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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR
CAMILA BEZERRA NOBRE
CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA E EFEITO SOBRE BACTÉRIAS ORAIS
DE UMA LECTINA DE SEMENTES DE Andira surinamensis (Bondt)
Splitg. ex Amshoff
FORTALEZA
2012
CAMILA BEZERRA NOBRE
CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA E EFEITO SOBRE BACTÉRIAS ORAIS
DE UMA LECTINA DE SEMENTES DE Andira surinamensis (Bondt)
Splitg. ex Amshoff
Dissertação de Mestrado submetida à
Coordenação do Curso de Pós Graduação em
Bioquímica da Universidade Federal do Ceará
como requisito parcial para obtenção do grau
de Mestre em Bioquímica.
Área de concentração: Bioquímica Vegetal
Orientador: Prof. Dr. Benildo Sousa Cavada
Co-orientador (a): Profa. Dra. Kyria Santiago
do Nascimento
FORTALEZA
2012
CAMILA BEZERRA NOBRE
CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA E EFEITO SOBRE BACTÉRIAS ORAIS
DE UMA LECTINA DE SEMENTES DE Andira surinamensis (Bondt)
Splitg. ex Amshoff
Dissertação submetida à coordenação do
Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
da Universidade Federal do Ceará como
requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre em Bioquímica.
Aprovado em ___/___/___
BANCA EXAMINADORA
______________________________________________________________________
Prof. Dr Benildo Sousa Cavada (Orientador)
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular
Universidade Federal do Ceará
______________________________________________________________________
Profa. Dra. Kyria Santiago do Nascimento (Co-orientadora)
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular
Universidade Federal do Ceará
______________________________________________________________________
Profa. Dra. Beatriz Tupinambá Freitas (Examinadora)
Universidade Federal de Sergipe
A Deus,
A meus pais, por todo apoio, amor e
dedicação.
Dedico
AGRADECIMENTOS
A Deus, pelo dom da vida e por ter me concedido saúde, paz, determinação e
coragem para que eu prosseguisse firme na realização desse trabalho.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Benildo Sousa Cavada, por ter me recebido no seu
laboratório, antes mesmo que eu fosse mestranda, por ter acreditado no meu trabalho e por
todo apoio e incentivo nesses anos que estive no BioMol-Lab.
À minha co-orientadora, Profa. Dra. Kyria Santiago do Nascimento, pela co-
orientação no desenvolvimento desse trabalho e pelos valiosos conhecimentos transmitidos
durante o mestrado. Também não posso deixar de agradecer por toda dedicação, amizade e
carinho desde que cheguei no laboratório.
Ao Prof. Dr. Celso Shiniti Nagano, pelos conhecimentos transmitidos e por ter
disponibilizado a estrutura do seu laboratório para execução de parte desse trabalho.
Ao Prof. Dr. Bruno Anderson Matias da Rocha, pelos ensinamentos e por todo
carinho e amizade desde a época da graduação.
À Profa. Dra. Beatriz Tupinambá Freitas, por ter me iniciado nesse vasto mundo
da pesquisa e por todo carinho e atenção que sempre teve comigo.
Ao Prof. Dr. Rodrigo Maranguape, pela atenção e presteza que sempre me
dispensou.
A todos que compõe o Laboratório Integrado de Biomoléculas (LIBS) da UFC-
Campus de Sobral, especialmente ao Prof. Dr. Edson Holanda Teixeira, pela disponibilidade
na utilização da estrutura do laboratório e aos amigos Victor, Rafaela e Érica por todo auxílio,
carinho, amizade e atenção quando estive em Sobral.
Aos Professores do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular-UFC, por
todos os ensinamentos transmitidos durante o curso.
A Capes pelo auxílio finaceiro.
À Mayara Torquato, por ter sido peça fundamental para realização desse trabalho,
sempre tão presente e dedicada em enfrentar os desafios ao meu lado e pela sincera amizade
que conseguimos construir.
Aos colegas de trabalho do BioMol-Lab, Caio, Clareane, Arthur, Guilherme,
Fernando, Ronniery, Kássia, Ivandra, Alfa, Rafael Porto, Cibelle, Vinícius, Vanir, Adolph,
Mayara Queiroz, Lia, Claúdia, Karine, Batista, Suzete, Caludener, Eduardo, Raphael Batista,
Cíntia, pelo convívio diário, pelo apoio e pelos bons momentos vivenciados ao lado de cada
um de vocês.
Aos meus dois grandes amigos-irmãos e colegas de trabalho, Helton e Júnior, por
todos esses anos de amizade, por todo amor, incentivo, aprendizado e por todas as situações,
boas e ruins, que compartilhamos no decorrer desses anos.
Aos grandes amigos que conquistei nesses anos de BioMol-Lab, Sâmia, Aninha,
Joana, Maria Júlia, Rafael Simões, Bruno Lopes, Rômulo, Mayron, Alysson, Ito, Tales, por
terem se tornado pessoas tão especiais durante todo esse tempo e que quero conservar na
minha vida para sempre. Obrigada por tudo!
À Raquel, meu agradecimento mais que especial, pelos valiosos ensinamentos,
pela contribuição diferencial nessa etapa final e pela amizade e carinho que firmamos durante
essa jornada!
A todos os amigos que se fizeram presentes nessa etapa da minha vida, com muito
amor, paciência, carinho, incentivo, compreensão, proporcionando-me maravilhosos
momentos de descontração.
A todos os meus amigos da turma de Mestrado 2010.1 do Departamento de
Bioquímica e Biologia Molecular-UFC.
Palavras jamais irão descrever tudo que eu tenho a agradecer a toda minha imensa
família e em especial à minha mãe Marigel, ao meu pai Nobre e ao meu irmão João Paulo...
mas, quero que vocês saibam que sem o amor, apoio, dedicação, força e oração de vocês,
desde quando vim morar em Fortaleza, nada disso seria possível!
Enfim, meus sinceros agradecimentos a todos aqueles que contribuíram direta ou
indiretamente para a realização desse trabalho.
“Enquanto estiver vivo, sinta-se vivo. Se sentir
saudades do que fazia, volte a fazê-lo. Não
viva de fotografias amareladas... Continue,
quando todos esperam que desistas... Não
deixe que enferruje o ferro que existe em você.
Faça com que em vez de pena, tenham respeito
por você. Quando não conseguir correr atrás
dos anos, trote. Quando não conseguir trotar,
caminhe. Quando não conseguir caminhar, use
uma bengala. Mas nunca se detenha.”
(Madre Teresa de Calcutá)
RESUMO
As sementes de Andira surinamensis (Bondt) Splitg. ex Amshoff, uma espécie pertencente à
família Leguminosae, subfamília Papilionoideae, tribo Dalbergieae, possuem uma lectina
glicose/manose específica, que aglutina eritrócitos de coelhos nativos ou tratados com
enzimas proteolíticas. A lectina de sementes de Andira surinamensis foi purificada através de
cromatografia de afinidade em matriz de Sepharose-Manose seguida por cromatografia de
troca iônica em matriz de DEAE-Sephacel. Esse procedimento resultou na lectina purificada,
nomeada de ASL. O processo de purificação da ASL foi monitorado pela atividade
hemaglutinate específica e SDS-PAGE, onde se observou que essa lectina é composta por seis
bandas protéicas, uma de maior peso molecular aparente de aproximadamente 20 kDa e outras
cinco bandas de menor peso molecular aparente entre 15 e 12 kDa. A massa molecular intacta
da lectina purificada foi determinada através da técnica de espectrometria de massa com
Ionização por Eletrospray (ESI). A análise do espectro de massa intacta mostrou a presença de
dois íons majoritários de massa molecular de 12.220+ 2 e 13.258 + 2 Da. ASL também teve
sua estrutura primária parcialmente sequenciada através de espectrometria de massa
sequencial. Essa lectina é uma glicoproteína e demonstra elevada estabilidade, sendo capaz de
manter sua atividade hemaglutinante em uma ampla faixa de pH e após exposição a
temperaturas de até 80 ºC por 1hora. Após diálise contra o agente quelante EDTA, ASL teve
sua atividade hemaglutinante diminuída, porém recuperou sua atividade após a adição de
metais, mostrando-se dependente de cátions metálicos divalentes. Foi avaliado também o
efeito da ASL no crescimento planctônico bacteriano e na formação de biofilmes e observou-
se que ela interferiu no crescimento planctônico de duas diferentes cepas bacterianas gram-
positivas (Streptococcus mitis e Streptococcus salivarius) e na formação de biofilme por
Staphylococcus aureus e Streptococcus salivarius.
Palavras-chave: Lectina. Andira surinamensis. Purificação. Biofilme.
ABSTRACT
Andira surinamensis (Bondt) Splitg. ex Amshoff seeds, a species belonging to the
Leguminosae family, Papilionoideae subfamily, Dalbergieae tribe, have a glucose/mannose
specific lectin rabbit erythrocytes that agglutinate native or treated with proteolytic enzymes.
The lectin from Andira surinamensis seeds was purified by affinity chromatography on
Mannose-Sepharose matrix followed by ion exchange chromatography on DEAE-Sephacel
matrix. This procedure resulted in a purified lectin, named ASL. ASL purification process
was monitored by specific hemagglutinating activity and SDS-PAGE, where it was observed
that this lectin is composed of six protein bands, a higher molecular weight of approximately
20 kDa and five other bands of lower apparent molecular weight between 15 and 12 kDa.The
intact molecular mass of the purified lectin was determined by mass spectrometry with
electrospray ionization (ESI). The analysis of the intact mass spectrum showed the presence
of two majority ions of molecular mass 12.220+ 2 and 13.258 + 2 Da. ASL also had its
primary structure partially sequenced by mass spectrometry sequence. This lectin is a
glycoprotein and shows high stability, being able to maintain their hemagglutinating activity
in a wide pH range and after exposure to temperatures up to 80 °C for 1 hour. After dialysis
against the chelating agent EDTA, ASL had its hemagglutinating activity decreased, but
recovered its activity after the addition of metals, being dependent on divalent metal cations.
We also evaluate the effect of ASL on planktonic bacterial growth and biofilm formation and
found that it interfered with the growth of two different planktonic gram-positive bacterial
strains (Streptococcus mitis and Streptococcus salivarius) and biofilm formation by
Stafilococcus aureus e Streptococcus salivarius.
Key words: Lectin. Andira surinamensis. Purification. Biofilm.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Biossíntese de glicoconjugados e reconhecimento na superfície
celular................................................................................................
21
Figura 2 - Representação esquemática de merolectinas, hololectinas,
quimerolectinas, e superlectinas .......................................................
26
Figura 3 - Classificação das lectinas vegetais.................................................... 26
Figura 4 - Interações lectina-carboidrato na superfície celular.......................... 27
Figura 5 - Modificações pós-traducionais durante a biossíntese da
Concanavalina A(ConA)...................................................................
30
Figura 6 - Relação filogenética proposta para as tribos da subfamília
Papilionoideae...................................................................................
36
Figura 7 - Visão geral da estrutura dimérica de PELa em complexo com
trimanose...........................................................................................
36
Figura 8 - Visão geral da estrutura dimérica de PELa em complexo com o
heptassacarídeo simétrico..................................................................
37
Figura 9 - Estrutura geral da lectina de P. angolensis....................................... 37
Figura 10 - Andira surinamensis (Bondt) Splitg. ex Amshoff............................. 39
Figura 11 - Componentes básicos de um espectrômetro de massa....................... 40
Figura 12 - Representação esquemática da natureza temporal proposta para o
acréscimo de bactérias orais humanas na superfície do dente........
45
Figura 13 – Desenvolvimento de um biofilme...................................................... 47
Figura 14- SDS-PAGE.......................................................................................................... 67
Gráfico 1 - Cromatografia de Afinidade em matriz de Sepharose-Manose......... 65
Gráfico 2 - Cromatografia de Troca Iônica em matriz de DEAE-Sephacel......... 65
Gráfico 3 - Estabilidade térmica da lectina de Andira surinamensis................... 68
Gráfico 4 - Estabilidade da lectina de Andira surinamensis a uma ampla faixa
de pH................................................................................................
68
Gráfico 5- Efeito do EDTA sobre a atividade hemaglutinante da ASL..............
69
Gráfico 6- Espectro de massa deconvoluído mostrando a massa isotópica
média das cadeias da ASL................................................................. 70
Gráfico 7 - Avaliação do potencial da lectina de sementes de Andira
surinamensis (ASL) sobre o crescimento planctônico de
Streptococcus mitis ATCC 903.........................................................
73
Gráfico 8 - Avaliação do potencial da lectina de sementes de Andira
surinamensis (ASL) sobre o crescimento planctônico de
Streptococcus salivarius ATCC Salivarius.......................................
73
Gráfico 9 - Avaliação do potencial antibiofilme da lectina de sementes de
Andira surinamensis (ASL) sobre o desenvolvimento do biofilme
de Stafilococcus aureus ATCC 25923..............................................
74
Gráfico10 - Avaliação do potencial antibiofilme da lectina de sementes de
Andira surinamensis (ASL) sobre o desenvolvimento do biofilme
de Streptococcus salivarius ATCC Salivarius..................................
74
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Exemplos de atividades biológicas descritas para lectinas.................. 28
Tabela 2 - Lectinas da tribo Dalbergieae, especificidade por açúcar e atividades
biológicas..............................................................................................
35
Tabela 3 - Atividade hemaglutinante da ASL...................................................... 63
Tabela 4 - Inibição da atividade hemaglutinante da ASL por
carboidratos..........................................................................................
64
Tabela 5 - Tabela de purificação da ASL ............................................................. 66
Tabela 6- Efeito do EDTA sobre a atividade hemaglutinante da
ASL......................................................................................................
69
Tabela 7- Sequência obtida por espectrometria de massa sequecial (MS/MS)
dos peptídeos oriundos de digestão tríptica da ASL..........................
71
LISTA DE SIGLAS
AaL: lectina de Araucaria angustifolia
AAL: lectina de Aleuria aurantia
Abu: ácido α-amino butírico
ACA: aglutinina de Amaranthus caudatus
A.H.E.: atividade hemaglutinante específica
AMA: aglutinina de Arum maculatum
ASL: lectina de Andira surinamensis
ATCC: Coleção de Cultura Tipo Americana
BmoLL: lectina de Bauhinia monandra
BSA: albumina sérica bovina
CGL: lectina de Canavalia gladiata
CID: Decomposição Induzida por Colisão
CMI: Concentração Mínima Inibitória
ConA: lectina de Canavalia ensiformis
ConBol: lectina de Canavalia boliviana
ConBr: lectina de Canavalia brasiliensis
ConM: lectina de Canavalia maritima
CRD: Domínio de Reconhecimento a Carboidratos
CT: Concentração total
C-terminal: carboxi terminal
Da: Dalton
DDA: Análise Direta de Dados
DEAE: dietilaminoetano
DNA: ácido desoxirribonucléico
EDTA: Ácido Etilenodiaminotetracético
ELISA: Ensaio de Imunoabsorção Enzima-Ligada
EPSs: Substância Extracelular Polimérica ou Exopolissacarídeos
ECorL: lectina de Erythrina corallodendron
ESI: Ionização por Eletrospray
Fru: frutose
FT-ICR: Transformada de Fourier- Ressonância Ciclotrônica Iônica
GlcNAc: N-acetilglicosamina
Glu: glicose
GNA: aglutinina de Galanthus nivalis
kDa: Quilodalton
Man: manose
MALDI: Ionização por Dessorção a Laser Assistida por Matriz
MBL: lectina humana ligante a manose
MLP: lectina de Manihot esculenta
MPTs: Modificações protéicas pós-traducionais
mRNA: ácido ribonucléico mensageiro
MS: Espectrometria de Massa
MS/MS: Espectrometria de Massa Sequencial
m/z: relação massa/carga
N-terminal: amino terminal
OD: densidade ótica
PA: pureza analítica
PAL: lectina de Pterocarpus angolensis
PAL: lectina de Pisum arvensis
PDB: Protein Data Bank
PELa: lectina recombinate de Platypodium elegans
pH: potencial hidrogeniônico
PPL-1: lectina de Parkia platycephala 1
PPL-2: lectina de Parkia platycephala 2
RE: retículo endoplasmático
RIP: proteínas inativadoras de ribossomos
RPM: rotações por minuto
SBA: aglutinina de sementes de soja (Glycine max)
SDS: dodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE: Eletroforese em gel de poliacrilamida em presença de dodecil sulfato de sódio
ToF: Tempo de vôo
TSB: caldo tríptico de soja
TxLCI: lectina do bulbo de tulipa
TEMED: N-N-N´-N´-tetrametilenodiamina
UFC: unidades formadoras de colônia
U.H.: Unidade Hemaglutinate
VML: lectina de Vatairea macrocarpa
WGA: aglutinina do gérmen de trigo
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO........................................................................................... 19
1.1 Glicobiologia................................................................................................ 20
1.2 Fatos históricos e definições....................................................................... 22
1.3 Classificação de lectinas vegetais............................................................... 24
1.4 Ubiquidade na natureza............................................................................. 27
1.5 Ocorrência nos vegetais.............................................................................. 29
1.6 Lectinas de leguminosas............................................................................. 29
1.7 Lectinas de Papilionoideae......................................................................... 33
1.8 Andira surinamensis (Bondt) Splitg. ex Amshoff..................................... 38
1.9 Espectrometria de massa: generalidades.................................................. 39
1.10 Biofilmes: generalidades............................................................................. 44
2 OBJETIVOS................................................................................................ 50
2.1 Objetivo Geral............................................................................................. 51
2.2 Objetivos Específicos.................................................................................. 51
3 MATERIAIS E MÉTODOS...................................................................... 52
3.1 Purificação da Lectina de Sementes de A. surinamensis......................... 53
3.1.1 Preparo da Farinha................................................................................ 53
3.1.2 Extração de proteínas das sementes............................................................ 53
3.1.3 Preparo da solução protéica.................................................................. 53
3.1.4 Atividade hemaglutinante............................................................................ 53
3.1.5 Cálculo da Atividade Hemaglutinante Específica...................................... 54
3.1.6 Especificidade por Carboidratos................................................................. 54
3.1.7 Cromatografia de Afinidade em Matriz de Sepharose-Manose................. 55
3.1.8 Cromatografia de Troca Iônica em Matriz de DEAE-Sephacel................ 55
3.2 Caracterização da Lectina de Sementes de A. surinamensis................... 56
3.2.1 Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS....................... 56
3.2.2 Determinação da massa molecular intacta por espectrometria de massa.. 57
3.2.3 Digestão in gel e sequenciamento dos peptídeos por espectrometria de
massa.............................................................................................................
57
3.2.4 Efeito da temperatura sobre a atividade hemaglutinante da
ASL.....................................................................................................
58
3.2.5 Efeito do agente quelante (EDTA) sobre a atividade hemaglutinante da
ASL.................................................................................................................
58
3.2.6 Efeito do pH sobre a atividade hemaglutinante da ASL.............................. 59
3.2.7 Dosagem de carboidratos totais.................................................................... 59
3.3 Avaliação do efeito da ASL sobre o crescimento bacteriano e
formação de biofilmes..................................................................................
59
3.3.1 Microorganismos........................................................................................... 59
3.3.2 Atividade da ASL sobre o crescimento bacteriano....................................... 60
3.3.3 Efeito da ASL sobre a formação de biofilmes.............................................. 60
3.3.4 Análise estatística.......................................................................................... 61
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................ 62
4.1 Purificação e caracterização pela especificidade a carboidratos da
lectina de sementes de Andira surinamensis..............................................
63
4.2 Caracterização físico-química da lectina de sementes de A.
surinamensis..................................................................................................
66
4.3 Determinação da massa molecular e sequenciamento por
espectrometria de massa..............................................................................
70
4.4 Avaliação do efeito da ASL sobre o crescimento bacteriano e
formação de biofilmes..................................................................................
72
5 CONCLUSÃO.............................................................................................. 77
REFERÊNCIAS.......................................................................................... 79
19
1 INTRODUÇÃO
20
1.1 GLICOBIOLOGIA
Na primeira metade do século XX, a química, bioquímica e biologia de
carboidratos foram assuntos de grande interesse. No entanto, durante a fase inicial da
revolução da biologia molecular moderna, estudos com glicanos foram preteridos em favor
das outras principais classes de bio ou macromoléculas. Isso se deve em grande parte à
complexidade estrutural inerente, a dificuldade em determinar sua sequência e o fato de que
sua biossíntese não pode ser diretamente predita a partir de um molde de DNA. O
desenvolvimento de uma variedade de novas tecnologias para explorar as estruturas dessas
cadeias de açúcar abriu uma nova fronteira da biologia molecular que tem sido chamada de
glicobiologia (Figura 1) (VARKI et al., 1999).
A glicobiologia compreende o estudo da estrutura, biossíntese e biologia de
sacarídeos (cadeias de açúcar ou glicanos) que estão amplamente distribuídos na natureza. É
um dos campos de mais rápido crescimento nas ciências biomédicas, com relevância para a
pesquisa básica, biomedicina e biotecnologia (HALTIWANGER; FEIZI, 2011).
Oligossacarídeos e glicoconjugados (glicoproteínas e glicolipídios) têm intrigado
pesquisadores por décadas no seu envolvimento como mediadores de eventos celulares
complexos. A respeito da diversidade estrutural, eles têm a capacidade de ultrapassar
proteínas e ácidos nucléicos. Sua variedade estrutural permite que eles codifiquem
informações para reconhecimento molecular específico, servindo como determinantes para o
enovelamento e estabilidade de proteínas, comunicação, diferenciação e proliferação celular,
entre outros eventos de importância fisiológica. O arranjo estrutural de glicanos na superfície
celular representa um fator determinante na identificação de células tumorais. As alterações
nos padrões de glicosilação são o resultado de atividades alteradas de glicosiltransferases e
glicosidases (GHAZARIAN, IDONI, OPPENHEIMER, 2011).
A habilidade de ligação de carboidratos a outras macromoléculas tais como
proteínas, possibilita que as informações armazenadas nas moléculas de açúcar sejam
decodificadas e traduzidas em eventos biológicos de interesse. Várias classes de proteínas
apresentam essa capacidade de ligação, entre elas, as lectinas.
O termo lectina é derivado da palavra em latim legere que significa “escolher” ou
“selecionar” e abrange todas as aglutininas carboidrato específicas de origem não-imune que
têm especificidade sanguínea (SHARON; LIS, 2004).
A interação de lectinas com carboidratos pode ser tão específica quanto à
interação antígeno/anticorpo e enzima/substrato. Essas proteínas não se ligam a apenas
21
oligossacarídeos nas células, mas também a glicanos livres, incluindo monossacrídeos.
(GHAZARIAN, IDONI, OPPENHEIMER, 2011).
A habilidade das lectinas de se ligarem a carboidratos está restrita a um pequeno
número de aminoácidos na estrutura da proteína que compõem uma região denominada
domínio de reconhecimento a carboidratos (CRD) (SHARON; LIS, 2004). Esse domínio
lectínico reconhece resíduos de carboidratos em terminais não-redutores de glicoproteínas e
glicolipídios encontrados nas membranas celulares. Essa região também pode discriminar
entre isômeros anoméricos de um mesmo açúcar; a lectina de Canavalia ensiformis (ConA)
liga-se especificamente aos α-anômeros de glicose e manose, mas não aos seus β isômeros
(MODY, JOSHI, CHANEY, 1995).
Figura 1- Biossíntese de glicoconjugados e reconhecimento na superfície celular.
Fonte: Adaptado de BERTOZZI; KIESSLING, 2001. Monossacarídeos fornecidos exogenamente são absorvidos
pelas células e convertidos em “blocos construtores” (tipicamente açúcares nucleosídeos) dentro da célula.
Várias etapas de transformação metabólica podem ocorrer na rota de um açúcar exógeno a um bloco construtor.
Os blocos construtores são importados para os compartimentos secretores onde eles são montados por
glicosiltransferases em oligossacarídeos ligados a uma proteína (ou lipídio). No caso de glicoproteínas N-ligadas,
um núcleo de oligossacarídeos é montado no citosol, em seguida transportado ao RE, onde é processado por
glicosidases e depois elaborado por glicosiltransferases. Uma vez expresso de forma totalmente madura na
superfície celular, os glicoconjugados podem servir como ligantes para receptores em outras células ou
patógenos. Ferramentas químicas podem ser usadas para inibir ou controlar qualquer estágio desse processo.
22
1.2 FATOS HISTÓRICOS E DEFINIÇÕES
No final do século XIX surgiram as primeiras evidências que apontavam a
existência na natureza de proteínas com habilidade de aglutinar eritrócitos. Tais proteínas
foram referidas como hemaglutininas ou fitohemaglutininas, por terem sido encontradas
inicialmente em extratos de plantas (SHARON; LIS, 2004).
Peter Hermann Stillmark em sua tese de doutorado em 1888 foi o responsável pela
primeira descrição de lectinas vegetais. Em seu trabalho, Stillmark isolou a partir de extratos
de sementes de mamona (Ricinus communis), uma toxina denominada de “ricina” que
apresentou capacidade de aglutinar eritrócitos. Esse estudo foi um marco para a bioquímica
vegetal porque a ricina foi a primeira proteína de planta a ter uma atividade biológica
estabelecida. Após a descoberta da ricina, outras substâncias tóxicas similares foram
identificadas em sementes de Croton tiglium (crotina), Abrus precatorius (abrina) e na casca
de Robinia pseudoacacia (robinia) (VAN DAMME et al., 1998).
Posteriormente, Paul Ehrlich, do Instituto Real de Terapia Experimental
(Frankfurt) empregou a ricina e a abrina como modelos de antígenos para estudos
imunológicos. A partir desses estudos, Ehrlich conseguiu estabelecer em 1890 vários
princípios fundamentais de imunologia, demonstrando que a imunidade às toxinas é
transferida de mãe para filho pelo sangue durante a gravidez e pelo leite após o nascimento
(SHARON; LIS, 2004).
O termo hemaglutinina foi usado pela primeira vez por Elfstrand em 1898 para
designar todas as proteínas vegetais que causam aglutinação das células. Esse termo foi
inspirado na similaridade entre a atividade hemaglutinante macroscopicamente visível
causada pelas proteínas vegetais e aquela de aglutininas do soro humano e animal, descrita
por Landois em 1875 (VAN DAMME et al., 1998).
A ideia de que toxicidade é uma propriedade intrínseca de lectinas foi abandonada
no início do século seguinte por Landsteiner e Raubitscheck em 1907, quando eles relataram
pela primeira vez a presença de lectinas não tóxicas em sementes de Phaseolus vulgaris
(feijão), Pisum sativum (ervilha), Lens culinaris (lentilha) e Vicia sativa (vicia). Após o
trabalho de Landsteiner e Raubitscheck outras hemaglutininas vegetais não tóxicas foram
descobertas. Com esses achados tornou-se evidente que lectinas estão amplamente
distribuídas no reino vegetal e que o papel tóxico dessas moléculas é uma exceção, e não uma
regra. (VAN DAMME et al., 1998).
23
No início do século XX, James B. Sumner, da Universidade de Cornell (Ithaca,
Nova Iorque), isolou das sementes de Canavalia ensiformis uma proteína denominada de
concanavalina A (ConA), obtendo assim a primeira lectina purificada da história. Entretanto,
apenas em 1936, Sumner e Howell relataram que a ConA aglutina células tais como
eritrócitos e leveduras e também precipita glicogênio a partir de solução. Eles mostraram que
a hemaglutinação pela ConA foi inibida por sacarose, demonstrando pela primeira vez a
afinidade de lectinas por açúcares. Esses dois pesquisadores ainda sugeriram que a
hemaglutinação induzida por essa proteína é consequência de uma reação com carboidratos da
superfície dos eritrócitos (SHARON; LIS, 2004).
O fato das lectinas exibirem uma clara preferência por eritrócitos de algum grupo
sanguíneo em particular do sistema ABO constituiu-se o primeiro marco histórico no estudo
dessas moléculas, registrado na primeira metade do século XX. Essa preferência foi relatada
por Renkonen em 1948 e por Boyd e Reguera em 1949 (VAN DAMME et al., 1998). Eles
encontraram que extratos brutos de Phaseolus limensis e Vicia cracca, aglutinavam eritrócitos
do grupo sanguíneo A, mas não dos grupos B ou O, enquanto que o de Lotus tetragonolobus,
aglutinava especificamente eritrócitos do grupo O. Essa descoberta da especificidade a um
grupo sanguíneo levou à introdução do novo termo “lectina” (do latim legere, que significa
selecionar ou escolher), por Boyd e Shapleigh em 1954 (SHARON; LIS, 2004).
A ideia de que lectinas exibem distintas especificidades por eritrócitos de grupos
sanguíneos diferentes do sistema ABO foi corroborada pelo trabalho de Olavi Mäkelä, um
estudante de doutorado de Renkonen, em 1957. Ele analisou extratos de sementes de
diferentes espécies da família Leguminosae e verificou que as hemaglutininas exibiram
diferentes especificidades para os grupos sanguíneos; algumas delas aglutinando eritrócitos
dos grupos A, B ou O, e outras para ambos os grupos A e B. Esses achados contribuíram para
as investigações iniciais das bases estruturais da especificidade dos antígenos associada aos
grupos sanguíneos do sistema ABO, levando Morgan e Watkins, do Instituto Lister (Londres)
em 1950 a encontrar que a aglutinação de eritrócitos do grupo A pela lectina de Phaseolus
limensis era melhor inibida por α-N-acetil-D-galactosamina, enquanto que a aglutinação de
eritrócitos do grupo O induzida pela lectina de Lotus tetragonolobus foi inibida
preferencialmente por α-L-fucose. Eles concluíram que α-N-acetil-D-galactosamina e α-L-
fucose são os açúcares que conferem especificidade determinante aos grupos sanguíneos A e
O, respectivamente (SHARON; LIS, 2004).
As descobertas na década de 60 de que as lectinas das sementes de Phaseolus
vulgaris e Canavalia ensiformis desempenham um papel mitogênico sobre linfócitos e que a
24
lectina do gérmen de trigo (WGA) aglutina preferencialmente células malignas reforçaram a
importância da interação entre lectinas e os carboidratos encontrados nas superfícies celulares
para a execução de diferentes papéis biológicos (SHARON; LIS, 2004).
A habilidade peculiar de se ligar e reconhecer de forma específica carboidratos na
superfície das células coloca as lectinas como um grupo de proteínas que podem ser
distinguidas das demais por um critério funcional bem definido.
Com base nesse critério, Peumans & Van Damme (1995) definiram lectinas como
sendo proteínas de origem não-imune com no mínimo um domínio não catalítico que se ligam
reversivelmente a mono ou oligossacarídeos específicos.
1.3. CLASSIFICAÇÃO DE LECTINAS VEGETAIS
As lectinas vegetais são consideradas um grupo heterogêneo de proteínas por
serem diferentes entre si no que diz respeito às propriedades bioquímicas e físico-químicas,
relação evolucionária, estrutura molecular, especificidade e atividades biológicas (VAN
DAMME et al., 1998), o que torna laboriosa a tarefa de classificá-las considerando todos os
aspectos que as descrevem simultaneamente.
Van Damme e colaboradores (1998) subdividiram as lectinas vegetais em quatro
classes principais tendo por base a estrutura do(s) sítio(s) de ligação a carboidratos, sendo
assim classificadas: merolectinas, hololectinas, quimerolectinas e superlectinas (Figura 2).
As merolectinas são proteínas que consistem exclusivamente de único domínio
de ligação a carboidrato. Devido ao seu caráter monovalente, as merolectinas são incapazes de
precipitar glicoconjugados ou aglutinar células. A heveína, uma proteína do látex da
seringueira (Hevea brasiliensis), que se liga à quitina, é uma típica merolectina (VAN
PARIJS et al., 1991).
As hololectinas também são compostas exclusivamente de domínios que se ligam
a carboidratos, mas com dois ou mais sítios ligantes que são idênticos ou parecidos. Devido às
hololectinas serem di ou multivalentes elas podem aglutinar células e/ou precipitar
glicoconjugados. As hololectinas comportam-se como verdadeiras aglutininas e compreendem
a maioria das lectinas de plantas, sendo a classe de lectinas melhor estudada. São exemplos
típicos de hololectinas aquelas encontradas em sementes de plantas pertencentes aos gêneros
Canavalia e Dioclea (família Leguminoseae, sub-família Papilionoideae, tribo Phaseoleae).
As quimerolectinas representam a fusão das proteínas compostas de um ou mais
domínios de carboidratos ligantes e de um domínio não relacionado, com uma atividade
25
catalítica bem definida, e que age independentemente dos domínios de carboidratos ligantes.
Dependendo do número de sítios de ligação a carboidratos, as quimerolectinas comportam-se
como merolectinas ou hololectinas. São exemplos de quimerolectinas as proteínas
inativadoras de ribossomos (RIP tipo 2), como a ricina (toxina da mamona, Ricinus
communis) e a abrina (toxina de Abrus precatorius), que possuem dois domínios de ligação
para carboidratos comportando-se como hololectinas e um domínio para a inativação do
ribossomo (PEUMANS et al., 1998). Outro exemplo é a PPL-2, uma lectina quitina-ligante
isolada de sementes de Parkia platycephala que possui, além do sítio ligante a carboidrato,
um sítio catalítico com atividade endoquitinásica (CAVADA et al., 2006).
As superlectinas consistem de, no mínimo, dois domínios de ligação para
carboidratos. Diferente das hololectinas os domínios de ligação para carboidratos das
superlectinas reconhecem açúcares estrutural e funcionalmente diferentes. Como exemplo, a
lectina do bulbo de tulipa (TxLCI) que é formada por dois domínios de ligação a carboidrato,
que reconhecem manose e N-acetil-galactosamina, respectivamente (VAN DAMME et al.,
1996).
Van Damme e colaboradores (1998) também propuseram um sistema de
classificação das lectinas baseado em relações sorológicas e/ou semelhanças de sequência,
bem como nas suas relações evolutivas. De acordo com esse sistema, as lectinas foram
subdividas em setes famílias, sendo elas: lectinas de leguminosas; lectinas de
monocotiledôneas ligantes a manose; lectinas ligantes a quitina contendo domínios
heveínicos; proteínas inativadoras de ribossomos tipo 2 (RIP tipo 2); lectinas relacionadas a
jacalina; lectinas do floema de Curcubitaceae e lectinas de Amaranthaceae (Figura 3).
26
Figura 2- Representação esquemática de merolectinas (Heveína; PDB: 1Q9B), hololectinas
(ConBr; PDB: 3JU9), quimerolectinas (PPL-2; PDB: 2GSJ) e superlectinas, que não possuem
representantes com estrutura tridimensional determinada
Fonte: Adaptado de PEUMANS; VAN DAMME, 1998.
Figura 3- Classificação das lectinas vegetais
Fonte: PDB. (A) Lectinas de leguminosas, Canavalia brasiliensis (ConBr; PDB: 3JU9); (B) Lectina ligante a
quitina composta por domínios heveínicos, Heveína (PDB: 1Q9B) ; (C) Lectinas de monocotiledôneas ligantes
manose, Galanthus nivalis aglutinina (GNA; PDB: 1MSA); (D) RIP’s do tipo II, Ricina; (PDB: 2AAI); (E)
Lectinas relacionadas à jacalina, Parkia platycephala (PPL-1; PDB: 1ZGR ); (F) Lectinas da família das
amarantinas, Amaranthus caudatus (ACA; PDB: 1JLY ).
27
1.4. UBIQUIDADE NA NATUREZA
Lectinas estão presentes nos vários grupos de organismos vivos, sendo
encontradas em vírus (GERMAIN et al., 2011), bactérias (KOUKI et al., 2011), algas
(NAGANO et al., 2005), fungos (KHAN; KHAN, 2011), plantas (COLARES et al., 2011) e
animais (MOURA et al., 2006). A ocorrência de lectinas em diferentes organismos reflete
uma ampliação das possibilidades de estudos de isolamento e caracterização dessas
moléculas, do seu mecanismo de interação com carboidratos e do seu papel biológico intra e
intercelular.
Essas proteínas apresentam-se como ferramentas indispensáveis para a pesquisa
nos mais diversos segmentos científicos (agricultura, medicina, biotecnologia, dentre outros),
devido à diversidade de eventos biológicos que são desencadeados em função da interação
proteína/carboidrato (Figura 4). Alguns desses eventos encontram-se listados na Tabela 1.
Figura 4- Interações lectina-carboidrato na superfície celular.
Fonte: Adaptado de SHARON; LIS, 2004. Lectinas servem como meio de fixação de diferentes tipos de células,
bem como para vírus a outras células via carboidratos da superfície deste último. Em alguns casos, lectinas
ligam-se a glicoproteínas particulares da superfície celular (asialoglicoproteínas), enquanto em outros casos os
28
carboidratos de glicoproteínas ou glicolipídios da superfície celular servem como sítios de ligação a moléculas
biologicamente ativas, como as próprias lectinas.
Tabela 1- Exemplos de atividades biológicas descritas para lectinas.
Lectina Atividade biológica Referência
Frutalina e r-Frutalina (Artocarpus
incisa)
Citotoxicidade e Apoptose Oliveira et al.,
(2011).
MBL (lectina ligante a manose) humana Infecções parasitárias Padilla-Docal et
al., (2011).
AAL (Aleuria aurantia) Endereçamento de drogas Roth-Walter et
al., (2004).
Con A (Canavalia ensiformis)
Morniga G (Morus nigra)
Efeito anti-tumoral Lei ;Chang
(2009).
Poiroux et al.,
(2011).
CvL (Cliona varians) Atividade anti-bacteriana Moura et al.,
(2006).
Lectina I de Pseudomonas aeruginosa Adesão celular Kouki et al.,
(2011).
MLP (Manihot esculenta) Atividade fungicida Silva et al.,
(2010).
ConBr (Canavalia brasiliensis) Atividade antidepressiva Barauna et al.,
(2006).
HCA (Hypnea cervicornis)
CcL (Caulerpa cupressoides)
Atividade antinociceptiva e
anti-inflamatória
Bitencourt et al.,
(2008).
Vanderlei et al.,
(2010).
AaL (Araucaria angustifolia) Atividade anti-inflamatória Mota et al.,
(2006).
AMA (Arum maculatum) Atividade pró-inflamatória Alencar et al.,
(2005).
ConBr (Canavalia brasiliensis), CGL
(Canavalia gladiata), ConM
(Canavalia marítima)
Efeito vasodilatador Assreuy et
al.,(2009)
ConBol (Canavalia boliviana), ConM
(Canavalia maritima), Con A
(Canavalia ensiformis
Interferências no processo de
formação de biofilmes
bacterianos
Cavalcante et
al., (2011).
PAL (Pisum arvensis) Relaxamento de aorta e
liberação de óxido nítrico
Assreuy et al.,
(2011).
VML (Vatairea macrocarpa) Alteração na função renal Martins et al.,
(2005).
29
1.5. OCORRÊNCIA NOS VEGETAIS
As lectinas estão amplamente distribuídas no reino vegetal, sendo encontradas
desde os organismos mais simples, como algas (NAGANO et al., 2005), musgos (PEUMANS
et al., 2007) e pteridófitas (TATENO et al., 2003), até aqueles mais complexos, como
angiospermas (DINANT, et al., 2003) e gimnospermas (SANTI-GADELHA et al., 2006).
Um crescente número de lectinas vegetais vêm sendo isoladas e caracterizadas sob
diversos aspectos (físico-químicos, biológicos, estruturais), sendo que as famílias
Leguminosae, Gramineae, Algae, Euphorbiaceae detêm a maior quantidade de estudos para
essas moléculas. Contudo, dentre as famílias anteriormente citadas, a família Leguminosae é a
que apresenta o maior número de lectinas isoladas e destas destacam-se principalmente as de
sementes (LORIS et al., 1998; PRAKASHKUMAR, PUSHPANGADAN, VIJAYA
KUMA,1998; SHARON, 1993). Lectinas também estão presentes em outros tecidos
vegetativos, tais como em folhas (RATANAPO, NGAMJUNYAPORN,
CHULAVATNATOL, 2001), túberculos (SUSEELAN et al., 2002), frutos (SAMPIETRO et
al., 2001) e raízes de algumas Convolvulaceae (PEUMANS et al., 1997; VAN DAMME et
al., 1997).
Muitas funções têm sido propostas para as lectinas vegetais, tais como proteção
contra patógenos e insetos, transporte e armazenamento de carboidratos, reconhecimento
celular (dentro da célula, entre células ou entre organismos), proteínas de reserva ou
reguladores de crescimento (PUSZTAI, 1991). Alguns experimentos indicam que as lectinas
vegetais são proteínas de defesa contra animais herbívoros e possuem função na simbiose
entre as bactérias fixadoras de nitrogênio (Rhizobium spp.) e as raízes de leguminosas
(CAVADA et al., 2001).
1.6. LECTINAS DE LEGUMINOSAS
Lectinas de leguminosas constituem uma ampla família de proteínas intimamente
relacionadas, encontradas exclusivamente em representantes da família Leguminosae
(Fabaceae), sendo a família de lectinas vegetais mais bem estudada (SHARON; LIS, 1990).
Até o momento foram isoladas dezenas de lectinas de leguminosas, a partir de
diferentes espécies e pertencentes a vários grupos taxonômicos. Elas são isoladas
principalmente a partir das sementes maduras e estão localizadas nos corpos protéicos do
parênquima dos cotilédones (ETZLER, 1986), constituindo de 1 a 10% do total de proteínas
30
solúveis, embora algumas espécies possam apresentar concentrações acima de 50%, ou abaixo
de 0,1% do total de proteínas solúveis presentes nas sementes (SHARON & LIS, 1990; VAN
DAMME, et al., 1998).
Quanto à sua biossíntese, essas proteínas são sintetizadas no retículo
endoplasmático rugoso na forma de pré-pro-lectinas, sendo compostas por um peptídeo sinal
(20 a 30 resíduos de aminoácidos) na região N-terminal, duas cadeias peptídicas (β e γ), uma
cadeia intermediária que será glicosilada no retículo endoplasmático (RE) e um peptídeo sinal
na região C-terminal. Após a clivagem do peptídeo sinal na região N-terminal, a pré-pro-
proteína passa por um novo processamento proteolítico no complexo de Golgi, onde uma
endopeptidase é responsável pela remoção do peptídeo sinal na região C-terminal e da cadeia
intermediária, tornando-se deglicosilada e funcionalmente ativa. As cadeias β e γ são então
religadas em uma posição invertida em relação ao precursor, formando a cadeia α (Figura 5)
(CARRINGTON, AUFFRET, HANKE, 1985).
Figura 5- Modificações pós-traducionais durante a biossíntese da Concanavalina A (ConA).
Fonte: Adaptado de CARRINGTON, 1985. Sumário dos eventos de processamento convertendo a pro-
concanavalina A glicosilada (pré-pro-conA) em lectina madura. Extremidades amino e carboxi terminal da
lectina madura estão indicados por N e C, respectivamente, e o número em parênteses refere-se a resíduos da
concanavalina A madura. Durante o processamento na planta, a pro-proteína glicosilada inativa é deglicosilada
resultando no surgimento da atividade de ligação a carboidrato. A ação de uma endopeptidase que cliva o
nonapeptídio carboxiterminal e o espaçador da deglicosilação está mostrado em verde e amarelo,
respectivamente. Resíduos 118 e 119 são ligados enzimaticamente. Splicing então resulta em uma transposição
do arranjo linear dos domínios protéicos γ e β. RE: retículo endoplasmático, CG: complexo de golgi, V: vacúolo.
31
Outro tipo de processamento conhecido é o que ocorre com as lectinas de duas
cadeias da tribo Vicieae. Neste caso uma sequência de seis resíduos é clivada da pró-lectina,
resultando numa proteína contendo uma pequena cadeia α C-terminal e uma longa cadeia β N-
terminal (HIGGINS et al., 1983).
A lectina de sementes de Vatairea macrocarpa, espécie representante da tribo
Dalbergieae, sofre processamento pós-traducional seguindo uma rota proposta por Calvete e
colaboradores (1998). A cadeia alfa sofre uma clivagem pelo rompimento da ponte entre
asparagina-114 e lisina-115. Essa clivagem é diretamente dependente da deglicosilação do
resíduo de asparagina-111. A partir dessa clivagem são gerados os fragmentos gama (N-
terminal deglicosilado) e beta (C-terminal glicosilado). O fragmento beta pode sofrer ainda
uma deglicosilação no resíduo asparagina-183 seguido de processamento N- e C-terminal,
gerando isoformas. Esses fragmentos são reunidos por ligações não covalentes fazendo com
que ela tenha estrutura tridimensional praticamente idêntica àquela da cadeia alfa (não
processada) (CALVETE et al., 1998).
Do ponto de vista estrutural, as lectinas de leguminosas são geralmente compostas
de duas ou quatro subunidades, iguais ou diferentes, com massa molecular em torno de 25 a
30 kDa, compostas geralmente de uma cadeia polipeptídica simples com cerca de 250
aminoácidos, cuja união é estabelecida por forças não covalentes como ligações de
hidrogênio, interações hidrofóbicas e eletrostáticas, que formam dímeros canônicos e
estabilizam o tetrâmero pela união destes dímeros. Cada uma destas subunidades apresenta
um único sítio de ligação a carboidratos com a mesma especificidade, além de um ou mais
sítios de ligação a íons, podendo ainda apresentar um ou dois oligossacarídeos N-ligados.
Entretanto, algumas lectinas possuem subunidades formadas por duas cadeias polipeptídicas,
entre elas as lectinas da tribo Vicieae, gêneros Pisum, Vicia, Lathyrus e Lens. Estas lectinas
são dímeros formados por duas subunidades iguais e cada subunidade é constituída de uma
cadeia α (5 a 7 kDa) e uma β (15 a 19 kDa) mantidas por ligações não-covalentes (SHARON;
LIS, 1989).
Outras lectinas de diferentes partes vegetais existem como uma complexa mistura
de isoformas, como por exemplo, as lectinas de Robinia pseudoacacia (VAN DAMME et
al., 1995), do gênero Erythrina (BONNEIL et al., 2004), de Acacia constricta
(GUZMAN-PARTIDA et al., 2004) e de Amaranthus leucocarpus (HERNANDEZ et al.,
2001). A presença de isoformas tem alto impacto sobre a função biológica de lectinas e a
existência de várias isoformas poderia oferecer uma estratégia alternativa ou uma adaptação
evolutiva para compensar a baixa especificidade (BENEVIDES, 2011).
32
Lectinas de leguminosas são consideradas um modelo de estudo das bases
moleculares das interações proteína-carboidrato (LORIS et al., 1998). Elas requerem cátions
divalentes em sítios ligantes a metal. Cada subunidade possui um íon Ca2+
e Mn2+
, que são
essenciais para a atividade de ligação a carboidrato da lectina. Os aminoácidos envolvidos na
ligação desses íons são altamente conservados (VAN DAMME et al., 1998).
Os monômeros de diferentes lectinas de leguminosas são bastante semelhantes e
sua estrutura pode ser descrita como um β-sanduíche constituído por uma folha plana de seis
fitas (a folha anterior) e por uma folha curva de sete fitas (a folha frontal). Uma terceira
pequena folha-β, formada por cinco fitas, faz a ligação das duas outras (BANERJEE et al.,
1996; HAMELRYCK et al., 1998).
O sítio de ligação a carboidratos está localizado no lado côncavo do β-sanduíche,
formado pela folha-β frontal curva, ao lado dos sítios de ligação a metais. Esse sítio de
reconhecimento a carboidratos é formado por diversos loops com diferentes graus de
variabilidade (SHARMA; SUROLIA, 1997). As conformações desses loops são determinadas
pela presença na estrutura de íons de metais de transição, no caso o Ca2+
e o Mn2+
, cuja
ausência resulta em instabilidade local e na perda da capacidade de ligar-se a carboidratos
(LORIS et al., 2004).
Estudos recentes têm demonstrado que além dos domínios de ligação a
carboidratos, esse grupo de proteínas pode apresentar sítios específicos que reconhecem
metabólitos secundários, fitohormônios e aminoácidos não-protéicos, sendo que esses podem
estar diretamente relacionados a mecanismos de defesa da planta contra a ação de patógenos,
no processo de germinação da semente, dentre outros (DELATORRE et al., 2007).
Através da caracterização estrutural, por experimentos de cristalografia de raios
X, Delatorre e colaboradores (2007) comprovou que uma lectina isolada de sementes de
Canavalia gladiata apresenta um sítio ligante para o aminoácido não protéico ácido α-amino
butírico (Abu). Esse sítio está presente na interface dos contatos monoméricos de cada dímero
canônico dessa lectina e a presença do Abu nesse local aumentou os contatos intermoleculares
e estabilizou fortemente os dímeros canônicos. Abu provavelmente desempenha um papel na
proteção dessa leguminosa contra patógenos.
Algumas lectinas de leguminosas, como as lectinas extraídas de espécies da
subtribo Diocleinae, exibem uma oligomerização dependente de pH, onde a proporção entre
proteínas no estado dimérico e no estado tetramérico pode ser alterada de acordo com o pH do
meio (CALVETE et al., 1999; NAGANO et al., 2008). A alteração desse equilíbrio
dímero/tetrâmero dependente de pH pode influenciar diretamente nas atividades biológicas
33
dessas lectinas, pelo fato dessas proteínas serem capazes de se ligar aos receptores
glicoconjugados da superfície das membranas com uma maior afinidade quando na forma
tetramérica (DELATORRE et al., 2006).
1.7. LECTINAS DE PAPILIONOIDEAE
A família das leguminosas está subdividida em três subfamílias: Papilionoideae,
Caesalpinoideae, Mimosoideae. A subfamília Papilionoideae é a que detém o maior número
de espécies a partir das quais lectinas já foram isoladas e estudadas. Muitos dos estudos com
letinas de leguminosas envolvem membros da subfamília Papilionoideae, enquanto que
investigações com lectinas das outras subfamílias, Caesalpinioideae e Mimosoideae, são
escassos (MANN et al., 2001).
A subfamília Papilionoideae é formada por 483 gêneros e 13.800 espécies
divididas em 28 tribos (Figura 6). No Brasil são 88 gêneros e 180 espécies nativas
(BARROSO et al. 1991; LEWIS et al., 2005). Inúmeras lectinas dessa subfamília foram
isoladas e caracterizadas, sendo verificadas também algumas atividades biológicas para vários
exemplares, tais como: atividade antidepressiva, ConBr (Canavalia brasiliensis); efeito anti-
tumoral, Con A (Canavalia ensiformis); atividade antinociceptiva, ConBol (Canavalia
boliviana); relaxamento de aorta e liberação de óxido nítrico, PAL (Pisum arvensis).
A tribo Dalbergieae, pertencente a subfamilia Papilionoideae, família
Leguminosae, compreende 48 gêneros e cerca de 1.200 espécies. Apesar do grande número de
espécies descritas, até o momento foram isoladas apenas 11 lectinas de diferentes espécies
que compõe essa tribo. A Tabela 2 mostra a quais espécies pertencem, seus açúcares-ligantes
específicos e apresenta algumas atividades biológicas que já foram evidenciadas para essas
lectinas.
Até o momento, apenas duas lectinas de espécies pertencentes à subtribo
Dalbergieae tiveram as estuturas tridimensionais determinadas: PAL (lectina de Pterocarpus
angolensis) e PELa (lectina recombinate de Platypodium elegans).
A PELa possui uma organização dimérica canônica típica de lectinas de
leguminosas. Uma análise da especificidade por Glycan array evidenciou uma preferência
bastante não-usual para N-glicanos do tipo complexos com ramificações assimétricas. Duas
estruturas cristalinas de PELa, uma em complexo com um trimanose ramificado (Figura 7) e
outra com um heptassacarídeo complexo simétrico ligado a Asn (Figura 8) foram resolvidas a
resoluções de 2,1 e 1,65 Å, respectivamente. A lectina mostrou adotar uma organização
34
dimérica canônica típica de lectinas de leguminosas. O trimanose faz uma ponte entre os sítios
de ligação a carboidrato de dímeros vizinhos, resultando na formação de cadeias infinitas no
cristal. O heptassacarídeo liga-se com o braço 1-6 no sítio primário de ligação e com contatos
extensivos adicionais em ambos os braços. O GlcNAc do braço 1-3 está ligado em uma
conformação restrita que pode justificar a alta afinidade que é observada em chips para
oligossacarídeos com braço 1-3 curto que não apresentam esse monossacarídeos
(BENEVIDES, 2011).
A lectina de Pterocarpus angolensis (PAL), glicose/manose específica, foi
cristalizada em complexo com três diferentes açúcares: glicose, sacarose e turanose (Glc(α1–
3)Fru). A estrutura tridimensional de PAL mostra que ela está arranjada sob a forma de um
dímero canônico, o que também é observado para as outras lectinas de leguminosas glicose-
manose específicas tais como, ConA e outras representantes do gênero Dioclea e também
para lectinas da tribo Vicieae (Figura 9) (LORIS et al., 2003). A lectina contém um loop
clássico de ligação à manose, mas seu loop de ligação a metal assemelha-se à de lectinas com
especificiade não-relacionada, como Ulex europaeus e Maackia amurensis. Como
consequência, as interações com manose no sítio de ligação primário são conservadas, mas
detalhes da extensão desse sítio de ligação a carboidratos diferem daqueles vistos em
complexos carboidratos equivalentes de Concanavalina A. Essas observações explicam as
diferenças em seus respectivos perfis de especificidade fina para oligomanoses (LORIS et al.,
2004). Ainda em busca de esclarecimentos sobre a estrutura de PAL, Garcia-Pino e
colaboradores (2006) analisaram os efeitos da desmetalização na estabilidade conformacional,
estrutura e propriedades de ligação a açúcar dessa lectina através de técnicas calorimétricas,
espectroscópicas e cristalográficas. A remoção dos metais levou a uma forma mais flexível da
proteína com estabilidade conformacional significativamente menor. As estruturas cristalinas
sem metal mostraram rearranjos estruturais significativos, embora algumas características
estruturais que permitem a ligação de açúcar sejam mantidas. Estes resultados juntos com
dados termodinâmicos e espectroscópicos contribuem para o melhor entendimento das
interações lectina-carboidrato.
Como mencionado anteriormente, apenas um pequeno número de espécies da
tribo Dalbergieae tiveram lectinas isoladas e caracterizadas, fazendo-se necessária a execução
de novos estudos em busca de outras moléculas com potencial biotecnológico e que também
possam contribuir para o entendimento da relação evolutiva, sob um ponto de vista
bioquímico, entre as diferentes tribos da subfamília Papilionoideae.
35
Tabela 2- Lectinas da tribo Dalbergieae, especificidade por açúcar e atividades biológicas.
Lectina Especificidade por açúcar Atividade biológica
Vatairea
macrocarpa
Galactose/N-
acetilgalactosamina
Atividade pró-inflamatória (Alencar et al.,
2004); alteração na atividade renal (Martins
et al., 2005); atividade anti-microbiana
(Teixeira et al., 2006); liberação de
mediadores quimiotáticos por macrófagos
(Alencar et al., 2007); especificidade para
resíduos de antígeno do tipo Tn (Dam et al.,
2007)
Vatairea
guianensis
Galactose/ N-
acetilgalactosamina
Lonchocarpus
sericeus
N-acetilglicosamina
Atividade anti-inflamatória (Alencar et al.,
1999); efeito anti-inflamatório e
antibacteriano em um modelo de
peritonite infecciosa (Alencar et al.,
2005); diminuição da migração
leucocitária e hipernocicepção mecânica
pela inibição da produção de citocinas e
quimiocinas (Napimoga et al., 2007).
Lonchocarpus
araripensis
N-acetilglicosamina
Atividade anti-inflamatória (Pires et al.,
2008).
Platypodium
elegans
Glicose-Manose
Atividade termiticida e fungicida
(Benevides et al., 2008).
Lonchocarpus
carpassa
Galactose/ N-
acetilgalactosamina/Glicose
Platymiscium
floribundum
Manose/N-Acetilglicosamina
Pterocarpus
angolensis
Glicose-Manose
Andira
surinamenis
Glicose-Manose Atividade anti-inflamatória na cistitite
hemorrágica em camudongos (Silvestre et
al., 2005).
36
Figura 6- Relação filogenética proposta para as tribos da subfamília Papilionoideae.
Fonte: Adaptado de CALVETE et al., 1998. As tribos que possuem lectinas compostas por duas cadeias
resultantes do processamento pós-traducional estão sublinhadas e as que possuem processamento por
permutação circular estão com um asterisco.
Figura 7- Visão geral da estrutura dimérica de PELa em complexo com trimanose, formada
pelos monômeros A em vermelho e monômero B em azul. Presença dos metais Ca+2
e Mn+2
(esferas verde e roxa, respectivamente), do ligante trimanose (αMan1-3(αMan1-6)Man
(preto), de duas moléculas de glicerol (amarelo) e de dois íons sulfato (verde) .
Fonte: Adaptado de BENEVIDES, 2011.
37
Figura 8- Visão geral da estrutura dimérica de PELa em complexo com o heptassacarídeo
simétrico, formada pelos monômeros A em vermelho e monômero B em azul. Presença dos
metais Ca+2
e Mn+2
(esferas verde e roxa, respectivamente), do ligante heptassacarídeo
(preto), de quatro moléculas de glicerol (amarelo) e de duas de uréia (verde).
Fonte: Adaptado de BENEVIDES, 2011.
Figura 9- Estrutura geral da lectina de P. angolensis. Representação esquemática do dímero
de PAL em duas orientações ortogonais. Um monômero colorido de laranja e o outro de
amarelo. Os íons de manganês são mostrados como esferas azuis e íons de cálcio como
esferas verdes. As moléculas de ligantes Me-α-D-glicopiranosídeo também estão
representadas.
Fonte: Adaptado de LORIS et al., 2003.
38
1.8. Andira surinamensis (Bondt) Splitg. ex Amshoff
O gênero Andira, tribo Dalbergieae, família Leguminosae, compreende 29
espécies, sendo que desse total, 27 ocorrem no Brasil. A distribuição geográfica indica
ocorrência em todo território brasileiro e na região Nordeste há registros para o estado do
Ceará (MATTOS, 1979; PENNINGTON, 2003).
As espécies deste gênero encontram-se entre as raras leguminosas dispersadas por
vertebrados. A maioria das espécies possuem frutos menores que 6,0 cm, esverdeados ou
amarelados, com cheiro adocicado e mesocarpo fibroso, os quais são dispersados por
morcegos (o nome Andira é derivado do tupi e significa morcego) da família Phyllostomidae.
Algumas espécies que ocorrem em beira de rios podem ser dispersadas pela água
(PENNINGTON; LIMA, 1995).
Andira surinamensis (Bondt) Splitg. ex Amshoff é uma espécie não endêmica do
Brasil e ocorre nos domínios fitogeográficos da Caatinga, Cerrado e Amazônia. Essa espécie
ocorre sob a forma de árvores, arbustos ou raramente subarbustos, atingindo de 4 a 42 metros
de altura. Sua casca geralmente apresenta exsudado vermelho quando cortada. A madeira
pode ser usada em construções navais, obras expostas, esteios, postes, carpintaria, carroçaria
ou tanoaria (FERREIRA, HOPKINS, SECCO, 2004).
Algumas propriedades medicinais já foram relatadas para essa espécie: a madeira
é utilizada na cura de úlceras, sendo também purgativa ou narcótica; as sementes são
vermífugas, laxantes ou, dependendo da dose, narcóticas e seu uso em doses elevadas pode
ser perigoso. As folhas também possuem propriedades vermífugas (CORRÊA, 1926;
MATTOS, 1979).
39
Figura 10- Andira surinamensis (Bondt) Splitg. ex Amshoff .
Fonte: (A) Adaptado de FERREIRA, HOPKINS, SECCO, 2004; (B) e (C) Adaptado de Google Imagens, 2011;
(D) NOBRE, 2012. (A) Representação esquemática da exsicata, (B) Copa da árvore, (C) Exemplar encontrado
no Campus do Pici e (D) Frutos.
1.9. ESPECTROMETRIA DE MASSA: GENERALIDADES
Em linhas gerais, a espectrometria de massa (MS) é uma técnica capaz de
determinar a relação entre massa e carga (m/z) de espécies ionizadas em fase gasosa
(AEBERSOLD; MANN, 2003). O espectrômetro de massa é constituído por uma fonte de
ionização, onde os componentes de uma amostra são convertidos em íons e imediatamente
acelerados em direção ao analisador de massa; um analisador de massa, que separa os íons de
40
acordo com sua relação massa-carga (m/z); um detector, que recebe os íons que foram
separados pelo analisador, transformando a corrente de íons em sinais elétricos que são
processados, armazenados na memória de um computador e mostrados em uma tela (Figura
11).
Figura 11- Componentes básicos de um espectrômetro de massa.
Fonte: PUC-RIO.
Os dois métodos de ionização de amostras para análise proteômica por MS mais
utilizados são: a ionização por eletrospray (Elelectrospray ionization, ESI) e a dessorção a
laser assistida por matriz (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization, MALDI)
(HOFFMAN; STROOTBART, 2007).
A ionização por eletrospray (ESI), junto à ionização por MALDI, representa um
dos dois métodos de ionização “suave” que têm feito a precisão, sensitividade e elegância da
espectrometria de massa prontamente disponível para o estudo de biomoléculas e suas reações
(FENN, 2002). Ela é hoje a técnica de ionização mais amplamente utilizada em análises
químicas e bioquímicas. A interface com um espetrômetro de massa permite investigar a
composição molecular de amostras líquidas (WILM, 2011). Esse método, que possui
capacidade de análise de moléculas com menos de 100 Da até maiores de 1.000.000 Da e é
desenvolvido à pressão atmosférica, possibilita a análise desde pequenas moléculas apolares a
grandes moléculas polares, como peptídeos e proteínas (HOFFMAN; STROOTBART, 2007).
41
A ionização por eletrospray é um processo de transferência de íons pré-existentes
em solução para a fase gasosa, envolvendo a formação de um “spray” eletrostático, a partir do
qual são geradas pequenas gotas carregadas e destas são liberados os íons. Tipicamente, esta
solução é bombeada através de um capilar (d.i. 50 a 100 µm) com uma vazão inferior a 10
µL/min. No caso de fluxos menores que 1 µL/min, o processo é chamado de
“nanoelectrospray” (MORAES; LAGO, 2003).
Quando um potencial positivo, por exemplo, é aplicado na solução, os íons
positivos tendem a se afastar para uma região menos positiva, isto é, em direção ao contra-
eletrodo. Assim, a gota sendo formada na ponta do capilar estará enriquecida em íons
positivos. Este tipo de separação de carga é chamado de processo eletroforético. Conforme a
densidade de carga aumenta na gota, o campo elétrico formado entre o capilar e o contra
eletrodo aumenta provocando a deformação da gota. A gota ganha a forma de um cone que é
denominado de cone de Taylor (MORAES; LAGO, 2003).
Esta gota na forma de cone permanece “presa” ao capilar até o momento em que a
densidade de carga na superfície da gota e o aumento da repulsão entre os íons vençam a
tensão superficial do líquido, ocorrendo então a liberação de pequenas gotas (através de
explosões coulômbicas) com alta densidade de carga. A frequência deste processo depende da
magnitude do campo elétrico, da tensão superficial do solvente e da condutividade da solução
(MORAES; LAGO, 2003).
A ionização por MALDI tornou-se uma ampla e poderosa fonte para a produção
de íons na fase gasosa a partir de uma ampla gama de compostos de grande porte, não-voláteis
e termicamente lábeis, como proteínas e oligonucleotídeos (HOFFMAN; STROOTBART,
2007).
A fonte de íons MALDI baseia-se na absorção intensa da radiação laser por uma
matriz, que é misturada em solução com quantidades muito pequenas da biomolécula de
interesse (o analito). A mistura matriz-analito é depositada sobre o porta amostra e secada,
produzindo uma amostra sólida (FERNANDÉZ-LIMA, 2005).
Supõe-se que as funções da matriz sejam: i) absorver fortemente a radiação laser
para possibilitar uma transferência eficiente da energia do pulso de radiação para o analito e
ii) isolar as moléculas de analito umas das outras, para diminuir as ligações intermoleculares
e permitir a dessorção intacta das moléculas. A rápida elevação da temperatura devido à
interação da radiação laser com a amostra, tanto na fase sólida quanto gasosa, gera uma
pressão extremamente alta na mistura matriz-analito em sublimação (FERNANDÉZ-LIMA,
2005).
42
Dois mecanismos são possíveis para a criação de íons no sistema matriz-analito
(BAER, CHEUK-YIU, POWIS, 1997): i) ablação explosiva em clusters a partir de uma
energia limiar (BEAVIS; CHAIT, 1991; BÖKELMANN, SPENGLER, KAUFMANN, 1995)
e ii) expansão gasosa em jato, no qual as moléculas do analito estão dispersas dentro da matriz
(KARAS, GLÜCKMANN, SCHÄFER, 2000; ZHIGUILEI et al., 1997).
Assim como há uma grande variedade de fontes de ionização, uma variedade de
analisadores de massa têm sido desenvolvida. Todos os analisadores de massa usam elétrica
estática ou dinâmica e seus campos magnéticos podem ser usados sozinhos ou combinados,
dando origem a equipamentos classificados como híbridos, os quais fazem uso das vantagens
inerentes a cada analisador. A maioria das diferenças básicas entre os vários tipos comuns de
analisador de massa encontram-se na maneira pela qual esses campos são usados para
conseguir a separação (HOFFMAN; STROOTBART, 2007). Quadrupolos, ion-traps
(tridimensionais e lineares), Time-of-Flight (ToF), Fourier-transform ion cyclotron resonance
(FT-ICR), orbitrap são exemplos de analisadores de massa. Tais equipamentos permitem que
experimentos em sequência (tandem) sejam realizados, isto é, sendo possível detectar um
determinado íon e posteriormente submetê-lo a uma etapa de fragmentação. Uma vez
separados, esses íons são detectados por eletro multiplicadores que constituem os detectores
mais largamente usados (CANTU et al., 2008).
Os programas mais comumente empregados para a identificação de proteínas em
bancos de dados a partir de dados de MS são o Sequest e o Mascot. Ambos os programas
correlacionam espectros de massa de fragmentação (não interpretados) de peptídeos com
sequências de aminoácidos de proteínas registradas em bancos de dados (CHAMRAD et al.,
2004; ELIAS et al., 2005). Além disso, esses softwares também têm a capacidade de usar
sequências de nucleotídeos para fazer tal correlação. Para tal, eles primeiramente simulam as
sequências primárias potenciais das proteínas correspondentes àquelas sequências de
nucleotídeos encontradas nos bancos de genes, utilizando-se do código genético universal.
Posteriormente, simulam a fragmentação destas sequências primárias. De forma geral, estes
programas têm como objetivo encontrar a sequência de aminoácidos, em um determinado
banco de dados, que melhor descreve os íons fragmentos encontrados em um espectro. As
sequencias “candidatas” são procuradas nos bancos de dados de acordo com a massa do
peptídeo intacto e com o espectro de fragmentação obtido para cada peptídeo (CANTU et al.,
2008).
Contudo, a interpretação manual de espectros de fragmentação (sequenciamento
De novo) é recomendada em todos os casos e indispensável em algumas situações. Por fim,
43
existem situações nas quais o genoma de uma determinada espécie ainda não está
completamente sequenciado ou disponível e, neste cenário, é necessário derivar a sequência
primária de aminoácidos de um determinado peptídeo baseado única e exclusivamente nos
dados obtidos por espectrometria de massa, isto é, sem recorrer a banco de dados
(sequenciamento De novo) (STEEN; MANN, 2004).
O potencial de aplicação da MS em estudos biológicos tem sido bastante
estendido, em razão dos impressionantes avanços observados nos últimos anos nas áreas de
genômica, de transcriptômica, de metabolômica, de proteômica, de lipidômica e de outras
plataformas “omics”, e do desenvolvimento extraordinário dos equipamentos (FENG et al.,
2008; HOFFMANN; STROOBANT, 2007). A MS é atualmente a técnica de escolha para
identificação de proteínas e para estudo de modificações protéicas pós-traducionais (MPTs)
em diferentes condições fisiológicas. Além disso, a MS vem sendo utilizada no
monitoramento e na caracterização de diversos processos industriais, tais como processos
fermentativos (ROYCE, 1993) e até mesmo análise de microrganismos intactos (CLAYDON
et al.,1996; FENSELAU; DEMIREV, 2001).
A utilização da MS no estudo de lectinas vegetais permite a caracterização dessas
moléculas através da determinação da massa molecular intacta, identificação do estado
oligomérico, localização e caracterização de pontes de sulfeto e modificações pós-
traducionais, identificação de proteínas provenientes de uma eletroforese bidimensional. Além
da rapidez e relativa simplicidade de análise, outra vantagem dessa técnica é a necessidade de
pequenas quantidades de amostras para realização dos estudos (SIMÕES, 2011).
Algumas lectinas de leguminosas já tiveram suas sequências primárias
parcialmente determinadas por MS, entre elas Erythrina velutina (SIMÕES, 2011),
Luetzelburgia auriculata (SIMÕES, 2011), Canavalia bonariensis (CALVETE, et al., 1999),
Dioclea virgata (CALVETE, et al., 1999), Dioclea guianensis (CALVETE, et al., 1999),
Dioclea violacea (CALVETE, et al., 1999), Dioclea rostrata (CALVETE, et al., 1999),
Canavalia grandiflora (SIMÕES, 2011), Platymiscium floribundum (PEREIRA JÚNIOR,
2011).
A lectina de sementes de Vatairea macrocarpa (VML) teve a sua massa
molecular e de suas cadeias determinadas por MS, além da caracterização dos glicanos N-
ligados (CALVETE et al., 1998). Através desses resultados foi sugerido um mecanismo de
processamento pós- traducional para essa lectina.
44
1.10. BIOFILMES: GENERALIDADES
A diversidade de mecanismos de adaptação, sejam eles metabólicos ou
fenotípicos, permite que os organismos procarióticos habitem tanto os ambientes adequados
às formas de vida superiores, quanto ambientes inóspitos à maioria das formas de vida. Essas
características adaptativas também possibilitaram às bactérias o desenvolvimento de uma
sábia estratégia ecológica de sobrevivência que facilita sua adaptação às alterações
ambientais: a vida em comunidade. Para os microbiologistas, a maioria das bactérias
encontra-se na natureza vivendo em comunidades, de maior ou menor estruturação, e
raramente elas ocorrem como células individuais, crescendo de maneira planctônica (livres,
em suspensão). Sendo assim, esses organismos apresentam-se em seus habitats naturais em
comunidades de diferentes graus de complexidade, associadas a superfícies diversas,
geralmente compondo um biofilme.
Biofilmes são comunidades microbianas complexas estabelecidas em uma ampla
variedade de superfícies que são geralmente associadas a uma matriz extracelular composta
por vários tipos de biopolímeros (ABEE et al., 2010). Essas comunidades dinâmicas podem
se espalhar através de superfícies, incorporar partículas e outros microorganismos do meio
circundante e continuamente liberar novas células planctônicas (STEPHENS, 2002). Eles
estão presentes no meio aquático (RIVERA, et al., 2010), em equipamentos de diferentes
segmentos industriais (DAT et al., 2012), dispositivos médicos, como válvulas cardíacas
artificiais, marcapassos e articulações sintéticas (STEPHENS, 2002), lentes de contato
(ONURDAĞ et al., 2010). Entre os biofilmes de maior interesse médico destacam-se aqueles
que são responsáveis pela colonização da cavidade oral e da superfície dos dentes, levando à
ocorrência da cárie dental (OKUDA et al., 2010).
Superfícies dentárias expostas ao ambiente oral são quase instantaneamente
cobertas por uma película proteinácea, que é conhecida como a película do esmalte adquirida.
Essa película de proteína é formada pela adsorção seletiva de proteínas salivares, peptídeos e
outras moléculas orgânicas (OLIVEIRA et al., 2007). O processo inicial de adesão bacteriana
à película do esmalte adquirida compreende interação específica entre espécies bacterianas
presentes na cavidade oral e a película (Figura 12).
45
Figura 12- Representação esquemática da natureza temporal proposta para o acréscimo de
bactérias orais humanas na superfície do dente.
Fonte: Adaptado de Rickard et al., 2003. As espécies representadas aqui são Streptococcus gordonii,
Streptococcus mitis, Streptococcus oralis, Streptococccus sanguinis, Haemophilus parainfluenzae,
Propionibacterium acnes, Veillonella atypica, Actinomyces naeslundii, Fusobacterium nucleatum,
Actinobacillus actinomycetemcomitans, Helicobacter pylori, Treponema spp. e Porphyromonas gingivalis. Os
conjuntos de símbolos complementares adesina-receptor (um exemplo é mostrado no alto) representa interações
por coagregação específica diferente ou adesão à película adquirida. Coagregação entre P. gingivalis and S.
gordonii é mediada pelas proteínas adesinas expressas na superfície de ambos tipos de células. Símbolos
idênticos não se destinam a identificar moléculas idênticas, mas relacionadas funcionalmente. Os símbolos
retangulares representam coagregações lactose-sensíveis, outros símbolos representam coagregações lactose-
insensíveis.
Cáries dentais são causadas pela colonização e acúmulo de microorganismos orais
e a aderência desses microorganismos é o primeiro passo para a colonização (GIBBONS,
1984; NAPIMOGA et al., 2005). Organismos orais se ligam aos componentes salivares da
película do esmalte adquirida e, através do crescimento e interação entre espécies, formam
uma comunidade de biofilme. Por conseguinte, o reconhecimento bacteriano de receptores
salivares na superfície do dente representa um passo inicial importante na patogênese da
doença oral (PALMER et al., 2003).
Teixeira e colaboradores (2006) investigaram o potencial de seis diferentes
lectinas de leguminosas (Canavalia ensiformis, Canavalia brasiliensis, Dioclea violacea,
46
Dioclea grandiflora, Cratylia floribunda e Vatairea macrocarpa) em inibir a aderência de
cinco espécies de Streptococcus (S. oralis, S. sanguis, S. mitis, S. mutans e S. sobrinus) à
película adiquirida in vitro. Todas as lectinas glicose-manose específicas foram capazes de
reduzir a aderência das espécies de Streptococcus testadas, enquanto que a lectina de Vatairea
macrocarapa (VML), que reconhece galactose e N-acetil-galactosamina, diminuiu a aderência
apenas de S. sanguis. Essas lectinas glicose-manose específicas provavelmente diminuíram a
adesão pela competição com outras proteínas expressas pelas diferentes espécies bacterianas
que se ligam a esses resíduos de açúcar.
A ecologia de um biofilme é uma complexa equação de parâmetros físico-
químicos e biológicos (SIMÕES, SIMÕES, VIEIRA, 2007). Como em todos os níveis de
evolução, uma complexa teia de interações é fundamental para a estrutura, composição e
função dessa ou de qualquer comunidade (HANSEN et al., 2007). Biofilmes podem ser
formados por uma única espécie bacteriana, como aquele formado por Pseudomonas
aeruginosa, um notório patógeno oportunista que infecta queimaduras e feridas, coloniza
alguns tipos de dispositivos permanentes e causa infecções pulmonares crônicas
(GOLDBERG, PIER, 2000). Entretanto, a maioria dos biofilmes existe na forma de um
consórcio funcional entre várias espécies, onde as diferentes bactérias presentes afetam umas
às outras tanto de uma forma positiva, quanto negativa (BURMØLLE et al., 2006).
Algumas interações beneficiam uma ou mais colônias ou espécies em um
biofilme, tais como a coagregação de células (BLEHERT, et al., 2003; RAO, WEBB,
KJELLEBERG, 2005), conjugação (GHIGO, 2001) e proteção de uma ou várias espécies da
erradicação quando o biofilme está exposto a compostos antimicrobianos (COWAN et al.,
2000). Tal proteção envolve uma variedade de fatores, incluindo complementação enzimática
e distribuição espacial organizada das células do biofilme (COWAN et al., 2000; LERICHE,
BRIANDET, CARPENTIER, 2003). Esses e outros mecanismos são semelhantes a efeitos
sinergísticos que resultam na formação de um biofilme cooperativo pelas colônias que seriam
incapazes de formar um biofilme sozinhas (FILOCHE, ANDERSON, SISSONS, 2004).
Interações negativas em biofilmes incluem produção de bacteriotoxinas (RAO et al., 2005) e
redução do pH (BURNE; MARQUIS, 2000) por um membro do consórcio biofilme. Um
aspecto importante para descrever as interações em biofilmes multiespécies é avaliar entre
espécies individuais, ou consórcio multiespécies, o ganho de algumas vantagens quando
comparadas a biofilmes de apenas uma espécie (BURMØLLE et al., 2006).
Microorganismos patogênicos que formam biofilmes podem causar infecções
persistentes que desafiam o sistema imunológico e resistem à eliminação por antibióticos
47
(STEPHENS, 2002). Periodondite e infecção pulmonar crônica em pacientes com fibrose
cística são exemplos de doenças que geralmente estão associadas à presença de biofilmes
(SINGH et al., 2000). Várias infecções nosocomiais como aquelas relacionadas ao uso de
cateteres (MORRIS, SSTICKLER, Mc LEAN, 1999) e dispositivos ortopédicos (GRISTINA
et al., 1994) estão claramente associadas a biofilmes que aderem à superfície do biomaterial
(STEWART; COSTERTON, 2001). Essas infecções partilham características comuns,
embora as causas e os sítios hospedeiros variem. A erradicação de biofilmes patogênicos é
facilitada pelo melhor entendimento de seu metabolismo e desenvolvimento. Estudos de
expressão gênica e a identificação de produtos gênicos necessários para a formação do
biofilme ou resistência a antibióticos oferecem ajuda significante (STEPHENS, 2002).
Figura 13- Desenvolvimento de um biofilme.
Fonte: Adaptado de Rickard et al., 2003. (a) Colonização primária de um substrato; (b) crescimento, divisão
celular e produção do exopolissacarídeo (EPS), com o desenvolvimento de microcolônias; (c) coadesão de
células individuais, de células coagregadas e grupos de células idênticas, originando um biofilme jovem, de
múltiplas espécies; (d) maturação e formação de mosaicos clonais no biofilme maduro.
O desenvolvimento do biofilme inicia quando bactérias planctônicas – células
individuais livres – aderem a uma superfície (Figura 13). Diversos locais podem ser
colonizados, incluindo superfícies minerais, tecidos vegetais ou animais vivos e/ou mortos,
48
polímeros sintéticos, cerâmicas e ligas metálicas. Os mecanismos de aderência variam
dependendo do microorganismo e da superfície. Como células aderidas crescem e se dividem,
a proximidade da superfície induz adaptações fisiológicas, incluindo secreção de substância
extracelular polimérica ou exopolissacarídeos (EPSs), utilizada como uma matriz protetora
em torno das células e também como substrato para outros microorganismos.
Exopolissacarídeos hidratados representam a maior parte do volume do biofilme e são os
responsáveis pelas propriedades viscosas macroscópicas (STEPHENS, 2002). Muitas vezes, a
composição e a quantidade de EPS variarão dependendo do tipo de microrganismos, da idade
do biofilme e das diferentes condições ambientais em que os biofilmes são formados
(MAYER et al., 1999). Biofilmes desenvolvidos são estruturas surpreendentemente
elaboradas, com pilares levantados por células desordenadas, permeadas por micro canais
cheios de líquidos (STEPHENS, 2002).
Além da presença de EPS, as estruturas da superfície celular bacteriana, tais
como, outras proteínas, lipopolissacarídeos e os flagelos possuem claramente um papel
importante no processo de adesão (CARNEIRO, 2011).
A aquisição de novas características genéticas pelas espécies componentes de um
biofilme ocorre através do mecanismo de conjugação, pois várias bactérias possuem
plasmídeos (segmentos de DNA extracromossomial), conferindo-lhes as mais diversas
características, e estes podem ser transferidos horizontalmente por conjugação, para diferentes
espécies presentes em um biofilme. O uso dessa estratégia de troca de informação genética
assegura a variabilidade genética, formação inicial e adaptação do biofilme a diferentes
condições ambientais.
A expressão gênica das diferentes espécies que compõe um biofilme é regulada de
acordo com as suas necessidades para a sobrevivência. Sendo assim, muitas bactérias usam o
mecanismo de quorum sensing para controlar a expressão de seus genes. Bactérias que usam
quorum sensing constantemente produzem e secretam moléculas sinalizadoras, denominadas
autoindutores ou feromônios. Essas bactérias também têm um receptor que pode
especificamente detectar a molécula sinalizadora ou o indutor. Quando o indutor se liga ao
receptor, ele ativa a transcrição de certos genes, incluindo aqueles para a síntese do indutor.
Existe uma pequena probabilidade de uma bactéria detectar o indutor que ela própria secretou.
Assim, para que a transcrição gênica seja ativada, a célula deve encontrar moléculas
sinalizadoras secretadas por outras células em seu meio ambiente. Quando apenas outras
poucas bactérias do mesmo tipo estão na vizinhança, a difusão reduz a concentração do
indutor no meio circundante a quase zero, de modo que a bactéria passa a produzir pouco
49
indutor. No entanto, como a população cresce, a concentração do indutor passa de um limiar,
causando a síntese de mais indutor. Isso forma um ciclo de feedback positivo e o receptor
torna-se completamente ativado. A ativação do receptor induz o aumento da regulação de
outros genes específicos, fazendo com que todas as células possam começar a transcrição
aproximadamente ao mesmo tempo (KOK GAN et al., 2011).
A expressão dos genes de Pseudomonas aeruginosa em biofilmes foi analisada
por Whiteley e colaboradores (2001). Para comparar a expressão gênica entre as células
planctônicas e aquelas do biofilme, eles analisaram bactérias cultivadas em um quemostato,
de nado livre ou aderidas a seixos de granito. Os níveis de mRNA foram comparados usando
microarrays com sequências codificantes a partir de 5.500 genes identificados a partir de
sequências de DNA genômico de P. aeruginosa. Surpreendentemente, apenas 73 genes, 1,3%
do total, mostraram níveis de expressão significantemente diferentes do biofilme. A cultura
planctônica controle foi suficientemente densa para ativar genes quorum-dependentes, uma
vez que esses não estavam entre a população diferencialmente expressa. Embora esses
resultados certamente subestimem o número de genes que tiveram mudanças de expressão em
biofilmes patogênicos, em que estímulos adicionais estão em jogo, eles oferecem apenas uma
informação muito básica para análise da expressão gênica de biofilmes dessa espécie.
Devido ao seu papel na adesão e aglutinação, lectinas são consideradas
importantes em interações simbióticas e patogênicas entre alguns organismos e hospedeiros
(SLIFKIN; DOYLE, 1990). Em bactérias, carboidratos da superfície, tais como
peptidioglicanos, ácidos teióicos e lipopolissacarídeos são potenciais sítios reativos para
lectinas. A habilidade de lectinas em formar complexos com glicoconjugados microbianos
torna possível o uso dessas moléculas como sonda para investigar a estrutura e função da
superfície celular. Um dos usos mais importantes de lectinas em microbiologia é na agregação
direta de micoorganismos em suspensão. Lectinas são as proteínas vegetais capazes de
reconhecer e se ligar a glicoconjugados presentes na superfície de microorganismos tais como
bactérias e fungos, e desse modo inibir sua motilidade e multiplicação (BROEKAERT et al.,
1984; LILJAMARK; SCHAUER, 1977).
50
2 OBJETIVOS
51
2.1 Objetivo Geral
Purificar uma lectina de sementes de Andira surinamensis (Bondt)
Splitg. ex Amshoff, caracterizá-la estruturalmente e verificar seu potencial biotecnológico
como ferramenta para o estudo com biofilmes de importância em diferentes áreas.
2.2 Objetivos Específicos
Purificar uma lectina de sementes de A. surinamensis através da utilização de técnicas de
cromatografia líquida;
Verificar a especificidade desta lectina por eritrócitos humanos e de coelho;
Caracterizar a lectina purificada em relação à sua afinidade por carboidratos e quanto a suas
características físico-químicas;
Determinar a massa molecular intacta da lectina por espectrometria
de massa com ionização por Eletrospray (ESI);
Determinar parcialmente a sequência primária da lectina por espectrometria de massa
sequencial (MS/MS);
Investigar o potencial antibacteriano da lectina durante o crescimento planctônico e a
respectiva capacidade em inibir a formação e o desenvolvimento de biofilme experimental de
diferentes cepas de bactérias gram-positivas e gram-negativas.
52
3 MATERIAIS E MÉTODOS
53
3.1 Purificação da Lectina de Sementes de A. surinamensis
3.1.1 Preparo da Farinha
As sementes de Andira surinamensis foram coletadas no Campus do Pici da
Universidade Federal do Ceará (UFC), Fortaleza-CE. Em seguida foram descascadas e
trituradas em moinho elétrico para obtenção da farinha a partir da qual foi feita uma
delipidação com hexano. A farinha fina foi acondicionada em recipientes fechados para uma
posterior utilização.
3.1.2 Extração de proteínas das sementes
As proteínas solúveis foram extraídas da farinha em sulfato de amônio
[(NH4)2SO4] 1 mol/L, na proporção de 1:10 (p/v), sob agitação constante por 1 h a
temperatura ambiente. A suspensão obtida foi centrifugada a 10.000 x g, temperatura 4 ºC,
durante 20 min, obtendo-se assim um precipitado que foi descartado, e um sobrenadante
denominado de extrato total. Esse extrato foi utilizado para realização de ensaios de atividade
hemaglutinante e para o preparo de proteína em concentração pré-estabelecida, para o
posterior cálculo da atividade específica.
3.1.3 Preparo da solução protéica
A concentração de proteínas solúveis no extrato total e nas diferentes frações foi
preparada em mg/mL. O extrato foi preparado a uma concentração de 8 mg/mL, pela adição
de sulfato de amônio [(NH4)2SO4]. As frações resultantes das cromatografias de afinidade e
troca iônica foram preparadas a uma concentração de 1 mg/mL, solubilizadas em Tris-HCl
0,1 mol/L pH 7,6 com NaCl 0,15 mol/L.
3.1.4 Atividade hemaglutinante
Os testes de atividade hemaglutinante foram realizados em tubos com o extrato
protéico total e com as frações resultantes dos dois passos cromatográficos, a partir de uma
adaptação ao protocolo descrito por Moreira e Perrone (1967), como descrito a seguir:
54
As amostras foram dispostas em duplas seriadas e diluídas em tubos (1:2, 1:4,
1:8...) em Tris-HCl 0,1 mol/L pH 7,6 acrescido de NaCl 0,15 mol/L. Para cada 100 µL da
diluição foram acrescentados 100 µL de uma suspensão de hemácias de coelho e dos tipos
sanguíneos A, B e O, a 2% em NaCl 0,15 mol/L, normais e tratadas com enzimas proteolíticas
(papaína ou tripsina). O ensaio foi incubado a 37 °C por 30 minutos e, após esse período,
deixado em repouso à temperatura ambiente por mais 30 minutos. A presença ou não de
hemaglutinação foi então detectada macroscopicamente.
Os títulos de hemaglutinação foram medidos em termos de Unidade
Hemaglutinante (U.H./mL) como sendo o inverso da maior diluição ainda capaz de apresentar
hemaglutinação visível.
3.1.5 Cálculo da Atividade Hemaglutinante Específica
Após a obtenção do título de hemaglutinação e da concentração de proteínas
solúveis, a atividade específica para cada uma das frações foi calculada, com o objetivo de se
monitorar avanços na concentração/purificação da lectina em estudo.
O cálculo foi feito pela divisão do título de hemaglutinação (UH/mL) pela
concentração de proteínas solúveis (mgP/mL), cujo quociente foi expresso em UH/mgP
(unidades de hemaglutinação por miligrama de proteína). Esses resultados puderam ser
comparados, levando à escolha da melhor condição / fração purificadora ou concentradora da
atividade hemaglutinante.
A atividade hemaglutinante contra eritrócitos de coelho tratados com tripsina foi
calculada a partir de diluições seriadas na base dois para determinação dos títulos de
hemaglutinação. A purificação foi calculada como a relação entre a atividade hemaglutinante
específica do extrato total e aquela de cada passo de purificação subsequente.
3.1.6 Especificidade por Carboidratos
A especificidade da lectina de sementes de Andira surinamensis por carboidratos
foi determinada pela inibição da atividade hemaglutinante por açúcares simples e
glicoproteínas, os quais foram realizados segundo protocolo adaptado a partir daquele descrito
por Ramos e colaboradores (1996).
O ensaio foi conduzido em tubos de ensaio em duplicata. Foram utilizados 50 μL
de soluções estoques de carboidratos a uma concentração de 0,1 mol/L ou de glicoproteínas a
55
uma concentração de 5 mg/mL, para diluição seriada em tampão Tris-HCl 0,1 mol/L pH 7,6
com NaCl 0,15 mol/L. No primeiro tubo de cada série foram adicionados 50 μL de uma
solução de lectina em uma concentração capaz de provocar uma aglutinação de 4 U.H./mL e
em seguida foram feitas diluições seriadas (1:2, 1:4, 1:8, 1:16...). O ensaio foi incubado a 37
°C por 30 minutos, e logo depois, deixado em repouso por mais 30 minutos à temperatura
ambiente. Decorrido esse período, foram adicionados a cada um dos tubos 100 μL de uma
suspensão a 2 % (v/v) de eritrócitos tripsinisados de coelho. O ensaio foi mais uma vez
incubado a 37 °C durante 30 minutos, e logo depois, mantido em repouso por mais 30
minutos à temperatura ambiente. Os resultados foram observados macroscopicamente com 1
e 12 horas.
A inibição da atividade hemaglutinante pelos açúcares foi então verificada. Para
aqueles carboidratos que se mostraram capazes de inibir a atividade hemaglutinante foi
determinada a concentração mínima inibitória (CMI), a qual corresponde a menor
concentração de açúcar em que permaneceu a ausência de atividade hemaglutinante.
3.1.7 Cromatografia de Afinidade em Matriz de Sepharose-Manose
O extrato total foi submetido à cromatografia de afinidade em matriz de
Sepharose-Manose. Esse extrato foi centrifugado a 10.000 g, temperatura 4 ºC, durante 20
min e, em seguida, 6 mL do sobrenadante, a uma concentração protéica de 8 mg/mL, foram
aplicados em uma matriz de Sepharose-Manose (2 x 3,8 cm), previamente equilibrada com
uma solução de sulfato de amônio [(NH4)2SO4] 1 mol/L. A fração não retida foi lavada com a
mesma solução de equilíbrio enquanto que a fração retida foi eluída com tampão glicina 0,1
mol/L pH 2,6 adicionado de NaCl 0,15 mol/L. Frações de cerca de 1,5 mL foram coletadas
manualmente. As frações foram coletadas a um fluxo de 1 mL/min e as absorbâncias
forammonitoradas por espectrofotometria em um comprimento de onda de 280 nm.
As frações obtidas foram exaustivamente dialisadas contra água destilada e, então,
liofilizadas. A atividade hemaglutinante, o teor de proteínas solúveis e a atividade específica
de todas as frações cromatográficas foram avaliados.
3.1.8 Cromatografia de Troca Iônica em Matriz de DEAE-Sephacel
O pico retido resultante da cromatografia de afinidade foi submetido à
cromatografia de troca iônica em matriz de DEAE-Sephacel, uma resina com trocador
56
aniônico imobilizado (DEAE-dietilaminoetano). O material foi extensivamente dialisado,
liofilizado, solubilizado em Tris-HCl 0,02 mol/L pH 7,6 e centrifugado a 10.000 g,
temperatura 4 ºC, durante 5 min e, em seguida, 4 mL do sobrenadante, com uma concentração
de proteínas de 50 mg/mL, foram aplicados em uma matriz de DEAE-Sephacel (2 x 4,5 cm),
previamente equilibrada com Tris-HCl 0,02 mol/L pH 7,6. O pico não retido foi eluído com a
mesma solução de equilíbrio e o pico retido foi eluído com o tampão de equilíbrio acrescido
de NaCl 1 mol/L. Frações de cerca de 1,5 mL foram coletadas manualmente. As frações
foram coletadas a um fluxo de 1 mL/min e as absorbâncias foram monitoradas por
espectrofotometria em um comprimento de onda de 280 nm.
As frações obtidas foram exaustivamente dialisadas contra água destilada e, então,
liofilizadas. A atividade hemaglutinante, o teor de proteínas solúveis e a atividade específica
de todas as frações cromatográficas foram avaliados. Após esse passo obteve-se a lectina de
sementes de Andira surinamensis (ASL) pura.
3.2 Caracterização da Lectina de Sementes de A. surinamensis
3.2.1 Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS
O monitoramento do processo de purificação e a estimativa da massa molecular
aparente das subunidades da lectina purificada foram realizados por meio de eletroforese em
gel de poliacrilamida na presença de SDS (SDS-PAGE), de acordo com o protocolo
estabelecido por Laemmli (1970) com algumas alterações.
O gel de separação ou corrida (main gel) foi montado a uma concentração de
12,5% preparado em tampão Tris-HCl 0,1 mol/L pH 8,8, contendo SDS 1%, TEMED 0,04%
e persulfato de amônio 0,1%. O gel superior ou de aplicação (stacking gel) foi preparado
usando acrilamida/bisacrilamida 4 % em tampão Tris-HCl 0,1 mol/L pH 6,8, SDS 1 %,
persulfato de amônio 0,1% e TEMED 0,04%.
O extrato protéico total e as amostras liofilizadas oriundas dos dois passos
cromatográficos foram solubilizadas a uma concentração de 1mg/mL em tampão de amostra
contendo Tris-HCl 0,0625 mol/L pH 6,8, 10 % de glicerol, 0,02 % de azul de bromofenol e
1% de SDS. Foram aplicados 15 μL desta preparação em cada poço.
A corrida eletroforética foi realizada em sistema Mini-Protean II mini-gel (Bio-
Rad; Milão, Itália) com a voltagem variando até 150 V, potência até 10 W e amperagem
constante de 25 mA. O tampão de corrida utilizado continha Tris 0,025 mol/L, Glicina 0,192
57
mol/L e SDS 0,1% pH 8,8. Os marcadores de massa molecular utilizados foram: Fosforilase b
(97 kDa), BSA (66 kDa), Ovoalbumina (45 kDa), Anidrase Carbônica (29 kDa), Inibidor de
tripsina (20,1 kDa) e α-lactoalbumina (14,4 kDa). Após a corrida eletroforética, o gel de
separação foi fixado em uma solução contendo 25% isopropanol e 10% ácido acético, por 1
hora. O gel fixado foi então corado em Coomassie R-250 a 0,05%, dissolvido em metanol,
ácido acético e água a uma proporção 1:3,5:8 (v/v/v). A retirada do excesso do corante
(descoramento) foi feita em água destilada aquecida.
3.2.2 Determinação da massa molecular intacta por espectrometria de massa
A massa molecular da ASL foi determinada através da técnica de espectrometria
de massa com Ionização por Eletrospray (ESI) utilizando um instrumento híbrido (Synapt
HDMS, Waters Corp., Milford, USA) operando no modo positivo, com uma resolução de
10.000 e uma exatidão de massa de 3 ppm. Para tal, a proteína foi solubilizada em uma
solução contendo 50% de acetonitrila e 0,1% de ácido fórmico, a uma concentração final de
aproximadamente 1 pmol de proteína. A amostra foi aplicada a um fluxo de 10 μL/minuto e
as voltagens do capilar e do cone foram ajustadas para 3,0 kV e 40 V, respectivamente. A
coleta de dados foi realizada com o auxílio do software Mass Lynx 4.0 e os espectros
multicarregados foram deconvoluídos usando técnicas de maximização da entropia
(FERRIGE et al., 1992).
3.2.3 Digestão in gel e sequenciamento dos peptídeos por espectrometria de massa
A ASL foi aplicada em um gel de 12% de poliacrilamida (SDS-PAGE). As
bandas referentes à proteína foram retiradas do gel e recortadas com auxilio de uma ponteira
plástica. O gel de eletroforese contendo a proteína de interesse foi descorado em uma solução
de 50% de acetonitrila contendo 0,025 mol/L de bicarbonato de amônio, desidratado em
100% de acetonitrila e seco em Speedvac (LabConco). O gel foi então reidratado em uma
solução de 0,05 mol/L de bicarbonato de amônio contendo a enzima tripsina (Promega) na
proporção de 1:50 (p/p; enzima:substrato). A reação de digestão permaneceu overnight a 37
ºC, sendo parada com a adição de ácido fórmico a 2 %.
Os peptídeos oriundos da digestão foram extraídos do gel utilizando uma solução
de 5% de ácido fórmico em 50% de acetonitrila sob agitação durante 15 minutos. Este
procedimento foi repetido por 3 vezes, o sobrenadante contendo os peptídeos extraídos foram
58
unidos e concentrados em Speedvac e avolumados para 25 µL com ácido fórmico 0,1%. Estes
peptídeos foram injetados em um sistema nanoacquit (Waters Corp.) conectado a uma fonte
de nanoeletrospray do espectrômetro de massa (SYNAPT HDMS – Waters Corp.). A amostra
foi aplicada em uma coluna de fase reversa C18 (75 µM x 100 µM) e eluída em um gradiente
de acetonitrila de 10% a 85% contendo 0,1% de ácido fórmico.
O espectrômetro de massa operou em modo positivo, com a temperatura da fonte
de 90 ºC e a voltagem do capilar de 3.0 kV. Os experimentos de LC-MS/MS foram realizados
de acordo com a função DDA (Direct Data Analysis – Análise Direta de Dados) os íons
precursores com carga entre +2 e +4 foram selecionados para análise de MS/MS sendo
fragmentados através de CID (Collision Induced Decomposition – Decomposição induzida
por colisão). Os dados foram coletados, processados e analisados utilizando o programa
MassLynx v4.1 (Waters Corp.) e ProteinLynx v2.4 (Waters Corp.). Os peptídeos comuns a
outras proteínas foram sequenciados por buscas em banco de dados utilizando ferramenta de
pesquisa por padrão de fragmentação dos peptídeos nos programas ProteinLynx (Waters
Corp.) e MASCOT (Matrix Science). Para os demais peptídeos, as sequências foram
determinadas através da interpretação manual dos espectros de fragmentação (sequenciamento
De novo).
3.2.4 Efeito da temperatura sobre a atividade hemaglutinante da ASL
Alíquotas da ASL (1mg/mL) foram separadas em eppendorfs, diluídas em tampão
Tris-HCl 0,1 mol/L pH 7,6 com NaCl 0,15 mol/L, centrifugadas e o sobrenadante resultante
foi utilizado para determinar a termoestabilidade da lectina. Em seguida, cada amostra foi
submetida a diferentes temperaturas variando de 40 ºc a 80 ºc por 60 minutos. Após o
término, foi realizado o ensaio de hemaglutinação com todas as amostras. Cada amostra foi
testada em duplicata.
3.2.5 Efeito do agente quelante (EDTA) sobre a atividade hemaglutinante da ASL
A avaliação da dependência da atividade hemaglutinante da ASL por diferentes
cátions divalentes foi analisada. Para tal fim, uma alíquota da lectina (1 mg/mL) foi
solubilizada em NaCl 0,15 mol/L e dialisada contra soluções de EDTA 0,05 mol/L (pH 8,0)
e 0,02 mol/L (pH 6,0) contendo NaCl 0,15 mol/L por 48 horas, seguida pela diálise exaustiva
contra NaCl 0,15 mol/L para retirada do excesso de EDTA. Após isto, a atividade
59
hemaglutinante foi testada pela adição de 100 µL de soluções de NaCl 0,15 mol/L contendo
CaCl2, MnCl2 , MgSO4, NiSO4, separadamente, a uma concentração de 0,01 mol/L em tubos
de ensaio, onde em seguida foram feitas diluições seriadas em duplicata a partir da adição de
100 μL da lectina (1 mg/mL) e acrescentou-se 100 μL de eritrócitos tripsinizados de coelho a
2 % em cada tubo e levou-se a incubação por 1 hora.
3.2.6 Efeito do pH sobre a atividade hemaglutinante
O efeito do pH sobre a atividade da ASL foi avaliado através de testes de
atividade hemaglutinante. Para isto, a ASL foi solubilizada em Tris-HCl 0,1 mol/L pH 7,6
com NaCl 0,15 mol/L (1 mg/mL) e dialisada por 24 horas contra diferentes soluções tampão
com pH variando de 4,0 a 10,0 contendo NaCl 0,15 mol/L. Os seguintes tampões foram
utilizados: acetato de sódio 0,1 mol/L pH 4,0 e 5,0, citrato de sódio 0,1 mol/L pH 6,0, fosfato
de sódio 0,1 mol/L pH 7,0, Tris-HCl 0,1 mol/L pH 8,0, glicina-NaOH pH 9,0 e 10,0.
3.2.7 Dosagem de carboidratos totais
A ASL foi solubilizada em NaCl 0,15 mol/L, obtendo-se uma solução na
concentração de 1,0 mg/mL e em seguida foi submetida ao método de Dubois e colaboradores
(1956) para a determinação do conteúdo de carboidratos, utilizando-se galactose como
padrão.
3. 3 Avaliação do efeito da ASL sobre o crescimento bacteriano e formação de biofilmes
3.3.1. Microorganismos
Os microorganismos usados nesses experimentos foram: uma bactéria gram-
negativa (Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027) e nove bactérias gram-positivas
(Streptococcus sobrinus ATCC 6715, Staphyilococcus aureus ATCC 25923, Streptococcus
sanguis ATCC 10556, Streptococcus sp. ATCC 15300, Streptococcus oralis ATCC 10557,
Streptococcus mitis ATCC 903, Streptococcus mutans UA 159, Streptococcus pyogenes
ATCC 19615, Streptococcus salivarius ATCC Salivarius). As cepas foram mantidas em uma
cultura estoque de meio TSB (caldo triptico de soja) à -80 ºC com 20% de glicerol.
60
3.3.2. Atividade da lectina sobre o crescimento bacteriano
Para os testes da concentração inibitória mínima (CIM) foram inoculados 50 µL
de cada cepa bacteriana em 5 mL de meio TSB caldo e incubados em estufa por 24 horas a 37
ºC com 10% de CO2 . Após esse período, um novo inóculo de 50 µL do tubo já crescido em
um meio novo com 5 mL de TSB foi incubado por 18 horas, sob as mesmas condições
anteriormente descritas. Em seguida, as cepas foram centrifugadas a 5000 rpm por 5 minutos
a 4 ºC e lavadas 3 vezes com NaCl 0,15 mol/L. Esse mesmo procedimento foi realizado para a
bactéria aeróbica Staphylococcus aureus, mas essa espécie foi incubada em estufa sem
emissão de CO2. Após esse processo foi verificada a absorbância (OD620nm) em um
espectrofotômetro de luz visível (Ultrospec 2100 pro, Amersham, Bioscience). A partir da
absorbância foi quantificada a concentração inicial da bactéria e para isso foi necessário a
utilização da fórmula abaixo:
CT = [( 4x109. OD] -1x10
8]
onde CT corresponde a concentração total de bactérias e OD é a densidade ótica verificada a
620 nm.
As diluições foram feitas em placas de microtitulação de 96 poços onde foram
adicionados 100 µL (1mg/mL) da lectina solubilizados em NaCl 0,15 mol/L nos primeiros
poços e 50 µL de NaCl 0,15 mol/L nos demais e depois foi realizada a diluição seriada na
base dois para obtenção de diferentes concentrações (15,6 a 1.000 µg/mL). Em seguida foram
adicionados em cada poço 50 µL da bactéria na concentração de 1 x 106
UFC/mL e após 1
hora de contato à 37 ºC (lectina-bactéria) adicionou-se 100 µL de meio TSB (2x concentrado).
Após a montagem das placas foi feita uma leitura inicial da OD620nm (Biotrak II Plate Reader–
Amersham Biosciences) e em seguida foram realizadas leituras periódicas em 12, 18 e 24
horas de incubação a 37 ºC em estufa com 10% de CO2.
3.3.3. Efeito da lectina sobre a formação de biofilmes
A formação de biofilmes foi avaliada através de testes em placas de micro-
titulação de 96 poços de fundo chato, segundo metodologia adaptada de Islan e colaboradores
(2009). Para os Streptococcus envolvidos em patologias orais foi realizada a seguinte
metodologia: as placas receberam 100 µL de saliva e 100 µL de tampão carbonato de sódio
0,2 mol/L pH 9,3. Essa mistura foi incubada por 2 horas a 4 ºC e logo em seguida foi lavada
61
duas vezes com tampão PBS 0,01 mol/L pH 7,4. Após a lavagem foram adicionados 50 µL da
lectina previamente diluída (15,6 a 1.000 µg/mL) em cada poço, 50 µL de bactéria (1 x 106
UFC/mL) e 100 µL de meio TSB 2x concentrado com 2% de sacarose. As placas foram então
incubadas por 24 h a 37 ºC em estufa de CO2. Para a bactéria Staphylococcus aureus não foi
preciso adicionar saliva e nem tampão.
A revelação dos biofilmes foi feita pela remoção do meio de cultura dos poços,
seguida da lavagem das placas na lavadora de placas. Logo depois foram adicionados 200 µL
de metanol, para fixação do biofilme, a 95% (PA) por 10 minutos e após esse período o
mesmo foi retirado e as placas foram deixadas secar em temperatura ambiente. Em seguida
adicionou-se 200 µL de cristal violeta a cada poço por 10 minutos. Decorrido esse tempo, o
cristal violeta foi removido por meio da lavagem das placas e estas foram colocadas para
secar por 30 minutos. Por fim, adicionou-se 200 µL de ácido acético 33% em cada poço por
10 minutos e em seguida transferiu-se 100 µL para outra placa de fundo chato. A absorbância
foi verificada a 590 nm em espectrofotômetro ELISA.
3.3.4 Análise estatística
As análises estatísticas foram realizadas pelo programa GraphPad Prism® versão
5 (Microsoft Windows®). O método usado foi ANOVA com pós teste de Bonferroni. Os
dados foram obtidos em triplicata a partir de três experimentos independentes. Os gráficos
foram apresentados com valores de média e desvio padrão médio. Valores de p menores que
0,01 foram considerados estatisticamente significantes.
62
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
63
4.1 Purificação e caracterização pela especificidade a carboidratos da lectina de
sementes de Andira surinamensis
A ASL mostrou atividade hemaglutinante contra eritrócitos de coelho (nativos,
papainados e tripsinizados) e fraca atividade para eritrócitos humanos do sistema ABO
enzimaticamente tratados, sendo que os maiores títulos de hemaglutinação foram verificados
para os eritrócitos de coelho tratados com enzimas proteolíticas (Tabela 3). A sensibilidade
das células à aglutinação por lectinas pode ser aumentada enzimaticamente (tripsina, papaína
ou neuraminidase) (SHARON; LIS, 1972); isto ocorre pelo fato destas enzimas atuarem
clivando certas proteínas da superfície da membrana celular dos eritrócitos, podendo expor
melhor carboidratos que compõem o glicocálice. Isso permite que as lectinas tenham um
maior acesso a estes, aumentando assim os títulos de hemaglutinação (NAGANO et al., 2002;
PINTO et al., 2008).
Tabela 3- Atividade hemaglutinante da ASL
Eritrócitos Tratamento enzimático
Tripsina Papaína Nativo
Coelho
Humano tipo A
Humano tipo B
Humano tipo O
2048*
2
2
2
1024
2
ND**
2
32
ND
ND
ND
*Valores expressos em termos de Unidade Hemaglutinante (U.H.)
**ND: Não detectado
A especificidade da ASL por carboidratos foi determinada pelo ensaio de inibição
da atividade hemaglutinante contra diferentes soluções de açúcares. Os melhores resultados
foram obtidos com N-acetil-D-glicosamina, glicose, manose, sacarose, respectivamente
(Tabela 4). A lectina de sementes de Platymiscium floribundum também foi inibida por N-
acetil-D-glicosamina e manose (PEREIRA JÚNIOR, 2011). Em outra espécie da tribo
Dalbergieae, Lonchocarpus sericeus, existe uma lectina que também mostrou ser específica
por resíduos de N-acetil-D-glicosamina (ALENCAR, et al., 1999). Enquanto isso, as lectinas
de sementes de Pterocarpus angolensis (LORIS et al., 2003) e Platypodium elegans
(BENEVIDES, 2008) foram inibidas por glicose e manose. De forma diferente, a lectina de
sementes de Vatairea macrocarpa (VML), também da mesma tribo, apresenta especificidade
por galactose e alguns derivados (CAVADA et al., 1998).
64
Tabela 4- Inibição da atividade hemaglutinante da ASL por carboidratos
Carboidrato CMI* (mM)
Carragenana
ND**
Glicose
25
Manose
25
Glc-Nac
12,5
Galactose
ND
Sacarose
50
Xilose
ND
Arabinose ND
L-fucose ND
D-Lactose
ND
Mucina
ND**
* Concentração Mínima Inibitória em mM;
** O carboidrato não inibiu a uma concentração de 5mg/ mL.
A ASL foi purificada através de duas etapas cromatográficas. Para isto, o extrato
total foi submetido à cromatografia de afinidade em matriz de Sepharose-manose (Gráfico 1).
Após eluição do pico não retido, o pico retido da cromatografia de afinidade foi aplicado em
matriz de DEAE-Sephacel, para realização de uma cromatografia de troca iônica (Gráfico 2).
Essas duas cromatografias proporcionaram a purificação da ASL com um grau de pureza de 4
vezes, quando comparado o pico retido eluído da cromatografia de troca iônica em relação ao
pico retido eluído da cromatografia de afinidade (Tabela 5).
65
Gráfico 1- Cromatografia de afinidade em matriz de Sepharose-Manose
Amostra: 8 mL (8 mgP/mL) de extrato total em sulfato de amônio ((NH4)2SO4) 1 mol/L, aplicados em matriz de
Sepharose-Manose. Volume da coluna: 7 mL. Volume aplicado: 6 mL. Solução de equilíbrio: Sulfato de Amônio
1 mol/L. Solução de Eluição: Glicina 0,1 M pH 2,6 NaCl 0,15 mol/L. Frações coletadas: 1,5 mL. Fluxo: 1
mL/min. Abs: 280 nm.
Gráfico 2- Cromatografia de troca iônica em matriz de DEAE-Sephacel
Amostra: 50 mg da fração retida/ 1mL de Tris-HCl 0,02 mol/L pH 7,5, aplicados em matriz de DEAE-
Sephacel. Volume da coluna: 12 mL. Volume aplicado: 4 mL. Solução de equilíbrio: Tris-HCl 0,02 mol/L pH
7,5. Solução de Eluição: Tris-HCl 0,02 mol/L pH 7,5 NaCl 1 mol/L . Frações coletadas: 1,5 mL. Fluxo: 1
mL/min. Abs: 280 nm.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51
Ab
s 2
80
nm
Frações (1,5 mL/tubo)
pH 2,6
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1 4 7 10 13 16 19 22
Ab
s 2
80
nm
Frações (1,5 mL/tubo)
NaCl 1M
66
Tabela 5- Tabela de purificação da ASL
Fração
a)Proteínas
(mg/mL)
b) U.H./mL
c) A.H.E.
(U.H./mgP)
d) Fator de
Purificação
Extrato total
Manose (pico retido)
ASL
8
1
1
128
512
2048
16
512
2048
1
32
128
a) Concentração de proteínas solúveis (mg/mL);
b) Atividade hemaglutinante contra eritrócitos de coelho tratados com tripsina, expressa em termos de Unidade
Hemaglutinante (U.H./mL);
c) Atividade Hemaglutinante Específica calculada como a relação entre a atividade hemaglutinante e a
concentração de proteínas;
d) Fator de Purificação, calculado como a relação entre a atividade hemaglutinante específica do extrato total e
aquela de cada passo de purificação subsequente.
4.2 Caracterização físico-química da lectina de sementes de A. surinamensis
A purificação da ASL foi monitorada por SDS-PAGE na presença ou ausência do
agente redutor β-mercaptoetanol. A figura 14 mostra o perfil eletroforético das frações
protéicas correspondentes aos diferentes estágios de purificação da lectina. A lectina
purificada é caracterizada por um perfil eletroforético composto por seis bandas protéicas:
uma de maior peso molecular aparente de aproximadamente 20 kDa e outras cinco bandas de
menor peso molecular aparente entre 15 e 12 kDa. A lectina de sementes de Vatairea
macrocarpa, espécie pertencente à tribo Dalbergieae, possui um perfil eletroforético
composto por quatro bandas, sendo duas delas de peso molecular aparente maior, de 34 e 32
kDa, e duas bandas de peso molecular aparente menor, de 22 e 13 kDa (CAVADA et al.,
1998), sendo que as bandas de 22 e 13 kDa correspondem aos fragmentos C-(beta)-terminal e
N-(gama)-terminal da cadeia alfa, respectivamente (CALVETE et al., 1998).
Entretanto, em outras duas espécies, também da tribo Dalbergieae, foram isoladas
duas lectinas, sendo que cada uma delas apresentou um perfil eletroforético composto por
apenas uma banda. A lectina de sementes de Platymiscium floribundum caracteriza-se por
uma banda única de massa molecular aparente de aproximadamente 29 kDa, tanto na presença
quanto na ausência do agente redutor (PEREIRA JÚNIOR, 2011) e a lectina de Platypodium
elegans apresentou uma banda dupla de massa molecular aparente de 30 kDa (BENEVIDES,
2008).
67
Figura 14- SDS-PAGE
Poços: 1- Marcadores moleculares (Fosforilase b 97 kDa, BSA 66 kDa, Ovoalbumina 45 kDa, Anidrase
Carbônica 29 kDa, Inibidor de tripsina 20,1 kDa e α- lactoalbumina 14,4 kDa), 2- Extrato total, 3- PII
Manose, 4- PII DEAE (não reduzido), 5- PII DEAE (reduzido) e 6- VML.
A quantificação de carboidratos totais, realizada pelo método de Dubois, mostrou
que a ASL é uma glicoproteína apresentando cerca de 2% de carboidratos, sendo que essa foi
a mesma quantidade encontrada para a lectina de sementes de Platymiscium floribundum.
Para as lectinas de Platypodium elegans e de Vatairea macrocarpa também foi realizada a
quantificação de carboidratos totais verificando-se que as duas também são glicoproteínas
compostas de aproximadamente 7% e 8% de carboidratos, respectivamente.
ASL apresentou considerável termoestabilidade, pois manteve sua atividade
hemaglutinante mesmo após incubação a 60 ºC por 1 hora. No entanto, a atividade
hemaglutinante decaiu significativamente quando a lectina foi submetida a temperaturas
iguais ou superiores a 70 ºC (Figura 14). De forma oposta, Cavada e colaboradores (1998)
verificaram que a VML mostrou-se com significativa termoestabilidade, uma vez que reteve
55% de sua atividade após exposição a 100 ºC por 5 minutos.
68
Gráfico 3- Estabilidade térmica da lectina de Andira surinamensis
Amostra: 1 mg ASL/ 1mL de Tris-HCl 0,1 mol/L pH 7,6 NaCl 0,15 mol/L. Temperaturas: 40 ºC, 50 ºC, 60 ºC,
70 ºC, 80 ºC.
Quanto à estabilidade em uma ampla faixa de pH, a ASL também mostrou-se
bastante estável, exibindo seus maiores títulos de hemaglutinação na faixa de pH entre 7,0 e
9,0, mostrando que essa é a faixa de pH ótimo para sua atividade. Porém, a atividade
hemaglutinante foi reduzida de forma significativa em valores extremos de pH (Figura 15) .
Gráfico 4- Estabilidade da lectina de Andira surinamensis a uma ampla faixa de pH
pH
Amostra: 1 mg ASL/ 1mL de Tris-HCl 0,1 mol/L pH 7,6 NaCl 0,15 mol/L. Diálise por 24 horas contra diferentes
soluções tampão contendo NaCl 0,15 mol/L. Tampões: acetato de sódio 0,1 mol/L pH 4,0 e 5,0, citrato de sódio
0,1 mol/L pH 6,0, fosfato de sódio 0,1 mol/L pH 7,0, Tris-HCl 0,1 mol/L pH 8,0, glicina-NaOH pH 9,0 e 10,0.
Uma das características principais das lectinas de leguminosas é o fato de que estas
possuem sítios de ligação a cátions divalentes, principalmente cálcio e manganês, em suas
estruturas. Esses íons atuam estabilizando a estrutura do sítio de ligação a carboidratos e sua
0
200
400
600
800
1000
1200
40 50 60 70 80
U.H
./m
L
0
10
20
30
40
50
60
70
4 5 6 7 8 9 10
U.H
. /m
L
Temperatura (ºC)
69
ausência resulta em uma instabilidade local e na perda da capacidade de ligar-se a
carboidratos (LORIS et al., 2004). A atividade hemaglutinante da lectina de sementes de
Andira surinamensis foi afetada após a proteína ter sido submetida a uma diluição seriada na
presença de EDTA 0,05 mol/L. Após a adição de cátions divalentes, a lectina recuperou
significativamente sua atividade. Em relação a outras lectinas de sementes de espécies
pertencentes à tribo Dalbergieae, a lectina de Pterocarpus angolensis teve sua atividade
hemaglutinante totalmente perdida após tratamento com EDTA (ECHEMENDIA-BLANCO
et al., 2009). A lectina de sementes de Platypodium elegans também teve sua atividade
hemaglutinante comprometida pela presença do agente quelante, sendo revertida após a
adição dos cátions divalentes (BENEVIDES, 2008). Enquanto isso, a lectina de Platymiscium
floribundum não teve sua atividade hemaglutinante afetada após tratamento com EDTA
(PEREIRA JÚNIOR, 2011).
Tabela 6 - Efeito do EDTA sobre a atividade hemaglutinante da ASL
U.H./mL
pH 6,0 (0,02 mol/L) U.H./mL
pH 8,0 (0, 05 mol/L)
Sem metal: 4
MnCl2: 64
CaCl2: 64
MgSO4: 64
NiSO4: 32
Sem metal: 4
MnCl2: 16
CaCl2: 32
MgSO4: 16
NiSO4: 8
Gráfico 5- Efeito do EDTA sobre a atividade hemaglutinante da ASL
S.M: sem metal, Mn: manganês, Ca: cálcio, Mg: magnésio, Ni: níquel
0
10
20
30
40
50
60
70
S.M. Mn Ca Mg Ni
U.H
./m
L
Metais
pH 6,0
pH 8,0
70
4.3 Determinação da Massa Molecular e Sequenciamento por Espectrometria de
Massa
A massa molecular média da lectina purificada foi determinada através da técnica
de espectrometria de massa com Ionização por Eletrospray (ESI). A análise do espectro de
massa mostrou a presença de dois íons majoritários de massa molecular de 12.220+ 2 e
13.258 + 2 Da (Gráfico 5).
Gráfico 6- Espectro de massa deconvoluído mostrando a massa isotópica média das cadeias
da ASL.
Os peptídeos oriundos das digestões com tripsina foram aplicados ao
espectrômetro de massa e dados coletados foram processados e analisados utilizando o
programa MassLynx v4.1 (Waters Corp) e ProteinLynx v2.4 (Waters Corp). Os peptídeos
comuns a outras proteínas foram identificados por buscas em banco de dados utilizando
ferramentas de pesquisa por padrão de fragmentação dos peptídeos nos programas
ProteinLynx e MASCOT (Matrix Science). Foram encontrados peptídeos da ASL comuns aos
da sequência da lectina de Bowringia mildbraedii, a qual foi utilizada como modelo para
ESI 10 PMOL 20 UL/MIN
mass 11600 11800 12000 12200 12400 12600 12800 13000 13200 13400 13600 13800 14000 14200 14400 14600 14800
%
0
100 20090910_A_RETUSA_02 1 (0.034) M1 [Ev-274760,It29] (Gs,0.750,500:2199,1.00,L33,R33) TOF MS ES+
4.68e3 12220.0010
12213.0010
12189.0010
12119.0010
13258.0010
12236.0010 12243.0010
12302.0010
13187.0010 12323.0010
12337.0010 12403.0010
13329.0010
13367.0010 13443.0010
14350.0010 13748.0010 14333.0010
14541.0010 14747.0010
71
auxiliar no sequenciamento da ASL. Os demais peptídeos foram sequenciados manualmente
por sequenciamento De novo utilizando a ferramenta PepSequence do programa MassLynx
v4.1 (Waters Corp). Alguns dos petídeos que compõe a sequência parcial da ASL estão
mostrados na Tabela 6.
Tabela 7- Sequência obtida por espectrometria de massa sequecial (MS/MS) dos peptídeos
oriundos de digestão tríptica da ASL
BANDA
M/Z
(razão
massa/carga)
MASSA
OBSERVADA
MASSA
CALCULADA
PEPTÍDEO
B6 476.75 951.4844 951.5178 ALYYAPVR B4 674.86 1347.7043 1347.7285 PVLVSYDVELSK B5 343.66 685.3044 685.3547 PEWVR B5 421.75 841.4844 841.5021 VATVSLPR
A partir das sementes de Bowringia mildbraedii, espécie pertencente à tribo
Sophoreae, foi isolada uma lectina manose/N-acetil-glicosamina específica, denominada
BMA (CHAWLA et al.,1993). Como citado anteriormente, alguns peptídeos dessa proteína
foram comuns àqueles encontrados para ASL e com base nesse achado a sequência da BMA
serviu de molde para o sequenciamento parcial da ASL.
Essas duas lectinas, embora pertencentes a tribos diferentes da subfamília
Papilionoideae apresentam outras características em comum, além das semelhanças
verificadas em suas sequências primárias. Ambas mostram especificidade a resíduos de
manose/N-acetil-glicosamina e os dados de massa intacta da BMA revelam a presença de duas
espécies iônicas predominantes com massas moleculares de 13.596 e 12.115 Da,
correspondendo às subunidades α e β2, respectivamente (CHAWLA et al.,1993). Esses
valores estão bem próximos daqueles encontrados para ASL (12.220+ 2 e 13.258 + 2 Da).
A sequência primária de BMA também mostrou uma extensiva homologia com
outras sequências de lectinas de leguminosas, tais como: ConA (Canavalia ensiformis), favina
(Vicia faba), ECorL (Erythrina corallodendron), SBA (Glycine max) e UEA I (Ulex
europaens). O sítio de proteólise pós-traducional do precursor de BMA ocorre em uma
posição similar ao identificado em lectinas obtidas de outras espécies da tribo Sophoreae, tal
como Sophora japonica, e em lectinas Diocleineae, como ConA, mas ele é diferente daquele
encontrado em lectinas “a duas cadeias” (tribo Vicieae, por exemplo) obtidas de outras tribos
da subfamília Papilionoideae (CHAWLA et al.,1993).
72
A composição polipeptídica de BMA mostra que ela é formada por um precursor
de aproximadamente 29 kDa e que durante o processamento pós-traducional é clivado em
dois fragmentos de aproximadamente 13,3 kDa (subunidade α) e 11,9 kDa (subunidade β).
Essa subunidade β corresponde ao N-terminal da proteína madura (β1, β2 e β3), sendo que o
mais proeminente dos três é β2. A lectina assume a estrutura de um dímero (αβ)2 e as duas
subunidades β componentes desse dímero encontram-se unidas através de uma ponte
dissulfeto intercadeia.
A homologia na sequência de BMA e na sequência parcial de ASL reforçam a
possibilidade de uma origem evolucionária em comum e sugere a manutenção de alguma
função fisiológica ainda a ser determinada em estudos futuros. Além disso, o modelo de
processamento pós-traducional de BMA poderia ser considerado para ASL, uma vez que o
perfil eletroforético das duas lectinas é bem semelhante.
4.4 Avaliação do efeito da ASL sobre o crescimento bacteriano e formação de biofilmes
A ASL interferiu no crescimento planctônico de duas diferentes cepas bacterianas
gram-positivas (Streptococcus mitis e Streptococcus salivarius) e na formação de biofilme por
Staphylococcus aureus e Streptococcus salivarius.
ASL induziu o crescimento planctônico de Streptococcus mitis nas três maiores
concentrações inicialmente testadas (1.000, 500 e 250 µg/mL) (Gráfico 6), enquanto que para
Streptococcus salivarius, a lectina mostrou-se como um estímulo significante para o
crescimento em todas as concentrações testadas (Gráfico 7).
73
Gráfico 7- Avaliação do potencial da lectina de sementes de Andira surinamensis (ASL) sobre
o crescimento planctônico de Streptococcus mitis ATCC 903.
S. mitis ATCC 903
010
00 500
250
125
62,5
31,2
515
,60.0
0.5
1.0
1.5*** *** ***
[ ] ASL (g/mL)
O.D
. 62
0n
m
*** p < 0, 0001 estatisticamente significante em relação ao controle.
Gráfico 8- Avaliação do potencial da lectina de sementes de Andira surinamensis (ASL) sobre
o crescimento planctônico de Streptococcus salivarius ATCC Salivarius.
S. salivarius ATCC Salivarius
010
00 500
250
125
62,5
31,2
515
,6
0.0
0.5
1.0
1.5
****** ***
******
******
[ ] ASL g/mL
O.D
. 6
20
nm
*** p < 0, 0001 estatisticamente significante em relação ao controle.
No processo de formação de biofilmes, ASL mostrou induzir a biomassa da
espécie Staphylococcus aureus nas duas maiores concentrações inicialmente testadas (1.000 e
74
500 µg/mL) (Gráfico 8). De maneira oposta, essa lectina diminuiu a formação de biofilmes da
espécie gram-positiva Streptococcus salivarius em todas as concentrações testadas (Gráfico
9).
Gráfico 9- Avaliação do potencial antibiofilme da lectina de sementes de Andira surinamensis
(ASL) sobre o desenvolvimento do biofilme de Stafilococcus aureus ATCC 25923.
S. aureus ATCC 25923
010
00 500
250
125
62,5
31,2
515
,60
1
2
3 ***
***
[ ] ASL g/mL
O.D
. 59
0n
m
*** p < 0, 0001 estatisticamente significante em relação ao controle.
Gráfico 10- Avaliação do potencial antibiofilme da lectina de sementes de Andira
surinamensis (ASL) sobre o desenvolvimento do biofilme de Streptococcus salivarius ATCC
Salivarius.
*** p < 0, 0001 estatisticamente significante em relação ao controle.
S. salivarius ATCC Salivarius
010
00 500
250
125
62,5
31,2
515
,60.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
*** ***
***
******
******
[ ] ASL g/mL
O.D
. 59
0n
m
75
Por outro lado, a ASL não interferiu no crescimento planctônico e na formação de
biofilmes das demais cepas testadas (Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Streptococcus
sobrinus ATCC 6715, Streptococcus sanguis ATCC 10556, Streptococcus sp. ATCC 15300,
Streptococcus oralis ATCC 10557, Streptococcus mutans UA 159, Streptococcus pyogenes
ATCC 19615) (dados não mostrados).
As bactérias, assim como quase todos os outros microorganismos, expressam
carboidratos que ficam expostos na sua superfície. Esses carboidratos, tais como
peptideoglicanos, ácidos teóicos e lipopolissacarídeos são sítios reativos potenciais para
lectinas. Essas moléculas promovem a agregação direta de microorganismos em suspensão,
devido à sua habilidade de formar complexos com os glicoconjugados da superfície
bacteriana (SANTI-GADELHA et al., 2006). Lee e colaboradores (1998) examinaram
interações entre lectinas de várias especificidades e várias espécies de Streptococcus orais.
Eles observaram que certas lectinas apenas interagem com algumas espécies, indicando que
lectinas podem ser usadas para agregação de determinados organismos alvos.
A ASL estimulou o crescimento planctônico de Streptococcus mitis e
Streptococcus salivarius e esse comportamento pode ser decorrente da baixa/fraca
especificidade de ligação dos carboidratos da superfície bacteriana à lectina em questão. Essa
lectina é glicose/manose específica e os carboidratos que estão na superfície dessas bactérias
provavelmente não estão expostos ou não estão disponíveis para interação com a lectina por
conta de algum impedimento estérico, impossibilitando a interação lectina/carboidrato e a
conseqüente inibição do crescimento planctônico.
Segundo Aas e colaboradores (2005), Streptococcus mitis é a bactéria comensal
que se encontra em maior quantidade na cavidade oral de pessoas saudáveis. A microflora
residente beneficia o hospedeiro por agir como parte das defesas dele e prevenir a colonização
por microorganismos exógenos (e frequentemente patogênicos). Esse processo é conhecido
por “colonização de resistência”. O conceito de mudança ecológica microbiana como um
mecanismo para prevenir o dano dental é importante. Sendo assim, o aumento do
crescimento de S. mitis poderia assegurar a manutenção saudável da superfície do dente e da
cavidade oral, evitando a colonização desse ambiente por outra bactéria patogênica, como por
exemplo, Streptococcus mutans.
O estímulo na formação do biofilme de Staphylococcus aureus ocorreu
provavelmente pela necessidade de estabelecimento de uma espécie colonizadora inicial para
a formação do biofilme. Uma vez que os carboidratos presentes na superfície bacteriana
possivelmente não se ligam à ASL, a bactéria estabeleceria uma ligação com os componentes
76
salivares da película adquirida pelo esmalte, consolidando a adesão à superfície do dente para
uma posterior formação do biofilme.
Segundo Wong e colaboradores (2010), as lectinas vegetais inibem o crescimento
de microorganismos (bactérias, fungos) pela ligação aos carboidratos presentes na parede
celular desses microorganismos, uma vez que elas não são capazes de se ligar às moléculas
que estão nas membranas celulares ou penetrar no citoplasma devido à barreira formada pela
parede celular. Sendo assim, a formação do biofilme de Streptococcus salivarius esteve
comprometida pela presença da ASL, semelhante ao que foi visto por Teixeira e
colaboradores (2006) e Cavalcante e colaboradores (2011) para outras lectinas de leguminosas
glicose/manose específicas quando testadas contra diferentes espécies gram-positivas.
Um outro fato interessante foi observado para Streptococcus salivarius: ASL
aumentou o crescimento planctônico dessa espécie e comprometeu a formação do biofilme.
Segundo Liljemark; Schauer (1981) isso pode acontecer porque a formação de grandes
agregados causa uma diminuição no número de bactérias aderentes e indica que acima de uma
certa concentração de lectina, a atividade agregante da proteína não se opõe ao seu efeito
bloqueador e ajuda a diminuir o número de Streptococcus aderentes.
77
5 CONCLUSÃO
78
Uma lectina específica para manose e N-acetil-D-glicosamina foi purificada a
partir das sementes de Andira surinamensis. A ASL mostrou-se estável quando submetida a
uma ampla faixa de temperatura e pH, mas teve sua hemaglutinante comprometida quando na
presença de agente quelante. O espectro de massa intacta da ASL mostrou a presença de dois
íons majoritários de massa molecular de 12.220+ 2 e 13.258 + 2 Da. ASL interferiu no
crescimento planctônico de duas diferentes cepas bacterianas gram-positivas (Streptococcus
mitis e Streptococcus salivarius) e na formação de biofilme por Staphylococcus aureus e
Streptococcus salivarius.
Com a execução do presente trabalho, novas informações são somadas ao estudo
de lectinas da tribo Dalbergieae. Este estudo também reforça a importância das interações
lectina-carboibratos e seu potencial como ferramenta biotecnológica. Experimentos adicionais
são necessários para a determinação da sequência primária completa e para a elucidação dos
mecanismos moleculares específicos responsáveis pela interferência da ASL no crescimento
planctônico bacteriano e na formação de biofilmes
79
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