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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA
ANA BEATRIZ ARRAIS
INFLUÊNCIA DO DIODO EMISSOR DE LUZ (LED) DE ALTA POTÊNCIA SOBRE
A RETINA – UM ESTUDO PILOTO EXPERIMENTAL EM RATO
Natal/RN
2017
ANA BEATRIZ ARRAIS
INFLUÊNCIA DO DIODO EMISSOR DE LUZ (LED) DE ALTA POTÊNCIA SOBRE A
RETINA – UM ESTUDO PILOTO EXPERIMENTAL EM RATO.
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado no curso de Graduação de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito para obtenção do título de Cirurgiã-Dentista. Orientador: Prof. Dr. Sergei Godeiro Fernandes Rabelo Caldas Coorientador: Prof. Dr. Ruthnaldo Rodrigues Melo de Lima
Natal/RN
2017
Catalogação na Fonte. UFRN / Departamento de Odontologia Biblioteca Setorial de Odontologia “Profº Alberto Moreira Campos”.
Arrais, Ana Beatriz. Influência do diodo emissor de luz (LED) de alta potência sobre a retina – um estudo piloto experimental em rato / Ana Beatriz Arrais. – Natal, RN, 2017.
29 f.: il. Orientador: Prof. Dr. Sergei Godeiro Fernandes Rabelo Caldas. Monografia (Graduação em Odontologia) – Universidade Federal do Rio
Grande do Norte. Centro de Ciências da Saúde, Natal, 2017.
1. Luzes de cura dentária - Monografia. 2.Ortodontia - Monografia. 3. Propriedades de superfície - Monografia. 4. Retina - Monografia. 5. Ratos - Monografia. I. Caldas, Sergei Godeiro Fernandes Rabelo. II. Título.
RN/UF/BSO BLACK D4
Ana Beatriz Arrais
INFLUÊNCIA DO DIODO EMISSOR DE LUZ (LED) DE ALTA POTÊNCIA SOBRE A
RETINA – UM ESTUDO PILOTO EXPERIMENTAL EM RATO
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado no curso
de Graduação de Odontologia da Universidade Federal
do Rio Grande do Norte como requisito para obtenção
do título de Cirurgiã-Dentista.
Aprovado em ____/____/_____.
BANCA EXAMINADORA
______________________________________________________
Prof. Dr. Sergei Godeiro Fernandes Rabelo Caldas
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
(Orientador)
__________________________________________________
Prof. Dr. Ruthnaldo Rodrigues Melo de Lima
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
(Membro)
__________________________________________________
Prof. Dr. Arthur César de Medeiros Alves
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
(Membro)
Dedico este trabalho aos que amo e que
acompanharam de perto essa caminhada,
prestando apoio incondicional. Especialmente
aos meus pais, Nivia e Ricardo, minha eterna
gratidão.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente, agradeço a Deus por todas as pessoas que Ele colocou em
meu caminho, para que eu pudesse concluir mais uma etapa acadêmica. Sou grata
pelo privilégio de poder aprender sempre mais e de ter forças e apoio frente às
dificuldades enfrentadas ao longo dessa jornada.
Aos meus pais, Nivia e Ricardo, genuinamente os maiores incentivadores do
meu crescimento pessoal e da minha educação. Obrigada por nunca medirem
esforços e por sempre me apoiarem em tudo que já sonhei, mesmo quando o
coração apertava diante dos medos e inseguranças. Devo tudo a vocês.
Aos meus irmãos, Luciana e Daniel, que sempre foram meus maiores
exemplos de dedicação e humildade. Agradeço pela atenção e carinho nos
momentos que precisei. Não poderia deixar de agradecer também a quem chegou
de surpresa e trouxe leveza e alegria nos dias corridos e estressantes na rotina:
minha sobrinha Sofia.
Ao meu namorado Yvisson, pela compreensão nos momentos de ausência,
pelo amor e apoio diante de todos os desafios e por me ensinar diariamente a ser
mais positiva e generosa.
Aos amigos que conquistei ao longo dessa jornada e que se tornaram família,
“eternos 99”, especialmente Lidya Araújo e minha primeira dupla, Fernanda
Fagundes. Além disso, aos mais recentes e de grande importância nesta etapa final,
Jessika, Victoria, Matheus, Carolina, Amanda, Fernanda e Isabelle. Muito obrigada
por dividirem momentos tão valiosos, pelo apoio, amizade e cumplicidade, nas
alegrias e nos desafios da nossa profissão.
A Marcela, por ser minha companheira em todos os momentos, assumindo
esse desafio comigo, de braços abertos, e tornando-se mais que uma colega de
pesquisa, mas uma amiga e parceira de vida. Agradeço pela ajuda e pelas palavras
de incentivo nos momentos certos. A Ariane, por todo o auxílio e conselhos durante
a construção dos nossos trabalhos.
Ao Prof. Dr. Arthur César, agradeço desde já por toda a contribuição que
certamente acrescentará muito desenvolver do meu trabalho, além de toda a
disponibilidade.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Sergei Rabelo, primeiramente por depositar sua
confiança em mim para a realização de uma pesquisa que se tornou especial e me
acrescentou muito, profissionalmente e pessoalmente. Obrigada pelos conselhos,
dedicação e especialmente pelos ensinamentos que me foram transmitidos. Não há
nada mais gratificante do que ser orientada brilhantemente por alguém que nos
serve de inspiração e por isso agradeço profundamente.
Ao meu coorientador, Prof. Dr. Ruthnaldo Lima, que assumiu grande parte da
execução dessa pesquisa, fazendo-me sair da minha zona de conforto e
despertando grande interesse na área de pesquisa. Agradeço pela disponibilidade,
entusiasmo e por todo o conhecimento que me foi humildemente passado.
A todos os funcionários do Departamento de Morfologia da UFRN e a todos
que, de alguma forma, contribuíram para a execução desta pesquisa.
RESUMO
Introdução: A evolução dos fotopolimerizadores quanto à sua potência e
consequente redução do tempo clínico tem se mostrado de grande valia para a
otimização da rotina de colagem de bráquetes ortodônticos. Contudo, existe uma
carência na literatura do efeito desses aparelhos sobre a retina do profissional e/ou
paciente, uma vez que estes podem receber indiretamente parte da luz refletida
durante os procedimentos clínicos Assim sendo, o presente estudo teve como
objetivo avaliar a influência do uso de um fotopolimerizador à base de diodo emissor
de luz (LED) de alta potência na retina do rato. Material e Métodos: Um rato Wistar
foi usado como objeto de estudo, sendo um dos olhos considerado como amostra
controle (esquerdo), coberto com um tampão removível durante a fotoestimulação
do olho contralateral. O outro olho (direito) foi, então, exposto à luz do LED na
potência Xtra de 3200mW/cm2 (Valo Ortho - Ultradent), por 144 segundos, à
distância de 30cm, seguindo um protocolo de exposição três vezes ao dia, durante
um dia, com um intervalo de 4 horas entre cada aplicação. Decorridos sete dias da
primeira fotoestimulação, o animal foi anestesiado, procedido à eutanásia para
remoção dos olhos e processamento histológico. As lâminas foram digitalizadas
utilizando uma câmera acoplada a um microscópio óptico e suas imagens
analisadas para aferição de parâmetros morfológicos da retina. Resultados: Houve
um aumento estatisticamente significativo na espessura de todas as camadas,
exceto da camada nuclear externa (CNE). Em relação à densidade, apenas a
camada nuclear interna (CNI) apresentou diferença, com uma diminuição no olho
experimental em relação ao olho controle. Além disso, a área nuclear das células de
todas as camadas aumentou no olho exposto à luz LED de alta potência. Por fim,
observou-se um aumento dos prolongamentos de cones e bastonetes (PCB),
aumento do espaço citoplasmático na CNI e células hipercromadas sugestivas de
picnose. Conclusões: Mesmo com um protocolo agudo e curto de exposição do
olho à luz LED de alta potência, houve uma alteração, especialmente da atividade
metabólica das células fotossensíveis e neuronais, o que ressalta a necessidade de
proteção durante a utilização desses aparelhos fotoativadores, assim como o estudo
desse efeito a longo prazo e com mais animais.
Palavras-chave: Luzes de cura dentária; Ortodontia; Retina; Ratos.
ABSTRACT
Introduction: The evolution of light curing units (LCU) in terms of potency and
consequent reduction of clinical time have been shown to be of great value to
orthodontists, regarding the routine of brackets bonding. However, there is a lack in
the literature regarding the effect of these devices on the operator and/or patient
retina. Therefore, the present study aimed to evaluate the influence of the use of a
light emitting diode-based device (LED) in the retina of a Wistar rat. Methods: A
single Wistar rat was used as the object of study, one eye was considered as control
sample (left eye) and was covered with a removable tampon during the contralateral
eye photostimulation. The other eye (right eye) was exposed to LED light at Xtra
potency mode of 3200mW/cm2 (Valo Ortho - Ultradent), for 144 seconds, at the
distance of 30cm, following a protocol of three exposures per day, for one day, within
4 hours between each application. Seven days after the first photostimulation, the
animal was anesthetized and then euthanized for posterior eye removal and
histological processing. The histological slides were scanned using a camera
connected to an optical microscope and their images analyzed for the measurement
of morphological parameters of the retina. Results: A statistically significant raise
was found in all layers of retina in relation to thickness, except for the outer nuclear
layer (ONL). Regarding density, a statistically significant decrease was found for the
inner nuclear layer (INL) of exposed eye. Besides that, the nuclear area of the cells
raised in all layers analyzed after high potency LED exposure. Lastly, the extension
of cone and rods (ECR) also increased, as well as the citoplasmatic space on INL
and the appearance of hyperchromic cells suggestive of pyknosis. Conclusions:
Despite the short and acute protocol of eye exposure to high potency LED, a
significant alteration was found, especially in the metabolic activity of photosensitive
and neuronal cells. These results emphasize the importance of using eye protection
during the use of these devices, as well as a further research on the long term
effects with more animals.
Keywords: Curing Lights, Orthodontics, Retina, Rats.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 10
2 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................... 12
3 RESULTADOS...................................................................................................... 14
4 DISCUSSÃO ......................................................................................................... 15
5 CONCLUSÃO ....................................................................................................... 19
REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 21
LEGENDA DAS FIGURAS ...................................................................................... 23
FIGURAS ................................................................................................................. 24
TABELAS ................................................................................................................ 26
10
1 INTRODUÇÃO
Em virtude da constante evolução tecnológica dos materiais e aparelhos
odontológicos usados rotineiramente nas clínicas, é crucial destacar a importância
de se conhecer as propriedades físicas desses, para que possamos usá-los da
forma mais eficaz, obtendo assim os melhores resultados possíveis em nossos
tratamentos. Nesse sentido, o mercado passou pelas mais diversas fontes para
polimerização de materiais odontológicos, como luzes halógenas de tungstênio de
quartzo, lâmpadas de plasma, laser de argônio, até chegar à atual luz emissora de
diodo (LED), que tem como objetivo sanar os aspectos negativos provenientes das
fontes anteriores,1,2 tais como o pouco tempo de vida útil dos aparelhos devido ao
calor gerado, o que acaba aumentando a temperatura pulpar,3 diminuindo a
emissão de luz com o tempo e consequentemente o grau de conversão dos
monômeros.4,5
Dentre esses aparelhos fotoativadores à base de LED, há uma grande
variação quanto à forma de apresentação e, principalmente, com relação à potência
da luz emitida. Com o intuito de otimizar o tempo clínico, os LEDs de alta potência,
que permitem uma rápida polimerização e maior estabilidade na emissão de luz,
têm sido alvo de diversos estudos comparativos com as fontes de luz mais antigas,
como a luz halógena. Os resultados dessas pesquisas mostram que a força de
adesão do compósito resinoso ao substrato dentário quando polimerizado com
LEDs de alta potência, se apresenta tão satisfatória quanto a polimerização
realizada com luz halógena.6,7 Entretanto, quanto à profundidade da polimerização e
o grau de conversão de monômeros, o LED apresentou melhores resultados.5
No que se refere ao calor gerado durante a cura do material, os estudos
mostram que esta relação é diretamente proporcional ao tempo de exposição, da
mesma forma que quanto maior a intensidade do LED, maior o aumento de
temperatura registrado na câmara pulpar, o que aumenta o risco de danos pulpares.
Porém, quando comparados os aumentos de temperatura pulpar, foi comprovado
que a luz halógena resulta em valores significativamente maiores quando
comparados ao LED.3 Por isso, se fazia necessário atentar à regulamentação
desses aparelhos, assim como ao tempo de exposição.8,9
11
Apesar das algumas vantagens já afirmadas cientificamente, existem estudos
que comprovam um potencial dano ocular proveniente de aparelhos LED de alta
potência.10,11,12,13 Mesmo assim, ainda observa-se uma limitação de estudos
experimentais, que possam simular de forma mais fiel a situação clínica vivida pelos
cirurgiões-dentistas, especialmente os ortodontistas, que buscam nesses aparelhos
um meio mais eficaz e capaz de otimizar o tempo clínico durante uma sessão de
colagem de bráquetes, procedimento comum à rotina desses profissionais. Desta
forma, torna-se relevante a realização de um estudo que avalie a influência do LED
de alta potência nas estruturas retinianas, visando não somente analisar a
capacidade de gerar ou não lesão, como também identificar os aspectos
morfométricos após exposição a essa luz.
Sabe-se que retina é uma estrutura responsável pela fotossensibilidade do
olho, tendo uma forma de cálice característica. Os componentes responsáveis pelo
processamento luminoso se distribuem nas suas seis principais camadas, além de
estruturas associadas a ela, como o epitélio pigmentar da retina e o nervo óptico,
garantindo sua manutenção e transmissão das informações visuais.14 Numa
distribuição de fora para dentro, ou seja, o caminho que a luz percorre quando
incide sobre o olho, temos a camada de células ganglionares, a camada plexiforme
interna; camada nuclear interna; camada plexiforme externa; camada nuclear
externa e camada de prolongamentos de cones e bastonetes.
Especialmente na camada nuclear externa, é possível encontrar as principais
células fotorreceptoras, que captam e codificam as informações visuais e a
transmitem para o cérebro, conhecidas como cones e bastonetes. Além dessas, na
camada nuclear interna e camada de células ganglionares, existem células com
funções distintas, as células de Muller, que atuam como barreira hematorretiniana e
na transmissão de impulsos elétricos; células bipolares e ganglionares, que atuam
na via de transmissão vertical entre camadas e células horizontais, amácrinas e
interplexiformes, que atuam na via de transmissão horizontal.15 Essas células
interagem entre si em toda a extensão da retina, através de conexões sinápticas
para a transmissão e transdução dos impulsos elétricos, formando a grande rede de
conexões celulares da retina.
Portanto, sabendo da importância das células que constituem a retina para
todo o processamento visual, o objetivo desse trabalho foi avaliar as possíveis
12
alterações encontradas nas estruturas retinianas, em rato, expostas a um LED de
alta potência, durante um protocolo que simularia um dia de atendimento do
ortodontista, representado por uma média de três sessões de colagem de
bráquetes.
2 MATERIAL E MÉTODOS
O presente estudo, experimental com base descritiva e inferencial, teve como
unidade de experimento e observação as retinas de um rato da linhagem Wistar
(Rattus norvegicus albinus), sendo a amostra composta pelas 02 (duas) estruturas
oculares referentes a este único rato.
Foi utilizado um animal adulto, sexo feminino, 300 gramas de peso, com 8
semanas de vida, oriundo do biotério de experimentação do Departamento de
Morfologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), mantido com
ração padrão extrusada (ad libitum) e água mineral natural conforme a Resolução
RDC n° 274, de 22 de setembro de 2005 da Agência Nacional de Vigilância
Sanitária. Esse animal foi selecionado de acordo com a disponibilidade do biotério,
com o aspecto da estrutura ocular, sendo este visualmente saudável, além do
cumprimento das especificações por parte do Comitê de Ética no Uso de Animais
(CEUA-UFRN). Toda a metodologia empregada neste estudo foi previamente
aprovada CEUA – UFRN, sob o protocolo nº 007012/2017.
O animal foi mantido durante todo o experimento no biotério experimental do
Departamento de Morfologia (DMOR) da UFRN, lotado no Museu de Ciências
Morfológicas, em uma caixa de polipropileno na proporção de 04 (quatro) animais
por caixa com as dimensões (41x34x16cm). O animal permaneceu em regime de
claro-escuro 12/12h em ciclo invertido em relação ao ambiente natural, com
intensidade luminosa no interior da gaiola de 60 lux.
Para a realização do experimento, o animal foi contido e anestesiado por via
inalatória, contendo uma mistura de isoflurano (4-5%) e oxigênio 100% (1l/min)
como dose de indução, e para manutenção a concentração foi de 1,5-3%. Em
seguida, um dos olhos foi fechado (esquerdo) e coberto com um tampão opaco
circular removível (3cm²), de PVC e fita isolante, na cor preta, e fixado à cabeça do
13
animal por meio de um elástico, para que não fosse exposto à luz
fotopolimerizadora, constituindo, portanto, a amostra controle. O olho direito foi
então exposto à luz, sendo a amostra experimental de caso, respeitando uma
distância pré-definida de 30cm entre a ponta do aparelho e o olho do animal. Para
fotoestimulação, foi utilizado um aparelho de luz LED de marca comercial
VALO® (Ultradent, Utah, USA) no modo de alta potência (Xtra 3200mW/cm2).
(Figura 1)
Esse aparelho foi calibrado ao início do experimento, garantindo uma
intensidade de luz padrão. Além disso, a iluminância do fotoativador também foi
aferida com o uso de um luxímetro digital (Minipa® MLM-1010, Houston, USA),
atingindo aproximadamente 3500lux. A distância de 30cm foi determinada
considerando a distância do olho do dentista operador até a ponta da fonte de luz
durante um procedimento e foi obtida acoplando e fixando o aparelho LED a um
aparato metálico com a altura estabelecida. O outro olho, considerado como
amostra controle da pesquisa, permaneceu protegido pelo tampão durante todo o
tempo de aplicação.
O tempo de exposição à luz LED foi de um total de 144s por aplicação.. Esse
tempo simula o procedimento clínico da colagem de 24 bráquetes ortodônticos, de
primeiro molar a primeiro molar, inferior e superior, considerando um tempo total de
6s por elemento, visto que há uma aplicação de 3s na região cervical e outros 3s na
oclusal. Esse tempo de exposição foi utilizado por ser o protocolo clínico padrão da
especialidade, mas também a partir das especificações de uso do fabricante.
O animal foi avaliado após o protocolo de exposição ao LED de alta potência
que consistiu em 03 (três) aplicações diárias, com um intervalo de 4 horas entre
cada exposição, durante apenas 01 (um) dia, realizado pelos três pesquisadores
envolvidos.
Decorridos 07 (sete) dias da exposição ao LED, foi realizada então a
eutanásia do animal para a obtenção da estrutura ocular. O animal foi eutanasiado
com uma dose de Tiopental (90mg/kg) associado a Lidocaína 2% (10mg/Kg) em
seringa única, por via intraperitoneal, e em seguida, foi realizada a dissecação para
remoção das duas estruturares oculares. Após a dissecação, o protocolo de
processamento do material, assim como o passo a passo do preparo da lâmina
14
histológica, seguiu o manual de Bermer (2003)16, elucidado na tabela I. As lâminas
foram preparadas com espécimes emblocados em parafina e padronizados com
4µm de espessura de corte, corados em seguida com hematoxilina e eosina (H&E).
Todos esses procedimentos foram realizados no Centro de Biociências, por
técnicos do laboratório de técnicas histológicas do DMOR com habilidades e
experiência para realizar corretamente os processos de anestesia, eutanásia,
dissecação e preparo da lâmina histológica.
A análise dos resultados foi realizada por três examinadores independentes
treinados a partir de um mesmo padrão de avaliação, por meio de imagens
digitalizadas das lâminas histológicas obtidas utilizando uma câmera (Nikon, DXM-
1200, Melville, USA) acoplada ao microscópio (Olympus, BX-41, Melville, USA) e
conectada a um computador (Dell Optiplex 9020, Miami, USA). Os parâmetros
morfométricos foram aferidos com o uso do software Canvas 12 (ACD Systems),
pelos três examinadores calibrados, com a finalidade de garantir a fidedignidade dos
resultados. A escolha da região de demarcação da área nuclear foi realizada por um
sorteio aleatório, para garantir que não houvesse uma amostra e resultados
viciados.
Os dados foram coletados e tabulados no programa Excel® 2016 (Office
2016, Microsoft, EUA). A estatística descritiva e inferencial foi composta por média e
desvio padrão da espessura e densidade das camadas da estrutura ocular e da
área nuclear das células encontradas em cada amostra. Foi utilizado o teste T de
Student para amostras independentes, com o objetivo de identificar diferenças entre
as amostras avaliadas. O procedimento estatístico foi realizado no software
estatístico SPSS versão 16.0 (Statistical Package for Social Sciences; SPSS Inc.,
Chicago, IL, USA). A significância estatística adotada foi p<0,05.
3 RESULTADOS
Para a análise descritiva dos resultados, foram consideradas as espessuras
das camadas constituintes da retina: camada plexiforme interna (CPI), camada
nuclear externa (CNE), camada nuclear interna (CNI) e os prolongamentos de cones
15
e bastonetes (PCB); a densidade da CNE, CNI e camada de células ganglionares
(CCG), e a área e perímetro do núcleo das células da CNE e CNI.
A comparação entre as médias (valores) dos resultados encontrados
demonstrou que houve o aumento da espessura (Tabela III) e redução da
densidade (valores) das camadas constituintes da retina (Tabela IV) no grupo
experimental.
O grupo experimental apresentou as espessuras das camadas CPI, CNI e
PCB significativamente maiores quando comparado ao grupo controle (Tabela III).
A densidade da camada CNI se mostrou significativamente menos no grupo
experimental, quando comparado ao grupo controle (Tabela IV).
A área e o perímetro das células da retina foram medidos em três camadas:
CNE, CNI E CCG de cada grupo. Calculadas as médias e desvios padrão das áreas
das células, por cada camada, observou-se um aumento estatisticamente
significativo da área das células em todas as camadas estudadas no grupo
experimental quando comparado ao grupo controle. (Tabela V).
Ademais, por meio da análise comparativa dos cortes histológicos referentes
ao olho exposto à luz LED e ao olho não exposto, houve alteração morfológica
visualmente perceptiva em algumas estruturas retinianas do rato. Aspectos como a
desorganização das camadas, aumento do espaço citoplasmático das células,
expansão da CNI, aumento da camada PCB e núcleos hipercromados, que são
sugestivos de picnose celular, foram detectados. Não foi encontrada nenhuma
diferença significativa com relação às demais camadas da retina. [Figura 2 – (A) e
(B)]
4 DISCUSSÃO
Diante da comprovação científica de que os aparelhos à base de diodos
emissores de luz garantem a mesma qualidade de polimerização dos compósitos
resinosos com relação às propriedades físico-mecânicas, sua utilização vem se
tornando cada vez mais rotineira nos consultórios odontológicos. Em especial, os
fotoativadores de alta potência que diminuem o tempo clínico dos procedimentos,
vêm atraindo a atenção dos profissionais. Nesses aparelhos, o comprimento de
16
onda referente à luz azul, se mostrou indispensável para dar início à cascata de
polimerização destes materiais, assim como, uma adequada relação entre a
potência e o tempo de exposição.1
Entretanto, esse mesmo componente azul, associado à alta intensidade, é
considerado uma das maiores preocupações com relação aos efeitos nocivos do
LED ao olho humano, especialmente na região fotossensível da retina.17 Estudos
mostram que esse comprimento de onda é um fator crítico para a toxicidade na
retina, em virtude dos danos na camada de fotorreceptores, além de gerar um
grande desconforto visual devido ao caráter pontual, alto nível de iluminância (lux) e
estresse oxidativo gerado nas células.18,19,20
Além da grande associação entre o comprimento de onda e danos à retina, a
iluminância do LED também pode estar associada a esses efeitos. A princípio,
parecia não haver uma correlação positiva entre a energia e o dano.18 Entretanto,
Kim (2016)21 comprovou que à medida que a energia em lux do aparelho aumenta,
maiores são os efeitos nocivos às células fotorreceptoras, especialmente na indução
do fenômeno da apoptose.
O aparelho fotopolimerizador utilizado nesse estudo (VALO® - Ultradent)
apresenta amplo espectro, com ondas no intervalo de 395nm – 480nm, ou seja,
abrangendo as luzes ultravioleta e azul. Apesar dos estudos já relatarem maior risco
de danos oculares à luz azul, a luz ultravioleta proveniente do fotoativadores
também demonstrou potência suficiente para causar danos visuais severos.22 Em
um estudo com LEDs odontológicos,22 com iluminância de 1000 lux, inferior ao valor
mensurado no aparelho utilizado na pesquisa (3500 lux), sobre a mesma distância
de 30cm entre o aparelho e o olho, a resposta fisiológica da retina foi afetada
irreversivelmente através de danos fotoquímicos. Corroborando com a literatura
disponível, mesmo com um protocolo de exposição mais curto, de apenas um dia,
as alterações retinianas encontradas neste estudo confirmam que a potência do
aparelho é um ponto crucial para a ocorrência de alterações nocivas à retina.
Os primeiros estudos acerca dos potenciais danos ao olho causados pelo
efeito da luz se iniciaram a partir do estudo referência de Noel (1966).23 Os achados
iniciais descreveram um inchaço celular, com citoplasma pouco corado e núcleo
aumentado. Além disso, a picnose, descrita como o sinal inicial indicativo de
17
apoptose celular e representada por um núcleo hipercromado, também foi descrita,
especialmente na região central da retina. Assim sendo, o presente trabalho focou
as análises histológicas nesta região, tomando como referência a fóvea central,
identificada a partir da análise da disposição do cristalino e das outras estruturas do
olho.
Os resultados mostraram que houve um aumento estatisticamente
significativo da área nuclear em todas as camadas analisadas (CNI, CNE, CCG)
(Tabela V). Se associarmos isto à análise visual (Figura 2), é possível notar que
algumas células estão hipercromadas, especialmente quando comparadas ao
padrão mais homogêneo do grupo controle. Apesar deste aspecto picnótico
representar uma condensação da cromatina, o que sugere uma diminuição da área
nuclear, estatisticamente houve um aumento dos valores da área, representando
um inchaço. Entretanto, estudos mostram que, a princípio, esse fenômeno se inicia
com uma remodelação e aumento dessa medida, descrita como fase 1
picnótica,19,24,25 o que corrobora com nossos achados.
Não obstante, apesar do aumento desses núcleos, a densidade da CNI se
comportou de forma contrária, apresentando uma diminuição. Essa medida se
caracteriza pela razão entre o número de células e a área da camada. Entretanto,
essa alteração ocorreu não apenas por conta da variação do número de células,
mas especialmente em razão do aumento do conteúdo citoplasmático, o que
acabou resultando em um aumento da sua espessura. Esse resultado também foi
apresentado em outro estudo da literatura, sendo descrito como um inchaço dessa
região.18,26 Sabemos que as organelas responsáveis por toda a atividade metabólica
se concentram nesse compartimento celular, dessa forma, componentes como as
mitocôndrias, responsáveis pela produção energética celular, necessitam produzir
cada vez mais essa energia à medida que a oferta de luz – no caso, luz LED – se
torna abundante, para que as células fotorreceptoras e neuronais possam trabalhar
no sentido do processamento e transdução em impulsos elétricos que gerem a
informação visual.14,15
Seguindo esse raciocínio, pode-se explicar o aumento estatisticamente
significativo na espessura da camada referente aos prolongamentos dos cones e
bastonetes (Tabela III). Sabe-se que esta região é composta basicamente pelos
componentes citoplasmáticos e toda a maquinaria metabólica da célula, subdividida
18
em segmento externo e interno. Especificamente no segmento interno, todas as
organelas presentes trabalham para suportar a atividade das células
fotorreceptoras.14
Dessa forma, é possível compreender que, com a exposição aumentada da
luz LED, as células fotossensíveis acabam trabalhando mais para processar a
informação e com isso se faz necessário um maior desenvolvimento e produção de
energia, especialmente por parte das mitocôndrias,15 o que poderia justificar o seu
aumento em espessura, quando comparado ao olho controle. Além disso, é
reconhecido que a emissão de luz azul, especialmente, também atua fortemente na
formação de radicais de superóxidos a partir dessas mitocôndrias, que podem ser
rapidamente transformados em componentes tóxicos quando em estado mais
avançado de exposição, causando danos oxidativos às células.18
Diversos estudos demonstram que a CNE, cujos componentes celulares são
fotorreceptores denominados cones e bastonetes, apresenta as principais
alterações quando exposta à luz.18,19,27 Entretanto, o presente estudo mostrou não
haver alteração significativa da espessura, densidade ou área nuclear. Isso pode ser
explicado inicialmente pelo fato de que, diferente da CNI, a maior parte do
componente citoplasmático dessas células está localizado nos segmentos interno e
externo, que fazem parte da camada de PCB. Dessa forma, apesar de não ter
ocorrido nenhuma variação dos fatores analisados, o aumento da espessura dos
PCB resulta da exacerbação da atividade metabólica, o que confere uma resposta
ativa à exposição aumentada à luz.
Além disso, se analisarmos os valores apresentados na tabela III, referente
às espessuras, é possível notar que a maior diferença ocorreu exatamente na
camada de PCB, aumentando de 17,58 para 37,69µm, em média. Os bastonetes e
cones possuem diferentes graus de sensibilidade à luz, sendo o primeiro mais
sensível, ou seja, pouca presença de luz já é facilmente detectada por essas
células.14,27 Os bastonetes, no entanto, mostraram-se mais susceptíveis a danos por
luz azul, enquanto que os cones são mais resistentes.26 Desta forma, visto que o
animal utilizado no experimento possui visão noturna mais desenvolvida, os
bastonetes acabam exercendo maior função e consequentemente a maquinaria
metabólica se desenvolve mais, justificando a espessura da camada de PCB.
19
Apesar do protocolo de exposição ter sido relativamente baixo, representado
apenas por três exposições em um único dia, é necessário considerar os
parâmetros relacionados à vida média dos ratos, visto que estes constituem o nosso
objeto de estudo. Desta forma, de acordo com Andreolo (2012),28 cada dia de vida
de um rato equivale a 30 dias na vida de humanos, o que à princípio justificaria a
classificação dessa metodologia como aguda. Desta forma, este estudo mostrou
que as respostas fisiológicas destes animais são mais pronunciadas devido ao seu
desenvolvimento mais rápido, tendo um ciclo metabólico mais rápido que dos
humanos.
A comprovação das alterações morfométricas nas camadas da retina,
indicando atividade metabólica aumentada e possíveis danos a essa estrutura,
chamam a atenção quanto à necessidade de proteção contra essa exposição à luz
LED. Os filtros de luz, que estão inclusos como um acessório destes aparelhos
fotoativadores, muitos vezes tem seu uso negligenciado e deve ser obrigatoriamente
utilizados pelos profissionais. Nesse sentido, foi comprovado em um estudo29 que
pelo menos 97% da irradiação nociva consegue ser bloqueada por filtros de
diversas marcas e, especialmente o filtro do Valo, mostrou a maior eficácia entre
todos os outros testados, reafirmando os benefícios do seu uso rotineiro.
Por fim, apesar do estudo atual apresentar um protocolo de exposição aguda
e diante das limitações relacionadas ao tamanho da amostra, é necessário lembrar
que, na rotina dos cirurgiões-dentistas, esse contato com o LED se dá de forma
prolongada e contínua, o que representará um efeito cumulativo. Com isso, se faz
necessário a continuação da pesquisa, aumentando o número amostral, assim
como os grupos experimentais e tempos de exposição, objetivando um maior
conhecimento sobre os efeitos do LED em protocolos que simulem a rotina clínica
dos cirurgiões-dentistas.
5 CONCLUSÃO
Dentre os principais achados nesta pesquisa, é possível ressaltar que mesmo
com um protocolo curto e agudo de exposição do olho à luz LED de alta potência,
foi observado que:
20
As células fotorreceptoras e neuronais de todas as camadas da retina
responderam ativamente, demonstrando intenso metabolismo celular em
resposta à luz;
Essa resposta metabólica exacerbada resultou num aumento significativo da
espessura de todas as camadas avaliadas (CNI, CPI e PCB), exceto a CNE,
visto que as organelas citoplasmáticas responsáveis pela produção de
energia estão presentes especialmente nas camadas supracitadas. Além
disso, a densidade mostrou uma diminuição estatisticamente significativa na
CNI do grupo experimental, também associado ao aumento citoplasmático;
A área nuclear das células de todas as camadas avaliadas (CNI, CNE e
CCG) aumentou, o que, juntamente com as características visualmente
aparentes, foram compatíveis com as fases iniciais do fenômeno da picnose
celular, indicando possível apoptose.
Assim sendo, fica clara a necessidade de outros estudos sobre os efeitos
dessa luz, especialmente a longo prazo, com um grupo experimental maior, visto
que esta fonte de luz é utilizada durante toda a vida profissional do cirurgião-
dentista.
21
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LEGENDA DAS FIGURAS
Figura 1: Fotopolimerizador LED de alta potência durante a exposição do olho
direito – caso experimental – à luz, na distância pré-estabelecida de 30cm, definida
por um aparato metálico.
Figura 2: Cortes histológicos com coloração em H&E do olho controle (A) e do olho
exposto à luz LED de alta potência (B).
24
FIGURA 1
Figura 1: Aparelho fotopolimerizador LED de alta potência
(seta), fixado a um aparato metálico (chave), durante
fotoestimulação do olho experimental do animal, mantido
sobre anestesia inalatória (estrela).
25
FIGURA 2
Figura 2. Secções histológicas da retina do rato A (Controle) e B (Experimental) – Camada de células ganglionares (CG); Camada plexiforme interna (CPI); Camada nuclear interna (CNI); Camada plexiforme externa (CPE); Camada nuclear externa (CNE); Prolongamento de cones e bastonetes (PCB). Célula hipercromada sugestiva de picnose (seta); Aumento do espaço citoplasmático (cabeça de seta); Aumento dos prolongamentos de cones e bastonetes (dupla seta). Ambas as fotos no aumento de 100x, campo 9.
26
Tabela I. Descrição do protocolo de coloração das retinas em Hematoxilina e Eosina (HE). Laboratório de técnicas histológicas – UFRN, Natal/RN, 2017.
ETAPA REAGENTE
Desidratação
(1h em cada solução)
Álcool 70%
Álcool 80%
Álcool 90%
Álcool absoluto I
Álcool absoluto II
Álcool absoluto III
Diafanização
(1h em cada solução)
Xilol PA I
Xilol PA II
Xilol PA III
Impregnação
(1h em cada solução)
Estufa 60°C
Parafina I
Parafina II
Parafina III
27
Tabela I - Continuação. Descrição do processamento e preparo das lâminas histológicas para posterior análise.
ETAPA ESTÁGIO REAGENTE
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
Desparafinização
Desparafinização
Desparafinização
Hidratação
Hidratação
Hidratação
Lavagem
Coloração
Lavagem
Coloração
Lavagem
Desparafinização
Desparafinização
Desparafinização
Desparafinização
Fixação do corante e conservação do
material
Fixação do corante e conservação do
material
*Estufa 45ºC
Xilol I
Xilol II
Álcool Etílico 100%
Álcool Etílico 80%
Álcool Etílico 70%
Água
Hematoxilina
Água corrente
Eosina
Água corrente
Álcool Etílico 70%
Álcool Etílico 80%
Álcool Etílico 100%
Álcool Etílico 100% II
Xilol I
Xilol II
28
Tabela II. Espessura das camadas retinianas, expressas em valores médios (µm) e respectivos desvios padrão (DP).
CAMADAS CPI CNE
CNI
PCB
GRUPO MÉDIA DP P MÉDIA DP P MÉDIA DP P MÉDIA DP P
OE 45,64 9,17 <0,001
45,54 9,17 0,853
23,37 4,38 <0,001
17,58 4,5 <0,001
OD 54,77 9,99 45,71 6,47 30,80 5,38 37,69 5,0
Teste de T-Student: OE: Olho esquerdo, OD: Olho direito, CPI: Camada plexiforme interna. CNE: Camada nuclear externa, CNI: Camada nuclear interna e
PCB: Prolongamentos de cones e bastonetes.
29
Tabela III: Densidade das camadas retinianas celulares, expressa em valores médios (células
por mm²) e respectivos desvios padrão (DP).
CAMADAS CNE CNI CCG
GRUPO MÉDIA DP P MÉDIA DP P MÉDIA DP P
OE 14.200 2.021
0,683
8.504 618
<0,001
2.177 621
0,467 OD 14.623 1.428 7.118 792 1.970 251
Teste de T-Student: OE: Olho esquerdo, OD: Olho direito. CNE: Camada nuclear externa, CNI: Camada nuclear interna e CCG:
Camadas de células ganglionares.
30
Tabela IV: Área nuclear das células das camadas CNE, CNI e CCG, expressas em valores
médios (µm2) e respectivos desvios padrão (DP).
CAMADAS CNE CNI CCG
GRUPO MÉDIA DP P MÉDIA DP P MÉDIA DP P
OE 8,81 1,95 <0,001
15,31 1,91 <0,001
7,35 1,79 <0,001
OD 10,86 1,91 16,84 2,76 8,56 2,76
Teste de T-Student: OE: Olho esquerdo, OD: Olho direito. CNE: Camada nuclear externa, CNI: Camada nuclear interna e CCG: Camadas de
células ganglionares.