universiteit gent faculteit farmaceutische...
TRANSCRIPT
UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN
Vakgroep Farmaceutische Analyse
Laboratorium voor Radiofarmacie
Academiejaar 2011-2012
Optimalisatie van de radiosynthese van [11C]-raclopride en kwaliteitscontrole volgens de normen
van de Europese Farmacopee
Dieter DE MEESTERE Eerste master farmaceutische zorg
Promotor
Prof. Dr. Apr. F. De Vos
Commissarissen
Prof. Dr. Apr. B. De Spiegeleer
Dr. K. Kersemans
UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN
Vakgroep Farmaceutische Analyse
Laboratorium voor Radiofarmacie
Academiejaar 2011-2012
Optimalisatie van de radiosynthese van [11C]-raclopride en kwaliteitscontrole volgens de normen
van de Europese Farmacopee
Dieter DE MEESTERE Eerste master farmaceutische zorg
Promotor
Prof. Dr. Apr. F. De Vos
Commissarissen
Prof. Dr. Apr. B. De Spiegeleer
Dr. K. Kersemans
AUTEURSRECHT
“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar
te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de
beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting
uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef.”
23 mei 2012
Promotor Auteur
Prof. Dr. Apr. F. De Vos Dieter De Meestere
SAMENVATTING
Deze onderzoeksstage heeft als doel het optimaliseren van de radiosynthese van [11C]-
raclopride. [11C]-raclopride is een, met de β+-straler 11C gelabelde, reversibele dopamine D2-
receptor antagonist en wordt gebruikt als radiotracer bij PET-scanning. Dit [11C]-raclopride
treedt in competitie met het endogeen dopamine in bepaalde delen van de hersenen, ter hoogte
van de D2-receptoren. Het verschil in bindingspotentiaal van [11C]-raclopride kan in de D2-
receptor rijke regio’s (bv. striatum) goed in beeld gebracht worden en is bijgevolg nuttig om
verstoringen in de dopaminebalans te monitoren bij verschillende pathologieën in het
dopaminerg systeem.
Het [11C]-isotoop wordt, via een 14N (p,α) nucleaire reactie, met behulp van een
cyclotron deeltjesversneller, onder de vorm van [11C]-CH4, geproduceerd. Dit [11C]-CH4 wordt
doorgestuurd naar de synthesemodule die zich in een hot cell bevindt. Daar reageert het [11C]-
CH4 via een radicalaire reactie bij 600 °C met I2, tot [11C]-CH3I. Dit wordt op zijn beurt over
een AgOTf-kolom gestuurd, waar het reageert tot [11C]-CH3OTf. Doordat het triflaat een
bijzonder goede leaving group is, zal het via een SN-2 reactie in aceton reageren met de
nuceofiele hydroxylgroep van O-DMR tot [11C]-raclopride. Dit [11C]-raclopride wordt via
reversed phase HPLC uit het reactiemengsel opgezuiverd.
Tijdens deze onderzoeksstage is het opzuiveringsproces geoptimaliseerd door gebruik
te maken van een base deactivated HPLC kolom, waarbij [11C]-raclopride voor zijn precursor
elueert. Dit levert een betrekkelijke tijdwinst op van om en bij de 5 minuten. Dit is relatief
veel aangezien de totale radiosynthese slechts 28 minuten duurt en het halfleven van 11C
20,38 minuten bedraagt. Een andere mogelijke optimalisatie is gesitueerd ter hoogte van de
omzetting van [11C]-CH3I naar [11C]-CH3OTf in de triflaatkolom. Het testen van verschillende
samenstellingen van deze kolom levert echter weinig verschil in rendement op. Ook worden
verschillende loopvolumes voor de HPLC-opzuivering getest.
De Europese Farmacopee 7.2 standaarden leggen enkele kwaliteitseisen op voor het
eindproduct dat [11C]-raclopride bevat. De oplossing moet steriel en pyrogeenvrij zijn en moet
een hoge specifieke activiteit, radiochemische en radionuclidische zuiverheid hebben en de
identiteit moet bevestigd worden. Verder mag het ook geen residueel aceton bevatten en moet
het een geschikte pH hebben om intraveneus geïnjecteerd te mogen worden bij patiënten.
Dankwoord
Mijn dank gaat uit naar mijn promotor Prof. Dr. Apr. F. De Vos om het mogelijk te maken deze masterproef uit te voeren in het labo Radiofarmacie.
In het bijzonder bedank ik Nick Van Laeken voor de constructieve begeleiding en de aangename werksfeer tijdens de vele uren in de cyclotronafdeling van het UZ Gent.
Een woordje van dank gaat uit naar Johan Sambre en Dr. K. Kersemans voor hun vakkennis en behulpzaamheid.
Ook bedank ik mijn ouders en broer voor de steun en motivatie tijdens mijn onderzoeksstage.
Tenslotte wil ik mijn vriendin bedanken om er altijd te zijn voor mij.
INHOUDSTAFEL
1 INLEIDING ....................................................................................................................... 1 1.1 HET DOPAMINERG SYSTEEM ............................................................................... 1
1.1.1 Dopamine ............................................................................................................ 1 1.1.2 Dopaminerge receptoren ................................................................................... 2 1.1.3 Aandoeningen gerelateerd aan de dopamine D2-receptor .............................. 4
1.1.3.1 De ziekte van Parkinson ................................................................................... 4 1.1.3.2 Schizofrenie ...................................................................................................... 4 1.1.3.3 Chorea van Huntington ..................................................................................... 4 1.1.3.4 Myoclonus dystonia .......................................................................................... 5
1.2 [11C]-RACLOPRIDE ................................................................................................... 5 1.2.1 Algemeen ............................................................................................................. 5 1.2.2 Gebruik van [11C]-raclopride ............................................................................ 5
1.3 POSITRON EMISSION TOMOGRAPHY ................................................................. 7 2 OBJECTIEVEN .............................................................................................................. 11 3 MATERIALEN EN METHODEN ................................................................................ 12
3.1 CYCLOTRON: PRODUCTIE VAN 11C .................................................................. 12 3.2 MODULE VOOR DE RADIOSYNTHESE VAN [11C]-RACLOPRIDE ................ 14
3.2.1 Productie van [11C]-CH3I uit [11C]-CH4 ......................................................... 16 3.2.1.1 De ‘natte’-methode ......................................................................................... 16 3.2.1.2 De ‘gas fase’-methode .................................................................................... 16
3.2.2 Productie van [11C]-CH3OTf uit [11C]-CH3I .................................................. 17 3.2.3 Productie van [11C]-raclopride ........................................................................ 18
3.3 HPLC OPZUIVERING VAN [11C]-RACLOPRIDE ................................................ 19
3.3.1 Mobiele fase ...................................................................................................... 20 3.3.2 Loop en injector ................................................................................................ 20 3.3.3 Pomp .................................................................................................................. 21 3.3.4 Kolom ................................................................................................................ 21
3.3.4.1 Semi –preparatieve kolom .............................................................................. 21 3.3.4.2 Analytische kolom .......................................................................................... 21
3.3.5 Detector ............................................................................................................. 22 3.3.5.1 Ultraviolet/visible light ................................................................................... 22 3.3.5.2 Radioactiviteitsdetectoren .............................................................................. 23
3.3.6 Integrator .......................................................................................................... 24 3.4 KWALITEITSCONTROLE ...................................................................................... 24
3.4.1 Radionuclidische identiteit en zuiverheid van het radionuclide .................. 25 3.4.1.1 Meting van het halfleven ................................................................................ 25 3.4.1.2 Meting van het gamma-spectrum ................................................................... 25
3.4.2 Kwaliteit van de opzuivering door analytische HPLC ................................. 27 3.4.2.1 System Suitability Test (SST) ........................................................................ 28 3.4.2.2 Identiteit .......................................................................................................... 28 3.4.2.3 Chemische zuiverheid ..................................................................................... 28 3.4.2.4 Radiochemische zuiverheid (RCP) ................................................................. 28 3.4.2.5 Specifieke activiteit ........................................................................................ 29
3.4.3 Farmaceutische kwaliteit ................................................................................. 29 3.4.3.1 pH meting ....................................................................................................... 29 3.4.3.2 Controle op residuele solventen via GC ......................................................... 29 3.4.3.3 Endotoxinetest ................................................................................................ 31 3.4.3.4 Steriliteitstesten .............................................................................................. 32
4 RESULTATEN EN DISCUSSIE ................................................................................... 33 4.1 OPTIMALISATIE VAN DE OPBRENGST ............................................................ 33
4.1.1 Optimalisatie van de omzetting [11C]-CH3I naar [11C]-CH3OTf ................. 33 4.1.2 Testen van verschillende loopvolumes ............................................................ 35
4.2 OPTIMALISATIE VAN DE OPZUIVERING ......................................................... 37 4.2.1 Analytische C18-kolom ..................................................................................... 37 4.2.2 Analytische Supelcosil™ Suplex™ pKb-100 HPLC kolom .......................... 38
4.2.2.1 'Koude' testen .................................................................................................. 38 4.2.2.2 'Warme' testen ................................................................................................. 40
4.3 KWALITEITSCONTROLE ...................................................................................... 42 4.3.1 Radionuclidische identiteit en zuiverheid van het radionuclide .................. 42
4.3.1.1 Meting van het halfleven ................................................................................ 42 4.3.1.2 Meting van het gamma-spectrum ................................................................... 42
4.3.2 Kwaltiteit van de opzuivering door analytische HPLC ................................ 43 4.3.2.1 System Suitability Test (SST) ........................................................................ 43 4.3.2.2 Identiteit .......................................................................................................... 44 4.3.2.3 Chemische zuiverheid ..................................................................................... 44 4.3.2.4 Radiochemische zuiverheid (RCP) ................................................................. 45 4.3.2.5 Specifieke activiteit ........................................................................................ 45
4.3.3 Farmaceutische kwaliteit ................................................................................. 45 4.3.3.1 pH meting ....................................................................................................... 45 4.3.3.2 Controle op residuele solventen via GC ......................................................... 46
4.3.3.3 Endotoxinetest ................................................................................................ 47 4.3.3.4 Steriliteitstesten .............................................................................................. 49
5 CONCLUSIE ................................................................................................................... 50
6 LITERATUURLIJST ..................................................................................................... 51
6.1 LITERATUUR .......................................................................................................... 51 6.2 INTERNETBRONNEN ............................................................................................ 54
LIJST MET AFKORTINGEN
[11C]-CH3OTf [11C]-methyltriflaat
[11C]-CH3I [11C]-methyliodide
AADC L-aminozuur decarboxylase
AC adenylaatcyclase
ADH aldehydedehydrogenase
BGO bismuthgermanaat
Bp bindingspotentiaal
Bq becquerel
C concentratie
ATP adenosine-5’-trifosfaat
cAMP cyclisch adenosinemonofosfaat
COMT catechol-O-methyltransferase
CT computer tomografie
DMF dimethylformamide
DMSO dimethylsulfoxide
DNA desoxyribonucleic acid
FDG 2-[18F]fluoro-2-deoxy-D-glucose
FID flame ionization detector
FLT fluorothymidine
GSO gadolinium oxyorthosilicate
GPCRs G-proteïne gekoppelde receptoren
HPLC high performance liquid chromatography
ID interne diameter
IU international unit
IV intraveneus
keV kilo elektronvolt
L lengte
LAF laminaire air flow
LAL limulus amoebocyt lysaat
L-DOPA 3,4-dihydroxyfenylalanine
LoD limit of detection
LOR line of response
LoQ limit of quantification
LSO lutetium orthosilicate
MAO monoamineoxidase
NBP 4-(4-nitrobenzyl)pyridine
O-DMR S-(+)-O-desmethylraclopride
PET positron emission tomography
PIN p-intrinsic-n
PMT photon multiplier tube
QC quality control
R resolutie
RCP radiochemical purity
RSD relatieve standaarddeviatie
SD standaarddeviatie
SOP standard operating procedure
SST system suitability test
TBAOH tetrabutylammonium hydroxide
TEA triethylamine
tR retentietijd
UV ultraviolet
Inleiding
1
1 INLEIDING
1.1 HET DOPAMINERG SYSTEEM
Dopamine is een belangrijke neurotransmitter in het menselijk lichaam en is cruciaal
voor het functioneren van neurologische processen in het centraal en perifeer zenuwstelsel.
Het wordt al sinds zijn ontdekking in verband gebracht met het moduleren van het cognitief
vermogen en motorische activiteit. Dopamine medieert deels de endocriene secreties in de
perifere stelsels en speelt verder ook een kritische rol bij emotie, motivatie, verslaving en
diverse pathologische aandoeningen (Cumming, 2009).
1.1.1 Dopamine
Figuur 1.1: Dopamine (Le Foll et al., 2009).
Dopamine of 2-(3,4-dihydroxyfenyl)ethylamine (Figuur 1.1) is een catecholamine, in
het bijzonder een monoamine. Het bezit één basische aminegroep (pKb=4,95) en twee
fenolgroepen (pKa=10,60 en 12,05). Het is een relatief polaire verbinding (log P=-2,36), die
bovendien oxidatiegevoelig is.
Dopamine wordt in het lichaam gesynthetiseerd vanuit L-tyrosine, afkomstig van het
aminozuur L-fenylalanine. Dit L-tyrosine wordt eerst omgezet tot L-DOPA door tyrosine 3-
hydroxylase en daarna wordt vanuit L-DOPA, via het aromatisch L-aminozuur decarboxylase
(AADC), dopamine gevormd. De hydroxylatie tot L-DOPA is de snelheidsbepalende stap bij
de biosynthese vanuit L-tyrosine. Dopamine wordt intracellulair opgeslagen in vesikels in de
zenuwcel (Figuur 1.2), die bij een zenuwimpuls versmelten met het presynaptisch membraan
waardoor de neurotransmitter in de synaps terecht komt. Vervolgens kan dopamine zijn effect
uitoefenen op een dopamine receptor (Le Foll et al., 2009; Winlow en Markstein, 1986).
De voornaamste enzymen die verantwoordelijk zijn voor de metabolisatie van
dopamine zijn het cytoplasmatisch en synaptisch catechol-O-methyltransferase (COMT),
monoamineoxidase A en B (MAO A en B), die geassocieerd zijn met het buitenste
mitochondriaal membraan, en aldehydedehydrogenase (ADH) (Okada et al., 2010).
Inleiding
2
1.1.2 Dopaminerge receptoren
Vijf belangrijke subtypes dopamine receptoren zijn gekarakteriseerd en worden
opgedeeld in twee klassen, namelijk de D1-like (D1, D5) en de D2-like (D2, D3, D4)
receptoren. Deze indeling wordt hoofdzakelijk gemaakt op basis van het
signaaltransductiesysteem van de receptoren (Jaber et al., 1996).
Alle dopamine receptoren zijn G-proteïne gekoppelde receptoren (GPCRs). Hierbij
wordt de signaaltransductie gemedieerd door het guanosinemonofosfaat (GMP)-bindend
proteïne (G-proteïne). Deze superfamilie van receptoren wordt ook wel de 7-
transmembranaire receptoren genoemd omdat ze het celmembraan 7 maal doorkruisen.
Figuur 1.2: Dopaminerg neuron en synaps: (1) syntheseweg dopamine vanuit L-
tyrosine; (2) transport en opslag; (3) exocytose dopamine; (4) binding op de D2-like of
D1-like receptoren (5) binding op de presynaptische D2-receptoren; (6) heropname van
dopamine door een dopamine transporter; (7) afbraak door enzymes zoals MAO en
COMT.1
De D1-like (D1, D5) en de D2-like (D2, D3, D4) receptoren verschillen vooral in de
koppeling met het adenylaatcyclase. De D1-like receptoren stimuleren het adenylaatcyclase
(AC) via het Gαs–proteïne en dit resulteert in de omzetting van ATP tot cAMP (Gainetdinov
et al., 2004). Dit cAMP bindt aan de regulatoire subeenheden van het proteïnekinase A en 1fhttp://www.psych.ndsu.nodak.edu/mccourt/Psy486/Biochemistry%20and%20Neuropharmacology/synaptic%20transmission%20and%20neuropharmacology.htm
Inleiding
3
activeert de katalytische eenheid van dit enzym. Het is een fosforylase dat verschillende
eiwitten fosforyleert die belangrijk zijn bij de signaaltransductie en genexpressie in de cel. Bij
de D2-like receptoren gebeurt net het omgekeerde. Hier wordt het adenylaatcyclase
geïnhibeerd en wordt minder cAMP gevormd. Er worden dan ook minder proteïnen
gefosforyleerd. G-proteïnen kunnen ook rechtstreekse effecten uitoefenen op Ca2+ en K+
kanalen (Neve et al., 2004).
Een ander verschil is dat D2-receptoren ook presynaptisch, als autoreceptoren, kunnen
fungeren en zo de synthese en vrijstelling van dopamine regelen (Figuur 1.2). Opmerkelijk is
dat dopamine receptoren zich in verschillende toestanden kunnen bevinden. Zo bezit zowel de
post- als presynanaptische D2-receptor een toestand met hoge of lage affiniteit voor dopamine
(Kilbourn et al., 2011).
De belangrijkste dopaminerge banen zijn gelokaliseerd in de middenhersenen
(tegmentum en substantia nigra) en projecteren in het corpus striatum, bestaande uit het
putamen en de nucleus caudatus, en de frontale cortex, die deel uitmaakt van het limbisch
systeem. Het corpus striatum wordt geassocieerd met de motorische activiteit en beloning en
wordt beschouwd als een van de belangrijkste regio’s in het dopaminerg systeem. Het
limbisch systeem op zijn beurt, speelt een rol in verband met emotioneel gedrag. Het effect
van dopamine op zijn receptoren wordt gestopt door heropname via een dopamine transporter
in de presynaptische neuronen en in mindere mate door metabolisatie (COMT, MAO) in de
synaps (Minagar et al., 2010).
Figuur 1.3: Schema van de dopaminerge banen en projecties (Kandel et al., 1991).
Inleiding
4
1.1.3 Aandoeningen gerelateerd aan de dopamine D2-receptor
Toen werd vastgesteld dat dopamine in bepaalde delen van het lichaam (striatum,
longen, urine, glomuscaroticum, pancreas) meer voorkwam dan norepinephrine, werd
aangenomen dat dopamine een fysiologische functie moest hebben en niet louter een
precursormolecule was. Verschillende pathologieën zijn dan ook gerelateerd aan een
onevenwicht of dysfunctie in het dopaminerg systeem (Barbeau et al., 1970).
1.1.3.1 De ziekte van Parkinson
De ziekte van Parkinson is een progressieve neurodegeneratieve aandoening, met als
primaire oorzaak het verlies van dopaminerge neuronen in de substantia nigra. De ziekte van
Parkinson kan zowel sporadisch als erfelijk ontstaan. De eigenlijke aanleiding tot verlies van
dopaminerge neuronen is onbekend. Momenteel zijn tien genen in verband gebracht met de
aandoening, maar er is verder nog weinig bekend over de erfelijke etiologie (Saiki et al.,
2012). De aanwezigheid van lewy inclusion body's in de dopaminerge neuronen zou
eventueel een factor in de pathologie kunnen zijn. Typische symptomen zijn tremor,
bradykinesie en rigiditeit. Parkinson wordt ook gekenmerkt door niet-motorische symptomen
zoals cognitieve, sensorische en autonome stoornissen. De gedaalde dopamineconcentratie in
het striatum kan in beeld gebracht worden met behulp van radioliganden zoals [11C]-
raclopride (Brooks et al., 2006) (infra). In tegenstelling tot de lage dopamineconcentratie is de
hoeveelheid acetylcholine in het striatum verhoogd.
1.1.3.2 Schizofrenie
Schizofrenie is een neuropsychotische ontwikkelingsstoornis, met een genetische
voorbeschiktheid, die meestal ontstaat tijdens de adolescentie. De aandoening wordt
gekenmerkt door positieve (hallucinaties, wanen) en negatieve (vermindering van psychisch
en sociaal functioneren) symptomen alsook cognitieve tekorten (Freedman et al., 2003).
Momenteel wordt aangenomen dat er een verhoogde synaptische dopamineconcentratie en
upregulatie van postsynaptische D2-receptoren aanwezig is in het striatum. Anderzijds werd er
bij schizofreniepatiënten een verminderde D2-receptor binding in de regio's buiten het
striatum vastgesteld, in bijzonder in de thalamus, wat gerelateerd is aan de sensorische
abnormaliteiten bij schizofrenie (Harrison et al., 2004; Faludi et al., 2011).
1.1.3.3 Chorea van Huntington
Chorea van Huntington is een progressieve neurodegeneratieve aandoening,
Inleiding
5
veroorzaakt door mutaties in het Huntington gen (IT15 gen) en is autosomaal dominant.
Huntington wordt gekarakteriseerd door het ontstaan van choreatische bewegingen, depressie
en dementie op middelbare leeftijd, als gevolg van de destructie van medium spiny neuronen
in het striatum en neuronen in de cortex. Studies met radiotracers toonden aan dat er een
significant verlies is van D1-en D2-receptoren in het striatum (Weeks et al., 1996; Raymond et
al., 2011).
1.1.3.4 Myoclonus dystonia
Myoclonus dystonia is een bewegingsstoornis gekenmerkt door korte ongewilde
spiercontracties en abnormale houding. De ziekte kan zowel autosomaal dominant
overgedragen worden als sporadisch voorkomen. De aandoening wordt hoofdzakelijk
veroorzaakt door een missense of nonsense mutatie in het epsilon-sarcoglycan gen, dat
codeert voor de D2-receptor (Schüle et al., 2004).
1.2 [11C]-RACLOPRIDE
1.2.1 Algemeen
Raclopridej(3,5-dichloro-N-[[(2S)-1-ethyl-2-pyrrolidinyl]methyl]-2-hydroxy-6-
methoxy-benzamide) is een synthetisch benzamide en behoort tot de selectieve D2-receptor
antagonisten. Het bezit net als enkele andere benzamiden antipsychotische eigenschappen.
Het eerste benzamide dat een duidelijke anti-psychotische werking werd toegeschreven was
sulpiride. Raclopride is relatief hydrofiel en daarom goed oplosbaar in waterige solventen. De
log P van raclopride is 3.576 (±0.493). De fenolische hydroxylgroep heeft een pKa van 5.93
(±0,50), terwijl de amidegroep een pKa heeft van 8.97 (±0.50) (scifinder). Bij fysiologische
pH, komt raclopride voor meer dan 96% voor onder de vorm van het zwitterion (Tsai et al.,
1993).
Figuur 1.4: [11C]-raclopride (Iwata et al., 2001).
1.2.2 Gebruik van [11C]-raclopride
Raclopride is niet als antipsychotisch geneesmiddel geregistreerd. De [11C]-gelabelde
Inleiding
6
vorm van raclopride wordt echter wel als diagnostisch radioligand gebruikt. Het bindt
reversibel op de D2-receptoren in het striatum. [11C]-raclopride is namelijk onderhevig aan
competitie met het endogeen dopamine en kan gebruikt worden om veranderingen in de
synaptische dopamineconcentratie, via PET, op een reproduceerbare manier in beeld te
brengen (Farde et al., 1985). De binding van [11C]-raclopride aan de D2-receptor wordt
uitgedrukt via de bindingspotentiaal (BP) (formule 1.1) (Innis et al., 2007).
𝐵𝑃 = Bmax
𝐾D (formule 1.1)
Waarin: BP: bindingspotentiaal
Bmax: concentratie [11C]-raclopride waarbij alle receptoren bezet zijn
KD: dissociatieconstante
Belangrijk is dat raclopride een grote affiniteit bezit voor de D2-receptor en daardoor ook een
hoge Bmax en lage KD heeft, welke ideale eigenschappen zijn voor een radioligand. KD is
omgekeerd evenredig met de affiniteit, terwijl Bmax een maat is voor de receptordensiteit
(Farde et al., 1989). De verhouding van Bmax/KD moet minstens 4 zijn om een PET-opname te
verkrijgen met voldoende contrast (Elsinga et al., 2002). Raclopride gaat weinig aspecifieke
bindingen aan, waardoor het cerebellum, dat bijna geen D2-receptoren bezit, als
referentieregio kan worden gebruikt (Farde et al., 1985).
Aangezien raclopride een vrij hydrofiele molecule is, zal het niet door de membranen
van de zenuwcellen kunnen diffunderen. Het blijft extracellulair aanwezig in de synaps en kan
enkel binden op D2-receptoren op het oppervlak van neuronen (Elsinga et al., 2002). Als er
veel dopamine aanwezig is ter hoogte van de synaptische spleet, dan zullen ook veel D2-
receptoren geoccupeerd zijn. Hierdoor zullen er minder receptoren met [11C]-raclopride
kunnen binden en zal er minder radioactiviteit, ter hoogte van receptorrijke regio’s, gemeten
worden door de detector (Volkow et al., 2009). Daarom is [11C]-raclopride belangrijk bij de
diagnose van pathologieën zoals de ziekte van Parkinson en schizofrenie, waar een verstoorde
dopaminebalans aanwezig is. Door depletie van dopamine in het striatum, zoals bij de ziekte
van Parkinson, zal een hogere bindingspotentiaal van [11C]-raclopride geconstateerd worden
(Ishibashi et al., 2010).
Via de [11C]-raclopride binding op de centrale D2-receptoren kunnen de doeltreffendheid en
neveneffecten van antipsychotica worden nagegaan (Kim et al., 2011). Een ander toepassing
van [11C]-raclopride is het in beeld brengen van de dopaminevrijstelling in het striatum bij
Inleiding
7
injectie van amfetamines, alcohol of andere drugs bij proefdieren (Martinez et al., 2003;
Sullivan et al., 2011).
Figuur 1.5: Links wordt de normale [11C]-raclopridebinding weergegeven, rechts deze
bij een verhoogde dopamine release in de synapsen (Brooks et al., 2003).
1.3 POSITRON EMISSION TOMOGRAPHY
Positron emission tomography (PET) scanning is een niet-invasieve nucleaire
medische beeldvormingstechniek, die een radioactieve tracer gebruikt om een bepaald
biochemisch proces in het lichaam te onderzoeken en eventueel ziektebeelden te verklaren.
Een PET-onderzoek vereist een kleine hoeveelheid radiotracer, die vervolgens intraveneus
wordt geïnjecteerd en zich via het bloed naar de organen verdeelt. Om de hoeveelheid
radiotracer in een bepaald weefsel te kunnen kwantificeren in verloop van de tijd, is een PET-
camera nodig. Deze is opgebouwd uit verschillende detectorringen, bestaande uit
scintillatiekristallen en elektronenvermenigvuldigaars (PMT's).
Bij PET worden radiotracers met een kort halfleven gebruikt, die positronen uitstralen.
De meest gebruikte radionucliden zijn 11C (T1/2=20,38 min), 13N (T1/2=9,97 min), 15O (T1/2=2
min) en 18F (T1/2=110 min) (Paans et al., 2002). Dit zijn allemaal β+-stralers. Wanneer een
kern β+-verval ondergaat, wordt een proton naar een neutron omgezet. Hierbij worden een
positron (e+) en een neutrinodeeltje uitgestraald (Figuur 1.6). β+-verval komt voor bij isotopen
met een protonenexcedent en vereist een energieoverschot van 1,02 MeV. De energie van het
uitgezonden positron varieert van 0 tot Emax (0,968 MeV) (Wong et al., 1954). Het neutrino (ν)
bezit geen lading of massa maar wel een hoeveelheid energie, afhankelijk van de energie van
het uitgezonden positron (Turkinton et al., 2001; De Vos, 2012).
Inleiding
8
Figuur 1.6: β+-verval (De Vos, 2012).
Positron-emitters hebben een speciale eigenschap, annihilatie genaamd. Een positron
afkomstig van het radionuclide annihileert met een elektron uit de omgeving waarbij twee
fotonen met een energie van 511 keV in een hoek van 180° worden uitgezonden. Een positron
is namelijk een onstabiel deeltje dat, wanneer het zijn kinetische energie verliest, onmiddellijk
intrageert met een negatief geladen elektron. De massa van beide deeltjes wordt hierbij
omgezet naar energie, onder de vorm van twee fotonen (Patton, 1998). Deze fotonen worden
gedetecteerd door een PET-camera en worden in de literatuur vaak als γ-stralen aangeduid,
hoewel ze stricto sensu niet rechtstreeks door de kern worden uitgezonden (Figuur 1.7)
(Turkinton et al., 2001).
Bij detectie van de gamma-stralen, met een PET-camera, worden enkel fotonen gedetecteerd
als deze op eenzelfde tijdstip (5-10 nanoseconden interval) de detector bereiken. Dit wordt
coïncidentie genoemd. Als coïncidentie optreedt, wordt aangenomen dat beide vrijgestelde
fotonen afkomstig zijn van één annihilatie. De lijn tussen de twee detectiepunten wordt ook
wel de Line of Response (LOR) genoemd. Vanuit deze wetenschap kan het punt bepaald
worden waar annihilatie heeft plaatsgevonden (De Vos, 2012; Humm et al, 2003).
Figuur 1.7: Het annihilatiemechanisme (De Vos, 2012).
De eigenlijke radioactiviteitsdetector van een PET-camera is een
scintillatiedetector, waarbij anorganische scintillatiekristallen gebruikt worden. Een PET-
camera bestaat uit verschillende detectorringen, die opgebouwd zijn uit detectorblokken
(Figuur 1.8), die in circuit met elkaar geschakeld zijn (De Vos, 2012). Het principe van deze
detector is gebaseerd op het proces van excitatie en de-excitatie. De kristallen die vroeger veel
Inleiding
9
gebruikt werden bij PET-camera's zijn bismuthgermanaat (BGO) kristallen. Deze hebben
echter het nadeel dat ze een relatief lange dode tijd en een beperkte lichtopbrengst hebben.
Momenteel worden bij de meeste PET-camera’s lutetium oxyorthosilicate (LSO) en
gadolinium oxyorthosilicate (GSO) kristallen gebruikt. Deze bezitten een veel betere
lichtopbrengst en een kortere dode tijd dan de standaard NaI-kristallen (3.4.7.2) en BGO
kristallen. De fotonen, uitgezonden bij annihilatie, zorgen voor excitatie van de atomen in de
kristalroosters. Bij dergelijke roosters bevinden alle elektronen zich in eenzelfde valentieband
en worden ze geëxciteerd naar de conductieband. Bij het terugvallen naar de grondtoestand
zenden deze kristallen fotonen uit in het zichtbare of UV gebied. Deze lichtbundels worden
via het foto-elektrisch effect omgezet tot foto-elektronen die vervolgens versterkt worden aan
de hand van een PMT (Figuur 1.8) (Turkinton et al., 2001).
Een PMT bestaat uit een vacuümbuis met daarin een fotokathode, dynodes en één
anode. Tussen de verschillende dynodes wordt een potentiaalverschil van 50 V aangelegd.
Eerst wordt het invallende foton omgevormd tot een foto-elektron dat vervolgens, ten gevolge
van het spanningsverschil tussen de fotokathode en de eerste dynode, naar de dynode zal
migreren en daardoor versneld zal worden. Door botsingen bij verhoogde snelheid met de
dynodes zullen er nog meer elektronen worden vrijgesteld. Doordat dit proces meerdere
malen na elkaar plaatsvindt, wordt uiteindelijk een groot en meetbaar signaal gecreëerd ter
hoogte van de anode. De PET-camera opstelling bevat meerdere PMT's en alle
detectiesignalen van deze verschillende naast elkaar gelegen PMT's worden verwerkt en via
een matrixsysteem tot een bruikbaar beeld omgevormd (De Vos, 2012; Turkinton et al.,
2001).
Figuur 1.8 : Detectorblok met PMT’s (Paans et al., 2002).
Inleiding
10
PET-scanners kunnen ontworpen worden om een 2D of 3D beeld weer te geven. Om
een bruikbaar beeld te verkrijgen, moeten bepaalde technieken toegepast worden om dit beeld
te reconstrueren. Een veelgebruikte techniek is ‘filtered back’-projectie en ook iteratieve
reconstructie wordt gebruikt.
Door de korte halfwaardetijd van de gebruikte isotopen worden deze meestal ‘in
house’ aangemaakt via een cyclotron. Een PET-scan wordt gebruikelijker wijs gecombineerd
met een CT-scan om het beeld dat met PET bekomen werd, anatomisch te lokaliseren (Humm
et al., 2003). PET heeft veel toepassingen en naargelang het biochemisch proces dat wordt
geobserveerd, wordt een specifieke radiotracer gebruikt. Tijdens de onderzoeksstage wordt
gebruik gemaakt van [11C]-raclopride dat bindt op de striatale D2-receptoren. Een ander
veelgebruikt radioligand is 2-[18F]fluoro-2-deoxy-D-glucose (FDG), voor visualisatie van
tumoren. Tumoren hebben een verhoogde glucoseopname, waardoor ook FDG meer
opgenomen wordt. Ook 39-deoxy-39-[18F] fluorothymidine (FLT) dient om tumoren op te
sporen. FLT is een thymidineanaloog en wordt ingebouwd in DNA. Zo wordt de verhoogde
celproliferatie van tumorcellen gevisualiseerd (Phelps et al., 2000).
Objectieven
11
2 OBJECTIEVEN
Deze onderzoeksstage wordt uitgevoerd op basis van twee primaire doelstellingen. Ten eerste
is het de bedoeling om de radiosynthese van [11C]-raclopride in de cyclotronafdeling van het
UZ Gent aan te leren en te optimaliseren. Het tweede doel omvat het aanleren en uitvoeren
van kwaliteitscontroles voor [11C]-raclopride, opgelegd door de Europese Farmacopee 7.2
standaarden.
De twee belangrijkste aspecten bij het optimaliseren van het syntheseproces zijn het verkorten
van de synthesetijd en het verhogen van de opbrengst van [11C]-raclopride.
Een eerste potentiële optimalisatie is gesitueerd ter hoogte van het opzuiveringsproces van het
reactiemengsel. Deze gebeurt tot op heden aan de hand van een hydrofobe C18 analytische
HPLC-kolom. Raclopride elueert via een dergelijke kolom later dan zijn precursormolecule.
De bedoeling tijdens deze onderzoeksstage is om een analytische Supelcosil™ Suplex™ pKb-
100 HPLC kolom te testen, die mogelijks de retentietijden van raclopride en zijn precursor
omkeert. Dit zou een belangrijke tijdswinst kunnen betekenen voor het opzuiveringsproces .
Om een hogere opbrengst aan [11C]-raclopride te bekomen, wordt gestreefd naar een groter
rendement van de omzetting van [11C]-CH3I naar [11C]-CH3OTf aan de hand van
verschillende samenstellingen en bereidingswijzen van de triflaatkolom in de module. Ook
wordt getracht om smallere pieken te bekomen bij de opzuivering, door loopvolumes bij de
HPLC-injectie te laten variëren. Dit mag echter niet ten koste gaan van de totale hoeveelheid
activiteit die geïnjecteerd wordt.
Het tweede belangrijke luik tijdens deze onderzoeksstage houdt in dat de kwaliteitscontrole
moet voldoen aan de eisen van de Europese Farmacopee 7.2 standaarden. Dit is vooral
belangrijk in functie van bepaalde klinische studies, waar PET-scanning met [11C]-raclopride
als radioligand wordt uitgevoerd.
Tenslotte zal door middel van proefdierexperimenten de invloed van D-amfetamine sulfaat,
agonisten/antagonisten en beloning op de beschikbaarheid/concentratie van dopamine D2
receptoren in het striatum van ratten worden nagegaan, gebruik makend van PET met [11C]-
raclopride als radiotracer.
Materialen en methoden
12
3 MATERIALEN EN METHODEN
3.1 CYCLOTRON: PRODUCTIE VAN 11C
De β+-straler 11C wordt gebruikt om bepaalde liganden zoals raclopride radioactief te
labelen. 11C heeft als voordeel dat het in een molecule ingebouwd kan worden zonder de
chemische eigenschappen te wijzigen, in tegenstelling tot bijvoorbeeld 18F. Het lichaam kan
geen onderscheid maken tussen het 11C en het 12C isotoop. Het is ook een kortlevend isotoop,
hetgeen de stralingsdosis voor de patiënt beperkt.
11C wordt meestal aangemaakt via een 14N (p,α) nucleaire reactie met behulp van een
Cyclone 18/9 cyclotron deeltjesversneller (IBA, Louvain-la-Neuve, België). Bij de 14N (p,α)
nucleaire reactie worden positief geladen protonen gebruikt om een bepaald targetgas te
beschieten. Een cyclotron bestaat uit een vacuüm waarin twee koperen schijven (D's)
geplaatst zijn met daartussen een ionenbron. Deze bestaat uit een waterstofgasstroom, die
langs een gloeidraad wordt gestuurd, waardoor H+ en H- ionen worden gevormd. De ionen
worden onderworpen aan een verticaal homogeen magneetveld en een oscillerend
potentiaalverschil tussen de twee D's. Hierdoor leggen de H- ionen halve cirkels af in de D's
en worden ze telkens versneld in de ruimte tussen deze twee schijven. De straal van de
afgelegde halve cirkels wordt geleidelijk groter tot de H- ionen de rand van de D's bereiken.
Figuur 3.1: Cyclotron deeltjesversneller.3
Eens de H- ionen voldoende kinetische energie hebben, verlaten ze de versneller via
een elektrostatische deflector en worden ze langs een stripper geleid. Een stripper capteert de
elektronen van H- zodat H+ gevormd wordt. Deze versnelde protonen kunnen nu de
3 http://images.yourdictionary.com/cyclotron
Materialen en methoden
13
coulombbarriere van de targetatomen overwinnen, zodat er kernreacties kunnen optreden
wanneer ze in contact komen met het targetgas. De protonen hebben een kinetische energie in
de MeV grootteorde (De Vos, 2012).
Voor de productie van 11C wordt meestal N2-gas als targetgas gebruikt, dat zich onder
verhoogde druk (10 - 12 bar, volume 1 – 4 L) in een konische cilinder bevindt. Een 14N atoom
heeft zeven protonen en zeven neutronen in zijn kern. Als 14N met protonen wordt beschoten,
verwerft het een extra proton. Hierdoor wordt er een α-deeltje afgesplitst, waarna er een
element met zes protonen en vijf neutronen wordt gecreëerd, 11C genaamd (Wuest et al.,
2007). Doordat N2 gas geen koolstof bevat, wordt een grote specifieke radioactiviteit
gerealiseerd.
De radioactieve 11C kan via een cyclotron, vanuit N2-gas, onder twee vormen
geproduceerd worden. 11C kan als [11C]-CO2 vrijgesteld worden, wanneer 0,5-2% O2 wordt
toegevoegd aan het N2-gas. Een andere mogelijkheid is het toevoegen van 5-10% H2 gas.
Onder deze omstandigheden wordt [11C]-CH4 geproduceerd (Elsinga et al., 2002).
Er kunnen ook nevenproducten gevormd worden. Tijdens de productie waarbij
gebruik gemaakt wordt van [11C]-CH4 kan NH3 als nevenproduct bekomen worden. Bij de 11C- productie onder de vorm van 11CO2 , wordt ook deels 13N en 11CO geproduceerd
(Schlyler et al., 2004; De Vos, 2012).
Het syntheseproces voor raclopride, dat tijdens de onderzoeksstage wordt gebruikt,
maakt gebruik van [11C]-CH4 als koolstof-11 bron. Het mengsel dat na bestraling wordt
bekomen, wordt via een heliumstroom naar de hot cell gevoerd. Daar komt [11C]-CH4 in een
spiraal terecht die kan worden ondergedompeld in een beker met vloeibaar argon. Bij de
temperatuur van dit argon (-185,9 °C) zal [11C]-CH4 uitvriezen en N2 niet, want stikstofgas
heeft een lager kookpunt dan [11C]-CH4. Het nevenproduct NH3 wordt vooraf al gecapteerd
via een P2O5-kolom die bij de aanvoer vanuit het cyclotron is geplaatst.
De opbrengst is afhankelijk van de flux en energie van de positief geladen deeltjes, de
werkzame doorsnede en de hoeveelheid targetmateriaal die wordt bestraald. De productie is
optimaal als de energie van de protonen 16 MeV bedraagt (De Vos, 2012; Andersson et al.,
2009)
Materialen en methoden
14
3.2 MODULE VOOR DE RADIOSYNTHESE VAN [11C]-RACLOPRIDE
De module en de bijhorende software, die gebruikt worden voor de radiosynthese van
[11C]-raclopride tijdens de onderzoeksstage, zijn niet commercieel aangemaakt. Het geheel
werd ontworpen door Johan Sambre in de cyclotron-afdeling van het UZ Gent. De
computergestuurde module bevindt zich in een hot cell. Dit is een met lood afgesloten ruimte
die bij onderdruk wordt gehouden en die noodzakelijk is om met relatief hoge radioactiviteit
te werken.
Figuur 3.2 Overzicht programma modulebesturing A: links de heliumkraan en rechts de
gewone perslucht, B: de loop die gekoeld kan worden in vloeibaar argon, C: reactor met
I2, D: Porapak N, P2O5 kolom en AgOTf-kolom, E: reactievial, F: HPLC, G:
opvangflesje H: SEP-PAK (Buiten gebruik).
Voor de synthese moeten enkele stappen ondernomen worden om te controleren of de
module volledig operationeel is. Belangrijk is dat er in totaal vijf lektesten worden uitgevoerd,
zodat geen radioactiviteit geloosd wordt tijdens de radiosynthese. Hierbij worden bepaalde
circuits in het systeem doorlopen en wordt de druk gecontroleerd (zie bijlage 1).
De HPLC-kolom wordt vooraf 20 min voorgespoeld aan 2 mL/min met mobiele fase.
De leiding tussen overloopvial en reactievial, en de vials zelf worden ook gereinigd met
aceton. Achteraan in de module bevindt zich een tedlar opvangzak die als waste fungeert.
Deze moet voor iedere synthese leeggemaakt worden.
Materialen en methoden
15
Tussen de porapak en de triflaatkolom is een P2O5 trap voorzien. P2O5 heeft sterke
hygroscopische eigenschappen en kan daardoor sporen van water capteren.
De reactievial wordt vooraf gevuld met 100 µg precursor en een equimolaire
hoeveelheid NaOH in 200 µl aceton. Het overloopvat wordt gevuld met een bepaald volume
HPLC-buffer. Dit volume is afhankelijk van de HPLC-loop die gebruikt wordt tijdens de
synthese. Vervolgens wordt de reactorbuis opgewarmd, zodat deze tijdig een constante
temperatuur van 600 °C bereikt.
Daarna start de bestraling van de gastarget N2 + 5% H2 met versnelde protonen,
afkomstig van het cyclotron. Voor een volledige synthese wordt 30 min bestraald aan 14 µA.
Hierbij wordt [11C]-CH4 geproduceerd. Het [11C]-methaan wordt getrapt in de loop die op
voorhand gekoeld werd in vloeibaar argon. De loop is gevuld met porapak N 80/100 (Grace,
Deerfield, USA), waarop het [11C]-CH4 kan binden. Ter hoogte van deze loop is er een
radioactiviteitsdetector aanwezig. Als het detectiesignaal daar stabiel is, wordt de spiraal
‘geflushd’. Na 30 seconden wordt de spiraal terug opgewarmd, door deze uit de argon te
halen. Het [11C]-CH4 komt vrij en zal richting de reactor vorderen. Daar wordt [11C]-CH3I
gevormd bij een temperatuur van 600 °C (zie 3.2.1), dat daarna over een sodalime-kolom
wordt gestuurd, waar ongewenst HI wordt gecapteerd. Vervolgens wordt dit [11C]-CH3I
gecapteerd op de kolom gevuld met porapak N 80/100 bij kamertemperatuur, waar ook een
radioactiviteitsdetector geplaatst is. Bij een constant signaal, wordt de porapak N opgewarmd
tot 120 °C zodat [11C]-CH3I wordt vrijgesteld. Hierna reageert het in de zilvertriflaat-kolom
tot [11C]-CH3OTf (zie 3.2.2).
Het gevormde [11C]-CH3OTf wordt opgevangen in de reactievial, waar het reageert
met de precursor van [11C]-raclopride, S-(+)-O-desmethylraclopride. Ter hoogte van de
reactievial is een derde detector aanwezig. Het opvangen wordt gestopt zodra dit signaal
stabiel is en op dat moment wordt er een bepaald volume 0.05 M ammoniumacetaat pH 6
buffer vanuit het overloopvat naar de reactievial gestuurd. Door de gedaalde pH wordt de
reactie gestopt. De detectoren in de hot cell zijn PIN (p-intrinsic-n) fotodiode-detectoren (zie
3.3.5.2).
[11C]-raclopride wordt opgezuiverd uit het reactiemengsel via HPLC (zie 3.3). De
bedoeling is zoveel mogelijk van het mengsel op de loop te kunnen overbrengen en te
injecteren op de HPLC-kolom. Daarna wordt de fractie [11C]-raclopride gecollecteerd in de
reactievial.
Materialen en methoden
16
Figuur 3.3: Signalen van de verschillende radioactiviteitsdetectoren. De blauwe curve is
afkomsig van de detector ter hoogte van de loop. De rose curve representeert het signaal
van de detector bij de porapak N-kolom. Tenslotte staat de groene curve voor het
signaal afkomstig van de detector ter hoogte van de reactievial, die niet gekalibreerd is.
3.2.1 Productie van [11C]-CH3I uit [11C]-CH4
[11C]-Methyliodide kan op verschillende manieren gesynthetiseerd worden. De
bedoeling van deze jodering van [11C]-methaan is om een leaving group te creëren, zodat de
fenolgroep van O-DMR in een SN-2 reactie als nucleofiel kan optreden.
3.2.1.1 De ‘natte’-methode
Deze methode is gebaseerd op de reductie van [11C]-CO2 door LiAlH4 in
tetrahydrofuraan en diethylether (0,05-0,1 M). Hierbij wordt [11C]-CO2 omgezet tot [11C]-
methanol als lithiumzout (Wuest et al., 2007). Vervolgens wordt het solvent uitgedampt en
HI, P2I4 of PPh3I2 toegevoegd met vorming van [11C]-CH3I (Figuur 3.4). Deze methode is
betrouwbaar op vlak van radiochemische opbrengst, maar er bestaat een risico op lage
specifieke activiteit door contaminatie van LiAlH4 met ‘koud’ CO2 en door te grote volumes
(Elsinga et al., 2002; Andersson et al., 2009).
Figuur 3.4: De ‘natte’-methode (Wuest et al., 2007).
3.2.1.2 De ‘gas fase’-methode
Via deze methode wordt [11C]-CH4 naar [11C]-CH3I omgezet via een radicalaire
0 500
1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 5500 6000 6500 7000 7500 8000 8500 9000
0 10 20 30 40 50 60 Activiteit CH4 MeI RV t (min)
Materialen en methoden
17
iodering met iodide-damp bij verhoogde temperatuur (600 °C) (Wuest et al., 2007). Deze
methode is eenvoudiger te construeren en het risico op verlaagde specifieke activiteit wordt
uitgesloten. De omzetting levert normaal slechts een rendement op van 20-30%. Het
gevormde [11C]-CH3I wordt gecapteerd op de porapak N-kolom bij kamertemperatuur. Dit is
een kolom bezet met poreuze polymeren, bestaande uit polystyreen divenylbenzeen. De rest
van het niet gereageerde [11C]-CH4 wordt teruggestuurd via een circuit naar de reactor. Daar
wordt opnieuw een fractie naar [11C]-CH3I omgezet, waardoor het rendement wordt verhoogd
tot maximaal ± 38%. Wanneer de porapak N wordt opgewarmd tot 120 °C komt het
gecapteerde [11C]-CH3I vrij. Er wordt opgewarmd wanneer het signaal van de
radioactiviteitsdetector op de porapak N-kolom constant blijft (Andersson et al., 2009).
Figuur 3.5: Radicalaire iodering [11C]-CH4 (Elsinga et al., 2002).
3.2.2 Productie van [11C]-CH3OTf uit [11C]-CH3I
Tegenwoordig wordt steeds meer geopteerd voor [11C]-methyltriflaat als methyldonor
voor de methylatie van O-DMR. [11C]-CH3OTf heeft verschillende voordelen ten opzichte
van het traditionele [11C]-CH3I. [11C]-methyltriflaat is veel reactiever dan [11C]-CH3I, omwille
van het feit dat triflaat een betere leaving group is in de SN-2 reactie. [11C]-CH3OTf is minder
vluchtig dan [11C]-CH3I en kan daarom minder snel verdampen uit kleine volumes. Ook gaat
de reactie tussen O-DMR en [11C]-CH3OTf door bij kamertemperatuur, terwijl bij [11C]-CH3I
de temperatuur moet worden opgedreven, met een lager rendement tot gevolg. Door de hoge
reactiviteit is er minder O-DMR precursor nodig, wat de kostprijs drukt. Kortom, [11C]-
CH3OTf zorgt voor een grotere radiochemische opbrengst en een korte reactietijd (Wuest et
al., 2007). Het [11C]-CH3I dat vrijkomt van de porapak N-kolom bij 120 °C wordt over een
zilvertriflaat-kolom (Figuur 3.4) bij een temperatuur van 230 °C gestuurd. Deze kolom bestaat
uit een mengsel van actieve koolstof en triflaat, waarbij verschillende verhoudingen mogelijk
zijn (zie 4.1.1). Het is belangrijk dat de kolom afgeschermd is van licht en volledig droog is,
omwille van de reactiviteit van zilvertriflaat met sporen water.
Materialen en methoden
18
Figuur 3.4: Zilvertriflaat.3
3.2.3 Productie van [11C]-raclopride
De reactie waarbij [11C]-raclopride wordt gevormd, uitgaande van [11C]-CH3OTf en
O-DMR, is een SN-2 (nucleofiele substitutie) reactie. De vrije base van O-DMR moet hierbij
gebruikt worden, omdat de tevens commercieel beschikbare zoutvorm O-DMR HBr reageert
met [11C]-CH3OTf tot [11C]-CH3Br. De meest frequent gebruikte solventen zijn DMSO,
DMF, aceton en acetonitrile. Dit zijn allen polaire aprotische solventen, die de
transitietoestand van een SN-2 reactie stabiliseren. Er wordt ook een equimolaire hoeveelheid
base toegevoegd, meestal NaOH of TBAOH. Dit om de fenolgroep te deprotoneren, zodat de
zuurstof negatief geladen wordt en betere nucleofiele eigenschappen krijgt (Langer et al.,
1999).
Figuur 3.5: 11C-methylering van O-DMR (Iwata et al., 2001).
Er bestaan verschillende methoden om de methylatie uit te voeren. Een eerste is de
‘bubbling’-methode. Deze wordt momenteel ook in het cyclotron UZ Gent gebruikt. Hierbij
wordt het gevormde [11C]-CH3OTf in een reactievial geborreld met helium als dragergas.
Deze reactievial bevat 100 µg precursor en een equimolaire hoeveelheid NaOH (Sigma
aldrich, St. Louis, US) in 200 µL aceton (Sigma aldrich, St. Louis, US) (Langer et al., 1999;
Iwata et al, 2001). De reactietijd bedraagt ongeveer 3,5 min, waarna het signaal van de
radioactiviteitsdetector ter hoogte van de reactievial constant is.
Een tweede methode is de ‘on-column’-methode. [11C]-CH3OTf wordt hierbij door
een heel hydrofobe en gedroogde SEP-PAK C18 Plus kolom (Waters Chromatography, Etten-
Leur, Nederland) gestuurd, die geladen wordt met 1-4 µl NaOH-oplossing (1 M) en een 50
µL- 300 µL precursoroplossing (1 mg). De kolom wordt daarna gespoeld met helium en het
3 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/176435?lang=en®ion=BE
Materialen en methoden
19
[11C]-CH3OTf wordt erdoor gestuurd. [11C]-CH3OTf reageert met de precursor en wordt
daarna geëlueerd met 1-2 mL aceton.
Als derde mogelijkheid is er de ‘loop’-methode. De precursor (1 mg), opgelost in
NaOH (1 M, 2 µl) bevattend solvent, wordt geïnjecteerd in een PTFE (polytetrafluorethyleen)
-buis (0,75 mm x10-50 mm), die verticaal gepositioneerd is. Deze wordt gespoeld met
heliumgas, zodat er nog 10-130 µL precursoroplossing achterblijft. Het [11C]-CH3OTf wordt
door deze loop gestuurd en reageert met de precursor (Iwata et al., 2001).
De aard van het reactiesolvent kan ook invloed hebben op de opbrengst van de reactie.
Voor de ‘bubbling’-methode wordt aceton als het beste en meest gebruikte reactiesolvent
beschouwd. Bij de ‘on column’-methode is dit echter niet het geval omdat aceton te vluchtig
is. Bij deze methode is het beter om cyclohexanon (CHO) te gebruiken, dat een hoger
kookpunt heeft (Iwata et al, 2001).
Een andere parameter is de hoeveelheid precursor. Als de precursorconcentratie wordt
opgedreven, neemt de radiochemische opbrengst toe. Dit gebeurt echter tot op een bepaalde
hoeveelheid precursor. Er wordt meestal geopteerd om een kleinere hoeveelheid te gebruiken
dan het maximum, omdat de chromatografische scheiding, via een reverse phase kolom, beter
doorgaat als kleinere hoeveelheden staal worden geïnjecteerd. Er moet ook rekening
gehouden worden met het feit dat maximum 10 µg [11C]-raclopride en 1 µg O-DMR mag
worden geïnjecteerd bij patiënten volgens de Europese Farmacopee 7.2 standaarden.
3.3 HPLC OPZUIVERING VAN [11C]-RACLOPRIDE
Nadat de reactie is doorgegaan, moet het gevormde [11C]-raclopride uit het
reactiemengsel geïsoleerd worden. De andere componenten die nog aanwezig zijn in het
mengsel zijn: een hoeveelheid niet-gereageerde precursor, restanten [11C]-CH3I en/of [11C]-
CH3OTf, solventen (aceton) en een base (NaOH). Het doel is zo snel mogelijk de zuivere
fractie [11C]-raclopride te isoleren.
De opzuivering wordt gerealiseerd aan de hand van High Performace Liquid
Chromatography (HPLC). Dit is een chromatografische techniek waarbij een mengsel
gescheiden wordt op basis van de interactie met de stationaire fase gepakt op een kolom.
Hierbij wordt een mobiele fase gebruikt, die met een hoge druk over de kolom gepompt wordt
(Snyder et al., 2003). De stationaire fase kan hydrofiele (normal phase) of hydrofobe
(reversed fase) eigenschappen hebben. Vaak wordt silica, al dan niet gemodificeerd, als
Materialen en methoden
20
stationaire fase gebruikt. Hoe goed het mengsel gescheiden wordt, hangt af van verschillende
factoren. De belangrijkste zijn de samenstelling van de mobiele fase, de eigenschappen van de
stationaire fase, de flow (mL/min), lengte en diameter van de kolom en de pakkingsdichtheid.
De fractie [11C]-raclopride wordt, via twee filters met een poriëngrootte van 0,22 µm, naar
een steriele opvangvial geleid. Deze wordt dan in een loodcontainer geplaatst en kan de de
opvangvial uit de hot-cell genomen worden.
Nadat de opzuivering is doorgegaan, wordt op het af te leveren product een kwaliteitscontrole
uitgevoerd. Hierbij wordt eveneens de HPLC-techniek toegepast om enkele kwaliteitseisen na
te gaan (zie 3.4.2).
3.3.1 Mobiele fase
De mobiele fase die gebruikt wordt bij de HPLC-opzuivering is steriele 0.05 M
ammoniumacetaat buffer/ethanol: 70/30 (V/V) bij pH 6. Het water dat hierbij gebruikt wordt
is water voor injectie (B. Braun Medical, Melsungen, Duitsland). Steriele bereiding in een
LAF (laminair air flow)-kast (klasse 2) is vereist, omdat [11C]-raclopride intraveneus wordt
geïnjecteerd. Tijdens het bereiden van de mobiele fase wordt ook de buffer aangemaakt, die
gebruikt wordt om de reactie tussen O-DMR en [11C]-CH3OTf te beëindigen.
715 µL azijnzuur (Sigma aldrich, St. Louis, US) en 1190 µL ammoniumhydroxide
25% oplossing (Sigma aldrich, St. Louis, US) worden aan een fles van 250 mL water voor
injectie toegevoegd, zodat pH 6 bereikt wordt. 75 mL hiervan wordt op een Millipore express
TM plus filter (Merck KGaA, Darmstadt, Duitsland) gebracht die aangesloten is op een
vacuümpomp. Deze filter heeft een poriëngrootte van 0,22 µm en kan alle bacteriën en
virussen tegenhouden. Enkel de pyrogenen kunnen door de filter diffunderen. Het filtraat van
deze 75 mL wordt als buffer gebruikt. Bij de resterende 175 mL wordt 75 mL ethanol
toegevoegd (Chem-Lab, Zedelgem, België) en wordt de pH gecorrigeerd tot pH 6. Dit
mengsel wordt opnieuw op een Millipore express TM plus filter overgebracht. Daarna wordt
het filtraat in een steriele fles overgebracht, waarop een ventilatienaald (BD microlance 3, BD
Medical, Heidelberg, Duitsland) wordt geplaatst, die vervolgens 10 minuten in een
ultrasoonbad wordt ontgast.
3.3.2 Loop en injector
De injectie van het reactiemengsel op een HPLC-loop is een van de meest precaire
Materialen en methoden
21
delen van het syntheseproces om te automatiseren. Een loop wordt gebruikt om een
reproduceerbare hoeveelheid reactiemengsel op de kolom te kunnen injecteren. Bij de
opzuivering wordt een groot loopvolume gebruikt (500-1000 µL) in vergelijking met de
kwaliteitscontrole (20 µL).
3.3.3 Pomp
De pomp gebruikt voor de HPLC-opzuivering tijdens de synthese is een Waters 510
HPLC pomp (Meadows Instrumentation, Bristol, UK).
3.3.4 Kolom
Klassiek wordt bij de opzuivering van [11C]-raclopride reversed phase HPLC
toegepast. Hierbij heeft de stationaire fase apolaire en het eluens polaire eigenschappen. Dit
kan zowel via een semi-preparatieve als een analytische kolom gebeuren.
3.3.4.1 Semi –preparatieve kolom
Vroeger werd een semi-preparatieve kolom gebruikt voor de opzuivering van [11C]-
raclopride. Semi-preparatieve kolommen zijn de link tussen preparatieve en analytische
HPLC en zijn breder en langer dan analytische kolommen, waardoor ze een grotere
staalcapaciteit hebben.4 De kolom die vroeger in de module in het UZ Gent cyclotron werd
gebruikt is een Alltima C18-kolom (Grace, Deerfield, USA). Dit is een reversed phase kolom
waar silanolgroepen van de silica gesubstitueerd zijn met octadecyl groepen. De kolom heeft
een lengte (L) van 250 mm en een interne diameter (ID) van 10 mm en kan gebruikt worden
bij een flow van 5 mL/min.
3.3.4.2 Analytische kolom
Momenteel wordt een analytische reversed phase Alltima C-18 kolom (250 mm x4,6 mm)
(Grace, Deerfield, USA) gebruikt om [11C]-raclopride op te zuiveren uit het reactiemengsel.
De stationaire fase bestaat eveneens uit, met octadecyl gederivatiseerde, silica. Normaal
gezien is de staalcapaciteit voor een dergelijke kolom beperkt. In vele gevallen wordt in de
literatuur daarom een semi-preparatieve C18-kolom gebruikt. Echter wanneer in de praktijk
getest wordt met een analytische C18-kolom, worden alsnog bruikbare chromatogrammen
verkregen. De pieken vertonen wel wat tailing, maar daarvoor wordt gecompenseerd door de
fracties langer op te vangen. In figuur 3.6 is een opzuiveringschromatogram weergegeven.
4 https://www.chem.agilent.com/Library/applications/59801660.pdf
Materialen en methoden
22
Ook worden andere analytische kolommen getest om het opzuiveringsproces te optimaliseren,
waaronder de analytische Supelcosil™ Suplex™ pKb-100 kolom (zie 4.2).
Figuur 3.6: Chromatogram van de opzuivering van het reactiemengsel van de synthese.
(1) injectiepiek UV-detector en activiteitspiek [11C]-methanol; (2) UV-piek O-DMR en
activiteitspiek [11C]-methyliodide; (3) UV piek raclopride en activiteitspiek [11C]-
raclopride.
3.3.5 Detector
3.3.5.1 Ultraviolet/visible light
[11C]-raclopride en O-DMR bevatten een aromatische ring in hun structuur. Deze
aromatische ring is rijk aan π-elektronen, die in staat zijn om UV-licht te absorberen. De π-
elektronen vertonen een elekronenovergang naar het π* antibindend molecuulorbitaal. De
absorbantie is het omgekeerde van de transmissie en wordt als volgt geformuleerd.5
A = -log(T) (formule 3.1)
T = I/I0 (formule 3.2)
Waarin: I: intensiteit uittredende EMS
I0: intensiteit intredende EMS
T: transmissie
A: absorbantie
Het rechtlijnig verband tussen de absorbantie en de concentratie absorberend
bestanddeel in een oplossing wordt weergegeven door de wet van Lambert-Beer (formule
3.3). 5fhttp://www.plant.uoguelph.ca/research/homepages/raizada/Equipment/RaizadaWeb%20Equipment%20PDFs/5B.%20UV%20VIS%20theory%20ThermoSpectric.pdf
-1000 0
1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000
0 5 10 15 20 HPLC UV Activiteit t (min)
1 2 3
Materialen en methoden
23
A = ε. c. l (formule 3.3)
Waarin: A: absorbantie
c: concentratie absorberende component (mol/L)
l: afgelegde weg licht (cm)
ε: molaire extinctiecoëfficiënt (L/(mol.cm))
Belangrijk is om het absorptiespectrum goed te interpreteren bij het kiezen van de
optimale absorptiegolflengte. Deze wordt zo gekozen dat het verschil in absorptie tussen het
analyt en andere eventueel aanwezige interfererende solventen maximaal is.
Voor raclopride en O-DMR werd dit absorptiespectrum al eerder opgenomen. De
golflengte wordt gekozen zodat zowel raclopride als O-DMR voldoende absorberen. Als er
geen interferentie is van de mobiele fase of solvent, wordt best geopteerd voor een golflengte
van 220 nm. Aceton absorbeert weinig bij 220 nm en is mede daarom een ideaal
reactiesolvent.
De spectrofotometer die gebruikt wordt voor de opzuivering is een Smartline Knauer
UV detector (Knauer, Berlijn, Duitsland). De UV detector maakt gebruik van een
deuteriumlamp als lichtbron. Een deuteriumlamp heeft een continu spectrum, zodat de
gewenste golflengte eenvoudig geselecteerd kan worden. Er wordt een cuvet uit kwarts
gebruikt omdat glas absorbeert in het UV gebied.
3.3.5.2 Radioactiviteitsdetectoren
De radioactiviteitsdetector van het HPLC-systeem in de hot cell is een p-intrinsic-n
(PIN) fotodiode-detector. Deze is opgebouwd uit twee elektroden met daartussen een junctie
bestaande uit een klein kristal (zonder activator), met aan weerszijden semi-geleidend
materiaal. Dit semi-geleidend materiaal bestaat uit p- en n-type regio’s. De n-type regio heeft
een elektronenexcedent, terwijl de p-type regio holes’bezit. Onder invloed van een aangelegd
potentiaalverschil migreren elektronen naar de p-type regio en holes naar de n-type regio en
worden, door de achtergebleven kationen en anionen, depletiezones gevormd. Door
invallende ioniserende straling worden nieuwe holes geproduceerd, die een meetbaar
elektrisch stroomsignaal met zich meebrengen. Dit type detector is wel temperatuurgevoelig.
Hiervoor wordt gecorrigeerd door middel van een klein verwarmelement in de detector,
Materialen en methoden
24
verbonden met een thermokoppel, zodat de temperatuur constant blijft.6
De detector die de activiteit in de opvangvial meet bij de productie van [11C]-raclopride is een
Shaft ionization chamber type 70-130 (Vacutec, Dreesden, Duitsland). Dit is een gasdetector
waarbij een potentiaalverschil van 150 – 200 V is aangelegd tussen twee elektroden, die zich
in een afgesloten meetkamer met argongas bevinden. Tussen deze twee elektroden zal de
invallende straling het gas ioniseren en aanleiding geven tot ionenparen. De ontstane
elektronen en positieve ionen migreren respectievelijk naar de anode en de kathode, wat een
stroompuls oplevert. De intensiteit van de stroompuls is evenredig met de vrijgestelde energie
ten gevolge van de invallende ioniserende straling. Deze energie is afhankelijk van de
activiteit (Bq) en van de energie (eV) van de straling. Een ionisatiekamer heeft een relatief
hoge gevoeligheid voor β+-straling. Hoe groter een ionisatiekamer, hoe gevoeliger die is (De
Vos, 2012).
Figuur 3.7: Ionisatiekamer (De Vos, 2012).
3.3.6 Integrator
Bij de opzuivering wordt geïntegreerd door een computer. Deze zet het signaal van de
detector om in een chromatogram en berekent de hoogte van de verschillende pieken en het
tijdstip waarop deze elueren.
3.4 KWALITEITSCONTROLE
Volgens de Europese farmacopee 7.2 standaarden moet een injectie, die [11C]-raclopride
bevat, voldoen aan bepaalde kwaliteitseisen. Deze kwaliteitscontroles worden allemaal
uitgevoerd op het eindproduct van de synthese, al dan niet voor de vrijgave van het product.
Vooraf moeten alle kwaliteitscontroles reeds uitgevoerd zijn tijdens testsyntheses, vooraleer
de radiotracer voor klinische toepassingen gebruikt mag worden.
6 http://goldbook.iupac.org/P04598.html
Materialen en methoden
25
De kwaliteitscontroles worden uitgevoerd op de onverdunde vorm van het eindproduct. Voor
intraveneuze injecties moet de concentratie ethanol echter gereduceerd worden tot 10%
(V/V). Aangezien het eindproduct momenteel 30% (V/V) ethanol bevat, wordt driemaal
verdund alvorens te injecteren bij een patiënt.
3.4.1 Radionuclidische identiteit en zuiverheid van het radionuclide
3.4.1.1 Meting van het halfleven
Om de identiteit van het geproduceerde isotoop van het radiofarmacon te bevestigen
wordt het halfleven (T1/2) ervan bepaald. Deze controle moet voor de vrijgave worden
uitgevoerd.
Het meten van het halfleven van [11C]-raclopride gebeurt met behulp van een Atomlab
100 plus gekalibreerde ionisatiekamer (dosiskalibrator) (Biodex Medical Systems, New York,
USA). De activiteit wordt tweemaal gemeten en het tijdsinterval wordt gechronometreerd.
Aan de hand van deze gegevens en formule 3.4 kan het halfleven van [11C]-raclopride
berekend worden. De T1/2 moet gelegen zijn tussen 19,9-20,9 minuten.
𝑇1/2 = 𝑙𝑛(2)×(𝑇2−𝑇1)ln(𝐴1) −𝑙𝑛(𝐴2)
(formule 3.4)
Waarin: T1/2: Halfleven = halfwaardetijd (min)
T2-T1: tijdsverschil (min)
A1: activiteit bij begin van de meting (MBq)
A2: activiteit bij het einde van de meting (MBq)
3.4.1.2 Meting van het gamma-spectrum
De radionuclidische zuiverheid wordt uitgedrukt als de fractie van de totale
radioactiviteit afkomstig van het gewenste radionuclide. 11C-radioliganden hebben meestal
een hoge radionuclidische zuiverheid omdat de meeste radioactieve nevenproducten ofwel
een zeer korte halfwaardetijd hebben (15O) of geëlimineerd worden tijdens het syntheseproces
(13N onder de vorm van 13N2 of 13NH3). Een hoge radionuclidische zuiverheid is gewenst om
de stralingsbelasting van de patiënt te beperken en de interferentie op de beeldkwaliteit zo
laag mogelijk te houden (De Vos, 2012). Deze kwaliteitscontrole wordt voor de vrijgave van
de [11C]-raclopride oplossing uitgevoerd.
Het gamma-spectrum wordt opgenomen aan de hand van een NaI(Tl)-detector
(Ludlum measurements, Sweetwater, Texas, USA). Deze is geschikt voor het bepalen van de
Materialen en methoden
26
ioniserende straling afkomstig van een radio-isotoop dat β+-verval vertoont. De gamma-
stralen gevormd bij het annihilatiemechanisme (1.3) worden gedetecteerd.
De anorganische scintillatiekristallen zijn zo gerangschikt dat alle atomen eenzelfde
elektronenconfiguratie hebben en de elektronen zich grotendeels in eenzelfde energieniveau
bevinden, namelijk de valentieband. Als er gamma-stralen door deze kristallen worden
gestuurd, dan worden een deel van de elektronen geëxciteerd naar de conductieband. Wanneer
deze terugvallen naar de valentieband worden lichtfotonen uitgezonden. De energie die
vrijkomt, kan ook worden omgezet in thermische bewegingen. Om dit te beperken wordt
thalium aan deze kristallen toegevoegd (activator, doping). Deze thaliumatomen hebben een
lagere conductieband en een hogere valentieband. Wanneer een elektron uit het NaI-kristal
geëxciteerd wordt, zal het niet terugvallen naar zijn valentieband, maar eerst naar de
conductieband van thalium, waarbij thermische energie wordt vrijgesteld. Daarna valt het
elektron terug naar de valentieband van thalium met vrijstelling van een foton. Dit foton is
niet in staat om andere elektronen te exciteren. Dit in tegenstelling tot de hoog energetische
fotonen, bij zuivere NaI-kristallen, die ongewenste excitaties teweeg brengen. Uiteindelijk
valt het elektron terug naar de valentieband van NaI. Om geen interferentie te ondervinden
afkomstig van omgevingslicht wordt de detector omsloten door een laagje lood, waar de
gamma-stralen wel nog door kunnen (De Vos, 2012; Humm et al., 2003).
Figuur 3.8: De bandstructuur van een NaI(Tl)-detector (Humm et al., 2003).
Er zijn drie belangrijke effecten te zien op het spectrum. Ten eerste is er het foto-
elektrisch effect. Hierbij veroorzaken de foto-elektronen, onstaan onder invloed van de
gamma-stralen, een cascade van excitaties en de-excitaties met bijhorende lichtfotonen. Deze
worden allen versterkt tot een elektrisch signaal via een PMT-fototube. De sterkte van het
elektrisch signaal is evenredig met de energie van de uitgezonden foto-elektronen en dus ook
evenredig met de sterkte van de gamma-stralen (De Vos, 2012).
Materialen en methoden
27
Het tweede waargenomen effect, is compton-scatter. Hierbij wordt een elektron uit
zijn baan geschoten door een gamma-straal met een relatief hoge energie. Dit elektron kan op
zich opnieuw aanleiding geven tot excitaties en de-excitaties en daardoor fotonen opwekken.
Als het elektron echter de detector verlaat zonder volledig zijn energie af te staan, dan zal de
PMT enkel voor dit elektron een signaal opvangen. Dit fenomeen verklaart de compton-rug in
het gamma-spectrum .
Het derde fenomeen is backscatter, dat optreedt wanneer de gamma-straal intrageert
met het omhulsel van de detector. De weerkaatste gamma-straal ondergaat compton-
interacties met het kristal en geeft aanleiding tot een continu energiespectrum (De Vos, 2012).
Het spectrum van [11C]-raclopride mag enkel gamma-fotonen met een energie van 511
eV bevatten en mag niet afwijken van een gestandaardiseerde 18F oplossing.
3.4.2 Kwaliteit van de opzuivering door analytische HPLC
Via analytische HPLC wordt de chemische identiteit, de chemische en radiochemische
zuiverheid en concentratie aan eindproduct bepaald. Er wordt een staal van 0,1 mL genomen
uit de [11C]-raclopride oplossing. De kwaliteitscontrole via analytische HPLC gebeurt altijd
voor de vrijgave van de [11C]-raclopride oplossing. Indien niet voldaan aan de eisen van de
Europese Farmacopee 7.2 standaarden kan het staal niet worden vrijgegeven.
De kolom gebruikt voor de kwaliteitscontrole is een Alltima C18 HPLC-kolom (Grace,
Deerfield, USA) (250 mm x4,6 mm). Er wordt gebruik gemaakt van een 0,05M Natrium
acetaat buffer/acetonitrile: 60/40 (V/V) waaraan 5 mmol triethylamine (TEA) (Sigma aldrich,
St. Louis, USA) wordt toegevoegd. De pH bedraagt 5,5 en er wordt ultrapuur water (Nanopin
ultrapore water system) gebruikt. UV-detectie gebeurt met een Smartline Knauer UV detector
(Knauer, Berlijn, Duitsland) bij 220 nm. De radioactiviteitsdetector gebruikt bij de HPLC-
kwaliteitscontrole is een Bricon frisk-tech detector. Het injectievolume is 20 µL en de flow
bedraagt 1 mL/min. Het HPLC-systeem voor de kwaliteitscontrole maakt gebruik van een C-
R8A Shimadzu chromatopac integrator (Shimadzu Scientific Instruments, Columbia, USA).
Er kunnen verschillende parameters aangepast worden. Attenuatie is daarbij een van de
belangrijkste. Door deze parameter aan te passen wordt de weergave van een piek groter of
kleiner. Dit is noodzakelijk om een bruikbaar chromatogram te verkrijgen bij zowel relatief
grote als kleine hoeveelheden analyt. De gebruikte pomp is een Waters 515 HPLC pomp
(Meadows Instrumentation, Bristol, UK).
Materialen en methoden
28
De kwaliteitscontrole wordt uitgevoerd aan de hand van verschillende
referentieoplossingen. Een eerste bevat 0,29 µmol raclopride-tartraat (Sigma aldrich, St.
Louis, USA) per mL water voor injectie (referentieoplossing A), ter identificatie van de
raclopridepiek. Een tweede bevat bepaalde hoeveelheden O-DMR HBr (ABX, advanced
biochemical compounds, Radeberg, Duitsland) en raclopride-tartraat die overeenkomen met 1
µg O-DMR en 10 µg raclopride in 2 mL (referentieoplossing B).
Belangrijk is ook dat de limit of detection (LoD) en de limit of quantification (LoQ)
bepaald worden voor raclopride en O-DMR. De LoD is de laagste concentratie van een
substantie die kan onderscheiden worden van de blanco met een UV-detector. Deze bedraagt
voor raclopride 0,21 µM en voor O-DMR 0,23 µM. De LoQ wordt gedefinieerd als de
concentratie die op een kwantitatieve manier en met voldoende accuraatheid en precisie kan
bepaald worden. Voor raclopride is dit 0,71 µM en voor O-DMR 0,35 µM.
3.4.2.1 System Suitability Test (SST)
Het doel van een system suitability test is om een adequate HPLC-analyse te
verzekeren. De HPLC-analyse moet aan twee belangrijke eisen voldoen. Ten eerste moet de
resolutie tussen de pieken voor raclopride-tartraat en O-DMR HBr minstens 5 bedragen bij
injectie van referentieoplossing B. Ten tweede moet de relatieve retentietijd van O-DMR ten
opzichte van raclopride 0,65 (±0,10) zijn. Dit laatste is een maat voor reproduceerbaarheid.
3.4.2.2 Identiteit
De grootste piek in het radiogram van de testoplossing moet een gelijkaardige tR
hebben ten opzichte van de grootste piek in het UV chromatogram verkregen door injectie
van referentieoplossing A.
3.4.2.3 Chemische zuiverheid
Er worden eisen gesteld in verband met de aanwezigheid van onzuiverheden in het
eindproduct. De belangrijkste onzuiverheid in het eindproduct met [11C]-raclopride is de
precursor O-DMR. De piekoppervlakte van O-DMR op het UV chromatogram van de
testoplossing mag niet groter zijn dan de piekoppervlakte van O-DMR van referentieoplossing
B.
3.4.2.4 Radiochemische zuiverheid (RCP)
Het percentage van het gewenste radio-isotoop, dat zich bevindt onder de correcte
Materialen en methoden
29
chemische vorm, wordt gedefinieerd als de radiochemische zuiverheid. Deze wordt berekend
aan de hand van de volgende formule.
% 𝑅𝐶𝑃 = �𝑃MRC
𝑃TRC� × 100 (formule 3.5)
Waarin: PMRC: piekoppervlakte van de gewenste component op het
radioactiviteitchromatogram
PTRC: som van de piekoppervlaktes op het radioactiviteitchromatogram
3.4.2.5 Specifieke activiteit
Specifieke activiteit wordt gedefinieerd als de ratio van de radioactiviteit, uitgedrukt in
GBq van een bepaald radio-isotoop ten opzichte van de hoeveelheid uitgedrukt in eenheid van
massa (µmol). De specificaties betreffende specifieke activiteit stellen dat de piekoppervlakte
van raclopride op het UV chromatogram van de testoplossing niet groter mag zijn dan de
piekoppervlakte van raclopride op het UV chromatogram van de referentieoplossing B.
3.4.3 Farmaceutische kwaliteit
3.4.3.1 pH meting
De pH van de racloprideoplossing, die IV wordt geïnjecteerd, moet gelegen zijn tussen
pH 4 en pH 8,5. Om de pH te bepalen worden pH-strips (Merck KGaA, Darmstadt, Duitsland)
gebruikt die meten binnen het pH 2,0- pH 9,0 gebied. Het bepalen van de pH gebeurt voor de
vrijgave van het [11C]-raclopride product.
3.4.3.2 Controle op residuele solventen via GC
Om na te gaan of er geen residueel aceton aanwezig is in het eindproduct wordt een
gaschromatografie (GC)-analyse uitgevoerd. GC is een scheidingstechniek die gebruik maakt
van een vloeibare (GLC) of vaste stationaire (GSC) fase en een inert gas (He, N2, H2) als
dragergas.
De voorwaarde om een bepaald bestanddeel via GC te kunnen analyseren is dat de stof
in kwestie een laag kookpunt heeft en het moleculair gewicht kleiner is dan 1000 Da. De
meeste organische solventen voldoen aan deze vereisten en kunnen dan ook perfect aan de
hand van een GC-run geanalyseerd worden. Het scheidingsproces gebeurt op basis van twee
eigenschappen. Ten eerste op basis van de dampspanning en ten tweede volgens affiniteit
voor de stationaire fase.
Materialen en methoden
30
Een gaschromatograaf bestaat uit een oven waar zich een GC-kolom en een
injectiepoort in bevindt. Door deze kolom wordt een dragergas gestuurd. De GC aanwezig in
de cyclotronunit maakt gebruik van een headspace-injector. Bij deze techniek wordt een
bepaalde hoeveelheid vloeibaar staal afgesloten in een vial met een septum en dop. Deze is
slechts voor een deel gevuld. De vrije ruimte boven de vloeistof wordt de headspace
genoemd. De headspace laat toe dat er staal verdampt wanneer het gethermostatiseerd wordt.
Uit de gasfase wordt, met behulp van een naald, een monster met een bepaald volume
genomen, dat vervolgens geïnjecteerd wordt op de kolom. Deze methode voor injectie is
ideaal voor vluchtige analyten in waterige stalen (Grob et al., 2004).
Tabel 3.1: Eigenschappen gaschromatograaf.
Toestel Thermo Focus GC Gaschromatograph (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA)
Kolom capillaire Crossbond kolom (L: 30 m; ID: 0,65 mm; filmdikte: 3 μm) Stationaire fase 6% polycyanopropylphenylsiloxaan– 94% dimethyl polysiloxane Dragergas helium 5 ml/min Injectiesysteem Thermo Triplus headspace (Thermo Fisher Scientific, Waltham,
Massachusetts, USA) Detector Flame Ionization Detector (FID) Injectievolume 1 mL
Voor de analyse van residuele solventen wordt hier temperatuursprogrammatie
toegepast. Eerst wordt de kolom voor 20 min bij 40 °C gethermostatiseerd. Daarna 20 min bij
50 °C en tenslotte wordt de temperatuur tot 240 °C opgedreven aan 10 °C per min. De
injector wordt bij 140 °C gethermostatiseerd en de detector bij 250 °C.
Als detector wordt een FID (flame ionization detector) gebruikt. Hierbij wordt het
mengsel, met carrier gas, gemengd met H2-gas en door een hete jet gestuurd. Het H2 mengsel
vloeit samen met een O2 stroom en dit zorgt voor een continue diffusievlam. Deze
bewerkstelligt de ionisatie van de te analyseren moleculen. Hierbij worden zowel kationen als
anionen gevormd. Een positief geladen collectorelektrode trekt de negatief geladen ionen aan
en er wordt een signaal gegenereerd door een elektronenmultiplier. Het signaal is afhankelijk
van de hoeveelheid koolstofatomen in de te analyseren molecule. De gevoeligheid tussen de
C-verbindingen onderling verschilt weinig. FID kan beschouwd worden als een universele en
massastroomgevoelige detector. De GC-analyse wordt pas na de vrijgave uitgevoerd, omdat
een dergelijke analyse veel tijd in beslag neemt (Beesley et al., 2000).
Materialen en methoden
31
Figuur 3.9: FID.7
3.4.3.3 Endotoxinetest
Endotoxines, of ook wel pyrogenen of lipopolysachariden genoemd, zijn biologische
toxines die deel uit maken van het buitenste cytoplasmatisch membraan van bepaalde gram
negatieve bacteriën. Endotoxines lokken een sterke inflammatoire reactie uit. Bij systemische
infectie veroorzaken ze een levensbedreigende sepsis en shock (Wang, 1998). Vandaar dat de
[11C]-raclopride oplossing vrij moet zijn van pyrogenen volgens de Europese Farmacopee 7.2
standaarden. Deze test wordt uitgevoerd na de vrijgave van de [11C]-raclopride oplossing.
Om eventueel aanwezige pyrogenen te detecteren in een radiofarmacon wordt een
LAL-test uitgevoerd. LAL staat voor Limulus Amoebocyte Lysate ofwel het amoebelysaat
van de Limulus krab. De test die hier werd uitgevoerd is een Kinetic Chromogenic Bacterial
Endotoxin Determination. Hierbij wordt een gemodificeerd amoebelysaat gebruikt. Dit is een
zymogeen of pro-enzym dat geactiveerd wordt door pyrogenen. In aanwezigheid van
pyrogenen zal het geactiveerde LAL para-nitroaniline (pNA) afsplitsen van het LAL-
substraat.
Figuur 3.10: Principe LAL-test.8
Para-nitroaniline heeft een gele kleur, dewelke spectrofotometrisch kan gekwantificeerd
worden. Er wordt gemeten bij 405 nm en bij een temperatuur van 37 °C. De gebruikte LAL-
kit werd aangekocht bij de firma Lonza (Walkersville, USA). Om deze LAL-test uit te voeren,
7 http://www.srigc.com/FID.pdf 8 http://www.lonza.co.jp/bioscience/rapid-testing-solutions/endotoxin/pdf/647u.pdf
Materialen en methoden
32
wordt in een LAF-kast (type 2) gewerkt.
Momenteel wordt gewerkt aan een methode om via een nieuw toestel de endotoxines voor de
vrijgave van het eindproduct te bepalen.
3.4.3.4 Steriliteitstesten
Aangezien het eindproduct wordt gebruikt voor intraveneuze injecties bij de mens, zijn
steriliteit en afwezigheid van pyrogenen absolute vereisten.
Twee testen die jaarlijks één maal extern uitgevoerd moeten worden, zijn een
Bioburden analyse en een gewone steriliteitstest op het eindproduct. Deze analyses worden
door de firma LCA Laboratoire de Contrôle et d'Analyse (Avenue Jean Jaurès 46, Brussel,
België) uitgevoerd.
Er worden verder ook interne steriliteitstesten uitgevoerd. Twee verschillende
voedingsbodems worden gebruikt om te testen op aanwezigheid van micro-organismen. De
eerste soort voedingsbodem is TSB bodem (tryptic soy broth for microbiolgy (500 g), Merck
KGaA, Darmstadt, Duitsland). Ten tweede wordt een VTM-bodem (fluid thioglycolate
medium for microbiology (500 g), Merck KGaA, Darmstadt, Duitsland) aangemaakt. Deze
worden overgebracht in serumflessen (100 mL), afgesloten met een rubberen stop en een
aluminium kapsel en worden vervolgens geautoclaveerd gedurende 15 min bij 121 °C.
Na een synthese wordt met een steriele spuit 0,1 mL radiofarmacon aan de TSB en
VTM-voedingsbodem toegevoegd en gewacht tot alle activiteit verdwenen is. Daarna wordt
de TSB-bodem geïncubeerd bij 20-25 °C en de VTM bodem bij 30-35 °C gedurende 14
dagen. Er wordt gecontroleerd op microbiële groei na 7 en 14 dagen.
Resultaten en discussie
33
4 RESULTATEN EN DISCUSSIE
4.1 OPTIMALISATIE VAN DE OPBRENGST
4.1.1 Optimalisatie van de omzetting [11C]-CH3I naar [11C]-CH3OTf
Om de omzetting van [11C]-CH3I naar [11C]-CH3OTf te optimaliseren worden
triflaatkolommen getest, die een verschillende hoeveelheid of verhouding van triflaat (Sigma
aldrich, St. Louis, USA) en koolstof (Graphpac-GC 80/100) (Grace, Deerfield, USA)
bevatten. Deze mengsels worden in een glasbuisje afgesloten met glaswol.
Er worden in totaal drie verschillende triflaatkolommen getest. Een eerste bevat 1250
mg in een 1:1 verhouding. Vervolgens wordt ook een triflaatkolom met 1250 mg triflaat/kool
mengsel in een 3:1 verhouding aangemaakt. Deze twee kolommen worden aan de hand van
dezelfde methode aangemaakt. De hoeveelheden worden afgewogen, gemengd en daarna
opgewarmd met een warmtepistool.
Een derde kolom wordt op een alternatieve manier aangemaakt. Er wordt opnieuw
1250 mg triflaat/koolstofmengsel (1:1) afgewogen. Vervolgens wordt dit gesuspendeerd in
droge acetonitrile (Acros Organics, Geel, België) en uitgedampt met behulp van een rotavapor
R 114 (Büchi, Flawil, Zwitserland). Daarna wordt dit mengsel tot poeder gemalen (stamper en
mortier) en in de kolom overgebracht.
Om de activiteit van het omgevormde [11C]-CH3OTf rechtstreeks te kunnen meten,
wordt tijdens de synthese gebruik gemaakt van een precursor die enkel met [11C]-CH3OTf
reageert en niet met [11C]-CH3I. Hiervoor wordt 4-(4-nitrobenzyl)pyridine (NBP) gebruikt.
NBP is een relatief slecht nucleofiel maar reageert toch met [11C]-CH3OTf (Jewett, 1992). Dit
kan verklaard worden door de kinetiek van een SN-2 nucleofiele substitutie. Deze reactie kent
een 2e orde kinetiek, waarbij zowel de leaving-group als het nucleofiel een invloed hebben op
de reactiesnelheid. Enkel triflaat, dat een zeer goede leaving group is, reageert met het matig
nucleofiele NBP. 20 mg NPB/0,5 mL aceton oplossing wordt voor de synthese in de
reactievial overgebracht. Het [11C]-CH3OTf, [11C]-CH3I en [11C]-CH3OH worden allen naar
de reactievial geleid, waar enkel het [11C]-CH3OTf kan reageren met het NBP. Vervolgens
wordt een He-stroom door de reactievial gestuurd, waardoor het niet gereageerde en tevens
vluchtige [11C]-CH3I en [11C]-CH3OH verdampen en enkel het gereageerde [11C]-CH3-NPB
overblijft. Als alle aceton verdampt is, wordt de activiteit gemeten. Belangrijk is dat de
tijdspanne van de reactie wordt gechronometreerd, zodat gecorrigeerd kan worden voor het
Resultaten en discussie
34
verval. Op deze manier kan de hoeveelheid [11C]-CH3OTf uitgedrukt worden in MBq. Dit
wordt voor alle triflaatkolommen toegepast, zodat de methode met het hoogste rendement,
kan worden onderscheiden. Het rendement van de omzetting van [11C]-CH3I naar [11C]-
CH3OTf kan hieruit ook berekend worden.
Figuur 4.1: Structuurformule NBP.9
Om de opbrengst aan [11C]-CH3OTf correct te kunnen berekenen is een kalibratie van
de reactievial vereist. De vial werd in een specifieke geometrische positie geplaatst en
vervolgens werd deze gevuld met een welbepaalde hoeveelheid 18F. Nadat de activiteit
voldoende gedaald is, wordt de hot cell geopend en de radioactiviteit gemeten met een
dosimeter. Er wordt teruggerekend voor het verval op verschillende tijdstippen. Zo kan de
absolute radioactiviteit (MBq) ter hoogte van de vial uitgedrukt worden in functie van het
nettosignaal afkomstig van de detector. Aan de hand van verschillende meetpunten werd een
ijklijn opgesteld (Figuur 4.2).
Figuur 4.2: Ijklijn kalibratie reactievial. Metingen zijn in het blauw weergegeven. De
zwarte rechte is de extrapolatie van de ijklijn.
De berekening van het rendement gebeurt als volgt. Nadat de reactie tussen [11C]-
CH3OTf en NBP is doorgegaan, wordt het aceton verdampt samen met [11C]-CH3I en [11C]-
CH3OH. De detector blijft gedurende dit proces meten (Figuur 4.3). Wanneer alle aceton 9 http://www.rdchemicals.com/chemicals.php?mode=details&mol_id=2592
y = 12,74x + 20,097 R² = 0,9998
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000
Net
tosi
gnaa
l
MBq
CALIBRATIE DETECTOR REACTIEVAATJE
Resultaten en discussie
35
verdampt is, wordt op dit tijdstip teruggerekend voor het verval. Via de kalibratiecurve wordt
afgeleid hoeveel MBq [11C]-CH3-NBP aanwezig was in de vial, nadat de reactie volledig was
doorgegaan. Vervolgens wordt dit aantal MBq gedeeld door het werkelijke aantal MBq in de
reactievial. Zo wordt het rendement van de omzetting van [11C]-CH3I naar [11C]-CH3OTf
verkregen.
Figuur 4.3: NBP-test 1250 mg (1:1).
Het rendement van de omzetting met behulp van de verschillende triflaatkolommen
wordt in de tabel 4.1 weergegeven.
Tabel 4.1: Rendement triflaatkolom.
Inhoud triflaatkolom Rendement omzetting 1250 mg (1:1) 90% 1250 mg (3:1) 91% 1250 mg (1:1) (alternatieve methode) 91%
Uit de resultaten blijkt dat de verschillende samenstellingen van de triflaatkolom
weinig tot geen effect hebben op het rendement van de omzetting van [11C]-CH3I naar [11C]-
CH3OTf.
4.1.2 Testen van verschillende loopvolumes
Om het chromatogram van het reactiemengsel te optimaliseren worden verschillende
loopvolumes getest. Het volume van een loop heeft namelijk invloed op de piekbreedte. Een
kleinere loop levert smallere pieken op, wat de resolutie ten voordele komt en het eindvolume
in de opvangvial reduceert. Desondanks moet er ook rekening gehouden worden met het feit
dat nooit alles perfect op de loop geïnjecteerd kan worden. Er is telkens een kleine fractie van
de te injecteren vloeistof, die achterblijft in de vial en in de leidingen. Bij een kleiner
startvolume is de oplossing meer aangeconcentreerd. Bij kleinere injectievolumes zal het
Resultaten en discussie
36
relatief verlies van vloeistof tegenover het totaalvolume ook groter zijn. Vandaar dat bij een
kleiner loopvolume er een groter absoluut verlies van activiteit zal zijn. Er worden drie
loopvolumes getest.
Tabel 4.2: Samenstelling loopvolume.
Loopvolume Solvent/ buffer verhouding 1000 µL 200 µL aceton/800 µL buffer 750 µL 200 µL aceton/550 µL buffer 500 µL 200 µL aceton/300 µL buffer
Figuur 4.4: Activiteitsgrafieken syntheses verschillende loopvolumes (bovenaan 1000 µL
loop, midden 750 µL loop, onderaan 500 µL loop).
Tabel 4.3 beschrijft het procentueel volume dat geïnjecteerd is op de loop. Dit wordt
Resultaten en discussie
37
bekomen door de activiteit die geïnjecteerd werd te delen door de activiteit in de reactievial
(RV) voor injectie. De activiteit in de reactievial wordt berekend door het verschil te nemen
van de maximale waarde van de groene curve en zijn baseline voor de injectie. De
geïnjecteerde hoeveelheid activiteit wordt berekend door het verschil te nemen van maximale
waarde van de groene curve en de basislijn na de injectie (Figuur 4.4). De waarden van de
geïnjecteerde activiteit zijn gecorrigeerd voor het verval.
Tabel 4.3: Resultaten loop-testen.
Volume Signaal RV Activiteit geïnjecteerd % geïnjecteerd % verlies 1000 µL 2706 2675 99% 1% 750 µL 2335 2231 96% 4% 500 µL 2842 2453 86% 14%
Uit de resultaten kan de conclusie worden getrokken dat er weinig activiteit verloren
gaat wanneer voor de 750 µL loop wordt gekozen in plaats van de 1 mL loop. Het gebruik
van de 750 µL loop is daardoor perfect verantwoord. De loop met het volume van 500 µL
geeft echter wel aanleiding tot een relatief groot verlies van activiteit. Dit alles in
beschouwing genomen, wordt geopteerd voor de loop van 750 µL. Deze zal smallere pieken
opleveren dan de 1000 µL loop, zonder dat hierbij een significant activiteitsverlies optreedt.
4.2 OPTIMALISATIE VAN DE OPZUIVERING
4.2.1 Analytische C18-kolom
Scheiding via de analytische reversed phase Alltima C-18 kolom (250 mm x4,6 mm)
tijdens de opzuivering van [11C]-raclopride, gebeurt momenteel bij een flow van 2 mL/min.
Omdat een dergelijke relatief hoge flow voor een analytische kolom niet zo gunstig is, wordt
gestreefd naar een scheiding bij 1 mL/min. Aan de hand van een gelijkaardige Alltima C-18
kolom (150 mm x4,6 mm) worden verschillende nieuwe mobiele fasen getest. De beste
resultaten worden in tabel 4.4 weergegeven.
Tabel 4.4: Resultaten verschillende 0,010 M fosfaatbuffers (flow 1 mL/min).
% EtOH tR Raclopride-tartraat (min) tR O-DMR HBr (min) tR CH3I (min) pH 7 40,0 12,20 6,359 9,699 45,0 9,384 4,911 8,152
Deze verschillende mobiele fasen kunnen later getest worden tijdens syntheses. Eerst
wordt vooral gefocust op de kolom gebruikt in 4.2.2.
Resultaten en discussie
38
4.2.2 Analytische Supelcosil™ Suplex™ pKb-100 HPLC kolom
4.2.2.1 'Koude' testen
Zowel analytische als semi-preparatieve C18 reversed phase kolommen leveren een
relatief goede scheiding op van het reactiemengsel. Scheiding gebeurt op basis van het
verschil in lipofiliciteit tussen O-DMR en [11C]-raclopride. De extra gemethyleerde
hydroxylfunctie bij [11C]-raclopride is verantwoordelijk voor de langere retentietijd van [11C]-
raclopride ten opzichte van O-DMR. Deze lipofiele methoxy-functie van [11C]-raclopride
vertoont een sterkere interactie met de octadecyl-substituenten op de silica pakking dan de
hydroxylgroep van O-DMR, waardoor [11C]-raclopride langer wordt weerhouden.
Literatuurgegevens tonen echter een gunstigere scheiding aan bij gebruik van een
semi-preparatieve Supelcosil™ Suplex™ pKb-100 HPLC kolom (Supelco-analytical, St.
Louis, USA) (Lehel et al., 2009). Aan de hand van deze kolom wordt er geprobeerd om het
effect van het verschil in lipofiliciteit op de retentievolgorde te verminderen. Dit gebeurt door
een minder hydrofobe stationaire fase te kiezen en in te spelen op het feit dat O-DMR, een
zuurder karakter heeft dan [11C]-raclopride. Daarom wordt voor een basische kolom
geopteerd, meerbepaald een zogenaamde base deactivated kolom, die een grotere polaire
activiteit bezit (Lehel et al., 2009).
Figuur 4.5: Omgekeerde retentievolgorde met semi-preparatieve Supelcosil™ Suplex™
pKb-100 HPLC kolom (Lehel et al., 2009).
De stationaire fase van deze semi-preparatieve HPLC kolom bestaat uit sferische
poreuze silica partikels, waarvan het oppervlak gemodificeerd is. Een deel van de vrije
silanolgroepen is gesubstitueerd met C16-alkylamide.
Doordat de scheiding van O-DMR en [11C]-raclopride nu meer gebaseerd is op de
polaire interacties met de alkylamide-groepen, zal O-DMR later elueren dan [11C]-raclopride.
Resultaten en discussie
39
De vrije hydroxylgroep van O-DMR kan namelijk een extra waterstofbinding aangaan
met de stationaire fase en zal zo langer weerhouden worden (Figuur 4.5). Acetaatbuffer 0,025
M pH 3/ethanol 75/25 (V/V) werd als mobiele fase gebruikt bij 6 mL/min (Lehel et al., 2009).
In dit onderzoek wordt echter nagegaan of deze scheiding met omgekeerde
retentietijden ook mogelijk is met behulp van een analytische Supelcosil™ Suplex™ pKb-100
HPLC kolom (Tabel 4.5). Deze analytische kolom heeft verschillende voordelen tegenover de
semi-preparatieve kolom. Een dergelijke kolom levert een gelijkaardige of snellere
opzuivering op als een semi-preparatieve kolom. Maar bovendien zal door de lagere flow (1
mL/min i.p.v. 6 mL/min) en de korte opvangtijd het eindvolume veel kleiner zijn.
Tabel 4.5
Eigenschappen analytische Supelcosil™ Suplex™ pKb-100 HPLC kolom Stationaire fase Silica gemodificeerd met C16-alkylamide Diameter partikels 5 μm L × I.D. 150 mm x4.6 mm pH-range 2 - 7.5 Poriëngrootte 120 Å
Om testen te kunnen uitvoeren met de kolom, wordt een standaard met O-DMR HBr
en raclopride-tartraat aangemaakt. De concentraties in de oplossing zijn bij benadering
analoog aan deze van het eindproduct tijdens de synthese.
De keuze van mobiele fase is heel belangrijk. Deze heeft een grote invloed op het
elueren van de verschillende componenten. Om de retentietijd te optimaliseren worden
verschillende mobiele fasen getest. 0,025 M citraatbuffers pH 2,5 tot pH 5 worden getest,
telkens met een variërende ethanolconcentratie tussen de 10% (V/V) en 30% (V/V). Ethanol
fungeert hier als modifier. De buffers bij pH 4 en 5 bleken meteen onbruikbaar, omdat de
fracties veel te laat elueerden.
Tabel 4.6: Resultaten verschillende 0,025 M citraatbuffers (flow 1 mL/min).
% EtOH tR Raclopride-tartraat (min) tR O-DMR (min) tR CH3I (min) pH 3 25,0 6,163 12,710 9,774 30,0 4,443 8,645 7,981 27,5 5,146 10,871 9,470 pH 2,5 25,0 5,012 9,652 8,942
Bij de buffers, waarmee een basislijn scheiding werd gerealiseerd, wordt tevens de
retentietijd van CH3I nagegaan. De resultaten zijn weergegeven in tabel 4.6.
Deze resultaten in beschouwing genomen lijkt de 0,025 M citraatbuffer pH 3/ethanol:
Resultaten en discussie
40
72,5/27,5 (V/V) de beste mobiele fase. Er is een goede baseline scheiding tussen raclopride-
tartraat en het ongewenste O-DMR HBr en MeI. Ook de 0,025 M citraatbuffer pH
2,5/ethanol: 75/25 (V/V) en de 0,025 M citraatbuffer pH 3/ethanol: 75/25 (V/V) mobiele
fasen zijn veelbelovend en kunnen later getest wordens tijdens een synthese. Als de fracties
vroeger dan vijf minuten elueren, bestaat er echter een kans dat de piek van raclopride
samenvalt met deze van methanol, die een retentietijd heeft van 2-3 min. Daarom wordt toch
eerder geopteerd voor een mobiele fase waar raclopride slechts na 5,5 à 6 minuten elueert.
Bijgevolg wordt gesteld dat de Supelcosil™ Suplex™ pKb-100 HPLC kolom twee
belangrijke voordelen heeft ten opzichte van vorige kolommen bij de opzuivering van [11C]-
raclopride. Ten eerste wordt er een omgekeerde retentievolgorde gerealiseerd met de nieuwe
kolom ten opzichte van de klassieke C18-kolom. Dit levert een kortere retentietijd op voor
[11C]-raclopride, wat een voordeel is, aangezien de radiochemische opbrengst hoger zal zijn.
Tenslotte is de precursor meestal in relatief hoge concentratie aanwezig, waardoor er tailing
optreedt. Hierdoor moeten de pieken van O-DMR en [11C]-raclopride ver van elkaar gelegen
zijn om geen grote hoeveelheden O-DMR in het eindproduct te bekomen. Met deze nieuwe
kolom is dit niet meer nodig aangezien [11C]-raclopride eerst elueert.
4.2.2.2 'Warme' testen
De componenten voor de aanmaak van mobiele fase (citroenzuur en sodium citrate
tribasic dehydrate, Sigma Aldrich, St. Louis, USA) werden vooraf getest op aanwezigheid van
pyrogenen. Deze testen waren negatief. Om de succesvolle mobiele fasen te testen tijdens een
synthese van [11C]-raclopride, wordt tien minuten bestraald bij 14 µA. Voor de opzuivering
wordt 0,010 M citraatbuffer pH 3/ethanol: 72,5/27,5 (V/V) als mobiele fase gebruikt. Zoals
verwacht zijn de retentietijden van [11C]-raclopride en O-DMR omgekeerd (Figuur 4.6). Op
het signaal van de radioactiviteitsdetector is te zien hoe [11C]-raclopride elueert na ongeveer
4,5 minuten en basislijn gescheiden is van [11C]-methanol dat na 3 minuten elueert en [11C]-
CH3I dat pas na 11 minuten elueert. Op het UV-chromatogram is de piek van O-DMR terug te
vinden bij 11 minuten.
De fractie [11C]-raclopride wordt opgevangen gedurende 2 min, bij een flow van 1
mL/min. De HPLC-kwaliteitscontrole toonde aan dat de hoeveelheid O-DMR nu onder de
LoD en LoQ ligt en er geen andere onzuiverheden, die absorberen in het UV-gebied,
aanwezig zijn in het eindproduct (Figuur 4.6).
Resultaten en discussie
41
Figuur 4.6: Chromatogram opzuivering [11C]-raclopride met Analytische Supelcosil™
Suplex™ pKb-100 kolom en 0,010 M citraatbuffer pH 3/ethanol: 72,5/27,5 (V/V) als
mobiele fase.
In vergelijking met de analytische C18-kolom wordt de fractie [11C]-raclopride veel
vroeger bekomen en is er geen O-DMR meer aanwezig in het eindproduct (3.3.4.2: Figuur
3.6). Dit betekent een tijdswinst van minstens 5 minuten. Ook wordt slechts 2 mL
opgevangen, terwijl de ethanolconcentratie nog lager ligt dan bij de C18-kolom met 0.05 M
ammoniumacetaat buffer/ethanol: 70/30 (V/V) als mobiele fase. Na de verdunning tot 10%
(V/V) ethanol wordt een eindproduct verkregen waarbij het aantal MBq/mL veel hoger zal
zijn.
Figuur 4.7: HPLC-QC: (A) Het activiteitchromatogram bevat enkel een piek voor [11C]-
raclopride. (B) Op het UV-chromatogram is enkel een piek van raclopride te zien, die
onder de limiet van 10 µg/mL gelegen is.
De mobiele fase voor deze Supelcosil™ Suplex™ pKb-100 is hierna verder
-1000 0
1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000
10000 11000 12000 13000
0 5 10 15 20 HPLC UV Activiteit
t (min)
Resultaten en discussie
42
geoptimaliseerd. Een 0,010 M citraatbuffer pH 3/ethanol: 75/25 (V/V) mobiele fase bij 1
mL/min leverde een [11C]-raclopride piek op na 5 minuten. Deze is nog beter gescheiden van
het [11C]-methanol. Op het UV- en activiteitchromatogram zijn geen onzuiverheden terug te
vinden en er wordt een hoge chemische zuiverheid geconstateerd (Figuur 4.7).
In de toekomst zal deze opzuivering gebruikt worden voor de synthese van [11C]-
raclopride en zullen nieuwe SOP's (standard operating procedures) voor de kwaliteitscontroles
worden opgesteld.
4.3 KWALITEITSCONTROLE
4.3.1 Radionuclidische identiteit en zuiverheid van het radionuclide
4.3.1.1 Meting van het halfleven
Bij alle halfwaardetijdopnames wordt een halfleven bekomen dat zich binnen het
interval 19,9-20,9 bevindt (Tabel 4.7). Hiermee wordt zowel de radionuclidische identiteit en
radionuclidische zuiverheid bevestigd. Het tijdsinterval tussen de twee activiteitsmetingen
bedraagt exact 5 minuten.
Tabel 4.7
Datum QC Achtergrond (MBq) Meting 1 (MBq) Meting 2 (MBq) T1/2 (min) 30-3-2012 0,333 83,62 70,30 20,0 18-4-2012 0,189 219,8 184,6 19,9 19-4-2012 0,171 203,5 171,3 21,3 20-4-2012 0,185 345,6 272,0 21,5 04-5-2012 0,148 175,4 148,4 20,7 08-5-2012 0,152 162,1 136,2 19,9 10-5-2012 0,222 105,1 88,43 20,0 14-5-2012 0,148 126.2 106.9 20.9 21-5-2012 0.150 829.5 699.3 20,3 22-5-2012 0,222 202.0 167.98 20,6
4.3.1.2 Meting van het gamma-spectrum
Bij alle kwaliteitscontroles is een gamma-piek vastgesteld bij ongeveer 511 keV. Uit
dit resultaat kan besloten worden dat het eindproduct een positronstraler bevat. Via het
halfleven kan verder bevestigd worden dat het om het isotoop 11C gaat (zie 4.3.3.1).
Resultaten en discussie
43
Figuur 4.8: Gamma-spectrum [11C]-raclopride.
4.3.2 Kwaltiteit van de opzuivering door analytische HPLC
4.3.2.1 System Suitability Test (SST)
Het gebruikte HPLC-systeem kan als conform beschouwd worden met de gestelde
eisen. De relatieve retentie van O-DMR en raclopride is telkens gelegen binnen het 0,55-0,75
interval (Tabel 4.8).
Tabel 4.8
Datum QC tR O-DMR (min) tR [11C]-raclopride (min) relatieve retentie 30-3-2012 6,53 10,9 0,599 18-4-2012 5,77 10,5 0,550 19-4-2012 5,89 10,7 0,550 20-4-2012 5,98 10,8 0,554 04-5-2012 5,40 8,89 0,607 08-5-2012 5,51 9,09 0,606 10-5-2012 5,36 9,04 0,592 14-5-2012 5.62 9.55 0.588 21-5-2012 6,47 10,4 0.622 22-5-2012 6.21 10.7 0.581
𝑅 = 2 × 𝑡R(1)−𝑡R(2)𝑊(1)+𝑊(2)
(formule 4.1)
Waarin: tR(1): retentietijd [11C]-raclopride (min)
tR(2): retentietijd O-DMR (min)
W(1): piekbreedte O-DMR (min)
W(2): piekbreedte [11C]-raclopride (min)
De resolutie tussen de piek van O-DMR en deze van [11C]-raclopride is bij elke
Resultaten en discussie
44
kwaliteitscontrole groter dan de vijf (Tabel 4.9). De resolutie wordt aan de hand van formule
4.1 berekend.
Tabel 4.9
Datum QC Piekbreedte O-DMR (min) Piekbreedte [11C]-raclopride (min) R 30-3-2012 0,5 0,8 6,69 18-4-2012 0,4 1,0 6,76 19-4-2012 0,3 1,0 7,37 20-4-2012 0,3 1,0 7,46 04-5-2012 0,3 1,0 6,36 08-5-2012 0,3 0,8 6,51 10-5-2012 0,3 0,8 6,70 14-5-2012 0,3 0,8 7,14 21-5-2012 0,3 0,8 7,18 22-5-2012 0,3 0,8 8,13
4.3.2.2 Identiteit
De tR van de grootste piek op het radiochromatogram moet gelijkaardig zijn aan de tR
van raclopride op het UV chromatogram van de referentieoplossing A. Aan deze eis is voor
alle kwaliteitscontroles voldaan.
4.3.2.3 Chemische zuiverheid
Tabel 4.10
Datum QC Chemische zuiverheid [11C]-raclopride (µg/2 mL)
Chemische zuiverheid O-DMR (µg/2 mL)
30-3-2012 3,68 <LoD 18-4-2012 8,93 0,124 19-4-2012 2,81 0,073 20-4-2012 2,36 <LoD 04-5-2012 1,57 <LoD 08-5-2012 1,41 <LoD 10-5-2012 161 <LoD 14-5-2012 2,28 <LoD 21-5-2012 3,59 <LoD 22-5-2012 4,05 <LoD
De chemische zuiverheid wordt berekend aan de hand van de volgende formule.
Craclopride (µg/2 mL) = 10 ×𝑂𝑝𝑝𝑒𝑟𝑣𝑙𝑎𝑘𝑡𝑒 𝑟𝑎𝑐𝑙𝑜𝑝𝑟𝑖𝑑𝑒 𝑈𝑉 𝑐ℎ𝑟𝑜𝑚𝑎𝑡𝑜𝑔𝑟𝑎𝑚 𝑡𝑒𝑠𝑡
𝑂𝑝𝑝𝑒𝑟𝑣𝑙𝑎𝑘𝑡𝑒 𝑟𝑎𝑐𝑙𝑜𝑝𝑟𝑖𝑑𝑒 𝑈𝑉 𝑐ℎ𝑟𝑜𝑚𝑎𝑡𝑜𝑔𝑟𝑎𝑚 𝑟𝑒𝑓𝑒𝑟𝑒𝑛𝑡𝑖𝑒
(formule 4.2)
Resultaten en discussie
45
CO-DMR (µg/2 mL) = 𝑂𝑝𝑝𝑒𝑟𝑣𝑙𝑎𝑘𝑡𝑒 𝑂 − 𝐷𝑀𝑅 𝑈𝑉 𝑐ℎ𝑟𝑜𝑚𝑎𝑡𝑜𝑔𝑟𝑎𝑚 𝑡𝑒𝑠𝑡
𝑂𝑝𝑝𝑒𝑟𝑣𝑙𝑎𝑘𝑡𝑒 𝑂 − 𝐷𝑀𝑅 𝑈𝑉 𝑐ℎ𝑟𝑜𝑚𝑎𝑡𝑜𝑔𝑟𝑎𝑚 𝑟𝑒𝑓𝑒𝑟𝑒𝑛𝑡𝑖𝑒
(formule 4.3)
De concentratie raclopride en O-DMR moet lager zijn dan de concentratie van de
referentieoplossing, respectievelijk 10 µg raclopride/2 mL en 1 µg O-DMR/2 mL (Tabel
4.10). Er kan geconcludeerd worden dat alle geanalyseerde stalen conform zijn wat betreft de
chemische zuiverheid.
4.3.2.4 Radiochemische zuiverheid (RCP)
De radiochemische zuiverheid voor alle radiofarmaceutische preparaten moet hoger
zijn dat 95%. Voor alle kwaliteitscontroles werd een radiochemische zuiverheid van meer dan
99% bekomen.
4.3.2.5 Specifieke activiteit
De specifieke activiteit wordt berekend aan de hand van formule 4.4. De 2 staat voor de
oppervlakte van de UV-fractie raclopride en de 1 de oppervlakte van de UV-fractie O-DMR.
𝑆𝑝𝑒𝑐𝑖𝑓𝑖𝑒𝑘𝑒 𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑒𝑖𝑡 = 𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑦 (𝑀𝐵𝑞)×(2)×0,06947𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 (𝑚𝐿)×(1)
(formule 4.4)
Tabel 4.11
Datum QC Specifieke activiteit (GBq/µmol) 30-3-2012 112 18-4-2012 46,6 19-4-2012 153 20-4-2012 163 04-5-2012 196 08-5-2012 221 10-5-2012 134 14-5-2012 147 21-5-2012 109 22-5-2012 100
De specifieke activiteit moet meer of evenveel bedragen als 21,40 GBq/µmol, uit tabel
4.11 kan besloten worden dat voldaan is aan de specificaties.
4.3.3 Farmaceutische kwaliteit
4.3.3.1 pH meting
Bij alle pH metingen werd een pH vastgesteld in het interval 5,5-6.
Resultaten en discussie
46
4.3.3.2 Controle op residuele solventen via GC
Van het eindproduct met [11C]-raclopride mag maximaal 2 mL geïnjecteerd worden bij
een patiënt. De concentratie van het residueel aceton moet hierbij minder bedragen dan 50
mg/2 mL of 25000 ppm. Om dit na te gaan wordt een testoplossing aangemaakt van het
eindproduct en een referentieoplossing die zowel eindproduct als een bepaalde hoeveelheid
aceton bevat. De testoplossing bevat 50 mg eindproduct en wordt aangelengd tot 6 mL met
water voor injectie (B. Braun Medical, Melsungen, Duitsland). De referentieoplossing bevat
1,25 mg aceton (Sigma aldrich, St. Louis, USA) en 50 mg eindproduct in een totaal volume
van 6 mL met water voor injectie. Beiden worden in drievoud via GC geanalyseerd.
Tabel 4.12: Resultaten GC-analyse staal A (08/02/2012) en B (24/02/2012).
A Oppervlakte Gemiddelde oppervlakte SD RSD (%) Test 1 1228172 1225793 71736 5,85 Test 2 1296310 Test 3 1152898 Oppervlakte Gemiddelde oppervlakte SD RSD (%) Ref 1 82808021 81834671 1000779 1,22 Ref 2 80808550 Ref 3 81887441 B Oppervlakte Gemiddelde oppervlakte SD RSD (%) Test 1 1140789 1221865 169138 13,84 Test 2 1108527 Test 3 1416279 Oppervlakte Gemiddelde oppervlakte SD RSD (%) Ref 1 80686020 79309953 1562478 1,97 Ref 2 77611391 Ref 3 79632448
Voor de oppervlaktes van de 3 pieken van zowel de referentie- als testoplossingen
worden de relatieve standaarddeviatie berekend. Deze mogen niet hoger zijn dan 15%. Dit
geldt als een system suitability test. Als criterium voor het aanvaarden van de [11C]-raclopride
oplossing wordt gesteld dat de piek voor aceton van de testoplossing kleiner of gelijk aan de
helft van de oppervlakte van de piek van de referentie-oplossing mag zijn.
Voor beide stalen bedraagt de RSD minder dan 15% en is de oppervlakte van de
testoplossing kleiner dan de helft van de oppervlakte van de referentie (Tabel 4.12). De twee
stalen kunnen als conform beschouwd worden voor wat betreft de contaminatie met residueel
aceton.
Resultaten en discussie
47
4.3.3.3 Endotoxinetest
Om een LAL-test uit te voeren, wordt in een LAF-kast gewerkt. De stalen [11C]-
raclopride worden 1/50 verdund met LAL-trisbuffer om de ethanolconcentratie voldoende te
verlagen, zodat er geen interferentie optreedt bij de spectrofotometrische detectie. Er worden
ook spikes aangemaakt. Daarvoor wordt 20 µL van een 5 IU/ml pyrogeenoplossing
toegevoegd aan 180 µL staal. Dit wordt gedaan om na te gaan of het staal de activiteit van
LAL niet inhibeert.
Om de pyrogenen te kunnen kwantificeren moet eerst een standaardreeks met een
gekende pyrogeenconcentratie worden aangemaakt (0,005 IU/mL, 0,050 IU/mL, 0,500 IU/mL
tot 5,000 IU/mL). Hiervoor worden E. Coli bacteriën (E.coli 055:B5) gebruikt. Deze bevatten
endotoxines in hun celwand. IU staat voor International units. Dit is een bepaalde hoeveelheid
die vastgelegd werd door experts. Om te verdunnen wordt pyrogeenvrij LAL-water gebruikt.
De standaarden worden gemeten en uitgezet via een semi-logaritmische grafiek in functie van
de onset-time (Figuur 4.10).
Figuur 4.9: Weergave van LAL-test resultaat voor 2 stalen. In kolom 2 en 3 zijn mean
values van de standaardreeks uitgedrukt. De laagste standaard begint bij C(2-3) en de
hoogste is weergegeven in F(2-3). In B1 en B2 bevindt zich een blanco. De 2 stalen
bevinden zich in B(4-5) en D(4-5) en de spikes in C(4-5) en E(4-5).
50 µL van alle testoplossingen en standaarden wordt overgebracht op een
microtitterplaat en na 10 minuten incuberen bij 37 °C wordt 50 µL van het LAL-reagens
toegevoegd. Dit bevat het LAL-zymogeen en het LAL-substraat. Daarna worden de
Resultaten en discussie
48
absorbanties gemeten in een spectrofotometer gedurende drie uur. Geleidelijk wordt p-
nitroaniline gevormd, dat gedetecteerd wordt. De absorbantie is omgekeerd evenredig met de
onset-time, namelijk de tijd die nodig is om een enige detectie te registreren. Hoe groter de
onset-time, hoe kleiner de concentratie aan endotoxines (Figuur 4.9).
Tabel 4.13: Waarden ijklijn standaarden.
Staal C (IU/mL) Wells Onset (s) Gemiddelde (s) SD RSD (%) Standaard 1 0,005 C2 5202,00 5098,50 146,4 2,9 C3 4995,00 Standaard 2 0,050 D2 2454,00 2502,00 67,88 2,7 D3 2550,00 Standaard 3 0,500 E2 1258,11 1281,82 33,53 2,6 E3 1305,53 Standaard 4 5,000 F2 732,000 735,947 4,913 0,7 F3 738,947
Rekening houdend met de eisen in verband met de ijklijn, wordt gesteld dat de
correlatiecoëfficiënt van de ijklijn groter of gelijk aan 0,98 moet zijn. De ijklijn voldoet aan
de eisen en heeft een correlatiecoëfficiënt van 0,997 (Figuur 4.10). De rico van de ijklijn moet
tevens een waarde hebben tussen -1 en 0,1. Bij dit staal is dit ook voldaan want de rico
bedraagt -0,281.
De vergelijking van de best passende rechte voor de ijklijn is de volgende:
log(𝑦) = 3,045 − 0,281 × log (𝑥) (formule 4.5)
Figuur 4.10: Ijklijn pyrogeenstandaarden.
De absolute gemiddelde waarde voor de blanco (BL) moet kleiner zijn dan de absolute
gemiddelde waarde van de 0,005 IU/mL standaard. De gemiddelde waarde voor de blanco is
R² = 0,997
500
1000
2000
4000
8000
0 1 2 3 4 5 Gem
indd
elde
ons
et st
alen
(s)
Concentratie standaard (IU/mL)
Ijklijn standaarden
Resultaten en discussie
49
0,015 IU/mL en deze voor de 0,005 IU/mL standaard 0,0947. Hiermee is aan de
vooropgestelde eis voldaan.
Tabel 4.14: Waarden blanco's.
Staal C (IU/mL) Wells Resultaat (IU/mL) Gemiddeld (IU/mL) SD RSD (%) BL 1 0,500 B2 0,012 0,015 0,003 22,9 BL 2 0,500 B3 0,017
De terugvinding van de spikes moet gelegen zijn tussen 50% en 200%. De
concentratie van de geanalyseerde spikes bedraagt 0,424 IU/mL en 0,408 IU/mL. De
verwachte waarde is 0,500 IU/mL. Er wordt een terugvinding berekend van respectievelijk
84,8% en 81,6%, waarmee deze beide in het interval 50-200% vallen.
Tabel 4.15: Waarden spikes.
Staal C (IU/mL) Wells Resultaat (IU/mL) Gemiddelde (IU/mL) SD RSD (%) Spike 1 0,500 C4 0,416 0,424 0,012 2,8 C5 0,408 Spike 2 0,500 E4 0,259 0,408 0,21 51,5 E5 0,557
Het aanvaardingscriterium voor de stalen stelt dat de concentratie aan endotoxine lager
moet zijn dan 175/V IU/ml, waarbij V het maximaal volume is aan radiofarmacon dat zal
toegediend worden.
Tabel 4.16: Waarden stalen [11C]-raclopride.
Staal Onset (s) Wells Resultaat (IU/mL) Gemiddeld (IU/mL) SD RSD (%) 03-02-12 5274,0 B4 0,004 0,008 0,005 69,7 3892,5 B5 0,012 08-02-12 7587,0 D4 0,001 0,001 0,000 0 Masked D5 Masked
De stalen bevatten 0,008 en 0,001 IU/mL. Rekening houdend met de verdunning
wordt dit respectievelijk 0,4 IU/mL en 0,05 IU/mL voor de oorspronkelijke oplossing. Dit ligt
ver beneden de grens van 87,5 IU/ml, waardoor er kan geconcludeerd worden dat beide stalen
conform zijn wat betreft het endotoxinegehalte. Er wordt 5 mL raclopride-eluens opgevangen
gedurende de opzuivering via HPLC. Dit volume wordt daarna nog drie maal verdund om de
ethanolconcentratie van 30% (V/V) terug te brengen naar 10% (V/V), zodat het aantal IU/mL
voor de injectie in werkelijkheid nog lager ligt.
4.3.3.4 Steriliteitstesten
Alle steriliteitstesten waren negatief op microbiële groei.
Conclusie
50
5 CONCLUSIE
De radiosynthese van de, met 11C gelabelde D2-receptorantagonist, [11C]-raclopride is
een complex multi-step proces. Tijdens deze onderzoeksstage werd getracht enkele van deze
stappen te optimaliseren of te perfectioneren. Ook werd de kwaliteitscontrole op het [11C]-
raclopride eindproduct geëvalueerd.
De pogingen om het rendement van de omzetting van [11C]-CH3I naar [11C]-CH3OTf
te verhogen, aan de hand van verschillende samenstellingen van de triflaat-kolom, leverden
weinig resultaat op. Allen leverden ze een rendement op van ± 90%. Uit de syntheses met
verschillende loopvolumes kan geconcludeerd worden dat best geen te klein loopvolume
gekozen wordt, omwille van het absoluut verlies aan reactiemengsel. Er werd geopteerd voor
een loopvolume van 750 µL.
De optimalisatie ter hoogte van het opzuiveringsproces was erg succesvol. Aan de
hand van een Analytische Supelcosil™ Suplex™ pKb-100 HPLC-kolom slaagden we erin
[11C]-raclopride voor de precursor O-DMR te laten elueren. Hierdoor wordt de totale
synthesetijd met minstens 5 minuten ingekort. Aangezien de synthesetijd momenteel 28
minuten bedraagt en 11C een T1/2 van 20,38 minuten heeft, is dit een significante verbetering.
De radiochemische opbrengst zal hierdoor hoger zijn. Bovendien wordt, door de lage flow (1
mL/min) met deze kolom, slechts 2,5 mL (25% EtOH) opgevangen, met als gevolg dat het
[11C]-raclopride meer aangeconcentreerd is. Het eindproduct bevat ook geen sporen O-DMR
meer, aangezien dit ver na de [11C]-raclopride fractie elueert. Deze opzuiveringsmethode zal
binnenkort operationeel zijn.
Gedurende de onderzoeksstage zijn een aantal kwaliteitscontroles, opgelegd door de
Europese farmacopee 7.2 standaarden, uitgevoerd op het [11C]-raclopride eindproduct. Uit de
resultaten kan geconcludeerd worden dat meestal ruim aan alle specificaties wordt voldaan.
Helaas zijn de verschillende onderdelen van de module, die instaan voor de synthese
van [11C]-raclopride, soms onderhevig aan hardware problemen. Hierdoor zijn
herstellingswerken noodzakelijk, waardoor de experimenten wat vertraging hebben
opgelopen. Enkele testen zijn niet kunnen doorgaan omwille van deze problemen en ook het
proefdierexperiment met behulp van PET-scanning is pas na het afwerken van de
onzoeksstage gepland.
Literatuurlijst
51
6 LITERATUURLIJST
6.1 LITERATUUR
Minagar, M. (2010). Basic Aspects of Catechol-O-Methyltransferase and the Clinical Applications of Its Inhibitors. Elsevier Science. Andersson, J., Truong, P., and Halldin, C. (2009). In-target produced [11C]methane: Increased specific radioactivity. Appl Radiat Isot 67, 106-10. Barbeau, A. (1970). Dopamine and disease. Can Med Assoc J 103, 824-32. Beesley, T. E., and Buglio, B. (2000). Quantitative Chromatographic Analysis. Marcel Dekker. Brooks, D. J. (2003). PET studies on the function of dopamine in health and Parkinson's disease. Ann N Y Acad Sci 991, 22-35. Cumming, P. (2009). Imaging Dopamine. Cambridge University Press. De Vos, F. (2010-2011). Cursus medische stralingsfysica en kernchemie.
Elsinga, P. H. (2002). Radiopharmaceutical chemistry for positron emission tomography. Methods 27, 208-17. Europese Farmacopee 7.2 standaarden. Faludi, G., Dome, P., and Lazary, J. (2011). Origins and perspectives of schizophrenia research. Neuropsychopharmacol Hung 13, 185-92. Farde, L., Ehrin, E., Eriksson, L., Greitz, T., Hall, H., Hedstrom, C. G., Litton, J. E., and Sedvall, G. (1985). Substituted benzamides as ligands for visualization of dopamine receptor binding in the human brain by positron emission tomography. Proc Natl Acad Sci U S A 82, 3863-7. Farde, L., Eriksson, L., Blomquist, G., and Halldin, C. (1989). Kinetic analysis of central [11C]raclopride binding to D2-dopamine receptors studied by PET--a comparison to the equilibrium analysis. J Cereb Blood Flow Metab 9, 696-708. Freedman, R. (2003). Schizophrenia. N Engl J Med 349, 1738-49. Gomez-Vallejo, V., and Llop, J. Fully automated and reproducible radiosynthesis of high specific activity [(1)(1)C]raclopride and [(1)(1)C]Pittsburgh compound-B using the combination of two commercial synthesizers. Nuclear medicine communications 32, 1011-7. Grob, R. L., and Barry, E. F. (2004). Modern Practice of Gas Chromatography. Wiley-Interscience. Harrison, P. J. (2004). The hippocampus in schizophrenia: a review of the neuropathological evidence and its pathophysiological implications. Psychopharmacology 174, 151-62.
Literatuurlijst
52
Humm, J. L., Rosenfeld, A., and Del Guerra, A. (2003). From PET detectors to PET scanners. Eur J Nucl Med Mol Imaging 30, 1574-97. Innis, R. B., Cunningham, V. J., Delforge, J., Fujita, M., Gjedde, A., Gunn, R. N., Holden, J., Houle, S., Huang, S. C., Ichise, M., Iida, H., Ito, H., Kimura, Y., Koeppe, R. A., Knudsen, G. M., Knuuti, J., Lammertsma, A. A., Laruelle, M., Logan, J., Maguire, R. P., Mintun, M. A., Morris, E. D., Parsey, R., Price, J. C., Slifstein, M., Sossi, V., Suhara, T., Votaw, J. R., Wong, D. F., and Carson, R. E. (2007). Consensus nomenclature for in vivo imaging of reversibly binding radioligands. J Cereb Blood Flow Metab 27, 1533-9. Ishibashi, K., Ishii, K., Oda, K., Mizusawa, H., and Ishiwata, K. (2010). Competition between 11C-raclopride and endogenous dopamine in Parkinson's disease. Nuclear medicine communications 31, 159-66. Iwata, R., Pascali, C., Bogni, A., Miyake, Y., Yanai, K., and Ido, T. (2001). A simple loop method for the automated preparation of (11C)raclopride from (11C)methyl triflate. Appl Radiat Isot 55, 17-22. Jaber, M., Robinson, S. W., Missale, C., and Caron, M. G. (1996). Dopamine receptors and brain function. Neuropharmacology 35, 1503-19. Jewett, D. M. (1992). A simple synthesis of [11C]methyl triflate. Int J Rad Appl Instrum A 43, 1383-5. Kandel, E. R., Schwartz, J. H., and Jessell, T. M. (1991). Principles of Neural Science. Prentice-Hall International. Kilbourn, M. R., and Domino, E. F. Increased in vivo [11C]raclopride binding to brain dopamine receptors in amphetamine-treated rats. European journal of pharmacology 654, 254-7. Kim, J. H., Son, Y. D., Kim, H. K., Lee, S. Y., Cho, S. E., Kim, Y. B., and Cho, Z. H. (2011). Antipsychotic-associated mental side effects and their relationship to dopamine D2 receptor occupancy in striatal subdivisions: a high-resolution PET study with [11C]raclopride. J Clin Psychopharmacol 31, 507-11. Langer, O., Nagren, K., Dolle, F., Lundkvist, C., Sandell, J., Swahn, C. G., Vaufrey, F., Crouzel, C., Maziere, B., and Halldin, C. (1999). Precursor synthesis and radiolabelling of the dopamine D-2 receptor ligand [C-11]raclopride from [C-11]methyl triflate. J Labelled Compd Rad 42, 1183-1193. Le Foll, B. (2009). Dopamine receptors. In Biotrend, Toronto. Martinez, D., Slifstein, M., Broft, A., Mawlawi, O., Hwang, D. R., Huang, Y., Cooper, T., Kegeles, L., Zarahn, E., Abi-Dargham, A., Haber, S. N., and Laruelle, M. (2003). Imaging human mesolimbic dopamine transmission with positron emission tomography. Part II: amphetamine-induced dopamine release in the functional subdivisions of the striatum. J Cereb Blood Flow Metab 23, 285-300.
Literatuurlijst
53
Neve, K. A., Seamans, J. K., and Trantham-Davidson, H. (2004). Dopamine receptor signaling. J Recept Signal Transduct Res 24, 165-205. Okada, M., Nakao, R., Hosoi, R., Zhang, M. R., Fukumura, T., Suzuki, K., and Inoue, O. (2011). Microdialysis with radiometric monitoring of L-[beta-11C]DOPA to assess dopaminergic metabolism: effect of inhibitors of L-amino acid decarboxylase, monoamine oxidase, and catechol-O-methyltransferase on rat striatal dialysate. J Cereb Blood Flow Metab 31, 124-31. Paans, A. M., van Waarde, A., Elsinga, P. H., Willemsen, A. T., and Vaalburg, W. (2002). Positron emission tomography: the conceptual idea using a multidisciplinary approach. Methods 27, 195-207. Patton, J. A. (1998). Introduction to nuclear physics. Radiographics 18, 995-1007. Phelps, M. E. (2000). PET: the merging of biology and imaging into molecular imaging. J Nucl Med 41, 661-81. Raymond, L. A., Andre, V. M., Cepeda, C., Gladding, C. M., Milnerwood, A. J., and Levine, M. S. (2011). Pathophysiology of Huntington's disease: time-dependent alterations in synaptic and receptor function. Neuroscience 198, 252-73. Saiki, S., Sato, S., and Hattori, N. (2012). Molecular pathogenesis of Parkinson's disease: update. J Neurol Neurosurg Psychiatry 83, 430-6. Schlyer, D. J. (2004). PET tracers and radiochemistry. Ann Acad Med Singapore 33, 146-54. Schüle, B., Kock, N., Svetel, M., Dragasevic, N., Hedrich, K., De Carvalho Aguiar, P., Liu, L., Kabakci, K., Garrels, J., Meyer, E. M., Berisavac, I., Schwinger, E., Kramer, P. L., Ozelius, L. J., Klein, C., and Kostic, V. (2004). Genetic heterogeneity in ten families with myoclonus-dystonia. J Neurol Neurosurg Psychiatry 75, 1181-5. Shao, X., and Kilbourn, M. R. (2009). A simple modification of GE tracerlab FX C Pro for rapid sequential preparation of [11C]carfentanil and [11C]raclopride. Appl Radiat Isot 67, 602-5. Scifinder Snyder, L. R., Kirkland, J. J., and Dolan, J. W. (2009). Introduction to Modern Liquid Chromatography. John Wiley & Sons. Sullivan, J. M., Risacher, S. L., Normandin, M. D., Yoder, K. K., Froehlich, J. C., and Morris, E. D. Imaging of alcohol-induced dopamine release in rats:preliminary findings with [(11) C]raclopride PET. Synapse (New York, N.Y) 65, 929-37. Symposium, N. N. G., Winlow, W., and Markstein, R. (1986). The Neurobiology of Dopamine Systems. Manchester University Press. Tsai, R. S., Carrupt, P. A., Testa, B., Gaillard, P., el Tayar, N., and Hogberg, T. (1993). Effects of solvation on the ionization and conformation of raclopride and other
Literatuurlijst
54
antidopaminergic 6-methoxysalicylamides: insight into the pharmacophore. J Med Chem 36, 196-204. Turkington, T. G. (2001). Introduction to PET instrumentation. J Nucl Med Technol 29, 4-11. Volkow, N. D., Fowler, J. S., Wang, G. J., Baler, R., and Telang, F. (2009). Imaging dopamine's role in drug abuse and addiction. Neuropharmacology 56 Suppl 1, 3-8. Wang, X., and Quinn, P. J. (2010). Endotoxins: Structure, Function and Recognition. Springer. Weeks, R. A., Piccini, P., Harding, A. E., and Brooks, D. J. (1996). Striatal D1 and D2 dopamine receptor loss in asymptomatic mutation carriers of Huntington's disease. Ann Neurol 40, 49-54. Wong, C. (1954). Beta Decay of F^{17} and C^{11}. Physical Review 95, 765-766. Wuest, F., Berndt, M., and Kniess, T. (2007). Carbon-11 labeling chemistry based upon [11C]methyl iodide. Ernst Schering Research Foundation workshop, 183-213.
6.2 INTERNETBRONNEN
1. http://www.psych.ndsu.nodak.edu/mccourt/Psy486/Biochemistry%20and%20Neuropharm
acology/synaptic%20transmission (10-04-2012)
2. http://images.yourdictionary.com/cyclotron (2-04-2012)
3. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/176435?lang=en®ion=BE (25-
03-2012)
4. https://www.chem.agilent.com/Library/applications/59801660.pdf (20-04-2012)
5. http://www.plant.uoguelph.ca/research/homepages/raizada/Equipment/RaizadaWeb%20E
quipment%20PDFs/5B.%20UV%20VIS%20theory%20ThermoSpectric.pdf (2-03-2012)
6. http://goldbook.iupac.org/P04598.html (25-04-2012)
7. http://www.srigc.com/FID.pdf (15-03-2012)
8. http://www.lonza.co.jp/bioscience/rapid-testing-solutions/endotoxin/pdf/647u.pdf (25-03-
2012)
9. http://www.rdchemicals.com/chemicals.php?mode=details&mol_id=2592 (2-05-2012)
Bijlage
BIJLAGE 4
INTERNALISATION AT HOME
1e evening lecture: Improving adherence: from research to policy to practice. Professor Barber- UCL School of Pharmacy
Het onderzoek van Professor Barber heeft alles te maken met het proberen vermijden van schade aan de patiënt door geneesmiddelengebruik. Hij benadrukt dat tegenwoordig veiligheid en voorkomen van risico’s erg belangrijk is geworden. Apothekers spelen daarbij een belangrijke rol. Drie parameters dragen bij tot schade door geneesmiddelgebruik: therapietrouw, het geneesmiddel zelf en fouten gemaakt door de zorgverstrekkers. Hij vermeldt ook dat het beter is de belangrijkste factoren grondig aan te pakken, dan overal iets aan te veranderen. De therapietrouw komt bijvoorbeeld bij 1/3 patiënten voor terwijl voorschrijffouten veel minder vaak voorkomen. De therapietrouw verbeteren is daarom belangrijk. 30-50% van de bevolking gebruikt een geneesmiddel chronisch, vandaar dat een lage therapietrouw nefast is voor de volksgezondheid en dat dit de staat veel geld kost aan extra ziekenzorg. Daarom dat de regering momenteel veel geld pompt in het ontwikkelen van een 'New Medicines Service'. Ook rationeel voorschrijven wordt belangrijker. Een behandeling instellen op basis van Number Needed to Treat (NNT) bijvoorbeeld. Om het effect van een interventie door de zorgverstrekker (apotheker) na te gaan, zette Prof. Barber een RCT op. Men bestudeerde patiënten die nieuwe chronische medicatie moesten nemen voor een cardiovasculaire aandoening of diabetes of ouder waren dan 75. Men maakte twee groepen. Een met en een zonder interventie van apothekers. Uit de resultaten blijkt dat een interventie een positief effect heeft op de veiligheid en effectiviteit en bovendien kosten bespaart. Ook de patiënten zelf vinden het nuttig. Nu is het moeilijkste en belangrijkste dit ook om te zetten in de praktijk en naar een ziekenzorg te evolueren waar voorkomen van ziekte belangrijker is dan genezen. Persoonlijk vind ik het belangrijk dat factoren zoals therapietrouw verbeterd worden. Het ontwikkelen van nieuwe geneesmiddelen of betere therapieën schiet hun doel anders wat voorbij, aangezien veel patiënten hun medicatie niet eens innemen.
2e evening lecture : counterfeit medicine. Wendy Greenall- Counterfeit Medicines Laboratory Manager Pfizer Counterfeit medicines worden gedefinieerd als een geneesmiddel waarvan de inhoud of verpakking niet overeenkomt met het authentiek product. Het is mogelijk dat het namaakproduct het actieve bestanddeel bevat maar dat kan evengoed ook niet zo zijn. Allerlei klassen geneesmiddelen van het farmaceutisch bedrijf Pfizer werden al nagemaakt(bv. viagra, aricept, cabaser, ...). Deze counterfeit medicines worden in enorme hoeveelheden geproduceerd en verkocht met woekerwinsten. Zeker de inburgering van het internet heeft voor een doorbraak van de namaak-geneesmiddelen gezorgd. Mensen kunnen makkelijk via het internet bestellen en er is weinig controle mogelijk. Pfizer heeft wereldwijd 3 anti-counterfeit laboratoriums (VS, UK, India) waar medicijnen worden geanalyseerd, bewijs tegen criminelen wordt gezocht en databases met informatie over vervalsingen worden aangemaakt. Er wordt geanalyseerd op basis van fysische, visuele en spectrale eigenschappen. Hierbij worden verschillende spectroscopische technieken gebruikt en ook GC en HPLC analyse wordt uitgevoerd. Persoonlijk vond ik het geen interessante lezing. Mvr. Greenall
Bijlage
heeft ,denk ik, niet de aspecten van haar vakgebied uiteengezet die voor ons het meeste nuttig waren.
3e evening lecture : Computational chemistry in drug discovery Alexander Alex- Great Mongeham, Kent, United Kingdom
Deze ‘evening lecture’ spitste zich toe op de ontwikkeling van kleine geneesmiddelmoleculen, met name op het vinden van een ‘lead’-molecule en de optimalisatie ervan. Deze processen kaderen in de ‘discovery’ fase van de geneesmiddelenontwikkeling. Dit wordt ook wel de computationele chemie genoemd. Sinds de jaren 80 is de kost om een nieuw geneesmiddel te ontwikkelen exponentieel gestegen, mede doordat veel potentiële geneesmiddelen falen tijdens de eerste fasen van het ontwikkelingsproces. De ontwikkelingskost van een nieuw geneesmiddel wordt momenteel geraamd op 1,1 biljoen dollar. Momenteel falen de meeste geneesmiddelen door een te lage efficiëntie. Meestal is het belangrijk dat een bepaalde molecule bindt op een proteïne ('docking'). Hierbij is een negatieve Gibbs-energie vereist en treedt interactie op via waterstofbruggen, zoutbruggen en van der Waalse interacties. Met polaire interacties is het moeilijk om een binding te vormen, gezien de vele mogelijke conformaties van de molecules. Computationele chemie is zeer belangrijk in het inschatten van de meest beloftevolle molecules. De software berekent welke molecules qua structuur en lading het meeste kans hebben om te intrageren met de target. Computationele chemie heeft een hogere kost-effectiviteit dan biologisch screenen van molecules. Er moet ook rekening gehouden worden met de absorptie en verdelingseigenschappen van de ‘lead’. Intramoleculaire waterstofbruggen verbeteren bijvoorbeeld de diffusie door celmembranen. Ook het metabolisme kan voorspeld worden door software. Persoonlijk vond ik dit een interessante en nuttige lezing. Het is duidelijk dat het ontwikkelen van nieuwe geneesmiddelen efficiënter moet gebeuren om de stijgende kosten te drukken.
4e evening lecture : Applications of antibodies in the analysis of drugs, disease markes, bacteria en toxines. Professor Richard O'Kennedy- Dublin city university, Dublin, Ireland
Het onderzoeksgebied van Professor O'Kennedy is vooral toegespitst op antilichamen (AL). Deze AL kunnen zowel polyclonaal, monclonaal als recombinant zijn. Bij de productie van AL zijn zes zaken belangrijk (specificiteit, gevoeligheid, bronnen, selectie, screening en ‘sensing’). Antilichamen kunnen op verschillende manieren worden aangemaakt. Men kan het genfragment bijvoorbeeld in een plasmide incorporeren en bacteriën dit tot expressie laten brengen via een transformatie. Fagen kunnen deze AL ook op hun oppervlak dragen als ze dergelijke bacteriën infecteren. Er worden zo bibliotheken aangelegd met allemaal fagen die verschillende antilichamen tot expressie brengen. Op deze manier kan men screenen of een bepaald antigen bindt met een van de AL. Gebonden antilichamen kunnen gedetecteerd worden via de faag-ELISA techniek. Eens de correcte faag geselecteerd, worden opnieuw bacteriën hiermee geïnfecteerd om het AL te produceren. Tegenwoordig worden AL-bibliotheken automatisch gescreend via de ‘Surface Plasma Resonance biosensing’ (SPR) techniek. AL hebben verschillende toepassingen. Een eerste belangrijke toepassing is een AL dat bindt op Cardiac Troponin I (cTnI). Dit is een biomerker voor cardiovasculaire schade. Via dit AL is een snelle detectie van een beginnende hartkwaal mogelijk. Een tweede toepassing zijn AL die binden op geneesmiddelen of drug, zodat de plasma of
Bijlage
urineconcentratie kan berekend worden. Bijvoorbeeld een antilichaam dat warfarine kan binden of heroïne. Er bestaan ook antilichamen die binden op bacteriën die aanwezig zijn in voeding (Listeria monocytogenes) of toxines die door bacteriën worden geproduceerd (bv. alfatoxines). Een ander onderzoeksdomein van professor O'Kennedy zijn biochips, die voor meerdere molecules kunnen detecteren. Over het algemeen een zeer interessante lezing.