univerzita palackého v olomouci - theses.cz

Univerzita Palackého v Olomouci

Diplomová práce

Olomouc 2013 Bc. Dita Badalová

Univerzita Palackého v Olomouci

Přírodovědecká fakulta

Katedra buněčné biologie a genetiky

Analýza cukerné komponenty rekombinantního

gp120 proteinu pomocí průtokové cytometrie

s využitím fluorescenčních mikropartikulí a sady

vybraných lektinů

Diplomová práce

Bc. Dita Badalová

Studijní program: Biologie

Studijní obor: Molekulární a buněčná biologie

Forma studia: Prezenční

Olomouc 2013 Vedoucí práce: Doc. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D.

Bibliografická identifikace:

Jméno a příjmení autora: Dita Badalová

Název práce: Analýza cukerné komponenty rekombinantního gp120 proteinu pomocí

průtokové cytometrie s využitím fluorescenčních mikropartikulí a sady

vybraných lektinů

Typ práce: diplomová

Pracoviště: Ústav imunologie, Lékařská fakulta, Olomouc

Vedoucí práce: Doc. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D.

Rok obhajoby práce: 2013

Abstrakt: Diplomová práce byla zaměřena na analýzu cukerné komponenty

rekombinantního

glykoproteinu gp120 metodou průtokové cytometrie s využitím fluorescenčně

značených mikrosfér. Cukerná komponenta imobilizovaného gp120 byla

analyzována pomocí tří lektinů s odlišnou glykanovou specifitou: AAL, GNL,

PHA-L. Po nalezení optimální koncentrace lektinů byla studována změna

Reaktivity vybraných lektinů s gp120 před a po ošetřením enzymem PNGasa F.

Klíčová slova: gp120, glykany, Aleuria aurantia lektin (AAL), Galanthus nivalis lektin

(GNL), Phaseolus vulgaris leukoaglutinin (PHA-L), průtoková cytometrie,

fluorescenčně značené mikrosféry

Počet stran: 72

Počet příloh: 0

Jazyk: český

Bibliographical identification:

Author’s first name and surname: Dita Badalová

Title: The flow cytometry analysis of oligosaccharide moiety of recombinant gp120

protein

adsorbed on fluorescent microparticles using set of selected lectins

Type of thesis: master

Department: Department of Immunology, Faculty of Medicine, Olomouc

Supervisor: Doc. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D.

The year of presentation: 2013

Abstract: This thesis was focused on the analysis of oligosaccharide moiety

of recombinant gp120 protein by flow cytometry using fluorescently labeled

microspheres. A sugar component of immobilized gp120 was analyzed using

three lectins with different glycan specificity: AAL GNL, PHA-L. After finding

the optimal concentration of lectins,there were studied the changes of the

reactivity of selected lectins with gp120 before and after treatment with the

enzyme PNGasa F.

Keywords: gp120, glycans, Aleuria aurantia lectin (AAL), Galanthus nivalis lectin

(GNL) Phaseolus vulgaris leucoagglutinin (PHA-L), flow cytometry,

fluorescently labeled microspheres

Number of pages: 72

Number of appendices: 0

Language: czech

Prohlašuji, že jsem tuto diplomovou práci vypracovala sama a že uvádím veškerou

použitou literaturu.

V Olomouci dne 3.5.2013 ................................................

Ráda bych poděkovala mému vedoucímu, panu Doc. MUDr. Mgr. Milanu Raškovi, Ph.D.,

a pracovnímu kolektivu na Ústavu imunologie LF za jejich cenné rady. Dále bych ráda

poděkovala Studentské grantové soutěži na Univerzitě Palackého v Olomouci

(2012 - 2013) LF_2012_011, za materiální podporu ve studiu.

SOUHRN

Syndrom získané imunodeficience (AIDS), patří k jednomu z nejrozšířenějších

onemocnění na světě. Jedná se o fatální virové onemocnění, jehož původcem je virus

lidské imunodeficience (HIV). V současnosti již existují medikamenty, které dokáží

významně prodloužit život HIV infikovaných pacientů. Bohužel, dosud nebyl nalezen lék,

který by umožnil jejich úplné uzdravení. Proto, ale také z důvodu finanční náročnosti

dostupné léčby, probíhá intenzivní výzkum usilující o vývoj HIV vakcíny, sloužící jako

prevence šíření HIV viru.

Konstrukce efektivní vakcíny je závislá na znalosti virových komponent a jejich vlivu

na proces infekce. Glykoprotein gp120, který společně s glykoproteinem gp41 vytváří

obalový protein Env, se jeví jako slibný adept pro sestrojení účinné vakcíny založené

na indukci neutralizačních protilátek. Pro vytvoření funkční vakcíny je však nezbytné

nalézt vhodnou variantu Env antigenu, indukujícího tvorbu účinných neutralizačních

protilátek.

V této diplomové práci byla zavedena metoda analýzy gp120 proteinů, imobilizovaných

na fluorescenčně značené polystyrenové mikrosféry, které umožní charakterizovat některé

vlastnosti gp120 pomocí průtokové cytometrie. Hlavním cílem diplomové práce byla

analýza cukerné komponenty rekombinantního glykoproteinu gp120 pomocí lektinů

z Aleuria aurantia (AAL), Galanthus nivalis (GNL) a Phaseolus vulgaris (PHA-L).

SUMMARY:

Acquired immune deficiency syndrom (AIDS) belongs to one of the most frequent cause

of the death worlwide. It is a disease caused by the human immunodeficiency virus (HIV).

At present there are drugs that can significantly extend survival of HIV-1-infected patients.

Unfortunately, full recovery of patients was not still achieved. Therefore extensive

research is focused on development of a prophylactic vaccine that would prevent spreading

of the HIV virus.

The design of an effective vaccine depends on the knowledge of viral biology

and structural components and their involvement in the course of infection. The viral

envelope glycoprotein Env consists of trimers of gp120 plus p41 subunites. Env appears

to be a promising candidate for construction of an effective vaccine. To create a functional

Env-based vaccine, it is necessary to identify an appropriate Env variant, which could

induce effective neutralizing antibodies.

In this thesis, a method analyzing glycosylation of gp120 protein was introduced. It

is based on immobilization of gp120 on fluorescently labeled polystyrene microspheres

followed by determination of gp120 reactivity with selected lectins using flow cytometry.

The main aim of the thesis was to analyze oligosaccharide components of recombinant

gp120 using lectins Aleuria aurantia lectin (AAL), Galanthus nivalis lectin (GNL),

and leukoagglutinin from Phaseolus vulgaris (PHA-L).

OBSAH

1 ÚVOD .............................................................................................................................. 11

2 SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY ..................................................... 12

2.1 VIRUS LIDSKÉ IMUNODEFICIENCE

(HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS; HIV) .................................................................... 12

2.1.1 GENOM VIRU HIV ....................................................................................................... 14 2.1.2 BUNĚČNÝ TROPIZMUS HIV VIRU .......................................................................... 15 2.1.3 SYNDROM ZÍSKANÉ IMUNODEFICIENCE

(ACQUIRED IMMUNE DEFICIENCY SYNDROM; AIDS) ............................................... 17 2.1.3.1. PRŮBĚH CHOROBY ................................................................................................ 17 2.1.4 ANTI-RETROVIRÁLNÍ TERAPIE .............................................................................. 18

2.2 OBALOVÝ GLYKOPROTEIN gp120 ................................................................................. 20

2.2.1. STRUKTURA gp120 .................................................................................................... 20 2.2.1.2 V3 OBLAST ............................................................................................................... 22 2.2.1.3 GLYKOSYLACE GP120............................................................................................ 23 2.2.2 IN VITRO EXPRESE gp120........................................................................................... 25

2.3 ANALÝZA GLYKOPROTEINŮ POMOCÍ PRŮTOKOVÉ CYTOMETRIE ..................... 28

2.3.1 PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE ..................................................................................... 28 2.3.1.1 SLOŽENÍ PRŮTOKOVÉHO CYTOMETRU ............................................................ 28 2.3.1.2 PRINCIP PRŮTOKOVÉ CYTOMETRIE .................................................................. 29 2.3.1.3 ANALYZOVANÉ PARAMETRY ............................................................................. 30 2.3.1.4 VÝHODY A NEVÝHODY PRŮTOKOVÉ CYTOMETRIE, JEJÍ APLIKACE ....... 32 2.3.2 LEKTINY ....................................................................................................................... 33

3 CÍLE PRÁCE .................................................................................................................. 35

4 MATERIÁL A METODIKA ......................................................................................... 36

4.1 BIOLOGICKÝ MATERIÁL ................................................................................................. 36

4.1.1 GLYKOPROTEIN gp120 .............................................................................................. 36 4.1.2 LEKTINY ....................................................................................................................... 36 4.1.3 OSTATNÍ BIOLOGICKÝ MATERIÁL ........................................................................ 37

4.2 ROZTOKY A CHEMIKÁLIE ............................................................................................... 37

4.3 MIKROSFÉRY ...................................................................................................................... 38

4.4 LABORATORNÍ PŘÍSTROJE A VYBAVENÍ .................................................................... 39

4.5 PŘÍPRAVA MIKROPARTIKULÍ S KONJUGOAVNÝM REKOMBINANTNÍM gp120

PROTEINEM NAVÁZANÝM PŘES pentaHIS PROTILÁTKU (1000 μl SUSPENZE) .......... 40

4.5.1 PŘÍPRAVA MIKROSFÉR............................................................................................. 40 4.5.2 MODIFIKACE pentaHIS PROTILÁTKY ..................................................................... 40 4.5.3 VÝMĚNA PUFRU PRO ODSTRANĚNÍ NEZREAGOVANÝCH KOMPONENT ... 40 4.5.4 VAZBA pentaHIS PROTILÁTKY NA MIKROPARTIKULE ..................................... 41 4.5.5 NAVÁZÁNÍ REKOMBINANTNÍHO gp120 PROTEINU

NA MIKROSFÉRY AKTIVOVANÉ pentaHIS PROTILÁTKOU ........................................ 41

4.6 OPTIMALIZACE ŘEDĚNÍ LEKTINŮ A CHARAKTERIZACE JEJICH REAKTIVITY

S gp120 PROTEINEM ................................................................................................................ 42

4.7 DEGLYKOSYLACE gp120 PROTEINU VÁZANÉHO NA MIKROSFÉRY POMOCÍ

PNGasy F ..................................................................................................................................... 45

5 VÝSLEDKY .................................................................................................................... 46

5.1 ANALÝZA CUKERNÉ KOMPONENTY gp120 (293T, RD) POMOCÍ LEKTINU

ALEURIA AURANTIA (AAL) .................................................................................................. 49

5.1.1 ANALÝZA REAKTIVITY AAL S REKOMBINANTNÍM gp120 PROTEINEM

(293T, RD) .............................................................................................................................. 49 5.1.2 ANALÝZA REAKTIVITY AAL S REKOMBINANTNÍM gp120 PROTEINEM

(293T, RD) PO ENZYMATICKÉM OŠETŘENÍ PNGasou F ............................................... 51

5.2 ANALÝZA CUKERNÉ KOMPONENTY gp120 (293T, RD) POMOCÍ LEKTINU

GALANTHUS NIVALIS (GNL) ................................................................................................ 53

5.2.1 ANALÝZA REAKTIVITY GNL S REKOMBINANTNÍM gp120 PROTEINEM

(293T, RD) .............................................................................................................................. 53 5.2.2 ANALÝZA REAKTIVITY GNL S REKOMBINANTNÍM gp120 PROTEINEM


5.3 ANALÝZA CUKERNÉ KOMPONENTY gp120 (293T, RD) POMOCÍ

LEUKOAGLUTININU Z PHASEOLUS VULGARIS (PHA-L) ............................................... 57

5.3.1 ANALÝZA REAKTIVITY PHA-L S REKOMBINANTNÍM gp120 PROTEINEM

(293T, RD) .............................................................................................................................. 57 5.3.2 ANALÝZA REAKTIVITY PHA-L S REKOMBINANTNÍM gp120 PROTEINEM


6 DISKUZE ........................................................................................................................ 61

7 ZÁVĚR ............................................................................................................................ 65

8 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY .......................................................................... 66

9 SEZNAM ZKRATEK .................................................................................................... 72

11

1 ÚVOD

Od objevení viru lidské imunodeficience (HIV), uplynulo třicet let. Za tuto krátkou

dobu si onemocnění vyvolané HIV virem, zvané AIDS, vybralo asi třicet milionů lidských

životů. V současnosti je na naší planetě nakaženo asi třicet čtyři milionů lidí a asi osm tisíc

lidí se každodenně HIV virem nově infikuje (UNAIDS, 2012). Přestože jsou v dnešní době

známa léčiva, která dočasně oddálí rozvoj stádia AIDS u HIV pozitivních pacientů, dosud

není známa vakcína, která by předcházela vzniku infekce (Levinson a kol., 2006).

AIDS je choroba rozšířená po celém světě a její léčba je vysoce finančně náročná.

Proto je nalezení účinné vakcíny velmi důležité. Přes všechny snahy se však doposud

nepodařilo najít účinnou a bezpečnou vakcínu. Důležitým krokem při konstrukci úspěšné

vakcíny je nalezení vhodného imunogenu, který bude indukovat tvorbu účinných

neutralizujících protilátek a efektivní buněčnou obranu. Jedním z virových proteinů, který

bude ve vakcíně obsažen je glykoprotein Env nebo jeho podjednotka gp120 (Mascola

a Montefiori, 2010).

Glykoprotein gp120 vytváří společně s glykoproteinem gp41 obalový protein HIV viru

(Env), prostřednictvím kterého dochází k vazbě HIV na receptory a ko-receptory

hostitelské buňky. Gp120 je tedy důležitým proteinem, umožňujícím vstup HIV do buňky

(Janeway a kol., 1999). Gp120 je silně glykosylovaný. Asi polovinu molekulové hmotnosti

glykoproteinu gp120 vytváří N-vázané glykany. Glykosylace gp120 významně ovlivňuje

jeho antigenicitu i imunogenicitu, a proto se stává předmětem mnoha studií (Go a kol.,

2008; Kong a kol., 2010; Leonard a kol., 1990; Raška a kol., 2010).

Tato diplomová práce je zaměřena na analýzu cukerné komponenty glykoproteinu

gp120 navázaného na fluorescenčně značené mikrosféry pomocí průtokové cytometrie.

Výhodou použité metody je zachování nativní konformace analyzovaného proteinu, díky

čemuž se studie interakcí gp120 více přibližují podmínkám in vivo.

12

2 SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY

2.1 VIRUS LIDSKÉ IMUNODEFICIENCE (HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS; HIV)

Virus lidské imunodeficience (human immunodeficiency virus, HIV) spadá do čeledi

Retroviridae, podčeledi Lentivirinae. Podčeleď Lentivirinae zahrnuje kromě virů Visna,

Maedi, virů imunologické nedostatečnosti opic (SIV) a virů imunologické nedostatečnosti

koček (FIV), také dva typy viru HIV, HIV-1 a HIV-2. Jedná se o výrazně antigenně

a biologicky odlišné typy HIV viru. Infekce virem HIV setrvává dlouhodobě v latentním

stádiu, po kterém dojde k její aktivaci. Aktivace infekce vede k cytopatickému efektu a lýzi

napadené buňky (Bednář a kol., 1996).

Původ HIV-1 je odvozen od viru SIV, který infikoval několik geograficky izolovaných

šimpanzích populací v jižním Kamerunu. SIV byl pravděpodobně přenesen z šimpanze

na člověka, a to krevní cestou. Fylogenetická analýza HIV-1 prokázala, že tři na sobě

nezávislé přenosy na počátku dvacátého století daly vznik třem skupinám viru HIV-1,

a to hlavní (major; M), vedlejší (outlier; O) a ne-hlavní (nonmajor; nonoutlier; N) skupině

(Taylor a kol., 2008). Nejrozšířenější skupina mezi infikovanými jedinci, skupina M, je

dále členěna na subtypy (A-K). V Americe, Asii, Austrálii a Evropě převládá infekce

subtypem B, zatímco v Africe jsou rozšířeny především subtypy A, C, D a E (Janini a kol.,

1998). Jednotlivé subtypy viru HIV se vyznačují rozdílnými charakteristikami

a interakcemi s hostitelskými buňkami. Odlišné vlastnosti virových subtypů zapříčiňují

rozlišnou účinnost přenosu HIV viru a průběh onemocnění (Taylor a kol, 2008).

Z morfologického hlediska patří HIV mezi obalené viry. Velikost virové částice

se pohybuje v rozmezí od 100 nm do 120 nm. Na povrchu virionu se nachází lipidový obal,

který virus získává z membrány hostitelské buňky během pučení. V lipidovém obalu je

ukotven obalový protein Env tvořený trimerem podjedntotek gp120 a gp41. Pod lipidovým

obalem se nachází membránový protein p18. Nukleoid je ohraničen zevní kapsidou,

tvořenou proteinem p24. Vnitřní, helikoidální kapsida, je tvořena polypeptidy p7 a p9,

které se váží na virovou nukleovou kyselinu. Genom HIV viru sestává ze dvou identických

vláken RNA, s pozitivní polaritou. Genom viru, polypeptidy p7 a p9, virové enzymy

integráza (p32), reverzní transkriptáza (p66, p51) a proteáza (p12) a další proteiny, vytváří

13

tzv. dřeň nukleokapsidu (Bednář a kol., 1996). Schéma HIV viru je uvedeno

na obrázku č. 1.

Obrázek č. 1: Morfologie HIV viru

(Upraveno podle Rubbert a kol., 2011)

Přenos viru z jedince na jedince je zprostředkován krevní cestou, spermatem,

vaginálním sekretem a mateřským mlékem. V populaci se HIV nejčastěji šíří pohlavním

stykem, méně frekventní cestu přenosu představují kontaminované injekční jehly, krevní

transfúze, či transplacentární nebo perinatální přenos z matky na dítě. V těle jedince jsou

následně virem HIV infikovány CD4+ T-lymfocyty a makrofágy (Krejsek a Kopecký.,

2004).

14

2.1.1 GENOM VIRU HIV

Jak již bylo uvedeno, genom viru HIV je tvořen dvěma jednořetězcovými molekulami

RNA s pozitivní orientací, které jsou vzájemně spojeny vodíkovou vazbou. Genom HIV

nese tři typické retrovirální strukturní geny (gag, pol a env) a dále šest genů regulačních

(tat, rev, nef, vif, vpr a vpu). Zmíněné geny jsou ohraničeny dlouhými koncovými

repeticemi (long terminal repeats; LTR), které umožňují integraci virové nukleové

kyseliny do genomu hostitelské buňky (Janeway a kol., 1999).

Gen gag kóduje proteiny vnitřního jádra, mezi něž patří proteiny p24, p17, p7 a p6

(Greene, 1991). Detekce protilátek vůči antigenu p24, gp41 a gp120 nebo gp160

při sérologických testech poukazuje na expozici testovaného jedince HIV (Krejsek

a Kopecký, 2004).

Mezi proteiny, kódované genem pol, patří reverzní transkriptáza, integráza a proteáza.

Reverzní transkriptáza je bifunkční enzym, jak s ribonukleázovou, tak polymerázovou

aktivitou. Po vstupu viru do buňky a jeho rozbalení dochází k přepisu molekuly RNA

do molekuly DNA za vzniku hybridní molekuly RNA-DNA. V tomto kroku má reverzní

transkriptáza funkci RNA-dependentní DNA polymerázy. V přítomnosti hybridní

molekuly RNA-DNA vykazuje reverzní transkriptáza aktivitu ribonukleázy H a štěpí RNA

vlákno (Simons a Snustad, 2009). Tento krok je esenciální pro následnou syntézu

dvouvláknové virové DNA. Integráza následně slouží k zabudování virové DNA do

hostitelského genomu za vzniku tzv. proviru. Funkcí proteázy je štěpení virových

prekurzorových polyproteinů na funkční polypeptidy.

Produktem genu env je prekurzorový glykoprotein gp160. Ten je dále pomocí proteázy

rozštepen na dva obalové glykoproteiny gp120 a gp41 (Borrow a kol., 1997). Podrobnější

informace o gp120 a gp41 jsou uvedeny v následujících kapitolách.

Produkt genu tat zesiluje transkripci virové (a možná také buněčné) DNA a společně

s produktem genu nef reprimují syntézu MHC molekul I. třídy, čímž redukují schopnost

cytotoxických (CD8+) T-lymfocytů rozpoznávat a následně likvidovat HIV-infikované

buňky.

Protein vzniklý expresí genu rev zodpovídá za kontrolu transportu zralé virové mRNA

z jádra do cytoplazmy. Poslední zmíněný gen, gen vif, zesiluje infekčnost HIV viru inhibicí

apolipoprotein B RNA-editujícího enzymu (APOBEC3G), jehož úlohou je deaminace

cytosinů virových nukleových kyselin (Levinson, 2006).

15

2.1.2 BUNĚČNÝ TROPIZMUS HIV VIRU

Schopnost viru infikovat pouze některé typy buněk je označován, jako buněčný

tropizmus. Buněčný tropizmus je determinován expresí specifických buněčných receptorů,

které jsou rozpoznávány příslušnými viry. Oba typy HIV, HIV-1 a HIV-2, mají selektivní

tropizmus k buňkám, které na svém povrchu nesou antigen CD4. Molekula CD4 slouží

jako specifický buněčný receptor, který viru umožňuje vstup do buňky. Vazba HIV

na CD4+ buňky je zprostředkována nekovalentně vázanými, asociovanými proteiny gp120

a gp41, které jsou umístěny ve virovém obalu. Fúzi a následnému vstupu HIV do buňky

předchází vazba glykoproteinu gp120 na chemokinový ko-receptor, který se nachází

v membráně hostitelské buňky (Levinson a kol., 2006).

Chemokinové ko-receptory patří mezi G-proteiny, rozsáhlou skupinu membránových

proteinů, pro něž je charakteristická přítomnost sedmi transmembránových alfa helixů, čtyř

extracelulárních a čtyř intracelulárních domén (Krambovitis a kol., 2005). Hlavními

ko-receptory, které jsou využívány HIV virem pro vstup do buňky, jsou dva typy

chemokinových ko-receptorů, a to CCR5 a CXCR4 ko-receptory. CCR5 ko-receptor je

exprimován na dendritických buňkách, makrofázích a CD4+

T-lymfocytech, zatímco

CXCR4 ko-receptor je exprimován pouze T-lymfocyty včetně subpopulace nativních

T-lymfocytů (Janeway a kol., 1999).

Ve výjmečných případech mohou být virem HIV-1 infikovány též buňky, které na svém

povrchu CD4 receptor nenesou. Jedná se o astrocyty (Liu a kol., 2004), B-lymfocyty

(De Silva a kol. 2001), CD8+ T-lymfocyty (Livingstone a kol., 1996), thymocyty (Kitchen

a kol., 1997), trofoblasty (Al-Harthi a kol., 2002) a dendritické buňky (Gummuluru a kol.,

2003).

Za hlavní molekulární determinantu, která předurčuje buněčný tropizmus, je

považována třetí variabilní oblast (V3) virového obalového glykoproteinu gp120. Bohužel,

jak již název napovídá, V3 oblast je vysoce variabilní, a to jak v sekvenci aminokyselin,

tak v jejich počtu. Díky této skutečnosti je obtížné využívat V3 oblast při určování

buněčného tropizmu viru (Dybowski a kol., 2010). Podrobnější informace o V3 oblasti

a úloze, kterou zastává v buněčném tropizmu viru, je pojednáno v podkapitole 2.2.1.2 (V3

oblast).

Na základě skutečnosti, jaké buňky HIV-1 infikuje, jsou rozlišovány kmeny

X4 (T-lymfotropní) a R5 kmeny. T-lymfotropní kmeny napadají T-lymfocyty, zatímco R5

16

kmeny mají zvýšený tropizmus k makrofágům. Jmenované kmeny se liší ve vazbě na

chemokinové ko-receptory, prostřednictvím kterých dochází ke vstupu HIV-1 do buňky.

Zatímco X4 kmeny využívají pro vstup do buňky ko-receptor CXCR4, R5 kmeny do

buňky vstupují pomocí ko-receptoru CCR5. Existují taktéž kmeny, které mají takzvaný

„dvojí“ tropizmus a jsou tedy schopny využívat jak ko-receptor CXCR4, tak CRR5 (Koot

a kol., 1993). Znalost buněčného tropizmu našla své využití v antiretrovirální léčbě. Léčivo

s názvem Maraviroc vytváří vazbu s CCR5 ko-receptorem, čímž znemožňuje navázání

gp120 proteinu viru HIV. Bohužel, CCR5 inhibitory jsou v případě X4 kmenů neúčinné

(Dybowski a kol., 2010).

Infekce hostitele je zahájena R5 kmenem HIV-1, tedy kmenem s tropizmem

k makrofágovým buňkám. V průběhu období latence dochází ke genetickému

rozrůzňování jednotlivých kmenů viru HIV-1. Kmeny s tropizmem k makrofágům jsou

postupně nahrazovány T-lymfotropními kmeny. T-lymfotropní kmeny napadají CD4+

lymfocyty infikovaného jedince, které cytopaticky ničí. Úbytek T-lymfocytů je příčinou

vzniku syndromu lidské imunodeficience (acquired immune deficiency syndrom, AIDS)

(Krejsek a Kopecký, 2004).

17

2.1.3 SYNDROM ZÍSKANÉ IMUNODEFICIENCE (ACQUIRED IMMUNE DEFICIENCY SYNDROM; AIDS)

AIDS lze charakterizovat, jako pomalu rozvíjející se chorobu, při níž dochází

k progresivnímu úbytku obranyschopnosti organismu. AIDS propuká u naprosté většiny

jedinců infikovaných virem HIV. Důvodem je existence mnoha mechanizmů, díky nimž

HIV úspěšně uniká dozoru imunitního systému. Mezi hlavní mechanizmy patří integrace

virové DNA do hostitelského genomu a vznik perzistentní infekce. Dále také produkce Tat

a Nef proteinů, které snižují expresi MHC molekul I. třídy, nutných pro správnou funkci

cytotoxických T-lymfocytů (Levinson, 2006). V neposlední řadě je to vysoká variabilita

Env proteinu, který je zodpovědný za vstup HIV do buňky. Protein Env je taktéž výrazně

glykosylován, díky čemuž jsou neutralizační epitopy nepřístupné pro většinu potenciálně

neutralizačních protilátek (Taylor a kol., 2008). Díky jmenovaným skutečnostem virus

odolává imunitnímu systému svého hostitele, v němž se pomalu ale jistě šíří. Výsledkem je

dříve či později úmrtí infikovaného jedince.

2.1.3.1. PRŮBĚH CHOROBY

Asi u poloviny jedinců se dva až tři týdny po infekci virem HIV objevuje tzv.

primární syndrom. Primární syndrom je charakteristický projevy podobnými chřipce, může

se objevit únava, či zvětšené lymfatické uzliny. Během několika týdnů příznaky infekce

ustávají. Zhruba polovina infikovaných jedinců příznaky primárního syndromu nemá

(Bednář a kol., 1996).

Ať už se infekce HIV virem projeví či neprojeví rozvojem primárního syndromu,

u všech infikovaných osob následuje latentní období, při němž se infekce u nakažených

jedinců nikterak neprojevuje. Latentní období trvá u každého pacienta různě dlouhou dobu,

nakonec však přechází v tzv. perzistentní generalizovanou lymfadenopatii, která

se projevuje pocením, únavou, průjmy a lehce zvýšenou teplotou. Tento stav může trvat

i po několik let, po kterých přechází do stadia označovaného jako ARC (AIDS-related

complex). ARC stádium je typické výskytem lymfadenopatie, horečkou, průjmy,

hubnutím, kožními problémy, kandidózami sliznic a častými aktivacemi herpesvirů

a papilomavirů (Krejsek a Kopecký, 2004).

18

Posledním stádiem infekce je stádium rozvinutého syndromu imunitní nedostatečnosti

(AIDS). (Bednář a kol., 1996). V posledním stádiu infekce HIV virem je nakažený jedinec

vystaven vysokému riziku nákazy oportunními patogeny, často také dochází k propuknutí

zhoubných nádorových onemocnění, jako např. B-buněčný lymfom nebo Kaposiho

sarkom. Kaposiho sarkom je nádorové onemocnění způsobené lidským herpesvirem

HHV-8. Zdravý organismus je schopen virus potlačit, nemoc propuká teprve u jedinců

s vážně narušenou imunitou. Kaposiho syndrom je charakterizován houbovitými

hnědočervenými uzly, které se nachází typicky na bércích, později je lze nalézt také

na horních končetinách a na sliznicích (Janeway a kol., 1999).

V dnešní době hovoříme o tzv. celosvětové pandemii AIDS, jejíž příčinou je infekce

virem HIV, nejčastěji typem HIV-1. Vyjímkou je západní Afrika a Indie, v nichž je

mnoho nemocných infikováno typem HIV-2. Přestože typ HIV-2 vyvolává podobné

symptomy, jako typ HIV-1, rozvoj onemocnění je pomalejší (Levinson, 2006).

2.1.4 ANTI-RETROVIRÁLNÍ TERAPIE

V současné době jsou v klinické praxi využívány tři základní druhy anti-retrovirálních

léčiv, a to nukleosidové inhibitory reverzní transkriptázy, ne-nukleosidové inhibitory

reverzní transkriptázy a inhibitory virové proteázy (De Luca a kol., 2013).

Nukleosidové inhibitory reverzní transkriptázy jsou antiretrovirové látky, které

postrádají 3´-OH skupinu. Díky nepřítomnosti 3´-OH skupiny nedochází ke vzniku

3´-5´fosfodiesterové vazby mezi 5´ nukleosid trifosfátem a prodlužujícím se řetězcem

virové DNA. Začlenění antiretrovirového nukleosidu do nově vznikajícího řetězce virové

DNA tudíž vede k ukončení jeho syntézy (Krejsek a Kopecký, 2004).

Jako nenuklesidové inhibitory reverzní transkriptázy je označována pestrá škála

polycyklických sloučenin, jejichž funkce je založena na přímé vazbě na virovou reverzní

transkriptázu a tím omezení její mobility a aktivity. (Richman, 2001).

Inhibitory virové proteázy fungují jako syntetické analogy štěpných míst virových

peptidů. Na rozdíl od virových peptidů však nejsou virovými proteázami rozložitelné.

Naopak, po vazbě virové proteázy na zmíněné inhibitory dochází k blokování její funkční

aktivity. Inhibitory HIV proteázy tak znemožňují štěpení gag a gag-pol bílkovinných

prekurzorů v infikovaných buňkách, čímž blokují infekčnost vznikajících virionů.

(Flexner, 1998).

19

Pacienti jsou nejčastěji léčeni kombinací alespoň dvou rozličných antiretrovirálních

terapeutik. Tento léčebný přístup je označován jako vysoce aktivní antiretrovirální terapie

(Highly Active AntiRetroviral Therapy, HAART). HAART léčba však sebou nese určitá

úskalí, ať už se jedná o její mimořádně vysoké náklady nebo vážné vedlejší zdravotní

komplikace pacientů. Mezi vedlejší účinky HAART patří např. útlum krvetvorby, vznik

inzulinové intolerance nebo poruchy v metabolizmu lipidů (Krejsek a Kopecký, 2004).

Díky vědeckému pokroku jsou však objevována nová, efektivnější či méně toxická léčiva,

jako např. enfuvirtid, raltegravir, či maraviroc. Funkce medikamentu enfuvirtid je založena

na vazbě léčiva na obalový glykoprotein gp41. Tímto krokem dochází k inhibici fúze HIV

viru a hostitelské buňky (Robertson, 2003). Účinek léku raltegravir je zaměřen vůči

virovému enzymu integráze (Grinsztejn a kol., 2007). Funkcí léčiva Maraviroc je blokace

CCR5 ko-receptoru, jak je již popsáno v předchozí podkapitole (2.1.2. Buněčný tropizmus

HIV viru).

Bohužel, použití jednotlivých antiretrovirálních terapeutik, ani jejich kombinace, není

schopna HIV infekci zcela vyléčit. Proto je nalezení efektivní vakcíny vůči viru HIV

jedním z hlavních úkolů, kterého se snaží soudobá medicína dosáhnout. Konstrukce

vakcíny by se měla řídit několika zásadními požadavky, mezi něž patří dlouhodobá

ochrana vůči všem genotypům viru HIV-1 a cenová dostupnost umožňující plošnou

aplikaci i v zemích třetího světa (Taylor a kol., 2008). Současné snahy, o konstrukci účinné

vakcíny vůči viru HIV, jsou založeny na poznatcích o struktuře HIV a jeho biologii. Cílem

je vývoj imunogenů, jež jsou schopny vyvolat vznik neutralizujících protilátek, tedy

specifické imunitní odpovědi (Joyce a Meulen, 2010). Existuje však řada problémů, které

brání dosažení stanoveného cíle. Jedním z nich je vysoká frekvence mutací HIV viru.

Mutace vznikají při přepisu RNA do virové DNA, a to díky reverzní transkriptáze, která

postrádá opravnou (proof-reading) aktivitu (Hedestam a kol, 2008). V důsledku toho

dochází ke vzniku vysoké diverzity v rámci HIV. Sekvence HIV viru se mezi jedinci může

lišit až 30%, genetická diverzita existuje taktéž v rámci jednoho jedince, a to až 10%

(Mascola a Montefiori, 2010). Výsledkem je únik HIV jak před imunitním systémem

hostitele, tak před antiretrovirovou terapií (Taylor a kol., 2008).

20

2.2 OBALOVÝ GLYKOPROTEIN gp120

Vstup HIV-1 do buňky je zprostředkován glykoproteiny virového obalu, gp120 a gp41.

Jedná se o nekovalentně vázané podjednotky, vnější gp120 a transmembránovou gp41,

které společně utváří protein virového obalu (Env). Proteinové komplexy gp120-gp41 jsou

na povrchu virionu přítomny ve formě trimerů a jsou schopny vazby na receptory

a koreceptory hostitelské buňky. Vazba komplexu gp120-gp41 na CD4 glykoprotein

a chemokinový ko-receptor CCR5 nebo CXCR4, které se nachází na povrchu hostitelské

buňky, je prvním krokem při vstupu HIV-1 do buňky (Kwong a kol., 1998).

Po vazbě gp120 na buněčný receptor a ko-receptor dochází k fúzi virového obalu

a cytoplazmatické membrány buňky. Fúze je zprostředkována N-terminálním fúzním

peptidem glykoproteinu gp41. Po vsunutí N-terminálního fúzního peptidu gp41

do buněčné membrány dochází k rozbalení gp41 glykoproteinu a následně k přímé fúzi

virionu a plasmatické membrány. Do hostitelské buňky jsou uvolněny enzymy

a genomická RNA HIV viru (Wyatt a Sodroski., 1998). Jelikož gp120 hraje důležitou roli

při vstupu HIV do buňky a interakcích s neutralizačními protilátkami, je informace o jeho

struktuře důležitá pro pochopení průběhu HIV infekce a vývoj terapeutických

a profylaktických strategií (Mascola a Montefiori, 2010).

2.2.1. STRUKTURA gp120

Glykoprotein gp120 je tvořen 484 - 543 aminokyselinami a obsahuje pět

konzervovaných (C1 - C5) a pět variabilních oblastí (V1 – V5) (Korber a kol., 2001).

Oblasti V1 – V4 jsou zformovány do podoby smyček. Konzervované oblasti gp120 vytváří

diskontinuální struktury, které hrají hlavní úlohu při interakci s vnější

doménou glykoproteinu gp41. Jak konzervované, tak variabilní oblasti glykoproteinu

gp120 jsou silně glykosylovány (Leonard a kol., 1990).

Pomocí rentgenové krystalografie byla stanovena struktura nativního gp120

glykoproteinu tvořící komplex s CD4 molekulou. Krystalizace nativního gp120

v nevazebné konformaci je dosud obtížně překonatelnou překážkou. Z toho důvodu byly

provedeny kroky, jako deglykosylace glykoproteinu gp120, odstranění V1/V2 a V3

domény a zkrácení N a C konců proteinu. Deglykosylovaný a jinak upravený gp120

protein byl konjugován s CD4 molekulou. Po krystalizaci komplexu gp120-CD4 bylo

21

možné analyzovat strukturu gp120 technikou rentgenové krystalografie (Rizzuto a kol,

1998).

V tomto stavu je gp120 tvořen třemi doménami, vnitřní doménou, vnější doménou

a tzv. „bridging sheet“ neboli spojující list. Vnitřní doména zahrnuje C- a N- konec

glykoproteinu gp120 a je složena ze dvou helixů, dvouřetězcového svazku na terminálně-

distálním konci a pětiřetězcového β-sendviče na terminálně-proximálním konci. Vnější

doména je tvořena skládaným dvojitým soudkem, jehož osa leží rovnoběžně s osou

dvouřetězcového svazku na terminálně-distálním konci vnitřní domény. Dvojitý soudek

vnější domény se skládá z proximální a distální části. Proximální část zahrnuje β-list

obtáčející se kolem α-šroubovice. Distální část je tvořena sedmiřetězcovým antiparalelním

β-soudkem. „Bridging sheet“ je doména vznikající po vazbě molekuly CD4 na gp120

protein (Kwong a kol., 1998). „Bridging sheet“ je tvořen dvěma páry antiparalelních

β-skládaných listů, které spojují vnitřní a vnější doménu. Vnitřní doména interaguje

s proteinem gp41, vnější doména tvoří povrch proteinu Env. (Rizzuto a kol., 1998).

Struktura proteinu gp120 je znázorněna na obrázku č. 2.

Obrázek č. 2: Struktura glykoproteinu gp120

(Obrázek upraven dle Kwong a kol., 1998)

22

2.2.1.2 V3 OBLAST

Ze zmíněných pěti variabilních oblastí hraje při infikování hostitelské buňky stěžejní

roli V3 oblast, na níž se nachází epitopy pro neutralizující protilátky. Tyto epitopy jsou

pojmenovány jako hlavní neutralizační doména (Krejsek a Kopecký, 2004). V3 oblast

se účastní přímé vazby na buněčný ko-receptor a stává se tak jedním z nejdůležitějších

článků, které rozhodují o buněčném tropizmu HIV-1. Výzkumy prokázaly, že V3 smyčka

působí jako elektrostatický modulátor, ovlivňující celkovou strukturu a diverzitu vnější

domény gp120 proteinu. Z uvedeného tvrzení vyplývá, že V3 smyčka ovlivňuje vazbu

neutralizačních protilátek na HIV-1 a je tedy důležitým článkem při modulování

biologických a imunologických fenotypů viru HIV-1 (Yokoyama a kol., 2012).

V3 oblast viru HIV-1 je obvykle tvořena třiceti pěti aminokyselinami, které vytváří

smyčce podobnou strukturu na vnější doméně glykoproteinu gp120. V3 oblast je bohatá

jak na bazické, tak aromatické aminokyseliny (Yokoyama a kol., 2012). Jak již bylo

řečeno, V3 oblast je zformována do podoby smyčky. V3 smyčka je kladně nabitá a je

uzavřená disulfidovým můstkem, který se vytváří mezi dvěma molekulami cysteinu. V3

smyčka je složena ze tří vzájemně oddělených částí a to svrchní, středové a spodní části

(Dybowski a kol., 2010).

V současnosti je V3 smyčka považována za jednoho z možných imunogenů

využitelných pro konstrukci vakcíny. Na rozdíl od konzervovaných oblastí gp120, je

variabilní V3 oblast v průběhu různých stádií infekce alespoň krátkodobě vystavena

na povrchu viru HIV, je imunogenní u všech HIV pozitivních jedinců a je schopna

indukovat tvorbu neutralizačních protilátek. Současné výzkumy ukazují, že anti-V3

protilátky z HIV infikovaných jedinců vykazují křížovou reaktivitu s různými molekulami

gp120 a jsou tedy schopné neutralizovat široké spektrum primárních izolátů (Zolla-Pazner,

2005).

Nejlepším způsobem studia specifity a funkce jednotlivých protilátek je studium

monoklonálních protilátek. Výzkum zaměřený na široké spektrum monoklonálních

lidských protilátek prokázal, že monoklonální anti-Env protilátky rozpoznávají jedenáct

Env oblastí HIV viru (Nabel a kol., (2005). Nicméně, pouze protilátky specifické ke třem

oblastem na gp120 a jedné oblasti na gp41 jsou schopné široké neutralizace HIV-1. Jedná

se o membránovou externální proximální oblast (MPER) gp41, CD4 vazebnou oblast,

vazebnou oblast pro chemokinový receptor a glykany na povrchu gp120.

23

Vazebná oblast pro chemokinový receptor je rozpoznávána nejméně dvěma odlišnými

sadami monoklonálních protilátek. Jedná se o CD4 indukované (CD4i) protilátky

rozpoznávající „bridging sheet“ gp120 a protilátky, které interagují s V3 smyčkou. Oba

zmíněné typy protilátek jsou přítomny u většiny HIV pozitivních jedinců a inhibují vazbu

gp120 na chemokinový receptor buňky. Na rozdíl od CD4i jsou však protilátky

interagující s V3 smyčkou gp120 schopné neutralizovat primární izoláty HIV jako

kompletní IgG molekuly. Na základě těchto poznatků se jeví V3 oblast gp120 jako jeden

z možných cílů pro vývoj HIV vakcíny. Profylaktická vakcína však musí indukovat tvorbu

vyšší koncentrace anti-V3 protilátek se širší specifitou, než je tomu u přirozené infekce.

(Zolla-Pazner, 2005).

2.2.1.3 GLYKOSYLACE GP120

Glykosylace patří mezi jednu z nejdůležitějších kotranslačních a posttranslačních

modifikací proteinů. V živých systémech existují tři hlavní typy glykosylace, a to N-, O-

a C- glykosylace (Varki, Cummings a kol., 2009).

Zhruba polovinu molekulové hmotnosti glykoproteinu gp120 tvoří N-vázané glykany

(Huskens a Schols, 2012). Jádro N-glykanů sestává ze dvou molekul N-acetylglukosaminu,

tří molekul manózy a variabilního počtu přídatných glykanů (manóza, N-acetylglukosamin,

fukóza, galaktóza, kyselina sialová) (Zhu a kol., 2000). N-glykany jsou připojeny

k proteinové kostře, a to v pozicích, které jsou předurčeny krátkými aminokyselinovými

motivy (N-X-S/T). Jako X je označena jakákoliv aminokyselina kromě prolinu (Huskens

a Schols, 2012). Tyto motivy jsou označovány jako potencionální N-glykosylační místa

(PNGS) a jsou kódována virovým genomem. Zatímco určitá PNGS lze najít u většiny

kmenů HIV-1, přítomnost jiných může být vysoce variabilní. Variabilní PNGS jsou

lokalizována na variabilních doménách gp120. Vyjímkou je V3 smyčka,

na níž se variabilní PNGS nenachází (Mascola a Montefiori, 2010).

N-glykany jsou k nově syntetizovanému polypetidovému řetězci ko-translačně

připojovány v endoplazmatickém retikulu (Helenius a Aebi., 2001). Glykosylace peptidů

v endoplazmatickém retikulu hraje stěžejní roli při skládání proteinu. Správně složený

peptid migruje do Golgiho aparátu, kde dochází k další úpravě glykanů pomocí glykosidáz

a glykosyltransferáz. Výsledkem procesu glykosylace dochází ke vzniku třech typů

glykanů, a to glykanů s vysokým obsahem manózy, hybridních glykanů a komplexních

24

glykanů. N-glykany s vysokým obsahem manózy obvykle obsahují pět až devět

manózových zbytků, připojených k N-glykanovému jádru. Typickou součástí komplexních

N-glykanů je sialyllactosaminová sekvence. Hybridní oligosacharidy obsahují jak prvky

N-glykanů s vysokým obsahem manózy, tak komplexních N-glykanů (Kornfeld

a Kornfeld, 1985). Struktura high-mannose, hybridních a komplexních N-glykanů je

znázorněna na obrázku č. 3.

Obrázek č. 3: Schematické znázornění struktury N-glykanů

(Upraveno dle Varki a kol., 2009)

Heterotrimery virového obalu HIV-1 jsou vysoce glykosylovány. Povrchové proteiny

HIV-1 jsou typické vysokým obsahem glykanů s vysokým obsahem manózy, zatímco

lidské buňky exprimují proteiny s obsahem high-mannose glykanů jen velmi zřídka (Weis

a kol., 1998). K připojení cukerné struktury může u Env proteinu docházet nejméně

na 24 PNGS, které se nachází jak na konzervovaných, tak na variabilních oblastech

(Leonard a kol., 1990). Např. u transmembránové podjednotky gp41, umožňující fúzi viru

a hostitelské buňky, je lokalizováno na extravirální doméně 4-5 PNGS (Johnson a kol.,

25

2001). Přestože je informace o PNGS zapsána v nukleové kyselině viru, finální podoba

glykanu je určena biosyntetickými pochody hostitelské buňky (Raška a kol., 2010).

Glykosylace hraje významnou roli v množství biologických procesů, mezi něž patří

např. skládání proteinů a jejich stabilita, buněčná adheze, či buněčná signalizace. (Varki,

Freeze a kol., 2009). Znalost glykosylace proteinů je taktéž vysoce důležitá při výrobě

bioterapeutik. Glyskosylační profily proteinů poskytují nezbytné informace o jejich

efektivitě a bezpečnosti (Jefferis, 2007). V neposlední řadě hraje glykosylace klíčovou roli

v HIV patogenezi. Glykosylace zajišťuje správné skládání a funkční konformaci obalového

proteinu Env, čímž ovlivňuje antigenicitu a imonogenicitu proteinu. Glykosylace Env

proteinu je však virem využita také jako mechanismus úniku před imunitním systémem.

Tento mechanismus zahrnuje konformační maskování epitopů a krytí glykanů indukujících

neutralizační protilátky. V současné době jsou Env glykany považovány za jeden

z nejslibnějších cílů pro indukci anti-HIV-1 neutralizačních protilátek (Go a kol., 2008).

Jako příklad široce neutralizující protilátky vážící se ke glykanům lze uvést monoklonální

protilátku 2G12. 2G12 je schopná výměny svých těžkých řetězců za účelem tvorby

zvětšeného vazebného povrchu, jehož součástí jsou tři vazebná místa. Jedná se o vysoce

účinnou strategii při vazbě glykanů (Calarese a kol., 2003). Mezi další molekuly

rozpoznávající glykany patří například široce neutralizující protilátky specifické vůči

N-glykanům s vysokým obsahem manózy nebo různé typy lektinů (např. konkavalin A)

(Pashov a kol., 2009). Jako další strategie neutralizace gp120, obsahující různé

glykosylační profily, mohou být využity také polyreaktivní protilátky na bázi lektinů (Pope

a kol., 1995).

2.2.2 IN VITRO EXPRESE gp120

Veškeré glykoproteiny, stejně jako gp120, mají strukturu, složení a různorodost

připojených glykanů závislou na buněčném systému, který je využit pro jejich expresi.

Glykosylace gp120 je tedy ovlivněna orgánovým původem a metabolickou aktivitou

buněk, v nichž je produkován. Rozdílná glykosylace též aminokyselinové kostry

signifikantně ovlivňuje vazbu Env na polyklonální protilátky, které se nachází v séru

HIV-1 infikovaných pacientů. Tato skutečnost potvrzuje existenci vztahu mezi glykosylací

gp120 a imunologickou odpovědí jedince (Raška a kol., 2010).

T-lymfocyty, přirozené hostitelské buňky HIV, patří mezi buňky s nízkou rychlostí

syntézy proteinů. Z tohoto důvodu jsou pro produkci rekombinantních gp120 proteinů

26

častěji využívány jiné buněčné systémy, jako CHO (vaječníky křečka čínského)

(Lu a kol.,, 2008), 293/HEK (buňky lidských embryonálních ledvin), či hmyzí buněčné

kultury SF9 (Spodoptera fugiperda) (Kong a kol., 2010). Nevýhoda jmenovaných

buněčných systémů tkví v glykosylaci gp120, která se liší od jeho glykosylace

v T-lymfocytech (Raška a kol., 2010). Jak již bylo řečeno, odlišně glykosylované

glykoproteiny gp120 vyvolávají různou imunologickou odpověď. Použití nevhodného

imunogenu tak může vést k výrobě nefunkčních vakcín (Robinson., 2007).

Ve výzkumu Raška a kol., (2010) byl studován vliv exprese glykoproteinu gp120

v různých buněčných liniích na jeho glykosylaci. Předmětem experimentu byl

rekombinantní glykoprotein gp120, produkovaný různými buněčnými liniemi: 293T/HEK

(lidskou embryonální ledvinnou buněčnou línií), Jurkat (buňkami lidské T-leukémie),

Molt4 (buňkami lidské akutní T-lymfoblastické leukémie), Dakiki (lidskou

EBV-imortalizovanou B-buněčnou linií), RD (buňkami lidského rhabdomyosarkomu),

HepG2 (buňkami lidského hepatocelulárního karcinomu), Ht1080 (buňkami lidského

fibrosarkomu) a CHO (buňkami vaječníků křečka čínského). Experiment prokázal,

že glykoprotein gp120 produkovaný v různých buněčných liniích vykazuje různou míru

glykosylace. Různá glykosylace gp120 koreluje s jejich rozdílnou molekulovou hmotností

(viz. obrázek č. 4). Nejnižší Mr byla zjištěna u gp120 produkovaného linií CHO a Dakiki,

a to zhruba 125 kDa. Naopak, nejvyšší relativní molekulová hmotnost byla prokázána

u gp120 produkovaného linií HepG2, a to asi 145 kDa.

Obrázek č. 4: Analýza relativní molekulové hmotnosti glykoproteinu gp120

exprimovaného v různých buněčných liniích

(upraveno dle Raška a kol., 2010)

27

Rozdílné glykosylační profily rekombinatních proteinů samozřejmě ovlivňují i jejich

biologické vlastnosti. Vliv různých expresních systémů na antigenicitu a imunogenicitu

proteinu gp120 byl testován výzkumnou skupinou Kong a kol., 2010. Mezi prověřované

expresní systémy byly zahrnuty dvě hmyzí linie (SF9 a SF9 MimicTF

) a jedna linie savčí

(293 FreeStyleTM

bez kifunensinu a 293 FreeStyleTM

v přítomnosti kifunensinu). Linie

293F produkuje glykany s vysokým obsahem manózy, hybridní i komplexní glykany

s kyselinou sialovou. 293F v přítomnosti kifunensinu vytváří glykoproteiny obsahující

pouze glykany s vysokým obsahem manózy. Glykoproteiny exprimované v hmyzí buněčné

linii SF9 obsahuje především tzv. paucimanózový typ glykanů. SF9 MimicTF

produkuje

glykany s vysokým obsahem manózy, hybridní i komplexní glykany, avšak bez kyseliny

sialové. Analýza rekombinantních gp120 proteinů prokázala, že gp120 exprimovaný

v systému inkorporujícím kyselinu sialovou vykazoval, oproti systému neinkorporujícím

kyselinu sialovou, nižší imunogenicitu i antigenicitu. Získané poznatky podporují v rámci

strukturně-funkčních a vakcinačních studií využívání expresních systémů neinkorporující

kyselinu sialovou.

28

2.3 ANALÝZA GLYKOPROTEINŮ POMOCÍ PRŮTOKOVÉ CYTOMETRIE

Cílem této diplomové práce byla analýza cukerné komponenty glykoproteinu gp120

pomocí lektinů metodou průtokové cytometrie. Důležitým kritériem pro výběr analytické

metody byla nutnost zachování nativní konformace proteinu. Průtoková cytometrie se jeví

jako vysoce efektivní, přesná metoda umožňující detekci proteinů imobilizovaných

na fluorescenčně značené mikropartikule. Analyzované proteiny, jejichž konformace je

srovnatelná s konformací, kterou zaujímají in vivo, umožňují jejich přesnější

a efektivnější studie. Z důvodu využití metody průtokové cytometrie v této diplomové

práci se v dalších podkapitolách pokusím objasnit princip a význam průtokové cytometrie

a možnost uplatnění lektinů v analýze glykoproteinů.

2.3.1 PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE

Průtoková cytometrie představuje moderní, vysoce efektivní metodu, která umožňuje

současné měření a analýzu fyzikálních a chemických vlastností buňky nebo biologických

částic v roztoku. Analýza je založena na sbírání signálů po ozáření částic laserovým

paprskem.

2.3.1.1 SLOŽENÍ PRŮTOKOVÉHO CYTOMETRU

Průtokový cytometr je tvořen z části fluidní, optické a elektronické. Fluidika zahrnuje

kapiláru, přivádějící vzorek do průtokové komůrky, průtokovou komůrku a samotnou

unášecí kapalinu, jíž může být destilovaná voda nebo slabý roztok solí (Shapiro, 2003).

Optická část průtokového cytometru je tvořena zdrojem excitačního záření a sběrnými

optickými cestami. U starších průtokových cytometrů lze nalézt jako zdroj excitačního

záření rtuťové lampy, modernější přístroje již disponují lasery, které jsou zdrojem

monochromatického záření. V praxi je nejčastěji využívaný vzduchem chlazený argonový

laser emitující záření o vlnové délce 488 nm. Jedná se o vlnovou délku vhodnou k excitaci

velké škály dnes používaných fluorochromů. Sběrné optické cesty jsou tvořeny čočkami,

zrcadly a filtry. Funkcí čoček je usměrňování fotonů emitovaného záření, zrcadla a filtry

slouží k rozdělení světelných paprsků na jednotlivé detektory (Roubalová, 2012).

29

Elektronickou část průtokového cytometru prezentují fotodetektory a počítačový

software, zobrazující distribuci hodnoty zkoumaného parametru. Fotodetektory slouží

k přijímání částicemi rozptýlených a emitovaných fotonů. Energie fotonů je následně

transformována na energii elektronů, které jsou z fotodetektorů uvolňovány. Vzniklý signál

je poté převeden do digitální podoby. V praxi jsou nejčastěji využívány dva typy

fotodetektorů, fotodiody a fotonásobiče. Mezi nesporné výhody fotodiod patří jejich

rychlost a levná pořizovací cena. Fotodiody však neumožňují měření fluorescence,

což patří mezi jejich hlavní nevýhody. Fotonásobiče jsou však na rozdíl od fotodiod

mnohonásobně sensitivnější. Intenzita signálu může být prostřednictvím fotonásobičů

až milionkrát zvýšena. Využití fotonásobičů je proto velmi vhodné při analýze malých

nebo slabě fluoreskujících částic, poskytujících signál nízké intenzity (Robinson a Grégori,

2007).

2.3.1.2 PRINCIP PRŮTOKOVÉ CYTOMETRIE

Úspěšnost cytometrické analýzy spočívá v dodržení několika základních podmínek.

Veškeré vzorky analyzované metodou průtokové cytometrie musí mít podobu suspenze.

V jednom mililitru analyzované suspenze by mělo být přítomno 105 – 10

6 částic.

Pro analýzu jsou nejvhodnější částice o průměru 1 – 30 μm (Givan, 2004).

Připravená suspenze částic je nasávána tenkou kapilárou, která suspenzi usměrňuje

do tzv. průtokové komůrky, jíž proudí unášecí kapalina. Unášecí kapalina zajišťuje

separaci jednotlivých částic a jejich uspořádání. Vzniká proud oddělených částic, které

se pohybují jedna za druhou. Jedná se o proces nazvaný jako hydrodynamická fokusace.

Každá z částic je následně ozářena (laserovým) paprskem (Robinson a Grégori, 2007).

Vznikající signály jsou dále zpracovávány a převáděny do digitální podoby. Získané

informace jsou ukládány do počítače, jako datové soubory v LIST MODE FILE

a zobrazovány v tzv. formátu cytometrického standardu (FCS).

Vizualizace distribuce hodnot vybraného parametru je zabezpečena počítačovým

softwarem, který je k cytometru dodáván. Výsledkem cytometrické analýzy mohou být

jednoparametrové histogramy, dvouparametrové histogramy a trojrozměrné izometrické

grafy. Jednoparametrový histogram zobrazuje frekvenci distribuce částic pro vybraný

parametr. Dvouparametrový histogram podává záznam o distribuci dvou různých

parametrů. Trojrozměrné izometriecké grafy zobrazují korelaci tří různých parametrů

(Givan, 2004).

30

Obrázek č. 5: Schéma průtokové cytometrie

(Upraveno dle http://biomedicina.prf.jcu.cz/wordpress/wp-

content/uploads/2011/12/Vyuzitiprutokovecytometrievimunologii.pdf)

2.3.1.3 ANALYZOVANÉ PARAMETRY

Poté, co jsou částice ozářeny světelným paprskem, jsou získávána data, která jsou dále

využívána při stanovování studovaných vlastností částic. Mezi parametry, které jsou

při průtokové cytometrii analyzovány, patří rozptyl světla a emise fluorescence.

ROZPTYL SVĚTLA

Při analýze průtokovým cytometrem jsou získávány dva typy rozptylu světla,

a to přímý rozptyl světla (FSC) a boční rozptyl světla (SSC). Zatímco při přímém rozptylu

je paprsek sbírán pod malým úhlem vůči vektoru dopadajícího světla (2º - 13º), při bočním

rozptylu je paprsek vůči vektoru dopadajícího světla sbírán pod úhlem 90º. Příslušné

fotodetektory poté převádí zachycenou energii rozptýleného záření na elektrický signál.

Elektrický signál je dále přetransformován v signál digitální. Zatímco přímý rozptyl je

indikátorem velikosti částice, pravoúhlý rozptyl poskytuje údaje o její granularitě

(Ormerod, 2009).

31

FLUORESCENCE

Fluorescence vzniká po ozáření fluorochromů excitačním zářením. Excitační záření je

světlo o konkrétní vlnové délce, která způsobí excitaci elektronů fluorochromů a jejich

přechod na vyšší energetickou hladinu. Jelikož je tento stav nestabilní, elektrony se vrací

zpět do základního stavu za současné emise světla o vyšší vlnové délce a tudíž nižší

energii, než tomu bylo u záření excitačního. Tento proces nazýváme jako fluorescence

(Shapiro, 2003). Fluorochromy mohou být na cílovou molekulu vázány přímo, nebo

mohou být konjugovány na protilátku, sloužící k detekci konkrétního proteinu. Pro analýzu

lze využít i kombinaci několika různých fluorochromů s nepřekrývajícími se emisními

spektry. Množství použitých typů fluorochromů je taktéž limitováno počtem fotodetektorů,

které jsou v průtokovém cytometru instalovány (Ormerod, 2009). Přehled

nejpoužívanějších fluorochromů v průtokové cytometrii je zaznamenán v tabulce I.

Tabulka I: Nejběžnější fluorochromy používané v průtokové cytometrii

(dle Roubalová, 2012)

Název fluorochromu Zkratka

fluorochromu

Excitační vlnová

délka [nm]

Emisní vlnová

délka [nm]

Samostatné fluorochromy

Allophycocyanin APC 630 661

Fluorescein isothiocyanate FITC 488 530

Peridinin-chlorophyl-protein compex PerCP 488 675

Phycoerythrin PE 488 580

Fluorochromy v tandemu

Allophycocyanin – Cyanin 5.5 APC – Cy5.5 633 695

Allophycocyanin – Cyanin 7 APC – Cy7 633 785

Phycoerythrin – Cyanin 5 PE – Cy5 488 670

Phycoerythrin – Cyanin 7 PE – Cy7 488 780

Phycoerythrin – Texas Red PE – Texas Red 488 615

32

2.3.1.4 VÝHODY A NEVÝHODY PRŮTOKOVÉ CYTOMETRIE, JEJÍ APLIKACE

V dřívějších dobách byla průtoková cytometrie využívána k analýze buněk.

V současnosti lze analyzovat částice o různé velikosti, ať už se jedná o viry, chromozómy,

fragmenty DNA a další (Roubalová, 2012). Průtoková cytometrie nalezla své využití

v mnoha rozličných oborech, jako v buněčné a molekulární biologii, imunologii, genetice

a enviromentálních vědách (Robinson a Grégori, 2007). V klinické praxi je průtoková

cytometrie nejčastěji využívána v klinické imunologii (např. pro detekci autoprotilátek,

imunofenotypizaci lymfocytů, testování alergií, či určení viability spermatu),

hematoonkologii (např. imunofenotypizace leukémií) a nádorové a molekulární biologii

(např. pro analýzu buněčného cyklu, stanovení ploidie, sledování vzniku lékových

rezistencí a další) (Eckschlager a Bartůňková, 1999).

Průtoková cytometrie poskytuje svým uživatelům dvě nesporné výhody. První z nich je

možnost analýzy obrovského množství částic ve velmi krátkém čase. Získané údaje jsou

dostatečně reprezentativní a statisticky hodnotitelné. Z každé částice lze i při rychlosti sto

tisíc událostí za sekundu získat a analyzovat až dvacet parametrů. Druhou výhodou

průtokové cytometrie je možnost separovat jednotlivé částice ze směsi, procesem zvaným

třídění (sorting). Částice určené k separaci jsou sbírány do zkumavek, misek

nebo na podložní sklíčka (Robinson a Grégori, 2007).

Technika průtokové cytometrie nabízí vědeckým pracovníkům značnou mírů pozitiv

a aplikací. Při užívání průtokové cytometrie k rozmanitým analýzám se však mohou

objevit také jisté problémy, které je nutné překonat. Zmiňované problémy se týkají např.

analyzovaných vzorků, které obsahují organické materiály. Mezi vlastnosti organických

materiálů patří přilnavost ke kovovým, skleněným a plastovým materiálům, které jsou

samozřejmě také součástí průtokového cytometru (Shapiro, 2003). Jak již bylo řečeno,

technikou průtokové cytometrie lze analyzovat pouze částice ve formě suspenze. Pokud

jsou zkoumány buňky pevných tkání, musí být před samotnou analýzou jednotlivé buňky

separovány. Separace však může způsobit změnu nebo dokonce ztrátu zkoumaných

vlastností buněk (Givan, 2004).

33

2.3.2 LEKTINY

Lektiny, dříve nazývané jako fytohemaglutininy (na základě schopnosti aglutinovat

červené krvinky), vytváří heterogenní skupinu glykoproteinů, která se vyznačuje

schopností vytvářet nekovalentní vazbu s cukernými zbytky komplexních

glykokonjugantů. Jedná se o proteiny, které vykazují specifickou afinitu vůči konkrétním

sacharidům.

Lektiny jsou syntetizovány bezpočtem druhů organizmů. Nalezneme je u živočichů,

rostlin, ale také hub a mikrooganismů (Vodrážka, 2007). Lektiny z jednotlivých druhů

organismů se liší aminokyselinovou sekvencí, molekulovou hmotností, počtem

podjednotek, glykanovou specifitou, termostabilitou a pH stabilitou (Wang a kol. 1995).

Lektiny jsou zapojeny v mnoha biologických procesech, jako např. v mezibuněčné

komunikaci, indukci apoptózy, interakci patogena a hostitele, šíření a diferenciace

rakovinných buněk a dalších dějích (Huskens a Schols, 2012). Pro svůj vysoký biologický

potenciál jsou lektiny také využívány v různých biomedicínských výzkumech

(Nascimento-Neto a kol., 2012). Lektiny vykazují proti-nádorové, insekticidní,

antinematodní, antifungální a antibakteriální vlastnosti, působí jako modulátory imunitního

systému a také jako inhibitory reverzní transkriptázy viru HIV-1.

Lektiny mohou být klasifikovány na základě glykanové specifity, jež vykazují

nebo na základě jejich všeobecné struktury. Podle struktury jsou lektiny členěny

na merolektiny, hololektiny a chimerolektiny. (Lam a kol., 2011). Merolektiny lze

definovat, jako lektiny nesoucí pouze jednu sacharid vazebnou doménu. Hololektiny jsou

charakteristické přítomností dvou či více stejných nebo podobných glykan-vazebných

domén. Chimerolektiny obsahují jednu nebo více glykan-vazebných domén, dále však také

domény s odlišnou biologickou funkcí (Peumans a Van Damme, 1995). Jak již bylo

řečeno, lektiny mohou být dále členěny na základě afinity k jednotlivým monosacharidům.

Většina lektinů vykazuje glykanovou specifitu vůči manóze, glukóze, galaktóze, fukóze,

N-acetylglukosaminu (GlcNAc), N-acetylgalaktosaminu (GalNAc)

a/nebo N-acetylneruraminidové (sialové) kyselině (Auwerx a kol., 2008).

Lektiny lze získávat dvěma způsoby, a to produkcí lektinů expresními systémy,

využívajících technologii rekombinatní DNA nebo jejich izolací z přírodních zdrojů

chromatografickými metodami. Mezi chromatografické techniky využívané k izolaci

lektinů patří iontově-výměnná chromatografie, afinitní chromatografie, gelová

chromatografie a hydrofóbní chromatografie (Lam a kol., 2011). V současné době bylo

34

blíže prostudováno přes 50 různých lektinů. Komerčně dostupné lektiny se využívají jako

ligandy v afinitní chromatografii a v biochemickém výzkumu, kde své uplatnění nachází

jako sondy vhodné pro mapování buněčných povrchů (Vodrážka, 2007). Lektiny, ale také

protilátky, slouží jako vhodné nástroje pro identifikaci glykanů. Přestože monoklonální

protilátky mohou vykazovat vyšší specifitu vůči cukerným determinantám, u rostlinných

i živočišných lektinů je lépe charakterizována vazebná specifita, jsou stabilnější a levnější

(Varki a kol., 2009).

35

3 CÍLE PRÁCE

1) Seznámení se s průtokovou cytometrií.

2) Optimalizace podmínek adsorpce pomocných protilátek na mikrosféry.

3) Optimalizace podmínek vazby gp120 proteinu na mikropartikule potažené vaznou

protilátkou.

4) Charakterizace navázaného gp120 proteinu pomocí vybraných lektinů.

36

4 MATERIÁL A METODIKA

4.1 BIOLOGICKÝ MATERIÁL

4.1.1 GLYKOPROTEIN gp120

Reaktivita lektinů byla testována s rekombinantním glykoproteinem gp120,

produkovaným buněčnou linií 293T a RD. Jednotlivé gp120 se liší svými glykosylačními

profily. Oba rekombinantní proteiny nesou peptidové značky HIS Tag a V5 Tag.

Koncentrace gp120 byla stanovena srovnáním denzity proužku gp120 proteinu s denzitou

proužků odpovídajících titrační řadě kalibračního proteinu po SDS-PAGE a obarvení

proteinů Coomassie Brilliant Blue R-250.

Charakterizace gp120:

293T (1 mg/ml)

- gp120 produkovaný stabilně transfekovanou buněčnou linií lidských

embryonálních ledvin (HEK) obsahující T antigen

RD (3,3 mg/ml)

- gp120 produkovaný stabilně transfekovanou buněčnou lini lidského

rhabdomyosarkomu; před použitím byl protein naředěn v PBS na koncentraci

1mg/ml

4.1.2 LEKTINY

Charakteristika glykosylačních profilů vybraných gp120 proteinů byla provedena

pomocí tří lektinů s rozdílnou karbohydrátovou specifitou: AAL, GNL a PHA-L lektinu.

Lektiny nesou biotynylovou značku, díky čemuž mohou být detekovány pomocí

streptavidinu konjugovaného s fykoerytrinem.

Charakterizace lektinů:

Galanthus nivalis lectin (GNL) (2 mg/ml) (Vector)

- jedná se o tetramerní aglutinin, vykazující afinitu vůči (α-1,3) D-manóze. Relativní

molekulová hmotnost tohoto tetramerního glykoproteinu je 50 kDa (Hester a kol.,

1995).

37

Aleuria aurantia lectin (AAL) (2 mg/ml) (Vector)

jedná se o dimerní lektin, tvořený ze dvou identických podjednotek. Každá

podjednotka má velikost asi 36 kDa. AAL vytváří vazbu s fukózou, připojenou

(α-1,6) na N-acetylglukosamin nebo s fukózou připojenou (α -1,3) na struktury

podobné N-acetyllactosaminu.

Phaseolus vulgaris leucoagglutin (PHA-L) (2 mg/ml) (Vector)

- PHA-L je tetramerní fytohematoglutin o velikosti 126 kDa. Díky schopnosti

aglutinovat leukocyty a indukovat mitogenní aktivitu T-lymfocytů dostal své

označení L. Vykazuje afinitu vůči terminálním reziduúm manózy, galaktózy

a N-acetylglukosaminu komplexních glykanů savčích glykoproteinů (Liener a kol.,

1986).

4.1.3 OSTATNÍ BIOLOGICKÝ MATERIÁL

- Monoklonální protilátka pentaHis (Quiagen)

- Monoklonální protilátka Mouse anti-V5 – TAG FITC (AbD Serotec)

- Streptavidin – PE (eBioscience)

- N-Glycanase (Peptide N-Glycosidase F; PNGasaF)* (Prozyme)

______________________________________________________________________

* Společně s enzymem byl dodán také 5 x Tris N-glycanase reakční pufr

38

4.2 ROZTOKY A CHEMIKÁLIE

- Blokační pufr (4% FBS v 1x PBS)**

- PBS, Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 1x (Invitrogen)

- Konjugační pufr (BD Biosciences (BDTM

CBA))

- Uskladňovací pufr (BD Biosciences (BDTM

CBA))

- Sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]cyklohexan-1-karboxylát

(Sulfo-SMCC) (Thermo Scientific)

- N-Ethylmaleimid (NEM) (Thermo Scientific)

- Deionizovaná voda (dH2O)

- Dimethylsulfoxid (DMSO) (Sigma-Aldrich)

- Dithiothreitol (DTT) (Duchefa)

______________________________________________________________________

** Příprava blokačního pufru:

- Ke 2 ml fetálního bovinnního séra (FBS) přidat 48 ml 1 x PBS. Roztok přefiltrovat

a skladovat při 4 ºC.

4.3 MIKROSFÉRY

K analýze reaktivity lektinů s rekombinantním gp120 proteinem, byly použity

polystyrenové mikrosféry (BDTM

CBA Functional Bead A6) značené dvěma

fluorochromy: APC a APC-Cy7. Na trhu jsou mikrosféry k dostání v různých velikostech,

a to s negativně nabitými sulfoskupinami nebo pozitivně nabitými aminoskupinami, které

jsou lokalizovány na jejich povrchu. Pro účely mé diplomové práce byly vybrány

mikrosféry s navázanými sulfoskupinami.

Za účelem vazby proteinu na povrch mikropartikulí je nutné zredukovat sulfoskupiny

(S-S) na povrchu mikrosfér, pomocí redukčního činidla dithiothreitolu (DTT). Konjugace

proteinu na mikrosféry je umožněna pomocí heterobifunkčního kross-linkeru

sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]cyklohexan-1-karboxylátu (sulfo-SMCC), který

kovalentně konjuguje molekulu proteinu obsahující volnou aminoskupinu

se sulfhydrylovou skupinou mikropartikule. Aby v dalších krocích nedocházelo

k nespecifickým vazbám jiných proteinů na povrch mikropartikulí, musí být nezreagované

sulfhydrylové skupiny mikrosfér zablokovány pomocí N-ethylmaleimidu (NEM). NEM je

39

alkylační činidlo, které reaguje se sulfhydrylovými skupinami za vzniku stabilních

thioeterických vazeb. Takto připravené mikrosféry je možné dále využívat k testování

reaktivity požadovaných molekul. Schéma přípravy mikrosfér s konjugovaným proteinem

je zobrazeno na obrázku č. 6.

Obrázek č. 6: Schéma přípravy mikrosfér s konjugovaným proteinem. (Upraveno dle BD

manual)

4.4 LABORATORNÍ PŘÍSTROJE A VYBAVENÍ

Analytické váhy (Metter AE 240)

Bio-Spin 30 Tris kolona (BioRad)

Flow box (LC 212)

Malá stolní centrifuga (Mikro 22R)

Mikropipeta 0,5 μl – 10 μl (Labsystems)

Mikropipeta 5 μl – 40 μl (Labsystems)

Mikropipeta 20 μl – 200 μl (Labsystems)

Mikropipeta 100 μl – 1000 μl (Eppendorf)

Průtokový cytometr (BD FACS Canto II)

Sonikační lázeň (Transsonic T460)

Termostat (BT 120M LabMet)

Třepačka (bioSan)

Velká laboratorní centrifuga (CR 322)

Vortex (IKA® MS3 basic)

40

4.5 PŘÍPRAVA MIKROPARTIKULÍ S KONJUGOVANÝM REKOMBINANTNÍM gp120 PROTEINEM NAVÁZANÝM PŘES pentaHIS PROTILÁTKU (1000 μl SUSPENZE)

4.5.1 PŘÍPRAVA MIKROSFÉR

1. 150 μl roztoku zvortexovaných, fluorescenčně značených mikrosfér bylo přeneseno

do mikrocentrifugační zkumavky o objemu 1,5 ml. Zkumavka byla z důvodu

ochrany mikrosfér před světlem zabalena do alobalu.

2. Zkumavka s mikrosférami byla ponořena do sonikační lázně po dobu 1 min.

3. K mikrosférám bylo přidáno 3,8 μl 1M DTT. Následovala inkubace na třepačce

(1h, 200 otáček/min, tma).

4. K mikrosférám byl přidán 1ml konjugačního pufru.

5. Roztok byl zcentrifugován (3 min při 900 x g). Po centrifugaci byl odstraněn

supernatant.

6. Kroky 5 a 6 byly 3x zopakovány.

7. Mikrosféry byly resuspendovány v 40 μl konjugačního pufru.

4.5.2 MODIFIKACE pentaHIS PROTILÁTKY

Ke 180μl pentaHIS protilátky (1 mg/ml) byly přidány 4 μl čerstvě připraveného

roztoku sulfo-SMCC (2 mg rozpustit v 1 ml dH2O). Roztok byl inkubován na třepačce

(200 otáček/min) po dobu 1h.

4.5.3 VÝMĚNA PUFRU PRO ODSTRANĚNÍ NEZREAGOVANÝCH KOMPONENT

1. Bio-Rad Spin kolona byla 3x promyta konjugačnim pufrem.

2. Kolona byla přenesena do zkumavky a centrifugována po dobu 2 min při 1000 x g.

Tímto krokem byl z kolony odstraněn veškerý zbylý konjugační pufr.

3. Kolona byla přenesena do nové zkumavky. Na kolonu byl nanesen roztok obsahující

modifikovanou pentaHIS protilátku. Kolona byla centrifugována po dobu 2 min 15

s při 1000 x g. Tímto krokem byl přenesen modifikovaný protein do zkumavky.

41

4.5.4 VAZBA pentaHIS PROTILÁTKY NA MIKROPARTIKULE

1. PentaHIS protilátka byla přenesena do mikrocentrifugační zkumavky obsahující

připravené funkční mikrosféry. Roztok byl inkubován na třepačce

(1h, 200 otáček/min, tma).

2. Do mikrozkumavky obsahující funkční částice s konjugovanou pentaHIS

protilátkou bylo přidáno 4 μl NEM (2 mg NEM rozpustit v 1 ml DMSO). Suspenze

byla inkubována na třepačce (15 min, 200 otáček/min, tma).

3. K roztoku byl přidán 1 ml uskladňovacího pufru.

4. Roztok byl centrifugován 3 min při 900 x g. Po centrifugaci byl odstraněn

supernatant.

5. Kroky 8 a 9 byly 3x zopakovány.

4.5.5 NAVÁZÁNÍ REKOMBINANTNÍHO gp120 PROTEINU NA MIKROSFÉRY AKTIVOVANÉ pentaHIS PROTILÁTKOU

1. Pelet obsahující mikrosféry s konjugovanou pentaHIS protilátkou byl

resuspendován v 1 ml blokačního roztoku (4% FBS v 1x PBS). Blokace mikrosfér

probíhala ve tmě po dobu 1h. Blokace slouží k zabránění nespecifického vázání

gp120 na povrch mikrosfér.

2. Po hodinové blokaci byl roztok centrifugován 5 min při 1000 x g. Supernatant byl

odstraněn.

3. K peletu bylo přidáno 180 μl gp120 proteinu (1 mg/ml). Po vortexování následovala

inkubace na třepačce (1,5h, 200 otáček/min, tma).

4. Po inkubaci byl k roztoku přidán 1 ml uskladňovacího pufru. Roztok byl

centrifugován 5 min při 1000 x g. Po centrifugaci byl odstraněn supernatant.

5. Pelet byl resuspendován v 1 ml uskladňovacího pufru (koncentrace mikrosfér

odpovídá 6 x 106 mikrosfér v 1 ml). Takto připravené mikrosféry byly skladovány

ve tmě při 4 ºC a byly dále používány pro další práci.

42

4.6 OPTIMALIZACE ŘEDĚNÍ LEKTINŮ A CHARAKTERIZACE JEJICH REAKTIVITY S gp120 PROTEINEM

Po přípravě mikrosfér s navázaným gp120 proteinem (293T, RD) bylo testováno

optimální ředění sady vybraných lektinů (AAL, GNL a PHA-L). Lektiny byly před

použitím 100 x naředěny v PBS na koncentraci 0,02 mg/ml. Reaktivita lektinů

s rekombinantním gp120 proteinem (293T, RD) byla testována v následujících

ředěních: AAL – 5 000 x, 10 000 x, 20 000 x, 40 000 x, 60 000 x a 80 000 x;

GNL – 50 000 x, 80 000 x, 100 000 x; PHA-L – 200 x, 300 x, 400 x, 500 x, 1000 x,

2000 x, 4000 x.

Reakční směs o objemu 500 μl, obsahující blokační pufr (4% FBS v 1x PBS),

mikrosféry s konjugovaným gp120 (293T, RD) a lektin (AAL, GNL nebo PHA-L) byla

inkubována ve tmě na třepačce (200 otáček) po dobu 1,5h. Reakční směs byla následně

zcentrifugována (6 min, 1000 g). Po odsátí 400 μl supernatantu bylo zbylých 100 μl

reakční směsi vortexováno a rozděleno po 50 μl do dvou zkumavek. Jedna zkumavka

prezentuje negativní kontrolu 1 (NK1), do druhé bylo přidáno 2 μl detektoru

(streptavidin – PE (0,2 mg/ml)).

Kromě NK1 byla připravena také negativní kontrola 2 (NK2). NK2 byla připravena

následujícím způsobem: do 47,5 μl blokačního pufru bylo přidáno 2,5 μl připravených

mikrosfér s konjugovaným gp120 proteinem a 2 μl detektoru (streptavidin-PE).

NK2 neosahuje lektin.

43

Do všech zkumavek bylo následně napipetováno 0,5 μl anti-V5 protilátky značené

fluorochromem FITC (fluorescein isothiokyanát), 10 x naředěné v PBS.

Anti-V5 – FITC ověřuje vazbu gp120 na pentaHIS protilátku, konjugovanou

na mikrosféry. Reakční směs byla inkubována ve tmě na třepačce (160 otáček) po dobu

1h. Po inkubaci byl do zkumavek přidán 1 ml PBS. Po centrifugaci (6 min, 1000g) byl

odstraněn supernatant a pelet byl resuspendován ve 150 μl PBS. Reaktivita lektinů byla

prověřována pomocí průtokového cytometru. Složení vlastního vzorku, NK1 a NK2 je

graficky znázorněno v tabulce II.

Tabulka II: Grafické znázornění komponent jednotlivých vzorků

NK1 NK2 Vlastní vzorek

44

Optimální ředění lektinů bylo stanoveno na základě nejvyšší dosažené reaktivity

s rekombinantním gp120 proteinem (293T, RD). Rozpis množství konkrétních reagencií

u optimalizovaných ředění je zaznamenán v tabulce.

Tabulka III: Složení reakční směsi obsahující optimalizované ředění lektinů

Gp120 Lektin

[0,02 mg/ml ]

Ředění Reagencie Množství

[μl]

293T

GNL

80 000 x

Mikrosféry 5,0

Lektin 0,6

4% FBS v 1x PBS 494,4

AAL

10 000 x

Mikrosféry 5

Lektin 5

4% FBS v 1x PBS 490

PHA-L

2 000 x

Mikrosféry 5

Lektin 25

4% FBS v 1x PBS 470

RD

GNL

80 000 x

Mikrosféry 5

Lektin 0,6

4% FBS v 1x PBS 494,4

AAL

10 000 x

Mikrosféry 5

Lektin 5

4% FBS v 1x PBS 490

PHA-L

300 x

Mikrosféry 5

Lektin 167

4% FBS v 1x PBS 328

45

4.7 DEGLYKOSYLACE gp120 PROTEINU VÁZANÉHO

NA MIKROSFÉRY POMOCÍ PNGasy F

Mikrosféry s konjugovaným gp120 proteinem (293T, RD) byly 5 x promyty v 1x PBS.

Tento krok slouží k odstranění azidu sodného, jež je součástí uskladňovacího pufru.

K mikrosférám s gp120 byl přidán 5x Tris reakční pufr, destilovaná voda

a enzym peptid N-glykosidasa F (PNGasa F), jejíž aktivitou dochází k odstranění

N-glykanů. Jako kontrola sloužily vzorky, do nichž enzym přidán nebyl. Reakční směs

byla inkubována v termostatu (37 ºC) po dobu 36 h. Přesný rozpis množství jednotlivých

reagencií je uveden v tabulce IV.

Tabulka IV: Složení reakční směsi u vlastního (deglykosylovaného) vzorku a kontroly

Bez enzymu

(kontrola)

S enzymem

(vlastní vzorek)

Mikrosféry 5 μl 5 μl

Destilovaná voda 19 μl 17 μl

5 x Tris pufr 6 μl 6 μl

PNGasa F ---- 2 μl

Celkový objem 30 μl (1 test) 30 μl (1 test)

Po inkubaci byl roztok s mikrosférami 5 x promyt, aby došlo k odstranění enzymu.

Následně byla testována reaktivita jednotlivých lektinů o optimalizovaném ředění (dle

modifikovaného postupu viz. 4.6). Modifikace spočívá ve vynechání přípravy NK1 a NK2.

Po zcentrifugování 500 μl reakční směsi bylo odpipetováno 450 μl. Do zbylých 50 μl bylo

přidáno 0,5 μl anti-V5-FITC protilátky a 2 μl streptavidinu – PE.

46

5 VÝSLEDKY

Součástí analýzy cukerné komponenty rekombinantního gp120 proteinu pomocí sady

vybraných lektinů byly dva experimenty. Cílem prvního experimentu, bylo nalezení ředění

lektinů (AAL, GNL, PHA-L) poskytující optimální reaktivitu s rekombinantním gp120

proteinem (293T a RD). Druhý experiment byl zaměřen na analýzu reaktivity

optimalizované koncentrace lektinu (AAL, GNL, PHA-L) s gp120 proteinem (293T, RD)

po ošetření enzymem PNGasou F.

Vazba lektinů (AAL, GNL a PHA-L) na rekombinantní gp120 protein (293T, RD) byla

ověřována pomocí streptavidinu značeného fykoerytrinem. Detekce lektinů pomocí

streptavidinu je možná díky přítomnosti biotynylové značky, která je součástí komerčně

dodávaných lektinů, používaných v této diplomové práci. Jako negativní kontroly byly

použity vzorky NK1 a NK2, které určovaly hladinu pozadí. Na základě srovnání

s negativními kontrolami byly v rámci histogramu stanoveny oblasti pozitivní reaktivity:

G1 (gate 1) - vymezuje populaci mikrosfér s navázaným lektinem, který je detekován

pomocí streptavidinu; G2 (gate 2) - vymezuje populaci mikrosfér s konjugovaným gp120

proteinem, který je detekován pomocí anti-V5-TAG – FITC Ig detektoru.

Reaktivita lektinů byla vypočítána jako rozdíl hodnoty získané měřením vlastního

vzorku (% událostí v G1) a nejvyšší hodnoty pozadí (% událostí v G1), získané v rámci

jednoho experimentu. Změna reaktivity lektinů s rekombinantním gp120 proteinem (293T,

RD) po deglykosylaci byla vztahována ke kontrolnímu vzorku, který deglykosylaci

podroben nebyl. Hodnotě kontrolního vzorku bylo ve vztahu ke vzorku podrobenému

deglykosylaci přisouzeno 100 %.

47

Vazba rekombinantního gp120 proteinu (293T, RD) na pentaHIS protilátku, která je

konjugována na mikropartikule, byla při každé průtokově-cytometrické analýze ověřena

pomocí mouse anti-V5-TAG Ig detektoru značeného fluorescein isothiokyanátem (FITC).

Příklad výstupu z průtokového cytometru je uveden na obrázku č. 7 a 8. Populace

mikrosfér, u níž došlo k navázání mouse anti-V5-TAG – FITC Ig detektoru

na rekombinantní gp120 protein, je lokalizována v rámci gate 2 (G2). Jednotlivé výsledky

určující úspěšnost vazby mouse anti-V5-TAG – FITC Ig detektoru na gp120

rekombinantní protein jsou uvedeny v příslušných tabulkách.

Obrázek 7: Mikrosféry před ověřením vazby gp120 pomocí

anti-V5-TAG – FITC Ig detektoru

48

Obrázek č. 8: Ověření vazby gp120 na vaznou pentaHIS protilátku konjugovanou

na mikrosféry pomocí anti-V5-TAG – FITC Ig detektoru

Legenda k tabulkám V, VII a IX:

Vlastní vzorek - mikrosféry s navázaným gp120 po inkubaci s lektinem,

streptavidin-PE a anti-V5-TAG Ig detektorem; NK1 - mikrosféry s navázaným gp120

po inkubaci s mouse anti-V5 – TAG – FITC Ig detektorem a lektinem

(bez streptavidin - PE); NK2 - mikrosféry s navázaným gp120 po inkubaci s mouse

anti-V5 – TAG FITC Ig detektorem a streptavidin-PE (bez lektinu);

G1 (gate 1) - vymezuje populaci mikrosfér s navázaným lektinem, který je detekován

pomocí streptavidinu; G2 (gate 2) - vymezuje populaci mikrosfér s navázaným gp120,

který je detekován anti-V5-TAG – FITC Ig detektorem

Legenda k tabulkám VI, VIII a X:

kontrola – mikrosféry s navázaným gp120 proteinem (293 / RD), který nebyl podroben

deglykosylaci; PNGasa F – mikrosféry s navázaným gp120 proteinem (293T / RD), který

byl po navázání podroben deglykosylaci PNGasouF; G1 (gate 1) - vymezuje populaci

mikrosfér s navázaným lektinem, který je detekován pomocí streptavidinu; G2 (gate 2) -

vymezuje populaci mikrosfér s navázaným gp120, který je detekován anti-V5-TAG –

FITC Ig detektorem

49

5.1 ANALÝZA CUKERNÉ KOMPONENTY gp120 (293T, RD) POMOCÍ LEKTINU ALEURIA AURANTIA (AAL)

5.1.1 ANALÝZA REAKTIVITY AAL S REKOMBINANTNÍM gp120 PROTEINEM (293T, RD)

Reaktivita lektinu AAL s rekombinantním gp120 proteinem (293T, RD) byla testována

v následujících ředěních AAL lektinu: 5 000 x, 10 000 x, 20 000 x, 40 000 x, 60 000 x

a 80 000 x. Ředění AAL lektinu, při němž bylo dosaženo nejlepších výsledků bylo ředění

10 000 x. Výsledky průtokově-cytometrické analýzy jsou zaznamenány v tabulce V.

Výstupy z průtokového cytometru jsou uvedeny na obrázku č. 9.

Procentuální zastoupení mikrosfér v gate 2 (G2) se pohybovalo od 99,3 % do 99,9 %.

Získané výsledky potvrzují, že došlo k navázání rekombinantního gp120 proteinu (293T,

RD) na pentaHIS protilátku konjugovanou na mikrosféry. Reaktivita AAL s gp120 byla

stanovena jako rozdíl procentuálního zastoupení mikrosfér v gate 1 (G1) u vlastního

vzorku a nejvyšší hodnoty pozadí, které prezentují negativní kontroly. Při ředění

poskytujícím nejlepší výsledky (ředění 10 000 x) byla reaktivita AAL s 293T 83,3 %

a s RD 84,6 %.

Tabulka V: Stanovení reaktivity lektinu Aleuria aurantia (AAL) s rekombinantním gp120

proteinem (293T, RD)

Lektin Rekombinantní

gp120

Typy vzorků Vazba

streptavidin – PE

(% událostí v G1)

Vazba mouse anti-

V5-TAG – FITC

(% událostí v G2)

AAL

293T

NK1 0,4 99,3

NK2 0,1 99,7

Vlastní vzorek 83,7 99,6

RD

NK1 0,6 99,8

NK2 0,1 99,9


50

Obrázek 9: Průtokově-cytometrická analýza reaktivity lektinu Aleuria aurantia (AAL)

s rekombinantním gp120 proteinem (293T a RD)

51

5.1.2 ANALÝZA REAKTIVITY AAL S REKOMBINANTNÍM gp120 PROTEINEM (293T, RD) PO ENZYMATICKÉM OŠETŘENÍ PNGasou F

Po nalezení optimálního ředění AAL lektinu byly mikrosféry s navázaným gp120

proteinem (293T, RD) podrobeny deglykosylaci. Výsledky průtokově-cytometrické

analýzy jsou zaznamenány v tabulce VI. Výstupy z průtokového cytometru jsou uvedeny

na obrázku č. 10 a 11.


Získané výsledky potvrzují, že došlo k navázání gp120 proteinu (293T, RD) na pentaHIS

protilátku konjugovanou na mikrosféry a že během inkubace nedošlo k jeho ztrátám.

Reaktivita AAL s rekombinantním gp120 proteinem byla stanovena na základě

procentuálního zastoupení mikrosfér v gate 1 (G1).

Reaktivita AAL s 293T, který nebyl podroben deglykosylaci (kontrola), byla 98,1 %.

Reaktivita AAL s 293T, který byl ošetřen PNGasou F, byla 52,9 %. Pokud bereme

reaktivitu kontroly ve vztahu k reaktivitě vzorku podrobenému deglykosylaci jako 100%,

došlo po ošetření vzorku PNGasou F k poklesu reaktivity AAL s 293T o 46,1 %.

Reaktivita AAL s RD, který nebyl podroben deglykosylaci (kontrola), byla 81,6 %.

Reaktivita AAL s RD, který byl ošetřen PNGasou F, byla 0,5 %. Po enzymatickém

ošetření gp120 exprimovaného buněčnou linií RD PNGasouF došlo ve vztahu ke kontrole

k poklesu reaktivity AAL s RD o 81,0 %.

Tabulka VI: Stanovení reaktivity lektinu Aleuria aurantia (AAL) s rekombinantním gp120

proteinem (293T, RD) po deglykosylaci


gp120

Typy vzorků Vazba

streptavidin – PE

(% událostí v G1)

Vazba mouse anti-

V5-TAG – FITC

(% událostí v G2)

AAL

293T

Kontrola 98,1 96,9

PNGasa F 52,9 99,6

RD

Kontrola 81,6 99,0

PNGasa F 0,5 99,2

52

Obrázek 10: Analýza reaktivity lektinu AAL s rekombinantním gp120 proteinem (293T,

RD) u kontrolních vzorků

Obrázek 11: Analýza reaktivity lektinu AAL s rekombinantním gp120 proteinem (293T,

RD) po ošetření enzymem PNGasouF

53

5.2 ANALÝZA CUKERNÉ KOMPONENTY gp120 (293T, RD) POMOCÍ LEKTINU GALANTHUS NIVALIS (GNL)

5.2.1 ANALÝZA REAKTIVITY GNL S REKOMBINANTNÍM gp120 PROTEINEM (293T, RD)

Reaktivita lektinu GNL s rekombinantním gp120 proteinem (293T, RD) byla testována

v ředěních 50 000 x, 80 000 x a 100 000 x. Ředění GNL lektinu, při němž bylo dosaženo

nejlepších výsledků, bylo ředění 80 000 x u obou proteinů (293T, RD). Výsledky

průtokově-cytometrické analýzy jsou zaznamenány v tabulce VII. Výstupy z průtokového

cytometru jsou uvedeny na obrázku č. 12.

Procentuální zastoupení mikrosfér v gate 2 (G2) se pohybovalo od 99,1 % do 100 %.

Naměřené hodnoty potvrzují, že došlo k navázání rekombinantního gp120 proteinu (293T,

RD) na pentaHIS protilátku konjugovanou na mikrosféry.

Při ředění poskytujícím nejlepší výsledky (ředění 80 000 x) byla reaktivita GNL

s 293T 98,7 % a s RD 97,3 %. Reaktivita byla vypočítána jako rozdíl hodnoty získané

měřením vlastního vzorku (% událostí v G1) a nejvyšší hodnoty pozadí (% událostí v G1),

získané v rámci jednoho experimentu.

Tabulka VII: Stanovení reaktivity lektinu Galanthus nivalis (GNL) s rekombinantním

gp120 proteinem (293T, RD)


gp120

Typy vzorků Vazba

streptavidin – PE

(% událostí v G1)

Vazba mouse anti-

V5-TAG – FITC

(% událostí v G2)

GNL

293T

NK1 0,6 99,6

NK2 0,1 99,6


RD

NK1 0,1 99,1

NK2 0,1 99,1


54

Obrázek 12: Průtokově cytometrická analýza reaktivity lektinu Galanthus nivalis (GNL)

s rekombinantním gp120 proteinem (293T a RD)

55

5.2.2 ANALÝZA REAKTIVITY GNL S REKOMBINANTNÍM gp120 PROTEINEM (293T, RD) PO ENZYMATICKÉM OŠETŘENÍ PNGasou F

Po nalezení optimálního ředění GNL lektinu byly mikrosféry s navázaným gp120

proteinem (293T, RD) podrobeny deglykosylaci. Výsledky průtokově cytometrické

analýzy jsou zaznamenány v tabulce VIII. Výstupy z průtokového cytometru jsou uvedeny

v obrázku č. 13 a 14.


Získané výsledky potvrzují, že došlo k navázání rekombinantního gp120 proteinu (293T,

RD) na pentaHIS protilátku konjugovanou na mikrosféry a že během inkubace nedošlo

k jeho ztrátám. Reaktivita GNL na gp120 byla stanovena na základě procentuálního

zastoupení mikrosfér v gate 1 (G1). Změna reaktivity GNL s rekombinantním gp120

proteinem (293T, RD) po deglykosylaci byla stanovena ve vztahu ke kontrolnímu vzorku,

jehož naměřené hodnotě bylo přiřazeno 100 %.

Reaktivita GNL s 293T, který nebyl podroben deglykosylaci (kontrola), byla 98,4 %.

Reaktivita GNL s 293T, který byl ošetřen PNGasouF, byla 61,1 %. Pokles reaktivity GNL

s glykosylovaným 293T a deglykosylovaným 293T byl 36,3 %.

Reaktivita GNL s RD, který nebyl podroben deglykosylaci (kontrola), byla 97,9 %.

Reaktivita GNL s RD, který byl ošetřen PNGasouF, byla 49,5 %. Pokles v reaktivitě GNL

s kontrolou a vzorkem podrobeným deglykosylaci činí 47,4 %.

Tabulka VIII: Stanovení reaktivity lektinu Galanthus nivalis (GNL) s rekombinantním

gp120 proteinem (293T, RD) po deglykosylaci


gp120

Typy vzorků Vazba

streptavidin – PE

(% událostí v G1)

Vazba mouse anti-

V5-TAG – FITC

(% událostí v G2)

GNL

293T

kontrola 98,4 98,2

PNGasa F 61,1 94,9

RD

kontrola 97,9 98,7

PNGasa F 49,5 97,1

56

Obrázek 13: Analýza reaktivity lektinu GNL s rekombinantním gp120 proteinem (293T,

RD) u kontrolních vzorků

Obrázek 14: Analýza reaktivity lektinu GNL s rekombinantním gp120 proteinem (293T,

RD) po ošetření PNGasouF

57

5.3 ANALÝZA CUKERNÉ KOMPONENTY gp120 (293T, RD) POMOCÍ LEUKOAGLUTININU Z PHASEOLUS VULGARIS (PHA-L)

5.3.1 ANALÝZA REAKTIVITY PHA-L S REKOMBINANTNÍM gp120 PROTEINEM (293T, RD)

Reaktivita lektinu PHA-L s rekombinantním gp120 proteinem (293T, RD) byla

testována v ředěních 200 x, 300 x, 400 x, 500 x, 1000 x, 2000 x a 4000 x. Ředění PHA-L

lektinu, při němž bylo dosaženo nejlepších výsledků bylo ředění 300 x u proteinu RD

a 2000 x u proteinu 293T. Optimální ředění lektinu PHA-L se tedy pro jednotlivé proteiny

(293T, RD) výrazně lišilo. Výsledky průtokově-cytometrické analýzy jsou zaznamenány

v tabulce IX. Výstupy z průtokového cytometru jsou uvedeny na obrázku č. 15.


Získané údaje potvrzují, že došlo k navázání rekombinantního gp120 proteinu (293T, RD)

na pentaHIS protilátku konjugovanou na mikrosféry. Reaktivita PHA-L byla vypočítána

jako rozdíl hodnoty získané měřením vlastního vzorku (% událostí v G1) a nejvyšší

hodnoty pozadí (% událostí v G1), získané v rámci jednoho experimentu. Reaktivita

lektinu PHA-L s 293T při ředění 2000 x byla 84,7 %. Reaktivita PHA-L s RD při ředění

300 x byla 79,2 %.

Tabulka IX: Stanovení reaktivity lektinu Phaseolus vulgaris leucoagglutin (PHA-L)

s rekombinantním gp120 proteinem (293T, RD)


Gp120

Typy vzorku Vazba

streptavidin – PE

(% událostí v G1)

Vazba mouse anti-

V5-TAG – FITC

(% událostí v G2)

PHA – L

293T

NK1 0,0 99,8

NK2 0,1 99,6


RD

NK1 0,2 99,7

NK2 0,0 99,6


58

Obrázek 15: Průtokově-cytometrická analýza reaktivity lektinu Phaseolus vulgaris

(PHA-L) s rekombinantním gp120 proteinem (293T, RD)

59

5.3.2 ANALÝZA REAKTIVITY PHA-L S REKOMBINANTNÍM gp120 PROTEINEM (293T, RD) PO ENZYMATICKÉM OŠETŘENÍ PNGasou F

Po nalezení optimálního ředění PHA-L lektinu byly mikrosféry s navázaným gp120

proteinem (293T, RD) podrobeny deglykosylaci. Výsledky průtokově cytometrické

analýzy jsou zaznamenány v tabulce X. Výstupy z průtokového cytometru jsou uvedeny

v obrázku č. 16 a 17.

Naměřené hodnoty procentuálního zastoupení mikrosfér v gate 2 (G2) se pohybovaly

od 88,5 % do 99,6 %. Naměřené hodnoty potvrzují, že došlo k navázání rekombinantního

gp120 proteinu (293T, RD) na pentaHIS protilátku konjugovanou na mikrosféry

a že během inkubace nedošlo k jeho výrazným ztrátám.

Reaktivita PHA-L s gp120 byla stanovena na základě procentuálního zastoupení

mikrosfér v gate 1 (G1). Změna reaktivity PHA-L s rekombinantním gp120 proteinem

(293T, RD) po deglykosylaci byla stanovena ve vztahu ke kontrolnímu vzorku, jehož

naměřená hodnota odpovídala 100 %. Reaktivita PHA-L s 293T, který nebyl podroben

deglykosylaci (kontrola), byla 96,9 %. Reaktivita PHA-L s 293T, který byl ošetřen

PNGasouF, byla 0,3 %. Rozdíl reaktivit PHA-L u kontroly a vzorku, který byl podroben

deglykosylaci, činí 96,6 %.

Reaktivita PHA-L s RD, který nebyl podroben deglykosylaci (kontrola), byla 85,8 %.

Reaktivita PHA-L s RD, který byl ošetřen PNGasouF, byla 3,6 %. Pokud bereme kontrolu

ve vztahu ke vzorku podrobenému deglykosylaci jako 100 %, došlo po ošetření vzorku

PNGasou F k poklesu reaktivity PHA-L o 81,6 %.

Tabulka X: Stanovení reaktivity lektinu Phaseolus vulgaris (PHA-L) s rekombinantním

gp120 proteinem (293T, RD) po deglykosylaci


gp120

Typy vzorků Vazba

streptavidin – PE

(% událostí v G1)

Vazba mouse anti-

V5-TAG – FITC

(% událostí v G2)

PHA-L

293T

Kontrola 96,9 99,6

PNGasa F 0,3 99,9

RD

Kontrola 85,8 93,8

PNGasa F 3,6 88,5

60

Obrázek č. 16: Analýza reaktivity lektinu PHA-L s rekombinantním gp120 proteinem

(293T, RD) u kontrolních vzorků

Obrázek č. 17: Analýza reaktivity lektinu GNL s rekombinantním gp120 proteinem (293T,

RD) po ošetření PNGasou F

61

6 DISKUZE

Cílem této diplomové práce byla optimalizace analytické metody, umožňující studium

proteinu gp120 za nativních podmínek. Analýza protein metodou průtokové cytometrie

pomocí fluorescenčně značených mikropartikulí poskytuje několik výhod. Mikrosféry

disponují velkým vazebným povrchem, díky čemuž dochází k omezení sterického bránění

mezi navázanými proteiny. Fluorescenčně značené mikropartikule umožňují taktéž

současné měření několika odlišných parametrů, a to pomocí proteinů nesoucích různou

fluorescenční značku, tzv. multiplexní analýzu. V neposlední řadě lze mikrosféry využít ke

studiu cukerných komponent glykoproteinů – deglykosylačním studiím. Díky možnosti

centrifugace vzorků v jakémkoliv stádiu experimentu je možné používat velmi malé

objemy jednotlivých reagencií. Jelikož inkubační podmínky ani enzymatické působení

nezpůsobují degradaci mikrosfér, ani ztrátu analyzovaných proteinů, lze analyzované

glykoproteiny navázat na povrch mikrosfér před samotným enzymatickým ošetřením. To

je pro vyhodnocení efektu deglykosylace klíčové. Na rozdíl od metody ELISA (Enzyme-

Linked ImmunoSorbent Assay) tak nedochází ke změně množství enzymaticky ošetřeného

antigenu, který je předmětem analýzy.

Využití fluorescenčně značených mikrosfér tedy nachází mnohá použití a nabízí oproti

dnes konvenčně používaným metodám mnoho výhod. Hlavní nevýhodu fluorescenčně

značených mikropartikulí představuje jejich pořizovací cena, která omezuje jejich použití

v klinické praxi.

V rámci této diplomové práce byly analyzovány cukerné komponenty rekombinantního

gp120 proteinu, exprimovaného savčí buněčnou linií 293T (buněčná linie lidských

embryonálních ledvin) a RD (buněčná linie rhabdomyosarkomu) metodou průtokové

cytometrie pomocí tří vybraných lektinů s rozdílnou karbohydrátovou specifitou: Aleuria

aurantia lektinu (AAL) s afinitou k fukóze, připojené (α-1,6) na N-acetylglukosamin nebo

(α -1,3) na struktury podobné N-acetyllactosaminu (Yamashita a kol., 1985), Galanthus

nivalis lektinu (GNL) se specifitou vůči (α-1,3) D-manóze (Hester a kol., 1995)

a Phaseolus vulgaris leukoaglutininu (PHA – L), který se specificky váže na terminální

rezidua manózy, galaktózy a N-acetylglukosaminu komplexních glykanů savčích

glykoproteinů (Liener a kol., 1986).

V rámci prvního experimentu byla testována reaktivita jednotlivých lektinů

s rekombinantním gp120 proteinem (293T, RD). Jako optimální ředění lektinů, při němž

62

bylo dosaženo nejvyšší reaktivity s gp120 proteinem (293T, RD), bylo vytestováno ředění

10 000 x pro AAL a 80 000 x pro GNL. Lektiny AAL i GNL reagovaly při jmenovaných

ředěních přibližně stejně s oběma rekombinantními gp120 proteiny – 293T a RD. Množství

navázaného gp120 proteinu bylo vždy normalizovánu reakcí gp120 navázaného

na mikrosféry s V5 specifickou protilátkou. Reakce s V5 byla použita jako kontrolní

a může bsloužit k normalizaci navázaného proteinu v případě testování velkého množství

variant gp120. Reaktivita AAL s 293T odpovídala 83,3 % a 84,6 % s RD. Nejvyšší

reaktivity s rekombinantím gp120 proteinem (293T, RD), bylo ze všech testovaných

lektinů dosaženo u lektinu GNL, a to 98,7 % s 293T a 97,3 % s RD. Vysoká reaktivita

GNL při nízkých koncentracích lektinu s gp120 proteinem koresponduje s výsledky

výzkumu Yee a kol., (2011), v němž byla prokázána schopnost GNL inhibovat Env

zprostředkovanou buněčnou fúzi při relativně nízkých koncentracích lektinu. Reaktivita

GNL byla též ověřována ve studii Akashi a kol., (1998), v níž byla vyhodnocena reaktivita

GNL imobilizovaného na nanočástice (0,5 mg/ml) s gp120 proteinem, a to na 82 %.

U lektinu PHA-L byla rovněž stanovena optimální ředění pro vazbu lektinu na gp120

produkovaný buněčnou linií 293T a RD. Hodnoty optimální koncentrace se lišily. Nejvyšší

reaktivity s 293T bylo u PHA-L dosaženo při ředění 2000 x, a to 84,7 %. Nejlepší

výsledky při reakci s RD byly získány u PHA-L při ředění 300 x, tzn. při 10 x nižším

ředění než u 293T, a to 79,2 %. Z výsledků lze vyvodit, že rekombinantní gp120 protein

exprimovaný buněčnou linií RD obsahuje nižší počet triantenárních/tetraantenárních

komplexních N-glykanů, než gp120 produkovaný linií 293T. Získané výsledky

korespondují s výsledky výzkumu Raška a kol., (2010), v němž byla analyzována cukerná

komponenta gp120 pomocí metody Western blott s využitím lektinů. Studie prokázala,

že gp120 produkovaný savčí buněčnou linií RD nese méně komplexních/hybridních

glykanů ve srovnání s obsahem glykanů s vysokým obsahem manózy. Výsledky získané

metodou Western blott byly následně potvrzeny metodou hmotnostní spektrometrie.

Různorodost glykosylačních profilů rekombinantního gp120, produkovaného různými

buněčnými liniemi (293T a CHO), byla taktéž prověřována metodou hmotnostní

spektrometrie v rámci výzkumu Go a kol., (2013). Výsledky studie prokázaly, že gp120

produkovaný dvěma různými buněčnými liniemi, vykazuje různé glykosylační profily.

Na základě uvedených poznatků lze konstatovat, že glykosylace téhož proteinu je přímo

závislá na buněčném typu, v němž je glykoprotein syntetizován. Různá glykosylace téhož

proteinu hraje důležitou roli na jeho biologické vlastnosti, jako jsou antigenicita

a imunogenicita, které jsou hlavním předmětem výzkumu v rámci vakcinačních studií.

63

Získaná data v rámci této diplomové práce jsou v souladu s výsledky výzkumu Akashi a

kol., (1998), Raška a kol., (2010), Yee a kol., (2011) a jsou ve shodě s očekávanými

výsledky.

V rámci druhého experimentu byla studována reaktivita optimalizovaných ředění

lektinů s rekombinantním gp120 proteinem (293T, RD) po ošetření PNGasou F, která

odštěpuje N-glykany. Reaktivita lektinů (AAL, GNL a PHA-L) s deglykosylovaným gp120

(293T, RD) byla porovnávána s jejich reaktivitou s tzv. kontrolou, tedy vzorkem,

ke kterému nebyla přidána PNGasa F. Naměřená hodnota reaktivity lektinů s kontrolním

vzorkem byla ve vztahu k reaktivitě lektinů se vzorkem ošetřeným PNGasou F počítána

jako 100 %.

U všech testovaných lektinů došlo ke snížení reaktivity s oběma deglykosylovanými

rekombinantními proteiny (293T, RD). Získané výsledky částečně korespondují s výsledky

výzkumné práce Raška a kol., (2010), v níž byl studován vliv deglykosylace

rekombinantních gp120 proteinů (293T, RD, Jurkat, HepG2, Dakiki a CHO) na změnu

reaktivity lektinů (AAL, GNL a PHA-L) pomocí metody Western blott. Po ošetření gp120

enzymem PNGasa F nebyla s gp120 dříve pozorována žádná reaktivita ani jednoho

z testovaných lektinů. V případě této diplomové práce však byla i po deglykosylaci

zaznamenána reaktivita lektinu s deglykosylovaným gp120 u většiny testovaných vzorků.

Pozorovaný fakt je možné vysvětlit podmínkami deglykosylace. V práci Raška a kol.,

(2010) byla deglykosylace provedena na denaturovaném proteinu gp120. Zde byla naopak

volena deglykosylace za nativních podmínek. To je stěžejní pro zachování nativní

konformace gp120, jež je klíčová pro reakci proteinu s faktory imunitního systému,

zejména neutralizačními a vaznými protilátkami.

Reaktivita AAL s deglykosylovaným 293T poklesla o 46,1 %, s deglykosylovaným RD

o 81,0 %. Z výsledku lze usuzovat, že gp120 produkovaný linií 293T nese více

N-vázaných karbohydrátů obsahující rezidua fukózy, které jsou rezistentní vůči PNGase F,

oproti gp120 exprimovanému linií RD.

Naměřená hodnota reaktivity GNL s deglykosylovaným gp120 (293T, RD) nebyla příliš

odlišná. Po enzymatickém ošetření 293T došlo ke snížení reaktivity GNL o 36,3 %.

Pokles reaktivity GNL s deglykosylovaným RD oproti kontrole činí 47,4 %. Z uvedených

výsledků vyplývá, že 293T i RD obsahují velký počet glykanů s vysokým obsahem

manózy rezistentních vůči účinku PNGasy F. Výsledek opět nekoresponduje s výsledky

výzkumu Hong a kol., (2002), v němž byla testována reaktivita GNL s gp120-Fc (gp120

64

z klonu JRCSF) po deglykosylaci enzymem PNGasa F metodou ELISA. ELISA prokázala

stoprocentní pokles reaktivity GNL s deglykosylovaným gp120-Fc. V citované práci však

nebyly podmínky deglykosylace uvedeny a v případě provedení za denaturačních

podmínek není pozorovaný pokles překvapující. V nedávné době bylo publikováno několik

prací, které jasně potvrdily, že nativní a optimálně složený multimerní gp120 a zejména

pak Env na povrchu virionu je poměrně rezistentní k deglykosylaci PNGaseF. Významný

závěr z předložené diplomové práce je, že analýza vlastností rekombinantnícho gp120

pomocí fluorescenčních kuliček je biologicky velmi relevantní postup a rovněž fakt,

že použité rekombinantní gp120 proteiny jsou biologicky do jisté míry velmi podobné Env

proteinu vystavenému na povrchu virionu. Toto tvrzení však vyžaduje další experimentální

dúkazy.

Rozdíl reaktivit PHA-L u kontroly a vzorku, který byl podroben deglykosylaci, činil

96,6 % u 293T a 81,6 % u RD. Z uvedených dat lze usuzovat, že RD i 293T obsahují velmi

málo triantenálních / tetraantenálních komplexních sacharidů, rezistentních k činnosti

PNGasy F.

Výsledky získané v rámci této diplomové práce se mohou lišit od výsledků získaných

metodou ELISA nebo metodou Western blott. Zatímco při metodě ELISA dochází

ke sterickému bránění navázaných proteinů, při metodě Western blott jsou proteiny

analyzovány za denaturujících podmínek. Důvodem odlišných výsledků, získaných

v rámci této diplomové práce, tak mohou být redukce sterického bránění proteinů,

navázaných na povrchu mikrosfér a analýza za nedenaturujících podmínek. Z těchto

důvodů se jeví metoda analýzy proteinů imobilizovaných na fluorescenčně značené částice

jako optimální detekční metoda.

65

7 ZÁVĚR

V rámci této diplomové práce byla analyzována cukerná komponenta rekombinantního

gp120 metodou průtokové cytometrie pomocí fluorescenčně značených mikrosfér. První

experiment byl založen na nalezení optimálního ředění lektinů Aleuria aurania (AAL),

Galanthus nivalis (GNL) a leukoaglutininu z Phaseolus vulgaris (PHA-L), poskytující

vysokou reaktivitu s gp120 rekombinantním proteinem, produkovaným savčí buněčnou

linií 293T a RD. Nejvyšší reaktivita s oběma rekombinantními gp120 proteiny byla

zjištěna u lektinu GNL při ředění 80 000 x, a to 98,7% s 293T a 97,3% s RD.

Druhý experiment byl zaměřen na sledování změny reaktivity lektinů

o optimalizovaném ředění po enzymatickém ošetření rekombinantního gp120 proteinu

(293T, RD) enzymem PNGasa F, který odštěpuje N-vázané glykany. Analýza reaktivity

lektinů s deglykosylovaným gp120 proteinem (293T a RD) prokázala pokles reaktivity

u všech testovaných lektinů. Nejvyšší pokles reaktivity byl zaznamenán u lektinu PHA-L,

a to 96,6 % při inkubaci s 293T a 81,6 % při inkubaci s RD.

66

8 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY Akashi, M., Niikawa, T., Serizawa, S., Hayakawa, T., Baba, M. (1998): Graft copolymers

having hydrophobic backbone and hydrophilic branches part XIV - Capture of HIV-1 gp120

and Virions by Lectin-Immobilized Polystyrene Nanospheres. Bioconjugate Chemistry.

Vol. 9: 50-53. ISSN: 1043-1802. DOI: 10.1021/bc970045y

Al-Harthi, L., Guilbert, L. J., Hoxie, J. A., Landay, A. (2002): Trophoblasts

are productively infected by CD4-independent isolate of HIV type 1. AIDS research

and human retroviruses. Vol. 18: 13 – 17. PMID: 11804552.

DOI:10.1089/088922202753394673

Auwerx, J., François, K. O., Covens, K., Van Laethem, K., Balzarini, J. (2008): Glycan

deletions in the HIV-1 gp120 V1/V2 domain compromise viral infectivity, sensitize

the mutant virus strains to carbohydrate-binding agents and represent a specific target

for therapeutic intervention. Virology. Vol. 382: 10 – 19. ISSN: 0042-6822. DOI: 10.1016/j.virol.2008.09.010

Bednář, M., Fraňková, V., Schindler, J., Souček, A., Vávra, J. (1996): Lékařská mikrobiologie.

Marvil, Praha. ISBN-10: 80-2380-297-6

Borrow, P., Lewicki, H., Wei, X., Horwitz, M. S., Peffer, N., Meyers, H., Nelson, J. A., Gairin,

J. E., Hahn, B. H., Oldstone, M. B. A., Shaw, G. M. (1997): Antiviral pressure exerted by

HIV-1-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs) during primary infection demonstrated by

rapid selection of CTL escape virus. Nature Medicine. Vol. 3: 205-211. ISSN: 1078-8956.

DOI: 10.1038/nm0297-205

Calarese, D. A., Scanlan, C.N., Zwick, M. B., Deechongkit, S., Mimura, Y., Kunert, R., Zhu, P.,

Wormald, M. R., Stanfield, R. L., Roux, K. H., Kelly, J. W., Rudd, P. M., Dwek, R. A., Katinger,

H., Burton, D. R., Wilson, I. A. (2003) Antibody domain exchange is an immunological solution

to carbohydrate cluster recognition. Science. Vol. 300: 2065–2071. ISSN: 0036-8075.

DOI: 10.1126/science.1083182

De Silva, F. S., Venturini, D. S., Wagner, E., Shank, P. R., Sharma, S. (2001): CD4-

independent infection of human B cells with HIV type 1: detection of unintegrated viral DNA.

AIDS Res. Hum. Retroviruses. Vol. 17: 1585 – 1598. ISSN: 0889-2229.

DOI: 10.1089/088922201753341997

De Luca, A., Dunn, D., Zazzi, M., Camacho, R., Torti, C., Fanti, I., Kaiser, R., Sonnerborg, A.,

Codoner, F. M., Van Laethem, K., Vandamme, A. M., Bansi, L., Ghisetti, V., van de Vijver, D. A.

M. C., Asboe, D., Prosperi, M. C. F., Di Giambenedetto, S. (2013): Declining Prevalence of HIV-1

Drug Resistance in Antiretroviral Treatment-exposed Individuals in Western Europe. Journal

of infectious diseases. Vol. 207: 1216-1220. ISSN: 0022-1899. DOI: 10.1093/infdis/jit017

Dybowski JN, Heider D, Hoofman D. (2010): Prediction of co-receptor usage of HIV-1 from

genotype. PLOS Computational Biology. Vol. 6: Article Number: e1000743.

ISSN: 1553-734X. DOI: 10.1371/journal.pcbi.1000743

Eckschlager, T., Bartůňková, J. (1999): Průtoková cytometrie v klinické praxi. Praha, Grada

Publishing. ISBN: 80-7169-279-4

67

Flexner, Ch. (1998): HIV-protease inhibitors. New England Journal

of Medicine. Vol. 338: 1281 – 1292. ISSN: 0028-4793.

DOI: 10.1056/NEJM199804303381808

Givan, A. L. (2004): Flow Cytometry: An Introduction. Edited by Hawley, T. S., Hawley, R.

G. (2004): Flow Cytometry Protocols, Second Edition. Humana Press.

ISSN: 1064-3745. E-ISBN: 1-059259-773-4

Go, E. P., Irungu, J., Zhang, Y., Dalpathado, D. S., Liao, H., Sutherland, L. L., Alam, S. M.,

Haynes, B. F., Desaire, H. (2008): Glycosylation Site-Specific Analysis of HIV Envelope

Proteins (JR-FL and CON-S) Reveals Major Differences in Glycosylation Site Occupancy,

Glycoform Profiles, and Antigenic Epiptopes‘ Accessibility. Journal of Proteome Research.

Vol. 7: 1660 – 1674. PMID: 18330979. DOI: 10.1021/pr7006957

Go, E. P, Liao, H. X., Alam, S. M., Hua, D., Haynes, B. F., Desaire, H. (2013):

Characterization of Host-Cell Line Specific Glycosylation Profiles of Early

Transmitted/Founder HIV-1 gp120 Envelope Proteins. Journal of proteome research.

Vol. 12: 1223-1234. ISSN: 1535-3893. DOI: 10.1021/pr300370

Greene, W. C. (1991): Mechanisms of disease – The molecular biology of human

immunodeficiency virus type 1 infection. New England Journal of Medicine.

Vol. 324: 308-317. ISSN: 0028-4793. DOI: 10.1056/NEJM199101313240506

Grinsztejn, B., Nguyen, B. Y., Katlama, C., Gatell, J. M., Lazzarin, A., Vittecoq, D., Gonzales,

C. J., Chen, J., Harvey, C. M., Isaacs, R. D. (2007): Safety and efficacy of the HIV-1 integrase

inhibitor raltegravir (MK-0518) in treatment-experienced patients with multidrug-resistant

virus: a phase II randomised controlled trial. Lancet. Vol. 369: 1261 – 1269. ISSN: 0140-6736.

DOI: 10.1016/S0140-6736(07)60597-2

Gummuluru, S., Rogel, M., Stamatatos, L., Emerman, M. (2003): Binding of human

immunodeficiency virus type 1 to immature dendritic cells can occur independently

of DC-SIGN and mannose binding C-type lectin receptors via a cholesterol-dependent

pathway. Journal of Virology. Vol. 77: 12865 – 12874. PMCID: PMC262553.

DOI: 10.1128/JVI.77.23.12865-12874.2003

Hedestam, G. B. K., Fouchier, R. A., Phogat, S., Burton, D. R., Sodroski, J., Wyatt, R. T.

(2008): The challenges of eliciting neutralizing antibodies to HIV-1 and to influenza virus.

Nature Reviews Microbiology. Vol. 6: 143–155. ISSN: 1740-1526.

DOI: 10.1038/nrmicro1819

Helenius, A., Aebi, M. (2001): Intracellular functions of N-linked glycans. Science.

Vol. 291: 2364 – 2369. PMID: 11269317. DOI: 10.1126/science.291.5512.2364

Hester, G., Kaku, H., Goldstein, I. J., Wright, Ch. S. (1995): Structure of mannose-specific

snowdrop (Galanthus nivalis) lectin is representative of a new plant lectin family. Nature

Structural Biology. Vol. 2: 472 – 479. ISSN: 1072-8368. DOI:10.1038/nsb0695-472

Hong, P. W. P., Flummerfelt, K. B., de Parseval, A., Gurney, K., Elder, J. H.,

Lee, B. (2002): Human immunodeficiency virus envelope (gp120) binding to DC-SIGN and

primary dendritic cells is carbohydrate dependent but does not involve 2G12 or cyanovirin

binding sites: Implications for structural analyses of gp120-DC-SIGN binding. Journal of

68

virology. Vol. 76: 12855-12865 ISSN: 0022-538X.

DOI: 10.1128/JVI.76.24.12855-12865.2002

Huskens, D., Schols, D., (2012): Algal Lectins as Potential HIV Microbicide Candidates. Mar

Drugs. ISSN: 1660-3397. DOI: 10.3390/md10071476

Janeway, Ch. A., Travers, P., Walport, M., Capra, J. D. (1999): Immunobiology:

The immune systém in health and disease, Fourth edition. Garland Publishers, New York.

ISBN: 0-8153-3217-3

Janini, L. M., Tanuri, A., Schechter, M., Peralta, J. M., Vicente, A. C., Dela Torre, N.,

Pieniazek, N. J., Luo, C. C., Ramos, A., Soriano, V., Schochetman, G., Rayfield, M. A.,

Pieniazek, D. (1998): Horizontal and vertical transmission of human immunodeficiency virus

type 1 dual infections caused by viruses of subtypes B and C. The Journal of Infectious

Diseases. Vol. 177: 227 – 231. ISSN: 0022-1899. DOI: 10.1086/517360

Jefferis, R. (2007): Antibody therapeutics:

isotype and glycoform selection. Expert opinion on biological therapy. Vol. 7: 1401-1413.

ISSN: 1471-2598. DOI: 10.1517/14712598.7.9.1401

Johnson, W. E., Sauvron, J. M., Desrosiers, R. C. (2001): Conserved, N-linked carbohydrates

of human immunodeficiency virus type 1 gp41 are largely dispensable for viral replication.

Journal of Virology. Vol. 75: 11426 – 11436. ISSN: 0022-538X.

DOI: 10.1128/JVI.75.23.11426-11436.2001

Joyce, J. G., ter Meulen, J. (2010): Pushing the envelope on HIV-1 neutralization. Natural

Biotechnology. Vol. 28: 929–931. ISSN: 1087-0156. DOI: 10.1038/nbt0910-929

Kitchen, S. G., Uittenbogaart, C. H., Zack, J. A. (1997): Mechanism of human

immunodeficiency virus type 1 localization in CD4-negative thymocytes: differentiation from

a CD4-positive precursor allows productive infection. Journal of Virology.

Vol. 71: 5713 – 5722. ISSN: 0022-538X

Kong, L., Sheppard, N. C., Stewart-Jones, G. B. E., Robson, C. L.., Chen, H., Xu, X.,

Krashias, G., Bonomelli, C., Scanlan, C. N., Kwong, P. D., Jeffs, S. A., Jones, I. M., Sattentau,

Q. J. (2010): Expression-System-Dependent Modulation of HIV-1 Envelope Glycoprotein

Antigenicity and Immunogenicity. Journal of Molecular Biology. Vol. 403: 131 – 147.

ISSN: 0022-2836. DOI: 10.1016/j.jmb.2010.08.033

Koot, M., Keet, I. P., Vos, A. H., de Goede R. E., Roos, M. T., Coutinho, R. A., Miedema, F.,

Schellekens, P. T., Tersmette, M. (1993): Prognostic value of HIV-1 syncytium-inducing

phenotype for rate of CD4+ cell depletion and progression to AIDS. Annals of internal

medicine. Vol. 118: 681-688. PMID: 8096374

Korber, B., Gaschen, B., Yusim, K., Thakallapally, R., Kesmir, C., Detours, V. (2001):

Evolutionary and immunological implications of contemporary HIV-1 variation. British

Medical Bulletin. Vol. 58: 19–42. ISSN: 0007-1420. DOI: 10.1093/bmb/58.1.19

Kornfeld, R., Kornfeld, S. (1985): Assembly of asparagine-linked oligosaccharides. Annual

Review of Biochemistry. Vol. 54: 631-664. ISSN: 0066-4154.

DOI: 10.1146/annurev.bi.54.070185.003215

69

Krambovitis, E., Porichis, F., Spandidos, D. A. (2005): HIV-1 cell entry inhibitors: a new

generation of antiretroviral drugs. ACTA Pharmacologica Sinica. Vol. 26: 1165–1173.

ISSN: 1671-4083. DOI: 10.1111/j.1745-7254.2005.00193.x

Krejsek, J., Kopecký, O. (2004): Klinická imunologie. 1. vydání. Nucleus HK®.

ISBN: 80-86225-50-X

Kwong, P., D., Wyatt, R., Robinson, J., Sweet, R., W., Sodroski, J., Hendrickson, W., A.

(1998): Structure of an HIV gp120 envelope glycoprotein in complex with the CD4 receptor

and a neutralizing human antibody. Nature. Vol. 393: 648 – 659. PMID: 9641677

Lam, S. K., Ng, T. B. (2011): Lectins: production and practical applications. Appl Microbiol

Biotechnol. 89 (1): 45 – 55. PMCID: PMC3016214. DOI: 10.1007/s00253-010-2892-9

Leonard, C. K., Spellman, M. W., Riddle, L., Harris, R. J., Thomas, J. N.,

Gregory, T. J. (1990): Assignment of intrachain disulfide bonds and characterization

of potential glycosylation sites of the type 1 recombinant human immunodeficiency virus

envelope glycoprotein (gp120) expressed in Chinese hamster ovary cells.

Journal of Biological Chemistry. Vol. 265: 10373 – 10382. ISSN: 0021-9258

Levinson, W. (2006): Review of Medical Microbiology and Immunology, ninth edition.

The McGraw-Hill Companies. ISBN: 0-07-110438-0

Liener I. E., Sharon N., Goldstein I. J. (1986): The Lectins – Properties, Functions and

Applications in Biology and Medicine. Academic Press. ISBN: 0-12-449945-7

Liu, Y., Liu, H., Kim, B. O., Gattone, V. H., Li, J., Nath, A., Blum, J., He, J. J. (2004): CD4-

independent infection of astrocytes by human immunodeficiency virus type 1: requirement for

the human mannose receptor. Journal of Virology. Vol. 78: 4120 – 4133. ISSN: 0022-538X.

DOI: 10.1128/JVI.78.8.4120-4133.2004

Livingstone, W. J., Moore, M., Innes, D., Bell, J. E., Simmonds, P. (1996): Frequent infection

of peripheral blood CD8-positive T-lymphocytes with HIV-1. Edinburgh Heterosexual

Transmission Study Group, Lancet. Vol. 348: 649 – 654. ISSN: 0140-6736. DOI:

10.1016/S0140-6736(96)02091-0

Lu, S. (2008): Immunogenicity of DNA vaccines in humans: it takes two to tango.

HumanVaccines. Vol. 4: 449–452. PMID: 18443427. DOI: 10.4161/hv.4.6.6179

Mascola, J. R., Montefiori, D. C. (2010): The role of antibodies in HIV vaccines. Annual

Review of Immunology. Vol. 28: 413 – 444. ISBN: 978-0-8243-3028-6. ISSN: 0732-0582.

DOI: 10.1146/annurev-immunol-030409-101256

Nabel, G. J. (2005): Close to the edge: neutralizing the HIV-1 envelope. Science.

Vol. 308: 1878-1879. ISSN: 0036-8075. DOI: 10.1126/science.1114854

Nascimento-Neto, G. L., Carneiro, R. F., Da Silva, S. R., Da Silva, B. R., Francisco Arruda, V.

S., Carneiro, V. A., Do Nascimento, K. S., Saker-Sampaio, S., Da Silva Jr., V. A., Porto, A. L.

F., Cavada, B. S., Sampaio, A. H., Teixeira, E. H., Nagano, C. S. (2012): Characterization of

Isoforms of the Lectin Isolated from the Red Algae Bryothamnion seaforthii and Its Pro-

Healing Efect. Mar Drugs. Vol. 10: 1936–1954. PMCID: PMC3475265.

DOI:10.3390/md10091936

70

Ormerod, M. G. (2009): Flow Cytometry: A Basic Introduction. By Michael G. Ormerod.

2009. ISBN 978-0-9559812-0-3

Pashov, A., Garimalla, S., Monzavi-Karbassi, B., Kieber-Emmons, T. (2009): Carbohydrate

targets in HIV vaccine research: lessons from failures. Imunnotherapy. Vol. 1: 777-794.

ISSN: 1750-743X. DOI: 10.2217/IMT.09.44

Peumans, W. J., Van Damme, E. J. (1995): Lectins as plant defense proteins. Plant physiology.

Vol. 109: 347 – 352. ISSN: 0032-0889. DOI: 10.1104/pp.109.2.347

Pope, M., Gezelter, S., Gallo, N., Hoffman, L., Steinman, R. M. (1995): Low levels of HIV-1

infection in cutaneous dendritic cells promote extensive viral replication upon binding to

memory CD4+ T cells. J Exp Med 182: 2045–2056. ISSN: 0022-1007.

DOI: 10.1084/jem.182.6.2045

Raška, M., Takahashi, K., Czernekova, L., Zachova, K., Hall, S., Moldoveanu, Z., Elliott, M.

C., Wilson, L., Brown, R., Jancova, D., Barnes, S., Vrbkova, J., Tomana, M., Smith, P. D.,

Mestecky, J., Renfrow, M. B., Novak, J. (2010 a): Glycosylation patterns of HIV-1 gp120

depend on the type of expressing cells and affect antibody recognition. The journal of

biological chemistry. Vol. 285: 20860 – 20869. PMCID: PMC2898351.

DOI: 10.1074/jbc.M109.085472

Richman, D. D. (2001): HIV chemotherapy. Nature. Vol. 410: 995 – 1001.

ISSN: 00280836. DOI: 10.1038/35073673

Rizzuto, C. D., Wyatt, R., Hernandez-Ramos, N., Sun, Y., Kwong, P. D., Hendrickson, W. A.,

Sodroski, J. (1998): A conserved HIV gp120 glycoprotein structure involved

in chemokine receptor binding. Science. Vol. 280: 1949 – 1953.

DOI: 10.1126/science.280.5371.1949

Robertson, D. (2003): US FDA approves new class of HIV therapeutics. National

Biotechnology. Vol. 21: 470 – 471. PMID: 12721558. DOI:10.1038/nbt0503-470

Robinson, H. L. (2007): HIV/AIDS vaccines: 2007. Clinical Pharmacology

& Therapeutics. Vol. 82: 686-693. ISSN: 0009-9236. DOI: 10.1038/sj.clpt.6100408

Robinson, J. P., Grégori, G. (2007): Principles of Flow Cytometry. Edited by Doležel, J.,

Greilhuber, J., Suda, J. (2007): Flow Cytometry with Plant Cells. WILEY-VCH Verlag GmbH

& Co. KGaA. ISBN: 978-3-527-31487-4

Roubalová, L. (2012): Průtoková cytometrie. FONS. roč. 22, č. 2, s. 5-9. ISSN: 1211-7137

Rubbert, A., Behrens, G., Ostrowski, M. (2011): Pathogenesis of HIV-1 infection. Edited

by Hoffmann, Ch., Rockstroh, J. K. http://hivbook.com/category/part-1-the-basics/3-

pathogenesis-of-hiv-1-infection/

Shapiro, H. M. (2003): Practical Flow Cytometry, 4th edition. Wiley-Liss, New York, NY,

USA. ISBN: 0-471-41125-6

Snustad, D. P., Simmons, M. J. (2009): Genetika. Nakladatelství Masarykovy univerzity, Brno.

ISBN 978-80-210-4852-2

71

Taylor, B. S., Sobieszczyk, M. E., McCutchan, F. E., Hammer, S. M. (2008):

The Challenge of HIV-1 Subtype Diversity. New England Journal

of Medicine. Vol. 359: 1965-1966. ISSN: 0028-4793. DOI: 10.1056/NEJMc086373

Unaids report on the global AIDS epidemic. WHO Library Cataloguing-in-Publication Data.

ISBN: 978-92-9173-592-1

Varki, A., Cummings, R., Esko, J., Freeze, H., Stanley, P., Bertozzi, C. R., Hart, G. W., Etzler,

M. E. (2009): Essentials of Glycobiology, Second Edition. ISBN: 978-087969770-9

Varki, A., Freeze, H., Manzi, A. E. (2009): Overview of Glycoconjugate Analysis. Current

Protocols in Protein Science. Vol. 57:12.1.1-12.1.10.

PMCID: PMC2749716. DOI: 10.1002/0471140864.ps1201s57

Vodrážka, Z. (2007): Biochemie. Academia. Kap. 5: 9-179. ISBN 978-80-200-0600-4

Wang, H. X., Ng, T. B., Liu, W. K., Ooi, V. E., Chang, S. T. (1995): Isolation and

characterization of two distinct lectins with antiproliferative activity from the cultured

mycelium of the edible mushroom Tricholoma mongolicum. Int J Pept Protein Res.

Vol. 46: 508–513. DOI: 10.1111/j.1399-3011.1995.tb01606.x

Weis W. I., Taylor M. E., Drickamer K. (1998): The C-type lectin superfamily in the immune

system. Immunol. Rev. Vol. 163:19–34. DOI: 10.1111/j.1600 065X.1998.tb01185.x

Wyatt, R., Sodroski, J. (1998): Envelope glycoproteins: fusogens, antigens,

and immunogens. Science. Vol. 280: 1884–1888. ISSN: 0036-8075.

DOI: 10.1126/science.280.5371.1884

Yee, M., Konopka, K., Balzarini, J., Düzgüneş, N. (2011): Inhibition of HIV-1 Env-Mediated

Cell-Cell Fusion by Lectins, Peptide T-20, and Neutralizing Antibodies. Open Virology

Journal. Vol. 5: 44–51. PMCID: PMC3109660. DOI: 10.2174/1874357901105010044

Yokoyama, M., Naganawa, S., Yoshimura, K., Matsushita, S., Sato, H. (2012): Structural

Dynamics of HIV-1 Envelope Gp120 Outer Domain with V3 Loop. PLoS ONE 7(5): e37530.

doi:10.1371/journal.pone.0037530.

Zhu, X., Borchers, C., Bienstock, R. J., Tomer, K. B. (2000): Mass spectrometric

characterization of the glycosylation pattern of HIV-gp120 expressed in CHO cells.

Biochemistry. Vol. 39: 11194–11204. DOI: 10.1021/bi000432m.

Zolla-Pazner, Improving on nature: Focusing the immune response on the V3 loop. Human

Antibodies. Vol. 14: 69-72. PMID:16720976

Internetové zdroje:

http://biomedicina.prf.jcu.cz/wordpress/wpcontent/uploads/2011/12/Vyuzitiprutokovecytometr

ievimunologii.pdf

http://hivbook.com/category/part-1-the-basics/3-pathogenesis-of-hiv-1-infection/

72

9 SEZNAM ZKRATEK

AAL Aleuria aurantia lectin

AIDS Acquired immunodeficiency syndrom

ARC AIDS-related comlex

CD4 Cluster of differentiation 4

CD4i CD4-induced

DNA Deoxyribonucleic acid

DMSO Dimethylsulfoxid

DTT Dithiothreitol

EBV Epstein-Barr virus

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

FCS Flow cytometry standard format

FSC Forward scatter

FITC Fluorescein isothiocyanate

G1 Gate 1

G2 Gate 2

GNL Galanthus nivalis lectin

HAART Highly Active AntiRetroviral Therapy

HEK Human embryonal kidney

HIV Human immunodeficiency virus

LTR Long terminal repeats

mRNA Ribonucleic acid messenger

MPER Membrane-proximal external region

NEM N-ethylmaleimid

NK1 Negativní kontrola 1

NK2 Negativní kontrola 2

PHA-L Phaseolus vulgaris leucoagglutin

PNGasa F Peptide N-Glycosidase F

PNGS Potential N-glycosylation site

RNA Ribonucleic acid

SSC Side scatter

Sulfo-SMCC Sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]cyklohexan-1-carboxylate

univerzita palackého v olomouci - theses.cz

Documents