univerza v ljubljani biotehniŠka fakulteta oddelek za ... · dejavniki okolja, kjer se reakcija...

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

ODDELEK ZA ŽIVILSTVO

MIKROBIOLOŠKO-MOLEKULARNI PRAKTIKUM – LABORATORIJSKE VAJE ZA BIOTEHNOLOGE

Iztok Dogša,Tjaša Danevčič, Blaž Stres, Špela Höfferle, Ines Mandič Mulec

Ljubljana, 2008

I. Dogša,T. Danevčič, B. Stres, Š. Höfferle, I. Mandić-Mulec Mikrobiološko- molekularni- praktikum – laboratorijske vaje za biotehnologe. Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, Katedra za mikrobiologijo, 2008.

KAZALO PRAVILA ZA VARNO DELO V MIKROBIOLOŠKEM LABORATORIJU ............1 VAJA 1. Osnove aseptične tehnike in rokovanje z osnovnim laboratorijskim orodjem........................................................................................................................................2 VAJA 2. Izolacija fiziološko različnih kultur iz aktivnega blata čistilne naprave in tal na trdnem gojišču- spremljanje rasti in pojavljanja bakterijskih kolonij v odvisnosti od časa in temperature inkubacije.......................................................................................3 VAJA 3 : Rastna krivulja tekoče bakterijske kulture in podvojevalni čas v odvisnosti od temperature rasti......................................................................................................10 VAJA 4: Sterilizacija, inhibicija, rezsitenca, kompeticija ...........................................14 VAJA 4a : Sterilizacija, aseptična tehnika...................................................................14 VAJA 4b: Minimalna inhibitorna koncentracija protimikrobne snovi (MIK).............17 VAJA 4c: Bakteriocini................................................................................................19 VAJA 4d: Naravna odpornost na antibiotike...............................................................21 VAJA 4e: Sinteza sideroforov .....................................................................................24 VAJA 5: Verižna reakcija s polimerazo (PCR) in preverjanje polimorfizma dolžine restrikcijskih fragmentov (RFLP) pri izoliranih okojskih sevih ..................................26 PRILOGE.....................................................................................................................35 LITERATURA ............................................................................................................38

II

I. Dogša,T. Danevčič, B. Stres, Š. Höfferle, I. Mandić-Mulec Mikrobiološko- molekularni- praktikum – laboratorijske vaje za biotehnologe. Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, Katedra za mikrobiologijo, 2008. PRAVILA ZA VARNO DELO V MIKROBIOLOŠKEM LABORATORIJU 1. Pri delu z mikroorganizmi obravnavaj mikroorganizme kot pogojno patogene in

zato ves čas dela z mikroorganizmi uporabljaj aseptično tehniko. 2. Pred in po vsaki vaji si umij roke z razkužilom (detergent z biocidnim delovanjem). 3. Delovni pult razkuži pred in po uporabi mikrobne kulture (alkohol, Incidur ali

Spitaderm). 4. V primeru manjših nezaščitenih ran na koži ne začni dela z mikrobnimi kulturami

brez dodatne zaščite (zaščitne rokavice, respiratorna maska) in predhodnega pogovora z asistentom oz. predpostavljenim.V primeru večjih odprtih ran na koži je delo z mikrobnimi kulturami prepovedano.

5. Nikoli ne pipetiraj kulture mikroorganizmov z usti. 6. V primeru razlitja mikrobne kulture preliješ razlito kulturo z razkužilom (alkohol,

5% lizol) in nemudoma obvesti asistenta oziroma predpostavljenega. Če je prišlo do razlitja po telesu, inficirano mesto razkužimo in speremo s toplo vodo in milom. Če je prišlo do poškodbe kužnino odstranimo, iztisnemo kri v posodo z razkužilom in mesto poškodbe razkužimo ter rano sterilno obvežemo. V kolikor pridejo mikrobi v usta jih izpljunemo v posodo z razkužilom ter usta izpiramo z 0.2 % solno kislino.

7. Mikrobnih kultur nikoli ne odnašaj iz laboratorija. 8. Ves uporabljen material na vajah mora biti jasno in nedvoumno označen (vrsta

mikroorganizma, ime študenta, datum, vrsta vzorca, razredčitev) in odložen na dogovorjeno mesto.

9. S plinskim gorilnikom delaj zelo previdno. Če imaš dolge lase morajo biti povezani ali zaščiteni z zaščitno kapo. Plinski gorilec ugasni takoj po končanem delu in preveri ali je plinska napeljava zaprta.

10.Optični material (leče, objektivi) očisti pred in po uporabi. Leče čisti izključno s staničevino.

11.Po uporabi vse reagente in opremo (epruvete, petrijevke, pipete, mikroskop) vrni na dogovorjeno mesto. Material, ki je bil v stiku z mikrobno kulturo je potrebno sterilizirati in zato ločiti od ostalega materiala.

12.Nesreče pri delu (opekline, urezi, razlitje mikrobioloških kultur) takoj javi asistentu ali nadrejenemu.

13. V laboraotriju vedno nosi zaščitno haljo 14. V laboratoriju je prepovedano zauživati hrano in pijačo.

1

I. Dogša,T. Danevčič, B. Stres, Š. Höfferle, I. Mandić-Mulec Mikrobiološko- molekularni- praktikum – laboratorijske vaje za biotehnologe. Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, Katedra za mikrobiologijo, 2008. VAJA 1. Osnove aseptične tehnike in rokovanje z osnovnim laboratorijskim orodjem Uvodna vaja je namenjena seznanjanju študentov z osnovami dela v laboratoriju. Uspešno pridobljena znanja s te vaje so koristna in potrebna za uspešno izvedbo vseh sledečih vaj. Osnove aseptične tehnike Aseptična tehnika je način dela, ki preprečuje kontaminacijo preučevanega mikrobiološkega vzorca z mikrobi, ki niso del tega vzorca in hkrati preprečuje mikrobno kontaminacijo izvajatelja aseptične tehnike. Aseptično tehniko bomo uporabljali vedno kadar bomo rokovali z mikrobiološkimi kulturami, še posebej ob prenosu kulture iz enega medija v drugega ali pri dodajanju določenih snovi h kulturi. Naštetih je nekaj splošnih napotkov za aseptično delo z mikrobiološkimi kulturami: -Razkužite delovno površino pred začetkom dela. Mikrobi so povsod! To lahko naredite s protimikrobnim sredstvom, ki vam ga pripravi asistent. -Delajte ob prižganem gorilniku, kadar imate odprto kulturo, ob ožiganju ali sterilizaciji s plamenom, odprite odprtino za dotok zraka na Bunsenovem gorilniku toliko, da dobite modrikast plamen (delovni plamen). Sicer zaprite odprtino za dotok kisika (varnostni plamen). Topel plamen dviguje zrak in s tem preprečuje kontaminacijo vzorcev z mikroorganizmi iz zraka v bližini gorilnika. -Orodja s katerimi prenašate mikrobe ali na kakršenkoli način posegate v medij predhodno sterilizirajte. Kadar uporabite mikrobiološko zanko (ezo), jo ožgite v delovnem plamenu gorilnika (zanka mora rdeče žareti) in jo ohladite tik ob plamenu, preden sežete v mikrobiološko kulturo. Materiala iz plastike nikoli ne ožigajte, temveč ga uporabljajte v bližini ognja, tako da se ne kontaminira in se ne opečete. -Ob vsakem odpiranju epuvete (ali erlenmajerice) najprej ob gorilniku previdno snamite pokrovček in vrat epruvete nekajkrat počasi popeljite skozi plamen. Enako storite preden zaprete epruveto. Pokrovček naj bo ves čas v bližini gorilnika. -Po končanem delu vedno razkužite delovno površino. Izvedba: a) Precepljanje iz trdnega/tekočega na trdno gojišče Vsak študent dobi tri plošče z LB agarjem. Prvo ploščo naj odpre in previdno potipa površino agarja s prsti. Na drugo ploščo naj aseptično z mikrobiološko zanko precepi mikrobno kulturo iz plošče, ki mu jo priskrbi asistent. Na tretjo ploščo naj aseptično s pipeto prenese 0,1 ml tekoče kulture, ki mu jo pravtako priskrbi asistent. Kulturo na plošči študent razmaže s konico epruvete, ki jo predhodno pomočeno v etanol ožge na gorilniku. Plošče je potrebno tudi pravilno označiti (lastnik, sev, datum) in jih nato inkubirati na 37 °C s pokrovom obrnjenim navzdol. Čez teden dni študent preveri mikrobno rast. Za kontrolo inkubirajte tudi eno ploščo, ki se je ne sme odpirat.

2

I. Dogša,T. Danevčič, B. Stres, Š. Höfferle, I. Mandić-Mulec Mikrobiološko- molekularni- praktikum – laboratorijske vaje za biotehnologe. Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, Katedra za mikrobiologijo, 2008. b) Priprava redčitvene vrste V tem delu vaje vsak študent pripravi redčitveno vrsto metilenskega modrila. V ta namen si študenti pripravijo stojalo s šestimi mikrocentrifugirkami, ki jih z avtomatsko pipeto napolnijo z 0,9 ml vode. V prvo mikrocentrifugirko v vrsti naj študent doda 0,1 ml metilenskega modrila, zapre centrifugirko in z vrtinčnim mešalom (vibracijskim mešalnikom) premeša njeno vsebino (1 mililiter redčitve 10-1). Iz redčitve 10-1 prenese 0,1 ml v naslednjo mikrocentrifugirko (10-2) ter ponovno premeša vsebino. Enake korake ponovi vse do redčitve 10-6. Vrsta tako pripravljenih redčitev se imenuje redčitvena vrsta. V vsaki naslednji epruveti je koncentracija redčene snovi manjša za 10-krat (redčitveni faktor). V primeru natančnega dela, morajo biti gladine vsebine vseh mikrocentrifugirk na enakem nivoju in obarvane v enakomerno padajočem vrstnem redu (od najbolj koncentrirane k manj koncentrirani raztopini). VAJA 2. Izolacija fiziološko različnih kultur iz aktivnega blata čistilne naprave in tal na trdnem gojišču- spremljanje rasti in pojavljanja bakterijskih kolonij v odvisnosti od časa in temperature inkubacije

Rast mikroorganizmov na nivoju celice je večanje volumna in mase posamezne

celice ter podvojitev. Pogosteje pa rast mikroorganizmov obravnavamo na nivoju populacije ali združbe. Na tem nivoju je rast mikroorganizmov večanje števila celic oziroma mase vseh celic. Za rast je potrebna energija.

Različne vrste mikroorganizmov lahko izkoriščajo različne vrste energije: sončno energijo ali pa energijo vezano v različnih organskih spojinah. Posebnost metabolizma mikroorganizmov je njihova sposobnost izkoriščanja energije vezane v anorganskih spojinah ter elementih npr. H2, H2S, NH4

+, Fe2+, So, S2O3, NO2-. Vsem

navedenim anorganskim skupinam in elementom je skupno, da so v relativno reduciranem stanju. Izkoriščanje energije v mikrobnih celicah je vezano na encimske oksidacijsko-redukcijske reakcije, kjer se sproščena energija porabi za produkcijo ATP-ja. Kemijsko vezana energija v obliki ATP je najbolj pogosta oblika energije, ki jo celica neposredno izkorišča pri energetsko zahtevnih biosintetskih reakcijah. Za kemijske reakcije, kjer je potrebno manj energije se lahko uporabljajo tudi drugi viri energije. Izkoriščanje energije je termodinamski proces in zato so pomembni dejavniki okolja, kjer se reakcija odvija (temperatura, pH, pritisk, prosta Gibsova energija, koncentracija reaktantov in produktov).

Poleg energije potrebuje mikroorganizem za rast ogljik in druge elemente, ki so sestavine novo sintetizirane biološke snovi. Te elemente opredeljujemo kot hranila in mikroorganizmi jih sprejemajo iz okolja v različnih oblikah. Ločimo makro-hranila (C, O, H, N, P, S, K, Mg, Na, Ca), ki jih organizem potrebuje v večjih količinah in mikro-hranila (npr. Fe, Co, Cr, Mn, Mo, Ni, Se, W, V, Zn, I), ki so za rast potrebna v manjših količinah. Posebnost nekaterih mikroorganizmov je zmožnost, da določeno hranilo v različnih redukcijskih stanjih, lahko uporabljajo za več namenov: za asimilativni metabolizem, to je za sintezo nove biološke snovi, kot donor elektronov

3

I. Dogša,T. Danevčič, B. Stres, Š. Höfferle, I. Mandić-Mulec Mikrobiološko- molekularni- praktikum – laboratorijske vaje za biotehnologe. Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, Katedra za mikrobiologijo, 2008. oziroma vir energije (H2, H2S, NH4

+, Fe2+, So, S2O3, NO2-) ali pa kot sprejemnik

elektronov pri dihanju - disimilativni metabolizem (npr. NO3-, SO4

2-, Fe3+, So). Mikroorganizmi, ki kot vir ogljika izrabljajo organske spojine sodijo med heterotorfne orgnizme. Mikroorganizmi, ki so sposobni izrabljati kot vir ogljika anorganske spojine pa sodijo k autotrofom.

Mikroorganizme najdemo v vseh okoljih, kjer imajo na voljo dostopna hranila in vir energije. Okolje s svojimi biotičnimi in abiotičnimi dejavniki daje prednost mikroorganizmu, ki je okolju najbolje prilagojen. V svojem naravnem okolju mikroorganizem po pravilu ne izkoristi v celoti svojega rastnega potenciala, ker običajno vsi dejavniki okolja niso v optimalnih območjih in hranila niso prisotna v optimalnih koncentracijah in ustreznih fizikalno-kemijskih stanjih.

Naravna okolja so običajno poseljena z večjim številom različnih mikroorganizmov in tudi drugih združb, sestavljenih iz populacij različnih organizmov. Številne biotske in abiotske interakcije še povečujejo kompleksnost in zato opazovanja pojavov neposredno v takih okoljih ne nudijo veliko možnosti za opisovanje in vrednotenje posameznega mikroorganizma in še manj za vrednotenje vzročnih povezav med vlogo posameznega organizma in spremembami v okolju.

Lastnosti posameznega mikroorganizma in tudi njegove vloge v okolju tradicionalno proučujemo v poenostavljenih laboratorijskih modelih s čistimi kulturami. Čista kultura mikroorganizma je najbolj splošno opredeljena kot populacija mikroorganizma v odsotnosti vseh ostalih mikroorganizmov. Čista kultura je fenotipsko in genotipsko homogena. Ko so celice v čisti kulturi dokazljivo potomstvo ene same celice jo imenujemo klon. Potomstvo ene ali več enakih celic pa imenujemo sev. Seve, ki so opredeljeni po antigenskih značilnostih, imenujemo serotipe.

Mešanico substratov, ki omogočajo rast mikroorganizmov imenujemo gojišča. Za uspešno gojitev mikroorganizmov, moramo poznati prehranske zahteve in dejavnike okolja, ki vplivajo na rast izbranega mikroorganizma. Pri dejavnikih okolja je pomembno poznavanje zahtev mikroorganizma glede temperature, prisotnosti ali odsotnosti kisika, dostopnost vode in pH. Glede na sestavo gojišča poznamo naravna gojišča (npr. mleko, sadni sok), sestavljena (pepton, mesni ekstrakt, kvasni ekstrakt), in sintetična gojišča, kiso sestavljena izključno iz kemijsko dobro določenih snovi, ki jih dodamo v znanih koncentracijah in jih pogosto imenujemo definirana gojišča Glede namembnosti ločimo hranljiva (hranljivi agar, hranljivi bujon), obogatena (dodatek krvi, rastlinskega soka), selektivna (NH4

+ kot edini vir energije) in

diferencialna gojišča (EMB, krvni agar). Glede na agregatno stanje uporabljamo tekoča gojišča, poltrdna gojišča (0.5 % agarja) in trdna gojišča (1.5 - 2 % agarja).

Rast mikroorganizmov lahko spremljamo na več načinov: s štetjem celic pod mikroskopom, z gojitvenimi števnimi metodami, s spektrofotometričnim določanjem optične gostote tekoče kulture (absorbcija pri valovni dolžini 660 nm), z merjenjem količine suhe snovi mikrobnih celic, s spremljanjem porabe substrata ali povečanja mikrobnega produkta, z merjenjem količine vgrajenega radioaktivnega substrata v mikrobno celico (npr. 3H, izotopno označen levcin), z merjenjem celičnih sestavin (DNA, proteini, biomasni ogljik in dušik, ATP). Števne metode so najbolj pogosto uporabljeni pristop za določanje velikosti mikrobne populacije. Uporabne so tako pri delu s čistimi kulturami, kot tudi za določanje velikosti mikrobnih populacij ali združb v heterogenih naravnih vzorcih (tekočih, trdnih ali plinastih). Ločimo direktne in indirektne oziroma gojitvene števne metode. Pri direktnih metodah preštejemo celice s pomočjo mikroskopa neposredno v vzorcu. Z indirektnimi - gojitvenimi

4

I. Dogša,T. Danevčič, B. Stres, Š. Höfferle, I. Mandić-Mulec Mikrobiološko- molekularni- praktikum – laboratorijske vaje za biotehnologe. Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, Katedra za mikrobiologijo, 2008. prijemi pa določamo število živih celic oz. enot, ki so sposobne rasti na uporabljenih gojiščih in v razmerah inkubacije.

Za namene proučevanja lastnosti odbranega mikroorganizma je nujna njegova izolacija iz naravnega okolja. Pogosto je v postopek izolacije vključena stopnja obogatitve vzorca z odbranim mikroorganizmom. Na osnovi različnih prehranskih in okoljskih zahtev mikroorganizmov lahko z izbiro pogojev, ki pospešujejo rast odbranega mikroorganizma, le-tega številčno obogatimo glede na ostale mikroorganizme prisotne v vzorcu. Npr. fotoavtotrofni mikroorganizem lahko selektivno namnožimo v gojišču, ki ima potrebne makro in mikroelemente, vitamine, kofaktorje, nima pa vira organske ali anorganske energije. Z inkubacijo na svetlobi in ob prisotnosti CO2 kot edinega vira ogljika favoriziramo rast tistih mikroorganizmov, ki lahko izkoriščajo svetlobo kot vir energije. Selektivno obogatena kultura običajno še ni čista kultura.

Čisto kulturo lahko iz obogatene kulture izoliramo s pomočjo mikroskopa (direktna metoda). V tem primeru izberemo posamezno mikrobno celico in jo s primerno majhno kapilaro prenesemo na sterilno gojišče. Pri indirektnih metodah izoliramo celice iz posamezne kolonije (predpostavimo, da je kolonija nastala iz ene same ali maloštevilnih enakih celic) in jo aseptično prenesemo na novo gojišče. Pri izolaciji v tekočih kulturah predpostavimo, da je pri višjih razredčitvah v gojišču omejeno število mikrobnih celic željenega organizma (v posebnem primeru je lahko prisotna samo ena celica). Kulturo iz teh razredčitev precepimo v sveže gojišče.

Izolirano čisto kulturo moramo obdržati nespremenjeno in čisto. Pogosti vzrok napačnih zaključkov v mikrobiologiji je prav delo s kontaminiranimi kulturami. Vzdrževanje čiste kulture zajema ohranjanje živosti, preprečevanje kontaminacije in občasno preverjanje nespremenjenosti fenotipskih in genotipskih lastnosti mikroorganizma. Za krajšo dobo kulturo lahko ohranimo živo z občasnim precepljanjem na sveže gojišče in hranjenjem pri nizkih temperaturah (+ 4 oC). Paziti moramo, da se nam kultura ne izsuši. Nekatere kulture lahko tudi zamrznemo do - 20 oC in jih tako ohranimo od dveh mesecev do dveh let, odvisno od mikroorganizma. Kulture mikroorganizmov, ki sporulirajo lahko hranimo v obliki spor v suhem stanju v želatini ali na papirju. Za daljše obdobje je primerno zmrzovanje kulture pri -70 oC, ali v tekočem dušiku (-196 oC) oziroma v dušikovih parah (-140 oC). Mikrobno kulturo lahko ohranimo tudi v liofiliziranem stanju. Liofiliziranje je postopek sušenja v zmrznjenem stanju in pri močno znižanem tlaku. V takih razmerah voda iz vzorca sublimira v ohlajeno past. Liofilizirano kulturo shranimo v vakuumiranih ampulah.

Čiste kulture mikroorganizmov hranijo v različnih splošnih in specializiranih zbirkah: ATCC (American Type Culture Collection), DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen), NCTC (National Collection of Type Cultures). Obstajajo specializirane zbirke za industrijske mikroorganizme, kmetijske mikroorganizme, rastlinske patogene organizme. V Sloveniji imamo tako MZKI (Mikrobiološko zbirko Kemijskga inštituta) ter ločene zbirke mikroorganizmov, ki jih hranijo posamezne katedre Biotehniške fakultete in Institut Jozef Stefan.

V tej vaji se bomo seznanili z najpogosteje uporabljeno metodo za ugotavljanje

števila živih celic v vzorcu- štetje na ploščah. Z njo ugotavljamo število enot (CFU- Colony Forming Units), ki na trdnem gojišču tvori kolonije. Predpostavka te metode je, da kolonijo lahko tvori samo živa celica in da iz vsake celice, ki je na plošči zraste

5

I. Dogša,T. Danevčič, B. Stres, Š. Höfferle, I. Mandić-Mulec Mikrobiološko- molekularni- praktikum – laboratorijske vaje za biotehnologe. Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, Katedra za mikrobiologijo, 2008. ena kolonija. Število zrastlih kolonij pa ni odvisno samo od količine celic v nacepljenem vzorcu, temveč tudi od sposobnosti nacepljenih celic, da zrastejo pri danih inkubacijskih pogojih (vrsta gojišča, temperatura, kisik, trajanje inkubacije idr.). Zato s to metodo odkrijemo aerobne heterotrofne mikroorganizme, kar tipično predstavlja samo 0.1 - 10 % vseh mikroorganizmov v tleh in 1 - 20 % vseh organizmov v vodnem okolju (v mleku 80%). Ploščo lahko nacepimo z vmešavanjem vzorca (tipično 0.1 - 1.0 ml) v še tekoče sterilno gojišče pri temperaturi 45 °C, tik preden se le-to ohladi pod temperaturo strjevanja ali, kot v tej vaji, z razmazovanjem vzorca (tipično 0.1 ml) po površini trdnega gojišča. Izvedba: Razdelitev v podskupine: Asistent naj vas razdeli v 6 podskupin. Tri podskupine se bodo ukvarjale z vzorcem iz tal, tri z vzorcem aktivnega blata. Vsaka podskupina inkubira vzorec pri svoji temperaturi.:

Podskupina 1 4°C Podskupina 2 28°C


Podskupina 5 28°C

Podskupina 6 37°C a) Priprava redčitev Vsaka podskupina naj označi šest epruvet s fiziološko raztopino z oznakami redčitev: -1, -2, -3, ..., -6. Tri podskupine prejmejo suspenzijo vzorca tal, druge tri podskupine pa suspenzijo vzorca aktivnega blata čistilne naprave, ki že predstavljajo desetiško redčitev vzorca. Vsaka skupina pripravi nadaljne desetiške redčitve svojega vzorca do 10-6 (redčitvna vrsta). Redčitve pripravite aseptično ob plamenu plinskega gorilnika. Aseptično odpipetiraj 1 ml vzorca in ga prenesi v 9 ml fiziološke raztopine v epruveti z oznako 10-1 (desetkratna redčitev osnovne suspenzije). Pripravljeno redčitev dobro premešaj (uporabi mešalec ali pa epruveto vrti med dlanmi).

6


7

Naslednjo redčitev pripravi tako, da 1ml razredčitve 10-1 preneseš v 9 ml fiziološke raztopine s čisto sterilno pipeto. Dobro premešaj in označi redčitev z 10-2 (stokratna redčitev). Na enaki način pripravi še ostale redčitve. Ko si pripravil razredčitve vzorca v fiziološki raztopini pripravi sterilne petrijevke z gojiščem in jih označi enako kot razredčitve (vzorec, redčitev, ime, datum). Za vsako redčitev, ki jo boš nacepljal, pripravi po tri označene plošče (glej tabelo 1). Vsaka skupina dobi 18 plošč. b) Nacepljanje S pipeto aseptično prenesi 0,1 ml vsake redčitve (npr. iz epruvete z oznako 10-5) na površino gojišča R2A v petrijevki z oznako 10-5. Epruveto pomoči v čašo z etanolom in jo v varni oddaljenosti od te čaše previdno približaj plamenu. Ko plamen na epruveti dogori, jo ohladi na površju gojišča in prični z razmazovanjem nanešenega vzorca. Nacepljene plošče inkubiraj s pokrovom navzdol pri zgoraj navedenih temperaturah. Inkubacija traja toliko časa, da se število kolonij ne spreminja več (običajno 5 tednov). Vsak teden preštej kolonije na števni plošči. Števne so plošče s 30 do 300 kolonij. Končni rezultat izrazimo v CFU/ml vodne suspenzije ali CFU/g tal.

Iza

. Dogša,T. Danevčič, B. Stres, Š. Höfferle, I. Mandić-Mulec Mikrobiološko- molekularni- praktikum – laboratorijske vaje za biotehnologe. Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, Katedra mikrobiologijo, 2008.

8

datum -1 -1 -1 -2 -2 -2 -3 -3 -3 -4 -4 -4 -5 -5 -5 -6 -6 -6

Tabela 1: Pojavljanje mikroorganizmov pri različnih temperaturah enotah (CFU) iz vzorca tal ali aktivnega blata .

plošča plošča plošča plošča plošča plošča Skupina 1 1. teden 4°C 2. teden 3. teden 4. teden Skupina 2 1. teden 28°C 2. teden 3. teden 4. teden Skupina 3 1. teden 37°C 2. teden 3. teden 4. teden Skupina 4 1. teden 4°C 2. teden 3. teden 4. teden Skupina 5 1. teden 28°C 2. teden 3. teden 4. teden Skupina 6 1. teden 37°C 2. teden

3. teden 4. teden

I. Dogša,T. Danevčič, B. Stres, Š. Höfferle, I. Mandić-Mulec Mikrobiološko- molekularni- praktikum – laboratorijske vaje za biotehnologe. Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, Katedra za mikrobiologijo, 2008. Slika 1: Krivulja pojavljanja bakterijskih kolonij mešane združbe pri različnih temperaturah za vzorec tal in vzorec aktivnega blata (CFU / g vzorca)

9

I. Dogša,T. Danevčič, B. Stres, Š. Höfferle, I. Mandić-Mulec Mikrobiološko- molekularni- praktikum – laboratorijske vaje za biotehnologe. Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, Katedra za mikrobiologijo, 2008. VAJA 3 : Rastna krivulja tekoče bakterijske kulture in podvojevalni čas v odvisnosti od temperature rasti

Namen vaje je spoznati dinamiko rasti bakterijske populacije in določiti njen generacijski ali podvojevalni čas. Čisto kulturo bakterijskih celic nacepimo v sterilno gojišče in inkubiramo pri optimalnih pogojih okolja (temperatura, pH, aerobne oz. anaerobne razmere).

Rast bakterijske populacije v zaprtem (batch) sistemu ponazarja rastna krivulja, ki jo lahko razdelimo na štiri faze: lag fazo, logaritemsko ali eksponentno fazo, stacionarno fazo in fazo odmiranja. Rastna krivulja ponazarja številčnost mikrobne populacije v odvisnosti od časa.

Po prenosu celic v sveže gojišče, so celice sicer metabolično aktivne, prilagajajo se na nove hranljive vire oz. sintetizirajo razne encime, vendar se še ne delijo. Govorimo o lag fazi. Lag faza izostane samo v primeru, če prenesemo mlado kulturo iz logaritemske faze v sveže gojišče enake sestave. Velikost celic se veča, dokler ne doseže kritične velikosti za delitev in od tu naprej govorimo o eksponentni fazi. Celice pospešeno rastejo in se delijo ustrezno svojemu genetskemu potencialu, sestavi gojišča in pogojem rasti (temperatura, pH, kisik...). Pogosto proizvajajo tudi rezervne snovi iz obilice hranil v okolici.

Ko se hranljivi viri izčrpajo, ali pa se akumulirajo toksični odpadni produkti (aerobom lahko začne primanjkovati kisika, ki je slabo topen), celice spremenijo svojo fiziologijo. Lahko dodajo novo plast celične stene, upočasnijo metabolizem in delitev, ali pa začnejo rabiti rezervne snovi. Rastna krivulja preide v stacionarno fazo. V tej fazi je število celic konstantno. Celice se tipično še vedno počasi delijo ampak tudi počasi odmirajo, tako da je njihovo število v povprečju konstantno. Dolžina stacionarne faze je odvisna od vrste organizma. Talni mikrobi, ki so navajeni na hitro spreminjajoče se okolje, imajo zelo učinkovite mehanizme za vzdrževanje živosti med pomanjkanjem hranil. Mnogi tvorijo spore in ciste.

Po določenem času preide populacija v fazo odmiranja. Smrt nastopi zaradi izstradanja ali toksičnih odpadnih snovi. V tej fazi se število celic ne spreminja, če jih določamo z mikroskopom ali turbidimetrično (razen če celice lizirajo), če pa jih določamo z gojitvenimi tehnikami, se ponavadi število celic zmanjšuje.

Slika 2: Prikaz faz mikrobne rasti – označite osi in faze rasti

10

I. Dogša,T. Danevčič, B. Stres, Š. Höfferle, I. Mandić-Mulec Mikrobiološko- molekularni- praktikum – laboratorijske vaje za biotehnologe. Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, Katedra za mikrobiologijo, 2008. Da bi lahko narisali rastno krivuljo moramo na nek način spremljati številčnost bakterijske populacije v odvisnosti od časa. Elegantna metoda je turibidimetrija oz. merjenje motnosti gojišča s pomočjo fotometra. Metoda temelji na dejstvu, da se z večanjem celične gostote veča tudi motnost gojišča. Merjeni količini bolj strokovno rečemo optična gostota in jo označujemo z OD (optical density), ki je pogosto tudi sinonim za absorbacno. Slabost metode je, da ne ločuje med živimi in mrtvimi celicami in da nam velikost OD ne pove neposredno koliko celic se nahaja v vzorcu. Zato bomo v tej vaji vzporedno z merjenjem OD tekoče kulture ugotavljali številčnost bakterijske populacije tudi s štetjem na plošči. Za razliko od prve vaje, kjer smo razmazali kulturo (spread plate), bomo na tej vaji kulturo nakapljali brez razmazovanja (drop plate) in prešteli zrastle kolonije (CFU) na mestu kaplje. Seveda je potrebno rezulate odbrati primerno hitro, dokler so kolonije še drobne, sicer se prerastejo ena z drugo. Generacijski ali podvojevalni čas

V eksponentni fazi se celice delijo v konstantnih intervalih. V določenem času se torej populacija podvoji. Povprečni podvojevalni čas lahko določimo iz rastne krivulje, ki jo prikažemo na semilogaritemskem diagramu. Izvedba: Razdelitev v podskupine: Asistent naj vas razdeli v 6 podskupin. Tri podskupine se bodo ukvarjale s kulturo Salmonella typhymurium, tri s kulturo Escherichia coli. Vsaka podskupina inkubira vzorec pri svoji temperaturi.:

Podskupina 1 4°C


Podskupina 4 4°C Podskupina 5 28°C Podskupina 6 37°C a) Inkubacija, merjenje OD in priprava redčitvene vrste Nacepite 1 ml kulture bakterijskih celic v sveže termostatirano (37 °C) tekoče gojišče LB v erlenmajerici (50 ml) ter daj na stresanje v termostatirani prostor (37 °C) na 150 obratov / min. V časovnih intervalih, kot so navedeni v tabeli odvzemite aseptično 100 μL vzorca in ga dajte v 0,9 ml sterilne fiziološke raztopine, da boste lahko pripravili redčitveno vrsto (dve ponovitvi). Istočasno v epruvetko erlenmajerice previdno pretočite kulturo in izmerite absorbanco (oz. OD) v fotometru pri λ = 650 nm. Še preden pomerite OD dobro poglejte epruvetko erlenmajerice. V primeru prisotnosti zračnih mehurčkov počakajte nekaj trenutkov, da izginejo. Če je erlenmajerica zarosena, jo previdno

11

I. Dogša,T. Danevčič, B. Stres, Š. Höfferle, I. Mandić-Mulec Mikrobiološko- molekularni- praktikum – laboratorijske vaje za biotehnologe. Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, Katedra za mikrobiologijo, 2008. obrišite s papirnato brisačko. Delajte hitro in vrnite erlenmajerico na stresalnik kakor hitro je to mogoče. S tem želite doseči, da bi se rastni pogoji v inkubirani kulturi spremenili čim manj. Z uporabo aseptične tehnike pripravite serijo mikrocentrifugirk z 0,9 mL sterilne fiziološke raztopine v dveh ponovitvah (redčitvena vrsta). Delajte ob ognju in ožigaje pinceto pomočeno v etanol, s katero jemljete sterilne mikrocentrifugirke iz kozarca. Pripravite 10-kratne redčitve ustrezno tabeli 2. b) Nacepljanje (drop plate) Za vsako redčitveno vrsto v dveh ponovitvah dobite prav tako 2 plošči s trdnim gojiščem LB. S flomastrom razdelite vsako ploščo na spodnji strani na četrtine. Vsako četrtino označite z ustrezno redčitvijo, kot je podano v tebeli 2 pod »nacepljene redčitve«. Na vsako četrtino nakapljajte po 3-krat 10 μL ustreznih redčitev iz redčitvene vrste na plošče in sicer tako, da se nakapljane kaplje ne bodo stikale. Plošče inkubirajte pri 37°C. Naslednji dan prešteje zrasle kolonije in izračunajte CFU/ml gojišča. Števne so samo tiste kaplje, kjer je število kolonij med 3-30. Narišite tudi grafa, kjer nanašate absorbanco v odvisnosti od časa in absorbanco v odvisnosti od CFU/ml. Izračunajte rastno konstanto za zaprt sistem in generacijski čas za dva testna organizma Salmonella typhimurium (skupine I-III ) in Escherichia coli (skupine IV-VI) iz spodnjih enačb ter iz grafa. Primerjajte obe vrednosti. logX2 - logX1 1 k = tgen = 0.301 . t k TABELA 2: Motnost in število enot, ki na trdnem gojišču tvorijo kolonije, za tekoče kulture inkubirane pri različnih temperaturah. Temperatura inkubacije kulture: 4°C Kultura: podskupina 1 : E. coli; podskupina 2 : S. typhymurium čas inkubacije nacepljene redčitve A660 CFU (min) 0 10-2 10-3 10-4 10-5

30 60 10-2 10-3 10-4 10-5

90 120 150 10-2 10-3 10-4 10-5

180

210 10-2 10-3 10-4 10-5

240 270 300 10-2 10-3 10-4 10-5

12

I. Dogša,T. Danevčič, B. Stres, Š. Höfferle, I. Mandić-Mulec Mikrobiološko- molekularni- praktikum – laboratorijske vaje za biotehnologe. Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, Katedra za mikrobiologijo, 2008. Temperatura inkubacije kulture: 28°C Kultura: podskupina 3 : E. coli; podskupina 4 : S. typhymurium čas inkubacije nacepljene redčitve A660 CFU (min) 0 10-2 10-3 10-4 10-5

30 60 10-3 10-4 10-5 10-6

90 120 150 10-4 10-5 10-6 10-7

180 210 10-4 10-5 10-6 10-7

240 270 300 10-4 10-5 10-6 10-7

Temperatura inkubacije kulture: 37°C Kultura: podskupina 5 : E. coli; podskupina 6 : S. typhymurium čas inkubacije nacepljene redčitve A660 CFU (min) 0 10-2 10-3 10-4 10-5

30 60 10-3 10-4 10-5 10-6

90 120 150 10-4 10-5 10-6 10-7

180 210 10-4 10-5 10-6 10-7

240 270 300 10-4 10-5 10-6 10-7

PRIPRAVA ZA NASLEDNJO VAJO: Za vajo 3 si izberi po dva seva na ploščah nacepljenih v vaji 1 - CFC. Z ezo z aseptično tehniko ob gorilniku ju precepi na trdno gojišče R2A, na katerem bosta rasla do naslednjega tedna. Takrat ju boš uporabil za vaji 3d in 4. Polovica skupine naj izbere seve aktivnega blata, polovica pa seve iz tal. Zapišite si tudi iz katrega okolja in inkubacijske temperature seva izhajata.

13

I. Dogša,T. Danevčič, B. Stres, Š. Höfferle, I. Mandić-Mulec Mikrobiološko- molekularni- praktikum – laboratorijske vaje za biotehnologe. Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, Katedra za mikrobiologijo, 2008. VAJA 4: Sterilizacija, inhibicija, rezsitenca, kompeticija

VAJA 4a : Sterilizacija, aseptična tehnika

Mikroorganizmi so v naravnih okoljih splošno razširjeni. Iz tega sledi, da je potrebno za namnoževanje in proučevanje odbranega organizma v čisti kulturi, iz uporabljenih substratov predhodno odstraniti avtohtone mikroorganizme oziroma odstraniti njihovo živost. Postopkom uničenja živosti mikroorganizmov ali njihove odstranitve iz substratov pravimo sterilizacija. Zaradi svoje majhnosti in enostavnega prenosa po zraku, vodi, s prahom, s kožo ali z laboratorijsko opremo, je potrebno ves čas dela z odbranim mikroorganizmom preprečevati vnos drugih mikroorganizmov iz okolja (preprečevanje kontaminacije). Postopkom, ki preprečujejo kontaminacijo sterilnega rastnega medija z mikroorganizmi, pravimo aseptična tehnika. Aseptična tehnika zajema delo v sterilnem okolju: v aseptičnih komorah, delo ob plinskem gorilniku in uporabo sterilnega materiala.

Sterilizacija je proces, s katerim uničimo živost celic ali odstranimo vse žive celice.

Sterilnost je stanje sistema v katerem ni živih celic. Načinov sterilizacije je več: suha sterilizacija (ožiganje s plamenom, vroč zrak 140-180°C za 2-3 ure); vlažna sterilizacija (standardno avtoklaviranje 1.3 bar, 121.1°C, 15 min, ali pa 110°C, 30 min), tindalizacija (100°C, 30 min, 3x v presledku 24 ur) filtracija (velikost por < 0.2 μm), zaplinjanje (formaldehid, etilen oksid); radiacija (UV sevanje, γ žarki). Razen filtracije se vse ostale sterilizacijske metode dajo matematično opisati s hitrostjo odmiranja mikrobne populacije. Število mikroorganizmov se zmanjšuje eksponencialno s kinetiko reakcije prvega reda (podobno kot kemijske reakcije prvega reda, N = No . e-kt). Običajno se za matematičen opis procesa uporablja parameter D (decimalni redukcijski čas), ki pomeni čas potreben za zmanjšanje mikrobne populacije pri izbrani temperaturi za 10-krat. Vrednost D dobimo grafično, če nanesemo logaritem preživelih mikroorganizmov v odvisnosti od časa sterilizacije. O uspešni sterilizaciji govorimo tedaj, ko je verjetnost, da bomo našli preživeli organizem manjša od 10-6. Preživelost organizma določamo z gojitvenimi metodami. Včasih lahko pride do odstopanja od logaritemskega zmanjšanja mikrobne populacije (različna odpornost, agregiranost celic, sestava gojišča). V takih primerih standardizirani postopki ne bodo zagotovili sterilnega materiala in je potrebno uspešnost sterilizacije preveriti z odsotnostjo rasti mikroorganizmov. Zaradi dolgotrajnega postopka ugotavljanja preživelosti mikroorganizmov (nekaj ur do nekaj tednov) si pomagamo z indikatorji sterilnosti (negativen test z indikatorjem ni zagotovilo da je material sterilen!). Kot biološki indikator uporabimo spore mikroorganizmov, ki so toplotno zelo odporne (npr. Bacillus stearotermophilus, Bacillus subtilis). Sterilizacijo smatramo za uspešno, če spore po prenosu na izbrano gojišče ne vzkalijo in mikroorganizem ne začne rasti. Pri postopku sterilizacije z avtoklaviranjem pa lahko uporabimo kemične indikatorje, ki se talijo pri določeni temperaturi (jantarjeva kislina) ali pa spremenijo barvo pri določeni temperaturi (avtoklavirni trakovi).

14


-7-6-5-4-3-2-1012345

0 1 2 3 4 5 6

čas (min)

Log

štev

ila p

reži

velih

cel

ic

D parameter

Slika 3: Eksperimentalna določitev D parametra in verjetnost preživetja

Število živih mikroorganizmov lahko zmanjšamo tudi s postopkom pasterizacije.

Pasterizacija ni sterilizacija! Uporablja se za mleko, pivo, razne sadne napitke. Pri pasterizaciji segrejemo snov na 60 do 80 oC za nekaj sekund do nekaj minut. Na ta način inaktiviramo encime in uničimo večino mikroorganizmov. Če pasteriziran material hranimo pri nižji temperaturi (4 oC) je zaradi zmanjšanega števila mikroorganizmov aktivnost zmanjšana in lahko pasterizirani substrat ohranimo dlje časa nespremenjen.

Mikrobno rast lahko kontroliramo tudi s kemijskimi sredstvi. Antimikrobna sredstva

zaustavijo rast (statična sredstva) ali pa ubijejo mikroorganizme (cidna sredstva). Glede na vrsto mikroorganizma ločimo bakteristatična, fungistatična, algistatična oziroma baktericidna, fungicidna ali algicidna sredstva. Razlika med bakteristatičnim in baktericidnim sredstvom je velikokrat odvisna od koncentracije. Pri majhni koncentraciji je neko sredstvo lahko bakteristatično pri višji koncentraciji pa baktericidno. Izvedba: Razdelitev v podskupine: Asistent naj vas razdeli v 6 podskupin. Vsaka podskupina bo preskusila po eno stresno okolje za mikrobe.

15


Obdelovanje čiste kulture: Vsaka podskupina prejme po eno epruveto s 5 mL gojišča PKE in jo označi. Z avtomatsko pipeto vanjo nacepi po 0,1 ml testne čiste kulture Serratia marcescens.

Nacepljena gojišča obdelujte glede na podskupino:

Podskupina 1: epruveto z nacepljeno čisto kulturo inkubiraj aerobno 7 dni pri 28 oC; Podskupina 2: epruveto z nacepljeno čisto kulturo avtoklaviraj v avtoklavu 1.3 bar, 121 oC, 15 min in jo po končanem avtoklaviranju inkubiraj aerobno 7 dni pri 28 0C; Podskupina 3: epruveto z nacepljeno čisto kulturo pasteriziraj 30 sek v vodni kopeli na 60 oC in jo po končani pasterizaciji inkubiraj aerobno 7 dni pri 28 oC; Podskupina 4: epruveto z nacepljeno čisto kulturo segrevaj 60 sek v vodni kopeli ogreti na 100 oC in jo nato inkubiraj aerobno 7 dni pri 28 oC; Podskupina 5 epruveto z nacepljeno čisto kulturo segrevaj 5 min v vodni kopeli ogreti na 100 oC in jo nato inkubiraj aerobno 7 dni pri 28 oC; Podskupina 6 vsebino iz epruvete z nacepljeno čisto kulturo filtriraj skozi sterilni 0.2 μm filter v sterilno epruveto. Filtrat aseptično zamaši in inkubiraj aerobno 7 dni na 28 oC. Po inkubaciji, najbolje naslednji dan, preveri kje je prišlo do pojava rasti (motnost gojišča). Razloži rezultate.

Tabela 3: Rast mikroorganizmov v gojišču PKE, po predhodni termični ali mehanski obdelavi vzorcev.

Obdelava vzorca Pričakovan rezultat

Rezultat

Brez obdelave Avtoklaviranje 30 sek 60oC 60 sek 100oC 5 min 100oC Filtriranje

16

I. Dogša,T. Danevčič, B. Stres, Š. Höfferle, I. Mandić-Mulec Mikrobiološko- molekularni- praktikum – laboratorijske vaje za biotehnologe. Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, Katedra za mikrobiologijo, 2008. VAJA 4b: Minimalna inhibitorna koncentracija protimikrobne snovi (MIK)

Z minimalno inhibitorno koncentracijo (MIK) vrednotimo protimikrobno aktivnost kemijskega sredstva. Ugotavljamo najmanjšo količino snovi, ki je potrebna za preprečevanje rasti testnega organizma. MIK ni absolutna vrednost, ampak je odvisna od testnega organizma, sestave gojišča ter dejavnikov okolja kot so temperatura, pH, prezračevanje in čas inkubacije.

Izvedba: Razdelitev v podskupine: Asistent naj vas razdeli v 6 podskupin. Po tri skupine bodo preskusile protimikrobno sredstvo Spitaderm, tri pa Izosan G. Priprava in nacepitev mikrotitrskih ploščs protimikrobnim sredstvom Vsaka skupina prejme po eno sterilno mikrotitrsko ploščo s pokrovom. Ne odpiraj. Na multikanalni pipeti nastavi volumen na 100uL (preveri natančen volumen na vajah). V sterilno petrijevko nalij del tekočega gojišča PKE s TTC (2,3,5, trifeniltetrazolijev klorid). TTC se ob prisotnosti metabolno aktivnih mikroorganizmov reducira in dobi rdečo barvo. Z multikanalno pipeto prenesi v vsako jamico mikrotitrske plošče 100 uL tekočega gojišča PKE s TTC. Ko končaš, pokrij mikrotitrsko ploščo s pokrovom. V sterilno petrijevko prelij del 2 % raztopine Izosana G (dezinfekcijsko sredstvo). Na multikanalni pipeti nastavi volumen na 100 μL (preveri natančen volumen na vajah). Zajemi raztopino 2 % Izosana G s previdnim pipetiranjem in jo prenesi v prvo vrsto mikrotitrske plošče z gojiščem PKE. Odvrzi tipse, vzemi sterilne in kontrolirano premešaj vsebino luknjic s počasnim pipetiranjem gor in dol (3x). Nato vsebino prenesi v naslednjo vrsto in odvrzi tipse. Z nadaljnimi prenosi razredči raztopino do predzadnje vrste. V zadnjo vrsto NE prenašaj razredčenih raztopin Izosana G. Δ Izračunaj, kakšne koncentracije Izosana G so v stolpcih od 1 -12 mikrotitrske plošče? V sterilno stekleno petrijevko prelij del testne kulture Serratia marcescens in na multikanalni pipeti nastavi volumen na 20 μL (preveri natančen volumen na vajah). S tako nastavljeno multikanalno pipeto zajemi del čiste testne kulture in jo najprej nacepi v stolpec 12 (brez Izosana G). Nato z istimi nastavki zajemi nov del testne kulture in jo nacepi v stolpec 11 ter tako do stolpca 1.

Δ Izračunaj, kakšne koncentracije Izosana G so v stolpcih od 1 -12 mikrotitrske plošče po nacepljanju?

17

I. Dogša,T. Danevčič, B. Stres, Š. Höfferle, I. Mandić-Mulec Mikrobiološko- molekularni- praktikum – laboratorijske vaje za biotehnologe. Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, Katedra za mikrobiologijo, 2008. Nacepljeno in označeno serijo gojišč z različno koncentracijo Izosan G inkubiraj 1 dan pri 28 oC.

Po končani inkubaciji ugotovi, kje je prišlo do rasti mikroorganizmov (motnost in/ali pojav rdeče barve) in določi minimalno inhibitorno koncentracijo protimikrobne snovi.

Tabela 4: Rast Serratia marcescens na gojišču PKE z različnim odstotnim deležem (%)Izosana G Stolpec 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 % Izosan G rast bakterije

18

I. Dogša,T. Danevčič, B. Stres, Š. Höfferle, I. Mandić-Mulec Mikrobiološko- molekularni- praktikum – laboratorijske vaje za biotehnologe. Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, Katedra za mikrobiologijo, 2008. VAJA 4c: Bakteriocini

Mnoge bakterije izdelujejo snovi, ki zavirajo ali preprečujejo rast drugim vrstam mikroorganizmov. Bakteriocini so proteinski produkti s protimikrobnim delovanjem. Razlikujejo se v velikosti, mehanizmih delovanja, spektru protimikrobne aktivnosti in mehanizmih imunosti. Njihovo protimikrobno delovanje je omejeno na ozko sorodne bakterijske vrste in je največkrat posledica nastanka por v celični membrani občutljivih celic. Dve glavni razliki, ki bakteriocine razlikujejo od antibiotikov, pa sta specifičnost protimikrobne aktivnosti in ribosomska sinteza v času aktivne rasti. Antibiotiki so sekundarni metaboliti, ki nastajajo v stacionarni fazi rasti.

Protimikrobne učinkovine predstavljajo prednost za bakterijo pri tekmovanju za hranila v okolju, kjer se bakterija nahaja. Poimenujemo jih po vrsti organizma, ki jih proizvaja (E. coli - kolicin, Bacillus subtilis – subtilizin, Vibrio – vibricin).

Pri testih, s katerimi sledimo protimikrobno aktivnost, je pomemben izbor indikatorskega organizma, gostota kulture in difuzijska sposobnost bakteriocina. Indikatorsko kulturo lahko vzdržujemo v tekočem gojišču ali na trdnih gojiščih, kamor položimo diske z bakteriocinom. Aktivnost je določena s conami zbistritve indikatorske kulture v mm.

Pri bakteriji Vibrio sp., ki je bil izoliran iz morske vode v Piranskem zalivu, je bila opažena protimikrobna aktivnost na nekatere bakterijske vrste, pravtako izolirane iz tega okolja. Učinkovino bakterija izloča v gojišče. Izvedba:

Razdelitev v podskupine: Asistent naj vas razdeli v 6 podskupin. Vsaka skupina prejme po eno posodico z diski, indikatorskim sevom in epruveto z izrabljenimi gojišči. Vsak študent dobi svojo PKS ploščo

Določanje protimikrobne aktivnosti z difuzijskim testom:

Celice Vibrio sp. DSM 14379, namnožene do začetka prehoda v stacionarno fazo rasti (8ur), odstranimo s centrifugiranjem in supernatant prefiltriramo skozi 0,2 μm membranski filter v sterilno posodo. Filtrat označimo z IG (izrabljeno gojišče, ki vsebeuje bakteriocin).

Protimikrobno aktivnost določimo z difuzijskim testom na trdnem gojišču.

Indikatorsko kulturo 5A (čista kultura izolirana iz morja) razmažemo (100 μl) na ploščo PKS. Nato položimo 5 sterilnih papirnatih diskov (premer ~ 7mm) na površino in dodamo na diske po 3, 5, 7, 10, 15 μl IG. Inkubiramo en teden pri 28°C in nato izmerimo bistro cono okrog diskov.

19

I. Dogša,T. Danevčič, B. Stres, Š. Höfferle, I. Mandić-Mulec Mikrobiološko- molekularni- praktikum – laboratorijske vaje za biotehnologe. Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, Katedra za mikrobiologijo, 2008. Rezultat: Tabela 5: Rezultati difuzijskega testa na trdnem gojišču za vse študente Izrabljeno gojišče IG (3μl) IG (5μl) IG (7μl) IG (10μl) IG (15μl) Bistra cona (mm) Bistra cona (mm) Bistra cona (mm) Bistra cona (mm) Bistra cona (mm) Bistra cona (mm) Bistra cona (mm) Bistra cona (mm) Bistra cona (mm) Bistra cona (mm) Bistra cona (mm) Bistra cona (mm) Bistra cona (mm) Bistra cona (mm) Bistra cona (mm) Bistra cona (mm) Bistra cona (mm) Bistra cona (mm)

20

I. Dogša,T. Danevčič, B. Stres, Š. Höfferle, I. Mandić-Mulec Mikrobiološko- molekularni- praktikum – laboratorijske vaje za biotehnologe. Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, Katedra za mikrobiologijo, 2008. VAJA 4d: Naravna odpornost na antibiotike

Leta 1928 je škotski znanstvenik Alexander Fleming po naključju odkril antibiotik penicilin. Opazil je plesen, ki je rasla na bakterijski kulturi v njegovem laboratoriju in zaznal čisto cono okoli plesni, saj bakterijske celice tam niso rasle. Nadaljne študije so pokazale, da ta plesen tvori nekatere zaščitne spojine, ki inhibirajo ali uničijo bakterije. Plesen so identificirali kot Penicillium notatum in zaščitno spojino kot penicilin. Temu so sledila odkritja drugih organizmov, ki tudi tvorijo podobne spojine, ki bodisi uničujejo ali inhibirajo bakterijsko rast. Te spojine so poimenovali antibiotiki, ker imajo letalni vpliv na mikroorganizme. Antibiotiki se uporabljajo za preprečevanje bakterijsko pogojenih bolezni pri človeku. Zaradi njihove prekomerne uporabe za zdravljenje ljudi in živali so bakterije mutirale in razvili so se novi sevi odporni na velik spekter antibiotikov. Odpornost na antibiotike je zato velik problem sodobne medicine. Antibiotike delimo v skupine glede na njihove biosintetske poti in prekurzorje:

- antibiotiki iz aminokislinskih prekurzorjev sintetizirani po neribosomski sintetski poti (β-laktamski antibiotiki, ciklični peptidi, lipopeptidi) ali po normalni ribosomski sintezi (nizin)

- antibiotiki iz sladkorjev (aminoglikozidi) - antibiotiki iz maščobnih kislin (poliketidni anibiotiki kot tetraciklin, makrolidi,

polieni). Antibiotike delimo tudi glede na način oziroma mehanizem delovanja na bakterijske celice:

- delovanje na celično steno (bacitracin in vankomicin preprečujeta sintezo peptidoglikana; penicilin in cefalosporin preprečujeta povezave peptidoglikanskih molekul in s tem tvorbo celične stene)

- delovanje na ribosomsko proteinsko sintezo v celici (kloramfenikol, eritromicin, streptomicin, tetraciklin, gentamicin, streptomicin – antibiotiki s širokim spektrom delovanja)

Rezistenca na antibiotike je velik problem sodobne medicine. Zaradi prekomerne uporabe antibiotikov za zdravljenje ljudi in živali so v npr. bolnišnicah nastali sevi, odporni na velik spekter antibiotikov. Vendar pa tudi v okoljih, kjer antibiotikov niso uporabljali, obstajajo sevi z multiplo rezistenco. To kaže, da obstajajo tudi naravni viri generiranja rezistence na antibiotike, kar ni posebej presenetljivo, saj so do obdobja kemične modifikacije aktivnih spojin, večino uporabljanih antibiotikov pridobili iz organizmov izoliranih iz okolja. Izvedba:

Vsak študent je v vaji 2 precepil dva izbrana seva na ploščo agarja R2A. Tako smo pridobili 16 sevov iz vzorca tal in 16 sevov iz vzorca aktivnega blata.

21


22

Vsak študent dobi sedem plošč R2A, od katerih vsaka vsebuje drug antibiotik. Vsako ploščo predelite na polovico in vsako polovico označite s številko seva, ki ga nameravate nacepiti na izbrano označeno polovico plošče. Nato z aseptično tehniko ob gorilniku z ezo precepite izbrana seva. Preverite, da se oznake ujemajo. Plošče bomo inkubirali v temi pri sobni temperaturi 28 °C. V naslednjih dneh bomo opazovali njihovo rast in ugotavljali ali je kateri sev odporen na več antibiotikov.

Pregled uporabljenih antibiotikov: Koncentracije antibiotikov v gojišču so bile 50 mg / L gojišča, razen za mitomicin C (0,4mg / L) in trimetoprim (200 mg / L). Amplicilin – ovira zadnjo fazo sinteze celične stene Eritromicin – inhibira podaljševanje v stopnji transpeptidacije pri sintezi

proteinov Kanamicin – z vezavo na malo podenoto ribosomov (30S) ovira sintezo

proteinov Mitomicin C – inhibira sintezo DNA Streptomicin – veže na malo podenoto ribosoma in povzroča napačno branje

mRNA Tetraciklin – blokira vezavno mesto amino-acil tRNA in s tem inhibira

podaljševanje proteina Trimetoprim – inhibira reduktazo dihidro - folne kisline

. Danevčič, B. Stres, Š. Höfferle, I. Mandić-Mulec Mikrobiološko- molekularni- praktikum – laboratorijske vaje za biotehnologe. Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, Katedrikrobiologijo, 2008.

a za m

23

Odpornost na antibiotik Multiple rezistence

Sev Skupina Temperatura Amplicilin Trimetoprim Eritromicin Kanamicin Mitomicin C Streptomicin TetraciklinNa 1

Na 2

Na 3

Na 4

Na 5

Na 6

Na 7

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32

I. Dogša,T


VAJA 4e: Sinteza sideroforov Mikroorganizmi v svojem okolju tekmujejo za nutriente, ki so prisotni v sledeh. Sposobnost odtegovanja železa drugim organizmom pomeni selektivno prednost pred ostalimi. Predajanje s sideroforom keliranega železa fitosideroforom z višjo konstanto vezave rastlinskih celic pomeni dodatno prednost za rastlino in bakterijo v tleh. Bakterija v tleh onemogoča ali vsaj zavira razvoj drugih mikroorganizmov (tudi patogenih) v bližini korenine, zato je gostota mikrobnih celic tam manjša, hkrati pa je za bakterijo s siderofori na voljo večja količina izločenih rastlinskih eksudatov. Sposobnost keliranja je odvisna tudi od količine dostopnega železa v okolju. Kjer je železa dovolj, postane nek drug faktor bolj limiten od dostopnosti železa. Za primerjavo sposobnosti keliranja železa izoliranih bakterij uporabimo seve izolirane v vaji 1. V vaji 2 smo jih precepili na trdno gojišče PKE, v vaji 3d smo analizirali njihovo odpornost na antibiotike. Za vsak sev pripravite po 100 mL minimalnega sukcinatnega gojišča v erlenmajericah z vratom. Vsak študent označi dve erlenmajerici z vratom z zaporedno številko seva in nacepi sev z ustrezne plošče. Preverite, da se oznake ujemajo. Nacepljene seve inkubiramo na stresalniku v temi pri 28°C. Rast spremljamo z merjenjem OD pri 660nm. V začetku stacionarne faze posameznega seva vsak študent odvzame po 1.5ml kulture v sterilne označene epice. Po centrifugiranju 5 min 4000g supernatant shranite v čisti sterilni epici pri 4°C. V posamezne izrezane jame na modrih ploščah CAS odpipetirajte supernatant v alikvotih po 15 ul. V nekaj minutah se okrog jame razvije rumen obroč. V primeru neizrazitega obroča dodajte še en ali več alikvotov supernatanta ter izmerite največji dosežen premer nastalega obroča. Izračunajte razmerje med premerom obroča in volumnom dodanega supernatanta ter primerjajte nastala razmerja med sevi iz vzorcev tal in aktivnega blata. Seve razdelite v skupine glede na ugotovljen obseg sinteze sideroforov.

24


Tabela 7: Pregled sintetiziranih sideroforov in razmerja p/v (premer haloja glede na dodan volumen supernatanta)

Sev Skupina volumen premer razmerje p/v

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32

25


VAJA 5: Verižna reakcija s polimerazo (PCR) in preverjanje polimorfizma dolžine restrikcijskih fragmentov (RFLP) pri izoliranih okojskih sevih Uvod v molekularni del vaj Pri dosedanjih vajah ste uspešno pridobili (predpostavljamo!) čiste kolonije talnih izolatov ali izolatov aktivnega blata in preverili njihovo razlikovanje na fenotipskem nivoju (odpornost na antibiotike, morfologija kolonij, …). Pri sledečih vajah bomo poskušali določiti, ali se naši izolati med seboj razlikujejo tudi na nivoju genov. Za to bomo uporabili metodo PCR oz. verižno reakcijo s polimerazo (ang. »Polymerase Chain Reaction«) na osnovi kolonije, pri kateri bomo pomnoževali del gena za 16S rRNA. Analiza tega gena nam do določene mere omogoča razlikovanje med organizmi. Pogosto uporabljena metoda za analizo takšne raznolikosti med organizmi je PCR-RFLP. Gre za princip, kjer metodi PCR sledi preverjanje polimorfizma dolžine restrikcijskih fragmentov oz. RFLP (ang. »Restriction Fragment Length Polymorphism«). Na podlagi RFLP bomo, iz restrikcijskih profilov gena za 16S rRNA iz naših izolatov, poskušali sklepati na genetsko različnost med izolati. a.) PCR PCR je in vitro metoda za hitro pomnoževanje odseka DNA (matrična DNA), ki leži med dvema regijama z znanim nukleotidnim zaporedjem. V reakciji sodelujejo tri vrste molekul: - matrična dvoverižna DNA z odsekom, ki ga želimo pomnožiti, - začetna oligonukleotida (ang. »primer«), ki sta komplementarna vsak svojemu koncu

odseka DNA, - encim DNA-polimeraza, ki podaljšuje novo-nastajajočo verigo odseka DNA z

dodajanjem novih deoksinukleozid-trifosfatov (dNTP-jev). Reakcijska PCR mešanica vsebuje:

- Matrično DNA, - »Forward« in «reverse« začetni oligonukleotid, - mešanico vseh dNTP-jev (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), - pufer, ki zagotavlja delovanje polimeraze (+Mg2+), - termostabilno DNA polimerazo, - neobvezne dodatke za večjo specifičnost reakcije (formamid, goveji serumski

albumin – BSA). PCR reakcija je sestavljena iz zaporedja treh različnih temperatur, ki ustrezajo trem zaporednim reakcijskim stopnjam (slika 1): 1) denaturacija dvoverižne DNA do enoverižnih (~ 94 ºC); 2) prileganje oz. hibridizacija ustrezno izbranih začetnih oligonukleotidov na

komplementarno mesto enoverižnih DNA, tako da sta njuna 3`-konca obrnjena drug proti drugemu (50 – 65 ºC);

3) podaljševanje nastajajoče DNA verige od mesta vezave začetnih oligonukleotidov, s pomočjo termostabilnega encima DNA-polimeraze, z dodajanjem prostih dNTP-jev na

26


3` konec nastajajoče verige, tako da sinteza novonastale DNA vedno poteka od 5`- proti 3`-koncu verige (~72 ºC).

Omenjene tri stopnje sestavljajo en cikel. Po vsakem zaključenem ciklu dobimo iz ene molekule tarčne DNA dve molekuli, novonastala DNA pa služi kot osnova za naslednji cikel. Število tarčnih DNA molekul torej narašča eksponentno, tako da po n ciklih dobimo 2n molekul DNA.

Slika 1: Princip PCR (Cook, 2007). Za učinkovito in specifično pomnoževanje želenega odseka DNA so ključni optimalni reakcijski pogoji. Optimalna temperatura prileganja začetnih oligonukleotidov je odvisna od njihove temperature tališča, le-ta pa je odvisna od nukleotidne sestave začetnih oligonukleotidov. Za optimalno delovanje polimeraze so pomembni primerna ionska jakost, pH, prisotnost kofaktorjev v reakcijski mešanici, koncentracija encima, ter temperatura v stopnji podaljševanja, ki je odvisna od temperaturnega optimuma encima (običajno 72 °C). Ključna je tudi termostabilnost DNA polimeraze oz. njena obstojnost pri temperaturi denaturacije dvoverižne DNA (nad 90 °C). Omenjeni protein je v današnjem času pridobljen z izolacijo iz termofilne bakterije Thermus aquaticus. Obstaja več izvedb PCR, ki ponujajo široke možnosti uporabe PCR. Uporablja se za direktno kloniranje genomske DNA, analizo DNA, ki je prisotna v zelo majhnih količinah (forenzične preiskave), v diagnostičnih metodah, itd. Med drugim je metoda uporabna tudi za ugotavljanje različnosti organizmov na nivoju gena/genoma. PCR na osnovi kolonije je

27


28

metoda, pri kateri vzorčno DNA, za uporabo v PCR, na preprost način pridobimo kar neposredno iz bakterijske kolonije. Celice razkrojimo z enostavnim kratkotrajnim prekuhavanjem in pridobimo celični lizat, ki vsebuje tudi celično DNA (Colony PCR, 2007). Izvedba:

Pri teh vajah bomo s PCR na osnovi kolonije pomnoževali del bakterijskega gena za 16S rRNA, v velikosti približno 1400 bp. Ta gen pri bakterijah kodira 16S rRNA, ki skupaj s proteini sestavlja del male (30S) podenote ribosoma, ki skupaj z drugimi podenotami ribosoma opravlja funkcijo sinteze proteinov. Zaradi svoje velike razširjenosti in evolucijske ohranjenosti je gen za 16S rRNA pogosto uporabljen za določanje diverzitete bakterij ter njihove filogenetske sorodnosti in je osnova npr. za molekularno taksonomijo, sistematiko in evolucijo (Macrae, 2000). Navodila: Priprava celičnega lizata za PCR na osnovi kolonije • Vzemite sterilno 1,5 mL mikrocentrifugirko in jo označite. • V mikrocentrifugirko s pipeto dodajte 30 µL sterilne ddH2O (mQ). • Z ožgano in rahlo ohlajeno ezo postrgajte s plošče nekaj bakterijskih kolonij in jih

resuspendirajte v prej pripravljenih mikrocentrifugirkah z vodo. • Mikrocentrifugirke s suspenzijo celic segrevajte na 100 ºC, 10 min. Suspenzijo vmes 1-

krat do 2-krat premešajte s pomočjo vrtinčnega mešala. • Mikrocentrifugirke s suspenzijo bakterijskih celic dajte na led in pripravite PCR

reakcijsko mešanico. Vzorci za PCR:

• pripravljene suspenzije celic (vzorčna DNA) neznanih bakterijskih izolatov, • pozitivna kontrola - predhodno izolirani DNA čistih kultur bakterij iz rodu

Bacillus in/ali Vibrio • negativna kontrola – sterilna ddH2O namesto vzorčne DNA.

Navodila: Izvedba PCR (demonstracijska vaja) • S pomočjo preglednice 1 (na naslednji strani) izračunajte sestavo naše skupne

reakcijske mešanice in jo pripravite. Ves čas uporabljajte rokavice in sterilne pipetne nastavke!

• Pripravljeno skupno reakcijsko mešanico razdelite med skupine, tako da alikvote po 23 μL odpipetirate v sterilne 0.2 mL- PCR mikrocentrifugirke.

• Odpipetiranim alikvotom dodajte: - 2 µL prej pripravljenega celičnega lizata (tarčna DNA) - 2 µL predhodno izolirane DNA čistih kultur bakterij iz rodu Bacillus ali Vibrio

(pozitivne kontrole) - ddH2O (negativne kontrole)

• Mikrocentrifugirke s PCR mešanicami vstavite v PCR aparaturo in zaženite izbrani program. Po končanem pomnoževanju (program bo trajal približno 2 uri in pol) pomnožke shranite na -20 ºC, do analize na agaroznem gelu.

gša,T. Danevčič, B. Stres, Š. Höfferle, I. Mandić-Mulec Mikrobiološko- molekularni- praktikum – laboratorijske vaje za biotehnologe. Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, Katedra za mikrobiologijo, 2008.

29

Preglednica 1: Ključni reagenti in pogoji PCR za pomnoževanje dela bakterijskega gena za 16S rRNA. Izračunajte manjkajoče podatke!

• Vreag. v skupni reak. mešanici = Št. reak. mešanic × Vreagentov na eno reak. mešanico (na 25 μl) • *Št. reak. mešanic = • *Volumen 1 reak. mešanice = 25 μl

PCR bakterijskega gena za 16S rRNA

REAGENTI Czaložnih

raztopin

Creag. v reak. mešanici

Vreagentov na eno reak. mešanico (μl)

Vreag. v skupni reak. mešanici* (µl) Pogoji reakcije: T (°C) t (s)

sterilna ddH2O Začetna denaturacija 94 300

pufer 5 X 1 X Denaturacija 94 60

MgCl2 25 mM 2 mM Prileganje 53 60

BSA 10 μg/μl 0,2 μg/μl Podaljševanje 72 90

formamid 100 % 1 % Končno podaljševanje 72 600

mešanica dNTP 10 mM 0,2 mM Št. ciklov 35

zač. olig. 27F 10 μM 0,2 μM

zač. olig. 1406R 10 μM 0,2 μM

polimeraza 5 U/μl 1 U/25 μl vzorčna DNA 2 µl /

I. Do


b.) Agarozna gelska elektroforeza Agarozna gelska elektroforeza je standardna metoda, ki jo uporabljamo za ločevanje, prepoznavo, pa tudi čiščenje DNA/fragmentov DNA. Agaroza je linearni polimer D-galaktoze in 3,6-anhidro-L-galaktoze. Pripravimo jo tako, da trdno agarozo s segrevanjem raztopimo v elektroforeznem pufru, z ohlajevanjme pa nato pride do zamreženja in nastanka gela. Gostota gela je odvisna od koncentracije agaroze. Potovanje molekul DNA v gelu je mogoče pod vplivom električnega polja. Molekula DNA je, zaradi negativno nabitih fosfatnih skupin, nabita negativno. Zaradi negativnega naboja potuje DNA proti pozitivno nabiti elektrodi (anodi). Hitrost potovanja oz. prepotovana razdalja DNA na gelu je odvisna od več dejavnikov, in sicer velikosti molekule DNA, oblike DNA (krožna, linearna, sproščena oblika), jakosti električnega polja, sestave elektroforeznega pufra, koncentracije agaroze in dodanih interkalirajočih barvil (npr. etidijev bromid). Krajše in s tem manjše molekule se, zaradi manjšega upora, hitreje prebijajo skozi gel, v primerjavi z večjimi molekulami. Z agaroznimi geli lahko v električnem polju ločujemo molekule velikosti 100 – 50000 bp (bazni pari). Pred nanosom PCR produktov na gel, moramo le-te ustrezno pripraviti tako, da jih zmešamo z nanašalnim pufrom (glej Priloga, slika 1). Ta nam, zaradi vsebnosti barvil, med elektroforezo omogoča vizualno zasledovanje migracije DNA na gelu. Določitev približne velikosti PCR produktov po končani elektroforezi je možna le, če na gel v eno od jamic nanesemo tudi molekulski označevalec velikosti DNA, ki vsebuje fragmente DNA znanih velikosti (glej Priloga, slika 2). Za boljše razumevanje si oglejte tudi sliko 2.

Slika 2: Shema principa agarozne gelske elektroforeze

30


Vizualizacijo DNA v gelu po končani elektroforezi nam omogoča barvanje gela z etidijevim bromidom (EtBr). To je molekula, ki se vrine med baze nukleinskih kislin in se ji, pod vplivom UV svetlobe, poveča jakost fluoresciranja (v rdeče oranžnem delu vidnega spektra) v primerjavi z molekulami, ki so proste v raztopini. Vizualizacija »obarvanih« PCR produktov in slikanje gela se izvaja s pomočjo UV-transiluminatorja. Izvedba: S pomočjo agarozne gelske elektroforeze bomo preverili uspešno pomnoževanje dela tarčnega bakterijskega gena za 16S rRNA, ki se bo na gelu pokazal kot fragment velikosti približno 1400 bp (PCR produkt). Navodila: Priprava 0,8 % agaroznega gela (nujna uporaba rokavic!)

• Izračunajte, koliko agaroze potrebujemo za pripravo 0,8 % agaroznega gela v 30 mL 1X TAE pufra (Tris pufer, ocetna kislina, EDTA - etilendiamin tetraocetna kislina)

• S pomočjo merilnega valja odmerite 30 mL 1-kratnega pufra TAE, ga prelijte v erlenmajerico in mu dodajte ustrezno količino agaroze.

• Suspenzijo agaroze segrevajte v mikrovalovni pečici dokler raztopina ni popolnoma bistra. Preveliko izhlapevanje pufra lahko preprečite z uporabo vatnega zamaška. Pazite, da se ne opečete!

• Raztopino ohladite na približno 60 ºC in jo nato razlijte v prej pripravljen nosilec za gel z ustreznim elektroforeznim glavničkom. Počakajte, da se gel strdi, previdno odstranite glavniček in gelček prestavite v elektroforezno kadičko ter ga prelijte z 1X TAE pufrom.

Navodila: Nanos vzorcev na gel

• Izberite si poljubno zaporedje oz. sistem nanosa vzorcev na gel in si ga zapišite. • Na odrezanem koščku parafilma zmešajte približno 1 µL nanašalnega pufra (kapljica)

s 5 µL pomnožka PCR / pozitivne kontrole / negativne kontrole. • S pipeto previdno nanesite vzorce v jamice gela. V zadnjo jamico dodajte 5 µL

molekulskega označevalca velikosti DNA (Gene Ruler DNA Ladder Mix, 100 – 10000 bp).

• Pokrijte elektroforezno kadičko s pokrovom in nastavite napetost na 75 V. Elektroforeza naj teče 30 – 45 min.

Navodila: Barvanje in analiza gela

• EtBr je potencialno kancerogen, zato uporabljajte rokavice! • Gelček za 10 min prenesite v banjico z vodno raztopino etidijevega bromida (EtBr). • Gelček za 10 min prestavite v banjico z dH2O, da se spere odvečni EtBr. • Vizualizacija in fotografiranje gelčka poteka s pomočjo transiluminatorja pod UV

svetlobo. Komentirajte rezultate! V primeru uspešno pomnoženega dela gena za 16S rRNA sledi RFLP.

31


c.) RFLP Polimorfizem dolžine restrikcijskih fragmentov je pogosto uporabljena metoda za hitro identifikacijo organizmov na osnovi sprememb oziroma razlik na specifičnem delu DNA (Hill, 2008). Princip temelji na uporabi specifičnega restrikcijskega encima, ki je v naravnem sistemu del prokariontskega obrambnega sistema pred vdorom tuje DNA. Restrikcijska endonukleaza, ki jo izolirano uporabljamo za RFLP, reže dvoverižno DNA specifično v ali ob svojem prepoznavem nukleotidnem zaporedju (slika 3). Za uspešno restrikcijo moramo tudi tu vzpostaviti optimalne pogoje za delovanje encima. Optimalen pH, ionska jakost in kofaktorji so zagotovljeni z uporabo pufra, ki ga ponavadi kupimo skupaj z encimom.

Slika 3: Princip RFLP Prepoznavno zaporedje restrikcijskega encima se v odseku DNA lahko pojavlja enkrat ali večkrat, lahko pa se tudi ne pojavlja, zato je dolžina fragmentov po restrikciji odvisna od nukleotidnega zaporedja DNA, ki jo režemo. Organizmi z različnim nukleotidnim zaporedjem v preiskovanem genu (odseku DNA) bodo, po rezanju s specifičnim restrikcijskim encimom, na gelu kazali različne velikosti restrikcijskih fragmentov oz. različne restrikcijske profile (slika 4).

Slika 4: Primer PCR-RFLP profilov bakterij na agaroznem gelu RFLP nam omogoča ločevanje posameznikov na genskem nivoju, to je npr. s polimorfizmom specifičnih genskih markerjev (test starševstva, prisotnost mutacij v genih, ...). Poleg tega se ga pogosto uporablja tudi za enostavno določanje razlik v bakterijskem genu za 16S rRNA. Različni restrikcijski profili namreč omogočajo razlikovanje tudi na nivoju sevov.

32


Izvedba: Pri tej vaji bomo prej pomnoženi del gena za 16S rRNA rezali z restrikcijskim encimom HaeIII (BsuRI). Preglednica 2: Lastnosti restrikcijskega encima HaeIII (Herzog-Velikonja in Gruden, 2000).

Ime encima Izvor Zaporedje in mesto rezanja Tipi koncev, po rezanju

HaeIII (BsuRI) Haemophilus aegyptius

GG^CC

CC^GG topi

Navodila: Priprava restrikcijske mešanice

• V sterilni 1,5 mL mikrocentrifugirki zamešaj ustrezno skupno restrikcijsko mešanico. Glej preglednico 3 in jo dopolni!

• Restrikcijsko mešanico razdeli med prej pripravljene sterilne 1,5 mL mikrocentrifugirke (alikvoti po 15 µL).

• Vsakemu alikvotu dodaj 15 µL ustreznega DNA pomnožka. • Restrikcijske mešanice na kratko centrifugiraj, jih zloži na stojalo in čez noč inkubiraj

pri 37 ºC. • Po končanem rezanju inaktiviraj delovanje restrikcijskega encima z 20 min inkubacijo

pri 80 ºC. Preglednica 3: Sestava restrikcijske mešanice. Dopolni preglednico.

Reagent Vreagentov na 30 µL mešanico* (µL)

Vreagentov za skupno restr. mešanico

sterilna ddH2O (mQ) 11 10X pufer R 3 encim HaeIII (10U/ µl) 1 / pomnožek PCR 15 Skupni volumen 30

*Opombe: • 15 µL vsake restrikcijske mešanice predstavlja pomnožek PCR, ki ga dodamo po

tem, ko skupno restrikcijsko mešanico že razdelimo na alikvote po 15 µL. • Št. restr. mešanic = _______ • Volumen 1 restr. mešanice = 30 µL

Po končani restrikciji bomo restrikcijske profile naših vzorcev primerjali na 2,5 % agaroznem gelu. Večja zamreženost gela nam bo omogočila lepše ločevanje manjših fragmentov DNA, kakršne pričakujemo po restrikciji. Navodila: Agarozna gelska elektroforeza restrikcijskih fragmentov in analiza restrikcijskih profilov

• Pripravi 2,5 % agaroznega gela (v 60 mL pufra 1X TAE) • Celotnemu volumnu restrikcijske mešanice (30 µL) dodaj 6 µL nanašalnega pufra

(»6X loading dye«), s pipeto dobro premešaj in naloži v luknjice že vnaprej pripravljenega 2,5 %- agaroznega gela.

33


• V zadnjo luknjico dodaj 10 µL molekulskega označevalca velikosti DNA (Gene Ruler 100 bp Ladder) Elektroforeza naj poteka pri 60 – 70 V. •

• Po končani elektroforezi gelček pobarvaj z EtBr. Zaradi večje debeline in zamreženosti gela podaljšaj čas barvanja na 20-30 min, ravno tako tudi čas spiranja gelčka v dH2O.

• Slikaj gel in komentiraj rezultate!

34


PRILOGE a.) Gelska elektroforeza

Slika 1: Vsebnost in migracija barvil v nanašalnem pufru (»6x DNA Loading Dye«, Fermentas) za vizualno zasledovanje potovanja DNA med elektroforezo (6x DNA…, 2008). a)

b)

Slika 2: Pri agarozni gelski elektroforezi uporabljeni molekulski označevalci velikosti DNA. a) Molekulski označevalec Gene RulerTM DNA Ladder Mix (0.5 mg DNA/mL, 1-odstotni agarozni gel) (Gene Ruler..., 2008), b) Molekulski označevalec 100 bp (0,2 mg DNA/mL, 1,7-odstotni agarozni gel) (Gene Ruler 100 bp, ...2008)

35


b.) Sestava gojišč Fiziološka raztopina: NaCl 9 g Dvoda 1000 mL Agar R2A: Kvasni ekstrakt 0,5 g Kisli hidrolizat kazeina 0,5 g Glukoza 0,5 g Škrob 0,5 g K2HPO4 0,3g Na piruvat 0,3 g Pankreatski hidrolizat kazeina 0,25g Pepton 0,25 g MgSO4 0,024 Agar 15 g Dvoda 1000 mL pH 7,2 LB: Tripton 10g Kvasni ekstrakt 5g NaCl 5g Dvoda 1000 mL Agar LB: Tripton 10g Kvasni ekstrakt 5g NaCl 5g agar 15 g Dvoda 1000 mL Agar PKE: Pepton 6 g kvasni ekstrakt 3 g agar 15 g Dvoda 1000 mL PKE + TTC (0,01%): Pepton 6 g kvasni ekstrakt 3 g TTC 0,1 g Dvoda 1000 mL

36


Agar PKS: Pepton 6 g kvasni ekstrakt 3 g NaCl 30 g Agar 15 g Dvoda 1000 mL Minimalno sukcinatno gojišče: K2HPO4 6 g KH2PO4 3 g (NH4) 2SO4 1 g MgSO4 * 7H2O 0,2 g Sukcinat 4 g Ddvoda 1000 ml pH 7.1 plošče CAS: raztopina a: CAS-S 60,5 mg v 50 ml vode, Fe (III) 10 ml = 1 mM FeCl3 * 6H20, HCl 10 mM HDTMA vmešali 72,9 mg v 40 ml ddvode. raztopina b: Agaroza 10 g Pipes 30.24 g dvode 900 ml NaOH 12 g 50 % (W/v) za končni pH 6,8 Obe raztopini smo avtoklavirali v ločenih posodah. Med ohlajanjem smo raztopini zmešali na mešalu in razlili v plošče po 20 ml. V vsako ohlajeno ploščo smo izvrtali štiri luknje premera 5 mm in jih shranili pri 4°C.

37


LITERATURA 6X DNA Loading Dye. 2008. Burlington, Fermentas (februar 2008)

http://www.fermentas.com/catalog/electrophoresis/6xloadingsdye.htm (marec 2008): 2 str.

Atlas, R.M., Bartha, R., (1998) Microbial ecology; Fundamentals and applications, fourth

edition, Benjamin/Cumming Science Publishing, Menlo Park. Bartlett J.M.S., StirlingD. 2003. PCR protocols. 2nd ed. Totowa, New Jersey, Humana Press:

545 str. Cappuccino, J.G., Sherman, N., (1996) Microbiology; A Laboratory Manual, Fourth Edition,

The Benjamin, Cummings Publishing Company, Menlo Park. Cook S. 2007. Molecular biology methods (avgust 2007) http://www.steve.gb.com/images/science/pcr.png (marec 2008): 1 str. Colony PCR. 2007. PCR station (2007) http://www.pcrstation.com/colony-pcr/ (marec 2008): 5 str. GeneRuler™ and O'GeneRuler™ DNA Ladders. 2008. Burlington, Fermentas (februar 2008) http://www.fermentas.com/catalog/electrophoresis/generulers.htm (marec 2008): 14 str. GeneRuler™ 100 bp Ladder, Ready to use. 2008. Burlington, Fermentas (februar 2008) http://www.fermentas.com/profiles/electrophoresis/pdf/coa_sm0243.pdf (marec 2008): 2

str. Gerhard, P., Murray, R.G.E., Wood, W.A., Krieg, N.R., (1994) Methods for General and

Molecular Bacteriology, ASM Press, Washington, D.C. Herzog-Velikonja B., Gruden K. 2000. Praktikum iz molekularne biologije – teoretični del.

Ljubljana, Študentska založba: 104 str. Hill W. 2008. RFLP. US Food and drug administration, Rockville MD (marec 2008) http://vm.cfsan.fda.gov/~frf/rflp.html (marec 2008): 1 str. Harley, J. P. L. M. Prescott. 2002. Laboratory excercises in microbiology. Fifth ed. McGraw-

Hill College, New York, 466 str. Hurst, C.J., Knudsen, G.R., McInerney, M.J., Stetzenbach, L.D., Walter MV (1997) Mannual

of Environmental Microbiology, ASM Press, Washington, D.C.

38

http://www.fermentas.com/catalog/electrophoresis/6xloadingsdye.htm

http://www.steve.gb.com/images/science/pcr.png

http://www.fermentas.com/catalog/electrophoresis/generulers.htm

http://www.fermentas.com/profiles/electrophoresis/pdf/coa_sm0243.pdf

http://vm.cfsan.fda.gov/%7Efrf/rflp.html


Lawrence, J.R., Korber, D.R., Wolfaardt, G.M., Caldwell, D. E., Behavioral Strategies of Surface-Colonizing Bacteria, V: Advances in microbial ecology, 14 volumen, (Gwynfryn, J., urednik), 1995, Plenum Press New York, London, str. 1-59.

Macrae A. 2000. The use of 16S rDNA methods in soil microbial ecology. Brazilian Journal

of Microbiology, 31: 77-82. Madigan M.T. Martinko J.M., Parker J. 2003. Brock biology of microorganisms. 10th ed.

Upper Saddle River, NJ, Prentice-Hall, Pearson Education International: 1019 str. Phillips, J.A., Brock, T.D., (1991) Laboratory Manual; Biology of Microorganissms. Sixth

Edition, Prentice Hall, New Jersey. Ratledge, C. B. Krisiansen. 2006. Basic biotechnology. Third ed. Cambridge, University

press. 666 str. Rhodes, P. M., P.F. Stanbury. 1997. Applied microbial physiology. A practical approach.

Oxford University Press, New York, 270 str. Riley, M. A., J. E. Wertz. 2002. Bacteriocin diversity: ecological and evolutionary

perspectives. Biochimie, 84:357-364. Sung Heui Shin, Yong Lim, Shee Eun Lee, Nam Woong Yangand Joon Haeng Rhee. 2001.

CAS agar diffusion assay for the measurement of siderophores in biological fluids . Journal of Microbiological Methods, 44:89-95

39

univerza v ljubljani biotehniŠka fakulteta oddelek za ... · dejavniki okolja, kjer se reakcija...

Documents