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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL FACULDADE DE VETERINÁRIA
HOSPITAL DE CLÍNICAS VETERINÁRIAS LABORATÓRIO DE ANÁLISES CLÍNICAS VETERINÁRIAS
PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS E CLASSIFICAÇÃO DE ANEMIA EM UMA POPULAÇÃO DE CÃES ATENDIDOS NO LACVET - UFRGS
Ana Elize Ribeiro D’Avila
PORTO ALEGRE 2011
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL FACULDADE DE VETERINÁRIA
HOSPITAL DE CLÍNICAS VETERINÁRIAS LABORATÓRIO DE ANÁLISES CLÍNICAS VETERINÁRIAS
PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS E CLASSIFICAÇÃO DE ANEMIA EM UMA POPULAÇÃO DE CÃES ATENDIDOS NO LACVET - UFRGS
Autor: Ana Elize Ribeiro D’Avila
Monografia apresentada como requisito para obtenção do certificado de Residência Médica em Patologia Clínica Veterinária
Orientador: Félix H. D. González
PORTO ALEGRE 2011
TÍTULO: “PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS E CLASSIFICAÇÃO DE ANEMIA EM UMA POPULAÇÃO DE CÃES ATENDIDOS NO LACVET – UFRGS”
AUTOR: ANA ELIZE RIBEIRO D’AVILA ORIENTADOR: FÉLIX HILÁRIO DÍAZ GONZÁLEZ BANCA EXAMINADORA:
_________________________________________________________________________ Prof. Félix Hilário Díaz González (UFRGS) Orientador
_________________________________________________________________________ Profª. Luciana de Almeida Lacerda (UFRGS) Membro da Banca Examinadora
_________________________________________________________________________ Profª. Ana Cristina Pacheco de Araújo (UFRGS) Membro da Banca Examinadora
PORTO ALEGRE 2011
RESUMO
A anemia é uma anormalidade bastante comum na medicina de pequenos animais. Ela pode ser considerada uma síndrome originada por várias causas, sendo geralmente secundária a algum processo patológico. O presente estudo tem como objetivo identificar as causas de anemia mais prevalentes em cães que realizaram exames laboratoriais durante o período de junho a julho de 2010, além de classificar os tipos de anemia de acordo com a literatura, buscando correlações entre alguns parâmetros hematológicos (Volume Corpuscular Médio, Concentração Hemoglobínica Corpuscular Média e Amplitude de Distribuição dos Eritrócitos – VCM, CHCM e RDW, respectivamente – e avaliação semiquantitativa de níveis de anisocitose e policromasia), além da determinação dos níveis de reticulócitos. Amostras de sangue de 48 pacientes anêmicos (grupo anêmico) e de 90 pacientes saudáveis (grupo controle) foram coletadas para o presente estudo. Foram avaliados parâmetros hematológicos, como contagem de eritrócitos, hemoglobina, hematócrito, VCM, CHCM, RDW de ambos os grupos. Do grupo anêmico, também foi realizada contagem de reticulócitos através de três formas (contagem absoluta, contagem corrigida e Índice de Produção de Reticulócitos). Dos 48 cães anêmicos, 20 apresentavam anemia leve, 16 moderada, 8 severa e 4 muito severa. Verificou-se que houve correlação estatística positiva somente entre as variáveis contagem corrigida de reticulócitos e IPR e contagem absoluta de reticulócitos e IPR. Verificou-se relação moderada, direta e estatisticamente significativa entre o número de cruzes de policromasia e anisocitose (avaliação semiquantitativa) com o IPR. Não houve correlação estatística entre VCM e RDW. Dos 48 pacientes, 13 vieram a óbito e 5 foram eutanasiados. Com relação ao tempo de sobrevida após diagnóstico veterinário, verificou-se que 62,5 % dos cães se recuperaram das causas que levaram a anemia, 14,6% morreram em até 1 semana após diagnóstico, 16,7% em até 1 mês e 6,2 % em até 2 meses. Dos 48 pacientes anêmicos, 16,7% apresentaram anemia regenerativa, 43,7% não regenerativa e 39,6% regenerativa modificada. Anemia por deficiência de ferro e da doença crônica foram os tipos mais frequentes. Através do presente estudo, verificou-se que a contagem manual de reticulócitos foi uma boa ferramenta para o diagnóstico e classificação de anemias, desde que seja realizada de acordo com normas estabelecidas. A análise semiquantitativa de anisocitose e policromasia demonstrou apresentar correlação com o nível de reticulócitos, servindo como parâmetro para direcionar o diagnóstico do clínico, não substituindo a contagem de reticulócitos. O IPR demonstrou ser um bom índice e aplicável para a medicina veterinária, principalmente para a espécie canina. Palavras-chave: cães, anemia, reticulócitos, Red blood cell distribution width (RDW), Índice de Produção de Reticulócitos (IPR).
ABSTRACT
Anemia is a very common abnormality in small animal medicine. It can be considered a syndrome originated from several causes and is usually secondary to some patological process.The present study aims to identify the most prevalent causes of anemia in dogs who performed laboratory tests during the period of June-July 2010, and classify the types of anemia according to the literature, looking for correlations between some hematological parameters (Mean Corpuscular Volume, Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration and Red Blood Cell Distribution Width – MCV, MCHC and RDW – and semiquantitative assessment of levels of polychromasia and anisocytosis), and determination of levels of reticulocytes. Blood samples of 48 patients with anemia (anemic group) and 90 healthy patients (control group) were collected for this study. We evaluated hematological parameters such as erythrocyte counting, hemoglobin, hematocrit, MCV, MCHC, RDW of both groups. For the anemic group, it was also performed reticulocyte count in three ways (absolute count, corrected count and Reticulocyte Production Index). Of the 48 anemic dogs, 20 had mild anemia, 16 moderate, 8 severe and very severe 4 patients. There was a positive correlation between the variables corrected reticulocyte count and RPI and absolute reticulocyte count and RPI. There was a moderate, direct and significant association between semiquantitative evaluation of polychromasia and anisocytosis with RPI. There was no statistical correlation between MCV and RDW in both groups. Of the 48 patients, 13 eventually died and five were euthanasied. About the survival time after diagnosis, 62.5% of dogs have recovered from the causes that led to anemia, 14.6% died within 1 week after diagnosis, 16.7% within 1 month and 6.2% within 2 months. Of the 48 anemic patients, 16.7% had regenerative anemia, 43.7% non-regenerative and 39.6% regenerative modified. Iron deficiency anemia and chronic disease anemia were the most frequent types. Through this study, it was found that the manual reticulocyte count is a good tool for the diagnosis and classification of anemias, if carried out according to established standards. Semiquantitative analysis of anisocytosis and polychromasia showed correlation with the level of reticulocytes, and serves as a baseline to guide the clinician's diagnosis, without replacing the reticulocyte count. The RPI has proved to be a good index for veterinary medicine, especially for the dog. Key-words: dogs, anemia, reticulocytes, Red blood cell distribution width (RDW), Reticulocyte Production Index (RPI).
LISTA DE FIGURAS
Pág. Figura 1. Representação esquemática da maturação celular da linhagem eritroide para espécie canina (Fonte: HARVEY, 2001)............................................................................. 14 Figura 2. Reticulócitos corados com novo azul de metileno em esfregaço sanguíneo (2000x) ................................................................................................................................ 17 Figura 3. Fórmulas para obtenção do volume médio celular (VCM) e concentração hemoglobínica corpuscular média (CHCM)........................................................................ 23 Figura 4. Distribuição normal de eritrócitos com mínimo “encurvamento” a direita. O RDW é derivado do histograma usando a distribuição de eritrócitos (entre as linhas verdes) a 50 % da altura do pico (linha vermelha), resultando num RDW de 15 a 16% (linhas azuis). O eixo X representa o número de células e o eixo Y, o volume celular (em fL) (Fonte: NEIGER et al., 2002)................................................................................. 26 Figura 5. Organograma da classificação de anemias por patogênese (Fonte: adaptado de RAVEL, 1997)..................................................................................................................... 30 Artigo Figura 1. Gráfico que demonstra a ausência de correlação significativa entre RDW (%) e VCM (fL) e entre RDW (%) e IPR em amostras de sangue de48 cães anêmicos atendidos no LACVet – UFRGS, 2010 .............................................................................. 43 Figura 2. Gráfico que demonstra correlação direta e estatisticamente significativa entre contagem corrigida de reticulócitos e IPR e contagem absoluta de reticulócitos e IPR em amostras de sangue de 48 cães anêmicos atendidos no LACVet – UFRGS, 2010 ............. 44
LISTA DE TABELAS
Pág. Tabela 1. Relação entre hematócrito e número de dias de desenvolvimento na medula óssea e no sangue para espécie canina (FELDMAN, 2003)............................................... 22 Tabela 2. Principais causas de aumento de VCM descritas para a espécie canina e felina (adaptado de VILLIERS & BLACKWOOD, 2010) ........................................................... 24 Tabela 3. Algumas causas de alteração em VCM e RDW .................................................. 27 Tabela 4. Avaliação semiquantitativa da morfologia eritrocitária de cão baseada no número médio de células anormais por objetiva de imersão (100x) (HARVEY, 2001) .... 29 Tabela 5. Classificação de anemias através de análise morfológica eritrocitária (adaptado de JAIN, 1993 e FIGHERA, 2001) .................................................................... 31 Tabela 6. Classificação de anemias por regeneração medular (adaptado de LOPES et al., 2007) ................................................................................................................................... 32 Artigo Pág. Tabela 1. Idade, sexo, raça e suspeita diagnóstica de 48 pacientes anêmicos atendidos no LACVet –UFRGS .......................................................................................... 40 Tabela 2. Variáveis descritas pela média e desvio padrão comparadas pelo teste t de Student para amostras independentes (P < O,O5 para ser significativo) ............................ 41 Tabela 3. Valores mínimos, máximos, média, desvio padrão e mediana (intervalo interquartil) de alguns parâmetros hematológicos de 48 pacientes anêmicos ..................... 42 Tabela 4. Coeficiente de correlação de alguns parâmetros (P < O,O5 para ser significativo) ....................................................................................................................... 43
LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES
BFU-E Burst Forming Unity-Erythroid CFU-E Colony Forming Unity-Erythroid CHCM Concentração hemoglobínica corpuscular média EDTA-K2 Ácido etilenodiamino-tetracético dipotássico FDA Food and Drug Administration ICSH International Commitee for Standardization in Haematology IPR Índice de Produção de Reticulócitos (do inglês, RPI) LACVet Laboratório de Análises Clínicas Veterinárias NCCLS National Comittee for Clinical Laboratory Standards RDW Red cells distribution width (amplitude de distribuição dos eritrócitos) TIM Trombocitopenia imunomediada UFRGS Universidade Federal do Rio Grande do Sul VCM Volume Corpuscular Médio
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 9 2 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 11
2.1 Objetivos gerais ............................................................................................................. 11 2.2 Objetivos específicos ...................................................................................................... 11
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................................ 12 3.1 Eritropoiese ................................................................................................................... 12 3.2 Eritropoietina ................................................................................................................ 15 3.3 Reticulócitos................................................................................................................... 16
3.3.1 Métodos de avaliação e contagem ............................................................................. 18 3.3.2 Contagem absoluta, contagem corrigida e IPR .......................................................... 22
3.4 Índices de Wintrobe – VCM e CHCM.......................................................................... 23 3.5 RDW .............................................................................................................................. 26 3.6 Avaliação semiquantitativa de anisocitose e policromasia ........................................... 29 3.7 Anemia ........................................................................................................................... 30
3.7.1 Classificação ............................................................................................................ 31 4 RESULTADOS .................................................................................................................... 34
4.1 Artigo ............................................................................................................................. 34 4.1.1 Utilização de parâmetros hematológicos como ferramenta diagnóstica em uma população de cães anêmicos atendidos no LACVet–UFRGS .................................................................. 34
4.1.2 Resumo .................................................................................................................... 34 4.1.3 Abstract .................................................................................................................... 35 4.1.4 Introdução ................................................................................................................ 36 4.1.5 Materiais e métodos .................................................................................................. 38 4.1.6 Resultados ................................................................................................................ 39 4.1.7 Discussão ................................................................................................................. 46 4.1.8 Conclusões ............................................................................................................... 47 4.1.8 Referências ............................................................................................................... 48
5 CONCLUSÕES .................................................................................................................... 52 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................... 53
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1 INTRODUÇÃO
Segundo Fighera (2001), os distúrbios anêmicos são a principal alteração
hematológica relatada tanto em animais como em seres humanos. Na maior parte dos casos,
a anemia tem origem secundária a alguma doença sistêmica e assim normalmente não é
avaliada de maneira mais profunda. A anemia pode ser considerada uma síndrome
originada por várias causas. Por apresentar alta prevalência, principalmente em função de
anemia ferropênica em humanos, é considerada um problema mundial de saúde pública
(FAILACE, 2009).
Em um estudo retrospectivo realizado na Nigéria, verificou-se que de 5.278 cães
atendidos, cerca de 40% apresentavam anemia, com hematócrito variando de 7 a 36%
(USEH et al., 2003). Em outro estudo realizado nos Estados Unidos, de 203.939 cães
atendidos em laboratórios veterinários, 9,3% dos cães apresentavam anemia (DeNICOLA
et al., 2006).
O termo anemia indica um processo patológico que se caracteriza pela diminuição de
eritrócitos e/ou hemoglobina de um indivíduo, sendo essa diminuição acompanhada ou não
de diminuição no hematócrito. Na maior parte dos casos, os distúrbios anêmicos não são
primários, e sim secundários a outras patologias (FIGHERA, 2001).
Segundo Couto (2003), as principais manifestações clínicas de anemia são mucosas
pálidas ou ictéricas (no caso de destruição de eritrócitos), letargia, diminuição da atividade,
intolerância ao exercício. Esses sinais podem ser agudos ou crônicos e podem variar de
acordo com a severidade do quadro. Taquicardia ou aumento no batimento pré-cordial
também podem ocorrer como mudança adaptativa à anemia.
Como forma de orientação para indicar o diagnóstico e tratamento terapêutico mais
adequado, foram criadas várias classificações para anemia, das quais a baseada na
regeneração medular é a mais empregada, diferenciando em anemias regenerativas e não-
regenerativas através de contagem de reticulócitos (DeNICOLA et al., 2006).
A contagem de reticulócitos no sangue periférico é uma determinação valiosa no
laboratório de hematologia por ser um indicador sensível da atividade eritropoiética da
medula óssea, tanto no diagnóstico e acompanhamento de anemias quanto no
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monitoramento de terapias e de transplante de medula óssea (PEREIRA et al., 2008;
LEONART, 2009; SIMIONATTO et al., 2009b).
O método tradicional de contagem de reticulócitos é o visual através de microscopia,
sendo que a avaliação de seus resultados permite que se façam escolhas adequadas em
relação aos exames laboratoriais específicos para o diagnóstico das anemias em geral.
Porém, esta técnica tem sido acusada de tediosa e de apresentar baixa acurácia e
reprodutibilidade (LEONART, 2009).
A precisão e a acurácia deste método, no entanto, podem ser asseguradas quando o
exame é realizado dentro de critérios técnicos rigorosamente estabelecidos, como os
preconizados pelo National Comittee for Clinical Laboratory Standards e International
Commitee for Standardization in Haematology (LEONART, 2009).
Embora a quantificação de reticulócitos tenha relevante importância para o
diagnóstico de doenças, ele é pouco solicitado, devido ao custo agregado em razão de
outros exames de rotina considerados preferenciais (como hemograma e exames
bioquímicos). Como alternativa, muitos veterinários se utilizam da avaliação
semiquantitativa de anisocitose e policromasia realizada no esfregaço sanguíneo para
fundamentar suas suspeitas de uma resposta regenerativa. Em se tratando de uma
estimativa, muitos autores a consideram subjetiva e pouco precisa. Dessa forma, revela-se a
importância de realizar a comparação entre contagem de reticulócitos e essa avaliação no
presente estudo.
Além da contagem de reticulócitos, outros parâmetros hematológicos são
fundamentais para avaliação do eritrograma, dentre eles estão o hematócrito, a
hemoglobina, o Volume Corpuscular Médio (VCM), a Concentração Hemoglobínica
Corpuscular Média (CHCM), e o RDW (do inglês, Red Cell Distribution Width, ou
amplitude de distribuição dos eritrócitos).
Nesse trabalho, foi realizada uma análise crítica com vista a enfatizar a importância
da realização da contagem de reticulócitos para a classificação dos tipos de anemia, assim
como da correta interpretação do restante dos parâmetros hematológicos fornecidos pelo
hemograma. Ademais, avaliam-se várias hipóteses de correlação entre os parâmetros acima
citados, principalmente entre RDW, um índice considerado novo e pouco conhecido ainda
nos laboratórios veterinários nacionais.
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2 OBJETIVOS
2.1 Objetivos gerais
Identificar as causas de anemia mais prevalentes em cães que realizaram exames
laboratoriais no Laboratório de Análises Clínicas Veterinárias da UFRGS, através da
classificação proposta pela literatura.
Avaliar a importância da contagem de reticulócitos para determinar níveis de
regeneração da anemia.
2.2 Objetivos específicos
Estudar alguns parâmetros hematológicos (VCM, CHCM, RDW e avaliação de níveis
de anisocitose e policromasia), além da determinação dos níveis de reticulócitos através da
contagem absoluta, contagem corrigida e IPR em cães anêmicos.
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3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Eritropoiese
Os eritrócitos são células que desempenham um importante papel no transporte de
oxigênio e de dióxido de carbono pelos tecidos através de ligação com a hemoglobina,
realizando trocas gasosas e tamponamento dos íons de hidrogênio (H+). Também está
envolvido em algumas vias metabólicas. No cão, medem cerca de 6,7 a 7,0 µm de diâmetro
e são uniformemente arredondados e bicôncavos, com uma área de depressão central pálida
(REBAR, 2000).
A produção de células sanguíneas (hematopoiese) decorre do constante turnover das
células do sistema hematopoiético, cuja principal função é a manutenção das frequentes
oscilações dos elementos celulares do sangue, mantendo as populações de leucócitos,
plaquetas e eritrócitos em quantidades suficientes para o seu adequado desempenho, frente
a estímulos fisiológicos ou patológicos. Em resposta a diversas situações, como hipóxia,
hemorragia ou processos infecciosos, pode ocorrer um aumento significativo na produção e
liberação de determinados tipos celulares (WINTROBE, 1998).
Segundo Day et al. (2000), a eritropoiese envolve a presença de um microambiente
propício, citocinas e as células-tronco propriamente ditas na medula óssea. São necessários
alguns nutrientes, como ferro e aminoácidos, e adequado suprimento de oxigênio para
fornecer um microambiente ideal para o crescimento e diferenciação das células-tronco. A
interleucina-3 e eritropoietina são algumas das citocinas que agem em receptores de
superfície dos progenitores hematopoiéticos eritroides (BFU-E e CFU-E, Burst Forming
Unity-erythroyd e Colony Forming Unity-erythroyd, respectivamente).
Além disso, o microambiente é formado por uma rede microfibrilar complexa,
fibroblastos, macrófagos, células endoteliais, células gordurosas e células intersticiais, que
promovem sustentação das células hematopoiéticas e a produção de substâncias
importantes, que podem estimular ou bloquear a formação celular, gerando homeostase
(SILVEIRA, 2000).
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A eritropoietina, basicamente, tem como efeitos promover o aumento na quantidade
de células-tronco eritroides, elevar a sobrevivência dessas e da sua progênie, estimular a
liberação de hemácias maduras, consequentemente, aumenta o número de eritrócitos
produzidos pela medula óssea. O efeito da eritropoietina é modulado e estimulado por
outros hormônios, como andrógenos, tiroxina, hormônio do crescimento, corticosteróides e
prostaglandinas E1 e E2 (DAY et al., 2000).
Algumas substâncias agem inibindo a eritropoiese, como a interleucina-1, fator de
necrose tumoral (TFN), estrógenos e prostaglandina F2α, por exemplo. Acredita-se que isso
ocorra através da regulação da expressão de receptores de superfície nas células
progenitoras (DAY et al., 2000).
Todas as linhagens hematopoiéticas se originam de uma célula mãe, denominada
célula-tronco ou célula progenitora totipotencial, que dá origem a outros progenitores
celulares, multi ou pluripotenciais, que, por sua vez, induzem ao aparecimento das diversas
linhagens hematopoiéticas (WINTROBE, 1998). Segundo Jain (1993), as células primitivas
pluripotentes (PPSC) na medula óssea se diferenciam e dão origem às células unipotentes,
que podem se diferenciar em células das séries eritrocítica, granulocítica, monocítica ou
megacariocítica.
Os demais órgãos que faziam eritropoiese na vida pré-natal, como baço, fígado e
linfonodos, deixam de fazê-la após o nascimento. Contudo, ainda apresentam essa
capacidade pelo resto da vida adulta, podendo voltar a exercer a hematopoiese em situações
de necessidade, o que é chamado de hematopoiese extra-medular (JAIN, 1993; GARCIA-
NAVARRO, 2005).
No animal saudável, existe uma porcentagem de eritrócitos que morrem no interior da
medula, sem chegar à circulação, fenômeno chamado de eritropoiese ineficaz. Este pode
chegar a uma taxa normal de aproximadamente 10% na maioria das espécies (GARCIA-
NAVARRO, 2005).
Para a produção de eritrócitos, o organismo necessita de uma série de nutrientes,
como: aminoácidos, proteínas e vitaminas (as mais importantes são a riboflavina ou
vitamina B2, a piridoxina ou vitamina B6, a niacina, o ácido fólico, a tiamina e a vitamina
B12). Esta última é necessária para a divisão celular nas fases nucleadas da célula. Além
disso, são necessários lipídeos, que fazem parte da composição da membrana do eritrócito e
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desempenham papel de regulação da resistência osmótica da célula, como é o caso do
colesterol. Minerais também são importantes, entre os quais o ferro, que é o principal
componente do grupo heme; o cobalto, necessário à síntese da vitamina B12; o cobre, que
atua como agente catalisador da eritropoiese e como cofator da enzima ALA-desidrase,
utilizada na síntese do heme; e o selênio (KERR, 2003).
A eritropoiese começa com a diferenciação da célula tronco pluripotencial (PPSC)
para BFU-E, que dá origem a uma última célula progenitora, a CFU-E. CFU-E dá origem
aos precursores eritroides (JAIN, 1003).
A formação de progenitores eritroides é regulada pela interleucina-3 e fator
estimulante de colônia – monócito-granulócito (GM-CSF). BFU-E é também estimulada
por substâncias liberadas por várias células, como macrófagos e linfócitos T, enquanto que
CFU-E e sua progênie são sensíveis a eritropoietina (JAIN, 1993).
A produção e a maturação dos eritrócitos pode ser dividida em seis etapas sucessivas
a partir da CFU-Ee, cada uma delas constituindo um tipo celular: rubroblasto (pró-
eritroblasto), pró-rubrícito (eritroblasto), rubrícito (normoblasto ortocromático),
metarrubrícito (normoblasto metacromático), reticulócito (eritrócito policromático) e
eritrócito maduro (GARCIA-NAVARRO, 2005). A Figura 1 mostra uma representação da
eritropoiese.
Durante o processo de proliferação e maturação, as células eritroides progenitoras
sofrem 4 a 5 mitoses, produzindo 16 a 32 células filhas. Em cada etapa de maturação,
ocorrem transformações, com diminuição do tamanho, condensação de núcleo e mudança
na tonalidade do citoplasma, que muda de azul-escuro para vermelho-alaranjado
(GRINDEM et al., 2009).
Figura 1. Representação esquemática da maturação celular da linhagem eritroide para espécie canina (Fonte: HARVEY, 2001)
15
3.2 Eritropoietina
O estímulo fundamental para eritropoiese é tensão tecidual de oxigênio (PO2). A
hipóxia tecidual desencadeia a produção de eritropoietina, um fator humoral ligado
especificamente a produção de eritrócitos. A eritropoietina é produzida pelos rins (pelas
células intersticiais, glomerulares e endoteliais corticais) e por uma pequena fração no
fígado (pelas células de Kupffer, hepatócitos e células endoteliais). Acredita-se que o rim
seja a única fonte de eritropoietina no cão e o fígado é o órgão de predominância no feto
(JAIN, 1993; LOPES et al., 2007).
A eritropoietina é gerada pela ativação do eritropoietinogênio, uma α2-globulina
produzida pelo fígado, pelo fator eritropoiético renal ou eritrogenina, ou pela ativação de
proeritropoietina produzida pelo rim por um fator plasmático.
Ela pode ser encontrada no plasma, urina, leite e outros fluídos biológicos, incluindo
líquido amniótico. É uma glicoproteína com peso molecular de cerca de 38 kD com um
tempo de meia-vida de cerca de 7-10 horas no cão. Em função de ser uma molécula grande,
não pode atravessar a barreira placentária (JAIN, 1993; LOPES et al., 2007).
Aumentos nas concentrações renais de prostaglandina E (PGE), prostaciclina I (PGI),
e AMP cíclico são associados com aumento na produção de eritropoietina (JAIN, 1993;
LOPES et al., 2007).
Um gene humano para eritropoietina foi clonado, e eritropoietina recombinante está
disponível comercialmente para o tratamento de anemias responsivas a eritropoietina.
Eritropoietinas de espécies diferentes mostram fraca reatividade cruzada antigênica, mas
têm similar atividade biológica. Eritropoietina estimula eritropoiese em vários focos por
induzir a diferenciação de células progenitoras eritroides a rubriblastos, estimular a mitose
de células eritroides e reduzir tempo de maturação, e aumentar a liberação de reticulócitos e
células jovens para o sangue periférico. Ela age através de receptores de eritropoietina
presentes na superfície de várias células responsivas (JAIN, 1993; LOPES et al., 2007).
A concentração de eritropoietina está aumentada durante perda de sangue e anemia
hemolítica, mas está diminuída em anemias associadas com doenças renais terminais.
Eritropoiese se encontra mais acelerada em casos de anemias hemolíticas que em anemias
por perda de sangue, mas a causa precisa dessa diferença é desconhecida. A concentração
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de eritropoietina se encontra elevada em casos de policitemia secundária; policitemia
primária é eritropoietina-independente.
Vários órgãos endócrinos têm demonstrado influência na eritropoiese, através de
atuação na síntese de eritropoietina. Promovem influência positiva sobre ela os metabólitos:
prolactina, TSH, ACTH, hormônio do crescimento, cortisol , tiroxina e andrógenos. A
única influência negativa é ocasionada pelos estrógenos (JAIN, 1993; LOPES et al., 2007).
Pechereau et al. (1997) verificaram que a dosagem de eritropoietina é mais útil no
diagnóstico de anemia em gatos do que na espécie canina. Já Cook & Lothrop (1994),
comprovaram aumento nos níveis séricos de eritropoietina em cães anêmicos. No entanto,
em função da grande faixa de limites de referência em cães saudáveis e da sobreposição de
valores entre pacientes anêmicos e pacientes saudáveis, consideram que pode limitar o seu
uso no diagnóstico de anemia (com ou sem envolvimento de falha renal) e policitemia. Em
gatos, foi possível verificar uma diferença nos níveis de eritropoietina entre pacientes
anêmicos com ou sem insuficiência renal crônica.
Os primeiros relatos de desenvolvimento de eritropoietina recombinante humana
surgiram em meados de 1990, com a aprovação de uso pelo FDA (Food and Drug
Administration). Dessa forma, se busca elevar ou manter o nível de eritrócitos e diminuir a
necessidade de transfusões, além de promover qualidade de vida e prevenir problemas
cardíacos, como hipertrofia ventricular esquerda. Relatam o uso em pacientes anêmicos
com ou sem comprometimento renal (com envolvimento de neoplasia ou em doenças auto-
imunes, por exemplo), pacientes com câncer recebendo tratamento quimioterápico ou em
casos de cirurgia (JELKMANN, 2007; JELKMANN, 2010).
3.3 Reticulócitos
Reticulócitos são eritrócitos imaturos que contém ribossomos, polirribossomos e
mitocôndria, o que possibilita a síntese de cerca de 20% do conteúdo de hemoglobina da
célula. Em seu interior, podem ser encontrados raramente remanescentes de outras
organelas citoplasmáticas, como centríolos e complexo de Golgi. Os ribossomos e
polirribossomos contribuem para sua policromasia, como é observado em esfregaços de
sangue (BAUER, 1970).
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Os reticulócitos são capazes de sintetizar hemoglobina e outras proteínas, como
enzimas metabólicas, podendo liberar energia por via aeróbica nas mitocôndrias através da
degradação do piruvato a gás carbônico (CO2) e água (H2O) no ciclo de Krebs
(SIMIONATTO, 2009a).
É necessário o uso de corantes supra-vitais, como novo azul de metileno ou azul de
cresil brilhante para diferenciação entre reticulócitos e eritrócitos maduros, com a
finalidade de mostrar detalhes que são difíceis de verificar pelo uso de fixadores e corantes
convencionais. Eles promovem a precipitação dos ribossomos residuais (Figura 2). Esses
corantes também permitem a identificação de corpúsculos de Heinz, corpúsculos de
Howell-Jolly, dentre outros achados hematológicos (BAUER, 1970) Os corantes de
Romanowsky, amplamente empregados na rotina laboratorial para a coloração de
esfregaços sanguíneos, evidenciam os reticulócitos apenas através de um nível leve de
basofilia, não possibilitando a sua quantificação de forma precisa (SIMIONATTO, 2009a).
Figura 2. Reticulócitos corados com novo azul de metileno em esfregaço sanguíneo (2000x).
Os reticulócitos podem ficar na medula óssea por 2 a 3 dias antes de entrar no sangue
por diápedese através das células endoteliais que revestem os sinusóides da medula. A sua
liberação para circulação é controlada por um número de fatores agindo em equilíbrio,
incluindo concentração de eritropoietina, sua deformabilidade celular e carga elétrica de
superfície. Em cães, são liberados pela medula óssea em cerca de 14 dias de maneira cíclica
(SIMIONATTO, 2009a; RIZZI et al., 2010).
18
Reticulócitos maturam a eritrócitos em 24 a 48 horas na circulação ou no baço, onde
eles podem ser sequestrados temporariamente. O processo de maturação envolve algumas
alterações importantes, como perda de parte da superfície de membrana, receptores de
transferrina e fibronectina, ribossomos e outras organelas; obtenção de conteúdo normal de
hemoglobina; montagem final do esqueleto de submembrana; redução no tamanho celular e
mudança no formato (para uma forma bicôncava), o que otimiza a transferência de gases
(SIMIONATTO, 2009a).
Reticulócitos podem apresentar ainda corpúsculos de Howell-Jolly, que são restos
nucleares remanescentes de extrusão incompleta do núcleo do metarrubrícito. Esses
corpúsculos são normalmente removidos após passagem pelo baço, exceto em algumas
situações (esplenectomia, função esplênica comprometida). Em casos de intoxicação por
chumbo, ribossomos podem se agregar e aparecer como grânulos basofílicos em
reticulócitos e células jovens. A enzima pirimidina 5’-nucleotidase, presente nos
reticulócitos e que normalmente cataboliza ribossomos e polirribossomos, tem sua
atividade reduzida em casos de intoxicação por chumbo. Essa característica celular é
chamada de pontilhado basofílico. Também podem ser encontradas células com pontilhado
basofílico durante uma resposta intensa a anemia em cães e gatos, sendo uma característica
espécie-específica de reticulócitos de ruminantes (JAIN, 1993).
Com relação à conservação das amostras para contagem, sabe-se que os reticulócitos
são viáveis por 48 h a temperatura ambiente e cerca de 4 dias a 4ºC. No cão adulto, são
encontrados menos de 1% de reticulócitos, sendo que no filhote o nível permanece em
torno de 7% (JAIN, 1993).
3.3.1 Métodos de avaliação e contagem
A contagem dos reticulócitos é muito utilizada na rotina laboratorial para avaliar a
atividade eritropoiética da medula óssea, desempenhando um papel importante para o
diagnóstico, prognóstico e terapia de anemias. A presença de reticulocitose é um indício de
resposta medular satisfatória frente a processos hemolíticos ou hemorrágicos ou devido a
terapias específicas aplicadas (suplementação com ferro ou vitaminas, exemplificando), já a
presença de reticulocitopenia pode significar pouca atividade eritropoiética, que pode ser
19
temporária (ainda não houve tempo suficiente da medula óssea responder a estímulo,
liberando mais reticulócitos para a circulação) ou permanente (SIMIONATTO, 2009a).
A utilização de contagem é relatada em casos de monitoramento terapêutico de
pacientes anêmicos e de regeneração medular depois de tratamento mielossupressivo (como
em casos de quimioterapia). Também em casos de transplante de medula óssea e no
acompanhamento de terapia com eritropoietina (ZUPAN-PRELOZNIK et al., 2000).
A contagem manual de reticulócitos ainda hoje é o método padrão de enumeração.
No entanto, durante as duas últimas décadas, foram desenvolvidos equipamentos
veterinários modernos (com base em citometria de fluxo) que realizam a contagem
automática de reticulócitos utilizando corantes fluorescentes de ácidos nucléicos (na grande
maioria dos contadores), contando um número maior de células e fornecendo uma
variedade de parâmetros relacionados com reticulócitos, como volume, concentração de
hemoglobina e maturidade celular (ZANDECKI et al., 2007).
No entanto, a metodologia manual é muito utilizada em laboratórios de pequeno e
médio porte, devido ao baixo custo em relação ao método automatizado. Verifica-se que,
mesmo laboratórios de médio porte que contam com aparelhos automáticos para a
contagem de reticulócitos, nem sempre os utilizam, devido ao alto custo dos reagentes
específicos. As contagens de reticulócitos feitas em contadores eletrônicos, que empregam
a metodologia de citometria de fluxo, são mais rápidas e precisas, devido ao maior número
de células contadas e da redução das fontes de erros (SIMIONATTO, 2009a).
Assim como em todos os procedimentos e técnicas utilizadas em laboratórios,
procura-se buscar uma padronização para estabelecer controle interno de qualidade. O
National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) e o International
Committee for Standards in Haematology (ICSH) estabeleceram protocolos de normas
técnicas para realização da contagem de reticulócitos através de metodologia manual e
automatizada (LEONART, 2009).
Embora menos precisa, a contagem manual ainda serve para indicar alterações no
número de reticulócitos e é uma boa ferramenta para diagnóstico de patologias associadas
com reticulocitose ou não (SIMIONATTO et al., 2009b).
Alguns fatores que levam a erro por esse método são o baixo número de células
contadas, distribuição aleatória de reticulócitos na área de contagem, podendo se concentrar
20
mais de um lado da lâmina do que de outro, artefatos de coloração, variação na coloração
devido ao tempo de maturação dos reticulócitos ou por problemas nos corantes,
dificuldades de discriminação visual de reticulócitos mais maduros (apresentam pouco
RNA residual), tempo exaustivo para contar número significativo de células são alguns
fatores determinantes que podem gerar alta variabilidade intra e inter-observador
(PEREIRA et al., 2008; SIMIONATTI, 2009; TVEDTEN & MORITZ, 2010). Alguns
estudos comprovam grande coeficiente de variação entre análises, cerca de 15 a 20% para
amostras com alto nível de reticulócitos e pesquisas que apontam variação de até 40% para
amostras com níveis de reticulócitos dentro dos valores de referência (ZUPAN-
PRELOZNIK et al., 2000; FERNÁNDEZ et al., 2007). Em outros estudos, verificaram que
os maiores erros de reprodutibilidade de contagem ocorriam em amostras com nível baixo
de reticulócitos, com coeficiente de variação obtido acima de 49% (ZUPAN-PRELOZNIK
et al., 2000).
Outras causas de erros da contagem manual que devem ser consideradas são: os
critérios morfológicos para o reconhecimento do reticulócito, inclusive a sua diferenciação
com o eritrócito maduro e com pontilhados basofílicos, corpúsculos de Howell-Jolly e de
Heinz; o preparo da lâmina para as contagens; a padronização da área de contagem; o
emprego de corantes de Romanowsky como contra-corantes; a preparação da suspensão da
amostra e do corante; a diferença de gradiente de densidade entre reticulócitos e eritrócitos
durante a incubação; a inibição da coloração em hiperglicemia (SIMIONATTO, 2009a).
O desenvolvimento de aparelhos que utilizam como metodologia a citometria de
fluxo possibilitou um novo método para enumeração de reticulócitos. Para tanto, utilizam
corantes fluorescentes ou fluorocromos, como laranja de tiazole e laranja de auramina, que
coram RNA. Através dos citômetros, é possível obter contagens com coeficiente de
variação menor que 12% para diferentes aparelhos. Contudo, não são corantes específicos
para RNA, podendo corar DNA também, o que pode gerar algumas interferências, como
contagem de células com corpúsculos de Howell-Jolly e Heinz, além de inclusões de
Babesia spp. e Plasmodium spp. Também acredita-se que plaquetas gigantes e um grande
número de leucócitos ou leucócitos anormais (como em casos de leucemia) poderia causar
confusão na contagem de reticulócitos, em função dos fluorocromos também corarem RNA
dessas células, além de poder se combinar com DNA de células nucleadas. Nesses casos,
21
recomenda-se a conferência através de método tradicional de contagem (ZUPAN-
PRELOZNIK et al., 2000; ZANDECKI et al., 2007).
Em função de verificar que todo e qualquer método apresenta vantagens e
desvantagens, é imprescindível a aplicação de normas para controle interno de qualidade e
técnicas para assegurar confiabilidade na contagem de reticulócitos. Uma metodologia de
referência utilizada é o protocolo H44-A criado pelo National Committee for Clinical
Laboratory Standards – NCCLS. Existe ainda a aplicação de amostras controle,
industrializadas e compostas por eritrócitos humanos e/ou eritrócitos de outros mamíferos
apresentando níveis baixos, normais e altos de reticulócitos, para comprovar o correto
treinamento de contagem manual (e automática) de laboratoristas.
Simionatto et al. (2009b), através de um estudo com 341 amostras de sangue humano
que comparava as duas metodologias (manual e automatizada), demonstraram que a
diferença entre ambas é muito pequena, com cerca de 0 a 4% de erro sistemático e 3 a 9%
de erro randômico, sugerindo que a contagem manual, se houver cuidado adequado e boa
condução, pode refletir com precisão a contagem real de reticulócitos. Em um estudo
realizado por Zupan-Preloznik et al. (2000), verificaram que, embora exista grande
variabilidade nos resultados entre comparação de dois citômetros de fluxo e contagem
manual, houve boa correlação entre os métodos testados.
A identificação dos reticulócitos, tanto através da metodologia manual, quanto da
automatizada, deve ser feita de acordo com a padronização do College of American
Pathologists (CAP) que define o reticulócito como “qualquer célula vermelha sem núcleo
que após fixada por corante supra-vital, contenha um mínimo de duas partículas de material
corado, correspondendo à precipitação de ácidos nucléicos” (NASCIMENTO, 2004;
TVEDTEN & MORITZ, 2010).
Em um estudo realizado comparando a contagem manual de dez laboratórios em duas
cidades diferentes, observou-se que obtiveram contagens variadas de reticulócitos, com
coeficiente de variação de 4 a 60% entre observadores. Mesmo havendo a comprovação de
imprecisão, verificou-se que o perfil entre eles era parecido, e o coeficiente de correlação
intraclasse indicou que os resultados obtidos eram clinicamente úteis (SIMIONATTO et al.,
2009b).
22
A metodologia automatizada tem demonstrado ser simples, segura e sensível para
quantificação de reticulócitos. No entanto, o custo do aparelho e de manutenção dos
reagentes ainda é um fator limitante. Além disso, o estabelecimento de valores de
referência para as diferentes espécies e a necessidade de uso de controles são fatores que
não devem ser omitidos para a fixação dessa nova técnica (PEREIRA et al., 2008;
LEONART, 2009).
3.3.2 Contagem absoluta, contagem corrigida e IPR
A regeneração na medula óssea em espécies que demonstram respostas consistentes
de reticulocitose frente a estímulos (como cães, gatos e ratos) é avaliada pela contagem de
reticulócitos (TVEDTEN, 2010). Para melhor avaliação do nível de reticulócitos, foram
criadas fórmulas de correção que apontam a resposta fisiológica ou fisiopatológica do
animal baseada em fatores humorais.
A quantificação de reticulócitos por microscopia óptica é realizada através da
contagem de 1000 células (entre eritrócitos e reticulócitos) em vários campos de um
esfregaço preparado com corantes supra-vitais, obtendo-se um valor em porcentagem. A
partir desse dado, são realizadas conversões matemáticas, que têm como objetivo adequar a
uma melhor resposta do animal, levando em conta o seu estado (se saudável ou anêmico),
evitando erros de interpretação de resultados. Pode-se dizer que essas conversões são a
contagem absoluta e corrigida de reticulócitos e o IPR.
A contagem absoluta de reticulócitos envolve a porcentagem de reticulócitos
multiplicada pelo número de eritrócitos do paciente e, por muitos autores, é considerada
como parâmetro preferido para interpretação (COWGILL et al., 2003; TVEDTEN, 2010).
Sugere-se que a força de aumento na contagem absoluta de reticulócitos por unidade de
volume de sangue pode transparecer melhor o quão efetiva é a eritropoiese em um paciente
(TVEDTEN, 2010). Valores acima de 60.000 células/µL seriam sugestivos de resposta
regenerativa para a espécie canina (LASSEN & WEISER, 2007)
A porcentagem de reticulócitos corrigida e o Índice de Produção de Reticulócitos
(IPR) são outros métodos para interpretação de resposta medular. A contagem corrigida de
reticulócitos é um valor que leva em conta o grau de severidade de anemia e número de
23
eritrócitos maduros remanescentes. Ela é realizada através da porcentagem de reticulócitos
encontrada multiplicada pelo resultado da razão entre o hematócrito do paciente e o
hematócrito médio da espécie (para cães, o valor estabelecido é 45%) (LOPES et al., 2006).
Com relação ao IPR, o seu cálculo envolve uma estimativa do tempo de efeito da
eritropoietina sobre a medula óssea até liberação de reticulócitos, bem como a duração do
tempo de maturação dos reticulócitos, que está correlacionada com o grau de anemia. A
Tabela 1 mostra a estimativa (em dias) do período de maturação dos reticulócitos de acordo
com o hematócrito do paciente (FELDMAN, 2003; LASSEN & WEISER, 2007).
Tabela 1. Relação entre hematócrito e número de dias de desenvolvimento na medula óssea e no sangue
para espécie canina (FELDMAN, 2003).
Hematócrito (%)
Desenvolvimento na medula óssea (em dias)
Desenvolvimento no sangue periférico (em dias)
45 3,5 0,5 35 3,0 1,5 25 2,5 2,0 15 1,5 2,5
Dessa forma, para corrigir o efeito da eritropoietina na liberação de reticulócitos,
sabendo que é inversamente correlacionada com o número de eritrócitos/hematócrito do
paciente (quanto menor o hematócrito, maior as concentrações de eritropoietina), após a
obtenção da contagem corrigida de reticulócitos, divide-se pelo número de dias que o
reticulócito permanecerá no sangue. Um cão que apresenta 10% de hematócrito apresentará
ao final do cálculo o fator de correção 2,5, como exemplo (DAY et al., 2000).
Através do IPR, é possível classificar os vários tipos de anemia. A maioria dos
autores considera um IPR maior que 2,0, sugestivo de anemia regenerativa (DAY et al.,
2000; FELDMAN, 2003).
3.4 Índices de Wintrobe – VCM e CHCM
Um grande número de doenças causa alteração no tamanho e na concentração de
hemoglobina dos eritrócitos, e a mensuração desses parâmetros têm sido bastante utilizada
para estabelecer diagnóstico e no monitoramento de terapias. Volume médio celular (VCM)
24
e concentração hemoglobínica corpuscular média (CHCM) são os índices eritrocitários
comumente usados para caracterizar o estado geral das hemácias. Desde sua introdução por
Maxwell Myer Wintrobe em meados de 1930, eles têm formado a base de classificação
para a maioria dos tipos de anemia. Em 1935, Wintrobe realizou estudos com cães, coelhos
e ratos, determinando valores de referência desses índices para essas espécies. A Figura 3
mostra as fórmulas para cálculo do VCM e CHCM.
VCM (fL) = Hematócrito (%) x 10 .
Eritrócitos (milhões/µL)
CHCM (%) = Hemoglobina (g/dL) x 100 . Hematócrito (%)
Figura 3. Fórmulas para obtenção do volume médio celular (VCM) e concentração hemoglobínica corpuscular média (CHCM).
Conceitualmente, o VCM baseia-se no fato de que, se o tamanho médio dos
eritrócitos está aumentado, isso significa que o mesmo número de eritrócitos apresentará
aumento na massa celular e determinará aumento no hematócrito, mesmo que leve. Essa
relação também ocorrerá em casos de eritrócitos com tamanho/volume menor que os
valores de referência estabelecidos para a espécie (RAVEL, 1997).
As principais causas que levam a aumento de VCM em animais estão descritas na
Tabela 2.
Tabela 2. Principais causas de aumento de VCM descritas para a espécie canina e felina
(adaptado de VILLIERS & BLACKWOOD, 2010)
Aumento na quantidade de reticulócitos circulantes Deficiência de vitaminas (ácido fólico ou vitamina B12) Doenças mieloproliferativas Infecção pelo vírus da Leucemia Viral Felina Macrocitose familiar da raça Poodle (Toy e Miniatura) Autoaglutinação (artefato) Estomatocitose hereditária das raças Schnauzer Miniatura e Malamute do Alaska
Com relação aos fatores que levam à diminuição de VCM, pode-se citar deficiência
crônica de ferro, anemia da doença crônica, doenças hepáticas (como em casos de shunt
25
portossistêmico) e a microcitose comum em raças como Akita e Shiba Inu. Em α ou β-
thalassemia também ocorre diminuição desse parâmetro, sendo patologias mais comumente
descritas para a espécie humana (RAVEL, 1997; FIGHERA, 2001, VILLIERS &
BLACKWOOD, 2010).
Sabe-se que reticulocitose acentuada, com aproximadamente 50% de reticulócitos
circulantes, gera aumento significativo no VCM. Contudo, a presença de células
macrocíticas e microcíticas pode resultar em VCM normal (WALLACH, 2009).
CHCM é um parâmetro que estima a concentração média de hemoglobina pelo
número de eritrócitos do paciente. As principais causas relatadas de aumento de CHCM são
em casos de esferocitose, hemólise intra-vascular ou in vitro, altos títulos de aglutininas
frias, lipemia e presença de quantidade significativa de células com corpúsculos de Heinz.
Anemia da doença crônica, anemia envolvendo deficiência de ferro e anemias regenerativas
podem promover diminuição do CHCM (JAIN, 1993; RAVEL, 1997; VILLIERS &
BLACKWOOD, 2010).
O VCM é um importante índice na medida em que sua determinação orienta o
diagnóstico das anemias, classificando-as em microcíticas, normocíticas e macrocíticas.
Sendo determinado através de cálculos ou por contadores hematológicos, o VCM
representa a média de todas as células medidas. Contudo, para revelar heterogeneidade nas
populações de eritrócitos, exige uma quantidade muito grande de um padrão celular, em
função de, em muitos casos, existirem várias populações co-existindo na mesma amostra
(células microcíticas, macrocíticas e normocíticas).
Sendo determinado através de cálculos ou por contadores hematológicos, o VCM
representa a média de todas as células medidas (BESSMAN & JOHNSON, 1975).
Dessa forma, vários autores têm sugerido que o valor do VCM seja utilizado em
conjunto com o do RDW. Nessa composição, o VCM indicaria a média do tamanho dos
eritrócitos e o RDW nortearia a interpretação da população eritroide, relacionada à
heterogeneidade ou não da distribuição morfológica da massa eritroide (NEIGER et al.,
2002; FLAIBAN & BALARIN, 2004; BARBOSA et al, 2006).
26
3.5 RDW
Em função do desenvolvimento de contadores hematológicos mais modernos, tornou-
se possível separar eritrócitos de tamanhos diferentes e agrupá-los de acordo com seu
tamanho, calculando o VCM e produzindo um histograma dessas populações. São
avaliados cerca de 20 mil eventos em contagens sucessivas, aumentando a acurácia do
método.
Em um paciente com volume homogêneo de eritrócitos, haverá um único pico no
histograma. No entanto, algumas situações patológicas podem levar a alterações no VCM,
que se refletirão em mais picos ou deslocamento do histograma para a esquerda
(populações celulares microcíticas) ou para a direita (populações macrocíticas). Na maioria
dos casos, a população eritrocitária anormal coexistirá com a normal (RAVEL, 1997).
Dessa forma, RDW é um índice de anisocitose, ou coeficiente de distribuição do
volume, que usa como dados para cálculo o desvio padrão do histograma e o VCM
(RAVEL, 1997; FAILACE et al, 2009; ZVORC et al., 2010). A Figura 4 mostra um
histograma para obtenção de RDW.
Com o surgimento do RDW, pode-se considerar que houve a criação de uma nova
abordagem de pacientes com anemia. Ao contrário da medicina humana, em que ocorreu
uma grande aceitação do RDW, na medicina veterinária ainda são poucos veterinários e
laboratórios que utilizam esse parâmetro como ferramenta diagnóstica para diagnóstico
diferencial laboratorial das anemias, o que pode ser devido ao desconhecimento de sua
aplicação (ZVORC et al., 2010).
O histograma e o RDW são subprodutos da medida eletrônica individual do volume
dos eritrócitos e tornam-se importantes na avaliação da heterogeneidade volumétrica das
populações eritroides. Em um paciente normal, o histograma apresenta-se como uma curva
gaussiana e de abertura estreita (FAILACE et al, 2009).
27
Figura 4. Distribuição normal de eritrócitos com mínimo “encurvamento” à direita. O RDW é derivado
do histograma usando a distribuição de eritrócitos (entre as linhas verdes) a 50 % da altura do pico (linha vermelha), resultando num RDW de 15 a 16% (linhas azuis). O eixo X representa o número de
células e o eixo Y, o volume celular (em fL) (Fonte: NEIGER et al., 2002).
Em geral, o RDW estará elevado em condições de falha na produção de eritrócitos
(como na deficiência de ferro, vitamina B12 ou folato, e hemoglobinopatias), destruição
aumentada de células e fragmentação eritrocitária (como em casos de hemangiossarcoma e
anemia hemolítica auto-imune, por exemplo), ou após transfusão sanguínea. Esse índice se
encontra dentro dos valores de referência em casos de anemia da doença crônica, anemia
aplásica e síndrome mielodisplásica (ROBERTS & El BADAWI, 1985; RAVEL, 1997;
ZVORC et al., 2010).
Esse índice pode estar anormal antes de identificação de um quadro de anemia, e
antes mesmo de alteração no VCM (RAVEL, 1997). Em anemias regenerativas, o aumento
do RDW é encontrado na fase da doença onde existe um número significativo de eritrócitos
com tamanho normal e anormal presentes simultaneamente (ZVORC et al., 2010).
Em função das diferenças existentes na forma de determinar o volume celular e RDW
entre contadores hematológicos automáticos, Ravel (1997) sugere que cada laboratório
determine seus valores de referência para RDW.
28
Utilizando um contador hematológico ABC Vet (HORIBA ABX Diagnostics, São
Paulo, Brasil), o RDW considerado dentro dos valores de referência para a espécie canina
fica em torno de 14,0 a 17,0%. Valores mais baixos não apresentam significado clínico para
o paciente, pois indicariam população eritroide mais homogênea que a normal. Acima de
17,0% indicam excesso de heterogeneidade volumétrica da população, ou anisocitose
(ZVORC et al., 2010).
No entanto, RDW dentro dos valores de referência pode ser a consequência de um
estado de pré-regeneração. Anemia vista dentro de 3 a 4 dias depois da hemólise pode não
demonstrar nenhum sinal de regeneração no sangue periférico em função do tempo de
produção, que é de cerca de 4 dias (ZVORC et al., 2010).
RDW e VCM fornecido por contadores hematológicos automáticos podem fornecer
primeiros indícios de resposta da medula óssea de pacientes anêmicos, além do aumento no
nível de reticulócitos (NEIGER et al., 2002; ZVORC et al., 2010). Para Roberts e El
Badawi (1985), aumento em RDW em pacientes anêmicos estaria associado com maior
nível de reticulócitos circulantes, apresentando uma correlação direta entre esses
parâmetros hematológicos. A relação entre patologias que levam a alterações no RDW e
VCM estão expressas na Tabela 3.
Tabela 3. Algumas causas de alteração em VCM e RDW.
Relação VCM/RDW Causas VCM alto, RDW alto Alta quantidade de reticulócitos (como exemplos,
anemia hemolítica, anemia falciforme, recém-nascidos, hemorragia)
VCM normal, RDW alto Desordens nutricionais, desordens hemolíticas VCM baixo, RDW alto Deficiência de ferro VCM normal, RDW normal Desordens hipoproliferativas
Alguns autores sugerem a possibilidade de interferência de elevado nível de
leucócitos e plaquetas com a determinação do RDW (ROBERTS & El BADAWI, 1985).
Segundo Ferreira et al. (2009), existe uma grande diferença entre dados sobre RDW
de cães na literatura em função dos aparelhos hematológicos, condições em que os cães são
criados, métodos de coleta, exercício físico e doença subclínica.
29
Já Neiger et al. (2002) relatam que diferentes contadores eletrônicos podem
apresentar variação nos valores de referência para VCM e RDW. Sugere-se estabelecer
valores de referência para cada laboratório e para cada analisador hematológico automático,
em função das técnicas usadas para medir o tamanho dos eritrócitos individuais que
diferem, e modelos diferentes que geram variação nos resultados.
3.6 Avaliação semiquantitativa de anisocitose e policromasia
Embora a identificação e quantificação de reticulócitos seja realizada através do uso
de corante supra-vitais, em lâminas de esfregaço periférico coradas com corantes
Romanowsky podem ser encontrados eritrócitos policromatófilos (células maiores,
apresentando coloração diferente dos eritrócitos maduros, que é devido a menor
concentração de hemoglobina), correspondendo aos reticulócitos propriamente ditos.
Uma possível confirmação de uma contagem elevada de reticulócitos é a sua
correlação com a presença de eritrócitos policromatófilos na lâmina do sangue periférico
(WALLACH, 2009).
Dessa forma, ao longo das décadas, foram determinados índices de anisocitose e
policromasia para análise em esfregaços sanguíneos, com a finalidade de indicar alterações
nos parâmetros eritrocitários. Antigamente, alguns autores realizavam uma análise
qualitativa de anisocitose, policromasia e hipocromia, classificando as alterações no
esfregaço sanguíneo em leves, moderadas ou marcantes. No entanto, devido à subjetividade
dessa avaliação, criou-se a necessidade de uma classificação mais objetiva e quantitativa
(ROBERTS et El BADAWI, 1985).
Publicações internacionais e uma recomendação antiga da Organização Mundial de
Saúde (OMS) preconizam semiquantificação de 1+ a 4+ como critério mais reprodutível e
uniforme. Alguns autores utilizam a classificação de 1+ a 3+ (HARVEY, 2001; FAILACE
et al, 2009). Essa avaliação semiquantitativa deve ser feita na área de contagem, onde os
eritrócitos não encontram-se amontoados, e sim separados por cerca de meia célula de
distância (HARVEY, 2001).
30
Tabela 4. Avaliação semiquantitativa da morfologia eritrocitária de cão baseada no número médio de células anormais por objetiva de imersão (100x) (HARVEY, 2001)
1+ 2+ 3+ 4+ Anisocitose 7-15 16-20 21-29 >30 Policromasia 2-7 8-14 15-29 >30 Hipocromasia 1-10 11-50 51-200 > 200
No entanto, alguns autores consideram a estimativa de avaliação de morfologia e
coloração celular ainda bastante subjetiva em função de se tratar de uma inspeção visual
que apresentará variações inter-laboratoristas. Sugere-se que, para cada laboratório, sejam
criados procedimentos operacionais padrão a fim de padronizar essa metodologia, evitando
uma grande variação nos resultados (ROBERTS & El BADAWI, 1985; FAILACE et al,.
2009).
3.7 Anemia
A palavra anemia tem derivação grega, onde an significa ausência e aima, sangue.
Anemia é um processo que se caracteriza pela diminuição do número de eritrócitos,
concentração de hemoglobina e/ou hematócrito abaixo dos valores normais de referência.
Em casos de um alto nível de regeneração, o hematócrito pode não sofrer grandes
alterações em função do tamanho aumentado dos eritrócitos compensar o menor número de
células (FIGHERA, 2001; LOPES et al, 2007).
Raramente, a anemia é uma patologia primária, na maioria das vezes, é o resultado de
outras causas ou doenças. Dessa forma, torna-se importante a investigação de sua origem.
Em função dos problemas decorrentes da deficiência em transportar oxigênio, das
alterações fisiológicas para compensar o número reduzido de eritrócitos na circulação
sanguínea (ou eritron) e da diminuição do débito cardíaco consequente, os sinais clínicos
mais comuns de anemia são: dispnéia, depressão, intolerância ao exercício, palidez de
mucosas, aumento da frequência cardíaca, taquicardia, sopro cardíaco (sistólico) e aumento
da frequência respiratória. Em casos relacionados a patologias auto-imunes, como anemia
31
hemolítica, podem ser encontradas icterícia, febre, hemoglobinemia e hemoglobinúria
(FIGHERA, 2001; LOPES et al, 2007).
3.7.1 Classificação
A fim de auxiliar no diagnóstico de diversas patologias a partir dos resultados obtidos
no hemograma, incluindo índices hematimétricos e alterações morfológicas de eritrócitos,
foram criadas várias formas de classificação para os tipos de anemia. Cada uma dessas
oferece vantagens em algum aspecto. A anemia pode ser classificada através da patogênese
ou etiologia. De acordo com isso, existem três mecanismos que podem ser responsáveis:
deficiência de fatores, defeito na produção medular ou depleção (perda, destruição ou
sequestro).
Ferro Deficiência de fatores Ácido fólico Vitamina B12 Fibrose Neoplasia (primária ou metastática) Defeito produção medular Hipoplasia Substâncias químicas Anemia Infecção grave Supressão tóxica Doença renal crônica Metástase generalizada Hipotireoidismo Aguda Hemorragia Crônica Depleção Hemólise Anemias hemolíticas Sequestro Hiperesplenismo Figura 5. Organograma da classificação de anemias por patogênese (Fonte: adaptado de RAVEL (1997)
32
Existe ainda outra classificação baseada na morfologia dos eritrócitos, realizada
através dos índices de Wintrobe (VCM e CHCM) e da observação microscópica do
esfregaço de sangue periférico. Através disso, a anemia pode ser classificada como
microcítica, normocítica ou macrocítica (analisando o volume celular) e como hipocrômica
ou normocrômica (avaliando a quantidade média de hemoglobina dos eritrócitos). Essa
forma de classificação (Tabela 5) é a mais aceita mundialmente (FIGHERA, 2001).
Tabela 5. Classificação de anemias através de análise morfológica eritrocitária (adaptado de JAIN, 1993 e FIGHERA, 2001).
Tipos Alguns exemplos Normocítica / Normocrômica
Anemias hipoproliferativas (deficiências nutricionais), anemia da doença crônica, desordens endócrinas (hipotireoidismo e hipoadrenocorticismo no cão), hepatopatia; anemia aplásica, hipoplásica ou mieloptise
Normocítica / Hipocrômica
Fase inicial de deficiência de ferro, fase inicial de hemorragia crônica
Macrocítica/Normocrômica
Deficiência de vitamina B12 e folato, deficiência de cobalto em ruminantes, eritrogênese defeituosa (macrocitose do Poodle)
Macrocítica / Hipocrômica
Hemorragia aguda, anemia hemolítica (com resposta regenerativa)
Microcítica/ Normocrômica
Deficiência de ferro em progressão
Microcítica/ Hipocrômica
Deficiências de ferro e cobre, hemorragia crônica, anemia da doença crônica, distúrbios no metabolismo das porfirinas ou da globina
Outra forma de classificação é através do nível de regeneração ou de resposta
medular. As anemias podem ser enquadradas como regenerativas ou arregenerativas. A
anemia que não é causada por disfunções da medula óssea deve mostrar evidências de
eritropoiese, sendo responsiva ou regenerativa (TVEDTEN, 2010).
Esse enquadramento é realizado de acordo com quantidade de reticulócitos
(reticulocitose), além de outros achados, como anisocitose, policromasia,
metarrubricitemia, presença de pontilhado basofílico e número significativo de corpúsculos
de Howell-Jolly, elementos que revelam regeneração. No entanto, somente após 2 a 3 dias
do desenvolvimento da anemia para verificar-se uma resposta regenerativa (FIGHERA,
33
2001, LOPES et. al, 2007). A Tabela 6 traz a relação de algumas patologias associadas a
essa classificação.
Tabela 6. Classificação de anemias por regeneração medular (adaptado de LOPES et al., 2007).
Tipos de anemia Algumas causas Não regenerativa Leucemias, neoplasias crônicas e/ou
metastáticas, doença renal crônica, erlichiose, hipoadrenocorticismo, hiperestrogenismo, linfossarcoma, dentre outros.
Regenerativa Por perda sanguínea: traumas ou cirurgias, coagulação intravascular disseminada, intoxicação por dicumarínicos. Por hemólise: hemoparasitas (como Babesia spp.), anemia hemolítica auto-imune, reação transfusional, dentre outros.
34
4 RESULTADOS
4.1 Artigo
4.1.1 Utilização de parâmetros hematológicos como ferramenta diagnóstica em uma população de cães anêmicos atendidos no LACVet–UFRGS
Ana Elize Ribeiro D’Avila1, Luciana de Almeida Lacerda2, Félix Hilario Diaz González3
1Laboratório de Análises Clínicas Veterinárias, Universidade Federal do Rio Grande do
Sul; 2Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias, Universidade Federal do Rio
Grande do Sul; 3Departamento de Patologia Clínica Veterinária, Faculdade de Veterinária,
Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
4.1.2 Resumo
A anemia é um quadro patológico que conhecidamente leva a piora de sinais clínicos e
sobrevida em animais. Para tanto, é um achado que necessita de elucidação etiopatogênica.
O objetivo deste estudo foi avaliar a prevalência da anemia em cães, através de alguns
parâmetros hematológicos utlizados na prática laboratorial. Amostras de sangue de 48
pacientes anêmicos (grupo anêmico) e de 90 pacientes saudáveis (grupo controle) foram
coletadas para avaliar parâmetros hematológicos, como contagem de eritrócitos,
hemoglobina, hematócrito, VCM, CHCM, RDW de ambos os grupos. Do grupo anêmico,
também foi realizada contagem de reticulócitos através de três formas de cálculo (contagem
absoluta, contagem corrigida e IPR) para classificação de anemias. Dos cães anêmicos, 20
apresentavam anemia leve, 16 moderada, 8 severa e 4 muito severa. Verificou-se que houve
correlação estatística positiva somente entre as variáveis contagem corrigida de
reticulócitos e IPR e contagem absoluta de reticulócitos e IPR. Constatou-se relação
moderada, direta e estatisticamente significativa entre o número de cruzes de policromasia
e anisocitose (avaliação semiquantitativa) com o IPR. Não houve correlação estatística
entre VCM e RDW. Dos 48 pacientes, 13 pacientes vieram a óbito e 5 foram eutanasiados.
35
Com relação ao tempo de sobrevida após diagnóstico veterinário, verifica-se que 62,5% dos
cães se recuperaram das causas que levaram a anemia, 14,6% morreram em até 1 semana
após diagnóstico, 16,7% em até 1 mês e 6,2% em até 2 meses. Dos 48 pacientes anêmicos,
16,7% dos pacientes apresentaram anemia regenerativa, 43,7% não regenerativa e 39,6%
regenerativa modificada. Anemia por deficiência de ferro e da doença crônica foram os
tipos mais frequentes. Através do presente estudo, verificou-se que a contagem manual de
reticulócitos foi uma boa ferramenta para o diagnóstico e classificação de anemias, desde
que seja realizada de acordo com normas estabelecidas. A análise semiquantitativa de
anisocitose e policromasia demonstrou apresentar correlação com o nível de reticulócitos,
servindo como parâmetro para nortear o diagnóstico do clínico veterinário, não substituindo
a contagem de reticulócitos. O IPR demonstrou ser um bom índice e aplicável para a
medicina veterinária, principalmente para a espécie canina.
Palavras-chave: cães, anemia, reticulócitos, RDW, IPR.
4.1.3 Abstract
Anemia is a pathological situation that knowingly leads to worsening of clinical signs and
survival in animals. Thus, there is a finding that needs elucidating etiopathogenesis. The
aim of this study was to evaluate the prevalence of anemia in dogs through several
hematological parameters used in laboratory practice. Blood samples of 48 patients with
anemia (anemic group) and 90 healthy patients (control group) were collected for evaluate
hematological parameters such as erythrocyte counting, hemoglobin, hematocrit, MCV,
MCHC, RDW of both groups. For the anemic group, it was also performed reticulocyte
count in three ways of calculations (absolute count, corrected count and RPI). Of the 48
anemic dogs, 20 had mild anemia, 16 moderate, 8 severe and very severe 4 patients. There
was positive statistical correlation between variables corrected reticulocyte count and RPI
and absolute reticulocyte count and RPI. There was moderate, direct and significant
association between semiquantitative evaluation of polychromasia and anisocytosis with
RPI. There was no statistical correlation between MCV and RDW in both groups. Of the 48
patients, 13 patients eventually died and five were euthanasied. About the survival time
36
after diagnosis, 62.5% of dogs have recovered from the causes that led to anemia, 14.6%
died within 1 week after diagnosis, 16.7% within 1 month and 6.2% within 2 months. Of
the 48 anemic patients, 16.7% had regenerative anemia, 43.7% non-regenerative and 39.6%
regenerative modified. Iron deficiency anemia and chronic disease anemia were the most
frequent types. Through this study, it was found that the manual reticulocyte count is a
good tool for the diagnosis and classification of anemias, if carried out according to
established standards. Semiquantitative analysis of anisocytosis and polychromasia showed
correlation with the level of reticulocytes, and serves as a baseline to guide the clinician's
diagnosis, without replacing the reticulocyte count. The RPI has proved to be a good index
for veterinary medicine, especially for the dog.
Key-words: dogs, anemia, reticulocytes, RDW, RPI.
4.1.4 Introdução
O termo anemia indica um processo patológico que se caracteriza pela diminuição de
eritrócitos e/ou hemoglobina de um indivíduo, sendo essa diminuição acompanhada ou não
do decréscimo no hematócrito. Na maior parte dos casos, os distúrbios anêmicos não são
primários, e sim secundários a outras patologias, devendo-se então elucidar as causas
dessas (FIGHERA, 2001; JAIN, 1993).
Os distúrbios anêmicos são a principal alteração hematológica descrita em animais e
em seres humanos. A anemia pode ser considerada uma síndrome em função de ser
originada por várias causas. Por apresentar alta prevalência, principalmente em função de
anemia ferropênica em humanos, é considerada um problema mundial de saúde pública
(FIGHERA, 2001; FAILACE, 2009).
Algumas estatísticas apontam que mais de 10% dos pacientes humanos internados em
hospitais são anêmicos (FAILACE, 2009). Em um estudo retrospectivo realizado na
Nigéria, verificou-se que de 5.278 cães atendidos, cerca de 40% (2,139) apresentavam
anemia, com hematócrito variando de 7 a 36% (USEH et al., 2003). Em outro estudo
realizado nos Estados Unidos, de 203.939 cães atendidos em laboratórios veterinários,
9,3% apresentavam anemia (DeNICOLA et al., 2006).
37
Segundo Couto (2003), as principais manifestações clínicas de anemia são mucosas
pálidas ou ictéricas (no caso de destruição de eritrócitos), letargia, diminuição da atividade,
intolerância ao exercício. Esses sinais podem ser agudos ou crônicos e podem variar de
acordo com a severidade do quadro. Taquicardia ou aumento no batimento pré-cordial
também podem ocorrer como mudança adaptativa à anemia.
Como forma de orientação para indicar o diagnóstico e tratamento terapêutico mais
adequado, foram criadas várias classificações para anemia, sendo a mais comumente
empregada aquela com base na regeneração através de contagem de reticulócitos
(DeNICOLA et al., 2006).
A contagem de reticulócitos no sangue periférico é uma determinação valiosa no
laboratório de hematologia por ser um indicador sensível da atividade eritropoiética da
medula óssea, tanto no diagnóstico e acompanhamento de anemias quanto no
monitoramento de terapias e de transplante de medula óssea (PEREIRA et al., 2008;
LEONART, 2009; SIMIONATTO et al., 2009b).
O método padrão de contagem de reticulócitos utiliza microscopia óptica, sendo que a
avaliação de seus resultados permite que se façam escolhas adequadas em relação aos
exames laboratoriais específicos para o diagnóstico das anemias em geral. Porém, esta
técnica tem sido acusada de tediosa e de apresentar baixa acurácia e reprodutibilidade. A
precisão e a acurácia deste método, no entanto, podem ser asseguradas quando realizado
dentro de critérios técnicos rigorasamente estabelecidos, como os preconizados pelo
National Comittee for Clinical Laboratory Standards e International Commitee for
Standardization in Haematology (H44-A, 1997; LEONART, 2009).
Além da contagem de reticulócitos, outros parâmetros hematológicos são
fundamentais para avaliação do eritrograma, dentre eles estão o hematócrito, a
hemoglobina, o Volume Corpuscular Médio (VCM), a Concentração Hemoglobiníca
Corpuscular Média (CHCM), e o RDW (do inglês, Red Cell Distribution Width, ou
amplitude de distribuição dos eritrócitos) (FLAIBAN & BALARIN, 2004).
O objetivo deste ensaio foi comparar resultados de alguns parâmetros hematológicos
(VCM, CHCM, RDW e avaliação de níveis de anisocitose e policromasia), além da
determinação dos níveis de reticulócitos através da contagem absoluta, contagem corrigida
e Índice de Produção de Reticulócitos (IPR) em cães saudáveis e em cães com anemia.
38
4.1.5 Materiais e métodos
Foram utilizadas amostras de 48 cães anêmicos (29 fêmeas e 19 machos), entre 10
meses e 16 anos de idade, de diversas raças, machos e fêmeas. As amostras de sangue
foram coletadas das veias jugular externa ou cefálica através de sistema a vácuo, utilizando
como anticoagulante o ácido etilenodiaminotetracético de sódio (EDTA-K2), na
concentração de 3,6 mg para 2 mL de sangue e 5,4 mg para 3mL de sangue (Vacutainer,
BD Diagnostics, São Paulo, Brasil).
Como grupo controle, foram coletadas amostras de 90 animais saudáveis (61 fêmeas
e 29 machos) de várias raças, com idades variando de 11 meses a 10 anos. Após exame
clínico, a coleta de sangue era realizada da veia jugular externa, preferencialmente, ou da
veia cefálica, utilizando tubos a vácuo de 2 ou de 3 mL contendo EDTA-K2.
As amostras de sangue foram processadas imediatamente após a coleta no contador
hematológico ABC Vet (HORIBA ABX Diagnostics, São Paulo, Brasil) para obtenção de
contagem de leucócitos, contagem de eritrócitos, RDW e dosagem de hemoglobina. O
aparelho foi calibrado de acordo com as instruções do fabricante, utilizando amostras
controle (ABX Minotrol 16, HORIBA ABX Diagnostics, São Paulo, Brasil). Diariamente
essas amostras controle eram testadas no aparelho, utilizando com base os valores de
referência do kit. O hematócrito foi obtido pela técnica de micro-hematócrito descrita por
Kerr (2003) utilizando microcentrífuga modelo 1-15 (SIGMA, Osterode, Alemanha), com
processamento de 5 minutos a 2000 rpm. VCM e CHCM foram calculados pela fórmula
descrita por Lassen e Weiser (2006).
A determinação do número de reticulócitos foi realizada por técnica descrita por
Harvey (2001) e H44-A (1997), que indica uso de corante novo azul de metileno na
concentração de 0,5%, utilizando proporções iguais de corante para amostra. Foram
utilizados 300 µL de amostra/corante e foi incubado por 15 minutos em banho-maria a
37ºC. Após, foram realizados esfregaços (cerca de 3 por amostra), onde uma lâmina era
contra-corada com Panótico (Instant-Prov®, NewProv, Pinhais, Brasil) para melhor
identificação de células. Foram contados 1000 eritrócitos, entre reticulócitos e células
maduras em objetiva de imersão (100x). Para amostras com baixa quantidade de
reticulócitos, realizou-se contagem de 3.000 células para averiguação. Foi realizada
39
correção da contagem de reticulócitos pelo grau de anemia através de fórmula descrita por
Tvedten (2010), contagem absoluta de reticulócitos através de fórmula obtida de Lassen e
Weiser (2006) e Índice de Produção de Reticulócitos (IPR) por fórmula e classificação
proposta por Day et al. (2000). Como controle de qualidade da contagem manual de
reticulócitos, foram utilizadas amostras controle com níveis de reticulócitos em quantidade
baixa, média e alta previamente conhecidos e fornecidos pelo fabricante (BD Retic-Count
Control, BD Diagnostics, San Jose, Estados Unidos). As amostras controle foram
processadas de maneira similar às amostras dos pacientes anêmicos, realizando-se
esfregaço após período de incubação com corante supra-vital.
Anisocitose, policromasia e hipocromia, além de alterações morfológicas de
eritrócitos foram classificadas de acordo com Harvey (2001), através de avaliação
microscópica do esfregaço sanguíneo.
Na análise estatística, foram descritas as variáveis quantitativas pela média e o desvio
padrão quando a sua distribuição foi simétrica ou pela mediana e intervalo interquartil
quando assimétrica. A comparação de variáveis com distribuição simétrica entre duas
categorias foi realizada pelo teste t de Student para amostras independentes e entre três ou
mais categorias pelo teste ANOVA. As correlações entre variáveis quantitativas com
distribuição simétrica foram realizadas pelo coeficiente de correlação de Pearson, e para as
com distribuição assimétrica pelo coeficiente de correlação de Spearman. Foi considerado
um nível de significância de 5%.
4.1.6 Resultados
As 48 amostras foram agrupadas em graus de anemia de acordo com Tvedten (2010)
em anemia leve (hematócrito entre 30-36 %), moderada (20-29%), severa (13-19%) e muito
severa (menor que 13%).
Dos 48 pacientes, 20 apresentavam anemia leve, 16, moderada, 8 severa e 4 muito
severa. Observou-se a existência de elementos multifatoriais desencadeando o quadro
anêmico, como ectoparasitose concomitante com neoplasia, por exemplo. Do total, 17
animais apresentavam mais de uma patologia (Tabela 1).
40
Tabela 1. Idade (anos), sexo, raça e suspeita diagnóstica de 48 pacientes anêmicos atendidos no LACVet –UFRGS. Paciente Idade Sexo Raça Suspeita diagnóstica 1 12 F Pinscher Hemorragia TGI 2 8 M São Bernardo Sem diagnóstico 3 6 F Daschund Sem diagnóstico 4 5 M Dogue Alemão Úlceras gástricas 5 12 F SRD Colangiocarcinoma hepático com metástase pulmonar/hipotireoidismo 6 9 F SRD Piometra/neoplasia mamária 7 10 F SRD Piometra/cardiopatia 8 7,5 M Rottweiler IRC/cistite/ metástase pulmonar (osteossarcoma) 9 13 F Fox Paniculite cervical, puliciose intensa, endocardiose 10 14 F Beagle Colangiocarcinoma hepático 11 14 F Collie Tumor hepático/esplênico não identificado, intoxicação paracetamol 12 0,83 F SRD Coagulopatia 13 1 F SRD Sem diagnóstico 14 10 F Rottweiler Sem diagnóstico 15 13 F Cocker Sem diagnóstico 16 13 M SRD Linfoma 17 8 M Akita Hepatite/colecistite/linfoma 18 11 F Poodle Linfoma linfocítico 19 2 M Fox Hemorragia por trauma 20 6 M SRD Linfoma histiocítico e metástase pulmonar 21 2 F SRD Colecistite/hepatite/hemocitozoários (não comprovado) 22 12 F SRD Neoplasia mamária 23 7 F SRD Pneumonia/ hemocitozoários (não comprovado) 24 14 F SRD Leucemia linfocítica crônica 25 4 M Pinscher Trauma inguinal por mordedura 26 13 M Cocker Inglês Gastrite, cardiopatia 27 12 M Fox Terrier ICC 28 10 F SRD Sem diagnóstico 29 8 M SRD Hérnia perineal, necrose bexiga, míiase prepúcio 30 10 F Beagle Colangiocarcinoma hepático 31 5 F SRD Carcinoma mamário, piometra 32 14 M SRD Hepatite crônica/cirrose/ascite 33 10 M Weimaraner Linfoma 34 11 F Fila Lipossarcoma intra-abdominal (metastático) 35 15 M Daschund Mastocitoma grau III 36 3 M Pittbull Leptospirose 37 12 F Pinscher Corpo estranho esofágico 38 3 F Daschund Hepatopatia e hérnia de disco 39 7 M Pittbull Corpo estranho intestinal 40 5 F Poodle Piometra 41 8 M SRD Sem diagnóstico 42 16 F SRD Piometra, IRA, neoplasia baço 43 11 F Poodle Hemorragia TGI, gastrite 44 8 F Boxer Hemangiossarcoma de átrio direito 45 5 F Labrador Trombocitopenia imunomediada 46 9 F Pinscher Rim policístico, hemorragia aguda pós-cirúrgica 47 11 M SRD Hemocitozoários (Rangelia vitalii) 48 13 M Bichon Frisé Leucemia linfocítica crônica
M = macho; F = fêmea; SRD = sem raça definida; TGI = Trato gastrointestinal; IRC = Insuficiência renal crônica; IRA = Insuficiência renal aguda; ICC= Insuficiência cardíaca congestiva
41
As suspeitas clínicas foram confirmadas por exames complementares, como exames
laboratoriais (hemograma, exames bioquímicos, sorologia, citologia, histopatologia, PCR),
ultrassonografia e radiografia. No entanto, em 7 casos não foi possível identificar a
patologia que levou ao quadro de anemia.
Das causas de anemia leve, podem-se citar anemia da doença crônica, coagulopatias,
anemia por deficiência de ferro e anemia da doença renal. Das causas de anemia moderada,
verificou-se a presença de doenças endócrinas (como hipotireoidismo), anemia da doença
crônica, hemorragia aguda, anemia por deficiência de ferro e doenças auto-imunes
(trombocitopenia imunomediada). Das causas levantadas para pacientes com anemia
severa, relata-se a presença de anemia por deficiência de ferro, anemia da doença crônica,
intoxicação por medicamentos e hemoparasitose. Por fim, algumas causas analisadas para
anemia muito severa, foram por infecções bacterianas (como leptospirose) e hemorragia
aguda.
Como esperado, houve diferença significativa entre o grupo de pacientes anêmicos
(grupo 1) e o grupo controle (grupo 2) (Tabela 2). Os cães do grupo 1 apresentaram todos
os parâmetros do eritrograma mais diminuídos que os do grupo 2, com diferença
significativa a 99% de confiança (P< 0,001) na maioria das variáveis. A diferença do VCM
foi significativa a 95% de confiança (P< 0,023).
Os parâmetros encontrados para eritrócitos, hematócrito, hemoglobina, VCM,
CHCM, plaquetas e leucometria total observados para o grupo controle estão de acordo
com a literatura para a espécie (JAIN, 1993; RIZZI et al., 2010). Os valores médios de
hematócrito, VCM, CHCM e RDW diferiram dos encontrados por Neiger et al. (2002), que
relataram 46%, 68,8 fL, 33,9% e 15,6%, para os respectivos parâmetros. No entanto,
utilizavam um analisador hematológico diferente, impedindo maiores comparações.
Tabela 2. Variáveis descritas pela média e desvio padrão comparadas pelo teste t de Student para amostras independentes.
Variável Grupo 1 (anêmico) N = 48
Grupo 2 (controle) N= 90
P
Eritrócitos (x106/uL) 3,5 ± 1,3 7,4 ± 0,6 < 0,001 Hemoglobina (g/dL) 7,9 ± 2,7 17,4 ± 1,8 < 0,001 Hematócrito (%) 25,4 ± 8,1 52,1 ± 4,9 < 0,001 VCM (fL) 73,9 ± 10,2 70,4 ± 2,8 < 0,023 CHCM (%) 30,6 ± 2,5 33,5 ± 1,0 < 0,001 RDW (%) 16,1 ± 2,8 14,1 ± 0,6 < 0,001
42
Os valores médios e a amplitude de variação (mínimo e máximo) dos parâmetros
hematológicos hematócrito, contagem de eritrócitos, hemoglobina, VCM, CHCM, RDW e
mediana (interquartil 25 e 75) da contagem de reticulócitos absoluta, corrigida e IPR dos 48
cães anêmicos, em relação aos valores de referência, estão apresentados na Tabela 3.
Verificou-se que o valor de mediana da contagem corrigida de reticulócitos está acima dos
valores de referência, indicando reticulocitose. No entanto, os valores da contagem absoluta
e do IPR indicam que uma grande parte dos pacientes apresentava anemia não regenerativa.
75% dos cães anêmicos apresentavam 1,98 como valor de IPR.
Tabela 3. Valores mínimos, máximos, média, desvio padrão e mediana (intervalo interquartil) de alguns parâmetros hematológicos de 48 pacientes anêmicos.
Parâmetros Mínimo Máximo Média ± desvio padrão
Mediana (P25;P75)
Valores de referência
Eritrócitos (céls x106/uL)
0,85 5,48 3,5 ± 1,3 - 5,5 – 8,5a
Hemoglobina (g/dL)
2,2 11,5 7,9 ± 2,7 - 12-18a
Hematócrito (%) 8 36 25,4 ± 8,1 - 37-55a VCM (fL) 50,00 105,89 73,9 ± 10,2 - 60-77a CHCM (%) 23,63 34,84 30,6 ± 2,5 - 32-36a RDW (%) 12,3 24,2 16,1 ± 2,8 - 14-17b Ret. corrigida (%) 0,068 27,87 - 2,02 (0,36-3,26) < 1,5a Ret. absoluta (céls/uL)
4.480 1293.600 - 40.000 (13.000-73.000)
< 60.000c
IPR 0,04 18,58 - 1,05 (0,16-1,98) < 2d a – JAIN, 1993; b – valores fornecidos pelo manual do fabricante do contador hematológico; c – LASSEN & WEISER, 2006; d – DAY et al, 2000. Ret. corrigida = contagem corrigida de reticulócitos; Ret. absoluta = contagem absoluta de reticulócitos
Tabela 4. Coeficiente de correlação de alguns parâmetros
Parâmetros Coeficiente de correlação P RDW x VCM - 0,091 0,581 RDW x IPR 0,274 0,091 Ret. corrigida x IPR 0,964 < 0,001 Ret. absoluta x IPR 0,954 < 0,001 Policromasia x IPR 0,411 0,004 Anisocitose x IPR 0,438 0,002 Ret. corrigida = contagem corrigida de reticulócitos; Ret. absoluta = contagem absoluta de reticulócitos; Policromasia = análise semiquantitativa de policromasia; Anisocitose = análise semiquantitativa de anisocitose Parâmetro verificado através do coeficiente de correlação de Pearson para variáveis simétricas. Parâmetro verificado através do coeficiente de correlação de Spearman para variáveis assimétricas.
43
Através dos dados da tabela 4, verifica-se que houve correlação positiva somente
entre as variáveis contagem corrigida de reticulócitos e IPR e contagem absoluta de
reticulócitos e IPR, além de relação moderada, direta e estatisticamente significativa entre o
número de cruzes de policromasia e anisocitose com o IPR. As Figuras 1 e 2 demonstram
gráficos de correlação entre alguns parâmetros citados na Tabela 4.
Figura 1. Gráfico que demonstra a ausência de correlação significativa entre RDW (%) e VCM (fL) e RDW (%) e IPR em amostras de sangue de 48 cães anêmicos atendidos no LACVet – UFRGS, 2010.
44
Figura 2. Gráfico que demonstra correlação direta e estatisticamente significativa entre contagem
corrigida de reticulócitos e IPR e contagem absoluta de reticulócitos e IPR em amostras de sangue de 48 cães anêmicos atendidos no LACVet – UFRGS, 2010.
Com relação à comparação entre variáveis RDW e VCM, verificou-se não haver
correlação significativa em ambos os grupos, diferente do que é citado pela literatura
(ROBERTS e El BADAWI, 1985). No entanto, em função do VCM representar um valor
médio, e de, muitas vezes, o RDW, apresentar aumento ou diminuição antes desse,
justifica-se esse resultado.
Também não houve correlação significativa entre RDW e IPR. Como observado, os
tipos de anemia mais prevalentes nesse grupo de cães foram a anemia por doença crônica e
anemia por deficiência de ferro, assim como é verificado em pacientes humanos
(BARBOSA et al, 2006). A presença de populações macrocíticas (como os reticulócitos) e
45
de células microcíticas pode gerar RDW dentro dos valores de referência, justificando essa
falta de relação com o IPR.
Já a contagem absoluta e corrigida de reticulócitos apresentou alta correlação com o
IPR, comprovando a validade desse índice para a classificação dos tipos de anemia, da
mesma forma que ocorre na medicina humana (FERREIRA et al., 2009).
A análise semiquantitativa de anisocitose e policromasia realizada através do
esfregaço sanguíneo demonstrou apresentar significativa relação com o IPR. Embora pouco
sensível, específica e dependente de vários fatores, como: ótima qualidade do esfregaço e
da coloração empregada além de laboratorista treinado, ainda é uma boa ferramenta que
auxilia o veterinário com relação à presença de resposta regenerativa medular do paciente.
Contudo, vale ressaltar que não substitui a contagem de reticulócitos.
Com relação ao grau de severidade da anemia e a idade dos pacientes do grupo
anêmico, embora se verifique que animais com anemia considerada leve eram mais velhos
que animais com anemia muito severa, não houve diferença estatística significativa entre
classes.
Dos 48 pacientes, 13 pacientes vieram a óbito e 5 foram eutanasiados. Com relação
ao tempo de sobrevida após diagnóstico veterinário, verificou-se que 62,5 % dos cães se
recuperaram das causas que levaram a anemia, 14,6% morreram em até 1 semana após
diagnóstico, 16,7% em até 1 mês e 6,2 % em até 2 meses.
Dos 48 pacientes anêmicos, 8 (16,7%) dos pacientes apresentaram anemia
regenerativa, 21 (43,7%) não regenerativa e 19 (39,6%) semiregenerativa ou regenerativa
modificada de acordo com classificação proposta por Day et al. (2000).
Com relação ao período de sobrevida dos pacientes, pode-se afirmar que a maioria
dos cães apresentou melhora do quadro de anemia. Das patologias que levaram ao óbito ou
eutanásia sugerida pelo veterinário responsável, as mais frequentes foram insuficiência
renal aguda/crônica e neoplasias com ou sem metástase em órgãos (como osteossarcoma e
linfoma). Leptospirose, hemocitozooses, trombocitopenia imunomediada e hemorragia
aguda foram doenças que comprometeram o estado de recuperação dos cães anêmicos,
gerando mortes.
46
4.1.7 Discussão
Através dos resultados obtidos, verifica-se que grande porcentagem dos cães
anêmicos eram pacientes oncológicos (35,42%). Diversos estudos corroboram a hipótese
que a anemia é um fator que determina pior prognóstico para recuperação ou
prolongamento do tempo de sobrevida em pacientes com neoplasias (WELLER, 1985;
ABBO & LUCROY, 2007; MILLER et al., 2009).
Com relação aos tipos de anemia, as principais causas de anemia regenerativa
estavam relacionadas com hemorragia/hemólise, estando de acordo com a literatura (JAIN,
1993; TVEDTEN, 2010). Anemia da doença renal e anemias causadas por deficiência de
ferro e da doença crônica foram os principais fatores que levaram a anemias não
regenerativas.
Nos casos de anemias semiregenerativas ou regenerativas modificadas, anemias por
deficiência de ferro e da doença crônica também estavam relacionadas. Deficiência de
vitamina B12 e mielodisplasia podem estar envolvidas em uma pequena parte dos casos, no
entanto, alterações na medula óssea ou deficiência vitamínica não puderam ser confirmadas
em função de custos para proprietário.
Como observado, grande parte dos pacientes apresentavam anemia ferropênica. A
prevalência de anemia por deficiência de ferro é muito elevada, tanto em medicina
veterinária como na humana, constituindo-se num problema de saúde pública. Acredita-se
que 20% da população mundial não tenha reservas de ferro extra-hemoglobínico no
organismo, apesar da excreção de ferro ser insignificante (FAILACE, 2009).
A dosagem de ferro sérico, ferritina sérica e capacidade de ligação do ferro total
(TIBC), além de punção de medula óssea, poderiam ter sido realizados neste estudo para
comprovação da deficiência de ferro e diferenciação entre anemia de doença crônica e
deficiência de ferro. Podem ser utilizadas várias combinações de exames e de diferentes
parâmetros hematológicos e bioquímicos para esse diagnóstico diferencial. Contudo, em
função do hemograma ser o mais utilizado para isso na rotina veterinária, dado a facilidade
de acesso à população, simplicidade de técnica, custo baixo e capacidade de fornecer várias
informações, como os valores de hemoglobina, hematócrito, contagem de eritrócitos e
47
determinação dos índices hematimétricos (VCM, CHCM e RDW), importantes para a
classificação das anemias, justifica-se a ausência de dados extras (MENEZES et al., 2010).
IPR é um índice muito utilizado em medicina humana para classificação dos tipos de
anemia. Através dos resultados desse estudo, pode-se comprovar como uma boa ferramenta
diagnóstica para a área veterinária, principalmente para a espécie canina.
A análise semiquantitativa de anisocitose e policromasia demonstrou ser útil com
relação a sugerir a presença ou não de reticulócitos na circulação. No entanto, não substitui
a contagem de reticulócitos, em função de ser um método de estimativa.
A utilização de diferentes parâmetros hematológicos para a classificação dos tipos de
anemia comprovou ser fundamental para elucidar as várias patologias primárias envolvidas.
Conforme descrito neste estudo, verifica-se que uso de vários exames complementares é a
chave para desvendar o diagnóstico definitivo. Não existe um exame por si só que consiga
demonstrar de forma completa o estado geral do paciente.
4.1.8 Conclusões
De todos os exames diagnósticos, o hemograma pode ser considerado um dos mais
valiosos em avaliar o estado geral de saúde de um paciente. Em sua composição,
encontram-se alguns parâmetros que são importantes para a classificação das anemias. A
definição desses e correta interpretação das alterações ocasionadas pelos quadros anêmicos
ajuda no direcionamento dos diversos tratamentos terapêuticos em pequenos animais.
Alguns parâmetros hematológicos são ainda pouco conhecidos ou empregados na
rotina clínico-laboratorial dos médicos veterinários, como é o caso do RDW e do IPR. O
RDW é um coeficiente de anisocitose ou de distribuição do volume dos eritrócitos. Já o IPR
é um índice empregado em medicina humana para classificação dos tipos de anemia.
Através desse estudo, pode-se comprovar que ambos servem como uma boa ferramenta
diagnóstica para a área veterinária, principalmente para a espécie canina.
A contagem de reticulócitos ainda hoje é um parâmetro necessário para verificar
níveis de resposta medular frente a quadros anêmicos. Embora cada vez mais os
laboratórios estejam se modernizando e adquirindo equipamentos hematológicos
48
automáticos para contagem de células - com capacidade para contagem de reticulócitos -
devido aos custos elevados de manutenção dos reagentes exigidos, muitos laboratórios
ainda preferem o método manual e o uso de corantes supra-vitais. No entanto, cada
laboratório deve criar um procedimento operacional padrão para realização da contagem
manual de reticulócitos, a fim de gerar mais acurácia e reproduzir fidedignamente o estado
do paciente analisado.
4.1.8 Referências ABBO, A.H.; LUCROY, M.D. Assessment of anemia as an independent predictor of
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52
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS
A anemia é uma síndrome e, na maioria das vezes, está sendo gerada por muitas
patologias concomitantes. De acordo com esse estudo, pode-se observar as dificuldades do
médico veterinário no momento de elucidar o diagnóstico definitivo. Vários tipos de
exames são necessários para tanto. No entanto, em função de custos de exames e do tempo
dispendido para realização desses, muitas vezes não existe colaboração ou interesse do
proprietário em desvendar a(s) causa(s) que levaram um paciente animal à anemia. Dessa
forma, a preocupação maior recai somente na recuperação dos sinais clínicos do animal
naquele momento, e não na prevenção de futuras rescidivas.
O IPR é um índice muito utilizado em medicina humana para classificação dos tipos
de anemia. Através desse estudo, pode-se comprovar que é uma boa ferramenta diagnóstica
para a área veterinária, principalmente para a espécie canina.
A contagem de reticulócitos ainda hoje é um parâmetro necessário para verificar
níveis de resposta medular frente a quadros anêmicos. Embora cada vez mais os
laboratórios estejam se modernizando e adquirindo equipamentos hematológicos
automáticos para contagem de células - com capacidade para contagem de reticulócitos -
devido aos custos elevados de manutenção dos reagentes exigidos, muitos laboratórios
ainda preferem o método manual e o uso de corantes supra-vitais. No entanto, cada
laboratório deve criar um procedimento operacional padrão para realização da contagem
manual de reticulócitos, a fim de gerar mais acurácia e reproduzir fidedignamente o estado
do paciente analisado.
A análise semiquantitativa de anisocitose e policromasia demonstrou ser útil com
relação a sugerir a presença ou não de reticulócitos na circulação. No entanto, não substitui
a contagem dos mesmos, em função de ser um método subjetivo de estimativa.
O presente trabalho servirá como base para um próximo estudo de comparação de
contagem de reticulócitos por método manual e por método automático, utilizando
citometria de fluxo.
53
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