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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA ANA BEATRIZ ARRAIS INFLUÊNCIA DO DIODO EMISSOR DE LUZ (LED) DE ALTA POTÊNCIA SOBRE A RETINA UM ESTUDO PILOTO EXPERIMENTAL EM RATO Natal/RN 2017

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA

ANA BEATRIZ ARRAIS

INFLUÊNCIA DO DIODO EMISSOR DE LUZ (LED) DE ALTA POTÊNCIA SOBRE

A RETINA – UM ESTUDO PILOTO EXPERIMENTAL EM RATO

Natal/RN

2017

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ANA BEATRIZ ARRAIS

INFLUÊNCIA DO DIODO EMISSOR DE LUZ (LED) DE ALTA POTÊNCIA SOBRE A

RETINA – UM ESTUDO PILOTO EXPERIMENTAL EM RATO.

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado no curso de Graduação de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito para obtenção do título de Cirurgiã-Dentista. Orientador: Prof. Dr. Sergei Godeiro Fernandes Rabelo Caldas Coorientador: Prof. Dr. Ruthnaldo Rodrigues Melo de Lima

Natal/RN

2017

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Catalogação na Fonte. UFRN / Departamento de Odontologia Biblioteca Setorial de Odontologia “Profº Alberto Moreira Campos”.

Arrais, Ana Beatriz. Influência do diodo emissor de luz (LED) de alta potência sobre a retina – um estudo piloto experimental em rato / Ana Beatriz Arrais. – Natal, RN, 2017.

29 f.: il. Orientador: Prof. Dr. Sergei Godeiro Fernandes Rabelo Caldas. Monografia (Graduação em Odontologia) – Universidade Federal do Rio

Grande do Norte. Centro de Ciências da Saúde, Natal, 2017.

1. Luzes de cura dentária - Monografia. 2.Ortodontia - Monografia. 3. Propriedades de superfície - Monografia. 4. Retina - Monografia. 5. Ratos - Monografia. I. Caldas, Sergei Godeiro Fernandes Rabelo. II. Título.

RN/UF/BSO BLACK D4

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Ana Beatriz Arrais

INFLUÊNCIA DO DIODO EMISSOR DE LUZ (LED) DE ALTA POTÊNCIA SOBRE A

RETINA – UM ESTUDO PILOTO EXPERIMENTAL EM RATO

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado no curso

de Graduação de Odontologia da Universidade Federal

do Rio Grande do Norte como requisito para obtenção

do título de Cirurgiã-Dentista.

Aprovado em ____/____/_____.

BANCA EXAMINADORA

______________________________________________________

Prof. Dr. Sergei Godeiro Fernandes Rabelo Caldas

Universidade Federal do Rio Grande do Norte

(Orientador)

__________________________________________________

Prof. Dr. Ruthnaldo Rodrigues Melo de Lima

Universidade Federal do Rio Grande do Norte

(Membro)

__________________________________________________

Prof. Dr. Arthur César de Medeiros Alves

Universidade Federal do Rio Grande do Norte

(Membro)

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Dedico este trabalho aos que amo e que

acompanharam de perto essa caminhada,

prestando apoio incondicional. Especialmente

aos meus pais, Nivia e Ricardo, minha eterna

gratidão.

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AGRADECIMENTOS

Primeiramente, agradeço a Deus por todas as pessoas que Ele colocou em

meu caminho, para que eu pudesse concluir mais uma etapa acadêmica. Sou grata

pelo privilégio de poder aprender sempre mais e de ter forças e apoio frente às

dificuldades enfrentadas ao longo dessa jornada.

Aos meus pais, Nivia e Ricardo, genuinamente os maiores incentivadores do

meu crescimento pessoal e da minha educação. Obrigada por nunca medirem

esforços e por sempre me apoiarem em tudo que já sonhei, mesmo quando o

coração apertava diante dos medos e inseguranças. Devo tudo a vocês.

Aos meus irmãos, Luciana e Daniel, que sempre foram meus maiores

exemplos de dedicação e humildade. Agradeço pela atenção e carinho nos

momentos que precisei. Não poderia deixar de agradecer também a quem chegou

de surpresa e trouxe leveza e alegria nos dias corridos e estressantes na rotina:

minha sobrinha Sofia.

Ao meu namorado Yvisson, pela compreensão nos momentos de ausência,

pelo amor e apoio diante de todos os desafios e por me ensinar diariamente a ser

mais positiva e generosa.

Aos amigos que conquistei ao longo dessa jornada e que se tornaram família,

“eternos 99”, especialmente Lidya Araújo e minha primeira dupla, Fernanda

Fagundes. Além disso, aos mais recentes e de grande importância nesta etapa final,

Jessika, Victoria, Matheus, Carolina, Amanda, Fernanda e Isabelle. Muito obrigada

por dividirem momentos tão valiosos, pelo apoio, amizade e cumplicidade, nas

alegrias e nos desafios da nossa profissão.

A Marcela, por ser minha companheira em todos os momentos, assumindo

esse desafio comigo, de braços abertos, e tornando-se mais que uma colega de

pesquisa, mas uma amiga e parceira de vida. Agradeço pela ajuda e pelas palavras

de incentivo nos momentos certos. A Ariane, por todo o auxílio e conselhos durante

a construção dos nossos trabalhos.

Ao Prof. Dr. Arthur César, agradeço desde já por toda a contribuição que

certamente acrescentará muito desenvolver do meu trabalho, além de toda a

disponibilidade.

Ao meu orientador, Prof. Dr. Sergei Rabelo, primeiramente por depositar sua

confiança em mim para a realização de uma pesquisa que se tornou especial e me

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acrescentou muito, profissionalmente e pessoalmente. Obrigada pelos conselhos,

dedicação e especialmente pelos ensinamentos que me foram transmitidos. Não há

nada mais gratificante do que ser orientada brilhantemente por alguém que nos

serve de inspiração e por isso agradeço profundamente.

Ao meu coorientador, Prof. Dr. Ruthnaldo Lima, que assumiu grande parte da

execução dessa pesquisa, fazendo-me sair da minha zona de conforto e

despertando grande interesse na área de pesquisa. Agradeço pela disponibilidade,

entusiasmo e por todo o conhecimento que me foi humildemente passado.

A todos os funcionários do Departamento de Morfologia da UFRN e a todos

que, de alguma forma, contribuíram para a execução desta pesquisa.

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RESUMO

Introdução: A evolução dos fotopolimerizadores quanto à sua potência e

consequente redução do tempo clínico tem se mostrado de grande valia para a

otimização da rotina de colagem de bráquetes ortodônticos. Contudo, existe uma

carência na literatura do efeito desses aparelhos sobre a retina do profissional e/ou

paciente, uma vez que estes podem receber indiretamente parte da luz refletida

durante os procedimentos clínicos Assim sendo, o presente estudo teve como

objetivo avaliar a influência do uso de um fotopolimerizador à base de diodo emissor

de luz (LED) de alta potência na retina do rato. Material e Métodos: Um rato Wistar

foi usado como objeto de estudo, sendo um dos olhos considerado como amostra

controle (esquerdo), coberto com um tampão removível durante a fotoestimulação

do olho contralateral. O outro olho (direito) foi, então, exposto à luz do LED na

potência Xtra de 3200mW/cm2 (Valo Ortho - Ultradent), por 144 segundos, à

distância de 30cm, seguindo um protocolo de exposição três vezes ao dia, durante

um dia, com um intervalo de 4 horas entre cada aplicação. Decorridos sete dias da

primeira fotoestimulação, o animal foi anestesiado, procedido à eutanásia para

remoção dos olhos e processamento histológico. As lâminas foram digitalizadas

utilizando uma câmera acoplada a um microscópio óptico e suas imagens

analisadas para aferição de parâmetros morfológicos da retina. Resultados: Houve

um aumento estatisticamente significativo na espessura de todas as camadas,

exceto da camada nuclear externa (CNE). Em relação à densidade, apenas a

camada nuclear interna (CNI) apresentou diferença, com uma diminuição no olho

experimental em relação ao olho controle. Além disso, a área nuclear das células de

todas as camadas aumentou no olho exposto à luz LED de alta potência. Por fim,

observou-se um aumento dos prolongamentos de cones e bastonetes (PCB),

aumento do espaço citoplasmático na CNI e células hipercromadas sugestivas de

picnose. Conclusões: Mesmo com um protocolo agudo e curto de exposição do

olho à luz LED de alta potência, houve uma alteração, especialmente da atividade

metabólica das células fotossensíveis e neuronais, o que ressalta a necessidade de

proteção durante a utilização desses aparelhos fotoativadores, assim como o estudo

desse efeito a longo prazo e com mais animais.

Palavras-chave: Luzes de cura dentária; Ortodontia; Retina; Ratos.

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ABSTRACT

Introduction: The evolution of light curing units (LCU) in terms of potency and

consequent reduction of clinical time have been shown to be of great value to

orthodontists, regarding the routine of brackets bonding. However, there is a lack in

the literature regarding the effect of these devices on the operator and/or patient

retina. Therefore, the present study aimed to evaluate the influence of the use of a

light emitting diode-based device (LED) in the retina of a Wistar rat. Methods: A

single Wistar rat was used as the object of study, one eye was considered as control

sample (left eye) and was covered with a removable tampon during the contralateral

eye photostimulation. The other eye (right eye) was exposed to LED light at Xtra

potency mode of 3200mW/cm2 (Valo Ortho - Ultradent), for 144 seconds, at the

distance of 30cm, following a protocol of three exposures per day, for one day, within

4 hours between each application. Seven days after the first photostimulation, the

animal was anesthetized and then euthanized for posterior eye removal and

histological processing. The histological slides were scanned using a camera

connected to an optical microscope and their images analyzed for the measurement

of morphological parameters of the retina. Results: A statistically significant raise

was found in all layers of retina in relation to thickness, except for the outer nuclear

layer (ONL). Regarding density, a statistically significant decrease was found for the

inner nuclear layer (INL) of exposed eye. Besides that, the nuclear area of the cells

raised in all layers analyzed after high potency LED exposure. Lastly, the extension

of cone and rods (ECR) also increased, as well as the citoplasmatic space on INL

and the appearance of hyperchromic cells suggestive of pyknosis. Conclusions:

Despite the short and acute protocol of eye exposure to high potency LED, a

significant alteration was found, especially in the metabolic activity of photosensitive

and neuronal cells. These results emphasize the importance of using eye protection

during the use of these devices, as well as a further research on the long term

effects with more animals.

Keywords: Curing Lights, Orthodontics, Retina, Rats.

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 10

2 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................... 12

3 RESULTADOS...................................................................................................... 14

4 DISCUSSÃO ......................................................................................................... 15

5 CONCLUSÃO ....................................................................................................... 19

REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 21

LEGENDA DAS FIGURAS ...................................................................................... 23

FIGURAS ................................................................................................................. 24

TABELAS ................................................................................................................ 26

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1 INTRODUÇÃO

Em virtude da constante evolução tecnológica dos materiais e aparelhos

odontológicos usados rotineiramente nas clínicas, é crucial destacar a importância

de se conhecer as propriedades físicas desses, para que possamos usá-los da

forma mais eficaz, obtendo assim os melhores resultados possíveis em nossos

tratamentos. Nesse sentido, o mercado passou pelas mais diversas fontes para

polimerização de materiais odontológicos, como luzes halógenas de tungstênio de

quartzo, lâmpadas de plasma, laser de argônio, até chegar à atual luz emissora de

diodo (LED), que tem como objetivo sanar os aspectos negativos provenientes das

fontes anteriores,1,2 tais como o pouco tempo de vida útil dos aparelhos devido ao

calor gerado, o que acaba aumentando a temperatura pulpar,3 diminuindo a

emissão de luz com o tempo e consequentemente o grau de conversão dos

monômeros.4,5

Dentre esses aparelhos fotoativadores à base de LED, há uma grande

variação quanto à forma de apresentação e, principalmente, com relação à potência

da luz emitida. Com o intuito de otimizar o tempo clínico, os LEDs de alta potência,

que permitem uma rápida polimerização e maior estabilidade na emissão de luz,

têm sido alvo de diversos estudos comparativos com as fontes de luz mais antigas,

como a luz halógena. Os resultados dessas pesquisas mostram que a força de

adesão do compósito resinoso ao substrato dentário quando polimerizado com

LEDs de alta potência, se apresenta tão satisfatória quanto a polimerização

realizada com luz halógena.6,7 Entretanto, quanto à profundidade da polimerização e

o grau de conversão de monômeros, o LED apresentou melhores resultados.5

No que se refere ao calor gerado durante a cura do material, os estudos

mostram que esta relação é diretamente proporcional ao tempo de exposição, da

mesma forma que quanto maior a intensidade do LED, maior o aumento de

temperatura registrado na câmara pulpar, o que aumenta o risco de danos pulpares.

Porém, quando comparados os aumentos de temperatura pulpar, foi comprovado

que a luz halógena resulta em valores significativamente maiores quando

comparados ao LED.3 Por isso, se fazia necessário atentar à regulamentação

desses aparelhos, assim como ao tempo de exposição.8,9

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Apesar das algumas vantagens já afirmadas cientificamente, existem estudos

que comprovam um potencial dano ocular proveniente de aparelhos LED de alta

potência.10,11,12,13 Mesmo assim, ainda observa-se uma limitação de estudos

experimentais, que possam simular de forma mais fiel a situação clínica vivida pelos

cirurgiões-dentistas, especialmente os ortodontistas, que buscam nesses aparelhos

um meio mais eficaz e capaz de otimizar o tempo clínico durante uma sessão de

colagem de bráquetes, procedimento comum à rotina desses profissionais. Desta

forma, torna-se relevante a realização de um estudo que avalie a influência do LED

de alta potência nas estruturas retinianas, visando não somente analisar a

capacidade de gerar ou não lesão, como também identificar os aspectos

morfométricos após exposição a essa luz.

Sabe-se que retina é uma estrutura responsável pela fotossensibilidade do

olho, tendo uma forma de cálice característica. Os componentes responsáveis pelo

processamento luminoso se distribuem nas suas seis principais camadas, além de

estruturas associadas a ela, como o epitélio pigmentar da retina e o nervo óptico,

garantindo sua manutenção e transmissão das informações visuais.14 Numa

distribuição de fora para dentro, ou seja, o caminho que a luz percorre quando

incide sobre o olho, temos a camada de células ganglionares, a camada plexiforme

interna; camada nuclear interna; camada plexiforme externa; camada nuclear

externa e camada de prolongamentos de cones e bastonetes.

Especialmente na camada nuclear externa, é possível encontrar as principais

células fotorreceptoras, que captam e codificam as informações visuais e a

transmitem para o cérebro, conhecidas como cones e bastonetes. Além dessas, na

camada nuclear interna e camada de células ganglionares, existem células com

funções distintas, as células de Muller, que atuam como barreira hematorretiniana e

na transmissão de impulsos elétricos; células bipolares e ganglionares, que atuam

na via de transmissão vertical entre camadas e células horizontais, amácrinas e

interplexiformes, que atuam na via de transmissão horizontal.15 Essas células

interagem entre si em toda a extensão da retina, através de conexões sinápticas

para a transmissão e transdução dos impulsos elétricos, formando a grande rede de

conexões celulares da retina.

Portanto, sabendo da importância das células que constituem a retina para

todo o processamento visual, o objetivo desse trabalho foi avaliar as possíveis

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alterações encontradas nas estruturas retinianas, em rato, expostas a um LED de

alta potência, durante um protocolo que simularia um dia de atendimento do

ortodontista, representado por uma média de três sessões de colagem de

bráquetes.

2 MATERIAL E MÉTODOS

O presente estudo, experimental com base descritiva e inferencial, teve como

unidade de experimento e observação as retinas de um rato da linhagem Wistar

(Rattus norvegicus albinus), sendo a amostra composta pelas 02 (duas) estruturas

oculares referentes a este único rato.

Foi utilizado um animal adulto, sexo feminino, 300 gramas de peso, com 8

semanas de vida, oriundo do biotério de experimentação do Departamento de

Morfologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), mantido com

ração padrão extrusada (ad libitum) e água mineral natural conforme a Resolução

RDC n° 274, de 22 de setembro de 2005 da Agência Nacional de Vigilância

Sanitária. Esse animal foi selecionado de acordo com a disponibilidade do biotério,

com o aspecto da estrutura ocular, sendo este visualmente saudável, além do

cumprimento das especificações por parte do Comitê de Ética no Uso de Animais

(CEUA-UFRN). Toda a metodologia empregada neste estudo foi previamente

aprovada CEUA – UFRN, sob o protocolo nº 007012/2017.

O animal foi mantido durante todo o experimento no biotério experimental do

Departamento de Morfologia (DMOR) da UFRN, lotado no Museu de Ciências

Morfológicas, em uma caixa de polipropileno na proporção de 04 (quatro) animais

por caixa com as dimensões (41x34x16cm). O animal permaneceu em regime de

claro-escuro 12/12h em ciclo invertido em relação ao ambiente natural, com

intensidade luminosa no interior da gaiola de 60 lux.

Para a realização do experimento, o animal foi contido e anestesiado por via

inalatória, contendo uma mistura de isoflurano (4-5%) e oxigênio 100% (1l/min)

como dose de indução, e para manutenção a concentração foi de 1,5-3%. Em

seguida, um dos olhos foi fechado (esquerdo) e coberto com um tampão opaco

circular removível (3cm²), de PVC e fita isolante, na cor preta, e fixado à cabeça do

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animal por meio de um elástico, para que não fosse exposto à luz

fotopolimerizadora, constituindo, portanto, a amostra controle. O olho direito foi

então exposto à luz, sendo a amostra experimental de caso, respeitando uma

distância pré-definida de 30cm entre a ponta do aparelho e o olho do animal. Para

fotoestimulação, foi utilizado um aparelho de luz LED de marca comercial

VALO® (Ultradent, Utah, USA) no modo de alta potência (Xtra 3200mW/cm2).

(Figura 1)

Esse aparelho foi calibrado ao início do experimento, garantindo uma

intensidade de luz padrão. Além disso, a iluminância do fotoativador também foi

aferida com o uso de um luxímetro digital (Minipa® MLM-1010, Houston, USA),

atingindo aproximadamente 3500lux. A distância de 30cm foi determinada

considerando a distância do olho do dentista operador até a ponta da fonte de luz

durante um procedimento e foi obtida acoplando e fixando o aparelho LED a um

aparato metálico com a altura estabelecida. O outro olho, considerado como

amostra controle da pesquisa, permaneceu protegido pelo tampão durante todo o

tempo de aplicação.

O tempo de exposição à luz LED foi de um total de 144s por aplicação.. Esse

tempo simula o procedimento clínico da colagem de 24 bráquetes ortodônticos, de

primeiro molar a primeiro molar, inferior e superior, considerando um tempo total de

6s por elemento, visto que há uma aplicação de 3s na região cervical e outros 3s na

oclusal. Esse tempo de exposição foi utilizado por ser o protocolo clínico padrão da

especialidade, mas também a partir das especificações de uso do fabricante.

O animal foi avaliado após o protocolo de exposição ao LED de alta potência

que consistiu em 03 (três) aplicações diárias, com um intervalo de 4 horas entre

cada exposição, durante apenas 01 (um) dia, realizado pelos três pesquisadores

envolvidos.

Decorridos 07 (sete) dias da exposição ao LED, foi realizada então a

eutanásia do animal para a obtenção da estrutura ocular. O animal foi eutanasiado

com uma dose de Tiopental (90mg/kg) associado a Lidocaína 2% (10mg/Kg) em

seringa única, por via intraperitoneal, e em seguida, foi realizada a dissecação para

remoção das duas estruturares oculares. Após a dissecação, o protocolo de

processamento do material, assim como o passo a passo do preparo da lâmina

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histológica, seguiu o manual de Bermer (2003)16, elucidado na tabela I. As lâminas

foram preparadas com espécimes emblocados em parafina e padronizados com

4µm de espessura de corte, corados em seguida com hematoxilina e eosina (H&E).

Todos esses procedimentos foram realizados no Centro de Biociências, por

técnicos do laboratório de técnicas histológicas do DMOR com habilidades e

experiência para realizar corretamente os processos de anestesia, eutanásia,

dissecação e preparo da lâmina histológica.

A análise dos resultados foi realizada por três examinadores independentes

treinados a partir de um mesmo padrão de avaliação, por meio de imagens

digitalizadas das lâminas histológicas obtidas utilizando uma câmera (Nikon, DXM-

1200, Melville, USA) acoplada ao microscópio (Olympus, BX-41, Melville, USA) e

conectada a um computador (Dell Optiplex 9020, Miami, USA). Os parâmetros

morfométricos foram aferidos com o uso do software Canvas 12 (ACD Systems),

pelos três examinadores calibrados, com a finalidade de garantir a fidedignidade dos

resultados. A escolha da região de demarcação da área nuclear foi realizada por um

sorteio aleatório, para garantir que não houvesse uma amostra e resultados

viciados.

Os dados foram coletados e tabulados no programa Excel® 2016 (Office

2016, Microsoft, EUA). A estatística descritiva e inferencial foi composta por média e

desvio padrão da espessura e densidade das camadas da estrutura ocular e da

área nuclear das células encontradas em cada amostra. Foi utilizado o teste T de

Student para amostras independentes, com o objetivo de identificar diferenças entre

as amostras avaliadas. O procedimento estatístico foi realizado no software

estatístico SPSS versão 16.0 (Statistical Package for Social Sciences; SPSS Inc.,

Chicago, IL, USA). A significância estatística adotada foi p<0,05.

3 RESULTADOS

Para a análise descritiva dos resultados, foram consideradas as espessuras

das camadas constituintes da retina: camada plexiforme interna (CPI), camada

nuclear externa (CNE), camada nuclear interna (CNI) e os prolongamentos de cones

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e bastonetes (PCB); a densidade da CNE, CNI e camada de células ganglionares

(CCG), e a área e perímetro do núcleo das células da CNE e CNI.

A comparação entre as médias (valores) dos resultados encontrados

demonstrou que houve o aumento da espessura (Tabela III) e redução da

densidade (valores) das camadas constituintes da retina (Tabela IV) no grupo

experimental.

O grupo experimental apresentou as espessuras das camadas CPI, CNI e

PCB significativamente maiores quando comparado ao grupo controle (Tabela III).

A densidade da camada CNI se mostrou significativamente menos no grupo

experimental, quando comparado ao grupo controle (Tabela IV).

A área e o perímetro das células da retina foram medidos em três camadas:

CNE, CNI E CCG de cada grupo. Calculadas as médias e desvios padrão das áreas

das células, por cada camada, observou-se um aumento estatisticamente

significativo da área das células em todas as camadas estudadas no grupo

experimental quando comparado ao grupo controle. (Tabela V).

Ademais, por meio da análise comparativa dos cortes histológicos referentes

ao olho exposto à luz LED e ao olho não exposto, houve alteração morfológica

visualmente perceptiva em algumas estruturas retinianas do rato. Aspectos como a

desorganização das camadas, aumento do espaço citoplasmático das células,

expansão da CNI, aumento da camada PCB e núcleos hipercromados, que são

sugestivos de picnose celular, foram detectados. Não foi encontrada nenhuma

diferença significativa com relação às demais camadas da retina. [Figura 2 – (A) e

(B)]

4 DISCUSSÃO

Diante da comprovação científica de que os aparelhos à base de diodos

emissores de luz garantem a mesma qualidade de polimerização dos compósitos

resinosos com relação às propriedades físico-mecânicas, sua utilização vem se

tornando cada vez mais rotineira nos consultórios odontológicos. Em especial, os

fotoativadores de alta potência que diminuem o tempo clínico dos procedimentos,

vêm atraindo a atenção dos profissionais. Nesses aparelhos, o comprimento de

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onda referente à luz azul, se mostrou indispensável para dar início à cascata de

polimerização destes materiais, assim como, uma adequada relação entre a

potência e o tempo de exposição.1

Entretanto, esse mesmo componente azul, associado à alta intensidade, é

considerado uma das maiores preocupações com relação aos efeitos nocivos do

LED ao olho humano, especialmente na região fotossensível da retina.17 Estudos

mostram que esse comprimento de onda é um fator crítico para a toxicidade na

retina, em virtude dos danos na camada de fotorreceptores, além de gerar um

grande desconforto visual devido ao caráter pontual, alto nível de iluminância (lux) e

estresse oxidativo gerado nas células.18,19,20

Além da grande associação entre o comprimento de onda e danos à retina, a

iluminância do LED também pode estar associada a esses efeitos. A princípio,

parecia não haver uma correlação positiva entre a energia e o dano.18 Entretanto,

Kim (2016)21 comprovou que à medida que a energia em lux do aparelho aumenta,

maiores são os efeitos nocivos às células fotorreceptoras, especialmente na indução

do fenômeno da apoptose.

O aparelho fotopolimerizador utilizado nesse estudo (VALO® - Ultradent)

apresenta amplo espectro, com ondas no intervalo de 395nm – 480nm, ou seja,

abrangendo as luzes ultravioleta e azul. Apesar dos estudos já relatarem maior risco

de danos oculares à luz azul, a luz ultravioleta proveniente do fotoativadores

também demonstrou potência suficiente para causar danos visuais severos.22 Em

um estudo com LEDs odontológicos,22 com iluminância de 1000 lux, inferior ao valor

mensurado no aparelho utilizado na pesquisa (3500 lux), sobre a mesma distância

de 30cm entre o aparelho e o olho, a resposta fisiológica da retina foi afetada

irreversivelmente através de danos fotoquímicos. Corroborando com a literatura

disponível, mesmo com um protocolo de exposição mais curto, de apenas um dia,

as alterações retinianas encontradas neste estudo confirmam que a potência do

aparelho é um ponto crucial para a ocorrência de alterações nocivas à retina.

Os primeiros estudos acerca dos potenciais danos ao olho causados pelo

efeito da luz se iniciaram a partir do estudo referência de Noel (1966).23 Os achados

iniciais descreveram um inchaço celular, com citoplasma pouco corado e núcleo

aumentado. Além disso, a picnose, descrita como o sinal inicial indicativo de

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apoptose celular e representada por um núcleo hipercromado, também foi descrita,

especialmente na região central da retina. Assim sendo, o presente trabalho focou

as análises histológicas nesta região, tomando como referência a fóvea central,

identificada a partir da análise da disposição do cristalino e das outras estruturas do

olho.

Os resultados mostraram que houve um aumento estatisticamente

significativo da área nuclear em todas as camadas analisadas (CNI, CNE, CCG)

(Tabela V). Se associarmos isto à análise visual (Figura 2), é possível notar que

algumas células estão hipercromadas, especialmente quando comparadas ao

padrão mais homogêneo do grupo controle. Apesar deste aspecto picnótico

representar uma condensação da cromatina, o que sugere uma diminuição da área

nuclear, estatisticamente houve um aumento dos valores da área, representando

um inchaço. Entretanto, estudos mostram que, a princípio, esse fenômeno se inicia

com uma remodelação e aumento dessa medida, descrita como fase 1

picnótica,19,24,25 o que corrobora com nossos achados.

Não obstante, apesar do aumento desses núcleos, a densidade da CNI se

comportou de forma contrária, apresentando uma diminuição. Essa medida se

caracteriza pela razão entre o número de células e a área da camada. Entretanto,

essa alteração ocorreu não apenas por conta da variação do número de células,

mas especialmente em razão do aumento do conteúdo citoplasmático, o que

acabou resultando em um aumento da sua espessura. Esse resultado também foi

apresentado em outro estudo da literatura, sendo descrito como um inchaço dessa

região.18,26 Sabemos que as organelas responsáveis por toda a atividade metabólica

se concentram nesse compartimento celular, dessa forma, componentes como as

mitocôndrias, responsáveis pela produção energética celular, necessitam produzir

cada vez mais essa energia à medida que a oferta de luz – no caso, luz LED – se

torna abundante, para que as células fotorreceptoras e neuronais possam trabalhar

no sentido do processamento e transdução em impulsos elétricos que gerem a

informação visual.14,15

Seguindo esse raciocínio, pode-se explicar o aumento estatisticamente

significativo na espessura da camada referente aos prolongamentos dos cones e

bastonetes (Tabela III). Sabe-se que esta região é composta basicamente pelos

componentes citoplasmáticos e toda a maquinaria metabólica da célula, subdividida

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18

em segmento externo e interno. Especificamente no segmento interno, todas as

organelas presentes trabalham para suportar a atividade das células

fotorreceptoras.14

Dessa forma, é possível compreender que, com a exposição aumentada da

luz LED, as células fotossensíveis acabam trabalhando mais para processar a

informação e com isso se faz necessário um maior desenvolvimento e produção de

energia, especialmente por parte das mitocôndrias,15 o que poderia justificar o seu

aumento em espessura, quando comparado ao olho controle. Além disso, é

reconhecido que a emissão de luz azul, especialmente, também atua fortemente na

formação de radicais de superóxidos a partir dessas mitocôndrias, que podem ser

rapidamente transformados em componentes tóxicos quando em estado mais

avançado de exposição, causando danos oxidativos às células.18

Diversos estudos demonstram que a CNE, cujos componentes celulares são

fotorreceptores denominados cones e bastonetes, apresenta as principais

alterações quando exposta à luz.18,19,27 Entretanto, o presente estudo mostrou não

haver alteração significativa da espessura, densidade ou área nuclear. Isso pode ser

explicado inicialmente pelo fato de que, diferente da CNI, a maior parte do

componente citoplasmático dessas células está localizado nos segmentos interno e

externo, que fazem parte da camada de PCB. Dessa forma, apesar de não ter

ocorrido nenhuma variação dos fatores analisados, o aumento da espessura dos

PCB resulta da exacerbação da atividade metabólica, o que confere uma resposta

ativa à exposição aumentada à luz.

Além disso, se analisarmos os valores apresentados na tabela III, referente

às espessuras, é possível notar que a maior diferença ocorreu exatamente na

camada de PCB, aumentando de 17,58 para 37,69µm, em média. Os bastonetes e

cones possuem diferentes graus de sensibilidade à luz, sendo o primeiro mais

sensível, ou seja, pouca presença de luz já é facilmente detectada por essas

células.14,27 Os bastonetes, no entanto, mostraram-se mais susceptíveis a danos por

luz azul, enquanto que os cones são mais resistentes.26 Desta forma, visto que o

animal utilizado no experimento possui visão noturna mais desenvolvida, os

bastonetes acabam exercendo maior função e consequentemente a maquinaria

metabólica se desenvolve mais, justificando a espessura da camada de PCB.

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19

Apesar do protocolo de exposição ter sido relativamente baixo, representado

apenas por três exposições em um único dia, é necessário considerar os

parâmetros relacionados à vida média dos ratos, visto que estes constituem o nosso

objeto de estudo. Desta forma, de acordo com Andreolo (2012),28 cada dia de vida

de um rato equivale a 30 dias na vida de humanos, o que à princípio justificaria a

classificação dessa metodologia como aguda. Desta forma, este estudo mostrou

que as respostas fisiológicas destes animais são mais pronunciadas devido ao seu

desenvolvimento mais rápido, tendo um ciclo metabólico mais rápido que dos

humanos.

A comprovação das alterações morfométricas nas camadas da retina,

indicando atividade metabólica aumentada e possíveis danos a essa estrutura,

chamam a atenção quanto à necessidade de proteção contra essa exposição à luz

LED. Os filtros de luz, que estão inclusos como um acessório destes aparelhos

fotoativadores, muitos vezes tem seu uso negligenciado e deve ser obrigatoriamente

utilizados pelos profissionais. Nesse sentido, foi comprovado em um estudo29 que

pelo menos 97% da irradiação nociva consegue ser bloqueada por filtros de

diversas marcas e, especialmente o filtro do Valo, mostrou a maior eficácia entre

todos os outros testados, reafirmando os benefícios do seu uso rotineiro.

Por fim, apesar do estudo atual apresentar um protocolo de exposição aguda

e diante das limitações relacionadas ao tamanho da amostra, é necessário lembrar

que, na rotina dos cirurgiões-dentistas, esse contato com o LED se dá de forma

prolongada e contínua, o que representará um efeito cumulativo. Com isso, se faz

necessário a continuação da pesquisa, aumentando o número amostral, assim

como os grupos experimentais e tempos de exposição, objetivando um maior

conhecimento sobre os efeitos do LED em protocolos que simulem a rotina clínica

dos cirurgiões-dentistas.

5 CONCLUSÃO

Dentre os principais achados nesta pesquisa, é possível ressaltar que mesmo

com um protocolo curto e agudo de exposição do olho à luz LED de alta potência,

foi observado que:

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20

As células fotorreceptoras e neuronais de todas as camadas da retina

responderam ativamente, demonstrando intenso metabolismo celular em

resposta à luz;

Essa resposta metabólica exacerbada resultou num aumento significativo da

espessura de todas as camadas avaliadas (CNI, CPI e PCB), exceto a CNE,

visto que as organelas citoplasmáticas responsáveis pela produção de

energia estão presentes especialmente nas camadas supracitadas. Além

disso, a densidade mostrou uma diminuição estatisticamente significativa na

CNI do grupo experimental, também associado ao aumento citoplasmático;

A área nuclear das células de todas as camadas avaliadas (CNI, CNE e

CCG) aumentou, o que, juntamente com as características visualmente

aparentes, foram compatíveis com as fases iniciais do fenômeno da picnose

celular, indicando possível apoptose.

Assim sendo, fica clara a necessidade de outros estudos sobre os efeitos

dessa luz, especialmente a longo prazo, com um grupo experimental maior, visto

que esta fonte de luz é utilizada durante toda a vida profissional do cirurgião-

dentista.

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21

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LEGENDA DAS FIGURAS

Figura 1: Fotopolimerizador LED de alta potência durante a exposição do olho

direito – caso experimental – à luz, na distância pré-estabelecida de 30cm, definida

por um aparato metálico.

Figura 2: Cortes histológicos com coloração em H&E do olho controle (A) e do olho

exposto à luz LED de alta potência (B).

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24

FIGURA 1

Figura 1: Aparelho fotopolimerizador LED de alta potência

(seta), fixado a um aparato metálico (chave), durante

fotoestimulação do olho experimental do animal, mantido

sobre anestesia inalatória (estrela).

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25

FIGURA 2

Figura 2. Secções histológicas da retina do rato A (Controle) e B (Experimental) – Camada de células ganglionares (CG); Camada plexiforme interna (CPI); Camada nuclear interna (CNI); Camada plexiforme externa (CPE); Camada nuclear externa (CNE); Prolongamento de cones e bastonetes (PCB). Célula hipercromada sugestiva de picnose (seta); Aumento do espaço citoplasmático (cabeça de seta); Aumento dos prolongamentos de cones e bastonetes (dupla seta). Ambas as fotos no aumento de 100x, campo 9.

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Tabela I. Descrição do protocolo de coloração das retinas em Hematoxilina e Eosina (HE). Laboratório de técnicas histológicas – UFRN, Natal/RN, 2017.

ETAPA REAGENTE

Desidratação

(1h em cada solução)

Álcool 70%

Álcool 80%

Álcool 90%

Álcool absoluto I

Álcool absoluto II

Álcool absoluto III

Diafanização

(1h em cada solução)

Xilol PA I

Xilol PA II

Xilol PA III

Impregnação

(1h em cada solução)

Estufa 60°C

Parafina I

Parafina II

Parafina III

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Tabela I - Continuação. Descrição do processamento e preparo das lâminas histológicas para posterior análise.

ETAPA ESTÁGIO REAGENTE

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

Desparafinização

Desparafinização

Desparafinização

Hidratação

Hidratação

Hidratação

Lavagem

Coloração

Lavagem

Coloração

Lavagem

Desparafinização

Desparafinização

Desparafinização

Desparafinização

Fixação do corante e conservação do

material

Fixação do corante e conservação do

material

*Estufa 45ºC

Xilol I

Xilol II

Álcool Etílico 100%

Álcool Etílico 80%

Álcool Etílico 70%

Água

Hematoxilina

Água corrente

Eosina

Água corrente

Álcool Etílico 70%

Álcool Etílico 80%

Álcool Etílico 100%

Álcool Etílico 100% II

Xilol I

Xilol II

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Tabela II. Espessura das camadas retinianas, expressas em valores médios (µm) e respectivos desvios padrão (DP).

CAMADAS CPI CNE

CNI

PCB

GRUPO MÉDIA DP P MÉDIA DP P MÉDIA DP P MÉDIA DP P

OE 45,64 9,17 <0,001

45,54 9,17 0,853

23,37 4,38 <0,001

17,58 4,5 <0,001

OD 54,77 9,99 45,71 6,47 30,80 5,38 37,69 5,0

Teste de T-Student: OE: Olho esquerdo, OD: Olho direito, CPI: Camada plexiforme interna. CNE: Camada nuclear externa, CNI: Camada nuclear interna e

PCB: Prolongamentos de cones e bastonetes.

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Tabela III: Densidade das camadas retinianas celulares, expressa em valores médios (células

por mm²) e respectivos desvios padrão (DP).

CAMADAS CNE CNI CCG

GRUPO MÉDIA DP P MÉDIA DP P MÉDIA DP P

OE 14.200 2.021

0,683

8.504 618

<0,001

2.177 621

0,467 OD 14.623 1.428 7.118 792 1.970 251

Teste de T-Student: OE: Olho esquerdo, OD: Olho direito. CNE: Camada nuclear externa, CNI: Camada nuclear interna e CCG:

Camadas de células ganglionares.

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Tabela IV: Área nuclear das células das camadas CNE, CNI e CCG, expressas em valores

médios (µm2) e respectivos desvios padrão (DP).

CAMADAS CNE CNI CCG

GRUPO MÉDIA DP P MÉDIA DP P MÉDIA DP P

OE 8,81 1,95 <0,001

15,31 1,91 <0,001

7,35 1,79 <0,001

OD 10,86 1,91 16,84 2,76 8,56 2,76

Teste de T-Student: OE: Olho esquerdo, OD: Olho direito. CNE: Camada nuclear externa, CNI: Camada nuclear interna e CCG: Camadas de

células ganglionares.