universidade federal do rio grande do norte … · contribuições ao conhecimento dos seus genomas...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SISTEMÁTICA E EVOLUÇÃO
REARRANJOS CROMOSSÔMICOS, EVOLUÇÃO GENÔMICA
E DIVERSIFICAÇÃO CARIOTÍPICA EM TETRAODONTIFORMES
________________________________________________
Dissertação de Mestrado
Natal/RN, março de 2016
JULIANA GALVÃO BEZERRA
JULIANA GALVÃO BEZERRA
REARRANJOS CROMOSSÔMICOS, EVOLUÇÃO GENÔMICA E DIVERSIFICAÇÃO
CARIOTÍPICA EM TETRAODONTIFORMES
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Sistemática e Evolução/PPGSE da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como
parte dos requisitos para a obtenção do título de mestre
em Sistemática e Evolução.
Orientador: Prof. Dr. Wagner Franco Molina
Co-Orientador: Prof. Dr. Luiz Antônio Carlos Bertollo
Natal-RN
2016
Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro de
Biociências
Bezerra, Juliana Galvão.
Rearranjos cromossômicos, evolução genômica e diversificação
cariotípica em tetraodontiformes / Juliana Galvão Bezerra. – Natal, RN,
2016.
60 f.: il.
Orientador: Prof. Dr. Wagner Franco Molina.
Coorientador: Prof. Dr. Luiz Antônio Carlos Bertollo.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do
Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em
Sistemática e Evolução.
1. Tetraodontiformes. – Dissertação. 2. Evolução cromossômica. –
Dissertação. 3. Genomas compactos. – Dissertação. I. Molina, Wagner
Franco. II. Bertollo, Luiz Antônio Carlos. III. Universidade Federal do
Rio Grande do Norte. IV. Título.
RN/UF/BSE-CB CDU 597.556.37
JULIANA GALVÃO BEZERRA
REARRANJOS CROMOSSÔMICOS, EVOLUÇÃO GENÔMICA E
DIVERSIFICAÇÃO CARIOTÍPICA EM TETRAODONTIFORMES
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Sistemática e Evolução/PPGSE da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como
parte dos requisitos para a obtenção do título de mestre
em Sistemática e Evolução.
_________________________________________________
Dr. Paulo Augusto de Lima Filho
IFRN
_________________________________________________
Dr. Gideão Wagner Werneck Félix da Costa
UFRN
_________________________________________________
Dr. Wagner Franco Molina
(Presidente da Banca – UFRN)
“À minha mãe Ivanoska e familiares.”
AGRADECIMENTOS
À Deus, primeiramente, que permitiu que tudo isso acontecesse, аo longo dе minha
vida, pоr tеr mе dado saúde е força pаrа superar аs dificuldades. Agradeço a minha família,
aos meus tios e tias, aos primos e irmão, Igor. E todos aqueles que de alguma forma
compartilharam comigo os momentos difíceis e que foram imprescindíveis quando tudo
parecia impossível. Em especial a minha mãe, Ivanoska, heroína que mе deu apoio, incentivo
nаs horas de desânimo е cansaço.
Aos amigos de escola, de vida e graduação que torceram e torcem por mim, que
buscaram compreender o momento e entender que nem sempre foi possível estar presente.
Meus agradecimentos especiais à Karlla, Khadija e Roberta, amigas e companheiras de
estudo, em uma etapa em que a união foi o diferencial, obrigada meninas pelos dias e noites
de conversas e estudos.
Aos amigos do LGRM que contribuíram direta ou indiretamente com esta pesquisa:
Allyson, Amanda, Aparecida, Cristiane, Clóvis, Davi, Gideão, Inailson, Jeane, Josi, Karlla,
Leonardo Calado, Paulo, Rafael, Roberta, Rodrigo e Vanessa, que sempre me acolheram com
simpatia e sempre estiveram dispostos a ajudar! Obrigada pelas boas risadas!!
Ao professor Dr. Wagner Franco Molina pela oportunidade que me foi concedida e
que tem sido de grande crescimento não apenas acadêmico, mas também pessoal e
profissional.
À Universidade Federal do Rio Grande do Norte, seu corpo docente, direção е
administração pelo ambiente agradável е amigável que proporciona. Ao programa de Pós
Graduação em Sistemática e Evolução e todo seu corpo docente pelo suporte oferecido
durante o desenvolvimento deste trabalho.
Aos membros da banca de qualificação: Professor Doutor Paulo Augusto de Lima
Filho, Doutor Gideão Wagner Werneck Félix da Costa e ao Professor Doutor Carlos Alfredo
Galindo Blaha.
À CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) pela bolsa
concedida.
“Só se pode alcançar um grande êxito quando nos mantemos fiéis a nós mesmos.”
Friedrich Nietzsche
RESUMO
A ordem Tetraodontiformes se destaca por exibir características morfológicas e genéticas
bastante singulares, representando um dos principais ramos derivados da diversificação dos
teleósteos. Alguns dos seus grupos constituem os vertebrados com os genomas mais
compactos, qualificando-os como modelo de estudo da evolução do genoma. Esta
característica genômica parece ser o resultado de perdas evolutivas de DNA. Com vistas a
realizar comparações citogenômicas entre espécies de alguns grupos de Tetraodontiformes
foram realizadas análises citogenéticas nas espécies Cantherhines pullus e Monacanthus
chinensis (Monacanthidae), Sphoeroides testudineus (Tetraodontidae) e Melichthys niger
(Balistidae). As análises foram ralizadas utilizando as metodologias clássicas (coloração pelo
Giemsa, bandamento C, Ag-RONs), coloração com fluorocromos base-específicos e
mapeamento cromossômico através da hibridação in situ fluorescente (FISH) de sequências
ribossomais 18S e 5S e teloméricas. As espécies C. pullus e M. niger revelaram cariótipos
compostos de 40 cromossomos, todos acrocêntricos. Ambas possuem apenas um par de RONs
e heterocromatinas, em maior parte, pericentroméricas, contudo, o mapeamento de sequências
teloméricas em C. pullus mostrou marcações teloméricas intersticiais, resultado da dinâmica
de rearranjos cromossômicos que ocorre no grupo. Comparações citogenéticas entre as
espécies S. testudineus (2n=46; NF=74) e M. chinensis (2n=34; NF=34) revelaram cariótipos
díspares em relação ao número diploide e de braços cromossômicos, bem como quanto ao
diminuto tamanho dos cromossomos de S. testudineus, em relação ao grandes cromossomos
acrocêntricos presentes em M. chinensis. A marcante divergência no tamanho dos
cromossomos, estrutura cariotípica e distribuição de heterocromatina evidencia a elevada
dinâmica cromossômica e as múltiplas tendências carioevolutivas presentes em
Tetraodontiformes. Em vista do interesse sobre a evolução genômica na ordem, novas
contribuições ao conhecimento dos seus genomas e cariótipos são fornecidos e discutidos sob
perspectivas citogenômicas e evolutivas.
Palavras-chave: Tetraodontiformes, evolução cromossômica, rearranjos, sítios intersticiais,
genomas compactos.
ABSTRACT
Tetraodontiformes order is featured for exhibiting extremely singular morphological and
genetics characteristics, representing one of the main derivatives branches of the teleosts
diversification. Some of its groups constitute vertebrates with the most compact genomes,
qualifying them as a model of genome evolution studies. This genomic feature looks to be the
result of evolutionary DNA loss. In order to perform cytogenomic comparisons between
species of some Tetraodontiformes groups, cytogenetic analyzes were done on species
Cantherhines pullus and Monacanthus chinensis (Monacanthidae) Sphoeroides testudineus
(Tetraodontidae) and Melichthys niger (Balistidae). The analysis used classical methodologies
(Giemsa staining, C-banding, Ag-NORs), fluorochromes base-specific staining and
chromosomal mapping by fluorescence in situ hybridization (FISH) of telomeric and the
ribosomal sequences 18S and 5S. The species C. pullus and M. niger revealed karyotypes
composed of 40 chromosomes, all acrocentric. Both have only a single pair of NORs and
heterochromatin, mostly, pericentomeric, however, the telomeric sequences mapping in C.
pullus showed interstitial telomeric marks, result of the chromosomal rearrangements
dynamics wich occurrs in the group. Cytogenetic comparisons among the species S.
testudineus (2n = 46, NF = 74) and M. chinensis (2n = 34, NF = 34) revealed disparate
karyotypes in relation to diploid and chromosomal arm numbers, as well as the tiny size of S.
testudineus chromosomes in relation to the large acrocentric chromosomes present in M.
chinensis. The striking differences on the chromosomes size, karyotypical structure and
heterochromatin distribution evidences high chromosomal dynamics and multiple
karyoevolutive trends present in Tetraodontiformes. In face of the interest on the genomic
evolution in this Order, new contributions to the knowledge of their genomes and karyotypes
are provided and discussed over cytogenomic and evolutionary perspectives.
Keywords: Tetraodontiformes, evolution, rearrangements, interstitial sites, compact genomes.
LISTA DE FIGURAS E TABELA
INTRODUÇÃO
Figura 1
Figura 2
Tabela 1
Diversidade das famílias de Tetraodontiformes, dados obtidos de
Eschmeyer & Fong
(2016).....................................................................................................
Filogenia de Tetraodontiformes modificado de Santini et al. (2013b).
Destaque para as famílias do presente
estudo......................................................................................................
Revisão dos dados genômicos em Tetraodontiformes. Extraído e
modificado de Gregory (2016)...............................................................
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MATERIAL E MÉTODOS
Figura 3
(a) Pontos de coleta das espécies de Tetraodontiformes no Atlântico e
no Índico. (b) Em detalhe no litoral de Natal (RN), Salvador (BA),
litoral nordeste do Brasil, Arquipélago São Pedro e São Paulo
(ASPSP), Ilha da Trindade (IT). (c) Mar de Andaman (MA), Oceano
Índico........................................................................................................
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CAPÍTULO I
Figura 4
Figura 5
Cariótipos de Cantherhines pullus e Melichthys niger através de (a)
coloração convencional; (b) Bandamento C; (c) double-FISH com
sondas DNAr 18S (sinais vermelhos) e DNAr 5S (sinais verdes). Em
destaque respectivamente os pares organizadores nucleolares
evidenciando os sítios Ag-RONs e sob coloração MM/DAPI. Em (d)
padrão de distribuição de sondas (TTAGGG)n com destaque para os
pares portadores de sítios ITS.................................................................
Idiograma de referência dos quatro primeiros pares cromossômicos de
C. pullus, indicando a distribuição de heterocromatina e sequências
(TTAGGG)n nos mesmos. Os segmentos cromossômicos delimitados
entre os sítios teloméricos estão indicados em relação a faixas
diferenciais de tamanho observadas entre os cromossomos do
complemento da espécie........................................................................
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CAPÍTULO II
Figura 6 Cariótipos de S. testudineus e M. chinensis através de (a) coloração
convencional (em destaque os sítios Ag-RONs); (b) Bandamento C;
(c) double-FISH com sondas DNAr 18S (sinais vermelhos), e DNAr
5S (sinais verdes)...................................................................................
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SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO...........................................................................................
1.1 Diversidade e filogenia em Tetraodontiformes......................................
1.2 Distribuição e aspectos biológicos das famílias Monacanthidae,
Balistidae e Tetraodontidae..........................................................................
1.3 Aspectos genômicos dos Tetraodontiformes..........................................
1.4 Aspectos citogenéticos nos Tetraodontiformes......................................
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2. OBJETIVOS................................................................................................
2.2 Objetivo geral.........................................................................................
2.3 Objetivos específicos..............................................................................
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3. MATERIAL E MÉTODOS........................................................................
3.1 Material...................................................................................................
3.2 Métodos..................................................................................................
3.2.1 Estimulação mitótica.......................................................................
3.2.2 Obtenção de cromossomos mitóticos..............................................
3.2.3 Detecção das Regiões Organizadoras de Nucléolos (RONs)..........
3.2.4 Detecção de Heterocromatina (Banda-C).......................................
3.2.5 Coloração com fluorocromos base-específicos DAPI e MM.........
3.2.6 Hibridação in situ fluorescente – FISH...........................................
3.2.7 Análises cromossômicas.................................................................
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4. RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................
4.1 CAPÍTULO I.........................................................................................
Fusões em tandem na evolução do cariótipo de Balistidae e
Monacanthidae (Tetraodontiformes)
4.2 CAPÍTULO II........................................................................................
Aspectos da redução genômica em Tetraodontiformes inferida por dados
citogenéticos em Tetraodontidae e Monacanthidae
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5. CONCLUSÕES ........................................................................................... 55
6. REFERÊNCIAS.......................................................................................... 56
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1. INTRODUÇÃO
1.1 Diversidade e filogenia em Tetraodontiformes
Dentre a grande diversidade de peixes marinhos, a ordem Tetraodontiformes se
destaca por exibir características morfológicas e genéticas bastante singulares, representando
um dos principais ramos da diversificação dos teleósteos. A ordem é um dos grupos
sistematicamente mais derivados e contém a maior parte dos peixes atuais (Igarashi et al.,
2013). Quanto ao período de origem e diversificação, as ocorrências estratigráficas de
Tetraodontiformes datam do final do Cretáceo, com gêneros fósseis que se estendem para o
Plioceno e Pleistoceno (Sorbini & Tyler, 2004; Arcila et al., 2015).
As 440 espécies de Tetraodontiformes (Figura 1) (Eschmeyer & Fong, 2016), estão
divididas em dez famílias, sendo elas Triacanthodidae, Triacanthidae, Balistidae,
Monacanthidae, Ostraciidae, Triodontidae, Tetraodontidae, Diodontidae, Molidae e
Aracanidae (Figura 1), de ampla distribuição circuntropical, ocupando águas tropicais e
temperadas, marinhas e doces (Matsuura, 2014). Representando uma das radiações
morfológicas e ecológicas mais peculiares de peixes teleósteos (Santini et al., 2013b), a
ordem exibe notável diversidade de formas corporais e tamanhos, estruturas esqueléticas,
ecologia e tamanho do genoma (Brainerd et al., 2001; Santini & Tyler, 2003; Jaillon et al.,
2004;). Seus representantes, conhecidos popularmente como cangulos, peixes-porco e
baiacus, não apresentam comportamento migratório podendo permanecer em um mesmo local
durante todo o ano (Figueiredo & Menezes, 2000).
Vários aspectos da biologia evolutiva dos Tetraodontiformes são peculiares, como a
marcante diversidade de tamanho, com espécies medindo desde pouco mais de 2 cm
(Carinotetraodon travancoricus) até mais de 3m (o peixe lua, Mola mola) (Nelson, 2006;
Matsuura, 2014). Além disso, podem apresentar diversos mecanismos de defesa, como
mecanismos de inflação do corpo, placas ósseas e espinhos cutâneos (Brainerd et al., 2001). A
evolução esquelética neste grupo reflete uma forte tendência à redução, simplificação e/ou
perda de elementos do esqueleto (Winterbottom, 1974; Santini & Tyler 2003; 2004).
O elevado grau de diversificação morfológica é especialmente intrigante tendo em
vista que apenas as famílias Monacanthidae (110 espécies) e Tetraodontidae (195 espécies),
possuem um elevado número de espécies, enquanto a maioria exibe menos de 25 espécies
(Figura 1) (Eschmeyer & Fong, 2016).
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Apesar da diversidade observada, o monofiletismo da ordem é suportado com base em
28 sinapomorfias (Arcila et al., 2015), além de amplas evidências envolvendo dados
morfológicos e moleculares (Figura 2) (Santini & Tyler, 2003, 2004; Holcroft, 2005; Alfaro et
al., 2007; Yamanoue et al., 2008, Santini et al., 2013b). Algumas famílias, como
Monacanthidae e Balistidae, constituem grupos irmãos agrupados na superfamília Balistoidea
(Yamanoue et al., 2008; Santini et al., 2013a; McCord & Westneat, 2016). Devido a
considerável diversidade familiar, várias relações-chave entre linhagens de Tetraodontiformes
permanecem controversas, incluindo as relações de alto nível e da posição de alguns fósseis
de famílias existentes (Arcila et al., 2015).
Com relação ao grau de ancestralidade dos Tetraodontiformes, acredita-se que forme
um grupo irmão dos Acanthuroidea, uma subordem dos Perciformes (Holcroft, 2005; Nelson,
2006; Arratia et al., 2010).
Figura 1. Diversidade das famílias de Tetraodontiformes, dados obtidos de Eschmeyer & Fong (2016).
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Figura 2. Filogenia de Tetraodontiformes modificado de Santini et al. (2013b). Destaque para as famílias do
presente estudo.
1.2 Distribuição e aspectos biológicos das famílias Monacanthidae, Balistidae e
Tetraodontidae
Os representantes da família Monacanthidae distribuem-se pelos oceanos Atlântico,
Índico e Pacífico, porém, são em grande parte restritos ao Indo-Pacífico, com apenas algumas
espécies ocorrendo no Atlântico e no Mar Vermelho (Matsuura, 2014). Seus representantes
geralmente apresentam dois espinhos dorsais sendo o segundo comumente menor do que o
primeiro, podendo inclusive estar ausente (Nelson, 2006). Quando adultos atingem cerca de 1
metro de comprimento e a maioria das espécies se alimenta de uma grande variedade de
invertebrados bentônicos, mas alguns se especializaram em corais ou zooplâncton (Carpenter,
2002). Normalmente, os monacantídeos colocam ovos demersais em um local preparado,
sendo estes guardados pelo macho ou ambos os parentais, podendo também algumas das
espécies subtropicais liberarem seus ovos em mar aberto (Nelson, 2006).
Dentro da variação cromática desta família, a espécie Cantherines pullus exibe
coloração geralmente marrom, onde se destacam faixas claras longitudinais na parte posterior
do corpo com numerosas pintas alaranjadas. Presente no Atlântico Ocidental distribui-se
desde a costa dos Estados Unidos até São Paulo - Brasil (Carpenter, 2002). A espécie
Monacanthus chinensis, habita estuários e recifes costeiros, apresentando hábitos onívoros
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que incluem principalmente algas e camarões, bem como de briozoários, ascídias e copépodes
(May & Maxwell, 1986; Kuiter & Tonozuka, 2001). Distribui-se pelo Indo-Pacífico nos
litorais da Malásia e Indonésia, norte ao sul do Japão, sul da Austrália e ao sul do País de
Gales (Shen, 1993).
Grupo-irmão de Monacanthidae, os membros da família Balistidae são popularmente
conhecidos como cangulos ou peixes porcos, distribuindo-se pelos oceanos Atlântico,
Pacífico e Índico (Nelson, 2006). Sua principal característica é a presença de três espinhos
dorsais, onde o primeiro é mais desenvolvido que os demais, principal característica que os
difere morfologicamente dos Monacanthidae (Carpenter, 2002). As espécies desta família
possuem geralmente cores vivas, são diurnas e habitantes comuns de áreas recifais (Chen,
2001). A maioria dos representantes é carnívora alimentando-se de uma grande variedade de
invertebrados, incluindo moluscos e equinodermos. Põem ovos demersais em um ninho que é
agressivamente vigiado pela fêmea e menos frequentemente pelo macho, sendo bastante
populares entre os aquariofilistas (Carpenter, 2002).
Entre os Balistidae, o representante mais bem distribuído é a espécie Melichthys niger,
denominada cangulo-preto, devido à coloração negra do corpo, com linhas azuis ao longo da
nadadeira dorsal e caudal. Esta espécie forma grandes cardumes em ilhas oceânicas, recifes e
parcéis em águas claras e afastadas da costa e distribuindo-se pelos oceanos Atlântico, Índico
e Pacífico (Szpilman, 2000).
Uma família de particular interesse entre os Tetraodontiformes é Tetraodontidae, cujos
representantes são conhecidos como baiacus-lisos, dos quais a maioria é marinha, contudo,
algumas espécies de água doce e salobra já foram descritas. Peculiarmente são capazes de
inflar o corpo (região ventral), dificultando a predação e fazendo com que pareçam maiores
(Carpenter, 2002). Alguns membros desta família possuem elevada toxicidade. A carne,
especialmente as vísceras, ou gônadas contém tetrodotoxina, um veneno neurotóxico, que em
casos de ingestão pode ser fatal (Nelson, 2006). Um dos representantes desse grupo,
Sphoeroides testudineus, tem frequente e abundante ocorrência no litoral do Rio Grande do
Norte, nordeste do Brasil, exibindo-se manchas escuras distribuídas sobre o dorso do corpo.
Esta espécie tem hábitos solitários, podendo ocorrer em grupos de dois ou três indivíduos,
alimentando-se principalmente de moluscos e outros seres bentônicos, os quais esmagam com
seus dentes potentes (Szpilman, 2000).
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1.3 Aspectos genômicos dos Tetraodontiformes
Com aproximadamente 28.872 espécies, os peixes teleósteos constituem a radiação
dominante dos vertebrados em nosso planeta, ainda sendo sugerido que a grande diversidade
morfológica e de espécies de teleósteos pode estar relacionada com duplicações de genes
independentes em grande escala ou a uma duplicação de todo o genoma de um antigo
teleósteos (Santini et al., 2009). Compondo esse clado, os Tetraodontiformes se destacam
como os vertebrados com os genomas mais compactos (Dolezel et al., 2003; Noleto et al.,
2007, 2009).
A família Tetraodontidae, por exemplo, possui as menores quantidades de DNA por
célula entre os vertebrados (Neafsey & Palumbi, 2003), estimado em 0,34 – 0,80pg haploide
(Tabela 1), que significa mais de oito vezes menor que o genoma humano (3,50pg) (Noleto et
al., 2009; Martinez et al., 2011; Gregory, 2016). A variação genômica observada no grupo
tem sido atribuída à perda de DNA repetitivo e não codificante (Neafsey & Palumbi, 2003;
Noleto et al., 2009). Outras famílias, entretanto, exibem valores maiores, como as famílias
Monacanthidae e Balistidae (0,54 – 0,80pg), enquanto que Ostraciidae e Diodontidae exibem
valores variando de 0,80 a 1,10pg (Brainerd et al., 2001; Gregory, 2016).
Assim, as variações no tamanho do genoma dos Tetraodontiformes sugere que os
membros desta ordem podem ser alçados à condição de modelos adequados ao estudo da
evolução do genoma dos vertebrados, o que favorece estudos moleculares, assim como
comparações com espécies mais basais (Crnogorac-Jurcevic et al., 1997; Jaillon et al., 2004).
A família Tetraodontidae, em especial, tem despertado grande interesse como modelo para o
estudo do genoma de vertebrados, resultando em uma crescente quantidade de dados
disponíveis sobre as sequências gênicas de vários tetraodontídeos, particularmente os gêneros
Fugu (Crnogorac-Jurcevic et al., 1997) e Tetraodon (Mandrioli et al., 2000; Jaillon et al.,
2004).
Entretanto, como a evolução genômica não foi uniforme para todos
Tetraodontiformes, as diferenças quanto ao tamanho do genoma nas linhagens sugere que a
expansão ou a contração dos genomas ocorreu independente em cada táxon (Hinegardner,
1968; Neafsey & Palumbi, 2003; Jaillon et al., 2004). Enquanto a expansão parece ser o
resultado de duplicações em tandem, inserções, poliploidia, atividade de elementos de
transposição ou ainda da acumulação de sequências repetitivas, um genoma compacto poderia
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ser o resultado de deleções acumuladas constituindo um estado derivado (Venkatesh et al.,
2000; Petrov, 2001).
As características genômicas dos Tetraodontiformes, como variação na quantidade de
DNA, além da ocorrência de diversos rearranjos cromossômicos os tornam especialmente
indicados para a identificação in situ de genes. A partir do aprofundamento do conhecimento
dos aspectos cromossômicos desta ordem, análises envolvendo sequências de DNA podem ser
facilitadas pelo conhecimento prévio da sua ultraestrutura cariotípica e do mapeamento
cromossômico de determinados genes. Isso é possível através da técnica de hibridação in situ
com fluorescência (FISH), que trouxe avanços significativos para o conhecimento do genoma
com base nos cromossomos (Artoni et al., 2015).
Tabela 1 – Revisão dos dados genômicos em Tetraodontiformes. Extraído e modificado de Gregory (2016).
Família Espécies Valor C Referência
BALISTIDAE
Abalistes stellatus
0,64
Hardie & Hebert, 2003; 2004
Balistapus undulatus 0,67 Hardie & Hebert, 2003; 2004
Balistapus undulatus 0,74 Ojima & Yamamoto, 1990
Balistes carolinensis 0,54 Mirsky & Ris, 1951
Balistes carolinensis 0,55 Bachmann & Cowden,1967
Balistes sp 0,72 Hinegardner, 1968;
Hinegardner & Rosen, 1972
Balistoides viridescens 0,68 Ojima & Yamamoto, 1990
Melichthys niger 0,70 Brainerd et al., 2001
Rhinecanthus aculeatus 0,64 Hardie & Hebert, 2004
Sufflamen
chrysopterum
0,58 Hardie & Hebert, 2004
Sufflamen fraenatus 0,64 Hardie & Hebert, 2003; 2004
Xanthichthys ringens 0,74 Brainerd et al., 2001
Valor médio 0,60
MONACANTHIDAE
Aluterus schoepfii
0,64
Hinegardner & Rosen, 1972
Cantherines pullus 0,58 Brainerd et al., 2001
Monacanthus chinensis 0,66 Hardie & Hebert, 2004
Monacanthus ciliatus 0,58 Brainerd et al., 2001
Monacanthus tuckeri 0,58 Brainerd et al., 2001
16
Nelusetta ayraud 0,65 Hardie & Hebert, 2004
Paramonacanthus
filicauda
0,77 Hardie & Hebert, 2004
Pervagor janthinosoma 0,51 Hardie & Hebert, 2004
Pseudomonacanthus
peroni
0,43 Hardie & Hebert, 2003; 2004
Stephanolepis cirrhifer 0,62 Ojima & Yamamoto, 1990
Stephanolepis hispidus 0,68 Hinegardner, 1968;
Hinegardner & Rosen, 1972
Thamnaconus modestus 0,56 Ojima & Yamamoto, 1990
Valor médio 0,60
TETRAODONTIDAE
Arothron diadematus
0,40-0,50
Pizon & Bernardi, 1984
Arothron hispidus 0,40 Ojima & Yamamoto, 1990
Arothron hispidus 0,52 Hardie & Hebert, 2004
Arothron manilensis 0,50 Hardie & Hebert, 2003; 2004
Arothron meleagris 0,38 Ojima & Yamamoto, 1990
Canthigaster bennetti 0,38 Hardie & Hebert, 2003; 2004
Canthigaster rostrata 0,45 Brainerd et al., 2001
Canthigaster valentini 0,44 Hardie & Hebert, 2003; 2004
Lagocephalus lunaris 0,44 Hardie & Hebert, 2003; 2004
Lagocephalus lunaris 0,72 Hardie & Hebert, 2003; 2004
Sphoeroides greeleyi 0,71 Noleto et al., 2009
Sphoeroides maculatus 0,50 Hinegardner, 1968;
Hinegardner & Rosen, 1972
Sphoeroides nephelus 0,45 Brainerd et al., 2001
Sphoeroides nephelus 0,50 Hinegardner & Rosen, 1972
Sphoeroides spengleri 0,34 Noleto et al, 2009
Sphoeroides
testudineus
0,82 Noleto et al, 2009
Takifugu niphobles 0,42 Ojima & Yamamoto, 1990
Takifugu rubripes 0,40 Brenner et al, 1993
Tetractenos hamiltoni 0,51 Hardie & Hebert,2004
Tetraodon cutcutia 0,41 Vinogradov, 1998
Tetraodon fluviatilis 0,35 Lamatsch et al., 2000
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Tetraodon fluviatilis 0,40 Hinegardner, 1968;
Hinegardner & Rosen, 1972
Tetraodon fluviatilis 0,40 Brainerd et al., 2001
Tetraodon fluviatilis 0,41 Ojima & Yamamoto, 1990
Tetraodon nigroviridis 0,35 Jaillon et al., 2004
Tetraodon nigroviridis 0,51 Hardie & Hebert, 2003; 2004
Tetraodon
palembangensis
0,48 Hinegardner & Rosen, 1972
Valor médio 0,46
OSTRACIIDAE
Acanthostracion
quadricornis
0,96
Mirsky & Ris, 1951
Acanthostracion
quadricornis
1,10 Brenner et al, 1993
Lactophrys bicaudalis 0,98 Brenner et al, 1993
Lactophrys trigonis 0,85 Hinegardner & Rosen, 1972
Lactophrys triqueter 1,10 Hinegardner & Rosen, 1972
Valor médio 0,90
DIODONTIDAE
Cyclichthys schoepfi
0,81
Brainerd et al., 2001
Chilomycterus schoepfi 0,85 Brainerd et al., 2001
Cyclichthys schoepfi 0,90 Hinegardner & Rosen, 1972
Chilomycterus spinosus 1,00 Noleto et al., 2009
Diodon holocanthus 0,78 Brainerd et al., 2001
Diodon hystrix 0,80 Brainerd et al., 2001
Diodon liturosis 0,85 Ojima & Yamamoto, 1990
Valor médio 0,85
TRIACANTHIDAE
Tripodichthys
angustifrons
0,51
Hardie & Hebert, 2003; 2004
Valor médio 0,51
MOLIDAE
Mola mola
0,84
Brainerd et al., 2001
Mola mola 0,97 Venkatesh et al., 2000
18
Valor médio 0,90
1.4 Aspectos citogenéticos nos Tetraodontiformes
Tetraodontiformes constitui um dos principais ramos derivados da diversificação dos
teleósteos, e apresentam os cariótipos mais diversos com números diploides variando entre 28
e 52 cromossomo, a exemplo disso temos a família Triacanthidae que possui 2n=48 e NF=48
(Arai, 2011), características consideradas basais e extensamente difundida entre os
Perciformes. Enquanto famílias, tais como Balistidae, Monacanthidae e Molidae, exibem
valores de 2n entre 33 – 46 formado em maior parte por cromossomos monobraquiais (Molina
et al., 2014b). Tetraodontidae, Ostraciidae, e Diodontidae, entretanto, exibem as mais
variadas fórmulas cariotípicas, com valores 2n=28 a 52 e NF=36 a 96 (Arai, 2011; Nirchio et
al., 2014). Essa diversidade de fórmulas cariotípicas, pode ser reflexo da forte especialização
do grupo, não sendo possível a identificação de um padrão comum como ocorre nos
Perciformes (Sá-Gabriel & Molina, 2005).
Nesse sentido, os dados disponíveis para os Tetraodontiformes revelam, ainda,
diferentes tendências carioevolutivas como a ocorrência de alguns rearranjos estruturais, tais
como fissões e fusões cêntricas (Sá-Gabriel & Molina, 2005; Arai, 2011), associados a
ocorrência de cromossomos sexuais e Bs (Nirchio & Oliveira, 2007; Martinez et al., 2011;
Molina et al., 2014a), que também são promotores na diversificação cariotípica na ordem.
Rearranjos cromossômicos têm desempenhado um papel importante na evolução do
cariótipo de diversos grupos de peixes, a exemplo dos salmonídeos (Pomianowski et al.,
2012). A ocorrência de diferentes números de cromossomos com a manutenção do número de
braços cromossômicos, resultantes de fusões cêntricas é conhecidas como polimorfismos
Robertsonianos e são observadas em diversos grupos de peixes, incluindo a ordem
Tetraodontiformes (Phillips & Ráb, 2001).
Nesse sentido análises citotaxonômicas contribuem significativamente para o estudo
da evolução pelo fato do material genético estar contido nos cromossomos (Almeida-Toledo,
2000). Portanto, alterações como, rearranjos cromossômicos, polimorfismos estruturais e/ou
numéricos, poliploidia natural, sistemas de cromossomos sexuais entre outros, são quase
sempre significativas para que se possa inferir o rumo evolutivo das espécies.
19
2. OBJETIVOS
2.2 Objetivo geral
O presente trabalho tem como objetivo compreender os processos evolutivos ocorridos
nos cariótipos e genomas dos grupos de peixes aqui estudado, com o intuito de ampliar as
informações existente para a ordem Tetraodontiformes.
2.3 Objetivos específicos
• Comparar por meio de métodos citogenéticos clássicos (Giemsa, Ag-RON,
bandamento C), fluorocromos base-específicos e mapeamento da distribuição de
sequências teloméricas e DNA ribossomal 18S e 5S por meio da hibridização in situ
com fluorescência (FISH) em Cantherhines pullus (Monacanthidae) e Melichthys
niger (Balistidae), grupos com um recorrente processo de redução numérica do valor
diploide.
• Analisar citogeneticamente a espécie Sphoeroides testudineus (Tetraodontidae) e
Monacanthus chinensis (Monacanthidae), através de coloração convencional, Ag-
RON, bandamento C, fluorocromos MM/DAPI e FISH com sondas de DNAr 18S e 5S
com vistas a identificar e discutir a dinâmica cromossômica de espécies com genoma
reduzido.
• Identificar os mecanismos evolutivos envolvidos na diferenciação cariotípica das
espécies estudadas.
20
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Material
Os exemplares utilizados no presente trabalho foram coletados, na praia de Ponta
Negra – Natal (RN) (5º52´S, 35º10´O), no litoral da Bahia, costa de Salvador (BA) (12º58’S,
38º31’O), no Arquipélago São Pedro e São Paulo (ASPSP) (00º 55'15" N 029º20'60" O), ilha
da Trindade (IT), distante 1200km da costa da cidade de Vitória, no centro sul do Oceano
Atlântico (20º30’13”S, 29º19’50”O), Mar de Andaman (11º04’00”N, 95º44’34”L) (Figura3).
Os espécimes foram coletados utilizando-se redes de pesca (arrasto, puçá e tarrafa),
bem como linha e anzol, sendo posteriormente acondicionados e mantidos em condições de
aeração até que se procedesse as preparações cromossômicas. Para as análises citogenéticas
foram empregados indivíduos das espécies Melichthys niger (Bloch, 1786), n=8 (Balistidae);
Cantherhines pullus (Ranzani, 1842), n=5 e Monacanthus chinensis (Osbeck, 1765), n=2
(Monacanthidae), e Sphoeroides testudineus (Linnaeus, 1758), n=12 (Tetraodontidae).
21
Figura 3. (a) Pontos de coleta das espécies de Tetraodontiformes no Atlântico e no Índico. (b) Em detalhe no
litoral de Natal (RN), Salvador (BA), litoral nordeste do Brasil, Arquipélago São Pedro e São Paulo (ASPSP), Ilha
da Trindade (IT). (c) Mar de Andaman (MA), Oceano Índico.
22
3.2 Métodos
3.2.1 Estimulação mitótica
Depois de acondicionados e aclimatados em tanques devidamente aerados, os
exemplares foram submetidos à estimulação mitótica seguindo a metodologia preconizada por
Molina et al. (2010), que faz uso dos complexos comerciais de antígenos bacterianos e
fúngicos, Munolan® (Allergan Frumtost™) e Aminovac®. Este procedimento consiste na
inoculação intraperitoneal de solução do composto (2 comprimidos/1ml de água destilada), na
proporção de 1ml/50g de peso corporal, por um período de 24 a 48 horas. Decorrido este
tempo, os exemplares foram anestesiados com Eugenol® – óleo extraído do cravo (Syzygium
aromaticum) e eutanaziados para extração de fragmentos do rim anterior.
3.2.2 Obtenção de cromossomos mitóticos
Para a obtenção de cromossomos mitóticos foi adotado o método de preparação in
vitro descrito por Gold et al. (1990). Após a eutanásia, procedeu a extração de fragmentos dos
rins anterior, que possuem função hematopoiética. Nos casos em que as quantidades de rim
eram insuficientes, outros tecidos foram utilizados. O material retirado foi acondicionado em
frascos contendo 5ml de meio de cultura (RPMI 1640) e desagregado através de movimentos
de sucção e esvaziamento com seringas de vidro. Após essa etapa adicionaram-se 125µl de
colchicina 0,025%, agindo por 30 minutos. Após este período o material foi centrifugado por
10 minutos a 1000rpm, sendo descartado o sobrenadante e foram adicionados 8ml de solução
hipotônica (KCl 0,075M), agindo por 28 minutos, logo se prefixou com 100µl de fixador (3
Metanol: 1 Ac. Acético), sendo novamente centrifugado por 10 minutos a 1000rpm,
descartou-se o sobrenadante e se adicionou 6ml de fixador, centrifugando-se novamente por
10 minutos a 1000 rpm, este último passo foi repetido três vezes. Após a última centrifugação,
reservaram-se 2,0ml de fixador ressuspendeu-se o material e transferiu-se a suspensão
cromossômica para um microtubo que foi mantido em freezer (-20ºC) até o momento das
análises e demais procedimentos.
Após a preparação, aproximadamente 100µl de suspensão celular, foi gotejada sobre
uma lâmina recoberta com um filme de água destilada aquecida a 60ºC de tal forma que se
23
descarta a água sobre a lâmina inclinando-a e goteja-se a suspensão cromossômica no espaço
gerado, após essa etapa as lâminas são secas ao ar, e posteriormente coradas com Giemsa,
diluído a 5% em tampão fosfato (pH 6,8), por 10 minutos. As melhores metáfases foram
fotografadas em fotomicroscópio de epifluorescência (OlympusTM BX50) sob aumento de
1000X e capturadas e digitalizadas, por meio de um sistema digital de captura (câmera CCD
Optronics, modelo DP73) com o uso do software cellSens© para a captura da imagem.
As melhores microfotografias foram utilizadas na preparação do cariótipo das
espécies, onde os cromossomos metafásicos foram ordenados em ordem decrescente de
tamanho e definidos de acordo com a posição do centrômero segundo Levan et al. (1964).
3.2.3 Detecção das Regiões Organizadoras de Nucléolos (RONs)
A detecção de regiões organizadoras de nucléolos foi obtida pela técnica de
impregnação com nitrato de prata preconizada por Howell & Black (1980). Sobre uma lâmina
previamente preparada com suspensão celular foram adicionadas 175µl de solução gelatinosa
(1g de gelatina incolor, dissolvida em 50ml de água destilada e 0,5ml ácido fórmico), e 150µl
de solução de nitrato de prata (AgNO3) à 50%. A solução foi recoberta com a lamínula sendo
então incubada em estufa a 60°C de 3 a 5 minutos. Após o período a remoção da lamínula foi
realizada com jatos de água destilada, sendo posteriormente secas em temperatura ambiente e
analisadas eventualmente, para destacar as marcações argênteas, as preparações podiam ser
coradas por cerca de 20 segundos com solução de Giemsa a 5%. Após secas as preparações
foram analisadas e fotografadas no mesmo dia para evitar oxidação.
3.2.4 Detecção de Heterocromatina (Banda-C)
A análise das regiões heterocromáticas foi realizada através do bandamento-C,
segundo Sumner (1972). Foram utilizadas lâminas com material envelhecido em estufa a
37°C por no mínimo 3 dias, após esse período a lâminas foram imersas em HCl 0,2N por 14
minutos em temperatura ambiente, sendo lavadas com água destilada e secas. Posteriormente
a lâmina foram mergulhadas em uma solução a 5% de Ba(OH)28H2O à 42°C por cerca de 1
minuto e 35 segundos sendo rapidamente imersas em HCl 0,1N e posteriormente lavadas em
água destilada. Após secar ao ar, as lâminas foram então imersas em solução salina 2xSSC à
24
60°C em estufa por 30 minutos. Para a análise o material foi corado com Giemsa 5% por 6
minutos.
3.2.5 Coloração com os fluorocromos base-específicos DAPI e MM
A coloração pelos fluorocromos Mitramicina e DAPI foi realizada seguindo a técnica
de Schweizer (1976) com pequenas modificações. Após um processo de desidratação por 30
minutos em solução fixadora (metanol 3: 1 ácido acético) e 1 hora em etanol 100%, as
lâminas foram secas ao ar e um total de 30µl de solução Mitramicina (0,5 mg/ml – 10 ml) foi
depositado em cada lâmina, sendo as mesmas cobertas por lamínulas, permanecendo 1 hora
em câmara escura umedecida. Após esse procedimento lavaram-se as lâminas em água
destilada, utilizando-se de um jato moderado para a retirada das lamínulas. Depois as lâminas
foram secas ao ar no escuro e sobre as mesmas foi depositado um total de 30µl de solução de
DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) (2 µg/ml - 10 ml) em cada lâmina, sendo cobertas
novamente por lamínulas e permanecendo por 30 minutos em câmara escura umedecida.
Decorrido esse tempo, as lâminas foram, novamente, submetidas à lavagem com água
destilada, utilizando-se do jato moderado para a retirada das lamínulas e secas ao ar no escuro.
Por último, aplicou-se 30µl do meio de montagem (Glicerol-Macllvaine, pH 7,0, 1:1), sobre
cada lâmina no escuro e sobre as mesmas depositaram-se as lamínulas, sendo o conjunto
selado com base incolor de esmalte nas extremidades, para evitar que o meio de montagem se
dispersasse durante a estocagem. As lâminas foram preservadas em câmara escura à
temperatura ambiente por 4 dias e então analisadas, sendo as melhores metáfases foram
fotografadas em fotomicroscópio de epifluorescência com filtros apropriados (OlympusTM
BX50) sob aumento de 1000X e capturadas e digitalizadas, por meio de um sistema digital de
captura Olympus DP73 com o uso do software cellSens©.
3.2.6 Hibridação in situ fluorescente – FISH
Obtenção de sondas para hibridização
A hibridização in situ com fluorescência foi realizada de acordo com Pinkel et al.
(1986) usando sondas de 18S e 5S. As sondas de DNAr 5S (200 pb) e 18S DNAr (1400 pb)
foram obtidos a partir de amostras de DNA de Rachycentron canadum (Teleostei,
Perciformes), via PCR utilizando os primers A 5'-TAC CCG CGA TCT CGT CCG ATC-3 '/
25
B 5'-CAG GGT GCT ATG CCG GTA AGC-3' (Pendás et al., 1994) e NS1 5'-GTC ATA
GTA TGC TTG TCT C-3' / NS8 5'-TCC GCA GGT TCA CCT ACG AG-3' (White et al.,
1990), respectivamente. A sonda 18S foi marcada por nick translation digoxigenina-11-dUTP
(Roche) e a sonda DNAr 5S foi marcada por nick translation biotina-14-dATP (Roche), de
acordo com as especificações do fabricante. As sequências (TTAGGG)n foram mapeadas
utilizando o Kit FISH Telomere PNA/FITC® de acordo com as instruções do fabricante
(DakoCitomation™).
Hibridização cromossômica
A FISH foi realizada de acordo com Pinkel et al. (1986). Análise por dual-color FISH
foi desenvolvida usando sondas DNAr 18S e DNAr 5S. Os cromossomos foram tratados com
RNAse livre de DNAse (20mg / mL em 2xSSC) à 37°C por 1 hora, com pepsina (0,005% em
HCl 10mM) à 37°C por 10 minutos e fixados com formaldeído à 1% por 10 minutos, em
seguida desidratados em série alcoólica (70%, 80% e 100%), por 5 minutos cada. Os
cromossomos foram, então, desnaturados em 70% formamida/2×SSC à 72°C por 5 minutos.
A solução de hibridização consistiu em 50% de formamida, 2×SSC, 10% de sulfato de
dextrano e a sonda desnaturada (5 ng/μl). Após hibridação, overnight à 37°C, as lâminas
foram lavadas em 15% formamida/0.2×SSC à 42°C por 20 minutos, 0,1×SSC à 60°C por 15
minutos e Tween20 0,5%/4×SSC à temperatura ambiente. O sinal de hibridização da sonda
foi detectado usando streptavidina-FITC (Vector™) para a sonda DNAr 5S e anti-
digoxigenina rodamina conjugada (Roche™) para a sonda DNAr 18S. Os cromossomos
foram contracorados com Vectashield/DAPI® (1,5μg/ml). As preparações cromossômica
submetidas à FISH foram analisadas conforme descrito para as análises com fluorocromos.
3.2.7 Análises cromossômicas
Após a obtenção das imagens como previamente explanado para todos as técnicas aqui
elucidadas, os cromossomos metafásicos foram definidos de acordo com a posição do
centrômero segundo Levan et al. (1964). As imagens foram tratadas com o software Adobe©
Photoshop© CS6 versão 13.1.2x64 (1990-2012 Adobe Systems Incorporated, all rights
reserved).
26
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1.CAPÍTULO I
FUSÕES EM TANDEM NA EVOLUÇÃO DO CARIÓTIPO DE BALISTIDAE E
MONACANTHIDAE (TETRAODONTIFORMES)
Juliana G. Bezerra1; Luiz A.C. Bertollo2; Gideão W.W.F da Costa1; Allyson S. Souza1;
Marcelo B. Cioffi2 ; Wagner F. Molina1
1 Departamento de Biologia Celular e Genética, Centro de Biociências, Universidade Federal
do Rio Grande do Norte, Natal – RN, Brasil.
2 Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos, São Paulo – SP,
Brasil.
Resumo
Tetraodontiformes exibem diferentes tendências carioevolutivas e filogenéticas, decorrentes
da ação preferencial de certos rearranjos estruturais, entre elas fusões em tandem. Estes
mecanismos de difícil identificação por métodos citogenéticos convencionais podem
eventualmente ser detectados pelo mapeamento de sequências teloméricas ao longo dos
cromossomos, através da hibridização in situ com fluorescência (FISH). Com vistas a analisar
a ocorrência de cariótipos com números diploides reduzidos nesta ordem, foram realizadas
análises carioevolutivas nas espécies Cantherhines pullus (Monacanthidae) e Melichthys niger
(Balistidae), através de metodologias da citogenética convencional (coloração pelo Giemsa,
bandamento C, Ag-RONs), coloração com fluorocromos base-específicos e mapeamento
cromossômico de sequências ribossomais e teloméricas através da técnica de FISH. Ambas as
espécies apresentaram cariótipos com 2n=40 cromossomos, todos acrocêntricos, um par de
RONs e heterocromatina preferencialmente pericentromérica. Cantherhines pullus apresentou
sítios (TTAGGG)n intersticiais, apoiando a ocorrência de eventos de fusão in tandem na
diversificação cariotípica de algumas famílias.
Palavras-chave: Balistoidea, carioevolução, FISH, telômeros, rearranjos cromossômicos.
27
IN TANDEM FUSION IN THE KARYOTYPE EVOLUTION OF BALISTIDAE AND
MONACANTHIDAE (TETRAODONTIFORMES)
Juliana G. Bezerra1; Luiz A.C. Bertollo2; Gideão W.W.F da Costa1; Allyson S. Souza1;
Marcelo B. Cioffi2 ; Wagner F. Molina1
1 Departamento de Biologia Celular e Genética, Centro de Biociências, Universidade Federal
do Rio Grande do Norte, Natal – RN, Brasil.
2 Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos, São Paulo – SP,
Brasil.
Abstract
Tetraodontiformes exhibit different karyoevolutive and phylogenetic trends, resulting from
the action of preferential structural rearrangements, among them in tandem fusions. These
mechanisms are difficult to identify by conventional cytogenetic methods and can be possibly
detected by physical mapping of telomeric sequences along the chromosomes through in situ
hybridization with fluorescence. In order to analyze the occurrence of karyotypes with
reduced diploid number in this Order, karyoevolutive analyzes were performed on the species
Cantherhines pullus (Monacanthidae) and Melichthys niger (Balistidae) through
methodologies of conventional cytogenetics (Giemsa staining, C-banding, Ag-NORs),
fluorochromes base-specific staining and chromosomal mapping of ribosomal and telomeric
sequences through FISH technique. Both species showed karyotypes with 2n = 40
chromosomes, all acrocentric, a pair of NORs and heterochromatin preferably
pericentromeric. Cantherhines pullus presented interstitials sites (TTAGGG)n, supporting the
occurrence of in tandem fusion events in karyotypical diversification of some families.
Keywords: Balistoidea, karyoevolution, FISH, telomeres, chromosomal rearrangements.
28
Introdução
Os Tetraodontiformes compõem uma linhagem pós-Perciformes e constituem o último
ramo da difusão dos teleósteos (Elmerot et al., 2002), ocupando uma posição filogenética de
destaque nesse contexto. Desde a detecção das menores quantidades de DNA entre os
vertebrados para os peixes da família Tetraodontidae (Hinegardner, 1968), este grupo tornou-
se um importante modelo animal com a ocorrência do aumento de informações citogenéticas,
identificação de elementos de transposição, sequenciamento do genoma completo e do
genoma mitocondrial (Crollius & Weissenbach, 2005). Concomitantemente, intensificou-se o
interesse em vários outros grupos de Tetraodontiformes (Jaillon et al., 2004; Santini et al.,
2013a), que com a ampliação do espectro filogenético permitiu identificar diferentes
tendências carioevolutivas entre suas famílias (Sá-Gabriel & Molina, 2005).
Diferenças quanto ao tamanho do genoma em diversas famílias sugere que a expansão
ou a contração dos genomas ocorreu independentemente em cada táxon e que, portanto, este
tamanho reduzido do genoma não é uniforme para todas as espécies nem característico de
todos os Tetraodontiformes, o que torna o grupo bastante peculiar (Venkatesh et al., 2000).
Nos Tetraodontiformes ocorre, também, uma marcante diversidade de fórmulas
cariotípicas, reflexo da forte especialização do grupo, aparentemente não existindo um
padrões amplamente distribuídos como ocorre nos Perciformes (Sá-Gabriel & Molina, 2005).
Nesse cenário as espécies da ordem apresentam cariótipos variáveis com números diploides
variando entre 28 a 52 cromossomos (Arai, 2011; Nirchio & Oliveira, 2014). Enquanto
espécies da família Triacanthidae, possuem números diploide e número fundamental (número
de braços cromossômicos, NF) frequentemente iguais a 48, outras famílias, como Balistidae,
Monacanthidae, Diodontidae, Tetraodontidae, Ostraciidae e Molidae exibem uma diversidade
de fórmulas cromossômicas, com cariótipos mais derivados e números diploides variando de
28 a 52 e números fundamentais com valores de 33 a 96 (Arai, 2011). Os dados disponíveis
para a ordem revelam ainda, diferentes tendências carioevolutivas como a ação de alguns
rearranjos estruturais, tais como fissões e fusões cêntricas (Sá-Gabriel & Molina, 2005).
As famílias Balistidae e Monacanthidae, que divergiram no Eoceno Médio, acerca de
50 milhões de anos, revelam grande proximidade filogenética (Santini et al., 2013b). A
proximidade entre essas famílias é reforçada por dados moleculares e morfológicos, que
suportam sua provável origem monofilética com formação do clado Balistoidea (Yamanoue et
al., 2009; McCord & Westneat, 2016).
29
Apesar da estreita relação evolutiva, as famílias Balistidae e Monacanthidae
apresentam padrões contrastantes de riqueza de espécies e diversidade morfológica. Balistidae
compreende 42 espécies, enquanto Monacanthidae inclui, pelo menos, 110 espécies
(Eschmeyer & Fong, 2016). Além disso, quase todos os Balistidae são encontrados
circuntropicalmente em associação com recifes de coral, já os Monacanthidae são em grande
parte restritos ao Indo-Pacífico, com apenas algumas espécies no Atlântico e no Mar
Vermelho (Santini et al., 20013b).
As causas da redução do número cromossômico nestas famílias, em relação a outros
Tetraodontiformes, têm sido inferidas como derivadas de fusões in tandem, contudo sem
evidências definitivas sobre esse processo. Nos peixes, fusões cromossômicas têm sido
relatadas em processos que envolvem diferenciação de sistemas sexuais múltiplos (Margarido
& Moreira-Filho, 2008), principalmente entre cromossomos acrocêntricos, tais como em
Eigenmannia sp. e Brachyhypopomus pinnicaudatus (Almeida-Toledo et al., 2000),
Erythrinus eyrthrinus (Bertollo et al., 2004), Gymnotus pantanal (Silva & Margarido, 2005) e
Harttia carvalhoi (Centofante et al., 2006), embora fusões in tandem também tenham sido
detectadas envolvendo cromossomos bibraquiais (Bertollo et al., 1997).
Fusões cromossômicas têm desempenhado um papel importante na evolução do
cariótipo de diversos grupos de peixes, a exemplo dos salmonídeos (Pomianowski et al.,
2012). De fato, fusões Robertsonianas têm sido observadas nos gêneros Hucho, Salmo,
Oncorhynchus e Salvelinus (Phillips & Ráb, 2001). Além disso, tem se identificado, através
da presença de sítios teloméricos intersticiais (ITS) observados em grandes cromossomos
acrocêntricos de Salmo salar, como resultado de fusões in tandem (Amaro et al., 1996).
Diante disto, visando uma melhor compreensão da evolução cariotípica nas famílias
Monacanthidae e Balistidae aqui foram analisadas a estrutura cromossômica de um de seus
representantes, respectivamente Cantherhines pullus e Melichthys niger por métodos
citogenéticos clássicos (coloração convencional, bandamento C, Ag-RON), coloração com
fluorocromos base-específicos DAPI/MM e pelo mapeamento por FISH de sequências do
DNAr 18S, DNAr 5S e sequências (TTAGGG)n.
30
Material e Métodos
Coleta de espécimes, obtenção de cromossomos mitóticos e bandamentos cromossômicos
Exemplares de Cantherhines pullus (Ranzani, 1842) (n=5) foram coletados no litoral
da Bahia, costa de Salvador (12º58’S, 38º31’O) e de Melichthys niger (Bloch, 1786) no
Arquipélago São Pedro São Paulo (n=8) (00º 55'15", N 029º20'60" O) e ilha da Trindade
(n=4) (20º30’13”S, 29º19’50”O), distante 1.200 km da costa do Espírito Santo, no centro sul
do Oceano Atlântico. Após a coleta, os exemplares foram estimulados mitoticamente com
injeção intraperitoneal de complexos comerciais de antígenos bacterianos e fúngicos, por um
período de 24 a 48 horas (Molina et al., 2010). Decorrido este tempo, os exemplares foram
anestesiados com óleo de cravo (Eugenol) e após a eutanásia procedeu a extração do rim
anterior. Os cromossomos mitóticos foram preparados a partir da suspensão de fragmentos do
tecido renal de acordo com a técnica in vitro preconizada por Gold et al. (1990). Os
cromossomos foram corados com solução de Giemsa à 5%, diluída em tampão fosfato pH 6,8.
As regiões heterocromáticas foram visualizadas através do bandamento C, segundo Sumner
(1972). As regiões organizadoras de nucléolo (RONs) foram obtidas pela técnica de
impregnação por nitrato de prata, idealizada por Howell & Black (1980).
A coloração pelos fluorocromos Mitramicina e DAPI foi realizada seguindo a técnica
de Schweizer (1976). As lâminas foram preservadas em câmara escura à temperatura
ambiente por 4 dias e então analisadas, sendo as melhores metáfases fotografadas em
fotomicroscópio de epifluorescência com filtros apropriados (OlympusTM BX50) sob aumento
de 1000X e capturadas e digitalizadas, por meio de um sistema digital de captura (Olympus
DP73®) com o uso dos softwares cellSens® (Olympus Optical Co.ltd.) e DPManager®,
v.1.2.1.108 (Olympus Optical Co.ltd.) para a sobreposição das imagens.
Hibridização in situ fluorescente – FISH
Obtenção de sondas
As sondas de DNAr 5S (200 pb) e DNAr 18S (1400 pb) foram obtidas via PCR a
partir de amostras de DNA de Rachycentron canadum (Teleostei, Perciformes), utilizando os
primers A 5'-TAC CCG CGA TCT CGT CCG ATC-3 '/ B 5'-CAG GGT GCT ATG CCG
GTA AGC-3' (Pendás et al., 1994) e NS1 5'-GTC ATA GTA TGC TTG TCT C-3' / NS8 5'-
31
TCC GCA GGT TCA CCT ACG AG-3' (White et al., 1990), respectivamente. A sonda 18S
foi marcada por nick translation com digoxigenina-11-dUTP (Roche™) e a sonda DNAr 5S
foi marcada por nick translation com biotina-14-dATP (Roche™), de acordo com as
especificações do fabricante. As sequências (TTAGGG)n foram mapeadas utilizando o Kit
FISH Telomere PNA/FITC® de acordo com as instruções do fabricante (DakoCitomation™).
Hibridização cromossômica
A hibridização in situ com fluorescência foi realizada em metáfases mitóticas (Pinkel
et al., 1986) das duas espécies. Análise por dual-color FISH foi desenvolvida usando sondas
DNAr 18S e DNAr 5S. Os cromossomos foram tratados com RNAse livre de DNAse
(20mg/mL em 2xSSC ) à 37°C por 1 hora, com pepsina (0,005 % em HCl 10mM) à 37°C por
10 minutos e fixados com formaldeído a 1% por 10 minutos, em seguida desidratados em
série alcoólica. Os cromossomos foram, então, desnaturados em 70% formamida/2×SSC à
72°C por 5 minutos. A solução de hibridização consistiu em 50% de formamida, 2×SSC, 10%
de sulfato de dextrano e a sonda desnaturada (5 ng/μl). Após hibridação, overnight à 37°C, as
lâminas foram lavadas em 15% formamida/0.2×SSC à 42°C por 20 minutos, 0,1×SSC à 60°C
por 15 minutos e Tween20 0,5% 4×SSC à temperatura ambiente. O sinal de hibridização da
sonda foi detectado usando strepavidina-FITC (Vector) para a sonda DNAr 5S e anti-
digoxigenina rodamina conjugada (Roche) para a sonda DNAr 18S. Os cromossomos foram
contra-corados com Vectashield/DAPI (1,5 μg/ml). As análises da FISH e registro fotográfico
foram realizados conforme descrito para as análises de fluorocromos. Os cromossomos foram
definidos de acordo com a relação entre os braços, segundo Levan et al. (1964).
Resultados
Os resultados obtidos para Melichthys niger e Cantherhines pullus corroboram com os
dados citogenéticos prévios para as espécies (Sá-Gabriel & Molina, 2005). Ambas as espécies
apresentam 2n=40 cromossomos, todos acrocêntricos, com número fundamental (NF) igual a
40 (Figura 1a). Os exemplares de Melichthys niger do litoral da Bahia e ASPSP, não
apresentaram diferenciações cariotípicas detectáveis.
Em Cantherhines pullus as regiões heterocromáticas estão distribuídas em posição
pericentromérica em todos os cromossomos, como algumas evidências de marcações
32
intersticiais, nos pares 1, 3 e 4 (Figura 1b). Os sítios Ag-RONs/MM+/DAPI- são únicos e
localizados em posição pericentromérica no par 5, corroborado por sinais de DNAr 18S
(Figura 1a-c). Sítios DNAr 5S estavam localizados no par 10 (Figura 1c). Sítios (TTAGGG)n
foram identificados em posições terminais dos cromossomos, bem como intersticiais, nos
pares 1, 3 e 4 (Figura 1).
Em Melichthys niger os sítios Ag-RONs/MM+/DAPI- estavam localizados em posição
intersticial no par 2, sendo corroborado por sinais de hibridização com sondas DNAr 18S. Os
sítios DNAr 5S estão localizados no par 10. As regiões heterocromáticas mostraram-se
preferencialmente em posição pericentromérica na maioria dos pares, com uma marcação
mais intensa sobre o par 2, sobreposto à localização das RONs. Em alguns dos maiores pares
ocorrem regiões heterocromáticas em posição intersticial do braço longo. Os sítios
teloméricos ocorrem exclusivamente em marcações terminais nos cromossomos.
33
Figura 4. Cariótipos de Cantherhines pullus e Melichthys niger através de (a) coloração convencional (em destaque
os sítios Ag-RONs); (b) Bandamento C; (c) double-FISH com sondas DNAr 18S (sinais vermelhos), e DNAr 5S
(sinais verdes), em destaque os pares organizadores nucleolares sob coloração MM/DAPI (sinais verdes) pares 5 e 2,
respectivamente; (d) padrão de distribuição de sondas (TTAGGG)n com destaque para os pares portadores de sítios
ITS Barra=5 μm.
34
Figura 5. Idiograma de referência dos quatro primeiros pares cromossômicos de C. pullus, indicando a
distribuição de heterocromatina e sequências (TTAGGG)n. Os segmentos cromossômicos delimitados entre os
sítios teloméricos estão indicados em relação a faixas diferenciais de tamanho observadas entre os cromossomos
do complemento da espécie.
Discussão
Levantamentos citogenéticos têm apontado que alguns grupos de peixes marinhos
apresentam prevalentemente um complemento diploide de 48 cromossomos acrocêntricos
(Supiwong et al., 2013). Em contraste, os Tetraodontiformes exibem uma grande
diversificação cariotípica, decorrentes de diferentes tendências carioevolutivas, mediadas por
rearranjos cromossômicos particulares (Molina & Freitas, 2007), como identificado nos dados
apresentados.
Tanto em Monacanthidae, cujos números diploides variam de 2n = 33/34 a 36
cromossomos (Lima et al., 2011), como em Balistidae que apresentam 2n variando entre 36-
46 cromossomos, a maioria das espécies apresenta cariótipos preferencialmente formados por
elementos mono-braquiais (Supiwong et al., 2013). De fato, tanto C. pullus como M. niger
apresentam cariótipos (2n=40) inteiramente compostos por cromossomos acrocêntricos. Essas
35
reduções numéricas sugerem a ocorrência de rearranjos cromossômicos particulares (Lima et
al., 2011).
As características cromossômicas observadas em C. pullus e M. niger, como a
presença de um único par de RONs e blocos de heterocromatina em sua maior parte
pericentroméricos têm sido relatado para outros Tetraodontiformes (Martinez et al., 2010;
2011), Perciformes (Calado et al., 2013; Lima-Filho et al., 2014), Mugiliformes (Nirchio et
al., 2009), Beryciformes (Bacurau & Molina, 2004). Estas características fileticamente
disseminadas corroboram a hipótese de que constituem características ancestrais para diversos
grupos e, portanto, não exclusivas para as famílias Monacanthidae e Balistidae. Além disso, a
associação entre RONs e heterocromatina ricas em bases GC, observada em ambas as
espécies analisadas, é frequentemente descrita em peixes (Almeida-Toledo et al., 1996;
Nascimento et al., 2014), onde estas regiões mostram-se adjacentes, sobrepostas ou
intercaladas às RONs, o que pode favorecer rearranjos nos pares portadores (Vicari et al.,
2003; Martinez et al., 2011).
Em ambas espécies, os sítios ribossomais 5S, foram localizados no par 10, em posição
pericentromérica, o que sugere homeologia destes cromossomos e evidências do estreito
relacionamento filogenético entre Monacanthidae e Balistidae (Lima et al., 2011). Em muitos
vertebrados, genes DNAr 5S estão localizados em um único par de cromossomos, no entanto,
nos peixes, estes genes podem ser encontrados em um ou vários pares cromossômicos (Lima-
Filho et al., 2014). A localização dos sítios 5S em um único par de cromossomos tem sido
relatada para várias espécies de peixes (Sola et al., 2000). Esta característica parece
representar uma condição basal para o grupo (Martins & Galetti, 2001; Jacobina et al., 2012).
Sítios 5S rDNA não sintênicos com a subunidade DNAr 18S constitui o padrão mais
comumente encontrado em peixes (Martins & Galetti, 2001; Neto et al. 2011; Molina et al.,
2013), assim como ocorrido para C. pullus e M. niger. Esta situação também já foi
evidenciada em outras famílias de Tetraodontiformes, como Diodontidae, Tetraodontidae
(Noleto et al., 2007; Vicari et al., 2012).
As regiões heterocromáticas são altamente variáveis entre os organismos (Brutlag,
1980), desempenhando um papel chave na evolução dos cariótipos dos peixes. Podem estar
relacionadas a polimorfismos, sejam eles intra-individuais (Vasconcelos & Molina, 2009),
intra-populacionais (Mantovani et al., 2001) ou inter-populacionais (Molina et al., 2008;
Jacobina et al., 2009). Dessa maneira, essas regiões, frequentemente associadas com a
36
diversificação cariotípica nos peixes (Mantovani et al., 2001; Molina & Freitas, 2007), podem
ter contribuído na diferenciação cariotípica de Balistoidea.
A presença de heterocromatina associada com RONs, em regiões adjacentes ou
intercalados (Pendás et al., 1993), tal qual apresentado para M. niger, pode contribuir para a
ocorrência de rearranjos estruturais envolvendo os pares portadores (Vicari et al., 2003). No
entanto, deve-se salientar que heterocromatina pode ser mais complexa do que se estima,
abrigando um grande número sequências repetitivas (histonas, transposons, retrotransposons e
microssatélites), como revelado em algumas espécies de Perciformes (Costa et al., 2013,
2014)
As inferências sobre ocorrência de fusões in tandem nos grupos foram corroboradas
pelas respostas da FISH com sequências (TTAGGG)n. Estas sequências estão presentes nos
telômeros de cromossomos de vertebrados e a sua análise permite determinar a presença de
rearranjos envolvidos na evolução cromossômica, tais como fusões ou inversões
Robertsonianas e fusões in tandem (Jacobina et al., 2011; Cioffi et al., 2011). Dessa maneira,
as sequências (TTAGGG)n foram localizadas nas regiões teloméricas dos cromossomos de M.
niger como de C. pullus. Entretanto, sítios teloméricos intersticiais (ITS) estavam presentes,
em C. pullus nos pares 1, 3 e 4 (Figura 2) o que indica que fusões in tandem provavelmente
estiveram envolvidas na evolução cariotípica do grupo, onde ocorreu a fusão entre pares
acrocêntricos menores, dando origem aos três pares citados do complemento.
As sequências de DNA repetitivo compreendem uma fração substancial do genoma de
muitos eucariotos e podem estar dispersas ou situadas em repetições in tandem (Charlesworth
et al., 1994). Esta classe de DNA encontra-se principalmente em regiões centroméricas e
teloméricas, achando-se associados a regiões heterocromáticas (Martinez et al., 2010). Assim,
ITS se mostraram co-localizados com blocos heterocromáticos intersticiais (Figura 2),
situação que reforça pontos de fusões in tandem nas espécies analisadas.
Por outro lado, apesar de possivelmente terem sofrido mecanismos de fusão in
tandem, em M. niger não foram identificados ITS, com sequências teloméricas presentes
apenas nas regiões dos telômeros. Embora a presença de sítios teloméricos intersticiais seja
evidência visível de processos de fusões cromossômicas, nem sempre são facilmente
detectados, uma vez que essas sequências se modificam rapidamente após a fusão,
provavelmente como decorrência da perda da função do telômero ou devido ao acúmulo de
mutações que se perderam ao longo do tempo (Jacobina et al., 2011; Fernandes et al., 2015).
37
O conhecimento sobre os aspectos do genoma Balistoidea ainda é limitado, embora se
saiba que, como os Tetraodontidae, este clado é composto por espécies com genomas
compactos que evoluíram de forma independente (Brainerd et al., 2001). Contudo, o genoma
Tetraodontidae tem sido extensamente estudado (Crollius et al., 2000), revelando que a
pequena quantidade de sequências repetitivas está localizada nos centrômeros e braços dos
cromossomos. Esta disposição física parece estar presente nos cromossomos de Balistoidea e
poderia ajudar a explicar por que as regiões centroméricas e dos telômeros estariam propensas
à ocorrência de fusões ou rearranjos cromossômicos.
Adicionalmente um número diploide inferior a 48 cromossomos, em ambos Balistidae
e Monacanthidae, corrobora que eventos de fusão in tandem, parecem ter sido um mecanismo
importante na diferenciação cariotípica destes pós-grupo Perciformes.
Agradecimentos
Os autores agradecem ao CNPq pelo apoio financeiro (556793/2009-9), ao Instituto
Brasileiro de Meio Ambiente e Recursos Renováveis pela licença de coleta dos exemplares
(Processo No. 19135/1), a Universidade Federal do Rio Grande do Norte por prover os meios
para conduzir o estudo.
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43
4.2 CAPÍTULO II
ASPECTOS DA REDUÇÃO GENÔMICA EM TETRAODONTIFORMES INFERIDA POR
DADOS CITOGENÉTICOS EM TETRAODONTIDAE E MONACANTHIDAE
Juliana G. Bezerra1; Luiz A.C. Bertollo2; Gideão W.W.F da Costa1; Rodrigo X. Soares1;
Marcelo B. Cioffi2 ;Wagner F. Molina1
1 Departamento de Biologia Celular e Genética, Universidade Federal do Rio Grande do
Norte
2 Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos
Resumo
A ordem Tetraodontiformes está dividida em dez famílias, algumas apresentando
características singulares, com relação as suas estruturas cariotípicas e genômicas. A família
Tetraodontidae apresenta, indivíduos com os menores genomas entre os vertebrados e
representado, normalmente, por diminutos cromossomos com número diploide em torno de
46. Em contrapartida a família Monacanthidae, também com baixo conteúdo de DNA,
apresenta espécies com 2n reduzidos, geralmente, em torno de 36. Visando analisar padrões
de mudança em espécies com redução genômica, foram realizadas análises citogenéticas
convencionais (coloração pelo Giemsa, bandamento C, Ag-RONs, fluorocromos base-
específicos) e mapeamento físico de sequências ribossomais por hibridação in situ com
fluorescência (FISH) nas espécies Sphoeroides testudineus (Tetraodontidae) e Monacanthus
chinensis (Monacanthidae). As espécies revelaram cariótipos dispares, tanto em relação ao
número diploide, quanto ao número de braços cromossômicos, das quais S. testudineus
apresentou 2n=46 (NF=74), com cromossomos diminutos, e M. chinensis com 2n=34
(NF=34) cromossomos acrocêntricos. As marcantes divergências na estrutura cariotípica
evidenciam que mesmo genomas compactos podem exibir elevada dinâmica cromossômica.
Palavras-chave: Carioevolução, tamanho do genoma, evolução cromossômica, cangulo,
baiacu
44
ASPECTS OF GENOMICS REDUCTION IN TETRAODONTIFORMES INFERRED BY
CYTOGENETICAL DATA IN TETRAODONTIDAE AND MONACANTHIDAE
Juliana G. Bezerra1; Luiz A.C. Bertollo2; Gideão W.W.F da Costa1; Rodrigo X. Soares1;
Marcelo B. Cioffi2 ;Wagner F. Molina1
1 Departamento de Biologia Celular e Genética, Universidade Federal do Rio Grande do
Norte
2 Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos
Abstract
The Tetraodontiformes order is divided into ten families, some featuring singular
characteristics, related to their karyotypical and genomic structures. The Tetraodontidae
family presents, individuals with the smallest genomes among vertebrates and represented,
usually, by tiny chromosomes with diploid number around 46. However the Monacanthidae
family, also with low DNA content, presents species with reduced 2n, generally around 36. In
order to analyze changing patterns in species with genomic reduction, conventional
cytogenetics analyzes were performed (Giemsa staining, C-banding, Ag-NORs, base-specific
fluorochromes staining) and physical mapping of ribosomal sequences through in situ
hybridization with fluorescence in the species Sphoeroides testudineus (Tetraodontidae) and
Monacanthus chinensis (Monacanthidae). The species showed disparate karyotypes, as in
relation to diploid number, as well to the number of chromosomal arms, of which S.
testudineus presented 2n = 46 (NF = 74) with tiny chromosomes, and M. chinensis 2n = 34
(NF = 34) acrocentric chromosomes. The striking divergences at the karyotypical structure
evidenced that even compact genomes can display high chromosomal dynamics.
Keywords: Karyoevolution, genome size, chromosomal evolution, triggerfish, pufferfish.
45
Introdução
As 440 espécies de Tetraodontiformes (Eschmeyer & Fong, 2016), estão divididas em
dez famílias e representam uma das mais peculiares radiações morfológicas e ecológicas de
peixes teleósteos (Santini et al., 2013a; Matsuura, 2014). A ordem exibe notável diversidade
de formas corporais e tamanhos, estruturas esqueléticas, ecologia e tamanho do genoma
(Brainerd et al., 2001; Santini & Tyler, 2003; Jaillon et al., 2004). Embora metade da
diversidade de Tetraodontiformes seja associada a ambientes recifais, as 10 famílias
reconhecidas habitam uma grande variedade de habitats (Alfaro et al., 2007). Apesar da
grande diversidade para o grupo, diversos estudos que envolvem dados morfológicos e
moleculares suportam o monofiletismo da ordem (Santini & Tyler, 2003, 2004; Holcroft,
2005; Alfaro et al., 2007; Yamanoue et al., 2008; Santini et al., 2013b).
Entre os vertebrados, o tamanho do genoma medido em picogramas (pg) de DNA por
célula haploide varia consideravelmente e estas variações também ocorrem entre as famílias
de Tetraodontiformes (Dolezel et al., 2003). Dentre elas, Tetraodontidae apresenta os menores
conteúdos de DNA dentre os vertebrados (0,34-0,82 pg) (Noleto et al., 2009; Gregory, 2016).
Ainda com baixos conteúdos de DNA, destaca-se as famílias Monacanthidae e Balistidae,
apresentando valores entre 0,54 – 0,77 (Gregory, 2016). Enquanto que Ostraciidae,
Diodontidae, Triacanthidae e Molidae exibem maiores conteúdos de DNA por célula, com
valores variando entre 0,60 – 1,10 (Gregory, 2016).
Apesar dos Tetraodontiformes ter um complemento similar de genes a de outros
vertebrados, o pequeno tamanho é aparentemente o resultado de perda de introns e de DNA
repetitivo (Elgar et al. 1999; Loh et al., 2008). Devido a esta notável compactação do
genoma, os Tetraodontiformes tornaram-se um modelo atrativo para a genômica comparativa,
essencialmente útil no entendimento da evolução genômica e cariotípica de vertebrados
(Jaillon et al., 2004). Associado a essa característica, a ordem apresenta, ainda, uma variedade
de tendências carioevolutivas com a presença de inúmeros rearranjos, além de valores
diploides variando de 2n=28 a 52 cromossomos e de uma considerável diferenciação em
relação ao número de braços cromossômicos, com valores de NF entre 34 e 96 (Arai, 2011;
Martinez et al., 2011). Essas peculiaridades torna a ordem intrigante e particularmente
interessante aos estudos citogenômicos.
Assim, com vistas a identificar e discutir a dinâmica cromossômica sob condições de
redução genômica em Tetraodontidae e Monacanthidae foram realizadas análises
46
citogenéticas em Sphoeroides testudineus (Tetraodontidae) e Monacanthus chinensis
(Monacanthidae), por métodos citogenéticos clássicos (bandamento C, Ag-RON), coloração
com fluorocromos base-específicos MM+/DAPI- e pelo mapeamento por FISH de sequências
do DNAr 18S e DNAr 5S.
Material e Métodos
Coleta de espécimes, obtenção de cromossomos mitóticos e bandamentos cromossômicos
Os exemplares de Sphoeroides testudineus (Linnaeus, 1758) (n=12) (Tetraodontidae) e
Monacanthus chinensis (Osbeck, 1765), n=2 (Monacanthidae) utilizados nas análises
citogenéticas foram coletados no Atlântico Sul, respectivamente, em Natal, Rio Grande do
Norte, (5º52´S, 35º10´O) e no Mar de Andaman (11º04’00”N, 95º44’34”L), no litoral da
Tailândia, no oceano Índico.
Após a coleta, os exemplares foram estimulados com injeção intraperitoneal de
complexos comerciais de antígenos bacterianos e fúngicos, por um período de 24 a 48 horas
(Molina et al., 2010). Decorrido este tempo, os exemplares foram anestesiados com óleo de
cravo (Eugenol) e após a eutanásia procedeu a extração do rim anterior. Os cromossomos
mitóticos foram preparados a partir da suspensão de fragmentos do tecido renal de acordo
com a técnica in vitro preconizada por Gold et al. (1990). Os cromossomos foram corados
com solução de Giemsa à 5%, diluída em tampão fosfato pH 6,8. As regiões heterocromáticas
foram visualizadas através do bandamento C, segundo Sumner (1972). As regiões
organizadoras de nucléolo (RONs) foram obtidas pela técnica de impregnação por prata,
idealizada por Howell & Black (1980).
A coloração pelos fluorocromos Mitramicina e DAPI foi realizada seguindo a técnica
de Schweizer (1976). As lâminas foram preservadas em câmara escura à temperatura
ambiente por 4 dias e então analisadas, sendo as melhores metáfases fotografadas em
fotomicroscópio de epifluorescência com filtros apropriados (OlympusTM BX50) sob aumento
de 1000X e capturadas e digitalizadas, por meio de um sistema digital de captura Olympus
DP73 com o uso dos software cellSens (Olympus Optical Co.ltd.) e DPManager, v.1.2.1.108
(Olympus Optical Co.ltd.) para a sobreposição das imagens.
47
Hibridização in situ fluorescente – FISH
Obtenção de sondas
As sondas de DNAr 5S (200 pb) e 18S DNAr (1400 pb) foram obtidas via PCR a
partir de amostras de DNA de Rachycentron canadum (Teleostei, Perciformes), utilizando os
iniciadores A 5'-TAC CCG CGA TCT CGT CCG ATC-3 '/ B 5'-CAG GGT GCT ATG CCG
GTA AGC-3' (Pendás et al., 1994) e NS1 5'-GTC ATA GTA TGC TTG TCT C-3' / NS8 5'-
TCC GCA GGT TCA CCT ACG AG-3' (White et al. 1990), respectivamente. A sonda 18S
foi marcada por nick translation com digoxigenina-11-dUTP (Roche) e a sonda DNAr 5S foi
marcada por nick translation com biotina-14-dATP (Roche), de acordo com as especificações
do fabricante. As sequências (TTAGGG)n foram mapeadas pela técnica de FISH com Kit
FISH Telomere PNA/FITC de acordo com as instruções do fabricante (DakoCitomation).
Hibridização cromossômica
A hibridização in situ com fluorescência foi realizada em metáfases mitóticas (Pinkel
et al., 1986) das duas espécies. Análise por dual-color FISH foi desenvolvida usando sondas
DNAr 18S e DNAr 5S. Os cromossomos foram tratados com RNAse livre de DNAse (20mg /
mL em 2xSSC ) à 37°C por 1 hora, com pepsina (0,005 % em HCl 10mM) à 37°C por 10
minutos e fixados com formaldeído a 1% por 10 minutos, em seguida desidratados em série
alcoólica. Os cromossomos foram, então, desnaturados em 70% formamida/2×SSC à 72°C
por 5 minutos. A solução de hibridização consistiu em 50% de formamida, 2×SSC, 10% de
sulfato de dextran e a sonda desnaturada (5 ng/μl). Após hibridação, overnight à 37°C, as
lâminas foram lavadas em 15% formamida/0.2×SSC à 42°C por 20 minutos, 0,1×SSC à 60 °C
por 15 minutos e Tween20 0,5%/4×SSC à temperatura ambiente. O sinal de hibridização da
sonda foi detectado usando streptavidina-FITC conjugada (Vector) para a sonda DNAr 5S e
anti-digoxigenina rodamina conjugada (Roche) para a sonda DNAr 18S. Os cromossomos
foram contracorados com Vectashield/DAPI (1,5 μg/ml). As análises da FISH e registro
fotográfico foram realizados conforme descrito para as análises de fluorocromos. Os
cromossomos foram definidos de acordo com a relação entre os braços, de acordo com Levan
et al. (1964).
48
Resultados
Os dados citogenéticos obtidos para S. testudineus corroboram dados prévios para a
espécie (Sá-Gabriel & Molina, 2005). O cariótipo é formado por 2n=46 (NF=74). Os sítios
Ag-RON/MM+/DAPI- são únicos e localizados em posição terminal no par 5 (Figura 1a), o
que foi confirmado com hibridação in situ com sondas DNAr 18S. Os sítios DNAr 5S estão
localizados no maior par submetacêntrico, em posição terminal do braço menor (Figura 1c).
Regiões heterocromáticas em pequena quantidade se apresentam dispersas em regiões
pericentroméricas e terminais na maior parte dos cromossomos (Figura 1b).
A espécie Monacanthus chinensis apresentou notável redução do número de
cromossomos, com 2n=34 (NF=34) (Fig. 1a). As regiões heterocromáticas (Figura 1b) para a
referida espécie, também se apresentaram em pequena quantidade e se mostraram em grande
parte com localização pericentromérica, com destaque para os pares 1, 7 e 12 que
apresentaram blocos mais conspícuos. Os sítios Ag-RONs/MM+/DAPI- são únicos e
localizados no par 5, o que foi corroborado por sinais de hibridização com sondas DNAr 18S.
49
Figura 6. Cariótipos de S. testudineus e M. chinensis através de (a) coloração convencional (em destaque os
sítios Ag-RONs); (b) Bandamento C; (c) double-FISH com sondas DNAr 18S (sinais vermelhos) e DNAr 5S
(sinal verde). Barra=5 μm.
50
Discussão
Os padrões citogenéticos de S. testudineus e M. chinensis, reforçam a diversidade
cariotípica presente em Tetraodontiformes. As regiões heterocromáticas em M. chinensis e
em S. testudineus estão localizadas em posição pericentromérica da maioria dos pares de
cromossomos e apresentam conteúdo reduzido. Em M. chinensis apresentam blocos mais
conspícuos sobre alguns poucos pares cromossômicos. O baixo conteúdo heterocromático em
ambas as espécies parece ser reflexo da diminuição evolutiva do tamanho do genoma
(Hinegardner, 1968; Brainerd et al., 2001; Jaillon et al., 2004). Essa característica genômica
deve-se presumivelmente à perda de DNA repetitivo e não codificantes (Neafsey & Palumbi,
2003).
Os padrões heterocromáticos presentes nos cromossomos dessas espécies indicam
caminhos evolutivos particulares. Em S. testudineus, os blocos heterocromáticos se encontram
limitados a pequenos blocos nas regiões centroméricas de alguns pares cromossômicos e
associados às regiões organizadoras de nucléolos. Esta condição tem sido observada na
maioria das espécies de Tetraodontidae, como em S. greeleyi (Sá-Gabriel & Molina, 2005;
Noleto et al., 2009), Tetraodon fluviatilis (Mandrioli & Manicardi, 2001) e T. nigroviridis
(Fischer et al., 2000; Mandrioli et al., 2000). Por outro lado, em M. chinensis e outros
Monacanthidae (Lima et al., 2011), os blocos heterocromáticos reduzidos, evidenciam a
possível perda de sequências de DNA repetitivo (Petrov, 2001), durante o processo
carioevolutivo.
Genomas compactos são resultado de deleções acumuladas ou representa um estado
derivado, esta condição contrapõe à expansões genômicas que ocorreram em outros grupos,
derivadas de duplicações in tandem, inserções, poliploidia, atividade de elementos de
transposição ou ainda da acumulação de sequências repetitivas, (Venkatesh et al., 2000;
Petrov, 2001; Nirchio et al., 2014).
A ordem revela outras tendências carioevolutivas, com alguns rearranjos estruturais,
tais como, fissões cêntricas, fusões e inversões pericêntricas com ocorrência preferencial em
algumas famílias e não em outras (Sá-Gabriel & Molina, 2005). A redução no número do
complemento parece ser uma característica para a família Monacanthidae e Balistidae (Lima
et al., 2011).
Modelos de diversificação evolutiva de cromossomos em peixes são geralmente
ausentes, com poucas exceções. Evidências da participação da deriva meiotica, bem como de
ortoseleção cariotípica têm sido identificadas em diversos grupos, incluindo
51
Tetraodontiformes (Molina & Freitas, 2007; Molina et al., 2014b). Nestes grupos alguns
clados exibem claramente uma propensão para a fixação de certos tipos de rearranjos
cromossômicos em detrimento de outros, condição aparentemente presente tanto em
Tetraodontidae, como Monacanthidae (Molina et al., 2014b).
As características genômicas desta ordem parece influenciar na dinâmica estrutural e
tamanho dos cromossomos, a exemplo do que ocorre em famílias, como Ostraciidae. Nesta
família as espécies Acanthostracion polygonius e A. quadricornis apresentam os maiores
pares cromossômicos do cariótipo variando em tamanho de 2,5-4,5 µm (Martinez et al.,
2011), enquanto que Lactoria diaphana possuem grandes cromossomos metacêntricos, com
aproximadamente 8µm (Arai, 1983; 2011). É importante ressaltar, também, que a família
Ostraciidae exibe indivíduos com quantidades mais significativas de DNA, quando
comparados a membros de outras famílias, a exemplo dos Tetraodontidae (Brainerd et al.,
2001; Vicari et al., 2012).
Assim, como para a maioria dos organismos, as diferenças no tamanho do genoma
para os Tetraodontiformes não está relacionada a diferenças quanto a ploidia, mas pode ser
percebida quanto ao tamanho e conteúdo de heterocromatina nos cromossomos, como podes
ser percebido para outros Tetraodontiformes, a exemplo de Sphoeroides testudineus e S.
spengleri (Tetraodontidae) que apresentam diminutos cromossomos e os grandes
cromossomos de Chilomycterus spinosus (Diodontidae) (Noleto et al., 2009). Essas
características claramente diferenciam as inúmeras tendências genômicas sofridas entre os
diferentes clados da ordem.
Nesse contexto, o conjunto de dados de conteúdo de DNA de peixes teleósteos,
sugerem uma correlação entre conteúdo de DNA e evolução nesse grupo (Hinegardner, 1968).
Espécies mais derivadas de peixes têm menor conteúdo de DNA por núcleo do que formas
mais ancestrais, sugerindo implicitamente que a evolução e a especialização em teleósteos
tenha sido acompanhada por perda de DNA (Hinegardner, 1968; Yi & Streelman, 2005).
Genomas mais basais como os da ordem Acipenseriformes, são cerca de 20 vezes maior que
alguns encontrados em Tetraodontiformes, grupo mais derivado (Nirchio et al., 2014).
A análise das estruturas cariotípicas de M. chinensis e S. testudineus demonstrou
evidências que reforçam para a redução genômica e fixação cariotípica preferencial em
famílias de Tetraodontiformes.
52
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5. CONCLUSÕES
A ordem Tetraodontiformes tem se destacado por suas particularidades genômicas e
citogenéticas, no que diz respeito aos tamanhos genômicos que se apresentam com grandes
variações, apesar de ser uma ordem relativamente pequena, em número de espécies.
Destacam-se por recorrentes processos de diversificação cariotípica, com a diminuição em
seus números diploides e a ocorrência de diversos rearranjos estruturais, que têm influenciado
significativamente na evolução do grupo.
Nesse sentido, análises citogenéticas têm contribuído grandemente para compreensão
dos processos de diversificação e os caminhos evolutivos dentro de Tetraodontiformes. Os
dados aqui apresentados permitiram algumas conclusões em relação à carioevolução na
ordem:
• A presença de sequências teloméricas internalizadas indica a ocorrências de fusões in
tandem, preferencialmente envolvendo cromossomos pequenos, na diversificação
cariotípica de C. pullus;
• A redução numérica observada, tanto em Balistidae, como em Monacanthidae, sugere
que eventos de fusões in tandem, constituem um dos importantes mecanismos de
evolução cariotípica para estes grupos pós-Perciformes;
• O baixo conteúdo de heterocromatina, como observado para os cromossomos de S.
testudineus e M. chinensis, sugere que seja reflexo do tamanho do genoma, uma vez
que a redução do conteúdo de DNA é um mecanismo peculiar envolvido na evolução
do genoma dos Tetraodontiformes;
• Apesar de representarem cariótipos compactos, M. chinensis (Monacanthidae) e S.
testudineus (Tetraodontidae) exibem tendências evolutivas próprias, onde a redução
numérica dos cromossomos na primeira, possivelmente derivada de eventos de fusões,
contrasta com cariótipos largamente formado por elementos bi-braquiais encontrados
na segunda.
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6. REFERÊNCIAS
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