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UNIVERSIT DU QUBEC MONTRAL
RGULATION DE LA SYNTHTASE DES ACIDES GRAS PAR L'INSULINE
ET LA T3 : MISE EN VIDENCE DE L'ACTION GNOMIQUE ET NON
GNOMIQUE DE LA T3
MMOIRE
PRSENT
COMME EXIGENCE PARTIELLE
DE LA MATRISE EN BIOLOGIE
PAR
ANNE RADENNE
Novembre 2008
-
UNIVERSIT DU QUBEC MONTRAL Service des bibliothques
Avertissement
La diffusion de ce mmoire se fait dans le respect des droits de son auteur, qui a sign le formulaire Autorisation de reproduire et de diffuser un travail de recherche de cycles suprieurs (SDU-522 - Rv.01-2006). Cette autorisation stipule que conformment l'article 11 du Rglement no 8 des tudes de cycles suprieurs, [l'auteur] concde l'Universit du Qubec Montral une licence non exclusive d'utilisation et de publication de la totalit ou d'une partie importante de [son] travail de recherche pour des fins pdagogiques et non commerciales. Plus prcisment, [l'auteur] autorise l'Universit du Qubec Montral reproduire, diffuser, prter, distribuer ou vendre des copies de [son] travail de recherche des fins non commerciales sur quelque support que ce soit, y compris l'Internet. Cette licence et cette autorisation n'entranent pas une renonciation de [la] part [de l'auteur] [ses] droits moraux ni [ses] droits de proprit intellectuelle. Sauf entente contraire, [l'auteur] conserve la libert de diffuser et de commercialiser ou non ce travail dont [il] possde un exemplaire.
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REMERCIEMENTS
Je souhaite tout d'abord remercier ma directrice de recherche Catherine Mounier. Un
grand merci, puisque c'est toi qui m'as vraiment donn l'envie de faire de la
recherche lors de mon premier stage, cela fait dj quelques annes. J'ai
normment appris sous ta direction, tu nous as appris tre autonome tout en
restant disponible pour nos questions.
Et puis nous allons remettre a pour une paire d'annes encore!!!!
Un grand merci toute l'quipe du laboratoire: toutes les personnes qui ont travaill
sur le projet FAS, Caroline, Sabine et Murielle, sans oublier l'quipe SCD, Daniel,
Michle, Omar et Gab.
Merci, aux professeurs Julie Lafond, Benot Barbeau, Eric Rassart et Franois
Dragon pour le prt du materiel, cela nous a beaucoup aid.
Merci tous mes amis et collgues du 3 me tage pour vos conseils et votre aide.
Pardonnez moi de ne pas vous nommez un un mais vous tes assez nombreux.
Et puis bien sr, merci mille fois mes parents qui m'ont toujours soutenu dans mes
projets. Je sais que a n'a pas t facile pour vous de me laisser partir aussi loin!
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TABLE DES MATIRES
LISTE DES FIGURES Vl
LISTE DES ABRVIATIONS, SIGLES ET ACRONYMES Vlll
AVANT-PROPOS XII
RSUM XIV
INTRODUCTION _
CHAPITRE l 3
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
1.1 Mtabolisme des acides gras 3
1.1.1 Origine des acides gras 4
1.1.2 Synthse de novo des acides gras 4
\.1.3 Transformations mtaboliques des acides gras 7
1.1.4 Lieux de synthse des acides gras de novo 8
\.1.5 Rgulation de la lipogense 9
1.1.5.1 Rgulation nutritionnelle de la lipogense 9
1. 1.5.2 Rgulation hormonale de la lipogense 9
).2 Le complexe de l'acide gras synthase 1l
\.2.\ Organisation structurelle Il
1.2.2 Ractions effectues par la FAS 12
1.2.3 Le gne FAS et sa rgion promotrice ]4
1.2.4 Expression tissulaire de la FAS 16
1.3 Rgulation de l'expression de la FAS ]6
1.3.1 Rgulation hormonale de la FAS 17
-
---------
IV
1.3.1.1 Rgulation de la FAS par la T3 _ 17
1.3.1.1.1 Synthse des hormones thyrodiennes _ 17
1.3.1.1.2 Mcanisme gnral d'action des hormones thyrodiennes _ 20
1.3.1.1.3 Les rcepteurs aux hormones thyrodiennes _ 22
1.3.1.1.4 Modulation du mcanisme d'action des TRs 25
1.3.1.1.5 Modifications posttraductionnelles des TRs _ 27
1.3.1.1.6 Action non gnomique des THs _ 29
1.3.1.1.7 Le TRE sur le promoteur FAS _ 30
1.3.1.2 Rgulation de la FAS par l'insuline _ 31
1.3.2 Rgulation nutritionnelle de la FAS _ 33
1.3.2.1 Rgulation de la FAS par le glucose _ 33
1.3.2.2 Rgulation de la FAS par les PUFAs _ 34
1.3.2.3 Rgulation de la FAS par les MCFAs _ 34
CHAPITRE II 36
ARTICLE SCIENTIFIQUE
2.] Abstracts 38
2.2 Introduction 39
2.3 Materials and methods 42
2.3.1 Materials 42
2.3.2 Plasmid constructs 42
2.3.3 Cell culture and transfection 43
2.3.4 FAS activity 43
2.3.5 Analysis of mRN A expression level 44
2.3.6 Analysis ofpromoter activity 45
2.3.7 Gel electromobility shift assay 45
2.3.8 Western blot 45
2.4 Results 47
2.4.1 Role ofT3 and insulin on FAS enzymatic activity, protein and mRNA level __ 47
2.4.2 Effects of insulin and T3 at the transcriptionnallevel 47
2.4.3 Role ofphosphorylation in the regulation offAS 49
2.4.4 Role of the PB-kinase and Erkl/2 MAPK pathways in the regulation ofFAS in
response to T3 and insulin 49
-
v
2.5 Discussion 52
2.6 References 57
2.7 Figure legends 68
CHAPITRE II! 83
DISCUSSION
CONCLUSION 90
REFERENCES 91
-
LISTE DES FIGURES
Figure 1.1: Principales tapes de la synthse de novo des acides gras 6
Figure 1.4: Comparaison des squences promotrices du gne FAS de l'humain,
Figure 1.8: Comparaison des diffrentes isoformes des rcepteurs aux honnones
Figure 1.10: Reprsentation shmatique du domaine en doigts de zinc localis
Figure 1.12: Shma rcapitulatif du mcanisme d'action gnomique et non
Figure 2.1: Effects ofT3 and insulin on FAS enzymatic activity,protein and
Figure 2.3: Mobility shift assays using the fragment Jocated between
Figure 2.4: Role of phosphorylation in the regulation of FAS activity and
Figure 2.5: Effects ofLY294002 and PD98059 on FAS activity and
Figure 1.2: Famille des acides gras polyinsaturs 8
Figure 1.3: Le complexe de l'acide gras synthase 13
de la souris, du rat, du poulet et de l'oie. 15
Figure 1.5: La synthse des hormones thyrodiennes 19
Figure 1.6: Modle gnral d'action des hormones thyrodiennes 21
Figure 1.7: Organisation des diffrents TREs 21
thyrodiennes 23
Figure 1.9: Structure gnrale des rcepteurs nuclaires 24
sur le TR~ humain 25
Figure 1.11 : Modle molculaire de la rpression basale en absence de T3 et de
l'activation de la transcription en prsence de T3 27
gnomique des THs 30
mRNA levels 73
Figure 2.2: Localization of the TRE on the goose FAS gene promoter 74
-732 and -692 bp of the goose FAS gene 75
transcription in response to T3 and insulin treatments 76
-
VII
TRE-mediated transcription in response to T3 and insulin treatments 78
Figure 2.6: Effect ofT3and insulin on the level of Erk1l2 MAPK
Figure 2.7: Effect ofPD98059, U0126 and LY294002 on T3 and
Figure 2.9: Shematic representation of the FAS transcriptional regulation
phosphorylation 79
insulin-induced Erk1/2 MAPK phosphorylation 80
Figure 2.8: Effect ofT3 and insulin on the leveJ of Akt phosphorylation 81
in response to T3 and insulin 82
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LISTE DES ABRVIATIONS, SIGLES ET ACRONYMES
ACC: Acetyl-coA carboxylase
ACP: Acyl carrier protein
ADN: Acide dsoxyribonuclique
AGRP: Agouti-related peptide
AMPc: Adnosine monophosphate cyclique
AMPK : AMP Kinase
ARNm: Acide ribonuclique messager
ATF2: Activating transcription factor 2
CART: cocaine-amphetamine related transcript
CBP: CREB Binding protein
CEH: Chick embryo hepatocytes
ChIP: Chromatin Immunoprecipitation
ChREBP: Carbohydrate Responsive Element Binding Prote in
CPT-1: Carnitine palmitoyl transfrase
DBD: DNA binding domain
DIT: Diiodo-tyrosine
DR4: Direct Repeat 4
DRlPs: Vitamin D receptor interacting proteins
eNOS: Endothelialnitric oxide synthase
-
IX
ERK: Extracellular signal regulated kinase
GH: Growth Hormone
GPCR: Gprotein-coupled receptor
HAT: Histone acetyltransferase
HDAC: Histone deacetylase
HDL: High density lipoprotein
HPRT-1: Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1
IP: Invert palindrome
IMC: Indice de masse corporel
IR: Insulin receptor
IRE: Insulin response element
IRS : Insulin Receptor substrate
Kpb: Kilo paire de base
kD: Kilo Dalton
LBD: Ligand binding do main
MAPK: Mitogen activated protein kinase
MCFA: Medium chainfattyacid
ME: Malic enzyme
MEK: Map-erk kinase
MIT: Monoiodo-tyrosine
mTOR: Mammalian targe/ ofrapamycin
-
x
NAOPH: Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
NCor: Nuclear co-repressor
NF-Y: Nuclearfaclor Y
OMS: Organisation mondiale de la sant
Pal: Palindrome
pb: Paire de base
POK 1 : Pyruvate dehydrogenase kinase l
PCAF: p300 CBP associaledfaclor
PKA: ProIein kinase A
PKB: ProIe in kinase B
PKC: ProIe in kinase C
PB-Kinase: Phosphatidyl-inositol-3 phosphate kinase
PIP2: Phosphoinositol di-phosphate
PIP3: Phosphoinositol tri-phosphate
POMC: Pro-opiomelanocorlin
PUFA: Polyunsaluraledfalty acid
SCAP : SREBP cleaving-activating prolein
SCO : Stearyl-CoA dsaturase
SFI: Sleroidogenicfaclor-i
SMRT: Sifencing mediator ofRAR and TR
SRC: Sleroid receplor co-activators
-
Xl
SRE: Sterol response element
SREBP-I: Sterol response element binding protein 1
rT3: Reverse T3
STAT: Signal Transducers and Activator ofTranscription
RT: Reverse transcriptase
RXR: Retinoid X receptor
T3: Triiodothyronine
T4: Thyroxine
Tg: Thyroglobuline
TH: Thyroid hormone
TK: Thymidine kinase
TRAPs: TR-associated proteins
TRE: T3 response element
USf: Upstream stimulatory factors
VLOL: Very low density lipoprotein
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AVANT-PROPOS
1. Contribution de l'tudiant l'exprimentation et la rdaction.
o Ce qui a t ralis par l'tudiante ./ Les transfections et les mesures des activits CAI
./ Les expriences d' immunobuvardage
./ Les expriences de retards sur gel
./ La mise au point des RI-PCR FAS
./ Participation la rdaction de l'article scientifique
~ Ce qui n'a pas t ralis par l'tudiante
x La localisation du IRE
x Les clonages du IRE, DR4 et 1,6FAS dans diffrents vecteurs
x La mesure des activits FAS
2. Liste des auteurs de l'article scientifique
Raderme A, Akpa M, Martel C, Sawadogo S, Mauvoisin D et Mounier C
3. Statut de la publication
Article accept dans American Journal of Physiology-Endocrino1ogy and
Metabolism.
2008 Oct; 295(4):E884-94. Epub 2008 Aug 5.PMID: 18682535
[PubMed - in process]
-
Xlll
4. Autres travaux raliss par l'tudiante pendant la matrise
Raie of the PI3-kinase1nTOR pathway in the regulation of stearayl CoA desaturase
(SCD1) gene expression by insulin in liver.
Mauvoisin D, Rocque G, Arfa 0, Radenne A, Boissier P, Mounier C.
] Cell Commun Signal. 2007 Sep;I(2):113-25. Epub 2007 Oct 6.
PMID: 18481202 [PubMed - in process]
o Ce gui a t ralis par l'tudiante ./ Les expriences de retard sur gel
-
RSUM
La synthtase des acides gras (FAS) est une enzyme clef de la lipogense hpatique responsable de la synthse des acides gras saturs longue chane. Cette enzyme est rgule au niveau transcriptionel par les nutriments et les honnones. Ainsi, le glucose, l'insuline et la T3 augmentent son activit alors que les acides gras moyennes chnes (MCFAs), les acides gras poly-insaturs (PUFAs) et le glucagon la diminuent. Dans des cellules hpatiques, nous avons mis en vidence que la T3 et l'insuline taient capables d'activer de faon synergique l'activit enzymatique et le niveau d'expression des ARNm de la FAS (14 fois). L'analyse du promoteur a pennis de dmontrer que cette activation tait aussi transcriptionnelle. Par la suite l'lment de rponse la T3 (TRE) a t localis dans la rgion promotrice du gne FAS. Ce TRE fixe un htrodimre TRlRXR en absence d'honnone et cette fixation est augmente en prsence d'insuline et/ou de T3. L'utilisation de H7, un inhibiteur gnral des serines/thronines kinases, nous a pennis de mettre en vidence que des mcanismes de phosphorylation sont impliqus dans la rgulation transcriptionelle de la FAS par ces deux hormones. En fait, nous avons dmontr que la voie de signalisation cellulaire PI3Kinase/ERK1I2-MAPK est implique dans la rgulation de la FAS par la T3 via le TRE. De plus, nous avons aussi mis en vidence un effet de l'insuline sur ce TRE qui impliquerait la mme voie de signalisation ainsi qu'une voie qui pourrait aussi impliquer Akt. Les mmes effets non gnomiques de la T3 et de l'insuline sont aussi observs au niveau d'un TRE consensus de type DR4. En conclusion, nos rsultats suggrent que la T3 rgule la transcription par un mcanisme d'action la fois gnomique et non gnomique impliquant la voie PI3Kinse/MAPK et que l'insuline est aussi capable de cibler ce TRE par des voies de signalisation spcifiques.
Mots cls: FAS, T3, Insuline, PI3-Kinase, Erk1l2-MAPK
-
INTRODUCTION
Le surpoids et l'obsit ne cessent de progresser dans le monde.
L'organisation mondiale de la sant (OMS) utilise le terme de globsit pour
dsigner la pandmie croissante d'obsit. D'aprs l'OMS, plus de 1 milliard
d'adultes prsentent un excs de poids et au moins 300 millions d'entre eux sont
obses. Aux Etat-Unis, 30% des amricains sont obses et plus de 65% prsentent
une surcharge pondrale. La situation au Canada n'est gure plus rjouissante (45%
de la population prsente un surpoids). Cet excs de poids est principalement due
une modification du rgime alimentaire dont une augmentation du ratio calorique et
notamment une augmentation de l'apport en graisse, en sel et en sucre. De plus,
l'augmentation gnrale de la sdentarit amplifie ce phnomne. Ces kilos superflus
constituent une vritable menace pour la sant. L'augmentation de l'indice de masse
corporelle est un facteur de risque majeur pour le dveloppement des maladies
cardiovasculaires, le diabte de type 2 ainsi que certains types de cancers. Le surpoids
et l'obsit sont donc des fardeaux conomiques importants pour le systme de sant
canadien.
Des tudes rcentes ont mis en vidence une implication directe de la synthse
de novo des lipides (lipogense) dans le dveloppement de l'obsit (Kusunoki,
Kanatani et al. 2006). La synthtase des acides gras (FAS) (EC 2.3.1.85) est une des
enzymes clefs de la lipogense hpatique. Cette enzyme est implique dans la
formation des acides gras saturs longue chane (Wakil 1989). Le traitement
d'animaux avec un inhibiteur spcifique de la FAS, le C75, induit une perte de poids
importante, cependant cet inhibiteur de graves effets anorxiques (Loftus, Jaworsky
et al. 2000). Ces tudes dmontrent que la FAS pourrait tre une cible thrapeutique
intressante pour lutter contre l'obsit. C'est pour cette raison qu'il est important de
comprendre les mcanismes molculaires impliqus dans la rgulation de l'activit et
de l'expression de cette enzyme.
-
2
La FAS est rgule par les nutriments et les hormones dont les concentrations
varient au cours de la prise alimentaire. La T3 (Stapleton, Mitchell et al. 1990) et
l'insuline (Sul, Wang 1998), deux hormones fortement augmentes aprs la prise
alimentaire augmentent l'activit de la FAS. Par contre, les MCFAs (acides gras
moyerJ1es chanes) (Roncero et Goodridge 1992), les PUFAs (acides gras
polyinsaturs) (Moon, Latasa et al. 2002) et le glucagon (Lakshmanan, Nepokroeff et
al. 1972) diminuent l'activit de cette enzyme.
L'objectif de ce projet de matrise est de caractriser les mcanismes molculaires
d'action de la T3 et de l'insuline (Kusunoki, Kanatani et al. 2006) sur la rgulation de
l'activit et de l'expression de la FAS dans des cellules hpatiques.
-
CHAPITRE 1
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
1.1 Mtabolisme des acides gras
Le mtabolisme lipidique reprsente un ensemble de processus anaboliques et
cataboliques visant la production de divers composs, tels que les phospholipides
(principaux constituants des membranes cellulaires), certaines hormones (hormones
strodiennes), ainsi que la production et le stockage d'nergie sous forme de
triacylglycrols. Les graisses (triacylglycrols) constituent les plus importantes
rserves d'nergie chez les animaux et constituent des formes de stockage d'nergie
hautement concentre. Elles sont en particulier mises en rserve dans les cellules du
tissu adipeux, les adipocytes, o elles subissent un cycle permanent de synthse et de
dgradation.
La synthse de novo des triacylglycrols aussi appele lipogense, peut tre
dfinie comme l'ensemble des activits cellulaires visant la formation des acides
-
4
gras partir de divers prcurseurs tels que les acides gras eux-mmes, les sucres, les
protines et leurs mises en rserve sous forme de triacylglycrols.
1.1.1 Origine des acides gras
Le principal prcurseur impliqu dans la voie de biosynthse des acides gras
est l'actyl-CoA (Lynen et Ochoa 1953). Il reprsente la source de tous les atomes de
carbone des acides gras. L'origine de l'actyl-CoA est diverse. Il provient soit de la
dcarboxylation oxydative du pyruvate, soit de la dgradation de certains acides
amins ou encore de la ~-oxydation des acides gras longue chane.
1.1.2 Synthse de novo des acides gras
La synthse de novo des acides gras se droule en 2 tapes distinctes (figure
1.1). La premire tape est la carboxylation de l'actyl-CoA en malonyl-CoA. Cette
raction est catalyse dans le cytoplasme de la cellule par une enzyme clef de la
synthse des acides gras: l'actyl-CoA carboxylase (ACC) (Munday 2002).
CH3-CO-S-CoA + CO2 ~ COOH-CH2-CO-S-CoA
Acetyl-Co Malonyl-CoAr+ ATP ADP+Pi
Par la suite, la synthse des acides gras s'effectue grce l'acide gras synthase
(FAS). Cette enzyme multifonctionnelle fixe une molcule d'actyl-CoA et l'allonge
en utilisant des groupements malonyl au cours de 7 cycles de raction pour aboutir au
palmitate (C16 :0). Le malonyl-CoA, substrat de cette raction d'longation, libre
son groupement carboxyl sous forme de CO2 lors de la raction de condensation.
Cette raction requiert la prsence d'un agent rducteur le NADPH, cofacteur gnr
-
5
par l'enzyme malique (ME) lors de la dcarboxylation oxydative du malate en
pyruvate (Wakil, Stoops et al. 1983; Wakil 1989). L'allongement des acides gras
catalyss par l'acide gras synthase s'arrte C16 librant ainsi l'acide palmitique
(C 16 :0). Cependant, le starate (C18 :0), le myristate (C 14 :0) mais galement des
acides gras plus courte chane peuvent tre synthtiss (Semenkovich 1997). Par
exemple, des acides gras moyelU1e chane sont synthtiss par la synthtase des
acides gras de la glande mammaire et sont retrouvs au niveau du lait excrt (Tai,
Chirala et al. 1993).
Actyl-CoA + 7 Malonyl-CoA --...... Acide palmitique + 8 CoA-SH +~
14 NADPH + 14 H+ 14 NADP+ + 7 CO2 + 6 CO2
-
6
MITOCHONDRIE
~ GLYCOLYSE i ~----j4- Pyruvate ( Glucose
-?:J\~maIl0 \ / NNJI'< Malate GI~ 6P dnyd",~
~ioactate h ~ ~......
Citrate" ~
Isocitrate acides gras
acides amins
a ctoglutarate 'if
Actyl-CoA
j~~ CYTOPLASME
Malonyl-CoA j....".. ....
~defadd~j ~-
Acides gras non estrifis saturs
Acides gras dsaturs 1 ESTERIFICATION 1
PhospholipidesTriglycrides
FOIE t- Apollpoprotln~s VLDL====================
PLASMA
1 -v Dpot des lipides
TISSU ADIPEUX
Figure 1.1: Principales tapes de la synthse de novo des acides gras
(Mounier 1994)
-
7
1.1.3 Transformations mtaboliques des acides gras
A partir du palmitate ainsi form, des acides gras trs longues chanes et des
acides dsaturs vont pouvoir tre gnrs. Les acides gras C 16 :0 et C 18 :0 peuvent
tre allongs nouveau, soit au niveau de la mitochondrie, soit dans le rticulum
endoplasmique. Dans la mitochondrie, les acides gras saturs possant 12 16
carbones peuvent subir une longation par une addition successive de molcules
d'actyl-CoA, ce qui conduit la formation d'acides gras chanes trs longues (C18
C26). Dans le rticulum endoplasmique, ces acides gras saturs ou non saturs
peuvent aussi subir une longation supplmentaire par une addition successive de
malonyl-CoA. La raction est la mme que pour la synthse du palmitate (Jakobsson,
Westerberg et al. 2006).
Les acides gras saturs longue chane peuvent tre dsaturs par
l'introduction d'une double liaison. Cette raction est catalyse par des dsaturases.
La staroyl-CoA dsaturase (SCDl) encore appele la ~9 dsaturase, localise dans
le rticulum endoplasmique, est une des enzymes clefs de la dsaturation. Elle
dsature les acides gras en ajoutant une double liaison en position 9. L'acide
palmitolique (C16 :1) et l'acide olique (C18 :1) sont produits par dsaturation
respectivement de l'acide palmitique (C16 :0) et de l'acide starique (C18 :0) (figure
1.2).
La biosynthse des triacylglycrols s'effectue alors partir d'acides gras
activs (acyl-CoA) et de glycrol-3-phosphate issus de la glycolyse ou encore de la
phosphorylation du glycrol. Les triacylglycrols seront ensuite intgrs par les
hpatocytes dans des lipoprotines (VLDL) et librs dans le sang pour alimenter les
autres tissus ou tre mis en rserve dans les adipocytes (figure 1.1).
-
8
1 Animaux 1 Animaux, Vgtaux,
Bactries arobies 1'------'1
/19 I.M E /1 5 E /1 6 ~ 16:0 -16:1:-16:2 -18:2 -18:3 -20:3 -->20:4 ~
1/19 :.66 E /15 18:0 - 18:1 :--18:2------1
.6 12 1: 1/16 E
- 20:2
.65
- 20:3
E
24:4
t .66 --24:5
1
1 Vgtaux 1
18:2 t- 18:3 1
1
- 20:3 - 20:~ l
-.,,__.
22:4 22:~ .... ~..__.....__,
1
.615 1 1 24:5
.66 - 24:6
:.66 E AS E t 1 ~ 18:3,- 18:4 - 20:4 - 20:? - 22:5 22:,6 ~
1 1. -1
Figure 1.2: Famille des acides gras polyinsaturs (www.jle.com)
1.1.4 Lieux de synthse des acides gras de novo
Chez l'homme, la synthse de novo des acides gras a lieu principalement au
niveau hpatique. Cependant, une faible synthse est mesure dans le tissu adipeux,
les reins, les poumons et les glandes mammaires (Kusakabe, Maeda et al. 2000; Tai,
Chirala et al. 1993). Chez les oiseaux, la plupart des tudes suggrent galement que
le foie est le principal site de la synthse des acides gras (Leveille, Q'Hea et al. 1968).
Chez les mammifres ( l'exception de l'homme), la biosynthse des acides gras a
lieu la fois dans le tissu adipeux et dans le foie. Chez le rat en croissance, on
observe une lipogense intense dans le tissu adipeux, alors que chez le rat adulte, la
lipogense a lieu aussi principalement dans le foie (Gandemer, Pascal et al. 1980).
-
9
1.1.5 Rgulation de la lipogense
1.1.5.1 Rgulation nutritionnelle de la lipogense
La lipogense est trs sensible aux modifications alimentaires. Les acides gras
polyinsaturs (PUFAs) diminuent la lipogense hpatique en inhibant l'expression de
diffrents gnes, telle que la FAS, spot 14 et SCD 1 (lump, Clarke et al. 1994). Par
contre, une alimentation riche en sucres va stimuler la lipogense la fois dans le foie
et le tissu adipeux, entranant une augmentation postprandiale du niveau de
triglycrides plasmatiques (Kersten 2001). La diminution de la lipogense induite par
une restriction alimentaire peut s'expliquer en partie par une diminution plasmatique
du glucose, ainsi que par une augmentation des PUFAs libres circulants (Kersten
2001).
Le glucose plasmatique va stimuler la lipogense via diffrents mcanismes.
Premirement, le glucose est le principal substrat de la lipogense, puisqu'il y est
rapidement converti en acetyl-CoA par la glycolyse (Kersten 2001). De plus, le
glucose est capable de rguler directement la transcription des gnes lipogniques
(Kersten 2001), notamment grce l'activation et la fixation sur des squences
promotrices du facteur de transcription ChREBP (Charbohydrate Responsive Element
Binding Protein). Des squences de fixation de ce facteur de transcription sont
d'ailleurs retrouves sur le promoteur de la FAS, de la fructose 6 phosphate 2 kinase/
fructose-2,6- bisphosphatase et de l'ACC (Uyeda, Yamashita et al. 2002). Enfin, le
glucose stimule la lipogense en augmentant la libration d'insuline et en inhibant la
libration de glucagon par le pancras (Kersten 2001).
1.1.5.2 Rgulation hormonale de la lipogense
Une restriction alimentaire est associe une importante modification de la
concentration des hormones plasmatiques, notamment une diminution du niveau
d'insuline, de T3 et de leptine ainsi qu'une augmentation du niveau d'hormone de
-
10
crOlssance (GH) et de glucagon (Kersten 2001). L'insuline est l'hormone qui a
probablement la plus grande influence sur la lipogense (Kersten 2001). L'insuline
augmente l'entre de glucose dans la cellule en favorisant la translocation du
transporteur au glucose (GLUT4) la surface des cellules hpatiques (Kersten 2001).
L'insuline est galement implique dans les modifications post-traductionnelles des
enzymes glycolytiques et lipogniques. L'insuline stimule la lipogense en modifiant
les liaisons covalentes de ces enzymes (Kersten 2001). Enfin, l'insuline est capable
d'activer diffrentes voies de signalisation cellulaire en se fixant sur son rcepteur
membranaire (Nakae et Accili 1999) modulant ainsi la transcription des gnes
lipogniques. La T3 est bien connue pour stimuler la lipogense, son action est
mdie par la fixation d'un complexe hormone/rcepteur sur les squences
promotrices de certains gnes impliqus dans le lipogense (Stapleton, Mitchell et al.
1990; Thurmond et Goodridge 1998).
L'hormone de croissance (GH) est une hormone qui a une grande importance
dans la rgulation de la lipogense. Cette hormone rduit de faon trs importante la
lipogense au niveau du tissu adipeux et induit un important gain de masse
musculaire (Kersten 2001) (Etherton 2000). La leptine est une hormone produite par
le tissu adipeux dcouverte rcemment (Zhang, Proenca et al. 1994). La leptine
diminue le stockage de graisse en rgulant la prise alimentaire mais galement en
agissant au niveau du mtabolisme nergtique dans de nombreux tissus, notamment
le tissu adipeux et le foie (Kersten 2001). Par exemple, il a t mis en vidence que la
leptine est implique dans l'inhibition des gnes impliqus dans la synthse des
acides gras ainsi que dans la synthse des triglycrides (Wang, Lee et al. 1999). Le
facteur de transcription SREBP-l est galement une cible potentielle de la leptine par
lequel elle inhiberait le transcription des gnes lipogniques (Kakuma, Lee et al.
2000). Le glucagon est impliqu dans l'inhibition de la transcription de nombreux
gnes lipogniques (FAS, ME). Cette hormone induit une augmentation de l'AMPc,
ce qui entrane l'activation de la PKA qui par la suite va modifier la fixation de
-
Il
facteurs de transcription. c-Jun et ATF2 sur un lment de rponse ngatif l' AMPc
localis sur le promoteur de l'enzyme malique (Mounier, Chen et al. 1997).
1.2 Le complexe de l'acide gras synthase
1.2.1 Organisation structurelle
La biosynthse des acides gras requiert une srie de ractions enzymatiques. Chez
les organismes conune la bactrie, chaque tape est catalyse par des enzymes
indpendantes (Wakil 1983). Chez les manunifres et les oiseaux, ces diffrentes
tapes sont ralises au sein d'une mme protine formant un complexe
multicatalytique. Cette protine multifonctionelle est le produit d'un gne unique. La
FAS des vertbrs est fonctionnelle sous forme d'un homodimre constitu de 2
chanes peptidiques de 250 kDa (Stoops, Arslanian et al. 1975). Chacune de ces
units peut catalyser 7 ractions paI1ielles distinctes, ncessaires la synthse du
palmitate. Le rapprochement spatial de plusieurs ractions enchanes l'une derrire
l'autre, prsente un avantage par rapport des enzymes spares. La comptition
entre les ractions est vite, la raction se droule sous forme coordonne et cette
raction est trs efficace grce la concentration leve en substrat.
Chaque moiti de l'acide gras synthase peut lier le substrat (rsidu acyl ou actyl)
sous forme d'un thioester au niveau de 2 groupements SH particuliers: un sur un
rsidu cystine (Cys-SH) et un autre sur un groupement 4'phosphopantthine (Pan
SH). La Pan-SH est associe un fragment du complexe que l'on nonune ACP (Acy]
Carrier Protein). Cette partie de l'enzyme fonctionne comme un long bras qui fixe le
substrat et le dplace ensuite d'un centre actif un autre. Les 2 moitis de l'acide gras
synthase cooprent dans ce domaine. Le complexe enzymatique n'est donc
fonctionnel que sous forme dimrique. La dissociation de l'enzyme en monomres
conduit l'inactivation de la FAS (Stoops, Arslanian et al. 1975; Lornitzo, Qureshi et
al. 1975). De faon spatiale, les activits enzymatiques sont rparties en 3 domaines
-
12
distincts. Le premier domaine catalyse l'introduction du substrat, acty1-CoA et
malonyl-CoA, grce aux activits [ACP]-S-actyl transfrase (figure l.3.A.]) et
[ACP]-S-malonyl-transfrase (figure 1.3.A.2) qui sont par la suite condenss via la 3
cto-acyl-[ACP]-synthase (figure ] .3.A.3). Le deuxime domaine rduit la chane
d'acide gras au cours de la synthse l'aide de la 3-ctoacyl-[ACP]-rductase (figure
1.3.AA), de la 3 hydroxyacyJ-[ACP]-dehydratase (figure 1.3.A.5), et de l'noyl
[ACP]-rductase (figure 1.3.A.6). Le troisime domaine sert librer le produit fini
aprs sept tapes d'allongement de la chane grce l'activit acyl-[ACP]-hydrolase
(figure 1.3.A.7) (Koolman, Rohm 1999).
1.2.2 Ractions effectues par la FAS
La premire raction ralise par la FAS est le transfert d'un groupement
actyl sur le rsidu cystine (figure].3 .B.l) et le transfert d'un rsidu ma10nyl sur la
4-phosphopantthine (Pan-SH) de l'ACP (figure 1.3.B.2). Par la suite, l'longation a
lieu par le transfert d'un groupement actyl en C-2 du rsidu malonyl. Le groupement
carboxyl libre est alors cliv et forme du CO2 (figure 1.3.B.3). Par la suite, il y a
rduction du groupement 3-cto (figure 1.3.BA), limination de l'eau (figure
1.3.B.5), puis rduction (figure 1.3.B.6). L'ensemble de ces ractions aboutit la
formation d'un acide gras 4 carbones. Ce produit est par la suite transfr de l'ACP
sur le rsidu cystine par l'acyl-transfrase (figure 1.3 .B.]) afin qu'un nouveau cycle
puisse recommencer aprs un nouveau chargement de l'ACP par du malonyl-CoA.
Au bout de 7 cycles, l'acyl-[ACP]-hydrolase (figure 1.3.B.7) libre le produit final:
le palmitate (C16 :0) (Koolman, Rohm 1999).
-
13
G) 0 entre du substrat o limination d'eau palmitate o allongement CD rduction '\.....~._----,
de la chaine ; libration o rduction (2) libration du produit 1du produit o H H H
palmitate 11111 ~ Pan-8 - C - C - C - C - H ~
r 1 1 1 Cys-SH H H H NADPH 7
I~~hine l ACP @] ..~/ Crs SH S{"i SH / SH Cys
ACP 0 / ~ ~ ~ Pan-S - C - C = - -H ~ trans-nOYI-! p,_SH :r
H O
o H OH Hactyl -ls~ Il 1 1 1 ,Pan-S -C-C-C-C- H 1 1 1
malonyl -1 S ~ Cys-SH H H H NADPH
A. Acide gras synthase
'1l (ACP]-S-actyl~ transfrase 2.3. 7.38
i2l [ACP]-S-malonyl o H 0 H ~ transfrase 2.3. 7.39 Il 1 Il 1
,Pan-S - C - C - C - C - H ~ 3-ctoacyl 1 7x - 1 1f3 3-ctoacyl-[ACP]
Cys-$'H H H~ synthase 2.3. 7.47
f4l 3-ctoacyl-[ACP] ~C02 L2J rductase 7.7. 7. 700
f5l 3-hydroxypalmitoyl-(ACP] T--H ~ dshydratase 4.2. 7.67 o H
1\ 1
f6l noyl-[ACP]- Pan-S - C - ~ f C01-& ~ rductase (NADPH) 7.3.1.70
7 acyl-[ACP] ~ H Is~ hydrolase 3. 7.2. 74
Acys-s-C-9- H
,----1 _H_ 2 rsidu acyl malonyl -1 5 ~Araction de dpart _ouac~
B. Ractions de l'acide gras synthase
Figure 1.3: Le complexe de l'acide gras synthase (Koolman, Rhm 1999)
-
14
1.2.3 Le gne FAS et sa rgion promotrice
Chez les vertbrs, la FAS est code par un gne unIque localis sur le
chromosome 17q25 chez l'humain et sur le chromosome Il chez la souns
(Semenkovich, Coleman et al. 1995). En dpit de la taille importante de sa protine,
le gne FAS est relativement petit. La rgion codante reprsente environ 50 kpb chez
l'oie, 18 kpb chez le rat et moins de 40 kpb chez l'homme (Semenkovich 1997). Le
gne FAS est bien conserv entre les espces avec une homologie d'environ 80%
(Amy, Witkowski et al. 1989; Holzer, Liu et al. 1989).
Le gne FAS gnre un seul ARNm chez la souris et 2 ARNm chez le rat et le
poulet suite un pissage alternatif (Sul et Wang 1998). Chez le rat, on retrouve 43
exons et 42 introns espacs par des squences GT/AG, squences universelles
connues servant l' pissage alternatif (Amy, Williams-Ahlf et al. 1992). Il est
important de noter que les introns correspondent aux zones charnires situes entre
chacune des sous units catalytiques du complexe multienzymatique de la FAS. Chez
les plantes et les bactries, les acides gras saturs longues chanes sont synthtiss
par une succession d'enzymes monofonctionnelles codes par des gnes
indpendants. L'ensemble de ces observations suggrent donc que la FAS des
vertbrs est issue de la fusion de plusieurs gnes ancestraux (Amy, Williams-Ahlf et
al. 1992).
Les lments ncessaires la rgulation transcriptionnelle de la FAS semblent
tre situs dans les premiers 2,1 kpb du promoteur (Wang, Jones Voy et al. 2004).
Une analyse informatique de cette rgion promotrice chez diffrentes espces a
permis d'identifier de nombreux lments consensus (Wang, Jones Voy et al. 2004)
(figure lA) dont certains IREs (Elements de rponses l'insuline) dj bien
caractriss (Sul et Wang 1998).
-
15
-1000 ~----'I'CC ~:.... --------- ---~.--- -,~ ~ -1000 -lOOtl .1000
C"~GA CMG7C'l'"JC ,cn,":'i'(;,;-.... --CGC'ivil.C7 TT,c.------.----- ----1'CTCTC 7CTiT':'i'Ci --c~.,..;,\(:! 'i1"Ta---- 1AAA----- ------- -----.~~ Gl"J\!"oG"l'G.AA':' lcrr.ACA:;~ ~:~~ ~~~1!11 ~~~~~~ ~~~~~~ ~~~~~~
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-
16
1.2.4 Expression tissulaire de la FAS
Chez l'homme, l'expression de l'ARNm FAS est ubiquitaire. Cependant, son
niveau d'expression varie d'un tissu l'autre (Semenkovich 1997). Le plus haut
niveau d'expression de l'ARNm FAS est retrouv au niveau du foie et des poumons
chez l'humain (Semenkovich, Coleman et al. 1995). Chez les rongeurs, la lipogense
a lieu en grande partie au niveau du tissu adipeux, ce qui n'est pas le cas chez
l'humain. Cependant, un haut niveau d'expression de l'ARNm FAS est retrouv chez
l'humain au niveau du tissu adipeux intra abdominal (Semenkovich, Coleman et al.
1995), suggrant que son niveau d'expression pourrait varier et dpendre de l'origine
du tissu adipeux (Semenkovich 1997).
1.3 Rgulation de l'expression de la FAS
La FAS, enzyme clef de la lipogense hpatique est rgule par les hormones et
les nutriments. Au niveau hpatique, son activit est inhibe par une dite et
augmente par une ralimentation riche en sucre (Burton, Collins et al. 1969)
(Goodridge, Back et al. 1986). La FAS est rgule la fois au niveau transcriptionnel
(Katsurada, Iritani et al. 1990; Back, Goldman et al. 1986; Iritani, Nishimoto et al.
1992) et post-transcriptionnel (Wilson, Back et al. 1986; Moustaid and Sul 1991;
Semenkovich, Coleman et al. 1993). La T3 (Stapleton, Mitchell et al. 1990) et
l'insuline (Paulauskis et Sul 1989) augmentent le niveau d'expression des ARNm de
la FAS. Quand les 2 hormones sont ajoutes en mme temps, un effet synergique est
observ (Stapleton, Mitchell et al. 1990). De faon trs intressante, l'ajout de
MCFAs (hexanoate et octanoate) induit une inhibition de la FAS au niveau
transcriptionnel (Roncero et Goodridge 1992). Cette inhibition est spcifique et
rversible.
-
17
1.3.1 Rgulation hormonale de la FAS
1.3.1.1 Rgulation de la FAS par la T3
Il est connu que la T3 augmente le niveau d'expression des ARNm FAS
(Stapleton, Mitchell et al. 1990), mais le mcanisme molculaire de rgulation n'est
pas encore caractris et c'est le but prcis de notre tude. Nous allons donc nous
attarder dans cette partie sur le mcanisme gnral d'action des hormones
thyrodiennes.
1.3.1.1.1 Synthse des hormones thyrodiennes
Les hormones thyrodiennes (TI--Is) sont synthtises au niveau de la glande
thyrode qui est situe juste en avant de la trache. Cette glande est forme de 2 lobes
latraux runis par l'isthme et un petit lobe pyramidal. Au niveau microscopique, on
trouve des structures particulires: les follicules thyrodiens. Ces follicules sont bien
individualiss par des traves de tissu conjonctif et sont constitus par un pithlium
pavimenteux qui dlimite une lumire: le collode. On trouve un autre type de cellules
appeles cellules C (cellules calcitonine) ou cellules parafol1iculaires, qui sont
impliques dans le mtabolisme phosphocalcique.
Les hOlmones thyrodiennes sont synthtises au nIveau des follicules
thyrodiens partir d'un acide amin la tyrosine. L'iode est indispensable la
synthse de ces honnones. Il est capt au niveau du ple basal des cellules par un
mcanisme actif (pompe Na/I) (Dai, Levy et al. 1996), puis il traverse les cellules
pour rejoindre le ple apical et tre transform en iode inorganique (I2) par la thyrode
peroxydase en prsence de peroxyde d 'hydrogne (Yen 2001). L'iode inorganique va
par la suite tre incorpor au niveau d'un rsidu tyrosine d'une glycoprotine de 660
kDa: la thyroglobuline (Tg). La Tg peut fixer un deux atomes d'iodes formant ainsi
des MIT (monoiodo-tyrosines) ou des DIT (diiodo-tyrosines) qui vont par la suite se
-
18
coupler grce une enzyme; la thyroperoxydase pour former la T3 et la T4
(thyroxine) (figure 1.5). Les Tg contenant les MIT, les DIT, la T3 et la T4 sont
stockes au niveau du collode dans la lumire des follicules thyrodiens, ce qui
constitue la principale rserve en hormones thyrodiennes. Par la suite, la scretion
des hormones THs ncessite l'endocy10Se des Tg iodes (contenant les MIT, les DIT,
la T3 et la T4) au niveau de la surface apicale des cellules folliculaires thyrodiemles.
Les Tg internalises sont ensuite incorpores dans des phagolysosomes et soumises
une digestion protolytique afin d'aboutir la libration dans la cellule des MIT, des
DIT, de la T3 et de la T4. Les MIT et les DIT sont par la suite recapturs au niveau
apical alors que la T3 et la T4 sont libres dans la circulation sanguine au niveau du
ple basal de la cellule folliculaire. La grande majorit des THs produites par les
follicules thyrodiens est libre sous forme de T4.
La T4 secrte par les follicules thyrodiens possde une activit biologique
faible alors que la T3 qui possde une activit biologique leve est produite dans les
tissus cibles partir de la T4. La T3 est produite dans le majorit des cas, via un
mcanisme de diodination en 5' de la T4 et fait intervenir des slnoenzymes : les
diodases (Kohrle 2000; Larsen et Berry 1995).
-
19
Portion do foll.cula Ihyro'~dIOn
ColloYdo ~lIulO
1O
-
20
1.3.1.1.2 Mcanisme gnral d'action des hormones thyrodiennes
Les hormones thyrodiennes sont des hormones ,nuclaires et Jusque
rcemment taient considres comme ne possdant pas de rcepteurs membranaires.
Elles pntrent dans la cellule par diffusion travers la membrane cellulaire puis sont
exportes jusqu'au noyau. De nombreuses tudes ont mis en vidence que les
rcepteurs nuclaires aux hormones thyrodiennes (TRs) sont impliqus dans la
rgulation gnique induite par la T3. En prsence de T3, ces rcepteurs sont capables
de fixer l'hormone et de s'associer la chromatine avec une grande affinit et
spcificit (Oppenheimer, Schwartz et al. 1987; Samuels, Forman et al. 1988). Le
complexe fOlm par le rcepteur et son ligand va reconnatre des lments spcifiques
de rponse aux hormones thyrodielU1es (TREs) localiss sur le promoteur de certains
gnes cibles. Le TR peut se fixer sur son lment de rponse sous forme de
monomre, d'homodimre ou encore d'htrodimre (Forman, Casanova et al. 1992).
Il a t mis en vidence que le TR forme un htrodimre avec des protines
nuclaires du foie (Murray et Towle 1989). Ces protines isoles ont t appeles les
protines auxiliaires (TRAPs) et ont la proprit d'augmenter la fixation du TR sur le
TRE (Murray et Towle 1989) (Darling, Burnside et al. 1989). Par la suite, il a t
dmontr que les RXRs (rcepteurs l'acide rtinoque) taient les principaux
TRAPs (Sugawara, Yen et al. 1993). En prsence de T3, le taux d 'homodimre
TRJTR tend diminuer alors que l'htrodimre TRJRXR forme un complexe stable
et se fixe sur le TRE rgulant ainsi la transcription (Yen, Sugawara et al. 1992)
(figure 1.6).
-
21
T3
T4
Figure 1.6: Modle gnral d'action des hormones thyrodiennes (Yen 2001).
Les TRE sont forms de squences consensus et sont localiss dans la
majorit des cas en amont du promoteur minimal mais peuvent parfois tre situs en
3' de la squence codante (Bigler et Eisenrnan 1995). En comparant diffrents TREs,
une demi squence consensuelle hexamrique a t dfinie 5'-(G/A)GGT(C/G)A-3'.
Cette squence peut s'organiser en palindrome (TREpal), en rptition directe (ORs)
ou encore en palindrome invers (lPs). Ces demi-squences peuvent tre spares
respectivement par 0, 4 ou 6 nuclotides (figure 1.7). L'heterodimre TRlRXR se fixe
majoritairement sur des TRE organiss en OR4 (Andersson, Nordstrom et al. 1992;
Kurokawa, Yu et al. 1993).
REPETITION DIRECTE AGGTAXXXXAGGTA
PALINDROME TGACCTXXXXXXAGGTA
---~. 141--PALINDROME INVERSE AGGTCATGACCT
Figure 1.7: Organisation des diffrents TREs (Yen 2001)
-
22
1.3.1.1.3 Les rcepteurs aux hormones thyrodiennes.
Les TRs sont des rcepteurs nuclaires qui appmtiennent la super famille des
rcepteurs incluant les hormones stroidiennes, la vitamine D et l'acide rtinoque. Il
existe 2 gnes diffrents qui vont coder pour 2 isofonnes distinctes, TRa et TRp. Ces
gnes sont localiss respectivement sur les chromosomes humains 17 et 3 (Lazar
1993). Ces isoformes existent chez diffrentes espces, comme chez les amphibiens,
le poulet et la souris (Lazar 1993). De plus, il existe un mcanisme d' pissage
alternatif, ce qui aboutit une htrognit encore plus impOltante des TRs. Selon le
type cellulaire, 5 diffrentes formes majeures de rcepteurs vont pouvoir tre
synthtises: TRal, TRa2, TR~1, TR~2, TR~3. Les rcepteurs TRal, TRp1, TRp2,
TR~3 diffrent en taille et dans la squence d'acides amins en N-terminal alors que
TRa2 diffre en C-tenninal. Ce dernier ne peut fixer la T3 et son rle est encore
mconnu (Flamant et Samarut 2003) (figure 1.8). L'ARNm TRal est hautement
exprim dans le muscle squelettique, dans le tissu adipeux brun, alors que l'ARNm
TRp 1 est plutt exprim dans le cerveau, dans le foie et au niveau du rein (Hodin,
Lazar et al. 1990). L'ARNm TRp2 et sa protine ont une expression tissulaire trs
spcifique. Il est produit au niveau de la glande pituitaire antrieure, et dans des aires
spcifiques de l 'hypothalamus (Cook, Kakucska et al. 1992).
-
23
T~~ Isoforms: 1 ~ 13 1- 481
132 t::-:-:::.~: :::-4 100 ;00 ~ 5~4
f,3 100 100 ;.-1 ~:t~ ~390
TRa lsoforms: al
a2
Il 86 , Il 86
82
82
III 4\10...
1 492
Domaln: Ale c OIE 1 1 DNA Il Hormone
Figure 1.8: Comparaison des diffrentes isoformes des rcepteurs aux hormones thyrodiennes (Yen 2001)
Les TRs ont la mme organisation structurale qui est retrouve chez
l'ensemble des rcepteurs nuclaires (Lazar 1993). On distingue 4 domaines: un
domaine ami no-terminal A/B, un domaine central de fixation l'ADN contenant 2
motifs en doigt de zinc (DNA Binding Domain, DBD), une zone charnire contenant
le signal de localisation nuclaire et un domaine C terminal de fixation au ligand
(Ligand Binding Domain, LBD) (figure 1.8 et 1.9).
-
24
Nt -f'--__-:-Al_B_-:-__ l.-..-,----J
AF-1
l Domaine: de fixation du ligand,
Domaine d'interaction avec de dimrisation et d'activation de les T3 response element (TRE) la transcription (AF-2)
AF-2 est le domaine d'interaction avec les Co-Activateurs/Rpresseurs
Figure 1.9: Structure gnrale des rcepteurs nuclaires
(Modifi de Yen 2001 par A.Radenne)
Le domaine de fixation l'ADN est situ dans la rgion centrale du TR et est
compos de 2 motifs en doigt de zinc. A l'intrieur du premier doigt de zinc, on trouve
une bote p qui joue un rle critique dans la reconnaissance du TRE (Nelson,
Hendy et al. 1995) (figure 1.10). Les TRs vont se fixer majoritairement au niveau du
TRE organis en DR4. L'htrodimrisation du TR avec le RXR est essentielle et
permet de stabiliser la fixation du complexe au niveau du TRE (Kurokawa, Yu et al.
1993).
Le LBD permet la fixation de l'honnone thyrodienne maiS intervient
galement dans les mcanismes de dimrisation, de transactivation et de rpression en
absence du ligand (Yen 2001). Cette rgion forme une poche hydrophobe o va venir
se fixer les hormones thyrodiennes.
Le domaine amino-terminal (AlB) est la rgion la moins conserve et son rle
n'est pas bien connu. Il interviendrait dans la transactivation de la transcription mais
cette thorie reste controverse (Thompson et Evans 1989).
-
25
Figure 1.10: Reprsentation shmatique du domaine en doigt de zinc localis sur le TRP humain (Yen 2001)
1.3.1.1.4 Modulation du mcanisme d'action des TRs
De nombreuses protines nuclaires vont pouvoir interagir avec le TR et
moduler la rgulation de la transcription des gnes cibles. Ces protines vont former
des complexes et vont rguler le niveau d'actylation des histones ou les interactions
avec la machinerie transcriptionnelle de base. On peut distinguer les co-rpresseurs
qui vont exercer une rpression basale et les co-activateurs qui vont activer la
transcri ption.
Contrairement aux rcepteurs des hormones strodiennes qui sont inactifs en
absence de ligand, en absence de T3, les TRs peuvent se fixer sur les TREs et
moduler la transcription des gnes. Les TRs sans ligand vont diminuer la transcription
basale des gnes positivement rguls par la T3 (Brent, Dunn et al. 1989). Il a t mis
en vidence que le TR sans ligand tait capable d'interagir avec TFIIB, un lment
clef de la machinerie transcriptionnelle et donc interfrait avec la formation d'un
complexe de prinitiation de la transcription (Baniahmad, Ha et al. 1993). Il est
important de noter que certains gnes sont rguls ngativement en prsence de T3 et
qu'en absence de T3, le complexe TR/RXR induirait une augmentation de la
transcri ption (Yen 2001 ).
-
26
Plusieurs co-rpresseurs ont dj t isols; le co-rpresseur NCor (nuclear co
repressor) (Horlein, Naar et al. 1995) qui est capable d'interagir avec TFIIB et le co
rpresseur SMRT (Silencing mediator ofRAR and TR). Ces 2 protines sont capables
de former des complexes avec d'autres co-rpresseurs comme sinl ou avec des
histones desactylases (l-lDACs) et jouer un rle clef dans la rpssion de la
transcription. Les HDAC sont des enzymes qui vont enlever les groupements actyles
situs sur les rsidus lysines des histones, ce qui va bloquer l'accs des facteurs de
transcription au niveau de l'ADN est donc inhiber la transcription. (Hu et Lazar 1999)
(figure 1.11).
Lors de la fixation du ligand, il se produit un changement conformationnel,
ce qui entrane la dissociation des co-represseurs et permet la fixation des co
activateurs. Ces co-activateurs en association avec diverses protines adaptatrices
vont former un complexe permettant de mettre en contact la machinerie
transcriptionnelle avec l'htrodimre TRJRXR. Un des co-activateurs bien
caractris est la protine p 160/SRC1 (Steroid Receptor Co-activator). Cette protine
possde une activit histone actyltransfrase (HAT) intrinsque et est galement
implique dans le recrutement de diffrentes HAT et d'histones mthyltransfrases. Il
est important de noter que SRC-l peut tre phosphoryl par les MAPK et donc peut
tre rgul par des effecteurs comme des hormones se fixant sur des rcepteurs
membranaires (Rowan, Garrison et al. 2000). Suite cette phosphorylation, SRC-l va
recruter le complexe p300/CBP (CREB Binding Protrein) qui va lui-mme recruter le
complexe PCAF (p3GGICBP Associated Factor). Ces protines servent d'adaptateurs
aux rcepteurs nuclaires pour la machinerie transcriptionel1e et possdent une
activit HAT (ce qui permet le remodelage de l'ADN) (Bassett, Harvey et al. 2003).
Il existe d'autres protines activatrices telles que les protines TRAPs (TR associated
proleins) et les DRIPs (Vitamin D receptor inleracling proteins). Ces protines vont
permettre la fixation et la stabilisation de l'ARN polymrase II. L'existence de 2
groupes diffrents de protines co-activatrices suggre que le TR rgule l'activation
de la transcription en 2 tapes. Dans un premier temps, il y a remodelage de l'ADN
-
27
avec la fixation du complexe p160/SRC l, suivi de la fixation des protines
TRAP/DRIP qui vont moduler la transcription des gnes (Bassett, Harvey et al. 2003)
(figure 1.11).
- T3
TRE TATA
------~------------------
+T3 DRIPfTRI\P complex
HI$~one ACtylatlon
GTFs
TRE TATA
Figure LU: Modle molculaire de la rpression basale en absence de T3 et de l'activation de la transcription en prsence de T3 (Yen 2001)
1.3.1.1.5 Modifications post-traductionnelles des TRs
Diffrents groupes de recherche ont montr que des modifications post
traductionnelles des TRs telles que la phosphoryiation (Jones, Brubaker et ai. 1994)
ou encore l'actylation (Fu, Rao et al. 2003) peuvent moduler la transcription des
gnes rguls par les THs.
L'augmentation du niveau de phosphorylation de la cellule par des inhibiteurs
de phosphatase accrot l'action induite par la T3 en activant la transcription de divers
-
28
gnes cibles (Swierczynski, Mitchell et al. 1991; Lin, Ashizawa et al. 1992; Jones,
Brubaker et al. 1994). Le TR, le RXR ou encore les co-activateurs pourraient tre des
cibles potentielles de phosphorylation. La voie de signalisation cellulaire des MAPK
semble tre implique dans ces modifications posttraductionnelles. Davis et son
quipe ont montr que le TR~l est capable de s'associer avec ERK1/2, ce qui aboutit
la phosphorylation du rcepteur (Davis, Shih et al. 2000). La phosphorylation du
TR favoriserait son htrodimrisation avec le R.XR et donc induirait l'augmentation
de la fixation du complexe TRJRXR au niveau du TRE (Bhat, Ashizawa et al. 1994).
Le co-activateur SRC-1 est galement une cible potentielle de phosphorylation par
ERKl/2 (Rowan, Garrison et al. 2000) et peut donc aussi moduler l'activation des
rcepteurs nuclaires. De plus, la phosphorylation du rcepteur TRa.l du rat semble
tre implique dans la localisation et la rtention du rcepteur dans le compartiment
nuclaire (Nicoll, Gwinn et al. 2003), ce qui favoriserait une induction de la
transcription des gnes cibles. L'ensemble de ces rsultats laisse suggrer que la
phosphorylation pourrait jouer un rle important dans la rgulation des gnes par la
TI mais par un mcanisme encore mconnus.
Les rcepteurs nuclaires et notamment les TRs sont aussi des cibles
potentielles d'actylation (Fu, Rao et al. 2004; Fu, Wang et al. 2004; Lin, Hopkins et
al. 2005). La protine CBP/p300 qui possde une activit HAT intrinsque semble
tre directement implique dans ce mcanisme d'actylation (Wang, Fu et al. 2001;
Lin, Hopkins et al. 2005). L'actylation des rcepteurs nuclaires induit une
augmentation de l'activit transcriptionnelle en favorisant le libration des co
rpresseurs et la fixation des co-activateurs (Fu, Rao et al. 2003). La voie MAPK
semble aussi tre implique dans la modulation de ce mcanisme d'actylation (Lin,
Hopkins et al. 2005).
-
29
1.3.1.1.6 Action non gnomique des THs
Il apparat de plus en plus vident que les hormones thyrodiennes pourraient
agir via un mcanisme d'action diffrent appel mcanisme d'action non gnomique
(Bassett, Harvey et al. 2003; Losel, Falkenstein et al. 2003) (figure 1.12). Comme
pralablement dcrit, les THs peuvent agir directement au niveau des gnes via la
fixation d'un complexe hormone/rcepteur au niveau d'un TRE (action gnomique).
Cependant, elles peuvent galement agir via l'activation de diffrentes cascades de
signalisation intracellulaire telle que la voie Pl3-Kinase/Akt et la voie MAPK (Davis,
Leonard et al. 200S). L'quipe de Cao a mis en vidence, dans des cellules
fibroblastiques humaines, que la T3 tait capable d'activer la voie Pl3 -Kinase/Akt
PKB/mTor/p70s6K via une interaction directe dans le cytosol entre le TR~ 1 et la sous
unit rgulatrice de Pl3kinase (pS5a). Ceci induirait une augmentation de la
transciption du gne de la calcineurine (ZAKI-4a) (Cao, Kambe et al. 2005). Dans
des cellules endothliales vasculaires aortiques, la T3 est aussi capable d'activer la
voie PB -Kinase/Akt via galement une interaction directe entre le TRa1 et la sous
unit pS5a de PB-Kinase. L'activation de cette voie induit l'activation de eNOS
induisant un effet vasodilatateur et neuroprotecteur au mveau cardiovasculaire.
L'activation de la voie PB-Kinase/Akt par la T3 ne semble pas induire une
modulation de la transcription du gne eNOS mais module l'activit de eNOS au
niveau post-traductionnel via un mcanisme de phosphorylation (Hiroi, Kim et al.
2006). De plus, l'quipe de Davis a rcemment mis en vidence que la thyroxine (T4)
tait capable de se fixer sur un rcepteur membranaire aux intgrines (Lin, Davis et
al. 1999; Davis, Davis et al. 2005), ce qui induit l'activation de PKC, Ras, Rafl,
MEK et de ERK. L'activation de ces kinases entrane la translocation dans le noyau
de ERK (Davis, Shih et al. 2000; Shih, Lin et al. 2001) et subsquemment la
phosphorylation du TR. Il est important de noter que le TR (Davis, Shih et al. 2000),
le RXR (Torra, Ismaili et al. 2008) ou encore les co-activateurs comme SRC-]
(Rowan, Garrison et al. 2000) sont des cibles potentielles de phosphorylation par ces
-
30
kinases et sont impliqus dans la modulation de la transcription des gnes rguls par
la T3.
Figure 1.12: Shma rcapitulatif du mcanisme d'action gnomique et non gnomique des THs (Davis, Davis et al. 2005)
1.3.1.1.7 Le TRE sur le promoteur FAS
Le mcanisme de rgulation de la FAS par la T3 n'a pas encore t bien
caractris. Cependant, un site consensus de fixation la T3 (TRE) a t localis sur
le promoteur FAS de diffrentes espces grce des analyses informatiques (Wang,
Jones Voy et al. 2004). Ce TRE a t localis entre -771 pb et -598 pb chez l'humain,
la souris, le rat et le poulet. Cet lment est organis en squence directe spare par
4 nuclotides (DR4) et est fortement conserv entre ces diffrentes espces (Wang,
Jones Voy et al. 2004). Ces analyses ont permis C. Martel, tudiante la matrise
-
31
dans le laboratoire du professeur C. Mounier, de localiser un TRE sur le promoteur
FAS de l'oie entre -902 et -577 pb.
Plusieurs TREs prsents sur le promoteur aviaire de l'enzyme malique ont
dj t bien caractriss. L'enzyme malique est une enzyme lipognique rgule de
faon similai que la f AS (Wilson, Back et al. 1986; Swierczynski, Mitchell et al.
1991). En prsence de T3, ces TRE organiss en DR4 fixent l'htrodimre TRlRXR
ce qui induit une augmentation de la transcription (Thurmond et Goodridge 1998).
Ces rsultats laissent donc suggrer que la T3 induit la transcription de la FAS via la
fixation d'un complexe hormone/rcepteur sur un TRE localis sur le promoteur
FAS.
1.3.1.2 Rgulation de la FAS par l'insuline
Le mcanisme de rgulation transcriptionnelle de la FAS par l'insuline a dj
t bien caractris. L'insuline agit en se fixant sur son rcepteur membranaire (IR:
!nsulin receptor) localis la surface des cellules. La fixation de l'hormone sur l'IR
induit l'activation de l'activit tyrosine kinase du rcepteur, ce qui aboutit une
autophosphorylation puis une transphosphorylation de l'IR sur des rsidus tyrosines.
Les rsidus tyrosines phosphoryls de l'IR vont permettre le recrutement puis la
phosphorylation des protines adaptatrices telles que les IRS, Gab 1 ou CAP, ce qui
aboutit en aval l'activation de diffrentes voies de signalisation intracellulaire.
(Nakae et Accili 1999). La voie PI3-kinase/Akt a dj t bien caractrise: la
phosphorylation des IRS induit le recrutement de la sous-unit p85 (unit rgulatrice)
de la PI3-kinase qui par la suite va recruter la sous unit p110. L'activation de PI3
kinase induit la transformation du PIP2 en PIP3 au niveau membranaire aboutissant
la phosphorylation de PDKl. L'activation de PDKI va entraner en aval la
phosphorylation de Akt, kinase capable de moduler la transcription en phosphorylant
diffrents facteurs de transcription. La voie des MAPK (mitogen activated prolein
kinase) constitue aussi l'une des principales voies de signalisation active par
-
32
l'insuline. Aprs activation des rcepteurs l'insuline, cette voie implique par
l'intermdiaire de protines adaptatrices l'activation de la protine Ras. Cette protine
est l'origine d'une cascade de phosphorylation impliquant Raf (MAP kinase kinase
kinase), MEK (MAP kinase kinase) et ERK (MAP kinase). Cette dernire, transloque
dans le noyau de la cellule, phosphoryle alors des facteurs de transcription modulant
ainsi la transcription (Avruch 1998).
L'insuline rgule la FAS en modifiant la fixation de plusieurs facteurs de
transcription au niveau d'une unit de rponse l'insuline localise sur le promoteur.
Cette rgulation implique spcifiquement l'activation de la voie PB-kinase/Akt
(Wang et Sul 1998).
Le premier IRE (Element de rponse l'insuline) localis - 65 pb sur le
promoteur de la FAS est une E-box qui fixe les facteurs de transcription ubiquitaires
USF-l et USF-2 (Upstream Stimulatory Factor) (Moustaid, Beyer et al. 1994; Wang
et Sul 1995). Deux sites de fixation des facteurs SREBP-l c ont t localiss sur le
promoteur FAS: le premier SRE (Sterol response element) est localis entre -150 et
141 pb (Latasa, Griffin et al. 2003), Je second est plus atypique, il se situe -65 pb et
entoure la E-box (Kim, Sarraf et al. 1998). De plus, l'insuline peut galement
augmenter la transcription de la FAS en augmentant la synthse de la protine
SREBP-l c et cela par un mcanisme transcriptioneI (Shimomura, Bashmakov et al.
1999). Les protines SREBPs sont des facteurs de transcription regroupant 3
isoformes (SREBP-la, SREBP-lc, SREBP-2). SREBP-lc est l'isoforme qui rgule
principalement les gnes impliqus dans la synthse des lipides (Eberle, Hegarty et al.
2004). Les SREBPs sont synthtiss sous forme d'un prcurseur associ des
protines SCAP (SREBP C!eaving-activating proteins) au niveau du rticulum
endoplasmique (Nohturfft, Brown et al. 1998). Le niveau du facteur de transcription
SREBP mature et transcriptionellement actif est donc dtermin par le niveau de
synthse mais galement par le clivage protolytique du prcurseur. L'insuline
augmente la transcription du gne SREBP-1c dans le foie (Kim, Sarraf et al. 1998)
-
33
via l'activation de la vOIe de signalisation PI3-kinase et Akt (Azzout-Marniche,
Becard et al. 2000).
Il a galement t mis en vidence en rponse l'insuline un site de fixation
pour le facteur de transcription nuclaire NF-Y. Ce facteur stimule la transcription de
nombreux gnes en se fixant sur un motif CCAAT. Il existe un dernier site de
rgulation par l'insuline. Il fixe le facteur Sp 1 qui est un facteur de transcription
ubiquitaire ciblant une rgion riche en GC (Mounier et Posner 2006).
1.3.2 Rgulation nutritionnelle de la FAS
1.3.2.1 Rgulation de la FAS par le glucose
Une alimentation riche en sucre la suite d'une priode de dite induit une
augmentation importante du niveau de la protine FAS (Back, Goldman et al. 1986).
Cette rgulation aussi lieu au niveau transcriptionnel. Il a t mis en vidence dans
des cellules HepG2 (cellules issue d'un hpatocarcinome humain), que le glucose
induit une augmentation de l'expression de la FAS (Semenkovich, Coleman et al.
1993). Cette rgulation de la FAS par le glucose s'effectue via la fixation du facteur
de transcription ChREBP (Carbohydrate Responsive Element Binding Protein)
(Uyeda, Yamashita et al. 2002; Yamashita, Takenoshita et al. 2001; Ma, Robinson et
al. 2006) sur son lment de rponse localis sur le promoteur FAS. De plus, il est
noter qu'une alimentation riche en sucre stimule aussi la production d'insuline par les
cell ules ~ du pancras. L'insuline est bien connue pour rguler la FAS via la fixation
de diffrents facteurs de transcription, comme notamment les SREBP (Latasa, Griffin
et al. 2003) sur des IREs localiss sur le promoteur FAS. Il est donc relativement
difficile de diffrencier les effets activateurs induits par l'augmentation du taux de
sucre circulant ou par la production de l'insuline (Uyeda, Yamashita et al. 2002). Le
glucose est galement capable de rguler la FAS au niveau post-transcriptionnel, soit
-
34
en rgulant la stabilit des ARNm FAS (Li, Chua et al. 1998; Semenkovich, Coleman
et al. 1993).
1.3.2.2 Rgulation de la FAS par les PUFAs
Les acides gras poly insaturs diminuent la transcription de la FAS au niveau
hpatique (Blake et Clarke 1990), alors que dans le tissu adipeux, les PUFAs ont peu
d'effet (Sul et Wang 1998). Le mcanisme molculaire d'action des PUFAs n'est pas
encore bien caractris. Il a clairement t mis en vidence que les PUFAs peuvent
diminuer l'expression de la FAS via la diminution du facteur de transcription
SREBP-1. (Moon, Latasa et al. 2002). Les PUFAs pourraient galement agir en
inhibant la fixation de la T3 sur son rcepteur nuclaire, ce qui induirait une
diminution de la transcription (Inoue, Yamamoto et al. 1989). Enfin, la transcription
de la FAS pourrait tre module par les PUFAs via les facteurs de transcription PPAR
(peroxisome proliferator-activated receptor) (Bocos, Gottlicher et al. 1995).
1.3.2.3 Rgulation de la FAS par les MCFAs
Il a dj t mis en vidence que les acides gras saturs de 6 ou 8 carbones taient
capables d'inhiber l'effet synergique de la T3 et de l'insuline au niveau de la
transcription et de l'activit de la FAS (Roncero et Goodridge 1992) (Thurrnond,
Baillie et al. 1998). Cependant le mcanisme d'action des MCFAs sur la transcription
de la FAS reste encore tre lucid. Cette rgulation semble avoir lieu au niveau du
TRE (Thurmond, Baillie etaI. 1998). Cependant, les MCFAs ne semblent pas
moduler la fixation de l'hormone sur son rcepteur, ni du TR sur le TRE (Thurrnond,
Baillie et al. 1998). Diffrentes hypothses peuvent tre envisageables: (i) les
MCFAs ou leurs mtabolites pourraient moduler la maturation de la protine SREBP
1 entranant une inhibition de la transcription induite par la T3 et l'insuline (Zhang,
Yin et al. 2003), les MCFAs pourraient galement agir directement via leur fixation
-
35
sur un rcepteur de type GPCR (Brown, Jupe et al. 2005) et activer diffrentes voies
de signalisation qui pourraient moduler le niveau de phosphorylation ou d'actylation
du complexe TRJRXR ou encore des diffrents co-activateurs ou co-represseurs (Yen
2001).
L'objectif de ce travail de matrise est de mettre en vidence les mcanismes
molculaires par lesquels la T3 et l'insuline rgule la transcription de la FAS.
-
CHAPITRE II
ARTICLE SCIENTIFIQUE
-
37
HEPATIC REGULATION OF FATTY ACID SYNTHASE BY INSULIN AND
T3: EVIDENCE FOR T3 GENOMIC AND NON-GENOMIC ACTIONS.
Abbreviation titie: Insulin and T3 regulation of FAS gene expression
Anne Radenne, Murielle Akpa, Caroline Martel, Sabine Sawadogo, Daniel Mauvoisin
and Catherine Mounier*.
Dpartement des Sciences Biologiques, Centre de recherche BioMed, Universit du
Qubec, Montral, Qubec, Canada, H3C 3P8.
Correspondent footnote. *To whom correspondence should be addressed:
Dpartement des Sciences Biologiques, Centre de recherche BioMed, Universit du
Qubec. C.P. 8888, Succursale Centre-ville, Montral, Canada, H3C 3P8. Tel. 1-514
987-3000, Ext 8912; Fax: 1-514-987-4647; E-mail: mounier.catherine(),ugam.ca
-
38
2.1 Abstract
Fatty acid synthase (FAS) is a key enzyme of hepatic lipogenesis responsible
for the synthesis of long chain saturated fatty acids. This enzyme is mainly regulated
at the transcriptional level by nutrients and hormones. In particular, glucose, insulin
and T3 increase FAS activity whereas glucagon, saturated and polyunsaturated fatty
acids decrease il.
In the present study, we show that, in liver, T3 and insulin were able to activate FAS
enzymatic activity, mRNA expression and gene transcription. We have localized the
T3 response element (TRE) that mediates the T3 genomic effect, on the FAS
promoter between -741 and -696 bp that med iates the T3 genomic effect. We show
that both T3 and insulin regulate FAS transcription via this sequence. The TRE binds
a TR/RXR heterodimer, even in the absence of hormone and this binding is increased
in response to T3 and/or insulin treatment.
The use of H7, a serine/threonine kinase inhibitor, reveals that a phosphorylation
mechanism is implicated in the transcriptional regulation of FAS in response to both
hormones. Specifically, we show that T3 is able to modulate FAS transcription via a
non-genomic action targeting the TRE through the activation of a PI3-kinase-Erk ]/2
MAPK dependent pathway. Insulin also targets the TRE sequence, probably via the
activation of two parallel pathways: Ras/Erkl/2 MAPK and PI3-kinase/Akt. Finally,
our data suggest that the non-genomic actions of T3 and insulin are probably common
to several TREs, as we observed similar effects on a classical DR4 consensus
sequence.
Key words: Fatty acid synthase, triiodothyroninc, insulin, TRE, PB-kinasc, Erkl/2
MAPK.
-
39
2.2 Introduction
Lipogenesis converts dietary carbohydrates to fatty acids primarily in liver
(28). Insulin and triiodothyronine (T3) are involved in mediating the effects of diet on
lipogenesis in vivo (34). Hepatic lipogenesis is increased in hyperthyroid states or in
response to T3 injection (10, 15, 19, 24, 25, 28, 61, 70, 75, 82) as weil as in
hyperinsulinemic subjects (79). ln vivo, these two hormones are also involved in the
long-term regulation oflipogenic enzymes activities such as fatty acid synthase (37).
Farty acid synthase (FAS) (EC.2.3.1.85) is a key enzyme in hepatic
Iipogenesis. In presence of NADPH, this multifunctional enzyme catalyses the
conversion of acetyl-CoA and malonyl-CoA into long chain saturated fatty acids such
as palmitate and stearate (92). The de novo synthesis of fatty acids in human and
chicken mainly takes place in the liver (30, 58), whereas in rodents the adipose tissue
is also lipogenic (30). In vertebrates, FAS is a homodimer made of two identical
peptide chains of about 26kD (84, 91), located in the cytoplasm of the cell (31). FAS
is encoded by a unique gene that generates only one mRNA in mOllse (72) and two in
chicken and rat, as a result of alternative splicing (3). In the liver, the activity of FAS,
as most lipogenic enzymes (96), is regulated through nutrients and hormones.
Starvation causes decrease in the activity of the enzyme, and refeeding restores it (3,
66). A similar effect of refeeding is also observed on the mRNA expression level and
stability, as weil as on the transcription (3, 41, 48, 52, 65). It was also shown that
insulin (73) and T3 (83, 96) increase the FAS mRNA expression level, whereas
glucagon (50, 73, 81), medium chain fatty acids (MCFA) (76) and polyunsaturated
fatty acids (PUFA) decrease it (9, ]7,43,64).
lnsulin increases FAS transcription by modifying the binding of various
transcription factors on the insulin response element (IRE) located on the promoter
(73). The effect of insulin is mediated by the activation of the PI3-kinase/Akt
pathway (93). The first IRE characterized is an E-box, that binds the ubiquitous
transcription factors USFI and USF2 (Upstream Stimulatory Factors), located at
-
40
65bp on the FAS promoter (68, 94). lnsulin also increases transcription of FAS by
inducing the binding of SREBP-l c to two different SREs (Sterol Regulatory
Element), one located around -150bp (51) and the other at -65bp (51). Finally, insulin
also regulates FAS transcription by increasing the binding of NF-Y and SpI to the
103 bp 10 -53bp region (63).
Various studies from the AG. Goodridge's laboratory showed that T3 is able
to potentiate the effect of insulin on FAS transcription through an unknown
mechanism (83, 96). T3 is known to regulate gene transcription via the binding of
hormone/receptor complexes to T3 response elements (TRE) located on the promoter
of a variety of genes (97). The TREs are located, for the most part, upstream of the
minimal promoter, but can sometimes be 10cated on the 3' end of the coding sequence
(8). A consensual hexameric sequence, (GIA)GGT(CIG)A, was defined. This
sequence can be a palindrome (TREpal), a direct repeat (DRs) or an inverted
palindrome (IPs) (32). These TREs bind the T3 receptors (TR) belonging to the
nuclear receptor super-family (53). The latter can form homodimers or interact with
other nuclear receptors, such as RXR (retinoid X receptor) to forro heterodimers (lI,
27). The heterodimers bind preferentially to DRs separated by four nucleotides (DR4)
(74). This increases the transcriptional activity in response to T3, in a more efficient
manner than the TRJTR homodimers (39, 47). ln regard to the FAS gene, the
sequence alignment of different species (mouse, rat and chicken) suggests the
presence of a DR4-type TRE on the promoter (95).
Previous studies suggest that a general increase in the phosphorylation state of
the cell would maximize the T3 action by activating the transcription of target genes
(42, 60, 88). The TR nd RXR receptors, as well as different co-activators, can be
targets of these phosphorylation events. ln pmiicular, TR can be phosphorylated in
the cytosol (33) by casein kinase Il but a1so in the nucleus (85). This phosphorylation
would initiate TR heterodimerization with RXR (7), or could also protect it from
degradation, which in turn would increase transcription (89). It has also been shown
-
41
that SRC 1, a TR coactivtor, can be phosphory lated by MAP-kinase through the
activation of membrane bound receptors (77).
It becomes more apparent that thyroid hormones (THs) regulate transcription
via a non-genomic mechanism (5, 62), by activating different intracellular signaling
cascades. Cao and collaborators showed that in human. fibroblasts, T3 was able to
activate the PI3-kinase/PKB/mToRJp70s6K pathway via a direct cytosolic interaction
between TR and the PI3-kinase regulatory subunit, p85a. (14). Moreover, previous
studies have demonstrated that thyroid hormone is able to bind an integrin
alpha(V)beta(3) cell surface receptor leading to the activation of a PKCa. (1, 6, 21,
59). Subsequently, Erkl/2 MAPK is activated and translocated into the nucleus (22,
80) where it can phosphorylate the TR (22, 80).
In the present study, we have shown that at the hepatic level, insulin and T3
act synergistically to stimulate FAS activity. The effect of T3 on FAS is mainly
transcriptional and mediated by the binding of a TRJRXR heterodimer on a DR4-type
TRE. On top of that, our study reveals that the T3 action on the TRE also involved a
non-genomic action through the activation of a PB-kinase and Erkl/2 MAPK
dependent signaling pathway. Finally, our study also suggests that insulin is able to
modulate the transcriptional activity of the TRE either through the activation of a PI3
kinase/Akt and/or a Ras/Raf-Erkl/2MAPK signaling pathway.
-
42
2.3 Materials and methods
2.3.1 MateriaIs
The restriction enzymes, the T4 DNA ligase and the T4 polynucleotide kinase
were obtained from New England Biolabs (Pickering, CA). The Taq polymerase was
acquired from Perkin Elmer (Wellesley, MA). Eggs from white Leghorn chickens
were purchased from Couvoir Simentin (Mirabel, Quebec). HepG2 cells were
purchased from ATCC (Manassas, VA). Minimum Essential Medium (MEM),
Waymouth medium, 3,5,3-L-triiodothyronine, insulin, H7 and genistein were
obtained from Sigma. LY294002, PD98059 and UOl26 inhibitors were purchased
from Calbiochem (EMD Biosciences, San Diego, CA). [y_32p]_ATP was purchased
from Perkin Elmer (Wellesley, MA). Fugene HD transfecting agent, CAT-ELISA kit,
Collagenase H and Klenow enzyme were obtained from Roche Diagnostic (Laval,
Quebec). Fetal bovine serum was purchased from Cansera (Etobicoke, Ontario).
Antibodies (Akt, anti-phospho-Akt (Ser273), p42/44 MAPK, anti-phospho-p42/44
MAPK (Thr 2021204)) were acquired from Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers,
MA). Anti-TRa.lITr~1 and anti-RXRa./~/y antibodies were obtained from Santa Cruz
Biotechnology (Santa Cruz, CA). Unless otherwise stated in the text, ail other
chemicals were purchased from Sigma.
2.3.2 Plasmid Constructs
The goose fatty acid synthase promoter was graciously provided by Dr. A.G.
Goodridge (44). This cosmid contained 46kb of the FAS gene including 12kb
downstream of th.e transcription initiation site. The first 1.6kb of the FAS promoter
were cloned into the pJFCATI vector, which incorporates the Chloramphenicol
acetyl tranferase (29) reporter gene. The -902bp to -577bp fragment, containing the
FAS TRE, was PCR amplified using specifie primers containing HindIII and BamHI
restriction sites at their extremities. The amplified fragment was subsequently
inserted into the pBLCAT2 vector upstream of the thymidine kinase (88) minimal
-
43
promoter and the CAT reporter gene. The synthetic sequence of the classical TRE
DR4 (AGCTTAGCTTCAGGTCACAGGAGGTCAGAGAGG) was cloned into the
pBLCAT2 vector using the Hind III and SaI l restriction sites.
2.3.3 Ce!! culture and transfection.
Chick embryo hepatocytes (CEH) were isolated from livers of 19-day-old
chick embryos (35) (protocol # 590approved by the University animal care comity).
2.5 x 106 ceIls were plated in 35mm tissue dishes and cultured at 40 C under 5% CO2,
in Waymouth medium supplemented with streptomycin (100Ilg/mL) and penicillin
(60llg/mL). After 24h, the medium was removed by aspiration and replaced by
medium supplemented with T3 and/or insulin, and incubated for different periods of
time as indicated in the figure legends. For the experiment using kinase inhibitors, the
CEH were incubated with the hormones after a 30 min pre-incubation period with the
various inhibitors (DMSO 0.5%, 51lM genistein, 251lM H7, 50llM PD98059, SOIlM
LY294002, and 20llM U0126). The human hepatocarcinoma cells (HepG2) were
cultured in MEM medium supplemented with streptomycin Cl OOllg/mL), penicillin
(60llg/mL), FBS (10%) and glutamine (4mM final). The day before transfection, the
ceIls were plated at 80% confluence (about 6 x 105 cells per weIl). The cells were
then incubated for 24h with 71lL of Fugene HD, 1.Sllg of the different DNA
constructs tested and O.5llg of pRSV-~-galactosidase, in absence of serum and
antibiotics. The medium was then replaced with one containing antibiotics and serum,
and hormones were added as indicated in the figure legends. After 24h of culture, the
cells were harvested and the different cellular extracts were prepared.
2.3.4 FAS activity.
FAS activity was measured by tracking the decrease of absorbance at 340nm,
which is the result of NADPH disappearance due to the conversion of malonyl-CoA
and acetyl-CoA into long chain fatty acids (36). Following hormonal stimulation, 2 to
3 plates of treated cells (about 10 x 106 cells) were harvested in 1X PBS. After a short
-
44
centrifugation, the cells were re-suspended in cold homogenization butTer (0.1 M KPi,
pH 7; 3mM EDTA, pH 7 and ImM OTT). The cytosolic extracts were prepared
through homogenization of the cells with a Dounce homogenizer. The lysates were
subsequently centrifuged at 3000 rpm for 15 min at 4C. The FAS activi ties was
evaluated by mixing, in a Quartz cuvette, 50lJ,L of cell Iysate, O.IM KPi, pH 7;
0.0025mM acetyl-CoA; 0.18mM NADPH; 3mM EDTA and 1mM OTT. The reaction
was initialized by adding O.lmM of malonyl-CoA. The 00 at 340nm was then
recorded for a 15 min period, at 4oC in a Cary-lOO spectrophotometer (Varian,
Quebec).
2.3.5 Analysis of rnRNA expression level.
Total RNA was extracted from chick embryo hepatocytes as previously
described (16). UV-quantified RNA were diluted in DEPC-treated water at a final
concentration of 1!-Lg/fll. Reverse transcription (RT) was perfonned using the
Omniscript enzyme kit of Qiagen (Montreal, Quebec) and Oligo-dT (Roche
Diagnostics, Quebec) for 1hOO at 37C, with a 5 min inactivation step at 93C.
qPCRs were then performed using the QuantiTect SYBR Green PCR Kit from
Qiagen (Montreal, Quebec) and the LightCycler device (Roche Diagnostics, Quebec).
The HPRT-1 gene was used as reference. The relative quantification was then
performed using the RelQuant software (Roche Diagnostics, Laval, Canada). For the
FAS gene, primers were defined on goose sequences:
AGGAAATGAGGCTGCGTTG (sense) and CTGAGTGCTTCACGGTTGATG
(antisense) and for the HPRT-1 gene primers were defined on human sequences:
ATGACCTCTCAACCTTGACTGG (sense) and GGCCACTTTCACCATCTTTG
(antisense).
-
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2.3.6 Analysis of promoter activity.
HepG2 cells were Iysed at room temperature in 500jlL of CAl' Elisa Iysis
buffer (Roche Diagnostics, Laval, Quebec). Protein concentration (12) and ~
galactosidase activity (78) \vere measured by the indicated methods. The CAT
activity was evaluated using the CAT-ELISA kit according to the manufacturer's
instructions (Roche Diagnostics). The results were expressed as CAT activity per
milligram of soluble protein, and then norrnalized for transfection efficiency using the
~-galactosidase activity.
2.3.7 Gel electrophoretic mobility shift assay.
HepG2 cells were incubated for 24h in serum free MEM with or without
IOOmM insulin, 1.6jlM 1'3 or both hormones and nuclear extracts were prepared as
previously described (2). A 40bp double stranded oligonucleotide corresponding to
the TRE sequence of the goose FAS gene
(TGCCCTGCCCGCCGCCCTGTGGTAACCTCGGGACCGCGCT) was labeled
with [y)2p]_ATP using the 1'4 polynucleotide kinase. 5jlg of nuclear extract were
incubated with 2111 of binding buffer containing 20,000cpm of 32p labeled probe,
lOng ofpoly(dI-dC), Ijll ofBSA, 4% (v/v) glycerol and 1% (v/v) ficol/. The reaction
was then incubated for 15 min at room temperature. For supershift experiments,
nuclear extracts were pre-incubated for 15 min at room temperature with 2jlg of
specifie antibody or with IgG. The reaction mixtures were then subjected to
electrophoresis on a 6% polyacrylamide gel at 150 V in 25mM Tris-HCl, 0.19M
glycine, 1mM EDTA. Gels were dried and visualized by autoradiography using the
phospho-imager system (Molecular imager FX, Biorad, Mississauga, Canada).
2.3.8 Western blot.
After treatment with the test agents, for the time and the concentration
indicated in the figure legends, CEH were rinsed twice with ice-cold phosphate
buffered saline (pH 7.4) and solubilized with lysis buffer (50mM Hepes, pH
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46
7.S, lS0mM NaCI, 10mM sodium pyrophosphate, 100mM sodium fluoride, l.SmM
MgCb, 1mM EGTA, 200!lM sodium orthovanadate, 1mM phenylmethylsulfonyl
fluoride, tablet of EDTA free complete mini (Roche Diagnostics, Laval, Quebec),
10% glycerol, and 1% Triton X-100). Celllysates were c1arified by centrifugation at
10 000 x g for 20 min at 4 oC, and protein concentrations, in the resulting
supematants, were determined using the Bradford method (l2). 20!lg of protein from
cell Iysates were mixed with 4!l1 of 3x Laemmli sample buffer (2% SDS, 2% ~
mercaptoethanol, 10% VN glycerol and SOmg/ml bromophenol blue in 0.1 M Tris
HCI buffer, pH 6.8), heated at 100DC for S min, subjected to SDS-PAGE and then
transferred to Immobilon-P membranes (Millipore) for immunoblotting. Membranes
were incubated for 1h in blocking buffer (lX TBS, 0,1% Tween-20: TBST)
containing S% milk, and then overnight at 4C in TBST/5% BSA with the various
antibodies: FAS (l: 1000), GAPDH (1: 1000), Akt (1: 1000), phospho-Akt (l: 1000),
p42/44 MAPK (l: 1000), phospho-p42/44 MAPK (1: 1000)). After 3 consecutive
washes in IX TBST, the membranes were incubated in IX TBST with 5% milk in
presence of an anti-rabbit IgG bound to the horseradish peroxidase (1: 10000). SignaIs
were revealed using the ECL plus Western blotting detection reagent according to the
manufacturer's instructions (GE Healthcare, Baie d'Urf, Quebec). The appropriate
bands were quantified using the a-phospho-imager system (Molecular imager FX,
Biorad, Mississauga, Canada).
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47
2.4 Results
2.4.1 Roles ofT3 and insulin on FAS enzyrnatic activity, protein and
rnRNA levels.
Various swdies have already demonstrated that in liver T3 and insulin are able
to increase FAS enzymatic activity and mRNA expression (86, 88, 96). Incubation of
the human hepatocarcinoma cells (HepG2) with 10nM, 100nM or 1.6~M T3 for 24h
significantly increases the level of the FAS protein expression. Addition of 100nM
insulin leads also to a similar level of increase while combination of the two
hormones is synergistic (Fig. 2.1 A). Most of the subsequent experiments will be
perfonned using 1.6~M T3 and 100nM insulin. In CEH, insulin and T3 are able to
increase FAS enzymatic activity by about 3 fold (Fig. 2.1 B) and in presence of both
honnones, an important synergistic effect is also observed, increasing the activity by
14 fold. Similar honnonal effects are observed on mRNA expression level (2.5 fold
increase with T3 or insulin, and 10 fold with both hormones, Fig. 2.1 C). Taken
together, these results suggest that T3 and insulin regulate FAS expression through a
pre-translational mechanism.
2.4.2 Effects of insulin and T3 at the transcriptionallevel
In order to evaluate if the effects of T3 and insulin are the result of a
modulation of the FAS promoter's transcriptional activity, we c10ned the proximal
fragment (around 1.5kb upstream of the cap site, -1450 to +133bp) of the goose FAS
promoter upstream of the Chloramphenicol Acetyl Tranferase (29) reporter gene.
Subsequently, this DNA construct (TRE-TK-CAT) was transiently transfected into
HepG2 cells, and the CAT activity was evaluated in presence or not of the two
honnones. As depicted in Fig. 2.2A, having T3 in- the medium increases the
transcription of the FAS gene about 3 fold. This suggests that a T3 response element
(TRE) is 'present in the first 1450bp of the FAS promoter. By 5' seriaI deletions, we
localized the TRE between -902 and -577bp (data no! shawn). This sequence,
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containing the TRE, was then inserted upstream of the minimal promoter of
thymidine kinase and the CAT reporter gene, and transiently transfected into the
ceUs. When the cells were treated with T3, we observed about a 3 fold increase in
CAT activity. Comparing the goose FAS se