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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOMÉDICAS
Jessika Geisebel Oliveira Neto
IMPACTO DA SUPLEMENTAÇÃO MATERNA COM EXTRATO AQUOSO DE CANELA DURANTE A
LACTAÇÃO SOBRE A HOMEOSTASE ENERGÉTICA DA PROLE ADULTA
Niterói/RJ, 2016
ii
Jessika Geisebel Oliveira Neto
IMPACTO DA SUPLEMENTAÇÃO MATERNA COM EXTRATO AQUOSO DE CANELA DURANTE A
LACTAÇÃO SOBRE A HOMEOSTASE ENERGÉTICA DA PROLE ADULTA
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Fisiologia e Farmacologia da Universidade Federal Fluminense, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências Biomédicas. Área de concentração: Fisiologia.
Karen de Jesus Oliveira
Niterói/RJ, 2016
iii
Jessika Geisebel Oliveira Neto
IMPACTO DA SUPLEMENTAÇÃO MATERNA COM EXTRATO AQUOSO DE CANELA DURANTE A
LACTAÇÃO SOBRE A HOMEOSTASE ENERGÉTICA DA PROLE ADULTA
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Fisiologia e Farmacologia da Universidade Federal Fluminense, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências Biomédicas. Área de concentração: Fisiologia
Aprovada em:
BANCA EXAMINADORA
Dra Alessandra Choqueta, Universidade Federal Fluminense
Dra Isis Hara Trevenzoli, Universidade Federal do Rio de Janeiro
Dra Érica Patricia Garcia de Souza, Universidade do Estado do Rio de Janeiro
iv
RESUMO
Neto, J.G.O. Impacto da suplementação materna com extrato aquoso de canela durante a lactação sobre a homeostase energética da prole adulta Dissertação (Mestrado em Ciências Biomédicas) – Universidade Federal Fluminense, Niterói, 2016. A programação metabólica ocorre quando insultos promovem alterações
adaptativas nos períodos críticos do desenvolvimento e alteram as funções
endócrino-metabólicas ao longa da vida. Estudos com alimentos conhecidos
por trazerem benefícios à saúde além do valor nutritivo, mostraram que seu
consumo por mães gestantes e/ou lactantes podem vir a ter desfechos
negativos para a prole. Já está bem caracterizado que a ingestão de canela
gera benefícios para homeostase energética. Entretanto, dados prévios obtidos
pelo grupo mostraram que a suplementação com extrato aquoso de canela
(400mg/kg peso corporal/dia) durante a lactação leva ao desenvolvimento de
obesidade visceral, hiperleptinemia, hiperinsulinemia, associada a
normoglicemia, na prole adulta aos 180 dias de vida. Com o objetivo de melhor
compreender as alterações endócrino-metabólicas deste modelo, avaliamos a
expressão proteica no fígado e músculo esquelético por Western blot, além de
avaliarmos o conteúdo de triglicerídeo e glicogênio hepáticos através de
ensaios colorimétricos. No fígado, vimos uma diminuição na fosforilação do IR,
entretanto, observamos aumento na fosforilação do IRS1 e AKT. Quando
avaliamos a sinalização de leptina, não observamos alteração na expressão do
ObRB e SOCS3, no entanto, vimos um aumento na expressão da JAK2 e na
fosforilação da STAT3, sugerindo que a ativação do IRS1/AKT possa decorrer
da maior ativação da via da leptina. Apesar de não observarmos alteração da
via gliconeogênica (PEPCK, G6Pase, GLUT2), vimos que a programação leva
a um menor conteúdo de glicogênio hepático acompanhado por maior ativação
da GSK3β. Observamos aumento do conteúdo de triglicerídeo hepático
acompanhado por expressão normal do PPARα e uma interessante redução da
expressão do SREBP1c. Concluímos que a programação por canela na
lactação altera as principais ações da insulina no fígado, levando a uma menor
síntese de glicogênio e acúmulo de gordura neste tecido, sem gerar alterações
significativas no músculo esquelético.
Palavras-chave: Programação metabólica, canela, insulina, obesidade visceral,
metabolismo hepático.
v
ABSTRACT
Neto, J.G.O. Impact of maternal supplementation with aqueous extract of
cinnamon during lactation on energy homeostasis adult offspring.
Dissertation (Master in Biomedical Sciences) - Fluminense Federal University,
Niterói, 2016.
Metabolic programming occurs when insults promotes adaptive changes in critic
periods of development that alters the endocrine-metabolic functions in the
offspring in medium and long terms. Studies with foods known to promote
health benefits in addition to the nutritive value, shows that its consumption by
pregnant and/or lactating females could induce negative outcomes to the
offspring. It is well characterized that cinnamon intake promotes benefits to
energy homeostasis. However, previous data obtained by our research group
showed that supplementation with cinnamon water extract (400mg/kg body
weight/day) during lactation leads to the development of visceral obesity,
hyperleptinemia, hyperinsulinemia, associated to normoglycemia, in the adult
offspring with 180 days old. To increase the knowledge about the endocrine-
metabolic changes in this model, we evaluated the protein expression in liver
and skeletal muscle by Western blot, and evaluated the hepatic content of
triacylglycerol and glycogen using colorimetric assays. In liver, we observed a
reduced IR phosphorylation; however, we observed increased phosphorylation
of IRS1 and AKT. Concerning leptin signaling pathway, we did not observed
changes in the ObRB and SOCS3 expression, but we observed an increased
expression of JAK2 and phosphorylation of STAT3, suggesting that the
activation of IRS1/AKT could be resulted by the increased activation of leptin
signaling pathway. Although we observed no changes in the gluconeogenic
pathway (PEPCK, G6Pase, GLUT2), we observed that the programmed group
exhibit a lower hepatic glycogen content accompanied by increased activation
of GSK3β. We observed increased hepatic triacylglycerol content accompanied
by normal PPARα expression and an interesting reduction of SREBP1c
expression. We conclude that the programming induced by cinnamon intake
during lactation alters the main actions of insulin in liver; leading to lower
glycogen synthesis and accumulation of fat in this tissue, without promote
important changes in skeletal muscle.
Keywords: metabolic programming, cinnamon, insulin, visceral obesity, hepatic
metabolism.
vi
LISTA DE ABREVIATURAS
AgRP Proteína relacionada a agouti
AKT
FOXO1
Proteína quinase B
Fator de transcrição da família forkhead BOX O
G6Pase Glicose 6 fosfatase
GLUT2 Transportador de glicose tipo 2
GLUT4 Transportador de glicose tipo 4
GSK3β Glicogênio sintase quinase 3 β
HDL Lipoproteína de alta densidade
IR Receptor de insulina
IRS Substrato do receptor de insulina
JAK2 Janus quinase 2
LDL Lipoproteína de baixa densidade
NPY Neuropeptídio Y
ObRB
PDK1
Receptor para leptina isoforma b
Proteína quinase dependente de fosfoinositídeos-1
PEPCK Fosfoenolpiruvato carboxiquinase
PIP2
PIP3
PI3K
POMC
Fosfatidilinositol bifosfato
Fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato
Fosfatidilinositol 3 quinase
Pró-opiomelanocortina
PPAR Receptor nuclear ativado por proliferadores de peroxissomos
PTP1B Proteína tirosina fosfatase 1B
SOCS3 Supressor de sinalização e citocinas tipo 3
SREBP1c Proteína 1c ligadora do elemento regulado por esteróis
STAT3 Proteína sinalizadora e ativadora de transcrição tipo 3
TAG
VLDL
Triglicerídeo
Lipoproteína de muito baixa densidade
α-MSH Hormônio estimulador de melanócito
vii
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Ações mediadas pela insulina na regulação da homeostase
energética.
Figura 2: Esquema da sinalização de leptina.
Figura 3: Expressão proteica da via de sinalização de insulina no fígado.
Figura 4: Expressão proteica da via de sinalização da leptina no fígado.
Figura 5: Expressão proteica da via gliconeogênica.
Figura 6: Expressão proteica da via da glicogênese no fígado.
Figura 7: Avaliação de marcadores do metabolismo lipídico.
Figura 8: Expressão proteica da via de sinalização de insulina no músculo
esquelético.
Figura 9: Esquema representando as alterações no metabolismo hepático
provocadas pela programação induzida pela suplementação materna de canela
durante a lactação.
viii
SUMÁRIO
RESUMO.................................................................................................................... iv ABSTRACT ................................................................................................................. v LISTA DE ABREVIATURAS ....................................................................................... vi LISTA DE ILUSTRAÇÕES ........................................................................................ vii 1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 1
1.1. Programação metabólica ................................................................................. 1 1.2. Canela .............................................................................................................. 3 1.3. Insulina ............................................................................................................. 4 1.4. Obesidade ........................................................................................................ 9
2. Justificativa ............................................................................................................ 12 3. Objetivo ................................................................................................................. 14
3.1. Objetivos geral ............................................................................................... 14 3.2. Objetivos específicos. ................................................................................... 14
4. Materiais e métodos .............................................................................................. 15 4.1. Modelo experimental ...................................................................................... 15 4.2. Suplementação com canela ........................................................................... 15
4.3. Western blot ................................................................................................... 16
4.4. Glicogênio hepático ........................................................................................ 18
4.5. Triglicerídio hepático ...................................................................................... 18
4.6.Análises estatísticas ........................................................................................ 18
5. Resultados ............................................................................................................ 19
5.1. Fígado ............................................................................................................ 19
5.2. Músculo esquelético ....................................................................................... 24
6. Discussão .............................................................................................................. 26 7. Conclusão ............................................................................................................. 33
8. Referências ........................................................................................................... 34
1
1.Introdução
1.1. Programação metabólica
A plasticidade do desenvolvimento é a capacidade de um organismo de
modificar seu fenótipo em resposta a estímulos ambientais. Os períodos iniciais
da vida, como a gestação, lactação e infância precoce são muito importantes
para o adequado desenvolvimento do organismo. Nestes períodos críticos do
desenvolvimento observa-se grande capacidade de resposta aos estímulos
ambientais, hormonais e/ou nutricioais, e quando as respostas adaptativas
geram fenótipos com alterações nas funções endócrino-metabólicas, este
fenômeno passa a ser caracterizado como programação metabólica (Barker,
2004; Moura & Passos, 2005).
Estas alterações adaptativas são possíveis através das modificações
epigenéticas, que explicam como eventos ambientais no início da vida
provocam alterações nos padrões de expressão gênica. A regulação
epigenética consiste em alterações na estrutura da cromatina, sem alterar o
código genético, que ocorrem principalmente em regiões promotoras. A
metilação do DNA, acetilação de histonas e RNAs de interferência são as
principais alterações epigenéticas que alteram a atividade de determinado gene
(Attig et al., 2010; Pinney & Simmons, 2012).
Um importante insulto programador do metabolismo é a alimentação
materna durante a gestação e/ou lactação, pois esta influencia na síntese e
metabolismo de vários hormônios envolvidos no desenvolvimento, crescimento
da prole. Muitos estudos têm demostrado que a desnutrição materna leva ao
nascimento de bebês com baixo peso, o que está relacionado com o
desenvolvimento de doenças crônicas na vida adulta, como obesidade e
diabetes tipo 2 (Moura & Passos, 2005). Um dos primeiros relatos foi feito por
Stanner e colaboradores (1997) na Rússia, que observaram a programação
para obesidade em adultos cujas mães passaram fome na gestação durante a
segunda guerra mundial. Estudos em modelo animal mostraram que a restrição
calórica de 20 a 40% durante a gestação e/ou lactação levam a obesidade,
resistência à insulina e resistência a leptina na vida adulta (Ayala-Moreno et al.,
2013; Palou et al., 2012).
2
Por outro lado, a obesidade materna durante a gestação e/ou lactação
também podem ter consequências graves no desenvolvimento de doenças nos
filhos. Modelos animais de obesidade materna durante a gestação e lactação
mostraram o desenvolvimento de obesidade e hiperinsulinemia, e doenças
cardiometabólicas na prole adulta (Fan et al., 2013; Franco et al., 2015).
Assim, tanto em casos de desnutrição, quanto de hipernutrição podem
programar a prole a desenvolver doenças crônias na vida adulta, como
obesidade, resistência à insulina, hipertensão, disfunções hormonais (Moura &
Passos, 2005; Bresenke et al., 2013). Um estudos recente mostrou que cerca
de 54% das mulheres adicionam algum tipo de suplemento a dieta (Bailey et
al., 2013). Nesse contexto, se torna importante compreender os efeitos
programadores da ingestão materna de alimentos funcionais durante os
períodos críticos do desenvolvimento.
Alimentos funcionais são aqueles capazes de trazerem benefícios além
de suprirem as necessidades nutricionais básicas do organismo (Moraes e
Colla, 2006). Um exemplo de alimento funcional é o óleo de peixe, alimento rico
em ômega 3 e 6, onde seu consumo está relacionado com a melhora do perfil
lipídico, da resistência a insulina, e redução da gordura visceral assiciado a
uma diminuição da leptina sérica em modelo de obesidade (Rossi et al., 2005).
Trabalhos com programação por óleo de peixe mostraram que a
suplementação durante a gestação materna e/ou a infância estão associados a
mudanças no sistema imunológico, tanto em humanos quanto em modelos
animais (Palmer et al., 2014). A programação por óleo de peixe diminui a
sensibilização a comidas tipicamente alergênicas, e reduz a prevalência e a
severidade de dermatites no primeiro ano de vida, com a possibilidade de
persistir até a adolescência. Assim a ingestão de óleo de peixe diminui o risco
de desenvolver doenças alérgicas (Kremmyda et al., 2011; Lauritzen et al.,
2011).
Um outro exemplo é a semente de linhaça, no qual a adição de 25% de
semente de linhaça na ração leva a diminuição do peso corporal, níveis de
colesterol e triglicerídeos por ratas adultas lactantes (Brant et al., 2012). No
entanto, o consumo de semente de linhaça durante a lactação impacta
negativamente no metabolismo da prole, levando ao desenvolvimento de
resistência a insulina, acúmulo de gordura visceral, e hiperleptinemia na vida
3
adulta (Figueiredo et al., 2012). Sendo assim, alimentos conhecidos por
trazerem benefícios a saúde além do valor nutritivo, mostraram que seu
consumo por mães gestantes e/ou lactantes podem vir a ter desfechos
positivos ou negativos para a prole. Isso mostra a importância de estudar os
efeitos do consumo desses alimentos nas etapas críticas do desenvolvimento.
1.2. Canela
A canela (Cinnamomun zeylanicum) é uma das especiarias mais
consumidas no mundo, sendo utilizada na medicina por possuir diversas ações
benéficas no organismo. A canela possui diversas ações biológicas, entre elas
ação anti-inflamatória, antimicrobial, antiparasitária, antioxidante, além disso
diminui os níveis de glicose plasmático, e diminui a pressão sanguínea atuando
como cardioprotetor (Gruenwald et al., 2010; Ranasinghe et al., 2013).
A ação da canela mais bem caracterizada em humanos e roedores é seu
efeito insulina-sílime ou potencializador dos efeitos da insulina, e sua ingestão
está associada a melhora da homeostase glicêmica e lipídica (Khan et al.,
2003; Ranasinghe et al., 2012).
Estudos em pacientes com obesidade e/ou diabetes tipo 2, condição
clínica em que se observa resistência a ação da insulina, a suplementação com
esta especiaria reduz a glicemia de jejum, melhora o perfil lipídico e reduz a
pressão arterial média (Allen et al., 2013; Couturier et al., 2010; Khan et al.,
2003; Qin et al., 2010; Ziegenfuss et al., 2006). A resistência à insulina
associada a pacientes com ovário policístico também responderam de forma
positiva ao tratamento com canela (Wang et al., 2007). Outros trabalhos
mostraram que a suplementação com canela em indivíduos saudáveis reduziu
a insulinemia associada a normoglicemia (Hlebowicz et al., 2007; Solomon &
Blannin, 2009). Além disso, melhora a sensibilidade à insulina, previne a
hiperlipidemia e melhora a composição corporal em modelo animal de
síndrome metabólica (Couturier et al., 2011; Kannappan et al., 2006).
Estudos mostraram que a administração do extrato aquoso de canela
previne o desenvolvimento de resistência à insulina, agindo nos tecidos
periféricos inibindo a ação da PTP1B (proteína tirosina fosfatase) que inativa o
receptor de insulina (Saifudin et al., 2013). Além disso, o extrato aquoso da
canela é capaz de aumentar in vitro e in vivo a expressão gênica do receptor
4
de insulina (IR), substratos do receptor de insulina (IRS1 e 2), a fosfatidilinositol
3 quinase (PI3K) e proteína quinase B (AKT/PKB) em diferentes tecidos, além
de aumentar a translocação do transportador de glicose tipo 4 (GLUT4) para
membrana no músculo esquelético e tecido adiposo branco e aumentar a
captação de glicose (Qin et al., 2003, 2012; Shen et al., 2014).
Recentemente nosso grupo mostrou que o consumo de extrato aquoso de
canela em modelo animal saudável leva a diminuição do ganho de peso
corporal, diminuição do tecido adiposo visceral e triglicerídeo hepático. No
entanto, o consumo de canela leva a diminuição da concentrações de
hormônios como leptina e T3, importantes para a manutenção da homeostase
energética (Lopes et al., 2015; Gaique et al., 2015). Além disso o consumo de
canela leva a redução da leptina sérica, e redução da expressão gênica da
leptina no tecido adiposo, tanto in vivo, quanto in vitro (Cao et al., 2010 ; Lopes
et al., 2015). Entretanto, os efeitos da canela na ação da leptina nunca foi
investigado.
O cinamaldído é o componente majoritário presente no óleo essencial da
canela (cerca de 90%), e responsável pelo cheiro característico da especiaria
(Huang et al., 2011), e os trabalhos tem relatado o efeito do cinamaldeído como
anti-diabético e anti-obesidade (Camacho et al., 2015).
O tratamento com cinamaldeído em modelo de diabetes tipo 2 leva a uma
melhora da sensibilidade a insulina e melhora do perfil lipídico, com o aumento
da expressão de marcadores da via de sinalização de insulina (Li et al., 2012).
Além disso, cinamaldeído é capaz de estimular in vitro a expressão do
transportador de glicose no músculo esquelético (Nikzamir et al., 2014).
O trabalho de Huang e colaboradores (2011) mostrou em modelo animal
de obesidade, que o tratamento com cinamaldeído leva a diminuição de peso
corporal, melhora da resistência à insulina e melhora do perfil lipídico. Além
disso, eles mostraram in vitro, que o cinamaldeído reduz o acúmulo de gordura
nos adipócitos pela diminuição da lipogênese.
1.3. Insulina
A insulina é o hormônio anabólico mais conhecido, e é essencial para a
manutenção da homeostase de glicose, lipídeos, crescimento e diferenciação
5
celular. Esse hormônio é secretado pelas células β das ilhotas pancreáticas em
resposta ao aumento dos níveis circulantes de glicose e aminoácidos após as
refeições. A insulina regula a homeostase de glicose em vários níveis, como
por exemplo, reduzindo a produção hepática de glicose (via diminuição da
gliconeogênese e glicogenólise) e aumentando a captação periférica de
glicose, principalmente nos tecidos muscular esquelético e adiposo branco via
GLUT4 (Carvalheira 2002; Whiteman et al., 2002). O receptor de insulina
pertence a uma família de receptores de fatores de crescimento que têm
atividade tirosina quinase intrínseca. Após a ligação da insulina, o receptor
sofre autofosforilação em múltiplos resíduos de tirosina (IRp). Isto resulta na
ativação da quinase do receptor e consequente fosforilação em tirosina de uma
família de substratos do receptor de insulina (IRS) (Copps & White, 2012).
Apesar do receptor de insulina ser capaz de ativar diversos tipos de substratos,
trabalhos com animal knockout revelou que os efeitos em resposta a insulina
são dependentes da ativação do IRS1 e IRS2 (White, 2002). Por sua vez, os
IRSs recrutam PI3K, que hidrolisa a PIP2 (fosfatidilinositol bifosfato) para PIP3
(fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato). A PIP3 recruta a PDK1 (proteína
quinase dependente de fosfoinositídeos-1) que ativa a AKT pela fosforilação
em resíduos de serina (Bevan, 2001; Whiteman et al., 2002). As interações
proteína-proteína são fundamentais para transmitir o sinal do receptor em
direção ao efeito celular final, tais como translocação de vesículas contendo
GLUT4 para a membrana plasmática no músculo e tecido adiposo (Klip et al.,
2014).
A ação da insulina pode ser atenuada por proteínas fosfatases de tirosina,
que catalisam a rápida defosforilação do receptor de insulina e de seus
substratos. Várias proteínas fosfatases de tirosina foram identificadas, dentre
essas se destaca a proteína tirosina fosfatase 1B (PTP1B) (Knobler, 2014).
6
Figura 1: Ações mediadas pela insulina na regulação da homeostase energética.
Adaptado de Hassan 2014.
A insulina possui diversos papéis metabólicos atuando em diferentes
tecidos para manter a homeostase glicídica e lipídica (figura 1). Um dos alvos
metabólicos da insulina é o fígado. Este órgão realiza funções essenciais para
a homeostase energética do organismo, regulando o metabolismo glicídico,
lipídico e de aminoácidos. Disfunção na sinalização de insulina e metabolismo
hepáticos levam a pré-disposição ao desenvolvimento de diabetes tipo 2 e/ou a
doença gordurosa não alcoólica do fígado (Rui, 2014).
O fígado participa da manutenção dos níveis de glicose plasmático,
capturando glicose após as refeições e liberando glicose durante o jejum
(Fabbrini & Magkos, 2015). No estado alimentado, a glicose entra nos
hepatócitos através do transportador de glicose tipo 2 (GLUT2), ela é então
fosforilada pela glicoquinase e usada para sintetizar glicogênio. Este último
efeito é obtido via desfosforilação da glicogênio sintetase. Após estímulo com
insulina, a AKT fosforila e inativa a glicogênio sintase quinase 3 (GSK3β), o que
diminui a taxa de fosforilação da glicogênio sintetase, aumentando sua
atividade (Rayasam et al., 2009).
Durante o jejum, glicogênio é hidrolisado pela glicogênio fosforilase para
gerar glicose (glicogenólise). Nas primeiras horas de jejum, o fígado produz e
libera glicose principalmente pela glicogenólise a partir do estoque de
glicogênio. Além disso, durante o jejum o hepatócito sintetiza glicose através da
7
gliconeogênese a partir de substratos como lactato, piruvato, glicerol e
aminoácidos. A maquinaria envolvida na gliconeogênese é regulada por fatores
de transcrição, um deles é a FOXO1, que estimula a expressão da
fosfoenolpiruvato carboxiquinase (PEPCK) e glicose 6 fosfatase (G6Pase),
enzimas chaves para o processo gliconeogênico (Rui, 2014).
A resistência a insulina, definida pela redução da responsividade tecidual
a concentrações normais de insulina, é um fator determinante para o
desenvolvimento da diabetes tipo 2, que leva a uma hiperinsulinemia
compensatória (Copps & White, 2012). A insulina inibe a gliconeogênese, e a
resistência à insulina nos hepatócitos leva ao aumento da gliconeogênese,
resultando em hiperglicemia e intolerância a glicose (Michael et al., 2000).
O fígado também desempenha um papel importante no metabolismo
lipídico, através da captação e síntese de ácido graxo, direcionando-os para as
vias de oxidação ou esterificação (Fabbrini & Magkos, 2015). Os estoques de
triglicerídeo e colesterol hepático são regulados por diversos fatores e, sob
condições fisiológicas normais, a captação e a liberação de lipídeos pelo
hepatócito se mantem de forma equilibrada (Rui, 2014).
O fígado pode estocar lipídeos em gotículas de gorduras, e estas podem
ser provenientes da lipogênese, da captação de ácidos graxos da circulação
que foram liberados por outros tecidos através da lipólise (principalmente tecido
adiposo), ou pela captação de gorduras vindas da dieta. A insulina é o principal
estimulador da esterificação de ácido graxo a triglicerídeo no fígado (Leavens &
Birnbaum, 2011). A insulina regula a lipogênese estimulando o fator de
transcrição proteína 1c ligadora do elemento regulado por esteróis (SREBP1c).
Os SREBP1 controlam a biossíntese de triglicerídeos e ácidos graxos,
enquanto o SREBP2 controla o metabolismo de colesterol (Xu et al., 2013).
A beta oxidação mitocondrial é a mais importante via de oxidação de
ácido graxo e formação de ATP para a célula. Um importante fator de
transcrição envolvido com a oxidação lipídica são os receptores nucleares
ativados por proliferadores de peroxissomos (PPARs). O PPARα induz a
transcrição de diversas enzimas envolvidas na beta oxidação mitocondrial e
peroxissomal, além de estimular proteínas envolvidas com a captação e
transporte de ácido graxo (Pawlak et al., 2015).
8
A insulina possui importantes ações na regulação da homeostase glicídica
e lipídica em diversos tecidos além do fígado, como músculo esquelético e
tecido adiposo. A hiperinsulinemia associado a hiperglicemia, são
características do diabetes tipo 2, doença metabólica desencadeada pelo
aumento da resistência periférica à ação da insulina (DeFronzo & Tripathy,
2009). O músculo esquelético é responsável por cerca de 75 a 85% da
captação de glicose de todo organismo (DeFronzo, 1988) e portanto, pode ser
considerado o principal sítio periférico de ação da insulina, importante para a
manutenção sistêmica da homeostase glicídica.
A etapa inicial para a captação e estoque de glicose estimulada pela
insulina, ocorre pela regulação da entrada de glicose na célula muscular
através do GLUT4. A insulina estimula sua translocação para a membrana
celular através da via PI3K/AKT. Uma vez dentro da célula, a glicose pode ser
oxidada para produção de energia ou estocada na forma de glicogênio
(Carnagarin et al., 2015). A resistência a insulina no músculo é o principal fator
que contribui para o surgimento da hiperglicemia, estágio inicial do
desenvolvimento do diabetes (DeFronzo & Tripathy, 2009).
Outro tecido alvo da insulina que participa da homeostase de glicose é o
tecido adiposo. Este tecido é o maior órgão responsável pelo estoque
energético do organismo. O tecido adiposo estoca ácidos graxos, captados da
circulação normalmente na forma de triglicerídeo (TAG). Este lipídio pode ser
transportado na circulação por lipoproteínas como os quilomícrons, quando
provenientes do intestino, ou pelas VLDL produzidas pelo fígado. TAG
circulante é hidrolisado em ácido graxo não esterificado e glicerol pela ação da
lipoproteína lipase presente no endotélio, e sua atividade é estimulada pela
insulina. A insulina também promove a captação de glicose do tecido adiposo
através do estímulo a translocação do GLUT4 para membrana. O ácido graxo
que entra no adipócito é então re-esterificado usando glicerol-3-fosfato
derivado da glicose, e volta a forma de TAG que é estocado em gotículas de
lipídeos. Durante períodos de demanda energética, como o jejum ou a prática
de atividade física, os adipócitos são capazes de mobilizar os estoques
lipídicos e liberar ácidos graxos livres e glicerol para suprir a necessidade de
outros órgãos (Morigny et al., 2015).
9
O compartimento visceral do tecido adiposo está relacionado com maior
risco de desenvolver resistência à insulina, quando comparado ao
compartimento subcutâneo, além de possuir uma maior atividade lipolítica. A
proximidade do tecido adiposo visceral com o fígado expõe a veia porta a
grandes concentrações continuas de ácidos graxos. Sabe-se que elevadas
concentrações plasmáticas de ácidos graxos contribuem para o
desenvolvimento da resistência a insulina (Knights et al., 2014). Dessa forma,
dentre os fatores de risco para o desenvolvimento do diabetes tipo 2 destaca-
se principalmente a obesidade.
1.4. Obesidade
A obesidade é definida pelo excesso de acúmulo de gordura que pode
levar a um desbalanço metabólico e prejuízos para saúde. Além disso, a
obesidade é considerada fator de risco para o desenvolvimento não só do
diabetes tipo 2, mas também para o desenvolvimento da esteatose hepática e
problemas cardíacos (Le Lay et al., 2014).
O tecido adiposo branco além de ser o principal tecido associado à
reserva de energia na forma de triglicerídeos, também possui importante papel
endócrino (Knights et al., 2014). A leptina é um dos principais hormônios
produzido pelos adipócitos, proporcional a massa do tecido adiposo, que age
em diversos tecidos. Sua principal função é sinalizar para o sistema nervoso
central sobre o status energético disponível, diminuindo a ingestão alimentar e
aumentando o gasto energético (Allison & Myers, 2014). Entretanto, indivíduos
obesos apresentam alta taxa de leptina sérica (hiperleptinemia), mas não
apresenta aumento da saciedade, o que indica baixa sensibilidade hipotalâmica
na resposta a leptina, caracterizando resistência ao efeito do hormônio (Allison
& Myers, 2014).
O núcleo arqueado do hipotálamo é o principal local de ação da leptina,
onde inibe neurônios orexígenos (que estimulam a ingestão alimentar) que
produzem o neuropeptídio Y (NPY) e a proteína relacionada ao agouti (AgRP).
A leptina também estimula neurônios anorexígenos (diminuem a ingestão
alimentar) através da síntese de pró-opiomelanocortina (POMC), precursor do
hormônio estimulador de melanócito (α-MSH) (Münzberg & Morrison, 2015).
10
Figura 2: Esquema da sinalização de leptina. Adaptado de (Münzberg & Morrison, 2015).
Nos tecidos periféricos, a leptina tem sido descrita como responsável na
regulação de diversos processos fisiológicos, como angiogênese, formação
óssea, cicatrização, sistema imune, e regulação do metabolismo de lipídeos e
de carboidratos (Sáinz et al., 2015).
O fígado e o músculo esquelético são tecidos com alta atividade
metabólica e junto com o tecido adiposo constituem importantes alvos de ação
da leptina, que atua regulando a sensibilidade à insulina (Denroche et al.,
2012). Trabalhos mostram que a leptina aumenta a sensibilidade à insulina em
ratos normais, e restaura a euglicemia em ratos diabéticos (Chinookoswong et
al., 1999; Sivitz et al., 1997). A sinalização de leptina no fígado ocorre pela
ativação da via STAT3/JAK2 que pode resultar na ativação da via
PI3K/AKT/mTORC (Huynh et al., 2013; Polyzos et al., 2015), evidenciando a
exintência de um crosstalk antre a sinalização de insulina e leptina.
A leptina age através do receptor isoforma B (ObRB) e seus efeitos são
mediados pela ativação da via de sinalização JAK2-STAT3 (janus quinase 2-
proteína sinalizadora e ativadora de transcrição tipo 3). As proteínas JAK2 são
encontradas associadas ao domínio intracelular do ObRB. A ligação da leptina
ao receptor resulta em autofosforilação da JAK2 em resíduos de tirosina, com
consequente ativação da STAT3. A STAT3 ativada sofre dimerização,
11
translocando-se para o núcleo, onde regula a transcrição de diversos genes,
incluindo o estímulo à SOCS3 (supressor e sinalização e citocinas tipo 3).
SOCS3 possui efeito inibitório da via de sinalização, defosforilando tanto a
JAK2 quanto a STAT3 (figura 2) (Wunderlich et al., 2013).
12
2. Justificativa
Além dos benefícios do consumo da canela para a homeostase glicêmica
e lipídica, a canela também é capaz de alterar concentrações séricas de
hormônios como a leptina e hormônio tireoidiano, que podem vir a ser
importantes insultos programadores do metabolismo. Assim, nosso grupo
buscou investigar a ingestão crônica de extrato aquoso de canela por fêmeas
lactantes e os possíveis impactos para a prole a curto e longo prazos.
Dados iniciais obtidos com a suplementação de canela por ratas lactantes
mostrou que as fêmeas tiveram uma redução do tecido adiposo visceral, e uma
redução não significativa da insulina sérica, sem alteração da leptina e
adionectina (tabela 1) (Bento Bernardes, 2014).
Tabela 1
Perfil metabólico materno Controle Canela
Tecido adipose visceral 6.589 ± 1.127 3.976 ± 0.6137*
Insulina sérica (ng/mL) 1.445 ± 0.3232 0.8193 ± 0.1557
Adiponectina sérica (ng/mL) 3775 ± 474.2 4044 ± 460.7
Leptina sérica (ng/mL) 1.524 ± 0.1231 1.463 ± 0.1461
*p<0.05. Valores expressos como média ± erro padrão. Amostras por grupo 8-
11 (Bento Bernardes, 2014).
Já na prole adulta programada pela ingestão materna de canela durante a
lactação mostrou que os animais aos 180d apresentam um perfil metabólico
negativo, com aumento da gordura visceral (42%), hiperinsulinemia e
hiperleptinemia (tabela 2), sem alteração no perfil lipídico sérico (Bento
Bernardes, 2014).
13
Tabela 2
Perfil metabólico da prole adulta
(180d) Controle Canela
Tecido adipose visceral 40.67 ± 1.940 57.75 ± 2.803***
Leptina sérica (ng/mL) 11.50 ± 1.421 33.05 ± 5.150**
Insulina sérica (ng/mL) 1.804 ± 0.3446 2.863 ± 0.2454*
Glicemia (ng/mL) 94.70 ± 4.042 87.67 ± 1.354
*p<0.05, **p<0,01, ***p<0,001. Valores expressos como média ± erro padrão.
Amostras por grupo 8-11 (Bento Bernardes, 2014).
Sabe-se que a obesidade visceral tem uma associação direta com o
desenvolvimento de diabetes tipo 2. Portanto, a hiperinsulinemia observada
sugere resistência ao efeito do hormônio, porém com algum grau de
compensação, pois os animais são normoglicêmicos. Entretanto, os
mecanismos moleculares que possam ajudar na compreensão deste fenótipo
não foram ainda caracterizados. Além disso, o impacto da hiperleptinemia não
foi investigado nestes animais.
Pelo exposto, o presente trabalho objetivou caracterizar os efeitos da
programação nos tecidos periféricos, buscando entender as alterações
moleculares no fígado e músculo esquelético.
Nos hipotetizamos que os animais programados pela ingestão materna de
canela durante a lactação apresentam alterações no metabolismo hepático,
com resistência a ação da insulina, além de alterar a sinalização de insulina no
musculo esquelético.
14
3. Objetivo
3.1. Objetivo geral
Avaliar as alterações moleculares no metabolismo hepático e muscular
associadas a hiperinsulinemia e hiperleptinemia na prole adulta programada
pela ingestão materna de canela durante a lactação.
3.2. Objetivos específicos
Avaliar no fígado:
Proteínas da via da sinalização de insulina
Proteínas da via de sinalização de leptina
Expressão de marcadores da via gliconeogênica e glicogênica
Conteúdo de glicogênio
Expressão de marcadores do metabolismo lipídico
Conteúdo de triglicerídeo
Avaliar no músculo esquelético
Proteínas da via da sinalização de insulina
15
4. Materiais e métodos
4.1. Modelo Experimental
Ratas Wistar adultas, nulíparas, foram acasaladas na proporção de 3
fêmeas para 1 macho. Ao nascimento cada ninhada foi ajustada em 6 filhotes
por rata lactante (maior potencial lactotrófico), após 24h do nascimento as
mães foram divididas randomicamente em dois grupos: 1- Mães Controle:
receberam gavagem com água durante os 20 dias da lactação (n=9); 2- Mães
Canela: receberam gavagem com extrato aquoso de canela por 20 dias de
lactação (400mg/kg peso corporal/dia-n=11) sempre na parte da manhã. Os
animais foram mantidos no biotério do Instituto Biomédico, com temperatura
(251C) e ciclo claro-escuro (luzes acesas 7:00) controlados, recebendo ração
comercial e água ad libitum. Os animais aos 180 dias de idade foram
eutanasiados pelo método de decaptação (no estado alimentado). Ao menos 1
animal de cada mãe foi usado para manter a variedade do grupo programado.
O sangue coletado foi centrifugado para separação do soro que foi congelado e
armazenado no frezer -80°C. O fígado e o músculo solear foram coletados,
pesados e congelados imediatamente em nitrogênio líquido, sendo em seguida
armazenados no freezer -80°C para posterior análise. Os animais programados
por canela na lactação aos 180 dias de vida foram chamados de grupo P180. O
projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da UFF sob o
número 120/2011.
4.2. Suplementação com canela
A canela (Cinnamomum zeyleanicum) em pau foi macerada, em seguida
misturada a água destilada (1g/10ml) e aquecida em banho-maria a 60°C por
uma hora. Após centrifugação a 1000xg por 5 minutos o sobrenadante foi
aliquotado e armazenado a -20ºC. Durante todo o tratamento, o extrato foi
processado uma única vez (Adaptado Kannappan et al., 2006). O extrato obtido
foi analisado por cromatografia líquida de alta performance (HPLC). A análise
mostrou que o maior pico obtido é característico do cinamaldeído, um
fitoquímico muito comum no gênero Cinnamomum e o principal responsável
16
pelas ações metabólicas da canela. Esta análise foi realizada em colaboração
com o Dr. Ricardo M. Kuster no instituto de pesquisa de produtos naturais da
Universidade Federal do Rio de Janeiro (Lopes et al., 2015).
4.3. Western blot
Para a análise proteica, 50 mg de tecido muscular e hepático foram
homogeneizados com tampão de lise (Hepes 50mM, MgCl2 1mM, EDTA 10 mM
e Triton X 1%) e inibidores de protease e fosfatase (Pierce Protease and
Phosphatase inhibitor mini Tablet-Thermo Scientifc) sendo centrifugado
(15000xg, 30 minutos a 4°C) e o sobrenadante recolhido e armazenado no
freezer -20°C. A concentração total de proteínas foi quantificada utilizando kit
de ensaio de proteínas BCA (Pierce BCA Protein Assay Kit -Thermo Scientifc).
Para analisar as proteínas constituintes da membrana, as amostras foram
desnaturadas na presença de tampão de amostra por 30 minutos em
temperatura ambiente. As proteínas citosólicas foram desnaturadas em tampão
de amostra por cinco minutos a 95 °C no banho seco. As proteínas foram
separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida (10 – 12% SDS-PAGE) e
transferidas para uma membrana de PVDF (Amersham Hybond, GE). A
membrana foi então bloqueada em 3% de albumina sérica bovina (BSA,
INLAB), ambos diluídos em TBS-T (tampão salina com Tris 25 mM, Glicina 190
mM, Metanol 20%, com 0,1% de Tween) em temperatura ambiente, durante
uma hora para evitar ligações inespecíficas do anticorpo primário.
Sequencialmente, a membrana foi incubada overnight a 4 °C com os seguintes
anticorpos primários:
Fígado: IRβ (cabra, Santa Cruz Biotechnology, sc-31369, 1:250); IRβ
fosforilado em resíduos de tirosina 1162/1163 (cabra, Santa Cruz
Biotechnology, sc-22103, 1:500); IRS1 (coelho, Santa Cruz Biotechnology, sc-
7200, 1:1000); IRS1 fosforilado em resíduo de tirosina 632 (cabra, Santa Cruz
Biotechnology, sc- 17196, 1:1000); PTP1B (cabra, Santa Cruz Biotechnology,
sc-1718, 1:1000); AKT (camundongo, Cell Signaling, 2920, 1:2000); AKT
fosforilada em reíduos de serina 473 (coelho, Cell Signaling, 4060, 1:2000);
GLUT2 (coelho, Santa Cruz Biotechnology, SC9117, 1:1000); PEPCK (coelho,
Santa Cruz Biotechnology, SC32879, 1:1000); Glicose 6 fosfatase (coelho,
Santa Cruz Biotechnology, SC25840, 1:1000); GSK3-β (coellho, Santa Cruz
17
Biotechnology, sc-9166, 1:1000); GSK3-β fosforilada em resíduo de serine 9
(cabra, Santa Cruz Biotechnology, sc-11757, 1:1000); SREBP1c (coelho, Santa
Cruz Biotechnology, sc-366, 1:1000); PPARα (coelho, Abcam, ab8934,
1:1000); ObRB (coelho, Santa Cruz Biotechnology, sc-8325, 1:1000); JAK2
(coelho, Santa Cruz Biotechnology, sc-7229, 1:1000); STAT3 (coelho, Santa
Cruz Biotechnology, sc-483, 1:1000); STAT3 fosforilado em resíduo de tirosina
705 (camundongo, Santa Cruz Biotechnology, sc-8059, 1:1000); SOCS3
(coelho, Santa Cruz Biotechnology, sc-9023, 1:500).
Músculo esquelético: IRβ (cabra, Santa Cruz Biotechnology, sc-31369,
1:250); IRβ fosforilado em resíduos de tirosina 1162/1163 (cabra, Santa Cruz
Biotechnology, sc-22103, 1:500); PTP1B (cabra, Santa Cruz Biotechnology, sc-
1718, 1:1000); AKT (camundongo, Cell Signaling, 2920, 1:2000); AKT
fosforilado em resíduos de serina 473 (coelho, Cell Signaling, 4060, 1:2000);
GLUT4 (coelho, Abcam, ab654, 1:700).
A ciclofilina (cabra, Santa Cruz Biotechnology, sc-20361, 1:1000) foi
usada como proteína constitutiva para normalizar os dados obtidos no fígado e
músculo.
Depois de incubada com anticorpo primário, a membrana foi incubada
com o anticorpo secundário conjugado a peroxidase, específico para a origem
do anticorpo primário, durante duas horas em temperatura ambiente. A
expressão das proteínas foi detectada por meio de um sistema de detecção de
quimiluminescência com ECL (Healthcare, GE) e as imagens das bandas foram
obtidas com o sistema ChemiDoc (Bio-Rad).
As proteínas totais e as fosforiladas foram obtidas através da análise na
mesma membrana. Para a remoção do primeiro e do segundo anticorpo após a
análise das proteínas fosforiladas, as membranas foram submetidas a um
processo de decapagem (stripping) no qual foram lavadas com solução
contendo Glicina 1,5%, SDS 0,1%, Tween 20 1%, em seguida foram lavadas
com PBS (tampão fosfato em salina), e depois em TBST 0,1%. As membranas
foram então bloqueadas com BSA 3% e incubadas novamente com o anticorpo
primário para a proteína total overnight. Em seguida as membranas foram
incubadas com o anticorpo secundário e foram reveladas como descrito
anteriormente.
18
A intensidade das bandas quimioluminescentes foi determinada utilizando
o software ImageJ, versão 1.48. O grupo programado foi comparado ao grupo
controle (considerado 1).
4.4. Glicogênio hepático
Para avaliação do conteúdo de glicogênio hepático, 250 mg de fígado foi
homogeneizado em ácido tricloroacético 10% na proporção de 1:2. As
amostras foram centrifugadas a 425xg por 10 minutos em temperatura
ambiente. Ao sobrenadante transferido foi acrescentado etanol e as amostras
foram precipitas overnight na geladeira.
Após centrifugação, o sobrenadante foi desprezado e foi adicionado 1ml
de HCL 1N para a quebra do glicogênio hepático precipitado. As amostras
foram fervidas por 30 minutos no banho seco e após esfriar, a amostra foi
neutralizada com 1ml de NaOH 1N. A quantificação foi feita através do Kit
Glicose Liquiform (Lab Test).
4.5. Triglicerídeo hepático
Para quantificação do triglicerídeo hepático, 50 mg de fígado foi
homogeneizado em álcool isopropílico, em seguida as amostras foram
sonicadas por 1 minutos. Após centrifugação 2400xg por 10 minutos a 4°C, o
sobrenadante foi usado para quantificação. Foi usado o Kit Triglicerídio
Liquiform (Lab Test).
4.6. Análise estatística
Para análise estatística foi realizado Teste T de Student para comparação
das médias de amostras não pareadas. Valores foram expressos como média
± erro padrão. Foram considerados significativos os valores de p menor ou
igual a 0,05.
19
5. Resultados
5.1. Fígado
Para estudar a sinalização de insulina no fígado, avaliamos e expressão
de algumas proteínas da via (figura 3). Não vimos diferença na expressão do
receptor de insulina (IR) nos hepatócitos (figura 3 A). No entanto, o receptor de
insulina fosforilado em resíduo de tirosina (IRp) se apresentou
significativamente menor no grupo P180 (figura 3 B). Na figura 3 C vimos que a
expressão da PTP1B, um inibidor da via, não apresenta diferença no grupo
programado em relação ao seu controle.
Avaliamos a expressão proteica do substrato do receptor de insulina
(IRS1) não vimos diferença entre os grupos (figura 3 D). Quando avaliamos a
expressão IRS1 fosforilado, vimos aumento significativo no grupo programado
em relação ao controle (figura 3 E). Na figura 3 F e G, vimos que apesar de não
termos diferença entre os grupos em relação a expressão da AKT total (figura 3
F), vimos que a AKT apresenta maior fosforliação no grupo P180 em relação
ao grupo controle (figura 3 G). Em H temos a representação das bandas
obtidas por Western blot.
20
Figura 3: Expressão proteica da via de sinalização de insulina no fígado. Estudo feito na prole macho aos 180 dias de vida de mães suplementadas com extrato aquoso de canela durante a lactação (PROG) e machos controle (CT). A: Receptor de insulina (IR). B: Receptor de Insulina fosforilado (IRp). C: Proteina tirosina fosfatase 1B (PTP1B). D: Receptor de insulina 1 (IRS1). E: Receptor de insulina 1 fosforilado (IRS1p). F: Proteína quinase B (AKT). G: Proteína quinase B fosforilada (AKTp). H: Representação das bandas obtidas por Western blot; Ciclofilina (Ciclo). Amostras por grupo: 9-16. Resultados expressos em relação aos valores de expressão do grupo controle. Unidades Arbitrárias (U.A.). Valores expressos como média ± erro padrão. *p<0,05.
21
Para caracterizar uma possível resistência à ação da leptina, avaliamos
marcadores da sinalização deste hormônio no fígado dos animais programados
por canela na lactação. Na figura 4 A temos a expressão proteica do receptor
de leptina ObRB, e não vimos diferença entre os grupos. Também não vimos
diferença na expressão da SOCS3 (figura 4 B). Quando avalimos a JAK2,
vimos um aumento significativa da sua expressão no grupo programado (figura
4 C). Apesar de não termos visto diferença entre os grupos na expressão da
STAT total (figura 4 D), vimos um aumento significativo na expressão da
STAT3p (figura 4 E) no grupo P180. Em F temos a representação das bandas
obtidas por Western blot.
Figura 4: Expressão proteica da via de sinalização da leptina no fígado. Estudo feito na prole macho aos 180 dias de vida de mães suplementadas com extrato aquoso de canela durante a lactação (PROG) e machos controle (CT). A: Receptor de leptina (ObRB). B: Supressor de sinalização de citocina 3 (SOCS3). C: Janus quinase 2 (JAK2). D: Transdutor de sinal e ativador de transcrição 3 (STAT3). E: Transdutor de sinal e ativador de transcrição 3 fosforilado (STAT3p). F: Representação das bandas obtidas por Western blot; Ciclofilina (Ciclo). Amostras por grupo: 9-16. Resultados expressos em relação aos valores de expressão do grupo controle. Unidades Arbitrárias (U.A.). Valores expressos como média ± erro padrão. *p<0,05.
22
Na via gliconeogênica, avaliamos a expressão da PEPCK (figura 5A) e da
G6Pase (figura 5 B), e não vimos diferença entre os grupos. Ao avaliarmos a
expressão do transportador de glicose (GLUT2), também não vimos diferença
entre os grupos (figura 5 C). Em D temos a representação das bandas obtidas
por Western blot.
Figura 5: Expressão proteica da via gliconeogênica. Estudo feito na prole macho aos 180 dias de vida de mães suplementadas com extrato aquoso de canela durante a lactação (PROG) e machos controle (CT). A: Fosfoenolpiruvato carboxiquinase (PEPCK). B: Glicose 6 fosfatase (G6Pase). C: Transportador de glicose tipo 2 (GLUT2). D: Representação das bandas obtidas por Western blot; Ciclofilina (Ciclo). Amostras por grupo: 12-16. Resultados expressos em relação aos valores de expressão do grupo controle. Unidades Arbitrárias (U.A.). Valores expressos como média ± erro padrão.
Na via da glicogênese, avaliamos a expressão da GSK3β, e não vimos
diferença na expressão total da proteína (figura 6 A). Entretanto vimos uma
diminuição significativa na GSK3β fosforilada no grupo programado em relação
ao controle (figura 6 B). Também avaliamos o conteúdo de glicogênio no
23
fígado, e vimos que o estoque de glicogênio esta significativamente menor no
grupo P180 (figura 3 C). Em D temos a representação das bandas obtidas por
Western blot.
Figura 6: Expressão proteica da via da glicogênese no fígado. Estudo feito na prole macho aos 180 dias de vida de mães suplementadas com extrato aquoso de canela durante a lactação (PROG) e machos controle (CT). A: Glicogênio sintase quinase 3 (GSK3β). B: Glicogênio sintase quinase 3 fosforilada (GSK3βp). C: Conteúdo de glicogênio. D: Representação das bandas obtidas por Western blot; Ciclofilina (Ciclo). Amostras por grupo: 12-16. Resultados expressos em relação aos valores de expressão do grupo controle. Unidades Arbitrárias (U.A.). Valores expressos como média ± erro padrão. *p<0,05, **p<0,01.
Avaliamos indicadores do metabolismo lipídico, e vimos que a expressão
do SREBP1c apresenta redução significativa no grupo P180 (figura 7 A).
Quando avaliamos a expressão do PPARα, não vimos diferença entre os
grupos (figura 7 B). Avaliamos o conteúdo de triglicerídeo, e vimos aumento
significativo no grupo programado (figura 7 C). Em D temos a representação
das bandas obtidas por Western blot.
24
Figura 7: Avaliação de marcadores do metabolismo lipídico. Estudo feito na prole macho aos 180 dias de vida de mães suplementadas com extrato aquoso de canela durante a lactação (PROG) e machos controle (CT). A: Receptor nuclear ativado por proliferadores de peroxissomos isoforma α (PPARα). B: Proteína 1c ligadora do elemento regulado por esteróis (SREBP1c). C: Conteúdo de triglicerídeo. D: Representação das bandas obtidas por Western blot, Ciclo (ciclofilina). Amostras por grupo: 12-16. Resultados expressos em relação aos valores de expressão do grupo controle. Valores expressos como média ± erro padrão. *p< 0,05, **p<0,01.
5.2. Músculo esquelético
Também avaliamos a expressão da sinalização de insulina no músculo
esquelético (figura 8) e vimos que a expressão do IR está significativamente
menor no grupo programado em relação ao seu controle (figura 8 A). Quando
avaliamos o IRp, não vimos diferença entre os grupos (figura 8 B). Avaliamos a
expressão da PTP1B, e esta apresenta redução significativa no grupo P180
(figura 8 C). A expressão da AKT total (figura 8 D) e da AKTp (figura 8 E) não
apresentam diferenças entre os grupos. Já na figura 8 F vimos que a
expressão do GLUT4 também não se modificou no grupo programado.
25
Figura 8: Expressão proteica da via de sinalização de insulina no músculo esquelético. Estudo feito na prole macho aos 180 dias de vida de mães suplementadas com extrato aquoso de canela durante a lactação (PROG) e machos controle (CT). A: Receptor de insulina (IR). B: Receptor de insulina fosforilado (IRp). C: Proteína tirosina fosfatase 1B (PTP1B). D: Proteína quinase B (AKT). E: Proteína quinase B fosforilada (AKTp). F: Transportador de glicose tipo 4 (GLUT4). G: Representação das bandas obtidas por Western blot; Ciclo (ciclofilina). Amostras por grupo: 9-16. Resultados expressos em relação aos valores de expressão do grupo controle. U.A.- unidades arbitrárias. Valores expressos como média ± erro padrão. * p<0,05.
26
6. Discussão
A programação metabólica ocorre quando modificações adaptativas
ocorrem em resposta a alterações ambientais ou alimentares nos períodos
iniciais da vida e altera as funções endócrino-metabólicas da prole (Moura &
Passos, 2005). Estudos com alimentos conhecidos por trazerem benefícios a
saúde além do valor nutritivo, mostraram que seu consumo por mães gestantes
e/ou lactantes podem vir a ter desfechos negativos para a prole (Figueiredo et
al., 2012). Isso mostra a importância de estudar os efeitos do consumo desses
alimentos por fêmeas lactantes. No estudo da canela, já esta bem
caracterizado seu efeito benéfico na homeostase lipídica e glicêmica,
potencializando os efeitos da insulina tanto em humanos quanto em modelos
animais (Allen et al., 2013; Couturier et al., 2011).
Hormônios envolvidos com a homeostase energética, como a insulina,
podem impactar o desenvolvimento da prole (Hochberg et al., 2011; Martin-
Gronert & Ozanne, 2012). As fêmeas suplementadas com extrato aquoso de
canela durante a lactação tiveram uma redução da gordura visceral e uma
redução não significativa de 43% da insulina sérica (Bento Bernardes 2014), o
que pode alterar a concentração de insulina no leite e consequentemente afetar
a prole. Nesse sentido, também não podemos descartar a possibilidade de que
os componentes bioativos da canela estejam sendo transferidos pelo leite e
influenciar diretamente o metabolismo da prole. Estudos futuros são
necessários para avaliar a composição do leite de fêmeas tratadas com canela.
Dados prévios obtidos neste modelo também mostraram que a
suplementação com extrato aquoso de canela durante a lactação leva ao
aumento do depósito de gordura visceral, sem alteração do peso corporal na
prole adulta aos 180 dias de vida (Bento Bernardes 2014). Excesso de tecido
adiposo, principalmente visceral, está associado com importantes disfunções
metabólicas, tais como resistência a insulina e diabetes tipo 2, caracterizado
por hiperinsulinemia e hiperglicemia ou normoglicemia no estado pré-diabético
(Nowotny et al., 2015; DeFronzo, 1988; Seo & Rhee, 2014). Neste modelo de
programação, os animais desenvolveram hiperinsulinemia acompanhado de
normoglicemia (Bento Bernardes 2014), sugerindo um estado pré-diabético
com baixo nível de resistência a insulina.
27
No fígado dos animais programados aos 180 dias de vida não vimos
diferença na expressão proteica do receptor de insulina, no entanto, vimos
menor fosforilação (resíduo de tirosina 1162/1163), indicando que este está
menos ativo em relação ao controle. Este resultado sugere uma resistência na
ação da insulina, uma vez que o grupo P180 apresenta hiperinsulinemia. A
regulação do nível de fosforilação em resíduo tirosina deste receptor é feita em
grande parte pela PTP1B. Li e colaboradores (2011) mostraram que em
modelo animal de obesidade há aumento da expressão do PTP1B, tanto de
RNAm quanto da expressão proteica, e que este fenótipo está associado à
resistência ao efeito da insulina. Em nosso modelo, não vimos diferença
estatística entre a expressão proteica do PTP1B nos animais programados e os
animais controles. Entretanto, não podemos descartar uma possível
participação do PTP1B para a menor taxa de fosforilação do IR, uma vez que a
expressão proteica desta fosfatase está 37% maior em relação ao controle
(p=0,0804). De forma interessante, quando avaliamos o IRS1, vimos aumento
na fosforilação no resíduo tirosina 632, no grupo P180. Parece que o aumento
do PTP1B não influenciou no nível de fosforilação do IRS1.
Importantes ações da insulina no fígado são diminuir a produção de
glicose (gliconeogênese), aumentar a síntese de triglicerídeos (lipogênese) e
aumentar a síntese de glicogênio (glicogenogênese), cuja regulação ocorre via
ativação da AKT (Hassan, 2014). No fígado dos P180 vimos que a expressão
da AKT não difere entre os grupos, no entanto, há aumento da AKTp (resíduo
serina 473) no grupo programado, que pode ser consequência da maior
ativação do IRS1 (Bhattacharyya et al., 2015). Portanto, apesar de haver uma
dissociação entre a ativação do IR e IRS1, a maior ativação da AKT é coerente
com a maior fosforilação do IRS1 (Taniguchi et al., 2005).
Além da insulina, as isoformas da AKT podem ser reguladas por outros
fatores, tais como fatores de crescimento e citocinas, incluindo PDGF, IGF-1,
TNFα, IL-2. Dentre os fatores reguladores, estudos mostram que a leptina
possui ação na modulação da AKT (Ikejima et al., 2005; Schultze et al., 2011).
Nós observamos no grupo P180 aumento na concentração sérica de
leptina, hormônio secretado pelo tecido adiposo cujas principais funções são
atuar na regulação da homeostase energética, maturação reprodutiva e
funções neuroendócrinas. Seu efeito mais clássico ocorre no hipotálamo,
28
diminuindo a ingestão alimentar e aumentando o gasto energético (Polyzos et
al., 2015). Além disso, estudos têm demonstrado que a leptina possui ação
endócrina nos tecidos periféricos, podendo agir diretamente no fígado,
modulando a sinalização de insulina (Huynh et al., 2013). Para comprender se
o aumento da AKT pode ter sido estimulado pela hiperleptinemia nos animais
P180, analisamos a sinalização de leptina no fígado e vimos que apesar de não
haver diferença na expressão proteica do receptor de leptina ObRB, vimos
aumento significativo na expressão da JAK2 e STAT3p no grupo P180.
A sinalização de leptina no fígado ocorre pela ativação da via
STAT3/JAK2 que pode resultar na ativação da via PI3K/AKT/mTORC (Huynh et
al., 2013; Polyzos et al., 2015). Carvalheira e colaboradores (2003) mostraram
que por cross talk a leptina pode aumentar a sinalização de insulina no fígado.
A administração de leptina leva ativação da via JAK2/STAT3 que é capaz de
ativar os substratos do receptor de insulina IRS1 e IRS2. Jun e colaboradores
(2012) mostraram que em modelos animais de diabetes tipo 1, o tratamento
com leptina não só restaurou a sinalização de insulina através da ativação do
IRS1 e IRS2 como foi capaz de aumentar a fosforilação da AKT. Portanto,
sugerimos que o aumento da fosforilação do IRS1 e AKT observados nos
animais programados podem ter sido estimulados pela sinalização de leptina
no fígado (ao menos em parte), o que pode ser reflexo da hiperleptinemia
observada nesses animais.
Além da ativação exercida pela leptina, a via JAK2/STAT3 pode ser
ativada por diversas citocinas e fatores de crescimento no fígado. A ativação da
STAT3 desempenha um papel importante na proteção do fígado contra danos,
promove a regeneração celular, além de participar do metabolismo de glicose e
lipídios (Kisseleva et al., 2002). Dentre esses fatores se destaca a IL6 e a IL22,
onde seu principal efeito no fígado está relacionado com a função
hepatoprotetora e de regeneração (Gao, 2005). O trabalho de Hong e
colaboradores (2004) mostrou que o tratamento com IL6 in vivo leva a super
espressão da STAT3 e reverte o acúmulo de gordura no fígado, mostrando que
a interação IL6/STAT3 desempenha um papel no metabolismo hepático de
lipídeos. Dessa forma, a ativação da via JAK2/STAT3 no fígado dos animais
P180 pode estar sofrendo influência de citocinas como a IL6, e estes fatores
precisam ser melhor investigados.
29
Para melhor compreender as alterações metabólicas no fígado
promovidas pela exposição à canela durante a lactação, nós investigamos o
conteúdo de glicogênio, triglicerídeo e a via da gliconeogênese.
A síntese e armazenamento de glicogênio hepático estimulado pela
insulina representa um dos principais estoques de energia no organismo,
podendo ser mobilizado em momentos de necessidade (Greenberg, 2006). O
estímulo passa pela via PI3K/AKT, no qual a AKT fosforila e inibe a GSK3β.
Uma vez bloqueada, a GSK3β deixa de inibir a glicogênio sintase levando ao
aumento do depósito de glicogênio (Rayasam et al., 2009). Avaliamos a
expressão proteica da GSK3β, e apesar de não vermos diferença na GSK3β
total, vimos diminuição da fosforilação no resíduo serina 9 no grupo
programado, acompanhado pela diminuição do estoque de glicogênio. No
nosso modelo de programação, vimos no grupo P180 menor fosforilação da
GSK3β e menor estoque de glicogênio hepático, o que corrobora com a menor
ativação do IR, mas não mostra correlação com o aumento da ativação do
IRS1 e AKT possivelmente estimulado pela leptina. Portanto, sugerimos que a
redução do estoque hepático de glicogênio seja, pelo menos em parte,
independente do aumento da ativação do IRS/AKT observado neste modelo de
programação.
Na gliconeogênese, a resistência a insulina leva ao aumento da
transcrição dos genes PEPCK e G6Pase. A via PI3K/AKT estimula a
fosforilação da FOXO1, um fator de transcrição que controla a expressão de
enzimas da gliconeogênese (Rui, 2014). Em nosso modelo, não observamos
alteração na expressão proteica da PEPCK e da G6Pase no grupo P180 em
comparação ao grupo controle. É possível que, apesar da menor ativação do
IR, o aumento da ativação da AKT no grupo P180 contribua para que a
expressão destas enzimas se mantenha semelhante ao grupo controle. Além
disso, não observamos diferença na expressão proteica do GLUT2 hepático.
Portanto, nossos dados sugerem que não há alteração importante no output
hepático de glicose, o que deve contribuir para a normoglicemia observada nos
animais P180.
Avaliamos o conteúdo hepático de triglicerídeo nos animais do grupo
P180 e vimos que há aumento do depósito de gordura. A esteatose hepática é
uma complicação metabólica comum associada à obesidade, no qual o
30
acúmulo de triglicerídeos é causado principalmente pelo desequilíbrio entre
lipogênese e a oxidação lipídica (Gao et al., 2015). Um dos principais
responsáveis pelo aumento da lipogênese estimulado pela insulina, via AKT, é
a ativação da mTORC que estimula o SREBP1c, um fator de transcrição que
ativa o programa lipogênico (Xu et al., 2013).
Avaliamos a expressão do SREBP1c e surpreendentemente vimos que a
expressão deste esta menor no grupo P180. Este resultado não reflete o
aumento da ativação da AKT, sugerindo que a redução da expressão da
SREBP1c ocorra por outras vias.
Nosso grupo publicou recentemente um trabalho que mostra que a
suplementação com extrato aquoso de canela leva a redução na expressão do
RNAm do SREBP1c no fígado de ratos machos (Lopes et al., 2015). Sendo
assim, não podemos descartar o papel da programação metabólica induzida
pela canela durante a lactação, através de modulação epigenética, na
supressão da expressão gênica do SREBP1c. Além disso, a baixa expressão
de SREBP1c no fígado pode ter contribuído para que o perfil lipídico dos
animais programados se mantivesse normal (Bento Bernardes 2014).
A leptina também parece desempenhar um papel no metabolismo lipídico
hepático. Camundongos ob/ob, com deficiência de leptina desenvolvem
hipertrigliceridemia e esteatose hepática, e a administração de leptina restaura
parcialmente esse fenótipo (Huynh et al., 2013; Liang & Tall, 2001). Os
mecanismos moleculares ativados pela leptina para reduzir o acúmulo de
lipídeos esta associado com a diminuição da expressão de SREBP1c
(Nogalska et al., 2005). A sinalização de leptina nos animais programados,
evidenciada pelo aumento da JAK/STAT3, pode ter contribuído para a
diminuição da expressão do SREBP1c no fígado como observado.
Para tentar entender como o acúmulo de triglicerídeo pode estar
ocorrendo neste tecido, avaliamos a expressão do PPARα, um fator de
transcrição que estimula a β-oxidação lipídica. Este fator induz a expressão de
muitas enzimas envolvidas na β-oxidação mitocondrial e peroxissomal, além de
estimular a captação e transporte dos ácidos graxos (Mashek, 2013). Nos
animais P180, vimos que a expressão proteica do PPARα apresenta uma
redução não significativa de 25% (p=0.085) no grupo programado. Entretanto,
31
essa redução pode indicar uma menor taxa de oxidação lipídica, que pode
estar contribuindo para o acúmulo de gordura hepática.
Quando avaliamos a sinalização de insulina no músculo, vimos uma
diminuição da expressão proteica do IR, o que pode indicar uma resistência ao
efeito da insulina. No entanto, não vimos diferença na quantidade do IRp,
apesar da expressão do PTP1B estar menor neste tecido. Parece que a menor
expressão do PTP1B não influencia na fosforilação do IR. Também não vimos
diferença entre os grupos na expressão proteica da AKT e da AKTp, o que é
coerente com o padrão semelhante ao controle da fosforilação do IR. O
principal alvo da insulina para a captação de glicose é o músculo esquelético
(DeFronzo, 1988) e este é dependente da translocação do GLUT4 para
membrana plasmática, através da via PI3K/AKT (Klip et al., 2014). Avaliamos o
conteúdo total de GLUT4 dos animais P180 e não vimos diferença na
expressão deste transportador. Entretanto, não avaliamos o conteúdo de
GLUT4 presente na membrana celular. Vimos que apesar da menor expressão
do IR total, este evento não se traduz em modificação da ativação de outros
marcadores da via, e consequentemente não impactam em alteração na
expressão de GLUT4 no músculo esquelético.
32
Figura 9: Esquema representando as alterações no metabolismo hepático provocadas
pela programação induzida pela suplementação materna de canela durante a lactação.
33
7. Conclusão
A exposição à canela durante a lactação altera a resposta de vias
metabólicas reguladas pela insulina no fígado levando a uma diminuição nos
estoques de glicogênio, uma não alteração de via gliconeogênica e um
aumento do conteúdo de triglicerídeo. Vimos que parte desses efeitos pode ter
sido mediada pela ativação da via da leptina, evidenciando um crosstalk entre a
sinalização deste hormônio e a insulina no fígado desses animais. A via de
sinalização de insulina no músculo esquelético parece agir de forma
compensatória, o que sugere a não alteração da captação de glicose por este
tecido.
Assim, concluímos que a suplementação com extrato de canela por
fêmeas lactantes gera diversas consequências na fisiologia da prole adulta,
com importante desequilíbrio no metabolismo lipídico resultando em obesidade
visceral e acúmulo de gordura hepática.
34
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