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UNIVERSIDADE PRESBITERIANA MACKENZIE CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE

CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

GABRIELA MANZI MORAES

IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR BASEADA NO SEQUENCIAMENTO DE rDNA DE

FUNGOS ENDOFÍTICOS ASSOCIADOS À Pentacalia desiderabilis (VELL.) CUATREC.

(ASTERACEAE) PRESENTE EM CAMPOS DO JORDÃO (SÃO PAULO, BRASIL)

São Paulo

2017

GABRIELA MANZI MORAES

IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR BASEADA NO SEQUENCIAMENTO DE rDNA DE

FUNGOS ENDOFÍTICOS ASSOCIADOS À Pentacalia desiderabilis (VELL.) CUATREC.

(ASTERACEAE) PRESENTE EM CAMPOS DO JORDÃO (SÃO PAULO, BRASIL)

Trabalho de Conclusão de Curso

apresentado à Universidade Presbiteriana

Mackenzie como requisito à obtenção do

grau de Bacharelado em Ciências

Biológicas.

ORIENTADORA: Profa. Dra. Ana Paula Pimentel Costa

São Paulo

2017

AGRADECIMENTOS

Agradeço aos meus pais, Ednéia e Pedro, ao meu irmão e outros familiares por

todo suporte, carinho e alegria ao longo desta jornada. Pelos momentos que

demonstraram preocupação e interesse na área em que escolhi. Vocês são a minha

força.

Agradeço especialmente a minha querida orientadora, professora Ana Paula, por

toda a orientação, paciência, ensinamentos e oportunidades que me ofereceu durante a

faculdade, não consigo imaginar minha formação sem seu envolvimento. Agradeço

também por todos os momentos de risadas, histórias e desabafos. Obrigada pela

confiança.

Aos companheiros de laboratório Giovanna, Marina e Gustavo por toda a ajuda

que me deram neste projeto. Sentirei falta das risadas, desabafos, histórias e besteiras

que aconteceram. Obrigada por sempre alegrarem meus dias.

Aos colegas Anna, Camilla, Lucas e Luis pela ajuda neste trabalho. E, só para

ressaltar, fungos são lindos sim.

Aos meus amigos da faculdade e de fora da faculdade, não citarei nomes para

não correr o risco de esquecer alguém. Obrigada pelo suporte e por estarem sempre

presentes na minha vida. Não consigo imaginar como seriam meus dias sem vocês.

Aos professores Eder, Marcelo e Oriana que estiveram relacionados a este

trabalho, mesmo que de longe. Obrigada por tudo.

Aos professores da minha antiga escola e aos do Mackenzie. Vocês são os

principais componentes da base fundamental para a realização deste trabalho.

Obrigada por todos os ensinamentos.

À Universidade Presbiteriana Mackenzie por fornecer estrutura e oportunidades

para uma formação de qualidade.

Ao PIBIC Mackenzie, pelo apoio financeiro para a realização deste trabalho.

Aos técnicos de laboratório da Piauí. Obrigada pelos ensinamentos e pelas

risadas.

Aos estagiários por toda a ajuda na elaboração do projeto.

RESUMO

Fungos endofíticos são organismos simbiontes que vivem no interior de plantas,

localizando-se principalmente nos tecidos, folhas e flores da planta hospedeira sem

causar danos ao vegetal. Foram encontrados fungos endofíticos em todas as plantas

analisadas até hoje e são considerados uma possível fonte de compostos bioativos e

estruturas moleculares. Podem ser empregados como fontes de metabólitos primários e

secundários de interesse e também como vetores para inserção de genes úteis nas

plantas. Neste caso, podem ser empregados como agentes inibidores de pragas e

patógenos. Esses seres também podem ser manipulados para fornecer toxinas, fatores

de crescimento, antibióticos e outros produtos de interesse biotecnológico. Neste

trabalho, foi estudada a diversidade de fungos endofíticos associados às folhas do

vegetal Pentacalia desiderabilis (Asteraceae) presente em bordas da Floresta Ambrófila

Mista de áreas remanescentes do domínio Mata Atlântica no estado de São Paulo. Ao

todo, foram analisados 29 diferentes fungos isolados e todos foram identificados

através do sequenciamento das regiões ITS1 e ITS4 do rDNA. Os isolados obtidos

pertencem aos gêneros Diaporthe, Pestalotiopsis, Colletotrichum, Epicoccum,

Ophioceras, Phaeosphaeria, Paraphaeosphaeria. Todos os isolados pertencem ao Filo

Ascomycota. O gênero Diaporthe estava presente com maior frequência, sendo as

espécies Diaporthe phaseolorum e Diaporthe passiflorae as mais dominantes. Dentre

as espécies identificadas, algumas foram descritas por apresentarem interessantes

compostos bioativos. Em geral, os fungos obtidos neste estudo apresentam atividades

antifúngica, citotóxica, antibacteriana, anti-inflamatória, antioxidante e antitumorais. E.

nigrum, por exemplo, além de apresentar essas atividades, possui capacidade

antirretroviral, inibir protease e telomerase e é capaz de produzir um composto

fluorescente epicocconona e diversos pigmentos. Já C. gloeosporioides apresenta

também atividade antidepressiva. E Pestalotiopsis apresenta possível capacidade de

biodegradação. Os resultados obtidos indicam que P. desiderabilis possui uma

intrigante e única comunidade natural de fungos endofíticos que podem ser formadores

de compostos bioativos vantajosos à indústria, agricultura e medicina e também

produtores de compostos inéditos com diferenciadas utilidades.

Palavras-chave: Fungo endofítico. Pentacalia desiderabilis. Asteracea. Biologia

molecular. Sequenciamento genético. Ascomycota.

ABSTRACT

Endophytic fungi are symbiotic organisms that live inside plants, being located mainly in

the tissues, leaves and flowers of the host plant without causing damage to the

vegetable. Endophytic fungi were found in all plants analyzed to date and are

considered a source of bioactive compounds and molecular structures. They can be

used as sources of primary and secondary metabolites of interest and also as vectors

for insertion of genes useful in plants. In this case, they may be employed as pest and

pathogen inhibiting agents. These organisms can also be manipulated to provide toxins,

growth factors, antibiotics and other products of biotechnological interest. In the present

work, was investigated the diversity of endophytic fungi associated with the leafs of the

specie Pentacalia desiderabilis (Asteraceae) present in Mixed Ombrophilous forest

edges of remnant areas of the Atlantic Forest domain in São Paulo. In all, 29 different

fungis isolates were analyzed and all were identified through the sequencing of the ITS1

and ITS4 regions of rDNA. The isolates obtained belong to the genus Diaporthe,

Pestalotiopsis, Colletotrichum, Epicoccum, Ophioceras, Phaeosphaeria,

Paraphaeosphaeria. All fungi sequenced belong to the division Ascomycota. The genus

Diaporthe was present more frequently, being the species Diaporthe phaseolorum and

Diaporthe passiflorae the most dominant. Among the species identified, some were

described as interesting bioactive compounds. In general, the fungi obtained in this

study present antifungal, cytotoxic, antibacterial, anti-inflammatory, antioxidant and

antitumoral activities. E. nigrum, for example, besides presenting these activities, has

antiretroviral capacity, inhibits protease and telomerase and can produces a

fluorescence epicoconone compound and several pigments. C. gloeosporioides also has

antidepressant activity. And Pestalotiopsis presents a possible biodegradation activity.

The results indicate that P. desiderabilis has an intriguing and unique natural community

of endophytic fungi that can be useful bioactive compounders for industry, agriculture

and medicine and also producers of unpublished compounds with different utilities.

Keywords: Endophytic fungi. Pentacalia desiderabilis. Asteracea. Molecular biology.

Genetic sequencing. Ascomycota.

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

BD líquido Batata Dextrose Broth

BDA Batata Dextrose Ágar

BLAST Basic Local Alignmente Search Tool

BLASTn Nucleotide BLAST

CTAB Brometo de cetil trimetilamonio

DNA Ácido desoxirribonucleico

EDTA Ácido etilenodiamino terra-acético

g Força g – força gravitacional

HCl Ácido clorídrico

ITS Internal transcribed spacer

ng Nanograma

M Molar

mg Miligrama

MgCl2 Cloreto de magnésio

mL Mililitro

pb Pares de bases

PCR Reação em cadeia da polimerase

pm Picomol

rDNA Ácido desoxirribonucleico ribossomal

RNA Ácido ribonucleico

SDS Sódio dodecil sulfato

Tris-HCl Trishidroximetilaminometano

μl Microlitro

% Porcentagem

ºC Graus Celsius

λ Lambda

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 9

2. MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................... 14

2.1 CULTIVO DOS FUNGOS ........................................................................................ 14

2.2 EXTRAÇÃO DO DNA.............................................................................................. 15

2.3 REAÇÃO DE PCR .................................................................................................. 16

2.4 PURIFICAÇÃO, QUANTIFICAÇÃO E SEQUENCIAMENTO DAS SEQUÊNCIAS DE

DNA .............................................................................................................................. 17

2.5 ANÁLISE DAS SEQUÊNCIAS DE DNA .................................................................. 17

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................ 20

4. CONCLUSÃO/CONSIDERAÇÕES FINAIS .............................................................. 41

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................. 43

9

1. INTRODUÇÃO

Microrganismos endofíticos são organismos que habitam o interior de plantas,

encontrando-se principalmente nos tecidos, folhas e flores do vegetal, sem prejudicar

seu hospedeiro. Esses seres vivos podem ser tanto fungos como bactérias e insetos

(FELBER; PAMPHILE, 2013). Os endófitos são surpreendentemente úteis na

agricultura e na indústria, especialmente na alimentícia e farmacêutica. Podem ser

aplicados como fontes de metabólitos primários e secundários de interesse e também

como vetores para inserção de genes de interesse nas plantas, podendo ser

empregados como agentes inibidores de pragas e patógenos (SOUZA et al., 2004).

Como resultado, a possibilidade de descobrir novos microrganismos e estes serem

formadores de compostos bioativos vantajosos à indústria, agricultura e medicina vem

aumentando a quantidade de pesquisas sobre microrganismos endofíticos.

Os fungos são os principais decompositores da biosfera e atualmente estão

separados em seis grupos do Reino Fungi: Microsporidia, Quitrídios, Zigomicetos,

Glomeromycota, Ascomycota e Basidiomycota (RAVEN; EVERT; EICHHORN, 2014).

Fungos endofíticos já foram avistados em todas as plantas até agora estudadas,

podem ser fontes de inovadores compostos bioativos e estruturas moleculares, assim

como são muito numerosos em vegetais de regiões tropicais e subtropicais. Estão

distribuídos em vários grupos do Reino Fungi (ARAÚJO et al., 2010).

Os fungos endofíticos introduzem-se na planta pelas raízes, por aberturas

naturais como hidatódios e estômatos, por injurias de parasitas ou colheita de frutos

(AZEVEDO, 1998). Um mesmo fungo pode habitar diversas plantas, uma vez que seus

esporos podem ser conduzidos pelo vento ou por insetos de um vegetal para outro,

porém são capazes de interagir de específicas maneiras com cada hospedeiro

(FELBER; PAMPHILE, 2013). Segundo Chapla, Biasetto e Araújo (2012), nessa íntima

relação mutualística, os fungos conseguem proteção e nutrientes e minerais da planta,

ao mesmo tempo que promovem uma maior resistência, principalmente a fatores

bióticos e abióticos que podem danificar o vegetal. De acordo com Lucero et al. (2006),

a manifestação de tais resistências se deve a habilidade dos endofíticos de conseguir

modificar a genética, fisiologia e ecologia da planta. Consequentemente, apresentam

10

uma função crucial na mediação das interações planta-herbívoros, planta-patógenos e

planta-ambiente (OKI et al., 2009). Há diversos relatos de fungos micorrízicos que

apresentam relação íntima através de simbiose com diversos vegetais e também

possuem estas habilidades descritas acima (FOLLI-PEREIRA et al., 2012).

A diversidade dos endofíticos pode particularizar-se de acordo com o hospedeiro,

distribuição geográfica, idade da planta e condições em relação à sazonalidade e

ecologia da região onde ambos habitam, compreendendo também a altitude e a taxa de

precipitação do local. No vegetal, uma ou duas espécies de fungos endofíticos podem

ser dominantes em um único hospedeiro específico, enquanto os demais são

encontrados em menor quantidade (AZEVEDO, 1998; PIMENTEL et al., 2010).

Segundo Azevedo (1998), os fungos são formadores de substâncias

secundárias, sendo que algumas delas podem ser empregadas como inibidores de

herbívoros e de demais agentes causadores de injúrias. Esses seres também podem

ser manipulados para fornecer toxinas, fatores de crescimento, antibióticos e outros

fármacos e variados produtos de interesse biotecnológico. Atualmente, em torno de um

quarto de todos os produtos naturais biologicamente ativos, são fabricados a partir de

fungos (SILVA et al., 2010).

Os fungos endofíticos também podem ser importantes na produção de fármacos

anticancerígenos, uma vez que 48,6% desses medicamentos são adquiridos através de

produtos naturais desses fungos. Em outras pesquisas, concluíram-se que podem ter

propriedades antidiabéticas, imunossupressoras, citotóxicas e antivirais (CHAPLA;

BIASETTO; ARAÚJO, 2012). Segundo Araújo et al. (2010), esses fungos podem

fornecer compostos medicinais e, a partir de transferência horizontal de genes, tornar

plantas normais em plantas medicinais. São capazes também de reduzir o efeito de

poluentes ao degradar produtos tóxicos auxiliando na conservação do meio ambiente.

Considerando a vasta diversidade e abundância de espécies que constituem a

flora mundial, sabe-se que os vegetais de variados nichos ecológicos, em particular

aqueles que possuem plantas com morfologia atípica ou estratégias incomuns para sua

sobrevivência, são mais propícias para o estudo de seus endofíticos (KUSARI;

SPITELLER, 2011).

11

Estimativas indicam que há em torno de 1,5 milhão de espécies de fungos em

geral no planeta, porém apenas 100.000 destas espécies já foram identificadas

(RAVEN; EVERT; EICHHORN, 2014). Entretanto, em estudo mais recente, não foi

possível sua obtenção, revelam que este número se encontra desatualizado e que há

em torno de 5 milhões de fungos. O estudo da biologia endofítica de específicas plantas

foi pouco realizado até hoje. As chances de identificar novos microorganismos são altas

ao isolar e caracterizar estes indivíduos de plantas de variados ecossistemas,

especialmente de regiões áridas e tropicais, uma vez que são ambientes com maior

quantidade de interações entre seres vivos (CHAPLA; BIASETTO; ARAÚJO, 2012).

Deste modo, as asteráceas são vegetais que apresentam adaptações

morfológicas e fisiológicas que garantem sua sobrevivência e sucesso evolucionário.

Essas plantas possuem a capacidade de se apresentar em todos os habitats terrestres,

com exceção da Antártida (FUNK et al., 2009). A família Asteraceae pertence à ordem

Asterales, sendo esta a que representa um dos mais fundamentais grupos taxonômicos

de Eudicotiledôneas.

Uma espécie da família Asteraceae de clima tropical e que é colonizada por

fungos endofíticos é a Pentacalia desiderabilis (Vell.) Cuatrec. Se apresenta como um

arbusto com flores do raio amarelas e exclusivo de fragmentos restantes da Mata

Atlântica em estados brasileiros da região sul, sudeste e nordeste do país. Apresenta-

se em altitudes que variam de 400 a 2220 metros (TELES, 2008). De acordo com Teles

e Stehmann (2011), P. desiderabilis é uma das únicas espécies nativas do Brasil com

crescimento escandente da tribo Senecioneae, tornando-se facilmente reconhecida por

essa peculiaridade. Pode ser encontrada com flores e frutos nos meses de agosto e

setembro.

Um estudo iniciado anteriormente por Pena e colaboradores (comunicação

pessoal, 2012), tinha por objetivo a obtenção e seleção de extratos brutos provindos de

fungos endofíticos associados à espécie Pentacalia desiderabilis (Vell.) Cuatrec.

(Asteraceae). Este vegetal foi coletado em bordas da Floresta Ombrófila Mista de áreas

remanescentes do domínio Mata Atlântica no bairro de Umuarama em Campos do

Jordão, sendo um local com elevada taxa de umidade, baixas temperaturas e alta

12

altitude. Pena e colaboradores obtiveram 77 isolados de fungos endofíticos. Tais

isolados foram reunidos em 24 morfotipos, em base em suas velocidades de

crescimento (rápido, intermediário e lento) e seus aspectos (coloração do fungo e do

meio de cultura e textura do fungo) na cultura.

Este estudo foi iniciado com o isolamento destes microrganismos endofíticos

associados à Pentacalia desiderabilis, contudo é primordial o entendimento da

diversidade desta comunidade para a prospecção e realização de ensaios tendo em

vista avaliar o seu potencial na formação de compostos bioativos. A interação planta-

endofítico é de alta complexibilidade, sendo assim, a conhecimento desses padrões de

colonização apresenta-se como um fundamental modo de análise do desenvolvimento

da planta hospedeira e interfere nos compostos bioativos produzidos. Para tanto, é

essencial identificar quais são os fungos endofíticos associados à folhas de Pentacalia

desiderabilis e quantas destas espécies são dominantes nesta planta.

Na sistemática microbiana, antigamente, para realizar a identificação de algum

fungo filamentoso, tradicionalmente eram utilizadas apenas características

morfológicas, microscópicas e macroscópicas. Porém, esta metodologia nem sempre

origina dados e resultados precisos, podendo dar um falso diagnóstico e também

demanda de muito tempo e esforço. Por isso, métodos baseados na biologia molecular

estão sendo cada vez mais empregados devido sua praticidade, rapidez e alta precisão

nos resultados utilizando-se pequena quantidade de DNA, resultando na possível

identificação de espécimes em diferentes amostras ambientais e sem a necessidade de

cultivar os organismos estudados (WACULICZ-ANDRADE, 2009).

Hoje em dia, para investigar a variabilidade genética dos fungos, usa-se a

técnica de amplificação por PCR de fragmentos do DNA ribossômico (rDNA). Essa

região se encontra em locais específicos do genoma e possui a função de codificar

diferentes moléculas de RNA ribossomal. Se apresenta como um cluster gênico, que

possui o gene 18S, o gene 5,8S e o gene 28S, que não apresentam variações em sua

sequência uma vez que são intensamente conservadas por evoluir lentamente durante

as gerações (ARRUDA et al., 2003; WACULICZ-ANDRADE, 2009).

13

Dentre esses genes há regiões denominadas de regiões espaçadoras internas

(ITS), como a ITS1 e a ITS4, que apresentam alto polimorfismo por evoluir rapidamente

e, por isso, apresentam grande interesse para estudos a níveis de gênero, espécie e

populações (FUNGARO, 2000; WACULICZ-ANDRADE, 2009). O resultado final é

verificado com uma base de dados com sequências de DNA já anteriormente

identificadas. Esses marcadores possuem a capacidade de investigar o genoma não

importando o estado fisiológico dos microrganismos estudados ou o estágio de

desenvolvimento de seus tecidos e podem distinguir espécies muito parecidas (COSTA-

NETO, 2002; THOMPSON; OLIVEIRA, 2005; BRASIL, 2011).

Dentro deste contexto, o objetivo desse projeto foi analisar a diversidade dos

fungos endofíticos associada à espécie Pentacalia desiderabilis (Asteraceae) presente

em áreas de Floresta Ombrófila Mista no município de Campos do Jordão (São Paulo,

Brasil) em áreas remanescentes do domínio Mata Atlântica. Por meio da caracterização

molecular dos 77 isolados endófitos anteriormente obtidos, espera-se obter o máximo

de informações sobre cada isolado, determinando o gênero e espécie de cada isolado.

Estes dados serão importantes subsídios para a caracterização desta comunidade e a

realização de ensaios para avaliar o seu potencial na produção de compostos bioativos,

bem como para a formação de recursos humanos especializados.

14

2. MATERIAL E MÉTODOS

A espécie Pentacalia desiderabilis (Vell.) Cuatrec. (Asteraceae) foi coletada no

condomínio Umuarama, região à qual pertence à Universidade Presbiteriana

Mackenzie, encontrando-se a cerca de 1700 metros de altitude na Serra da

Mantiqueira, com as coordenadas 22 46’24”S e 45 33’45”W, no município de Campos

do Jordão, que se encontra localizados cerca de 170 quilômetros da capital paulista, na

região leste do Estado de São Paulo. A identificação da espécie foi realizada pela Profª.

Drª. Oriana Aparecida Fávero Profª. Drª. Fátima Maria Motter Magri e sua exsicata foi

depositada no Herbário Dom Bento José Pickel do Instituto Florestal SPSP 37596.

Para a realização do isolamento dos fungos endofíticos do espécime coletado,

foram aplicadas nas folhas de P. desiderabilis as metodologias empregadas por Maier

et al. (1997) e Souza et al. (2004), utilizando técnicas de desinfecção para total

remoção de fungos que não são endofíticos. Para o isolamento, o crescimento dos

microoganismos foi monitorado e repiques sucessivos foram realizados até a obtenção

de isolados totalmente puros. Posteriormente, foram preservados em “slants” (tubo de

ensaio contendo meio BDA inclinado) e água estéril.

2.1 CULTIVO DOS FUNGOS

Os fungos previamente isolados foram repicados e cultivados em meio Batata

Dextrose Ágar (BDA – Difco) em placa de Petri de 9 cm de diâmetro, em estufa a 25 ºC,

por 10 a 20 dias, dependendo da velocidade de crescimento do fungo. Em seguida,

foram analisados quanto sua morfologia, coloração e velocidade de crescimento, sendo

que os dados obtidos foram anotados em caderno adequado armazenado no próprio

laboratório. Após, foram realizadas suspensões micelianas em 5mL de meio Batata

Dextrose Broth (BD – Difco) líquido em tubos tipo falcon de 15mL, a partir de pequenos

repiques obtidos das culturas em placa. O material foi incubado em estufa a 25ºC por

15 dias completamente vedado com papel alumínio para impedir a entrada de luz.

15

2.2 EXTRAÇÃO DO DNA

A extração de DNA foi realizada conforme método descrito por Rodrigues (2010).

Após o crescimento do fungo, o micélio foi filtrado em papel filtro, lavado com água

purificada e seco em papel toalha para retirada do excesso de meio de cultura líquido e

submetido ao protocolo de extração. Para tal, foi necessário a remoção da parte antiga

do repique utilizada para crescimento em meio líquido com o auxílio de uma lâmina de

bisturi. O material restante foi armazenado em microtubos e acrescidos de 400 μl de

tampão de lise (Tris-HCL 0,05M; EDTA 0,005M; NaCl 0,1M; SDS 1%). Em seguida,

foram incubados por 15 minutos em congelador a -20ºC, ou até seu conteúdo congelar

totalmente.

Após o congelamento do material, ocorreu a trituração do micélio congelado com

o auxílio de um pistilo até provocar a homogeneização total do conteúdo. Em seguida,

foram adicionados 5 μl de Proteinase K (50 μg/mL), seguida de homogeneização total

da amostra e incubação a 60ºC por 30 minutos em banho-maria. Posteriormente, foram

acrescidos 162 μl de CTAB de Hoog (Tris 2M; NaCl 8,2%; EDTA 2M; CTAB 0,2%),

seguido novamente de homogeneização e incubação a 65ºC por 10 minutos

(RODRIGUES, 2010).

Após a incubação, foram adicionados 570 μl de clorofórmio/álcool isoamílico

(24:1), misturado por inversão até homogeneização total do conteúdo e,

posteriormente, incubado por 30 minutos em gelo. Em seguida, a amostra foi

centrifugada a 15.929 x g por 15 minutos. Nessa etapa, foi possível observar a fase

aquosa (superior) e esta foi transferida para um novo microtubo. Posteriormente, foi

adicionado 10% do volume de acetato de sódio 3M. Em seguida, o tubo foi invertido até

ocorrer a homogeneização completa e incubado a 0ºC por 30 minutos. Após a

incubação, a amostra foi centrifugada a 15.929 x g por 15 minutos (RODRIGUES,

2010).

O sobrenadante resultante da centrifugação foi transferido para um novo

microtubo e, em seguida, adicionado 50% do volume obtido de isopropanol. O tubo foi

ser invertido repetidamente. Após, ocorreu a centrifugação a 15.929 x g por 10 minutos.

Nessa etapa, o sobrenadante foi desprezado e, em seguida, foi adicionado 200 μl de

16

etanol 70% a 4ºC, promovendo uma gentil suspenção do material precipitado com o

auxílio de uma pipeta para não danificar o DNA. Após essa etapa, a amostra foi

centrifugada por 15929 x g por 5 minutos. Em seguida, a etapa na qual ocorreu a

adição de etanol 70% foi repetida mais uma vez para melhores resultados. Após a

centrifugação, o sobrenadante foi desprezado e a amostra permaneceu aberta para

ocorrer a evaporação total do etanol por cerca de 1 hora. Por fim, foi acrescido 100μl de

Tris-EDTA (Tris-HCl 0,01 M; EDTA 0,001M) na amostra (RODRIGUES, 2010).

Conforme necessário, as amostras foram congeladas (-20 ºC) até a sua utilização.

As amostras de DNA obtidas foram submetidas a eletroforese em gel de agarose

0,8% para quantificação, utilizando marcadores de concentração (λ DNA, Invitrogen).

2.3 REAÇÃO DE PCR

As amostras de DNA genômico foram submetidas a técnica de PCR para a

amplificação do rDNA. Os oligonucleotídeos iniciadores aplicados foram o ITS1 (5'

TTCCGTAGGTGAACCTGCGG 3') e ITS4 (5' TCCTCCGCTTATTGATATGC 3') para

estudo da região ITS conforme descrito por Rodrigues (2010), com algumas

modificações.

Cada reação de PCR apresentou um volume final de 50 μl contendo de 5-10ng

DNA; 10 μl de tampão de PCR 5x; 2,5 μl de primer ITS-1 (5’

TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3’) a 100 pm; 2,5 μl de primer ITS-4 (5’

TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’) a 100 pm; 2 μl de dNTPs a 10 pm; 7 μl de MgCl₂ 25

mM; 1 μl de enzima Taq Polimerase. As condições da PCR foram: desnaturação por 5

minutos a 94ºC, seguido de 24 ciclos (desnaturação a 94ºC por 1 minuto, anelamento a

55ºC durante 1 minuto e elongação a 72ºC por 1 minuto) e extensão final de 72 °C

durante 5 minutos (RODRIGUES, 2010). Conforme necessário, as amostras foram

congeladas (-20 ºC) até a sua utilização.

Os produtos de PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose 1,2%,

sendo utilizado marcador de concentração (1 kp DNA ladder Biolabs).

17

2.4 PURIFICAÇÃO, QUANTIFICAÇÃO E SEQUENCIAMENTO DAS SEQUÊNCIAS DE

DNA

O produto de reação da PCR foi submetido à purificação através do kit Invisorb®

Fragment CleanUp da Invitek, seguindo as instruções fornecidas pelo fabricante. Para a

confirmação do material, as amostras foram submetidas à eletroforese com gel 1,2% de

agarose.

Em seguida, as amostras foram quantificadas. Para tal, foi utilizado o aparelho

Quantus™ Fluorometer da Promega, seguindo o protocolo manual para QuantiFluor®

dsDNA System fornecido pelo fabricante. Os dados obtidos foram alojados em forma de

tabela para uso posterior.

Para a realização do sequenciamento das amostras, as amostras foram enviadas

para a empresa Helixxa Pesquisa (Campinas, SP), onde foi utilizada a plataforma

Applied Biosystems® 3500 Genetic Analyzer, sendo também enviados os dados de

quantificação de cada amostra.

2.5 ANÁLISE DAS SEQUÊNCIAS DE DNA

Depois de realizado o sequenciamento, as sequências obtidas se encontraram

em arquivos com formato “Arquivo AB1”, sendo um arquivo para a sequência forward

(sentido 3’ para 5’) e um outro arquivo para a sequência reverse (5’ para 3’) para uma

mesma amostra de DNA. Essas sequências foram visualizadas com o programa BioEdit

(Biological sequence alignment editor – versão 7.2.5).

Posteriormente, ambos os arquivos de cada amostra de DNA foram alinhados

para a obtenção de um contig, que é a junção de segmentos de DNA sobrepostos que,

em conjunto, representam uma região consensual de DNA. Para tal, os arquivos foram

convertidos em formato “.zip” e encaminhados para o programa Electropherogram

quality analysis (http://asparagin.cenargen.embrapa.br/phph/) desenvolvido pela

Embrapa: Genetic Resources and Biotechnology. Em seguida, foi obtida a tabela de

qualidade das amostras.

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A tabela informa o número total de bases, quantidade de bases com qualidade

superior a 20%, quantidade de bases com qualidade superior a 30% e se a sequência

apresentou mais de 100 bases com qualidade superior a 20% da sequência forward e

da sequência reverse. As sequências que apresentaram o último item como “Ok” foram

analisadas posteriormente e as que obtiveram “No” foram descartadas devido uma má

qualidade de uma ou ambas as sequências.

Em seguida, ambas as sequências com boa qualidade foram selecionadas em

“Read number” e foi selecionada a opção “cluster sequences using CAP3 for checked

reads” na parte inferior da tabela. Quando necessário, esse último passo foi refeito até

o surgimento da opção “contig list” na nova página carregada. Por fim, nessa opção foi

obtido o contig, que foi armazenado em arquivo word para posterior análise.

Para a identificação dos isolados, os contigs foram depositados separadamente

no banco de dados NCBI (National Center for Biotechnology Information

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), utilizando o programa BLAST Nucleotide (Basic Local

Alignment Search Tool Nucleotide) desenvolvido pela National Center for

Biothecnology. O contig foi armazenado em “Enter accession number(s), gi(s), or

FASTA sequence(s)” e, em seguida, foi selecionada a opção “BLAST” em azul no final

da página.

Posteriormente, o site demonstrou a distribuição dos 100 melhores BLASTs de

100 sequências armazenadas no site e sequências que produziram alinhamentos

significativos. Neste último, foi dado a descrição e o nome da sequência armazenada,

sendo o começo do nome, na maioria das vezes, o nome científico do organismo

estudado, juntamente com seu max score, total score, query cover, e-value, identidade

e accession (Query ID). São fundamentais para este estudo o max score, e-value e

identidade. Esses três foram armazenados em forma de tabela.

Em caso de obtenção de duas ou mais sequências com nomes diferentes, mas

com max score e identidade muito parecidas, foi realizada uma comparação com a

morfologia obtida com a literatura para poder diferenciar essas sequências e para uma

melhor identificação dos isolados. Posteriormente, os nomes que possuíam altas

diferenças morfológicas foram descartados.

19

Após obtenção do nome científico ou gênero de cada fungo, a literatura foi

consultada para descobrir qual nicho o isolado estudado pertence e informações gerais

e específicas dos mesmos.

20

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Dos 77 fungos inicialmente isolados, 51 apresentaram significativo crescimento e

estavam sem contaminação. Em todos estes, foi realizada a extração de DNA. Na figura

1 observa-se os resultados obtidos com a eletroforese em gel de agarose de amostras

de DNA extraídas dos isolados.

Figura 1 - Eletroforese em gel de agarose 0,8% da extração de DNA obtida de 4 diferentes isolados de fungos presentes em P. desiderabilis. Kb: tamanhos das bases do marcador utilizado. M: marcador λ

HindIII DNA da BioLabs®, onde não foi possível a visualização das bandas de tamanho 564 pb e 125 pb; 1 a 4: DNA de fungos com cerca de 9416 pb. Amostra 3 com pequeno rastro, mas com a presença de grande quantidade de RNA na parte inferior da figura. Amostra 4 com rastro significativo e pouco RNA.

Com a utilização de eletroforese em gel de agarose para verificar as amostras,

foi possível estimar a concentração de DNA obtido na extração de DNA de cada

isolado. De acordo com o manual do marcador, a banda de tamanho de 2027 pb possui

concentração de 20,9 ng/μl e a banda 4361 pb possui 45 ng/μl. Em vista disso, as

amostras foram comparadas com o marcador para se obter uma estimativa da

concentração de DNA das amostras.

Para a realização da técnica de PCR, é preciso de no mínimo 20 ng/μl de DNA e

no máximo 100 ng/μl. Entretanto, nem todas as amostras possuíram essa

concentração. Porém, sabe-se que mesmo com uma baixa concentração de DNA é

21

possível realizar a reação de amplificação, visto que esta técnica vai promover a

multiplicação do DNA, aumentando milhões de vezes o DNA inicial.

Também foi possível avaliar a qualidade do DNA obtido através da eletroforese.

Algumas amostras possuíram um rastro na banda de 9416 pb e este rastro pode

prejudicar na amplificação da região a ser estudada, uma vez que sinaliza degradação

do DNA. Porém, em alguns casos, a degradação ocorrida pode não ter afetado a região

a ser estudada, não interferindo, assim, na amplificação por PCR. Também foi visto que

grande parte das amostras demonstraram conter RNA. A presença do RNA não

interfere na amplificação, uma vez que o RNA é uma molécula estável e os primers vão

apenas se alinhar à molécula de DNA.

Para a extração de DNA, diversos autores, como Carvalho-Filho (2013) e

Barichello et al. (2010), descrevem a utilização do nitrogênio líquido na extração de

DNA como sendo o método mais apropriado, porém mesmo sem sua utilização, a

extração empregada neste estudo se mostrou efetiva e de baixo custo.

Também foi realizada a amplificação por PCR das 51 amostras de DNA

extraídas. Todas as amostras apresentaram uma banda de 500 pares de base, assim

como descrito por Araújo et al. (2010). Algumas destas amostras estão representadas

na figura 2. De acordo com o manual do marcador 1kp DNA ladder Biolabs® utilizado, a

banda de 3000 pb apresenta 125 ng/μl de concentração. Com isso, pode-se estimar

que todas as amostras obtiveram uma concentração superior de 125 ng/μl.

A figura 2 exemplifica os produtos de amplificação por PCR de 4 diferentes

isolados em gel de agarose 1,2%. Percebe-se que as amostras apresentaram um rastro

entre as bandas de 1000 pb e 500 pb que pode interferir no sequenciamento. Já na

região inferior da figura, há a presença de excessos de primers, DNA e reagentes que

também podem causar interferência.

22

Figura 2 - Eletroforese em gel de agarose 1,2% dos produtos de amplificação por PCR obtidos de 4 diferentes isolados presentes em P. desiderabilis utilizando os primers ITS 1 e ITS 4. Kb: tamanhos dos pares de bases do marcador utilizado. M: marcador 1 kp DNA ladder (Biolabs®); 1 a 4: produto de PCR de diferentes isolados apresentando banda de 500 pb com alta concentração; CN: controle negativo da

reação de PCR apresentando apenas excesso de componentes da reação, sem nenhuma banda aparente, demostrando que não houve contaminação na reação. Região inferior da foto demonstrando

excesso de primers, DNA e outros componentes da reação.

Todas as amostras foram purificadas para evitar problemas no sequenciamento.

A purificação se mostrou eficiente para a remoção tanto dos rastros e da banda de

1000 pb, quanto de excessos de primers, DNA e outros componentes da reação de

PCR. Como mostrado na figura 3, mesmo após a purificação, as amostras continuaram

apresentando mais de 125 ng/μl de concentração.

Figura 3 - Eletroforese em gel de agarose 1,2% dos produtos de amplificação purificados de 4 diferentes isolados fúngicos de Pentacalia desiderabilis. Kb: tamanhos dos pares de bases do marcador utilizado. M: marcador 1 kp DNA ladder (Biolabs®); 1 a 4: produto de PCR de diferentes isolados apresentando

banda de 500 pb com alta concentração. Todas amostras demonstraram possuir apenas a banda de 500 pb, sem rastros.

23

A quantificação foi realizada em todas as amostras e foi concluído que

possuíram cerca de 72 e 194 ng/μl de concentração, com uma média de 139 ng/μl. Tal

fato, confirma a concentração estimada com o uso do marcador. Posteriormente, todas

as amostras foram enviadas para sequenciamento.

Foram sequenciados 51 diferentes produtos de amplificação, cada um

correspondente a região ITS1 e ITS4 do rDNA de diferentes isolados. O resultado

obtido de cada isolado foi analisado com o programa Electropherogram quality analysis.

Este programa é a interface de um programa phrap que permite a montagem de

contigs, gera informações sobre eles, permite a manipulação de diversas sequências ao

mesmo tempo, dentre outras funções (FORMIGUIERI, 2004). As amostras que foram

avaliadas como “Ok” pelo programa apresentaram uma quantidade superior de 100

pares de bases com qualidade acima de 20% do total da sequência (Tabela 1). A

amostra exemplificada na Tabela 1 apresentou 1025 bases ao todo com qualidade

acima de 20, indicando que 89% da sequência apresentou boa qualidade

Já as avaliadas como “No” não cumpriram essas características e, por isso,

foram descartadas (Tabela 2). A amostra exemplificada na Tabela 2 apresentou 149

bases ao todo com qualidade acima de 20, indicando que somente 11% das

sequências se demonstrou com boa qualidade. De todas as amostras sequenciadas,

foram obtidas 29 sequências de boa qualidade, segundo análise realizada com o

programa.

Em alguns casos, pode-se obter uma sequência foward definida como “Ok”,

porém uma sequência reverse definida como “No”, ou vice-versa. Nestes casos, a

obtenção de uma sequência “No” acaba desqualificando a outra sequência, uma vez

que é necessário de ambas para formar o contig (Tabela 3). A amostra exemplificada

na Tabela 3 apresentou 365 bases ao todo com qualidade acima de 20, indicando que

24% das sequências se demonstrou com boa qualidade. A sequência foward se

demonstrou como “Ok” por possuir 291 bases com qualidade acima de 20, porém a

reverse se demonstrou como “No” por possuir 74 bases com qualidade acima de 20

Em outros casos, pode ocorrer uma quebra do DNA na região a ser

sequenciada. Tal ocorrência, pode resultar em uma fita incompleta ou fragmentada com

24

poucos trechos sequenciados, apresentando baixa quantidade de pares de bases com

qualidade acima de 20%, resultando em uma sequência qualificada como “No”.

Uma possível explicação para a obtenção de sequências qualificadas como “No”

seria a utilização de primers antigos na realização da amplificação por PCR, que

poderiam estar degradados.

Para confirmação, as amostras foram visualizadas com o programa BioEdit que é

um programa phred que permite a aferição da qualidade de cada base obtida, leitura de

cromatogramas, visualização e edição dos contigs, dentre outras funções

(FORMIGUIERI, 2004).

Tabela 1 – Resultado obtido através do programa Electropherogram quality analysis,

exemplificando a região ITS1 e ITS4 do isolado L69A, que foi classificado como “Ok”.

Tabela 2 – Resultado obtido através do programa electropherogram quality analysis,

exemplificando a região ITS1 e ITS4 do isolado P22 que foi classificado como “No”.

Tabela 3 – Resultado obtido através do programa electropherogram quality analysis,

exemplificando a região ITS1 e ITS4 do isolado P20A que foi classificada como “No”.

25

Nos cromatogramas das amostras analisadas, o programa atribuiu bases a cada

pico observado e valores que indicam a qualidade de cada base. Quanto maior o pico,

maior a chance da base indicada no cromatograma ser a correta, portanto, picos baixos

podem indicar uma imprecisão na base indicada. O programa aplica uma cor para cada

base para melhor identificação. A base T apresenta coloração vermelha, a base C

possui coloração azul, a base G possui cor preta, a base A possui coloração verde e as

bases indefinidas com outras letras do alfabeto é de cor roxa. Quanto menor a

quantidade de bases indefinidas, melhor a sequência para realizar a identificação de

indivíduos corretamente. O programa também demonstra, logo em cima das bases

obtidas, a região da sequência que está sendo observada.

A figura 4 exemplifica a sequência foward da amostra P2B que apresentou alta

qualidade devido a picos estáveis e únicos em cada região da sequência, apresentando

essas características por toda a sequência. É comum que a região inicial e a final da

sequência apresentem picos muito baixos e bases incertas.

Já a figura 5 exemplifica a sequência foward do isolado P22 que foi descartado.

Esta foi avaliada como uma sequência de baixa qualidade devido a picos muito baixos

em grande parte da sequência, principalmente na região central, demonstrando grande

quantidade de bases imprecisas. As poucas regiões que apresentaram picos mais altos

se demonstraram ser muito instáveis com diversas ocorrências de sobreposição entre

os picos.

Figura 4 – Sequência foward do isolado P2B visualizada no programa BioEdit. Primeira linha representa o começo da sequência com as primeiras bases obtidas. Segunda linha representa a região central da

sequência apresentando uma ótima qualidade. Terceira linha representa a região final da sequência, com as últimas bases obtidas.

26

Figura 5 – Sequência foward do isolado P22 visualizada no programa BioEdit. Primeira linha representa o começo da sequência com as primeiras bases obtidas. Segunda linha representa a região central da

sequência apresentando uma baixa qualidade. Terceira linha representa a região final da sequência, com as últimas bases obtidas.

Não foi utilizado um programa unicamente consed, uma vez que não houve

edição dos contigs e o programa phrap utilizado e o BLASTn já permitiram a

visualização dos alinhamentos.

O programa BLASTn permite a comparação de uma sequência de nucleotídeos

de entrada com um banco de dados de sequências de nucleotídeos. Com sua

utilização, é possível obter os parâmetros mais importantes para este estudo: o score,

identidade e e-value. O score é uma nota que foi atribuída pelo algoritmo criado pelo

programa e pela quantidade de pareamentos perfeitos e imperfeitos entre a sequência

que vai ser estudada com uma sequência já depositada no GenBank. Quanto maior o

score, melhor o pareamento, porém o score não pode ser analisado individualmente,

devendo ser acompanhado de outros valores (AMARAL et al., 2007).

O e-value representa a probabilidade de que o alinhamento realizado pelo site

seja correto ou errôneo (falso positivo). Pode ser considerado como a quantidade de

sequências errôneas que apresentariam score bastante similar à sequência correta.

Quanto menor seu valor, menor a chance de se obter um falso positivo e, portanto,

maior sua confiabilidade. Estatisticamente, o e-value pode representar um valor

significativo de ser um falso-positivo, porém, biologicamente, em alguns casos, o valor

obtido pode não ser significativo e se encontrar na faixa ideal. O e-value pode ser

representado como 0,0, 0,12 ou 3e-25. Neste último, esse valor pode apresentar-se

com outros números e em forma abreviada de notação científica. Também é importante

ressaltar que sequências curtas podem apresentar alta similaridade, porém e-value alto,

27

uma vez que há maiores chances de sequências pequenas apresentarem um resultado

falso positivo (AMARAL et al., 2007).

Identidade é a quantidade de letras com pareamento perfeito identificados no

alinhamento da sequência estudada e da sequência armazenada no banco de dados. É

expresso em porcentagem e a similaridade entre as sequências é baseada em seu

valor (AMARAL et al., 2007).

A partir destes parâmetros obtidos pelo BLASTn, foram escolhidas como certas

as sequências que apresentaram maior valor de score, maior identidade e menor e-

value possível.

Segundo Moreira (2013), fungos pertencentes ao filo Ascomycota, podem

apresentar problemas em sua identificação caso suas sequências sejam obtidas a partir

da região ITS. Para tal, é necessário realizar uma interpretação específica para estas

sequências. As sequências com identidade de 99% devem ser consideradas como a

mesma espécie, igual a 98% como pertencentes à mesma espécie ou gênero devendo

haver sempre uma comparação com sua morfologia, entre 95% e 97% devem ser

consideradas apenas o mesmo gênero e as abaixo de 95% como pertencentes à

mesma família, classe ou como inconclusiva.

Após a obtenção do sequenciamento, os fungos com boas sequências foram

cultivados novamente em duplicatas para verificação de contaminação por outros

fungos. Apenas o isolado P28A2 apresentou dois fungos, sendo descartado. Os demais

estavam totalmente isolados e o L69B não pode ser verificado devido a este se

apresentar sem crescimento mesmo após seu cultivo ser refeito outras 2 vezes.

Das 29 sequências, foram obtidos os gêneros Diaporthe, Pestalotiopsis,

Colletotrichum, Epicoccum, Ophioceras, Phaeosphaeria, Paraphaeosphaeria. A maioria

dos fungos pertencem ao gênero Diaporthe, sendo as espécies mais frequentes

Diaporthe passiflorae e Diaporthe phaseolorum. Todos os fungos identificados

pertencem ao filo Ascomycota e os dados obtidos no banco de dados NCBI se

apresentam na tabela 4.

28

Tabela 4 - Resultados da identificação dos fungos endofíticos através da comparação

das sequencias obtidas com o banco de dados do NCBI.

Nome do Fungo Nome científico Score (ident) E value

P2A1 Diaporthe passiflorae Diaporthe sp.

710 (93%) 704 (93%)

0.0 0.0

P2B Diaporthe passiflorae 1000 (98%) 0.0

P3 Diaporthe phaseolorum 806 (94%) 0.0




P22A Diaporthe sp. Diaporthe passiflorae

723 (92%) 721 (92%)

0.0 0.0

P22B1 Phomopsis sp. Diaporthe passiflorae

586 (96%) 583 (96%)

1e-163 2e-162

P23 Paraphaeosphaeria neglecta Paraconiothyrium sporulosum

1037 (99%) 1037 (99%)

0.0 0.0

P28C2 Diaporthe passiflorae 1029 (99%) 0.0

L44 Ophioceras leptosporum 929 (98%) 0.0

L46A Diaporthe sp. 983 (98%) 0.0

L46B Diaporthe sp. Phomopsis sp.

760 (93%) 754 (93%)

0.0 0.0

L48 Diaporthe sp. Diaporthe passiflorae

981 (99%) 970 (99%)

0.0 0.0

L49 Diaporthe phaseolorum 1014 (99%) 0.0

L50A Diaporthe phaseolorum 941(99%) 0.0

L56 Xylariaceae sp. Sordariomycetidae

571 (86%) 545 (91%)

6e-159 4e-151

L58A Diaporthe passiflorae 1013 (99%) 0.0

L62A1 Diaporthe phaseolorum 946 (98%) 0.0

L62A2 Diaporthe phaseolorum 968 (99%) 0.0

L63 Diaporthe phaseolorum Diaporthe passiflorae

992 (99%) 981 (99%)

0.0 0.0

L64 Phaeosphaeria poagena 547 (96%) 8e-152

L65A Colletotrichum gloeosporioides Pestalotiopsis microspora

1101 (99%) 1096 (99%)

0.0 0.0

L67 Diaporthe passiflorae Diaporthe phaseolorum

935 (97%) 926 (97%)

0.0 0.0

L69A Fungo endofítico Pestalotiopsis sp

Pestalotiopsis vismiae Pestalotiopsis carveri

1044 (99%) 1038 (99%) 1038 (99%) 1038 (99%)

0.0 0.0 0.0 0.0

L69B Fungo endofítico Pestalotiopsis microspora

Pestalotiopsis neglecta

1044 (99%) 1038 (99%) 1038 (99%)

0.0 0.0 0.0

L70B Epicoccum nigrum 885 (99%) 0.0

11B Diaporthe phaseolorum Diaporthe passiflorae

793 (95%) 776 (95%)

0.0 0.0

29

Nas figuras 6 e 7, é possível observar a morfologia de cada um dos isolados

sequenciados após crescimento de 10 a 20 dias.

Figura 6 – Alguns dos Isolados sequenciados. Cima para baixo, frente e verso, da esquerda para a direita: P2A1, P2B, P3, P8, P9, P18, P22A, P22B1, P23, P28C2, L44, L46A, L46B, L48 e L49.

30

Figura 7 – Alguns dos Isolados sequenciados. Cima para baixo, frente e verso, da esquerda para a direita: L50A, L56, L58A, L62A1, L62A2, L63, L64, L65A, L67, L69A, L70B e 11B.

O Filo Ascomycota apresenta cerca de 30 mil espécies de fungos unicamente

terrestres, sendo o maior grupo do reino Fungi compreendendo cerca de 75% de todos

os fungos descritos. Sua principal diferença é a presença de ascos, célula sexual

produtora de esporos destes fungos, que contém ascosporos. Podem apresentar tanto

reprodução sexuada quanto reprodução assexuada. Compreende espécies

cosmopolitas e possuem natureza saprofítica, fitopatógena, endofítica e patógena de

humanos. Vários representantes deste filo apresentam papel fundamental na indústria

alimentícia e biotecnológica (MAMEDE, 2012; SILVA; COELHO, 2006; MORAES et al.,

2009).

Os isolados P2A1, P3, P9, L46B e P22A foram classificadas como pertencentes

à família Diaporthaceae por apresentarem valor de identidade entre 92 a 94%, 0,0 e-

value e mediano score.

A família Diaporthaceae foi definida por Hohnel e Wehmeyer no ano de 1926.

Sua forma altera de acordo com sua maturidade. As paredes do asco são delicadas e

31

podem quebrar facilmente em água. Apresentam esporos com diversos formatos, como

hialino, septado, alantoide, dentre outros. Apresenta 24 gêneros, sendo um deles o

gênero Diaporthe (IMA, 2016; WEHMEYER, 1926).

Foram identificados como Diaporthe sp. as amostras P28A2, L46A, L67 e 11B

por apresentar de 98% a 99% de similaridade com Diaporthe sp. apresentando alto

score e baixo e-value ou por apresentar similaridade entre 95% e 97% com alguma

espécie do gênero Diaporthe apresentando 0.0 de e-value e score de mediano a alto.

Já a amostra P28A2, como explicado anteriormente, apresentou contaminação

com outro fungo e, portanto, foi classificada como inconclusiva. Enquanto isso, o

isolado P22B1 apresentou identidade de 96% e foi identificado como Diaporthe sp.,

porém demonstrou um e-value de 1x10-163, tal fato é explicado por este isolado ter

apresentando uma pequena sequência, como discutido anteriormente.

O gênero Diaporthe foi definido por Nitschke no ano de 1970. Apresenta

distribuição global e possui cerca de 800 espécies. O gênero Diaporthe inclui um

grande número de espécies nomeadas, sendo que muitas são sinônimas entre si. Seus

esporos se apresentam como hialinos e seus ascos são escuros e longos. O único

caráter constante é o formato de seu esporo. Acredita-se que sua forma simples tenha

sido originada a partir do gênero Gnomonia (IMA, 2016; ELFAR et al., 2013;

WEHMEYER, 1926; RODRIGUES, 2010).

Já foi visto como endofítico, saprofítico, fitopatógeno e patógenos de humanos.

Há diversos relatos de espécies de Diaporthe que causam câncer em caules e ramos,

deterioração de galho, podridão de frutos e sementes, queima da haste e da vagem,

mancha foliar e ferrugem em uma ampla gama de vegetais hospedeiros. Podem estar

presentes em vegetais de interesse econômico como amêndoa, abacate, azeitona,

pistache, girassol, limão, soja e morango. Em alguns desses casos pode ser

classificado como fitopatógeno fraco, causando danos não muito significativos no

vegetal. Entretanto, Diaporthe tem sido reportado como um dos fungos endofíticos mais

frequentemente encontrados (CHEN et al., 2014; GOMES et al., 2013; ELFAR et al.,

2013)

32

Tem sido reconhecido pela sua produção de enzimas e metabólitos secundários

para antibióticos e atividades anticancerígenas. Já foram utilizados para atividades

lignocelulolíticas, para deter herbivoria e como bioherbicida. Seu nicho ecológico vai

depender do meio onde este se encontra (GOMES et al., 2013; CHEN et al., 2014;

RODRIGUES, 2010). O complexo enzimático celulolítico é produzido por diversos

microrganismos para uso industrial das celulases. Sabe-se que o etanol combustível

pode ser fabricado a partir de materiais lignocelulósicos ao ter a conversão de açúcar

em etanol. Esse modo de produção auxilia na obtenção de preparações enzimáticas de

baixo custo, com altos níveis de atividade enzimática e estabilidade (BONOMI et al.,

2008).

Estudos realizados demonstraram apresentar taxol, dicetopiperazinas, ácido

nitropropiônico, uracila, tirosol, zygosporina D, pirrolidona, lovastatina e alternariol e as

enzimas Laccas e Dicerandrol A, B e C. Algumas destas enzimas e metabólitos podem

apresentar atividade anticancerígena, antioxidante, antifúngica e anti-inseticida. Produz

citocalasinas H e J, que demonstraram efeitos inibitórios potentes sobre os neutrófilos

humanos, possuindo a capacidade de atuar como inibidores potenciais de NADPH-

oxidase que podem ser alvos promissores para a elaboração de agentes anti-

inflamatórios. Em alguns estudos realizados, foi visto um composto inédito derivado de

triterpenoide tretracíclio 19-nor-lanostana, que apresentou atividade antibacteriana em

relação a bactérias gram-positivas e gram-negativas, como Streptococcus pyogenes,

Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus (BIASETTO, 2016; BORGES,

2008; PES, 2015).

Já a amostra L63 apresentou a mesma identidade de 99% para Diaporthe

phaseolorum e Diaporthe passiflorae e mesmo e-value de 0,0, porém o primeiro obteve

992 de score enquanto que o segundo teve 981 de score. Portanto, essa amostra foi

identificada como D. phaseolorum. O mesmo caso se apresentou no isolado L48, igual

identidade de 99% para Diaporthe sp. e Diaporthe passiflorae e igual e-value de 0,0,

porém Diaporthe sp. apresentou 981 de score, enquanto que D. passiflorae obteve 970.

Este isolado foi identificado como Diaporthe sp.

33

A partir do alinhamento com sequências previamente depositadas no GenBank,

os isolados P2B, P28C2 e L58A foram identificados como Diaporthe passiflorae, pois

apresentaram identidade máxima de respectivamente 98%, 99% e 99%, e-value 0.0 e

alto score.

Os fungos P8, P18, L49, L50A, L62A1 e L62A2 foram identificadas como

Diaporthe phaseolorum, uma vez que apresentaram identidade de 98% a 99%, e-value

0.0 e score alto.

A espécie Diaporthe phaseolorum foi descrita por Saccardo em 1870. Apresenta

7 subespécies e sua taxonomia vem sendo considerada difícil e controversa, porém

técnicas moleculares estão sendo aplicadas para auxiliar em uma melhor classificação

deste microorganismo. Pode ser fitopatógeno em plantações de feijão, porém em

alguns mangues pode ser endofítico. Além disso, já foi reportado um caso de

patogenicidade em paciente soro positivo para vírus linfotrópico de células T humanas

tipo 1 (HTLV-1), distúrbio que afeta resposta imune, que sofreu inoculação do fungo no

corpo através de injúrias causadas por espinhos de Amaranthus spinosus. Em estudo

realizado, foi visto que este fungo produziu derivados dicetopiperazinas (GOMES et al.,

2013; FERNÁNDEZ; HANLIN, 1996; BORGES, 2008).

O fungo Diaporthe passiflorae foi descrito primeiramente por Crous e Lombard no

ano de 2012. Apresenta crescimento em temperaturas entre 10ºC e 30ºC, possuindo

crescimento excelente de seus micélios em 20ºC. Portanto, possui preferência em

regiões tropicais e subtropicais. Segundo estudos, este fungo possui crescimento

rápido, correspondendo ao resultado observado nos isolados deste estudo identificados

como D. passiflorae (ELFAR et al., 2013; IMA, 2016). Estudos de Elfar et al. (2013)

descreveram o primeiro relato deste espécime atuando como altamente fitopatógeno

em plantações de mirtilo. Não foram encontrados estudos sobre sua composição

química.

Segundo Gomes et al. (2013), com a deleção do Art. 59 do Código Internacional

de Nomenclatura para algas, fungos e plantas (ICN), os organismos iguais que

apresentam diferenças quanto ao estado assexuado e sexuado devem ser nomeados

igualmente. Como o nome Diaporthe foi descoberto em 1870 e o Phomopsis em 1905,

34

deve-se ser adotado apenas o nome mais antigo para este grupo de fungos. Portanto,

nas amostras P22B1, P28A2 e L46B o gênero obtido como Phomopsis sp. foi

substituído para Diaporthe sp. Sendo assim, o isolado L46B foi identificado como

Diaporthe sp. devido a uma similaridade de 93%, e-value de 0.0 e mediano score.

O gênero Phomopsis (anamorfo de Diaporthe) foi definido em 1905 por

Saccardo. Contém mais de 1.000 espécies. Atualmente, as técnicas moleculares para

identificação deste gênero se demonstram eficazes e credíveis. Essas técnicas também

auxiliaram na separação do estado anamórfico e teleomórfico através de sequências

moleculares independentemente da presença de estruturas sexuadas ou assexuadas.

Já foi encontrado em algumas leguminosas e rubiáceas e apresenta o mesmo nicho

ecológico de Diaporthe sp. Além disso, outros estudos afirmaram que este gênero se

demonstrou como efetivo produtor de metabólitos novos e bioativos, havendo relatos de

Phomopsis apresentando alta atividade antimicobacteriana (CHEN et al., 2014;

RODRIGUES, 2010; IMA, 2016).

Em estudos realizados foi visto que algumas espécies de Phomopsis produziram

phomopsidinas inibidoras de microtúbulos, phomoxantonas com atividade antimalárica

e antituberculose, éter biraril herbicida, phomalactona com inibição de citoquinas,

phomopsichalasina antimicrobiana e citocalasina H sendo reguladora de crescimento

de vegetais. Também teve a produção de phomoxantona A e phomodol, lactonas,

mycoepoxydienos policetídeos, sesquiterpenos da classe dos cadinanos,

benzopiranona e lovastatina, sendo que alguns destes demonstraram atividade

antifúngica e atividade citotóxica (BIASETTO, 2016; BORGES, 2008; PES, 2015;

SEBASTIANES, 2010).

O isolado L56 foi considerado como inconclusivo por apresentar uma sequência

com similaridade de 86% e um score de 571, contrastando com a outra sequência

obtida de similaridade de 91%, porém com score de 545, menor que o da primeira.

Além disso, ainda apresentou um alto e-value de 6x10-159 para a primeira sequência e

4x10-151 para a segunda. Tais fatos podem ser explicados pelo lento crescimento deste

fungo, sendo provável que se tenha obtido menor quantidade de material para extração

35

de DNA e, portanto, baixa concentração de DNA, prejudicando a amplificação da região

ITS.

O isolado L65A foi o que apresentou menor concentração de DNA de todas as

amostras “Ok” e apresentou uma similaridade de 99%. Neste, obteve-se duas

sequências com a mesma identidade, porém o fungo foi devidamente identificado como

Colletotrichum gloeosporioides devido à morfologia comparada com estudos de

Waculicz-Andrade (2009).

Em estudos realizados, o fungo Colletotrichum gloeosporioides foi definido por

Penzing e Saccardo no ano de 1884. Já foram descritos como endofíticos de algumas

plantas medicinais, porém também já foi encontrado como saprofíticos. É o agente

causador de diversas doenças como antracnose, podridão de pedúnculo e varicela. A

antracnose afeta gravemente frutos em pós-colheita e é considerada uma doença de

elevada importância econômica em algumas regiões brasileiras. Pode afetar maracujá,

goiaba, mangueira e diversas outras plantas economicamente importantes. Possui

capacidade de produzir derivados iminoaçúcar, dicetopiperazínico, dicetopiperazinas,

substâncias N-(2-feniletil) acetamida, N-acetiltriptamina e metalonoato de 2-hidroxibutila

3-indol. É conhecido pela produção de ácido colletótrico que apresenta bioatividade

contra Bacilus subtilis e Staphylococcus aureus e pela produção do alcaloide piperina.

Apresentam atividade antimicrobiana, antidepressiva, anti-inflamatória, antioxidante e

antitumoral (IMA, 2016; BORGES, 2008; BIASETTO, 2016; MOREIRA, 2013; MARTINS

et al., 2005; SILVA et al., 2006; WACULICZ-ANDRADE, 2009).

O isolado L70B foi identificado como Epicoccum nigrum devido a obtenção de

99% de similaridade, e-value de 0,0 e alto score. Este fungo foi definido por Link no ano

de 1816. Pode ser encontrado em plantas, solo, ar, pele humana e insetos. Foi

encontrado que este fungo se apresenta como endofítico e epífita de alguns vegetais de

zona tropical e pode se relacionar com uma alta variedade de plantas diferenciadas,

demonstrando uma boa adaptação. Apresenta crescimento irregular e cotonoso. Pouco

se sabe atualmente quanto a sua interação com os hospedeiros vegetais, porém

estudos já relataram ele sendo endofítico facultativo de cana-de-açúcar e provocado a

inibição do crescimento de patógenos deste vegetal. Entretanto, seus conídios que se

36

propagam pelo ar podem causar desordens respiratórias em humanos (TUTTOBELLO

et al., 1969; IMA, 2016; FÁVARO et al., 2012; FERREIRA, 2016; ARAÚJO, 2012).

Já foi utilizado como biocontrole contra microorganismos patógenos e também

como fator de crescimento de sistema radicular. Foram encontrados compostos

antioxidante, antirretroviral, antitumoral, inibidor de protease e telomerase e causador

de hemólise de eritrócitos. O metabólito orevactaeno presente neste fungo inibe a

replicação do vírus HIV. Além disso, apresentam metabólitos com capacidade de

biotransformação, produção de beta-glicanas, formação de pigmentos para corantes

alimentícios e compostos fluorescentes epicocconona, que é um novo fluoróforo para

utilização em eletroforese (FÁVARO et al., 2012; FERREIRA, 2016; ARAÚJO, 2012).

Segundo Tuttobello et al. (1969), já foram isolados pigmentos amarelos e

vermelhos deste fungo. O pigmento amarelo foi identificado como flavina, que possui

ação antifúngica. Já o pigmento vermelho é composto por 4 diferentes carotenóides.

Em estudos realizados por Queissada et al. (2013), foi visto que o E. nigrum apresenta

efetividade contra efluentes altamente poluentes em água contaminadas com óleo,

diminuindo a demanda química de oxigênio, quantidade de fenóis totais, óleos,

gorduras e oxigênio dissolvido na água.

Já o fungo L44 foi identificado como Ophioceras leptosporum por apresentar

uma identidade de 98%, 0,0 de e-value e 929 de score. Este organismo foi definido

primeiramente por Walker no ano de 1980. O gênero Ophioceras apresenta fungos

presentes em algumas herbáceas e também em ambientes aquáticos. Algumas

espécies do gênero Ophioceras apresentam atividade antibacteriana, antifúngica de

fitopatógenos através da produção de ophiocerol, ophiocerinas, ácido isoamericanoico

A e ácido cafeico (IMA, 2016; MONKAI et al., 2013; KLAUBAUF, 2015).

A espécie Ophioceras leptosporum é uma espécie de fungo saprofítico. Estudos

revelam que são grandes decompositores, uma vez que crescem em folhas sobre

processo de decaimento e produzem muitas enzimas para realizar essa decomposição

química. Fungos saprofíticos são grandes potenciais para produção de metabólitos

secundários importantes para o ser humano. Apresenta atividade antibacteriana contra

37

Staphylococcus aureus e Bacillus cereus, além de compostos citotóxicos, antitumorais e

antioxidantes. Possui o composto bioativo sesquiterpenos (MONKAI et al., 2013)

O isolado L64 foi identificado como Phaeosphaeria sp. devido uma identidade de

96% e e-value de 8x10-152. Este microorganismo foi definido em 1909 por Miyake. O

gênero Phaeosphaeria é restrito como fitopatógeno de Poaceas e algumas outras

plantas monocotiledôneas. Uma espécie pertencente a este gênero é muito famosa por

causar a mancha branca do milho. Porém, estudos sugerem que ele sozinho não causa

essa doença, precisando de interações com outros fitopatógenos para causar danos em

vegetais. Foram encontrados compostos naftalenona, naftoquinona, dímero de

naftoquinona assimétrico e éter difenílico clorado, sendo que alguns destes possuem

atividade antimicobacteriana e citotóxica (IMA, 2016; SACHS et al., 2011; PUTZKE;

PEREIRA, 2016; PITTAYAKHAJONWUT et al., 2008).

Os isolados L69A e L69B foram primeiramente identificados como fungos

endofíticos no GenBank com uma similaridade de 99%, score de 1044 e 0,0 de e-value.

Porém, apresentaram diversas espécies do gênero Pestalotiopsis com identidade

também de 99%, entretanto com score de 1038. Por fim, foram identificados como

fungos endofíticos do gênero Pestalotiopsis.

Fungos do gênero Pestalotiopsis foram definidos em 1949 por Steyaert. São

encontrados amplamente distribuídos em solos, ramos, sementes, frutas e folhas.

Apresentam uma grande variedade de hospedeiros e podem ser fitopatógenos,

saprofíticos, epífitas e endofíticos. Estudos sugerem que apenas se demonstraram

como endofíticos em algumas gimnospermas de regiões tropicais e subtropicais. No

Brasil, é muito conhecido por causar podridão branca em florestas de eucalipto em

alguns estados brasileiros. Em relação aos metabólitos secundários, estes apresentam

variadas aplicabilidades na medicina e na biotecnologia, ao originar taxol,

polissacarídeos, ácido ambúico e isopestacina com ações, respectivamente,

anticancerígenas, antidiabética, antifúngico e antioxidante. Também já foram

encontradas atividades fitotóxicas e antitumorais (KRUSCHEWSKY, 2010; IMA, 2016;

MOREIRA, 2013).

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Em estudo realizado por Russel et al. (2011), a espécie Pestalotiopsis

microspora, pertencente ao gênero Pestalotiopsis, apresenta predisposição para

transferência horizontal de genes e tem a capacidade de degradar poliéster poliuretano

em condições aeróbias e anaeróbias, sendo o primeiro relato deste gênero com

capacidade de biodegradação.

Segundo Verkley et al. (2004), os organismos Paraphaeosphaeria sp. e

Paraconiothyrium sp. pertencem ao mesmo gênero Paraphaeosphaeria sp. O isolado

P23, portanto, foi identificado como Paraphaeosphaeria sp., uma vez que apresentou

similaridade de 99% com Paraphaeosphaeria neglecta e Paraconiothyrium sporulosum,

apresentando também o mesmo score de 1037.

O gênero Paraphaeosphaeria foi definido por Eriksson no ano de 1967. Possui

natureza endofítica e saprofítica. Apresenta atividade antimicrobiana, antifúngica e

antitumoral. Origina metabólitos derivados de coniontiriol e micosporulona, policetídeos,

terpenóides, modiólitos A e B, pentanotida linear e modiolina (IMA, 2016; DOURADO et

al., 2016; WIJERATNE et al., 2004; WONG et al., 2000). Em estudo realizado por

Wijeratne et al. (2004), foi visto que a espécie P. quadriseptata exibiu significante

citotoxidade contra diversas células humanas cancerígenas.

O quadro 1 apresenta o nome científico e gêneros encontrados após análise das

sequências, nicho a qual o fungo pertence e literatura do nicho encontrado. Não sendo

inclusa a família encontrada em alguns isolados.

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Quadro 1 – Relação entre gêneros e espécies obtidas dos isolados, seu nicho ecológico

e devida referência

Espécie e gênero Nicho ecológico Referências

Diaporthe sp. Endofítico, fitopatógeno, saprofítico e patógeno de mamíferos

GOMES et al., 2013; ELFAR et al., 2013

Diaporthe passiflorae Fitopatógeno ELFAR et al.,2013

Diaporthe phaseolorum Endofítico, fitopatógeno e patógeno de humano

FERNÁNDEZ; HANLIN, 1996; GOMES et al., 2013

Paraphaeosphaeria sp. Endofítico e saprofítico DOURADO et al., 2016; WONG et al., 2000

Ophioceras leptosporum Saprofítico MONKAI et al., 2013

Phaeosphaeria sp. Fitopatógeno SACHS et al., 2011.

Colletotrichum gloeosporioides

Endofítico, fitopatógeno e saprofítico

WACULICZ-ANDRADE, 2009; MOREIRA, 2013; MARTINS et al. 2005

Pestalotiopsis sp. Endofítico, saprofítico, fitopatógeno e epífita

KRUSCHEWSKY, 2010; OSONO, 2008

Epicoccum nigrum Epífita, endofítico, patógeno de humano e saprofítico

FERREIRA, 2016

Portanto, foram encontrados 7 endofíticos identificados como D. phaseorolum, 1

C. gloeosporioides e 1 E. nigrum. Já a nível de gênero, foram encontrados 7 isolados

com o gênero Diaporthe, 2 Pestalotiopsis e 1 Paraphaeosphaeria com possíveis fungos

endofíticos. Ao todo, 2 foram considerados inconclusivos e os demais não apresentam

características de endofíticos.

Apesar de alguns isolados obtidos neste trabalho serem considerados

fitopatógenos, os fungos foram extraídos a partir de folhas sadias de P. desiderabilis

sem qualquer doença aparente.

Segundo Borges (2008), é difícil classificar um organismo corretamente em

endofítico, epifítico ou fitopatógeno uma vez que não há estudos suficientes para

distinguir o limite de cada uma dessas categorias. Com isso, alguns autores podem

classificar erroneamente um determinado organismo como endofítico e este apresentar

características de outra categoria.

40

Alguns pesquisadores acreditam que os fungos endofíticos tenham surgido a

partir de patógenos assintomáticos ou latentes e que algumas alterações mutagênicas

podem alterar a patogenicidade destes microorganismos (BORGES, 2008).

Em pesquisas realizadas demonstraram que as Asteraceas apresentam diversas

substâncias biologicamente ativas como terpenóides, flavonoides, cumarinas,

poliacetilenos e as lactonas sesquiterpênicas. Sendo que os metabólitos flavonoides,

ácidos fenólicos e LST se demonstram como confiáveis quimiossistemáticos.

Apresentam atividades citotóxicas, anti-inflamatórias e antifúngicas. Já o gênero

Pentacalia, apresenta sesquiterpenos, triterpenos e fenilpropanóides, sendo que alguns

representantes deste gênero também podem apresentar sitosterol, eicosanol, friedelina,

cumarinas escolpoletina, 7-geraniloxiescopoletina, flavonoides quercetina e rutina

(BORGES, 2008; FERREIRA et al., 2013; FERREIRA, 2010).

Estudos realizados por Ferreira et al. (2013), P. desiderabilis apresentou

flavonoides, ácido clorogênico, sesquiterpenos, monoterpenos, quinoides e

hidrocarbonetos. Também possui atividade antifúngica, leishmanicida, tripanocida,

antimalárica, antitumoral, citotóxica, anti-inflamatória, miotóxica e antiradicalar.

41

4. CONCLUSÃO/CONSIDERAÇÕES FINAIS

Com este estudo, foi possível estudar a presença de fungos endofíticos

associados à folhas de P. desiderabilis presente em Campos do Jordão, São Paulo.

Esta possui uma interessante e singular comunidade natural de fungos endofíticos.

Sendo que dos 77 fungos inicialmente isolados, 29 foram identificados por meio do

sequenciamento das regiões ITS1 e ITS4 do rDNA. Foi visto que os isolados pertencem

aos gêneros Diaporthe, Pestalotiopsis, Colletotrichum, Epicoccum, Ophioceras,

Phaeosphaeria, Paraphaeosphaeria. Dentre as espécies identificadas, Diaporthe foi o

gênero mais frequente, sendo as espécies Diaporthe phaseolorum e Diaporthe

passiflorae as mais encontradas.

Para a correta identificação dos isolados, os seguintes aspectos dentro desse

processo devem ser cuidadosamente observados:

Correta desinfecção do material vegetal para obtenção apenas de fungos

endofíticos

Isolamento e caracterização em morfoespécies, para diminuir a obtenção

de grande quantidade de fungos da mesma espécie e gênero

Obtenção das amostras de DNA: obtenção de 20 ng/μl a 100ng/μl de

concentração de DNA, podendo ser possível realizar a técnica com menor

concentração; evitar degradação do DNA; RNA não interfere na

amplificação; alta concentração obtida após amplificação não garante

sequências de boa qualidade; purificação deve ser realizada com um kit

ou técnica de boa qualidade e com cuidado para remover aspectos que

podem prejudicar o sequenciamento

Análise das sequências da região ITS 1 e ITS 4 do rDNA: uma precisa

análise das sequências foward e reverse de cada amostra deve ser feita;

visualização das amostras com programa phred; o score deve ser alto e

analisado com o e-value e a identidade; e-value deve ser baixo e sua

correta análise permite a eliminação de resultados falso-positivos; contigs

42

pequenos podem interferir nos valores de e-value e score; identidade deve

ser alta e seu valor pode definir a classificação dos organismos.

Recomenda-se que os isolados que não foram sequenciados e os que

apresentaram baixa similaridade sejam submetidos novamente ao processo de

extração de DNA e produção de seus amplicons para correta identificação.

Por fim, maiores estudos devem ser realizados para avaliar a presença de outros

fungos associados à P. desiderabilis que não foram obtidos neste estudo, para avaliar

novos bioativos que podem ser extraídos destes fungos e também para investigar

relações simbióticas entre a planta hospedeira e estes fungos.

43

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