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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

LEONARDO CAMPOS MONÇÃO RIBEIRO

O PAPEL DOS RECEPTORES P2X7 EM MODELO MURINO DE LESÃO PULMONAR AGUDA

Rio de Janeiro 2008

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2

LEONARDO CAMPOS MONÇÃO RIBEIRO

O PAPEL DOS RECEPTORES P2X7 EM MODELO MURINO DE LESÃO PULMONAR AGUDA

Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas visando a obtenção do grau de Mestre em Ciências Morfológicas

Orientador: Prof Dra Christina Maeda Takiya

(ICB/UFRJ) Co-orientador: Prof. Dr. Robson Coutinho-Silva

(IBCCF-UFRJ)

Rio de Janeiro 2008

3

LEONARDO CAMPOS MONÇÃO RIBEIRO O papel dos receptores P2X7 em modelo murino de lesão pulmonar aguda

Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-graduação em Ciências Morfológicas visando a obtenção do grau de Mestre em Ciências

Morfológicas

Orientador: Prof Dra Christina Maeda Takiya Prof. Associado do Instituto de Ciências Biomédicas

(ICB/UFRJ)

Co-orientador: Prof. Dr. Robson Coutinho-Silva Prof. Associado do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho

(IBCCF-UFRJ)

4

Monção-Ribeiro, Leonardo Campos O papel dos receptores P2X7 em modelo murino de lesão pulmonar aguda Rio de Janeiro: UFRJ/CCS/ICB/Instituto de Ciências Biomédicas,2008 p.130 Dissertação de Mestrado em Ciências Morfológicas 1. Receptores P2X7 2. ALI/ARDS 3. inflamação

5

Este trabalho foi realizado nos laboratórios de Patologia Celular, no

Instituto de Ciências Biomédicas e nos laboratórios de Imunofisiologia e

Fisiologia pulmonar no Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho com os

auxílios financeiros concedidos pela FAPERJ, CNPq e PRONEX

6

AGRADECIMENTOS

A Deus.

À minha família. Ao meu filho que esta com 10 semanas na barriga da minha esposa

Flávia Aline, meu Amor.

À prof. Christina Maeda Takiya e ao prof. Robson Coutinho-Silva, meus orientadores e

responsáveis pela minha paixão que é a pesquisa.

A todos que direta ou indiretamente participaram desta dissertação ou da minha vida.

7

RESUMO Tem sido verificada a importância da sinalização purinérgica na imunidade inata e em

processos patológicos. Neste trabalho verificamos o papel dos receptores P2X7 em modelo

murino de lesão pulmonar aguda. Camundongos C57BL/6 selvagens e nocautes para o

receptor P2X7 foram instilados com lipopolissacarídeo - LPS (E. coli-60mg/50µL) ou salina

(50 µL), constituindo os grupos (LPS-KO, LPS-WT, CTRL-KO e CTRL-WT). Os animais

foram sacrificados 24 horas após a instilação sendo realizados estudos histológicos,

imunohistoquimicos e histomorfométricos. A partir do fluido do lavado bronco-alveolar

(BALF) foram dosados óxido nítrico, IL-β e lactato dehidrogenase (LDH) além da

realização de testes de função pulmonar (elastância estática e dinâmica, pressões resistivas

e viscoelásticas e o deltaP total) obtidos pelo método de oclusão ao final da inspiração. A

expressão dos receptores P2X7 foi aumentada no grupo LPS-WT em comparação com os

animais WT (p<0,05). Houve atenuação da lesão pulmonar nos animais LPS-KO com

diminuição significativa da inflamação pulmonar (células mononucleares e

polimorfonucleares), ausência de mastócitos e decréscimo de áreas de colapso pulmonar

(p<0,05), assim como na quantidade de NO, IL1β e LDH secretados no BALF nos animais

LPS-KO em comparação com animais KO (p>0,05). Apesar de não haver modificação do

número de macrófagos (F4/80+) no grupo LPS-KO em comparação com animais CTRL-

KO, o número de macrófagos ativados (BSL+) foi semelhante ao dos animais CTRL-KO.

As tramas de fibras colágenas, elásticas e fibronectina depositada nos animais LPS-KO são

quantitativamente semelhantes as do grupo CTRL-KO (p>0,05). A imunoexpressão de

TGF-β e MMP-9 aumentou em todos os grupos LPS quando comparados aos seus

controles, mas o aumento visto no grupo LPS-KO foi menor que o do grupo LPS-WT

8

(p<0,001). MMP-2 por outro lado, apesar de ter aumentado significativamente nos animais

LPS-WT, não foi modulado no animal LPS-KO quando comparado com o CTRL-KO. Os

animais LPS-KO não apresentaram alterações na função pulmonar (p>0.05). Em conclusão

podemos dizer que o receptor P2X7 participa na lesão pulmonar aguda induzida pelo LPS

atuando no recrutamento de neutrófilos e mastócitos, na ativação macrofágica e no

remodelamento da matriz extracelular.

Palavras-chaves: lesão pulmonar aguda; sinalização purinérgica, remodelamento pulmonar,

função pulmonar.

9

ABSTRACT The importance of the purinergic signalling in the mantainance of the innate immunity and

in pathological process has been object of extensive research.

We have investigated the roles of P2X7R activation in mice model of acute lung injury

(ALI). C57BL/6 wild-type and P2X7R knockout mice were intratracheally instillated with

LPS (n=6) (E. coli-60mg/50µL- LPS-KO e LPS-WT) or saline (n=5) (50 µL, C-KO e C-

WT) (LPS-KO, LPS-WT, CTRL-KO e CTRL-WT). Lung histology (amount of elastic,

collagen fibers, fibronectin and mast cells in the alveolar septa), the expression of P2X7R,

F4/80, BSL-1 lectin TGF-β and MMPs 2 and 9, mechanical parameters (static and dynamic

elastances, resistive and viscoelastic/inhomogeneous pressures, and deltaPtot obtained by

end-inflation occlusion method) and biochemical analysis of lactate dehydrogenase (LDH),

nitric oxide (NO) and IL-1β secretion in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) were

analyzed after 24 hours. Histomorphometric analysis of lung parenchyma demonstrated

diminished polymorphonuclear and mononuclear cells (p<0.05), absence of mast cells

(alcian-blue pH2.5) and decrease in alveolar collapse (p<0.05) in LPS-KO group . The

LPS-KO and C-KO animals did not change the amount of collagen and elastic fibers,

fibronection immunoexpression as well as secretion of LDH, NO and IL-1β in BALF

(p>0.05). The expression of P2X7R was increased in LPS-WT group when compared with

WT animals (p<0.05). Macrophages (F4/80+) did not change after LPS treatment in LPS

(WT and KO) groups (p>0.05), however the macrophage activation (BSL-1+ lectin) was

abolished in LPS-KO group (p<0.05). The expression of TGF-β was increased in all LPS

groups compared with controls, but the increase showed by LPS-KO group was smaller

(p<0,001). The animals LPS-KO did not have altered pulmonary functions (p>0.05).Thus

10

the P2X7R participates in ALI on the recruitment of neutrophils and mast cells, in

macrophage activation and in extracellular matrix remodeling.

Keywords: acute lung injury, purinergic signaling, pulmonary remodeling, pulmonary

function.

11

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

FIGURA 1. Esquema mostrando sistema respiratório. .................................................. 23

FIGURA 2. Esquema mostrando o receptor P2X7 e suas interações com componentes

celulares ............................................................................................................................... 32

FIGURA 3. Esquema mostrando protocolo experimental. ............................................ 41

FIGURA 4. Montagem experimental da obtenção e coleta de dados consistindo de ... 54

FIGURA 5. Representação esquemática dos traçados de fluxo, volume, pressão em

função do tempo, obtidos a partir da oclusão da via aérea ao final da inspiração....... 55

FIGURA 6. Detecção e Quantificação por imunohistoquímica (densidade de

superfície) dos receptores P2X7 . ...................................................................................... 58

FIGURA 7. Arquitetura pulmonar dos animais estudados evidenciados pela técnica de

hematoxilina e eosina. ........................................................................................................ 61

TABELA 1. Parâmetros Morfométricos e Celularidade no Parênquima Pulmonar... 63

FIGURA 8. Quantificação de nitrito no BAL de camundongos selvagens e nocautes

com e sem tratamento com LPS por 24 horas ................................................................. 64

FIGURA 9. Quantificação da presença da enzima lactato desidrogenase (LDH) no

BAL de camundongos selvagens e nocautes com e sem tratamento com LPS por 24

horas..................................................................................................................................... 65

FIGURA 11. Detecção imunohistoquímica e quantificação da População de

Macrófagos F4/80. .............................................................................................................. 68

FIGURA 12. Caracterização e quantificação dos macrófagos pulmonares ativados

pela deteção da isolectina Griffonia simplicifora. ........................................................... 70

12

FIGURA 13. Caracterização e quantificação dos mastócitos presentes no parênquima

pulmonar pela técnica histoquímica para alcian blue pH 2.5. ...................................... 73

FIGURA 14. Fibras colágenas no parênquima pulmonar evidenciadas pela coloração

.............................................................................................................................................. 76

de picrosirius. ...................................................................................................................... 76

FIGURA 15. Fibras elásticas no parênquima pulmonar. Evidenciadas pela coloração

Orceína. ............................................................................................................................... 79

FIGURA 16. Densidade de imunoexpressão da fibronectina no parênquima pulmonar.

.............................................................................................................................................. 81

FIGURA 17. Quantificação das metaloproteinases 2 e 9 por imunohistoquímica e da

citocina TGF-β por densidade de superfície. ................................................................... 83

FIGURA 18. Avaliação Funcional do Pulmão. Gráficos de elastância estática (A)

dinâmica do pulmão (B) de pressão resistiva (C) e de pressão viscoelástica (D) e de

variação de pressão total do pulmão (E). ......................................................................... 85

FIGURA 19. Esquema mostrando resumo dos resultados obtidos na dissertação .... 100

13

LISTA DE TABELAS

TABELA 1. Parâmetros Morfométricos e Celularidade no Parênquima Pulmonar... 63

14

SUMÁRIO

AGRADECIMENTOS........................................................................................................... 6

RESUMO ............................................................................................................................... 7

ABSTRACT ........................................................................................................................... 9

LISTA DE ILUSTRAÇÕES ................................................................................................ 11

1 INTRODUÇÃO................................................................................................................. 18

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA......................................................................................... 21

2.1 PULMÃO .................................................................................................................. 21

2.1.1 LESÃO E REPARO PULMONAR..................................................................... 24

2.2 LESÃO PULMONAR AGUDA (ALI) E O MODELO DO

LIPOPOLISSACARÍDEO BACTERIANO (LPS) ...................................................... 27

2.3 RECEPTORES P2X7.................................................................................................. 30

2.3.1 PULMÃO E RECEPTORES P2X7 ..................................................................... 32

2.3.2 INFLAMAÇÃO E RECEPTORES P2X7 ........................................................... 33

2.3.3 LPS E RECEPTORES P2X7 ............................................................................... 35

3 OBJETIVOS..................................................................................................................... 38

3.1 OBJETIVO GERAL................................................................................................... 38

3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS ..................................................................................... 38

4 MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................................. 40

4.1 INSTILAÇÃO DO LPS ........................................................................................... 40

4.2 PROCEDIMENTO CIRÚRGICO.............................................................................. 40

4.3 PROTOCOLO EXPERIMENTAL ............................................................................ 41

4.4 LAVADO BRONCOALVEOLAR (BAL) ................................................................ 41

15

4.5 PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO...................................................................... 42

4.6 IMUNOHISTOQUÍMICA E HISTOQUÍMICA ...................................................... 44

4.6.1 ANTICORPOS UTILIZADOS .......................................................................... 44

4.6.2 IMUNOHISTOQUÍMICA .................................................................................. 45

4.6.3 HISTOQUÍMICA PARA A DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DOS

MACRÓFAGOS PULMONARES ATRAVÉS DA MARCAÇÃO DE RADICAIS

CARBOIDRÁTICOS ................................................................................................... 47

4.7 HISTOMORFOMETRIA........................................................................................... 48

4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA........................................................................................ 49

4.9 MECÂNICA RESPIRATÓRIA ................................................................................. 49

5 RESULTADOS ................................................................................................................. 57

5.1 TRATAMENTO COM LPS AUMENTOU SIGNIFICATIVAMENTE

EXPRESSÃO DOS RECEPTORES P2X7 NO PARÊNQUIMA PULMONAR............. 57

5.2 ANIMAIS P2X7-/-

APRESENTARAM INFLAMAÇÃO ATENUADA E MENOS

ZONAS DE COLAPSO APÓS O TRATAMENTO COM LPS...................................... 60

5.3 AUSÊNCIA DO RECEPTOR P2X7 INIBIU A SECREÇÃO DO NITRITO (NO),

DA ENZIMA LACTATO DESIDROGENASE (LDH) E DA CITOCINA IL-1β NO

BAL DE ANIMAIS NOCAUTESPARA O RECEPTOR P2X7 APÓS O

TRATAMENTO COM LPS............................................................................................. 64

5.4 INIBIÇÃO DA ESTIMULAÇÃO DE MACRÓFAGOS, MAS NÃO DA

POPULAÇÃO DE MACRÓFAGOS F4/80+ EM ANIMAIS P2X7-/-

APÓS O

TRATAMENTO COM LPS............................................................................................. 66

SE ALTERARAM NOS ANIMAIS P2X7-/-

APÓS O TRATAMENTO COM LPS....... 75

16

5.7 OS ANIMAIS P2X7-/-

APÓS O TRATAMENTO COM LPS APRESENTARAM

DIMINUIÇÃO DA IMUNOREATIVIDADE PARA TGF-β, AUMENTO DA

IMUNOREATIVIDADE PARA MMP- 9 E AUSÊNCIA DE MODIFICAÇÃO DA

QUANTIDADE DE IMUNOREATIVIDADE PARA MMP-2 ..................................... 81

6 DISCUSSÃO..................................................................................................................... 87

7 CONCLUSÕES................................................................................................................. 99

8 REFERÊNCIAS .............................................................................................................. 102

17

INTRODUÇÃO

18

1 INTRODUÇÃO

Moléculas sinalizadoras são essenciais para o início e manutenção das reações

inflamatórias. Recentemente, nucleotídeos extracelulares como ATP e UTP, têm sido

considerados como uma nova classe de moléculas sinalizadoras que desempenham um

papel na inflamação (DI VIRGILIO E COLS., 2001; BOURS E COLS., 2006).

Nucleotídeos são liberados nos sítios de inflamação como resultado do dano celular,

secretados por células apresentadoras de antígeno, macrófagos e linfócitos (LA SALA E

COLS., 2003).

Virtualmente, todos os tipos celulares expressam receptores de superfície para

nucleotídeos sinalizadores (BURNSTOCK & KNIGHT 2004). Dentre os receptores para

nucleotídeos, o grupo dos receptores P2 compreende os receptores P2Y acoplados a

proteínas-G (P2YR) e os receptores P2X (P2XR), os quais são canais iônicos intrínsecos

(BURNSTOCK & KNIGHT 2004; DI VIRGILIO E COLS., 2001).

Receptores P2X são ativados por ATP extracelular e já foram clonados 7 sub-tipos

de receptores desta família P2X1–7 (BURNSTOCK & KNIGHT 2004).

O ATP extracelular pode ser secretado por células infectadas e submetidas a estresse

(FERRARI E COLS., 1997; WANG E COLS., 2004; BURNSTOCK 2006). O ATP quando

age através do receptor P2X7 pode levar a estimulação da secreção de citocinas pró-

inflamatórias, tais como IL-1β (GALLUCCI & MATZINGER 2001; BOURS E COLS.,

2006). Em diferentes tipos celulares, os receptores P2X7 levam a produção e secreção de

mediadores inflamatórios, tais como: IL-1β, IL6, TNF, IL18, monocyte chemoattractant

protein-1 (MCP-1) (BOURS E COLS., 2006; FERRARI E COLS., 2006), clivagem de

metaloproteases, CD23, CD27 e selectina-L (GU E COLS., 1998; 2006).

19

A Síndrome do Estresse Respiratório Agudo (ARDS) foi primeiramente descrita em

1967 por Ashbaugh e colaboradores. Ela continua sendo até os dias de hoje uma importante

causa de morbidade e mortalidade, sendo caracterizada por um processo inflamatório

pulmonar agudo com apoptose de células epiteliais e intersticiais e edema intra-alveolar,

seguida pela fibrose (ATABAI & MATTHAY, 2002). O lipopolissacarídeo (LPS) é um

componente da parede celular de bactérias, sendo, portanto, um estímulo para a iniciação

local de inflamação aguda. A instilação intratraqueal de LPS em animais tem sido

considerada como um modelo experimental de ARDS (BRIGHAM & MEYRICK., 1986),

servindo como um modelo de doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) (BRASS E

COL.S, 2003; GEORGE E COLS., 2001).

Neste trabalho, estamos interessados particularmente em entender como os

receptores P2X7 estão envolvidos com a patogenia da ARDS, visto que desempenham

funções em diversos processos biológicos, como apoptose, desenvolvimento da imunidade

e controle da infecção microbiana (COUTINHO-SILVA E COLS., 2001; DI VIRGILIO,

1995; DI VIRGILIO E COLS., 2001; CHEN & BROSNAN, 2006; LISTER E COLS.,

2007; FRANCHI E COLS., 2007).

20

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

21

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 PULMÃO

O sistema respiratório, constituído pelos pulmões e por uma seqüência de vias

aéreas, funcionam fornecendo oxigênio para as células do corpo e eliminando dióxido de

carbono das células do corpo. O sistema respiratório está dividido em duas porções: a

porção condutora e a porção respiratória. A porção condutora situada dentro e fora dos

pulmões, transporta ar do meio externo para os pulmões. A porção respiratória, localizada

estritamente dentro dos pulmões (GARTNER & HIATT 2007), funciona na troca efetiva de

oxigênio por dióxido de carbono.

A árvore brônquica começa na bifurcação da traquéia, com a formação dos

brônquios primários, direito e esquerdo, que se arborizam (formando ramos que diminuem

gradualmente de tamanho). Ela é constituída por vias aéreas localizadas fora dos pulmões

(brônquios primários, brônquios extrapulmonares e por vias localizadas dentro dos

pulmões: os brônquios intrapulmonares (secundários e terciários), bronquíolos, bronquíolos

terminais e bronquíolos respiratórios. Cada brônquio intrapulmonar constitui a via aérea

que supre um lobo do pulmão. Estas vias aéreas são semelhantes aos brônquios primários,

com exceção de que os anéis cartilaginosos em C são substituídos por placas irregulares de

cartilagem hialina, que envolvem completamente a luz dos brônquios intrapulmonares.

Os brônquios secundários são os ramos diretos dos brônquios primários que se

dirigem para os lobos pulmonares. Em humanos, o pulmão esquerdo tem dois lobos e,

portanto, tem dois brônquios secundários; o pulmão direito tem três lobos e, portanto, tem

22

três brônquios secundários. Ao entrarem nos lobos pulmonares, os brônquios secundários

subdividem-se em ramos menores, os brônquios terciários. Cada brônquio terciário se

arboriza, e vai para uma secção definida de tecido pulmonar denominada segmento

broncopulmonar. Cada pulmão tem dez segmentos broncopulmonares, que estão

completamente separados um do outro por elementos de tecido conjuntivo (GARTNER &

HIATT 2007).

Os bronquíolos não possuem cartilagem em sua parede, têm menos de 1mm de

diâmetro e possuem células de clara em seu revestimento epitelial. Cada bronquíolo fornece

ar para o lóbulo pulmonar. O revestimento epitelial dos bronquíolos varia de colunar

simples ciliado, com células caliciformes ocasionais, nos bronquíolos maiores, a células

cubóides simples, células de clara ocasionais e ausência de células caliciformes, nos

bronquíolos menores (GARTNER & HIATT 2007). Os bronquíolos terminais formam a

região menor e mais distal da porção condutora do sistema respiratório. Estas estruturas

trazem ar para os ácinos pulmonares, subdivisões do lobo pulmonar. Os bronquíolos

terminais se ramificam, dando origem aos bronquíolos respiratórios.

A porção respiratória do sistema respiratório é composta por bronquíolos

respiratórios, dutos alveolares, sacos alveolares e alvéolos. Os bronquíolos respiratórios são

a primeira região do sistema respiratório em que pode ocorrer a troca de gases, sua estrutura

é semelhante à dos bronquíolos terminais, mas sua parede está interrompida pela presença

de estrutura de paredes delgadas, semelhantes a bolsas, denominadas alvéolos, nos quais

pode haver trocar gasosas. Ao se ramificarem, o diâmetro dos bronquíolos respiratórios

torna-se mais estreito e aumenta sua população de alvéolos. Após ramificar-se várias vezes,

cada bronquíolo respiratório termina em um duto alveolar (FIGURA 1).

23

Os alvéolos possuem cerca de 200µm de diâmetro fazendo parte dos bronquíolos

respiratórios, dutos alveolares e sacos alveolares. Os alvéolos são revestidos por dois tipos

celulares, as células alveolares epiteliais do tipo I (pneumócitos do tipoI) e as células

alveolares epiteliais do tipo II (pneumócitos do tipo II) (GARTNER & HIATT 2007).

FIGURA 1. Esquema mostrando sistema respiratório. (retirado de http://blog-br.com/uploads/r/rodrigoprofbio/8215.jpg)

Em 1954, Mackin (MACKLIN 1954) postulou uma das funções mais importantes

do pneumócito tipo II ou célula epitelial alveolar tipo II (AE2). Macklin presumiu que estas

células secretam materiais que acarretam na diminuição da tensão de superfície, facilitam a

limpeza das partículas inaladas, com função bacteriostática, e ajudam na prevenção da

transdução do fluido dentro dos alvéolos. Em 1977 foi estabelecido que as funções dos

pneumócitos do tipo II eram de síntese e secreção de materiais ativos de superfície e que

24

serviriam como progenitor para as células AE1, as quais formam a barreira ar-sangue

(MASON 1977).

O pulmão é freqüentemente exposto à partículas do ambiente como micróbios,

partículas poluentes e substâncias que causam alergia. O macrófago alveolar é a célula

inicialmente responsável pelo reconhecimento, ingestão e limpeza de partículas inaladas

(BOWDEN 1987). Quando as partículas inaladas de microorganismos são opsonizadas por

anticorpos e/ou complemento, os macrófagos alveolares (MAs) podem se ligar mais

facilmente e fagocitar estas substancias via os receptores Fc (SWANSON & BAER 1995).

Os MAs são células imunes efetoras residentes nos espaços alveolares e vias aéreas

de condução. São responsáveis pela ativação de células inflamatórias e pela limpeza

pulmonar (HOCKING & GOLDE 1979). São responsáveis também por ingerir partículas

que podem ser o resultado de uma situação inflamatória aguda à também uma simples

ingestão e limpeza acarretando quase nenhuma inflamação (BECKER E COLS., 1989;

KOBZIK E COLS., 1990; ZHANG E COLS., 1993). Esta capacidade fagocítica é

especialmente importante para a limpeza de partículas inertes e partículas sem nenhum

risco de efeitos. Assim, os receptores que participam no reconhecimento das partículas

inaladas pelos MAs é o primeiro passo importante na manutenção da homeostasia

pulmonar.

2.1.1 LESÃO E REPARO PULMONAR

A inflamação é o evento inicial que precede a fibrose em diversas doenças

pulmonares, incluindo a fibrose pulmonar idiopática. Apesar da fibrose tecidual ser

25

resultante de um processo inflamatório agudo ou sub-agudo, já é conhecido que a

inflamação nem sempre vai resultar em fibrose (TRACEY 2002; NATHAN 2002). As

questões chave nas observações a cerca dos mecanismos de remodelamento das vias aéreas

são: (1) quais são os iniciadores inflamatórios específicos? e (2) qual é a seqüência de

eventos que culmina na fibroproliferação (início da fibrose)?

Em função da sua diversidade, as células epiteliais que revestem as vias aéreas são

particularmente bem adaptadas à proteção da mucosa em resposta a vários tipos de injúrias

(tabaco, poluentes, vírus), e bactérias, dentre várias outras causas. Estas células executam

uma série de funções críticas nas defesas imunes inatas. Na superfície do epitélio aéreo

(brônquios e bronquíolos) existem células especializadas incluindo as células colunares

ciliadas, células produtoras do muco, células de clara e células basais (GARTNER &

HIATT 2007). As células aéreas podem rapidamente mudar suas estruturas e funções para

se adaptar a mudanças do ambiente ou para efetuar o reparo epitelial após injúria

(GARTNER & HIATT 2007).

O epitélio que reveste as vias aéreas serve como uma barreira contra

microorganismos e moléculas agressivas. Suas funções incluem: a limpeza mecânica do

muco; adequação da homeostasia do transporte de íons e água, antioxidantes, antiproteases

e como uma barreira celular uma vez que apresentam junções intercelulares. Todas essas

funções são fundamentais para a proteção e manutenção da integridade do epitélio, a qual

pode ser rapidamente destruída após inflamação ou infecção (PARK E COLS., 2006). Em

uma situação normal, é sabido que as células ciliadas são células terminalmente

diferenciadas e que não são capazes de se dividirem, além de serem muito sensíveis a

injúrias. Entretanto, foi observado que essas células ciliadas podem se transdiferenciar em

26

células escamosas dentro de poucas horas após dano bronquiolar com o objetivo de manter

a integridade epitelial após a diferenciação (PARK E COLS., 2006).

Um dos passos mais importantes para a reparação pulmonar é a rápida e eficiente re-

epitelização da membrana basal desnuda após a injúria. O reparo epitelial eficiente pode

inibir o desenvolvimento da fibrose pulmonar, desde que esteja presente uma camada

intacta de células epiteliais suprindo a proliferação e deposição da matriz extracelular

efetuada pelos fibroblastos (ADAMSON E COLS., 1990).

Diversos mecanismos estão envolvidos no reparo epitelial alveolar. Células

alveolares epiteliais do tipo II (cuboidais) representam as células progenitoras que

regeneram o epitélio alveolar após injúria (ADAMSON & BOWDEN 1974; UHAL 1997;

FEHRENBACH 2001).

A ativação de quimiocinas, interleucinas, fatores de crescimento e fatores

estimuladores de colônias têm sido freqüentemente descritas durante estágios iniciais da

inflamação e durante a resposta quimiotática do epitélio aéreo (MESSAGE & JOHNSTON

2004; CHUNG 2001; KHAIR E COLS., 1996). Todos esses fatores são secretados por

células mesenquimais, endoteliais e macrófagos, mas também são secretados pelas células

epiteliais durante injúria e reparo. O TGF-β1 modula a composição da matriz provisória

(LECHAPT-ZALCMAN E COLS., 2006). As células epiteliais migram e estão envolvidas

com o aumento do reparo aéreo in vitro, via aumento da MMP-2. Este aumento da

metaloprotease em resposta ao TGF-β1 pode promover o reparo aéreo em condições de

homeostasia, enquanto que a MMP-9 pode ser crítica em um contexto inflamatório

caracterizado por um processo de remodelamento prolongado (LECHAPT-ZALCMAN E

COLS., 2006).

27

Outros fatores que estão envolvidos nos processos de lesão e reparação pulmonar

são as espécies reativas de oxigênio (ROS). Biologicamente, são considerados importantes:

radicais anions superóxidos (O2), peróxido de hidrogênio (H2O2), radicais hidroxila (OH) e

ácidos (HOCl). As espécies reativas de nitrogênio incluindo peroxinitrato (ONOO),

também tem sido implicadas na oxidação (nitração) de proteínas e lipídeos

(ISCHIROPOULOS 1998). As espécies reativas de oxigênio e nitrogênio podem acarretar a

injúria tecidual através de vários mecanismos, incluindo: (1) dano direto ao DNA

resultando em mutações; (2) peroxidação lipídica com a formação de moléculas vasoativas

e pró-inflamatórias; (3) oxidação de proteínas que alteram a atividade protéica (FIALKOW

E COLS., 1993;1994;1997), levando à liberação de proteases e à inativação de

antioxidantes e enzimas antiproteases (GADEK & PACHT 1996) e (4) alteração de fatores

de transcrição como proteína-1 e fator nuclear β (NF) κ- β, levando a um aumento na

expressão de genes pró-inflamatórios (HADDAD E COLS., 2000).

No metabolismo normal, as células a fim de neutralizar e conter os efeitos das ROS

liberadas expressa antioxidantes endógenos como, superóxido dismutase, catalase e

glutationa peroxidase (FINK 2002). Entretanto, estes anti-oxidantes são rapidamente

utilizados durante respostas inflamatórias agudas.

2.2 LESÃO PULMONAR AGUDA (ALI) E O MODELO DO LIPOPOLISSACARÍDEO BACTERIANO (LPS)

A Injúria Pulmonar Aguda (ALI) e a sua forma mais severa, a Síndrome do Estresse

Respiratório Agudo (ARDS) são importantes causas de morbidade e mortalidade no mundo

(WARE & MATTHAY 2000). Uma das características mais marcante da ALI/ARDS é o

28

acúmulo de fluido rico em proteínas, ou seja, edema no compartimento alveolar pulmonar

(WARE & MATTHAY 2000), causada pelo aumento do fluxo de fluidos nos espaços

aéreos e a diminuição do fluxo fora dos espaços aéreos. A Síndrome do Estresse

Respiratório Agudo representa um conceito fisiopatológico no qual as anormalidades

pulmonares são devidas a uma lesão pulmonar aguda (ASHBAUGH E COLS., 1967;

PONTOPPIDAN E COLS., 1972).

O lipopolissacarídeo bacteriano (LPS) ou endotoxina é uma mistura de fragmentos

de paredes celulares externas das bactérias gram-negativas. Ele é vital para a integridade

estrutural, funcional bacteriana e atua como um potente ativador de macrófagos. O LPS

induz inflamação local e sistêmica, pois é reconhecido pelas células locais que vão atuar na

tentativa de eliminá-lo e, como conseqüência, ocorre a liberação de fatores mediadores da

inflamação iniciando o processo de alteração da permeabilidade da membrana alvéolo-

capilar. Conseqüentemente, ocorre um grande afluxo de neutrófilos para o tecido pulmonar,

acarretando assim, uma liberação de várias enzimas proteolíticas e citocinas que estão

diretamente ligadas à agressão pulmonar (OPAL 2007).

A lesão pulmonar aguda (ALI), de manifestação grave, e a Síndrome do Estresse

respiratório agudo (ARDS) são igualmente definidas como disfunção grave da troca gasosa

e de anormalidades radiográficas peitorais (BERNARD E COLS., 1994). ARDS e ALI

podem ocorrer na presença de vários eventos, tais como, sepse, trauma ou transplante de

órgãos (ATABAI & MATTHAY 2002). Inflamação intra-pulmonar e endotelial e dano

epitelial culminando nas respostas reparativas, são componentes que estão envolvidos na

ALI e na progressão para a ARDS (BERNARD E COLS., 1994; MATTHAY E COLS.,

2003).

29

A incidência da ALI ainda é incerta, mesmo nos EUA, onde o Instituto Nacional de

Saúde, em 1972, a estimou em 75 casos/100 mil habitantes ao ano. Porém, estudos mais

recentes encontraram números bem mais baixos, de 1,5 a 15/100 mil habitantes ao ano

(BERNARD E COLS., 1994; WARE & MATTHAY 2000; LUCE 1998; GARBER E

COLS., 1996; ZILBERBERG & EPSTEIN, 1998; HUDSON & STEINBERG 1999;

ATABAI & MATTHAY 2002, VILLAR & SLUTSKY 1989; LUHR E COLS., 1999;

ARROLIGA E COLS., 2002; BERSTEN E COLS., 2002). O número de estudos

epidemiológicos vem crescendo nos últimos anos após a American-European Consensus

Conference on ARDS de 1994, ter redefinido os critérios diagnósticos. No Brasil, ainda não

temos estudos populacionais.

As características mais clássicas da ALI são o aumento da permeabilidade capilar,

edema intersticial e alveolar, influxo da circulação de células inflamatórias e a formação de

membranas hialinas (são fragmentos celulares, resultantes da morte das células alveolares

do tipo I e de fibrina depositada no espaço alveolar) (BERNARD E COLS., 1994;

MATTHAY E COLS., 2003). O aumento da permeabilidade leva ao edema pulmonar e a

um balanço defeituoso na manutenção do fluxo dentro dos espaços aéreos e nos

mecanismos biológicos da sua remoção. A gravidade da ALI depende do balaço entre as

injúrias alveolares epiteliais e/ou as injúrias vasculares endoteliais e os seus mecanismos de

reparo.

O LPS é reconhecido através da sua interação com proteínas séricas (proteína

LBP/receptor CD14/TLR4), ou com proteínas do surfactante pulmonar (VERNOOY E

COLS., 2002). Os receptores Toll like (TLRs) são expressos na maioria dos tecidos

animais, sendo que, os humanos e os camundongos possuem 10 subtipos. Contudo, os

camundongos possuem dois receptores adicionais onze e doze que não estão representados

30

em humanos (BEUTLER 2004). Os receptores TLRs reconhecem não somente bactérias e

fungos, mas também protozoários (CAMPOS E COLS., 2001) e vírus (HOEBE E COLS.,

2003; ALEXOPOULOU E COLS., 2001), sendo que o TLR4 reconhece mais

especificamente o LPS (POLTORAK E COLS., 1998). O TLR4 é um dos onze parálogos

identificados em mamíferos, dez dos quais foram descritos (CHUANG & ULEVITCH

2000;2001).

2.3 RECEPTORES P2X7

O conceito de que o ATP é uma molécula sinalizadora extracelular em adição ao

papel que possui no metabolismo intracelular e como sendo uma molécula energética, é

aceito a algum (GORDON 1986). Com o desenvolvimento de novas tecnologias e métodos

de estudo, a sinalização purinérgica tem sido estabelecida principalmente como um

sinalizador rápido envolvido na neurotransmissão, mas também tem ganhado bastante

atenção em tecidos animais e em diversos processos biológicos, incluindo proliferação

celular (BURNSTOCK & KNIGHT 2004). Nos 30 anos desde que a sinalização

purinérgica foi primeiramente proposta, o conceito de purinoreceptores têm sido

transformado primariamente da idéia de alvos terapêuticos para a prática clínica

(BURNSTOCK 2002). Conseqüentemente seus subtipos de receptores para nucleotídeos

extracelulares tem sido clonados em várias espécies de mamíferos. Os purinoreceptores

tiveram sua classificação original baseada na sua farmacologia e função e foram

primariamente divididos em receptores P1, tendo como a adenosina como ligante, e em

receptores P2, tendo o ATP e ADP como os principais ligantes. Os receptores P2 foram

mais tarde subdivididos em P2X e P2Y (RALEVIC & BURNSTOCK 1998). Existem, até

hoje, sete receptores P2X e oito receptores P2Y clonados e caracterizados.

31

Os receptores P2X são formados por três subunidades. Cada subunidade consistindo

em dois domínios transmembrana. São receptores de canais catiônicos não seletivos. Sob

condições fisiológicas normais, quando ativados, resultam em um influxo de Na+ e Ca2+ e

saída de K+ através da membrana celular levando a despolarização da membrana plasmática

(COUTINHO-SILVA E COLS, 1996).

Os receptores P2X7 (FIGURA 2) são bastante expressos em monócitos,

macrófagos, células dendríticas e linfócitos (COUTINHO-SILVA E COLS., 1999; 2001;

DI VIRGILIO 2001). Estão envolvidos na eliminação de micobactérias e clamídias em

macrófagos infectados (LAMMAS E COLS., 1997; COUTINHO-SILVA E COLS., 2003).

Os receptores P2X7 foram identificados no pulmão de ratos, camundongos e em humanos

(YAMAMOTO E COLS., 2004; SCHWIEBERT & ZSEMBERY 2003; LEWIS & EVANS

2001; SIM E COLS., 2004) inclusive em células epiteliais alveolares (CHEN E

COLS.,2004). A exposição desses receptores ao ATP extracelular leva a abertura de um

canal seletivo de cátions, que permite um influxo de Ca+ e Na+ e a saída de K+. A

estimulação com certas concentrações de ATP, na maioria das células que apresentam o

receptor P2X7, acarreta a formação de bolhas apicais membranares (VIRGINIO E COLS.,

1999) e morte celular (CHOW E COLS., 1997; DI VIRGILIO E COLS., 2001;

COUTINHO-SILVA E COLS., 1999).

Análises proteômicas identificaram 11 proteínas que estão associadas com o

receptor P2X7 em ratos, incluindo laminina α3, integrina β2, β-actina, α-actinina, MAGuK,

fosfatidilinositol-4 quinase e três proteínas de choque térmico (HSP70, HSP71 e HSP90)

(KIM E COLS., 2001) (FIGURA 2). Tem sido sugerido que esses receptores são parte de

um complexo multi-protéico, que facilita a comunicação entre a matriz extracelular, o

citoesqueleto de actina e cascatas de sinalização intracelular.

32

FIGURA 2. Esquema mostrando o receptor P2X7 e suas interações com componentes celulares. (modificado de KIM E COLS., 2001)

2.3.1 PULMÃO E RECEPTORES P2X7

Atualmente pouco é conhecido sobre a distribuição dos receptores P2X e P2Y no

sistema respiratório. E sabe-se que apesar deste fato, o epitélio aéreo tem sido um dos

tecidos mais estudados com o objetivo de se analisar os efeitos de agonistas purinérgicos

(DAVIS 2002; KUNZELMANN E COLS., 2003; HAYASHI E COLS., 2005).

É sabido que as células epiteliais alveolares liberam ATP e possuem tanto

receptores P2X quanto P2Y (SCHWIEBERT & ZSEMBERY, 2003; NOVAK 2003;

33

TAYLOR E COLS., 1999). Os receptores P2X4, por exemplo, já foram identificados em

cultura primária de células epiteliais alveolares, derivadas tanto de vias aéreas quanto de

epitélio alveolar (SOTO E COLS., 1996; TAYLOR E COLS., 1999). Outras isoformas

também foram encontradas no epitélio respiratório (LEPZIGER 2003; TAYLOR E COLS.,

1999). Os receptores P2X7 e P2X4 são utilizados como um novo marcador para células

epiteliais alveolares do tipo I (CHEN E COLS., 2004; QIAO E COLS 2003).

Os receptores P2X7 já foram identificados em: células endoteliais da artéria

pulmonar de ratos e humanos (YAMAMOTO E COLS., 2004; NOVAK 2003), no pulmão

de camundongos (LEWIS & EVANS, 2001) e em células alveolares epiteliais de rato

(CHEN E COLS., 2004).

2.3.2 INFLAMAÇÃO E RECEPTORES P2X7

A inflamação é um processo que pode ser desencadeado por microorganismos

invasores, estes estimulam a imunidade adaptativa através de um número quase infinito de

antígenos e a imunidade inata através de um repertório muito mais simples e conservado

(JANEWAY & MEDZHITOV 2002). Estes repertórios são desencadeados pelos padrões

moleculares associados à patógenos (PAMPs) (JANEWAY & MEDZHITOV 2002). Os

PAMPs sensibilizam as células inflamatórias inicialmente durante a infecção, é um

estímulo potente para a imunidade inata e são referidos como sinais de perigo exógenos.

Entretanto, todos os imunologistas sabem que o estresse celular ou dano tecidual

desencadeia a inflamação mesmo na ausência de patógenos. É sabido hoje em dia que as

células imunes reagem à injúria induzida pela liberação de moléculas que são normalmente

localizadas dentro das células (MATZINGER 2002). Fazendo parte do que chamamos de

34

sinais endógenos. Por este motivo, elas também são conhecidas como “padrões moleculares

associados ao dano” (DAMPs) (KORNBLUTH & STONE 2006). Contudo, tanto os

PAMPs quanto os DAMPs são necessários para iniciar uma resposta imune eficiente.

Moléculas sinalizadoras são essenciais para a manutenção das reações inflamatórias,

como citado anteriormente. Elas estão envolvidas no recrutamento de leucócitos,

mastócitos e células apresentadoras de antígenos ao sítio de inflamação. Atuam na ativação

de vasos e no prolongamento de outras respostas inflamatórias. Com o advento do

conhecimento acerca do ATP fazendo papel de uma molécula inflamatória (DI VIRGILIO

E COLS., 2001), essa molécula é secretada nos sítios de inflamação como resultante da

resposta inflamatória.

O ATP extracelular é secretado por células infectadas e submetidas a estresse. Em

virtude deste fato, é considerado atualmente como um marcador de “sinal de perigo” uma

vez que, atuando através do receptor P2X7 pode levar a estimulação da secreção de

citocinas pró-inflamatórias (GALLUCCI & MATZINGER 2001; BOURS E COLS., 2006;

HAAG E COLS., 2007). Uma das habilidades mais notáveis do ATP extracelular é a

capacidade de permeabilizar temporariamente a membrana plasmática de certas células,

fato observado primeiramente em mastócitos peritoneais (COCKCROFT & GOMPERTS

1979). Outro papel na inflamação é a constatação de que o ATP também induz o

processamento e a liberação de citocinas pró-inflamatórias (particularmente IL-1 e IL-6)

pela ação de receptores P2X7 (NORTH 2002; BULANOVA, E COLS., 2005; FERRARI E

COLS., 2006). Em animais P2X7-/-, macrófagos não foram capazes de secretar IL-1β em

resposta ao ATP (SOLLE E COLS., 2001). Foi mostrado também que camundongos P2X7-/-

35

desenvolveram uma artrite reduzida no modelo após injeção de colágeno (LABASI E

COLS., 2002) e atenuação da lesão obstrutiva renal (GONCALVES E COLS., 2006).

A ativação da sinalização intracelular dos receptores P2X7 pode ter efeitos

estimulatórios na síntese e secreção de citocinas. Em diferentes tipos celulares, os

receptores P2X7 levam a produção e secreção de mediadores inflamatórios, tais como: IL-1,

IL6, TNF, IL18, monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) (BOURS E COLS., 2006;

FERRARI E COLS., 2006; HEWINSON E COLS., 2008; TAKENOUCHI E COLS.,

2008) clivagem de metaloproteases, CD23, CD27, selectina-L, e matriz (GU E COLS.,

1998; 2006). Em mastócitos, a ativação dos receptores causa um aumento na expressão de

IL-4, IL-6, IL-13 e TNF-α (BULANOVA E COLS., 2005; PELEGRIN E COLS., 2008).

Em macrófagos, a ativação destes receptores aumenta os níveis de mRNA para óxido

nítrico sintase induzível (iNOS) e TNF-α causados por lipopolissacarídeos (LPS)

(TONETTI E COLS., 1994; 1995; HU E COLS., 1998).

2.3.3 LPS E RECEPTORES P2X7

Diversos estudos tem mostrado que os nucleotídeos extracelulares podem modular a

ação do LPS sob a função macrofágica (TANKE E COLS., 1991; PROCTOR E COLS.,

1994; TONETTI E COLS., 1995; DENLINGER E COLS., 1996; 1998; HUMPHREYS &

DUBYAK 1996; FERRARI E COLS., 1997; HU E COLS., 1998; SPERLAGH E COLS.,

1998; PERREGAUX E COLS., 2000; SOLLE E COLS., 2001). Entretanto, o papel

específico do clearance da Mycobacterium tuberculosis e os receptores para nucleotídeos

ainda envolvidos no processo ainda não esta claro (LAMMAS E COLS., 1997; SIKORA E

COLS., 1999). Os receptores P2X7 tem sido descritos como potenciadores da produção de

36

citocinas inflamatórias induzidas pelo LPS, citocinas essas que são extremamente

importantes para a fisiopatologia do choque séptico (WATTERS E COLS., 2001; DI

VIRGILIO E COLS., 2001). Outros estudos mostraram que macrófagos tratados com

agonistas ou antagonistas do receptor P2X7 podem modular a produção de IL-1β e NO

(TONETTI E COLS., 1995; DENLINGER E COLS., 1996; FERRARI E COLS., 1997;

HU E COLS., 1998). Adicionalmente, macrófagos estimulados pelo LPS em camundongos

nocautes para o receptor P2X7 produzem níveis menores de IL-1β e IL-6 após a co-

administração de ATP (SOLLE E COLS., 2001). O co-tratamento com o 2-methylthio-ATP

protege camundongos da injeção letal de LPS e promove uma redução dos níveis de TNF-α

e IL-1α (PROCTOR E COLS., 1994).

O LPS por si só é capaz de promover a síntese e a externalização de IL-1β, mas a

subseqüente adição de ATP as amostras tratadas com LPS aumentam a externalização da

citocina de dez a trinta vezes (PERREGAUX E COLS., 2000).

Estudos recentes indicam um mecanismo similar pelos ligantes TLRs para ATP

induzindo a ativação da caspase 1 em macrófagos peritoneais murinos (MARIATHASAN

E COLS., 2004; YAMAMOTO E COLS., 2004).

37

OBJETIVOS

38

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Estudar o envolvimento da sinalização pelo ATP na via de ativação dos receptores

P2X7 no modelo de lesão pulmonar aguda pelo LPS.

3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS

1- Caracterizar a lesão pulmonar induzida pela instilação intratraqueal de LPS em animais

selvagens e nocautes para o receptor P2X7.

2- Caracterizar a imunoexpressão dos receptores P2X7 na lesão pulmonar aguda induzida

pelo LPS

3- Avaliar o recrutamento e ativação de células inflamatórias na lesão pulmonar aguda em

animais selvagens e nocautes para o receptor P2X7.

4- Quantificar no lavado broncoalveolar (BAL) a presença de Interleucina 1β, TGF-β, de

óxido nítrico (NO) e a lise celular através da dosagem da enzima lacto dehidrogenase em


5- Quantificar as mudanças das tramas de fibras elásticas, colágenas e de fibronectina no

parênquima pulmonar em animais selvagens e nocautes para o receptor P2X7.

6- Quantificar no parênquima pulmonar a imunoexpressão das metaloproteases-2 e -9 em


7- Analisar os parâmetros da mecânica respiratória em animais selvagens e nocautes para o

receptor P2X7.

39

MATERIAIS E MÉTODOS

40

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 INSTILAÇÃO DO LPS

A utilização e o protocolo de experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética

do Centro de Ciências da Saúde (CCS) da Universidade federal do Rio de Janeiro. Foram

utilizados camundongos C57/BL6 nocautes para o gene do receptor P2X7 (P2X7-/-) e

selvagens, de ambos os sexos, oriundos dos laboratórios de Patologia Celular (ICB) e de

Imunofisiologia (IBCCF) da Universidade Federal do Rio de Janeiro, com 8-10 semanas de

idade e peso aproximado de 20g. A lesão pulmonar foi induzida através da instilação de

LPS (E. coli O55:B5, SIGMA, USA), por via intratraqueal, em dose única (60 µg), diluída

em 50 µL de solução salina estéril.

Os camundongos P2X7 (-/-) gerados inicialmente pelo acasalamento de

camundongos 129/Ola com camundongos C57BL/6 mice. A prole foi acasalada por 12

gerações com camundongos C57BL/6 (COUTINHO-SILVA E COLS., 2003), sendo

gentilmente cedidas pelo Dr James Mobley (PGRD, Pfizer Inc, Groton, CT, USA). Os

animais P2X7 (-/-) apresentam deleção da região do T1527 to T1605, localizado no exon

13.

4.2 PROCEDIMENTO CIRÚRGICO

Os animais foram anestesiados com ketamina® (35mg/Kg) e xilazina® (9mg/Kg) por

via intraperitoneal. Na região cervical foi realizada incisão da pele e divulsão da

musculatura para exposição da traquéia. Posteriormente o LPS foi instilado através de

41

seringa de insulina (50µL). Após este procedimento, a pele e o tecido celular subcutâneo

foram suturados com fio de nylon 4-0.

4.3 PROTOCOLO EXPERIMENTAL

Após 24 horas da instilação de LPS, os animais foram anestesiados e eutanasiados

por secção medular. Os grupos foram divididos seguindo o esquema (FIGURA 3). Para

cada grupo foram utilizados cinco animais (n = 5).

FIGURA 3. Esquema mostrando protocolo experimental.

4.4 LAVADO BRONCOALVEOLAR (BAL)

Após eutanásia, os animais foram colocados em decúbito ventral. A pele e toda

camada muscular adjacente à traquéia foram removidas. Uma cânula de polietileno foi

42

inserida na traquéia e um volume de 1mL de solução salina (PBS pH 7.4) à 37o C +

heparina (10 UI / mL) instilado e aspirado em cada animal.

O material obtido pelo BAL foi centrifugado a 250g durante cinco minutos a 4ºC

(Fanem®, São Paulo, Brasil). O sobrenadante foi coletado e congelado à -4°C para análises

posteriores (LDH e nitrito).

A dosagem IL-1β foi determinada usando-se o kit comercial ELISA, com o uso de

anticorpo monoclonal e policlonal contra camundongo. A detecção limite foi de 10pg/ml,

estando de acordo com o protocolo da empresa (R&D Systems Ltda., USA). Citocinas

recombinantes de camundongos foram utilizadas em todos os ensaios.

4.5 PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO

Para a análise histopatológica os animais foram previamente anestesiados e com a

traquéia exposta foi realizada a sua oclusão ao final da expiração. Esta manobra tem por

finalidade manter o volume de reserva expiratório e do volume residual, mantendo assim a

capacidade residual funcional, ou seja, impedir o colabamento dos pulmões. Logo após este

procedimento os animais foram eutanasiados.

Os pulmões foram fixados em formol tamponado a 10% por um período de 12

horas. Após fixação estes foram processados em séries crescentes de etanol e banhos de

xileno (100%) objetivando desidratação e diafanização do material. Em seguida os mesmos

foram impregnados em parafina. Cortes de 4 µm do tecido pulmonar foram obtidos por

microtomia em Micrótomo Leica (USA) e corados pela técnica de Hematoxilina-Eosina

(HE).

43

A trama colagênica dos granulomas foi observada através da coloração pelo Sirius

red modificado para microscopia confocal (DOLBER & SPACH, 1993). Após a

desparafinização e hidratação do material com três banhos de xilol e álcoois decrescentes

(100 / 95 / 70%), respectivamente, as lâminas foram lavadas em água destilada por duas

vezes de 5 minutos. Posteriormente as lâminas foram postas na solução de ácido

fosfomolíbdico (0,2%) por 1 minuto. Após o ácido, as lâminas foram colocadas na solução

de picrosirius (Sirius red F3 BA - 0,2g + Solução saturada de ácido pícrico [Dissolver 1 a

1,5g de ácido pícrico em 100ml de água destilada quente, Deixando esfriar e filtrado no dia

seguinte] - 200ml) por 90 minutos. Após 90 minutos, as lâminas foram lavadas com ácido

clorídrico 0,01N durante 2 minutos.e em álcool 70% por 45 segundos. Após este processo

as lâminas foram banhadas em banhos crescentes de álcoois e em três banhos de xileno

puro, todos por um período de 5 minutos. Finalmente, as lâminas foram montadas em

Entellan®.

As fibras elásticas foram coradas pelo método da orceína. Após a desparafinização e

hidratação do material com três banhos de xilol e álcoois decrescentes (100 / 95 / 70%),

respectivamente, as lâminas foram lavadas em água destilada por duas vezes de 5 minutos.

Posteriormente as lâminas foram postas na solução de orceína (orceína -1g +Etanol -100ml

+ ácido Clorídrico concentrado -.0,7ml) por 30 minutos. Após este processo, as lâminas

foram diferenciadas em álcool clorídrico 0,1% rapidamente, e lavadas em água destilada

por 2 vezes de 3 minutos. Após a lavagem, as lâminas foram contracoradas com solução de

ácido pícrico saturado (Dissolver em 100mL de água destilada quente 1,5g de Ácido

Pícrico, deixando esfriar e filtrado no dia seguinte) por 30 segundos. Após este processo as

lâminas foram banhadas em banhos crescentes de álcoois e em três banhos de xileno puro,

todos por um período de 5 minutos. Finalmente, as lâminas foram montadas em Entellan®.

44

Os mastócitos foram corados pela técnica de alcian blue pH 2,5. Após a

desparafinização e hidratação do material com três banhos de xilol e álcoois decrescentes

(100 / 95 / 70%), respectivamente, as lâminas foram lavadas em água destilada por duas

vezes de 5 minutos. Posteriormente, as lâminas foram colocadas na solução de alcian blue

pH 2,5 (alcian blue GX-1g+ ácido acético 3% -100mL) por 5 minutos. Após a solução as

lâminas foram lavadas em água estilada rapidamente e contracoradas com vermelho neutro

0,5% por 3 minutos. Após o vermelho neutro, as lâminas foram lavadas em água destilada

rapidamente e banhadas em banhos crescentes de álcoois e em três banhos de xileno puro,

todos por um período de 5 minutos. Finalmente, as lâminas foram montadas em Entellan®.

4.6 IMUNOHISTOQUÍMICA E HISTOQUÍMICA 4.6.1 ANTICORPOS UTILIZADOS

Foram utilizados os seguintes anticorpos primários:

1- Anticorpo policlonal coelho contra o receptor P2X7 extracelular (Alamone Labs,

-Jerusalem, Israel cat. APR008, na diluição de 1/200.

2- Anticorpo policlonal coelho contra pan-TGF-β da R&D Systems, USA – cat.

AB00NA), na diluição de 1/200.

3- Anticorpo policlonal cabra contra a MMP-2 (C-19) da Santa Cruz

Biotechnologies, CA, USA, cat. sc-6838, na diluição de 1/100.

4- Anticorpo policlonal cabra contra a MMP-9 (C-20) da Santa Cruz

Biotechnologies, CA, USA, cat. sc-6840, na diluição de 1/100.

45

5- Anticorpo monoclonal rato contra o antígeno F4/80 da Serotec, USA, cat.

MCA497, na diluição de 1/200.

6 - Anticorpo policlonal coelho contra fibronectina da DAKOCYTOMATION,

Carpinteria, CA, USA, cat. A245, na diluição de 1/800.

4.6.2 IMUNOHISTOQUÍMICA

Cortes de parafina foram desparafinizados e hidratados com três banhos de xilol e

álcoois decrescentes (100 / 95 / 70%) por 5 minutos, respectivamente. Os resíduos

aldeídicos foram inibidos pelo Bórax 3% com dois banhos de 15 minutos. As lâminas

foram lavadas em água destilada em dois banhos de cinco minutos. Após duas lavagens em

tampão fosfato salino (PBS) pH 7,4, a peroxidase endógena foi inibida com H2O2 3%

(Reagen) em metanol por 20 minutos, seguindo-se de dois banhos de PBS pH 7.4 por cinco

minutos cada. Recuperação antigênica foi realizada com tampão citrato pH. 6,0 no steamer

por 30 minutos, na temperatura de 96 oC, exceto para o F4/80, onde os cortes foram

submetidos a digestão enzimática com solução a 0,1% de tripsina, 0,01% de cloreto de

cálcio, no Tris-HCl (Trypsin tablets, SIGMA ), pH 7,6, a 38oC, por 30 minutos.

Posteriormente os cortes histológicos foram submetidos a bloqueio das ligações

inespecíficas dos anticorpos sendo realizado com a solução de PBS-BSA (albumina sérica

bovina, cat. A9647, SIGMA) 10%: leite molico 8% (v/v), exceto para o anticorpo anti-

P2X7 onde as lâminas foram incubadas com PBS-BSA 5%, soro normal de carneiro 10%,

por 30 minutos, seguido por três lavagens de cinco minutos cada em PBS. Foi realizado um

outro bloqueio das ligações inespecíficas com PBS-BSA5% + soro normal de camundongo

10% por uma hora.

46

Após estes procedimentos, as lâminas foram incubadas com os anticorpos diluídos

na solução de PBS/BSA 3% - Triton 0,1% - Tween 0,05%, permanecendo até o próximo

dia, em câmara úmida, a 4 oC.

No dia seguinte, após alcançar a temperatura ambiente, as lâminas foram lavadas

duas vezes em Tampão PBS pH 7.4 e uma vez em PBS - Tween 0,25%, por 10 minutos

cada e incubadas com o anticorpo secundário respectivo: anti -IgG de coelho feita em

cabra, biotinilada (BA-1000, Vector Laboratories, USA), na diluição de 1:50; anti -IgG de

rato feita em cabra, biotinilada, (BA-1000, Vector, USA) na diluição de 1:100, anti -IgG de

cabra feita em cabra, biotinilada (BA-5000, Vector Laboratories, USA) na diluição de

1:50, por uma hora. Ao final desse período e após duas lavagens com PBS - Tween 0,25%,

as lâminas foram incubadas com a Estreptavidina - Peroxidase (E-8386, Sigma, USA)

diluída 1:50 em PBS por 1 hora e reveladas com o substrato cromógeno diaminobenzidina -

DAB (K-3468, DAB líquida, DAKO, Carpinteria, CA, USA) por 10 a 15 minutos. Após 2

lavagens com tampão PBS pH 7.4 - Tween 20 0,25% por cinco minutos e uma lavagem em

água destilada por 10 minutos, as lâminas foram contra-coradas com hematoxilina de

Harris diluída (1:3) e montadas em Entellan® (Merck).

Como controles negativos da reação, os cortes histológicos foram incubados com

soro não imune de rato, coelho ou cabra ao invés do anticorpo primário respectivo. Para o

P2X7 o controle negativo consistiu na incubação das lâminas com a solução do anticorpo

diluído contendo o peptídeo P2X7 (Alamone) na proporção de 1:2, preparado com

antecedência de 1 hora.

47

4.6.3 HISTOQUÍMICA PARA A DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DOS MACRÓFAGOS PULMONARES ATRAVÉS DA MARCAÇÃO DE RADICAIS CARBOIDRÁTICOS

A fim de analisar e quantificar os macrófagos pulmonares ativados foi utlizada a

técnica histoquímica para a detecção da lectina Bandeiracea Griffonia Simplicifolia

isoagglutinin, que é um marcador de macrófago ativado (MADDOX E COLS., 1982 a e b)

Após a desparafinização e hidratação do material com três banhos de xilol e álcoois

decrescentes (100 / 95 / 70%) e banhos em água destilada respectivamente, os resíduos

aldeídicos foram inibidos pelo bórax 5 % por 20 minutos, seguindo-se a inibição da

peroxidase endógena com H2O2 3% (Reagen) em metanol por 20 minutos e banhos

seguidos de tampão PBS pH 7.4 por cinco minutos cada. Realizou-se o bloqueio das

ligações inespecíficas com PBS - BSA 3% por uma hora. Após este procedimento, as

lâminas foram incubadas com a lectina Bandeiracea Griffonia Simplicifolia conjugada à

biotina (B-1105, Vector Laboratories, USA) em câmara úmida na concentração de 1:100

em PBS-BSA 1% + Solução traço de metais, contendo Cloreto de Cálcio, Cloreto de

Magnésio, Cloreto de Manganês + Azida de Sódio durante a noite a 4°C. No dia seguinte,

após alcançar a temperatura ambiente, as lâminas foram lavadas em PBS pH 7.4 - Tween

20 0,25%, incubadas com a Estreptavidina - Peroxidase (E-8386, Sigma, USA) diluída 1:50

em PBS por 40 minutos e revelada pela DAB (K-3468, DAB líquida, DAKO, Carpinteria,

CA, USA) por 10 a 15 minutos. Após duas lavagens com água destilada por cinco minutos,

as lâminas foram contra-coradas com Hematoxilina de Harris (diluída 1:3) e montadas em

Entellan® (Merck).

48

4.7 HISTOMORFOMETRIA

O estudo morfométrico foi realizado através de um sistema de captura de imagens

constituído de câmara fotográfica digital EVOLUTION (Media Cybernetics, USA)

acoplada a microscópio de luz E 500 NIKON (Japão) e a um computador contendo o

programa de análise de imagens IMAGEPRO–PLUS 5.0 Media Cybernetics, USA).

Imagens digitalizadas de alta qualidade (2048 x 1536 pixels buffer) foram obtidas das

lâminas coradas pela hematoxilina-eosina, orceína, picrosírius, alcian blue. griffonia

simplicifora (BSL-1), F4/80, P2X7, TGF-β, Fibronectina, MMP-2, MMP-9, utilizando a

lente objetiva de 40x.

Os resultados foram expressos como percentual de imunoexpressão (superfície

reativa / superfície total examinada X 100) nas análises da imunoexpressão de TGF-β,

P2X7, MMP-2 e MMP-9; para a análise de mastócitos, o resultado foi expresso como o

número absoluto de células/µm2 ou número absoluto de células/campo para células reativas

para o BSL-1 e F4/80. Para as fibras colágenas e elásticas, os resultados foram expressos

como densidade de superfície das fibras /µm2.

Para a quantificação da celularidade no parênquima pulmonar foi realizado o

método de retículo de 100 pontos e 50 linhas acoplado a um microscópio convencional. A

fração de áreas alveolares colapsadas e normais foram realizadas utilizando a técnica de

contagem de pontos (SANTOS E COLS., 2006).

49

4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA

As variáveis foram analisadas descritivamente, sendo submetidas a um teste de

normalidade. As variáveis que apresentaram distribuição normal foram analisadas pelos

testes paramétricos T DE STUDENT, para amostras independentes (two tailed). Para a

comparação de mais de dois grupos, foi utilizado o teste ONE WAY ANOVA e quando

obtido o efeito principal foi empregado pós-teste de Tukey. Para a análise de variáveis que

não apresentaram distribuição normal, foram utilizados os testes não paramétricos

KRUSKAL-WALLIS e MANN-WHITNEY para análise de dois grupos e análise de mais

de dois grupos, respectivamente. Em todas as análises realizadas foi admitido p < 0,05 (5%)

como significativo.

4.9 MECÂNICA RESPIRATÓRIA

A mecânica foi realizada no laboratório de fisiologia pulmonar no IBCCF-UFRJ.

Esta técnica nós permite analisar a função pulmonar (fisiologia pulmonar) dos animais

como um todo, que juntamento com os dados morfológicos nos permite ter uma analise

mais fidedígna acerca do assunto abordado neste trabalho. Após 24 horas de LPS, os

animais foram sedados com diazepam (1 mg i.p.), em seguida pesados (balança Filizola,

modelo BR, Indústrias Filizola SA, SP, Brasil) e, então, anestesiados com pentobarbital

sódico (20 mg/kg i.p.).

Depois de anestesiados, os animais foram colocados em uma pequena mesa sob

foco cirúrgico em decúbito dorsal, sendo seus membros fixados por esparadrapo. Foi

realizada traqueotomia com introdução de cateter Jelco 20G com 32 mm de comprimento e

50

0,8 mm de diâmetro interno, sendo a cânula fixada à traquéia por meio de fios de algodão.

Os animais foram paralisados com trietiliodeto de galamina (2 mg/kg, através de

administração intra-abdominal).

Os camundongos foram, então, acoplados à prótese ventilatória por um ventilador

de fluxo constante (Samay VR15, Universidad de la Republica, Montevideu, Uruguai) e

ventilados com freqüência de 100 incursões respiratórias por minuto e um volume corrente

(VT) de 0,2 mL.

Após a adaptação ao respirador, os animais foram submetidos à incisão cirúrgica

por tesoura na linha média do abdômen estendendo-se a região torácica, sobre o esterno. A

pele foi rebatida por tração laterial. A seguir, a musculatura abdominal foi incisada até o

bordo inferior das costelas até atingir a linha axilar anterior, bilateralmente. Com a

cavidade abdominal aberta, foi possível visualizar o diafragma, que foi perfurado e

secionado segundo a mesma orientação da abertura da parede abdominal. Imediatamente

antes da perfuração do diafragma foi instalada pressão positiva ao final da expiração

(PEEP) de 2 cmH2O (SALDIVA E COLS., 1992). Após a retirada do diafragma, a parede

torácica foi removida.

O ventilador foi ajustado previamente para gerar, quando desejado, uma pausa de

cinco segundos ao final da inspiração. Foram tomados cuidados especiais na manutenção

do volume (VT = 0,2 mL) e fluxo (V’= 1 mL/s) constantes em todos os animais, a fim de

evitar os efeitos de diferentes fluxos, volumes e duração da inspiração nas variáveis

medidas (KOCHI E COLS., 1988 a; 1988 b).

O tubo traqueal foi conectado a um pneumotacógrafo para pequenos animais, como

descrito por Mortola e Noworaj (MORTOLA & NOWORAJ 1983), sendo o respirador

acoplado à outra extremidade do pneumotacógrafo. O pneumotacógrafo é constituído por

51

uma cânula metálica com duas saídas laterais conectadas a um transdutor diferencial de

pressão, Validyne MP 45-2 (Engineering Corp, Northridge, CA, EUA), para medida de

fluxo aéreo e volume corrente. Através de outra saída lateral, a via aérea foi conectada a um

transdutor diferencial de pressão Validyne MP45-2 (Engineering Corp, Northridge, CA,

EUA) para medida da pressão traqueal (Ptr).

A inexistência de mudanças abruptas no diâmetro do circuito (da traquéia até a

extremidade do pneumotacógrafo) evitou erros de medida de resistência ao fluxo (LORING

& MEAD, 1982; CHANG E COLS., 1981). Os transdutores conectados ao

pneumotacógrafo e ao tubo traqueal registraram os sinais de V’ e Ptr, respectivamente.

Em seguida, os sinais foram convertidos a digitais por um conversor analógico-

digital de 12-bitz (DT-2801A, Data Translation, Malboro, MA, EUA), e amostrados a uma

freqüência de 200 Hz. Os sinais foram armazenados em microcomputador, utilizando-se o

software LABDAT (RHT-InfoData, Montreal, Canadá) e gravados em disquetes

magnéticos para posterior análise (off line), que foi realizada pelo programa ANADAT

(RHT-InfoData, Montreal, Canadá). A montagem experimental está demonstrada

esquematicamente na figura 4.

Os parâmetros da mecânica respiratória foram determinados 24 horas após a

instilação LPS ou salina. A mecânica respiratória foi obtida através da captação de 10

ciclos respiratórios, pelo método da oclusão ao final da inspiração (BATES E COLS., 1985

a e b), que permite analisar separadamente os componentes elásticos, resistivos e

viscoelástico e/ou inomogêneo do sistema respiratório.

Após a oclusão das vias aéreas ao final da inspiração, sob fluxo constante, ocorre

uma queda súbita da PL até um ponto de inflexão (Pi) a partir do qual o decaimento da

52

pressão assume caráter mais lento, atingindo um platô em sua porção terminal. Esta fase de

platô corresponde à pressão de retração elástica do pulmão (Pel). A diferença de pressão

(∆P1) que caracteriza a queda rápida inicial, representada pela diferença entre a pressão

máxima inicial (Pmax) e o ponto a partir do qual a queda se torna mais lenta (Pi),

corresponde ao componente viscoso pulmonar. A segunda variação de pressão (∆P2),

representada pela queda lenta, do Pi ao platô (Pel), reflete a pressão dissipada para vencer

os componentes viscoelásticos (“stress relaxation”) e/ou inomogêneo (“pendelluft”) do

tecido pulmonar. A soma de ∆P1 e ∆P2 fornece a variação total de pressão no pulmão

(∆Ptot). A elastância estática (Est) do pulmão pode, então, ser obtida dividindo-se Pel pelo

volume corrente (FIGURA 5).

As seguintes fórmulas foram utilizadas na análise da mecânica pulmonar:

∆P1 = Pmax – Pi

∆P2 = Pi – Pel

∆Ptot = ∆P1 + ∆P2

Est = Pel / VT

Onde:

∆P1 = variação de pressão relativa ao componente viscoso pulmonar

∆P2 = variação de pressão relativa ao componente viscoelástico e/ou inomogêneo

pulmonar

∆Ptot = variação total de pressão pulmonar

Pmax = pressão pulmonar máxima atingida

53

Pi = pressão pulmonar no ponto de inflexão

Pel = pressão de retração elástica pulmonar

Est = elastância estática do pulmão

VT = volume corrente

A resistência total do equipamento (Req), incluindo a cânula traqueal, foi

previamente aferida através da aplicação de fluxos de ar ao sistema, com concomitante

registro das variações de pressão (∆P). Uma vez que R = ∆P / V’, a resistência do

equipamento corresponde ao coeficiente angular da curva ∆PxV’. A Req, constante até

fluxos de 26 mL/s (bem acima da faixa de fluxo utilizada no presente experimento) foi de

0,12 cmH2O/mL/s. A variação de pressão determinada pelo equipamento (∆Peq = Req.V’)

foi subtraída das pressões resistivas do pulmão, de tal forma que os resultados representam

as propriedades mecânicas intrínsecas.

54

12 13 11

FIGURA 4. Montagem experimental da obtenção e coleta de dados consistindo de: 1 - Cilindro de ar comprimido. 2 - Rotâmero de agulha. 3 - Ventilador de fluxo inspiratório constante com duas válvulas solenóides. 4 - Pneumotacógrafo. 5 - Peça T para medida de pressão nas vias aéreas. 6 - Cânula traqueal. 7 - Mesa cirúrgica. 8 - Transdutor de pressão esofagiana. 9 - Transdutor de pressão traqueal. 10 - Transdutor diferencial de pressão para medida de fluxo. 11 - Scireq-24 12 - Conversor analógico-digital de 12 bits. 13 - Microcomputador.

55

∆P1 ∆P2

1,25 1,00

0,5

0

-0,5

-1,00 -1,25

0,20

0,10

0,00

PL (c

mH

2O)

Pel

Pmax Pi

FIGURA 5. Representação esquemática dos traçados de fluxo, volume, pressão em função do tempo, obtidos a partir da oclusão da via aérea ao final da inspiração.

Pmax = pressão máxima alcançada; Pi = ponto de inflexão; Pel = pressão de retração elástica e VT = volume corrente. O platô foi alcançado após uma pausa inspiratória de cinco s. Após a oclusão das vias aéreas, há uma queda rápida na PL (∆P1) que corresponde a Pmax – Pi, pressão dissipada para vencer o componente viscoso do pulmão, seguida por uma queda lenta (∆P2), pressão dissipada para vencer os componentes viscoelástico e/ou inomogêneo do pulmão, até um ponto de equilíbrio elástico, representada pela pressão de retração elástica pulmonar (Pel). A linha de base do registro de pressão corresponde à pressão positiva ao final da expiração (PEEP) de 2 cmH2O.

56

RESULTADOS

57

5 RESULTADOS

5.1 TRATAMENTO COM LPS AUMENTOU SIGNIFICATIVAMENTE EXPRESSÃO DOS RECEPTORES P2X7 NO PARÊNQUIMA PULMONAR

Com o objetivo de se caracterizar se os receptores P2X7 estão presentes no tecido

pulmonar após a indução da lesão pulmonar aguda, imunohistoquímica foi realizada

fazendo-se o uso de anticorpo policlonal para os receptores P2X7 subunidade extracelular, o

qual revelou grandes diferenças na imunorreatividade nos grupos selvagens. Os animais

selvagens controle apresentaram marcação presente para o receptor de P2X7 em todos os

tipos celulares do parênquima pulmonar, com mais freqüência em células epiteliais

alveolares, cuja densidade de reatividade foi de (14,2 ± 4,2). Já para os animais selvagens

tratados, a reatividade também foi vista nos mesmos tipos celulares marcação porém se

tornou mais proeminente devido ao maior número de células inflamatórias presentes

(FIGURAS 6 A, B). A densidade de reatividade para o receptor P2X7 foi de (33,0 ± 2,6).

Houve diferença significativa entre os dois grupos (p<0,05) (FIGURA 6 D). Os animais

nocautes tratados ou não pelo LPS não apresentaram marcação para o receptor (FIGURA 6

C).

58

FIGURA 6. Detecção e Quantificação por imunohistoquímica (densidade de superfície) dos receptores P2X7 .

(A – C) Imunohistoquímica usando-se anticorpo para os receptores P2X7. (A) Animal selvagem sem tratamento com LPS (P2X7+/+ - CTRL). A maioria das células imunoreativas estão presentes no septo alveolar , células epiteliais e inflamatórias. (B) Animal selvagem tratado com LPS (LPS- P2X7+/+). Aumento da imunoexpressão em conseqüência ao aumento do número de células inflamatórias. (C) Controle negativo- animal nocaute controle. (D) Gráfico da quantificação dos receptores P2X7 por densidade de superfície. (*p<0.05). Colunas pretas são de animais após o tratamento com LPS por 24 horas. Barras 60µm. (inserts- aumento de 650x).

60

5.2 ANIMAIS P2X7

-/- APRESENTARAM INFLAMAÇÃO ATENUADA E MENOS

ZONAS DE COLAPSO APÓS O TRATAMENTO COM LPS

Os animais normais que não receberam tratamento com LPS, tanto selvagens como

nocautes para o receptor P2X7, apresentaram estrutura pulmonar preservada com raros

macrófagos presentes nos espaços alveolares (FIGURA 7, A e C). Após 24 horas de

instilação com LPS os animais selvagens apresentaram uma inflamação nos septos

alveolares (alveolite) com presença de mononucleares e polimorfonucleares, enquanto que

nos animais nocautes a alveolite era menos acentuada. (FIGURA 7, B e D; TABELA 1).

Notou-se também, zonais focais de colapso do parênquima.

Os animais selvagens tratados apresentaram congestão capilar, uma discreta

hiperplasia alveolar e um aumento no número de células inflamatórias no espaço

peribronquiolar, com predominância de mononucleares. Estas alterações também foram

vistas nos animais nocautes, porém em pequena quantidade.

Para a aferição de mudanças relativas da superfície dos espaços aéreos

considerando-se que as zonas de colapso representam espaços aéreos colabados

(diminuição da superfície) foi realizada morfometria da superfície dos espaços aéreos. Não

foram consideradas zonas do parênquima pulmonar situadas externamente, ou seja, ao lado

da pleura, pois muitas vezes refletem alterações devido a coleta do pulmão.

A histomorfometria através do uso de retículo demonstrou que os animais nocautes

após o tratamento com LPS por 24 horas apresentaram um número menor de áreas

colapsadas alveolares quando comparadas aos animais selvagens após o tratamento

(p<0,05) (TABELA 1).

61

FIGURA 7. Arquitetura pulmonar dos animais estudados evidenciados pela técnica de hematoxilina e eosina.

(A ) e (C) Animais sem tratamento (CTRL), P2X7+/+ e P2X7-/ -, respectivamente. Animal P2X7+/+ com estrutura pulmonar preservada (A) enquanto que, em animal P2X7-/ - nota-se discreta inflamação no septo alveolar. (B) e (D) Animais tratados com LPS (CTRL), P2X7+/+ e P2X7-/-, respectivamente, exibindo edema dema perivascular (seta) e inflamação em septo alveolar. Notar presença de inflamação mais branda no animal nocaute (B), em relação ao WT (B). Barras: 120µm. (insertos - aumento de 400x).

63

O número de polimorfonucleares totais analisados (a partir dos cortes histológicos)

presentes no grupo P2X7+/+ CTRL foi de (8,8 ± 2,0), já o grupo P2X7

+/+ LPS foi de (27,0 ±

2,8). Nos animais nocautes o grupo P2X7-/- CTRL foi de (9,3 ± 1,1) e o P2X7

-/- LPS foi de

(17,6 ± 1,9) (Tabela 1).

TABELA 1. Parâmetros Morfométricos e Celularidade no Parênquima Pulmonar

Grupo Area Normal

(%)

Colapso Alveolar

(%)

PMN (%) MN (%) Celularidade Total (%)

P2X7R+/+ 91.2 ± 4.2 a 8.8 ± 2.0 a 8.8 ± 2.0 a 21.1±1.6 a 29.9±2.5 a

P2X7R-/- 87.8 ± 1.8 a,c 12.2 ± 1.8 a 9.3 ± 1.1 a 21.5±2.0 a 30.8±2.6 a

LPS-P2X7R+/+ 75.4 ± 6.6 b,c 24.6 ± 6.6 b 27.0 ± 2.8 b 12.1±1.1 b 39.0±2.6 b

LPS-P2X7R-/- 83.2 ± 1.7 c 16.8 ± 1.7 a,b 17.6 ± 1.9 c 16.1±1.5 c 33.7±1.2 a,b

Os valores estão apresentados como media (±SD) de 6 a 9 animais em cada grupo. Os dados foram obtidos em 10 campos aleatórios em cada animal. Letras diferentes indicam diferenças significantes entre os grupos (p<0.05). PMN: área de células polimorfonucleares, MN: área de células mononucleares, Celularidade Total: fração de celularidade total.

64

5.3 AUSÊNCIA DO RECEPTOR P2X7 INIBIU A SECREÇÃO DO NITRITO (NO), DA ENZIMA LACTATO DESIDROGENASE (LDH) E DA CITOCINA IL-1β NO BAL DE ANIMAIS NOCAUTESPARA O RECEPTOR P2X7 APÓS O TRATAMENTO COM LPS

A análise de nitrito, que é uma medida indireta para se chegar aos níveis de NO,

apresentou comportamento semelhante aos resultados obtidos pela análise da enzima LDH,

isto é, os animais selvagens não liberaram uma quantidade de nitrito após o tratamento com

LPS. Os animais selvagens apresentaram uma diferença significativa após o tratamento

com LPS por 24 horas em relação a todos os outros grupos (p<0.05) (4,9±0,1 (P2X7+/+

CTRL) para (5,6 ± 0,5) (P2X7+/+ LPS) e (4,6 ± 0,3) (P2X7

-/- CTRL) para (4,5 ± 0,3) (P2X7-

/- LPS) (FIGURA 8).

FIGURA 8. Quantificação de nitrito no BAL de camundongos selvagens e nocautes com e sem tratamento com LPS por 24 horas. Seguindo o mesmo padrão obtido para a análise de LDH, os níveis da liberação de nitrito em animais após o tratamento com LPS por 24 horas foi apenas observado nos animais selvagens, indicando uma atenuação da lesão nos animais nocautes. (*p<0,05 quando comparado com todos os outros grupos).

65

A análise da atividade da LDH (medida indireta para se chegar aos níveis de lise

celular no BAL) no sobrenanadante do BAL mostrou que os animais nocautes tratados com

LPS não apresentaram aumento na liberação da enzima quando comparado ao seu controle

(0,20±0,01 para 0,19±0,01, respectivamente) , mas os animais selvagens tratados com LPS

por 24 horas apresentaram um aumento significativo (p<0.05) quando comparado com

todos os outros grupos (0,19±0,008 (P2X7+/+ LPS para 0,23±0,001 [P2X7

+/+ CTRL])

(FIGURA 9).

FIGURA 9. Quantificação da presença da enzima lactato desidrogenase (LDH) no BAL de camundongos selvagens e nocautes com e sem tratamento com LPS por 24 horas. Somente os animais selvagens após o tratamento com LPS apresentaram um aumento significativo na secreção do LDH. Notar que os camundongos nocautes não apresentaram aumento significativo quando comparado com o seu controle (*p<0,05 quando comparado com todos os outros grupos).

A análise por ELISA da citocina IL-1β no sobrenadante do BAL mostrou que os

animais nocautes após o tratamento com LPS por 24 horas não modificaram a quantidade

secretada da citocina (FIGURA 11), quando comparados com os animais nocautes não

tratados e animais selvagens tratados e não tratados (p>0,05). Já os camundongos selvagens

66

apresentaram após o tratamento, um aumento significativo de IL-1β no BAL (p<0,05)

quando comparados com os demais grupos (FIGURA 10).

FIGURA 10. Quantificação da liberação de IL-1β no BAL de camundongos selvagens e nocautes com e sem tratamento com LPS por 24 horas. Somente os animais selvagens após o tratamento com LPS apresentaram um aumento significativo na liberação de IL-1β. Notar que os camundongos nocautes não apresentaram aumento significativo quando comparado com o seu controle (*p<0,05 quando comparado com todos os outros grupos). Colunas pretas são de animais após o tratamento com LPS por 24 horas.

5.4 INIBIÇÃO DA ESTIMULAÇÃO DE MACRÓFAGOS, MAS NÃO DA POPULAÇÃO DE MACRÓFAGOS F4/80+ EM ANIMAIS P2X7

-/- APÓS O

TRATAMENTO COM LPS

Pela técnica de imunohistoquímica (glicoproteína F4/80) e histoquímica (lectina

Bandeiracea Griffonia Simplicifolia BSL-1) detectamos a presença de macrófagos totais e

macrófagos ativados no parênquima pulmonar, os dados estão expressos em número

absoluto de macrófagos por campo analisado.

As células F4/80+ localizadas no alvéolo e parênquima pulmonar aumentaram

significativamente (p<0,05) em ambos os grupos tratados com LPS por 24 horas (10 ± 0,6 e

67

10 ± 0,4, nos grupos P2X7+/+ LPS (FIGURA 11 B) e P2X7

-/- LPS (FIGURA 11 D),

respectivamente) em relação aos controles (6,7 ± 0,4 e 7,6 ± 0,4), nos grupos P2X7+/+

(FIGURA 11 A) e P2X7-/- (FIGURA 11 C), respectivamente) (FIGURA 11 E). Já as células

BSL-1+ aumentaram significativamente no grupo P2X7+/+ LPS (16 ± 0,8) (FIGURA 12 B)

em relação a todos os outros grupos (4,5 ± 0,3; 4,5 ± 0,4 e 4,9 ± 0,4; nos grupos P2X7+/+

CTRL (FIGURA 12 A), P2X7-/-CTRL (FIGURA 12 C) e P2X7

-/- LPS (FIGURA 12 D),

respectivamente) (p<0.001) (FIGURA 12 E).

68

FIGURA 11. Detecção imunohistoquímica e quantificação da População de Macrófagos F4/80.

(A – D) Imunohistoquímica usando o anticorpo F4/80 (macrófagos-seta). (A e C) Animais sem tratamento (CTRL), P2X7+/+ e P2X7-/-, respectivamente. Raros macrófagos positivos (setas) presentes no septo alveolar. (B e D) Animais tratados com LPS (CTRL), P2X7+/+ e P2X7-/-, respectivamente. Diversos macrófagos (setas) septais e alveolares reativos encontrados. Barras 90µm. Insertos, aumento de 450x. (E) Representação gráfica da densidade de superfície de células imunoreativas para F4/80. (*p<0.05 e **p<0.001 quando comparado com todos os outros grupos).

70

FIGURA 12. Caracterização e quantificação dos macrófagos pulmonares ativados pela deteção da isolectina Griffonia simplicifora.

(A – D) Deteção histoquímica da lectina BSL-1 (macrófagos ativados- seta). (A) Animal não tratado P2X7

+/+ CTRL. Os macrófagos reativos (setas) são pequenos e arredondados, presentes somente em raros septos alveolares. (B) Animal P2X7

+/+ tratado com LPS exibindo macrófagos reativos para BSL-1 (setas), com tamanho maior que os vistos no animal controle e presentes nos septos alveolares, espaços peribronquico e vascular e em espaços aéreos. (C) Animal P2X7

-/-, CTRL. Semelhante ao animal não tratado P2X7+/+ CTRL porém com um pouco

mais de células inflamatórias (setas) em septos alveolares. (D) Animal P2X7

-/- tratado com LPS. Semelhante ao animal CTRL respectivo. Barras: 90µm. Insertos, aumento de 480x. (E) Representação gráfica da densidade de superfície de células reativas para a lectina BSL-1. (*p<0.05 e **p<0.001 quando comparado com todos os outros grupos).

72

5.5 AUSÊNCIA DO RECRUTAMENTO DE MASTÓCITOS EM ANIMAIS P2X7-/-

APÓS O TRATAMENTO COM LPS

Com o objetivo de se caracterizar a presença dos mastócitos no parênquima

pulmonar dos animais estudados, as lâminas foram coradas com o corante alcian blue pH.

2,5 como descrito nos materiais e métodos.

Os mastócitos podem ser vistos em animais normais nas zonas de interface

da mucosa com o meio ambiente. Portanto, os animais CTRL apresentam uma pequena

quantidade de mastócitos vistos em regiões peribronquicas ou vasculares além do septo

alveolar (FIGURA 13 E).

No grupo CTRL a densidade mastocitária foi de (0,0010 ± 0,0008) e (0,0100 ± 0,0006) nos

animais P2X7+/+ e P2X7

-/- CTRL, respectivamente (FIGURA 13 A e C). No grupo LPS 24

horas o número de mastócitos/µm2 aumentou de (0,0200 ± 0,0006) para (0,0100 ± 0,0003)

nos animais P2X7+/+ e P2X7

-/- LPS, respectivamente (FIGURA 13 B e D).

73

FIGURA 13. Caracterização e quantificação dos mastócitos presentes no parênquima pulmonar pela técnica histoquímica para alcian blue pH 2.5.

(A – D). histoquímica (alcian blue pH. 2,5 – mastócitos corados em rosa (seta). (A e C) animais sem tratamento com LPS (CTRL), P2X7

+/+ e P2X7-/-, respectivamente. Barra: 100

µm. (B e D) animais tratados com LPS por 24 horas, P2X7+/+ e P2X7

-/-, respectivamente. Barras: 100 µm. (E) Representação gráfica da densidade de superfície de mastócitos (***p<0,001 quando comparado com todos os outros grupos).

75

5.6 AS FIBRAS ELÁSTICAS, COLÁGENAS E FIBRONECTINA NÃO SE ALTERARAM NOS ANIMAIS P2X7

-/- APÓS O TRATAMENTO COM LPS

Os animais P2X7+/+ e P2X7

-/- apresentaram rede colágena presente em torno dos

brônquios, vasos sanguíneos e em menor quantidade nos septos alveolares (FIGURAS 14 A

e B), não se notando diferenças entre a distribuição mas parecendo ser menos pronunciada

nos animais nocautes. Com o tratamento pela LPS, verificou-se um aumento desta trama,

mais visível nos animais P2X7+/+ (FIGURA 14 C). Já os animais nocautes tratados não

exibiram modificações na distribuição das fibras colágenas. Porém, quando da sua

quantificação verificou-se que os animais P2X7+/+ - LPS exibiram aumento significativo na

densidade de superfície para o colágeno. A densidade de colágeno no grupo P2X7+/+ - LPS

foi de (12,30 ± 0,80) em relação ao grupo P2X7+/+ (6,10 ± 0,20), diferença esta significante

(p<0,05) (FIGURA 14 E). No animal P2X7-/- - CTRL, o nível da densidade de colágeno

foi de (6,10 ± 0,20) passando a (9,70 ± 0,60) após o tratamento (p>0,05) (FIGURA 14 E).

76

FIGURA 14. Fibras colágenas no parênquima pulmonar evidenciadas pela coloração

de picrosirius.

(A) Os animais P2X7

+/+CTRL exibiram uma trama colágena presente em torno dos brônquios, paredes vasculares e no septo alveolar.. (B) P2X7

-/- CTRL. Aspecto semelhante ao do animal P2X7+/+ CTRL.

(C) P2X7+/+ LPS 24Hs . Trama colágena mais exuberante que o visto no CTRL.

(D) P2X7-/- LPS 24Hs. Aspecto semelhante ao dos animais P2X7

+/+CTRL. Barras: 220µm. Insertos, aumento de 480x. (E) Representação gráfica da densidade de superfície do colágeno; resultados expressos em percentagem. (***p<0.001).

78

As fibras elásticas, nos animais P2X7+/+ se mostraram presentes nas paredes dos

brônquios e vasos sanguíneos assim como nos septos alveolares. Os animais P2X7+/+

tratados com LPS exibiram uma diminuição da rede de fibras elásticas

Os animais P2X7-/- apresentaram a rede de fibras elásticas preservada (FIGURA 15),

não havendo mudanças na quantidade das fibras nos animais tratados em relação aos

animais não tratados com LPS. Já os animais selvagens apresentaram diminuição da rede de

fibras elásticas, uma das características da ALI, ou seja, destruição das fibras. No grupo

CTRL, a quantidade das fibras elásticas foram (14,90 ± 0,10) e (10,90 ± 0,10) nos animais

P2X7+/+ e P2X7

-/-, respectivamente (FIGURA 15). Já no grupo tratado com LPS por 24

horas as fibras elásticas aumentaram de (7,70 ± 0,30) para (10,20 ± 0,40) nos animais

P2X7+/+ e P2X7

-/-, respectivamente (FIGURA 15).

A fibronectina está presente nos septos alveolares nos animais P2X7+/+. Não houve

alteração na distribuição de fibronectina nos animais LPS-P2X7+/+. A densidade de

imunoexpressão da fibronectina nos animais LPS-P2X7-/- foi de 0,168±0,010 e é

semalhante ao do animal controle (P2X7-/-) (0,166 ± 0,010) (p>0,05). Os animais LPS-

P2X7+/+ exibiram imunoreatividade de (0,266 ± 0,013) que foi significativamente diferente

da encontrada nos animais controles (P2X7+/+), (0,172 ± 0,001) (p<0,05). (FIGURA 16).

79

FIGURA 15. Fibras elásticas no parênquima pulmonar. Evidenciadas pela coloração Orceína.

(A) Rede de fibras elásticas presente na parede de vasos sanguíneos e de forma discontínua em septos alveolares em animais P2X7

+/+ CTRL. (C) Animais P2X7

-/- CTRL – fibras elásticas presentes com a mesma distribuição da vista em animais P2X7

+/+ CTRL. (B) Rede de fibras elásticas se tornam mais proeminentes nos P2X7+/+ LPS

24Hs. (D) Animais P2X7

-/- LPS 24Hs. Barras: 220µm. Insertos, aumento de 480x. (E) Gráfico da quantificação (densidade de superfície) das fibras elásticas representados em percentagem. (*p<0.001).

81

+/+ +/+ -/- -/-0.0

0.1

0.2

0.3

P2X7R

* Sem TratamentoTratamento com LPS

Imun

oesp

ress

ãoFi

bron

ectin

a( µ

m2

)

FIGURA 16. Densidade de imunoexpressão da fibronectina no parênquima pulmonar. Representação gráfica da densidade de superfície da fibronectina (imunohistoquímica). (*p<0,05).

5.7 OS ANIMAIS P2X7

-/- APÓS O TRATAMENTO COM LPS APRESENTARAM

DIMINUIÇÃO DA IMUNOREATIVIDADE PARA TGF-β, AUMENTO DA IMUNOREATIVIDADE PARA MMP- 9 E AUSÊNCIA DE MODIFICAÇÃO DA QUANTIDADE DE IMUNOREATIVIDADE PARA MMP-2

A imunoreatividade para a citocina TGF-β foi evidenciada principalmente em

células inflamatórias, mas também em células de clara e células epiteliais em ambos os

animais estudados (P2X7+/+ e P2X7

-/-).

Diferenças significativas foram encontradas em todos os grupos estudados. Para os

animais selvagens foi observado um aumento de (6,0 ± 3,0 para 25,0 ± 1,1), nos grupos

P2X7+/+ CTRL e P2X7

+/+ LPS, respectivamente (p<0.001) (FIGURA 17 C). Os animais

P2X7-/- CTRL exibiram uma menor imunorreatividade para TGF-β, mas também comum

82

exibiram aumento significativo após o tratamento com o LPS. As densidades da

imunoreatividade foram de (11,0 ± 4,0 para 14,0 ± 5,0), nos grupos P2X7-/- CTRL e P2X7

-/-

LPS, respectivamente (p<0.05) (FIGURA 17 C).

Na imunohistoquímica para as metaloproteases 2 e 9 (MMP-2 e MMP-9) foram

observadas imunoreatividade presente principalmente em células mononucleares

(macrófagos) e em polimorfonucleares. As células bronquiolares também demonstraram

reatividade para as metaloproteases. A quantificação da imunoreatividade para a MMP-9

demonstrou que os animais P2X7+/+ LPS e os P2X7

-/- LPS apresentaram um aumento na

imunoexpressão (0,037 ± 0,003 e 0,037 ± 0,004, respectivamente), significativamente

diferente da dos animais controles respectivos (p<0,05) (FIGURA 17 A). Ambos os

animais após o tratamento com LPS por 24 horas apresentaram um aumento significante

quando comparados com os seus respectivos animais controles (0,021 ± 0,003 e 0,019 ±

0,002, respectivamente) (p<0,05) (FIGURA 17 A).

Já a quantificação da imuexpressão da MMP-2 demonstrou que apenas os animais

P2X7+/+ LPS (0,041± 0,004) apresentaram um aumento significativo na imunoexpressão

quando comparados ao seu controle (0,009± 0,001) (p>0,05) (FIGURA 17 B). Não houve

aumento significativo apresentados pelos grupos de animais nocautes (0,031 ± 0,002

(P2X7-/- LPS) e 0,028 ± 0,004 (P2X7

-/-)) (p<0,05) (FIGURA 17 B).

83

FIGURA 17. Quantificação das metaloproteinases 2 e 9 por imunohistoquímica e da citocina TGF-β por densidade de superfície. Gráficos da quantificação (densidade de superfície) da imunohistoquímica para MMP-9 (A), MMP-2 (B) e TGF-� (C). (*p<0.05; **p<0,001).

84

5.8 OS ANIMAIS P2X7-/-

APRESENTARAM FUNÇÃO PULMONAR NORMAL APÓS O TRATAMENTO COM LPS

A elastância estática foi aumentada de (29,0 ± 2,0) no grupo P2X7+/+ CTRL para

(58,0 ± 0,7) no grupo P2X7+/+ LPS) significativamente nos animais selvagens tratados com

LPS por 24 horas (p<0.001), fato não observado nos animais nocautes (de 29±1,4 no grupo

P2X7-/- CTRL para (36,0 ± 3,4) no grupo P2X7

-/- LPS) (FIGURA 18). Já para a análise da

elastância estática observou-se o mesmo padrão de aumento nos animais testados. Um

aumento significativo (p<0.05) foi observado nos animais selvagens tratados com LPS de

(6,0 ± 0,7) no grupo P2X7+/+ CTRL para (12,5 ± 1,2) no grupo P2X7

+/+ LPS. Nos animais

nocautes a diferença não foi significativa de (7,3 ± 0,3) no grupo P2X7-/- CTRL para (8,2 ±

0,4) no grupo P2X7-/- LPS (FIGURA 18).

O ∆P1 foi significativamente maior somente nos animais nocautes tratados com

LPS por 24 horas (p<0.05) de (0,40 ± 0,05) no grupo P2X7-/- CTRL para (0,60 ± 0,04) no

grupo P2X7-/- LPS (FIGURA 18), nos animais selvagens com o tratamento com LPS não foi

observado significância (de 0,67±0,07 no grupo P2X7+/+ CTRL para (0,61 ± 0,1) no grupo

P2X7+/+ LPS (FIGURA 18).

O ∆P2 obteve o padrão inverso, onde foi observado um aumento significativo

(p<0.001) nos animais selvagens tratados com LPS por 24 horas de (1,2 ± 0,1) no grupo

P2X7+/+ CTRL para (2,4 ± 0,2) no grupo P2X7

+/+ LPS (FIGURA 18). Nos animais

selvagens não foi observado significância no aumento de (1,4 ± 0,06) no grupo P2X7-/-

CTRL para (1,6 ± 0,1) no grupo P2X7-/- LPS (FIGURA 18).

O ∆Ptotal aumentou significativamente de (2,0 ± 0,2) para (3,0 ± 0,2) (p<0.05) nos

animais selvagens CTRL e LPS, respectivamente (FIGURA 18). Nos animais nocautes

85

aumentou de (1,8 ± 0,1) para (2,2 ± 0,1), nos grupos CTRL e LPS, respectivamente

(FIGURA 18).

FIGURA 18. Avaliação Funcional do Pulmão. Gráficos de elastância estática (A) dinâmica do pulmão (B) de pressão resistiva (C) e de pressão viscoelástica (D) e de variação de pressão total do pulmão (E). Camundongos selvagens e nocautes com e sem tratamento com LPS por 24 horas. (*p<0.05). Colunas pretas – animais após o tratamento com LPS por 24 horas, colunas brancas – animais controles.

86

DISCUSSÃO

87

6 DISCUSSÃO

Lipopolissacarídeo (LPS) é um antígeno da superfície celular de bactérias. Quando

aplicado in vivo suscita uma resposta inflamatória. Um dos primeiros eventos é a ativação

de macrófagos que, através de processo mediado por receptor leva a liberação de uma série

de citocinas incluindo o TNF-α (SU E COLS., 1995; RIETSCHEL E COLS., 1994). Esta

citocina leva ao recrutamento de neutrófilos e a infiltração no espaço aéreo (FAFFE E

COLS., 2000). A inflamação pulmonar é freqüentemente verificada no lavado

broncoalveolar constituído principalmente de células mononucleares incluindo

monócitos/macrófagos e linfócitos além de neutrófilos. É bem conhecido o fato de que há

diferenças da resposta ao LPS dependendo das cepas de camundongos (CORTELING E

COLS., 2002). No camundongo C57BL/6, após inalação intranasal, a resposta inflamatória

induzida pelo LPS é menor que a vista nos animais BALB/c. Segundo estes autores, após

24 horas, neutrófilos são as únicas células vistas no BAL, havendo uma quantidade seis

vezes menor de neutrófilos, em comparação com camundongos BALB/C (CORTELING E

COLS., 2002).

Nosso modelo animal utiliza uma dose alta de LPS (60 µg) por via intratraqueal, em

comparação com outros estudos, porém capaz de induzir um processo inflamatório

intrapulmonar após 24 horas de instilação, associado a remodelamento estrutural refletida

nas provas funcionais pulmonares.

Tendo em vista que este modelo de doença é caracterizado por um processo

inflamatório que, eventualmente leva a agressão dos tecidos, foi o modelo escolhido para a

88

verificação do envolvimento da sinalização purinérgica, mais especificamente do receptor

P2X7 na inflamação e lesão tecidual.

Pudemos evidenciar a importância dos receptores P2X7, na patogênese da lesão

induzida pelo LPS neste estudo. Através da realização de técnica imunohistoquímica para a

evidenciação do receptor P2X7, foi possível validar o modelo em estudo. Os animais

nocautes não exibiram imunoreatividade para o receptor enquanto que os animais WT

exibem imunoreatividade em células inflamatórias assim como no epitélio pulmonar como

já descrito por outros autores (CHEN E COLS., 2004; TAYLOR E COLS., 1999). Além

disso, pudemos demonstrar que o tratamento com LPS por 24 horas, leva a aumento

significativo da imunoexpressão dos receptores P2X7 nos animais selvagens. Estes dados

confirmam o papel destes receptores como sinalizadores do stress celular (SELSZNER E

COLS., 2004; HAAG E COLS., 2007). Sabe-se que após a ativação dos receptores P2X7,

este induz a liberação de diversas citocinas que influenciam a resposta imune adaptativa

(DI VIRGILIO E COLS., 2001; SOLLE E COLS., 2001). Neste trabalho os animais

nocautes apresentaram diminuição da secreção/imunoexpressão das citocinas aqui

analisadas (IL-1β e TGF- β), resultados que corroboram os dados de Solle e colaboradores

(2001). Estes autores demonstraram que a magnitude da resposta imune adaptativa em

resposta ao estímulo com LPS é diminuída em camundongos nocautes para o receptor P2X7

in vivo (SOLLE E COLS., 2001). Adicionalmente, macrófagos tratados com LPS ativam

seus receptores P2X7 (via liberação de ATP) que induz a secreção de IL-1β e diversas

outras citocinas (PELEGRIN E COLS., 2008; SOLLE E COLS., 2001).

A citocina IL-1β age recrutando e ativando populações de neutrófilos e macrófagos

que migram para o sítio de inflamação para combate-la (WARD 1994). Em adição à

locomoção, fagocitose e atividades microbicidas, macrófagos residentes e infiltrantes

89

secretam uma variedade de citocinas e quimiocinas que resultam na quimiotaxia de

leucócitos ao foco inflamatório e aumentam a resposta imune pela cooperação com outros

componentes do sistema imune (UNANUE & ALLEN, 1987). Os mecanismos moleculares

do LPS induzindo a ativação de macrófagos já tem sido extensamente investigados

(FUJIHARA E COLS., 2003). Estudos anteriores têm mostrado que os macrófagos

ativados expressam grupos carboidráticos que não são encontrados em macrófagos não

estimulados e são detectados utilizando-se lectinas (MADDOX E COLS., 1982A; 1982;

PETRYNIAK E COLS., 1986; TABOR E COLS., 1989). Para se examinar o papel dos

receptores P2X7 na infiltração e ativação macrofágica na patogênese da inflamação

pulmonar em resposta ao LPS, macrófagos foram marcados com anticorpo para a

glicoproteína F4/80 e com a lectina BSL-1 (Bandeiraea Simplicifolia Lectin I). Para a

marcação com o anticorpo F4/80, nossa hipótese era de que os macrófagos alveolares e

intersticiais poderiam ser identificados pela expressão da glicoproteína F4/80

(MCKNIGHT E COLS., 1996). A lectina BSL-1 (glicoproteína GSI) tem sido descrita

como sendo marcador direto para macrófagos ativados (MADDOX E COLS., 1982a;

1982b; PETRYNIAK E COLS., 1986; TABOR E COLS., 1989). Nós observamos que a

extensão da população de macrófagos (F4/80 positivos) não é dependente dos receptores

P2X7 em animais tratados com LPS por 24 horas. Estes dados combinados com a

histoquímica para a lectina BSL-1, demonstram haver uma importante queda na ativação de

macrófagos nos animais nocautes para o receptor P2X7 tratados com LPS quando

comparados com todos os grupos (300%) (p<0.001).

Sabe-se também que o conceito clássico da ativação macrofágica se dá pela

interação dos macrófagos com agentes inflamatórios (LPS) ou material provenientes de

necrose celular, ou ainda, citocinas. Macrófagos ativados produzem uma variedade enorme

90

de citocinas pró-inflamatórias, espécies reativas de oxigênio e de nitrogênio, proteases etc.,

os quais mantêm e perpetuam o processo inflamatório (GOERDT E COLS., 1999;

GOERDT 1999; BARNES 2000). Os macrófagos também liberam uma variedade de

mediadores antiinflamatórios, como IL-10, o qual de forma parácrina suprime a ativação

macrofágica e a produção de mediadores inflamatórios. Contudo, não podemos esquecer

que macrófagos expressam diversos receptores P2X e P2Y, incluindo P2Y1, P2Y2 e P2X7

(COUTINHO-SILVA E COLS., 2005) e estes receptores possuem papel na modulação da

ação do LPS (DI VIRGILIO E COLS., 2001). Por exemplo, o 2-methylthio-ATP (agonista

dos receptores P2X e P2Y) inibe a liberação in vivo de IL-1β e TNF- α e protege os

camundongos da morte por LPS (DI VIRGILIO E COLS., 2001; PROCTOR E COLS.,

1994; SAK & WEBB 2002). Portanto, adicionalmente aos achados deste trabalho, existem

diversas evidências que suportam a idéia de que os receptores P2X7 podem estar envolvidos

na ativação de macrófagos pelo LPS (DENLINGER E COLS., 1996; 2001; WATTERS E

COLS., 2001; HU E COLS., 1998 ).

Adicionalmente ao IL-1β, neste trabalho a citocina TGF-β se apresentou diminuída

nos animais nocautes após o tratamento com LPS quando comparados com os animais

selvagens após o tratamento. Várias são as fontes de TGF-β após uma agressão. TGF-α é

secretado por uma série de células, inclusive as células inflamatórias como macrófagos,

mastócitos e células epiteliais pulmonares (MALIZIA E COLS., 2008; HOSTTLER E

COLS., 2008; MALAVIA E COLS., 2008). Sabe-se que a ativação dos receptores P2X7

leva ao aumento da expressão do RNAm de TGF-β, efeito este dependente da via de

signalização PKC/MAPK, aspecto visto em astrócitos (WANG E COLS., 2003).

A diminuição junto com a IL-1β pode ter sido mais um estímulo à atenuação de

praticamente todos os parâmetros inflamatórios analisados à estarem atenuados, porque

91

sabe-se que o TGF-β medeia a quimiotaxia de diferentes tipos de células inflamatórias,

como, monócitos, macrófagos, mastócitos e linfócitos T (WAHL E COLS., 1987; ALLEN

E COLS., 1990; ADAMS E COLS., 1991; GRUBER E COLS., 1994). Podendo ainda,

estimular a expressão de moléculas de adesão célula-célula como a molécula-1 de adesão

intercelular (ICAM-1) nas células endoteliais (SUZUKI E COLS., 1994). TGF-β pode

também induzir a expressão de citocinas como o próprio IL-1β por monócitos e contribuir

assim para o processo inflamatório (WAHL E COLS., 1987; BOMBARA & IGNOTZ

1992). Contudo o TGF-β desempenha um papel crítico no desenvolvimento da inflamação

e fibrose pulmonar após a ALI (GIRI E COLS., 1993; PITTET E COLS., 2001). Portanto,

existem bastantes evidências de que o TGF-β está envolvido na inflamação. Finalmente, já

foi mostrado em cultura de astrócitos que os receptores P2X7 medeiam a secreção de TGF-

β1 (WANG E COLS., 2003).

A população de mastócitos nos animais nocautes após o tratamento com LPS não

foi recrutada. Estes são conhecidos como sendo uma das maiores fontes de citocinas e

fatores de crescimento e têm sido implicados em várias desordens fibróticas e inflamatórias

(WASSERMAN 1980). Assim, nossos dados sugerem que o receptor P2X7 além de induzir

ativação e degranulação em mastócito (BULANOVA E COLS., 2005; MYRTEK &

IDZKO 2007; SCHULMAN E COLS., 1999; LEE E COLS., 2001; JAFFAR & PEARCE

1990) está também, de alguma forma, associado com a migração dos mesmos em sítios

inflamatórios.

Tem sido verificado que os receptores para nucleotídeos tem sido implicados na

modulação da produção de superóxidos, peróxido de hidrogênio e outras espécies reativas

de oxigênio por diversas células do sistema imune (WARD E COLS., 1988; KUHNS E

COLS., 1988; KUROKI &. MINAKAMI 1989; SEIFERT E COLS., 1989; SUH E COLS.,

92

2001; MURPHY E COLS., 1993; DICHMANN E COLS., 2000; FERRARI E COLS.,

2000; PARVATHENANI E COLS., 2003; GUERRA E COLS., 2007). Com respeito à

sinalização dos receptores P2X7, ja é bastante conhecido sobre o envolvimento de ROS

nestes processos (NOGUCHI E COLS., 2008; TSAI E COLS., 2007; MASON E COLS.,

2004; CRUZ E COLS., 2007; KIM E COLS., 2007) , como também foi descrito que a

ativação do NFkB pelo P2X7 é sensível a antioxidantes (FERRARI E COLS., 1997),

sugerindo que ROS contribuem para estes processos.

O LPS induz a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) que é uma das

maiores causas da citotoxicidade. ROS pode causar a ativação de fatores de transcrição

sensitivos à redução como o NF-κB e AP-1 o qual transcrevem diversos genes

inflamatórios (BHATTACHARYY E COLS., 2004). No pulmão, estudos prévios

mostraram que a iNOS é aumentada durante a indução de lesão pulmonar induzido pelo

LPS e que a superprodução de NO via esta enzima é em detrimento da função pulmonar

(NUMATA E COLS., 1998). A presença de NO, a partir do lavado broncoalveolar, foi

quantificada de modo indireto pela presença de nitrito (AMBER E COLS., 1988; TSAI E

COLS., 1999). Os animais selvagens tratados com LPS liberaram uma quantidade

significativa de nitrito, fato que não ocorreu com os animais nocautes. Ou seja, nos animais

nocautes, o LPS induz uma lesão mais branda. Também podemos supor que o edema

peribronquiolar mais leve ou ausente nestes animais é conseqüente a inibição da liberação

de NO que finalmente reduz a inflamação como um todo. Neste contexto, foi observado

que na ausência do receptor P2X7, a inflamação e o edema foram reduzidos.

Adicionalmente, na ocorrência da inflamação é sabido que, na presença de uma resposta

inflamatória exuberante, a capacidade microbicida das células inflamatórias que migraram

para o foco de lesão é suprimida pela alta produção de óxido nítrico (CROSARA-

93

ALBERTO E COLS., 2002; BENJAMIN E COLS., 2002; 2000). Ou seja, esse óxido

nítrico inicialmente é liberado em quantidades fisiológicas, mas quando sua produção é

exageradamente aumentada pela ativação da sintase induzível do óxido nítrico (iNOS) ele

passa então, a inibir a atividade microbicida das células inflamatórias, principalmente dos

neutrófilos (CROSARA-ALBERTO E COLS., 2002; BENJAMIN E COLS., 2002;2000).

Estes resultados também podem ser relacionados com a idéia de que macrófagos RAW

264.7O pré-tratados com antagonistas do receptor P2X7 adenosina 5’trifosfato oxidado

(oATP) inibe a produção de NO e a expressão de iNOS e atenua a ativação de NFkB e

ERK-1,2 após a estimulação com LPS (HU E COLS., 1998). Estes receptores podem

também como citado anteriormente modular a produção de TNF-α e IL-1β e NO

(GUERRA E COLS., 2003; PFEIFFER E COLS., 2007).

Quanto ao remodelamento pulmonar após o tratamento com LPS pudemos

demonstrar que os animais selvagens apresentaram diminuição da trama de fibras elásticas

e aumento da rede colágena e da fibronectina. Estas alterações estão relacionadas ao

aumento progressivo da lesão pulmonar (JANOFF,1985; NEGRI E COLS., 2002; ORITO

E COLS., 2006; POSTMA & TIMENS 2006). Sabe-se que com a degradação das fibras

elásticas formam-se fragmentos de elastina que podem recrutar uma segunda população de

células inflamatórias ao pulmão, levando assim ao aumento da lesão pulmonar,

principalmente pelo recrutamento de macrófagos, que por sua vez liberam mais fatores

inflamatórios e enzimas proteolíticas (HAUTAMAKI E COLS., 1997). Em adição também

existe a liberação de espécies reativas (estresse oxidativo) e a apoptose de células

estruturais pulmonares (MACNEE 2005; OWEN 2005).

94

O remodelamento pulmonar nos animais nocautes após o tratamento com LPS

demonstrou-se inalterado quando comparado aos seus controles, havendo uma preservação

das trama colágena e elástica bem como a manutenção da fibronectina no tecido pulmonar.

Possivelmente estes dados expliquem os dados normais da função pulmonar (mecânica

respiratória) neste grupo.

Além disso, foi possível demonstrar que os animais nocautes apresentam uma trama

elástica menor que a vista nos animais selvagens e uma trama colágena maior que a dos

grupos controle selvagem (p<0,05). Estes dados ainda não tinham sido verificados nestes

animais podendo estar modificando parâmetros fisiológicos referentes a arquitetura

pulmonar normal. Provavelmente estes dados refletem a baixa expressão da citocina TGF-β

verificada em nosso estudo. É bem conhecido o fato que esta citocina é considerada como

prófibrótica (WILLIS & BOROK 2007; DANIELS E COLS., 2004; YEHUALAESHET E

COLS., 2000; ROMAN E COLS., 2005), como visto em diversos modelos experimentais

(SHEN E COLS., 2008; CUTRONEO E COLS., 2007; KITOWSKA E COLS., 2008;

VYAS-READ E COLS., 2007; XISTO E COLS., 2005).

Os efeitos verificados em relação as proteínas da MEC podem estar correlacionados

com a expressão de metaloproteases. Já foi verificado que as MMPs 2 e 9 estão implicadas

no remodelamento pulmonar após tratamento com LPS (COIMBRA E COLS., 2006;

CARNEY E COLS., 2001). Tanto o LPS quanto as citocinas próinflamatórias aumentam a

síntese de MMP-2 e a MMP-9 (gelatinases) por uma série de células inflamatórias.

Também se encontram elevadas na septicemia e ARD humanas (NAKAMURA E COLS.,

1998; CORBEL E COLS., 2000) assim como em animais (COIMBRA E COLS., 2006)

95

Nossos resultados estão condizentes com os dados da literatura. As MMP-2 e -9

estão aumentados após introdução de LPS sendo que a ausência de modulação da MMP-2

pode ser devida a sua regulação pelo TGF-β (LECHAPT-ZALCMAN E COLS., 2006).

Além disso, podemos explicar pela imunoexpressão da MMP-2 que nos animais

nocautes apresentou-se inalterada após o tratamento com LPS por 24 horas, indicando uma

possível mudança na interação célula-célula e célula-matriz que finalmente afeta a

migração e ativação celular (PARKS & SHAPIRO 2001). Ou possivelmente pela

diminuição do seqüestro de polimorfonucleares para dentro do interstício (CORRY E

COLS., 2002). Apesar da MMP-9 ter se mantido aumentada nos animais nocautes após o

tratamento com LPS e estar envolvida em diversos processos inflamatórios pulmonares ,

incluindo a ALI (WINKLER E COLS., 2003; SANTOS E COLS., 2006; RICOU E COLS.,

1996; RENCKENS E COLS., 2006), estes conseguiram manter uma atenuação da

inflamação pelos diversos parâmetros inflamatórios analisados que demonstraram-se

inalterados após o tratamento com LPS.

A mecânica pulmonar foi analisada pelo método da oclusão ao final da inspiração

(BATES E COLS., 1985; 1988). Após a oclusão ocorre uma queda rápida da pressão

traqueal até um ponto de inflexão, e a partir daí ocorre uma queda lenta que decorre até um

platô, o qual equivale à pressão de retração elástica do pulmão. A partir desses pontos de

pressão puderam-se calcular as variáveis estudadas no presente trabalho. A ∆Ptot, L,

correspondente à variação total de pressão pulmonar, refletindo as modificações nos

componentes resistivos e viscoelásticos do pulmão como um todo. Os animais selvagens

apresentaram um aumento do ∆Ptot após o tratamento com LPS por 24 horas (p<0.05), fato

não observado nos animais nocautes. A ∆P1, L, correspondente à dissipação de energia no

96

componente viscoso do pulmão, ou seja, a variação de pressão necessária para vencer o

componente viscoso das vias aéreas centrais. A ∆P1 nos animais selvagens CTRL e

tratados com LPS não obtiveram diferença significativa, estando de acordo com trabalhos

anteriores (RACKOW E COLS., 1988; FERRARI-BALIVIERA E COLS., 1989; PIPER E

COLS., 1996). Fato oposto foi observado com os animais nocautes tratados com LPS

quando comparados aos animais CTRL. Isto pode ser explicado pelo fato de que os animais

nocautes tratados com LPS por 24 horas apresentaram uma média do ∆P1 no mesmo

patamar dos animais selvagens CTRL e nos animais tratados com LPS. Contudo, este

aumento caracterizado nos animais nocautes pode ser explicado por alterações de fase

aguda que ocorre nos primeiros momentos da lesão por LPS (MENEZES E COLS., 2005).

Podemos, também relacionar estes dados à redução das vias aéreas em função do colapso

alveolar. Os componentes elásticos do pulmão ou ∆P2, L, reflete a variação de pressão

necessária para vencer os componentes viscoelásticos do pulmão nas vias aéreas

periféricas, traduzindo condições do parênquima pulmonar. O ∆P2 dos animais selvagens

de acordo com os achados histológicos apresentaram com tratamento com LPS por 24

horas, um aumento significativo (p<0.01) na sua variação. Corroborando com a piora geral

dos camundongos selvagens em relação aos camundongos nocautes, pois este componente

pulmonar tem relação com a estrutura pulmonar, a qual foi afetada. A elastância estática do

pulmão ou EST, L reflete a rigidez pulmonar e representa o inverso da complacência, ou

seja, mede a capacidade de distensão do pulmão. Este parâmetro mostrou que os animais

nocautes mesmo com o tratamento com o LPS não obtiveram diferença significativa na

EST e na DE (elastância dinâmica), fato não observado nos animais selvagens.

98

CONCLUSÕES

99

7 CONCLUSÕES

1- O LPS, após 24 horas, por instilação intratraqueal, induziu um processo inflamatório

pulmonar predominantemente do tipo mononuclear e remodelamento pulmonar.

2- A imunoexpressão do receptor P2X7 está aumentada significativamente no pulmão, na

lesão induzida pelo LPS, o que está de acordo com o conceito de ser um sinalizador de

estresse celular.

3- O receptor P2X7 parece estar envolvido no recrutamento de neutrófilos e mastócitos, mas

não no de macrófagos F4/80+ no modelo da lesão pulmonar induzida pelo LPS.

4- O receptor P2X7 parece estar envolvido na ativação de macrófagos na lesão aguda

pulmonar induzida pelo LPS.

5- A atenuação da lesão pulmonar induzida pela ausência do receptor P2X7 provavelmente

se deve não só à ausência do NO (menor estresse oxidativo), como também a menor

produção de fatores pró-inflamatórios, como o IL-1 e prófibróticos, como o TGF-β.

6- A atenuação da lesão pulmonar induzida pela ausência do receptor P2X7 também está

relacionada a diminuição/inibição do remodelamento pulmonar (tramas colágena e elástica

mantida, ausência de deposição de fibronectina e ausência de modulação de MMP-2).

7- A diminuição/inibição do remodelamento pulmonar pode ter sido o responsável pela

manutenção dos parâmetros funcionais em níveis normais nos animais nocautes.

8- Concluímos com um resumo esquemático de todos os resultados apresentados aqui.

100

FIGURA 19. Esquema mostrando resumo dos resultados obtidos na dissertação.

101

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