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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
FACULDADE DE ODONTOLOGIA
THIAGO SOARES DE LIMA
EFEITO DE DIFERENTES DOSES DE DEXAMETASONA SOBRE O REPARO
ALVEOLAR EM RATOS
Rio de Janeiro
2018
THIAGO SOARES DE LIMA
EFEITO DE DIFERENTES DOSES DE DEXAMETASONA SOBRE O REPARO
ALVEOLAR EM RATOS
Dissertação de mestrado apresentada ao
Programa de Pós Graduação em Clínica
Odontológica (Mestrado Profissional) da
Faculdade de Odontologia da Universidade
Federal do Rio de Janeiro, como requisito parcial
para obtenção do grau de Mestre em Clínica
Odontológica.
Orientador: Prof. Dr. Jônatas Caldeira Esteves.
Rio de Janeiro
2018
Dedicatória
À minha família, que sempre foi o meu norte, a minha força, e a minha motivação para
encarar os desafios da vida.
Esposa, Pai, Mãe e Irmão, a vocês todo o meu amor.
AGRADECIMENTOS
A Deus, por tudo que consegui, vivi, sorri, sofri e superei. Sem a certeza da Tua
existência em meu coração nada seria possível.
Aos meus pais, Nélio e Adira, pelos exemplos, dedicação e o amor de toda uma vida.
Obrigado por apoiarem meus projetos e acreditarem sempre no meu melhor.
À minha esposa Gisele, pelo entusiasmo cotidiano que me leva à busca de melhorar a
cada dia. O companheirismo, amor e esse sorriso lindo foram fundamentais nessa conquista.
Te amo!
Ao meu irmão Mauro, pelas palavras, pela força e exemplo de disposição em viver a
vida com leveza, alegria e muito trabalho.
Às minhas sobrinhas, Alice e Caroline. Que alegria é ter vocês em minha vida
renovando minhas energias e esperanças!
Aos meus sogros Lucio e Marlene, pela convivência, carinho, almoços, docinhos e
salgadinhos que serão sempre bem-vindos!
Ao meu orientador Jônatas, por toda confiança, ensinamentos e dedicação. Mestre, sua
tranquilidade, comprometimento e disponibilidade fizeram de cada etapa uma oportunidade
única de aprendizagem. Foi um privilégio desenvolver esse trabalho com você.
À Faculdade de Odontologia da UFRJ, nas pessoas de sua diretora Profª Maria
Cynesia Medeiros de Barros e do seu vice-diretor Prof. Ednilson Porangaba Costa.
Ao Programa de pós-gradução de Mestrado Profissional em Clínica odontológica, na
pessoa da diretora adjunta de pós-gradução Profª Katia Regina Hostílio Cervantes Dias, pela
oportunidade de crescimento profissional e pessoal.
Ao Centro Universitário de Araraquara - UNIARA - pela parceria acadêmica no
desenvolvimento da cirurgia experimental deste projeto.
À professora Thallita Pereira Queiroz pela orientação e apoio na fase experimental
desta pesquisa.
Aos colegas Daniela Marques e Vinícius Porto pela colaboração auxílio nas cirurgias e
manutenção dos animais.
À professora Ana Paula de Souza Faloni, pelas sugestões muito bem-vindas ao longo
da elaboração do projeto.
À professora Rosângela Peccinni da Faculdade de Farmácia e Bioquímica de
Araraquara-Unesp pela orientação nos cálculos de equivalência utilizados no trabalho.
À professora Maria Augusta Visconti pela colaboração na análise radiográfica.
À professora Aline Corrêa Abrahão pelo auxílio na fase laboratorial do projeto.
Ao professor Bruno Augusto Benevenuto pela disponibilidade de uso dos
equipamentos do laboratório de microscopia da UFRJ.
À amiga Amanda Oliveira, por toda ajuda e comprometimento com o projeto. Sua
participação foi essencial.
Às amigas Roberta Deris, Flavia Sader, Laura Mello, e todos os demais representados
no nome de vocês, por todo apoio e incentivo.
A todos que direta ou indiretamente contribuíram na elaboração deste projeto.
RESUMO
DE LIMA, Thiago Soares. Efeito de diferentes doses de dexametasona sobre o reparo
alveolar em ratos. Rio de Janeiro, 2018. Dissertação (Mestrado em Clínica Odontológica) –
Faculdade de Odontologia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2018.
Objetivo: O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de diferentes doses pré-operatórias de
dexametasona sobre o processo de reparo alveolar. Métodos: Sessenta ratos foram
randomicamente divididos em 4 grupos de 15 animais cada que receberam dose única pré-
operatória de dexametasona equivalente a doses humanas de 4mg (grupo 4mg), 8mg (grupo
8mg), 12mg (grupo 12mg) e soro fisiológico 0,9% (grupo controle). Em seguida os animais
foram anestesiados e tiveram seus primeiros molares inferiores esquerdos (M1) extraídos. Os
animais foram sacrificados aos 3, 7, e 40 dias e os alvéolos dentários dissecados e reduzidos.
O alvéolo do M1 foi radiografado para mensuração da densidade radiográfica e em seguida
descalcificado para obtenção de cortes histológicos em parafina para análise histomorfológica
e estereométrica. Os dados quantitativos foram submetidos à análise estatística em um nível
de significância de 5%. Resultados: As características histomorfológicas do processo de
reparo alveolar foram similares entre os 4 grupos. Os grupos controle e 12mg mostraram
diferenças quanto à densidade radiográfica e percentual de matriz conjuntiva aos 3 dias e no
percentual de tecido ósseo aos 7 dias. Este último ocorrendo também entre grupo controle e
8mg (p<0,05). Conclusão: Nenhuma das doses testadas impediu o reparo dos alvéolos com
tecido ósseo neoformado aos 40 dias. Entretanto, a dose equivalente a 12mg diminuiu a
quantidade de tecido conjuntivo e matriz osteóide nas fases iniciais do reparo.
Palavras-chave: dexametasona, alvéolo dental, extração dentária.
ABSTRACT
DE LIMA, Thiago Soares. Effect of different doses of dexamethasone on alveolar repair
in rats. Rio de Janeiro, 2018. Dissertação (Mestrado em Clínica Odontológica) – Faculdade
de Odontologia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2018.
Objective: The objective of this study was to evaluate the effect of different preoperative
doses of dexamethasone on the alveolar repair process. Methods: Sixty rats were randomly
divided into 4 groups of 15 animals receiving a single pre-operative dose of dexamethasone
equivalent to 4 mg (group 4mg), 8mg (group 8mg), 12mg (group 12mg) and saline 0.9 %
(group control). Then the animals were anesthetized and had their first left lower molars (M1)
extracted. The animals were euthanized at 3, 7, and 40 days and then the alveolus was
dissected and reduced. The alveolus of M1 was radiographed for radiographic density
measurement and then decalcified to obtain histological sections in paraffin for
histomorphological and stereometric analysis. The quantitative data were submitted to
statistical analysis at a significance level of 5%. Results: The histomorphologic
characteristics of the alveolar repair process were similar among the 4 groups. However, the
control and 12mg groups showed differences in radiographic density, and percentage of
conjunctive matrix at 3 days and percentage of bone tissue at 7 days. The latter occurring also
among control group and 8mg (p <0.05). Conclusion: None of the used doses prevented the
socket healing with newly formed bone at 40 days. However, the dosis equivalent to 12mg
decreased the quantity of connective tissue and osteoid matrix at the late period of repair.
Keywords: dexamethasone, tooth socket, tooth extraction .
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
FIGURAS
Figura 1: Imagem radiográfica para análise da densidade óssea. Região de interesse para
análise da densidade óssea (quadrado amarelo em detalhe). Superiormente, observa-se a
imagem da escala de alumínio para calibração da análise (imagem à esquerda). .................... 18
Figura 2: Desenho esquemático do método da análise estereométrica. O terço médio do
alvéolo distal do M1 foi enquadrado e sobre a ROI foi colocada uma grade com 200 pontos
para análise. .............................................................................................................................. 19
Figura 3: Avaliação histológica do reparo alveolar aos 3 dias. Hematoxilina & Eosina
(Imagem esquerda: terço médio do alvéolo em magnificação 100x; Imagem direita,
magnificação 400x). Coágulo sanguíneo permeado por células inflamatórias (setas) ocupando
o interior do alvéolo. Na porção periférica à crista alveolar (CA), observa-se tecido fibroso do
ligamento periodontal (LP), fibroblastos (f) e fibras colágenas recém- sintetizadas. .............. 21
Figura 4: Avaliação histológica do reparo alveolar aos 7 dias. Hematoxilina & Eosina
(Imagem esquerda: terço médio do alvéolo em magnificação 100x; Imagem direita,
magnificação 400x). Tecido de granulação (TG) ricamente celularizado com grande número
de vasos sanguíneos (VS) e fibras colágenas dispostas irregularmente. Osteoblastos (setas)
circundando pontos de matriz osteóide (MO). ......................................................................... 22
Figura 5: Avaliação histológica do reparo alveolar aos 40 dias. Hematoxilina & Eosina
(Imagem esquerda: terço médio do alvéolo em magnificação 100x; Imagem direita,
magnificação 400x). Alvéolo reparado por tecido ósseo (TO) imaturo com poucos espaços
medulares (EM). ....................................................................................................................... 22
Figura 6: Análise estereométrica apresentando o percentual de matriz extracelular, vasos
sanguíneos, tecido ósseo e espaço medular nos períodos analisados. * Diferença estatística
significante (p<0,05). Referência: grupo controle...................................................................24
Figura 7: Efeito das diferentes doses pré-operatórias sobre a intensidade de inflamação nos
quatro grupos aos 3, 7 e 40 dias................................................................................................ 25
Figura 8: Fotografias do procedimento cirúgico para exodontia do M1. Abridor bucal
posicionado (A), sidesmotomia com auxílio de uma sonda exploradora (B), luxação do M1
com auxílio de uma espátula Hollenback (C) e M1 extraído (D). ............................................ 34
Figura 9: Fotografia da exibição do programa ImageJ demonstrando a análise da escala de
alumínio. Demarcação da região central (seta vermelha) de 25x75 (circulo vermelho) sobre a
escala de degrau de alumínio. .................................................... Erro! Indicador não definido.
Figura 10: Histograma de distribuição dos níveis de cinza de um degrau da escala de
alumínio, gerada pelo programa ImageJ. Valor médio dos níveis de cinza (retângulo
vermelho) da região central do degrau da escala de alumínio. ................................................. 36
Figura 11: Curva de dispersão e tendência linear. Valores médios dos níveis de cinza (eixo Y)
de cada degrau da escala de alumínio (eixo X) e a fórmula gerada a partir da tendência linear
(retângulo vermelho). ............................................................................................................... 36
Figura 12: Fotografia da exibição do programa ImageJ demonstrando a análise do alvéolo
distal do M1. Demarcação da ROI (seta vermelha) de 10 X 10 (circulo vermelho) no alvéolo
distal do M1. ............................................................................................................................. 37
Figura 13: Histograma de distribuição dos níveis de cinza do alvéolo distal do M1, gerado
pelo programa ImageJ.Valor médio dos níveis de cinza (retângulo vermelho) da ROI do
alvéolo distal do M1. ................................................................................................................ 38
TABELAS
Tabela 1: Média e desvio padrão da densidade radiográfica (em mmAl) dos grupos nos
diferentes períodos de análise. .................................................................................................. 20
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AINEs Anti-inflamatórios não esteroidais
CEUA Comitê de ética no uso de animais
Col1A1 Colágeno 1A1
cm Centímetro
COX Cicloxigenases
DTA Dose total do animal
EM Espaço medular
GC Glicocorticóide
HE Hematoxilina e Eosina
M1 Primeiro molar inferior esquerdo
M2 Segundo molar inferior esquerdo
MC Matriz conjuntiva
mmAl Milímetros de Alumínio
mRNA Ácido ribonucleico menssageiro
ppi Pixel por polegada
PSP Placa de fósforo fotoestimulável
ROI Região de interesse
TIFF Tagged image file format
TO Tecido ósseo
TMB Taxa metabólica basal
UNIARA Centro Universitário de Araraquara
VS Vasos sanguíneos
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................................... 14
2. OBJETIVO .................................................................................................................................. 15
3. MATERIAIS E MÉTODO .......................................................................................................... 15
3.1 Cirurgia Experimental ................................................................................................................ 16
3.2 Análise da densidade radiográfica dos alvéolos dentais ............................................................ 17
3.3 Análise histológica ..................................................................................................................... 18
3.4 Análise Estatística ...................................................................................................................... 20
4. RESULTADOS............................................................................................................................ 20
4.1 Densidade Radiográfica ............................................................................................................. 20
4.2 Características Histomorfológicas ............................................................................................. 20
4.3 Análise Estereométrica .............................................................................................................. 23
5. DISCUSSÃO ............................................................................................................................... 25
6. CONCLUSÃO ............................................................................................................................. 28
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................................... 29
8. APÊNDICE .................................................................................................................................. 33
Apêndice A - Cálculo da equivalência alométrica. ......................................................................................... 33
Apêndice B – Procedimento cirúrgico. ........................................................................................................... 34
Apêndice C – Método de Quantificação da Densidade Radiográfica ............................................................. 35
9. ANEXO........................................................................................................................................ 39
1. INTRODUÇÃO
Os anti-inflamatórios esteroidais ou glicocorticóides (GC) são medicamentos
rotineiramente utilizados em cirurgia oral e maxilofacial para o controle do edema e dos
demais sinais e sintomas da fase aguda da inflamação pós-cirúrgica, induzida pelo trauma e
manipulação tecidual (1). Diferentemente dos anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs) que
inibem exclusivamente a ação das Cicloxigenases (COX) 1 e 2, a ação dos GCs se dá também
pela regulação de uma série de eventos celulares e moleculares do processo inflamatório
como a redução do número de leucócitos, estabilização da membrana de linfócitos, monócitos
e eosinófilos (2,3,4), diminuição da liberação local de enzimas proteolíticas e hialuronidases
(5) e a regulação negativa da expressão gênica de eicosanoides e proteínas pró-inflamatórias
como prostaglandinas, histaminas, bradicininas e adesinas (4,6).
A efetividade dos GCs no controle do edema após cirurgias orais tem sido
comprovada por estudos clínicos que demonstraram uma redução entre 42 a 69% no edema
pós-operatório (7,8,9,10,11). Tal habilidade confere a estes medicamentos uma aplicabilidade
em cirurgias na região de cabeça e pescoço, onde a formação de edema é pronunciada devido
ao grande aporte vascular da área.
Clinicamente, os GCs são administrados em doses pré-operatórias, com ou sem
seguimento pós-cirúrgico. Os regimes terapêuticos presentes na literatura são muito variados,
mas sugere-se que a redução no trismo e edema após extrações dentárias é observada com
doses a partir de 4mg de dexametasona, administradas por via oral uma a duas horas antes do
procedimento (12,13,14). Protocolos de estudos clínicos sugerem a administração de 4 a 8mg
de dexametasona ou betametasona, administrados por via oral ou intra-muscular para
cirurgias orais como extração de dentes inclusos (1,9,15,16). Em cirurgias maxilofaciais é
comum o uso de doses pré-operatórias iguais ou superiores a 10mg por via endovenosa, com
seguimento pós-cirúrgico estendido por 2 a 3 dias (1). A dexametasona é o principal GC
empregado para essa finalidade. Ele possui uma potência 25 vezes maior que o cortisol
endógeno apresenta uma meia-vida plasmática longa, de 36 a 54 horas, conferindo-lhe um
efeito residual que se estende por até 3 dias depois de administrado (17).
Apesar dos benefícios clínicos dos GCs, estes medicamentos possuem um efeito
negativo sobre o processo de cicatrização tanto do tecido ósseo como dos tecidos moles.
Estudos in vivo têm demonstrado que GCs como dexametasona ou prednisona podem levar à
diminuição na síntese de colágeno (18,19,20), redução no número de osteoclastos (18,19) e
15
fibroblastos (20), diminuição da diferenciação e função osteoblástica (18,19), na expressão de
osteocalcina (18) e prejuízo na neoformação e densidade óssea (21,22). Segundo Li et al
(2012), o efeito prejudicial da dexametasona sobre o processo de cicatrização óssea parece ser
limitado aos períodos iniciais, de forma que aos 17 dias pós-operatórios, em defeitos ósseos
produzidos em mandíbulas de ratos, os autores não encontraram diferença nos níveis de
expressão de colágeno entre os grupos dexametasona e controle. Entretanto, a densidade óssea
permaneceu significativamente menor no grupo dexametasona neste mesmo período.
Os dados presentes na literatura demonstram uma correlação entre a corticoterapia e
prejuízo no processo de reparo ósseo, entretanto, não está clara a relação dose-efeito que
potencialmente poderia levar a este prejuízo. Os trabalhos em modelo animal que
fundamentam tal correlação empregaram doses variadas de diferentes medicamentos, como
dexametasona e prednisona em concentrações que variavam desde 0,002mg/Kg a 3mg/Kg
(18,19,21,22). Somado a isso, as diferentes vias de administração, a potência dos
medicamentos e os regimes terapêuticos empregados nestes estudos dificultam ainda mais a
compreensão de como a dose dos medicamentos poderia influenciar no processo de reparo.
2. OBJETIVO
O objetivo deste trabalho foi testar a hipótese de que doses usuais de dexametasona
interferem no reparo alveolar, demonstrando qualitativa e quantitativamente quais etapas do
processo foram afetadas dentro dos diferentes esquemas terapêuticos.
3. MATERIAIS E MÉTODO
O presente estudo foi aprovado pelo comitê de ética no uso de animais (CEUA) do
Centro Universitário de Araraquara (UNIARA), número do processo 020/2016.
Foram utilizados 60 ratos (Norvegicus albinus - Wistar) machos, adultos, com
aproximadamente 300g provenientes do Biotério Central da Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto-USP. Os animais foram mantidos no biotério central do UNIARA em ciclo
circadiano de 12 horas luz/escuridão em uma sala com temperatura controlada de 23 ± 2 °C,
água e comida ad libtum. Após um período de sete dias de aclimatação no biotério, os ratos
foram randomicamente divididos, por meio de sorteio, em quatro grupos com 15 animais
cada. Com o objetivo de simular as doses pré-operatórias de 4, 8 e 12mg, utilizadas nos
16
protocolos clínicos em humanos, a equivalência da dose animal foi calculada por meio de
cálculo de equivalência alométrica (23). O método leva em consideração a espécie, sua
temperatura, massa corporal e taxa metabólica. Estes dados equacionados fornecem a taxa
metabólica basal ou a quantidade de energia que cada organismo necessita para se manter
vivo, durante 24 horas, em posição de repouso. A partir deste parâmetro, calcula-se a dose
metabólica de humanos e ratos, estabelecendo uma proporção entre ambas e
consequentemente, a dose equivalente (Apêndice A).
3.1 Cirurgia Experimental
Após o período de aclimatação, cada animal foi pesado e recebeu uma dose única pré-
operatória de dexametasona (Decadron®, Aché Laboratórios Farmacêuticos AS, São Paulo,
SP, Brasil) por via intramuscular de acordo com os cálculos previamente realizados para cada
grupo: Grupo 4mg: 0,25mg/kg; Grupo 8mg: 0,5 mg/kg; Grupo 12mg: 0,75mg/kg e Grupo
Controle: 0,1mL de Soro Fisiológico 0,9% (Fisiológico, Laboratórios Biosintética Ltda®,
Ribeirão Preto, SP, Brasil). Quinze minutos após a administração de dexametasona, momento
em que o medicamento atinge seu pico plasmático por via intra-muscular (24), cada rato foi
anestesiado com uma combinação de Cloridrato de Xilazina (Dopaser® - Bayer S. A – Saúde
Animal, Brasil) na dosagem de 0,04mL/100g de massa corporal, para promover o
relaxamento muscular e Cloridrato de Quetamina (Quetamin® - Virbac do Brasil Ltda, Brasil)
na proporção de 0,08 mL/100g de massa corporal para anestesia.
Os animais foram estabilizados em decúbito ventral para exodontia do primeiro molar
inferior esquerdo (M1). Um abridor de boca foi mantido na região anterior da cavidade bucal
para acesso à região dos molares, e posteriormente, uma gaze embebida em solução de
clorexidina 0,12% (Periogard, Colgate, São Bernardo do Campo, São Paulo, Brasil) foi
suavemente friccionada nas superfícies mucosas e dentárias da cavidade bucal do animal.
Com o auxílio de uma sonda exploradora foi realizada a sindesmotomia do tecido gengival,
correndo a ponta do instrumento em torno do dente em questão. Em seguida, os dentes foram
luxados e extraídos com auxílio de uma espátula Hollenback nos sentidos mésio-distal e
cérvico-apical (25,26) (Apêndice B). As exodontias foram realizadas pelo mesmo operador,
previamente treinado, utilizando a mesma técnica cirúrgica em todos os grupos.
Após a extração, todos os animais receberam, por via intramuscular, dose única de
0,2mL de antibiótico (benzilpenicilinabenzatina, procaína e potássica; diestreptomicina e
17
estreptomicina - Pentabiótico® Veterinário Reforçado Wyeth S.A. Indústrias Farmacêuticas,
São Bernardo do Campo, SP, Brasil) e 5mg/kg de tramadol por via-muscular (Janssen-Cilag
Farmacêutica LTDA, São Paulo, SP, Brasil). Os animais foram mantidos com dieta à base de
ração triturada durante o período de pós-operatório.
Cinco animais de cada grupo foram sacrificados por meio de dose excessiva de
anestésico (Quetamina) de acordo com os períodos de estudo: 3, 7 e 40 dias.
3.2 Análise da densidade radiográfica dos alvéolos dentais
Após a morte dos animais, a mandíbula foi dissecada, fixada em solução de
paraformaldeído a 4% durante 48 horas e então radiografada pelo sistema de imagem digital
semidireta Express®
(Kavo, Biberach, Alemanha), o qual utiliza uma placa de fósforo
fotoestimulável (PSP) como receptor de imagem (27, 28, 29). As tomadas radiográficas foram
realizadas com os seguintes parâmetros: 70 kVp, 10 mA, tempo de exposição de 0,2
segundos, e distância focal de 40cm. Todas as imagens foram adquiridas com um
posicionador de acrílico, padronizado, onde o feixe central de raios-x incidia de forma
perpendicular à área de interesse. Uma escala de alumínio (10 degraus e espessura de um
milímetro) foi utilizada durante a aquisição da imagem para o posterior cálculo da densidade
radiográfica.
As imagens foram exportadas do programa ClinView®, em uma resolução de 640 ppi
(pixel por polegada) e importadas, em formato TIFF (Tagged Image File Format) para o
programa ImageJ® versão 1.410 (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). Para
estabelecer um padrão na densidade óssea avaliada para cada imagem separadamente, em
cada degrau de alumínio foi selecionada uma região de 70 x 25 e extraído o histograma com
as médias dos valores de cinza. Todos os valores foram organizados em uma tabela no
programa Microsoft Excel® 2010 (Microsoft Corporation, Redmont, Washington, USA) e
gerado o gráfico de dispersão do qual se obteve uma linha de tendência com sua respectiva
fórmula (27). Com isso, foi possível calcular as médias dos valores de cinza, em milímetro de
alumínio (mmAl) para cada degrau da escala, compensando as possíveis diferenças entre as
radiografias. A região de interesse (ROI) de 10 x 10 no alvéolo distal do M1 foi definida
como a porção central do alvéolo correspondente à região do terço médio, tomando-se como
referência o comprimento da raiz mesial do M2 (Figura 1). O valor obtido da ROI foi aplicado
à fórmula para o cálculo da densidade em mmAl. (Apêndice C)
18
Figura 1: Imagem radiográfica para análise da densidade óssea. Região de interesse para análise da densidade
óssea (quadrado amarelo em detalhe). Superiormente, observa-se a imagem da escala de alumínio para
calibração da análise (imagem à esquerda).
3.3 Análise histológica
Após um período de 48 horas em paraformaldeído, os espécimes foram
descalcificados em EDTA 14% (0,5M pH 8.0) (Proquimios, Rio de Janeiro-RJ, Brasil)
durante 8 semanas, com três trocas semanais em temperatura ambiente. Em seguida, o
material foi neutralizado em água corrente durante 24 horas, desidratado numa sequência de
álcoois em concentrações crescentes (70%, 80%, 90% e 100%), diafanizados em xilol e
embebidos em parafina. O alvéolo processado de cada animal foi cortado em micrótomo com
cortes semi-seriados de 4μm de espessura no plano sagital. Cortes histológicos foram obtidos
da porção mais central do alvéolo, em 3 regiões diferentes, distando 50μm entre si (26).
Para a análise histomorfológica, as lâminas foram desparafinizadas e reidratadas para
coloração pela técnica de Hematoxilina e Eosina (HE). Os cortes foram analisados sob
microscopia ótica de luz (Leica DM2500, Leica Microsystems, Wetzlar Hessen, Alemanha)
com lentes objetivas de diferentes aumentos (25, 50, 100, 200 e 400x) para avaliação
qualitativa descritiva das diferentes fases do processo de reparo alveolar: fase de proliferação
celular, desenvolvimento do tecido conjuntivo, maturação do tecido conjuntivo, diferenciação
óssea e maturação óssea; ao longo dos períodos de reparo entre os diferentes grupos.
A análise estereométrica foi feita por dois avaliadores “cegos” para os grupos e
previamente calibrados (correlação intraclasse 0,78). A média das porcentagens obtidas pelos
dois avaliadores foi utilizada como réplica biológica para análise estatística (25,26). As
19
quantificações foram realizadas sob microscopia ótica de luz (Leica DM2500, Leica
Microsystems, WetzlarHessen, Alemanha) no alvéolo distal do M1, tomando-se como
referência o terço médio da raiz do M2 (Figura 2), a partir de uma fotomicrografia efetuada
com uma câmera fotográfica digital DFC-300-FX (Leica Microsystems, Alemanha), com
resolução de 1,3 megapixels, acoplada ao microscópio ótico (Leica DM2500, Leica
Microsystems, WetzlarHessen, Alemanha) com um aumento de 100x. Com o auxílio de um
programa editor de imagens (Adobe Photoshop® CS6, Adobe, USA) uma grade de linhas
verticais e horizontais equidistantes, cujas intersecções das linhas totalizaram 200 pontos, foi
construída e sobreposta sobre o terço médio do alvéolo distal do M1 - ROI (Figura 2). As
estruturas analisadas quantitativamente foram: Matriz Conjuntiva (MC) – matriz de tecido
conjuntivo não mineralizada e fibroblastos, Vasos Sanguíneos (VS), Tecido Ósseo (TO) e
Espaços Medulares (EM). Pontos de intersecção fora da área do alvéolo foram
desconsiderados. A quantidade de pontos coincidentes com cada estrutura dentro do alvéolo
foi considerada como uma porcentagem da área total, calculada por regra de três simples. A
intensidade do processo inflamatório foi mensurada na região do terço médio da raiz
utilizando um sistema de escore: 0= ausência de células inflamatórias; 1= inflamação leve
(poucas células inflamatórias); 2= inflamação moderada (muitas células inflamatórias); 3=
inflamação severa (predominância de células inflamatórias) (30,31,32,33).
Figura 2: Desenho esquemático do método da análise estereométrica. O terço médio do alvéolo distal do M1
foi enquadrado e sobre a ROI foi colocada uma grade com 200 pontos para análise.
20
3.4 Análise Estatística
Os dados quantitativos obtidos nas análises estereométrica e radiográfica foram
submetidos ao teste de normalidade de Kolmogorov-Smirnov, seguidos do teste de Kruskal-
Wallis e pós-teste de Dunn. Os cálculos foram realizados por meio do programa GraphPad
Prism® 6.0 (GraphPad Inc., San Diego, CA, USA) com nível de significância menor que 5%
(p<0,05).
4. RESULTADOS
4.1 Densidade Radiográfica
A análise das radiografias demonstrou um aumento progressivo nos valores da
densidade entre 3 e 40 dias, que ocorreu de forma semelhante nos quatro grupos analisados
(Tabela 1). Uma diferença estatisticamente significante foi detectada entre os grupos controle
e 12mg aos 3 dias (p<0,05).
Tabela 1: Média e desvio padrão da densidade radiográfica (em mmAl) dos grupos nos
diferentes períodos de análise.
Controle
(n=15)
4mg
(n=15)
8mg
(n=15)
12mg
(n=15)
3 dias (n=20) 1,35 0,30* 1,16 0,30 1,15 0,20 0,66 0,09
*
7 dias (n=20) 1,44 0,09 1,38 0,03 1,04 0,07 0,91 0,60
40 dias (n=20) 2,98 0,50 3,05 0,20 2,29 0,10 3,34 0,10
*Diferença estatisticamente significante (p<0,05).
4.2 Características Histomorfológicas
As caractéristicas histomorfológicas do processo de reparo dos alvéolos dentários
foram similares entre os 4 grupos ao longo dos períodos de análise (Figuras 3, 4 e 5). Aos 3
dias, um coágulo sanguíneo permeado por células inflamatórias mononuclerares e
polimorfonucleares era observado no interior do alvéolo de todos os grupos. Uma faixa de
tecido conjuntivo frouxo, correspondente ao ligamento periodontal se estendia ao longo das
margens do alvéolo. Nesta região, alguns fibroblastos e matriz colágena já podiam ser
observados. Aos 7 dias, o tecido de granulação ocupava a maior parte do alvéolo e uma
21
porção residual do coágulo sanguíneo cobria sua porção mais superficial. O tecido era
composto basicamente por fibras colágenas com disposição irregular envolvendo fibroblastos,
vasos sanguíneos e um infiltrado inflamatório predominantemente mononuclear que se
concentrava na porção cervical do alvéolo, junto ao coágulo sanguíneo. Em alguns espécimes,
especialmente no grupo controle, era possível identificar a presença de matriz osteóide
coberta por osteoblastos com características de atividade secretória intensa. A remodelação
óssea nas margens da ferida era evidenciada pela perda de continuidade da cortical alveolar e
presença de osteoclastos e osteoblastos ao redor de um osso imaturo. Aos 40 dias, o alvéolo
era preenchido por osso denso com distribuição irregular das lacunas osteocíticas. Os espaços
medulares eram escassos e continham especialmente vasos sanguíneos com presença de
poucas células inflamatórias. Essas características eram observadas nos 4 grupos.
Figura 3: Avaliação histológica do reparo alveolar aos 3 dias. Hematoxilina & Eosina (Imagem esquerda: terço
médio do alvéolo em magnificação 100x; Imagem direita, magnificação 400x). Coágulo sanguíneo permeado por
células inflamatórias (setas) ocupando o interior do alvéolo. Na porção periférica à crista alveolar (CA), observa-
se tecido fibroso do ligamento periodontal (LP), fibroblastos (f) e fibras colágenas recém- sintetizadas.
22
Figura 4: Avaliação histológica do reparo alveolar aos 7 dias. Hematoxilina & Eosina (Imagem esquerda: terço
médio do alvéolo em magnificação 100x; Imagem direita, magnificação 400x). Tecido de granulação (TG)
ricamente celularizado com grande número de vasos sanguíneos (VS) e fibras colágenas dispostas
irregularmente. Osteoblastos (setas) circundando pontos de matriz osteóide (MO).
Figura 5: Avaliação histológica do reparo alveolar aos 40 dias. Hematoxilina & Eosina (Imagem esquerda: terço
médio do alvéolo em magnificação 100x; Imagem direita, magnificação 400x). Alvéolo reparado por tecido
ósseo (TO) imaturo com poucos espaços medulares (EM).
23
4.3 Análise Estereométrica
Todos os grupos apresentaram neoformação óssea alveolar no estágio tardio de reparo.
As estruturas vasculares observadas foram estatísticamente semelhantes entre os quatro
grupos em todos os períodos estudados (Figura 6). Aos 3 dias, a deposição de matriz
extracelular, mostrou diferença significativa entre os grupos controle e 12mg (p<0,05). Aos 7
dias pós-operatórios, os alvéolos apresentaram predomínio de matriz extracelular e formação
de trabeculado ósseo rudimentar, com diferença estatística entre o grupo controle e os grupos
8mg (p<0,01) e 12mg (p<0,01). Passados 40 dias, as estruturas de neoformação óssea
apresentaram-se de forma similar nos quatro grupos.
A análise da intensidade do processo inflamatório (Figura 7) demonstrou um
predomínio de inflamação leve a moderada no grupo controle e no grupo 4mg, aos 3 e 7 dias.
Aos 40 dias a intensidade da inflamação foi menor e semelhante entre os grupos, mostrando
um infiltrado inflamatório leve ou ausente nos 4 grupos.
24
Figura 6: Análise esteriométrica apresentando o percentual de matriz extracelular, vasos sanguíneos, tecido
ósseo e espaço medular nos períodos analisados. * Diferença estatística significante (p<0,05). Referência:
grupo controle.
25
Figura 7: Efeito das diferentes doses pré-operatórias sobre a intensidade de inflamação nos quatro grupos aos 3,
7 e 40 dias.
5. DISCUSSÃO
A interferência dos GCs no processo de reparação de feridas, tanto de tecidos moles
quanto de tecidos duros, já é bem estabelecida na literatura (18,19,20,21,22). Tendo em vista
o uso frequente destes medicamentos como terapia anti-inflamatória em cirurgias orais e
maxilofacias, a proposta do presente estudo foi mensurar, in vivo, o efeito de doses usuais de
dexametasona sobre a dinâmica do processo de reparo alveolar por meio de um modelo
experimental translacional.
O rato é um modelo tradicional em estudos de reparação alveolar por sua fácil
disponibilidade, manuseabilidade e reprodutibilidade da cirurgia de extração dentária
(25,26,34,35,36). O alvéolo pós-extração segue um padrão de reparo próprio dos tecidos
conjuntivos, com a peculiaridade da presença de remanescentes do ligamento periodontal, rico
em células-tronco indiferenciadas (37,38). Segundo Consolaro (2009), a reparação alveolar
consiste na última fase de uma inflamação local bem-sucedida, dependente da formação de
um tecido de granulação e liberação local de citocinas e fatores de crescimento ósseo que
26
estimulam a regeneração do osso alveolar. Dessa forma, alterações produzidas em eventos
inicias da fase de formação do tecido de granulação podem afetar qualitativa e
quantitativamente o osso que irá se formar no interior do alvéolo. Assim, por meio de análises
radiográfica, histomorfológica e estereométrica buscou-se avaliar o reparo alveolar não
somente nos estágios iniciais como também em um período tardio, para analisarmos se as
doses testadas poderiam afetar o osso depois de completada sua reparação.
A equivalência de dose é um método matemático que estipula a dose equivalente
aproximada de um dado medicamento entre diferentes espécies. Ela pode ser feita por meio
da proporção de massa, superfície corpórea ou extrapolação alométrica. A estimativa por peso
é um método que não leva em consideração as diferenças dos parâmetros farmacocinéticos e
metabólicos entre duas espécies e deve ser usado apenas para indivíduos da mesma espécie
(40). A extrapolação por superfície corpórea assume as diferenças na taxa de metabolismo
entre duas espécies como fator de cálculo para a equivalência de doses. Mamíferos menores
possuem um metabolismo mais acelerado e, portanto, a velocidade dos processos fisiológicos
é maior. Neste modelo, tais diferenças fisiológicas são estimadas por meio de um único
parâmetro: a superfície corporal (41). A extrapolação alométrica, o método mais preciso, leva
em consideração a espécie, sua temperatura, massa corporal e taxa metabólica; dados que
equacionados, fornecem a taxa metabólica basal, ou a quantidade de energia que cada
organismo necessita para se manter vivo, durante 24 horas, em posição de repouso
(42,43,44,45).
Nos resultados obtidos neste estudo, observou-se um maior infiltrado inflamatório no
grupo controle comparado aos demais grupos, especialmente aos 7 dias, seguido por uma
acentuada diminuição das células inflamatórias aos 40 dias. Estes dados confirmam o efeito
farmacológico da administração de dexametasona neste modelo experimental e corroboram os
achados de Li et al (2012) em um estudo que avaliou o efeito da dexametasona no reparo de
defeito ósseo em mandíbula de ratos, onde notou-se maior intensidade na expressão de
cicloxigenase 2 (COX-2) no grupo controle. Com o objetivo de não acrescentar variáveis ao
efeito anti-inflamatório da dexametasona, optou-se pela administração pós-operatória de
tramadol, um analgésico de ação central que não possui atividade em cicloxigenases.
A análise da densidade radiográfica, conforme esperado, demonstrou aumento gradual
no decorrer dos períodos do reparo, devido à gradativa substituição do coágulo sanguíneo por
tecido de granulação, matriz osteóide e osso mineralizado, conforme observado ao longo dos
40 dias pós-opertórios na análise histomorfológica. As características histológicas dos
espécimes também permitem observar que mesmo a maior dose de dexametasona
27
administrada antes da cirurgia, 12mg, não impediu que o alvéolo se reparasse completamente,
à semelhança dos demais grupos.
As alterações atribuídas ao efeito da dexametasona ocorreram especialmente nos
períodos iniciais da cicatrização, com uma maior densidade radiográfica e deposição de
matriz conjuntiva aos 3 dias no grupo controle comparado ao grupo 12mg (p=0,04). Essa
diferença na matriz colágena reflete na porcentagem de osso neoformado aos 7 dias,
significativamente maior no grupo controle comparado ao 12mg (p=0,046). Este achado é
consistente com estudos que demonstram a interferência dos GCs na formação do colágeno
(20,46,47,48) e da matriz osteóide (18,19,49,50). Advani et al (1997) demonstraram a
diminuição na síntese de colágeno em defeitos de calota de ratos 24 horas após administração
de dose única de 1mg/Kg de dexametasona. Os autores observaram a redução nos níveis de
ácido ribonucleico menssageiro (mRNA), de colágeno 1A1 (Col1A1) e osteocalcina. Tal
redução na expressão de Col1A1 foi também observada, in vitro, em cultura de osteoblastos
(51) e fibroblastos (52,53,54). Os osteoblastos parecem ser células especialmente afetadas
pelos GCs. O uso destes medicamentos diminui a expressão de integrina beta-1 por
osteoblastos, interferindo na adesão destas células às proteínas da matriz óssea extracelular de
forma dose-dependente. Esta interferência da dexametasona parece estar restrita às fases
iniciais da reparação óssea (42). No presente trabalho, o osso formado no alvéolo aos 40 dias
não apresenta diferença qualitativa ou quantitativa entre os grupos.
É importante tomar como base que as fases finais do processo inflamatório são as
precursoras do processo de reparo, e vários dos mecanismos responsáveis pelo início da
neoformação tecidual são dependentes de fatores inflamatórios outrora inibidos pelo
medicamento. Assim, o limite entre o efeito anti-inflamatório desejável e o prejuízo no
processo de reparo é uma linha tênue e ainda não compreendida. Este trabalho é o primeiro a
demonstrar como doses terapêuticas utilizadas na prática clínica poderiam afetar a dinâmica
da reparação alveolar, de forma que novos estudos devam ser desenvolvidos a fim de se
buscar uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos nesse processo. Especialmente
em face aos novos tratamentos de superfície que permitem uma osseointegração precoce de
implantes dentários, é importante que se conheça cada vez mais estes mecanismos uma vez
que os eventos inicias da reparação alveolar têm sido a chave do sucesso para osseointegração
de implantes pós-exodônticos.
28
6. CONCLUSÃO
A análise conjunta dos resultados deste estudo permite sugerir que, dentro do modelo
proposto em ratos, dose única pré-operatória até 8mg de dexametasona não produziria
alterações significativas no processo de reparação alveolar. Em contrapartida, doses a partir
de 12mg produziriam alterações nas fases inicias da cicatrização do alvéolo.
29
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33
8. APÊNDICE
Apêndice A - Cálculo da equivalência alométrica.
A equivalência de dose é um método matemático que estipula a dose equivalente
aproximada de um dado medicamento entre diferentes espécies. Ela pode ser feita por meio
da proporção de massa, superfície corpórea ou equivalência alométrica. A extrapolação
alométrica, o método mais preciso, leva em consideração a espécie, sua temperatura, massa
corporal e taxa metabólica; dados que equacionados, fornecem a taxa metabólica basal, ou a
quantidade de energia que cada organismo necessita para se manter vivo, durante 24 horas,
em posição de repouso. A partir deste parâmetro, é possível calcular a dose metabólica da
cada espécie e finalmente, ajustar as doses em miligramas por quilo (mg/Kg) para que se
tornem equivalentes (55).
Para o cálculo de equivalência alométrica entre humanos e ratos das doses propostas
no presente estudo foi, primeiramente, determinada a taxa metabólica basal (TMB) que é
expressa pela seguinte fórmula:
TMB = M0,75
x k
onde:
M0,75
: Peso metabólico basal (massa corporal elevada à potencia de 0,75)
k: Constante teórica de proporcionalidade dependente da espécie, baseada na temperatura
(para mamíferos placentários, k=70)
Assumindo um Rato de 300g, a TMB=28,35kcal.
Assumindo um Humano adulto de 60Kg, TMB=1508,5Kcal
Em seguida, as doses humanas de dexametasona testadas foram assumidas como
Doses Metabólicas. Assim:
Dose de 4mg = 4mg/1508,5kcal=0,00265mg/Kcal
Dose de 8mg = 8mg/1508,5= 0,00530mg/Kcal
Dose de 12mg = 12mg/1508,5= 0,00795mg/Kcal
Por meio de regra de três simples, a Dose Total para o Animal alvo foi estimada a
partir da dose metabólica humana:
Para 4mg: 0,00265mg -------- 1 kcal
DTA -------- 28,35 kcal (TMB do rato)
DTA = 0,075mg
Portanto, para 8mg: DTA = 0,15 mg e para 12mg:DTA = 0,225 mg.
34
Apêndice B – Procedimento cirúrgico.
Para exodontia do primeiro molar inferior esquerdo (M1) os animais foram
estabilizados em decúbito ventral e em seguida um abridor de boca foi mantido nos incisivos
centrais para acesso à região dos molares. Com uma sonda exploradora foi realizada a
sindesmotomia do tecido gengival correndo a ponta do explorador em torno do M1 e então os
dentes foram luxados com auxílio de uma espátula Hollenback nos sentidos mésio-distal e
cérvico-apical e posteriormente extraídos (Figura 8).
Figura 8: Fotografias do procedimento cirúgico para exodontia do M1. Abridor bucal posicionado (A),
sidesmotomia com auxílio de uma sonda exploradora (B), luxação do M1 com auxílio de uma espátula
Hollenback (C) e M1 extraído (D).
35
Apêndice C – Método de Quantificação da Densidade Radiográfica
Após a tomada radiográfica as imagens obtidas da mandíbula e da escala de alumínio
foram analisadas no programa Image J (Figura 9). Posteriormente, um histograma sobre todos
os 10 degraus da escala de alumínio foi gerado sobre uma região central de 25x75, para obter
seus valores médios dos níveis de cinza (Figura 10).
Figura 6: Fotografia da exibição do programa ImageJ demonstrando a análise da escala de alumínio.
Demarcação da região central (seta vermelha) de 25x75 (circulo vermelho) sobre a escala de degrau de alumínio.
36
Figura 7: Histograma de distribuição dos níveis de cinza de um degrau da escala de alumínio, gerada pelo
programa ImageJ. Valor médio dos níveis de cinza (retângulo vermelho) da região central do degrau da escala de
alumínio.
Os valores gerados pelo histograma foram então organizados em uma planilha no
progama Microsoft Excel® 2010. Para correção de diferenças potenciais entre as imagens
radiográficas, a partir destes dados preliminares, foi gerado um gráfico de dispersão (Figura
11), de onde obtivemos sua tendência linear e sua fórmula, para definir em milímetros de
alumínio (mmAl), os valores dos níveis de cinza de cada imagem.
Figura 8: Curva de dispersão e tendência linear. Valores médios dos níveis de cinza (eixo Y) de cada degrau da
escala de alumínio (eixo X) e a fórmula gerada a partir da tendência linear (retângulo vermelho).
37
Em seguida, em cada imagem, foi gerado um histograma de uma área de 10x10 pixel
na região entre terços médio e apical do alvéolo distal do M1 (Figuras 12 e 13). O valor médio
do nível de cinza foi então inserido na fórmula do gráfico, para obter o valor equivalente em
mmAl dos níveis de cinza da ROI no alvéolo distal do M1.
Figura 9: Fotografia da exibição do programa ImageJ demonstrando a análise do alvéolo distal do M1.
Demarcação da ROI (seta vermelha) de 10 X 10 (circulo vermelho) no alvéolo distal do M1.
38
Figura 10: Histograma de distribuição dos níveis de cinza do alvéolo distal do M1, gerado pelo programa
ImageJ.Valor médio dos níveis de cinza (retângulo vermelho) da ROI do alvéolo distal do M1.
Os dados com os valores em mmAl da ROI do alvéolo distal do M1 de cada imagem,
foram então analisados de acordo com os grupos e períodos de estudo para realizar os testes
estatísticos.
39
9. ANEXO
Anexo A - Aprovação do comitê de ética em pesquisa em animais.