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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARAN

CECLIA FABIANA DA GAMA FERREIRA

EFEITO DA APLICAO DO CAMPO ELTRICO NA FORMAO DE FILMES PROTICOS

DE GlnB-Hs SOBRE SUBSTRATOS SLIDOS

Curitiba

2012

CECLIA FABIANA DA GAMA FERREIRA

EFEITO DA APLICAO DO CAMPO ELTRICO NA FORMAO DE FILMES PROTICOS

DE GlnB-Hs SOBRE SUBSTRATOS SLIDOS

Tese apresentada como requisito parcial obteno de grau de Doutor. rea de concentrao: Engenharia e Cincia dos Materiais,

Programa de Ps-Graduao em Engenharia e Cincia dos Materiais - PIPE. Setor de Tecnologia, Universidade Federal do Paran.

Orientador: Prof. Paulo Csar de Camargo

Co-orientadora: Prof. Elaine Machado Benelli

Curitiba

2012

Embora o bvio nem sempre seja evidente,

revolucionrio

A. H. Albuquerque

Agradecimentos

- Aos meus pais, Sandra e Valentin, pelo apoio, incentivo e carinho incondicionais por toda a vida.

- Ao Prof. Dr. Paulo Csar de Camargo pela orientao de tantos anos a frente do microscpio de

fora atmica, confiana e muita pacincia.

- A Prof. Elaine Machado Benelli pela amizade, auxlio em geral, orientao nas pesquisas, sugestes

oportunas e por discusses construtivas.

- Ao Prof. Ivo A. Hmmelgen pela utilizao do laboratrio e dos equipamentos e ao seu aluno de

doutorado Wagner Moura e Serbena pelo apoio nas medidas.

- Ao Divo e todos os demais professores e amigos pelas horas de treino, cuidados e descontrao.

- Ao Juliano e a equipe de Travessias da ASUFEPAR pelas horas de treino/relaxamento na piscina.

- Ao Leonardo Schneider pelas conversas construtivas e destrutivas no MFA.

- Ao Eduardo Bach pela amizade, ateno e carinho de todos esses anos.

- Ao Atair dos Santos por me mostrar o caminho.

- A Alcione A. Savariani e aos amigos pelo suporte fundamental.

- Ao Pai

Resumo

O efeito do campo eltrico externo sobre a formao de filmes de protena GlnB-Hs e sobre

os componentes da soluo tampo foi analisado por curvas de corrente em funo do campo

eltrico e por microscopia de fora atmica (MFA). A protena GlnB de Herbaspirillum seropedicae

(GlnB-Hs) globular, homotrmerica (36 kDa) e com estrutura tridimensional j determinada por

difrao de Raios-X. Concentraes de 10 nM e 100 nM de GlnB-Hs nativa e 10 nM de protena

desnaturada foram depositadas sobre lamnula siliconizada e mica sob temperatura e umidade

ambientes. Imediatamente aps a deposio, campos eltricos mximos de 30 kV/m e 75 kV/m

foram aplicados, com taxas de variao de 3 e 30 V/s. As correntes medidas so correntes de

superfcie e foram analisadas como sendo de corrente de transporte. Para todos os sistemas

analisados necessrio um campo eltrico mnimo (valor crtico) para a corrente ser significativa.

Dependendo do substrato e dos componentes da soluo este campo pode variar de 10 kV/m a 37

kV/m. As imagens de MFA mostraram filmes com alto grau de organizao direcional. Tanto nas

curvas de I-E quanto nas imagens de MFA, o componente Tris-HCl do tampo tem papel

determinante no comportamento das curvas de corrente eltrica e na interpretao das imagens de

MFA. Sobre a lamnula siliconizada somente as solues contendo protena mostraram evidncias de

orientao com o campo eltrico aplicado. Enquanto que, sobre a superfcie da mica a formao de

filmes com orientao preferencial devido ao E foram obtidos na presena e ausncia de GlnB-Hs. O

transporte da protena GlnB-Hs sobre a mica observado pelas imagens de MFA foi comprovado por

imunodeteco. Estes resultados mostram que o campo eltrico aplicado favoreceu a organizao

direcional dos filmes de protena GlnB-Hs e podem contribuir para o entendimento da formao de

filmes proticos sob campo eltricos aplicados.

Palavras chave: campo eltrico, filme de protena GlnB-Hs, mica, lamnula siliconizada, corrente em

funo do campo eltrico, microscopia de fora atmica.

Abstract

The effect of an external electric field on the formation of protein GlnB-Hs films and on its

buffer solution on solid surfaces has been analyzed by current vs electric field curves and atomic

force microscopy (AFM). The Herbaspirillum seropedicae GlnB protein (GlnB-Hs) is a globular, soluble

homotrimer (36 kDa) and the three-dimensional structure was already determined by X-Rays

diffraction. Concentrations of 10 nM and 100 nM native GlnB-Hs and 10 nM denatured protein were

deposited on siliconized glass slides and on mica at ambient conditions. Immediately after solutions

deposition a maximum electric field of 30 kV/m and 75 kV/m where applied with rates of 3 and 30

V/s. The measured currents were current surfaces and were analyzed as transport current. Electric

current started to flow only after a minimum electric field (critical value) for all systems analyzed.

Depending on the substrate and components of the solution the threshold electric field varies from

10 kV /m to 37 kV/m.The AFM images showed films with high degree of directional organization. The

Tris-HCl buffer compound has a decisive role both in the electric current curves pattern as in the AFM

images interpretation. On siliconized glass slides evidence of film orientation with the applied electric

field was only observed in the AFM images when native and denatured protein were present in the

solution. On mica surface films with preferred orientation with applied E were obtained in the

presence and absence of GlnB-Hs. The protein GlnB-Hs transport on mica observed by AFM images

was confirmed by imunoblotting. These results showed that the applied electric field favored

directional organization of the protein GlnB-Hs films and may contribute to understand the

formation of protein films under applied electric fields.

Keywords: electric field, GlnB-Hs protein film, mica, siliconized glass slide, current vs electric field,

atomic force microscopy.

Lista de Figura

Figura 2.1: Unidade bsica da protena formando o esqueleto polipeptdico. R1 e R2 simbolizam o

radical [Adaptado de 15].........................................................................................................................6

Figura 2.2: Desenho esquemtico da -hlice (direita) e da folha- anti-paralela (esquerda). A

primeira representao mostra todos os tomos no esqueleto polipeptdico, com as cadeias laterais

representadas pela cor roxa, enquanto que o segundo desenho mostra os smbolos usualmente

utilizados para representar a alfa-hlice e a folha em modelos esquemticos de protenas.

[Adaptado de 15]............................................................................................................................ ......8

Figura 2.3: Diagrama do trmero da protena GlnB de H. seropedicae....................................................9

Figura 2.4: Estado de cargas (a-c) e superfcie molecular (d-f) da protena GlnB-Hs. a) e d) face

inferior, b) e e) face lateral e c) e f) face superior [Adaptado de 20]. Imagem e conveno de cores

(RASMOL)..............................................................................................................................................11

Figura 2.5: Desenho esquemtico da dupla camada eltrica formada na interface da superfcie

carregada em contato com um lquido inico e a correspondente distribuio do potencial eltrico

vs a distncia z da parede. s representa o potencial negativo da superfcie, i corresponde a camada

interna composta por co- e contraons e d referente a camada externa composta somente por

contraons hidratados. A distncia caracterstica da camada de difuso dada pelo comprimento de

Debye (1/k) [Adaptado de 25]...............................................................................................................13

Figura 2.6: Diagrama das possveis orientaes de adsoro para uma protena retangular de

dimenses a x b x c em relao s demais protenas............................................................................17

Figura 2.7: Resumo dos modelos cinticos de adsoro. Um desenho esquemtico de cada

mecanismo de adsoro [Adaptado de 30]...........................................................................................17

Figura 2.8: Desenho esquemtico de uma protena com quatro lados interagindo com substratos

de superfcies compatveis. Uma face da protena hidrofbica, outra carregada negativamente,

outra carregada positivamente, outra de carter hidroflico neutro [44].............................................20

Figura 2.9: Esquema do fluxo eletroosmtico. A) Dimenses de um microcanal, W a largura, h a

altura e L o comprimento e a direo do fluxo e B) Desenho esquemtico do fluxo osmtico em um

tubo capilar de superfcie negativa [Adaptado de 9]............................................................................25

Figura 2.10: Desenho esquemtico da tcnica de monitoramento de corrente. Dois reservatrios com

solues eletrolticas com diferentes concentraes esto ligados por um microcanal. Inicialmente a

soluo menos concentrada (em preto) do reservatrio B preenche o microcanal. Quando um campo

eltrico aplicado a soluo mais concentrada (em cinza), reservatrio A, escoa pelo microcanal via

EOF, substituindo a soluo inicial [8]...................................................................................................29

Figura 2.11: Curva tpica de corrente em funo do tempo obtida pela tcnica de monitoramento de

corrente [8].............................................................................................................. ..............................29

Figura 2.12: Desenho esquemtico de um dipolo.................................................................................31

Figura 2.13: Desenho da orientao das molculas polares sob a influncia de um campo eltrico

externo [Adaptado de 63].....................................................................................................................31

Figura 2.14: Desenho esquemtico da interao dipolo-dipolo. a) Campo eltrico externo induz

dipolos (flechas brancas) nas partculas coloidais e interaes entre as mesmas com distncia R e b)

quando o campo forte suficiente partculas coloidais formam uma cadeia ao longo do campo

aplicado [69]............................................................................................................ ..............................34

Figura 2.15: Desenho esquemtico da dupla camada eltrica formada na interface da partcula em

contato com um lquido inico [Adaptado de 9]...................................................................................35

Figura 2.16: Desenho ilustrativo da eletroforese. Uma dupla camada eltrica origina na superfcie de

uma partcula carregada negativamente e foras resultantes de um campo eltrico externo

[Adaptado de 9].............................................................................................................................. .......36

Figura 2.17: Curva esquemtica mostrando a dependncia da fora de interao sonda-amostra em

funo da distncia entre elas. A fora proveniente do potencial de interao entre dois ou mais

tomos, as foras positivas so atrativas e acima da linha de fora zero as foras so repulsiva e cada

regio determina um modo operacional do microscpio [78]..............................................................39

Figura 2.18: Desenho esquemtico dos componentes do microscpio de fora atmica [Adaptado de

83]............................................................................................................................ ..............................40

Figura 2.19: Desenho esquemtico do modo contraste de fase. A sonda oscila sob o efeito de um

atuador e a diferena de fase D entre o atuador e o fotodetector, gerada durante a passagem da

sonda por materiais diferentes [Adaptado de 15]................................................................................42

Figura 4.1: Desenho esquemtico do substrato mica. A mica foi cortada em retngulos de 20 mm X 5

mm. As extremidades foram pintadas com tinta condutiva para fazer contado com eletrodos. As

superfcies limpa da mica para formao do filme de protena de 4 mm ou 10 mm.........................44

Figura 4.2: Desenho esquemtico do substrato lamnula siliconizada. A) substrato lamnula

siliconizada e B) design da canaleta feita com pasta de silicone sobre lamnula siliconizada (0, 43 X

0,43 X 4 mm). A lamnula foi cortada em retngulos de 20 mm X 10 mm e sobre esta canaletas de

silicone em pasta com uma mscara rgida. As extremidades foram pintadas com tinta condutiva para

fazer contado como eletrodos................................................................................................. .............45

Figura 4.3: Desenho esquemtico da deteco da protena GlnB-Ab sobre mica................................48

Figura 4.4: Desenho esquemtico do arranjo experimental para aplicao de tenso nas solues

depositadas sobre mica. A amostra foi ligada em srie com dois resistores. O multmetro ligado ao

resistor R1 de 43.7 K. Na mica, as solues foram depositadas imediatamente adjacentes a tinta

condutiva no eletrodo negativo. Na lamnula siliconizada, as solues preencheram o espao entre os

eletrodos. Na equao calculada pelo software VA a voltagem sobre a amostra, V o valor de

tenso medido sobre o resistor R1 e VT a tenso aplicada.................................................................50

Figura 5.1: Topografia da lamnula siliconizada (sem aplicao do campo eltrico). A) somente o

substrato lamnula siliconizada e B) sistema lamnula siliconizada com a canaleta de polisiloxano.....51

Figura 5.2: Topografia do substrato lamnula siliconizada aps tenso de 0 a 300 V. A) - B) sem

canaleta e C) - D) com canaleta de polisiloxano. A) e C) sob umidade relativa acima de 70 % e B) e D)

com H2O miliQ preenchendo o espao entre os eletrodos. Aps a gua de o volume ter evaporado a

superfcie das lamnulas foram analisadas............................................................................................52

Figura 5.3: Grfico corrente vs campo eltrico aplicado sobre a lamnula siliconizada. Curvas obtidas

sob A) umidade relativa do ar de 100 % a 40% e B) 15 l de H2O miliQ foram depositados sobre o

substrato................................................................................................................................................53

Figura 5.4: Grfico de corrente em funo do campo eltrico aplicado sobre o sistema lamnula

revestida com organosilano com canaleta de polisiloxano. Curvas obtidas com umidade relativa do ar

de 40% e acima de 70 % e com 5 l de H2O miliQ preenchendo todo o espao entre os

eletrodos............................................................................................................................................ ...53

Figura 5.5: Grfico de corrente eltrica com voltagem constante de A) 100 V para a lamnula

siliconizada e B) 500 V para a lamnula siliconizada e mica. A umidade relativa inicial de 100 %.

Depois de aproximadamente 450 s, a umidade de 60 %. A umidade relativa final de 40 %...........54

Figura 5.6: Grfico de corrente em funo do tempo com tenso constante: Linha em negrito: 100 V,

linha contnua: 300 V e linha pontilhada: 500 V. A) Substrato + canaleta de polisiloxano em umidade

relativa acima de 60 % e B) Substrato + canaleta de polisiloxano + 5 l de H2O miliQ. O ponto 2 indica

quando a tenso atinge a voltagem determinada.................................................................................55

Figura 5.7: Topografia dos filmes obtidos pelos componentes da soluo tampo sob efeito de um

campo eltrico externo de 0 a 75 KV/m. A) 50 mM NaCl, B) 50 mM Tris e C) soluo tampo............56

Figura 5.8: Grfico de corrente em funo da tenso aplicada sobre os componentes da soluo

tampo na canaleta sobre lamnula siliconizada. Linha tracejada: soluo tampo, linha contnua:

soluo de 50 mM NaCl e linha ponto-trao: soluo de 50mM de Tris-HCl pH

8.............................................................................................................................................................56

Figura 5.9: Topografia dos filmes obtidos pelas solues de protena GlnB-Hs sobre a lamnula

siliconizada+canaleta de polisiloxano sob efeito de um campo eltrico externo de 0 a 75 KV/m. A)

nativa 10 nM (soluo A), B) nativa 100 nM (soluo B) e C) desnaturada 10 nM (soluo C).............57

Figura 5.10: Grfico de I-E das solues de protena GlnB-Hs sob a influncia do campo eltrico

externo sobre a lamnula siliconizada. Linha contnua: soluo de 10 nM de GlnB-Hs nativa, linha

tracejada: a soluo de 100 nM de GlnB-Hs nativa e linha em negrito: soluo 10 nM de GlnB-Hs

desnaturada.................................................................................................................. ....................58

Figura 6.1: Frmula estrutural da molcula de organosilano, em que R so grupo qumicos que

podem ser orgnicos ou inorgnicos.....................................................................................................60

Figura 6.2: Superfcies hidrofbicas. Quanto maior o grau de hidrofobicidade da superfcie, maior o

ngulo de contato com a gota de gua. Superfcie (a) superhidroflica = 0, (b) com molhabilidade

parcial 0 < < 180 e (c) superhidrofbica = 180 [93] ....................................................................61

Figura 6.3: Grfico de corrente em funo da umidade relativa. Quanto maior a umidade, maior o

valor de corrente medido sobre a superfcie da lamnula siliconizada.................................................63

Figura 6.4: Desenho esquemtico mostrando os caminhos formados pelos agregados de molculas

de gua adsorvidas na superfcie do substrato slido e o possvel caminho percorrido pela corrente

(vermelho) [Adaptado de 99]................................................................................................................64

Figura 6.5: Grfico de frao revestida por umidade relativa nas condies em que as medidas de

corrente por campo eltrico foram realizadas, temperatura de 30 C e presso de vapor de 4233

Pa...........................................................................................................................................................65

Figura 6.6: Grfico de potncias dissipadas x corrente da lamnula siliconizada e mica (referentes as

Fig. 5.5-A e 5.6-B) com voltagens constantes de 100 V e 500 V............................................................66

Figura 6.7: Cargas cruzando uma seo reta em um microcanal devido a um campo externo aplicado

[Adaptado de 50]...................................................................................................................................71

Figura 6.8: Grfico da generalizao do comportamento observado para as curvas de corrente em

funo do campo eltrico aplicado, exceto para a soluo 50 mM de NaCl.........................................71

Figura 6.9: Desenho esquemtico da molcula de Tris. Em vermelho so as OH- e em azul o NH2+

[103].............................................................................................................................. ........................72

Figura 6.10: Dipolo eltrico em um campo eltrico. Se as foras atuantes no forem iguais (F1 F2) a

molcula migrar no sentido do maior F [Adaptado de 50]..................................................................72

Figura 6.11: Desenho esquemtico de uma estrutura do grafite cristalino. Folhas com os tomos de

carbono (roxa) em arranjo hexagonal [Adaptado de 104]. Resoluo da rede atmica dos tomos de

grafite (carbono ordenado hexagonalmente) no plano cristalinos. Imagens obtidas no modo de

contato [105].........................................................................................................................................73

Figura 6.12: Desenho esquemtico das foras sobre a protena GlnB-Hs sob um campo eltrico

aplicado. A fora de arraste se sobrepe na protena, que em pH 8 apresenta excesso de carga

negativa na superfcie............................................................................................................................77

Figura 7.1: Topografia da superfcie da mica muscovita recm clivada obtida por MFA operando no

modo de contato. A) rea de 100 m2 e B) aumento de 6x da rea maior...........................................80

Figura 7.2: Topografia da gua miliQ sob efeito de campo eltrico aplicado sobre mica. A) Prximo ao

anodo (lado depositado) e B) prximo ao catodo.................................................................................81

Figura 7.3: Imagens topogrficas do efeito do campo eltrico de 75 kV/m nos componentes das

solues controles. A) C) reas prximas ao anodo (lado no qual a soluo foi depositada) e de D)

F) reas prximas ao catodo. A) e D) soluo de 50 mM NaCl, B) e E) soluo de 50 mM Tris-HCL pH 8

e C) e F) soluo tampo.......................................................................................................................82

Figura 7.4: Grfico de corrente em funo do campo eltrico para as solues controles depositadas

paralelo ao anodo e um campo eltrico externo de 0 a 75 kV/m, com taxa de variao de 3 V/s. Linha

contnua: substrato mica de 4 mm de comprimento, linha tracejada: gua miliQ, linha em negrito:

soluo de 50 mM NaCl, linha com bolinhas brancas: soluo de 50 mM Tris-HCl pH 8 e linha de

bolinhas pretas: soluo tampo...........................................................................................................83

Figura 7.5: Topografia dos filmes de soluo A (A e C) e B (B e D) sob efeito de um campo eltrico de

75 kV/m sobre a mica. Regies prximas ao anodo A)-B) e ao catodo C)-D)........................................84

Figura 7.6: Filme da soluo de protena GlnB-Hs 10 nM desnaturada sob efeito de um campo

eltrico de 75 kV/m sobre a mica. rea prxima ao anodo A) Topografia e B) fase e rea prxima ao

catodo C) topografia..............................................................................................................................85

Figura 7.7: Grfico de corrente em funo do campo eltrico aplicado as solues de protena

depositadas ao lado do anodo sobre mica. Linha contnua: Soluo de GlnB-Hs 10 nM nativa, linha

tracejada: soluo de GlnB-Hs 100 nM nativa e linha em negrito: soluo de GlnB-Hs 10 nM

desnaturada...........................................................................................................................................85

Figura 7.8: Efeito da tenso de at 300 V com passo de 3 V/s aplicados sobre as solues controles na

mica muscovita. Lado do anodo A)-C) e ao lado do catodo D)-F) das solues: 50 mM NaCl A) e D), 50

mM Tris-HCl pH 8 B) e E) e da soluo tampo C) e F)..........................................................................86

Figura 7.9: Grfico de corrente em funo do campo eltrico das solues controles depositadas

paralelo ao anodo e uma tenso de 0 a 300 V aplicada, com taxa de variao de 3 V/s. Linha


soluo de 50 mM NaCl, linha com bolinhas brancas: soluo de 50 mM Tris-HCl pH 8 e a linha com


Figura 7.10: Topografia dos filmes da soluo de protena 10 nM nativa (A e E), 100 nM nativa (B e D)

e 10 nM desnaturada (C e F) expostas a um campo de 30 kV/m com taxa de variao de 3 V/s sobre

mica. reas prximas ao anodo (lado no qual a soluo foi depositada) A) a C) e reas prximas ao

catodo D) a F)........................................................................................................................................88

Figura 7.11: Grfico de corrente em funo do campo eltrico aplicado s solues de protena

depositadas ao lado do anodo sobre mica e expostas a uma tenso de 0 a 300 V com taxa de variao

de 3 V/s. Linha contnua: soluo de GlnB-Hs 10 nM nativa, linha tracejada: soluo de GlnB-Hs 100

nM nativa e linha em negrito: soluo de GlnB-Hs 10 nM desnaturada...............................................89

Figura 7.12: Efeito da tenso de at 300 V com passo de 30 V/s aplicados sobre as solues controles

na mica muscovita. Lado do anodo A)-C) e ao lado do catodo D)-F) das solues: 50 mM NaCl (A e D),

50 mM Tris-HCl pH 8 (B e E) e da soluo tampo (C e F).....................................................................91

Figura 7.13: Grfico de corrente em funo do campo eltrico das solues controles depositadas

paralelo ao anodo e uma tenso de 0 a 300 V aplicada, com taxa de variao de 30 V/s. Linha


soluo de 50 mM NaCl, linha com bolinhas brancas: soluo de 50 mM Tris-HCl pH 8 e linha com


Figura 7.14: Topografia dos filmes de soluo de protena GlnB-Hs nativa 10 nM (A e C) e 100 nM (B

e D) sob efeito de um campo eltrico de 30 kV/m sobre a mica. Regies prximas ao anodo A)-B) e ao

catodo C)-D).............................................................................................................................. .............93

Figura 7.15: Filme da soluo de protena GlnB-Hs 10 nM desnaturada sob efeito de um campo

eltrico de 30 kV/m sobre a mica. rea prxima ao anodo A) Topografia e rea prxima ao catodo B)

topografia e C) fase...............................................................................................................................93

Figura 7.16: Corrente em funo do campo eltrico aplicado as solues de protena depositadas ao

lado do anodo sobre mica e expostas a uma tenso de 0 a 300 V com taxa de variao de 30 V/s.

Linha contnua: soluo de GlnB-Hs 10 nM nativa, linha tracejada: soluo de GlnB-Hs 100 nM nativa

e linha em negrito: soluo de GlnB-Hs 10 nM desnaturada................................................................94

Figura 7.17: Radiograma dos controles. A) Superfcie recm clivada da mica, soluo tampo

depositada paralelamente ao eletrodo negativo (sinalizado na imagem) sobre a mica com B) 10 mm e

C) 4 mm de comprimento entre os eletrodos.......................................................................................95

Figura 7.18: Radiograma das solues de protena depositadas paralelas ao eletrodo negativo sem

aplicao de campo sobre mica de 4 mm (A a C) e 10 mm (D a F) de comprimento entre os eletrodos.

Concentraes de GlnB-Hs de nativa 10 nM (A e D), nativa 100 nM (B e E) e desnaturada 10 nM (C e

F).............................................................................................................................. ..............................95

Figura 7.19: Radiograma das solues de protena sob efeito de campo eltrico sobre mica com 4

mm de distncia entre eletrodos. Soluo de GlnB-Hs de A) 10 nM nativa, B) 100 nM nativa e C) 10

nM desnaturada....................................................................................................................................96


mm de distncia entre eletrodos e com taxa de variao de 3 V/s. Soluo de GlnB-Hs de A) 10 nM

nativa, B) 100 nM nativa e C) 10 nM desnaturada................................................................................96


mm de distncia entre eletrodos e com taxa de variao de 30 V/s. Soluo de GlnB-Hs de A) 10 nM

nativa, B) 100 nM nativa e C) 10 nM desnaturada................................................................................97

Figura 8.1: Desenho esquemtico de uma estrutura ideal de mica muscovita. Folhas tetradricas

duplas de (Si, Al)205 so ligadas eletrostaticamente por ons de potssio. A distncia perpendicular

entre as folhas de 10. [Adaptado de 79]. Topografia da mica muscovita (001) depois de ser

atacada com cido fluordrico por 3 horas. Anlise realizada em modo dinmico e imagem de

512X512 pixel. Cantilever de 10 m, freqncia de ressonncia de 4,6 MHz e velocidade de varredura

de 40 Hz [113]........................................................................................................ ................................98

Figura 8.2: Representao da molhabilidade da gota. A molhabilidade de uma superfcie slida o

resultado das interaes moleculares existentes entre o fluido e o substrato slido, se revelando

como a relao entre foras de coeso e adeso. medida que as foras de adeso aumentam em

relao as foras de coeso, mais afinidade a superfcie slida ter com a fase lquida......................99

Figura 8.3: Desenho esquemtico do sistema analisado. A soluo de protena depositada sobre a

mica, ao lado do anodo (1). Imediatamente aps uma tenso de at 300 V aplicada com taxas de

variao do campo eltrico diferentes. Atravs de foras agindo sobre os ons e molculas da soluo

a interface lquido-ar comea a escoar (2). No final de um tempo t a soluo reveste toda a superfcie

da mica entre os eletrodos (3)............................................................................................... ..............100

Figura 8.4: Grfico da generalizao do comportamento observado para as curvas de corrente em

funo do campo eltrico aplicado.....................................................................................................101

Figura 8.5: Sistema fsico anlogo a soluo de protena (dieltrico) entre os eletrodos. Campo

eltrico entre as placas de um capacitor com dieltrico (cinza). A carga superficial no dieltrico

enfraquece o campo original entre as placas [Adaptado de 50].........................................................102

Figura 8.6: Desenho esquemtico da soluo depositada paralelo ao polo negativo sobre a mica com

a fonte desligada. A frente no uniforme e a molhabidade da soluo foram observados

opticamente........................................................................................................................................105

Figura 8.7: Movimentao da protena causada pelo momento de dipolo induzido em um campo

eltrico no uniforme [Adaptado de 116]...........................................................................................107

Figura 8.8: Interao das molculas presentes na soluo com 50 mM Tris-HCl pH 8. Interao A) Tris-

Tris, B) Tris-H2O e C) molculas de gua..............................................................................................108

Figura 8.9: Modelo esquemtico da molcula de gua coadsorvida com tomo de Na sobre Ru (0 0 1)

[Adaptado de 123]. A molcula de gua reorienta-se com o aumento de Na presente na

superfcie.............................................................................................................................................109

Figura 8.10: Espectro de FTIR/ATR para filmes formados por 100 nM GlnB-Hs nativa (linha em preto)

e a soluo tampo. As duas alm de apresentarem pico na regio caracterstica da protena tambm

tem um sinal muito pequeno (destacado em vermelho)....................................................................111

Figura 8.11: Anlise por MEV-CL. A) Imagem de MEV, B) imagem por catodoluminescncia do filme

formado pela deposio de 10 nM GlnB-Hs nativa paralela ao anodo. Espectro obtido do filme

formado pela soluo controle Tris-CL pH 8. Observa-se no espectro que a faixa de emisso para os

aminocidos da protena GlnB-Hs apresenta sinal para o Tris............................................................112

Figura 8.12: Trajetrias de partculas em escoamentos unidimencionais laminar e turbulento

[93].............................................................................................................................. ........................115

Fig. Ap. 2.1: Desenho esquemtico do arranjo experimental para aplicao de tenso nas

solues............................................................................................................................. ..................131

Fig. Ap. 3.1: Topografia dos filmes de protena GlnB-Hs 10 nM nativa (A e C), 100 nM (B e E) e

desnaturadas (C e F) formados sobre mica (A a C) e lamnula siliconizada (D a F)..............................133

Fig. Ap. 3.2: Topografia dos filmes formados pela deposio de A) gua miliQ e B) soluo de 50 mM

de Tris-HCl pH 8 sobre mica.................................................................................................................134

Lista de Tabelas

Tabela 4.1: Concentrao final de protena GlnB-Hs e dos componentes da soluo tampo nas

solues aps diluio...........................................................................................................................45

Tabela 5.1: Anlise das curvas das solues de protena sobre lamnula siliconizada (referente a Fig.

5.10).............................................................................................................................. .........................59

Tabela 6.1: Potncia dissipada para a curva corrente em funo do tempo com tenso constante da

lamnula siliconizada com canaleta de polisiloxano sob umidade relativa acima de 70 % (referente a

Fig. 5.6-A)...............................................................................................................................................67

Tabela 6.2: Potncia dissipada para a curva corrente em funo do tempo com tenso constante da

lamnula siliconizada com canaleta de polisiloxano e 5 l de H2O miliQ preenchendo o espao entre

os eletrodos (referente a Fig. 5.6-B)......................................................................................................68

Tabela 6.3: Fora de arraste sofrida pelas protenas GlnB-Hs sob campo eltrico externo..................77

Tabela 7.1: Anlise das curvas das solues de protena sobre mica com taxa de variao de 3 V/s

(referente a Fig. 7.11)............................................................................................................................89

Tabela 8.1: Comprimento de onda de excitao e emisso para os aminocidos tirosina e fenilalanina

presentes na protena GlnB-Hs............................................................................................................111

Tabela 8.2: Nmero de Reynolds para a gua miliQ depositada sobre mica exposta ao campo eltrico

em diferentes taxas de variao..........................................................................................................114

Nomenclatura

Abreviaes

Ab Azospirillum brasiliense

CL catodoluminescncia

DCE dupla camada eltrica

DEF - dieletroforese

EF eletroforese

EOF fluxo eletroosmtico

FTIR espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier

FTIR/ATR espectroscopia de reflectncia total atenuada

Hs Herbaspirillum seropedicae

MEV microscpio eletrnico de varredura

MFA microscopia de fora atmica

MVS microscopia de varredura por sonda mecnica

PALS espalhamento de luz com fase alternada

RSA adsoro randmica sequencial

XPS espectroscopia de fotoeltrons gerados por Raios-X

Lista de smbolos

a raio da partcula (m)

A rea da seo transversal (m2)

A0 amplitude livre (m)

Ar amplitude real (m)

c concentrao das espcies de ons (mol/l)

cp calor especfico (J/gK)

C capacitncia (F)

d distncia da parede do canal (m)

D coeficiente de difuso (m2/s)

e carga do eltron (C)

E vetor campo eltrico (V/m)

F fora (N)

Fws frao revestida (%)

h altura do canal (m)

I corrente eltrica (A)

J densidade de corrente (A/m2)

1/ comprimento de Debye (m-1)

k constante dieltrica do material (C/Vm)

K constante de Boltzmann (J/K)

kcant constante de mola do cantilever (N/m)

K() fator Clausius-Mossotti

L comprimento do canal (m)

L0 comprimento caracterstico (m)

n nmero total de espcies carregadas no sistema

p momento de dipolo (C.m)

P presso (Pa)

PPV presso de vapor (Pa)

Pe permetro (m)

Pd potncia dissipada (W)

q magnitude da carga (C)

Q carga (C)

Qcant fator de qualidade

R distncia de separao entre os dois tomos (m)

Re nmero de Reynolds

Ri resistncia ()

t tempo (s)

tw espessura atribuda para molcula de gua ()

T temperatura absoluta (K)

u vetor velocidade (m/s)

u magnitude da velocidade (m/s)

U potencial de interao (V)

UR umidade relativa (%)

V tenso (V)

wcant frequncia de ressonncia (Hz)

W largura do canal (m)

z valncia do on

Letras gregas

0 permissividade do vcuo (C/Vm)

m permissividade do meio (C/Vm)

ngulo de separao (graus)

s condutncia da superfcie (S)

frequncia do meio aplicada (Hz)

potencial eltrico (V)

mobilidade (m2/Vs)

viscosidade (Pa.s)

densidade de carga

i resistividade (S/m)

f condutividade do meio (S/m)

p condutividade da partcula (S/m)

MW tempo de relaxao da partcula (s)

gradiente

t variao de tempo (s)

ngulo de contato (graus)

variao de fase

potencial zeta (V)

Sumrio

1. Introduo.................................................................................................................................1

1.1. Organizao da tese..............................................................................................................4

2. Reviso bibliogrfica.................................................................................................................6

2.1. Protenas..............................................................................................................................6

2.1.1. Estrutura tridimensional das protenas.......................................................................7

2.1.2. Estrutura tridimensional da protena GlnB-Hs..............................................................8

2.1.3. Propriedades inicas das protenas..............................................................................9

2.1.4. Propriedades inicas da protena GlnB-Hs..................................................................10

2.2. Formao de filmes finos proticos sobre substratos slidos Adsoro de protena..........12

2.3. Efeito do campo eltrico na adsoro de protena...............................................................21

2.3.1. Fluxo eletroosmtico................................................................................................25

2.3.1.1. Escoamentos eletroosmticos em superfcies livres.............................................27

2.3.1.2. Tcnica de monitoramento de corrente...............................................................28

2.3.2. Dieletroforese...........................................................................................................30

2.3.3. Eletroforese..............................................................................................................34

2.4. Cristalizao bidimensional de protenas............................................................................37

2.5. Microscpio de fora atmica.............................................................................................37

2.5.1. Princpio fsico do funcionamento do MFA..............................................................38

2.5.2. Princpio mecnico do funcionamento do MFA........................................................39

2.5.2.1. Modo dinmico..................................................................................................41

2.5.2.2. Imagem da fase..................................................................................................41

3. Objetivos..................................................................................................................................43

3.1. Objetivo geral.....................................................................................................................43

3.1. Objetivos especficos..........................................................................................................43

4. Procedimento experimental..................................................................................................44

4.1. Materiais............................................................................................................................44

4.1.1. Mica muscovita........................................................................................................44

4.1.2. Lamnula siliconizadas..............................................................................................44

4.1.3. Soluo estoque de protena GlnB-Hs........................................................................45

4.1.4. Solues controles....................................................................................................46

4.1.5. Solues para imunodeteco..................................................................................46

4.1.6. Fonte e Multmetro para aplicao de tenso...........................................................46

4.2. Mtodos.............................................................................................................................46

4.2.1. Deposio das solues sobre a mica para aplicao de tenso..................................46

4.2.2. Deposio das solues sobre lamnula siliconizada para aplicao de tenso.............47

4.2.3. Efeito da umidade nos valores de corrente na lamnula siliconizada...........................47

4.2.4. Deteco da protena GlnB-Ab sobre a superfcie da mica..........................................47

4.2.5. Anlise por microscopia de fora atmica (MFA) dos filmes formados sobre a mica e

lamnula siliconizada...........................................................................................................48

4.2.6. Obteno dos grficos de corrente em funo do campo eltrico...............................49

5. Resultados: Efeito do campo eltrico na organizao dos filmes formados sobre a

lamnula siliconizada...................................................................................................................51

5.1. Efeito da umidade relativa do ar nas medidas de corrente eltrica e imagens de MFA........51

5.2. Efeito do campo eltrico sobre as solues controles depositadas na canaleta de

polisiloxano...................................................................................................................................55

5.3. Efeito do campo eltrico sobre as solues de protena GlnB-Hs depositadas na canaleta de

polisiloxano...................................................................................................................................57

6. Discusso: Efeito do campo eltrico na organizao dos filmes formados sobre a

lamnula siliconizada...................................................................................................................60

6.1. Efeito da umidade relativa do ar nas medidas de corrente eltrica e imagens de MFA........60

6.2. Efeito do campo eltrico sobre as solues controles depositadas na canaleta de

polisiloxano...................................................................................................................................68

6.3. Efeito do campo eltrico sobre as solues de protena GlnB-Hs depositadas na canaleta de

polisiloxano...................................................................................................................................75

7. Resultados: Efeito do campo eltrico na organizao dos filmes formados sobre

mica..............................................................................................................................................80

7.1. Efeito do campo eltrico sobre o substrato e na gua miliQ depositada sobre mica............80

7.2. Campo eltrico de 75 kV/m com taxa de variao de 3 V/s.................................................81


7.2.2. Solues de protena GlnB-Hs....................................................................................84

7.3. Campo eltrico de 30 kV/m com taxa de variao de 3 V/s.................................................86



7.4. Campo eltrico de 30 kV/m com taxa de variao de 30 V/s............................................... 90



7.5. Deteco da protena GlnB-Ab sobre a superfcie da mica...................................................94

7.5.1. Controles: superfcie da mica e soluo tampo.........................................................95

7.5.2. Campo eltrico de 75 kV/m com taxa de variao de 3 V/s.........................................96

7.5.3. Campo eltrico de 30 kV/m com taxa de variao de 3 V/s.........................................96

7.5.4. Campo eltrico de 30 kV/m com taxa de variao de 30 V/s.......................................97

8. Discusso: Efeito do campo eltrico na organizao dos filmes formados sobre a

mica..............................................................................................................................................98

8.1. Efeito do campo eltrico sobre o substrato e gua miliQ depositada sobre mica................98

8.2. Grficos de I-E das solues controles e solues de protena GlnB-Hs depositadas sobre

mica.............................................................................................................................................100

8.3. Imagens de microscopia de fora atmica das solues controles e solues de protena

GlnB-Hs sobre mica......................................................................................................................106

8.4. Deteco da protena GlnB-Ab sobre a superfcie da mica.................................................110

9. Concluses.............................................................................................................................117

9.1. Trabalhos futuros..............................................................................................................119

10. Referncia Bibliogrfica......................................................................................................120

Apndice 1. Resumo das amostras preparadas e resultados de corrente em funo do campo

eltrico e imagens de MFA...........................................................................................................129

Apndice 2. Medida de corrente em funo do campo eltrico...................................................131

Apndice 3. Filmes formados sem campo eltrico aplicado........................................................133

1. Introduo

A interao de biomolculas com superfcies slidas determina caractersticas de importncia

fundamental para o desenvolvimento de filmes finos e suas aplicaes em nanotecnologia,

biomateriais e processos biotecnolgicos. As protenas apresentam diversidade estrutural e de

distribuio superficial de cargas o que favorece processos de adeso em substratos slidos. Os

processos de adeso envolvem tanto cintica de ligao quanto rearranjos estruturais de protenas.

Atualmente, vrios estudos procuram medir, prever, controlar e entender a conformao de

protenas, superestrutura e os detalhes cinticos das interaes destas biomolculas com a superfcie

[1, 2, 3, 4].

A funo de uma superfcie revestida com protenas depende das propriedades estruturais

da macromolcula, uma vez que sua funo biolgica esta diretamente ligada a sua estrutura

tridimensional que determinada pela sua sequncia de aminocidos.

A possibilidade de controlar filmes proticos tendo seus componentes adaptados e

otimizados para uma dada aplicao seria uma situao ideal. Na realidade, estamos longe desta

realidade. A complexidade das macromolculas, a influncia dos componentes da soluo de

protena e as caractersticas polares da superfcie slida dificultam o controle no posicionamento

espacial durante o momento da adeso das molculas.

Filmes finos formados pela deposio de soluo de protena GlnB de Herbaspirillum

seropedicae em mica foram caracterizados por MFA e XPS [5]. Na mica a interao da protena GlnB-

Hs fraca e a estrutura dos arranjos supramoleculares formados depende da concentrao de sal

presente na soluo de protena [5]. Alm disso, o NaCl e especialmente o Tris existentes na soluo

de protena limitam a resoluo e distino de arranjos supramoleculares na superfcie da mica,

podendo influenciar na interpretao dos resultados [5].

A superfcie do filme protico formado pela deposio da soluo de protenas em diferentes

concentraes sobre mica depositada por spin coating foi analisada por espectroscopia de

infravermelho [dados ainda no publicados]. Os grficos mostram a limitao da tcnica de preparo

na formao de filmes de protena GlnB-Hs, devido a fraca adeso destas protenas no substrato

[dados ainda no publicados]. Alm disso, os resultados mostram que os componentes da soluo de

protena (Tris-HCl e NaCl) tem maior afinidade com a superfcie da mica do que prpria GlnB-Hs.

Substratos diferentes foram usados na formao do filme de protena GlnB-Hs com

deposio por drop deposition para estudar a influncia do substrato na organizao de possveis

auto-arranjos dos componentes da soluo de protena por MFA [dados no publicados]. Superfcies

de mica, grafite piroltico e lamnula de vidro siliconizada foram utilizadas devido s diferentes

1

caractersticas polares e de molhabilidade. Pelas imagens de MFA observou-se arranjos lineares

sobre os substratos de grafite e lamnula siliconizada [dados ainda no publicados]. A clivagem em

diferentes planos do grafite e as cadeias polimricas do silicone podem ser a causa da organizao

linear das protenas observadas sobre estes substratos.

Uma maneira de controlar a homogeneidade espacial, orientao e razo de crescimento de

camadas de protenas atravs da aplicao de um campo eltrico externo [6, 7, 8, 9]. Muitas

protenas alinham e migram na presena de um campo eltrico por apresentarem carga lquida e

caractersticas polares.

A dificuldade de medir simultaneamente os mecanismos de adsoro e os efeitos de um

campo eltrico externo atuando sobre protenas em uma interface slida faz com que o interesse no

assunto aumente o nmero de pesquisas com diversas tcnicas, contribuindo para elucidar a adeso

de biomolculas em slidos [6, 7, 8, 9, 10].

Estudos anteriores investigaram a adsoro de protena em uma superfcie slida sob a

influncia de um campo eltrico utilizando um dos eletrodos da clula eletroqumica para formao

do filme e, assim, medir a influncia da quantidade de material adsorvido e espessura de camada [6],

orientao [10] e regulao de ligao entre antgeno-anticorpo [11].

Neste trabalho a migrao da soluo de protena GlnB-Hs sob efeito de campo eltrico

utilizado como sistema alternativo para controlar arranjos formados na interface lquido-superfcie

slida. Um volume de soluo de protena GlnB-Hs depositado sobre um substrato slido (mica e

lamnula de vidro siliconizada) e submetida a campos eltricos variados. Os filmes obtidos podem ser

usados como base para nucleao de cristais de protena e estudos de interao entre as protenas

da famlia PII.

A protena GlnB faz parte da famlia do tipo PII [12]. Esta biomolcula transdutora de sinal

envolvida na regulao da atividade das protenas relacionadas com a utilizao de fonte de

nitrognio [12, 13]. A protena GlnB-Hs globular, trimrica (36 kDa) e sua estrutura tridimensional

foi determinada por difrao de Raios-X [14].

As curvas de corrente em funo do campo eltrico aplicado foram analisadas procurando-se

entender a formao do filme resultante de diversos fenmenos como a migrao dos ons da

soluo, polarizao e arraste da protena e a evaporao da gua de soluo. A morfologia destes

filmes foi avaliada por microscopia de fora atmica (MFA) para caracterizao das possveis

estruturas supramoleculares altamente organizadas formadas.

A influncia do campo eltrico externo na organizao dos componentes da soluo de

protena na formao dos filmes foram avaliados em diferentes condies, como valor mximo de

campo eltrico aplicado, taxa de variao do campo eltrico, concentrao e estado da protena

GlnB-Hs na soluo e caracterstica hidrofbica dos substratos.

2

Modificaes feitas no protocolo de imunodeteco, mtodo usado em bioqumica e biologia

molecular para deteco especfica de protenas em uma dada amostra, permitiu a verificao da

migrao da protena GlnB-Hs diretamente sobre a superfcie da mica.

Com este estudo pretende-se contribuir para o entendimento dos fatores envolvidos na

formao de filmes proticos, suas estruturas supramoleculares e verificar se estes arranjos

supramoleculares podem ser organizados de forma a facilitar a cristalizao de protenas, para

estudar a sua estrutura e, consequentemente, a sua funo.

3

1.1. Organizao da tese

A tese esta organizada como se segue:

No Captulo 3 (Reviso Bibliogrfica) faz-se uma reviso geral sobre os efeitos do campo

eltrico sobre partculas carregadas em soluo, em especfico sobre protenas. Primeiramente, uma

viso geral sobre estruturas tridimensionais de protenas, em particular a estrutura tridimensinal e a

distribuio de cargas na superfcie da protena GlnB-Hs. Segue-se uma introduo sobre adsoro de

protenas em substratos slidos, os aspectos cruciais que devem ser levados em considerao no

preparo do filme e interao da soluo com as superfcies hidroflicas e hidrofbicas. A influncia do

campo eltrico sobre os componentes da soluo e a introduo de conceitos relacionados com

eletrocintica, como eletroosmose, dieletroforese e eletroforese tambm so discutidas neste

captulo. Ainda so descritos os princpios da tcnica de microscopia de fora atmica (MFA) usada

para analisar os filmes obtidos pela deposio da soluo de protena GlnB-Hs em substratos slidos

expostas a um campo eltrico externo. Diversos conceitos apresentados neste captulo tm o

objetivo de situar o leitor nas diversas tecnologias disponveis no uso de fluidos para a formao de

filmes finos.

O Captulo 4 (Procedimento Experimental) descreve os materiais utilizados e os mtodos

para aplicao do campo eltrico nas solues. As diferentes condies de deposio e arranjo

experimental e valores de campo aplicados para a obteno de filmes proticos altamente

organizados sobre lamnula siliconizada e mica.

Os Captulos 5 e 6 (Resultados e Discusso, respectivamente) so dedicados aos resultados e

discusso dos filmes de protena GlnB-Hs obtidos sobre a lamnula siliconizada quando expostos a um

campo mximo de 75 kV/m. No Captulo 6 descrita a caracterizao da superfcie da lamnula

siliconizada, apresentada a relao da umidade relativa do ar com as medidas de corrente e a

interferncia do substrato na organizao do filme protico. Neste captulo descreve-se ainda a

interpretao das curvas de corrente por campo eltrico, correspondentes s solues e a influncia

dos componentes da soluo tampo. A explicao da organizao das protenas observada por

imagens de MFA complementa esta parte do trabalho.

No Captulo 7 e 8 so apresentados os resultados e discusses, respectivamente, dos filmes

organizados de protena GlnB-Hs expostos a campos eltricos de 75 e 30 kV/m, em diferentes taxas

de variao do campo. As solues controle e de protenas foram depositadas paralelamente ao polo

negativo (por conveno nesta tese chamado de anodo). As medidas de curvas de corrente fornecem

informaes sobre a interao das partculas com o substrato, o nmero de portadores de carga e a

sua mobilidade sobre a superfcie da mica sob um campo eltrico aplicado. As imagens de MFA

4

mostram se h transporte de massa via eletroforese e dieletroforese e se as protenas orientam-se.

No Captulo 8 ainda discutida a eficincia da deteco direta da protena GlnB-Hs adsorvida sobre

mica e diferenciao desta das molculas de Tris em relao a tcnicas como espectroscopia no

infravermelho e por catodoluminescncia.

O nono captulo (Concluso) dedicado s concluses obtidas das imagens de MFA, das

curvas de corrente por campo eltrico e a deteco da protena GlnB-Hs por interao antgeno-

anticorpo na superfcie da mica, alm da sugesto de aplicabilidade para os filmes altamente

organizados obtidos.

5

2. Reviso Bibliogrfica

2.1. Protenas

Protenas so cadeias polimricas flexveis de alto peso molecular que participam de todos os

processos celulares. A multiplicidade de funes desempenhadas pelas protenas resulta do grande

nmero de diferentes formas tridimensionais que estas podem assumir j que a sua funo

determinada pela estrutura [15].

Quimicamente, as protenas so polmeros orgnicos formada pela ligao covalente de

aminocidos (ligao peptdica). Os aminocidos so formados: do grupo carboxila (-COOH) do

primeiro aminocido e com o grupo amina (R-NH2-) do segundo aminocido atravs de ligaes

covalentes (ligaes peptdicas) com a perda de uma molcula de gua, formando o chamado

esqueleto polipeptdico (Figura 2.1).

Normalmente, so encontrados 20 tipos de aminocidos nas protenas e sua sequncia

definida pelo cdigo gentico. Cada aminocido possui uma cadeia lateral diferente ligada ao

carbono .

As cadeias laterais (R1 e R2 da Figura 2.1) conferem a cada aminocido suas caractersticas

qumicas prprias. As cadeias laterais so formadas por aminocidos apolares e polares, carregados

positiva ou negativamente.

Figura 2.1: Unidade bsica da protena formando o esqueleto polipeptdico. R1 e R2 simbolizam o radical

[Adaptado de 15].

A versatilidade qumica que os 20 aminocidos comuns possuem de importncia vital para

a funo das protenas. Assim, alm dos 20 aminocidos padres cada qual com diferentes

propriedades qumicas, os resduos na protena podem, tambm, ser alterados quimicamente por

modificaes ps-traducionais (eventos de processamento covalente que mudam as propriedades

das protenas por clivagem proteoltica ou por adio de um grupo qumico a um ou mais

aminocidos).

6

2.1.1. Estrutura tridimensional das protenas

As protenas podem ter quatro nveis estruturais:

1) Estrutura primria: nvel estrutural mais simples e importante formado pela sequncia de

aminocidos ligados covalentemente ao longo da cadeia polipeptdica que originar todo o arranjo

espacial da molcula.

2) Estrutura secundria: dado pelo arranjo espacial de aminocidos prximos na sequncia

primria da protena, devido a rotao das ligaes entre os carbonos dos aminocidos e seus

agrupamentos amina e carboxila.

As estruturas secundrias mais frequentes so: as -hlice e as folhas- (Figura 2.2).

Nas -hlice o esqueleto polipeptdico est estreitamente enrolado ao longo do maior eixo

da molcula e os grupos R dos resduos de aminocido projetam-se para fora do esqueleto helicoidal

em direo perpendicular ao eixo da hlice (Figura 2.2). A estabilizao desta estrutura ocorre pelas

ligaes de ponte de hidrognio entre o grupamento CO de cada aminocido, com o grupamento NH

do aminocido que est situado a quatro unidades adiante na sequncia linear, sendo que todos os

grupamentos NH e CO formam pontes de hidrognio.

A outra estrutura frequente a folha-, em que a cadeia polipeptdica forma uma estrutura

em zig-zag em que as cadeias laterais de aminocidos distantes de dois resduos interagem (Figura

2.2). A estrutura estabilizada por pontes de hidrognio formadas entre o NH de uma fita com o

CO de outra fita , formando a estrutura em folha. Os grupos R (cadeia lateral) alternam-se para cima

e para baixo ao longo do esqueleto estendido.

7

Figura 2.2: Desenho esquemtico da -hlice (direita) e da folha- anti-paralela (esquerda). A primeira

representao mostra todos os tomos no esqueleto polipeptdico, com as cadeias laterais representadas pela

cor roxa, enquanto que o segundo desenho mostra os smbolos usualmente utilizados para representar a alfa-

hlice e a folha em modelos esquemticos de protenas. [Adaptado de 15].

3) Estrutura terciria: resulta do enovelamento das estruturas secundrias. Neste caso,

aminocidos distantes na cadeia polipeptdica passam a interagir. A estrutura estabilizada por

interaes fracas (pontes de hidrognio, interaes eletrostticas e hidrofbicas) e em alguns casos

por interaes fortes (ligaes covalente), por exemplo, as pontes de sulfeto.

Se a protena monomrica, ou seja, s apresenta uma cadeia polipeptdica a estrutura

terciria corresponde ao maior nvel estrutural da protena e a estrutura terciria confere a estas

protenas sua atividade biolgica.

4) Estruturas quartenrias: quando as protenas apresentam duas ou mais cadeias

polipeptdicas a estrutura quartenria o ltimo nvel estrutural da protena. Esta estrutura

caracterizada pela interao de cadeias laterias de aminocidos de cadeias polipeptdicas diferentes.

2.1.2. Estrutura tridimensional da protena GlnB-Hs

A protena GlnB uma protena globular que faz parte da famlia de protenas do tipo PII

[12].

8

As protenas da famlia PII so encontradas em bactrias, arqueas e plantas e auxiliam na

coordenao do metabolismo de nitrognio, carbono e energia controlando a atividade de protenas

e enzimas envolvidas nas respostas celulares a estes sinais.

GlnB uma protena transdutora de sinal envolvida na regulao da atividade das protenas

relacionadas com a utilizao de fontes alternativas de nitrognio [12] em muitas bactrias, incluindo

a Herbaspirillum seropedicae [13].

H. seropedicae uma bactria gram-negativa, diazotrfica que foi isolada da rizosfera de

gramneas, razes de milho, sorgo e arroz e de caules e folhas de diferentes culturas de cana-de-

acar, bananeira e abacaxizeiro [16, 17, 18].

Sua estrutura tridimensional foi determinada por difrao de Raios-X [14]. As protenas GlnB-

Hs so homotrmeros de 36 kDa e cada monmero formado por um ncleo que contm um duplo

motivo que bem conservado entre as protena da famlia PII (Figura 2.3).

As maiores diferenas estruturais so observadas nas 3 alas que se estendem a partir deste

ncleo: as alas T, B e C. A ala B contm o motivo Walker A (GXGKX) que responsvel pela ligao

a nucleotdeos (Fig. 2.3). A ala T, em geral, contm o resduo Tyr51 ou Ser49 que em alguns

organismos, podem sofrer modificaes ps-traducionais por uridililao ou fosforilao,

respectivamente. A ala C-terminal que pode apresentar estrutura do tipo -turn ou hlice 310.

Figura 2.3: Diagrama do trmero da protena GlnB de H. seropedicae.

As folhas do motivo esto alinhadas no interior da cavidade central e as -hlices

situam-se na periferia da protena. O interior da cavidade central hidrofbico. Entre os monmeros

formam-se trs cavidades laterais que so constitudas majoritariamente por aminocidos

hidroflicos.

9

2.1.3. Propriedades inicas das protenas

As propriedades inicas das protenas, determinadas primeiramente pelas cadeias laterais dos

aminocidos, so dependentes do pH e da fora inica da soluo que contm a protena.

Quando h equilbrio entre as cargas negativas e positivas dos grupamentos inicos de um

aminocido ou de uma protena, a carga lquida da molcula zero e o valor de pH em que isso

acontece conhecido como ponto isoeltrico, pI. Abaixo ou acima do pI, as protenas possuem

cargas positivas ou negativas na superfcie, interagindo eletrostaticamente uma com as outras.

A adio de sal na soluo comprime a camada de solvatao das protenas e diminui a

interao entre as mesmas. Conforme a concentrao de sal na soluo vai aumentando, mais

molculas do solvente associam-se aos ons da soluo. Como resultado, menos solvente fica

disponvel para participar da camada de solvatao das protenas, expondo padres hidrofbicos na

superfcie da protena.

Em uma concentrao baixa de sal os biopolmeros estaro em um estado mais relaxado e

expandido na soluo, fornecendo maior potencial de ligao para os stios [19]. Conforme a

concentrao inica aumenta o polmero fica mais compacto e comprimido, formando um denso

ncleo e fornecendo uma menor possibilidade de interao [19]. Assim, quanto mais condensada a

estrutura da biomolcula em alta concentrao inica mais fraca a ligao com a superfcie, devido a

menores foras de adeso com o substrato.

2.1.4. Propriedades inicas da protena GlnB-Hs

A face inferior do trmero, por conveno, a face que possui a volta C e contm resduos

carregados negativamente (Figura 2.4-a e 2.4-d). A outra face (face superior) da protena

positivamente carregada (Figura 2.4-c e 2.4-f). As cargas positivas so localizadas na face lateral da

protena, ao redor da volta B (Figura 2.4-b e 2.4-e).

10

Figura 2.4: Estado de cargas (a-c) e superfcie molecular (d-f) da protena GlnB-Hs. a) e d) face inferior, b) e e)

face lateral e c) e f) face superior [Adaptado de 20]. Imagem e conveno de cores (RASMOL).

As cargas de valor mais baixo (negativa) passam do vermelho at o azul, valor mais alto

(positiva) (RASMOL) [20]. O azul claro corresponde volta B, onde esto concentradas as cargas

positivas.

A superfcie molecular da GlnB-Hs (Figura 2.4-d, 2.4-e e 2.4-f) mostra a distribuio de cargas

na superfcie do trmero, na qual os resduos cidos da cadeia lateral esto representados em

vermelho, os resduos bsicos em azul e os demais em branco. Os resduos hidrofbicos esto

situados preferencialmente no interior da protena (branco), entre as folhas e nas -hlices, e os

resduos polares encontram-se na superfcie da protena. A face inferior apresenta uma maior

concentrao de cargas negativas, a face superior um equilbrio na distribuio de cargas e na lateral

observa-se uma maior quantidade de cargas positivas, devido presena da volta B.

Desta maneira, as protenas apresentam diversidade estrutural e de distribuio superficial

de cargas o que favorece processos de adeso em substratos slidos. Os processos de adeso

envolvem tanto cintica de ligao quanto rearranjos estruturais de protenas. Atualmente, vrios

estudos procuram medir, prever, controlar e entender a conformao de protenas, superestrutura e

os detalhes cinticos das interaes destas biomolculas com a superfcie [1, 2, 3, 4].

11

2.2. Formao de filmes finos proticos sobre substratos slidos Adsoro de protenas

Adeso de protenas em superfcies realmente um fenmeno comum, em qualquer interface

slida que as protenas entrem em contato muito provavelmente estas aderiro. O estudo da

adsoro de protena tem como objetivo primrio entender o comportamento destas biomolculas

depositadas na superfcie. Assim, os dados experimentais contem tipicamente informaes

macroscpicas resultante do comportamento individual de uma ou vrias protenas. Neste ponto o

desenvolvimento de modelos que descrevam matematicamente um dado experimental pode

desvendar ou confirmar detalhes do processo de adsoro. Entretanto, modelos so restritos aos

limites experimentais nos quais suas hipteses podem ser testadas e a generalizao para outros

sistemas deve ser feitas com cautela.

Muitas substncias adquirem uma superfcie carregada eletricamente quando colocadas em

contato com um meio aquoso [8, 9, 21, 22]. A estabilidade da disperso coloidal sensvel a adio

de eletrlitos e a superfcie carregada das partculas coloidais. As superfcies podem ficar carregadas

eletricamente por meio de vrios mecanismos, tais como [9]:

1) Ionizao de grupos de superfcie. Dissociao de grupos cidos e bsicos de xidos

resultando em cargas negativas e positivas, respectivamente;

2) Dissoluo diferencial dos ons de superfcie de cristais moderadamente solveis. Por

exemplo, dissoluo preferencial de ons de Ag em relao a halogenetos de prata;

3) Substituio isomrfica. Argilas podem trocar ons adsorvidos ou estruturais com um de

menor valncia, produzindo uma superfcie negativamente carregada;

4) Superfcies de cristais carregados. Pode acontecer quando um cristal quebrado e

superfcies com diferentes propriedades so expostas;

5) Adsoro especfica de ons. Adeso especfica de ons de surfactantes.

A presena da eletroneutralidade intuitiva, pois no h distribuio espacial preferencial

dos ons na soluo. O movimento Browniano suficiente para criar uma homogeneidade na

distribuio dos ons na soluo [9].

Entretanto, quando a superfcie colocada em contato com o lquido que possui propriedades

polares e na ausncia de reaes qumicas, uma superfcie carregada se formar [8, 9, 21]. Este

aparecimento do potencial eletrosttico pode ocorrer devido a diferentes mecanismos qumicos,

como a ionizao dos grupos da superfcie e a adsoro de ons especficos, por exemplo [9].

12

Esta superfcie carregada afeta os ons na soluo. Os ons de cargas opostas a da superfcie

sero atrados, enquanto que os de mesma carga sero repelidos. Este fenmeno ocorre para a

neutralizao da superfcie carregada. A regio prxima a superfcie slida na qual h a redistribuio

de ons livres na soluo devido aos ons na superfcie d origem a chamada dupla camada eltrica

(DCE) [9, 23, 24, 25]. A Figura 2.5 apresenta um esquema da DCE.

Figura 2.5: Desenho esquemtico da dupla camada eltrica formada na interface da superfcie carregada em

contato com um lquido inico e a correspondente distribuio do potencial eltrico vs a distncia d da

parede. s representa o potencial negativo da superfcie, i corresponde camada interna composta por co- e

contraons e d referente camada externa composta somente por contraons hidratados. A distncia

caracterstica da camada de difuso dada pelo comprimento de Debye (1/k) [Adaptado de 25].

Como representado na Figura 2.5, a carga da superfcie balanceada pelo acmulo de um

nmero igual de cargas opostas que podem estar tanto ligadas fisicamente superfcie e imveis

para formar a chamada camada de Stern (camada interna) como podem estar presentes na

13

atmosfera difusa acima da superfcie, com os ons em rpidos movimentos para dentro e fora da

camada de Stern, conhecida como camada de difuso [9, 21,23].

Os ons da camada de difuso podem mover-se para dentro e fora da dupla camada eltrica

para a soluo. A camada difusa expande-se a uma distncia na ordem do comprimento de Debye

(1/), que depende somente das propriedades da soluo eletroltica e no das caractersticas da

superfcie carregada [26]

= ( ci e

2 zi2

m 0KTi )

1/2 (2.1)

em que ci a concentrao de ons na soluo, e a carga do eltron, z a valncia do on, 0 e m

so a permissividade dieltrica do vcuo e do meio,respectivamente, K a constante de Boltzmann

e T a temperatura do sistema. O potencial atravs da camada difusa decresce exponencialmente.

Desta forma, a capacidade de um on em determinar a espessura da dupla camada eltrica

depende, principalmente, de sua valncia e de seu tamanho (que influencia em sua polarizabilidade e

facilidade em ser hidratado).

H um equilbrio da distribuio inica com a camada difusa, permitindo o uso da

distribuio de Boltzmann para relacionar a concentrao inica com o potencial eletrosttico [9]. A

importncia do potencial eletrosttico ao alcance da DCE vem da fora de corpo, que nesta escala

no pode ser negligenciado. Para achar a fora de corpo efetiva exercida pela DCE, a distribuio dos

ons na regio da dupla camada deve ser encontrada [21]. Sabendo-se que a distribuio inica de

uma certa espcie segue a distribuio de Boltzmann e dada por [9, 21]:

ci = ci exp(zi e

KT) (2.2)

em que ci a concentrao inica das espcies i, ci a concentrao inica no estado neutro

( = 0), zi a valncia dos ons, e a carga do eltron, o potencial eletrosttico da distribuio

da parede, K a constante de Boltzmann e T a temperatura absoluta.

A densidade de carga inica i afetada somente pelas cargas da parede dada por [9, 21]:

i = 2. e. zici . sinh(zi e

KT) (2.3).

A distribuio do potencial eletrosttico da DCE pode ser achada atravs da relao de

Poisson

d2

dy 2=

i

m (2.4)

14

substituindo a eq. (2.3) na (2.4) e para uma fina DCE o termo hiperblico fica reduzido ao primeiro

termo da expanso de Taylor (aproximao de Debye-Hckel), ento temos que [9, 21]

d2

dy 2= k. (2.5).

Uma propriedade importante da DCE o potencial eletrosttico no plano de cisalhamento

imaginrio, chamado de potencial zeta, denotado por . Este corresponde ao plano que separa as

parcelas de fluido que se movem em direes opostas em fenmenos fsicos da camada fixa (camada

de Stern) [8, 25].

Uma interface formada entre duas fases distintas, geralmente, possuem uma energia de

superfcie maior que a fase da soluo. Como resultado, esta interface apta para ser

termodinamicamente estabilizada adsorvendo qualquer substncia que difira das molculas do

solvente.

Como as protenas so, geralmente, molculas carregadas em solues aquosas, a presena

destas duplas camadas eltricas com seus campos eltricos associados influenciar na interao com

o substrato [23].

As condies nas quais os experimentos de adsoro so realizados possuem uma influncia

decisiva no comportamento e arranjo final da protena aderida.

A construo da interface substrato-protena deve respeitar as exigncias: a imobilizao na

superfcie da protena com estrutura tridimensional estvel e preparo da amostra mantendo o

ambiente apropriado para evitar ou minimizar mudanas conformacionais [27, 28].

Sendo assim, fatores como propriedades das protenas, as caractersticas da superfcie do

substrato, a preparao da soluo de protena (e.g. concentrao de molculas, pH, concentrao

inica, surfactantes), mtodo de deposio da soluo, condies ambientes, tais como temperatura

e umidade e os limites de medida do meio de anlise do filme obtido devem ser levados em

considerao no preparo de um filme protico.

Parmetros externos como temperatura, pH, concentrao inica e composio do tampo

determinam o estado de equilbrio e a cintica de adsoro das protenas atravs do controle de

cargas na soluo que podem modificar o estado de equilbrio estrutural da protena [29, 30, 31]. A

estabilidade da disperso coloidal sensvel adio de eletrlitos e a carga de superfcie das

partculas dispersas.

Com relao s propriedades das protenas, a carga, dimenses, estabilidade da estrutura,

composio de aminocidos e conformao so fatores que podem afetar a quantidade adsorvida

[30, 31]. A estabilidade estrutural da protena de particular importncia devido possibilidade de

15

existir um ou mais estados de adsoro, diferindo em energia de adsoro. A complexa estrutura

pode ser decomposta em domnios individuais exibindo propriedades especficas como

carregado/no carregado ou polar/no polar [30].

Interaes protena/superfcie so influenciadas pelas propriedades da biomolcula e da

superfcie do substrato. Caractersticas da superfcie incluindo a energia de superfcie, polaridade,

carga e morfologia devem ser levadas em considerao [29, 30]. A escolha do substrato

determinada pelo contexto do projeto cientfico e pela tcnica experimental utilizada, tais como a

transparncia tica, condutividade eltrica ou planicidade da superfcie. Comumente utilizada a

modificao qumica do substrato para ampliar seu uso em determinadas tcnicas [29, 30].

Apesar da espessura da camada adsorvida ser geralmente considerada igual a uma

monocamada, o detalhe morfolgico das estruturas formadas depende do mtodo de deposio. Os

mtodos de deposio variam em tempo de incubao, tempo de evaporao do solvente e difuso

molecular que podem induzir modificaes no filme [29].

A chegada da protena na interface direcionada por difuso, interaes hidrofbicas

eletrostticas, ganho de entropia das molculas do solvente ou pela modificao da concentrao de

ons na soluo [28, 30]. Em contato com a superfcie do slido os componentes da soluo de

protena, na ausncia de reaes qumicas, formaro uma superfcie carregada e esttica resultante

de diferentes mecanismos qumicos, tais como ionizao de grupos de superfcie, adsoro de ons

especficos na superfcie e do movimento aleatrio das molculas [23].

O modo mais simples de fixar uma protena na superfcie atravs da adsoro, em que foras

atrativas fixam as molculas na superfcie [32]. Pode existir uma grande variedade de foras fsicas

atuantes na interface protena-substrato durante a adsoro, tais como foras eletrostticas, foras

capilares, interaes hidrofbicas ou polares, foras de van der Waals, foras Coulombianas, foras

cido-base de Lewis, entropia conformacional e hidratao [2, 32, 33].

Na adsoro, geralmente, h falta de especificidade, estequiometria e fora direcional das

ligaes covalentes [33]. Pensando desta maneira, os tomos continuam com suas distribuies de

cargas inalteradas, apenas com uma perturbao, e mesmo assim so fortes o suficiente para manter

arranjos atmicos e moleculares estveis em slidos e lquidos em temperatura ambiente [33].

Protenas so molculas complexas e assimtricas, no se comportam como partculas rgidas

simtricas que adsorvem/desorvem da interface. Quando a forma da protena estimada retangular

com dimenses moleculares de a x b x c, geralmente so considerados dois tipos de configurao

para a molcula adsorvida, i. e., uma atravs do eixo longo (unio final com final) e outra pelo eixo

menor (unio lado-a-lado) perpendicular a superfcie (Figura 2.6).

16

Figura 2.6: Diagrama das possveis orientaes de adsoro para uma protena retangular de dimenses a x b x

c em relao s demais protenas.

Protenas podem adsorver em duas ou mais orientaes distintas. Uma simplificao e uma

reviso esquemtica de alguns modelos cinticos mais importantes desenvolvidos esta presente na

figura 2.7.

Figura 2.7: Resumo dos modelos cinticos de adsoro. Um desenho esquemtico de cada mecanismo de

adsoro [Adaptado de 30].

O modelo mais simples de adsoro o de Langmuir que leva em considerao a adsoro e

desoro de partculas em stios distintos da superfcie (Fig. 2.7-A) [34, 35]. Uma das maiores

desvantagens do modelo de Langmuir foi sanada pelo desenvolvimento do modelo de adsoro

randmica sequencial (random sequencial adsorption, RSA) que leva em considerao a adsoro das

protenas da soluo em stios de ligao aleatrios com proibio de um nmero de stios por

ocupao ou por restrio da vizinhana (Fig. 2.7-B) [36, 37].

17

McGuire et. al 1995 [38] propuseram um modelo de dois estados no qual as protenas

poderiam adsorver em um estado reversvel ou irreversvel na superfcie, chamado de modelo de

transio (Fig. 2.7-C). Dois mecanismos de adsoro so concebveis: um em que todas as protenas

devem inicialmente adsorver em um estado reversvel e pode subsequentemente mudar para um

estado irreversvel. O outro uma adsoro paralela das protenas em ambos os estados.

Uma extenso do modelo de transio foi proposta por Szllsi et al. 2004 [39] pela

introduo de um nmero indefinido de diferentes estados que a protena pode adsorver,

aumentando a afinidade com a superfcie (Fig. 2.7-D). A transio de estados entre molculas

vizinhas na superfcie permitida, superando a limitao que somente duas conformaes distintas

de protena so possveis.

O modelo desenvolvido Wahlgren e Elofsson implementa explicitamente a interao lateral

entre as protenas adsorvidas (Fig. 2.7-E) [40]. O modelo inclui a adsoro de dois tipos de

monmeros com diferentes resistncias de desoro e a adsoro de dmeros que podem deslocar

monmeros pr-adsorvidos na superfcie. A transio dos monmeros da soluo e aderidos so

linearmente dependentes da concentrao de dmeros presentes no substrato.

Wertz e Santore apresentaram dois modelos simples denominados de modelo de

deslocamento e rolamento (displacement and rollover model) que pode explicar tanto o efeito de

saturao que frequentemente ocorre na cintica de adsoro de protenas (Fig. 2.7-F) [34]. O

modelo de deslocamento a princpio anlogo ao efeito Vroman (relacionado com o tamanho das

protenas, as de menor peso molecular e de menor superfcie ativa adsorvem antes), exceto que s

h uma espcie de protena. Esta protena adsorvida rpida e fracamente superfcie na unio final

com final e, lentamente vai sendo adsorvida mais fortemente com a lateral. Como consequncia, no

estado de no equilbrio (inicial), a superfcie esta revestida com protenas unidas pelas

extremidades. A longo prazo, as protenas unidas lado-a-lado sero predominantes na superfcie,

conforme a sua afinidade com a superfcie aumenta e sua taxa de desoro diminui.

Em contraste com o modelo de deslocamento, o modelo de rolamento permite a transio

de protenas adsorvidas unidas pelas extremidades para aquelas unidas lado-a-lado, sendo que a

adsoro direta pela lateral no possvel [34].

Um modelo que implementa elementos de praticamente todos os modelos acima foi

desenvolvido por Rabe el al. 2007 [41]. O modelo contm 3 tipos diferentes de estados adsorvidos,

um estado inicial irreversvel, um estado intermediria reversvel e um final irreversvel (Fig. 2.7-G).

Inicialmente, enquanto a superfcie esta vazia ou parcialmente coberta, as protenas na soluo

adsorvem na superfcie exclusivamente pelo estado irreversvel. A transio entre o estado inicial e

intermedirio um resultado da unio lado-a-lado entre as protenas e acontece quando um

revestimento crtico da superfcie atingido. Protenas no estado intermedirio passam por mais

18

uma transio at o estado final. Esta transio muito mais lenta e envolve algum rearranjo

conformacional. O revestimento dependente das primeiras transies implica que um grande

nmero de protenas adsorvidas abruptamente muda sua afinidade com a superfcie de irreversvel

para reversvel.

O modelo proposto por Minton descreve o crescimento dos agregados bidimensionais de

protena na superfcie (Fig. 2.7-H) [42]. Neste modelo cada ligao de i-mero (i = mono, d, tri, etc)

com a superfcie tem a tendncia especfica de atrair mais protenas, aumentando os agregados. As

protenas so adsorvidas como espcies individuais na superfcie, as quais podem difundir e unir-se a

agregados pr-existentes ou podem se depositar diretamente na borda do agregado bidimensional.

Mais tarde, Rabe et al. 2008 [43] usaram as ideais chaves de Minton em um novo e

simplificado modelo de rastreamento (Fig. 2.7-I). Foi sugerido que a aproximao das protenas da

soluo so atradas verticalmente para a superfcie devido sobreposio das foras eletrostticas

das protenas pr-adsorvidas na superfcie. Na direo lateral para a superfcie, entretanto, a

distribuio das cargas das protenas pr-adsorvidas e das protenas que esto sendo adsorvidas leva

a uma repulso. A soma de todas as interaes eletrostticas leva a uma adsoro guiada pelas

outras molculas j adsorvidas. Este mecanismo necessariamente leva a uma formao de reas que

contm uma maior e menor densidade de molculas.

A adsoro de protenas em superfcies hidroflicas neutras (Figura 2.8) tende a ser

relativamente fraca, enquanto que adsoro de protenas em superfcies hidrofbicas forte e

parcialmente irreversvel [44]. Adsoro em superfcies carregadas depende da carga da protena, o

pH e a concentrao inica da solu

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