Università di Trieste e PadovaIngegneria Chimica

Ricerca di Dottorato Ricerca di Dottorato Maria Silvia PaneniMaria Silvia Paneni

XIX CicloXIX Ciclo

MOSE Molecular Simulation Engineering Laboratory - CASLAB Supervisore: Prof.ssa Sabrina Pricl

TesiTesi

Titolo:Titolo:

““Studio funzionale di proteine Studio funzionale di proteine coinvolte in patologie generali coinvolte in patologie generali

e virali con tecniche di e virali con tecniche di simulazione molecolare simulazione molecolare assistite al computer”assistite al computer”

Le ProteineLe Proteine

a) Il malfunzionamentoa) Il malfunzionamento

(uomo)(uomo)

b) La Buona attivitàb) La Buona attività

(Microrganismi:Virus Batteri, funghi)(Microrganismi:Virus Batteri, funghi)

Patologie Patologie

ApproccioApproccio

Interpretazione Termodinamica di:Interpretazione Termodinamica di:

a) Relazione Causa – Effetto del cattivo a) Relazione Causa – Effetto del cattivo funzionamento;funzionamento;

b)b) Legame Farmaco – Proteina:Legame Farmaco – Proteina:

_Wilde Type = Attività_Wilde Type = Attività

_Mutazione = Resistenza._Mutazione = Resistenza.

Determinare una “Chiave” Determinare una “Chiave”

ObbiettivoObbiettivo

Letteratura

Ing.Chimica

Informatica

Enti di ricercaScambi Culturali

Supporto della ricerca farmacologica

Fenomeni Chimico -Fisici

Modello Molecolare

Modello Clinico

RAZIONALE- COMPUTAZIONALERAZIONALE- COMPUTAZIONALEPer interpretare e prevederePer interpretare e prevedere

1. FHM - HCM1. FHM - HCM

1. Studio delle relazioni Studio delle relazioni genotipo-fenotipo delle genotipo-fenotipo delle

mutazioni della β-Miosina mutazioni della β-Miosina coinvolte in patologie come la coinvolte in patologie come la

cardiomiopatie ipertrofichecardiomiopatie ipertrofiche

1.1 Introduzione1.1 Introduzione

Obiettivo : Cercare un RAZIONALE tra il Modello Molecolare e quello Clinico

““II processi di rimodellamento possono essere meccanismi processi di rimodellamento possono essere meccanismi compensatori “(Cell vol 104, 557-567)”compensatori “(Cell vol 104, 557-567)”

““il cuore diventa più grande per compensare la riduzione della il cuore diventa più grande per compensare la riduzione della forza\potenzaforza\potenza “(Miller et al 2003) “(Miller et al 2003)

Cardiovascular Istitute,University of Colorado at Denver, CO USACardiovascular Istitute,University of Colorado at Denver, CO USA

Mutazioni della βMHCβMHC

(50% dei casi )

HCM: Eziologia oscura:

Ipertrofia, disordine dei miociti , aumento del tessuto connettivo

Beta-miosina + Actina = attività ATPasica driving-force (power – stroke) della

contrazione

1.2 Metodologia1.2 Metodologia

•Modellazione con omologia della 3D β-MHCModellazione con omologia della 3D β-MHC

•VALUTAZIONE del ΔΔGbindVALUTAZIONE del ΔΔGbind tra traCOMPLESSO COMPLESSO WT e MUTANTEWT e MUTANTE

ΔΔGbindΔΔGbind==ΔGbind(WT) - ΔGbind(MUT)ΔGbind(WT) - ΔGbind(MUT)

ΔGbind =ΔEMM +Δ Gsolv – TΔS metodo Molecular Mechanics/Poisson Boltzmann Surface Area (MM/PBSA-Kollman’90),utilizzando i

dati ricavati con dalla Dinamica Molecolare

ΔΔGbind<0 Complesso WT più Favorito del MutanteΔΔGbind<0 Complesso WT più Favorito del Mutante

1.3 Risultati / Conclusione 1.3 Risultati / Conclusione

Abbiamo ottenuto ΔΔGbind < 0ΔΔGbind < 0

Ecco il RAZIONALE :

Ridotta Driving Force

LOSS on FUNCTION

EFFETTO COMPENSATORE: SLITTAMENTO delle miofibrille EFFETTO COMPENSATORE: SLITTAMENTO delle miofibrille dal loro assetto naturale ed INGROSSAMENTO del tessuto dal loro assetto naturale ed INGROSSAMENTO del tessuto

miocardiaco MIOCARDIOPATIA IPERTROFICAmiocardiaco MIOCARDIOPATIA IPERTROFICA

Mut= Meno energia

1.4 Collaborazione1.4 Collaborazione

Molecular Genetics Laboratory of the University of the Colorado, Cardiovascular Istitute, Denver, CO USA;

2. Antivirali - HIV2. Antivirali - HIV

22. . Studio e sviluppo di principi attivi Studio e sviluppo di principi attivi anti – HIV: Resistenzaanti – HIV: Resistenza

a_Studio Farmacoforo della a_Studio Farmacoforo della resistenza dell’HIV a farmaci resistenza dell’HIV a farmaci inibitori della HIV- TIinibitori della HIV- TI

b_Studio della Resistenza dell’HIV-1 b_Studio della Resistenza dell’HIV-1 agli inibitori Non Nucleosidici della agli inibitori Non Nucleosidici della Transcrittasi InversaTranscrittasi Inversa

2. Introduzione2. Introduzione

21.8 milioni fino ad oggi i casi di decesso per AIDS nel mondo

I due siero tipi HIV1 e HIV-2 appartengono alla famiglia dei Retrovirus che è una sotto classe dei Lentivirus;

Approccio:

Valutare la Resistenza del HIV a inibitori della TIObiettivoObiettivo

TI

Mutazioni

Resistenza Resistenza = mutazioni per vincere il farmaco

Errore di trascrizione

Inibitori NNIs e NIs + =

Complesso Inattivo

2a. Metodologia2a. Metodologia

2a.Studio Farmacoforo2a.Studio Farmacoforo su Indolisu Indoli :

Abbiamo costruito un modello 3D di attività utilizzando un trend di composti con attività nota nel caso wt e K103N e Y181C. Abbiamo stimato l’attività dei nuovi composti “mappandoli “in tali modelli ( EC50 = concentrazione M del farmaco necessaria per bloccare l’attività del virus in cellula del 50%. )

Modello 3D per HIV-1 (es) monomutante-Ricavato da trend di composti con attività nota

Fucsia: Donatore legame idrogeno;HBDn

Verde: Accettore legame idrogeno ;HBAc

Light blue: Idrofobico aromatico;HyAr

2a. Risultati / Conclusione 2a. Risultati / Conclusione

•Concordanza dati sperimentali e stimatiConcordanza dati sperimentali e stimati

•Previsioni accettabili di attività; Previsioni accettabili di attività;

•Sono circa 2000 con ottime attività antivirali Sono circa 2000 con ottime attività antivirali oggetto di studio di Idenix-Novartis.oggetto di studio di Idenix-Novartis.

I modelli 3D ottenuti sono risultati adeguati I modelli 3D ottenuti sono risultati adeguati per affrontare questo caso di studio sulla per affrontare questo caso di studio sulla

ResistenzaResistenza

2b. Metodologia2b. Metodologia

2b.Studio con Modellazione 2b.Studio con Modellazione Molecolare della Molecolare della Resistenza Resistenza dell’HIV-1 agli inibitori Non dell’HIV-1 agli inibitori Non Nucleosidici della Transcrittasi Nucleosidici della Transcrittasi Inversa:Inversa:

Analisi della VaVa =variabilità dei residui nel sito allosterico di legame NNRTIs - HIV-RT derivata sulla base della sequenza di differenti specie. Le (SCR)s hanno caratteristiche funzionali. E valutare se

Residuo CCandidato a Resistenteandidato a Resistente

GV = ΔGAA * Va

ΔGAA contributo di energia libera di legame di un dato amminoacido derivante dalla dinamica molecolare

< - 0.35 ResistenteWang and Kollman,2001,parametro empirico

10xKi

2b. Risultati / Conclusione 2b. Risultati / Conclusione

•Perfetto accordo con i dati in Perfetto accordo con i dati in letteratura riguardo ai residui letteratura riguardo ai residui resistentiresistenti;

•Ottime previsioni su residui Ottime previsioni su residui resistenti. resistenti.

Per il 9-CL TIBO :Residuo Letteratura GV Y181 Y181C - 2.4 K103 K103N - 3.9

Per il 8-CL :Residuo Letteratura GV Y181 Y181C - 1.3 K103 - - 0.41

Valida metodologia di Valida metodologia di carattere predittivo sulla carattere predittivo sulla Resistenza dell’HIV ai Resistenza dell’HIV ai

farmaci , utile per il farmaci , utile per il design di miglioridesign di migliori

The winner isThe winner is

Il suddetto lavoro dal titolo “Prediction of HIV-1 Resistance to NNRTIs: a Computer-aided Molecular-based Rationale“ ,ed I relativi risultati sono stati presentati al “International Conference HIV DART 2004”, Montego Bay-Giamaica 11-19 dicembre 2004 ed è stato riconosciuto tra tutti quelli presenti come il migliore .

Collaborazione :Collaborazione :

Idenix - Novartis

Dipartimento di Scienze e Tecnologie Biomediche dell’Università di Cagliari

3. Antivirali - HCV3. Antivirali - HCV

3. Studio e sviluppo di principi 3. Studio e sviluppo di principi attivi anti HCVattivi anti HCV

a_Studio Farmacoforo di a_Studio Farmacoforo di Diketoacidi Inibitori della NS5BDiketoacidi Inibitori della NS5B

b_Studio di NI - Nucleosidi b_Studio di NI - Nucleosidi analoghi come inibitori dell’HCV analoghi come inibitori dell’HCV RNA dipendente RNA-polymeraseRNA dipendente RNA-polymerase

3. Introduzione3. Introduzione Il 3% della popolazione mondiale è cronicamente

Infetta. 85% Cronicizzazione

20% Cirrosi 75%Epatocarcinoma

ObiettivoObiettivo : : Valutazione dell’attività di Inibitori Non nucleosidici e Nucleosidici della NS5B – RNA dipendente – RNA Polymerase

Flaviviridae

Similarità Genomica (RNA+)

Hepacivirus(HCV)Pestivirus (BVDV)

Flavivirus (YFV) Dengue fever virus (DENV))

Bassa repilcabilità in vitro

Test in vitro su BVDV

Inibitori NNIs e NIs + =

Complesso InattivoNS5B

3a.Metodologia3a.Metodologia

3a.Studio Farmacoforo3a.Studio Farmacoforo su NNI - Diketo acidisu NNI - Diketo acidi derivatiderivati:

Abbiamo costruito un modello 3D di attività utilizzando un trend di 40 molecole con attività note .L’abbiamo testato su un 29 composti notiAbbiamo stimato le attività su nuovi DKAs derivati :

Modello 3D di Attività

Blue:Negativo ionizzabile; 1Neg I

Verde: Accettore legame idrogeno ; 2HBAc

Light blue: Idrofobico aromatico;HyAr

3a.Risultati / Conclusione3a.Risultati / Conclusione

N

In generale venivano mappati sempre 1HB Ac ( N, O ), Neg I ( al gruppo carbossile ) e 1HyAr ( Ring)

Per il 90% era mappato il secondo HB Ac

Per il 70% l’altro Hy Ar

Concordanza tra I dati sperimentali e stimati Concordanza tra I dati sperimentali e stimati ottime previsioni;ottime previsioni;

N 2

Activ:0.056 (M )

Estimate: 0.096 (M )N28

Activ:30 (M )

Estimate : 25 (M )

Il modello è risultato valido per la Il modello è risultato valido per la stima di nuovi Diketo acidi derivati stima di nuovi Diketo acidi derivati

inibitori della NS5B dell’HCVinibitori della NS5B dell’HCV

3a. Conclusione3a. Conclusione

I risultati di tale lavoro sono contenuti nel articolo dal titolo :“A simple but effective three-dimensional chemical feature-based pharmacophore model for diketo acid derivatives as hepatitis C virus RNA-dependent RNA-polymerase inhibitors “, Journal of Medicinal. Chemistry (2005) vol 48, pp.6304-6314

Collaborazioni: Collaborazioni:

“Istituto Pasteur-Fondazione Cenci Bolognetti"-Dipartimento di Studi Farmaceutici, Università di Roma

3b_Studio di NI - Nucleosidi analoghi come 3b_Studio di NI - Nucleosidi analoghi come inibitori dell’HCV RNA dipendente RNA-inibitori dell’HCV RNA dipendente RNA-polymerasepolymerase con la Modellazione Molecolare:con la Modellazione Molecolare:Note le attività e i siti allosterici 1 de Shire A, Shire B e Pfizer 1: a 35A dal sito attivo. Recentemente Recentemente scoperta l’esistenza di un sito allosterico 2 di legame superficiale specifico per rGTP, locato a 30 Ǻ dal sito catalitico, nella interfaccia dita- pollice

Alcuni HNIs AD1 e AD2Alcuni HNIs AD1 e AD2 , avevano mostrato un’attività confrontabile con quella della Ribavirina (unico NI in commercio)

Abbiamo modificato i gruppi funzionali e base azotata e valutato con la dinamica molecolare ΔGbind per ogni complesso doccato NS5B – HNI per il BVDV e HCV e calcolato le attività

ΔGbind = RTlnKdiss RTlnIC50

Base Azotata

1

2

NS5B

3b. Metodologia3b. Metodologia

IC50 : concentrazione M del farmaco necessaria per bloccare del 50% l’attività dell’enzima puro .

Kroeger Smith,2000;Wang et al. 2001

3b. Risultati3b. Risultati

HCV

BVDV

Procedura validataProcedura validata: testata per i tre inibitori conosciuti ShireA e ShireB e Pfizer 1:Concordanza con l’attività sperimentale e la struttura cristallografica note

Concordanza dati Concordanza dati sperimentale e calcolati;sperimentale e calcolati;Ottime previsioniOttime previsioni ;

La metodologia computazionale è risultata valida La metodologia computazionale è risultata valida per la verifica e predizione dell’attività di inibitori su per la verifica e predizione dell’attività di inibitori su

HCVHCV

I risultati di tale lavoro sono contenuti nel manoscritto, dal titolo:”Hindered Nucleoside analogs as inibitors of HCV RNA-dependent RNA-polymerase: evolving visitas” che è pubblicato in “Framing the knowledge of viral hepatitis”, edited by Rymond F.Schinasi, and E.R. Schiff, IHL Press Arlington MA,US, pp. 279-318 (2005) .

Collaborazioni :Collaborazioni :Dipartimento di Scienze Farmaceutiche - Università di Ferrara, Dipartimento di Scienze e Tecnologie Biomediche , Sezione di Microbiologia , Virologia Generale e Biotecnologie Microbiche e Laboratori Cooperativi Idenix - Università di Cagliari.

3b. Risultati / Conclusione 3b. Risultati / Conclusione

4. Antifungini – Antibatterici4. Antifungini – Antibatterici

4. Studio Sperimentale e 4. Studio Sperimentale e Computazionale Computazionale

dell’attività Antifungina dell’attività Antifungina e Antibatterica di nuovi e Antibatterica di nuovi

Imidazoli e Triazoli Imidazoli e Triazoli derivatiderivati

4.1 Introduzione 4.1 Introduzione

M.Tuberculosis M.Tuberculosis = Bacteria

Derivati AzoliciDerivati Azolici = Antifungini = Antifungini e Antibatterici (gram positivi)e Antibatterici (gram positivi)

Stesso meccanismo :Stesso meccanismo :Inibizione de lanosterolo C-14αdemetilasi, dipendente dal citocromo P450,

Eme – thiolata proteina

CandidaCandida = Funghi

Complex:P450 – Inibitore AzolicoComplex:P450 – Inibitore Azolico(struttura cristallografica)

ObiettivoObiettivo : Valutazione dell’attività di Nuovi Derivati AzoliciNuovi Derivati Azolici (imidazoli e triazoli)antifungini e anti batterici

4.2 4.2 MetodologiaMetodologia

4.2.1 La Chimica4.2.1 La Chimica :Sintesi e Test di Attività di Nuovi derivati Azolici (C.Albicans ,Glabrata M.Tuberculosis)

La parte aryl - azolyl – etano legata con legame azometino alla piridina -2- carboxamidrazone , una parte chimica che è strato dimostrato possedere un importante attività anti mycobacterica ; presso l’Istituto di Scienze Farmaceutiche di Trieste .

• La struttura del citocromo P450 -14 DM del M.Tuberculosis era disponibile presso il Protein data bank codice : 1E9X

• Costruzione del modello 3D per Candida AlbicansCostruzione del modello 3D per Candida Albicans .Alta conservazione della struttura delle omologhe P450s.Allineamento delle sequenze aminoacidiche del citocromo P450 della C. Albicans , C. Tropicalis , C. Glabrata , C. Krsuei e M. Tuberculosis.

4.2Metodologia4.2Metodologia

4.2.2 La Modellazione Molecolare:4.2.2 La Modellazione Molecolare:a) Homology Modeling:3DP450-Candida Albicansa) Homology Modeling:3DP450-Candida Albicans

Foglietti ElicheSCR

Homology modelingHomology modeling

Struttura 3D de citocromo P450 Candida Albicans

Centro attivo della catalisi : il nucleo di Fe- protoporphyrin ( eme)

b)Interazione Enzima - b)Interazione Enzima - FarmacoFarmacoModellazione dei nuovi composti Byopolimer Modulo di INSIGHTII

Docking del farmaco all’interno del sito attivo del P450

Calcolo dell’Energia di Legame: ΔGbind

ΔGbind =ΔEMM +Δ Gsolv – TΔS < 0

L’energia libera di legame ΔGbind di ciascun complesso farmaco – 14 DM in acqua è stato calcolato in accordo alla così chiamata procedura Molecular Mechanics/ Poisson –Boltzman

Surface Area (MM/PBSA) Kollman’90

4.3 .1Risultati - La Chimica4.3 .1Risultati - La Chimica

I nuovi Azoli hanno dimostrato attività antifungina e antibatterica. Analogia per I microrganismi – I composti 2b e 2c (quelli alogenati Br e Cl) con circa 1mg/l (Candida ) e 4mg/L ( Tuberculosis) sono risultati I

più attivi. I triazoli I meno attivi. Non additività per Il 2 – pyridinecarbox-amidrazone .

MIC =Conc.Minima Inibente (mg/L)-48h Candida-8g TBC

MIC MIC

MIC MIC

4.3 .2Risultati-ll 4.3 .2Risultati-ll ComputazionaleComputazionale

M.Tuberculosis2C

2L

•Concordanza Struttura Concordanza Struttura cristallografica con cristallografica con Configurazioni di Configurazioni di

equilibrioequilibrio dalla dimanica molecolare di composti doccati nel

sito attivo

4.3.2Risultati–Il 4.3.2Risultati–Il ComputazionaleComputazionale

C.Albicans2C

2L

•Concordanza Struttura Concordanza Struttura cristallografica con cristallografica con Configurazioni di Configurazioni di

equilibrioequilibrio dalla dimanica molecolare di composti doccati nel

sito attivo

M.Tuberculosis–(kcal/mol)

4.3.2Risultati–Il 4.3.2Risultati–Il ComputazionaleComputazionale

C.Albicans – (kcal/mol)

Concordanza fra dati calcolati e Concordanza fra dati calcolati e sperimentalisperimentali

4.4 Conclusione4.4 Conclusione

L’evidenza computazionale con i L’evidenza computazionale con i dati sperimentali è utile per il design dati sperimentali è utile per il design

di nuovi inibitori Azolicidi nuovi inibitori Azolici

I risultati di tale lavoro sono publicati nel seguente articolo : “Antifungal and antimycobacterial activity of new imidazole and triazole derivates. A combined and computational approach”.Journal of Antimicrobial Chemotherapy., July (2006); vol 58, pp. 76 – 84;

Collaborazioni:Collaborazioni:

Laboratorio di Microbiologia , Dipartimento di Scienze Laboratorio di Microbiologia , Dipartimento di Scienze Biomediche e Dipartimento di Scienze Farmaceutiche di Biomediche e Dipartimento di Scienze Farmaceutiche di TriesteTrieste

4.4 Conclusione4.4 Conclusione

E’Stata fornita

Una Chiave Razionale – Computazionale

Per interpretare e predire il funzionamento delle proteine coinvolte in patologie proteine coinvolte in patologie

generali e viraligenerali e virali. La modellistica molecolare integrata

all’analisi clinica è un valido strumento per la ricerca nel campo

medico-farmaceutico .

ConcludendoConcludendo

Goal:Goal:

RingraziamentRingraziamentii

Dott.ssa Mestroni L.

Prof.ssa Mamolo M.G.

Prof.ssa Banfi E.

Prof. Vio L.

Prof. La Colla P.

Prof. Di Santo R.

Prof. Manfredini S.

Idenix - Novartis

Staff del MOSE-CASLAB