UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ – UFC

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ECOLOGIA E RECURSOS

NATURAIS

TAYSLA ROBERTA ALMEIDA DE LIMA

LIGNINA É UM BOM PREDITOR DA RESISTÊNCIA DE ESPÉCIES AO ESTRESSE

HÍDRICO?

FORTALEZA

2015

TAYSLA ROBERTA ALMEIDA DE LIMA

LIGNINA É UM BOM PREDITOR DA RESISTÊNCIA DE ESPÉCIES AO ESTRESSE

HÍDRICO?

Dissertação submetida à Coordenação do

Curso de Pós-Graduação em Ecologia e

Recursos Naturais – PPGERN da Universidade

Federal do Ceará, como requisito parcial para a

obtenção do grau de Mestre em Ecologia e

Recursos Naturais.

Área de Concentração: Ecologia e Recursos

Naturais

Orientadora: Profª. Drª. Francisca Soares de Araújo

Co-orientadores:

Prof. Dr. Fernando Roberto Martins/UNICAMP

Profa. Dra. Jullyana Cristina Magalhães Silva Moura Sobczak /UNILAB

FORTALEZA

2015

Agradecimentos

Agradeço a Deus pelo dom da vida, e por me dar forças todos os dias para

concluir essa etapa da minha vida.

A minha família que sempre me apoiou e em especial a minha mãe Nazaré

Almeida, pelo amor, dedicação e grande incentivo aos estudos. Ao meu

companheiro Felipe Macêdo, pelo amor e compreensão.

A minha orientadora professora Francisca Soares de Araújo, pela orientação,

dedicação, incentivo, paciência, por sempre estar presente e disposta a ajudar, e

aos ensinamentos da vida acadêmica.

Aos meus co-orientadores Prof. Dr. Fernando Roberto Martins e Profa. Dra. Jullyana

Cristina Magalhães Silva Moura Sobczak e ao Prof. Dr. Rafael Oliveira pela

colaboração da realização desse trabalho.

Ao professor Enéas Gomes Filho do departamento de Bioquímica e Biologia

Molecular, pelos ensinamentos e por disponibilizar o laboratório de Fisiologia

Vegetal para a realização das análises da lignina.

A prof. Dra. Arlete Aparecida Soares do departamento de Biologia, por

disponibilizar o laboratório de Anatomia Vegetal para a realização das análises. Ao

prof. Dr Rafael Oliveira pela colaboração e ensinamentos.

Agradeço a Rafael Miranda por todo o ensinamento laboratorial, o qual esteve

presente durante todas as análises, e pela enorme paciência.

A todos os colegas que fazem parte do laboratório de Fitogeografia, que

sempre estiveram dispostos a ajudar, em especial a Ellen Dantas, Bruno Menezes, a

Clemir Oliveira e George Tabatinga pela ajuda no campo.

A minha família de coração, pois sempre estiveram presente nos momentos

que mais precisei; Dayse Teixeira, Monna Ramalho, Gustavo Nobre, Joemilia

Macêdo e Joalana Macêdo.

Á FUNCAP pela concessão de bolsa de estudo durante os dois anos de

Mestrado, e pelo auxilio financiamento para a realização desta pesquisa (PPS-

0088-00023.01.00/13 spu NO. 136984355). Também agradecemos a Fazenda

Experimental Vale do Curu pelo apoio logístico.

Resumo

Espécies de plantas de clima tropical sazonalmente resistem à seca por tolerância

ou evitação, mantendo ou perdendo folhas, respectivamente. Atributos da madeira

estão relacionados à resistência à seca e a lignina é um dos principais componentes

da madeira. Investigamos se a lignina está relacionada ao tempo de retenção foliar

(LR). Selecionamos 22 espécies, determinamos o teor de lignina do caule pelo ácido

tioglicólico e quantificamos os monômeros guaiacil (G) e siringil (S) by thioacidolysis

e GC-MS analysis. Dentre as espécies, selecionamos 15 espécies para medir a

vulnerabilidade ao embolismo pelo método pneumático. Incluímos medidas da

densidade da madeira, saturação de água no caule e potencial hídrico do caule na

estação seca, publicadas por outros autores. Nossas análises mostraram haver duas

maneiras de sobreviver à seca. Um pequeno grupo de espécies, para as quais a

lignina parece não ter importância, armazena água no caule e perde folhas logo no

final da estação chuvosa. Um grande grupo de espécies, que vão desde decíduas

precoces até sempre verdes, retêm folhas na estação seca por tempos cada vez

mais longos quanto maior a razão S/G. Maiores valores da razão S/G permitem

maior LR por diminuir a vulnerabilidade ao embolismo.

Palavras-chave: Atributos da madeira, Guaiacil, Sempre verdes, Siringil,

Vulnerabilidade ao embolismo.

Abstract

Tropical plant species resist seasonal drought by avoidance or tolerance, keeping or

losing leaves, respectively. Since drought resistance is influenced by wood attributes

and lignin is a major component of wood, we investigated whether lignin is related to

foliar retention time (LR). We selected 22 species, determined the stem lignin content

by thioglycolic acid and quantified guaiacyl (G) and syringyl (S) monomers by

thioacidolysis and GC-MS analysis. Among these species, we selected 15 species to

measure vulnerability to embolism by pneumatic method. In our analyses, were

considered measures of wood density, stem water saturation and stem water

potential in the dry season, published by other authors. Our analyses showed that

there are two ways of surviving drought. A small group of species, for which the lignin

does not seem to matter, stores water in the stem and loses leaves right at the end of

the rainy season. A large group of species, from early deciduous to evergreens,

retains leaves in the dry season for increasingly longer periods the higher the S/G

ratio is. Higher values of the S/G ratio allow greater LR by reducing vulnerability to

embolism.

Keywords: Evergreen, Guaiacyl, Syringyl, Vulnerability to embolism, Wood traits.

Lista de figuras

Figura 1. Diagrama climático de Walter e Lieth (clima normal). Estação

meteorológica da fazenda Experimental do Vale do Curu, município de Pentecoste,

estado do Ceará, Brasil..............................................................................................14

Figura 2. Climatograma de Walter e Lieth do ano da coleta de dados. Estação

meteorológica da Fazenda Experimental do Vale do Curu, município de Pentecoste,

estado do Ceará, Brasil..............................................................................................15

Figura 3. Análise de componentes principais com lignina, S/G, guaiacil (G),

densidade da madeira (WD) e potencial hídrico do caule na estação seca (Ψ dry

season) de espécies sempre verdes (EG), decíduas tardias (LD) e decíduas

precoces (ED). Os números se referem às espécies da tabela 1..............................22

Figura 4. Análise de componentes principais para 15 espécies, com lignina, S/G,

guaiacil (G), densidade da madeira (WD), potencial hídrico na estação seca (Ψ dry

season) e potencial com perda de 50% da condutividade (Ψ50). Espécies sempre

verdes (EG), decíduas tardias (LD) e decíduas precoces (ED). Os números se

referem às espécies da tabela 1................................................................................23

Figura 5. Análise de regressão linear entre retenção foliar (número de meses de

permanência das folhas na árvore) e a razão S/G. Sempre verde (EG), decíduas

tardias (LD) e decíduas precoces (ED)......................................................................24

Lista de tabelas

Tabela 1. Espécies analisadas com as classificações da fenodinâmica foliar, tempo

de retenção foliar, LR (meses), densidade da madeira, WD (g cm−3), saturação de

água no caule, QWsat (%), potencial hídrico do caule na estação seca, Ψ Dry

season (Ψ-MPa), teor de lignina (µg mg-1 dry wt), siringil, S (µmol g-1 dry wt),

guaiacil, G (µmol g-1 dry wt), a razão S/G, valores da perda de 50% da

condutividade, Ψ50 e margem de segurança, Safety margins Ψ50. *dados Oliveira et

al. (2015)...................................................................................................................20

Tabela 2. Correlação entre lignina, siringil (S), guaiacil (G), razão S/G do caule,

densidade da madeira (WD), saturação de água no caule (QWsat), potencial hídrico

do caule na estação seca (Ψ Dry season ), tempo de retenção foliar em meses (LR),

potencial hídrico com perda de 50% (Ψ50) da condutividade no xilema e margem de

segurança (Safety margins Ψ50). *Valores significativos com * p < 0.05, ** p < 0.01,

*** p < 0.001...............................................................................................................21

Sumário

Introdução.................................................................................................................10

Material e métodos...................................................................................................13

Área de estudo.........................................................................................................13

Preparo do material vegetal para análise do teor e da composição da lignina.......15

Dosagem de lignina pelo método do ácido tioglicólico.............................................16

Análise da composição monomérica da lignina.......................................................16

Cromatografia gasosa com espectrometria de massas (GC-MS)............................17

Vulnerabilidade ao embolismo.................................................................................18

Análise de dados......................................................................................................18

Resultados................................................................................................................19

Discussão.................................................................................................................24

Considerações finais...............................................................................................28

Referências...............................................................................................................29

10

Introdução

Durante a estação seca em clima tropical sazonalmente seco, onde a

disponibilidade de água é periódica, o déficit hídrico pode ocasionar estresse hídrico

nas plantas, e esse estresse pode gerar um aumento na tensão no xilema e

consequentemente a possibilidade de falha no transporte de água pela formação de

bolhas no xilema (Lens et al., 2013). A diminuição do transporte de água por

embolismo altera o estado hídrico da planta e pode diminuir as taxas de crescimento

e sobrevivência (Sperry; Tyree, 1988). Plantas de clima tropical sazonalmente seco

apresentam estratégias de sobrevivência que variam desde a evitação até tolerância

ao estresse hídrico (Markesteijn; Poorter 2009). A tolerância à seca pode ser

definida como a capacidade de a espécie sobreviver à dessecação mediante ajustes

metabólicos, mas esses ajustes podem levar a uma diminuição do crescimento e da

aptidão (Engelbrecht; Kursar, 2003; Larcher, 2003). Espécies tolerantes apresentam

maior resistência ao embolismo o que permite manter o transporte de água sob altas

tensões, as trocas gasosas e sobrevivência celular com baixo conteúdo de água

(Engelbrecht; Kursar, 2003, Tyree et al., 2003). A evitação do estresse hídrico

envolve características que aumentam o acesso à água e reduzem a perda de água,

que incluem raízes profundas, o precoce fechamento dos estômatos, a baixa

condutância cuticular, o armazenamento de água, ajustes osmóticos, e a queda das

folhas na estação seca (Tyree et al., 2003).

Espécies sempre verdes adotam estratégias de tolerância ao estresse hídrico

o que permite a continuidade das trocas gasosas na estação seca. Características

da madeira, como vasos do xilema com paredes mais espessas e com menos poros

nas membranas das pontoações aumentam a resistência ao embolismo (Hacke et

al., 2001, Jansen et al., 2009). Já espécies decíduas adotam estratégias de evitação

e diminuem suas atividades metabólicas na estação seca (Engelbrecht; Kursar 2003;

Tyree et al., 2003). Existe diferença no tempo de retenção foliar em espécies de

ambiente sazonalmente seco. Por exemplo, Oliveira et al. (2015) reconheceram três

padrões fenológicos principais em espécies arbóreas da Caatinga: sempre verdes,

decíduas tardias e decíduas precoces. Espécies sempre verdes permanecem com

folhas durante todo o ano; as decíduas tardias mantêm suas folhas por um período

de 7 até 10 meses; e as decíduas precoces permanecem 3 a 6 meses com folhas.

Embora outros fatores possam influenciar na fenodinâmica de plantas de ambiente

sazonalmente seco (Holbrook et al., 1995), sua fenodinâmica foliar é principalmente

11

desencadeada pela disponibilidade hídrica (Bullock; Solís-Magallanes, 1990;

Justiniano; Fredericksen, 2000; Riveira; Borchert, 2001; Borchert et al., 2002; Russo

et al., 2010; Kushwaha et al., 2011; Lima et al., 2012; Oliveira et al., 2015). Porém,

segundo esses autores, espécies de baixa densidade de madeira podem brotar

durante a estação seca, utilizando a água armazenada na madeira. Portanto,

características da madeira são importantes tanto nas estratégias de tolerância

quanto nas de evitação.

A madeira é composta por três polímeros estruturais: celulose, hemicelulose

e lignina (Stephen et al., 1987), tendo a lignina um papel fundamental nas relações

hídricas das plantas (Herbette et al., 2014), pois há indícios de que o teor e a

composição da lignina estão relacionados à maior resistência ao estresse hídrico

(Fan et al., 2006; Yoshimura et al., 2008; Moura et al., 2010). Lignina é um composto

fenólico polimérico, amorfo e tridimensional (Sun et al., 2010), que se deposita

principalmente nas paredes celulares secundárias de tecidos vegetais envolvidos no

suporte mecânico e na condução de água (Baucher et al., 1998), encontrado em

determinados tipos de células especialmente nas paredes celulares espessas

secundárias de elementos traqueais e fibras (Baucher et al., 1998; Fromm et al.,

2003; Awad et al., 2012; Li et al 2014). Sua deposição nas paredes celulares

aumenta a rigidez, a impermeabilidade à água e, consequentemente, é importante

na condução de água pelo xilema, no suporte mecânico e na proteção contra

patógenos (Pilate et al., 2012). A lignina aumenta a rigidez da parede celular por sua

característica mais hidrofóbica, mantendo as microfibrilas de celulose desidratadas e

mais resistentes (Niklas, 1992). Por ser hidrofóbica, a lignina reduz a permeabilidade

das paredes e a porosidade das células (Edwards; Axe, 2000). Essa rigidez e

relativa impermeabilidade permite o transporte de água sob altas tensões sem que

ocorra a implosão dos vasos e ainda permite relativa resistência à formação de

embolia (Hacke et al., 2006)

A lignina é constituída principalmente por três monômeros: p-hidroxifenil (H),

guaiacil (G) e siringil (S) (Boerjan et al., 2003; Morreel et al., 2010). Estas unidades

são formadas a partir de três monolignóis, fenilpropanóides (C6-C3) que diferem

entre si apenas pelo grau de metoxilação (Baucher et al., 1998) e são alcoóis

hidroxicinamoilícos: p-cumarílico, coniferílico e sinapílico. A composição monomérica

da lignina varia entre as espécies (Zhao et al., 2010), tipo de tecido, e resposta ao

estresse ambiental (Campbell; Sederoff, 1996). O siringil deposita-se

12

predominantemente nas fibras, ao passo que o guaiacil se deposita em maior

quantidade nos elementos de vaso (Voelker et al., 2011). Angiospermas tropicais

têm teores médios de lignina maiores que angiospermas de clima temperado e

próximos dos encontrados nas gimnospermas (Albuquerque et al., 1995).

Gimnospermas de clima temperado possuem os maiores teores de lignina (Telmo;

Lousada, 2011).

Estudos indicam que a biossíntese de lignina pode ser alterada por estresse

hídrico (Vincent et al., 2005; Fan et al., 2006; Bok-Rye et al., 2007; Yoshimura et al.,

2008; Sobczak, 2013). Por exemplo, a deposição de lignina pode aumentar sob

estresse hídrico (Fan et al. 2006), e alguns estudos têm mostrado o importante papel

da lignina no transporte de água e resistência à embolia (Voekler et al., 2011;

Herbette et al., 2014). A resistência à embolia está relacionada com o tipo de

estratégia de sobrevivência à seca e, em consequência, com o tempo de retenção

das folhas nas árvores (Choat et al., 2005).

A resistência à embolia também está relacionada com a densidade da

madeira, que por sua vez, a densidade da madeira está inversamente relacionada à

quantidade de água no caule e ao potencial hídrico do caule, que permitem à planta

sobreviver à estação seca (Oliveira et al., 2015). Portanto, diante de todas essas

relações de atributos da madeira, nós investigamos a hipótese de que o teor e a

composição da lignina determinam o tempo durante o qual diferentes espécies de

árvores retêm suas folhas em clima tropical estacionalmente seco. A partir dessa

hipótese fazemos as seguintes predições.

1) O teor e a composição monomérica da lignina estão diretamente

relacionados ao tempo durante o qual espécies arbóreas retêm suas

folhas na estação seca.

2) À medida que o tempo de retenção das folhas aumenta, a composição

da lignina se altera.

3) O teor e a composição monomérica da lignina influenciam na

resistência ao embolismo do xilema.

4) Tanto o teor de lignina total quanto sua composição monomérica estão

relacionados com outros atributos (densidade da madeira, saturação

de água no caule, potencial hídrico do caule na seca e

vulnerabilidade ao embolismo) que permitem a sobrevivência das

espécies na estação seca.

13

Material e métodos

Área de estudo

A zona tropical semiárida do Nordeste brasileiro ocupa uma área de 800.000

km2 com alta imprevisibilidade de chuva e sua concentração em um único período

de três a cinco meses no ano. A média de precipitação total anual é de 775 mm,

com um coeficiente de variação de 30% (Minter, 1984). Ocupando 70% da região

Nordeste, ocorre a Savana-Estépica, popularmente chamada de Caatinga (Veloso et

al., 2012), geralmente abaixo de 650 m de altitude (Castelletti et al., 2003). A longa

estação seca, chuvas concentradas em poucos meses e espacialmente

heterogêneas e as altas temperaturas provocam uma evapotranspiração que atinge

o dobro da precipitação (Nimer, 1989), provocando estresse hídrico nas plantas, que

se reflete em seu funcionamento (Mooney et al., 1995; Silveira et al., 2013).

Selecionamos 22 espécies de árvores e arbustos (Tabela 1) na Fazenda

Experimental Vale do Curu em uma savana-estépica nas coordenadas 3°47’S e

39°16 W, no município de Pentecoste estado do Ceará, nordeste do Brasil.

Selecionamos as mesmas espécies estudadas por Oliveira et al. (2015), que

mediram a densidade da madeira (WD, g/cm-3), a saturação de água no caule

(QWsat, %) e o potencial hídrico do caule na estação seca (Ψ dry season, Ψ – MPa)

segundo o método de Borchert (1994) e relacionaram essas variáveis à

fenodinâmica foliar dessas espécies. A fenodinâmica foliar foi realizada conforme o

método proposto por Fournier (1974).

O clima da área é BSh - semiárido, seco, com chuvas no verão-outono e seca

no inverno-primavera no sistema de classificação de Köppen-Geiger (Peel et al.,

2007). No clima normal (Figura 1), a estação chuvosa ocorre entre fevereiro e maio,

a precipitação total anual média é de 694 mm, e a temperatura anual média é de

28.7ºC.

14

Figura 1. Diagrama climático de Walter e Lieth (clima normal). Estação meteorológica da

fazenda Experimental do Vale do Curu, município de Pentecoste, estado do Ceará, Brasil.

No ano da coleta, 2014, a precipitação total foi de 494 mm e temperatura

média de 29.8ºC (Figura 2), a coleta foi realizada no mês de maio no período

chuvoso. Os solos são rasos e com pouca capacidade de retenção hídrica. A

topografia da região é plana com altitude média de 75 m (Souza et al., 2015).

15

Figura 2. Climatograma de Walter e Lieth do ano da coleta de dados. Estação

meteorológica da Fazenda Experimental do Vale do Curu, município de Pentecoste, estado

do Ceará, Brasil.

Preparo do material vegetal para análise do teor e da composição da lignina

Para cada espécie selecionamos três indivíduos adultos reprodutivos com

diâmetro do caule no nível do solo igual ou maior que 3 cm. De cada indivíduo

coletamos três ramos adultos. De cada ramo retiramos um segmento de 10 cm de

comprimento a partir do ápice caulinar.

Cada amostra de caule foi etiquetada com o nome da espécie e número do

indivíduo, imediatamente congelada em N2 líquido e armazenada em freezer a -70

ºC. Posteriormente, cada amostra foi macerada e liofilizada e lavada com etanol

conforme Sobczak (2013). A lavagem com etanol remove compostos não

covalentemente ligados (Day et al., 2005). Para esse procedimento, utilizamos

aproximadamente 100 mg de cada uma das amostras maceradas e liofilizadas. As

amostras foram lavadas três vezes com 1,5 ml de etanol 80% e uma vez com água

16

deionizada. A mistura foi centrifugada a 12.000 rpm por 15 min e o precipitado

colocado para secar em estufa a 65ºC “overnight”. O precipitado seco foi utilizado

para as análises de teor de lignina por ácido tioglicólico e para extração de ligninas

por tioacidólise.

Dosagem de lignina pelo método do Ácido Tioglicólico

O método do ácido tioglicólico envolve a formação de tioéteres do álcool

benzílico, grupos tipicamente encontrados na lignina (Hatfield; Fukushima, 2005).

Esse método causa pouca interferência nas amostras, mas o teor de lignina deve

ser determinado a partir de uma amostra livre de extrativos (Sarkanen,

1975). Seguindo Barber; Ride (1988), colocamos 15 mg de material macerado

(preparado conforme descrito anteriormente) de cada amostra em tubos de ensaio, e

adicionamos 1 ml de ácido clorídrico (HCl) 2N e 0,2 ml de ácido tioglicólico. Após

homogeneização, a solução foi mantida em banho-maria a 98ºC por 4 horas. Em

seguida, o tubo foi resfriado em gelo e centrifugado a 12.000 rpm por 10 min, sendo

descartado o sobrenadante. O precipitado (lignina insolúvel em ácido tioglicólico) foi

lavado com 1,5 ml de água destilada e novamente centrifugado a 12.000 rpm por 10

min, e novamente o sobrenadante foi descartado. O precipitado foi solubilizado em

1,5 ml de hidróxido de sódio (NaOH) 0,5N e deixado “overnight” sob agitação a 150

rpm na temperatura ambiente, para posterior centrifugação (12.000 rpm por 10 min).

O sobrenadante (lignina solubilizada em NaOH) foi transferido para um novo tubo,

ao qual foram adicionados 200 µl de HCl concentrado. O tubo foi colocado em uma

câmara fria a 4ºC, durante 4 horas. A adição de HCl permitiu uma nova precipitação

da lignina insolúvel em ácido, processo que foi complementado por centrifugação

(12.000 rpm por 10 min). Após a centrifugação, foi descartado o sobrenadante e feita

solubilização do precipitado em 2 ml de NaOH 0,5N.

A lignina extraída pelo método do ácido tioglicólico teve sua absorbância lida

em 280 nm, e sua concentração foi determinada por comparação com o

padrão lignin alkali, 2-hydroxypropyl ether (Sigma-Aldrich). Os valores de lignina

foram expressos em µg/mg de massa seca do tecido caulinar.

Análise da composição monomérica da lignina

A composição monomérica da lignina foi avaliada a partir da extração por

tioacidólise, que é considerado um bom método analítico (Xiao et al., 2011; Sun et

17

al., 2012). Este método extrai a lignina degradando-a por quebra seletiva das

ligações β-O-4 e permite a quantificação específica dos monômeros envolvidos

nessas ligações. A tioacidólise foi realizada segundo Lapierre et al. (1999) com

algumas modificações em Sobczak (2013). Em tubo de ensaio com tampa

rosqueada revestida com teflon, foram adicionados 10 ml de trifluoreto de

boro eterato (BF3 eterato) / etanotiol (EtSH) / dioxano (2,5:10:87,5 ; v/v/v) a 15 mg

de material macerado preparado como descrito anteriormente. O tubo foi incubado a

100°C (banho de glicerina) por 4 horas. Após o resfriamento, o volume da reação foi

diluído com 30 ml de água deionizada e o pH ajustado para 4 com solução aquosa

de 0,4 M de bicarbonato de sódio (NaHCO3). A mistura da reação foi extraída três

vezes com 30 ml de diclorometano (CH2Cl2). Para retirar a água presente, a este

extrato foi acrescentado sulfato de sódio anidro. Em seguida, realizamos a filtragem

destas soluções com filtros de papel. Os filtrados foram colocados para secar

“overnight” no fluxo de uma capela, sob temperatura ambiente. O resíduo final foi

ressuspendido em 0,2 ml de CH2Cl2. Em seguida retirou-se 20 µl de cada amostra e

foram adicionados 50 µl de N,O-bis (trimetilsilil) trifluoroacetamida e 10 µl de piridina,

por 1 hora em temperatura ambiente. O produto desta reação foi analisado por

cromatografia gasosa com espectrometria de massas (GC-MS).

Cromatografia Gasosa com Espectrometria de Massas (GC-MS)

Os derivados de trimetilsilil dos monômeros guaiacil e siringil foram

analisados utilizando-se algumas das condições descritas por Müsel et al. (1997) e

de acordo com Sobczak (2013). Utilizamos um cromatógrafo gasoso acoplado a um

detector de massas (Shimadzu GCMS-QP 2010) equipado com um auto-injetor Split

AOC-2i - Shimadzu, com fonte de ionização por elétrons operando com uma energia

de ionização de 70 e V. Cada amostra (1 µl) foi injetada em coluna capilar de sílica

(DB-5; 30 m de comprimento; 0,32 mm de diâmetro interno e 0,25 mm de espessura

do filme; J & W Scientific, USA). Usamos hélio (18,3 ml min-1) como gás de arraste e

mantivemos a temperatura do injetor em 260°C, com o divisor (split) do injetor

configurado em 1:30. Acionamos um programa de temperatura de 160°C para

260°C a 2°C min-1; com temperatura da fonte de ionização de: 200°C. Os

monômeros de lignina guaiacil (G) e siringil (S), analisados como seus derivados

trimetilsililados, foram identificados por comparação de seus tempos de retenção e

espectros de fragmentação de massas com aqueles obtidos a partir de compostos

18

padrões de alcoóis coniferílico e sinapílico (Sigma-Aldrich) e comparados com

espectros de referência previamente descritos na literatura (Rolando et al., 1992).

Para a construção das curvas de calibração nos baseamos no método da calibração

externa usando padrões comerciais dos monômeros de lignina.

Vulnerabilidade ao embolismo

Estimamos o potencial hídrico que induz perda de 50% (Ψ50) da condutância

hidráulica do xilema com um aparelho pneumático (Pereira et al., 2015 submetido).

O método pneumático foi escolhido por ser de fácil aplicação em condições de

campo e possibilitar medir rapidamente uma grande quantidade de espécies. O

aparato pneumático consiste de um vacuômetro conectado a um sistema de tubos e

válvulas que permite aplicar uma tensão de vácuo com o uso de uma seringa,

quando conectado à base de um ramo cortado. A tensão de vácuo é aplicada por

2,5 min e parte do ar contido dentro do ramo é extraído (ar descarregado, AD),

reduzindo a tensão dentro dos tubos. A partir da equação de gases ideais é possível

calcular o conteúdo extraído. Obtendo-se os conteúdos de AD mínimos, nos ramos

hidratados, e máximo, nos ramos desidratados, é possível calcular a porcentagem

de ar descarregado (PAD). Os valores foram ajustados seguindo a função logística:

PAD = 100/(1 + exp(0.25 S (Ψx – Ψ50))

Onde Ψ50 é o Ψx quando PAD é igual a 50% e S é a inclinação da curva.

Porém, só foi possível medir a vulnerabilidade hidráulica em 15 espécies

dentre as 22 selecionadas, pois a coleta foi realizada no final da estação chuvosa, e

algumas espécies estavam perdendo folha. As medições de vulnerabilidade foram

feitas em espécies sempre verdes, decíduas tardias e decíduas precoces.

Calculamos uma margem de segurança hidráulica de Ψ50 que foi definida como a

diferença entre Ψ na estação seca e Ψ50, onde quanto menor o valor dessa margem

de segurança, maior o risco de falha hidráulica em comparação com uma margem

de segurança mais elevada, segundo Choat et al. (2005).

Análise dos dados

Para testar a diferença entre valores médios de guaiacil e siringil usamos o

teste t de Student, com p < 0,05. Para verificar se havia colinearidade, realizamos

uma análise de correlação para cada par de variáveis. Usamos o coeficiente de

correlação de Pearson quando as variáveis tinham distribuição normal (teste de

19

Shapiro), e o coeficiente de correlação de Spearman quando a distribuição não era

normal. Adotamos o nível de significância menor que 0,05. Após esse procedimento,

retiramos uma variável de cada par com r ≥ 0.7, por serem colineares (Dormann et

al., 2013). A seguir, aplicamos uma análise de componentes principais (PCA) como

análise exploratória e indicativa de potenciais relações das espécies com as

variáveis.

Então, realizamos uma análise de regressão múltipla com as variáveis não

colineares, usando o tempo de retenção das folhas (LR) em meses como variável

resposta e teor de lignina total, teor de guaiacil (G), razão entre siringil e guaiacil

(S/G), densidade da madeira (WD), saturação de água no caule (QWsat) e potencial

hídrico do caule na estação seca (Ψ Dry season) como variáveis fatores. Construído

o modelo completo, aplicamos o procedimento backward para selecionar o modelo

mínimo. Testamos a normalidade dos resíduos com o teste de Shapiro e a

homocedasticidade com o teste de Fligner. Todas as análises estatísticas foram

realizadas no ambiente R (R Development Core Team, 2011).

Resultados

Nas 22 espécies analisadas, o teor de lignina caulinar variou de 5.81 µg/ mg-1

(0,58%) a 135.83 µg/mg-1 (13,58%) de massa seca (Tabela 1). As espécies com os

maiores teores de lignina foram: Ximenia americana (135.83 µg/mg-1), Aspidosperma

pyrifolium (112.55 µg/mg-1), ambas decíduas tardias, e Ziziphus joazeiro (132.94

µg/mg-1), sempre verde. As espécies com os menores teores de lignina foram

Helicteres heptandra (5.88 µg/mg-1) e Cochlospermum vitifolium (5.81 µg/mg-1)

ambas decíduas precoces.

A razão S/G no caule das espécies analisadas variou de 0.38 a 1.10 (Tabela

1). As espécies apresentaram, em média, maior quantidade de G do que de S (t= -

2.1542 p < 0.05) (Tabela 1). Nas espécies sempre verdes (Zizyphus joazeiro,

Piptadenia viridiflora e Cynophalla flexuosa), S/G foi igual ou maior que 1; nas

demais espécies, foi menor que 1 (Tabela 1).

Nas 15 espécies selecionadas, a vulnerabilidade hidráulica do xilema Ψ50

variou de -1.05 MPa em Cochlospermum vitifolium, espécie decídua precoce, a -4.94

MPa em Anadenanthera colubrina, decídua tardia (Tabela 1). Os valores de margem

de segurança do xilema variaram de 2.06 MPa em Cynophalla flexuosa a -6.74 MPa

em Mimosa caesalpiniifolia.

20

Tabela 1. Espécies analisadas com as classificações da fenodinâmica foliar, tempo de retenção foliar, LR (meses), densidade da madeira, WD

(g cm−3), saturação de água no caule, QWsat (%), potencial hídrico do caule na estação seca, Ψ Dry season (Ψ-MPa), teor de lignina (µg/mg-1

dry wt), siringil, S (µmol g-1 dry wt), guaiacil, G (µmol g-1 dry wt), a razão S/G, valores da perda de 50% da condutividade, Ψ50 e margem de

segurança, Safety margins Ψ50. *dados Oliveira et al. (2015).

Espécie Nº *Fenodiânmica foliar

*LR *WD

*QWsat

*Ψ Dry

season

Lignin

S G S/G Ψ50 Safety margins

Ψ50

Ziziphus joazeiro Mart. 1 Sempre verde 12 0.55 85 -2.7 132.94 36.92 34.58 1.1 -3.39 0.69

Cynophalla flexuosa (L.) J. Presl 2 Sempre verde 12 0.56 79 -2.4 27.62 67.31 62.71 1.11 -4.46 2.06

Piptadenia viridiflora (Kunth) Benth. 3 Sempre verde 12 0.59 69 -3.2 34.7 141.86 139.11 1.08 -3.54 0.34

Libidibia ferrea (Mar. ex Tul.) L.P. Queiroz 4 Decídua tardia 10 0.65 55 -3.3 29.35 55.03 65.22 0.86 -3.47 0.17

Ximenia americana L. 5 Decídua tardia 10 0.58 74 -7 135.83 27.41 48.54 0.93 ----- -----

Anadenanthera colubrina (Griseb.) Altschul 6 Decídua tardia 9 0.61 64 -7.3 94.11 64.23 83.41 0.8 -4.94 -2.36

Combretum leprosum Mart. 7 Decídua tardia 7 0.55 83 -4.5 35.06 126.07 175.4 0.72 -4.17 -0.33

Piptadenia stipulacea (Benth.) Ducke 8 Decídua tardia 7 0.57 76 -5.5 98.65 60.28 94.97 0.63 -2.17 -3.33

Aspidosperma pyrifolium Mart. 9 Decídua tardia 7 0.65 55 -6.5 112.55 50.68 55.39 0.95 -3.06 -3.44

Poincianella bracteosa (Tul.) L.P. Queiroz 10 Decídua precoce 6 0.65 54 -5.4 70.74 30.94 51.79 0.61 ----- -----

Lafoensia pacari St. Hil. 11 Decídua precoce 5 0.62 62 -7.1 37.89 156.73 209.97 0.77 -3.6 -3.5

Amburana cearensis (Allemão) A.C. Sm. 12 Decídua precoce 5 0.46 118 -1.2 57.53 94.14 113.3 0.83 -2.3 1.1

Bauhinia cheilantha (Bong.) D. Dietr. 13 Decídua precoce 5 0.67 50 -8 90.01 60.78 96.82 0.61 ----- -----

Cordia oncocalyx Allemão 14 Decídua precoce 5 0.55 83 -7.5 60.1 23.7 57.74 0.41 -1.66 -5.84

Helicteres heptandra L.B. Sm. 15 Decídua precoce 4 0.57 75 -8.3 5.88 48.66 86.71 0.56 ----- -----

Commiphora leptophloeos (Mart.) J.B. Gillett 16 Decídua precoce 4 0.30 236 -1.5 26.81 37.03 69.16 0.53 ----- -----

Sebastiana macrocarpa Müll. Arg. 17 Decídua precoce 4 0.62 61 -6.8 17.48 79.45 99.30 0.83 ----- -----

Cordia trichotoma (Vell.) Arráb. exSteud. 18 Decídua precoce 4 0.55 82 -8 35.88 120.99 189.04 0.65 ----- -----

Croton blanchetianus Baill. 19 Decídua precoce 4 0.62 61 -8.3 46.84 13.86 25.82 0.46 -3.89 -4.49

Mimosa caesalpiniifolia Benth. 20 Decídua precoce 4 0.65 54 -8.2 123.05 21.18 36.67 0.55 -1.46 -6.74

Cochlospermum vitifolium (Willd.) Spreng. 21 Decídua precoce 3 0.20 416 -1.2 5.81 43.14 47.68 0.52 -1.05 -0.15

Manihot carthaginensis (Müll. Arg.) Allemão 22 Decídua precoce 3 0.34 195 -1.1 33.35 27.55 201.88 0.38 -1.48 0.38

21

Na análise de correlação entre as variáveis (Tabela 2), o teor total de lignina

não apresentou correlação com nenhuma variável. As demais variáveis formaram

dois grupos de correlações: um envolvendo os monômeros de lignina, a

vulnerabilidade ao embolismo e o tempo de retenção foliar; outro, envolvendo as

características da madeira e a margem de segurança do xilema. O teor de guaiacil

correlacionou-se positivamente com o teor de siringil e negativamente com Ψ50. O

teor de siringil correlacionou-se positivamente com S/G. A razão S/G foi

positivamente correlacionada com o tempo de retenção foliar e negativamente com

Ψ50. Isso significa que quanto maiores os teores de S e a razão S/G mais baixos são

os potenciais de vulnerabilidade e maior o tempo de retenção foliar. A densidade da

madeira foi negativamente correlacionada com a saturação de água no caule, com o

potencial hídrico do caule na estação seca e com a margem de segurança do

xilema. Por sua vez, a saturação de água no caule e seu potencial hídrico do caule

na seca correlacionaram-se positivamente.

Tabela 2. Correlação entre lignina, siringil (S), guaiacil (G), razão S/G do caule, densidade da

madeira (WD), saturação de água no caule (QWsat), potencial hídrico do caule na estação seca

(Ψ Dry season ), tempo de retenção foliar em meses (LR), potencial hídrico com perda de 50%

(Ψ50) da condutividade no xilema e margem de segurança (Safety margins Ψ50). *Valores

significativos com * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001.

Lignin G S S/G WD QWsat Ψ Dry season LR Ψ50

Lignin G -0.342

S -0.289 0.749*** S/G 0.203 0.04 0.513*

WD 0.367 -0.167 -0.011 0.219 QWsat -0.344 0.16 0.024 -0.171 -0.994***

Ψ Dry season -0.299 0.131 0.158 0.22 -0.553* 0.59** LR 0.408 -0.115 0.271 0.807*** 0.247 -0.19 0.16

Ψ50 -0.071 -0.468 -0.754** -0.636* -0.205 0.159 0.013 -0.723** Safety margins -0.346 0.321 0.375 0.439 -0.626* 0.676* 0.924*** 0.318 -0.221

Isso indica que quanto maior a densidade da madeira, menor a saturação de

água no caule, menor seu potencial hídrico do caule e menor a margem de

segurança do xilema, mas quanto maior a saturação de água no caule, maior seu

potencial hídrico na estação seca e maior a margem de segurança do xilema. Essas

22

relações são reforçadas pela correlação positiva entre o potencial hídrico do caule

na estação seca e a margem de segurança do xilema.

Considerando o total das 22 espécies o primeiro e o segundo componentes

da PCA, representados pelos eixos 1 e 2, explicaram 41% e 24% da variação da

distribuição das espécies, respectivamente (Figura 3).

Figura 3. Análise de componentes principais com lignina, S/G, guaiacil (G), densidade da

madeira (WD) e potencial hídrico do caule na estação seca (Ψ dry season) de espécies

sempre verdes (EG), decíduas tardias (LD) e decíduas precoces (ED). Os números se

referem às espécies da tabela 1.

O primeiro eixo da PCA opôs Ψ Dry season a WD, confirmando a correlação

negativa entre ambos (Tabela 2) e separou um grupo de espécies decíduas

precoces (16, 21,22, tabela 1) das demais. O segundo eixo ordenou as demais

espécies principalmente pela variação da razão S/G. Essas espécies formaram um

arco, que é indicativo de uma variação em gradiente (Wartenberg et al., 1987),

23

significando que os valores de todas as variáveis variam continuamente e se

sobrepõem entre essas espécies.

Considerando as 15 espécies com os valores de Ψ50, o primeiro e o segundo

componentes da PCA, representados pelos eixos 1 e 2, explicaram 38% e 31%

respectivamente, da variação do tempo de retenção foliar (Figura 4).

Figura 4. Análise de componentes principais para 15 espécies, com lignina, S/G, guaiacil

(G), densidade da madeira (WD), potencial hídrico na estação seca (Ψ dry season) e

potencial com perda de 50% da condutividade (Ψ50). Espécies sempre verdes (EG),

decíduas tardias (LD) e decíduas precoces (ED). Os números se referem às espécies da

tabela 1.

O primeiro eixo da PCA opôs WD a Ψ dry season e Ψ50, e novamente

separou um grupo de espécies decíduas precoces (21, 22, tabela 1) das demais

espécies. O segundo eixo ordenou as demais espécies principalmente pela variação

da razão S/G e do teor de G. Essas espécies novamente formaram um arco, que é

indicativo de uma variação em gradiente (Wartenberg et al., 1987). Os resultados

24

dessa PCA são coerentes com os resultados da PCA considerando as 22 espécies

(Figura 3).

O modelo mínimo da regressão múltipla considerando as 22 espécies reteve

apenas a razão S/G: LR = 11,63 S/G (r2= 0.71, p < 0.001, F = 50.27). Esse modelo

indica que quanto maior a razão S/G, maior o tempo de retenção foliar (Figura 5). A

razão S/G foi também à única variável retida no modelo mínimo considerando as 15

espécies com valores de Ψ50, LR = 11,52 S/G (R2 = 0.76, p < 0.001, F = 42.57).

Figura 5. Análise de regressão linear entre retenção foliar (número de meses de

permanência das folhas na árvore) e a razão S/G. Sempre verde (EG), decíduas tardias

(LD) e decíduas precoces (ED).

Discussão

O método pneumático usa equipamentos de baixo custo, é mais rápido que

os métodos usados até agora e produz resultados confiáveis (Pereira et al., 2015

submetido). Usando o método pneumático, esses autores obtiveram resultados para

25

Ψ50 e Ψ88 que foram muito similares aos obtidos pelo método hidráulico tradicional.

Investigando espécies de florestas secas na Austrália pelo método hidráulico, Choat

et al. (2005) encontraram valores de Ψ50 = -5.0 MPa para espécies sempre verdes e

Ψ50 entre -1.4 MPa e -3.1 MPa para espécies decíduas. Nossos valores entre –

2.17 MPa e – 4. 94 MPa para espécies sempre verdes e decíduas tardias e entre –

1.05 MPa e – 3.89 MPa para decíduas precoces aproximam-se dos obtidos por

Choat et al. (2005).

As espécies que investigamos apresentaram variado teor de lignina total, que

são bem mais baixos que os encontrados por Albuquerque et al. (1995) em árvores

angiospermas pelo método de Klason. Provavelmente, os valores mais baixos que

obtivemos decorem do método do ácido tioglicólico, que sabidamente fornece

valores bem menores que outros métodos (Brinkmann et al., 2002; Moreira-Vilar et

al., 2014). Brinkmann et al. (2002) obtiveram teores de lignina total dosados pelo

método acetilbromida que foram 2.58 vezes maiores que os dosados pelo ácido

tioglicólico. Não conhecemos outros estudos que dosaram teor de lignina total em

caule de plantas da Caatinga, e é possível que espécies arbóreas da Caatinga

realmente tenham baixos teores de lignina total.

O teor de lignina não se correlacionou com nenhuma das variáveis

investigadas. O teor de lignina das espécies da Caatinga não apresentou correlação

com a composição monomérica, tal como observado por Wallis et al. (1996) para

Eucalyptus globulus, provavelmente porque os teores de lignina não são afetados

pelos monômeros que a compõem (Lapierre et al., 1999). A lignina é o segundo

composto mais abundante da madeira, mas não encontramos correlação

significativa do teor de lignina com a densidade da madeira, assim como observado

por Soares et al. (2014) em híbridos de Eucalyptus.

Os valores da razão S/G foram também muito baixos. Por exemplo, em

espécies de Eucalyptus a média da razão S/G variou entre 1.76 (Santos et al., 2012)

e 3.03 (Rodrigues et al., 2001; Nunes et al., 2010); em espécies de árvores da

floresta temperada, variou entre 1.37 e 3.35 (Kishimoto et al., 2010). Os teores de S

e G que encontramos tinham valores muito próximos e estavam fortemente

correlacionados, o que pode explicar os baixos valores da razão S/G. Entretanto,

Stackpole et al. (2011) encontraram que a razão S/G aumenta com o aumento da

latitude, e investigando espécies de Cactaceae no México, Reyes-Rivera et al.

(2015) encontraram razões S/G entre 0.3 e 11.7. A latitude do sitio em que

26

trabalhamos é muito baixa e, tal como espécies de Cactaceae, nossas espécies

ocorrem em clima com forte deficiência hídrica anual. Assim, é possível que

espécies de baixa latitude em ambientes áridos e semiáridos tenham como

características uma baixa razão S/G.

A forte correlação positiva entre a razão S/G e o teor de S indica que esse

monômero é o principal determinante da variação dessa razão. A forte correlação

negativa do teor de S com a variação da vulnerabilidade ao embolismo entre as

espécies indica que quanto maior o teor de S menor a vulnerabilidade da espécie.

Realmente, a vulnerabilidade ao embolismo mostrou uma correlação negativa mais

forte com o teor de S do que com a razão S/G. A variação da razão S/G está

fortemente correlacionada com variações estruturais da lignina (Akiyama et al.,

2005; Santos et al., 2012). Além disso, o monômero S deposita-se principalmente na

parede secundária das fibras (Voelker et al., 2011) e forma um polímero mais

resistente porém flexível em relação ao polímero enriquecido por unidades G, mais

rígido e hidrofóbico (Koehler; Telewski, 2006; Bonawittz; Chapple, 2010). As fibras

em torno dos vasos podem desempenhar um papel na resistência ao embolismo

(Hacke et al., 2001; Jacobsen et al., 2005), possivelmente aumentando a resistência

dos vasos quando submetidos à grandes tensões e evitando a formação de micro-

fraturas nas paredes dos vasos (Jacobsen et al., 2005). Possivelmente essas

propriedades de S explicam por que a razão S/G correlacionou-se fortemente e

positivamente com o tempo de retenção foliar. De fato, as espécies sempre verdes e

decíduas tardias que estudamos apresentaram maior resistência ao embolismo,

corroborando Choat et al. (2005).

A margem de segurança foi positiva nas espécies com maior tempo de

retenção foliar que estudamos. Segundo Choat et al. (2005) isso indica que essas

espécies têm menor risco de falha hidráulica no xilema, pois espécies sempre

verdes de ambiente com alta sazonalidade na disponibilidade hídrica têm margem

de segurança positivas (Pockaman et al., 2000). Algumas espécies decíduas que

estudamos apresentaram margem de segurança negativa, indicando que essas

espécies já estavam embolizadas no momento da medição e, conseguem sobreviver

com margem de segurança negativa, passando por muitos eventos de embolia

(Meinzer et al., 2008). A margem de segurança do xilema correlacionou-se

positivamente com a QWsat, indicando que espécies com alta QWsat podem usar a

água armazenada no caule para sobreviver na estação seca (Oliveira et al., 2015). O

27

maior teor de água no caule pode explicar as maiores margens de segurança que

observamos nessas espécies. A QWsat esteve negativamente correlacionada com a

WD das espécies que estudamos, um resultado esperado, pois espécies com alta

WD têm baixa capacidade de armazenamento de água (Meinzer et al., 2008). Da

mesma forma que Hoffmann et al. (2011), também observamos que WD

correlacionou-se negativamente com a margem de segurança.

Quando analisamos o tempo de retenção foliar das espécies que estudamos

em relação a todos os atributos da madeira, encontramos que na maior parte das

espécies a variação do teor de lignina, dos seus monômeros, da razão S/G e das

outras variáveis foi contínua, de modo que apenas um grupo de poucas espécies

(Commiphora leptophloeos, Cochlospermum vitifolium e Manihot carthaginensis) se

isolou das demais. Esse grupo de espécies apresentou os valores mais baixos de

densidade da madeira e de potencial hídrico na seca e os valores mais altos de

saturação de água no caule. Essas características indicam que essas espécies

armazenam água no caule e conseguem sobreviver na estação seca. Amburana

cearensis ocupou uma posição intermediária entre esse grupo de espécies e as

demais que formaram um gradiente desde as decíduas precoces até as sempre

verdes. Portanto, o grupo das espécies decíduas precoces pode resistir à estação

seca de duas maneiras, ou armazenando água no caule ou tendo teores de lignina

total semelhantes aos das sempre verdes. Para as demais espécies, ao redor de 71-

76% da variação do tempo de retenção das folhas pode ser explicada unicamente

pela variação da razão S/G. Nossos dados mostraram que maiores teores de lignina

total não estão relacionados ao tempo durante o qual espécies arbóreas retêm suas

folhas na estação seca, mas à medida que o tempo de retenção das folhas aumenta,

a composição da lignina se altera. Os teores de lignina total não conferem maior

resistência ao embolismo do xilema, mas a composição da lignina influencia na

vulnerabilidade ao embolismo. O teor de lignina total e sua composição monomérica

não estão relacionados com outros atributos da madeira, como densidade da

madeira, saturação de água no caule e potencial hídrico do caule na seca. Nossos

resultados mostraram claramente a existência de dois grupos de correlações entre

as variáveis que analisamos. Num dos grupos, a composição da lignina,

representada pelos teores de siringil e a razão S/G, correlacionou-se positivamente

com o tempo de retenção foliar e com a maior segurança do xilema, indicada por

Ψ50. No outro grupo, a densidade da madeira correlacionou-se negativamente com a

28

saturação de água no caule, o potencial hídrico do caule na seca e a margem de

segurança do xilema, ao passo que a saturação hídrica do caule e seu potencial

hídrico na seca correlacionaram-se positivamente com a margem de segurança do

xilema. Análises de componentes principais confirmaram a separação de dois

grupos de espécies. Um dos grupos sobrevive à seca armazenando água no caule e

perdendo as folhas logo no final da estação chuvosa, de modo a apresentar maiores

potenciais hídricos do caule e maiores margens de segurança do xilema na estação

seca. O outro grupo sobrevive investindo na composição da lignina, que varia

continuamente entre as espécies. Neste grupo, o aumento do teor de siringil em

relação à guaiacil possibilita menor vulnerabilidade ao embolismo do xilema e a

retenção das folhas por mais tempo na estação seca.

Considerações finais

Em clima tropical sazonalmente seco as espécies investigadas apresentaram

duas formas de sobreviver à seca, um grupo armazena água no caule, perdendo as

folhas logo no final da estação chuvosa, a apresentar maiores potenciais hídricos do

caule e maiores margens de segurança do xilema na estação seca, e baixa

resistência ao embolismo. O outro grupo sobrevive investindo na composição da

lignina, que varia continuamente entre as espécies. Nesse outro grupo, o aumento

do teor de siringil em relação à guaiacil possibilita menor vulnerabilidade ao

embolismo do xilema e a retenção das folhas por mais tempo na estação seca.

29

Referências

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