ako elemente air "spakujemo" u matricu A (I × R), elemente bjr u B (J × R) i cjr u C (K

× R) onda jednačina 1.7 može da se predstavi u funkciji matrice Xk, gde je Xk k-ti (I x J)

slice trodimenzionalne matrice X (I × J × K) što znači da elementi matrice Xk su xijk (i =

1 ,..., I ; j = 1 ,..., J za svako k):

𝐗𝑘 = 𝐀𝐃𝑘𝐁′ + 𝐄𝑘 = 𝑐𝑘1𝐚1𝐛𝟏

′ + ⋯ + 𝑐𝑘𝑅𝐚𝑅𝐛𝑅′ + 𝐄𝐤 (1.9)

gde je Dk dijagonalna matrica sa elementima k-tog reda matrice C na njenoj dijagonali

(elementi ck1 ,..., ckR); ar, br su r-te kolone matrica A i B, respektivno, a ostatak Ek (I ×

J) je definisan slično matrici Xk. Dakle, svako Xk se modeluje korišćenjem istih

komponenti matrica A i B, ali sa različitim težinskim faktorima koji su deo matrice Dk.

Grafički prikaz jednačine 1.9 je prikazan na slici 2.6.


13

Slika 2.6 – Grafički prikaz jednačine (1.9).

Za sve Xk slice-ove komponente ar i br ostaju iste, samo su njihovi težinski faktori

dk1 ,..., dkR različiti. Stoga se može zaključiti da su svi Xk slice-ovi modelovani

paralelnim i proporcionalnim profilima dk1a1b'1 ,..., dkRaRb'R. Ovo omogućava

opisivanje modela primenom notacije simultanih komponenata. Postoje tri ekvivalentna

načina za opis PARAFAC modela ovom notacijom zbog simetrije samog modela (1.9).

Ove jednačine opisuju frontalni, horizontalni i vertikalni slice, respektivno:

𝐗𝑘 = 𝐀𝐃𝑘(𝐂)𝐁′, 𝑘 = 1,… , 𝐾

𝐗𝑖 = 𝐁𝐃𝑖(𝐀)𝐂′, 𝑖 = 1,… , 𝐼

𝐗𝑗 = 𝐀𝐃𝑗(𝐁)𝐂′, 𝑗 = 1,… , 𝐽 (1.10)

gde dijagonalne matrice Dk(C), Di(A) i Dj(B) su operatori dobijeni ekstrakcijom k-tog,

i-tog i j-tog reda iz odgovarajuće loading matrice (C, A i B, respektivno).

Postoje i drugi načini i notacije za opis PARAFAC modela koji se u nekim slučajevima

koriste kada je jednostavnije prikazati problem na načine koji su dati u daljem tekstu

(definicije Kronecker, Hadamard i Khatri-Rao proizvoda su date u prilogu A.1).


14

2.2.2 PARAFAC model u notaciji Kronecker proizvoda

Jednačinu (1.9) je takođe moguće napisati i u notaciji Kronecker proizvoda koristeći da

je 𝐗 = [𝐗1 𝐗2 … 𝐗𝐾]; 𝐄 = [𝐄1 𝐄2 … 𝐄𝐾] i 𝐃 = [𝐃1 𝐃2 … 𝐃𝐾]:

𝐗 = 𝐀𝐃(𝐈 ⊗ 𝐁′) + 𝐄 (1.11)

ili korišćenjem superdijagonalne matrice 𝐈(𝑅 × 𝑅 × 𝑅) svedene na matricu 𝐇(𝑅 × 𝑅2)

𝐗 = 𝐀𝐇(𝐂′ ⊗ 𝐁′) + 𝐄 (1.12)

pri čemu za obe jednačine postoje dve ekvivalentne alternative zbog simetrične

strukture PARAFAC modela.

2.2.3 PARAFAC model u tenzorskoj notaciji

Korišćenjem tenzorskog proizvoda PARAFAC model se može opisati na sledeći način

𝐗 = ∑𝐚𝑟 △ 𝐛𝑟 △ 𝐜𝑟 + 𝐄

𝑅

𝑟=1

(1.13)

gde su 𝐚𝑟 , 𝐛𝑟 i 𝐜𝑟 r-te kolone matrica A, B i C, respektivno.

2.2.4 PARAFAC model u vektorskoj i Kronecker notaciji

PARAFAC model se može opisati i pomoću vektorskog operatora i Kronecker

proizvoda. To je dato sledećom jednačinom

vec 𝐗 = ∑𝐚𝑟 ⊗ 𝐛𝑟 ⊗ 𝐜𝑟 + vec 𝐄

𝑅

𝑟=1

(1.14)


15

gde je 𝐗 trodimenzionalna matrica veličine (I × J × K). Vec 𝐗 = vec 𝐗 gde je X

dobijeno svođenjem matrice 𝐗 u dvodimenzionalnu matricu.

2.2.5 PARAFAC model u notaciji Khatri-Rao proizvoda

Poslednji način na koji se može opisati PARAFAC model je dat Khatri-Rao

proizvodom.

𝐗 = 𝐀(𝐂 ⊙ 𝐁)′ + 𝐄 (1.15)

gde su X i E definisani na isti način kao i u jednačini (1.11).

Khatri-Rao proizvod je koristan za više-linearne modele. Ako krenemo od bilinearnog

dvodimenzionalnog modela

𝐗 = 𝐀𝐁′ (1.16)

Ovaj model se može vektorisati i onda se dobija

vec 𝐗 = vec (𝐀𝐁′) (1.17)

Što jednostavno znači da su matrice preuređene u vektore. Na primer, vec X je IJ vektor

dobijen kao

[

𝐱1

𝐱2

⋮𝐱𝐽

] (1.18)

gde je xJ j-ta kolona matrice X. U skladu sa tim, bilinearni deo ovog modela se može

napisati na sledeći način


16

vec(𝐀𝐁′) =

vec(𝐚𝟏𝐛𝟏′ ) + vec(𝐚𝟐𝐛𝟐

′ ) + ⋯+ vec(𝐚𝑅𝐛𝑅′ ) =

[

𝑏11𝐚1

𝑏21𝐚1

⋮𝑏𝐽1𝐚1

] + [

𝑏12𝐚2

𝑏22𝐚2

⋮𝑏𝐽2𝐚2

] + ⋯+ [

𝑏1𝑅𝐚𝑅

𝑏2𝑅𝐚𝑅

⋮𝑏𝐽𝑅𝐚𝑅

]

(1.19)

Stoga svaka bilinearna komponenta vec(𝐚𝑟𝐛𝑟′ ) se može napisati kao definisani vektor

koji je u funkciji samo od 𝐚𝑟 i 𝐛𝑟. Ovaj vektor predstavlja Kronecker-ov proizvod 𝐛𝑟 i

𝐚𝑟. Khatri-Rao proizvod dve matrice, A i B, sa istim brojem kolona je definisan na

sledeći način

𝐁 ⊙ 𝐀 =

[ 𝑏11𝐚1 ⋯ 𝑏1𝑅𝐚𝑅

𝑏21𝐚1 ⋯ 𝑏2𝑅𝐚𝑅∙∙∙

𝑏𝐽1𝐚1

⋯⋯⋯⋯

∙∙∙

𝑏𝐽𝑅𝐚𝑅 ]

= [𝐛1 ⊗ 𝐚1 . . 𝐛𝑅 ⊗ 𝐚𝑅]

(1.20)

Onda se model iz jednačine (1.17) može napisati na sledeći način

vec 𝐗 = (𝐁 ⊙ 𝐀)𝟏 (1.21)

gde je 1 R-vektor sačinjen od jedinica. Ovo je princip korišćen u jednačini (1.15)

izražavajući istovremeno drugi i treći mod u dvodimenzionalnoj matrici.

PARAFAC model je specifičan po tome što daje jedinstveno rešenje, odnosno

izračunate A, B i C matrice ne mogu biti promenjene bez promene ostatka (ne postoji

rotaciona sloboda). Ova osobina se drugačije naziva i osobina unutrašnjih osa zato što

sa PARAFAC-om se ne nalaze samo jedinstveni podprostori (kao kod PCA analize) već

i jedinstvene orijentacije bazičnog vektora.

Parametri u matricama A, B i C mogu biti izračunati uz pomoć različitih algoritama.

Bitno je istaći da za razliku od PCA gde se komponente računaju jedna po jedna, kod

PARAFAC modela faktori se moraju računati simultano. Razlog tome je što


17

komponente PARAFAC modela nisu međusobno ortogonalne i samim tim zavise jedna

od druge.

2.2.6 Rotaciona sloboda i unikatnost trodimenzionalnih PARAFAC modela

Unikatnost modela je najbitnija osobina PARAFAC modela. Jedinstven model je model

kod koga su svi parametri izračunati pod definisanim premisama odnosno uslovima, kao

što je struktura i dodatna ograničenja (ortogonalnost, unimodalnost). Uslov da model

matrice bude bilinearan nije dovoljan za dobijanje parametara modela na jedinstven

način. Međutim, ako se koriste neka dodatna ograničenja model može biti jedinstven

odnosno unikatan. Mnoge primene PARAFAC modela se baziraju upravo na ovoj

osobini, poput kalibracije drugog reda i razlaganja spektralnih podataka [Leurgans &

Ross 1992, Sanchez & Kowalski 1988]. Zato je bitno posvetiti pažnju ovoj temi.

Pojam jedinstvenosti se koristi u prethodno pomenutom smislu, odnosno trivijalna

nejedinstvenost usled skaliranja i permutacije matrica komponenti se ne uzima u obzir.

Ovakva vrsta neodređenosti se uglavnom rešava po principu rešavanja problema.

Pretpostavimo da je matrica X modelirana R- komponentnim PARAFAC modelom, sa

matricama komponenti A, B, C sa elementima air, bjr i ckr, respektivno. Stoga, elementi

xijk matrice X mogu biti napisani na sledeći način

𝑥𝑖𝑗𝑘 = ∑𝑎𝑖𝑟

𝑅

𝑟=1

𝑏𝑗𝑟𝑐𝑘𝑟 + 𝑒𝑖𝑗𝑘

(1.22)

gde je eijk element matrice ostatka E i jednačina (1.22) važi za i = 1 ,..., I ; j = 1 ,..., J ; k

= 1 ,..., K. Sada pretpostavimo da postoje matrice �̃�, �̃�, �̃� sa elementima �̃�𝑖𝑟 , �̃�𝑗𝑟 , �̃�𝑘𝑟

respektivno tako da važi

𝑥𝑖𝑗𝑘 = ∑�̃�𝑖𝑟

𝑅

𝑟=1

�̃�𝑗𝑟�̃�𝑘𝑟 + 𝑒𝑖𝑗𝑘 (1.23)

pri čemu su xijk i eijk identični odgovarajućim vrednostima u jednačini (1.22), u skladu sa

time osobina jedinstvenosti modela tvrdi da A, B, C je jednako �̃�, �̃�, �̃� respektivno,


18

osim razlika usled skaliranja i permutacija. Drugim rečima, nije moguće rotirati matrice

PARAFAC komponenti bez promene samog modela. Treba naglasiti da se osobina

jedinstvenosti odnosi na izračunate parametre modela. Ne postoji garancija da

PARAFAC model sadrži u sebi "pravo" rešenje. Međutim, ako je model dobro

okarakterisan sa tačnim brojem komponenata i sama PARAFAC trilinearna struktura

približno validna, u tom slučaju će rešenje PARAFAC analize dati dobru procenu

parametara.

Dovoljan uslov da PARAFAC model da jedinstvenu procenu parametara je dao Kruskal

[Kruskal 1989] koji su kasnije proširili Sidiropoulos i Bro [Sidiropoulos & Bro 2000].

Uslov je sledeći

𝑘A + 𝑘B + 𝑘C ≥ 2𝑅 + 2 (1.24)

gde kA, kB i kC su k-rangovi matrica komponenti A, B i C, respektivno; R je broj

komponenata PARAFAC modela. k-rang matrice se definiše kao veličina najvećeg

podskupa svih podskupova kolona te matrice koji uvek imaju pun rang. Takođe važi da

je jednokomponentni model uvek jedinstven, u tom slučaju se zanemaruje jednačina

(1.24). Kruskal-ovi uslovi ne moraju uvek biti ispunjeni osim kada je vrednost R manja

od četiri [Ten Berge & Sidiropoulos 2001]. Uslovi za jedinstvenost PARAFAC modela

koji imaju više od tri komponente još uvek nisu poznati. Kada je uslov iz jednačine

(1.24) ispunjen, PARAFAC model daje jedinstvenu procenu parametara. Takođe, ako je

na pravi način definisan, PARAFAC model može da da procenu osnovnih fizičkih

parametara koji se nalaze skriveni među početnim podacima.

2.3 PARAFAC algoritam

U ovom delu će biti detaljno opisani algoritmi za računanje parametara kod

višedimenzionalnih modela. Prvo će biti opisane tehnike optimizacije na primeru

fitovanja dvodimenzionalnog modela. Nakon opisa algoritma biće objašnjeno kako se

koriste fitovani modeli za nove podatke. Praktična primena toga bi mogla

podrazumevati predviđanje vrednosti određenih parametara (kalibracija) ili pronalaženje

"outlier"-a (statistička kontrola procesa). Podaci su uglavnom organizovani na takav


19

način da jedan pravac matrice odgovara opservacijama/uzorcima, dok druga dva pravca

odgovaraju varijablama. Kada se izračunaju loading matrice prethodno fitovanog

modela može se pristupiti izračunavanju score-ova novih uzoraka.

2.3.1 Tehnike optimizacije

Postoji više načina za procenu odnosno kalkulaciju parametara modela. Traženje

parametara je optimizacioni problem i u nekim slučajevima rešenje direktnog

izračunavanja može postojati. Ukoliko to nije slučaj mora se koristiti iterativni

algoritam. Dva alata koji se najviše koriste za fitovanje modela kod višedimenzionalne

analize su rešenja na osnovu naizmenično najmanjih kvadrata (eng. alternating least

square – ALS) i svojstvene vrednosti (eng. eigenvalue).

Uzmimo u razmatranje dvodimenzionalni problem fitovanja bilinearnog modela ranga R

za datu matricu X (I × J). Dakle, parametri A (I × R) i B (J × R) se dobijaju tražeći

rešenje najmanjeg kvadrata

min𝐀,𝐁

‖𝐗 − 𝐀𝐁′‖2 (1.25)

Idealan slučaj predstavlja situaciju kada postoji direktno rešenje zatvorene forme. U tom

slučaju kompleksnost algoritma proračuna je unapred poznata i sam algoritam je lakši

za optimizaciju. Ukoliko takvo rešenje nije dostupno za dati slučaj onda se moraju

koristiti iterativni algoritmi. Oni rade po principu postepenog poboljšavanja trenutne

procene parametara sve dok ne dođu do momenta kada dalje poboljšanje više nije

moguće. Loša strana ovog pristupa se ogleda u tome što kompleksnost može da varira

od situacije do situacije [Gill et al. 1981].

Za prethodno predstavljeni dvodimenzionalni problem, dekompozicija singularnom

vrednošću matrice X ili dekompozicija svojstvenom vrednošću matrice X'X može dati

direktno rešenje. Kada je trodimenzionalni problem u pitanju slična rešenja takođe

postoje, ali za razliku od dvodimenzionalnog problema gde se dobija rešenje najmanjih

kvadrata, u ovom slučaju se dobija uglavnom aproksimativno rešenje.


20

Iterativni algoritmi takođe postoje za fitovanje bilinearnog modela iz jednačine (1.25).

Opšte poznati iterativni algoritam za fitovanje prethodno prikazanog modela su

nelinearna iterativna metoda parcijalno najmanjih kvadrata (eng. Non-linear iterative

partial least squares - NIPALS) ili nelinearna iterativna metoda najmanjih kvadrata (eng.

Non-linear iterative least square – NILES) koje je razvio Wold [Wold 1966, Wold

1975]. NIPALS algoritam je baziran na principima naizmenično najmanjih kvadrata.

Kod naizmenično najmanjih kvadrata parametri se dele na nekoliko setova. Svaki set

parametara se uslovno računa korišćenjem najmanjih kvadrata na osnovu trenutnih

vrednosti ostalih parametara. Računanje odnosno procena parametara se iterativno

ponavlja sve do trenutka kada više nema greške. Razlog deljenja parametara u više

grupa je mogućnost korišćenja jednostavnijih algoritama za procenu parametara.

Uzmimo u obzir bilinearni model

�̂� = 𝐀𝐁′ (1.26)

Ako je poznata inicijalna procena A, označena sa �̃�, onda se procena B na osnovu �̃�

svodi na regresioni problem sa sledećim rešenjem

�̃� = 𝐗′(�̃�+)′ (1.27)

Jednačina (1.27) ne rešava celokupni problem, ali poboljšava bilo koju trenutnu procenu

parametra B. Nova i bolja procena A sa datim �̃� se zatim može odrediti sledećom

jednačinom

�̃� = 𝐗(�̃�+)′ (1.28)

na osnovu čega se dalje može dobiti bolja procena B itd. Osnovna ideja algoritma

naizmenično najmanjih kvadrata je: redefinisati osnovni problem (1.25) u uglavnom

linearne podprobleme koji su laki za rešavanje. Zatim iterativno rešavati ove probleme

dok ne dođe do konvergencije. Kako su sve procene parametara procene najmanjih

kvadrata, takav algoritam može samo da poboljša fitovanje modela ili da ostane

nepromenjen kad konvergira. Stoga se propratna vrednost funkcije gubitka ne povećava

i u praksi je pokazano da se uglavnom smanjuje. Kako je ovo ograničen problem


21

(funkcija gubitka ne može biti manja od nule), uglavnom je ispraćen konvergiranjem

funkcije. Iako konvergiranje u globalnom minimumu nije zagarantovano, konvergencija

je praktična, privlačna i jedan od razloga sve veće primene naizmenično najmanjih

kvadrata [de Leeuw et al. 1976]. Još jedna od prednosti algoritma naizmenično

najmanjih kvadrata je jednostavnost proračuna sa podeljenim grupama nasuprot

algoritmu koji simultano radi na kompletnom problemu. Takođe, postoji puno dostupnih

varijacija osnovne teorije regresije najmanjih kvadrata za rešavanje problema

ograničenih parametara i nedostajućih vrednosti. Mana ove metode u nekim slučajevima

može biti relativno puno vremena koje je potrebno da algoritam konvergira.

Uzmimo trodimenzionalnu matricu X i generički model

�̂� = 𝐌(𝐀, 𝐁, 𝐂) (1.29)

gde je M model matrice X, u funkciji parametara A, B i C pri čemu su veličine kao i

podaci sadržani u X. Broj setova parametara može da varira od modela do modela. Kod

PARAFAC-a postoje tri matrice, A, B i C, dok kod bilinearnog modela postoje samo

dve matrice. Za procenu parametara modela A, B i C algoritam naizmenično najmanjih

kvadrata može biti formulisan na sledeći način

1. Inicijalizacija parametara

2. �̃� = 𝑎𝑟𝑔𝑚𝑖𝑛S

∥∥𝐗 − 𝐌(𝐒,𝐁, 𝐂)∥∥2

3. �̃� = 𝑎𝑟𝑔𝑚𝑖𝑛T

∥∥𝐗 − 𝐌(�̃�, 𝐓, 𝐂)∥∥2

4. �̃� = 𝑎𝑟𝑔𝑚𝑖𝑛U

∥∥𝐗 − 𝐌(�̃�, �̃�, 𝐔)∥∥2

5. Vraćanje na korak dva dok algoritam ne konvergira

Izraz �̃� = 𝑎𝑟𝑔𝑚𝑖𝑛S

∥∥𝐗 − 𝐌(𝐒,𝐁, 𝐂)∥∥2 pokazuje da argument S, pri tom minimizirajući

funkciju gubitka ∥∥𝐗 − 𝐌(𝐒,𝐁, 𝐂)∥∥2, daje optimalno ažuriranje matrice A. U

prethodnom primeru sa bilinearnim modelom M(A, B) = AB', ažuriranje parametara

dato jednačinama (1.27) i (1.28) obezbeđuje neophodne korake u algoritmu

naizmenično najmanjih kvadrata.


22

Inicijalizacija parametara i provera da li je algoritam konvergirao će dalje biti detaljno

opisana za PARAFAC model.

2.3.2 PARAFAC algoritam naizmenično najmanjih kvadrata

Algoritmi za PARAFAC model se najčešće baziraju na metodi naizmenično najmanjih

kvadrata. Prednost ove metode je što je jednostavna za implementaciju, lako se

inkorporiraju ograničenja modela i garantuje konvergenciju. Međutim, nekad ume da

bude i spora.

Opšti trodimenzionalni PARAFAC model je definisan na sledeći način

𝐗(𝐼×𝐽𝐾) = 𝐀(𝐂 ⊙ 𝐁)′ + 𝐄 (1.30)

dok je odgovarajuća funkcija gubitka najmanjih kvadrata data sa

𝑚𝑖𝑛𝐀,𝐁,𝐂

∥∥𝐗 − 𝐀(𝐂 ⊙ 𝐁)′∥∥2 (1.31)

U cilju fitovanja modela uz primenu naizmenično najmanjih kvadrata neophodno je

ažurirati A uz dato B i C; B uz dato A i C; C uz dato A i B. Zbog simetrije samog

modela, ažuriranje jednog moda (pravca), na primer A, u suštini je isto ažuriranju za

bilo koji pravac samo što se uloge različitih loading matrica menjaju. Za procenu A,

uslovljene sa B i C, može se formulisati sledeći optimizacioni problem

𝑚𝑖𝑛𝐀

∥∥𝐗 − 𝐀𝐙′∥∥2 (1.32)

pri čemu je Z jednako C ⊙ B(=[D1B' D2B' ... DkB']') dok dijagonalna matrica Dk sadrži

k-ti red C matrice na svojoj dijagonali. Model u obliku dvodimenzionalne matrice, koja

je matematički ekvivalent trodimenzionalnoj matrici, predstavlja bilinearan model za A

i Z (= C ⊙ B). Stoga, nalaženje optimalnog A se svodi na regresioni korak gde se vrši

regresija podataka na C ⊙ B. To znači da za dato B i C, problem se svodi na

dvodimenzionalni problem pronalaženja najmanjih kvadrata optimalnog A u modelu X

= AZ' + E. Rešenje ovog problema, kada Z ima puni rang kolona, jednostavno sledi


23

𝐀 = 𝐗(𝐙′)+ = 𝐗𝐙(𝐙′𝐙)−𝟏 (1.33)

Zbog simetrije problema sledi da B i C mogu biti ažurirani na sličan način. Iz datih

jednačina može se formulisati sledeći algoritam za matricu X dimenzije I × J × K sa

traženom dimenzijom R.

1. Inicijalizacija B i C

2. Z = (C ⊙ B)

A = X(I x JK)Z(Z'Z)-1

3. Z = (C ⊙ A)

B = X(J x IK)Z(Z'Z)-1

4. Z = (B ⊙ A)

C = X(K x JI)Z(Z'Z)-1

5. Vraćanje na korak 1 dok relativna promena u fitu modela nije dovoljno mala

Računanje Z u konkretno prethodnom problemu može da bude jako "skupo" u smislu

izračunavanja za velike matrice. Takođe, matrica sa podacima mora konstantno da se

preuređuje ili da se čuva u tri verzije (X(I x JK), X(J x IK) i X(K x JI)) što zahteva jako veliku

memoriju. Harshman i Carroll i Chang [Carroll & Chang 1970, Harshman 1970] su

primetili da je jednostavnija šema ažuriranja moguća zbog same strukture problema.

Algoritam može biti formulisan u funkciji frontalnih slice-ova, Xk, što ne zahteva

preuređivanje matrica. Algoritam proračunava male matrice XZ i Z'Z direktno iz B, C i

X. Ovo je zgodno jer je "jeftinije" za izračunavanje i zahteva manje memorije. Za

ažuriranje matrice A, matrica X (I × JK) je jednaka [X1 X2 ...XK]. Iz toga sledi

XZ = [X1 X2 ...XK] [D1B' D2B' ... DKB']'

= X1 BD1 + X2 BD2 + ··· + XK BDK

(1.34)

i dalje sledi iz osobina Khatri-Rao proizvoda

Z'Z = (C ⊙ B)' (C ⊙ B) = (C'C)*(B'B) (1.35)


24

Stoga, ažuriranje A se može napisati na sledeći način

𝐀 = 𝐗𝐙(𝐙′𝐙)−1 = (∑ 𝐗𝑘

𝐾

𝑘=1

𝐁𝐃𝑘) {(𝐂′𝐂) ∗ (𝐁′𝐁)}−1 (1.36)

Za druga dva moda, slične prečice algoritma mogu biti razvijene i uobičajeno je da se

sva tri podproblema izraze uz pomoć frontalnih slice-ova matrice X na način kao što je

prethodno bilo prikazano [Kiers & Krijnen 1991]. Efikasniji algoritam za PARAFAC

model je dat u daljem tekstu. Ovaj algoritam je manje očigledan od prethodnog, ali je

efikasniji po pitanju računanja. Tri koraka za ažuriranje svakog moda nisu identična.

Razlog ovom očiglednom odsustvu simetrije algoritma je taj što su sva ažuriranja

bazirana na frontalnim slice-ovima podataka (Xk). Sam model je i dalje simetričan i

ekvivalentan modelu iz prethodnog algoritma.

Algoritam za matricu X dimenzije I × J × K sa traženom dimenzijom R, uz korišćenje

frontalnih slice-ova

1. Inicijalizacija B i C

2. 𝐀 = (∑ 𝐗𝑘𝐾𝑘=1 𝐁𝐃𝑘){(𝐂

′𝐂) ∗ (𝐁′𝐁)}−1

3. 𝐁 = (∑ 𝐗𝐾𝑘=1 ′𝑘𝐀𝐃𝑘){(𝐂

′𝐂) ∗ (𝐀′𝐀)}−𝟏

4. 𝒅𝑘 = {(𝐁′𝐁) ∗ (𝐀′𝐀)}−1{(𝐀′𝐗𝑘𝐁 ∗ 𝐈)}𝟏, 𝑘 = 1, . . . , 𝐾

5. Vraćanje na korak 2 sve dok relativna promena u fitu modela nije dovoljno mala

U koraku četiri, dk je k-ti red matrice C, I je matrica identiteta dimenzije R×R, a 1 je

vektor dimenzije R sačinjen od jedinica. Izraz {(𝐀′𝐗𝑘𝐁 ∗ 𝐈)}𝟏 predstavlja vektor sa R

kolona čiji su članovi matrice dijagonala matrice dobijene izrazom 𝐀′𝐗𝑘𝐁.

Teorijski, konvergencija u fitu modela ne znači neophodno da je došlo i do

konvergencije parametara, ali u praksi je to uglavnom slučaj. Uzimajući to u obzir,

kriterijum za zaustavljanje algoritma je uglavnom mala relativna promena u fitu modela.

Na primer algoritam može da se zaustavi ukoliko je poboljšanje u fitu modela između


25

dve iteracije manja od 0.0001%. Pri modeliraju jako velikih matrica sam proračun može

dosta dugo da traje ukoliko se računa fitovanje modela posle svake iteracije. Ako je

algoritam monotono konvergentan, poput algoritma naizmenično najmanjih kvadrata,

onda je moguće koristiti druge jednostavnije mere konvergencije algoritma. Jedan od

primera takvih mera konvergencije jeste praćenje relativne promene parametara umesto

samog modela. Iako ova promena nije ekvivalent promeni u fitu modela, ona će

konvergirati simultano sa fitom i samim tim mala promena u parametrima će ukazivati

na konvergenciju [Mitchell & Burdick 1994]. Ukoliko su podaci takvi da rešenje ima

dvofaktorsku degeneraciju, odnosno procena parametara nikada ne konvergira iako fit

konvergira, onda se ručno unosi određen broj iteracija jer bi u suprotnom algoritam

imao beskonačan broj iteracija.

2.3.3 Inicijalizacija PARAFAC – ALS

Kao i sa bilo kojom optimizacijom, dobre početne procene parametara mogu da ubrzaju

PARAFAC – ALS algoritam i da umanje rizik konvergiranja u lokalnom minimumu.

Dobra procena se karakteriše kao ona koja direktnije dovodi do globalnog minimuma.

Nasumična inicijalizacija ne daje uvek dobru prvu procenu [Burdick et al. 1990,

Harshman & Lundy 1984, Li & Gemperline 1993, Sanchez & Kowalski 1990]. Kod

težih slučajeva mogu se javiti dva problema ako inicijalizacija PARAFAC – ALS

algoritma nije adekvatna: algoritam daje rešenje u lokalnom minimumu ili proračun

zahteva puno vremena. Oba pomenuta problema se najčešće javljaju u dva slučaja: kada

su neki loading vektori visoko korelisani i kada model nije u potpunosti identifikovan.

U prvom slučaju to dovodi do situacije da su regresioni problemi koji se rešavaju tokom

iterativnog fitovanja loše uslovljeni. Ovo dovodi do situacije da se fitovanje modela

jako sporo odvija. U drugom slučaju neidentifikovani modeli se pojavljuju kada k-rang

uslov nije zadovoljen (jednačina (1.24)). Do ovoga može doći ukoliko neki parametar

(supstanca) u novom nepoznatom uzorku nije identifikovan, odnosno ako ga nema u

uzorcima na osnovu kojih je model građen. Čak i u ovom slučaju je moguće izgraditi

model, ali je proračun vremenski zahtevan jer je orijentacija nekih loading vektora

proizvoljna.


26

Rešenje prethodno navedenih problema, osim u slučaju degeneracije, jeste korišćenje

što bolje inicijalizacije koja se drugačije naziva racionalni start. PARAFAC racionalni

start se uglavnom bazira na približnom rešenju dobijenom direktnom trilinearnom

dekompozicijom. Racionalni start ima tu prednost da je najčešće vrlo blizu pravog

rešenja što štedi puno vremena za proračun. Problem sa racionalnim startom je procena

da li dobijeno rešenje konvergira u globalnom minimumu, jer ukoliko se fituje više puta

iz iste početne pozicije uvek će se po definiciji dobiti identični parametri. Sličan pristup

racionalnom startu je polu racionalni start. On se uglavnom bazira na singularnim

vektorima. Singularni vektori približno obuhvate pravi podprostor što je dovoljno da se

izbegnu navedeni problemi u mnogo situacija. Iako racionalni i poluracionalni start

uglavnom dobro funkcionišu nekad se može desiti da dovedu do lokalnog minimuma.

Tada postoji treća mogućnost odnosno nasumični start. Ako se koristi više različitih

nasumičnih startova može se videti da li će se negde naći lokalni minimum. Drugim

rečima ako su fitovi svih modela sa nasumičnim startom isti onda je to indikacija da je

algoritam dobro proračunao parametre, a ukoliko to nije slučaj onda ili postoji lokalni

minimum ili je algoritam prerano završio proračun.

2.3.4 Proračun skorova novih uzoraka

Kada je model fitovan i treba da se odrede skorovi novih uzoraka, osnovni problem koji

treba rešiti je višestruki linearni regresioni problem. PARAFAC model je dat

jednačinom

𝐗(𝐼×𝐽𝐾) = 𝐀(𝐂 ⊙ 𝐁)′ + 𝐄 (1.37)

za trodimenzionalnu matricu transformisanu u dvodimenzionalnu. Novi uzorak će biti

definisan matricom Xn dimenzije J × K. Oblikovanjem matrice Xn u skladu sa

prethodnim modelom uvodi se vektor dimenzije 1× JK (vec Xn) pri čemu model novog

uzorka uz korišćenje izračunatih loading-a iz prethodnog modela se može definisati na

sledeći način

(vec 𝐗n)′ = 𝐚′(𝐂 ⊙ 𝐁)′ + 𝐄n (1.38)


27

gde vektor a (R × 1) sadrži skor vrednosti novog uzorka (odgovara jednom redu matrice

A) gde su B i C već proračunati u prethodnom modelu. Na slici 2.7 je dat grafički

prikaz modela novog uzorka.

Slika 2.7 – Grafički prikaz modela novog uzorka.

Kada se prvi mod modela odnosi na uzorke onda je procena skorova uzorka, čiji se

podaci nalaze u matrici Xn ( J × K), definisana u obliku problema najmanjih kvadrata na

sledeći način

𝑚𝑖𝑛𝐚

∥∥vec 𝐗n − (𝐂 ⊙ 𝐁)𝐚∥∥2 (1.39)

gde su B i C dati prethodno izračunatim modelom. Dakle a se može definisati na sledeći

način

𝐚 = (𝐂 ⊙ 𝐁)+vec 𝐗n (1.40)


28

Slični izrazi se mogu izvesti ukoliko se traže parametri drugog ili trećeg moda (pri čemu

treba uzeti u obzir da se podrazumeva da su druga dva moda nepromenljiva za sve

uzorke).

2.3.5 Tretiranje matrica kojima nedostaju podaci

Prvo treba shvatiti da se podaci koji nedostaju u matrici ne mogu kompenzovati, ali

ukoliko su podaci suvišni to onda ne predstavlja problem za analizu. Ukoliko se sve

vrednosti podese na vrednost nula to može dovesti do netačnih rezultata. Razmišljanje

koje je pogrešno jeste da vrednost nula kojom se menjaju podaci koji nedostaju znači

„ništa“ i da ne utiče na rezultat modela. Kod modeliranja to nije slučaj. Kao primer

uzmimo u obzir situaciju predstavljenu na slici 2.8.

Slika 2.8 – Primer spektara sa svim podacima i u slučaju kada podaci nedostaju.

Na slici 2.8 u prvom slučaju imamo matricu koja ima sve podatke i u tom slučaju to

predstavlja problem sa jednim komponentom jer postoji samo jedan spektralni fenomen.

U drugom slučaju je dat isti spektar, ali kod njega fale podaci kod spektra manjeg

inteziteta. U principu i u ovom slučaju to mora biti problem sa jednom komponentom.

Međutim, vrednosti koje nedostaju su bile zamenjene nulom i očigledno je da je

nemoguće modelirati podatke sa vrednostima nula jednokomponentnim modelom.

Najbolji način za modeliranje matrica kojima nedostaju podaci jeste pravljenje modela

samo na osnovu podataka koji postoje, a to znači da se vrši optimizacija funkcije


29

gubitka za podatke koji postoje. Stoga se funkcija gubitka za bilo koji model

nekompletnih podataka može opisati na sledeći način

𝑚𝑖𝑛𝐌

∥∥𝐖 ∗ (𝐗 − 𝐌)∥∥2 (1.41)

gde matrica X sadrži podatke, M je model, a ∗ označava Hadamardov (pojedinačno

element po element matrice) proizvod. Struktura i ograničenja matrice M su definisani

određenim modelom, na primer AB’ u slučaju bilinearnog modela. Matrica W sadrži

težinske faktore koji imaju vrednost ili jedan ukoliko odgovara elementu početne

matrice koji postoji, ili nula ukoliko odgovara elementu početne matrice koji nedostaje.

Logičan način modeliranja podataka koji nedostaju je uz primenu težinske regresije sa

težinskim faktorima u obliku binarne matrice [Kiers 1997, Paatero 1997]. Ovaj pristup

funkcioniše za sve modele koji imaju dobro definisane celokupne kriterijume

optimizacije, kao što je slučaj kod PARAFAC modela.

2.3.6 Uslovljavanje nenegativnosti

Prethodno opisan algoritam dozvoljava da loading matrice sadrže i pozitivne i negativne

vrednosti. To je matematički korektno, ali nije uvek u skladu sa prethodnim znanjem

vezanim za merene uzorke. Nekada predznanje o uzorku uslovljava “nenegativnost” za

neke modove modela, na primer koncentracije ne mogu imati negativne vrednosti, kao

što ni pravilno izmereni spektri uglavnom ne mogu biti negativni. Ovo je vrlo bitna

informacija koja se može nekad uneti direktno u algoritam. Samim tim se može reći da

fitovanje modela kojem je uslovljena nenegativnost za određene modove može biti jako

praktično u nekim slučajevima. Takođe, Lawton i Sylvestre [Lawton & Sylvestre 1971]

su pretpostavili da korišćenje nenegativnosti bitno umanjuje prostor u kome treba

izračunati parametre.

Nenegativnost je manje ograničen problem, gde je svaki parametar ograničen samo time

da ima vrednost veću ili jednaku nuli. Takav problem se može efikasno rešiti


30

algoritmom aktivnog seta [Gill et al. 1980]. Dalje će biti detaljno objašnjeno na koji

način se taj algoritam implementira u algoritam naizmenično najmanjih kvadrata.

Uzmimo u obzir PARAFAC model matrice X veličine I × J × K. Model se najčešće

fituje minimiziranjem funkcije gubitka


∥∥𝐗 − 𝐀(𝐂 ⊙ 𝐁)′∥∥2 (1.42)

Ukoliko je prethodno poznato da parametri modela moraju biti nenegativni (na primer

ukoliko predstavljaju relativnu koncentraciju), onda je moguće fitovati ograničenu

verziju tog modela gde je uslovljena nenegativnost. Ovaj problem se može definisati na

sledeći način


∥∥𝐗 − 𝐀(𝐂 ⊙ 𝐁)′∥∥2 𝑎𝑖𝑟 ≥ 0, 𝑏𝑗𝑟 ≥ 0, 𝑐𝑘𝑟 ≥ 0 𝑧𝑎 i = 1,...,I ; j =

1,...,J ; k = 1,...,K ; r = 1,...,R.

(1.43)

Elementi 𝑎𝑖𝑟 predstavljaju elemente loading matrice A prvog moda veličine I × R, dok

su 𝑏𝑗𝑟 i 𝑐𝑘𝑟 elementi matrice B i C, respektivno. Razlika između neuslovljenog i

uslovljenog problema je samo ograničenje da svi parametri moraju biti nenegativni.

Algoritam za fitovanje modela može biti podeljen uz primenu naizmenično najmanjih

kvadrata vrlo slično kao i kod neuslovljenog modela. Loading matrice A, B i C se

ažuriraju iterativno dok su drugi parametri fiksni. Ažuriranje na primer parametara

prvog moda je predstavljeno sledećom jednačinom

𝑚𝑖𝑛𝐀

∥∥𝐗 − 𝐀(𝐂 ⊙ 𝐁)′∥∥2 𝑎𝑖𝑟 ≥ 0 𝑧𝑎 𝑖 = 1, . . . , 𝐼 ; 𝑟 = 1, . . . , 𝑅. (1.44)

Pošto je ažuriranje parametara za dato i (dati red matrice A) nezavisno od drugih

parametara u matrici A, onda se svaki red može odvojeno ažurirati dajući globalno

rešenje najmanjih kvadrata za jednačinu (1.44). Stoga, umesto razmatranja problema

datog jednačinom (1.44) dovoljno je razmatrati sledeći problem


31

𝑚𝑖𝑛𝐚𝒊

∥∥vec 𝐗𝑖 − (𝐂 ⊙ 𝐁)𝐚𝑖∥∥2 𝑎𝑖𝑟 ≥ 0 𝑧𝑎 𝑓 = 1, . . . , 𝐹. (1.45)

gde je vec Xi i-ti horizontalni slice (uzorak i) reorganizovan u vektor. Vektor ai sadrži

parametre u i-tom redu matrice A. Rešavanjem ovog problema za sve vrednosti i (i =

1,...,I) dobija se ažuriranje najmanjim kvadratima za matricu A. Ovaj problem je

ekvivalentan problemu standardne višestruke linearne regresije i predstavlja osnovu

jednog od najviše korišćenih algoritama za izračunavanje parametara ograničenih

nenegativnošću.

2.3.7 Validacija i dijagnostika PARAFAC modela

Analiza podataka je često bazirana na evaluaciji fitovanih modela. Ovi modeli nam daju

aproksimaciju i interpolaciju realnih sistema koji se posmatraju. Često postoji veliki

izbor modela i njihov kvalitet zavisi od raznih faktora. Razlog tome je taj što

matematički i statistički modeli koji se baziraju na realnim podacima imaju

karakteristike koje zavise ne samo od samog sistema koji se posmatra već i od

uzorkovanja, karakteristika modela, algoritma itd. Validacija modela se može posmatrati

kao analize gde se ispituje da li se iz modela mogu izvesti validni zaključci. Pri

validaciji se proverava na primer da li su varijacije u podacima predstavljene na

najjednostavniji način, da li model efikasno vrši predikcije, da li je na model uticao neki

određeni uzorak ili parametar u smislu da model više opisuje varijacije tog jednog

uzorka ili karakteristike, da li je algoritam konvergirao itd. Harshman [Harshman 1984]

deli validaciju na četiri dela:

teorijska podesnost;

tačnost proračuna;

statistička pouzdanost;

validnost objašnjenja.

Teorijska podesnost modela se odnosi na izbor modela. Da li je posmatrana struktura po

prirodi bilinearna ili trilinearna? Da li je neophodno predprocesiranje ili linearna

transformacija? To su samo neka od pitanja koja su specifična za ovaj deo validacije.


32

Tačnost proračuna se uglavnom bavi problemom da li je algoritam konvergirao u

željenom globalnom minimumu ili neželjenom lokalnom minimumu i zašto je do toga

došlo. Takođe je bitna greška zaokruživanja, kao i reproduktivnost proračuna. To sve

predstavlja probleme algoritma.

Statistička pouzdanost je vezana za podesnost pretpostavke distribucije, stabilnost

rešenja, izbor dimenzionalnosti parametara modela itd. Statističku pouzdanost je često

jako teško kvantifikovati u slučaju analize realnih podataka (zbog malog broja uzoraka

ili lošeg predznanja vezanog za posmatrani sistem).

Validnost objašnjenja se odnosi na procenu koliko model dobro reflektuje stvarni

fenomen koji se istražuje odnosno podesnost modela. Da li ostaci ukazuju da postoji još

sistemske varijacije? Da li rezultati potvrđuju zaključke izvučene iz modela?

Bitan deo validacije je primena dijagnostike za karakterizaciju kvaliteta modela. Većina

dijagnostika modela se mogu grafički prikazati, što ih čini lakšim za istraživanje i

pregled. Harshman [Harshman 1984] deli dijagnostiku na četiri nivoa: nula-fit (eng.

zero-fit) dijagnostika, jedan-fit (eng. one-fit) dijagnostika, mnogo-fit (eng. many-fit)

dijagnostika (jedan set podataka) i mnogo-fit (eng. many-fit) dijagnostika (više setova

podataka).

Zero-fit dijagnostike su one vezane za podatke pre nego što je model bio fitovan. One

podrazumevaju proveru očiglednih outlier-a (uzoraka koji se na neki način izdvajaju od

grupe merenih uzoraka) i pouzdanosti podataka.

One-fit dijagnostike su one koje se koriste za fitovanje određenog modela i koje su

korisne za validaciju tog modela. Pri tome se proverava statistička doslednost modela.

Dijagnostike se mogu podeliti na one koje se odnose na parametre i one koje se bave

ostacima.

Many-fit dijagnostike (jedan set podataka) su korisne za poređenje ili procenu modela sa

različitim početnim uslovima ili različite forme modela. I u ovom slučaju se one mogu

podeliti na dijagnostike parametara i dijagnostike ostataka.

Many-fit dijagnostike (više setova podataka) se koriste kada imamo više setova

podataka koji opisuju isti problem ili kada je set toliko veliki da se može podeliti na više

manjih setova podataka. U prvom slučaju je moguće primeniti test-set validaciju, dok u


33

drugom slučaju se može koristiti unakrsna validacija, raspolovljena (eng. split-half)

analiza itd.

Svi prethodno opisani delovi validacije i dijagnostike u praksi se svode na rešavanje tri

specifična problema:

unakrsna validacija i test-set validacija;

odabir broja komponenti modela;

analiza uticaja i ostataka.

2.3.8 Test-set i unakrsna validacija

Test-set i unakrsna validacija predstavljaju standardne metode koje se koriste u različite

svrhe pri validaciji. One nam omogućavaju da dobijemo realnije ostatke modela od onih

koji su dobijeni pri proračunu modela. Stoga su test-set i unakrsna validacija veoma

korisne kada se ostaci koriste za određivanje outlier-a, za dobijanje procenta objašnjene

varijacije u modelu itd. U nekim slučajevima ostaci modela umeju da budu različiti od

ostataka koji će se dobiti kada se model primeni na nove podatke, iz čega se može

zaključiti da ponekad struktura i veličina ostataka modela mogu dovesti do pogrešnih

zaključaka i rezultata. Test-set i unakrsna validacija mogu da umanje ovaj problem

pružajući ostatke koji tačnije reflektuju ostatke koje je moguće dobiti na novim

podacima. Ostaci dobijeni na taj način se dalje mogu koristiti za više stvari: određivanje

broja komponenata modela, procenjivanje predikcione sposobnosti modela,

upoređivanje unakrsno validiranih i fitovanih ostataka radi utvrđivanja optimalnosti

modela i analiza ostataka. Može se zaključiti da validirani ostaci daju objektivniju

informaciju u pogledu buduće primene modela.

Test-set validacija podrazumeva fitovanje trenutnog modela na osnovu novih podataka.

Ostaci se zatim dobijaju jednostavnim oduzimanjem modela novih podataka od

početnih podataka. Ova validacija simulira buduću primenu ovog modela u praksi na

novim podacima. Ukoliko je test set dobijen nezavisno od kalibracionih podataka onda

je test set validacija definitivna validacija modela jer se novi podaci mogu posmatrati


34

kao izvučeni set uzoraka iz populacije uzoraka nekih budućih merenja. Bitno je takođe

napomenuti da mali broj test uzoraka može da da nepouzdane rezultate.

Jedan od problema koji se javljaju kod test-set validacije u praksi je taj da dobijeni

ostaci nisu nezavisni od podataka korišćenih za fitovanje modela. Uzmimo jednostavan

primer dvodimenzionalnog PCA modela. Ukoliko je loading matrica P (J × R) dobijena

modeliranjem kalibracionog seta podataka dok se PCA model testira test set uzorcima

ili izostavljenim uzorcima tokom unakrsne validacije, onda se ostaci dobijaju tako što se

prvo računaju skorovi za nove podatke Xtest na sledeći način

𝐓test = 𝐗test𝐏 (1.46)

sa pretpostavkom da je Xtest bio na pravi način predprocesiran (slično kalibracionim

podacima). Zbir kvadrata ostatka za test set je dat sledećom jednačinom

‖𝐗test − �̂�‖2

= ‖𝐗test − 𝐓test𝐏′‖2 = ‖𝐗test − 𝐗test𝐏𝐏′‖2 (1.47)

Može se jasno videti da vrednosti modela (𝐗test𝐏𝐏′) nisu nezavisne od podataka

(𝐗test) i samim tim „overfitovanje“ može bit problem čak i za test set podataka. Stoga

da bi se poredili različiti modeli na osnovu zbira kvadrata računatog na ovaj način,

neophodno je uneti neke korekcije stepena slobode [Martens & Næs 1989]. Kako oni

nisu jednostavni za definisanje, pogotovo za višedimenzionalne modele, najčešće se

koriste umerene aproksimacije.

Alternativa test-set validacije je unakrsna validacija. Unakrsna validacija se može

posmatrati kao simulacija test-set validacije gde se test-set validacija ponavlja koristeći

svaki put drugačije uzorke ili parametre u test setu. U skladu sa tim, unakrsna validacija

je posebno korisna ukoliko je broj uzoraka ograničen. Takođe određene vrste unakrsne

validacije su korisne za validaciju modela jer prethodno pomenuti problem zavisnih

ostataka je eliminisam samom konstrukcijom unakrsne validacije.


35

Unakrsna validacija predstavlja metodu internog odabira uzorka za testiranje i za

kalibraciju. Osnovna ideja unakrsne validacije je vrlo jednostavna i sastoji se iz pet

koraka:

1) Izostaviti jedan deo podataka (uzoraka).

2) Izgraditi model bez tih podataka.

3) Koristiti dobijeni model za predikciju parametara izostavljenih uzoraka.

4) Izračunati odgovarajuću grešku ostatka.

5) Ponoviti ovu proceduru tako da svaki uzorak bude jednom izostavljen i sumirati

sve kvadratne greške predikcije (eng. Predicted residual sum of squares –

PRESS).

U slučaju kada se unakrsna validacija koristi za određivanje broja komponenti modela,

bira se broj komponenti za koji je vrednost PRESS-a najmanja. U praksi, minimalne

PRESS vrednosti nisu uvek prisutne ili je ponekad minimum samo malo bolji od

jednostavnijeg modela. U takvim slučajevima je mnogo teže odrediti broj komponenata

i tada se dodatno moraju uzeti u obzir: predznanje o sistemu, drugi rezultati modela i

celokupni cilj analize. Kada treba izabrati koje vrednosti (uzorke) treba izostaviti pri

validaciji, treba imati u vidu da će različiti pristupi dovesti do različitih rezultata. Na

primer ukoliko se izostave samo replikati dobiće se greška ponovljivosti, a ukoliko se

izostave uzorci iz novog eksperimenta iz druge laboratorije dobiće se greška

reproduktivnosti.

PRESS se koristi za dobijanje procene varijanse ili kao pomoć pri odabiru broja

komponenata modela. PRESS će biti u sledećem obliku

PRESS = ∑(𝑦𝑖 − �̂�(𝑖))2

𝐼

𝑖=1

(1.48)

gde član �̂�(𝑖) je predikcija od 𝑦𝑖 uz korišćenje modela koji je izgrađen bez korišćenja i-

tog objekta pri proceni modela. Ovaj objekat može biti i segment nekoliko individualnih

objekata što se tada naziva segmentna unakrsna validacija. Daljim proširivanjem ove


36

segmentacije, segmenti mogu biti nezavisni test setovi, u tom slučaju unakrsna

validacija će dati rezultate slične rezultatima test-set validacije.

2.3.9 Odabir broja komponenti modela

Jedna od najbitnijih stavki kod PARAFAC analize jeste odabir odgovarajućeg broja

komponenti modela. Odgovarajuća dimenzionalnost modela nije samo funkcija

podataka već i funkcija konteksta i cilja same analize. Stoga, prikladan PARAFAC

model za ispitivanje seta podataka može da ima broj komponenata različit od

PARAFAC modela čiji se skorovi kasnije koriste za regresioni model.

Postoje razni alati koji se koriste za odabir broja komponenata. Neki se baziraju na

statističkim pretpostavkama i testiranju značajnosti, dok se neki baziraju na empirijskim

pravilima. Generalno se ne treba oslanjati na samo jedno pravilo za određivanje

dimenzionalnosti. Svako pravilo ima svoje uslove i nijedni realni podaci neće ispuniti u

potpunosti sve njih. Za određivanje broja komponenata se najčešće koriste sledeći alati:

grafik svojstvenih vrednosti faktora (eng. scree plot), split-half analiza, unakrsna

validacija i vizuelna provera ostataka. Takođe predznanje o fenomenu koji se krije u

podacima često može pomoći pri proceni modela.

2.3.10 Grafik svojstvenih vrednosti faktora

U daljem tekstu biće opisano na koji način se grafik svojstvenih vrednosti faktora koristi

za određivanje broja komponenata. Radi jednostavnosti objašnjenja biće opisano na koji

način se ovom metodom određuje broj komponenata PCA modela, a zatim će biti

prikazano na koji način se to modifikuje za PARAFAC model.

Najčešće korišćena analiza za određivanje broja komponenata PCA modela jeste grafik

svojstvenih vrednosti faktora [Cattell 1966]. Grafik daje svojstvene vrednosti unakrsnog

proizvoda matrica sortiranih po veličini u funkciji broja komponenata. Prva svojstvena

vrednost je jednaka zbiru kvadrata objašnjenih prvom komponentom, druga vrednost je

jednaka zbiru kvadrata objašnjenih drugom komponentom itd. Suma svih svojstvenih


37

vrednosti je jednaka tragu unakrsnog proizvoda matrice. Singularne vrednosti dobijene

dekompozicijom singularnom vrednošću podataka takođe mogu biti korišćene umesto

svojstvenih vrednosti. Singularne vrednosti su jednake kvadratnom korenu

odgovarajućih svojstvenih vrednosti. Svojstvene vrednosti se prikazuju na vertikalnoj

osi grafika u funkciji broja komponenata na horizontalnoj osi (slika 2.9). Grafik

svojstvenih vrednosti faktora kod PCA se takođe može prikazati kumulativno jer

svojstvene vrednosti su nezavisne i sabiraju se do 100% zbira kvadrata. Određena

granična vrednost na grafiku se koristi za određivanje komponenata koje su previše

male da bi se koristile. Kada se vrši samo istraživanje podataka dovoljno je da se

izabere granična vrednost od 80% objašnjenih varijacija kod podataka sa šumom, ali

kada je kvantitativna namena u pitanju onda je korisno imati složeniju determinaciju

odgovarajuće granične vrednosti. Uglavnom je broj komponenata odabran na onoj

graničnoj vrednosti gde grafik počinje linearno da opada.

Slika 2.9 – Primer grafika svojstvenih vrednosti faktora.

Sličan grafik se može dobiti i za PARAFAC model prikazivanjem zbira kvadrata

individualnih komponenata. Međutim u ovom slučaju nije moguće napraviti direktno

kumulativni grafik jer varijanse pojedinačnih komponenti nisu aditivne. Može se

zaključiti da ovaj grafik nije direktno koristan za PARAFAC modele. S druge strane,


38

kumulativni grafik za PARAFAC modele može bit konstruisan prikazivanjem

objašnjenih ili ostataka zbira kvadrata za jednokomponentni model, dvokomponentni

model itd. Takav grafik će dati sličnu informaciju kao grafik svojstvenih vrednosti, sa

izuzetkom što će se faktori menjati za svaki model jer PARAFAC nije sekvencijalno

fitovan. Osnovni princip interpretacije grafika ostaje isti: broj komponenata koji će se

koristiti se bira kao broj komponenata kod kojeg pad varijacije ostataka na grafiku

postaje linearan.

2.3.11 Split-half analiza

Kod split-half analize različiti podsetovi podataka se nezavisno analiziraju. Zbog

jedinstvenosti PARAFAC modela, kada je odabran odgovarajuću broj komponenata

moraju se dobiti isti rezultati odnosno isti loadings-i za bilo koji podset podataka istog

sistema. Da bi se ocenilo da li su dva modela ista moraju se obratitit pažnja na

neodređenosti trilinearnog modela koje se mogu javiti: redosled i razmera mogu se

menjati ukoliko nisu fiksirane algoritmom. Ukoliko model ima previše ili premalo

komponenata, parametri modela će se razlikovati kada se model gradi na osnovu

različitih setova podataka. Ukoliko je model stabilan u smislu split-half analize onda je

to očigledna indikacija da je model realan, odnosno da realno oslikava varijacije

sistema, a ne karakteristike samo jednog određenog uzorka. S druge strane ukoliko neke

komponente nisu stabilne, to ukazuje da one ili reflektuju neki šum ili je pretpostavljen

pogrešan broj komponenata. Takav model nije validan.

Kada se radi split-half analiza mora se odlučiti po kom će se modu deliti podaci.

Deljenje se mora vršiti u onom modu gde postoji dovoljan broj razdvojenih

parametara/objekata, na taj način da svaki podset obuhvati ceo domen i da svi parametri

mogu biti izračunati iz individualnih podsetova podataka. Najčešće se u praksi dele

podaci po modu koji oslikava uzorke. Način podele podataka na dva podseta je prikazan

na slici 2.10. Podset A čini prva polovina uzoraka, a B druga polovina. Pošto se slučajno

može dogoditi da jedan od ovih podsetova ne sadrži informaciju o svim latentnim

fenomenima u sistemu, generišu se još dva seta C i D kako bi se osiguralo da se u svim

podsetovima nalaze sve varijacije sistema. Set C čini prvu polovinu uzoraka setova A i


39

B, a D čine druga polovina A i B. Model se računa na osnovu svakog od ovih setova i

ako se rezultati setova A i B ili C i D replikuju, onda je tačnost rezultata na taj način

empirijski potvrđena. U idealnom sličaju treba da se dobiju isti rezultati za A, B, C i D.

Ukoliko to nije ispunjeno, dovoljan je uslov da se dobije isti rezultat samo za jedan par

podsetova (A/B ili C/D) jer je malo verovatno da rezultati budu isti za jedan par ako su

uzorci nezavisni i rešenje nasumično. Razlog dobijanja različitih rezultata za jedan par

podsetova može da bude previše mali broj uzoraka. U tom slučaju se može desiti da nije

moguće podeliti četiri različita seta podataka, a da pri tome svaki od njih sadrži

informaciju o svim bitnim fenomenima sistema.

Slika 2.10 – Primer podele seta uzoraka za split-half analizu.

2.3.12 Analiza ostatka

Svaki trodimenzionalni PARAFAC model se može prestaviti sledećom formulom:

𝐗 = �̂� + 𝐄 (1.49)

Glavni cilj analize jeste dobijanje �̂�, ali ostatak 𝐄 takođe može da da bitne indikacije o

kvalitetu modela. Ono što se normalno očekuje da se nađe u ostatku jeste šum ili neke

distribucije koje su simetričnog oblika, što se može verifikovati grafičkim prikazom

ostataka ili uz primenu dijagnostičkih alata.

Činjenica da je 𝐄 trodimenzionalna matrica veličine I × J × K kao i matrica 𝐗, daje nam

mogućnost da ekstrahujemo podmatrice svakog uzorka ili parametra i da posmatramo i

upoređujemo za svaki od njih zasebno promenu varijacija u ostatku. To je prikazano na


40

slici 2.11. Ove podmatrice se mogu sumirati na različite načine. Prva podmatrica je

sama 𝐄 matrica, dok se zbir kvadrata matrice 𝐄 koristi za grafik svojstvenih vrednosti

faktora, što je prethodno bilo opisano. Matrica 𝐄 takođe se može podeliti na matrice 𝐄𝑖

(i = 1,..., I), 𝐄𝑗 (j = 1,..., J) i 𝐄𝑘 (k = 1,..., K). Ove matrice se mogu ispitivati koristeći

njihov zbir kvadrata, ili ponekad njihove varijanse, standardne devijacije itd. Kao

rezultat zbira kvadrata ovih matrica se dobijaju tri vektora vrednosti sI (I × 1), sJ (J × 1)

i sK (K × 1) gde i-ti element vektora sI predstavlja zbir kvadrata od Ei itd. Ovi vektori se

mogu posmatrati na različite načine, ali ono našta se treba fokusirati jesu outiler-i,

zaostale strukture ili artefakti. Slika 2.12 prikazuje praktičnu interpretaciju takvih

vektora.

Slika 2.11 – Model matrice X i njena odgovarajuća matrica ostatka E i njene

podmatrice.

Ukoliko 𝐗 ima na primer I uzoraka, J talasnih dužina emisije i K talasnih dužina

ekscitacije, ispitivanje sI će indikovati ukoliko postoje outlier-i ili neki trend među

uzorcima. Na isti način se može videti ako postoje outlier-i među talasnim dužinama

emisije i ekscitacije ispitivanjem sJ i sK, respektivno. Kada su spektri u pitanju određeni

diskontinuiteti u nekim delovima vektora sJ i sK ukazuju na neke hemijske ili fizičke

artefakte.

Zbir kvadrata podelemenata od matrice 𝐄 mogu biti izračunati i za redove, kolone i

tube: eij, ejk i eki (slika 2.11). Zbir kvadrata svih redova ejk formira matricu SJK dimenzije


41

(J × K). Kada J i K imaju velike vrednosti, što je slučaj kod fluorescentnih spektara,

neophodno je nacrtati konturni grafik matrice SJK. U tom slučaju se na grafiku mogu

videti površine koje liče na EEM koje predstavljaju zbir kvadrata ostatka za svaki par

talasne dužine ekscitacije i emisije. Ispitivanjem ovog grafika može se videti da li je

neka struktura, koja je bitna za fenomen koji posmatramo, ostala u ostatku i nije

obuhvaćena modelom. Ukoliko model dobro opisuje posmatrani sistem u ovim

graficima ne bi smelo da ima nekih preostalih struktura (pikova).

2.3.13 Predprocesiranje podataka

Pre svakog proračuna PARAFAC modela uglavnom je neophodno pripremiti podatke za

dalju analizu odnosno predprocesirati. Predprocesiranje podrazumeva centriranje

podataka srednjom vrednošću i skaliranje. Centriranje podataka srednjom vrednošću

Slika 2.12 – Različiti

primeri zbira kvadrata

(ZK) ostataka. (A) Zbir

kvadrata preseka koji

odgovaraju objektima

matrice E pokazuju

očekivane varijacije. (B)

U ovom slučaju se

uočava jako veliko

odstupanje kod uzorka

broj 11, što ukazuje na

mogućnost da je taj

uzorak outlier. (C) Na

poslednjem grafiku se

vidi da u ostatku postoji

određeni trend među

uzorcima koji sam model

nije obuhvatio.


42

podrazumeva nalaženje srednje vrednosti matrice i oduzimanje te vrednosti od svih

članova matrice čime se dobija da srednja vrednost matrice bude nula. Na ovaj način se

uklanjaju odstupanja u podacima ukoliko postoje. Skaliranje se vrši u slučaju kada su

parametri različitih mernih jedinica i neophodno je skaliranje kako bi njihov uticaj na

varijacije u modelu bio podjednak. Ukoliko neki parametar ima velike varijacije model

će pretpostaviti da je on najbitniji za opis sistema. Pošto kod fluorescentnih spektara ne

postoje odstupanja u podacima (vrednost nula u spektru znači nula koncetraciju te

supstance) i svi parametri (talasne dužine) su istih mernih jedinica (nanometri) onda

nema potrebe za skaliranjem i centriranjem podataka. Iz tog razloga skaliranje i

centriranje neće biti dalje detaljno objašnjeni.

Jedina neophodna obrada fluorescentnih spektara pre pristupanja PARAFAC analizi

jeste uklanjanje Rejlijevog rasejanja prvog i drugog reda iz razloga što ono ne opisuje

varijacije sistema. Rasejanje se iz spektara uklanja tako što se na mestima u matrici gde

se javlja rasejanje vrednost intenziteta menja vrednošću NaN (eng. Not a Number),

odnosno podešava se da ta vrednost nedostaje, dok se delovi spektra ispod Rejlijevog

rasejanja prvog reda i iznad Rejlijevog rasejanja drugog reda podešavaju na vrednost

nula, ukoliko u tim delovima ne postoje pikovi koji su bitni za model.

2.3.14 Vizuelizacija rezultata

Za predstavljanje rezultata PARAFAC modela mogu se koristiti razni grafički prikazi.

Svi grafici imaju za cilj da pomognu korisniku da interpretira svoje rezultate. Vrsta

grafika koji će se koristiti puno zavisi i od vrste podataka koji se modeliraju i problema

koji treba da se reši. U daljem tekstu će biti opisani grafici koji se koriste za prikaz i

interpretaciju modela na osnovu fluorescentnih spektara.

Stubasti dijagram prikazuje skalarne vrednosti vektora u obliku stubova različitih

dužina. Pozicije stubova ukazuju na poziciju u vektoru. Stubasti dijagrami se koriste za

prikaz zbira kvadrata objašnjenih varijacija za svaku komponentu, prikaz zbira kvadrata

ostataka u funkciji uzoraka itd.


43

Linijski dijagram grafik vektora gde na horizontalnoj osi je data pozicija u vektoru,

često predstavlja kontinualni parametar (npr. spektar), dok je na vertikalnoj osi data

skalarna vrednost u vektoru. Ove tačke mogu biti spojene pravim ili krivim linijama.

Ovakvi dijagrami se koriste za prikaz spektara, ali i za prikaz lodaing vektora dobijenih

na osnovu njih.

Grafik rasutosti (eng. Scatter plot) predstavlja grafički prikaz dva vektora iste veličine

prikazanih jedan nasuprot drugog, pri čemu se skalarne vrednosti vektora koriste kao

koordinate tačaka. Ovakvi grafici se koriste za prikaz dva loading vektora, dva skor

vektora itd. Na njima se mogu jasno uočiti outlier-i, grupisanja i trendovi među

uzorcima.

2.4 Metoda potpornih vektora

Metoda potpornih vektora (eng. Support Vector Machine – SVM) je multivarijantna

tehnika koja se koristi za građenje klasifikacionih i regresionih modela. Prednost ove

metode se ogleda u tome što ne zahteva veliki broj uzoraka za obučavanje modela i nije

osetljiva na prisustvo “outlier”-a [Burges 1998]. Koncept klasifikacije primenom SVM

metode podrazumeva transformaciju početnog prostora podataka u prostor veće

dimenzije kako bi klase bilo moguće linearno razdvojiti. Koristeći početne podatke kao

koordinate uzoraka, SVM pronalazi hiper ravan u transformisanom prostoru koja deli

prostor na taj način da što veći broj uzoraka koji pripadaju istoj klasi budu sa iste strane

ravni pri tome maksimizirajući udaljenost svake klase od hiper ravni. Optimalna hiper

ravan umanjuje rizik pogrešnog klasifikovanja test uzoraka.

Kao što je prethodno navedeno osnovni princip SVM metode je određivanje optimalne

hiper ravni za separaciju, koja maksimizira rastojanje između dve klase u

multidimenzionalnom prostoru.

Pretpostavimo da imamo linerano razdvojiv set podataka S koji se sastoji od m objekata,

gde svaki n-dimenzionalni objekat x je definisan sa n koordinata (x = (x1, x2, …, xn),


44

gde je svako xi realan broj). Bilo koja hiper ravan u S prostoru može biti opisana na

sledeći način

,,,}0{ RbSbS wxwx (1.50)

gde je proizvod definisan izrazom

n

i

ii xw1

.xw (1.51)

Uzimimo da svaki objekat xj, j = (1, 2, ..., m), pripada klasi }1,1{ jy , zadatak je u

tom slučaju naći hiper ravan koja deli prostor S na takav način da svi objekti koji

pripadaju različitim klasama leže u prostoru sa različitih strana hiper ravni. Drugim

rečima, treba naći par (w, b) koja zadovoljava sledeću jednačinu

,1)( by ii xw (1.52)

za svako i=1 do n. Tada jednačina hiper ravni koja razdvaja objekte (slika 2.13) postaje

.0 bxw (1.53)

U slučaju kada su klase linearno razdvojive, što je trenutna pretpostavka, postoji bar

jedna ili više hiper ravni (w, b) koje zadovoljavaju prethodni uslov. Svaka takva hiper

ravan predstavlja klasifikator koji tačno razdvaja sve objekte. Među njima SVM

pokušava da nađe jedan objekat koji ima najveće rastojanje od najbliže tačke ravni i na

taj način maksimizira odstojanje između klasa za bolju generalizaciju modela. Ova vrsta

hiper ravni se naziva optimalna separatišuća hiper ravan (eng. optimal separating

hyperplane – OSH).


45

Slika 2.13 – (a) Optimalna separatišućs hiper ravan; (b) Mapiranje linearno nerazdvojivih

podataka u prostor veće dimenzionalnosti omogućava njihovo linerno razdvajanje.

Ako uzmemo u obzir da odstojanje između objekata različitih klasa je 2/‖𝐰‖, drugi

zadatak je da se među svim mogućim hiper ravnima nađe jedna koja ima najveću

vrednost 2/‖𝐰‖, što je ekvivalentno minimumu ‖𝐰‖2/2. Time problem optimizacije

postaje

min

‖𝐰‖2

2 (1.54)

sa ograničenjem

.,,1,01)( miby ii xw (1.55)

što predstavlja minimizaciju kvadratne funkcije sa uslovljenom linearnošću.

Ovaj problem može biti rešen korišćenjem klasične metode Lagranžovih množioca u

formulaciji dualnog problema:

,

2

1),,(max

1 1 1

m

i

m

i

m

j

jijijii yybL xxw (1.56)

sa ograničenjem


46

m

i

ii y1

,0 (1.57)

gde su Λ = (𝜆1, 𝜆2, … , 𝜆𝑚) Lagranžovi množioci, 𝜆𝑖 ≥ 0, i predstavljaju rešenje

optimizacionog problema. Objekti SVM modela koji imaju 𝜆𝑖 > 0 predstavljaju

potporne vektore, dok objekti koji imaju 𝜆𝑖 = 0 nisu bitni i ne doprinose SVM modelu.

Parametri (wo, bo) OSH-a se mogu izračunati na sledeći način

m

i

Ns

i

iiiiiio yy1 1

.sxw (1.58)

i bo predstavlja srednju vrednost dobijenih vrednosti b za sve objekte potpornih vektora

.

1 1

m

i

Ns

i

jiiijjiiij yyyyb xsxx (1.59)

Ovde, s predstavlja potporne vektore, a Ns je njihov broj.

Bilo koji novi objekat može biti klasifikovan uz primenu izraza .bo xw Međutim,

takođe je moguće klasifikovati objekte bez računanja wo. U ovom slučaju mogu se

koristiti potporni vektori iz seta za obučavanje i odgovarajući Lagranžovi množioci za

pronalaženje funkcije odluke f(xnov) za klasifikaciju novog objekta xnov:

.sgnsgn)(

11

Ns

i

noviii

m

i

noviiinov bybyf xsxxx (1.60)

Većina objekata u setu podataka nisu linerno razdvojivi. U tom slučaju neophodno je

mapirati podatke u neki drugi prostor skalarnog proizvoda veće dimenzionalnosti

koristeći funkciju (x), :SF, tako da se postigne pouzdana linearna separacija. Tada

algoritam za obuku zavisi samo od podataka koji ulaze u skalarni proizvod F, odnosno

funkcija oblika (xi)(xj):


47

.)()(sgn)(

1

m

i

newiiinew byf xxx (1.61)

Međutim, pošto je F visoko dimenzionalno za ovaj proizvod je potrebno jako puno

vremena da bi se proračunao. Srećom, proračun u visoko dimenzionalnom prostoru se

može prevazići korišćenjem jednog trika, tzv. kernel trik [Ivancuic 2007], koji

omogućava proračun skalarnog proizvoda u inicijalnom prostoru podataka:

K(xi, xj) = (xi)(xj). (1.62)

Na ovaj način se dobija SVM model koji se nalazi u višedimenzionalnom prostoru i vrši

proračun u skoro istom vremenskom intervalu kao i kod nemapiranih podataka:

Ns

i

newiiinew bsKyf1

),(sgn)( xx . (1.63)

Izbor kernel funkcije je ograničen nekim uslovima, poput Mercer-ovog uslova [Mercer

1909], koji ovde neće biti detaljno opisivan. Neki od najpopularnijih kernela korišćenih

za proračun SVM modela su [Ivancuic 2007]:

linearni kernel: ;),( jijiK xxxx

polinomski kernel: ;)1(),( d

jijiK xxxx

neuronski kernel: );tanh(),( baK jiji xxxx

Gausov RBF (eng. radial basis function) kernel:

).2/exp(),( 22

jijiK xxxx

48

3. Fluorescentna spektroskopija

Fluorescentna spektroskopija predstavlja analitičku metodu velike senzitivnosti i

specifičnosti. Ova metoda ima veliki potencijal kao nedestruktivna metoda za

karakterizaciju bioloških i neorganskih uzoraka. Pokazano je da je ova tehnika od 100

do 1000 puta senzitivnija od drugih spektrofotometrijskih metoda [Strasburg &

Ludescher 1995]. Jedan od razloga visoke senzitivnosti ove metode je taj što većina

molekula ne fluorescira usled čega je uticaj fluorescencije okoline vrlo mali i lako se

mogu detektovati određeni molekuli.

U ovom poglavlju biće detaljno objašnjeni principi i teorija fluorescencije kao i opis

tehnike merenja fluorescentnih spektara.

3.1 Elektromagnetno zračenje i njegova interakcija sa molekulima

Mnoge metode koje služe za ispitivanje molekula koriste elektromagnetno zračenje.

Elektromagnetno zračenje može biti generisano u velikom opsegu talasnih dužina.

Različite talasne dužine imaju različite energije i samim tim interaguju drugačije sa

molekulima. Visoko energetski fotoni imaju dovoljno veliku energiju da raskinu

kovalentne veze, mada, da bi do toga došlo moraju biti ispunjeni određeni uslovi. Fotoni

malih energija imaju previše malu energiju da bi uticali na kovalentne interakcije i oni

mogu samo da predaju svoju energiju molekulima bez menjanja molekularne strukture.

Interakcija elektromagnetnog zračenja sa molekulima je jako kompleksna. Razumevanje

ovih interakcija zahteva poznavanje nekih elemenata kvantne mehanike.

Prilikom interakcije elektromagnetnog zračenja sa materijom jedan deo svetlosti će se

reflektovati o površinu materijala, deo će se propustiti dok će se jedan deo prostirati

kroz materijal. Prilikom prostiranja svetlosti kroz materijal mogu se javiti tri fenomena:

refrakcija, rasejanje i apsorpcija. Prilikom refrakcije dolazi do savijanja svetlosnih zraka

na površini materije jer se talasi prostiru manjom brzinom nego u slobodnom prostoru.

Usled rasejanja dolazi do promene pravca svetlosti i smanjenja njenog intenziteta pri


49

interakciji sa materijom. Apsorpcija predstavlja pojavu kod koje se pod uticajem dejstva

elektromagnetnog zračenja elektron pobuđuje iz osnovnog u više energetsko stanje.

3.1.1 Interakcija elektromagnetnog zračenja i molekula

Elektromagnetno zračenje se sastoji od vremenski promenljivog električnog polja i

vremenski promenljivog magnetnog polja. Za većinu elektronskih prelaza uticaj

magnetnog polja se može zanemariti. Kad je spektroskopija u pitanju, talasna dužina

zračenja je velika u odnosu na veličinu hromofora i iz tog razloga je uglavnom

nepotrebno uzimati u obzir varijaciju u jačini polja koja utiče na molekul. Ako

električno polje ima amplitudu E0 onda je uticaj polja na molekul

𝐄(𝑡) = 𝐄0e𝑖𝜔𝑡 (1.64)

Član 𝜔 predstavlja kružnu frekvenciju svetlosti (𝜔 = 2𝜋𝜈 =2𝜋𝑐

𝜆). Kako je električno

polje vremenski zavisno onda se mora koristiti vremenski zavisna Šredingerova

jednačina. Pošto efekat potencijala može biti zanemaren, ostaje nam vremenski

nezavisan Hamiltonijan i operator potencijala. Operator bitan za interakciju sa svetlošću

je operator električnog dipola 𝜇.

𝜇 = ∑𝑒𝑖𝐫𝑖

𝑖

(1.65)

gde je 𝑒𝑖 pojedinačno naelektrisanje, a 𝐫𝑖 pozicija operatora. Frank-Kondonov princip

kaže da se pomeranja jezgra mogu zanemariti jer svetlost intereaguje sa molekulima

vrlo kratak vremenski period. Ovo predstavlja modifikovanu Born-Openhajmerovu

aproksimaciju. Stoga se u obzir uzimaju samo elektroni. Električno polje svetlosti utiče

na talasnu funkciju stanja a tako što dovodi do promene stanja a u stanje približno

stanju b. Klasično važi da je indukovani dipolni momenat 𝜇ind = 𝛼 • E gde je 𝛼

operator polarizabilnosti molekula. Kod interakcije svetlosti sa molekulom, integral

⟨Ψ𝑏|μ|Ψ𝑎⟩ predstavlja dipol indukovan svetlošću.


50

3.1.2 Molarni koeficijent apsorpcije

Brzina promene apsorpcije svetlosti od strane sistema je definisana sledećom

jednačinom

𝑑𝑃𝑏

𝑑𝑡= 𝐵𝑎𝑏𝐼(𝜈)

(1.66)

gde je 𝐵𝑎𝑏 koeficijent verovatnoće prelaza po jedinici gustine energije zračenja, a 𝐼(𝜈)

je gustina energije na frekvenciji 𝜈. Gustina energije svetlosti je 𝐼(𝜈) = |E0|2/4𝜋 i

definiše se kao funkcija broja prisutnih fotona na toj frekvenciji, jer svaki elektron

doprinosi jačini električnog polja. Koeficijent verovatnoće prelaza 𝐵𝑎𝑏 (Ajnštajnov

koeficijent za stimulisanu apsorpciju) je:

𝐵𝑎𝑏 =

2

3

𝜋

ℏ2|⟨Ψ𝑏|𝜇|Ψ𝑎⟩|

2

(1.67)

Brzina kojom svetlost predaje energiju sistemu zavisi od verovatnoće apsorpcionih

prelaza, brzine emisionih prelaza iste frekvencije, energije po prelazu (ℎ𝜈 = 𝐸𝑏 − 𝐸𝑎) i

od 𝑁𝑎 i 𝑁𝑏 koji predstavljaju broj molekula po 1 cm3 u stanjima a i b.

−𝑑𝐼(𝜈)

𝑑𝑡= ℎ𝜈(𝑁𝑎𝐵𝑎𝑏 − 𝑁𝑏𝐵𝑏𝑎)𝐼(𝜈) (1.68)

Apsorpcija svetlosti kroz uzorak debljine dl sa koncentracijom c je data izrazom

−𝑑𝐼

𝐼= 𝑐𝜀′𝑑𝑙 (1.69)

Integraljenjem od I0 do I i od 0 do l

∫−𝑑𝐼

𝐼

𝐼

𝐼0

= ∫𝑐𝜀′𝑑𝑙

𝑙

0

(1.70)


51

dobija se

ln (

𝐼0𝐼) = 𝑐𝜀′𝑙 (1.71)

Izražavanjem logaritmom sa osnovom deset dobija se sledeći oblik prehodnog izraza

log (

𝐼0𝐼) = 𝑐𝜀𝑙 (1.72)

gde je 𝜀 molarni koeficijent apsorpcije, a l je dužina apsorpcionog puta (debljina

apsorpcionog medijuma) u centimetrima. Menjanjem leve strane izraza apsorbancom A

dobija se izraz A(λ) = 𝑐𝜀(λ)𝑙, koji predstavlja standardni oblik Lamber-Berovog

zakona.

Ako pretpostavimo da molekuli u rastvoru ne interaguju, onda je koeficijent 𝜀 konstanta

za dati molekul u rastvoru na datoj talasnoj dužini. Ukoliko molekuli interaguju

međusobno na takav način da dolazi do promene energetskih nivoa prelaza, onda će se

koeficijent ekstinkcije menjati zavisno od koncentracije.

3.1.3 Apsorpcija i energetska stanja

Elektromagnetno zračenje interaguje sa molekulima samo na određenim energijama. Da

bi električno polje indukovalo dipol, razlika u energiji između dva stanja mora biti

jednaka energiji koju foton sadrži i orijentacija vektora električnog polja mora se

poklapati sa orijentacijom molekula.

Stanje molekula se može opisati energetskim dijagramom prikazanom na slici 3.1.

Energetski dijagram prikazuje dva elektronska stanja, pri čemu se svaki elektronski nivo

sastoji od više vibracionih i rotacionih nivoa. Razlika energije između jednog

rotacionog nivoa i sledećeg je ~4kJ/mol, što spada u opseg termalne energije molekula.

Međutim, energije vibracionih nivoa su razdvojene za oko 40 kJ/mol, a elektronska

stanja su u razmaku od oko 150 do 450 kJ/mol (zavisno od molekula). Pošto su ove


52

energije daleko iznad energije termalnog opsega, ukoliko nema eksterno dovedene

energije biće popunjeni samo najniži vibracioni nivoi najnižih elektronskih nivoa.

Slika 3.1 – Energetski dijagram molekula.

Svako energetsko stanje u kome molekul može da bude je opisano talasnom funkcijom.

Najniže energetsko stanje, osnovno stanje, ima talasnu funkciju Ψ0. Druga stanja u

okviru osnovnog elektronskog stanja su opisana sa Ψ0,v,r, gde v i r označavaju određene

vibracione i rotacione nivoe.

Interakcija molekula sa elektromagnetnim zračenjem u ultraljubičastoj ili vidljivoj

oblasti indukuje prelaze sa jednog na drugo elektronsko stanje. Verovatnoća prelaza se

može izračunati uz pomoć integrala preklapanja za dva stanja. Za elektronske prelaze

integral preklapanja je ⟨Ψ1,y,r|𝜇|Ψ0⟩. Zbog operatora 𝜇 integral preklapanja može imati

vrednost različitu od nule. Do ovoga će doći samo ukoliko je energija fotona jednaka

razlici energija dva stanja Ψ0 i Ψ1,y,r. Čak i tada verovatnoća za taj prelaz je manja od

jedan ukoliko vektor električnog polja indukuje dipol u molekulu sa istom orijentacijom

kao i električno polje fotona koji se približava. U principu, apsorpcioni spektar

molekula, intenzitet apsorpcije u funkciji frekvencije ili talasne dužine svetlosti, treba

da bude skup oštrih pikova (linija), gde svaka linija odgovara prelasku sa jednog

energetskog stanja na drugo (slika 3.2a). Visina svake apsorpcione linije je direktno

vezana za verovatnoću prelaza.


53

Slika 3.2 – Izgled apsorpcionog spektra a) teorijski predviđen i b) izmeren za rastvor.

Za mnoge molekule Doplerov efekat i drugi uticaji okoline u rastvoru dovode do toga

da se kao rezultat dobije relativno široki pik (traka) apsorpcije sa širinom većom od 50

nm (slika 3.2b). Celokupna apsorpciona traka odgovara jednom elektronskom prelazu,

koji se širi zbog vibracionih i rotacionih prelaza.

3.1.4 Tipovi elektronskih prelaza kod molekula

Elektronski prelaz predstavlja prelaz elektrona, pri apsorpciji fotona, iz jedne orbitale

molekula u osnovnom stanju na upražnjenu orbitalu. Na taj način molekul prelazi u

pobuđeno stanje. Radi lakšeg daljeg objašnjenja, ukratko ćemo se podsetiti koji tipovi

orbitala postoje. σ orbitala se može formirati od dve s atomske orbitale ili jedne s i jedne

p atomske orbitale ili dve p atomske orbitale. Veza koja se na ovaj način ostvaruje

naziva se σ veza. π orbitala se formira preklapanjem dve p atomske orbitale i dobijena

veza se naziva π veza. Apsorpcijom fotona odgovarajuće energije omogućava se

prelazak elektrona sa π orbitale na antivezujuću orbitalu π*. Takav prelaz se označava sa

π→π*. Molekul može da poseduje i nevezujuće elektrone na heteroatomima i

odgovarajuće molekulske orbitale se nazivaju n orbitalama. Prelazak nevezujućeg

elektrona na antivezujuću orbitalu se označava sa n→π*. Redosled energija elektronskih

prelaza se može prikazati na sledeći način

n→π* < π →π* < n→σ* < σ→π* < σ→σ*


54

Kada jedan od dva elektrona suprotnih spinova pređe na molekulsku orbitalu veće

energije njegov spin u principu ostaje nepromenjen tako da njegov ukupan spinski

kvatni broj S ostaje jednak nuli. Pošto multipletnost osnovnog i pobuđenog stanja

(M=2S+1) ima vrednost jedan, ova stanja se nazivaju singletna stanja (osnovno stanje se

označava sa S0, a pobuđena sa S1, S2,...). Odgovarajući prelazi se nazivaju singlet-

singlet prelazi. Pri prelazu elektrona može doći do konverzije singletnog stanja u stanje

gde dolazi do promene spina elektrona. Kako tada postoje dva elektrona paralelnih

spinova, ukupni spinski kvantni broj je 1, a multipletnost 3. Takvo stanje se naziva

tripletno stanje jer odgovara trima stanjima istih energija. Po Hundovom pravilu

tripletno stanje ima manju energiju od singletnog stanja iste konfiguracije.

3.2 Luminescencija

Luminescencija predstavlja fenomen emisije ultraljubičastih, vidljivih ili infracrvenih

fotona iz energetski pobuđene materije. Pojam luminescencije (lat. lumen – svetlost) je

prvi uveo fizičar Eilhardt Wiedemann 1888. godine u cilju opisivanja svih fenomena

svetlosti koji nisu u potpunosti uslovljeni povećanjem temperature. Iz tog razloga se

luminescencija drugačije naziva i „hladna svetlost“. Zavisno od načina pobuđivanja

luminescencija se može podeliti na više tipova koji su predstavljeni u tabeli 3.1.

Tabela 3.1 Različiti tipovi luminescencije

Fenomen Način pobuđivanja

Fotoluminescencija Apsorpcija svetlosti (fotona)

Radioluminescencija Jonizujuće zračenje (x-zraci, α, β, γ)

Katodoluminescencija Katodni zraci

Elektroluminescencija Električno polje

Termoluminescencija Toplota (zagrevanjem)

Hemiluminescencija Hemijski procesi

Bioluminescencija Biohemijski procesi

Triboluminescencija Trenje ili elektrostatičke sile

Sonoluminescencija Ultrazvuk


55

Zavisno od vremena provedenog u pobuđenom stanju, fotoluminescenciju, fenomen kod

kojeg dolazi do prelaza elektrona u pobuđeno stanje usled apsorpcije elektromagnetnog

zračenja, možemo podeliti na fluorescenciju (~10-9 s) i fosforescenciju (10-4 - 102 s).

Radi lakšeg objašnjenja i razumevanja ovih procesa koristi se Jablonski dijagram (slika

3.3). On opisuje sve procese do kojih dolazi pri apsorpciji elektromagnetnog zračenja:

apsorpcija fotona, interna konverzija, fluorescencija, unutarsistemski prelaz,

fosforescencija, odložena fluorescencija i triplet-triplet tranzicija.

Osnovna singletna stanja se označavaju sa S0 (osnovno stanje), S1, S2,... dok se tripletna

označavaju sa T1, T2,... Vibracioni nivoi se vezuju za svako elektronsko stanje. Treba

napomenuti da je apsorpcija jako brza (~10-5 s) u odnosu na druge procese, što prema

Frank-Kondonovom principu podrazumeva da ne dolazi do pomeranja jezgra.

Vertikalne strelice koje odgovaraju apsorpciji kreću od nultog vibracionog energetskog

nivoa S0 jer se većina molekula nalazi na tom nivou na sobnoj temperaturi. Apsorpcijom

fotona molekul se dovodi na neki vibracioni nivo pobuđenog stanja S1, S2,... Kada se

molekul nađe u tom stanju postoji više procesa koji se mogu desiti pri vraćanju u

osnovno stanje, što će dalje biti opisano.

3.2.1 Interna konverzija

Interna konverzija predstavlja neradijativni prelaz između dva elektronska stanja iste

multipletnosti. Ovaj proces je ispraćen vibracionom relaksacijom na najniži vibracioni

nivo elektronskog stanja. Pri ovom procesu višak vibracione energije se predaje okolini.

Ukoliko se molekul pobudi na energetski nivo viši od najnižeg vibracionog nivoa prvog

elektronskog stanja (S1) onda se vibracionom relaksacijom pobuđeni molekul dovodi na

nulti vibracioni nivo S1 singletnog stanja. Ovaj proces traje između 10-13 – 10-11 s.

Interna konverzija između S1 i S0 je moguća, ali vrlo malo verovatna i manje efikasna

zbog mnogo veće energetske razlike nego kod konverzije između S1 i S2 stanja (što je

manja energetska barijera veća je efikasnost interne konverzije).


56

Slika 3.3 – Jablonski dijagram.

3.2.2 Fluorescencija

Fluorescencija je fenomen emisije fotona praćen S1→S0 relaksacijom. Kako je

radijativni prelaz S1→S0 dozvoljen po spinu, odnosno stanja su iste multipletnosti, ovaj

proces se odvija jako brzo tj. nakon ~10-9 s. Međutim, pre nego što dođe do emisije

fotona ili nekog drugog deekscitacionog procesa, pobuđeni molekuli ostaju u S1 stanju

neko vreme. Zavisno od tipa molekula ono može biti reda veličine od nekoliko desetina

pikosekundi do nekoliko stotina nanosekundi. To podrazumeva da će se posle

pobuđivanja molekula neko određeno vreme intenzitet fluorescencije eksponencijalno

smanjivati što određuje vreme života nekog molekula u S1 pobuđenom stanju.


57

0-0 prelaz je uglavnom isti za apsorpciju i fluorescenciju, međutim zbog gubitka

energije u pobuđenom stanju usled vibracione relaksacije, talasna dužina fluorescencije

će biti veća odnosno imaće manju energiju od apsorpcije. Prema Stoksovom pravilu

talasna dužina fluorescencije uvek mora biti veća od talasne dužine apsorpcije. U većini

slučajeva apsorpcioni spektar se delom preklapa sa fluorescentnim spektrom, odnosno

deo svetlosti se emituje na manjoj talasnoj dužini od apsorbovane svetlosti što je

grafički prikazano na slici 3.4. Iako ova pojava deluje u suprotnosti zakonu očuvanja

energije, ona se javlja zbog činjenice da se i na sobnoj temperaturi nalazi mali broj

molekula kako na višim vibracionim nivoima tako i u pobuđenom stanju. Na niskim

temperaturama uglavnom ne dolazi do pojave ovog defekta. Fluorescentni spektar često

liči na apsorpcioni zbog sličnosti vibracionih nivoa u osnovnom i pobuđenom stanju.

Razlika između položaja maksimuma apsorpcionog i fluorescetnog spektra naziva se

Stoksov pomeraj.

Slika 3.4 – Grafički prikaz emisionog i ekscitacionog spektra.


58

3.2.3 Unutarsistemski prelazi

Unutarsistemski prelaz predstavlja neradijativni prelaz između dva vibraciona nivoa

istih energija koji pripadaju elektronskim stanjima različite multipletnosti. Na primer,

pobuđeni molekul na 0 vibracionom nivou S1 stanja može da pređe na vibracioni nivo

iste energije Tn tripletnog stanja. Vibracionom relaksacijom molekul se dovodi na

najniži vibracioni nivo T1 stanja. Prelazi između stanja različite multipletnosti su

zabranjeni prelazi, ali ukoliko je spin-orbitalno sprezanje dovoljno veliko ovi prelazi će

biti omogućeni. Verovatnoća unutarsistemskih prelaza zavisi od odgovarajućih

singletnih i tripletnih stanja.

3.2.4 Fosforescencija i neradijativna relaksacija

Pri prelasku molekula sa T1 tripletnog stanja na osnovno stanje mogu se javiti dva

procesa: radijativni proces - fosforescencija i neradijativna relaksacija. Kod rastvora na

sobnoj temperaturi uvek je veća verovatnoća da dođe do neradijativne relaksacije. Pošto

je ovaj prelaz zabranjen, konstanta brzine radijacije je samim tim jako mala. Tokom

ovako sporih procesa brojni sudari molekula u rastvoru favorizuju untarsistemske

prelaze i vibracionu relaksaciju u S1 stanje. Nasuprot tome na niskim temperaturama i

kod rigidnih medijuma može doći do pojave fosforescencije. Vreme života tripletnog

stanja pod ovim uslovima može biti dovoljno dugo da se fosforescencija može

posmatrati u trajanju od nekoliko sekundi, a u nekim slučajevima čak i nekoliko minuta

ili više. Fosforescentni spektri se javljaju na većim talasnim dužinama od fluorescentnih

jer je energija najnižeg vibracionog nivoa tripletnog stanja T1 niža od najnižeg nivoa

stanja S1.

3.2.5 Eksterna konverzija i gašenje usled sudara

Eksterna konverzija predstavlja neradijativan proces koji omogućava molekulu da se

vrati u osnovno stanje kao rezultat sudara sa molekulima u rastvoru. Gašenje usled

sudara je povezano sa eksternom konverzijom, jer kod gašenja dolazi do oduzimanja

viška energije pobuđenog stanja od strane molekula u rastvoru. Iako je gašenje proces


59

drugog reda, velike koncentracije agensa koji gasi omogućavaju analize pseudo prvog

reda. Brzina procesa zavisi od konstante brzine i koncentracije agensa koji gasi [Q].

3.2.6 Kvantni prinos i intenzitet fotoluminescencije

Kvantni prinos fluorescencije ΦF predstavlja deo pobuđenih molekula koji se vrate u

osnovno stanje S0 uz emisiju fluorescentnih fotona.

ΦF =

𝑁𝑒

𝑁𝑎=

𝑘𝑟

𝑘𝑟 + 𝑘𝑛𝑟=

𝑘𝐹

𝑘𝐹 + 𝑘𝑖𝑐 + 𝑘𝑒𝑐 + 𝑘𝑖𝑠 + 𝑘𝑝𝑑 + 𝑘𝑞[𝑄]= 𝑘𝑟𝜏S (1.73)

𝑘𝑟 – konstanta brzine radijativnih prelaza

𝑘𝑛𝑟 – konstanta brzine neradijativnih prelaza

𝑘𝐹 – konstanta brzine fluorescencije

𝑘𝑖𝑐 – konstanta brzine interne konverzije

𝑘𝑒𝑐 – konstanta brzine eksterne konverzije

𝑘𝑖𝑠 – konstanta brzine unutarsistemskog prelaza

𝑘𝑝𝑑 – konstanta brzine fotodekompozicije

𝑘𝑞 – konstanta brzine gašenja

𝜏S – vreme života pobuđenog stanja S1

Intenzitet fotoluminescencije (Wl) predstavlja količinu emitovane energije iz materije po

jedinici vremena i definisana je sledećim izrazom

𝑊𝑙 = ∫ 𝑊𝑙(𝜈)

∞

0

𝑑𝜈 (1.74)

3.2.7 Ekscitacioni i emisioni spektri

Postoje dve vrste fotoluminescentnih spektara koji se mogu posmatrati: ekscitacioni i

emisioni spektri. Ekscitacioni spektar prikazuje promenu intenziteta fotoluminescentne


60

emisije na određenoj talasnoj dužini ili frekvenciji pri različitim talasnim dužinama

ekscitacije. Emisioni spektar prikazuje promenu intenziteta fotoluminescentne emisije

za određeni opseg talasnih dužina za fiksnu talasnu dužini ekscitacije. Usled Stoksovog

pomeraja emisioni spektar će biti pomeren ka višim talasnim dužinama u odnosu na

ekscitacioni spektar što se može videti na konfiguracionom koordinatnom dijagramu na

slici 3.5. Linije na slici predstavljaju elektronske prelaze u konfiguraciono-

koordinatnom modelu u skladu sa Kondonovim principom, o kojem je ranije bilo reči.

Takođe je prikazan izgled apsorpcionog spektra koji potiče od n = 0 → m = 0, 1, 2…

prelaza i emisionog spektra koji potiče od m = 0 → n = 0, 1, 2… prelaza. Maksimumi

apsorpcije i emisije se javljaju na mestu prelaza označenog strelicom AB i CD,

respektivno. U skladu sa Stoksovim pomerajem, vidi se da se maksimum emisije nalazi

na manjoj energiji od maksimuma apsorpcije, čija razlika odgovara Stoksovoj energiji.

Slika 3.5 – Konfiguraciono-koordinatni dijagram prelaza između dva stanja.

3.3 Luminescentni materijali

3.3.1 Organski luminescentni uzorci - fluorofore

Fluorescentni molekuli i fluorecentni funkcionalni delovi unutar većeg molekula se

nazivaju fluoroforama. Fluorofore se mogu podeliti na endogene i egzogene. Endogene

fluorofore su one koje se prirodno nalaze u uzorku. Fluorescencija koja potiče od

endogenih fluorofora naziva se autofluorescencija. Egzogene fluorofore se dodaju


61

uzorku koji ne pokazuje željene spektralne karakteristike. Kod proteina dominantna

fluorofora je indolna grupa triptofana. Indol apsorbuje na talasnoj dužini oko 280 nm i

emituje blizu 340 nm. U tabeli 3.2 je dat pregled endogenih fluorofora koje se najčešće

nalaze u biološkim uzorcima. Može se videti da se ekscitacioni maksimumi nalaze u

opsegu od 250-450 nm (UV/VIS spektralni region), dok su emisioni maksimumi

između 280 i 700 nm (UV/VIS/NIR spektralni region).

Tabela 3.2 Ekscitacioni i emisioni maksimumi endogenih fluorofora u biološkim

uzorcima

Endogene fluorofore Ekscitacioni maksimum

[nm]

Emisioni maksimum

[nm]

Triptofan 280 350

Tirozin 275 300

Fenilalanin 258 284

Vitamin A (retinol) 346 480

Vitamin B2 (riboflavin) 270 (382, 448) 518

Vitamin B6 (piridoksin) 328 393

Vitamin E (α-Tocopherol) 298 326

NADH 344 465

NADPH 336 464

FAD 450 535

Hlorofil A 428 663

Hematoporfirin 396 614

Porfirini 400-450 630,690

Kolagen 325 400,405

Elastin 290,325 340,400

3.3.1.1 Faktori koji utiču na organsku fluorescenciju

Fluorescentne karakteristike molekula mogu se menjati zavisno od uticaja različitih

faktora. Koncentracija, zamućenost, lokalno molekularno okruženje, pH i temperatura


62

utiču na fluorescenciju zbog pojave fenomena poput gašenja fluorescencije, efekta

unutrašnjeg filtera, rasejanja itd.

Gašenje fluorescencije odnosno smanjenje intenziteta fluorescencije se javlja kao

posledica međumolekulskih interakcija unutar samog fluorescirajućeg molekula ili sa

drugim molekulima u matrici uzorka. Gašenje može biti statičko ili dinamičko. Statičko

gašenje se javlja kada fluorofora formira nefluorescirajući kompleks sa molekulom koji

gasi fluorescenciju što onemogućuje dovođenje fluorofore u pobuđeno stanje. S druge

strane dinamičko gašenje se javlja pri difuziji ili molekularnim sudarima. Do njega

dolazi usled deaktivacije pobuđenog stanja pri kontaktu fluorofore sa drugim

molekulom u matrici. Poznato je da kiseonik, teški metali, organske i neorganske nitro

komponente kao i međumolekularne interakcije indukuju dinamičko gašenje. Molekul

se vraća u osnovno stanje bez fluorescentne emisije i bez hemijske modifikacije. Pri

visokim temperaturama takođe može doći do pojave dinamičkog gašenja jer pri

povećanju brzina molekula veće su šanse da dođe do molekularnih sudara.

Drugi tip mehanizma koji smanjuje mereni intenzitet fluorescencije je tzv. efekat

unutrašnjeg filtera. On se javlja usled apsorpcije ekscitovane ili emitovane svetlosti od

strane fluorofora ili hromofora u uzorku. Efekat unutrašnjeg filtera se dešava kad

hromofora reapsorbuje emitovanu fluorescenciju ili kad nefluorescirajuća hromofora

apsorbuje deo ekscitovane svetlosti. Kao rezultat se javlja smanjen intenzitet

fluorescencije ili izobličenje spektara. Problem koncentracionog gašenja i efekta

unutrašnjeg filtera se može rešiti razblaživanjem uzorka ili smanjivanjem dužine

optičkog puta. Međutim razblaživanje uzorka smanjuje koncentraciju bitnih fluorofora i

menja molekularnu interakciju u uzorku.

Intenzitet fluorescencije i koncentracija imaju linearnu zavisnost, ali koncentracija mora

biti u određenom opsegu da ne bi došlo do pojave artefakta poput gašenja i efekata

unutrašnjih filtera. Za transparentne rastvore sa apsorbancom manjom od 0.05,

intenzitet fluorescencije je linearno povezan sa koncentracijom fluorofora [Lakowicz

1999]. U tom slučaju intenzitet fluorescencije If, zavisi od intenziteta pobuđujuće


63

svetlosti I0, molarnog koeficijenta ekstinkcije ε, kvantni prinos fluorescencije ΦF,

dužine optičkog puta l i molarne koncentracije fluorofore c

𝐼f = 2.3ΦF𝐼0𝜀𝑐𝑙 (1.75)

Kvantni prinos fluorescencije zajedno sa molarnim koeficijentnom ekstinkcije

predstavlja meru efektivnosti fluorofore. Na slici 3.6 je prikazana zavisnost intenziteta

fluorescencije i koncentracije čistog rastvora triptofana. Može se uočiti da za

koncentracije triptofana do 10-4 M intenzitet fluorescencije raste sa koncentracijom, a

za veće koncentracije počinje da opada usled pojave gašenja i unutrašnjih filtera.

Takođe se primećuje da tek kada koncentracija dostigne vrednost 10-5 M apsorbanca je

0.05 (ova granica je prikazana horizontalnom linijom na grafiku). Samo za

koncentracije ispod ove granice važi izraz dat u jednačini (1.75).

Slika 3.6 – Grafički prikaz zavisnosti intenziteta fluorescencije i koncentracije čistog

rastvora triptofana.

Osim koncentracije na intenzitet fluorescencije utiču i svojstva okoline u kojoj se

molekul nalazi poput pH vrednosti, polarnosti, temperature itd. Na primer, zavisno od

izloženosti triptofana okolini u proteinu on će pokazati drugačije fluorescentne

karakteristike. Kod nekih proteina on se nalazi duboko unutar proteina i na njega u tom


64

slučaju ne utiče mnogo okolina, dok kod nekih proteina se nalazi na površini i tada

reaguje na svaku promenu okoline u rastvoru. Na slici 3.7 je prikazan primer emisionog

spektra merenog na proteinima mleka: α-lactalbumin, β-lactoglobulin i kasein. Kod

kaseina triptofan je najviše izložen rastvoru, koji je u ovom slučaju voda. Na grafiku se

uočava da kasein ima emisionu maksimum na najvećoj talasnoj dužini. Do ove pojave

dolazi jer je voda hidrofilni rastvor i to pomera emisioni maksimum triptofana, te u

zavisnosti od stepena izloženosti taj pomeraj može biti veći ili manji. Povećanje

hidrofobnosti okoline fluorofore dovodi do relaksacije pobuđenog stanja na niže

vibracione nivoe pre emisije fluorescencije usled čega se dobija emisija manje energije

od onih dobijenih iz polarnijih rastvora. Ove razlike u spektrima omogućavaju

izučavanje promena konformacija proteina kao i denaturaciju i međusobnu interakciju

proteina sa drugim supstancama u uzorku.

Slika 3.7 – Prikaz emisionih spektara proteina mleka: α-lactalbumin (linija sa kratkim

povlakama), β-lactoglobulin (linija sa dugim povlakama) i kasein (puna linija).

Rasejanje svetlosti predstavlja fenomen koji može da remeti mereni fluorescentni

signal. Pojava svetlosti je posledica prisustva malih čestica u uzorku koju detektor vidi

kao lažnu emitovanu svetlost. Rasejanje remeti merenje kada je Stoksov pomeraj mali i

rasejanje se poklapa sa emisijom supstance. Postoje dve glavne vrste rasejanja: elastično

Rejlijevo i neelastično Ramanovo. Rejlijevo rasejanje prvog reda se javlja na talasnoj


65

dužini jednakoj talasnoj dužini ekscitacije, dok se Rejlijevo rasejanje drugog reda javlja

na talasnoj dužini duplo većoj od talasne dužine ekscitacije. Kod Rejlijevog rasejanja ne

postoji elektronska interakcija između svetlosti i materije i zato se ono uvek javlja na

istim talasnim dužinama i ima istu energiju. Intenzitet Rejlijevog rasejanja je obrnuto

srazmeran četvrtom stepenu talasne dužine. Stoga se ovaj efekat može ublažiti

korišćenjem većih talasnih dužina pobude. Neelastično Ramanovo rasejanje je mnogo

slabije od Rejlijevog i uglavnom se ne vidi ukoliko je visok intenzitet fluorescencije.

Ramanovo rasejanje se javlja na većim talasnim dužinama od talasne dužine ekscitacije

sa konstantnom razlikom u frekvenciji u odnosu na pik Rejlijevog rasejanja. Do ove

pojave dolazi usled vibracionih interakcija sa rastvorom. Pik Ramanovog rasejanja za

vodu se javlja na 3600 cm-1 manjem talasnom broju od svetlosti ekscitacije [Lakowicz

1999]. Bitno je obratiti pažnu na Ramanovo rasejanje jer može da se poklopi sa

fluorescentnim signalom, pogotovo za niske intenzitete fluorescencije. Ramanovo

rasejanje se može ukloniti oduzimanjem fluorescentnog signala čistog rastvora od

signala merenog uzorka [Jiji & Booksh 2000].

3.3.2 Neorganski luminscentni materijali

Zavisno od mehanizma elektronskih prelaza usled kojih dolazi do emisije svetlosti, kod

čvrstih neorganskih materijala mogu se razlikovati dve vrste fotoluminescencije:

unutrašnja i spoljašnja fotoluminescencija. Unutrašnja fotoluminescencija se dalje može

podeliti na međuzonsku, ekscitonsku i rekombinacionu fotoluminescenciju.

Najčešće primenjivan način za dobijanje luminescentnih neorganskih materijala jeste

unos aktivatorskih jona u sam materijal. Aktivatori mogu biti atomi ili joni koji se

nalaze u višku kada se materijal samo-aktivira, zatim mogu biti neke intersticijske ili

supstitucijske nečistoće ili neke druge vrste defekta u kristalnoj rešetki. Ovako dobijeni

materijali koji emituju svetlost nazivaju se fosfori.

Zavisno od aktivatora koji se koriste i elektronskog prelaza, fosfori se dele na sledeći

način:

1) 1s ↔ 2p prelaz.


66

2) ns2 ↔ nsnp prelaz – u ovu grupu spadaju joni Tl+ tipa (Ga+, In+, Tl+, Ge2+, Sn2+,

Pb2+, Bi3+, Cu-, Ag-, Au- itd.).

3) 3d10 ↔ 3d9 4s prelaz – poput Cu+, Ag+ i Au+.

4) 3dn ↔ 3dn, 4dn ↔ 4dn prelaz – ovu grupu čine prvi i drugi red prelaznih metala.

5) 4fn ↔ 4fn, 5fn ↔ 5fn prelaz – spadaju joni retkih zemalja i joni aktinoida.

6) 4fn ↔ 4fn-15d prelaz – kao što su Ce3+, Pr3+, Sm2+, Eu2+, Tm2+ i Yb2+.

7) Prelaz između prazne orbitale katjona i p elektrona anjona ili prenos

naelektrisanja. Poput međumolekulskih prelaza u kompleksima kao što su VO43-,

WO42- i MoO4

2-.

8) π ↔ π i n ↔ π* prelaz – organski molekuli koji imaju π elektrone

3.3.2.1 Retke zemlje – elektronska konfiguracija jona i njihova interakcija

Pod retkim zemljama se podrazumevaju 15 elemenata III A grupe periodnog sistema

elemenata koji se nazivaju lantanoidi, od lantana do lutecijuma. Elektronska

konfiguracija lantanoida je data opštom formulom 4fn 5s3 5p6 6s2 pri čemu n ima

vrednosti od 0 do 14. Kako su 4f elektroni valentni i imaju najmanju energiju veze u

atomu oni su odgovorni za optičke karakteristike ovih elemenata. Uklanjanjem 6s

elektrona dobijaju se joni retkih zemalja pri čemu 4f orbitale unutar popunjenih 5s i 5p

ljuski ostaju optički aktivne. Joni koji imaju luminescentne osobine i karakteristične

energetske nivoe su joni od Ce3+ do Lu3+ sa delimično popunjenim 4f orbitalama, za

razliku od Sc3+, Y3+, La3+, Lu3+ jona koji ne pokazuju luminescentne osobine jer

nemaju slobodne 4f elektrone. Pri inkorporiranju jona retkih zemalja u rešetku matrice,

na njih počinje da deluje kristalno polje koje ga okružuje. Usled dejstva ovog polja na

inkorporirani jon doći će do pojave potencijala koji predstavlja perturbaciju na

energetsko stanje slobodnog jona. Uz primenu perturbacionog računa dobija se ukupno

razdvajanje energetskih nivoa i parametri kristalnog polja. Hamiltonijan kristalnog polja

je dat sledećim izrazom:

�̂�𝐶𝐹 = ∑𝑒𝑉(𝑟𝑖, 𝜃𝑖 , 𝜑𝑖)

𝑁

𝑖=1

(1.76)


67

gde je 𝑒𝑉(𝑟𝑖, 𝜃𝑖 , 𝜑𝑖) potencijalna energija i-tog valentnog elektrona u kristalnom polju.

U izrazu (1.76) je u obzir uzeta interakcija valentnih elektrona dopantnih jona sa

elektrostatičkim poljem koje ga okružuje.

Kod atoma koji imaju više elektronskih stanja postoje tri tipa interakcije:

1) Spin-spin interakcija,

2) orbitno-orbitna interakcija i

3) spin-orbitna interakcija.

Kada se jon dopanta inkorporira u kristalnu rešetku energetski nivoi slobodnog jona

retkih zemalja se razdvajaju na više optičkih energetskih nivoa (termova) koji su

definisani kvantnim brojevima L, S i J. Za 4f orbitalu orbitalni kvantni broj L ima

vrednost 3, što znači da ima 7 orbitala tog tipa (-3, -2, -1, 0, +1, +2, +3). Raspored

elektrona u tim orbitalama će uvek biti takav da spinski moment impulsa (S=Σs) bude

maksimalan. Kvantni broj J se dobija kombinacijom spinskog orbitalnog broja S i

orbitalnog momenta L (L=Σl) što je definisano sledećim jednačinama:

kada je broj 4f elektrona manji od 7 onda važi J = L – S

kada je broj 4f elektrona veći od 7 onda važi J = L + S

pri čemu L predstavlja S, P, D, F, G, H, I, K, L, M,..., koji odgovaraju vrednostima L =

1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, respektivno. Optički termovi se u skladu sa Rasel-Sanders-ovim

modelom opisuju kao stanje nastalo sprezanjem orbitalnih i spinskih orbitala (LS

sprega) pri čemu se za njihovo obeležavanje koriste simboli uz pomoć kojih se definišu

vrednosti kvantnih brojeva MLJ. M predstavlja multipletnost terma i definisan je na

sledeći način:

za L ≥ S važi M = 2S + 1

za L < S važi M = 2L + 1


68

Za nivoe bliske osnovnim stanjima važi da je sprezanje usled spin-orbitalne interakcije

malo dok je za pobuđena stanja sa sličnim J brojevima veliko. Efekat sprezanja ima

veliki uticaj na verovatnoću optičkih prelaza, a jako mali uticaj na energije nivoa.

Na slici 3.8 je prikazano cepanje energetskih nivoa na primeru trovalentnog jona

europijuma. Kvantni brojevi za Eu3+ jon, koji ima konfiguraciju 4f 6, su

S = Σs = 6 × ½ = 3

L = Σl = │– 3 – 2 – 1 + 0 + 1 + 2│=3

L ≥ S (3 ≥ 3) M = 2 × 3 +1 = 7

L ≥ S (3 ≥ 3) J = L + S, L + (S–1), L + (S–2),..., L+1, L, L–1,..., L – (S–2), L –

(S–1), L – S ; J = 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6

Slika 3.8 – Cepanje energetskih nivoa trovalentnog europijuma.

Uz pomoć datih kvantnih brojeva dobija se da je osnovni term za Eu3+ 7F0. Ono što se

uočava na slici 3.8 jeste da pod uticajem kristalnog polja ne dolazi do cepanja osnovnog

stanja (M=2×0+1=1) pri čemu se nivo 7F1 cepa na tri podnivoa (M=3). Na prikazanom

primeru je dat jon Eu3+ inkorporiran u matricu LaF3, gde je usled kulonovskih, spin-

orbitalnih, interakcija kristalnog polja i nuklearnih magnetnih interakcija došlo do


69

cepanja energetskih nivoa. Uticaj ovih interakcija opada po istom redosledu kao što je

prethodno navedeno. U tabeli 3.3 su prikazane elektronske konfiguracije jona

trovalentnih retkih zemalja.

Tabela 3.3 Elektronske konfiguracije jona trovalentnih retkih zemalja.

Z

Jon

-3

-2

-1

ml

0

1

2

3

S

Σs

L

Σl

J

Σ(L+S)

Osnovni

term

21 Sc3+ 0 0 0 1S 0

39 Y3+ 0 0 0 1S0

57 La3+ 0 0 0 1S0

58 Ce3+ ↑ 1/2 3 5/2 2F5/2

59 Pr3+ ↑ ↑ 1 3 4 3H4

60 Nd3+ ↑ ↑ ↑ 3/2 6 9/2 4I9/2

61 Pm3+ ↑ ↑ ↑ ↑ 2 6 4 5I4

62 Sm3+ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ 5/2 5 5/2 6H5/2

63 Eu3+ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ 3 3 0 7F0

64 Gd3+ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ 7/2 0 7/2 8S7/2

65 Tb3+ ↑↓ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ 3 3 6 7F6

66 Dy3+ ↑↓ ↑↓ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ 5/2 5 15/2 6H15/2

67 Ho3+ ↑↓ ↑↓ ↑↓ ↑ ↑ ↑ ↑ 2 6 8 5I8

68 Er3+ ↑↓ ↑↓ ↑↓ ↑↓ ↑ ↑ ↑ 3/2 6 15/2 4I15/2

69 Tm3+ ↑↓ ↑↓ ↑↓ ↑↓ ↑↓ ↑ ↑ 1 5 6 3H6

70 Yb3+ ↑↓ ↑↓ ↑↓ ↑↓ ↑↓ ↑↓ ↑ 1/2 3 7/2 2F7/2

71 Lu ↑↓ ↑↓ ↑↓ ↑↓ ↑↓ ↑↓ ↑↓ 0 0 0 1S0

Dieke i saradnici su na osnovu optičkih spektara pojedinačnih jona inkorporiranih u

kristalu LaCl3 eksperimentalno utvrdili energetske nivoe 4f elektrona. Dieke-ov

dijagram je prikazan na slici 3.9. Svaki nivo obeležen brojem J se dalje cepa na više

podnivoa pod uticajem kristalnog polja. Vrednost broja J i simetrija kristalnog polja

direktno utiču na broj podnivoa na koje će se nivo podeliti. Maksimalan broj podnivoa

je definisan sa dva izraza: 2J + 1, ukoliko J ima celobrojnu vrednost, a ukoliko je J

polovina celog broja onda važi J+1/2. Nivoi obeleženi polukrugom predstavljaju nivoe


70

sa kojih se dešava emisija i ovaj proces postaje dominantan usled zavisnosti da sa

povećanjem energetske razlike između nivoa opada brzina neradijativne emisije fotona.

Kako maksimalne varijacije u energetskim nivoima usled različitosti matrica ne prelaze

nekoliko stotina cm-1 ovaj dijagram se može primeniti na skoro sve matrice.

Slika 3.9 – Dieke-ov dijagram energetskih nivoa.

3.3.2.2 Dozvoljeni i nedozvoljeni prelazi, selekciona pravila i intenziteti elektronskih

prelaza

Kod oksida retkih zemalja dolazi do pojave tri vrste elektronskih prelaza: 4f – 4f, 4f – 5d

i prelaz prenosom naelektrisanja (eng. charge transfer). Na energetskom dijagramu

oksida retkih zemalja prikazanom na slici 3.10 se jasno vidi šta se dešava sa

energetskim nivoima pri apsorpciji energije.


71

Po pravilu parnosti prelazi 4f – 4f , kod kojih dolazi do prelaza elektrona između

različitih energetskih nivoa 4f orbitala u okviru istog jona retke zemlje, su zabranjeni.

Pravilo parnosti nalaže da do elektronskih prelaza ne može doći ukoliko su energetski

nivoi iste parnosti. U slučaju oksida retkih zemalja javlja se izuzetak od ovog pravila

usled uticaja kristalnog polja i postojanja poremećaja poput vibracije elektrona. Kako je

uticaj vibracija jako mali, glavnu odgovornost za ublažavanje pravila parnosti snosi

uticaj kristalnog polja. Ovaj uticaj se javlja zbog okupacije jona retkih zemalja na mestu

u rešetki koje nema inverznu simetriju (C2). Rezultujući apsorpcioni pikovi ovih prelaza

su uski i slabog intenziteta.

Slika 3.10 – Elektronski prelazi 4f – 4f, 4f – 5d i prelazi prenosom naelektrisanja.

Kod 4f – 5d prelaza dolazi do premeštanja jednog 4f elektrona na nivo veće energije u

5d orbitali unutar istog jona retke zemlje. Takvi prelazi se označavaju kao 4f n → 4f n-

15d. Ovakvi prelazi su dozvoljeni po pravilu parnosti i imaju široke apsorpcione spektre

visokog intenziteta.


72

Pri prelasku elektrona iz 2p orbitale okolnog jona O2- na viši energetski nivo u 4f

orbitali jona retke zemlje dolazi do pojave prelaza prenosom naelektrisanja i kao takvi

se označavaju sa 4f n → 4f n+12p-1. Ovi prelazi su takođe dozvoljeni i imaju široke

apsorpcione pikove visokog intenziteta.

Radijativni prelazi odnosno emisija kod oksida retkih zemalja, do kojih dolazi po

apsorpciji energije, su karakteristični za 4f – 4f prelaze. Ukoliko se elektroni iz

pobuđenog stanja vrate na niži energetski nivo ili osnovno stanje bez emisije svetlosti,

onda se to naziva neradijativnim prelazom. Još jedan od fenomena koji se može javiti

jeste višefotonski prelaz do čije pojave može doći ukoliko je energetska razlika manja

ili jednaka od vrednosti oko 5 puta veće od najviše vibracione frekvencije rešetke

domaćina.

3.3.2.3 Definicija luminescentnih aktivatora i matrice domaćina

Svaki luminescentni materijal nastaje inkorporiranjem luminescentnog centra odnosno

dopanta u matricu domaćina odnosno materijal domaćina (eng. host material). Postoje

različite vrste matrice koje mogu biti organske i neorganske (češće se koriste), a to su:

oksidi (Y2O3, Gd2O3, Lu2O3, ZrO2),

mešani oksidi ((Y1-xGdx)2O3, (Y1-xLax)2O3, ZnO-SiO2),

sulfidi (Y2O2S),

fluoridi (NaYF4, KMgF3, LiYbF4, YF3, NaLuF4 itd.),

silikati (Ln2SiO5, Ln2Si2O7),

fosfati (KCaPO4, NaCaPO4, BaCaPO4, SrMg2(PO4)2) itd.

Zavisno od efekata koji žele da se postignu vrlo je bitno izabrati odgovarajuću matricu.

Optička svojstva dobijenog materijala će puno zavisiti od interakcije matrice sa jonom

dopanta kao i od svojstva same matrice. Matrica će diktirati relativnu prostornu poziciju

jona dopanata, njihovu međusobnu udaljenost i vrstu anjona koji ih okružuju. Ukoliko

postoje defekti u matrici može doći do povećanja multifononske relaksacije

metastabilnih nivoa i smanjenja intenziteta emisije. Dobri kandidati za matricu

domaćina su matrice na bazi Na+, Ca2+ i Y3+ jer su njihovi jonski radijusi slični


73

veličinama jona lantanoida usled čega se smanjuje napon u kristalnoj rešetki i stvaranje

defekata.

Joni sa kojih se emituje svetlost odnosno luminescentni centri u matrici nazivaju se

aktivatorskim centrima ukoliko potiču od aktivatora. Emisione i apsorpcione

karakteristike materijala će zavisiti direktno od vrste jona koji je ugrađen u matricu.

Dobijeni spektri će davati određene boje. Ovakvi joni dopanta se unose u jako malim

količinama u matricu domaćina pri čemu uglavnom zamenjuju neke jone domaćina.

Pregled nekih karakterističnih luminescentnih centara i boja njihove emisije su date u

tabeli 3.4.

Tabela 3.4 Boje emisija jona lantanoida

Joni Boje emisije Joni Boje emisije

Ce3+ Ultraljubičasta, Zelena Tb3+ Zelena

Pr3+ Plava, Zelena, Crvena Dy3+ Žuta

Nd3+ Bliska infracrvena Ho3+ Plava, Zelena

Sm3+ Roze Er3+ Zelena, Infracrvena

Eu3+ Crvena Tm3+ Plava

Gd3+ Ultraljubičasta Yb3+ Plava, Bliska infracrvena

3.4 Uređaj za merenje fluorescencije

Za merenje fluorescentnih spektara koriste se spektrofotometri. Ova metoda se

uglavnom koristi za karakterizaciju organskih i neorganskih materijala.

Spektrofotometar predstavlja vrlo jednostavan uređaj čija je šema prikazana na slici

3.11. Osnovne komponente ovog uređaja su: izvor elektromagnetnog zračenja

(svetlosti), monohromator i detektor. U sastavne delove takođe spadaju i nosač uzorka

(bilo tečnih ili čvrstih) i kompjuter za registrovanje merenog signala.


74

Slika 3.11 – Šematski prikaz spektrofotometra.

3.4.1 Izvor elektromagnetnog zračenja

Za pobuđivanje elektronskih prelaza mogu se koristiti različiti izvori svetlosti poput

kontinualnih ili impulsnih lasera, lampe, emitujuće LE diode (eng. LE-light emitting)

itd. Vrsta izvora pobude zavisi od fotoluminescentne metode. Kako je intenzitet

luminescencije proporcionalan intenzitetu svetlosti ekscitacije, neophodno je da se

svetlost generiše iz stabilnog visoko-energetskog izvora. Kao najčešći izvor u

spektrofotometrima se koristi ksenonska lampa. Ona predstavlja kontinualni izvor koji

emituje zračenje u širokom opsegu talasnih dužina (190 nm – 1000 nm), sa nekoliko

oštrih linija koje se javljaju oko 450 nm i iznad 800 nm, i samim tim ima najširu

primenu. Ksenonske lampe emituju kontinualnu svetlost kao rezultat rekombinacije

elektrona sa jonizovanim atomima ksenona. Ovi joni se generišu pri sudarima atoma

ksenona sa slobodnim elektronima koji se nalaze u lampi. Potpuna separacija elektrona

od atoma rezultuje kontinualnom emisijom. Atomi ksenona koji su u pobuđenom stanju

ali nisu jonizovani kao rezultat imaju uske emisione linije umesto širokih traka. Pikovi


75

koji se javljaju na 450 nm su upravo rezultat tih pobuđenih stanja. Dobra strana

upotrebe ksenonske lampe jeste njena dugotrajnost, kratko vreme zagrevanja i osobina

da ne zagreva previše sam instrument. Danas kompaktni spektrofotometri često koriste

impulsne ksenonske lampe. Razlog tome je što impulsna ksenonska lampa daje bolje

strukturiran izlaz od kontinualne lampe. Impulsna ksenonska lampa troši manje energije

i generiše manje toplote.

Osim ksenonskih lampi često se koriste i živine lampe koje su primer linijskog izvora.

Ove lampe su jačeg intenziteta od ksenonskih, ali je intenzitet skoncentrisan u linijama.

One se najčešće primenjuju kada linije ekscitacije odgovaraju talasnim dužinama

ekscitacije uzorka koji se meri.

LE diode (eng. LE-light emitting) – LED izvor svetlosti je našao primenu u novije

vreme u spektrofotometriji. LED izvori se mogu naći u širokom opsegu talasnih dužina.

U tom slučaju, za dobijanje izvora širokog opsega mogu se koristiti više LED izvora

istovremeno. Prednosti LED-a su dug vek trajanja i niska potrošnja energije.

Slika 3.12 – Spektralni izlaz LE dioda, pri čemu crna linija predstavlja izlaz bele LE

diode.


76

Još jedan od izvora svetlosti su laserske diode. Za razliku od LED-a, laserske diode

emituju monohromatsku svetlost i dostupne su u opsegu talasnih dužina od 405 do 1500

nm (slika 3.12). Prednost laserskih dioda je u tome što je izlaz jednostavan za

fokusiranje i manipulaciju. Za razliku od raznih lampi, izlaz LED-a i laserskih dioda

može biti i pulsni i modulisan. Amplituda LED-a može biti modulisana čak i do 100

MHz, dok laserske diode mogu biti modulisane i do nekoliko GHz.

3.4.2 Monohromator

Monohromator predstavlja deo spektrofotometra koji je odgovoran za razlaganje

polihromatske svetlosti u monohromatsku. On se sastoji iz tri dela: ulaznog razreza

(eng. slit), disperzionog elementa i izlaznog razreza. Za disperziju se može koristiti

prizma ili difrakciona rešetka. Disperzioni element koji se najčešće koristi je difrakciona

rešetka. Specifikacija performansi monohromatora podrazumeva disperziju, efektivnost

i nivo lutajuće svetlosti. Disperzija je uglavnom data u nm/mm. Monohromator treba da

ima nizak nivo lutajuće svetlosti kako bi se izbegli problemi usled rasejanja ili zalutale

svetlosti. Pod lutajućom svetlosti se podrazumeva svetlost propuštena od strane

monohromatora, ali izvan željenog opsega talasnih dužina. Rezolucija snimanja će

zavisiti od širine razreza monohromatora. Razrezi su uski prorezi kroz koje svetlost

ulazi i izlazi iz monohromatora, respektivno. Širine razreza su najčešće podesive (od

0.005 – 1 mm) i monohromator najčešće ima i ulazni i izlazni razrez. Bitna

karakteristika razreza jeste da ivice budu paralelne i pravolinijske kako bi se dobila

simetrična spektralna linija pravilnog oblika. Razrezi mogu imati samo jednu ili obe

pomerljive ivice, pri čemu u slučaju kada su obe pomerljive ne dolazi do pomeranja

centra spektralnih linija pri promeni širine ivice. Intenzitet svetlosti koji prođe kroz

razrez je uglavnom srazmeran kvadratu širine razreza. Širi razrezi rezultuju većim

intenzitetom signala, ali takođe i većim odnosom signal-šum. Manji razrezi daju bolju

rezoluciju, ali samim tim i manji intenzitet signala. Stoga zavisno od materijala koji se

meri moraju se izabrati i odgovarajuće širine razreza.


77

Slika 3.13 – Šematski prikaz transmisione difrakcione rešetke.

Difrakciona rešetka je optička komponenta sa periodičnom strukturom koja se sastoji od

bliskih zareza (a) između kojih se nalaze zatamnjeni delovi (b) kroz koje svetlost ne

prolazi (transmisiona rešetka). Period rešetke se definiše kao konstanta jednaka zbiru

rastojanja a i b (slika 3.13). Prorezi na rešetki mogu biti zamenjeni reflektujućim slojem

i onda se takva rešetka naziva refleksiona, koja se najčešće i koristi u praksi. Moć

razlaganja rešetke zavisi od gustine zareza, odnosno što je veća gustina bolja je moć

razlaganja. Kod kvalitetnih rešetki zarezi se urezuju holografskim postupkom na glatkoj

staklenoj površini presvučenoj refleksivnim slojem. Nesavršenosti rešetke su izvor

lutajuće svetlosti transmisije monohromatora i pojave nepostojećih signala sa rešetke.

Moć razlaganja rešetke je definisana sledećim izrazom:

𝑅 =

𝜆

𝑑𝜆= 𝑁𝑚 (1.77)

Gde je N ukupan broj zareza na rešetki, a m difrakcioni ili spektralni red rešetke (m=1,

2, 3,...). Jednačina (1.77) upravo potvrđuje da moć razlaganja zavisi samo od broja

zareza i difrakcionog reda rešetke i da se sa većim brojem zareza dobija i veća

rezolucija.


78

2.4.3 Detektor

Kao detektor u spektrofotometru se može koristiti bilo koji fotosenzitivan uređaj.

Najčešće korišćeni detektori u praksi su fotomultiplikator i CCD (eng. Charge Coupled

Device) kamera.

Slika 3.14 – Šematski prikaz fotomultiplikatora.

Fotomultiplikator je detektor koji je jako osetljiv na elektromagnetno zračenje u

ultraljubičastom, vidljivom i infracrvenom opsegu. On pojačava struju proizvedenu od

strane upadne svetlosti i do 100 miliona puta, što omogućava detekciju pojedinačnih

fotona čak i kada je intenzitet svetlosti jako mali. Na slici 3.14 je prikazana šema

fotomultiplikatora. Može se uočiti da osnovni delovi fotomultiplikatora čine fotokatode

odnosno nekoliko dinoda i anode. Proces pojačavanja u fotomultiplikatoru se odvija na

sledeći način:

Elektromagnetno zračenje pada na fotokatodu i usled fotoefekta se izbijaju

primarni elektroni koji počinju da se kreću ka prvoj dinodi.

Svaka dinoda se nalazi na većem naponu (za oko 100 V) od prethodne. Grupa

primarnih elektrona, nastala dolaskom inicijalnih fotona, se kreće ka prvoj

dinodi pri čemu bivaju ubrzani električnim poljem.

Pri udaru u dinodu izbija se više elektrona manje energije koja im je dovoljna da

dalje izbijaju nove elektrone procesom sekundarne emisije.


79

Ovaj proces se ponavlja dalje na svakoj dinodi i kao rezultat se dobija veliki broj

elektrona koji stiže do anode i time omogućava lako detektovanje čak i slabog

signala.

Problem koji se može javiti pri korišćenju fotomultiplikatora jeste šum i struja mraka

koji se javljaju usled termoelektronske emisije. Hlađenjem fotomultiplikatora smanjuje

se i termoelektronska emisija, a time i prateći fenomeni.

CCD (eng. Charge Coupled Device) detektor je uređaj koji može istovremeno da meri

intenzitet svetlosti u više tačaka u ravni i konvertuje ga u digitalni signal koji se snima

na nekom uređaju (kompjuteru). Prednost ovog detektora je što omogućava istovremeno

snimanje spektra u širem spektralnom intervalu i iz tog razloga se ne koristi izlazni

razrez. Ova vrsta detektora ima izuzetnu senzitivnost linerni dinamički opseg.

Rezolucija snimanja spektra će zavisiti od broja mernih tačaka (piksela) po jedinici

dužine senzora, odnosno što je taj broj veći i rezolucija snimanja će biti bolja.

Standardan CCD detektor ima minimum 106 piksela. Karakteristično za CCD čip je

njegov oblik matrice, u smislu da svaki red matrice snima po jedan spektar i kao rezultat

daje usrednjenu vrednost spektara svih redova CCD čipa. Svaki piksel se ponaša kao

jedan akumulirajući detektor gde se naelektrisanje akumulira proporcionalno količini

svetlosti kojoj je izložen. Naelektrisanje svakog piksela može biti očitano u svakom

trenutku i pri tome se dobija dvodimenzionalna slika. U praksi se koristi i kamera sa

CCD senzorom (ICCD) koja može da radi u dva režima: impulsnom i kontinualnom. U

cilju smanjenja struje mraka, a time i šuma, CCD senzor se može hladiti na -20ºC uz

primenu Peltijeovog elementa. Još jedan od bitnih delova kamere jeste i tzv. sistem za

pojačavanje intenziteta slike koji ima funkciju za pojačavanje signala i kao brzi

elektronski zatvarač koji se koristi u impulsnom režimu. Mana CCD senzora je efekat

koji se javlja kada je jedan piksel izložen velikom intenzitetu svetlosti, pa time dolazi do

lažnog povećanja izmerenog intenziteta na susednim pikselima iako do njih stiže

svetlost relativno malog intenziteta. Ovaj efekat se naziva “preslušavanje”. Stoga se

može zaključiti da će linija detektovana foromultiplikatorom imati manju širinu od one

detektovane CCD senzorom. Zbog svojih malih dimenzija ova vrsta detektora se često

koristi kod prenosnih spektrofotometara.


80

3.4.4 Merenje luminescentnih spektara i vremena života pobuđenog stanja

Kod većine spektrofotometara moguće je meriti i emisione i ekscitacione luminescentne

spektre. Emisioni spektar podrazumeva merenje emisije za određeni opseg talasnih

dužina pri čemu je talasna dužina ekscitacije konstantna. Ekscitacioni spektar

predstavlja intenzitet luminescencije u funkciji talasne dužine ekscitacije pri fiksnoj

talasnoj dužini emisije. U cilju detekcije najvećeg mogućeg broja spektralnih

karakteristika posmatranog sistema koristi se složenije fluorescentne tehnike:

ekscitaciono-emisiona matrica (EEM) i sinhrona fluorescentna spektroskopija. EEM

predstavlja trodimenzionalni dijagram koji prikazuje intenzitet luminescencije u funkciji

energije ekscitacije i emisije. Ovakav dijagram se dobija snimanjem više emisionih

spektara za određene vrednosti talasne dužine ekscitacije i zatim se dobijeni linijski

spektri slažu u matricu gde redovi i kolone odgovaraju talasnim dužinama emisije i

ekscitacije, respektivno. EEM se pokazala kao jako korisna tehnika kod ispitivanja

višekomponentnih sistema zbog velikog broja informacija koje se na ovaj način

prikupe. Sinhroni fluorescentni spektri se dobijaju simultanim snimanjem ekscitacionih

i emisionih spektara pri čemu se interval razlike talasnih dužina (Δλ) ili frekvencije

između ekscitacije i emisije održava konstantnim.

Merenje ekscitacionih i emisionih spektara se u glavnom vrši u kontinualnom režimu,

odnosno kad se za pobuđivanje koristi lampa koja u idealnom slučaju emituje

konstantan broj fotona po jedinici vremena. Iako idealna kontinualna lampa ne postoji,

može se smatrati da je broj pobuđenih elektrona stalan jer je konstanta brzine

deekscitacije za nekoliko redova veličine manja od konstante brzine pobuđivanja

elektrona fotonom. U novije vreme se osim kontinualnog režima koristi i vremenski

režim odnosno merenje vremenski razloženih spektara. U tom slučaju se za pobuđivanje

koriste impulsni laseri, a za detekciju jako brzi detektori. U tom slučaju je moguće u

toku snimanja menjati vreme između detektovanja signala i na taj način dobiti različite

spektre, zavisno od toga šta se traži. U slučaju kompleksnih sistema vremenski

razloženi spektri će se razlikovati po različitim karakteristikama emisije supstanci

(njihovih molekula, jona ili atoma) koje se nalaze u smeši.


81

Merenje vremena života pobuđenog stanja podrazumeva merenje prosečnog vremena

koje molekul provede u pobuđenom stanju pre povratka u osnovno stanje. Vreme života

fluorescencije je oko 10 ns. Kako u fluorescentnim merenjima mi ne posmatramo broj

pobuđenih molekula (n) već samo promenu intenziteta fluorescencije (I(t)), koji je

proporcionalan broju n, matematički izraz koji opisuje vreme života odnosno vreme

koje je potrebno da intenzitet fluorescencije opadne za 1/e od početne vrednosti je

𝐼𝑡 = 𝐼0𝑒𝑥𝑝 (−

𝑡

𝜏) (1.78)

gde je 𝐼0 intenzitet u trenutku t = 0 s, a 𝜏 vreme života prelaza. Kao što je prethodno

naznačeno vreme života je prosečno vreme koje molekul provede u pobuđenom stanju.

To se naglašava iz razloga što u kompleksnim slučajevima kada postoji više prelaza ili

prenosa energije u sistemu izraz (1.78) neće biti tačan i može da odstupa od

eksponencijalne funkcije. Iz tog razloga se uvodi efektivno vreme života emisije koje

usrednjava vreme t po intenzitetu emisije

𝜏𝑒𝑓 =

∫ 𝑡𝐼𝑡𝑑𝑡∞

0

∫ 𝐼𝑡𝑑𝑡∞

0

(1.79)

Gde je 𝐼𝑡 intenzitet fluorescencije u trenutku t za 0 < t < tm ; tm >> 𝜏𝑒𝑓.

Slika 3.15 – Merenje vremena života u vremenskom domenu.


82

Za merenje vremena života pobuđenog stanja koriste se dve metode: merenje u

vremenskom domenu i merenje u frekventnom domenu. Na slici 3.15 je grafički

prikazano merenje vremena života pobuđenog stanja u vremenskom domenu, gde se

uzorak pobuđuje pulsom svetlošću. Puls treba da bude što je moguće uži i ako je

moguće mnogo kraći od vremena života 𝜏 uzorka koji se meri. Vremenski zavisan

intenzitet fluorescencije se meri odmah nakon pobuđivanja pulsom svetlošću i vreme

života 𝜏 se računa na osnovu krive sa grafika koji prikazuje zavisnost log I(t) i t ili

vremena za koje se intenzitet smanji za 1/e od početne vrednosti intenziteta. Na slici

3.16 je prikazana alternativna metoda za merenje vremena života pobuđenog stanja. U

ovom slučaju se uzorak pobuđuje svetlošću moduliranog intenziteta koja je najčešće

sinusnog oblika. Intenzitet pobuđivačke svetlosti varira na visokim frekvencijama od

oko 100MHz, tako da se recipročna vrednost frekvencije može porediti sa recipročnom

vrednošću vremena života 𝜏. Kada se uzorak pobudi na ovaj način emisija je prinuđena

da isprati istu modulaciju frekvencije. Vreme života uzorka uzrokuje kašnjenje emisije u

odnosu na ekscitaciju koje je prikazano kao fazni pomak (Φ) u desno koji se koristi za

računanje vremena života. U skladu sa tim vreme života se u tom slučaju dobija uz

pomoć sledećeg izraza:

𝜏 = (tan Φ) (2𝜋𝑓𝑚𝑜𝑑)⁄ (1.80)

gde je 𝑓𝑚𝑜𝑑 frekvencija modulacije ekscitacije. Merenja vremena života pobuđenog

stanja u frekventnom modu su se jako lepo pokazala u slučaju kada su vrednosti

vremena života reda veličine u opsegu μs – ms, dok se za kraća vremena života više

koriste merenja u vremenskom domenu. Merenje vremena života ima široki opseg

primene kako za organske tako i za neorganske materijale. Na taj način se mogu dobiti

neke dodatne informacije koje nije moguće dobiti standardnim merenjima spektara. Na

primer ova vrsta merenja se često koristi u slučaju kada u uzorku postoje dva molekula

sa vrlo sličnim apsorpcionim i emisionim spektrima koji se preklapaju, ali čija su

vremena života pobuđenog stanja različita. Na taj način merenjem spektara i vremena

života zajedno moguće je razdvojiti odgovarajuće čiste spektre.


83

Slika 3.16 – Merenje vremena života u frekventnom domenu.

Postoje dve geometrije luminescetnih merenja koje se mogu koristiti: geometrija pravog

ugla (eng. right-angle) i front-face geometrija (slika 3.17).

Slika 3.17 – Grafički prikaz front-face (A) i right-angle (B) geometrije.

Kada se se koristi geometrija pravog ugla, emisija se detektuje pod pravim uglom u

odnosu na pobudni zrak pri čemu je zrak fokusiran u centru kivete. Loša strana ove

geometrije je u tome što na primer kod visoko apsorbujućih rastvora sva apsorpcija će

se desiti blizu prednje površine kivete, sa vrlo malim pobuđivanjem koje stigne do

samog centra što rezultuje jako slabim intenzitetom emisije. U suštini kod geometrije

pravog ugla može doći do pojave samoapsorpcije kada se jako apsorbujući rastvor

ponaša kao unutrašnji filter. Ovakav efekat se eliminiše front-face geometrijom kod koje

upadni zrak zaklapa ugao od 22.8º ili 67.2º sa prednjom površinom kivete zavisno od


84

orijentacije adaptera, pri čemu je zrak fokusiran na prednju površinu uzorka. Na ovaj

način se minimizira reflektovana i rasejana svetlost. Front-face geometrija se najviše

koristi kod jako koncentrisanih, neprozirnih rastvora i čvrstih uzoraka poput krvi, živih

ćelija, polimernih filmova ili fosfora.

85

4. Materijali i metode

U ovoj disertaciji mereno je i analizirano četiri sistema kompleksnih fluorescentnih

karakteristika (sadrže više od jedne fluorofore) od čega su tri organska sistema i jedan

neorganski:

1. Rastvor vode i dve aminokiseline (triptofan i tirozin) u različitim odnosima

koncentracija.

2. Uzorci meda različitog botaničkog porekla (lipa, livada, bagrem, suncokret i

falsifikati).

3. Uzorci tkiva kancera dojke sa malignim promenama i uzorci normalnog tkiva

dojke.

4. Tri neorganska jedinjenja (Gd2O3, Gd2Ti2O7 i GdVO4 dopirani europijumom

(Eu3+)) čista i u mešavinama sa druga dva jedinjenja u različitim odnosima

koncentracija.

4.1 Priprema uzoraka

4.1.1 Rastvor vode i aminokiselina

Za prvi sistem bilo je pripremljeno 6 uzoraka za dalju analizu. Priprema uzoraka je

podrazumevala rastvaranje dve aminokiseline, triptofana i tirozina, u vodi u šest

različitih odnosa njihovih koncentracija. Tačne količine aminokiselina za svaki uzorak

su date u tabeli 4.1. Date količine aminokiselina su bile rastvarane u 200 ml destilovane

vode na sobnoj temperaturi. Pošto su aminokiseline lako rastvorne u vodi na sobnoj

temperaturi, nije bilo potrebno dodatno zagrevanje jedinjenja. Dobijeni rastvor je bio

sipan u kvarcne kivete zapremine 3 ml, kvadratnog poprečnog preseka dimenzije 10

×10 mm, a zatim je kiveta postavljana u poseban držač za kivete u spektrofotometru.


86

Tabela 4.1 Količina rastvorenih aminokiselina za svaki uzorak.

Br. uzorka Triptofan [mg] Tirozin [mg]

1. 0 150

2. 60 0

3. 30 180

4. 40 110

5. 40 150

6. 55 100

4.1.2 Med

Za drugi sistem bilo je sakupljeno 117 uzoraka meda (12 lipa, 30 livade, 47 bagrema, 14

suncokreta i 14 falsifikata) uz pomoć saveza pčelarskih organizacija Srbije (SPOS;

www.spos.info). Svi uzorci su pre merenja bili zagrejani na temperaturi od 40ºC radi

lakšeg sipanja uzoraka u kvarcne kivete za merenje. Osim zagrevanja, pre merenja

uzorci meda nisu bili ni na koji drugi način tretirani. Svaki uzorak je bio sipan u

kvarcnu kivetu zapremine 3 ml, kvadratnog poprečnog preseka dimenzije 10 ×10 mm, a

zatim je kiveta postavljana u poseban držač za kivete u spektrofotometru.

4.1.3 Tkivo dojke

Uzorci kancera (8 uzoraka) i normalnog (10 uzoraka) tkiva dojke su bili sakupljeni

nakon operacije 18 pacijenata u Institutu za Onkologiju i Radilogiju Srbije. Svi uzorci

su bili histopatološki ispitani i zatim odloženi na -80ºC do početka merenja. Po

odmrzavanju uzoraka, skalpelom su bili odsečeni delovi tkiva veličine od 0.2 × 0.5 ×

0.5 cm do 0.3 × 1.0 × 1.5 cm. Tako isečen uzorak je zatim stavljan između dve staklene

pločice koje su učvršćene, a zatim je pločica postavljana na specijalan držač u

spektrofotometru.


87

4.1.4 Neorganski materijali

Tri neorganska jedinjenja Gd2O3 :Eu3+, Gd2Ti2O7 :Eu3+ i GdVO4 :Eu3+ su bila sintetisana

kompleksnim hemijskim metodama: metoda polimerno-kompleksnog rastvora [Andrić

et al. 2008], metoda precipitacije [Jovanović et al. 2013] i metoda mešovitog metal

limunska kiselina kompleksa [Ćulubrk et al. 2014]. Navedene metode neće biti detaljno

opisane u ovom radu jer nisu predmet ispitivanja ove teze, a čija metodologija je

detaljno opisana u navedenim naučnim radovima. Za merenje je bilo pripremljeno 7

uzoraka za kalibraciju i 21 uzorak za testiranje modela u kojima su se ova jedinjenja

nalazila čista ili su bila međusobno mešana u različitim odnosima (tabela 4.2).

Tabela 4.2 Odnosi koncentracija tri neorganska jedinjenja za svaki uzorak.

Broj

uzorka Gd2O3 :Eu3+ [%] Gd2Ti2O7 :Eu3+ [%] GdVO4 :Eu3+ [%]

Set

za

kal

ibra

ciju

1. 26 0 74

2. 43 20 37

3. 43 57 0

4. 72 0 28

5. 0 90 10

6. 0 70 30

7. 0 80 20

Set

za

test

iran

je

1. 97 2.5 0.5

2. 97 2 1

3. 65 35 0

4. 65 0 35

5. 80 20 0

6. 80 0 20

7. 93 7 0

8. 94 0 6

9. 98 0 2

10. 99.7 0 0.3

11. 99.9 0.1 0

12. 99.9 0 0.1

13. 99 1 0


88

14. 99 0 1

15. 0 65 35

16. 0 80 20

17. 0 92 8

18. 0 98 2

19. 0 99.5 0.5

20. 0 99.9 0.1

21. 0 99 1

4.2 Merenje fluorescentnih spektara

Merenja fluorescentnih spektara su bila izvedena na dva spektrofotometra: Perkin Elmer

LS45 i Horiba JobinYvon FL-221. Šeme ova dva uređaja su prikazane na slikama 4.1 i

4.2, respektivno.

Slika 4.1 – Šema spektrofotometra Perkin Elmer LS45.

Kao izvor pobude u spektrofotometru Perkin Elmer LS45 koristi se impulsna

ksenonska lampa dok je detektor fotomultiplikatorska cev Hamamatsu R928. Ovaj


89

uređaj takođe ima i dva monohromatora, ekscitacioni i emisioni, čiji su opsezi rada od

200 do 800 nm. Princip rada je sledeći:

Od lampe se emituje svetlost i uz pomoć sistema ogledala usmerava ka ulaznom

razrezu monohromatora.

Polihromatska svetlost koja uđe u monohromator se usmerava na difrakcionu

rešetku gde se kao rezultat interferencije dobija monohromatska svetlost željene

talasne dužine koja se dalje usmerava ka izlaznom razrezu monohromatora.

Monohromatska svetlost zatim stiže do delitelja svetlosnog snopa gde se jedan

deo svetlosti usmerava na referentni uzorak, koji za cilj ima automatsku

korekciju intenziteta pobudne svetlosti, dok se drugi deo svetlosti usmerava ka

uzorku koji je postavljen na poseban držač.

Svetlost emitovana sa uzorka se dalje sakuplja na ogledalo koji ima poziciju pod

uglom od 90º, a zatim usmerava na drugi monohromator (emisioni).

Na kraju svetlost željene talasne dužine koja je izašla iz monohromatora

usmerava se i stiže do detektora.

Detektovan signal se zatim registruje na računaru i prikazuje izmereni spektar.

U spektrofotometru Horiba JobinYvon FL-221 se nalaze dve lampe koje se koriste kao

izvor pobude. Ksenonska lampa 450-W se koristi kao izvor kod emisionih merenja dok

se Xe-Hg pulsna lampa primenjuje za merenje vremenski razlučenih luminescentnih

spektara i vremena života pobuđenog stanja. Za razliku od prethodnog uređaja ovaj ima

dva emisiona monohromatora pri čemu je jedan dupli monohromator i pokriva opseg

talasnih dužina od 200 do 850 nm, dok je drugi jednostruki monohromator i pokriva

opseg od 800 do 1600 nm. Detektor korišćen za merenja za potrebe ove teze je

fotomultiplikatorska cev TBX-04-D PMT, dok osim tog detektora ovaj uređaj poseduje i

IR detektor koji se koristi za merenja u infracrvenom delu spektra. Princip rada ovog

uređaja je:

Svetlost izvora pobude se emituje i uz pomoć sistema ogledala usmerava ka

ekscitacionom monohromatoru.

Svetlost prolazi kroz dupli ekscitacioni monohromator, odnosno dva

monohromatora vezana u red, pri čemu se dobija monohromatska svetlost


90

određene talasne dužine koja ze zatim usmerava ka izlaznom razrezu

monohromatora.

Monohromatska svetlost se zatim usmerava ka uzorku i pobuđuje ga.

Svetlost emitovana od uzorka zatim biva usmerena kaulazno razrezu duplog

emisionog monohromatora koji se nalazi pod uglom od 90º u odnosu na osu

ekscitacionog monohromatora. Ovom geometrijom se minimalizuju smetnje

koje potiču od propuštene i rasejane ekscitacione svetlosti.

Svetlost prolazi kroz emisioni monohromator, pri čemu se na izlaznom razrezu

dobija monohromatski svetlosni signal određene talasne dužine koji stiže do

detektora.

Detektovani signal se prenosi na računar i na ekranu se prikazuje izmereni

luminescentni spektar.

Slika 4.2 – Šema spektrofotometra Horiba JobinYvon FL-221.


91

Osim merenja ekscitacionih i emisionih spektara na ovom uređaju je moguće meriti i

vreme života pobuđenog stanja. Ova merenja se vrše uz pomoć stanice sa podacima sa

integrisanim TCSPC softverom (eng. Time Corelated Single Photon Counting). Pri

ovim merenjima koristi se impulsna pobudna svetlost (Xe-Hg lampa) pri čemu je

poželjno da impuls lampe bude kraći od vremena života merenog uzorka. Pri ovom

merenju uzorak se pobuđuje serijom ponovljenih impulsa tokom čega se meri broj

fotona koji se detektuje u mernim kanalima, što predstavlja vreme dolaska fotona na

detektor, i na taj način se dobija emisija uzorka. Vreme života se na kraju računa na

osnovu krive fluorescencije dobijene serijom pobudnih impulsa.

Za uzorke organskih sistema bile su merene ekscitaciono-emisione matrice, dok je za

uzorke neorganskog sistema meren emisioni spektar i vreme života pobuđenog stanja.

Sva merenja su bila izvedena u front-face geometriji merenja.

4.2.1 Ekscitaciono-emisione matrice (EEM)

EEM uzoraka sva tri organska sistema su bile merene na Perkin Elmer LS45

spektrofotometru. Za pobudu je bila korišćena impulsna ksenonska lampa dok je za

detekciju bio korišćen detektor Hamamatsu R928. Ulazni i izlazni razrezi su bili 10 nm,

pošto je njihova širina kod ovog uređaja fiksirana i nije je moguće podešavati.

Primenom referentne fotofiode svi izmereni spektri su bili automatski korigovani na

intenzitet pobude. Uslovi merenja za svaki sistem pojedinačno su bili sledeći:

1) Amino kiseline – opseg ekscitacije 240-500 nm sa korakom 5 nm, opseg emisije

270-500 nm sa korakom 0.5 nm, brzina snimanja u oba opsega je bila 1000

nm/min. Dobijena EEM je bila veličine 462 × 53, odnosno bilo je snimljeno 53

emisiona spektra za 462 talasne dužine emisije.

2) Med – za ovaj sistem su bile izmerene EEM za 84 uzoraka pod sledećim

uslovima merenja: opseg ekscitacije 240-495 nm sa korakom 5 nm, opseg

emisije 270-640 nm sa korakom 0.5 nm, brzina snimanja u oba opsega je bila

200 nm/min. Dobijena EEM je bila veličine 741 × 52.


92

3) Dojka – kod ovog sistema bila su merena dva regiona. Region I: opseg

ekscitacije 335-400 nm sa korakom 5 nm, opseg emisije 430-645.5 nm sa

korakom 0.5 nm, brzina snimanja u oba opsega je bila 150 nm/min. Dobijena

EEM je bila veličine 432 × 14. Region II: opseg ekscitacije 400-470 nm sa

korakom 5 nm, opseg emisije 500-625 nm sa korakom 0.5 nm, brzina snimanja

u oba opsega je bila 150 nm/min. Dobijena EEM je bila veličine 251 × 15.

4.2.2 Sinhroni fluorescentni spektri

Sinhroni fluorescentni spektri uzoraka sva sistema meda i tkiva dojke su bile merene na

Perkin Elmer LS45 spektrofotometru. Spektri su bili snimani uz održavanje konstantnog

rastojanja između talasne dužine ekscitacije i emisije. Korišćeni detektor i izvor pobude

su bili isti kao i za merenje EEM-a. Razrezi su bili 10 nm, a spektri su bili automatski

korigovani na intenzitet pobude uz primenu referentne fotodiode. Uslovi merenja su bili

sledeći:

1) Med – sinhroni spektri su bili izmereni za 109 uzoraka sa opsegom ekscitacije

od 240-500 nm sa korakom 0.5 nm i sinhronim intervalom u opsegu od 30-300

nm sa korakom 5 nm (55 intervala). Kao rezultat merenja bilo je dobijeno 55

matrica dimenzija 109×521.

2) Dojka - opseg ekscitacije od 330-650 nm sa korakom 0.5 nm i sinhronim

intervalom u opsegu od 30-120 nm sa korakom 5 nm. Kao rezultat je dobijeno

19 matrica dimenzija 18×641.

4.2.3 Emisioni spektri i vreme života

Za merenje emisionih spektara i vremena života uzoraka kompleksnog sistema fosfora

na bazi retkih zemalja bio je korišćen Horiba JobinYvon FL-221 spektrofotometar. Za

merenja emisionih spektara kao pobuda je korišćena 450-W ksenonska lampa, dok je za

merenja vremena života korišćena Xe-Hg. Emisioni opseg merenja je bio od 570 do 650

nm u koraku od 0.1 nm, dok je talasna dužina ekscitacije bila 466 nm. Vreme života


93

pobuđenog stanja je bilo mereno nakon ekscitacije uzorka na 466 nm i zatim je dobijena

kriva iz koje se računa vreme života merenog uzorka. Dobijeni spektri su bili dimenzije

801 × 101, gde je bio meren intenzitet emisije za 801 talasnu dužinu emisije i za vreme

od 0 do 10 ms sa korakom od 0.1 ms (101 vrednost).

4.3 Analiza i modeliranje dobijenih spektara

Deo obrade EEM spektara se sastojao iz dva dela: 1) adekvatna priprema odnosno

predprocesiranje dobijenih EEM i 2) analiza i građenje PARAFAC modela merenih

sistema kao i dalja analiza rezultata modela PLS-DA i SVM metodom. Analiza

sinhronih spektara je obuhvatala takođe dva koraka: 1) predprocesiranje spektara i 2)

analiza spektara primenom PCA, PLS-DA i SVM metoda. Za analizu i modeliranje

spektara za potrebe ove teze bili su korišćeni programski paketi Solo verzija 6.5.4

(Eigenvector Inc., Chelan, WA, USA) i Matlab R2012a (uz dodatak N-way Toolbox-a,

besplatno dostupnog na sajtu www.models.kvl.dk).

4.3.1 Priprema podataka za analizu

Kako bi osigurali tačnost dalje analize i modeliranja spektara neophodna je

odgovarajuća priprema podataka za PARAFAC analizu. Da bi se podaci pripremili prvo

ih je neophodno organizovati na odgovarajući način i to formiranjem trodimenzionalnih

matrica za svaki sistem:

1) Podaci aminokiselina su bili organizovani u set podataka (eng. data set) koji je u

sebi sadržao matricu dimenzije 6 × 462 × 53 (broj uzoraka × broj talasnih dužina

emisije × broj talasnih dužina ekscitacije) i informaciju o talasnoj dužini za

svaki parametar. Kao posebna matrica bila je uneta i informacija o tačnim

koncentracijama aminokiselina za svaki uzorak koja je bila neophodna za

kasniju kalibraciju modela.


94

2) Podaci meda su bili organizovani u set podataka sa matricom dimenzije 84 ×

741 × 52 i informacijom o klasnoj pripadnosti svakog uzorka i talasnoj dužini

kojoj svaki parametar odgovara.

3) Za podatke kancera dojke formiran je set podataka sa matricom veličine 18 ×

432 × 14 i informacijom o klasnoj pripadnosti svakog uzorka i talasnoj dužini

kojoj svaki parametar odgovara.

4) Podaci kompleksnog sistema fosfora na bazi retkih zemalja su bili organizovani

u dva seta podataka sa matricom dimenzije 7 × 801 × 101 (broj uzoraka × broj

talasnih dužina emisije × broj vremenskih mernih tačaka) za kalibracioni set i 21

× 801 × 101 za test set i informacijom o tome kojem vremenskom trenutku i

kojoj talasnoj dužini emisije svaki član matrice odnosno parametar odgovara.

Slika 4.3 – Trodimenzionalni (levo) i konturni (desno) grafik neobrađene EEM jednog

uzorka meda.

Sinhroni spektri su već bili organizovani na odgovarajući način za dalju analizu tako da

nisu zahtevali dodatnu doradu u tom smislu. Priprema podataka se uglavnom sastoji od

centriranja podataka srednjom vrednošću, skaliranja i uklanjanja artefakta u podacima

ukoliko postoje. Kao što je ranije bilo rečeno (odeljak 2.3.13) kod EEM fluorescentnih

spektara ne postoji potreba za centriranjem i skaliranjem podataka, dok se kod sinhronih

spektara vrši centriranje radi lakše interpretacije rezultata PCA modela. Jedini problem

koji se često javlja kod fluorescetnih podataka jeste pojava raznih artefakta poput

rasejanja ili nekih drugih pikova koji nisu rezultat luminescetnih karakteristika

supstanci u uzorku. Rasejanje se kod sinhronih spektara retko javlja jer se te talasne


95

dužine često ne obuhvate merenjem. Ovakve pojave se uglavnom lako uočavaju kod

EEM jer se oni vide kao pikovi koji su ravni i konstantog intenziteta. Na slici 4.3 je

prikazan trodimenzionalni i konturni grafik neobrađene EEM jednog izmerenog uzorka

meda. Može se primetiti očigledno prisustvo Rejlijevog rasejanja prvog i drugog reda

koje je mnogo većeg intenziteta od fluorescencije samog uzorka. Po uklanjanju

Rejlijevog rasejanja na način čiji je postupak bio objašnjen u prethodnom poglavlju

dobija se EEM bez rasejanja gde se jasnije može videti izgled spektra merenog uzorka

(slika 4.4). U ovom trenutku je takođe neophodno videti da li slučajno postoji još neka

nepravilnost u spektru koja se nije mogla videti dok je rasejanje bilo prisutno. Na

konturnom garfiku na slici 4.4 se uočava još jedan pik na talasnoj dužini ekscitacije od

400 do 430 nm i emisije od 580 do 630 nm ( zaokruženo crvenom bojom na grafiku)

oblika ravne linije koji se javljao na istom mestu i istog intenziteta kod svih uzoraka što

može da bude vezano za sam uređaj, pa je i taj deo spektra bio odsečen jer u tom opsegu

se u svakom slučaju nije javljao ni jedan drugi pik bitan za posmatrani sistem. Uzorci

meda i aminokiselina su bili na isti način obrađivanji, u smislu uklanjanja rasejanja i

prethodno spomenutog artefakta, za koji se na kraju zaključilo da se javlja na svim EEM

spektrima na toj poziciji merenim na spektrofotometru Perkin Elmer LS45. Kako se

uzorci dojke nisu merili na talasnim dužinama gde se javlja Rejlijevo rasejanje, kod njih

nije bilo neophodno uklanjati te delove već samo navedeni artefakt. Celokupna

priprema podataka je bila izvedena u programskom paketu Matlab. Kod sinhronih

spektara ovaj artefakt se nije pojavljivao.

Slika 4.4 - Trodimenzionalni (levo) i konturni (desno) grafik EEM jednog uzorka meda

sa uklonjenim Rejlijevim rasejanjem.


96

4.3.2 Proračun i analiza PARAFAC modela

Posle odgovarajuće pripreme podataka može se pristupiti građenju PARAFAC modela

na osnovu izmerenih i obrađenih EEM-a. Svaki proračun modela se sastoji iz više

koraka. Prvo na osnovu prikupljenih informacija o merenim sistemima treba

pretpostaviti broj komponenata modela, koji odgovara broju fluorofora koje se nalaze u

posmatranom sistemu. Takođe je bitno napomenuti da nekad iako možda ima više

fluorofora u sistemu je moguće da neke od njih nemaju veliki doprinos ili nisu

dominantne u odnosu na druge tako da se one u tom slučaju zanemaruju u modelu.

Kako je popstupak proračuna PARAFAC modela vrlo kompleksan on neće biti detaljno

opisan u daljem tekstu već će biti samo ukratko objašnjeno koji su parametri neophodni

za proračun modela.

Parametri odnosno podaci koji su neophodni i koji se unose u kod pri modeliranju

jednog sistema su: matrica X (podaci koje želimo da modeliramo), pretpostavljeni broj

komponenata u sistemu, različite opcije modela, ograničenja itd. Matrica X predstavlja

n-dimenzionalnu matricu koju želimo da modeliramo i za koju se podrazumeva da ima

varijacije samo u jednoj dimenziji odnosno modu, dok su druge za sve uzorke iste. Na

primer kod EEM to znači da su nam za sve uzorke jednog sistema ekscitacioni i

emisioni spektri pojedinačnih fluorofora isti, a da se samo koncentracija tih fluorofora

za svaki uzorak variraju. Opcije nam daju mogućnost ubacivanja nekih dodatnih

parametara u proračunu poput: kriterijuma konvergencije – za koju vrednost relativne

promene u fitu modela želimo da se algoritam zaustavi pri čemu je standardno podešeno

da ta vrednost bude 10-6; metode inicijalizacije; načina prikaza rezultata; maksimalnog

broja iteracija itd. Ograničenje nam omogućava da postavimo ograničenje svakom

modu pojedinačno poput nenegativnosti, unimodalnosti ili ortogonalnosti moda. Za sve

naše modele bilo je korišćeno ograničenje nenegativnosti pošto nijedan od modova

(koncentracija, emisija, ekscitacija i vreme života) ne mogu imati negativnu vrednost.

Sve opcije su bile ostavljene na standardnim podešavanjima. Broj komponenata za

modele meda i kancera dojke su bili pretpostavljeni na osnovu prikupljenih podataka i

bilo je izgrađeno više modela sa različitim brojem komponenata, zatim na osnovu

validacije (split-half analiza i leave-one-out metoda odeljak) i interpretacije modela je


97

bilo odlučeno koji model najbolje opisuje posmatrani sistem. Za aminokiseline i

kompleksni sistem fosfora na bazi retkih zemalja broj komponenata je bio već poznat

jer su oba bila sintetisana kod nas u laboratoriji. U slučaju aminokiselina model je bio

validiran na osnovu kalibracije.

Kada je dobijen odgovarajući model za svaki od kompleksnih sistema može se pristupiti

njihovoj analizi. Kao rezultat svakog modela dobijamo tri grafika, odnosno za svaki

mod po jedan grafik. Za dva fiksna moda dobijamo prikaz fenomena odnosno model

koji je jedinstven za taj sistem, dok treći prikazuje vrednosti skorova za svaki uzorak

odnosno varijacije među uzorcima tog sistema. Zavisno od sistema koji analiziramo

pratimo različite trendove koji se javljaju među uzorcima i čime su oni uslovljeni. Na

ovaj način možemo oceniti signifikantnost modela. Kod sistema meda i kancera dojke

moguće je ispratiti kako promene koncentracija određenih flurofora utiču na pojedine

trendove koji se javljaju među uzorcima. Kod aminokiselina i neorganskog sistema se

može posmatrati kako se sa promenom intenziteta menja i koncentracija i uz koliku

tačnost se može odrediti prisutnost i koncentracija neke fluorofore u nepoznatom uzorku

na osnovu njegovog luminescentnog spektra ili emisionog spektra i vremena života,

respektivno.

4.3.3 Proračun i analiza PCA modela

Postupak proračuna PCA modela je mnogo manje zahtevan od PARAFAC analize. Kod

ovog modela se vrši redukcija dimenzionalnosti podataka pri čemu prvih nekoliko

glavnih komponenata sadrže procentualno najviše informacija o varijabilnosti među

uzorcima sistema. Cilj ovog modela je da sa što manjim brojem glavnih komponenata

opiše procentualno što više varijabilnosti prisutnih u sistemu. Kod spektralnih podataka

primenom PCA analize je moguće opisati sve karakteristike sistema sa jako malim

brojem glavnih komponenata, nekad i sa samo dve. Prednost ove analize je

pojednostavljena vizuelizacija spektralnih podataka, gde se uz pomoć grafika prve dve

komponente može analizirati da li postoje neki trendovi među uzorcima i mogu se na

jednostavan način interpretirati rezultati. Sam proračun podrazumeva unos centriranih

podataka u program i građenje modela. Odabir broja komponenata modela se vrši na

osnovu procenta obuhvaćene kumulativne varijabilnosti koju glavne komponente


98

opisuju, gde se najčešće bira broj komponenata čija je kumulativna varijabilnost preko

90%. Broj komponenata se ne mora uvek birati na osnovu te vrednosti, ali to

prevashodno zavisi od podataka koji se modeliraju. Kada se odabere željeni broj glavnih

komponenata, njihovi skorovi se mogu koristiti kao parametri sistema za dalju analizu.

Dobijeni rezultati se zatim analiziraju uz pomoć grafika rasutosti skorova glavnih

komponenata kao i grafika loadings-a glavnih komponenata. Na osnovu grafika

rasutosti mogu se uočiti grupisanja i međusobni odnosi uzoraka. Analizom grafika

loadings-a mogu se videti pozicije u spektrima gde se nalaze najveće varijacije među

spektrima uzoraka. Te pozicije na spektrima se uočavaju kao pozicije maksimuma i

minimuma krive.

4.3.4 Proračun i analiza PLS-DA modela

Za građenje PLS-DA modela u program se unose centrirane matrice sa podacima

organizovane na način da svaki red odgovara uzorcima, a kolone parametrima. Ovaj

model ne zahteva dimenzionalno redukovane podatke jer on sam vrši redukciju i računa

nove latentne varijable na osnovu kojih vrši klasifikaciju uzoraka. U početnim

podacima dodatno se moraju definisati i klasne pripadnosti svakog uzorka kako bi

model mogao da se obuči za klasifikaciju. Ovaj model vrši klasifikaciju tako što pravi

više modela gde svaki od njih razdvaja jednu klasu od svih drugih klasa. Na taj način

ukoliko imamo 5 grupa ovaj model će se sastojati od 5 manjih modela i pri validaciji

modela biće dobijeno 5 grešaka modela, odnosno dobiće se greška klasifikacije za

svaku grupu ponaosob. I kod ovog modela neophodno je odabrati broj latentnih varijabli

koje će biti korišćene za klasifikaciju. Uvek se teži tome da taj broj bude što manji kako

model ne bi bio predefinisan i nestabilan. Broj varijabli se u ovom slučaju bira na

osnovu grešaka klasifikacije modela i grafika praga klasifikacije. U ovoj analizi se

razmatraju dve greške modela: kalibraciona i unakrsno validirana. Kalibraciona greška

predstavlja grešku koju model pretpostavlja dok unakrsno validirana greška je dobijena

realnim testiranjem modela nepoznatim uzorcima. Kod stabilnog i optimalnog modela

ove dve greške bi trebale da budu istih ili što sličnijih vrednosti. Sa povećanjem ili

smanjenjem optimalnog broja latentnih varijabli ove dve greške će se sve više varirati.

U nekim slučajevima ove greške mogu biti iste , ali da sam model bude nestabilan usled


99

predefinisanosti, tada se proverava stabilnost modela analizom grafika praga

klasifikacije. Programski paket kao jedan od rezultata analize daje grafički prikaz ovih

grešaka za različite brojeve latentnih varijabli, uz pomoć kojeg se na jednostavniji način

može uočiti koji broj najviše odgovara modelu. Grafik praga klasifikacije pokazuje

senzitivnost i specifičnost modela u funkciji praga klasifikacije. Sa ovog grafika se

može videti stabilnost dobijenog modela za svaku grupu ponaosob. Stabilan PLS-DA

model mora imati isti ili sličan procenjen i unakrsno validiran odgovor, što se na ovom

grafiku može videti ukoliko se procenjena i validirana kriva poklapaju.

4.3.5 Proračun i analiza SVM modela

Postupak proračuna SVM modela je vrlo sličan prethodno opisanom postupku za PLS-

DA model. U sam program se unose podaci u obliku matrice gde važi da su redovi

uzorci, a kolone parametri na osnovu kojih se gradi model. Za ovaj proračun podaci ne

moraju biti centrirani već se mogu neobrađeni ubaciti u program. Kada se podaci unesu

neophodno je definisati klase svakog uzorka u matrici. Nakon toga se podešavaju

parametri modela, odnosno tip kernela koji će biti korišćen za obuku modela, tip

kompresije podataka ukoliko želimo da redukujemo dimenziju ulaznih podataka i broj

setova na koji će podaci biti deljeni radi obuke i testiranja. Za analize u ovom radu bio

je korišćen linearan kernel pri čemu podaci nisu bili komprimovani. Ulazni podaci su

bili deljeni na dva seta podataka, jedan za obuku i jedan za testiranje dobijenog modela.

Kao rezultat na kraju se dobijaju greške klasifikacije modela koje zatim analiziraju.

4.3.6 Proračun zapremine spektralnih domena

Zapremine spektralnih domena (zapremine ispod površine luminescentnog intenziteta)

su bile u ovom radu računate numerički. Spektralni domen od interesa (x-y površina →

λexc-Δλ domen) predstavlja se mrežom diskretnih tačaka (xi, yj), od kojih svaka ima

jedinstvenu vrednost uzetu iz spektralnog domena: xi = xmin + i∆x; yj = ymin + j∆y, ∆x =

(xmax - xmin)/N, ∆y = (ymax - ymin)/M, gde ‘max’ i ‘min’ označavaju gornju i donju


100

spektralnu granicu, a N i M su faktori diskretizacije. Zatim se zapremine spektralnih

domena računaju primenom sledeće jednačine:

max

min

max

min1 1

).,()(),(

y

y

x

x

M

j

N

i

ji yxIyxdxdyyxI (1.81)

101

5. Rezultati i diskusija

Primena PARAFAC analize za modeliranje fluorescentnih EEM-a je doživelo veliku

ekspanziju u poslednjih nekoliko godina [Callejón et al. 2012, Bro 1999,Christensen et

al. 2005] pogotovo u analizi prehrambenih proizvoda. Kombinacija ovih metoda je

pokazala veliki potencijal za primenu u kvalitativnoj analizi kako prehrambenih tako i

bioloških uzoraka na brz i jednostavan način. Uprkos svojim prednostima ona se još

uvek nedovoljno primenjuje iz razloga što dobijanje dobrog i pouzdanog modela jednog

kompleksnog sistema zahteva veliki broj uzoraka i jako puno proračuna i podešavanja

dok se ne odrede optimalni parametri za model određenog sistema. U ovoj tezi su

pravljeni modeli za četiri različita kompleksna sistema pri čemu se uzimao u obzir i

krajnji cilj odnosno praktična primena dobijenog modela. Kod modeliranja prvog

sistema, rastvora vode i dve aminokiseline, cilj je bio da se pokaže na jednostavnijem

primeru na koji način se spektri modeliraju PARAFAC metodom i šta se dobija kao

rezultat jednog takvog proračuna. Takođe je želja bila da se pokaže praktična primena

jednog takvog modela i na koji način on funkcioniše. Druga tri sistema koja su

modelirana u okviru ove teze se na osnovu naših saznanja iz stručne literature po prvi

put modeliraju i iz tog razloga su zahtevala jako puno proračuna kako bi se odredili

optimalni uslovi modela. Sistem meda je bio najkompleksniji od sva tri, a njegovo

modeliranje je imalo za cilj da se prouči koje fluorofore imaju najveći uticaj na

botaničko poreklo i kvalitet meda. S obzirom na kompleksnost i visoku cenu

standardnih metoda za analizu meda, postoji velika potražnja za metodom koja je brza,

jeftina i ne zahteva specijalnu obuku operatera. Osim modeliranja i analize EEM

spektara uzoraka meda, bili su analizirani i njihovi sinhroni fluorescentni spektri

metodom glavnih komponenata i PLS-DA metodom, kako bi se uporedili rezultati dva

različita pristupa i ustanovile njihove prednosti i mane. Modeliranje zdravog i malignog

tkiva dojke je imalo za cilj određivanje tačnog broja fluorofora prisutnih u tkivu i

analizu varijacije njihovih koncentracija u malignom i zdravom tkivu. Današnji trendovi

u medicini teže razvijanju novih neinvazivnih, brzih i pouzdanih metoda za praćenje

promena u humanim tkivima. Ova metoda ima veliki potencijal kao metoda koja

ispunjava te uslove i može se koristiti kao „screening“ test za razne vrste bolesti jer

svaka patologija u organizmu utiče na promenu fluorescencije kako tkiva tako i telesnih


102

tečnosti. Osim trodimenzionalnog modela tkiva dojke, takođe je bio ispitivan i drugi

pristup ovim podacima. U tom slučaju su bili računati parametri iz sinhronih

fluorescentnih spektara i EEM-a koji su zatim korišćeni za obučavanje SVM algoritma.

Dobijeni rezultati su nakon toga bili poređeni sa rezultatima SVM algoritma

obučavanog na osnovu parametara PARAFAC modela u cilju određivanja ulaznih

parametara koji omogućavaju izgradju najuspešnijeg modela. Poslednji sistem koji je

jedini bio neorganski je bio modeliran kako bi se iz mešavine tri neorganska

fluorescentna materijala odredila prisutnost i tačna koncentracija tih supstanci na

osnovu njihovih emisionih spektara i vremena života. Neorganski luminescentni centri

imaju veoma karakteristične emisione spektre, međutim neki od njihovih pikova se

javljaju na jako bliskim pozicijama i time dolazi do njihovog preklapanja. Iz tog razloga

je u takvim situacijama teško odrediti koje supstance i u kojoj količini se nalaze u

uzorku. Uz primenu PARAFAC modela ovaj problem se vrlo jednostavno rešava i daje

mogućnost karakterizacije datog materijala uz primenu samo jedne metode, na osnovu

čijih se spektara može ustanoviti da li je materijal čist ili su prisutne još neke supstance

u materijalu. Bitno je naglasiti da je u ovoj tezi po prvi put pri proračunu PARAFAC

modela bila korišćena vremenska zavisnost kao treća dimenzija ulazne matrice

kompleksnog sistema.

5.1 Rastvor vode i aminokiselina

Kao što je prethodno bilo navedeno za uzorke kompleksnog sistema rastvora vode i

aminokiselina bile su izmerene ekscitaciono-emisione matrice. Na slici 5.1 su prikazani

konturni grafici izmerenih EEM-a za tri uzorka na kojima je uklonjeno Rejlijevo

rasejanje prvog i drugog reda koje se na graficima vidi kao bela traka.

Na slici 5.1 a) je prikazan spektar za mešavinu koja sadrži obe aminokiseline dok su

pod b) i c) prikazani spektri za čist tirozin i čist triptofan, respektivno. Ono što se

primećuje na ovim spektrima jeste da je intenzitet fluorescencije triptofana mnogo jači

od fluorescencije tirozina iako je koncentracija triptofana manja od koncentracije

tirozina u rastvoru. Ovaj fenomen je već poznat i često se u biološkim uzorcima

fluorescencija tirozina ne vidi ili je jako slaba usled mnogo dominantnije fluorescencije


103

triptofana. Iz tog razloga je u pripremi uzoraka o tome vođeno računa i bile su stavljane

veće koncentracije tirozina kako bi i on došao do izražaja.

Cilj merenja i modeliranja ovog kompleksnog sistema sa samo dve fluorofore je bio da

se prikaže koliko pouzdano može da se izmodelira jedan kompleksan sistem i sa

kolikom tačnošću mogu da se odrede koncentracije obe fluorofore u svim uzorcima ako

se kalibriše koncentracijom u samo jednom uzorku. Problem na koji se često nailazi pri

modeliranju realnih bioloških sistema je taj da ne možemo uvek odrediti koncentracije

fluorofora u uzorku standardnim hemijskim metodama pa je stoga i kalibracija i potvrda

datog modela mnogo teža. Ali kako postoje druge metode validacije modela, ako

dobijemo dobar model on nam uvek kao izlaz daje relativne koncentracije fluorofora u

uzorcima, pa tako u situacijama gde se koncentracija nekih fluorofora ne može odrediti

standardnim metodama ova metoda može da nađe svoju primenu.

Slika 5.1 – Konturni grafici EEM-a tri uzorka rastvora vode i aminokiselina: a)

mešavina sa obe aminokiseline, b) čist tirozin i c) čist triptofan.


104

Proračun PARAFAC modela za ovaj sistem je bio olakšan time što nam je broj

komponenata bio poznat. Na slici 5.2 je prikazan PARAFAC model (sva tri moda)

dobijen za ovaj sistem. Grafik prvog moda PARAFAC modela nam prikazuje relativne

koncentracije obe aminokiseline za svaki uzorak, odnosno skorove svakog uzorka. Na

graficima triptofan odgovara komponenti 1 dok komponenti 2 odgovara tirozin. Grafik

drugog i trećeg moda modela prikazuje emisioni i ekscitacioni spektar, respektivno, za

svaku komponentu. Ovi spektri su izvučeni kao osnovni fenomen ovog sistema i oni su

isti za sve uzorke dok je koncentracija jedina koja varira među uzorcima sistema.

Ukoliko bi uzeli skor jednog uzorka i pomnožili sa čistim spektrima u drugom i trećem

modu dobili bi početni izmereni spektar.

Slika 5.2 – Prikaz PARAFAC modela na osnovu EEM-a rastvora vode i aminokiselina

u: a) prvom, b) drugom i c) trećem modu.

a) b)

c)


105

Ono što takođe možemo da vidimo na graficima drugog i trećeg moda jesu emisioni i

ekscitacioni maksimumi za obe komponente. Kao što je rečeno ranije, maksimumi

zavisno od okoline mogu da budu malo pomereni odnosno da variraju, ali uglavnom se

javljaju u jednom malom opsegu talasnih dužina. Ukoliko nam komponente sistema

nisu poznate, onda na osnovu pozicije maksimuma pikova možemo da odredimo koje su

fluorofore u nekom sistemu prisutne. Ovde vidimo da triptofan i tirozin imaju

maksimum emisije na 365 i 310 nm, dok su im ekscitacioni maksimumi na 275 i 270

nm, respektivno, što približno odgovara pozicijama njihovih maksimuma datim u tabeli

3.2.

Slika 5.3 – Stvarne i modelom pretpostavljene koncentracije triptofana i tirozina u svim

merenim uzorcima.

Da bi validirali dati model bila je izvršena kalibracija modela, tako što je modelu data

poznata koncentracija fluorofora u jednom uzorku i zatim su dobijene pretpostavke

modela za koncentracije fluorofora u svim drugim uzorcima na osnovu relativnih

koncentracija koje je model izračunao. Na slici 5.3 je dat grafik na kome su prikazane


106

stvarne i modelom predviđene koncentracije obe fluorofore u sistemu. Primećujemo da

su odstupanja od stvarne koncentracije relativno mala i da su veća u slučaju tirozina.

Naime, odstupanja koncentracije u ovom konkretnom slučaju ne zavise toliko od

modela već od preciznosti same pripreme uzoraka. Kako tačnost merenja kada su

miligrami u pitanju može malo da varira i pošto su male količine supstanci bile

rastvarane u velikoj količini vode to je moglo na kraju da rezultuje malo drugačijim

odnosom koncentracija. Najtačnija provera validnosti modela bi bila da su rastvori bili

pripremljeni, a zatim je određivana koncentracija aminokiselina u rastvoru uz primenu

neke standardne hemijske metode. Međutim, usled nemogućnosti u datom trenutku da

se na taj način izvede merenje, odlučeno je da se pokuša sa ovim pristupom. Iako ovaj

postupak nije bio idealan, ipak je pokazano da model lepo opisuje posmatrani sistem i

da sa visokom preciznošću predviđa koncentracije fluorofora u uzorcima.

5.2 Med

5.2.1 Analiza EEM-a

Na slici 5.4 su prikazani konturni grafici izmerenih EEM-a sa uklonjenim Rejlijevim

rasejanjem za pet uzoraka koji predstavljaju po jedan tip meda: a) bagrem, b) lipa, c)

suncokret, d) livada i e) falsifikat.

Na konturnim graficima prikazanim na slici 5.4 se uočava da se fluorescentne

karakteristike uzorka iz različitih grupa botaničkog porekla meda razlikuju. Na primer,

livadski, bagremov i suncokretov med imaju veoma izražene pikove u delu spektra od

260-290 nm talasne dužine ekscitacije i između 330 i 360 nm talasne dužine emisije, pri

čemu livadski i bagremov med imaju jedan pik izraženiji od suncokretovog meda na

emisiji od oko 350 nm i ekscitaciji od oko 270 nm. Za razliku od njih, falsifikat i lipov

med u pomenutoj oblasti imaju pikove jako slabog intenziteta. Fluorescencija u toj

oblasti potiče od aromatičnih aminokiselina i pretpostavlja se da na osnovu njihovih

koncentracija može utvrditi botaničko poreklo meda.


107

Slika 5.4 – Konturni grafici EEM-a 5 uzoraka meda različitih tipova: a) bagrem, b) lipa,

c) suncokret, d) livada i e) falsifikat.

Na osnovu ekscitaciono-emisionih matrica bio je urađen proračun 10 modela (broj

komponenata 1-10) i na osnovu split-half analize i analize ostataka, model koji je dao

najbolje rezultate je model sa 6 komponenata sa ograničenjem nenegativnosti u sva tri

moda. Na slici 5.5 su prikazana sva tri moda PARAFAC modela meda.

a) b)

c) d)

e)


108

Slika 5.5 – Prikaz PARAFAC modela na osnovu EEM-a uzoraka meda za: a) prvi, b)

drugi i c) treći mod.

Drugi i treći mod prikazanog PARAFAC modela meda nam prikazuju emisione i

ekscitacione spektre 6 fluorofora prisutnih u medu. Kao što je ranije navedeno

fluorescentni spektri fluorofora su jako osetljivi na okolinu u kojoj se nalaze, stoga

pozicija i oblik spektra zavise od: količine vlage koju sadrži određena biljka,

viskoznosti i pH vrednosti okoline u kojoj se fluorofora nalazi. Prva komponenta

(plava) ima ekscitacioni maksimum na 330 nm i emisioni maksimum na 430 nm. Prema

rezultatima Rodrigez-Delgado i saradnika [Rodrigez-Delgado et al.] fenolične

komponente imaju maksimum ekscitacije u opsegu između 265 i 335 nm i maksimum

emisije od 358 do 426 nm. U skladu sa tim prva komponenta bi mogla da odgovara

fenoličnim supstancama prisutnim u medu. Druga (zelena) i treća (crvena) komponenta

sa ekscitacionim maksimumima na 395 i 370 nm i emisionim na 473 i 426 nm najviše

odgovaraju produktima Maillard-ove reakcije poput furozina i hidroksimetilfurfurala

(HMF). Kulmyrzaev i Dufour [Kulmyrzaev & Dufour 2008] su pokazali da ove dve

fluorofore koje se prirodno nalaze u medu imaju svoj emisioni maksimum na 440 nm za

furozin i 425 nm za HMF sa ekscitacijom na oko 360 nm, što odgovara drugoj i trećoj


109

komponenti. Četvrta komponenta sa ekscitacionim maksimumom na 470 nm i

emisionim makismumom na 540 nm može poticati od fluorescencije riboflavina čije su

standardne vrednosti ekscitacionih i emisionih maksimuma date u tabeli 3.2. Pik sa

maksimumom ekscitacije na 275 nm i maksimumom emisije na 343 odgovara petoj

(ljubičastoj) komponenti, čija pozicija najviše odgovara aromatičnim aminokiselinama.

Poslednja šesta (svetlo zelana) komponenta sa ekscitacionim/emisionim maksimumom

od 395/473 nm takođe može poticati od fenoličnih supstanci.

Slika 5.6 – Rezultati split-half analize.

Na slici 5.6 je prikazan rezultat split-half analize dobijenog modela, gde su uzorci bili

podeljeni na dve grupe i na osnovu njih su bila izgrađena dva šestokomponentna modela

sa istim početnim uslovima. Na grafiku se vide emisioni i ekscitacioni spektri oba

modela i ono što se uočava je da ekscitacioni i emisioni spektri svih komponenata su

skoro identični i da su njihova odstupanja jako mala. Na ovaj način nam je potvrđeno da

je pravi broj komponenata za model bio odabran i da model precizno opisuje fenomene

u sistemu.

U cilju ispitivanja koje fluorofore najviše variraju među različitim tipovima meda bili su

analizirani koncentracioni nivoi fluorofora specifični za određene vrste meda.

Koncentracioni mod PARAFAC modela je dat na slici 5.7 pri čemu su uzorci

raspoređeni na osnovu njihovog botaničkog porekla radi lakše analize i interpretacije.

Uočava se da uzorci lipe i falsifikata imaju manje koncentracije prve komponente u

odnosu na ostale grupe. Takođe se primećuje da koncentracije druge i treće


110

komponente, koje odgovaraju produktima Maillard-ove reakcije su manje za uzorke

falsifikata i bagrema, respektivno. Kako bi ove razlike koncentracija kvantifikovali i

lakše analizirali u tabeli 5.1 su date srednje vrednosti i varijacije koncentracija šest

komponenata izračunatih za svaku botaničku grupu ponaosob.

Slika 5.7 – Relativne koncentracije 6 komponenata za sve uzorke meda.

Iz tabele 5.1 može se uočiti sledeće: (a) Najveća razlika između uzoraka bagremovog

meda i uzoraka dve botaničke grupe koji su njemu najsličniji (suncokret i livada) je u

koncentraciji treće komponente; (b) Koncentracioni nivo prve komponente predstavlja

najveću razliku između uzoraka lipovog meda i ostalih grupa; (c) Uzorci falsifikata

meda se najviše razlikuju od ostalih grupa na osnovu koncentracionih nivoa svih

komponenata i imaju najmanje varijacije u koncentracijama unutar same grupe. Na

osnovu ovih zaključaka predpostavili smo da će najbolja vizuelna razdvajanja među

grupama biti postignuta ukoliko se na grafiku rasutosti prikažu relativne koncentracije

prve i treće komponente za svaki uzorak, koje odgovaraju fenoličnoj komponenti i

produktu Maillard-ove reakcije (slika 5.8).


111

Tabela 5.1 Srednja vrednost (SV) i varijacija (Var.) relativnih koncentracija

6 komponenata PARAFAC modela.

Bagrem Lipa Livada Suncokret Falsifikat

Komp. 1

SV 6.93 1.15 6.73 6.55 3.28

Var. 1.14 0.57 4.46 0.62 0.13

Komp. 2

SV 5.93 5.25 6.19 5.36 2.97

Var. 0.51 0.74 1.41 0.25 0.44

Komp. 3

SV 3.45 4.38 4.47 4.28 2.71

Var. 0.24 0.60 2.01 0.19 0.25

Komp. 4

SV 3.17 2.78 3.96 3.38 0.72

Var. 1.02 2.39 2.31 0.94 0.08

Komp. 5

SV 3.00 1.78 3.38 2.30 0.83

Var. 0.58 3.12 0.77 0.19 0.15

Komp. 6

SV 0.73 2.24 1.06 1.04 0.71

Var. 0.62 0.30 0.87 0.26 0.08

Na grafiku se uočava da se sve klase osim uzoraka livadskog meda vrlo lepo grupišu.

Ovakav trend je i očekivan s obzirom na to da livadski med u sebi sadrži polene više

biljaka, dok ostali sadrže u većem procentu polen samo jedne biljne vrste. Stoga je

normalno da se uzorci livadskog meda prostiru šire po grafiku dok su ostale grupe bolje

separatisane. Ono što se na ovom grafiku može uočiti je da najveća razlika između

različitih tipova meda leži u različitim nivoima koncentracija jedne od fenoličnih


112

komponenti i produktu Maillard-ove reakcije karakterističnim za svaku botaničku vrstu

meda.

Slika 5.8 – Grafik rasutosti dobijen na osnovu relativne koncentracije prve i treće

komponente PARAFAC modela za svaki uzorak.

Ako malo bolje pogledamo dati grafik uočava se da lipov med ima najmanje količine

komponente 1, pa zatim falsifikati imaju malo veću koncentraciju ove fluorofore dok

livadski, bagremov i suncokretov med sadrže veoma slične količine ove supstance.

Međutim, razlika između ove tri grupe leži u različitim koncentracijama treće

komponente gde suncokret i livada očigledno sadrže veću količinu treće fluorofore.

Veoma bitan rezultat ove analize je da se falsifikat može vrlo lako detektovati na osnovu

koncentracija navedene dve komponente modela čime se može olakšati autentifikacija

meda.

Na osnovu relativnih koncentracija uzoraka meda bila su izgrađena dva PLS-DA

modela čije su kalibarcione i unakrsno validirane greške klasifikacije date u tabeli 5.2.

Prvi model je bio obučavan da otkrije da li je med prirodan ili falsifikat (model za


113

autentifikaciju). Drugi model je imao zadatak da klasifikuje uzorke na osnovu njihovog

botaničkog porekla. Oba modela su bila validirana na osnovu 4 parametara:

senzitivnosti, specifičnosti, kalibarcione i validacione greške. Najbolji model za

autentifikaciju je bio dobijen korišćenjem samo jedne latentne varijable, koji je dao iste

vrednosti greške kao i specifičnost i senzitivnost kalibrisanog i validiranog modela

(tabela 5.2). Ovim je potvrđeno da je dati model optimalan. On je dao odlične rezultate

sa maksimalnom senzitivnošću i specifičnošću i greškom od 0%. Najbolji model za

određivanje botaničkog porekla je bio izgrađen sa četiri latentne varijable. Model je

pokazao odličnu senzitivnost i specifičnost u slučaju klasifikacije bagrema i lipe, i jako

dobre rezultate za livadski i suncokretov med. Iako su greške bile malo veće kod

klasifikacije livade i suncokreta, rezultati su bili bolji i greške manje od dobijenih

grešaka klasifikacije meda u do sada objavljenim naučnim radovima ((Karoui et al.,

2007; Ruoff et al., 2005; Ruoff et al., 2006).

Tabela 5.2 – Kalibrisana (kal.) i unakrsno validirana (CV) senzitivnost, specifičnost i

klasifikaciona greške PLS-DA modela dobijenog na osnovu relativnih koncentracija

fluorofora u uzorcima meda.

Model za

autentifikaciju

Model za određivanje botaničkog

porekla

Prirodan Falsifikat Bagrem Lipa Livada Suncokret

Senzitivnost kal. 1 1 0.935 1 0.733 0.8

Senzitivnost CV 1 1 0.913 1 0.8 0.8

Specifičnost kal. 1 1 0.893 0.989 0.875 0.793

Specifičnost CV 1 1 0.875 0.989 0.833 0.805

Klas. greška kal.

[%] 0 0 8.6 0.5 19.5 20.3

Klas. greška CV

[%] 0 0 10.5 0.5 18.3 19.7


114

5.2.2 Analiza sinhronih fluorescentnih spektara

Slika 5.9 – Konturni sinhroni fluorescentni spektri uzoraka meda: a) bagrem, b) lipa, c)

suncokret, d) falsifikat i e) livada.

Na slici 5.9 su prikazani konturni grafici sinhronih spektara uzoraka meda predstavnika

svake od pet botaničkih vrsta ispitivanog meda (bagrem, lipa, suncokret, livada i

falsifikat). Emisija na konturnim graficima odražava specifičnost endogenih fluorofora i

njihovo mikrookruženje u medu. Glavne razlike između različitih botaničkih grupa

meda kod sinhronih spektara se mogu uočiti u nekoliko spektralnih regiona. Prvi region

obuhvata opseg talasne dužine ekscitacije od 240-270 nm i sinhronog intervala od 150-

220 nm. Fluorescencija u ovom regionu se može javiti usled prisustva fenoličnih

komponenata u medu. Ovi molekuli kao što je ranije bilo navedeno imaju maksimum

ekscitacije i emisije između 265 i 335 nm i emisije od 358 do 426, respektivno. Emisija

aromatičnih aminokiselina se može uočiti u spektralnom regionu koji odgovara talasnoj

dužini ekscitacije od 250 do 300 nm i sinhronom intervalu od 40 do 100 nm. Pokazano

je da emisioni spektar koji potiče od aromatičnih aminokiselina se može koristiti kao

„fingerprint“ za određivanje botaničkog porekla uzorka meda [Karoui et al. 2007a].

Uočava se da emisija triptofana kod uzoraka lipovog meda ima manje intenzivnu

emisiju od drugih botaničkih grupa. Treći spektralni region ima raspon talasne dužine


115

ekscitacije od 340-410 nm i sinhroni interval od 40-120 nm. Ovaj region može

odgovarati fluorescenciji produkata Maillard-ove reakcije poput furozina i

hidroksimetilfurfurala (HMF) ili neke druge fenolične komponente koja je prisutna u

medu, čiji su specifični ekscitacioni i emisioni maksimumi bili ranije navedeni u tekstu.

Slika 5.10 – Grafici rasutosti skorova glavnih komponenata PCA analize podataka

sinhronih spektara za: a) sinhroni interval ∆λ = 70 nm i b) sinhroni interval ∆λ = 40 nm.

Na osnovu sinhronih spektara bili su izračunati bilinearni PCA modeli u cilju ispitivanja

varijacija između različitih botaničkih grupa meda. Ovom metodom se ispitivalo da li

grupe pokazuju različite spektralne karakteristike i bila je omogućena vizuelizacija

podataka. Evaluacija grafika rasutosti skorova PCA komponenata je ukazala na to da

kod spektara merenih sa manjim sinhronim intervalom dolazi do preklapanja nekih

grupa. Najbolja vizuelna separacija među monofloralnim grupama meda (vrste meda

kod kojih je udeo polena jedne vrste biljke u medu veći od 45%) je bila postignuta za

vrednost sinhronog intervala ∆λ = 70 nm (slika 5.10 a), dok je zajedno sa polifloralnom

grupom najbolje razdvajanje bilo postignuto za vrednost ∆λ = 40 nm (slika 5.10 b). Na

graficima se uočava delimično preklapanje livadskog meda i bagrema i suncokreta, kao

i preklapanje bagrema i suncokreta, na grafiku monofloralnih vrsta meda. Ova pojava se

može objasniti time što su na graficima prikazane samo prve dve izračunate glavne

komponente PCA modela, dok ostali PCA skorovi sadrže još dodatnih informacija koje

mogu doprineti boljem razdvajanju grupa. Na slici 5.11 je prikazan grafik varijanse

PCA modela koji opisuje koliko procenta varijacija opisuje prvih deset komponenata


116

PCA modela izračunatih na osnovu spektara za ∆λ = 70 nm i ∆λ = 40 nm. U oba slučaja

prve dve komponente opisuju više od 90% varijacija u spektrima, dok prve tri opisuju

već više od 95%, što ukazuje na visoko efikasnu redukciju dimenzionalnosti podataka

uz primenu PCA analize. Na oba grafika je takođe evidentno razdvajanje uzoraka

falsifikata od prirodnog meda. Sva ova zapažanja nam ukazuju na mogućnost izgradnje

dobrog klasifikacionog modela korišćenjem sinhronih spektara.

Slika 5.11 – Grafik varijanse za prvih deset glavnih komponenata dobijenih PCA

analizom sinhronih spektara za sinhrone intervale ∆λ = 70 nm i ∆λ = 40 nm.

Slika 5.12 – “Lodaings”-i glavnih komponenata PCA analize za spektre sa: a)

sinhronim intervalom ∆λ = 70 nm i b) sinhronim intervalom ∆λ = 40 nm.


117

Na graficima na slici 5.12 su prikazani “loadings”-i PCA model za prve dve glavne

komponente dobijene na osnovu podataka za ∆λ = 70 nm i ∆λ = 40 nm. PCA

“loadings”-i nam pokazuju koliki uticaj ima svaki parametar na datu komponentu,

odnosno u ovom slučaju koliki doprinos ima spektar za svaku talasnu dužinu

ekscitacije. Na ovaj način se može videti na kojim talasnim dužinama ekscitacije se

javljaju najveće varijacije spektara kod uzoraka. U ovom slučaju maksimumi (pikovi) i

minimumi kriva na grafiku (PC2 je ortogonalno na PC1) se nalaze na talasnim

dužinama ekscitacije koje odgovaraju pozicijama pikova sinhronih spektara prikazanih

na slici 5.9. Uočava se da za opseg talasne dužine ekscitacije od 270 – 290 nm i 330 –

340 nm vrednosti “loading”-a su najveće, odnosno na toj poziciji su prisutne najveće

varijacije, što nam ukazuje na to da fluorescencija triptofana i fenoličnih komponenti

predstavlja najveću razliku između uzoraka meda različitog botaničkog porekla.

Na osnovu sinhronih spektara bili su izgrađeni PLS-DA klasifikacioni modeli za dva

slučaja: u prvom su korišćeni svi uzorci, dok su u drugom bili uzeti u obzir samo uzorci

monofloralnih vrsta i falsifikati. 55 PLS-DA modela je bilo izgrađeno kako bi se na

osnovu greške klasifikacije utvrdilo za koji sinhroni interval je greška najmanja

odnosno na osnovu kog spektra se postižu najbolja razdvajanja.

Tabela 5.3 – Kalibrisana (Cal.) i unakrsno validirana (CV) greška klasifikacije PLS-DA

modela izgrađenog na osnovu spektara za ∆λ = 160 i 215 nm.

Uzorci meda uključujući livadski

med za Δλ = 160 nm

Uzorci meda monofloralnih

grupa za Δλ = 215 nm

Klas. greška Kal. [%] CV [%] Kal. [%] CV [%]

Bagrem 5.6 5.6 0 0

Falsifikat 0.9 2.4 0 0

Lipa 1.02 1.53 0.7 0.7

Suncokret 2.1 2.6 0 0

Livadski 11.7 11.7 - -

U slučaju modela koji je izgrađen na osnovu svih uzoraka, najbolji model je bio dobijen

na osnovu spektara za sinhroni interval ∆λ = 160 nm. Kao što je bilo i očekivano model

je imao najveću grešku pri klasifikaciji livadskog meda, 11.7% (tabela 5.3). Ova pojava

se smatra normalnom pošto je pomenuti med sačinjen od polena više vrsta biljaka i


118

često se u našem geografskom regionu može naći polen bagrema i suncokreta. Stoga se

na taj način može objasniti zašto se neki uzorci livade klasifikuju kao bagrem i

suncokret i obrnuto. Uzimajući ovo u obzir može se reći da je ova greška relativno mala

za livadski med. Iako su uzorci livadskog meda uticali na uspešnost modela te greške su

bile mnogo manje od grešaka klasifikacionih modela dobijenih na osnovu pojedinačnih

ekscitacionih i emisionih spektara [Ruoff et al. 2005, Ruoff et al. 2006]. Na slici 5.13 je

prikazan grafik praga klasifikacije (eng. treshold plot) ovog modela koji vrši

klasifikaciju na osnovu osam komponenata. Puna i isprekidana linija predstavljaju

procenjen i unakrsno validiran odgovor modela, respektivno. Vertikalna linija pokazuje

vrednost praga klasifikacije za koju se postiže najbolja senzitivnost i specifičnost

modela, koju PLS-DA algoritam sam odabira. Sa ovog grafika je evidentno da su

vrednosti i specifičnosti i senzitivnosti jako velike (veće od 0.9) za sve klase, što

ukazuje na to da je model uspešan i da ima malu grešku klasifikacije.

Slika 5.13 – Grafik praga klasifikacije PLS-DA modela za spektre sa sinhronim

intervalom ∆λ = 160 nm za: a) bagrem, b) suncokret, c) falsifikat, d) livadski i e) lipu.


119

Slika 5.14 – Grafik praga klasifikacije PLS-DA modela za spektre sa sinhronim

intervalom ∆λ = 215 nm za: a) bagrem, b) lipu, c) falsifikat i d) suncokret.

U drugom slučaju model na osnovu sinhronih spektara za ∆λ = 215 nm se pokazao

najuspešnijim. Ovaj model je vršio klasifikaciju na osnovu sedam komponenata sa

tačnošću od 99.825% i izuzetnim grafikom praga klasifikacije (slika 5.14). Sa grafika

praga klasifikacije može se videti da su procenjen i validiran odgovor modela skoro

identični, što ukazuje na visoku stabilnost i kvalitet modela. Takođe bagremov i

suncokretov med imaju skoro idealne odgovore u modelu sa visokom senzitivnošću i

specifičnošću (preko 0.99) kod oba dela zbog njihovog vrlo jedinstvenog sinhronog

spektra. Kao što je bilo i očekivano greške za ovaj model su bile manje nego u prvom

slučaju.

PLS-DA modeli građeni na osnovu PARAFAC parametara i sinhronih spektara su

pokazali odlične rezultate za klasifikaciju botaničkog porekla meda. Utvrđivanje

autentičnosti meda je bilo 100% uspešno u oba slučaja. Pokazano je da su se modeli na

bazi sinhronih spektara malo bolje pokazali u klasifikaciji botaničkog porekla meda kod

svih klasa osim kod lipovog gde je greška bila 1.53% dok je za drugi model bila 0.5%.

Prednost modela baziranog na sinhronim podacima leži u tome što je potrebno izmeriti

samo jedan spektar kako bi se klasifikovao uzorak, dok je za drugi model neophodno

izmeriti celu EEM. Sinhroni spektri za razliku od emisionih mere drugi pravac spektra i

na taj način u jednom snimanju obuhvataju istovremeno više bitnih fluorescentnih

karakteristike za koje bi inače bilo neophodno meriti više emisionih spektara. Nasuprot


120

tome EEM meda sadrži sve informacije o sistemu i pokazala se korisnom za

karakterizaciju uzoraka meda uz primenu PARAFAC metode.

5.2.3 Analiza infracrvenih spektara

U cilju potvrde uspešnosti dobijenih rezultata uzorci meda su bili ispitivani i

infracrvenom spektroskopijom. Infracrvena spektroskopija Furijeovom transformacijom

(eng. Fourier transform infrared spectroscopy – FTIR) predstavlja metodu koja se

poslednjih godina često koristi kao standardna metoda za ispitivanje hrane. Iz tog

razloga su bili mereni i infracrveni spektri meda uz primenu tehnike prigušene totalne

refleksije (eng. attenuated total reflectance – ATR)(Lenhardt et al. 2014) radi poređenja

uspešnosti pomenutih metoda za klasifikaciju meda na osnovu botaničkog porekla. Za

merenje je bio korišćen Thermo Nicolet 380 FTIR spektrofotometar sa dodatkom za

ATR.

Slika 5.15 – FTIR-ATR spektri uzoraka različitih vrsta meda (A: uvećanje regiona

između 900 i 1150 cm-1).

Na slici 5.15 su prikazani FTIR-ATR spektri uzoraka meda različitog botaničkog

porekla (bagrem, suncokret i lipa). Najveće razlike među spektrima se uočavaju u

spektralnom regionu između 900 i 1050 cm-1. Pokazano je da apsorpcija u tom regionu


121

potiče od monosaharida prisutnih u medu poput fruktoze i glukoze, i disaharida poput

sukroze [Persano Oddo & Piro 2004]. Pikovi u spektralnom regionu između 1470 i 1150

cm-1 se javljaju zbog savijajućeg moda C-C-H, C-O-H i O-C-H grupa. Na poziciji oko

1060 – 1020 cm-1 javlja se pik kao rezultat vibracija O-H grupa, dok je pik između 3300

i 2820 cm-1 prisutan zbog vibracija istezanja O-H- i C-H- grupa koje potiču od šećera

prisutnih u medu [Pataca et al 2007].

Slika 5.16 – Grafik rasutosti skorova PCA analize za različite vrste meda.

Za analizu spektara bio je korišćen opseg spektra između 3718 i 631 cm-1 kako bi se

izbacio šum iz spektara. Prvo je dimenzija spektralnih podataka bila redukovana

primenom PCA analize na 22 komponente. Grafik rasutosti PCA modela (prikazana

četvrta i deveta glavna komponenta) je dat na slici 5.16. Na grafiku se zapaža da se

uzorci istog botaničkog porekla grupišu i da svaka klasa ima jedinstvene spektralne

karakteristike. Na osnovu toga može se pristupiti građenju klasifikacionog modela. U

ovom slučaju bila je primenjena SVM diskriminantna analiza koja je za građenje

modela koristila prethodno izračunate 22 glavne komponente. Nakon proračuna i

unakrsne validacije modela bile su dobijene kalibracione i validacione greške modela

(tabela 5.4). Za unakrsnu validaciju korišćena je metoda podele podataka gde su podaci

bili podeljeni na dva seta, jedan za obuku SVM-a i jedan za testiranje modela. Iz tabele

se vidi da model ima uspešnost od 98.6%, odnosno grešku klasifikacije od 1.4%.


122

Tabela 5.4 – Kalibrisana i unakrsno validirana greška SVM modela

Klasifikaciona greška Bagrem Lipa Suncokret

Kalibraciona [%] 0 0 0

Unakrsno validirana [%] 0.7 2.4 1.1

Rezultati klasifikacije na osnovu infracrvenih spektara su pokazali uspešnost sličnu ili

malo bolju od modela dobijenih na osnovu fluorescentnih spektara. Prednost

fluorescentne spektroskopije u odnosu na infracrvena spektroskopska merenja je u

količini informacija koju je moguće ekstrahovati iz dobijenih fluorescentnih spektara.

Time je moguće jednom metodom, na osnovu samo jednog merenja, kompletno

okarakterisati jedan uzorak kompleksnog sistema.

Primena fluorescentne spektroskopije zajedno sa odgovarajućim multivarijantnim

metodama bi u mnogome olakšala analiziranje i karakterizaciju uzoraka meda.

Standardne analize meda koje se danas koriste su jako komplikovane i zahtevaju puno

vremena i novca da bi se izvele na odgovarajući način. Ukoliko bi se predstavljen

PARAFAC model meda kalibrisao stvarnim koncentracijama prisutnih fluorofora u

medu, omogućila bi se daleko lakša i jednostavnija analiza meda. Zbog veličine

molekula šećera u medu, jako je teško odrediti standradnim hemijskim metodama (na

pr. tečna hromatografija) tačne koncentracije malih molekula kao što su triptofan i druge

fluorofore, kojih u medu ima relativno malo, ali čija je fluorescencija dominatna, i na

osnovu koje se može vrlo jednostavno proveravati kvalitet i vrsta meda.

5.3 Kancer dojke

5.3.1 PARAFAC analiza EEM-a

Na slici 5.17 su prikazane izmerene ekscitaciono-emisione matrice dva regiona uzoraka

tkiva dojke, pri čemu su oba merena na uzorku sa malignim promenama i na zdravom

tkivu dojke. Drugi mereni region nije bio korišćen za PARAFAC analizu već samo za

obučavanje SVM modela o kojem će kasnije biti reči. U drugom regionu mogu se uočiti


123

samo krajevi pikova pa nije bilo moguće izgraditi model na osnovu tako dobijenih

spektara, ali je njihov doprinos korišćen za klasifikacioni model.

Slika 5.17 – Konturni grafici EEM-a prvog i drugog merenog regiona zdravog tkiva

dojke (a) i (c) i kancera dojke (b) i (d), respektivno.

Na konturnim graficima prvog regiona se uočava jedan široki pik, koji predstavlja

rezultat doprinosa više fluorofora koje se nalaze u tkivu dojke. Može se primetiti da je

kod malignog tkiva taj pik širi što ukazuje na veću koncentraciju jedne ili više

fluorofora koje se nalaze u delu spektra sa talasnom dužinom ekscitacije u opsegu od

370 do 395 nm i emisijom od 430 do 480 nm. Kako bi se dalje lakše analizirale te

razlike bili su proračunati modeli sa opsegom komponenti od 1 do 6, pri čemu je posle

analize ostataka i validacije pokazano da četvorokomponentni model najbolje opisuje

ovaj sistem. Za proračun PARAFAC modela korišćen je samo deo spektra prvog regiona

u opsegu ekscitacije od 430 do 575 nm i emisije od 335 do 400 nm. U delu spektra koji


124

se nije koristio nalazio se artefakt u obliku linije koji nije posledica fluorescentnih

osobina uzorka tkiva i svojim prisustvom u spektru bi pravio zabunu u modelu.

Slika 5.18 – Drugi i treći mod četvorokomponentnog PARAFAC modela tkiva dojke.

Na slici 5.18 su prikazani drugi i treći mod datog PARAFAC modela sa četiri

komponente. Prva komponenta označena plavom bojom na grafiku ima ekscitacioni

maksimum na 345 nm i emisioni na 430 nm. Ova komponenta bi mogla da odgovara

kolagenu i elastinu pošto je njihov ekscitacioni/emisioni maksimum na 325/405 nm.

Druga komponenta (zelena) i četvrta (azurno plava) sa ekscitacionim maksimumom na

370 i 355 nm i emisionim na 505 i 554 nm, respektivno odgovaraju oblasti u kojoj

fluoresciraju lipidi. Trećoj komponenti sa emisijom na 472 nm i ekscitacijom na 400 nm

bi najverovatnije mogao da odgovara NADH. Pošto je set uzoraka jako mali u ovom

slučaju validacija split-half analizom ne bi dala realne rezultate, pa je iz tog razloga kao

validacija primenjena leave-one-out metoda. Kod ove validacije bilo je izgrađeno 18

modela pri čemu je svaki model građen tako što je bio izostavljan po jedan uzorak. Na

kraju su drugi i treći modovi izračunatih modela bili svi zajedno nacrtani na graficima

kako bi se videle varijacije među modelima. Dobijena dva grafika za drugi i treći mod

su prikazani na slici 5.19. Na grafiku se jasno vidi da su varijacije među modelima jako

male i što je najbitnije pozicije pikova su iste za sve modele što potvrđuje da je odabran

odgovarajući model sa tačno pretpostavljenim brojem komponenti. Ovakav rezultat je

jako dobar s obzirom na mali broj uzoraka i može da posluži kao dobra početna

pretpostavka u daljim ispitivanjima ovog sistema.


125

Slika 5.19 – Drugi i treći mod 18 PARAFAC modela dobijenih pri validaciji.

Kako bi se lakše analizirale razlike u koncentracijama ovih fluorofora u uzorcima

korišćen je grafik rasutosti. Slika 5.20 prikazuje grafik rasutosti gde je svaki uzorak

definisan relativnom koncentracijom prve i druge komponente.

Slika 5.20 – Grafik rasutosti na osnovu relativnih koncentracija prve i druge

komponente PARAFAC modela tkiva dojke.


126

Na grafiku se uočava jasna granica između uzoraka kancera i zdravog tkiva. Parametar

po kojem se oni razdvajaju jeste relativna koncentracija druge komponente, odnosno u

uzorcima malignog tkiva je koncentracija ove fluorofore veća nego kod zdravog tkiva.

Osim prve dve komponente bili su analizirani i grafici sa trećom i četvrtom

komponentom, međutim kod svih se pokazalo da su sve bitne razlike u tkivu definisane

koncentracijom druge komponente modela. Ekscitacioni i emisioni spektar ove

fluorofore posebno je izdvojen na slici 5.21 gde se jasno vide ekscitacioni i emisioni

maksimumi na 370 i 505 nm, respektivno. Kao što je ranije rečeno, pretpostavka je da

ova fluorofora odgovara lipidima, mada postoji mogućnost da ova fluorofora može da

bude i neka druga koja se zavisno od uslova okoline može javiti u toj oblasti poput

FAD-a, NADPH i NADH. U našem slučaju nije moguće precizirati tačno koja supstanca

u tkivu dojke fluorescira na toj poziciji jer kako je ranije navedeno fluorescentne

karakteristike molekula se mogu menjati zavisno od okoline u kojoj se nalaze i njihove

pozicije maksimuma mogu varirati i do 50 nm. U radovima koji se bave kancerom

dojke utvrđeno je da u tkivu tumora dojke dolazi do povećanja koncentracije koenzima

NADH i NADPH [Uppal 2003, Georgakoudi 2002]. U skladu sa tim može se reći da

ova fluorofora verovatno odgovara nekom od ta dva koenzima čiji su ekscitacioni i

emisioni maksimumi na 351, 336 nm i 460, 464 nm, respektivno. Na osnovu dobijenog

modela može se jednostavno pratiti promena koncentracije druge komponente i na brz i

jednostavan način odrediti da li postoje maligne promene u tkivu dojke.

Slika 5.21 – Emisioni i ekscitacioni spektar druge komponente dobijen PARAFAC

modelom tkiva dojke.


127

5.3.2 SVM analiza EEM-a i sinhronih spektara

Konturni sinhroni spektri dojke su prikazani na slici 5.22. Kao i kod EEM spektara

dojke (odeljak 5.3.1) na spektrima se u istim regionima uočava fluorescentni doprinos

kolagena, NADH, elastina i lipida.

Slika 5.22 – Konturni sinhroni spektri a) zdravog i b)malignog tkiva dojke i prvi izvos

sinhronih spektara zdravog i malignog tkiva c) i d), respektivno.

Građenje SVM klasifikacionog modela je bilo izvedeno korišćenjem podataka

ekstrahovanih iz određenih spektralnih regiona EEM i sinhronih spektara za svaki

pojedinačan uzorak. Kod EEM spektara, komponente su bile računate kao zapremine

ispod površine spektra primenom formule u pet podeljenih regiona:


128

1) talasna dužina ekscitacije od 335 do 400 nm i talasna dužina emisije od 460 do

530 nm – označen sa EEM-1;








615 nm – označen sa EEM-5.

U slučaju sinhronih spektara, komponente izvučene iz spektralnih regiona u obliku

zapremine ispod površine spektra i srednje vrednosti prvog izvoda sinhronih spektara.

Za nepromenjene sinhrone spektre bila su analizirana tri regiona:

1) talasna dužina ekscitacije od 330 do 400 nm i sinhroni interval od 65 do 120 nm

– označen sa SFS-1;

2) talasna dužina ekscitacije od 330 do 425 nm i sinhroni interval od 30 do 55 nm –

označen sa SFS-2;


označen sa SFS-3.

Za prvi izvod sinhronog spektra bili su analizirani seldeći regioni:


označen sa FDS-1;

2) talasna dužina ekscitacije od 380 do 420 nm i sinhroni interval od 65 do 120 nm

– označen sa FDS-2;


označen sa FDS-3;

Osim ovih komponenata različite aritmetičke kombinacije spektralnih komponenata su

bile takođe izračunate i korišćene kao ulazni podaci za građenje SVM klasifikacionog

modela (tabela 5.5).


129

Tabela 5.5 Kombinacije spektralnih komponenata korišćene kao ulazni podaci za obuku

SVM modela za klasifikaciju malignih i benignih promena na tkivu dojke.

Oznaka Formula Oznaka Formula

Etot EEM-1 + EEM-2 + EEM-3 +

EEM-4 + EEM-5

RT2 SFS-2 / Stot

E12 EEM-1 / EEM-2 RT3 SFS-3 / Stot

E13 EEM-1 / EEM-3 RT12 (SFS-1 + SFS-2) / Stot



E23 EEM-2 / EEM-3 PR112 SFS-1 / (SFS-1 + SFS-2)



E34 EEM-3 / EEM-4 Ftot FDS-1 + FDS-2 + FDS-3

E35 EEM-3 / EEM-5 D1 (FDS-1 – Ftot) / FDS-1

E45 EEM-4 / EEM-5 D2 (FDS-2 – Ftot) / FDS-2

Stot SFS-1 + SFS-2 + SFS-3 D3 (FDS-3 – Ftot) / FDS-3

S12 SFS-1 / SFS-2 D12 (FDS-1 – FDS-2) / FDS-1



RT1 SFS-1 / Stot

U cilju građenja i testiranja modela, podaci su bili podeljeni u dva jednaka seta

podataka: set za obuku i set za testiranje modela. U cilju dobijanja što boljeg modela,

broj uzoraka je bio uvećan sa izmerenih 18 na 42. Kako bi se uvećao broj uzoraka

generisani su novi setovi podataka (12 novih uzoraka normalnog i 12 malignog tkiva)

na osnovu srednje vrednosti i standardne devijacije parametara prikazanih u tabeli 5.5.

Zatim je SVM model bio obučavan za različite kombinacije 42 ulazna parametra koji

opisuju 42 uzorka (11 spektralnih komponenti i 31 kombinacija spektralnih

komponenata – tabela 5.5). Bitno je naglasiti da su sve kombinacije bile izračunate

samo na osnovu EEM ili sinhronih spektara. U oba slučaja je za obuku SVM modela

bio korišćen linearni kernel. Rezultati klasifikacionih modela za različite ulazne podatke

su dati u tabeli 5.6.


130

Tabela 5.6 Predikcija SVM modela naspram rezultata histoptologije svih uzoraka tkiva

za različite kombinacije ulaznih podataka.

Kombinacija

parametara: Rezultati testiranja SVM modela

Sve kombinacije

parametara na

osnovu EEM

Benigno Maligno Senzitivnost 66.67%

Benigno 15 6 Specifičnost 62.50%

Maligno 9 12 Greška 35.71%

SFS-1, SFS-2,

SFS-3, FDS-1,

FDS-2, FDS-3

Benigno Maligno Senzitivnost 100%



SFS-1, SFS-2,

SFS-3, RT-12,

RT-13, RT-23




FDS-1, FDS-2,

FDS-3




FDS-1, FDS-2,

FDS-3, RT12,

RT13, RT23




SFS-1, SFS-2,

SFS-3




SFS-1, SFS-2,

SFS-3, FDS-1,

FDS-2, FDS-3,

RT12, RT13,

RT23




D1, D2, D3, D12,

D13, D23


Benigno 21 0 Specifičnost 100%

Maligno 0 21 Greška 0%

RT12, RT23, SFS-

3, FDS-1




FDS-3, P112,

P113, D2, D3




FDS-3, P112,

P113, RT23, RT2




FDS-3, P112,

P113, RT23




FDS-3, P112,

P113




SFS-1, SFS-2,

SFS-3, FDS-1,




131

FDS-2, FDS-3,

RT1, RT2, RT3 Maligno 0 21 Greška 0%

FDS-1, FDS-2,

FDS-3, D12, D13,

D23




D12, D13, D23




FDS-3, PR-113




Generalno, pokazano je da SVM model obučen na osnovu fluorescentnih podatka može

klasifikovati promene na tkivu dojke. U slučaju EEM podataka uspešnost modela je bila

manja, sa senzitivnošću od 66.67% i specifičnošću od 62.50%, za slučaj kada su bile

korišćene sve kombinacije parametara zajedno za obuku algoritma. Nasuprot tome

devet SVM modela obučavanih na osnovu sinhronih spektara su bili mnogo uspešniji,

sa specifičnošću i senzitivnošću od čak 100%. Od ovih modela dva su kao ulazne

podatke koristili samo dva i tri parametra, FDS-3 i RT113 za prvi model i SFS-1, SFS-2

i SFS-3 za drugi model. Nalaženje uspešne kombinacije ulaznih podataka sa malim

brojem parametara ima veliki značaj jer se time smanjuje opseg merenja spektara i

pojednostavljuje sama metoda.

Tabela 5.7 Greška SVM klasifikacionog modela dobijenog na osnovu četiri relativne

koncentracije fluorofora, dobijene PARAFAC modelom, prisutnih u tkivu dojke.




Često obuka SVM modela na osnovu velikog broja parametara, koji opisuju svaki

uzorak, može da rezultuje dobijanjem lošijeg klasifikacionog modela. Iz tog razloga je

dodatno bio obučen još jedan SVM model na osnovu relativnih koncentracija 4

fluorofore prisutne u tkivu dojke dobijenih PARAFAC analizom. Ova četiri parametra

objedinjuju informacije o najbitnijim varijacijama među uzorcima jednog sistema što je

suštinski bitno za građenje dobrog kalsifikacionog modela. U tabeli 5.7 su date greške


132

dobijenog modela. Iz tabele se vidi da je uspešnost modela na osnovu pomenuta četiri

parametra bila 100%, odnosno da je greška klasifikacije bila 0%.

Dobijeni rezultati su pokazali, da je na osnovu fluorescentnih spektara, moguće

okarakterisati tkivo dojke i klasifikovati uzorke, na osnovu vrste promena na tkivu

(benigno i maligno), sa uspešnošću od 100%. Iako su se obe tehnike merenja pokazale

uspešnim za datu klasifikaciju, pokazano je da je kod EEM spektara za izgradnju

dobrog modela umesto celih spektara neophodno koristiti relativne koncentracije

fluorofora prisutnih u tkivu dojke. Na taj način se model ne opterećuje informacijama

prisutnim u spektrima koje su karakteristika sistema ili predstavljaju šum u spektrima,

koje ne doprinose građenju klasifikacionog modela.

5.4 Kompleksni sistemi fosfora na bazi retkih zemalja

Slika 5.23 – Prikaz trodimenzionalnih podataka za a) Gd2O3 :Eu3+, b) Gd2Ti2O7 :Eu3+, c)

GdVO4 :Eu3 i d) mešavinu sva tri jedinjenja.


133

Na slici 5.23 su prikazani trodimenzionalni grafici čije x, y i z ose odgovaraju talasnoj

dužini emisije, vremenu života i intenzitetu emisije, respektivno. Na graficima su

prikazana tri spektra koja sadrže svaka od tri jedinjenja ponaosob (Gd2O3 :Eu3+,

Gd2Ti2O7 :Eu3+ i GdVO4 :Eu3) i jedan spektar mešavine sve tri supstance zajedno. Na

spektrima pojedinačnih supstanci vide se jasni pikovi karakterističnih energetskih

prelaza. Kada se pogleda grafik mešavine, tu već dolazi do preklapanja spektara i

vremena života i samim tim je teško razdvojiti spektre čistih supstanci i odrediti njihove

odnose koncentracija. Cilj je takođe bio ustanoviti koja je granica detekcije ove metode

za prisutnost veoma malih koncentracija drugih supstanci (reda do 0.1%) u uzorku

čistog materijala.

Slika 5.24 – Grafik drugog i trećeg moda PARAFAC modela za neorganski sistem.

Kako bi se rešio dati problem bio je proračunat trokomponentni PARAFAC model na

osnovu merenih spektara za sedam uzoraka, gde dodatna validacija za određivanje broja

komponenti nije bila potrebna jer je broj bio unapred poznat. Na slici 5.24 su prikazani

svi modovi dobijenog modela, gde prvi mod prikazuje promenu koncentracija

pojedinačnih luminescentnih supstanci u svakom merenom uzorku, drugi mod prikazuje

emisione spektre pojedinačnih luminescetnih jedinjenja, dok treći pokazuje njihove

karakteristične krive vremena života pobuđenog stanja. Na grafiku drugog moda se vidi

da je model jasno izvukao karakteristične spektre pojedinačnih supstanci. Kako bi se

uporedio rezultat modela sa realnim spektrima na slici 5.25 su prikazani snimljeni

spektri čistih jedinjenja. Uočava se da je model ekstrahovao veoma precizno čiste

spektre iz kompleksnih jedinjenja i da su verodostojni izmerenim spektrima.

Slika 5.5 – Prikaz PARAFAC modela na osnovu

EEM-a uzoraka meda za: a) prvi, b) drugi i c)

treći mod.


134

Slika 5.25 – Izmereni emisioni spektri pojedinačnih jedinjenja.

Kako bi se potvrdila pouzdanost modela pri određivanju prisutnosti i koncentracije neke

od date tri supstance u nepoznatim uzorcima, korišćeni su izmereni spektri 21 uzorka pri

čemu je njima u Matlab-u na kraju dodat i šum od 5% intenziteta kako bi se ispitalo

ponašanje modela u težoj situaciji pošto uslovi merenja nisu uvek idealni i može se

desiti da se u spektru nađe šum koji može otežati dalju analizu. Za nepoznati 21 uzorak

traženo je da model odredi koncentracije supstanci u svakom pojedinačnom uzorku pri

čemu je modelu rečeno da pri tome koristi prethodno izračunati drugi i treći mod kao

polazni parametar koji su bili dobijeni na osnovu „idealnih“ spektara.

U tabeli 5.8 su prikazane stvarne koncentracije i koncentracije koje je model proračunao

na osnovu spektara početnih 7 uzoraka. Uočava se da su odstupanja u koncentraciji jako

mala i da je najveće odstupanje kod GdVO4 :Eu3+ gde je kod trećeg uzorka greška

predviđanja bila 0.036%. Ovo se može smatrati jako malom greškom i ukazuje na to da

model predviđa koncentracije sa jako visokom tačnošću i da je pouzdan čak i kod


135

spektara sa šumom iako je bio obučavan na „idealnim“ spektrima. Bitno je napomenuti

da su dati rezultati pokazali da se može smatrati da ova metoda ima granicu detekcije od

reda 0.1%, jer ako se obrati pažnja na dobijene predviđene koncentracije može se

primetiti da ukoliko se one zaokruže na prvu decimalu dobija se upravo realna

koncentracija svakog jedinjenja u uzorku. Time se može reći da za određivanje

prisutnosti drugih jedinjenja u nekom materijalu ova metoda može dati pouzdane

rezultate za koncentracije do reda 0.1%.

Tabela 5.8 Stvarne koncentracije i koncentracije luminescentnih supstanci dobijene na

osnovu PARAFAC modela

Broj

uzorka

Gd2O3 :Eu3+ Gd2Ti2O7 :Eu3+ GdVO4 :Eu3+

Stvarna

konc. [%]

Predviđena

konc. [%]

Stvarna

konc. [%]

Predviđena

konc. [%]

Stvarna

konc. [%]

Predviđena

konc. [%]

1. 97 97.001 2.5 2.5 0.5 0.534

2. 97 96.999 2 2 1 1.034

3. 65 65.012 35 34.99 0 0.015

4. 65 64.999 0 0.002 35 35.001

5. 80 80.006 20 19.994 0 0.024

6. 80 79.999 0 0.001 20 20.015

7. 93 93.001 7 6.998 0 0.032

8. 94 93.999 0 0.001 6 6.03

9. 98 97.999 0 0 2 2.034

10. 99.7 99.699 0 0 0.3 0.336

11. 99.9 99.899 0.1 0.1 0 0.036

12. 99.9 99.899 0 0 0.1 0.136

13. 99 98.999 1 1 0 0.036

14. 99 98.999 0 0 1 1.035

15. 0 0.023 65 64.984 35 34.96

16. 0 0.029 80 79.978 20 19.966

17. 0 0.033 92 91.974 8 7.971

18. 0 0.035 98 97.972 2 1.974

19. 0 0.036 99.5 99.472 0.5 0.475


136

20. 0 0.036 99.9 99.872 0.1 0.075

21. 0 0.035 99 98.972 1 0.975

Dobijeni model je pokazao potencijal za primenu ove vrste analize podataka odnosno

modeliranja ne samo za ekscitaciono-emisione matrice fluorescentnih spektara već i kod

druge vrste višedimenzionalnih podataka gde jedna dimenzija u sistemu varira dok su

druge fiksne i opisuju fenomen jedinstven za posmatrani sistem.

137

6. Zaključak

Predmet istraživanja ove doktorske disertacije je fluorescentna spektroskopija, odnosno

analiza fluorescentnih spektara višekomponentnih sistema, kao i analiza i modeliranje

podataka dobijenih tom metodom. Cilj ove teze je bio primena paralelne faktorske

analize i drugih multivarijantnih metoda, na EEM i sinhrone fluorescentne spektre više

kompleksnih sistema, u cilju modeliranja i analize bioloških i neorganskih sistema.

Razumevanje fizičkih fenomena u kompleksnim sistemima nam daje mogućnost

primene ove metode za karakterizaciju organskih i neorganskih materijala u različitim

oblastima nauke. PARAFAC modeli kompleksnih sistema omogućavaju da se na osnovu

fluorescentnih spektara nepoznatog uzorka odredi prisutnost određenih fluorofora u

njemu i njihove relativne koncentracije. Sa odgovarajućom kalibracijom PARAFAC

modela mogu se određivati i stvarne koncentracije pojedinačnih fluorofora u uzorcima

kompleksnog sistema i na taj način se izbeći standardne hemijske metode. Osim modela

za karakterizaciju uzoraka, na osnovu fluorescentnih spektara je moguće graditi različite

klasifikacione modela primenom različitih multivarijantnih analiza (PCA, PLS-DA,

SVM itd.). Klasifikacioni modeli mogu biti korisni u prehrambenoj industriji i u

medicini. Ovakvi modeli se mogu koristiti za autentifikaciju i klasifikaciju različitih

prehrambenih proizvoda, kao i za klasifikaciju benignih i malignih promena kod

bioloških uzoraka.

Pouzdanost i prediktabilnost PARAFAC modela je bila analizirana na primeru sistema

vode i dve aminokiseline. Dati model je pokazao da sa velikom tačnošću mogu da se

odrede koncentracije prisutnih aminokiselina u rastvoru. Osim toga model je kao

rezultat iz spektara kompleksnih sistema izvukao čiste ekscitacione i emisione spektre

pojedinačnih fluorofora, na osnovu čijih se pozicija moglo okarakterisati kojoj

fluorofori odgovaraju. U datom primeru ta informacija nije bila od velike važnosti,

međutim za kompleksne sisteme gde su fluorofore nepoznate takva vrsta informacije

ima veliku ulogu u karakterizaciji posmatranog sistema.

6. Zaključak

138

Analizom šestokomponentnog PARAFAC modela dobijenog na osnovu EEM-a uzoraka

meda dobijene su tačne pozicije ekscitacionih i emisionih maksimuma šest fluorofora

koje imaju najveći doprinos fluorescentnim karakteristikama meda. Pretpostavljeno je

da te pozicije odgovaraju: aromatičnoj aminokiselini – triptofanu, riboflavinu (vitamin

B2), fenoličnim komponentama i produktima Maillard-ove reakcije (HMF, furozin).

Uočeno je da botaničko poreklo meda direktno zavisi od koncentracije produkta

Maillard-ove reakcije i fenoličnih komponenti u uzorku. Klasa lipovog meda se mogla

jasno razdvojiti od ostalih grupa manjom koncentracijom fluorofore sa ekscitacionim i

emisionim maksimumom na 330/428 nm dok su ostale grupe mogle da se razdvoje

različitim doprinosima druge komponente sa maksimumom na 370/426 nm. Za uzorke

falsifikata meda se pokazalo specifičnim da sadrže manje količine prve i treće

komponente od prirodnog meda. Klasifikacioni modeli su potvrdili da se na osnovu

fluorescentnih spektara meda može odrediti njegovo botaničko poreklo i autentičnost.

Model izgrađen na osnovu sinhronih spektara se pokazao uspešniji sa srednjom

greškom klasifikacije od 5.35%. Model za utvrđivanje autentičnosti meda je imao 100%

uspešnost pri klasifikaciji. Takođe je bilo potvrđeno da su klasifikacioni modeli na

osnovu infracrvenih spektara meda podjednako uspešni.

Dobijeni PARAFAC model za uzorke tkiva dojke je razdvojio doprinos 4 fluorofore u

merenim uzorcima. Na osnovu rezultata modela dobijene su pozicije pikova tih

fluorofora i pretpostavljeno je da prva komponenta odgovara kolagenu i elastinu, druga

i četvrta lipidima i treća koenzimu NADH. Na osnovu grafika rasutosti primećeno je da

je najveća razlika između tkiva tumora i zdravog tkiva u koncentraciji druge

komponente koja je imala ekscitacioni maksimum na 370 nm, a emisioni na 505 nm.

Iako je bilo pretpostavljeno da ova pozicija odgovara lipidima, u skladu sa rezultatima

iz naučnih radova gde je pokazano da je u tkivu tumora povećana koncentracija

koenzima NADH i NADPH, na kraju je zaključeno da ova fluorofora najverovatnije

odgovara nekom od koenzima. Na osnovu parametara sinhronih spektara i relativnih

koncentracija 4 fluorofore dobijenih PARAFAC analizom, bili su dobijeni SVM modeli

sa validiranom greškom od 0%, za određivanje uzoraka sa malignim promenama.

6. Zaključak

139

Modeliranje neorganskog sistema je pokazalo uspešnu primenu PARAFAC analize ne

samo na EEM fluorescentne spektre već i na druge višedimenzionalne podatke, u ovom

slučaju emisione spektre i vremena života pobuđenog stanja u funkciji intenziteta.

Model izgrađen na osnovu sedam uzoraka mešavine tri luminescentne supstance je

pokazao veliku preciznost pri određivanju koncentracije 21 uzorka nepoznatih modelu.

Spektrima ovih test uzoraka je bio dodat i šum radi dodatne provere pouzdanosti

modela. I pored toga, model je sa visokom preciznošću pretpostavio koncentracije čak

do reda 0.1% pri čemu je najveće odstupanje od stvarne koncentracije bilo 0.034%.

Ovim je bilo pokazano da se uz primenu ovog modela mogu uspešno razdvajati i

spektri neorganskih materijala u slučajevima kada dolazi do njihovog preklapanja čime

je otežano karakterisanje datog materijala. Takođe ovaj model ima veliki potencijal za

primenu ove tehnike pri proveri čistoće nekog materijala prilikom karakterizacije, pri

čemu je neophodno samo jedno brzo merenje, bez potrebe za drugim metodama

karakterizacije koje se standardno koriste u ove svrhe. Ovakva tehnika bi mogla da nađe

primenu u proveri kvaliteta u industrijskoj proizvodnji ovakvih supstanci, pošto se može

jednostavno primeniti direktno na proizvodnoj traci.

Rezultati ove teze su pokazali veliki potencijal primene multivarijantnih metoda

(PARAFAC, PCA, PLS-DA i SVM) i fluorescentne spektroskopije u karakterizaciji i

klasifikaciji organskih i neorganskih materijala. PARAFAC metoda je pokazala jako

dobre rezultate kada je reč o preciznosti i pouzdanosti izgrađenih modela za date

kompleksne sisteme. Primena multivarijantnih metoda na fluorescentne spektre se

pokazala izuzetno uspešnom za klasifikaciju i autentifikaciju biloških uzoraka. Na

osnovu prikazanih rezultata ovog rada može se zaključiti da kombinacija

multivarijantnih metoda i fluorescentne spektroskopije ima veliki potencijal u

budućnosti kao brza, veoma osetljiva, nedestruktivna i jeftina metoda za primenu u

različitim oblastima nauke i industrije.

Dalja istraživanja će biti fokusirana na modeliranje novih kompleksnih sistema i

sakupljanje većeg broja uzoraka radi dobijanja što boljih modela i mogućoj

6. Zaključak

140

standardizaciji ove metode. Osim toga težiće se i ka tome da se PARAFAC analiza

olakša i prilagodi za korišćenje istraživačima iz različitih oblasti nauke. Metoda

prilagođena na taj način neće zahtevati od korisnika bilo kakvo predznanje iz statistike i

kompleksnog matričnog računa. Na taj način bi se ubrzala ekspanzija primene ove

metode i dostupnost većem broju istraživača.

141

7. Literatura

Alfano R.R., Tang G.C., Pradhan A., Lam W., Choy D.S.J. & Opher E. Fluorescence

spectra from cancerous and normal human breast and lung tissues. IEEE J Quantum

Electron (1987) 23: 1806–1811.

Andersen C.M. & Mortensen G. Fluorescence spectroscopy: a rapid tool for analyzing

dairy products. J Agric Food Chem (2008) 56: 720–729.

Andrić Ž., Dramićanin M.D., Mitrić M., Jokanović V., Bessière A. & Viana B. Polymer

complex solution synthesis of (YxGd1-x)2O3:Eu3+ nanopowders. Optical Materials

(2008) 30: 1023-1027.

Aubourg S.P. Recent advances in assessment of marine lipid oxidation by using

fluorescence. J Am Oil Chem Soc (1999) 76: 409–419.

Becker E.M., Christensen J., Frederiksen C.S. & Haugaard V.K. Front-face

fluorescence spectroscopy and chemometrics in analysis of yogurt: rapid analysis of

riboflavin. J Dairy Sci (2003) 86: 2508–2515.

Bro R. Exploratory study of sugar production using fluorescence spectroscopy and

multi-way analysis. Chemom. Intell. Lab. Syst. (1999) 46: 133-147.

Bro R. PARAFAC: Tutorial & applications, Chemom. Intell. Lab. Syst. (1997) 38: 149-

171.

Bro R. Multivariate calibration - What is in chemometrics for the analytical chemist?

Anal. Chim. Acta (2003) 500 (1-2): 185-194.

Burdick D.S., Tu X.M., McGown L.B. & Millican D.W. Resolution of multicomponent

fluorescent mixtures by analysis of excitation-emission-frequency array. J. Chemom.

(1990) 4: 15-28.

Burges C.J.C. A tutorial on support vectro machines for pattern recognition. Data Min

Knowl Disc (1998) 2: 121-167.

7. Literatura

142

Callejón R.M., Amigo J.M., Pairo E., Garmón S., Ocaña J.A. & Morales M.L.

Classification of Sherry vinegars by combining multidimensional fluorescence, parafac

and different classification approaches. Talanta (2012) 88: 456-462.

Carroll J. D. & Chang, J. Analysis of individual differences in multidimensional scaling

via an N-way generalization of 'Eckart- Young' decomposition. Psychometrika (1970)

35: 283-319.

Cattell R. B. 'Parallel proportional profiles' and other principles for determining the

choice of factors by rotation. Psychometrika (1944) 9: 267-283.

Cattell R. B. The three basic factor-analytic research designs-their interrelations and

derivatives. Psychological Bulletin (1952) 49: 499-520.

Cattell R. B. The scree test for the number of factors. Multivariate Behavioral Research

(1966) 1 (2): 245-276.

Christensen J., Becker E.M. & Frederiksen C.S. Fluorescence spectroscopy and

PARAFAC in the analysis of yogurt. Chemomet. Intell Lab. Syst. (2005) 75: 201–208.

Ćulubrk S., Antić Ž., Marinović-Cincović M., Ahrenkiel P.S. & Dramićanin M.D.

Synthesis and luminescent properties of rare-earth (Sm3+ and Eu3+) doped Gd2Ti2O7

pyrochlore nanopowders. Optical Materials (2014) DOI:10.1016/j.optmat.2014.08.001

Dramićanin T., Dramićanin M.D., Jokanović V., Nikolić-Vukosavljević D. &

Dimitrijević B. Three-dimensional total synchronous luminescence spectroscopy criteria

for discrimination between normal and malignant breast tissues. Photochem Photobiol

(2005) 81: 1554–1558.

Dramićanin T., Lenhardt L., Zeković I. & Dramićanin M.D. Support Vector Machine on

Fluorescence Landscapes for Breast Cancer Diagnostics. J Fluoresc., (2012) 22: 1281-

1289.

Dufour E., Devaux M.F., Fortier P. & Herbert S. Delineation of the structure of soft

cheeses at the molecular level by fluorescence spectroscopy - relationship with texture.

International Dairy Journal (2001) 11 (4-7): 465-473.

7. Literatura

143

Dufour E., Mazerolles G., Devaux M. F., Duboz G., Duployer M. H. & Riou M. N.

Phase transition of triglycerides during semi-hard cheese ripening. International Dairy

Journal (2000) 10 (1-2): 81-93.

Dufour E. & Riaublanc A. Potentiality of spectroscopic methods for the characterisation

of dairy products. I. Front-face fluorescence study of raw, heated and homogenised

milks. Lait (1997) 77 (6): 657- 670.

Geladi P. Analysis of multi-way (multi-mode) data. Chemometric and Intelligent

Laboratory Systems (1989) 7: 11-30.

Georgakoudi I., Jacobson B.C., Muller M.G., Sheets E.E., Badizadegan K., Carr-Locke

D.L., Crum C.P., Boone C.W., Dasari R.R., Van Dam J. & Feld M.S. NAD(P)H and

collagen as in vivo quantitative fluorescent biomarkers of epithelial precancerous

changes. Cancer Res (2002) 62(3): 682-687.

Gill P.E., Murray W. & Wright M.H. Practical optimization. Academic Press Inc.

(London) Limited. (1981)

Harshman R.A. & Lundy M.E. Data preprocessing and the extended PARAFAC model,

in "Research methods for Mulitmode data analysis". (Eds. H.G. Law, C.W. Snyder, J.A.

Hattie and R.P. McDonald) Praeger, New York, 1984.

Harshman, R. A. Foundations of the PARAFAC procedure: Models and conditions for

an "explanatory" multi-modal factor analysis. UCLA Working Papers in Phonetics (Ann

Arbor: University Microfilms) (1970) 16: 1-84.

Harshman R. A. "How can I know if it's 'real'?" A catalog of diagnostics for use with

three-mode factor analysis and multidimensional scaling. In H. G. Law, C. W. Snyder,

Jr., J. Hattie, & R. P. McDonald (Eds.), (1984) Research methods for multimode data

analysis (pp. 566-591). New York: Praeger.

He L.M., Kear-Padilla L.L., Lieberman S.H. & Andrews J.M. Rapid in situ

determination of total oil concentration in water using ultraviolet fluorescence and light

scattering coupled with artificial neural networks. Analytica Chimica Acta (2003) 478:

245-258.

7. Literatura

144

Herbert S., Mouhous R.N., Devaux M.F., Riaublanc A., Bouchet B., Gallant D.J. &

Dufour E. Monitoring the identity and the structure of soft cheeses by fluorescence

spectroscopy. Lait (2000) 80: 621–634.

Herbert S., Riaublanc A., Bouchet B., Gallant D.J. & Dufour E. Fluorescence

spectroscopy investigation of acid-or rennet-induced coagulation of milk. Journal of

Dairy Science (1999) 82 (10): 2056-2062.

Ho C.N., Christian G.D., Davidson E.R. Application of Method of Rank Annihilation to

Quantitative-Analyses of Multicomponent Fluorescence Data from Video Fluorometer.

Analytical Chemistry (1978) 50 (8): 1108-1113.

Ivancuic O. Applications of Support Vector Machines in Chemistry. In Reviews in

Computational Chemistry, Lipkowitz KB Cundari TR (eds), Wiley-VCH, Weinheim,

(2007) 23: 291-400.

Jiji R.D. & Booksh K.S. Mitigation of Rayleigh and Raman spectral interferences in

multi-way calibration of excitation-emission matrix fluorescence spectra. Anal. Chem.

(2000) 72: 718-725.

Jovanović D.J., Antić Ž., Krsmanović R.M., Mitrić M., Đorđević V., Bártová B. &

Dramićanin M.D. Annealing effects on the microstructure and photoluminescence of

Eu3+ -doped GdVO4 powders. Optical Materials (2013) 35 (10): 1797-1804.

Kamath S.D. & Mahato K.K. Optical pathology using oral tissue fluorescence spectra:

classification by principal component analysis and k-means nearest neighbor analysis. J

Biomed Opt (2007) 12: 014028

Karoui R., Dufour E., Bosset J.O. & De Baerdemaeker J. The use of front face

fluorescence spectroscopy to classify the botanical origin of honey samples produced in

Switzerland. Food Chem (2007a) 101: 314–323.

Karoui R., Dufour E. & De Baerdemaeker J. Front face fluorescence spectroscopy

coupled with chemometric tools for monitoring the oxidation of semi-hard cheeses

throughout ripening. Food Chem (2007b) 101: 1305–1314.

Kauppinen R.A., Williams S.R., Busza A.L. & Van Bruggen N. Applications of

magnetic resonance spectroscopy and diffusion-wighted imaging to the study of brain

biochemistry and pathology. Trends in Neuroscience (1993) 16(3): 88-95.

7. Literatura

145

Kiers H.A.L. & Krijnen W.P. An efficient algorithm for PARAFAC of three-way data

with large numbers of observation units. Psychometrika (1991) 56: 147-152.

Kiers H.A.L. Weighted least squares fitting using iterative ordinary least squares

algorithms. Psychometrika (1997) 62: 251-266.

Kruskal J.B. Rank, decomposition, and uniqueness for 3-way and N-way arrays, In

"Multiway data analyses", (Eds. R. Coppi and S. Bolasco), Elsevier Science Pub.

(North-Holland), (1989).

Kulmyrzaev A.A. & Dufour E. Determination of lactulose and furosine in milk using

front-face fluorescence spectroscopy. Lait (2002) 82 (6): 725-735.

Kulmyrzaev A.A., Levieux D. & Dufour E. Front-face fluorescence spectroscopy allows

the characterization of mild heat treatments. Lab. Syst. (2005) 75: 201-208.

Lackowicz J.R. Principles of fluorescence spectroscopy, 2nd ed., Kluwer

Academic/Plenum Publishers, New York, (1999).

Lawton W.H & Sylvestre E.A. Self modeling curve resolution. Technometr (1971) 13:

617-633.

Lenhardt L., Zeković I., Dramićanin T., Dramićanin M.D. & Bro R. Determination of

the botanical origin of honey by front-face synchronous fluorescence spectroscopy.

Appl. Spectrosc. (2014) 68 (5): 557-563.

Lenhardt L., Zeković I., Dramićanin T. & Dramićanin M.D. Artificial neural network

for processing fluorescence spectroscopy data in skin cancer diagnostics. Phys Scripta

(2013) T157: 014057.

Lenhardt L., Zeković I., Dramićanin T., Tešić Ž., Milojković-Opsenica D. &

Dramićanin M.D. Authentication of the botanical origin of unifloral honey by infrared

spectroscopy coupled with support vector machine algorithm. Phys Scripta (2014)

T162: 014042.

Leurgans S. & Ross R.T. Multilinear models in spectroscopy. Statist. Sci. (1992) 7: 289-

319.

Li J.S., Wang H., Zhang X. & Zhang H.S. Spectrofluorometric determination of total

amount of nitrite and nitrate in biological sample with new fluorescent probe 1,3,5,7-

7. Literatura

146

tetramethyl-8-(3’,4’-diaminophenyl)- difluoroboradiaza-s-indacene. Talanta. (2003) 61

(6): 797-802.

Li S. and Gemperline P.J. Eliminating complex eigenvectors and eigenvalues in

multiway analyses using the direct trilinear decomposition method. J. Chemom. (1993)

7: 77-88.

Marchiarullo M.A. & Ross R.T. Factor-analysis of chlorophyll fluorescence in

photosynthetic systems. Biophysical Journal (1982) 37 (2): A233.

Martens H. & Næs T., Mutivariate Calibration, John Wiley & Sons, Chichester, UK,

(1989).

Mazerolles G., Devaux M.F., Duboz G., Duployer M.H., Riou N.M. & Dufour E.

Infrared and fluorescence spectroscopy for monitoring protein structure and interaction

changes during cheese ripening. Lait (2001) 81 (4): 509-527.

Mercer J. Functions of positive and negative type and their connection with the theory

of integral equations. Phil Trans Roy Soc London A (1909) 209:415-446.

Mitchell B.C. & Burdick D.S. Slowly converging PARAFAC sequences: Swamps and

two-fator degeneracies. J. Chemom. (1994) 8: 155-168.

Munck L., Norgaard L., Engelsen S.B., Bro R. & Andersson C.A. Chemometrics in

food science – a demostration of the feasibility of a highly exploratory, inductive

evaluation strategy of fundamental scientific significance. Chemometrics and Intelligent

Laboratory Systems (1998) 44 (1-2): 31-60.

Paatero P. A weighted non-negative least squares algorithm for three-way "PARAFAC"

factor analysis. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems (1997) 38: 223-242.

Pataca L.C.M., Borges Neto W., Marcucci C.M. & Poppi J.R. Determination of apparent

reducing sugars, moisture and acidity in honey by attenuated total reflectance-fourier

transform infrared spectrometry. Talanta (2007) 71: 1926–1931.

Persano Oddo L. & Piro R. Main European unifloral honeys: descriptive sheets

Apidologie (2004) 35: 38–81.

7. Literatura

147

Plugge W. & Van Der Vlies C. Near-infrared spectroscopy as an alternative to assess

compliance of ampicillin trihydrate with compendial specifications. Journal of

Pharmaceutical and Biomedical Analysis (1993) 11 (6): 435-442.

Ramanujam N. Fluorescence spectroscopy in vivo. In: Meyers RA (ed) Encyclopedia of

analytical chemistry. John Willey & Sons, Ltd., Chichester, NewYork, pp 20–56, (2000).

Rodriguez-Delgado M.A., Malovana S., Perez J.P., Borges T. & Garcia Montelongo F.J.

Separation of phenolic compounds by high-performance liquid chromatography with

absorbance and fluorometric detection. J. Chromatogr. A. (2001) 912 (2): 249–257.

Ross R.T., Lee C.H., Davis C.M., Ezzeddine B.M., Fayyad E.A. & Leurgans S.E.

Resolution of the fluorescence-spectra of plant pigment-complexes using trilinear

models. Biochimica et Biophysica Acta (1991) 1056 (3): 317-320.

Ruoff K., Karoui R., Dufour E., Luginbuhl W., Bosset J.O., Bogdanov S. & Amado R.

Authentication of the botanical origin of honey by front-face fluorescence spectroscopy,

a preliminary study. J. Agric. Food Chem. (2005) 53 (5): 1343-1347.

Ruoff K., Luginbuhl W., Kunzli R., Bogdanov S., Bosset J., Von der Ohe K., Von der

Ohe W. & Amado R. Authentication of the Botanical and Geographical Origin of Honey

by Front-Face Fluorescence Spectroscopy. J. Agric. Food Chem. (2006) 54(18): 6858-

6866.

Russell M.D. & Gouterman M. Excitation-Emission-Lifetime analysis of

multicomponent systems .1. principal component factor-analysis. Spectrochimica Acta

Part A-Molecular and Biomolecular Spectroscopy (1988) 44 (9): 857-861.

Sadecka J. & Tothova J. Fluorescence spectroscopy and chemometrics in the food

classification—a review. Czech J Food Sci (2007) 546 (25) 159–173.

Sanchez E. & Kowalski B.R. Tensorial resolution: A direct trilinear decomposition. J.

Chemom. (1990) 4: 29-45.

Sanchez E. & Kowalski B.R. Tensorial calibration: II. Second-order calibration. J.

Chemometrics (1988) 2: 265–280.

Sanchez E. & Kowalski B.R. Generalized Rank Annihilation Factor-Analysis.

Analytical Chemistry (1986) 58 (2): 496-499.

7. Literatura

148

Schomacker K.T., Frisoli J.K., Compton C.C., Flotte T.J., Richter J.M., Nishioka N.S.

& Deutsch T.F. Ultraviolet laser-induced fluorescence of colonic tissue: basic biology

and diagnostic potential. Lasers Surg Med (1992) 12: 63–78.

Sidiropoulos N. D. & Bro R. On the uniqueness of multilinear decomposition of N-way

arrays. J. Chemometrics (2000) 14: 229–239.

Sikorska E., Gorecki T., Khmelinskii I.V., Sikorski M. & Kozioł J. Classification of

edible oils using synchronous scanning fluorescence spectroscopy. Food Chem (2005)

89: 217–225.

Silverman D.C. Corrosion prediction in complex enviroments using electrochemical

impedance spectroscopy. Electrochimica Acta (1993) 38 (14): 2075-2078.

Smilde A. K. & Doornbos D.A. 3-Way methods for the calibration of chromatographic

systems - comparing parafac and 3-way pls. Journal of Chemometrics (1991) 5 (4):

345-360.

Sterenborg H.J.C.M., Motamedi M., Wagner R.F., Duvic M., Thomsen S. & Jacques

S.L. In vivo fluorescence spectroscopy and imaging of human skin tumours. Lasers

Med Sci (1994) 9: 191–201.

Strasburg G.M. & Ludescher R.D. Theory and applications of fluorescence

spectroscopy in food research. Trends in Food Science & Technology (1995) 6 (3): 69-

75.

Ten Berge J.M.F. & Sidiropoulos N.D. On uniqueness in Candecomp/Parafac.

Psychometrika (2002) 67: 399–409.

Thurstone L. L. The vectors of mind: Multiple-factor analysis for the isolation of

primary traits. Chicago, IL, US: University of Chicago Press (1935).

Uppal A. & Gupta P.K. Measurement of NADH concentration in normal and malignant

human tissues from breast and oral cavity. Biotecnol. Appl. Biochem. (2003) 37: 45-50.

Wold H. Path models with latent variables: The NIPALS approach. In: Blalock H. M. et

al. (editors). Quantitative Sociology: International perspectives on mathematical and

statistical model building. Academic Press, N.Y., 307-357, (1975).

7. Literatura

149

Wold J.P., Mielnik M., Pettersen M.K., Aaby K. & Baardreth P. Rapid assessment of

rancidity in complex meat products by front face fluorescence spectroscopy. J Food Sci

(2002) 67: 2397–2404.

Wold H. Nonlinear estimation by iterative least squares procedures. Research Papers in

Statistics: Festschrift for J. Neyman (1966) 411-444.

Zeković I., Lenhardt L., Dramićanin T., Bandić J. & Dramićanin M.D. Discrimination

between melanoma, nevi and normal skin by using synchronous luminescence

spectroscopy. Appl. Spectrosc. (2014) 68 (8): 823-830.

Zeković I., Lenhardt L., Dramićanin T. & Dramićanin M.D., Classification of intact

cereal flours by front-face synchronous fluorescence spectroscopy. Food Anal. Methods

(2012) 5: 1205-1213.

150

8. Prilog

Prilog A

A.1 Kronecker, Hadamard i Khatri-Rao proizvod

Za opis multidimenzionalnih modela nisu dovoljni standardni matrični proizvodi. Stoga

će ovde biti objašnjeno još tri tipa matričnog proizvoda: Kronecker (⊗), Hadamard (*)

i Khatri-Rao (⊙).

Kronecker-ov proizvod dve matrice A ( I × J ) i B ( K × M ) je definisan na sledeći način

𝐀 ⊗ 𝐁 = [

𝑎11𝐁 … 𝑎1𝐽𝐁

⋮ ⋱ ⋮𝑎𝐼1𝐁 … 𝑎𝐼𝐽𝐁

] (A.82)

iz čega sledi da je veličina rezultujuće matrice 𝐀 ⊗ 𝐁 ( IK × JM ) i da Kronecker-ov

proizvod je definisan čak i za slučajeve gde standarni matrični proizvod nije moguće

primeniti (ako je J ≠ K).

Primer A.1

Kao jednostavan primer Kronecker-ovog proizvoda dat je proizvode sledeće dve

matrice

𝐀 = [1 23 4

] ; 𝐁 = [0 7

-1 8]

𝐀 ⊗ 𝐁 = [1𝐁 2𝐁3𝐁 4𝐁

] = [

0 7 0 14-1 8 -2 160-3

2124

0 28-4 32

]

8. Prilog

151

Za Kronecker-ov proizvod važe neki osnovni zakoni proizvoda:

𝐀 ⊗ 𝐁 ⊗ 𝐂 = (𝐀 ⊗ 𝐁) ⊗ 𝐂 = 𝐀 ⊗ (𝐁 ⊗ 𝐂)

(𝐀 + 𝐁) ⊗ (𝐂 + 𝐃) = 𝐀 ⊗ 𝐂 + 𝐀 ⊗ 𝐃 + 𝐁 ⊗ 𝐂 + 𝐁 ⊗ 𝐃 (A.83)

ukoliko 𝐀 + 𝐂 i 𝐂 + 𝐃 postoje i

(𝐀 ⊗ 𝐁)(𝐂 ⊗ 𝐃) = 𝐀𝐂 ⊗ 𝐁𝐃 (A.84)

Ukoliko AC i BD postoje. Još neke korisne osobine Kronecker-ovog proizvoda su:

a) 𝑎 ⊗ 𝐀 = 𝑎𝐀 = 𝐀𝑎 = 𝐀 ⊗ 𝑎 ; 𝑔𝑑𝑒 𝑎 𝑗𝑒 𝑠𝑘𝑎𝑙𝑎𝑟

b) (𝐀 ⊗ 𝐁)′ = 𝐀′ ⊗ 𝐁′

c) 𝐚′ ⊗ 𝐛 = 𝐛𝐚′ = 𝐛 ⊗ 𝐚′

d) tr(𝐀 ⊗ 𝐁) = tr(𝐀)tr(𝐁) ; 𝑧𝑎 𝑘𝑣𝑎𝑑𝑟𝑎𝑡𝑛𝑒 𝑚𝑎𝑡𝑟𝑖𝑐𝑒 𝐀 𝑖 𝐁

e) (𝐀 ⊗ 𝐁)−1 = 𝐀−1 ⊗ 𝐁−1 ; 𝑢𝑘𝑜𝑙𝑖𝑘𝑜 𝐀 𝑖 𝐁 𝑛𝑖𝑠𝑢 𝑠𝑖𝑛𝑔𝑢𝑙𝑎𝑟𝑛𝑒

f) r(𝐀 ⊗ 𝐁) = r(𝐀)r(𝐁)

g) (𝐀 ⊗ 𝐁)+ = 𝐀+ ⊗ 𝐁+

(A.85)

Drugi proizvod koji se dosta koristi u višedimenzionalnoj analizi jeste Hadamard-ov

proizvod koji je za dve matrice A ( I × J ) i B ( K × M )

𝐀*𝐁 = [

𝑎11𝑏11 … 𝑎1𝐽𝑏1𝐽

⋮ ⋱ ⋮𝑎𝐼1𝑏𝐼1 … 𝑎𝐼𝐽𝑏𝐼𝐽

] (A.86)

Gde su aij i bij elementi matrica A i B, respektivno. Stoga se može zaključiti da je

Hadamard-ov proizvod proizvod element po element.

Primer A.2

Za primer koji je prethodno korišćen za Kronecker-ov proizvod, Hadamard proizvod

matrica A i B je

8. Prilog

152

𝐀*𝐁 = [1 23 4

]*[0 7

-1 8]=[

0 14

-3 32]

Neke osobine Hadamard-ovog proizvoda su:

a) 𝐀* 𝐁= 𝐁* 𝐀

b) (𝐀* 𝐁)′= 𝐀′* 𝐁′

c) (𝐀* 𝐁) * 𝐂 = 𝐀 * (𝐁 * 𝐂)

d) (𝐀 + 𝐁)*(𝐂 + 𝐃)= A * C + A * D + B * C + B * D

e) A * I =diag(a11,...,ann)

(A.87)

Treći proizvod koji je koristan za trodimenzionalnu analizu je Khatri-Rao proizvod koji

je definisan na sledeći način:

𝐀 = [𝐀1. . 𝐀𝐾] i 𝐁 = [𝐁1. . 𝐁𝐾]

𝐀 ⊙ 𝐁 = [𝐀1 ⊗ 𝐁1. . 𝐀𝐾 ⊗ 𝐁𝐾] (A.88)

gde su A i B matrice podeljene na jednak broj delova odnosno matrica. Neke korisne

osobine Khatri-Rao proizvoda su:

(𝐀 ⊙ 𝐁) ⊙ 𝐂 = 𝐀 ⊙ (𝐁 ⊙ 𝐂)

(𝐓1 ⊗ 𝐓2)(𝐀 ⊙ 𝐁) = 𝐓1𝐀 ⊙ 𝐓2𝐁 (A.89)

Ukoliko su A i B podeljeni na njihovih K kolona, onda je to specijalan slučaj za koji

dodatno važi

(𝐀 ⊙ 𝐁)′(𝐀 ⊙ 𝐁) = (𝐀′𝐀)*(𝐁′𝐁) (A.90)

Primer A.3

Isti primer korišćen za Kronecker i Hadamard proizvod, U slučaju Khatri-Rao

proizvoda je prikazan na sledeći način

8. Prilog

153

𝐀 ⊙ 𝐁 = [(13) ⊗ (

0-1

) ⊗ (78)] = [

0-1

1416

0 28-3 32

]

A.2 Koncept linearnosti modela

Pretpostavimo da nam treba model koji će povezati parametre xi (prediktor) i yi

(rezultat), gde i indeksira objekte i ima vrednosti od 1 do I. Takav model je linearan po

parametrima i po varijablama ukoliko se može napisati na sledeći način

𝑦𝑖 = 𝑏0 + 𝑏1𝑥𝑖 + 𝑒𝑖 ; 𝑖 = 1,… , 𝐼 (A.91)

što predstavlja klasičan regresioni model sa presekom (𝑏0) i greškom (𝑒𝑖). Primer

modela koji je linearan po parametrima, ali je nelinearan po x je

𝑦𝑖 = 𝑏0 + 𝑏1𝑥𝑖 + 𝑏2𝑥𝑖2 + 𝑒𝑖 ; 𝑖 = 1,… , 𝐼 (A.92)

Koncept linearnosti se može proširiti na bilinearnost i trilinearnost. Ako nam treba

model sa dva parametra za opis matrice X ( I × J ) sa elementima xij, onda se jedan

takav dvokomponentni model može napisati na sledeći način

𝑥𝑖𝑗 = 𝑡𝑖1𝑝𝑗1 + 𝑡𝑖2𝑝𝑗2 + 𝑒𝑖𝑗 ; 𝑖 = 1,… , 𝐼; 𝑗 = 1,… , 𝐽 (A.93)

Uočava se da modeliran deo matrice X je linearan kako po 𝑡𝑖1, 𝑡𝑖2 (za fiksirane 𝑝𝑗1, 𝑝𝑗2)

tako i po 𝑝𝑗1, 𝑝𝑗2 (za fiksirane 𝑡𝑖1, 𝑡𝑖2). Stoga se izraz (A.12) naziva bilinearan model

matrice X.

Slično prethodnom primeru može se prikazati i koncept trilinearnosti na modelu

trodimenzionalne matrice X ( I × J × K ) sa elementima matrice xijk:

𝑥𝑖𝑗𝑘 = 𝑎𝑖1𝑏𝑗1𝑐𝑘1 + 𝑎𝑖2𝑏𝑗2𝑐𝑘2 + 𝑒𝑖𝑗𝑘; 𝑖 = 1,… , 𝐼; 𝑗 = 1, … , 𝐽;

𝑘 = 1,… , 𝐾 (A.94)

8. Prilog

154

gde je matrica X ( I × J × K ) modelirana sa dve komponente. Modelirani deo 𝑥𝑖𝑗𝑘 je

trilinearan po parametrima a, b i c. Samim tim se izraz (A.13) može nazvati trilinearnim

modelom matrice X, što je u stvari PARAFAC model matrice X.

A.3 Rang i k-Rang matrice

Rang matrice je broj r jednak najvećem redu kvadratne regularne podmatrice A pri čemu

važi da je r ≤ min (m,n) gde su m i n broj redova i kolona, respektivno. Postoji više

načina određivanja ranga matrice, u P

rimeru A.4 je prikazan jedan od načina.

Primer A.4

Određivanje ranga matrice i ranga kolona matrice se može jednostavno ilustrovati

primerom. Ako imamo matricu

𝐀 = [1 42 53 6

]

onda A ima dve nezavisne kolone. Stoga je rang kolona matrice jednak 2. Uz pomoć

matrice A definiše se linearna transformacija za dobijanje opsega ℜ(A)=Ax=y i

primenom

𝐀𝐱 = [1 42 53 6

] [𝑥1

𝑥2] = 𝑥1 [

123] + 𝑥2 [

456] = 𝐲

kolone matrice A formiraju bazu za ℜ(A). Stoga ℜ(A) je dvodimenzionalna i rang

matrice je samim tim 2. Primer matrice koja ima rang jedan je matrica

𝐀 = [1 32 6

]

Linearna transformacija ove matrice može biti napisana kao

8. Prilog

155

𝐀𝐱 = [1 32 6

] [𝑥1

𝑥2] = 𝑥1 [

12] + 𝑥2 [

36] = (𝑥1 + 3𝑥2) [

12] = 𝐲

samim tim je ℜ(A) jednodimenzionalan i rang matrice A je jedan.

k-Rang matrice je koristan koncept pri odlučivanju da li je PARAFAC dekompozicija

određene matrice jedinstvena. Ako uzmemo u obzir matricu X ( I × J ) koja ima rang R.

Samim tim X ima određeni set od R nezavisnih kolona. Međutim neki drugi set R

kolona matrice X može da bude nezavistan. Pretpostavimo da je svaki set R kolona

nezavistan i nazovimo ovu osobinu nezavisnost univerzalnih R-kolona. Očigledno je da

ako je matrica X nezavisna univerzalnih R-kolona onda je r(X) ≥ R. Najveća celobrojna

vrednost k za koju je matrica X nezavisna univerzalnih k-kolona se naziva k-Rang

matrice X i označava se sa kX.

Primer A.5

Primeri koncepta k-Ranga su:

𝐀 = [1 1 2 51 1 3 31 1 4 2

] ; r(𝐀) = 3, 𝑘A = 1

𝐁 = [1 2 32 3 43 4 5

] ; r(𝐁) = 3, 𝑘B = 3

𝐂 = [1 2 32 3 53 4 7

] ; r(𝐂) = 2, 𝑘C = 2

Matrica A ima rang tri. Svi mogući podsetovi od po dve kolone nemaju rang dva,

stoga samo svi podsetovi od po jedne kolone imaju puni rang i samim tim se dobija

da je 𝑘A = 1. Matrica B ima rang tri. Svi podsetovi od po dve kolone imaju rang dva i

postoji samo jedan podset od tri kolone odnosno cela matrica i zato je k-Rang matrice

B jednak 3. Matrica C ima rang 2 jer je treća kolona suma prve i druge kolone. Svi

podsetovi od po dve kolone imaju rang 2 odnosno pun rang. Podset od tri kolone

8. Prilog

156

nema pun rang stoga je k-Rang matrice C jednak 2.

A.4 Singularna dekompozicija matrice

Neku su m i n (m ≥ n) prirodni brojevi, a X proizvoljna realna matrica veličine m × n i

neka je r rang matrice. Tada postoji dekompozicija

𝐗 = 𝐔𝚺𝐕T (A.95)

Gde je U ortonormalna matrica veličine m × n i V ortogonalna n × n matrica, dok je 𝚺 =

diag(σ1, σ2, … , σ𝑟) ; σ1 ≥ σ2 ≥ ⋯ ≥ σ𝑟 ≥ 0 dijagonalna kvadratna matrica dimenzije r

× r sa pozitivnim singularnim vrednostima. Kolone matrice U nazivamo levi singularni

vektori, a kolone matrice V desni singularni vektori. Osnovna struktura singularne

dekompozicije matrice se može predstaviti i kao suma

𝐗 = σ1𝒖1𝒗′1 + σ2𝒖2𝒗′2 + ⋯+ σ𝑟𝒖𝑟𝒗

′𝑟 = ∑σ𝑖𝒖𝑖𝒗′𝑖

𝒓

𝑖=1

(A.96)

Iz čega sledi da matrica X, ranga r, može da se predstavi kao linearna kombinacija r

matrica (𝒖𝑖𝒗′𝑖), ranga 1.

Neka bitna svojstva singularne dekompozicije matrice su:

1) Neka je 𝐗 ∈ 𝐂𝑚×𝑛, njena inverzna matrica je jedinstvena matrica X+,takva da važi

𝐗𝐗+𝐗 = 𝐗, 𝐗+𝐗𝐗+ = 𝐗+

(𝐗𝐗+)∗ = 𝐗𝐗+, (𝐗+𝐗)∗ = 𝐗+𝐗.

2) Neka je m ≥ n i 𝐗 = 𝐔𝚺𝐕T singularna dekompozicija matrice X

a) Ako je X simetrična matrica sa svojstvenim vektorima qi, tj. X=QΛQT, pri čemu

je Q=[ q1,..., qn], Λ=diag(λ1,..., λn). Tada je 𝐗 = 𝐔𝚺𝐕T za ui=qi, σ𝑖= │λi│i

vi=sign(λi)qi.

b) Svojstvene vrednosti XTX su 𝜎𝑖2. Desni singularni vektori vi su odgovarajući

ortonormirani svojstveni vektori.

8. Prilog

157

c) Svojstvene vrednosti XXT su 𝜎𝑖2 i m-n nula. Levi singularni vektori ui su

odgovarajući ortonormirani svojstveni vektori za svojstvene vrednosti 𝜎𝑖2.

d) Ukoliko X ima pun rang, a b je proizvoljan vektor, onda je 𝑥 = 𝐗+𝑏 =

𝐕𝚺−1𝐔T𝑏 rešenje problema min𝑥‖𝐗𝑥 − 𝑏‖2.

e) Važi da je ‖𝐗‖2 = σ1. Ukoliko postoji X-1 onda je ‖𝐗−1‖2 = 1/σ𝑛.

f) Neka je 𝐗𝑘 = 𝐔𝚺𝑘𝐕T = ∑ σ𝑖𝒖𝑖𝒗′𝑖

𝒌𝑖=1 , gde je 𝚺 = diag(σ1, σ2, … , σ𝑘 , 0, … ,0).

Tada matrica 𝐗𝑘 ima rang k te je ona najbliža matrici X među svim matricama

ranga k:

‖𝐗 − 𝐗𝑘‖2 = min𝑟𝑎𝑛𝑔(𝐵)=𝑘

‖𝐗 − 𝑏‖2

Takođe važi da je ‖𝐗 − 𝐗𝑘‖2 = σ𝑘+1.

g) Pretpostavimo da za signularne vrednosti matrice X važi σ1 ≥ σ2 ≥ ⋯ ≥ σ𝑟 ≥

σ𝑟+1 = ⋯ = σ𝑛 = 0, tada je rang(X) = r.

Primer A.6

Singularna dekompozicija matrice veličine 3 × 2.

𝐗 = [1 22 33 4

]

= [-0.3381 0.8480 0.4082-0.5506 0.1735 -0.8165-0.7632 -0.5009 0.4082

] [6.5468 0

0 0.37420 0

] [-0.5696 -0.8219-0.8219 0.5696

]

158

8. Biografija

Lea Lenhardt rođena je 2.5.1986. u Beogradu, gde je završila osnovnu školu i

gimnaziju. Školske 2005/2006. godine upisuje osnovne studije na Mašinskom fakultetu

Univerziteta u Beogradu. Osnovne akademske studije završava 2008. godine sa

diplomskom radom pod nazivom “Senzori za detekciju raka”. Iste godine upisuje

master studije na Mašinskom fakultetu Univerziteta u Beogradu. 2010. godine završava

master studije sa master radom pod nazivom “Primena fluorescentne spektroskopije u

karakterizaciji i klasifikaciji biomolekula”. 2010. upisuje prvu godinu doktorskih studija

na Fizičkom fakultetu Univerziteta u Beogradu na studijskom programu – Primenjena i

kompjuterska fizika. Od maja 2010. godine je zaposlena u Institutu za nuklearne nauke

„Vinča“ u laboratoriji za radijacionu hemiju i fiziku “Gama“. Od tada osnovni predmet

istraživanja Lee Lenhardt je primena optičkih spektroskopskih metoda i multivarijantnih

statističkih tehnika u biologiji i medicini.

Kandidat je koautor 6 naučnih radova u međunarodnim časopisima sa SCI liste.

Objavila je značajan broj saopštenja iznetih na domaćim i međunarodnim

konferencijama štampanim u celini u izvodu. Radovi korišćeni za tezu su pod rednim

brojevima 1, 3 i 5.

Spisak naučnih radova:

1. Lenhardt L., Zeković I., Dramićanin T., Tešić Ž., Milojković-Opsenica D.&

Dramićanin M.D. Authentication of the botanical origin of honey by infrared

spectroscopy coupled with support vector machine algorithm. Physica Scripta, (2014)

T162: 014042.

2. Zeković I., Lenhardt L., Dramićanin T., Bandić J. & Dramićanin M.D.,

Discriminantion among melanoma, nevi and normal skin by using synchronous

luminescence spectroscopy. Applied Spectroscopy (2014) 68(8): 823-830.

8. Biografija

159

3. Lenhardt L., Zeković I., Dramićanin T., Dramićanin M.D. & Bro R. Determination of

the botanical origin of honey by front-face synchronous fluorescence spectroscopy.

Applied Spectroscopy (2014) 68(5): 557-563

4. Lenhardt L., Zeković I., Dramićanin T. & Dramićanin M.D. Artificial neural network

for processing fluorescence spectroscopy data in skin cancer diagnostics. Physica

Scripta (2013) T157: 014057.

5. Dramićanin T., Lenhardt L., Zeković I. & Dramićanin M.D. Support Vector Machine

on fluorescence landscapes for breast cancer diagnostics. Journal of Fluorescence

(2012) 22: 1281-1289.

6. Zeković I., Lenhardt L., Dramićanin T. & Dramićanin M.D. Classification of intact

cereal flours by front-face synchronous fluorescence spectroscopy. Food Analytical

Methods (2012) 5: 1205-1213.

160

Изјава о ауторству

Потписани-a Леа Ленхардт _____________________

број индекса D-5/2010 _______________________________

Изјављујем

да је докторска дисертација под насловом

Паралелна факторска анализа флуоресцентних својстава вишекомпонентних

система

резултат сопственог истраживачког рада,

да предложена дисертација у целини ни у деловима није била предложена

за добијање било које дипломе према студијским програмима других

високошколских установа,

да су резултати коректно наведени и

да нисам кршио/ла ауторска права и користио интелектуалну својину

других лица.

Потпис докторанта

У Београду, _________________

_________________________

161

Изјава o истоветности штампане и електронске верзије

докторског рада

Име и презиме аутора Леа Ленхардт

Број индекса D-5/2010

Студијски програм Примењена физика

Наслов рада Паралелна факторска анализа флуоресцентних својстава

вишекомпонентних система

Ментор Проф др Мирослав Драмићанин

Потписани/а Леа Ленхардт

Изјављујем да је штампана верзија мог докторског рада истоветна електронској

верзији коју сам предао/ла за објављивање на порталу Дигиталног

репозиторијума Универзитета у Београду.

Дозвољавам да се објаве моји лични подаци везани за добијање академског звања

доктора наука, као што су име и презиме, година и место рођења и датум одбране

рада.

Ови лични подаци могу се објавити на мрежним страницама дигиталне

библиотеке, у електронском каталогу и у публикацијама Универзитета у Београду.


У Београду, ________________________

_________________________

162

Изјава о коришћењу

Овлашћујем Универзитетску библиотеку „Светозар Марковић“ да у Дигитални

репозиторијум Универзитета у Београду унесе моју докторску дисертацију под

насловом:

ПАРАЛЕЛНА ФАКТОРСКА АНАЛИЗА ФЛУОРЕСЦЕНТНИХ СВОЈСТАВА

ВИШЕКОМПОНЕНТНИХ СИСТЕМА

која је моје ауторско дело.

Дисертацију са свим прилозима предао/ла сам у електронском формату погодном

за трајно архивирање.

Моју докторску дисертацију похрањену у Дигитални репозиторијум Универзитета

у Београду могу да користе сви који поштују одредбе садржане у одабраном типу

лиценце Креативне заједнице (Creative Commons) за коју сам се одлучио/ла.

1. Ауторство

2. Ауторство - некомерцијално

3. Ауторство – некомерцијално – без прераде

4. Ауторство – некомерцијално – делити под истим условима

5. Ауторство – без прераде

6. Ауторство – делити под истим условима

(Молимо да заокружите само једну од шест понуђених лиценци, кратак опис

лиценци дат је на полеђини листа).


У Београду, ________________________

____________________

163

1. Ауторство - Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела,

и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или

даваоца лиценце, чак и у комерцијалне сврхе. Ово је најслободнија од свих

лиценци.

2. Ауторство – некомерцијално. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно

саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране

аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу

дела.

3. Ауторство - некомерцијално – без прераде. Дозвољавате умножавање,

дистрибуцију и јавно саопштавање дела, без промена, преобликовања или

употребе дела у свом делу, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране

аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу

дела. У односу на све остале лиценце, овом лиценцом се ограничава највећи обим

права коришћења дела.

4. Ауторство - некомерцијално – делити под истим условима. Дозвољавате

умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе

име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце и ако се

прерада дистрибуира под истом или сличном лиценцом. Ова лиценца не

дозвољава комерцијалну употребу дела и прерада.

5. Ауторство – без прераде. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно

саопштавање дела, без промена, преобликовања или употребе дела у свом делу,

ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце.

Ова лиценца дозвољава комерцијалну употребу дела.

6. Ауторство - делити под истим условима. Дозвољавате умножавање,

дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на

начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце и ако се прерада

дистрибуира под истом или сличном лиценцом. Ова лиценца дозвољава

комерцијалну употребу дела и прерада. Слична је софтверским лиценцама,

односно лиценцама отвореног кода.

univerzitet u beogradu · 2020. 1. 17. · Članovi komisije 1. prof. dr miroslav dramićanin,...

Documents