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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA E MEDICINA LEGAL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MICROBIOLOGIA MÉDICA
MARIA LUCILENE QUEIROZ DA SILVA
EFEITO INIBITÓRIO, IN VITRO, DO IODETO DE POTÁSSIO E DA
MILTEFOSINA FRENTE A CEPAS DO COMPLEXO Sporothrix schenckii EM
BIOFILME NAS FORMAS FILAMENTOSA E LEVEDURIFORME
FORTALEZA
2017
MARIA LUCILENE QUEIROZ DA SILVA
EFEITO INIBITÓRIO, IN VITRO, DO IODETO DE POTÁSSIO E DA
MILTEFOSINA FRENTE A CEPAS DO COMPLEXO Sporothrix schenckii EM
BIOFILME NAS FORMAS FILAMENTOSA E LEVEDURIFORME
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Microbiologia Médica da
Universidade Federal do Ceará, como requisito
parcial à obtenção do título de mestre em
Microbiologia Médica. Área de concentração:
Micologia Médica.
Orientadora: Profª Drª. Raimunda Sâmia
Nogueira Brilhante
FORTALEZA
2017
MARIA LUCILENE QUEIROZ DA SILVA
EFEITO INIBITÓRIO, IN VITRO, DO IODETO DE POTÁSSIO E DA
MILTEFOSINA FRENTE A CEPAS DO COMPLEXO Sporothrix schenckii EM
BIOFILME NAS FORMAS FILAMENTOSA E LEVEDURIFORME
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Microbiologia Médica
da Universidade Federal do Ceará, como
requisito parcial à obtenção do título de
mestre em Microbiologia Médica. Área de
concentração: Micologia Médica.
Aprovada em: 13 de Julho de 2017.
BANCA EXAMINADORA
________________________________________
Profª. Drª. Raimunda Sâmia Nogueira Brilhante(Orientadora)
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________
Prof. Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha
Universidade Estadual do Ceará (UECE)
_________________________________________
Profa. Dr
a. Maria Fátima da Silva Teixeira
Universidade Estadual do Ceará (UECE)
À Deus, toda honra e toda glória
À minha querida mãe, Maria Lúcia, in memoriam
À minhaavó, Cleonice, por todo amor e incentivo
À minha filha, Lunna, minha motivação
Ao meu esposo Antônio, pelo carinho e companheirismo
z
AGRADECIMENTOS
À Deus, por ter me dado o dom da vida;
À minha mãe, Maria Lúcia, por ser para mim um exemplo de mulher, de dedicação e
fortaleza.
À minha avó, Cleonice, pelo exemplo de integridade e honestidade, por sempre me
incentivar e me apoiar nos momentos bons e mesmo nos mais difíceis, por tudo que
representa na minha vida, minha eterna gratidão, pois sem ela jamais chegaria até aqui.
Ao meu esposo Antônio, por suportar com paciência e serenidade, mais essa jornada
da minha vida.
À minha filha Lunna, pelo simples fato de existir, que me traz tanta alegria e ilumina
de uma forma sublime os meus dias.
Aos meus irmãos, Larisse e Jairo, por fazerem parte da minha vida.
À toda a minha amada família que são a base da minha existência, minha bisa Dos
Anjos, meus tios (Pedro, Cícero, Dôra, Fátima, Diana e Rosineide), a minha querida madrinha
Aparecida, aos primos (Luana, Romário, Rogério, Richard e Davi), e aos meus sogros
(Raimunda e João).
À profa. Sâmia, por ter me acolhido de braços abertos e me dado a oportunidade de
desbravar por esse universo da micologia, e por me acompanhar durante esse árduo e
gratificante período de mestrado, por me orientar e me mostrar como ainda tenho a aprender
como uma verdadeira mãe, sempre querendo que alcancemos o nosso melhor.
Aos participantes da bancade qualificação, o Prof. Dr. Manoel Paiva de Araújo Neto e
a Profa. Dra. Rita Amanda Chaves de Lima, assim como também a banca de defesa, o Prof.
Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha e a Profa. Dra. Maria Fátima da Silva Teixeira, pelo tempo,
pela disponibilidade e as valiosas sugestões e colaboração.
Aos meus amigos de infância que mesmo de longe estão sempre presentes, Erisberto,
Iara e Rivânia.
À minha amiga de bancada e de fluxo, Lana, que acompanhou de perto as angústias e
alegrias, que só quem trabalhou com Sporothrix é capaz de entender. Por ter se tornado uma
amiga mais chegada que uma irmã.
À minha parceira de NB3 e da vida, Glaucia, por ser esse ser humano generoso e cheio
de sabedoria, e um exemplo de profissional, que me orienta como se me enxergasse por
dentro.
À minha amada Terezinha (Tetezinha) que me ensinou tanto durante esses anos, com
sua experiência gigantesca e o seucarinho de mãe, quando nos encontramos por tanto tempo
longe da família, seu abraço é um verdadeiro aconchego.
Àos meus companheiros da equipeSporothrix que fizeram dessa jornada desafiadora
um pouco mais prazerosa, Felipe, Juliana, Raíssa e Vandbergue.
Àos meus colegas do Centro Especializado em Micologia Médica (CEMM),
Gleiciane, Jamille, Kleybson, Jaime, Lívia, Ana Luíza, Raquel, Patrícia, Lucas, Tony,
Giovanna, Géssica, Chryster, Thalita, Jonathas Sales e Jonathas Franco, Jamilla, Rosana,
Edmilson e Ewerton, os quais me proporcionaram momentos que sem dúvida foram
inesquecíveis para mim.
À Dra. Silviane e a Profa. Débora, por terem tido um carinho especial para comigo e
me acolhido em momentos que a caminhada parecia desalentadora, sempre estiveram
confiantes que eu conseguiria e tudo daria certo. Obrigado pelo trabalho e paciência de vocês
nas imagens do Confocal.
À secretária mais dedicada que conheço, Carol, por ser esse doce de pessoa que
facilita demais as nossas vidas.
Ao prof. Dr. Júlio Sidrim, por ter dedicado à sua vida na construção e
desenvolvimento do CEMM, para que pessoas como eu pudessem alcançar seu sonho, com
um desenvolvimento profissional de qualidade. Se tornando para mim como um exemplo de
ser humano admirável e transformador da sociedade.
Aos professores, Marcos Fábio Gadelha, Rossana Cordeiro, Cibele Barreto, Fernanda
Edna, Lidiany Rodrigues, Lilia Maria, Luís, por serem educadores que nos ensinam todos os
dias, não apenas o conhecimento científico, mas também a termos um olhar crítico e nos
superarmos a cada dia, são exemplo de profissionais para mim.
À Central Analítica da UFC e ao CEMM como um todo por disponibilizarem seus
profissionais e equipamentos para a realização dessa dissertação.
A todos os funcionários que formam o bloco da Biomedicina (porteiros, auxiliares de
serviços gerais e etc), sem os quais o desenvolvimento dessa dissertação seria impossível.
Ao Professor Zoilo Pires de Camargo, assim como todos os colaboradores de seu
laboratório na Universidade Federal de São Paulo, por gentilmente terem cedido as cepas
utilizadas neste estudo;
À Universidade Federal do Ceará, instituição que me orgulho em fazer parte;
À FUNCAP, pelo aporte financeiro que tanto foi útil durante esses anos;
“Como é feliz o homem que acha a sabedoria;
O homem que obtém entendimento;
Pois a sabedoria é mais proveitosa do que a prata
E rende mais do que o ouro.
É mais preciosa do que rubis;
Nada do que você possa desejar
Se compara a ela.”
(Provérbios 3: 13-15)
RESUMO
Sabe-se que a maior parte das infecções são ocasionadas por microrganismos associados em
biofilme e estudos demonstram que o fungo dimórfico, pertencente ao complexo Sporothrix
schenkii, agente etiológico da esporotricose, também é capaz de formar biofilme. Os micro-
organismos quando associados em biofilme, podem desenvolver resistência aos
antimicrobianos. O objetivo desde estudo foi avaliar a capacidade do complexo S. schenckiide
formar biofilme na forma leveduriforme,in vitro, assim como caracterizar a cinética de
crescimento e a sensibilidade dos biofilmes na forma filamentosa e leveduriforme ao iodeto
de potássio (KI) e à miltefosina (MIL). Foram utilizadas 18 cepas do complexo S. schenckii
(10 S. brasiliensis, 4 S. mexicana, 2 S. globosa e 2 S. schenckii stricto sensu). Para a formação
dos biofilmes leveduriformes foram utilizados inóculos na concentração de aproximadamente
1 x 106
UFC/mL em solução salina 0,9% e a maturação foi feita em meio RPMI. Para a
cinética de crescimento e a sensibilidade dos biofilmes foram realizadas as técnicas de
atividade metabólica e avaliação da biomassa. Para a sensibilidade plânctônica foi utilizada a
técnica de diluição em caldo, conforme metodologias do CLSI.E para a morfologia dos
biofilmes foram avaliadas pela microscopia óptica, MEV e confoval. O tempo de maturação
dos biofilmes leveduriformes, foram em média de 96 h. Os resultados mostraram que KI e
MIL tiveram efeito inibitório frente a todas as cepas, na forma planctônica, nas formas
filamentosa e leveduriforme. Os valores de CIM variaram de 62,5 a 250 mg/mL para KI e de
0,125 a 4 µg/mL para MIL. Em seguida testou-se as drogas frente aos biofilmes maduros de
Sporothrix spp., nas concentrações de CIM, 10xCIM e 50xCIM. Aatividade metabólica e a
biomassa dos biofilmes filamentosos, foi inibida pelo KI (10xCIM) com média de 75,4%e a
MIL(50xCIM) inibiu em média,55,1%. Para os biofilmes na forma leveduriforme, a média de
inibição para KI (10 x CIM)e MIL (50 x CIM) foi de 67,7% e 51,6%, respectivamente. Este
estudo demostrou que as cepas das diversas espécies do complexo S.schenckii na forma
leveduriforme são capazes de formar biofilme in vitro, e que o iodeto de potássio e a
miltefosina possuem efeito inibitório frente aos biofilmes filamentosos e leveduriformes.
Palavras-chave:Sporothrix. Iodeto de potássio. Miltefosina. Sensibilidade. Biofilme.
ABSTRACT
The most infections are caused by microorganisms associated with biofilms and it has been
recently demonstrated that dimorphic fungus, belonging the etiological agent of
Sporotrichosis Sporothrix schenkii complex, is also able to form biofilm. Microorganisms
when associated in biofilms may develop resistance to antibiotic therapy. The objective of this
study was to evaluate the ability of S. schenckii complex yeasts to form biofilm, in vitro, as
well as characterize the growth kinetics and susceptibility of filamentous and yeast biofilms to
potassium iodode (KI) and miltefosine (MIL). Eighteen strains of S. schenckii complex (10 S.
brasiliensis, 4 S. mexicana, 2 S. globosa and 2 S. schenckii sensu stricto) were used. For the
formation of yeast biofilms, inoculums at the concentration of approximately 1 x 106 CFU /
mL were used in 0.9% saline solution and maturation was done in RPMI medium. For the
growth kinetics and sensitivity of biofilms, the techniques of metabolic activity and biomass
evaluation were performed. For the planktonic sensitivity, the broth dilution technique was
used, according to the CLSI methodologies. And for the biofilm morphology were evaluated
by optical microscopy, SEM and confoval.The maturation time of yeast biofilms was, in
average, 96 h. Results showed that KI and MIL had an inhibitory effect against all strains, in
planktonic form (filamentous and yeast phases). The MICvalues ranged from 62.5 to 250
mg/mL for KI and from 0.125 to 4 μg/mL for MIL. Afterward, drugs were tested against
mature biofilms of Sporothrix spp., at following concentrations: MIC, 10 x MIC and 50 x
MIC.The metabolic activity and biomass of filamentous biofilms was inhibited by KI (10 x
MIC) with a meanof 75.4%and MIL (50xMIC) inhibited, on average, 55.1%. For biofilms in
yeast phase, the mean inhibition for KI (10 x MIC) and MIL (50 x MIC) was 67.7% and
51.6%, respectively. This study demonstrated that strains of various species of S. schenckii
complex in yeast phase are able to form biofilm in vitro, and that potassium iodide and
miltefosine have an inhibitory effect against filamentous and yeast biofilms.
Keywords:Sporothrix. Potassium iodide. Miltefosine. Sensitivity. Biofilm.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1– Sporothrix spp. na forma filamentosa. (a) Macromorfologia em ágar
batata que exibe colônias de cor branca, com aspecto membranoso, a seta
vermelha indica o centro da colônia tornando-se escurecido com o passar
do tempo; (b) Micromorfologia em lactofenol azul-algodão, 400X, pode-
se observar hifas e conídios nas extremidades assemelhando-se à flor de
margarida (seta preta). ................................................................................ 23
Figura 2– Sporothrix spp. na forma leveduriforme. (a) Macromorfologia em ágar
BHI (brain heart infusion), suplementado com 5% de sangue de carneiro,
que exibe colônias de cor creme, com aspecto glabroso; (b)
Micromorfologia em lactofenol azul-algodão, 400X, pode-se observar
células leveduriformes com formatos arredondados e ovais. A seta preta
indica blastoconídio em brotamento. ........................................................... 24
Figura 3 – Prevalência da Esporotricose no Mundo. .................................................... 26
Figura 4 – Mapa da América do Sul mostrando localidades de maior ocorrência de
esporotricose animal e humana no Brasil. Os estados do Rio de Janeiro e
Rio Grande do Sul são descritos como regiões com alta incidência de
esporotricose felina ...................................................................................... 28
Figura 5 – Casos notificados de esporotricose segundo ano de início de sintomas e
confirmação (nº e %), Estado do Rio de Janeiro, período de 2013 a 2016. . 29
Figura 6– Casos confirmados de esporotricose segundo ano de início de sintomas e
sexo, Estado do Rio de Janeiro, período de 2013 a 2016. ........................... 30
Figura 7– Formas clínicas de esporotricose humana. A - Linfocutânea no membro
superior; B - Cutânea fixa no membro superior; C - Extracutânea
pulmonar (a seta aponta a cavitação no ápice do pulmão esquerdo); D -
Cutânea disseminada (face de uma paciente). ............................................. 34
Figura 8 – Macromorfologia do Sporothrix spp. (a) crescimento filamentoso, com
aspecto enrugada e dobrada, de coloração esbranquiçada, com bordas
acastanhadas e enegrecidas, devido a síntese de melanina; (b)
crescimento leveduriforme, com aspecto cremoso e de coloração creme. .. 36
Figura 9– A e B: Corpo asteróide corado com HE x 1.150.. .............................................. 37
Figura 10 – Representação do ciclo de formação de um biofilme. .................................... 43
Figura 11 – Estrutura química da miltefosina (hexadecilfosfocolina). ........................... 52
Figura 12 – Fluxograma utilizado na metodologia do estudo. ........................................... 60
Figura 13– Cinética de crescimento dos biofilmes leveduriformes do complexo
Sporothrix schenckii. Os gráficos (a), (b) correspondem a cinética das
espécies estudadas na forma leveduriforme. O comprimento de onda para
asabsorbâncias foram: (a) 492 nm para atividade metabólica (XTT) e (b)
540 nm para cristal violeta (CV), biomassa. ................................................ 62
Figura 14– Quantificação da biomassa por cristal violeta. Os valores correspondem
as médias das absorbâncias de cada amostra obtidas com o ensaio de CV,
em duplicata, dos biofilmes formados in vitro por 18 cepas de Sporothrix
spp. na forma leveduriforme, por 96 h. As barras de erro indicam desvios
padrões das amostras. DO: densidade óptica. .............................................. 62
Figura 15– Biofilmes de Sporothrixbrasiliensis, corados através da técnica de
vermelho Congo, observado em microscópio óptico (A e D) e analisados
em microscopia eletrônica de varredura (MEV) (B, C, E e F). A -
Biofilme filamentoso, 400X,com hifas entrelaçadas (seta branca) e matriz
extracelular (seta preta); D - Biofilme leveduriforme, 1000X, mostra as
células em formato ovalado (seta branca) e a matriz extracelular (seta
preta). B - Biofilme filamentoso, 1000X. C – Biofilme filamentoso,
5000X, seta branca indica a formação do biofilme com hifas e conídios, a
seta preta mostra a matriz extracelular envolta das estruturas. E -
Biofilme leveduriforme, 1000X. F – Biofilme leveduriforme, 10000X, a
seta branca indica os blastoconídios em brotamento, com formato em
―charuto‖ e a seta preta mostra as células envolta por matriz
extracelular... ................................................................................................ 65
Figura 16 – Sensibilidade in vitro dos biofilmes do complexo Sporothrix schenckii à
anfotericina B (AMB), ao itraconazol (ITC), a miltefosina (MIL) e ao
iodeto de potássio (KI). Os dados representam a porcentagem (%) de
crescimento dos biofilmes após serem expostos as drogas testadas,
comparados ao controle de crescimento (100%). Para a atividade
metabólica (XTT) e a biomassa, por cristal violeta (CV) das cepas nas
formas filamentosa e leveduriforme. Controle: corresponde ao
crescimento do micro-organismo sem adição de droga, apenas com o
meio RPMI. CIM: concentração inibitória mínima; 10 x CIM: dez vezes
a concentração inibitória mínima; 50 x CIM: cinquenta vezes a
concentração inibitória
mínima.......................................................................................... ............... 69
Figura 17– Biofilmes de Sporothrix brasiliensis, por microscopia Confocal (100
µm), mostrando células vivas, na cor verde e células mortas ou
danificadas, na cor vermelha, para a forma filamentosa, apresentando
hifas e conídios (A, B, C, D, E) e leveduriforme apresentando
blastoconídios em brotamentos (F, G, H, I, J). (A e F) Controle de
crescimento do biofilme maduro sem adição de droga; Biofilmes tratados
com as drogas, demostrando a redução na quantidade total de células e o
aumento de células mortas: AMB (B e G), ITC (C e H), MIL (D e I) nas
concentrações de 50 x CIM e KI (E, J) na concentração de 10 x CIM ........ 71
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Resumo das principais características da diferenciação das espécies de
Sporothrix spp. ............................................................................................. 23
Tabela 2 - Classificação das cepas do complexo Sporothrix schenckii na forma
leveduriforme de acordo com a capacidade de formação de biofilme, in
vitro. ............................................................................................................. 63
Tabela 3 - Atividade antifúngica, in vitro, da miltefosina (MIL), iodeto de potássio
(KI), anfotericina B (AMB) e itraconazol (ITC), frente a cepas do
complexo Sporothrix schenckii nas formas filamentosa e leveduriforme. .. 67
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AMB Anfotericina B
ATCC American Type Culture Collection
BHI Brain Heart Infusion
CEMM Centro Especializado em Micologia Médica
CIM Concentração inibitória mínima
CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute
CV Cristal violeta
DHN 1,8-dihidroxinaftaleno
DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Ácido desoxirribonucleico
DO Densidade óptica
DP Desvio padrão
EUA Estados Unidos da América
FIL Filamentoso
HE Hematoxilina-eosina
ITC Itraconazol
L-DOPA 3,4-di-hidroxi-L-fenilalanina
LEV Leveduriforme
MIL Miltefosina
MOPS Ácido 3-(N-morfolina) propanossulfônico
PAS Ácido periódico de Schiff
PBS Phosphate buffered saline
PCR Reação em cadeia da polimerase
pH Potencial hidrogeniônico
RNA Ácido ribonucleico
RPMI 1640 Meio suplementado (de Roswell Park Memorial Institute)
SIDA Síndrome da imunodeficiência adquirida
SSKI Solução saturada de iodeto de potássio
UFC Unidade formadora de colônia
XTT (2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-[carbonilo(fenilamino)]-
2Htetrazóliohidróxido)
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 17
2 REVISÃO DE LITERATURA ...................................................................................... 19
2.1 Esporotricose ................................................................................................................ 19
2.1.1 Aspectos Históricos .................................................................................................... 19
2.1.2 Agente Etiológico ....................................................................................................... 20
2.1.2.1 Taxonomia ............................................................................................................... 20
2.1.2.2 Morfologia ............................................................................................................... 22
2.1.2.3 Aspectos Ecológicos ................................................................................................ 24
2.1.3 Epidemiologia ............................................................................................................ 26
2.1.4 Patogenia ................................................................................................................... 31
2.1.5 Aspectos Clínicos ....................................................................................................... 31
2.1.5.1 Formas cutâneas ..................................................................................................... 32
2.1.5.1.1 Cutânea localisada ............................................................................................... 32
2.1.5.1.2 Cutâneo-linfática .................................................................................................. 32
2.1.5.1.3 Cutâneo disseminada ............................................................................................ 33
2.1.5.2 Forma Extracutânea ................................................................................................ 33
2.1.6 Diagnóstico e Identificação Laboratorial ................................................................. 34
2.1.6.1 Amostra Biológica ................................................................................................... 34
2.1.6.2 Diagnóstico Micológico .......................................................................................... 34
2.1.6.3 Diagnóstico Histopatológico ................................................................................... 36
2.1.6.4 Diagnóstico Sorológico ........................................................................................... 37
2.1.6.5 Diagnóstico Molecular ............................................................................................ 37
2.1.7Fatores de Virulência ................................................................................................. 38
2.1.7.1 Biofilme .................................................................................................................... 41
2.1.8Tratamento .................................................................................................................. 44
2.1.8.1 Testes de Sensibilidade a Antifúngicos................................................................47
2.1.8.2Iodeto de Potássio .................................................................................................... 49
2.2 Miltefosina .................................................................................................................... 51
3HIPÓTESES .................................................................................................................... 53
4OBJETIVOS .................................................................................................................... 53
4.1 Objetivo Geral ............................................................................................................. 53
4.2 Objetivos Específicos ................................................................................................... 53
5MATERIAL E METODOS ............................................................................................ 54
5.1 Local do estudo ............................................................................................................ 54
5.2 Micro-organismos ........................................................................................................ 54
5.3 Formação de biofilme leveduriforme. .............................................................. 54
5.4Cinética de crescimento e classificação dos biofilmes leveduriformes..................... 55
5.5Análises microscópicas dos biofilmes .......................................................................... 56
5.6Drogas antemicrobianas .............................................................................................. 57
5.7 Ensaio de sensibilidade planctônico ........................................................................... 58
5.8Ensaio de sensibilidade dos biofilmes ......................................................................... 58
5.9Análises estatísticas ...................................................................................................... 59
6RESULTADOS ................................................................................................................ 60
6.1 Cinética de crescimento dos biofilmes leveduriformes ............................................ 60
6.2 Análises microscópicas dos biofilmes (Microscopia Óptica e MEV) ............ 63
6.3Ensaio de sensibilidade planctônica ............................................................................ 66
6.4Ensaio de sensibilidade dos biofilmes ......................................................................... 68
7DISCUSSÃO .................................................................................................................... 72
8CONCLUSÕES ................................................................................................................ 77
REFERÊNCIAS ................................................................................................................ 78
APÊNDICE A................................................................................................... 94
APÊNDICE B.....................................................................................................96
APÊNDICE C.....................................................................................................98
ANEXO A.......................................................................................................... 100
17
1 INTRODUÇÃO
A esporotricose, doençacosmopolita, causada por espécies do complexo Sporothrix
schenckii, ocorre principalmente em regiões de clima tropical e subtropical, é considerada
uma micose endêmica das Américas, com uma alta prevalência nas regiões Sul e Sudeste do
Brasil (BRILHANTE et al., 2014).Pode acometer tanto o homem quanto animais, e está
geralmente associada à implantação do fungo, através de lesões na pele,podendo ocorrer à
invasão da derme e do tecido subcutâneo (CRUZ, 2013).
Sporothrix é umfungo dimórfico e geofílico e sua patogenicidade se atribui a alguns
fatores inerentes, tais como: enzimas extracelulares, cepas termotolerantes,
diferentesconstituintes da parede celular e presença de grânulos demelanina que aumentam
suas chances de sobrevivência noambiente e no hospedeiro (MADRID et al., 2011; FREITAS
et al., 2015). Vale ressaltar ainda a sua capacidade de formar biofilmein vitro, como já foi
descrito (SÁNCHEZ-HERRERA et al., 2014; BRILHANTE et al.,2017).
O desenvolvimento de biofilme é um dos mecanismos mais comuns de crescimento
microbiano e ocorre através da multiplicação celular e da produção da matriz extracelular, que
na natureza, oferece proteção contra ambientes agressivos e possíveis predadores (LI et al.,
2015). No hospedeiro, são considerados importantes fatores de virulência, pois pode
participar no desenvolvimento da infecção e dessa forma pode conferir resistência aos
mediadores específicos da resposta imune e a antibioticoterapia convencional
(MARTINEZ;FRIES, 2010; PHILLIPS; SCHULTZ, 2012; BRILHANTE et al.,
2015).Entretanto os estudos sobre biofilmes envolvendo o complexo S. schenckii são escassos
(SÁNCHEZ-HERRERA et al., 2014; BRILHANTE et al., 2017).
Os fármacos mais utilizadas para cura clínica da esporotricose são: iodeto de potássio,
itraconazol e anfotericina B, esta última sendo utilizada nas formas mais graves da infecção
(SILVA et al., 2012). O Iodeto de potássio, continua sendo o tratamento de escolha para
esporotricose, mesmo após décadas da sua utilização e seu uso se deve em partes ao seu baixo
custo se comparado com outros fármacos, como os azólicos, por exemplo. Apesar de sua ação
como antimicótico ser de conhecimento médico antigo, raros são os relatos na literatura sobre
a ação dessa droga frente a cepas planctônicas do complexo S. schenckii, e outros ainda
afirmam que o KI não possui atividade, in vitro(WADA, 1968; HIMURA E KAGAWA,
1987; COSTA et al., 2013). A lista de quimioterápicos com ação antifúngica é extensa, porém
ainda muito restrita se comparada com os antibacterianos. Portanto, se faz necessário que os
antifúngicos tenham uma adequada aplicação clínica e que os efeitos adversos sejam
18
mínimos(NOBRE et al., 2002).
Com o aumento progressivo do numero de casos de esporotricose principalmente no
Sudeste do Brasil, se faz necessário o desenvolvimento de quimioterápicos alternativos para o
combate dessa infecção com uma maior eficácia e baixa toxicidade. Estudos demonstram que
alguns fármacos administrados para terapias de doenças não-fungicas, podem ter atividade
antimicótica relevante. É o caso da miltefosina, que foi desenvolvido inicialmente para atuar
na quimioterapia do câncer, e pesquisas posteriores verificaram também atividades inibitórias
relevantes frente Trypanossoma cruzi e Leishmania spp. Assim como, contra algumas cepas
de Sporothrix spp. na forma planctônica (BRILHANTE et al., 2014; BORBA-SANTOS et al.,
2015; BORBA-SANTOS et al., 2016a).
Contudo, não há relatos sobre as propriedades antifúngicas dessas drogas frente aos
biofilmes do complexo Sporothrix schenckii. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi avaliar
a capacidade de formar biofilme do complexo S. schenckii na sua forma leveduriforme,in
vitro, assim como caracterizar a sua cinética de crescimento e a sensibilidade dos biofilmes ao
iodeto de potássio (KI) e à miltefosina (MIL).
19
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Esporotricose
2.1.1 Aspectos Históricos
Foi o estudante de medicina da Hopkins Medical School, Benjamin Robinson
Schenck, que em 1896 isolou pela primeira vez o fungo Sporothrix schenckii, de um paciente
de 36 anos de idade, que após um ferimento no dedo indicador, na mão direita apresentou
ulceração no local e no braço. Este isolado foi estudado pelo micologista Erwin Smith, que
concluiu que o fungo pertencia ao gênero Sporotrichum (SHENCK,1898). Schenck fez a
primeira descrição da esporotricose com a publicação ―On refractory subcutaneous abscess
caused by a fungus possibly related to the Sporotricha‖ no Johns Hopkins Hospital Bulletins,
considerada a certidão de nascimento da esporotricose (SIDRIM & ROCHA, 2004).Antes
desse acontecimento, em 1809 Linck e em 1889 Lutz relataram alguns possíveis casos de
esporotricose, mas esses autores não conseguiram o isolamento do fungo (LUTZ;
SPLENDORE, 1907).
O segundo caso de esporotricose foi relatado por Hektoen e Perkins em 1900, também
nos Estados Unidos em Chicago. Foi o caso de uma criança do sexo masculino, de 5 anos de
idade, que sofreu uma lesão com um martelo batendo em seu dedo, a lesão apresentou
regressão espontânea. Foram esses pesquisadores que denominaram o agente da
esporotricose, Sporothrix schenckii (HEKTOEN; PERKINS, 1900). Este fungo foi incluído
no gênero Sporotrichum, equivocadamente, pois esse gênero compreende fungos
basidiomicetos que não são dimórficos nem patogênicos para animais e humanos. Essa
nomenclatura, permaneceu errada até 1962, até que Carmichael verificou diferenças nas
conidiações de membros do gênero Sporotrichum e isolados de casos de esporotricose
(BARROS et al., 2011).
Em 1907, Lutz e Splendore relataram pela primeira vez o caso de infecção natural de
animal que ocorreu em ratos aqui no Brasil (LUTZ e SPLENDORE, 1907). Também foi
Splendore que em 1908, no Brasil, descreveua detecção de corpos de asteróides em torno de
células de levedura de Sporothrix spp., que se tornaria um achado patognomônico para o
diagnóstico em exames histológicos, da esporotricose (BARROS et al., 2011).A
suscetibilidade de gatos para a infecção por Sporothrix spp. foi demonstrada
experimentalmente em 1909 (BEURMANN et al., 1909). O primeiro caso de esporotricose no
20
Rio de Janeiro foi descrito em 1912 por Terra e Rabelo e, desde então, casos isolados vêm
sendo descritos em várias regiões do país (DONADEL et al., 1993).
No início do século XX a doença apresentava maior prevalência nos EUA e na França,
com alguns casos no restante da Europa, América do Sul, Rússia e Extremo Oriente
(RIPPON, 1988). E,diversos surtos foram registrados ao longo do tempo, em vários países,
mas a maior epidemia já documentada, ocorreu na África do Sul, entre os anos de 1941 e
1944, onde aproximadamente 3.000 trabalhadores mineiros, adquiriram a infecção fúngica, o
fungo estava presente nas vigas de madeira de sustentação dos túneis das minas
(HELM;BERMAN, 1947).
Nos Estados Unidos, no vale do Mississipi, foram registrados surtos relacionados ao
trabalho em florestas, com mudas de pinheiro e manipulação de musgo. Ainda nos EUA, entre
os anos de 1992 e 1993, ocorreu uma microepidemia de esporotricose pela contaminação de
pessoas pelo feno estocado em uma casa abandonada, onde se realizavam festas de Halloween
(DOOLEY et al., 1997).No Sudoeste da Austrália entre os anos de 2000 e 2003 ocorreu um
surto tendo novamente o feno como material contaminado. Desde então, o fungo vem sendo
descrito em todos os continentes, sendo a maioria dos relatos, nas Américas, principalmente
México, Colômbia, Uruguai e Brasil(FEENEY et al., 2007).
No Brasil os maiores números de casos de esporotricose ocorridos com a transmissão
clássica pelo solo ou matéria orgânica são provenientes dos estados de São Paulo, com 235
casos humanos confirmados até o ano de 1953 (SAMPAIO et al., 1954) e do Rio Grande do
Sul, com 646 casos humanos acumulados entre os anos 1957 e 2002 (LONDERO;RAMOS,
1989; LOPES et al., 1999; DA ROSA et al., 2005). E ainda, dados do Serviço de Vigilância
em Saúde do Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas (IPEC), no Rio de Janeiro,
apontam para aproximadamente 2.200 casos humanos diagnosticados até dezembro de 2009.
Sendo que foram atendidos, até essa data, aproximadamente 3.244 gatos e mais de 120 cães
com esporotricose (BARROS et al., 2010).
2.1.2 Agente Etiológico
2.1.2.1 Taxonomia
O complexo Sporothrix schenckii é constituído por várias espécies pertencentes ao
reino fungi e são organismos eucarioto, heterótrofoe apresentam quitina na sua parece celular.
Inicialmente este fungo foi incluído na divisão Eumycota, subdivisão Deuteromycotina, da
classe Hyphomycetes, ordem Moniliales e família Moniliaceae (LACAZ et al., 1998). Após
21
uma revisão da taxonomia fúngica feita por Guarro e colaboradores, este fungo foi
classificado na divisão Ascomycota, na classe Sordariomycetes, na ordem Ophiostomatales, e
na família Ophiostomataceae e gênero Sporothrix (GUARRO et al., 1999; CARRADA-
BRAVO; OLVERA-MACÍAS, 2013).
Através de cepas de Sporothrix spp. isoladas a partir de amostras clínicas foi possível
evidenciar a heterogeneidade morfológica e genética desse fungo que tem sido relatada em
diversos trabalhos publicados nos últimos anos (ISHIZAKI et al., 2004; CARRADA-
BRAVO; OLVERA-MACÍAS, 2013). O primeiro estudo indicando que S. schenckii se
tratava de um complexo de espécies distintas foi baseado em análise filogenética e empregava
uma combinação de sequências de DNA de três loci (calmodulina, quitina sintase e β-
tubulina) que foram obtidas através do estudo de sessenta cepas de S. schenckii isoladas em
diversos países. Logo após, foi demonstrado que bastaria uma análise sequencial do locus
calmodulina para que todas as espécies de interesse médico que fazem parte do complexo
Sporothrix schenckii fossem identificadas (MARIMON et al, 2007; CRUZ, 2013).
Baseados em estudos sobre a genômica e análise com base nos conceitos da taxonomia
polifásica moderna que inclui informações sobre morfologia, fisiologia e nutrição, além do
sequenciamento de DNA, a espécie S. schenckii passou a ser considerada como um complexo
de espécies crípticas (MARIMON et al, 2007; CRUZ, 2013). Onde os principais agentes
etiológicos da esporotricose considerados atualmente são espécies Sporothrix schenckii stricto
sensu, Sporothrix brasiliensis,Sporothrix globosa, Sporothrix mexicanaeSporothrix luriei e
raros casos de infecção sendo causada pela espécie Sporothrix pallida, anteriormente
denominada S. albicans(ZHAO et al., 2015; CARRASCO-ZUBER et al., 2016; ALMEIDA-
PAES et al., 2016; GONÇALVES et al., 2017).
As espécies S. brasiliensis e S. schenckii stricto sensu são as formas clínicas mais
comumente isoladas no Brasil e também mais virulentas, considerando a infecção em modelos
animais (RODRIGUES et al., 2014; BORBA-SANTOS et al., 2016b).A espécie S. globosa,
sendo considerada com pouca virulência e de distribuição mundial (OLIVEIRA et al., 2010;
CRUZ et al., 2012) e a espécie S. mexicana, que é encontrada em certas amostras ambientais
do México e em casos de esporotricose na Europa e no Brasil (MARIMON et al.,
2007;RODRIGUES et al., 2013; ALMEIDA-PAES et al., 2014).
Espécies consideradas ambientais, e que não são capazes de causar infecções foram
descritas por Meyer et al. (2008), foram elas,S. stylites, S. humicola, e S. lignivora. A espécie
S. lignivora apresenta conídios distintos que não coincidem em forma e tamanho com os
apresentados por outras espécies do complexo. As duas primeiras espécies não produzem
22
conídios melanizados e, consequentemente, suas colônias não escurecem (DE MEYER et al.,
2008). E ainda, outras espécies têm sido isoladas de amostras de pele e sangue de humanos,
como por exemplo S. cyanescens. No entanto, com o estudo da patogenicidade verificou-se
que, por mais que estes fungos tenham a capacidade de crescer a 37ºC, não demonstram
virulência (BARROS et al., 2011).
Outras espécies obtidas de amostras de solo, que também fazem parte do complexo S.
schenckii, tem sido relatada, S. brunneoviolacea, S. inflata, S. variecibatus, S. dimorphospora
(ZHAO et al., 2015). As espécies saprófitas geralmente associação com a decomposição da
madeira e do solo, são raramente encontradas como causadoras de doenças humanas. Mais
recentemente, foi isolada no Chile a espécie S. chilensis, essa sendo obtida de amostra de
onicomicose e de solo, sendo o seu taxo mais próximo da espécie S. mexicana. Um modelo
disseminado de esporotricose murina revelou um potencial patogênico leve, com invasão
pulmonar para essa espécie (RODRIGUES et al., 2016).
2.1.2.2 Morfologia
O complexo Sporothrix schenckiiengloba espécies fúngicas classificadas como
dimórficas, ou seja,em seu estágio saprófitico ou em cultivo a temperatura de 25-28°C, se
apresenta na forma filamentosa, e causando infecção ou em cultivo a temperaturas próximas a
37ºC, na forma leveduriforme. A forma filamentosa é composta de hifas hialinas, muito
delicadas, septadas eramificadas, medindo de 1 a 2 μm de largura.Microscopicamente é
possível evidenciar células conidiogênicas a partir de hifas, formando conídios piriformes,
medindo de 1,5 a 3μm, em grupos, conhecido como flordemargarida (Figura 1b). Estes
conídios possuem formato de piriforme e surgem ao lado das hifas, com paredes espessas,
hialinos ou castanhos. As paredes celulares escuras desses conídios diferemas espécies de S.
schenckii de interesse médico de outras espécies deSporothrix não patógenicas (Tabela 1) (DE
MEYER et al., 2008; BARROS et al., 2011; RODRIGUES et al., 2016).
23
Tabela 1-Resumo das principais características da diferenciação das espécies de Sporothrix spp.
Espécies Presença de
conídios
pigmentados
Crescimento
a 37ºC
Teste de assimilação
Sacarose Rafinose
S. albicans Não Sim + -
S. brasiliensis Sim Sim - -
S. globosa Sim Não + -
S. mexicana Sim Sim + +
S. schenckii stricto sensu Sim Sim + +
Fonte: Adaptado de Marimon et al., 2007.
Na macroscopia, as colônias filamentosas cultivadas de 5 a 7 dias em meio como ágar
batata dextrosepossuem aspecto coreáceas e enrugadas, de coloração que varia de brancas a
creme no início do crescimento e depois de alguns dias tornando-se castanhas a negras(Figura
1a). Algumas cepas, no entanto, têm a capacidade de formar colônias escuras desde o início
do crescimento (ALMEIDA-PAES et al., 2007; CARRADA-BRAVO; OLVERA-MACÍAS,
2013).
Figura 1- Sporothrix spp. na forma filamentosa. (a) Macromorfologia em ágar batata que exibe
colônias de cor branca, com aspecto membranoso, a seta vermelha indica o centro da colônia
tornando-se escurecido com o passar do tempo; (b) Micromorfologia em lactofenol azul-algodão,
400X, pode-se obdervar hifas e conídios nas extremidades assemelhando-se à flor de margarida (seta
preta).
Fonte: CEMM, 2017.
Este fungo quando observado em tecidos humanos e em tecidos animais ou revertidas
in vitro, a 37ºC, se apresentam no formatoleveduriforme, e podem ser vistos em brotamento.
24
As células leveduriformespossuemvários tamanhos e formas,podem ser redondas a ovais, com
diâmetros de 2 a 6 µm, e normalmente são botões alongados, em forma de charuto com uma
base estreita (Figura 2b). Macroscopicamente, as colônias leveduriformes são de aspecto
ceroso, de formato irregular e cor creme (Figura 2a) (BARROS et al., 2011; CARRADA-
BRAVO; OLVERA-MACÍAS, 2013).
A forma para a reversão ser conseguida éatravés da cultura do micélios ou conídios em
meios de cultura ricos, tais como Brain Heart Infusion (BHI), suplementado com sangue de
carneiro a 35 a 37°C, porem média 7 dias (MAHMOUDI et al., 2016). Algumas cepas,
necessitam de temperaturas para conversão mais baixas, uma vez que não crescem bem a
37°C, especialmente aquelas relacionadas à espécie S. globosa(MARIMON et al., 2007) e
também dentro da faixa de pH entre 3,0-8,5 e toleram bem soluções com até 11% de cloreto
de sódio (NaCl). Embora sejam necessários meios ricos para a transição do fungo filamentoso
para a forma leveduriforme, estas podem ser mantidas a 37°C em outros meios, tais como
Sabouraud dextroseagar (BARROS et al., 2011; MAHMOUDI et al., 2016).
Figura 2 - Sporothrix spp. na forma leveduriforme. (a) Macromorfologia em ágar BHI (brain heart
infusion), suplementado com 5% de sangue de carneiro, que exibe colônias de cor creme, com aspecto
ceroso; (b) Micromorfologia em lactofenol azul-algodão, 400X, pode-se observar células
leveduriformes com formatos arredondados e ovais. A seta preta indica blastoconídio em brotamento.
Fonte: CEMM, 2017.
2.1.2.3 Aspectos Ecológicos
O desenvolvimento do Sporothrix spp. ocorre principalmente em lugares que possuem
as condições climáticas favoráveis com elevada umidade relativa ambiental acima de 92%,
devido a sua necessidade de ambientes com elevada umidade e altas temperatura, por volta de
31ºC (CARRARA-BRAVO; OLVERA-MACÍAS, 2013). Este fungo existe, normalmente,
25
como sapróbio da natureza, já foi isolado de palha, folha, frutas, grão de trigo, espinhos de
arbusto, madeira, casca de árvore, aranhas, insetos mortos e larvas, roseiras, poeira, moscas
vivas, excretas de animais, algas e animais marinhos, feno de pradaria e gramíneas(SIDRIM e
ROCHA, 2004; CRUZ, 2013).
Em humanos, a maioria dos casos clínicos são relatados em homens jovens e
saudáveis, cuja ocupação ou hobby o levam para locais que o fungo se faça presente.
Tradicionalmente são, agricultores, criadores, jardineiros, paisagistas e laboratoristas que
desenvolvem a esporotricose cutânea, pois estão expostos a materiais contaminados e suas
atividades diárias frequentemente levam a cortes, muitas vezes imperceptíveis, que ocorrem
geralmente nas mãos, braços, pernas, pés e rosto, que são os lugares de fácil exposição. Em
crianças menores, geralmente são acometidas através das picadas de insetos, mordidas,
quedas e abrasões (CARRARA-BRAVO; OLVERA-MACÍAS, 2013)
A transmissão zoonótica de Sporothrix spp. é causada por mordidas ou arranhões de
animais, sendo mais comumente relatados gatos, cães e tatus. Os gatos desenvolvem úlceras
cutâneas disseminadas, com infecção muitas vezes fatal. O fungo então é transmitido da
úlcera ou de mordidas e arranhões para o homem e cães. No Brasil, a partir da década de 80 o
perfil dessa doença tem sido basicamente de transmissão zoonótica, sendo o gato o animal
mais envolvido. Geralmente, o sexo feminino, é relatado como sendo o principal acometido,
não envolvendo necessariamente atividades laborais, e sim pelo hábito deter o gato como
animal doméstico (CARRARA-BRAVO; OLVERA-MACÍAS, 2013; CRUZ, 2013).
Os gatos possuem uma particularidade que os tornam mais susceptíveis a infecção
fúngica, adotando posição fundamental na epidemiologia dessa doença, fato esse que se deve
ao seu comportamento natural de afiar as unhas em árvores e cavar o solo para enterrar suas
fezes, o que facilita o abrigo do fungo na região ungueal. Como fator agravante, os gatos
infectados ainda apresentam na lesão e nas secreções de feridas ulceradas, uma carga
exuberante desse micro-organismo, potencializando dessa forma a transmissão tanto entre
gatos, como destes para outras espécies como o homem (MARQUES-MELO et al., 2014).
Vários casos de esporotricose foram descritos entre profissionais da área laboratorial
que manipularam animais infectados ou trabalham com culturas de Sporothrix spp. De um
modo geral, ocorre inoculação cutânea, masjá foi descrito o envolvimento de infecção
ocular,devido a esguicho de material de cultura ter atingido o olho. Outros profissionais que
estão mais expostos são os veterinários pelo contato direto, mordedura e arranhadura dos
animais infectados (CARRARA-BRAVO; OLVERA-MACÍAS, 2013).
26
2.1.3 Epidemiologia
A esporotricose é considerada uma doença cosmopolita, ocorrendo
predominantemente em áreas de clima quente e temperado. É endêmica no Sul da África, na
Índia, no Japão, no Estados Unidos da América (EUA)e em vários países latino-americanos
como Perú, Brasil, México, Colombia, Uruguai, Costa Rica e Guatemala (Figura 3). Nestes
países, a sua distribuição por sexo e idade está relacionada com a ocupação e exposição ao
fungo. No Brasil esta doença estamais relacionada ao contato com gatos, o que contribuiu
substancialmente na forma de transmissão da esporotricose (LÓPEZ-ROMERO et al., 2011;
OYARCE et al., 2016).
Figura 3 – Prevalência da Esporotricose no Mundo.
Fonte: Adaptado de Chakrabarti et al., 2015.
As espécies de Sporothrix spp. diferem quanto a sua distribuição geográfica.
Sporothrix globosa é distribuída mundialmente e tem sido recuperada de espécimes clínicos
na Europa (Reino Unido, Espanha, Itália), Estados Unidos, América do Sul (México,
Guatemala, Colômbia) e Ásia (Índia, China, Japão) (KANO et al., 2015). Do mesmo modo, S.
schenckii stricto sensu tem uma ampla distribuição geográfica e foi isolado das Américas
(Argentina, Bolívia, Brasil, Colômbia, Guatemala, México, Peru, Estados Unidos,
Venezuela), Europa (França, Itália, Reino Unido) , África (África do Sul) e Ásia (Japão).
27
Sporothrix brasiliensis é uma espécie emergente restrita ao Brasil. Sporothrix luriei foi
descrita a partir de três infecções humanas na África, Itália e Índia e uma infecção canina no
Brasil. Sporothrix mexicana foi retirada do ambiente na Austrália, no México e na Polônia
(CHAKRABARTI et al., 2015).
Na Europa os casos de esporotricose são escassos, sendo descrito 2 casos em
Barcelona, na Espanha, 58 casos na Itália, e 55 casos em outros países do continente, de 1963
a 1993 (VENTIN et al., 1987; BARILE et al., 1993). No continente asiático, onde a
esporotricose é considerada endemica, já foram relatados 78 casos na Índia de 1999 a 2007
(DEVI et al.,, 2006; HALDAR et al., 2007), em Delhi, entre 2008 e 2009 foram reportados 6
casos (CAPOOR et al., 2011), na Malásia, entre 2004 e 2010, foram descritos 19 casos
(TANG et al., 2012), e Nagasaki, entre 1951 e 2012, foram 165 casos (TAKENAKA et al.,
2014). Atualmente no nordeste da China, tem havido um aumento no número de casos de
esporotricose, publicados 467 casos humanos entre os anos de 2007 e 2016 (SONG et al.,
2013; FAN et al., 2016). Estudos apontam S. globosa como a espécie responsável pelos casos,
sendo a manipulação de gravetos para aquecimento domiciliar nos meses de inverno, a forma
de aquisição da doença (YU et al., 2013; LIU et al., 2014).
No continente africano, estudos relatam 2 casos de esporotricose no Sudão (GUMAA,
1978) e2 casos na Nigéria, entre os anos de 1974 e 1979 (JACYK et al., 1981). O maior
número de casos é relado na África do Sul, com 154 casos como reporta Vismer e Hull
(1997).Eainda um surto acometendo 81 mineiros em uma mina de ouro ocorrido em 2011;
ondea espécie S. schenckii stricto sensu foi isolada das amostras clínicas e a espécie S.
mexicana, das amostras ambientais, de solo e madeira da mina (GOVENDER et al., 2015). Já
na América, existem relatos de casos, principalmente na América do Sul com 30 casos
relatados na Venezuela entre os anos de 1973 e 2013 (CAMACHO et al., 2015). Em
Apurimac, no Peru, a doença é hiperendêmica com uma incidência anual média entre 1997 e
1999, com98 casos por 100.000 habitantes (OYARCE et al., 2016).E ainda, são relatados
casos no Chile (CRUZ et al., 2012), na Colômbia, no México (MESA-ARANGO et al., 2002;
RUBIO et al., 2010) e principalmente no Brasil (BARROS et al., 2010; OLIVEIRA et al.,
2013).
No Brasil as ocorrências de esporotricose envolvendo a transmissão clássica pelo solo
ou matéria orgânica são provenientes dos estados de São Paulo e Rio Grande do Sul. Já as
ocorrências envolvendo a transmissão zoonótica, envolvendo principalmente o gato, tem
ocorrido nas regiões Sul e Suldeste (Figura 4), com uma alta prevalência no estado do Rio de
Janeiro, na região metropolitana, onde é registrado o maior número de casos de esporotricose
28
felina e humana (CASTRO et al., 2016). Mais de 4.100 casos humanos foram diagnosticados
em apenas uma instituição de saúde desde 1998 (GONÇALVES et al., 2017). Estudos
mostram ainda que os indivíduos mais acometidos são mulheres e crianças, devido o contato
direto com o animal (ALMEIDA-PAES et al., 2014). No país, todas as espécies do complexo
S. schenckii ditas patogênicas, já foram isoladas (RODRIGUES et al., 2013), mas
particularmente, S. brasiliensis é a espécie mais isolada em casos de esporotricose humana e
felina no estado do Rio de Janeiro (RODRIGUES et al., 2013; BORBA-SANTOS et al.,
2016b). Casos envolvendo cães também tem sido relatado em menor número (FREITAS et
al., 2010; LOPEZ-ROMERO et al., 2011).
Figura 4 - Mapa da América do Sul mostrando localidades de maior ocorrência de esporotricose
animal e humana no Brasil. Os estados do Rio de Janeiro e Rio Grande do Sul são descritos como
regiões com alta incidência de esporotricose felina.
Fonte: Adaptado de Rodrigues et al., 2013.
Os indivíduos acometidos geralmente vivem sob condições de pobreza em áreas
suburbanas da área metropolitana com acesso escasso a saúde e condições de vida insalubres.
A maioria dos pacientes relatam que eles precisam ter gatos em suas casas como um controle
contra a invasão por roedores(ALMEIDA-PAES et al., 2014). A situação do perfil
epidemiológico da esporotricose se agravou no estado do Rio de Janeiro de tal forma que a
secretária de vigilância em saúde do estado juntamente com a Fundação Oswaldo Cruz
29
(FIOCRUZ), publicaram a nota técnica nº 3/2011, em 5 de outubro de 2011, com base no
artigo 10 da portaria nº 104 de 25 de janeiro de 2011, do Ministério da Saúde, considerando a
esporotricose como sendo de notificação compulsória. E através da Resolução SES nº 674 de
12 de julho de 2013 redefine a esporotricose para a lista de doenças de notificação
compulsória estadual e tendo sido incluída na Portaria GM/MS nº 1.271 de 6 de junho de
2014, artigo 2º, parágrafo IV, que inclui epizootia na lista de doenças de notificação
compulsória nacional.
Durante os anos de 2013 a 2016 foram notificados 3.377 casos suspeitos de
esporotricose no Estado do Rio de Janeiro. Durante este período o percentual de confirmação
dos casos, tanto laboratorial quanto clínico epidemiológico, se manteve acima de 60%,
conforme demonstrado na Figura5. Dentre os casos confirmados observou-se uma elevada
prevalência para pessoas do sexo feminino (Figura 6).
Figura 5 – Casos notificados de esporotricose segundo ano de início de sintomas e confirmação (nº e
%), Estado do Rio de Janeiro, período de 2013 a 2016.
Fonte: SINAN/GDTVZ/SES-RJ, 2016.
30
Figura 6 – Casos confirmados de esporotricose segundo ano de início de sintomas e sexo, Estado do
Rio de Janeiro, período de 2013 a 2016.
Fonte: SINAN/GDTVZ/SES-RJ, 2016
No nordeste brasileiro os casos de esporotricose publicados são, raros, são descritosum
caso de esporotricose cutânia canina na cidade de Mossoró no estado do Rio Grande do Norte
(FILGUEIRA, 2009), um caso de esporotricose cutânea em um felino, na cidade de
Itaporanga, no estado da Paraíba (NUNES et al., 2013), um caso de infecção felina e
transmissão para um humano na cidade de Rio Largo, no estado de Alagoas (MARQUES-
MELO et al., 2014). No estado de Pernambuco, houveum caso de esporotricose felina, na
cidade de Bezerros (ARAÚJO;DE SANTANA LEAL, 2016)e o Laboratório Central de Saúde
Pública de Pernambuco (Lacen/PE) confirmou 45 casos de esporotricose em animais e 5 casos
em humanos durante o ano de 2016, na região metropolitana do Recife, segundo dados da
Secretaria Estadual de Saúde (SES) do Estado de Pernambuco.Já, o estado da Paraíba, tem
registrado um número crescente de casos da doença, na cidade de João Pessoa, em 2015
foram 2 casos, em 2016 foram 8 casos e até o mês de abril de 2017, já haviam sido registrados
16 casos em humanos, e a principal forma de transmissão relacionada foi a zoonótica, através
de gatos doentes. Estes casos foram confirmados pelo laboratório de micologia, do Hospital
Universitário Lauro Wanderley (JPB, 2017).
31
2.1.4 Patogenia
A esporotricose é uma micose caracterizada por ser uma doença crônica que apresenta
lesões nodulares cutânea ou subcutâneas e podem acometer seres humanos e várias espécies
animais tais como gatos, cães, ratos, tatus, equinos, asininos, bovinos, caprinos, suínos,
hamsters, camelos, chimpanzés e aves domésticas (BAZZI et al., 2016). A infecção se inicia
por inoculação traumática do fungo através de lesões na pele ocasionadas por objetos, plantas
ou materiais orgânicos contaminados; por transmissão zoonótica, especialmente por
mordeduras e arranhões de gatos e cães; por picada de insetos (mais raramente)ou ainda por
inalação de conídios, esta última sendo menos frequente(LOPEZ-ROMERO et al., 2011;
GONÇALVES, et al., 2017).Quando a infecção se dá por inalação, geralmente há o
desenvolvimento de um quadro de pneumonite granulomatosa cavitária, inicialmente podendo
ser indistinguível de um quadro de tuberculose (ZANCOPÉ-OLIVEIRA et al., 2011).
Uma vez inoculado no hospedeiro humano ou animal, através da lesão, com a invasão
da derme e do tecido subcutâneo, o fungo que se encontrava presente no ambiente, na sua
forma micelial, passa para sua forma parasitária, a leveduriforme, esse processo se inicia após
24 ou 48 h e pode levar até 13 dias (CRUZ, 2013; MAHMOUD et al., 2016). Quando a
infecção se dá por transmissão zoonótica, geralmente o desenvolvimento da doença é mais
rápido, pois o micro-organismo já se encontra na sua forma parasitária, não necessitando por
tanto, passar pelo processo de reversão (LOPEZ-ROMERO et al., 2011; CRUZ, 2013).
Após a implantação do fungo, a doença pode evoluir de forma localizada onde, ocorre
o aparecimento de nódulos, úlceras e placas verrucosas com ou sem disseminação linfática em
pacientes imunocompetentes. E também, aesporotricose pode desenvolver-se como uma
doença disseminada grave podendo ter o envolvimento visceral e osteoarticular em indivíduos
imunocomprometidos, tais como: portadores de diabetes melito, pacientes com alcoolismo
crônico, portadores de neuplasias malígnas e portadores do HIV/SIDA(LOPEZ-ROMERO et
al., 2011; OYARCE et al., 2016; ALMEIDA-PAES et al., 2016).
2.1.5 Aspectos Clínicos
32
A esporotricose geralmente afeta as partes expostas do corpo, ou seja, as mãos, os
braços, a face e as pernas (CARRADA-BRAVO; OVEIRA-MACIAS, 2013). Essa doença é
caracterizada por possuir uma gama de manifestações clínicas que são classificadas nas
formas: cutânea, entre elas estão as formas cutânea localizada, cutâneo-linfática, e cutâneo
disseminada; e a forma extracutânea. As manifestações clínicas podem variar de acordo com
o estado imunitário do hospedero, a carga fúngica, profundidade e a localização do inóculo,
patogenicidade e tolerância térmica da cepa (RODRIGUES et al., 2016; OYARCE et al.,
2016).
2.1.5.1 Formas cutâneas
2.1.5.1.1 Cutânea localizada
Essa forma é caracterizada por lesões únicas, no local da inoculação, e não possui
nódulos acompanhando os vasos linfáticos. Geralmente estas lesões podem se apresentar de
diversas formas como pápulas que fistulizam, ulceras, placas achatadas, lesões eritemato-
escamosa entre outras (Figura 7B) que só através do isolamento do micro-organismo é
possível o diagnóstico.As extremidades superiores e inferiores são os locais mais comuns
dessas lesões, e as crianças apresentam um alto índice de lesões na face (SONG et al.,
2011).Nessa fase a esporotricose apresenta aspectos clínicos comuns e indistinguíveis com
outras doenças como leishmaniose, cromoblastomicose e tuberculose verrucosa (SIDRIM e
ROCHA, 2004; BARROS et al., 2011).
2.1.5.1.2 Cutâneo-linfática
Esta forma mostra lesão inicial no local do trauma, constituindo o chamado cancro de
inoculação, pode vir a apresentar aspectos diversificados deacordo com o tempo de
desenvolvimento. Geralmente pode ser lesão ulcerada de base infiltrada e eritematosa,
podendo ser também pápula, nódulo, placa vegetante e também uma lesão úlcero-gomosa. Se
desenvolve com formações de nódulos indolores ao longo dos vasos linfáticos, que podem
amolecer e ulcerar. Esse desenvolvimento pode ocorrer estendendo-se do local da lesão ou
permanecer próximo eessa cadeia de nódulos pode evoluir em mais de um vaso linfático. Esta
é a forma mais característica da doença, conhecida como ―aspecto esporotricóide‖ (BARROS
et al., 2011), Figura 7A. É tão característico que outras doenças como a leishmaniose, por
33
exemplo, que podem desenvolver lesões cutâneo-linfática são classificadas como
esporotricose. A lesão cutâneo-linfática é a manifestação clínica predominante da doença,
estando presente em mais de 75%, dos casos juntamente com a cutâneo localizada que
aparece em cerca de 20% dos casos (SIDRIM; ROCHA, 2004;; FREITAS et al., 2013;
FREITAS et al., 2014).
2.1.5.1.3 Cutâneo disseminada
Essa forma está sempre interligada com algum tipo de imunodepressão, ou doenças
associadas e, geralmente ocorre juntamente com a forma extra cutânea. Alcoolismo, diabetes,
corticoterapia prolongada, idade avançada, pacientes HIV-positivos ou com síndrome da
imunodeficiência adquirida (SIDA) são fatores de risco para a manifestação dessa forma
clínica(GALHARDO et al, 2010; GUTIERREZ-GALHARDO et al., 2010; FREITAS et al.,
2012; FREITAS et al., 2014). Esta se dá pela disseminação hematogênica do fungo, logo após
inoculação através da pele ou por inalação fúngica. Inicialmente observa-se lesões cutâneas
que após semanas ou meses, podem ulcerar-se (Figua 7 D, E e F). Essas lesões são bastante
parecidas com as presentes na tuberculose cutânea (SIDRIM; ROCHA, 2004).
2.1.5.2 Formas extracutâneas
Essa forma é considerada rara e com dificuldades para serem diagnósticadas e tratadas.
Como a forma cutâneo disseminada, estão sempre relacionadas com algum tipo de
imunodepressão (FREITAS et al., 2014). Qualquer tipo de tecido ou órgão pode ser
acometido na esporotricose (Figura 7C). As lesões são em decorrência da disseminação
hematogênica eacretita-se que esse tipo de manifestação se desenvolva após a inoculação,
ingestão ou inalaçãodo Sporothrix spp., pois em um considerável número de casos não se
encontra lesão primária. Os sintomas dessa fase são de acordo com o órgão envolvido
acompanhados de febre e comprometimento geral em alguns casos (ZANCOPÉ-OLIVEIRA
et al., 2011; LOPEZ-ROMERO et al., 2011). A pele e o tecido ósseo são os mais acometidos.
As lesões podem ser de forma variada como pequenos granulomas isolados ou grandes lesões
com uma extensa destruição óssea, podendo resultar em fratura expontânea. Se assemelham a
osteomielite e a periostite (KAUFFMAN et al., 2007; ALMEIDA-PAES et al., 2014).
34
34
Figura 7- Formas clínicas de esporotricose humana. A - Linfocutânea no membro superior; B -
Cutânea fixa no membro superior; C - Extracutânea pulmonar (a seta aponta a cavitação no ápice do
pulmão esquerdo); D - Cutânea disseminada (face de uma paciente).
Fonte: Freitas, 2014.
2.1.6 Diagnóstico e Identificação Laboratorial
2.1.6.1 Amostra Biológica
O diagnóstico da esporotricose é baseado no isolamento e identificação de seu agente
causal, de materiais biológicos (LÓPEZ-ROMERO et al., 2011; ZANCOPÉ-OLIVEIRA et
al., 2011).Esse material biológico deve ser coletado de acordo com o tipo e o local da lesão.
Podendo ser exsudato de lesões cutâneas ou mucosas podem ser obtidas com o auxílio de um
swab estéril e fragmentos de lesões cutâneas ou mucosas obtidos por biópsia, por exemplo
(BARROS et al., 2011).
2.1.6.2 Diagnóstico Micológico
Para realização do diagnóstico micológico uma das técnicas é o exame direto, que
consiste em preparações a fresco de espécimes clínicos tratados com hidróxido de potássio
(KOH) a 10% ou hidróxido de sódio (NaOH) a 4%,com a finalidade de observar as células
leveduriformes do fungo. Entretanto, a visualização das células leveduriformes, no exame
35
direto é rara, devido as células nesse formato serem de estrutura pequena e serem escassas em
amostras clínicas, com exceção de amostras biológicas provenientes de gatos (CRUZ, 2013).
Uma outra técnica a ser empregada é a cultura, o método mais simples, mais seguro,
mais rápido e mais barato para identificação deSporothrix spp.É conseguido através do
semeio do material clínico, que geralmente, é biópsia ou o pus da lesão, sem um tratamento
prévio, em Ágar Sabouraud simples, em Ágar Sabouraud acrescido de clorofenicol ou ainda
em Ágar Sabouraud acrescido de clorofenicol e cicloeximida, com os dois últimos, tendo a
finalidade de reduzir ou eliminar possíveis contaminantes. A incubação do material no meio
de cultivo é feita a temperatura de 28-30ºC, e entre cinco a sete dias já é possível a observação
do aparecimento de colônias filamentosas de aspecto enrugado e dobrado, de coloração
esbranquiçada, podendo haver escurecimento nas bordas com o passar do tempo. Um
microcultivo, com o objetivo de se estudar mais detalhadamente a estrutura fúngica através
damicroscopia, também pode ser feito. A presença de dois tipos de conídios: hialinos a
marrons, de parede fina, em conidióforo do tipo simpodial e conídios escuros de parede
espessa, dispostos ao logo de hifas delicadas, formando estrutura que se assemelham a flor de
margarida, identificam o micro-organismo como Sporothrix spp. (BARROS et al., 2011;
ZANCOPÉ-OLIVEIRA et al., 2011; OYARCE et al., 2016).
O teste de termo-conversão, como descrito anteriormente, do micro-organismo em
meio de BHI ágar (Brain Heart Infusion Agar) suplementado com sangue de carneiro,
também pode ser utilizado (CRISEO et al., 2008). Após em média 7 dias de incubação a 37ºC
a cultura do Sporothrix spp., apresenta células leveduriformes, pequenas, arredondadas com
um ou mais brotamentos, tais como aquelas observadas no exame direto (ALMEIDA-PAES,
2012). A confecção de lâminas de Sporothrix spp., tanto na forma filamentosa como na
leveduriforme, é feita com lactofenol-azul de algodão e estas são observadas em microscópio
óptico nos aumentos de 100 e 400X (ZANCOPÉ-OLIVEIRA et al., 2011).
36
Figura 8 – Macromorfologia do Sporothrix spp. (a) crescimento filamentoso, com aspecto enrugada e
dobrada, de coloração esbranquiçada, com bordas acastanhadas e enegrecidas, devido a síntese de
melanina; (b) crescimento leveduriforme, com aspecto cremoso e de coloração creme.
Fonte: CEMM, 2017.
2.1.6.3 Diagnóstico Histopatológico
Para histopatologia as técnicas de escolha são, hematoxilina-eosina (HE), impregnação
pela prata de Grocott e a coloração pelo ácido periódico de Schiff (PAS). No entanto, a
observação das estruturas leveduriformes do Sporotrhrix spp. só é possível caso a amostra
esteja muito rica em estruturas fúngicas (MIRANDA et al., 2009; CRUZ, 2013; OYARCE et
al., 2016). Geralmente, as estruturas leveduriformes têm formas variadas do arredondado a
ovalado com brotamentos, e forma de ―charuto‖. Podem em casos raros ser observado dentro
de macrófagos. Em aproximadamente 40% dos casos onde o fungo é encontrado, observa-se a
presença de corpo asteróide, que é uma estrutura eosinofílica de forma radiada constituída de
complexo antígeno-anticorpo, que se deposita na superfície de alguns fungos em organismo
sensibilizado(Figura 9) (SIDRIM; ROCHA, 2004; ZHANG et al., 2011; CARRADA-
BRAVO; OLVERA-MACÍAS, 2013).
37
Figura 9 – A e B: Corpo asteróide corado com HE x 1.150.
Fonte: Zhang et al., 2011.
2.1.6.4 Diagnóstico Sorológico
Para o diagnóstico sorológico da esporotricose várias técnicas têm sido descritas, tais
como reações de imunodifusão dupla,o teste de imunoeletroforese e o testes de aglutinação
em tubo e em partículas de látex. Astécnicas imunoenzimáticas também começaram a ser
utilizadas no diagnóstico da esporotricose. As primeiras reações imunoenzimáticas (ELISA)
descritas na literatura utilizaram um antígeno purificado de parede celular da forma
leveduriforme (BERNARDES-ENGEMANN et al., 2005), e um extrato bruto de cultivo da
forma filamentosa de Sporothrix spp. (ALMEIDA-PAESet al., 2007). As técnicas
demonstraram valores de especificidade e sensibilidade satisfatórios. Porém, o custo elevado
de equipamentos e reagentes, se tornam fatores limitantes para utilização desse tipo de
diagnóstico (CRUZ, 2013).
2.1.6.5 Diagnóstico Molecular
Os métodos moleculares foram sendo desenvolvidos com afinalidade de melhorar o
diagnóstoco fúngico no que diz respeito a quantidade e rapidez, mantendo ou melhorando a
especificidade, sensibilidade e precisão quando comparado à cultura fúngica(OLIVEIRA et
al., 2014). A identificação de Sporothrix spp., através de métodos moleculares é útil para
garantir um diagnóstico rápido de esporotricose e também é fundamental em casos de culturas
negativas devido a baixa carga fúngica ou infecções secundárias. Sabe-se no entanto que os
métodos moleculares para a detecção de Sporothrix spp. DNA de espécimes clínicos, são
38
excassos (BARROS et al., 2011) e que o fator que limita a sua utilização é o elevado custo de
material, equipamentos e profissionais qualificados (OLIVEIRA et al., 2014).
Através de estudos prévios da análise do DNA mitocondrial, demosntraram que
estaspossuem heterogeneidade de perfis em cepas de Sporothrix spp. (TAKEDA et al., 1991).
E foi através dessa técnica que foi possível demonstrar que isolados deSporothrixschenckii se
tratava na verdade de um complexo de espécies (MARIMON et al., 2007; MARIMON et al.,
2008; OLIVEIRA et al., 2014).
A primeira identificação de Sporothrix spp. por PCR foi descrita por Kano et al.
(2001). Iniciadores baseados no gene codificador da CHS 1 (quitina sintase 1) foram
desenhados e a PCR foi capaz de detectar 10 pg de fragmento de DNA genômico de
Sporothrix spp. A posteriori esta metodologia foi utilizada para o diagnóstico molecular da
esporotricose (KANO et al., 2005). Anested PCR também já foi utilizada para detecção de
Sporothrix spp. em amostras clínicas utilizando como alvo a região do gene 18S rRNA. Onde
foi possível detectar DNA de Sporothrix spp. em amostras de tecidos de animais infectados
ou de amostras clínicas. Essa técnica apresentou uma alta sensibilidade e especificidade (HU
et al., 2003). Estudos relataram uma PCR em biópsia de tecido utilizando o primer para o
gene codificador da CHS, S2-R2, que apresentou reações positivas em 25 de 30 casos
(83,3%). Esses primers também foram utilizados com sucesso para o diagnóstico da
esporotricose felina (KANO et al., 2005; LIU X et al. 2013).
A PCR fingerprinting utilizando o primer universal T3B, foi descrita, para diferenciar
as espécies do complexo Sporothrix schenckii: S. brasiliensis, S. globosa, S. mexicana e S.
schenckii stricto sensu. E essa metodologia gerou padrões de bandas distintos, permitindo
assim a correta identificação de isolados clínicos em nível de espécie, confirmados pelo
sequenciamento parcial do gene da calmodulina. Esta metodologia é considerada pelo autor
como, simples, confiável, rápida e de baixo custo, sendo um sistema de identificação ideal
para utilização em laboratórios clínicos de micologia que não disponham de recursos para o
sequenciamento de DNA (OLIVEIRA et al., 2012; RODRIGUES et al., 2014).
2.1.7 Fatores de Virulência
A definição para fator de virulência é, característica pertencenteao micro-organismo
que permite ou facilita o crescimento microbiano no hospedeiro. A descoberta da virulência
microbiana tem sido o principal objetivo de vários estudos. Sabe-se que os micro-organismos
interagem com outros organismos que se fazem presente no habitatnatural do patógeno, e com
39
isso desenvolvem estratégia de sobrevivencia, tendendo assim a uma maior virulência quando
acidentalmente entram em contato com um hospedeiro animal. Com isso, admite-se que a
origem da virulência do Sporothrix spp. tenha ocorrido pela interação intermicrobiana em seu
ambiente (STEENBERGEN et al., 2004). Estudo mostra que, quando Sporothrix spp. na
forma leveduriforme é ingerido por Acanthamoeba castellanii, uma ameba do solo, são
capazes de sobreviver dentro do protozoário, matá-lo, e usá-lo como nutriente (SGARBI et
al., 1997).
As informações relacionadasaos fatores de virulência do Sporothrix spp. ainda são
escassas. Apesar disso, alguns fatores de virulência podem ser encontrados descritos na
literatura, tais como o dimorfismo, a termotolerância, a produção de melanina, a presença de
adesinas e proteínas, a produção de ergosterol(MORA-MONTES et al., 2015) e mais
recentemente a formação de biofilme (SÁNCHEZ-HERRERA et al., 2014; BRILHANTE et
al., 2017).
O dimorfismo é uma das característica do Sporothrix spp. e é conciderado um fator de
virulência. Embora pouco se saiba sobre os fatores que induzem a transição do micélio a
levedura, existem evidências que sugerem um gene que codifica a cálcio/calmodulina-
quinase, em Sporothrix spp. e desempenhe possivelmente um papel como efetor de
dimorfismo nesse fungo (VALLE-AVILES et al., 2007). E ainda, uma histidina cinase
híbrida, DRK1, que é reconhecidamente um regulador universal do dimorfismo e virulência,
de fungos dimórficos, foi relatada também em Sporothrix spp.(HOU et al., 2014). Outra
histidina encontrada foi a SsDrk1, pode também estar relacionada com o dimorfismo deste
fungo. E estudos moleculares mostram que esta se faz presente em maior quantidade em
células leveduriformes se comparada com a forma micelial (TEIXEIRA et al., 2014), esse
pode ser um dos motivos que leva a forma leveduriforme a possuir uma maior virulência
(RODRIGUES et al., 2013). Outros estudos continuam em desenvolvimento para elucidar
outros potenciais reguladores da morfogêneses fúngica, baseados nos dados do genoma de
Sporothrix spp., já disponíveis (TEIXEIRA et al., 2014).
Um outro importante fator de virulência, presente no Sporothrix spp., assim também
como em outros fungos é a termotolerância (CASADEVALL, 2006; TEIXEIA et al., 2014).
Esta consiste na capacidade do micro-organismo sobreviver a temperaturas elevadas se
comparadas a temperatura no qual geralmente este é encontrado. EmSporothrix spp., essa
característica é notada através do desenvolvimento da forma clínica da doença, que vai
depender das características da cepa em questão. Por exemplo, os isolados que são capazes de
crescer a 35ºC, mas não o são a 37ºC, não são capazes de causar esporotricose linfática e
40
desenvolvem a forma cutânea fixa em vez disso. Quando no geral os isolados das demais
formas clínicas (cutâneo linfática, cutâneo disseminada e extracutânea) apresentam tolerância
e crescimento a 37ºC (KWON-CHUNG; BENNET, 1992).
Ambas as formas morfológica deSporothrix spp., são capazes de sintetizar a melanina.
Sendo que a produção apenas em conídeos ocorre através da via pentaketide 1,8-
dihidroxinaftaleno (DHN) (LÓPEZ-ROMERO et al., 2011) e a síntese desse composto pela
célula leveduriforme, pelas hífas e também por conídios, ou seja pelas formas filamentosas e
leveduriforme, são possíveis utilizando compostos fenólicos como a 3,4-di-hidroxi-L-
fenilalanina (L-DOPA) como substrato (TEIXEIRA et al., 2010; LÓPEZ-ROMERO et al.,
2011).
A produção de melanina na forma filamentosa, é interessante, pois evidencia que esta
deve ser importante contra fatores ambientais desfavoráveis, tais como radiação ultravioleta
(UV), dissecação e temperaturas extremas, uma vez que essa é a forma como esse micro-
organismo se encontra no ambiente (MORRIS-JONES et al., 2003). Os conídios geralmente
são as partículas fúngicas infectantes do Sporothrix spp. e a melanização desses conídios
conferem uma maior resistência a fagocitose pelos macrófagos, o que facilita o
desenvolvimento do processo infeccioso. A melanização também tem um papel na patogênese
da esporotricose cutânea, uma vez que os isolados melanizados possuem uma capacidade
invasiva maior do que as estirpe albina, o que foi evidenciado em camundongos (MADRID et
al., 2009).
O processo inicial para uma invasão eficaz do tecido do hospedeiro pelo fungo se faz
através da adesão as células endoteliais e epiteliais. Os conídios e as leveduras do Sporothrix
spp. reconhecem três glicoproteínas importantes da matriz extracelular, são elas, laminina,
bronectina e colágeno tipo II. Ainda, foi demostrado que o fungo possui moléculas de lectina
que são semelhantes à adesinas e reconhecem em vários pontos da molécula, a fibronectina
humana (LIMA et al., 2004). Nas células leveduriformes, as adesinas de fibronectina estão na
superfície das células, e sua expressão está relacionada a virulência desse micro-organismo
(TEIXEIRA et al., 2009). A ocorrência dessas adesinas, facilitam a adesão aos tecidos
hospedeiros e a disseminação do fungo pelo corpo. Já o ergosterol, também presente na
membrana celular fúngica, é capaz de reagir com o peróxido de hidrogênio que é produzido
pelos macrófagos, produzindo peróxido de ergosterol, esse mecanismo é considerado um
método de evasão do fungo (SGARBI et al., 1997; CARLOS et al., 2009).
Os constituintes da parede celular podem interferir na virulência do fungo. A parede
celular é o constituinte que separa a superfície do fungo do meio extracelular, esta possue um
41
papel importante na interação patógeno-hospedeiro. A camada mais externa da parede celular
do Sporothrix spp. é constituída por um material microfibilar amorfo. A constituição da
parede celular do fungo é basicamente, 80-90% de carboidratos, 5-20% de proteínas, 1-7% de
lipídios. E ainda, polisacarídios como quitinas e β-glucanas, que conferem rigidez a parede
celular fúngica em ambas as formas (LOPEZ-BEZERRA, 2006). Ramnomananas e
galactomananas são os principais constituintes de superfície dos antígenos de Sporothrix spp.
(LOPES-BEZERRA et al., 2011).
Ademais, várias proteínas foram descritas como estando relacionadas a virulência de
fungos patogênicos. Como por exemplo, a glicoproteina 43kDa, um antígeno
imunodominante presente no Paracoccioides brasiliensis, responsável molecular pela ligação
e reconhecimento da aminina e da fibronectina, aumentando a virulência fúngica (MENDES-
GIANNINIet al., 2006). Outro exemplo são as proteínas de ligação do cálcio, noHistoplasma
capsulatum, que permitem a aquisição de íons cálcio em ambientes com limitação destes. No
entanto a função de diferentes proteínas na virulência de Sporothrix spp. ainda não estão
esclarecidas. Acredita-se que a interação fungo-macrófago esteja relacionada com a ação da
fosfatase ácida. Já peptido-rhamnomanana presente na parede celular desse fungo, causa
depressão da resposta imune, podendo atuar como fator de virulência (CARLOS et al., 1998;
LOPEZ-BEZERRA et al., 2011; BARROS et al., 2011).
2.1.7.1 Biofilme
Antonie van Leeuwenhoek descreveu pela primeira vez o que seria considerado um
biofilme, no século XVII, mas até 1978 a teoria que descreveria o processo de formação
destes não havia sido desenvolvida. Atualmente, os biofilmes são definidos como sendo uma
comunidade séssil, caracterizada por células que formam microcolônias, aderidas a um
substrato artificial ou natural, a uma interface, ou ainda, umas às outras, embebidas numa
complexa matriz extracelular de substâncias poliméricas, exibindo um fenótipo alterado com
relação à taxa de crescimento microbiano e à transcrição genética (DONLAN; COSTERTON,
2002).
A formação do biofilme pode ocorrer em superfícies sólidas ou líquidas, bem como
em tecidos em organismos vivos, tais como por exemplo, dentes, células da epiderme, linhas
intravenosas ou articulações artificiais ou podem estar localizados no tecido. Esse tipo de
crescimento microbiano ocorre como um modo de proteçãopara as células envolvidas
sobreviverem em ambientes hostis (MITCHELL et al., 2016; BOLTZ et al., 2017).
42
Embora diferentes sistemas e modelos tenham sido descritos para definir o
desenvolvimento do biofilme em bactérias e fungos, os passos envolvidos no ciclo de
crescimento do biofilme são globais, com muitas características comuns. A adesão é a
primeira etapa para formação de biofilme (Figura 10), é promovido por vários sinais
ambientais, tais como mudanças nas concentrações de nutrientes, Ph,temperatura entre outros
(MARTINEZ; FRIES, 2010; ROILIDES et al., 2015).
A fase seguinte de formação de biofilme é caracterizada por uma disposição de
microcolonia na superfície aderida e produzida pela multiplicação de células flutuantes livres
(Figura 10); a motilidade é reduzida e a produção de exopolissacarídeos é ativada para
capturar nutrientes e células planctônicas, enquanto que as moléculas de sinal são segregadas
de uma maneira dependente da densidade celular para comunicar e coordenar as respostas
celulares através de um processo chamado ―quorum sensing”. Este processo de sinalização
nos eucariotos é pouco conhecido, foi descrita pela primeira vez em Candida albicans com a
identificação de farnesol como componente em culturas de alta densidade que inibem a
formação de hifas (HORNBY et al., 2001; MARTINEZ; FRIES, 2010).
Quando a densidade celular aumenta durante os estágios posteriores da fase de
maturação, canais são abertos entre agregados celulares para distribuir certos tipos e
quantidades de água e nutrientes para apoiar o crescimento celular. O intercâmbio de
nutrientes e descarte de metabólitos é facilitado por essa arquitetura do biofilme, permitindo
que este se desenvolvam em espessura e complexidade consideráveis, mantendo as células em
situações de nutrientes ótimos em muitos locais dentro do biofilme (LI et al., 2015).
Outra maneira de capturar tanto os nutrientes como as células planctônicas, uma vez
atingida uma massa crítica de biofilme, é a produção e secreção de matriz extracelular
predominantemente composta de polissacarídeos, proteínas e DNA extracelular. Esta matriz
promove a adesão celular inicial, desencadeia a formação de polissacarídeos e serve como um
suporte que liga as moléculas em conjunto na matriz de biofilme, influenciando assim a
estrutura ea organização de biofilmes maduros. Por fim, ocorre a disperssão do biofilme
(Figura 10), algumas moléculas atuam como peptídeos do tipo surfactante que inibem as
interações célula a célula na superfície do biofilme, levando ao desprendimento celular na
interfase do biofilme ea subseqüente disseminação microbiana, as células disperssas por sua
vez, podem interagir com um substrato e iniciar a formação de um novo biofilme (ROILIDES
et al., 2015; MITCHELLet al., 2016;).
43
Figura 10 – Representação do ciclo de formação de um biofilme.
Fonte: Própria autora.
Os micro-organismos, em geral, têm a habilidade de formar biofilmes que levam a
uma maior virulência (BARROS et al., 2011).Estudos tem mostrado que amaioria dos fungos
de interesse médico são capazes de formar biofilmes. Este grupo inclui fungosfilamentosos
(Aspergillus, Fusarium, zigomicetos), Pneumocysitis e leveduras (Saccharomyces,
Malassezia, Trichosporon, Cryptococcus e numerosas Candida spp.(NETT; ANDES, 2015).
Os biofilmes podem ser constituídos por um único tipo ou uma única espécie de
micro-organismo, ou ainda por vários tipos e espécies distintas, chamados de biofilme misto.
E esses organismos associados em biofilme comportam-se de maneira distinta daqueles que
vivem de forma isoladas, chamados de planctônicos, mostrando-se refratários à
antibioticoterapia e aos mecanismos de defesa inata e adaptativa do corpo (MARTINEZ;
FRIES, 2010; HOIBY et al., 2017). As infecções que envolvem biofilme, podem dar origem
infecções crônicas, ea patogênese envolve inflamação crônica potenciada por anticorpos em
torno dos biofilmes. A inflamação, portanto, é uma inflamação mediada pelo complexo
imune, uma vez que a resposta do anticorpo contribui para a patogênese da infecção (HOIBY
et al., 2017).
A capacidade de formação de biofilme in vitro pelo Sporothrix spp., na sua forma
filamentosa foi demonstrada pela primeira vez por Sánchez-Herrera et al., (2014). O estudo de
Brilhante et al. (2017) demonstra que as espécies S. brasiliensis, S. mexicana, S. globosa, e S.
schenckii stricto sensu, pertencentes ao complexo fúngico, na sua forma filamentosa são
capazes de formar biofilme in vitro e este possui uma formação densa de hifas e conídios,
44
sendo classificado como forte formador, pela elevada produção de biomassa; e que ainda
esses biofilmes levam em média 120h para atingir a maturação. O mesmo estudo também
afirma o aumento da resistência dos micro-organismo em biofilmes a antifúngicos clássicos,
como itraconazol e anfotericina B, quando comparado as mesmas cepas na forma planctônica.
Nesse contexto, não se sabe ainda se as lesões características da esporotricose são
causadas por esse fungo em biofilme. Pois, pouco se sabe a respeito desse fator de virulência
expressado pelo Sporothrix spp., na forma parasitária, os estudos são excassos e a correlação
clínica ainda não foi descrita. Portanto, se faz necessário a continuidade de investigações
científicas, no tocante ao conhecimento dessa forma de vida do Sporothrix spp., tanto na sua
forma filamentosa e principalmente na sua formaleveduriforme.
2.1.8 Tratamento
A definição para agente antifúngico ou antimicótico, engloba todo tipo de substância
ou molécula, capaz de proporcionar alterações nas estruturas da célula fúngica, e conseguir
inibir o seu desenvolvimento, alterar sua viabilidade ou sobrevivência, seja direta ou
indiretamente, com a finalidade de facilitar o funcionamento do sistema imune do
hospedeiro.A síntese de tais substâncias tive início no século XX, mesmo assim o número de
fármacos conhecidos com ação antifúngica é restrito se comparado ao número de
antibacterianos disponíveis (REIS-GOMES et al., 2012). Além disso o tratamento antifúngico
é muito mais difícil e limitado, devido a alguns características semelhantes entre a célula do
hospedeiro e a célula fúngica, o que resulta em medicamentos antimicóticos com uma estreita
faixa terapêutica e elevada toxicidade (MAYER; KRONSTAD, 2017).
Para o tratamento da esporotricose faz-se necessário primeiramente, o reconhecimento
da extensão da infecção e a identificação de fatores que predispõem o hospedeiro à gravidade
da doença. A escolha do antifúngico adequado no tratamento, baseia-se na condição clínica do
indivíduo, na dimensão das lesões cutâneas, na avaliação das interações medicamentosas, nos
efeitos adversos e no envolvimento sistêmico (CORDEIRO et al., 2011). A dificuldade no
tratamento pode ser atribuída a fatores como: diagnóstico tardio, baixo arsenal terapêutico,
longa duração do tratamento e desistência da terapia pelos pacientes (REIS-GOMES et al.,
2012).
A resolução espontânea da esporotricose é extremamente rara e a maioria dos
pacientes necessitam de tratamento. A duração de 3-6 meses para o tratamento da
esporotricose permanece arbitrária, mas qualquer tratamento deve ser continuado durante pelo
45
menos um período de 4 a 6 semanas após a remissão clínica completa para conseguir a cura
micológica. Embora o tratamento seja prolongado, espera-se uma recuperação completa sem
cicatrizes na esporotricose cutânea após terapêutica adequada. No entanto, podem ocorrer
comprometimento pulmonar na doença pulmonar, incapacidade grave decorrente da
esporotricose osteoarticular crônica ou cicatrização ocasional (SHARMA et al.,
2007).Diversas modalidades de tratamento são relatados para esporotricose, vai desde a
implementação de calor local, para a forma fixa da doença, até a utilização de fármacos,
dentre eles estão, o iodeto de potássio, o itraconazol, o fluconazol, terbinafina e a anfotericina
B(MAHAJAN et al., 2014).
O itraconazol, é um agente antifúngico oral, pertence a classe dos azólicosquesão um
grupo de compostos sintéticos, com estruturas químicas semelhantes, e agem inibindo a
enzima 14α-demetilase, presente no citocromo P-450 da célula fúngica, impedindo assim a
demetilação do precursor lanosterol, que converte lanosterol em ergosterol, o principal esterol
da célula fúngica. Essa propriedade dos azóis altera a função da membrana celular,
aumentando a sua permeabilidade (GLUJOY et al., 2014; BORBA-SANTOS et al., 2016b).
Este é eficaz e bem tolerado e vem substituindo em grande parte o uso da solução saturada de
iodeto de potássio (SSKI). Mesmo com seu alto custo, tornou-se a droga de escolha para o
tratamento de formas cutâneas (fixas e linfocutâneas) e osteoarticulares de esporotricose com
taxas de sucesso variando entre90-100% na esporotricose cutânea e extracutânea e de 60%-
80% para esporotricose osteoarticular(HU et al., 2003; BORBA-SANTOS et al., 2016b).
A variedade cutânea fixa responde mais rapidamente ao tratamento com este fármaco,
do que a forma linfocutânea. Contudo, doses mais elevadas são recomendadas para doentes
com resposta fraca ou casos de recaída. Doses elevadas desse fármaco geralmente estão
associadas a reações adversas (DE LIMA BARROS et al., 2011), tais como náuseas e dor
epigástrica, hipercolesterolemia ou hipertrigliceridemia, alterações nos testes de função
hepática (raramente hepatotoxicidade grave), cefaleias e edema periférico. Casos de recaídas
foram pouco relatadas, com ocorrência variando de 6-18 meses após a duração do tratamento
ou mesmo após a repetição do tratamento com o antifúngico.O seu uso é contraindicado em
caso de gravidez (BARROS et al., 2011; MAHAJAN, 2014).
Nos casos onde o itraconazol não é bem tolerado, pode-se utilizar o fluconazol,
sozinho ou em combinação com SSKI, o que proporciona outra opção terapêutica útil. Este é
utilizado para tratar esporotricose fixa e linfocutânea em doses entre 150 mg uma vez por
semana e 200 mg/dia. No entanto, doses mais elevadas entre 400 e 600 mg/dia são geralmente
recomendadas especialmente para o tratamento da esporotricose visceral e osteoarticular, mas
46
a resposta geralmente permanece pobre (SHARMA et al., 2007). Náuseas, vômitos e diarréia,
dor abdominal, dor de cabeça e enzimas hepáticas anormais, observadas raramente, requerem
descontinuação do tratamento. Está contra-indicado na gravidez devido ao seu potencial
teratogênico. Como a experiência com a terapêutica com fluconazol na esporotricose é
limitada, continua a ser uma opção de tratamento de segunda linha por serem moderadamente
eficazes (MAHAJAN, 2014).
Outra alternativa terapêutica em caso de pacientes insensível ao itraconazol ou quando
este não for bem tolerado é a terbinafina, pertencente as alilaminas, é indicada para o
tratamento das formas cutâneo ou linfocutânea da esporotricose. É bem absorvida após
administração oral, age inibindo a enzima esqualeno epoxidase, e por conseguinte, bloqueiam
uma etapa precose da biossíntese do ergosterol, além de ocasionar um acúmulo tóxico de
esqualeto na parede da célula fúngica, cujo resultado é a morte celular (SIDRIM; ROCHA,
2004; MAHAJAN, 2014). Esta, tem sido utilizada isoladamente ou em combinação com
SSKI, com doses que variam de 125 a 1000 mg/dia, durante 4-37 semanas. A sua eficácia,
numa dose de 250 mg/dia é relatada comparável ao itraconazol de 100 mg/dia (92,7% vs.
92%), administrada por duração média de 11,5 semanas e 11,8, respectivamente (MAHAJAN,
2014). Noentanto um fator limitante para a terbinafina, é o seu elevado custo, que chega a ser
superior ao do itraconazol, dificultando o seu uso principalmente em países em
desenvolvimento (BARROS et al., 2011).
Já para os casos mais graves da esporotricose, a droga de escolha é a Anfotericina B,
que é um agente antifungico, macrolídeo polieno, sintetizados a partir de Streptomyces
nodosus, é disponível principalmente para utilização intravenosa. Seu mecanismo de ação
consiste na sua ligação ao ergosterol, presente na membrana da célula fúngica, produzindo
poros que levam ao aumento da permeabilidade da membrana, e consequentemente uma
grande perda de pequenas moléculas e eletrólitos do meio intracelular, principalmente o
potássio, que altera a homeostase do micro-organismo, levando a morte celular (SIDRIM;
ROCHA, 2004; MAHAJAN, 2014).
No entanto, a sua principal atividade fungicida tem sido atribuído à sua capacidade
para causar a auto-oxidação da membrana citoplasmática e a libertação de radicais livres
letais. É considerada uma droga de uso seguro durante a gravidez (MAHAJAN, 2014), e a
droga de escolha para o tratamento das formas cutâneas mais graves da esporotricose, como a
forma disseminada, esporotricose pulmonar, e as formas associada ao HIV (ALMEIDA-
PAES et al., 2016). Ela também pode ser indicado em pacientes com esporotricose
osteoarticular ou que não estão respondendo à terapia, com o itraconazol (MAHAJAN, 2014).
47
A dose recomendada para adultos varia de 0,25 mg/kg/dia e é aumentada para alcançar
a dose alvo de 2,3g. Febre, calafrios, dor de cabeça, mal-estar e vómitos que podem ocorrer
durante a administração do fármaco, estes sintomas podem ser melhoradas por pré-medicação
com sedativos, antipiréticos e corticosteróides. Hipocalemia, hipomagnesemia,
nefrotoxicidade, anemia normocítica normocrômica e efeitos adversos reversíveis são comuns
e requerem um acompanhamento regularmente uma vez por semana(MERCURIO;
ELEWSKI, 1993).
Embora a anfotericina B e o itraconazol sejam aconselhados como tratamentos de
primeira ou segunda linha para várias apresentações clínicas de esporotricose, alguns isolados
foram considerados insensíveis a estes fármacos e outros agentes antifúngicos. As diferenças
nos padrões de susceptibilidade de isolados de diferentes espécies, fontes (humana, animal ou
ambiental) e regiões geográficas destacam a necessidade de identificação de espécies e testes
de sensibilidade a antifúngicos para adequar melhor a terapia a ser utilizada (MAHMOUD et
al., 2016).
2.1.8.1 Testes de Sensibilidade a Antifúngicos
O desenvolvimento de testes de sensibilidade a antimicrobiano tem sua história
atrelada aos avanços obtidos na quimioterapia antibacteriana. Assim, os testes de
sensibilidade in vitro, envolvendo princípios das metodologias conhecidas, como difusão em
ágar e diluição em tubo, foram inicialmente utilizados por Alexander Fleming, durante a
investigação do potêncial terapêutico da penicilina. Então, com o advento de novos
antibióticos, bem como o reconhecimento de bactérias resistentes a penicilina, inúmeros
laboratórios de microbiologia passaram a realizar testes de sensibilidade a antibióticos
(SIDRIM; ROCHA, 2004).
A quantidade de drogas com ação antifúngica é restrita ao ser comparada com o
número de drogas antibacterianas disponíveis. Como conseqüência das infecções por fungos
representarem o parasitismo de um organismo eucarioto sobre um outro eucarioto (homem e
animal), com diferenças fisiológicas muito pequenas, quando comparado a infecções
bacterianas (LACAZ; DEL NEGRO, 1994). Nos últimos 10 anos, o uso de novas drogas mais
efetivas, tem aumentado a sobrevida dos pacientes, porém tornam estes organismos mais
suscetíveis às infecções fúngicas, principalmente as ditas oportunistas (NOBRE et al., 2002).
Infecções fúngicas são uma das principais causas de morbidade e mortalidade, apesar
dos últimos desenvolvimentos de ferramentas de diagnóstico e opções terapêuticas. O início
48
precoce da correta terapia antifúngica demonstrou ter um impacto direto no desfecho do
paciente (PATEL et al., 2009). Infecções mais graves afetam principalmente pacientes
imunocomprometidos. Novas infecções pulmonares crônicas têm sido descritas com um
enorme impacto na qualidade de vida do paciente e um alto custo de tratamento e cuidados.
Além disso, algumas infecções fúngicas da pele envolvendo mucosa e tecidos subcutâneos
causam morbidade substancial (HAVLICKOVA et al., 2008). Cryptococcus, Candida,
Aspergillus e Pneumocystis são os principais agentes etiológicos das infecções fúngicas
(BROWN et al., 2012). A carga e a mortalidade associadas a estas doenças dependem da
região e da população afetada. Assim, estima-se que a meningite criptocócica afeta cerca de
um milhão de pessoas por ano. Apesar do tratamento, as taxas de mortalidade podem chegar a
55 a 70% em pacientes com AIDS na América Latina e na África Subsariana, sendo o número
estimado de mortes por ano acima de 620.000.Fungos dimórficos endêmicos como
Histoplasma, Coccidioides e Paracoccidioides também afetam pacientes imunocompetentes
eáreasendêmicas incluem várias regiões da América Latina(COLOMBO et al., 2011).
O aumento do uso de antifúngicos induziu uma maior pressão seletiva sobre as
estirpes fúngicas e a resistência surgiu de duas maneiras principais: várias espécies
desenvolveram resistência secundária e as espécies susceptíveis foram substituídas por
resistentes, alterando a epidemiologia das infecções fúngicas(LASS‐ FLÖRL, 2009).Neste
contexto, métodos de teste de sensibilidade antifúngica estão disponíveis para verificar
resistência antifúngica e para determinar o melhor tratamento para um fungo específico. A
microbiologia clínica baseia-se nestes métodos para seleccionar o agente de escolha para uma
infecção fúngica, e para conhecer a epidemiologia local e global da resistência
antifúngica(ALASTRUEY-IZQUIERDO et al, 2015).
Os métodos de microdiluição são o padrão-ouro ou técnicas de referência para
avaliação da sensibilidade a antimicrobianos in vitro. Duas organizações, o Comitê European
Committee on Antibiotic Susceptibility Testing (EUCAST) e o Clinical Laboratory Standards
Institute (CLSI) possuem métodos padronizados para realizar testes de sensibilidade aos
antifúngicos. Diferenças entre estes dois métodos têm sido amplamente discutidos em vários
relatórios. No entanto seus resultados demonstraram ser comparáveis e são utilizados em todo
o mundo. Ambas as instituições desenvolveram pontos de corte de alguns antifúngicos para as
espécies de Candida e Aspergillus que são atualmente usadas para classificar as cepas
resistentes(ALASTRUEY-IZQUIERDO et al, 2015).
Em 1985, o CLSI, anteriormente conhecido como o National Committee for Clinical
Laboratory Standards (NCCLS), formou um subcomitê sobre o teste de sensibilidade
49
antifúngica que publicou, em 1997, o documento M27-A que consiste em um método de
referência para teste de sensibilidade antifúngica de diluição em caldo para leveduras. Este
documento definiu cepas de referência com intervalos de concentrações inibitórias minimais
(CIM) e Break Points (BPs) para alguns antifúngicos e sua ação contra leveduras como
Candida e Cryptococcus. Desde então, várias atualizações foram publicadas, sendo a amais
recente aprovada em abril de 2008 (CLSI, 2008b).
Para fungos filamentosos, o primeiro documento foi publicado em 2002: M38-A, que
é o método de referência para o teste de sensibilidade antifúngica de diluição em caldo para
fungos filamentosos. Uma segunda edição publicada em 2008, é a atualmente aceita (CLSI,
2008a) e entre os fungos descritos nesta norma estão: Rhizopus oryzae, Pseudallescheria
boydii, Sporothrix spp. e os dermatófitos, Trichophyton, Microsporum e Epidermophyton. Um
estudo adicional indicou algum grau de correlação entre os resultados dos testes in vitro e a
resposta ao tratamento em modelos animais (CLSI 2008a; CLSI 2008b).
Essas normas de uma forma geral, estabelecem as condições do teste, incluindo a
preparação e a concentração do inóculo, o período e a temperatura de incubação, a formulação
do meio, as preparações e diluições das drogas, assim como os critérios para a determinação
da concentração inibitória mínima (CIM)(CLSI 2008a; CLSI 2008b).
2.1.8.2 Iodeto de Potássio
No início do século XX, o iodo, originalmente, era extraído de algas marinhas, e era
utilizado exclusivamente para o tratamento das desordens tireoidianas. Com o passar do
tempo, o medicamento foi se tornando útil e versátil, devido as suas novas aplicações,
especialmente em casos envolvendo falhas terapêuticas de doenças de origem infecciosa,
inflamatória ou imunomediada. Como exemplo, de alvo terapêutico do iodo, podemos
citar:psoríase, o eczema, o lúpus vulgar e a sífilis. A posteriori, também foi utilizado no
tratamento de dermatoses inflamatórias, como eritema polimorfo, eritema nodoso e
granuloma anular; de dermatoses neutrofílicas, como pioderma gangrenoso e síndrome de
Sweet; dermatoses infecciosas, como esporotricose e zigomicose (STERLING; HEYMANN,
2000).
O iodeto de potássio é um sal, que se apresenta como cristais hexaédricos
transparentes, opacos ou de cor branca e é constituído por 76% de iodo e 23% de potássio. É
classificado como fotossensível e possui propriedades higroscópicas, sendo, portanto, bastante
50
solúvel em água (1g/0,7mL de água). A solução desse sal possui propriedades neutras a
alcalinas.Diz ainda que, este é pouco absorvido quando utilizado em aplicações diretas na
pele. Quando administrada por via oral, o íon iodeto, presente na solução, é convertido em
iodo que é transportado e se concentra na glândula tireoide(COSTA et al., 2013).
O mecanismo de ação do KI ainda não é conhecido, no entanto acredita-se que este
atue na modulação da resposta inflamatória e melhore a resposta imune (COSTA et al.,
2013).E que, após ser metabolizado o iodo tenha sua ação direta no micro-organismo e o
potássio atue auxiliando a resposta imunológica do hospedeiro (HIMURA; KAGAWA,1987).
O uso do iodeto de potássio para tratamento da esporotricose foi sugerido em 1903 por
Sabouraud, Beurmann e Gougerot. E este tem sido utilizado até os dias atuais como terapia
satisfatória para esporotricose nas formas cutânea fixa e linfocutânea (YAMADA et al.,
2011).
O iodeto de potássio geralmente é administrado por via oral na forma de solução
saturada (SSKI). Entende-se por solução saturada, uma solução na qual qualquer adição de
solutoque resulte na precipitação do mesmo. Levando em consideração o limite de
solubilidade para água destilada, que é o solvente habitualmente utilizado, foi verificado que
1g do sal para um volume de 0,7mL deste solvente resulta em uma solução de
aproximadamente 1,42g/mL (SWEETMAN, 2009; MACEDO et al., 2015).A posologia
preconizada de iodeto de potássio para as doenças infecciosas varia de 4-6g/dia ou 6-7,5g/dia
nos adultos, dependendo da referência científica. A dose pediátrica é cerca de metade ou um
terço da dose do adulto. Eo tratamento deve ser continuado até um mês após a resolução
clínica das lesões.(RAMOS-E-SILVA et al., 2007; COSTA et al., 2013).
Estudos in vitroutilizando a solução saturada de KIem cepas de Sporothrix spp. na
forma filamentosa, mostrou que todas as cepas foram inibidas com até 30% da SSKI (WADA,
1966; MITCHELL et al., 1975). E ainda, o uso da solução de iodo-iodeto de potássio em
leveduras de Sporothrix spp.,demostrou que a taxa de gemulação das leveduras reduz eocorre
a lise celular, com liberação de enzimas lisossomais, conforme o aumento da concentração da
solução (HIMURA; KAGAWA, 1987).
As contraindicações para o uso do KI são relatadas em casos de tireoidopatias (hipo ou
hipertireoidismo), em pacientes com insuficiência renal ou transplantados eem casos de
histórico com doença alcoólica, pacientes insulino-dependentes, portadores de doenças
autoimunes de um modo geral. A SSKI não deve ser usado em gestantese nutrizes, pois
ocorre o desenvolvimento de hipotireoidismo neonatal, tireomegalia, obstrução respiratória
fetal e parto prolongado(BENNETT, 2001; WHO, 2017).Em gestantes o uso de KI é indicado
51
em formulações tópicas, em forma de pomada a 10%, que podem ser usadas diretamente na
lesão, com bons resultados (SIDRIM; ROCHA, 2004).
Alguns efeitos adversos podem ocorrer, devido as altas doses administradas. Estes
efeitos geralmente estão relacionados ao sistema digestivo, principalmente a intolerância
gastrointestinal e o sabor metálico do medicamento. Para minimizar esses efeitos recomenda-
se iniciar o tratamento com doses baixas, em geral utiliza-se 5 gotas 3 vezes ao dia, e vai
aumentando a dosagem progressivamente até atingir a dose terapêutica indicada, isto tanto
para adultos como para crianças (COSTA et al., 2013; WHO, 2017).
A eficácia e baixo custo do KI permitiram que este medicamento fosse utilizado com
segurança até os dias atuais (YAMADA et al., 2011). Noentanto, a comodidade posológica do
itraconazol, introduzido na década de 90, fez com que este fosse considerado o medicamento
de primeira linha em alguns centros, embora não haja diferença de eficácia em relação à SSKI
e ainda o itraconazol apresenta custo bem mais elevado (KAUFFMAN et al., 2007; COSTA
et al., 2013).
Apesar da relevância do KI como tratamento da esporotricose, poucos são os relatos
de estudos que comprovem a sua eficácia in vitro contra Sporothrix spp., outros autores ainda
reportam que esses efeitos inexistem (COSTA et al., 2013). Por esses motivos, incluímos o KI
para testes in vitro, com a finalidade de contribuirmos com mais informações sobre o efeito
inibitório dessa droga frente a cepas do complexo Sporothrix schenckii.
2.2 Miltefosina
A miltefosina é um análogo fosfolipídico, da classe dos agentes sintéticos
antineoplásicos, as alquilfosfocolinas. Foi inicialmente desenvolvida como uma droga
antitumoral, e no início de 1980, foi demostrado que esta possui boa atividade
antiparasitária(DORLO et al., 2012). O composto foi sintetizado, coincidentemente, por dois
grupos de pesquisas independentes: Bill Pendergast e Joseph Chan em 1982 na fundação
Burroughs Wellcome nos EUA (CROFT; ENGEL, 2006) e Hansjoerg Eibl no Instituto Max-
Planck (Alemanha) (EIBL; UNGER, 1990).
Em 1984, em Beckenham, no Reino Unido, a miltefosina, entre outras
alquilfosfocolinas e uma alquilfosfoetanolamina, foram selecionadas e testadas contra
parasitos leishmania e tripanossomas (CROFT; ENGEL, 2006). Esta então demostrou uma
excelente atividade antiparasitária, porém, naquele momento foi dada prioridade ao
desenvolvimento do fármaco como tratamento local de metástases cutâneas do câncer de
52
mama, o que foi levado a aprovação de uma formulação tópica desse medicamento (Miltex)
(DORLO et al., 2012).
Bioquimicamente, a miltefosina é uma molécula anfifílica, ou seja, é composta por
uma porção hidrofílica, a qual consiste em um grupo fosfocolina, e uma porção hidrofóbica, a
qual consiste em uma cadeia alquílica hexadecílica (Figura 11), apresentando desta forma a
capacidade de formar micelas. A miltefosina pertence a classe de tensoativos zwitteriônicos,
sendo estruturalmente semelhante aos fosfolipídios presentes nas membranas biológicas.
Desta maneira possui a capacidade de interagir com a membrana de células tumorais e de
protozoários, atingindo rapidamente outras membranas subcelulares, sendo capaz de afetar o
metabolismo em diferentes níveis (HUANG et al., 2005; MARCO et al., 2009).
Figura 11 – Estrutura química da miltefosina (hexadecilfosfocolina).
Fonte: Stroppa et al., 2017.
Embora o mecanismo de ação da miltefosina, não esteja completamente elucidado,
sabe-se que esta droga age interferindo na membrana celular do parasita, depois modula a
composição lipídica, a permeabilidade e fluidez da membrana, assim como interfere no
metabolismo de fosfolipídeos, levando a uma ruptura da estrutura da membrana que afeta os
processos de sinalização intracelular essenciais para a sobrevivência e o crescimento da
célula(COSTA FILHO et al., 2008; BORBA-SANTOS et al., 2015).É relatado efeitos de
apoptose, tais como, disfunção mitocondrial, externalização da fosfatidilserina, paralização do
ciclo celular nas fases G0/G1 e fragmentação do DNA em espécies de leishmania. A
miltefosina pode atuar também, como imunomodulador, promovendo a ativação de
macrófagos (STROPPA et al., 2017).
Estudos em camundongos imunodeficientes, demostraram que esse fármaco apresenta
efeito antitumoral e leishmanicida, o que leva a sugerir que sua ação não está relacionada com
uma resposta imune dependente de células T. Desta maneira a miltefosina, poderia ser uma
alternativa terapêutica, para o tratamento de pacientes imudeprimidos, já que sua ação não
parece ter relação com o estado imunológico do hospedeiro (SOARES-BEZERRA, 2004).
As dosagens de miltefosina para pacientes, de acordo com as diretrizes estabelecidas
pela Organização Pan-Americana da Saúde, deve ser administrada de 1,5-2,5 mg/kg/dia
53
durante o período de tratamento correspondente a 28 dias. Entretando, parece que esse
fármaco, afeta o sistema gastrointestinal, causando vômitos e diarreias, eleva a creatininemia
e os níveis sanguíneos de transaminases, pode causar também, nefrotoxicidade e possui
potencial teratogênico (ORYAN, 2015; BERGER et al., 2017).
O uso da miltefosina no tratamento da leishmaniose cutânea e visceral, é
licenciamento em vários países como a Índia e a Colômbia(DORLO et al., 2012). No Brasil, o
uso da miltefosina (Milteforan®) foi autorizada através da Nota Técnica de n° 001/2016
MAPA/MS, assinada pelo Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento e pelo
Ministério da Sáude,sendo indicado para o tratamento da leishmaniose visceral de cães. Um
fator limitante para seu uso é o custo elevado, o que dificulta o acesso principalmente em
países em desenvolvimento (DORLO et al., 2012).
Estudos recentes, têm demostrado que a miltefosina também possui atividade
antifúngica in vitro, frente a espécies de fungos dimórficos, tais como Paraccocidioidis spp.,
Histoplasma capsulatum e Sporothrix spp., nas formas filamentosas e leveduriforme
(BRILHANTE et al., 2014; BORBA-SANTOS et al., 2015; BORBA-SANTOS et al., 2016a;
ROSSI et al., 2017). Porém, não existem relatos de estudos com essa droga frente a cepas do
complexo Sporothrix schenckii na sua forma de maior resistência, o biofilme.
3HIPÓTESES
1. Espécies do complexo S. schenckii na forma leveduriforme, são formadores de
biofilme in vitro.
2. Miltefosina e iodeto de potássio, são capazes de inibir o crescimento de
biofilmesproduzidos por Sporothrix spp. nas suas formas filamentosa e leveduriforme.
4 OBJETIVOS
4.1 Objetivo Geral
Avaliar a capacidade do complexo S. schenckii na forma leveduriforme de formar
biofilme, in vitro, assim como a sensibilidade dos biofilmes filamentosos e
leveduriformes à miltefosina e ao iodeto de potássio.
54
4.2 Objetivos Específicos
1. Avaliar a capacidade de formação de biofilme leveduriforme por diferentes espécies
do complexo S. schenckii,in vitro;
2. Avaliar a cinética de crescimento do biofilme por diferentes espécies do complexo
S. schenckii,in vitro;
3. Visualizar a morfologia dos biofilmes leveduriformes do complexo S.schenckii,por
microscopia óptica, microscopia eletrônica de varredura e microscopia confocal;
4. Determinar a concentração inibitória mínima (CIM), in vitro,da anfotericina B, do
itraconazol, da miltefosina e do iodeto de potássio frente a cepas de Sporothrix spp.
nas formas planctônicas filamentosa e leveduriforme;
5. Determinar a sensibilidade, in vitro, dos biofilmes de Sporothrix spp.nas forma
filamentosa e leveduriforme,frente à anfotericina B, itraconazol, miltefosina e iodeto
de potássio, quanto à biomassa e a atividade metabólica.
5 MATERIAL E MÉTODOS
5.1 Local do estudo
As pesquisas foram realizadas nos laboratórios do Centro Especializado em Micologia
Médica (CEMM), da Universidade Federal do Ceará, com participação da Central analítica da
UFCna obtenção das imagens de microscopia eletrônica de varredura.
5.2Micro-organismos
Um total de 18 cepas pertencentes ao complexo Sporothrix schenckii (18 na forma
filamentosa e 18 na forma leveduriforme), fizeram parte deste estudo. Sendo 10 S.
brasiliensis, 4 S. mexicana, 2 S. schenckii stricto sensu e 2 S. globosa. Todos pertencentes a
Micoteca do Centro Especializado em Micologia Médica (CEMM) da Universidade Federal
do Ceará.Para a realização do controle de qualidade para as drogas antifúngicas, foram
utilizadas as cepas Candida parapsilosis ATCC 22019,Candida krusei ATCC 6258 e
Candida albicans ATCC 10231.
55
5.3 Formação do biofilme leveduriforme
A formação de biofilmes leveduriformes foi realizada como descrito por Brilhante et
al. (2015), com algumas modificações. Todos os 18 isolados de Sporothrix spp. foram
cultivados previamente em ágar batata por 6 a 7 dias a temperatura de 28 a 30 ºC na forma
filamentosa e posteriormente foram repicadas em ágar infusão de cérebro e coração (BHI;
Himedia, India) suplementado com 5% de sangue de carneiro e incubado a 37°C por 6 a 7
dias, para reversão (MAHMOUDI et al., 2016).
Posteriormente, foram preparadassuspenções fúngicas em solução salina e ajustada
para a escala 1McFarland, com concentração de aproximadamente 1 × 106 UFC/mL. Em
seguida, foi adicionado 200 µL dessa suspensão a placa de 96 poços de fundo chato, onde
foram incubadas por 24 h, a 37 °C, para a adesão das células(BRILHANTE et al., 2015).
Após esse período, foi removido o sobrenadante de cada poço e adicionado 200 µL de meio
RPMI 1640(Roswel Park Memorial Institute - Sigma) tamponado a pH 7,0 com de ácido 4-
morfolinopropanosulfonico (MOPS) (Sigma) 0,165 M, por poço. As placas foram incubadas
durante 4 dias a 37 °C, para a formação e maturação dos biofilmes e realização dos ensaios
posteriores.
5.4 Cinética de crescimento e classificação dos biofilmes leveduriformes
Seguindo a metodologia de formação dos biofilmes descrita acima, a cinética de
crescimento foi avaliada e mensurada após diferentes tempos de formação (24, 48, 72, 96, 120
e 144 h). O ensaio foi realizado com as cepas de Sporothrix spp. na formaleveduriforme, com
base na metodologia descrita por Costa-Orlandi et al. (2014) e Brilhante et al. (2017), com
algumas adaptações. Avaliamos a cinética de formação dos biofilmes, de 8 cepas (2S.
brasiliensis, 2S. mexicana, 2S. schenckiistricto sensu, 2S. globosa). Após cada tempo de
formaçãoos biofilmes eram lavados duas vezes com PBS/Tween estéril para remover as
células não aderidas. Então foram realizadas leituras da atividade metabólica pela redução do
2,3- bis (2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-[(Fenilamino) carbonil]-2H-tetrazólio (XTT; Sigma,
Alemanha) e da biomassa, por cristal violeta.
Para a leitura por XTT, os poços foram lavados duas vezes com PBS e em seguida,
alíquotas de 50 µL da solução de XTT (1mg/mL) em tampão fosfato-salino (PBS)e de 4 µL
da solução de menadiona (1 mM) em acetona, foram adicionados aos poços. As placas foram
56
incubadas a 35°C, durante 3 horas ao abrigo da luz. Em seguida, o conteúdo de cada poço foi
transferido para outra placa de 96 poços, onde foi imediatamente realizado a leitura em
espectrofotômetro a 492 nm (MARTINEZ; CASADEVALL; FRIES, 2008).
Para a leitura da biomassa por meio da coloração por cristal violeta, após cada período
de formação dos biofilmes (24, 48, 72, 96, 120 e 144h), os poços foram lavados com (PBS), e
fixados com metanol a 100% por 5 min(GQ - Grupo Química, São Paulo, Brasil). Então o
metanol foi removido e os poços foram secos em temperatura ambiente. Em seguida foi
adicionada, em cada poço, 200µL da solução de cristal violeta a 0,3%, por 20 min. Após esse
período, os poços foram lavados, duas vezes, com água destilada. Os poços foram então
descorados com a adição de uma solução de ácido acético a 33% (PITANGUI et al, 2012). O
conteúdo restante de cada poço foi então transferido para uma nova placa, onde foi realizada a
leitura em espectrofotômetro a 540 nm (SÁNCHEZ-HERRERA, 2014). Todos os testes
foram realizados em duplicata.
Após avaliação do tempo para formação e maturação dos biofilmes leveduriformes,
então foi feita a classificação da formação do biofilme dos 18 isolados através daavaliação da
biomassa, por meio da coloração por cristal violeta, conforme descrito anteriormente. As
cepas foram classificadas como descritas por Cordeiro et al. (2015), em não formadoras (DO≤
DOc), fracas formadoras (DOc<DO ≤ 2 ×DOc), formadora moderada (2 × DOc<DO ≤ 4 ×
DOc), e fortes formadoras (4 × DOc<DO).Todos os testes foram realizados em
duplicata.Candida albicans ATCC 10231 foi utilizado como controle positivo e RPMI sem
inóculo fúngico como controlo negativo (controle de esterilidade).
5.5 Análises microscópicas dos biofilmes
Os biofilmes foram formados conforme descrito anteriormente, sobre lâminas de
Thermanox® (Thermo Fisher Scientific - New York City - NY) em placas de 24 poços. Após
a incubação e maturação dos biofilmes, as placas com as lâminas recobertas com os biofilmes
foram processadas com as técnicas de vermelho congo, para avaliação de matriz, para
microscopia eletrônica de varredura, para avaliar a estrutura dos biofilmes e microscopia
confocal, para avaliação da arquitetura dos biofilmes.
Então, aavaliação da matriz extracelular se fez, seguindo um método qualitativo
descrito por Castelo-Branco et al. (2015), utilizando o vermelho congo para detecção de
polissacarídeos que constituem a maior parte da matriz extracelular dos biofilmes. Após a
formação do biofilme sobre lâminas, removeu-se o meio, e o biofilme foi lavado por duas
57
vezes com solução salina 0,9% e fixado com 500 µl de cloreto de cetilpirideno (10 mM)
(Sigma - Aldrich - São Paulo - Brasil) por 30 segundos. Após remoção da solução de fixação,
as lâminas foram secas a temperatura de 28 ºC durante 30 minutos, e coradas com 500 µL de
uma mistura 2:1 (vol/vol) de solução saturada de vermelho Congo (Sigma - Aldrich - St Louis
- USA) e 10% de Tween 80 (ISOFAR - Rio de Janeiro - Brasil) por 15 minutos. Os poços
foram lavados duas vezes com solução salina estéril 0,9% para remover o excesso de corante,
e em seguida, as lâminas de poliestireno foram coradas com carbol de fucsina 10%, por 6
minutos. O conteúdo foi removido e os biofilmes foram lavados com solução salina estéril
0,9%. Após secagem a temperatura de 28 ºC, as lamínulas foram visualizadas no microscópio
óptico OLYMPUS BX41 e câmera OLYMPUS DP71.
Para a análise morfológica, pela microscopia eletrônica de varredura (MEV), os
biofilmes formados em lamínulas foram processados conforme a metodologia descrita por
Cordeiro et al. (2015). Os biofilmes foram fixados com 500 µl de solução de glutaraldeído
2,5% (Sigma - Aldrich - St Louis - USA) em tampão cacodilato (0,15M) (Electron
Microscopy Sciences –Hatfiel - PA), com azul de alcian 0,1% (Sigma - Aldrich - São Paulo
Brasil) que preserva a estrutura dos fungos, overnight a 4 °C. Depois, os biofilmes foram
lavados com o tampão cacodilato por duas vezes. Após, seguiu-se uma série de desidratações
alcoólicas ascendente: 50, 70, 80, 95 e 100% de etanol, repetida duas vezes cada, e por 10
minutos cada desidratação, seguido de secagem por 30 minutos à 28 ºC. Após secagem, os
biofilmes foram desidratados com hexametildisilazano (Sigma - St Louis - USA) durante 30
minutos e secos emestufa a 35 ºC. Em seguida as lamínulas contendo o biofilme formado
foram recobertos com 10 nm de ouro (Emitech Q150T) e observados em microscópio
eletrônico de varredura (Quanta FEG 450), em alto vácuo a 20 kV. As imagens foram
processadas em software Photoshop CC5 (Adobe).
Para a análise quantitativa da arquitetura, pela microscopia confocal, os biofilmes
formados sobre as lamínulas foram processados segundo a metodologia descrita por Castelo-
Branco et al. (2015). Os biofilmes foram lavados com solução salina 0,9% e cobertos com
200 µl do corante fluorescente Live/Dead (InvitrogenTM - MA). Após 30 minutos, as
lamínulas foram observadas em microscópio Confocal Nikon C2, a 488 nm para detecção do
fluorocromo Syto9, que identifica células vivas, e a 561nm, e do fluorocromo iodeto de
propídeo, que identifica células mortas e danificadas.Para as análises, imagens tridimensionais
foram coletadas de cinco pontos equidistantes do biofilme, a fim de se obterem resultados
representativos sobre a amostra (HEYDORN et al., 2000; COLLINS, 2007).
58
5.6 Drogas antemicrobianas
Para o ensaio de sensibilidade, foram utilizados as formulações comercial de
miltefosina (MIL) (Sigma Chemical Corporation, EUA), e iodeto de potássio (KI)
(ALPHATEC) ambos diluídos em água estéril, e preparados conforme recomendações do
fabricante, foram testados nas concentrações 0,0313-16 µg/mL e 0,488-250 mg/mL,
respectivamente. Anfotericina B (AMB) (Sigma Chemical Corporation, EUA) e Itraconazol
(ITC) (Janssen Pharmaceutica, Bélgica) foram incluídos como drogas controle, e foram
testadas nas concentrações de 0,0313 a 16 µg/mL. As diluições seriadas foram preparadas em
RPMI conforme metodologia M38-A2 do Clinical and Laboratory Science Institute (CLSI).
5.7Ensaio de sensibilidade planctônico
O ensaio de sensibilidade planctônica foi realizado inicialmente com a finalidade de
obtermos os valores de CIM para posteriormente ser utilizado na sensibilidade dos
biofilmes.Os inóculos, foram feitos a partir do crescimento das culturas como descrito
anteriormente, em solução salina, e ajustado para escala 2 McFarland, para filamentoso e
1McFarland, para a forma leveduriforme. Em seguida, foram feitas diluições em RPMI(Sigma
Chemical Corporation, EUA), para ajuste final do inóculo, com as concentrações 1 a 5 × 105
UFC/mL para a forma filamentosa e 1 a 5 × 103UFC/mL, para forma leveduriforme. Os
ensaios de sensibilidade foram realizados utilizando o método de microdiluição em caldo,
com base nos métodos de referência do documento M38-A2 (CLSI, 2008a) para filamentoso e
M27-A3 para leveduriforme (CLSI, 2008b), com adaptações. As amostras foram testadas em
duplicata, e os resultados foram lidos visualmente após o período de incubação de 72 h a 35
ºC para a forma filamentosa e 96 h a 37 ºC para a forma leveduriforme. Considerou-se a
concentração inibitória mínima (CIM) da AMB como a mais baixa concentração capaz de
inibir 100% (CIM100) do crescimento fúngico e das demais drogas como a menor
concentração capaz de inibir 50% (CIM50), 80% (CIM80) e 100% do crescimento fúngico,
quando comparado com o controle de crescimento.
5.8 Ensaio de Sensibilidade dos biofilmes
Para o ensaio de sensibilidade dos biofilmes, utilizou-secomo base os valores da CIM
das cepas na formaplanctônicas, onde foram feitas três diluições, em RPMI 1640, das drogas
59
testadas nas concentrações CIM, 10xCIM e 50xCIM. Para o KI, foram analisadas CIM e
10xCIM, devido a concentração de 50xCIM ultrapassar a sua solubilização em água (1g/0,7
mL de água), não permitindo assim sua utilização nessa concentração contra os biofilmes
maduros de Sporothrix spp. Após o período de incubação para maturação dos biofilmes, onde
para os filamentosos foi adotado o período descrito por Brilhante et al. (2017), e para os
leveduriformes de acordo com a cinética avaliada neste estudo, os sobrenadantes foram
aspirados, os biofilmes foram lavados comPBS estéril por duas vezes, e então foram
adicionadas alíquotas de 200 µLpor poço, das drogas testadas nas três concentrações. O teste
foi realizado em duplicata. Os controles de crescimento para o teste foram feitos em
RPMIsem adição de droga. As placas foram novamente incubadas por 72h, a 35ºC para a
forma filamentosa e a 37ºC para a forma leveduriforme. A sensibilidade das células
associadas em biofilme frente aos antifúngicos foi analisada pelas metodologias de redução
do XTT e avaliação da biomassa, por cristal violeta (MARTINEZ; CASADEVALL, 2006),
conforme descrito na seção 5.4.
5.9 Análises estatísticas
Para o teste de sensibilidade dos biofilmes, foi comparado os valores de Densidade
Óptica (absorbância) do controle com osdas concentrações das drogas nas espécies estudadas
(S. brasiliensis, S. mexicana, S. globosa e S. schenckii stricto sensu), intra e interespécie. Para
a sensibilidade planctônica foi considerado os valores da CIM e o número de diluições como
variável.Todos os dados foram inicialmente analisados quanto a sua simetria e dispersão. Nas
comparações entre dados que apresentaram distribuição normal e variâncias semelhantes, foi
utilizado o teste de T de Studart, ou a ANOVA seguida do pós teste de Tukey para a
comparação entre pares. Nas comparações onde os dados que apresentaram assimetria e/ou
variâncias elevadas foram utilizados os testes não paramétricos de Wilcoxon, ou os Testes de
Friedmane Kruskal-Wallis seguidos do teste post hoc de Dunn para a comparação entre pares.
Em todas as situações, o nível de significância máximo, adotado para conclusões afirmativas,
foi de 5%.
Um resumo para melhor compreensão da metodologia do estudo pode ser observado
através do fluxograma representado na Figura 12.
60
Figura 12 – Fluxograma utilizado na metodologia do estudo.
6 RESULTADOS
6.1 Cinética de crescimento e classificação dos biofilmes leveduriformes
Em relação a formação dos biofilmes do complexo S. schenckii, na forma
leveduriforme, foi avaliado o tempo de maturação através da cinética de crescimento deste,
como mostra a Figura 13. Ondeverificou-se que, este se inicia logo após o período de adesão
(24h), e já nas primeiras 24h se observa crescimento perceptível pela análise da atividade
metabólica e produção de biomassa. Esse crescimento é progressivo atingindo o seu limiar,
por volta das 72 e 96h para a atividade metabólica e 96h para biomassa. A partir das 96h
61
observa-se, de um modo geral, o decréscimo nos valores de absorbância da atividade
metabólica e da biomassa, o que nos leva a sugerir que se inicia o processo de morte celular
e/ou desarranjo do biofilme. Como houve pequenas variações nos tempos de formação dos
biofilmes das diferentes espécies do complexo S. schenckiio presenteestudo adotou como
tempo de maturação dos biofilmes leveduriformes, tanto para a atividade metabólica quanto
para biomassa, o correspondente a 96h.
A capacidade de formação dos biofilmes, avaliada através da produção da biomassa,
evidenciou que todas as 18 cepas do complexo S. schenckii na forma leveduriforme, foram
capazes de produzir biofilme in vitro. Houve variação na classificação, com os isolados sendo
classificados como fraco (2/18), moderado (8/18) e fortes formadores (8/18), como mostra a
Tabela 2. Dentre as espécies avaliadas, S. brasiliensis apresentou a maior produção de
biomassa (Figura 14).
62
Figura 13- Cinética de crescimento dos biofilmes leveduriformes do complexo Sporothrix schenckii. Os gráficos (a), (b) correspondem a cinética das espécies
estudadas na forma leveduriforme. O Comprimento de onda para as absorbâncias foram: (a) 492 nm para atividade metabólica (XTT) e (b) 540 nm para cristal
violeta (CV), biomassa.
Figura 14 - Quantificação da biomassa por cristal violeta. Os valores correspondem as médias das absorbâncias de cada amostra obtidas com o ensaio de CV,
em duplicata, dos biofilmes formados in vitro por 18 cepas de Sporothrix spp. na forma leveduriforme, por 96 h. As barras de erro indicam desvios padrões
das amostras. DO: densidade óptica.
63
Tabela 2- Classificação das cepas do complexo Sporothrix schenckii na forma leveduriforme de
acordo com a capacidade de formação de biofilme, in vitro.
Código Cepa Espécie DO (Média ± DP)
Classificação de
formação do biofilme
CEMM 05-3-050 Sporothrix brasiliensis 0,592 ± 0,029 Moderado
CEMM 05-3-052 S. brasiliensis 0,816 ± 0,030 Forte
CEMM 05-3-053 S. brasiliensis 0,671 ± 0,008 Moderado
CEMM 05-3-054 S. brasiliensis 0,398 ± 0,005 Moderado
CEMM 05-3-055 S. brasiliensis 0,836 ± 0,003 Forte
CEMM 05-3-056 S. brasiliensis 1,224 ± 0,011 Forte
CEMM 05-3-057 S. brasiliensis 0,676 ± 0,012 Moderado
CEMM 05-3-058 S. brasiliensis 0,893 ± 0,004 Forte
CEMM 05-3-075 S. brasiliensis 1,376 ± 0,001 Forte
CEMM 05-3-078 S. brasiliensis 0,567 ± 0,022 Moderado
CEMM 05-3-008 S. Mexicana 1,504 ± 0,041 Forte
CEMM 05-3-009 S. Mexicana 0,389 ± 0,009 Moderado
CEMM 05-3-100 S. Mexicana 0,400 ± 0,012 Moderado
CEMM 05-4-001 S. Mexicana 0,261 ± 0,031 Fraco
CEMM 05-3-004 S. globosa 0,960 ± 0,002 Forte
CEMM 05-3-005 S. globosa 0,417 ± 0,005 Moderado
CEMM 05-3-090 S. schenckii stricto sensu 0,851 ± 0,008 Forte
CEMM 05-4-002 S. schenckii stricto sensu 0,315 ± 0,002 Fraco
Biofilme formado em microplacas de 96 poços em meio RPMI com 24 horas de adesão e 96 horas de
maturação. OD: Densidade óptica obtida a 540 nm para a técnica de coloração com cristal violeta,
expressa como média ± desvio padrão (DP).
6. 2 Análises microscópicas dos biofilmes (Microscopia óptica e MEV)
Através da microscopia óptica e da microscopia eletrônica de varredura (MEV), foi
possível observar a estrutura dos biofilmes de Sporothrix brasiliensis em suas formas
filamentosa e leveduriforme. Onde, o biofilme filamentoso, se apresentou composto por um
emaranhado de hifas entrelaçadas e ramificadas com conídios (setas brancas) e estas
estruturas recoberta por matriz extracelular (setas pretas) (Figura 15 A, B e C). Já para o
biofilme leveduriforme foi possível observar a composição deste, por células leveduriformes
de formato de ―charuto‖ e em brotamento (setas brancas), com uma exuberante camada de
matriz extracelular, recobrindo os blastoconídios (setas pretas) (Figura 15 D, E e F). Os
64
resultados de MEV corroboram com os resultados de vermelho congo, quanto a estrutura e
formação do biofilme.
65
Figura 15 – Biofilmes de Sporothrixbrasiliensis, corados através da técnica de vermelho Congo e observado ao microscópio óptico (A e D) e
analisados em microscopia eletrônica de varredura (MEV) (B, C, E e F). A - Biofilme filamentoso, 400X,com hifas entrelaçadas (seta branca) e matriz
extracelular (seta preta); D - Biofilme leveduriforme, 1000X, mostra as células em formato ovalado (seta branca) e a matriz extracelular (seta preta). B -
Biofilme filamentoso, 1000X. C – Biofilme filamentoso, 5000X, seta branca indica a formação do biofilme com hifas e conídios, a seta preta mostra a
matriz extracelular envolta das estruturas. E - Biofilme leveduriforme, 1000X. F – Biofilme leveduriforme, 10000X, a seta branca indica os
blastoconídios em brotamento, com formato em ―charuto‖ e a seta preta mostra as células envolta por matriz extracelular.
66
6.3 Ensaiode sensibilidade planctônica
Os dados de sensibilidade das cepas na forma planctônica estão descritos na Tabela 3.
Todas as cepas do complexo Sporothrix schenckii foram inibidas pelas drogas miltefosina e
iodeto de potássio. Para a forma filamentosa os valores de CIM variaram de 125 a 250 mg/mL
para KI; de1 a 4 µg/mL para MIL; de 0,25 a >16 µg/mL para ITC e de 0,25 a 4 µg/mL para
AMB. Foram encontrados valores significativos de inibição, para o KI e a MIL para cepas na
forma filamentosa,para a CIM, com o KI> AMB, ITC e MIL (p<0,0001); na CIM80, com o
KI>ITC e MIL (p<0,0001); na CIM50, com a KI> [ITC< MIL] (p<0,0001). Para a forma
leveduriforme, obtivemos os seguintes valores de CIM: 62,5 a 125 mg/mL para KI;0,125 a 2
µg/mL para MIL; 0,125 a 1 µg/mL para ITC; 0,0312 a 1 µg/mL para AMB. E foram
evidenciados os seguintes valores significativos de inibição do KIna CIM, com KI>AMB,
ITC e MIL (p<0,0001), para CIM80 e CIM50, com o KI>ITC e MIL (p<0,0001). Todas as
drogas apresentaram valores de CIM duas a quatro vezes menores para a forma leveduriforme
quando comparado com a forma filamentosa.
67 Tabela 3 - Atividade antifúngica, in vitro, da anfotericina B (AMB), itraconazol (ITC), miltefosina (MIL) e iodeto de potássio (KI), frente a cepas do complexo Sporothrix
schenckii nas formas filamentosa e leveduriforme.
Concentração Inibitória Mínima das Drogas (µg/mL)
AMB ITC MIL KI
Espécie 100% 100% 80% 50% 100% 80% 50% 100% 80% 50%
Sporothrix
brasiliensis (n=10)
0,25(2)* 0,25(1) 0,125(1) 0,0625(1) 2(5) 1(5) 0,5(5) 125000(5) 62500(6) 31250(6)
FIL
0,5 (2) 0,5(2) 0,25(3) 0,125(5) 4(5) 2(5) 1(5) 250000(5) 125000(4) 62500(3)
2(5) 1(4) 0,5(5) 0,25(3) 125000(1)
4(1) 2(2) 1(1) 0,5(1)
4(1)
LEV
0,125(2) 0,25(3) 0,0625(2) 0,0312(2) 0,25(1) 0,0625(2) 0,0312(2) 62500(3)
125000(7)
31250(3)
62500(7)
15620(3)
0,250(4) 0,5(7) 0,125(3) 0,0625(3) 0,5(3) 0,25(3) 0,125(4) 31250(7)
0,5(2) 0,250(5) 0,125(5) 1(4) 0,5(3) 0,25(2)
1(2) 0,25(3) 0,0625(2) 0,0312(2) 2(2) 1(2) 0,5(2)
Sporothrix schenckii stricto sensu (n=2)
FIL
0,25(1) 0,5(1) 0,25(1) 0,125(1) 1(1) 0,5(1) 0,25(1) 125000(1) 62500(1) 31250(1)
1(1) >16(1) 16(1) 2(1) 2(1) 1(1) 0,5(1) 250000(1) 125000(1) 62500(1)
LEV
0,0625(2) 0,25(1) 0,125(1) 0,0625(1) 0,125(1) 0,0625(1) 0,0312(1) 125000(2) 62500(2) 31250(2)
0,5(1) 0,25(1) 0,125(1) 0,25(1) 0,125(1) 0,0625(1)
Sporothrix mexicana (n=4)
FIL
1(2) 0,5(1) 0,25(4) 0,0312(1) 1(1) 0,125(1) 0,312(1) 125000(2) 62500(2) 31250(2)
2(1) 1(2) 0,0625(1) 2(3) 1(3) 0,5(3) 250000(2) 125000(2) 62500(2)
4(1) 2(1) 0,125(1)
LEV
0,125(1) 0,25(2) 0,125(2) 0,0625(2) 0,5(2) 0,25(2) 0,125(2) 62500(1) 31250(1) 15620(1)
0,25(1) 0,5(1) 0,25(1) 0,125(1) 1(2) 0,5(2) 0,25(2) 125000(3) 62500(3) 31250(3)
0,5(2) 1(1) 0,5(1) 0,25(1)
Sporothrix globosa
(n=2)
FIL
0,25(1) 1(1) 0,25 (1) 0,125(1) 1(1) 0,5(1) 0,25(1) 125000(1) 62500(1) 31250(1)
1(1) 2(1) 0,5(1) 0,25(1) 2(2) 1(1) 0,5(1) 250000(1) 125000(1) 62500(1)
LEV
0,0312(1) 0,125(1) 0,0625(2) 0,0312(2) 0,25(2) 0,125(2) 0,0625(2) 62500(2) 31250(2) 15620(2)
0,25(1) 0,25(1) 0,125(1) 0,0625(1)
*Número de cepas inibidas por essa concentração de droga. Cepas controle: Candida krusei (ATCC 6258) (AMB: 1 µg/mL; ITC: 0,25 µg/mL; MIL: 1 µg/mL; KI: 16 µg/mL;
C. parapsilosis (ATCC 22019) (AMB: 1 μg/mL, ITC: 0,25 μg/mL, MIL: 1 μg/mL, KI: 16 µg/mL). FIL: filamentoso; LEV: levedura.
68
6.4 Ensaio de sensibilidade dos biofilmes
No que diz respeito ao teste de sensibilidade dos biofilmes maduros observou-se que,
em relação aos biofilmes filamentosos, foi possível verificar inibição significativa da
atividade metabólicaem todas as concentrações testadas para AMB, ITC, MIL e KI
(p<0,0001) e redução significativa da biomassa nas concentrações 10xCIM e 50xCIM para
AMB, ITC, MIL(p<0,0001) e 10xCIM para KI (p=0,0039). Já para os biofilmes
leveduriformes, avaliando a atividade metabólica, houve diferença signifivativa apartir da
10xCIM para AMB, ITC e MIL (p<0,0001) e apartir da CIM para o KI (p<0,0001), enquanto
para a biomassa a diferença foi significativa apartir da CIM para AMB, MIL e KI (p<0,0001)
e apartir da 10xCIM para ITC(p<0,0001).
Os biofilmes maduros do complexo Sporothrix schenckii, na forma filamentosa,
quando expostos as drogas em suas maiores concentrações testadas (10xCIM para KI;
50xCIM para AMB, ITC e MIL), tiveram uma maior inibição da atividade metabólica e da
biomassa quando exposto ao KI (79,8% e 71%), seguida da MIL (51,3% e 58,9%), da AMB
(47% e 47,5%) e do ITC (40,3% e 38,2%) (Figura 15). Para a forma leveduriforme, a droga
que apresentou maiores valores de inibição, em sua maior concentração testada, para a
atividade metabólica foi KI (69,9%), seguido da AMB (54,2%), da MIL (50,1%),e do ITC
(49,5%). Em relação a inibição da biomassa, a droga que apresentou maior inibição também
foi o KI (65,5%), seguida da MIL (53,2%), da AMB (47,6%), do ITC (38,4%)(Figura 16).
Avaliando a redução dos biofilmes e fazendo a comparação entre as drogas testadas,
verificou-se que, para os biofilmes filamentosos, na redução da atividade metabólica, o KI na
CIM e 10xCIM apresentou valores de redução significativamente maiores quando comparado
as demais drogas testadas (p<0,0001). E com relação a biomassa, o KI na CIM, apresentou os
valores de redução significativamente maiores, quando comparado a CIM das drogas AMB,
ITC e MIL (p<0,0001) e a MIL na 50xCIM, apresentou valores significativos maiores
comparado a 50xCIM doITC (p=0,0242). E para os biofilmes leveduriformes, para a atividade
metabólica, na CIM e 10xCIM,o KI foi a droga que apresentou valores de redução
significativamente maiores quando comparado as demais drogas testadas (p<0,0001), nas
mesmas concentrações. E com relação a biomassa, na CIM, o KI apresentou valores
significativos maiores, comparado a CIM das demais drogas (p<0,0001) e a MIL, na 50xCIM,
apresentou valores significativamente maiores com relação a 50xCIM daAMB e do ITC
(p=0,0006).
69
Figura 16- Sensibilidade in vitro dos biofilmes do complexo Sporothrix schenckii à anfotericina B (AMB), ao itraconazol (ITC), a miltefosina (MIL) e ao
iodeto de potássio (KI). Os dados representam a porcentagem (%) de crescimento dos biofilmes após serem expostos as drogas testadas, comparados ao
crescimento dos biofilmes sem adição de droga (100%).Para a atividade metabólica (XTT) e a biomassa, por cristal violeta (CV)das cepas nas formas
filamentosa e leveduriforme.CSD: corresponde ao crescimento do micro-organismo sem adição de droga, apenas com o meio RPMI. CIM: concentração
inibitória mínima; 10xCIM: dez vezes a concentração inibitória mínima; 50xCIM: cinquenta vezes a concentração inibitória mínima.
70
Esses resultados também foram evidenciados através da microscopia confocal dos
biofilmes de Sporothrix brasiliensis, na forma filamentosa (Figura 17 A, B, C, D, E) e
leveduriforme (Figura 17F, G, H, I), foi possível observar a diferença entre células vivas
(coloração verde) e mortas ou danificadas (em vermelho). Os biofilmes maduros sem
tratamento com drogas (controle) apresentavam um número maior de células vivas, com
raríssimas células mortas ou danificadas, evidenciando que, a atividade metabólica dos
biofilmes se apresentam elevadas na maturação, como mostram as Figura 17A e 17F. Os
biofilmes tratados com as drogas nas suas maiores concentrações de estudo, apresentaram no
geral uma significativa redução na quantidade de células vivas e na estrutura, apresentando
redução de hifas e conídios, nos biofilmes filamentosos, e redução de blastoconídios nos
biofilmes leveduriformes, evidenciando a redução da atividade metabólica e da biomassa
destes. Sendo que, a desestruturação do biofilme e o aumento na quantidade de células
mortas, foram evidenciadas em uma maior intensidade para o KI, seguido pela MIL, logo
após pela AMB e por último pelo ITC, como pode ser observado na Figuras 17, quando
comparadas aosseus respectivos crescimentos sem adição de droga(Figura 17A e 17F). Esses
resultados corroboram com os resultados referentes ao XTT e ao cristal violeta.
71
Figura 17 – Biofilmes de Sporothrix brasiliensis, por microscopia Confocal (100 µm), mostrando células vivas, na cor verde e células mortas ou danificadas,
na cor vermelha, para a forma filamentosa, apresentando hifas e conídios (A, B, C, D, E) e leveduriforme apresentando blastoconídios em brotamentos (F, G,
H, I, J). (A e F) Crescimento do biofilme maduro sem adição de droga (CSD); Biofilmes tratados com as drogas, demostrando a redução na quantidade total de
células e o aumento de células mortas: AMB (B e G), ITC (C e H), MIL (D e I) nas concentrações de 50 x CIM e KI (E, J) na concentração de 10 x CIM.
CSD
CSD
AMB
(50 x CIM)
AMB
(50 x CIM)
ITC
(50 x CIM)
ITC
(50 x CIM)
MIL
(50 x CIM)
MIL
(50 x CIM)
KI
(10 x CIM)
KI
(10 x CIM)
72
7 DISCUSSÃO
As espécies patogênicas que constituem o complexoSporothrix schenckii, são: S.
brasiliensis, S. mexicana, S. globosa, S. schenckii stricto sensu, S. luriei e S.
pallida(CARRASCO-ZUBER et al., 2016; GONÇALVES et al., 2017). Entre elas quatro
espécies estão mais relacionadas com os casos de esporotricose humana e animal. Entre essas
espécies, S. brasiliensis e S. schenckii stricto sensu são as mais relacionadas a infecção
humana e a transmissão zoonótica, são classificadas como mais virulentas e as espécies mais
predominante em casos de esporotricose no Brasil (RODRIGUES et al., 2014; BORBA-
SANTOS et al., 2016b). S. globosa, é considerada de baixa virulência, apresentando
transmissão ambientais e de distribuição mundial. E, S. mexicana também considerada de
transmissão ambiental, é encontrada no México, na Europa, e em alguns casos na América do
Sul (CRUZ et al., 2012; ALMEIDA-PAES et al., 2014).
Ainda, as espécies que compõem o complexo S. schenckii são fungos classificados
como termodimórficos, ou seja, possuem morfologias distintas dependendo da temperatura
que estejam inseridos. Apresentando a forma micelial quando estão a temperatura ditas
ambientais (entre 25-28°C) e quando estão em temperaturas de aproximadamente 37 °C, se
apresentam leveduriforme, esta últimatambém é a forma que o micro-organismo se encontra
em parasitismo, ou seja, em contato com o hospedeiro humano ou animal, ocasionando a
infecção (BARROS, 2011; RODRIGUES et al., 2016).
No presente estudo, avaliamos a capacidade de espécies do complexo Sporothrix spp.
de formar biofilme, na sua forma leveduriformes, para isso utilizamos diversas técnicas como
a avaliação da atividade metabólica por XTT, avaliação da biomassa por cristal violeta e ainda
usamos de recursos onde fosse possível a visualização estrutural desses biofilmes, através das
técnicas de microscopia óptica, microscopia confocal e microscopia eletrônica de varredura.
A adesão é o primeiro contato na interação parasita-hospedeiro, de modo que é uma
etapa essencial para sobrevivência e/ou patogenicidade do micro-organismo, incluindo a
capacidade de formação de biofilme (SILVA-DIAS et al., 2015). Esse processo é dependente
das características da superfície com a qual ocorre a interação e dos fatores de virulência do
próprio micro-organismo (SANDOVAL-BERNAL et al., 2011).
Estudos já demostraram que Sporothrix spp. na forma leveduriforme tem alta
capacidade de adesão em células epiteliais (SANDOVAL-BERNAL et al., 2011) e sendo a
adesão a primeira etapa para formação do biofilme (NETT; ANDES, 2015),e que, a forma
leveduriforme é a forma parasitária deste micro-organismo, ou seja, a forma como o fungo se
73
encontra no hospedeiro ocasionando a infecção (GANDHI et al., 2016). Hipotetizamos se,
essa pode ser uma das formas que este fungo possa se apresentarin vivo. Assim, a capacidade
de formar biofilme nesta forma pode auxiliar esse micro-organismo a evadir-se da resposta
imune do hospedeiro, e também dificultar o tratamento (ROILIDES et al., 2015; NETT E
ANDES, 2015; GARCIA-SHERMAN et al., 2015). Estudos, in vitro, relatam que Sporothrix
spp. na forma filamentosa tem capacidade de formar biofilme (SÁNCHEZ-HERRERA et al.,
2014; BRILHANTE et al., 2017). No entanto, este estudo é o pioneiro a relatar a formação de
biofilme in vitro, de espécies do complexo Sporothrix schenckii na forma leveduriforme.
O modo como compreendemos a sobrevivência dos micro-organismos no ambiente
tem sofrido intensas modificações nas últimas décadas. E hoje, sabe-se que estes raramente
vivem de forma isolada, ocorrendo principalmente associados na forma de biofilme. Pesquisas
apontam que essa seja a forma mais predominante de adaptação desses organismos para sua
evolução, sendo portanto uma importante estrátégia de sobrevivência dessas espécies nos
mais diversos ambientes (MITCHELL et al., 2016).
Os biofilmes são comunidades séssil, organizada por células que formam
microcolônias, aderidas a um substrato biótico ou abiótico, recobertas por uma complexa
matriz extracelular de substâncias poliméricas, e apresentam algumas modificações quando
comparado ao crescimento planctônico, como alteraçõesno fenótipo da taxa de crescimento
microbiano, à transcrição genética entre outros (DONLAN; COSTERTON, 2002; RAMAGE
et al., 2012). Em geral a habilidade de formar biofilme levam os micro-organismos a uma
maior virulência, pois permite aos envolvidos sobreviverem a ambientes hostis, como
mudança de pH, desidratação, substâncias químicas e etc. Já é descrito que fungos
filamentosos, como Aspergillus e Fusarium; leveduriformes como Trichosporon,
Cryptococcus e Candida spp. e dimórficos, como Histoplasma capsulatum, possuem essa
capacidade ( BRILHANTE et al., 2014; NET; ANDES, 2015)
Ademais, acredita-se que grande parte das infecções microbianas em seres humanos e
animais são provocadas por micro-organismos nesse tipo de associação. E queinfecções
associadas a biofilmes também tendem a apresentam maior refratariedade ao tratamento com
antimicrobianos convencionais (MARTINEZ; FRIES, 2010; MITCHELL et al., 2016). Então,
conhecer os mecanismos que permeiam o processo de formação, maturação e reprodução
desses biofilmes se faz necessário para a aquisição de formas de controle dos mesmos.
Através da avaliação da formação e da cinética de crescimento dos biofilmes
leveduriformes verificamos quedas quatro espécies estudadas (S. brasiliensis, S. mexicana, S.
globosa, S. schenckii stricto sensu) ocorrem de maneira similar entre as espécies, com
74
oprocesso de adesão ocorrendo com 24h, e o crescimento do biofilme já sendo perceptível nas
primeiras 24h, atingindo a maturação com aproximadamente 72h par S. mexicana e 96h para
as demais espécies. Quanto a classificação em relação a formação dos biofilmes
leveduriformes verificamos que há diferença entre cepas, em fraco, moderado e forte
formadores, sendo que a maioria das cepas são moderadas e fortes formadoras com apenas 2
cepas das 18 estudadas, classificadas como fracas formadoras. O que difere do biofilme
filamentoso,segundo o estudo de Brilhante et al. (2017), que mesmo possuindo o seu tempo
de adesão equivalente ao leveduriforme (24h) possui um tempo de maturação maior (120 h).
E, todas as cepas, para biofilmes filamentosos, foram classificadas como fortes formadoras.
Ainda, os biofilmes filamentosos apresentaram valores para avaliação da biomassa maiores
quando comparados com os biofilmes leveduriformes, sugerindo que essa possa ser a forma
na qual esse fungo se encontra na natureza, uma vez que se tem relatado cada vez mais que
uma gama de fungos do ambiente e de interesse médico, frequentemente são encontrados
associados em biofilme (RAMAGE et al., 2012; CHAN et al., 2015).
Com a microscopia óptica e a microscopia eletrônica de varreduraverificou-se a
estrutura dos biofilmes filamentosos e leveduriformes, onde estes apresentaram um
aglomerado de blastoconídios firmemente aderido a superfície de formação recobertos por
uma densa e exuberante matriz polimérica extracelular. Quando comparamos aos biofilmes
filamentosos analisados em nosso estudo e com os biofilmes do estudo desenvolvido por
Brilhante et al. (2017), verificou-se que os biofilmes são robustos composto por hifas
entrelaçadas e conídios e que aprodução de matriz extracelular ocorreu mais abundantemente
nos biofilmes leveduriformes.
Com base no biofilme como fator de resiliência para sobrevivência dos micro-
organismos, investigamos a atividade antifúngica das drogas AMB, ITC, MIL e KI, contra
biofilmes maduros de Sporothrix spp. Utilizamos para essa avaliação a técnica da atividade
metabólica determinada por ensaio com XTT, pois este possui como mecanismoa redução
deste sal de tetrazólio em seu produto colorido, denominado formazan. E esta reação somente
acontece na presença de desidrogenases mitocondriais, ou seja, somente células vivas têm a
capacidade de produzir essa reação. Este ensaio é importante tanto para avaliar a cinética
decrescimento do biofilme quanto à atividade exercida por drogas no metabolismo deste
(PITANGUI et al., 2012; CORDEIRO et al., 2015b). E Utilizamos ainda a avaliação da
biomassa por cristal violeta, essa técnica consiste na capacidade de retenção do corante cristal
violeta pela matéria orgânica, constituinte do biofilme, e a ―liberação‖ do corante retido neste
75
material quando em contato com o ácido acético, permitindo a quantificação dessa cor,
proporcional a matéria orgânica (biomassa) que a reteve (PITANGUI et al., 2012).
Inicialmente obtivemos as concentrações inibitórias mínimas (CIMs) das cepas
planctônicas, e posteriormente utilizamos essas concentrações e múltiplos destas nos
biofilmes maduros de Sporothrix spp. para avaliar a sensibilidade dos mesmos. As CIMs das
formas planctônicas, para todas as drogas se assemelham aos valores de CIMs descritos na
literatura (BRILHANTE et al., 2014; BORBA-SANTOS et al., 2015; BORBA-SANTOS et
al., 2016a; BRILHANTE et al., 2017). Para a sensibilidade em biofilmenas concentrações
estudadas (CIM, 10 x CIM e 50 x CIM) não houve inibição 100% dos biofilmes para
nenhuma das drogas, evidenciando a dificuldade que o biofilme representa para a interação e
ação das drogas sobre os micro-organismos que o constituem (MARTINEZ; FRIES, 2010;
MITCHELL et al., 2016).
Então, foi possível evidenciar que o KI, inibiu todas as cepas planctônicas de
Sporothrix spp. testadas, nas formas filamentosa e leveduriforme. O efeito inibitório do KI em
cepas de Sporothrix spp. na forma filamentosa foi relatado por Wada (1968) onde foi
observado que todas as cepas eram inibidas com até 30% da solução saturada de KI (SSKI), o
que corrobora com os nossos resultados. No biofilme, verificamos que o KI inibiu tanto a
atividade metabólica quanto a biomassa, tendo como média percentual de inibição, para sua
maior concentração testada (10xCIM), 75,4% para os biofilmes filamentosos e 67,7% para os
leveduriformes. E quando comparamos os efeitos inibitórios do KI com as demais drogas
testadas, tanto nas cepas planctônicas como em biofilme, verificamos que esta droga possui
valores significativamente maiores.
Apesar de não se saber ainda qual o mecanismo de ação do KI, acredita-se que este
atue na modulação da resposta inflamatória e melhore a resposta imune (TORRES-
MENDOZA et al., 1997), onde após ser metabolizado o iodo tenha sua ação direta no micro-
organismo e o potássio atue auxiliando a resposta imunológica do hospedeiro. Um estudo
relata ainda que quando leveduras de Sporothrix spp. são expostas a solução de iodo-iodeto de
potássio, in vitro, há redução na taxa de gemulação das leveduras e ainda ocorre a lise celular,
com liberação de enzimas lisossomais (HIMURA; KAGAWA,1987). Há relatos também que,
a inibição do fungo in vitro requer concentrações mais elevadas do que as utilizadas para
tratamento in vivo (MITCHELL et al., 1975).
Com relação a miltefosina, verificou-se que esta possui efeito inibitório frente a todas
as cepas testadas, nas formas filamentosa e leveduriforme, corroboram com este trabalhoos
estudos de Brilhante et al. (2014) e Borba-santos et al. (2015). Nosbiofilmes, na maior
76
concentração testada para esta droga (50xCIM), foi possível observar que houve inibição na
atividade metabólica e na biomassa, com uma média percentual de 55,1% para a forma
filamentosa e 51,6% para os biofilmes leveduriformes. E ainda quando comparada com a
drogas controles AMB e ITC os testes, tanto planctônico como em biofilme, apresenta valores
de inibição semelhantes entre essas drogas. O estudo de Vila et al. (2016), obteve resultados
semelhantes entre MIL e AMB quanto ao efeito inibitório de biofilmes de Candida spp. o que
corrobora com os nossos resultados. Ainda, outro estudo,demonstra a atividadeinibitória da
miltefosina frente a biofilme de Fusarium oxysporum (VILA et al., 2015).
A miltefosina (hexadecilfosfocolina), embora não tenha um mecanismo de ação
definido, é descrito que esta induz mudanças na constituição lipídica, na fluidez e na
permeabilidade da membrana celular, afetando o processo de sinalização intracelular, que são
fundamentais para o crescimento e a sobrevivência da célula. Essa droga é um análogo de
fosfolipídio inicialmente desenvolvido como uma droga antitumoral, e posteriormente
mostrou ter potentes atividades antiparasitárias, e mais recentemente foi demostrado que esse
fármaco possui ação eficaz contra fungos como o Sporothrixspp. nas suas formas planctônicas
(COSTA FILHO et al., 2008; BRILHANTE et al., 2014;BORBA-SANTOS et al., 2015).
Com base na suposição da ação da miltefosina afetando o processo de sinalização da
célula, hipotetizamos que talvez essa seja a forma que esta droga atue no desarranjo do
biofilme, interferindo no processo de ―quorumsensing” ou comunicação celular importante
para o desenvolvimento do biofilme (HORNBY et al., 2001; KAVANAUGH; HORSWILL,
2016), perceptível pela redução da biomassa dos biofilmes tratados quando comparado com o
controle de crescimento sem adição da droga e consequentemente levando a morte celular,
evidenciado através da redução da atividade metabólica dos biofilmes tratados com essa
droga.
Ainda, quando analisamos a arquitetura dos biofilmes tratados sem e com as drogas
AMB, ITC, MIL e KI, através da microscopia confocal, verificou-se que ocorre a redução da
biomassa dos biofilmes para todas as drogas, quando comparados aos controles sem adição de
droga, tendo destaque para o KI com uma maior inibição, e a MIL de uma forma geral
apresentou valores semelhantes a AMB e ITC, em alguns casos apresentando efeito inibitório
maior que o ITC, como para CIM50 na forma planctônica filamentosa e para biomassa, na
concentração de 50 x CIM, tanto para os biofilmes filamentosos e leveduriformes. Quanto a
quantidade de células vivas e mortas, o KI apresentou uma ação de inibição superior as
demais drogas, com uma maior quantidade de células mortas.Os achados da microscopia
77
confocal corroboram com os achados referentes a atividade metabólica e a biomassa da
sensibilidade dos biofilmes.
Em suma, nesse estudo foi verificado que a MIL apresentou valores de inibição
semelhantes aos da AMB e em alguns casos, maiores do que ITC, quanto a sensibilidade dos
biofilmes filamentos e leveduriformes. E com relação a atividade inibitória do KI, frente aos
biofilmes maduros nas duas formas,este apresentou uma maior inibição se comparado as
demais drogas estudadas. E ainda,comparando o efeito inibitório da MIL e do KI entre os
biofilmes filamentosos e leveduriformes não foi encontrada diferença significativa entre estes
para as diferentes formas estudadas. Ademais, para as cepas na forma planctônica, na forma
leveduriforme, apresentam CIM menores para as drogas estudadas quando comparadas com a
CIM das cepas na forma filamentosa, o estudo de Borba-santos et al. (2015) utilizando cepas
de S. schenckii stricto sensu com miltefosina, obteve valores de CIM sem diferença
significativa para as diferentes formas dessa espécie.
E ainda que, embora o KI seja a primeira droga a ser utilizada no tratamento da
esporotricose, é perceptível o quanto a sua ação inibitória frente as cepas do complexo
Sporothrix spp. é superior a drogas clássicas como a AMB e o ITC, o que contribui para
confirmação da sua boa eficácia; a MIL se apresenta como uma droga a ser considerada, para
o tratamento da esporotricose, necessitando para tanto de estudos in vivo, mas com resultados
promissores quando comparamos o seu desempenho com ao da AMB e ao do ITC in vitro.
8CONCLUSÕES
Através deste estudo foi possível evidenciar que:
1. As cepas das diversas espécies patogênicas pertencentes ao complexo Sporothrix
schenckii, são capazes de formar biofilme na forma leveduriforme.
2. O processo de formação desses biofilmes se inicia com uma adesão de 24h e
maturação com até 96h e estes possuem diversidade de classificação entre as
espécies e as cepas estudadas. Apresentando-se em sua maioria como moderados e
fortes formadores.
3. A sensibilidade dos biofilmes demonstrou que estes requerem uma concentração
maior das drogas para se alcançar uma redução significativa na atividade
78
metabólica e na biomassa destes quando comparadas as concentrações utilizadas
nas formas planctônica.
4. O KI apresentou efeito inibitório significativamente superior as demais drogas
estudadas, tanto para a forma planctônica como em biofilme, de Sporothrix spp.
nas formas filamentosa e leveduriforme.
5. A MIL apresentou efeito inibitório semelhante aos da AMB e aos do ITC tanto
para a forma planctônica como em biofilme, de Sporothrix spp. nas formas
filamentosa e leveduriforme.
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APÊNDICE A – RESULTADOS DE SENSIBILIDADE PLANCTÔNICA E SENSIBILIDADE BIOFILME DAS CEPAS DO
COMPLEXO Sporothrix schenckii NA FORMA FILAMENTOSA
Concentração inibitória mínima (CIM) está em µg/mL para as drogas anfotericina B (AMB), itraconazol (ITC), miltefosina (MIL) e iodeto de potássio (KI).
AMB
Espécie Espécies CIM 100% CIM 100% CIM 80% CIM 50% CIM 100% CIM 80% CIM 50% CIM 100% CIM 80% CIM 50%
SS03 S. brasiliensis 4 2 0,5 0,25 2 1 0,5 125000 62500 31250
SS05 S. brasiliensis 2 1 0,25 0,125 2 1 0,5 125000 62500 31250
SS06 S. brasiliensis 2 4 1 0,5 4 2 1 250000 125000 62500
SS07 S. brasiliensis 0,25 1 0,5 0,125 4 2 1 250000 125000 62500
SS08 S. brasiliensis 2 0,5 0,25 0,125 4 2 1 125000 62500 31250
SS09 S. brasiliensis 0,25 1 0,5 0,25 4 2 1 250000 125000 62500
SS10 S. brasiliensis 2 1 0,5 0,25 4 2 1 125000 62500 31250
SS11 S. brasiliensis 0,5 0,5 0,25 0,125 2 1 0,5 250000 125000 62500
SS28 S. brasiliensis 2 2 0,5 0,125 2 1 0,5 125000 62500 31250
SS31 S. brasiliensis 0,5 0,25 0,125 0,0625 2 1 0,5 250000 125000 62500
SS43 S. schenckii 0,25 >16 16 2 1 0,5 0,25 125000 62500 31250
SS55 S. schenckii 1 0,5 0,25 0,125 2 1 0,5 250000 125000 62500
SS53 S. mexicana 1 1 0,25 0,125 2 1 0,5 250000 125000 62500
SS54 S. mexicana 1 0,5 0,25 0,0625 2 1 0,5 125000 62500 31250
SS61 S. mexicana 2 2 0,25 0,125 2 1 0,5 250000 125000 62500
SS62 S. mexicana 4 1 0,25 0,0312 1 0,125 0,0312 125000 62500 31250
SS57 S. globosa 0,5 2 0,25 0,125 2 1 0,25 250000 125000 62500
SS58 S. globosa 2 1 0,5 0,25 2 1 0,5 250000 125000 62500
Sensibilidade antifúngica de Sporothrix na fase filamentosa (FORMA PLANCTÔNICA)
ITC MIL KI
95
Os valores correspondem Densidade Óptica, no comprimento 492 nm. As células vazias correspondem as concentrações de KI que ultrapassam a solubilidade em água, logo
não foi possível a análise nesta concentração.
Os valores correspondem Densidade Óptica, no comprimento 540 nm. As células vazias correspondem as concentrações de KI que ultrapassam a solubilidade em água, logo
não foi possível a análise nesta concentração.
AMB
Espécies CIM 100% CIM 100% CIM 80% CIM 50% CIM 100% CIM 80% CIM 50% CIM 100% CIM 80% CIM 50%
S. brasiliensis 4 2 0,5 0,25 2 1 0,5 125000 62500 31250
S. brasiliensis 2 1 0,25 0,125 2 1 0,5 125000 62500 31250
S. brasiliensis 2 4 1 0,5 4 2 1 250000 125000 62500
S. brasiliensis 0,25 1 0,5 0,125 4 2 1 250000 125000 62500
S. brasiliensis 2 0,5 0,25 0,125 4 2 1 125000 62500 31250
S. brasiliensis 0,25 1 0,5 0,25 4 2 1 250000 125000 62500
S. brasiliensis 2 1 0,5 0,25 4 2 1 125000 62500 31250
S. brasiliensis 0,5 0,5 0,25 0,125 2 1 0,5 250000 125000 62500
S. brasiliensis 2 2 0,5 0,125 2 1 0,5 125000 62500 31250
S. brasiliensis 0,5 0,25 0,125 0,0625 2 1 0,5 250000 125000 62500
S. schenckii 0,25 >16 16 2 1 0,5 0,25 125000 62500 31250
S. schenckii 1 0,5 0,25 0,125 2 1 0,5 250000 125000 62500
S. mexicana 1 1 0,25 0,125 2 1 0,5 250000 125000 62500
S. mexicana 1 0,5 0,25 0,0625 2 1 0,5 125000 62500 31250
S. mexicana 2 2 0,25 0,125 2 1 0,5 250000 125000 62500
S. mexicana 4 1 0,25 0,0312 1 0,125 0,0312 125000 62500 31250
S. globosa 0,5 2 0,25 0,125 2 1 0,25 250000 125000 62500
S. globosa 2 1 0,5 0,25 2 1 0,5 250000 125000 62500
Sensibilidade antifúngica de Sporothrix na fase filamentosa (FORMA PLANCTÔNICA)
ITC MIL KI
AMB
Espécies CIM 100% CIM 100% CIM 80% CIM 50% CIM 100% CIM 80% CIM 50% CIM 100% CIM 80% CIM 50%
S. brasiliensis 4 2 0,5 0,25 2 1 0,5 125000 62500 31250
S. brasiliensis 2 1 0,25 0,125 2 1 0,5 125000 62500 31250
S. brasiliensis 2 4 1 0,5 4 2 1 250000 125000 62500
S. brasiliensis 0,25 1 0,5 0,125 4 2 1 250000 125000 62500
S. brasiliensis 2 0,5 0,25 0,125 4 2 1 125000 62500 31250
S. brasiliensis 0,25 1 0,5 0,25 4 2 1 250000 125000 62500
S. brasiliensis 2 1 0,5 0,25 4 2 1 125000 62500 31250
S. brasiliensis 0,5 0,5 0,25 0,125 2 1 0,5 250000 125000 62500
S. brasiliensis 2 2 0,5 0,125 2 1 0,5 125000 62500 31250
S. brasiliensis 0,5 0,25 0,125 0,0625 2 1 0,5 250000 125000 62500
S. schenckii 0,25 >16 16 2 1 0,5 0,25 125000 62500 31250
S. schenckii 1 0,5 0,25 0,125 2 1 0,5 250000 125000 62500
S. mexicana 1 1 0,25 0,125 2 1 0,5 250000 125000 62500
S. mexicana 1 0,5 0,25 0,0625 2 1 0,5 125000 62500 31250
S. mexicana 2 2 0,25 0,125 2 1 0,5 250000 125000 62500
S. mexicana 4 1 0,25 0,0312 1 0,125 0,0312 125000 62500 31250
S. globosa 0,5 2 0,25 0,125 2 1 0,25 250000 125000 62500
S. globosa 2 1 0,5 0,25 2 1 0,5 250000 125000 62500
Sensibilidade antifúngica de Sporothrix na fase filamentosa (FORMA PLANCTÔNICA)
ITC MIL KI
0,787 0,786 0,676 0,667 0,432 0,412 0,354 0,345 0,692 0,689 0,409 0,398 0,306 0,315 0,574 0,570 0,354 0,349 0,190 0,188 0,503 0,499 0,236 0,230
0,996 0,995 0,945 0,950 0,895 0,890 0,846 0,835 0,975 0,988 0,895 0,886 0,876 0,869 0,716 0,705 0,408 0,400 0,378 0,369 0,647 0,639 0,418 0,410
1,577 1,571 1,338 1,330 0,818 0,806 0,441 0,440 1,511 1,500 1,243 1,238 1,039 1,038 1,070 1,065 0,708 0,705 0,330 0,325 0,866 0,860
0,888 0,872 0,766 0,760 0,678 0,675 0,651 0,649 0,827 0,820 0,722 0,719 0,678 0,675 0,818 0,812 0,405 0,400 0,255 0,252 0,519 0,510
4,000 3,953 3,737 3,730 2,783 2,779 2,465 2,445 3,976 3,975 3,896 3,890 3,817 3,813 3,936 3,926 1,988 1,980 0,755 0,750 3,777 3,769 1,392 1,387
1,591 1,547 1,537 1,535 1,334 1,330 0,769 0,760 1,490 1,485 0,767 0,755 0,596 0,580 1,255 1,237 0,910 0,906 0,643 0,637 0,784 0,774
1,644 1,442 1,200 1,204 0,940 0,957 0,590 0,571 1,406 1,358 1,276 1,312 0,912 0,880 1,487 1,528 1,099 1,080 1,112 1,080 1,100 1,003 0,284 0,278
0,858 0,850 0,720 0,719 0,384 0,379 0,282 0,275 0,777 0,775 0,350 0,343 0,342 0,337 0,726 0,718 0,487 0,480 0,299 0,287 0,512 0,509
3,548 3,487 3,367 3,370 3,122 3,126 2,836 2,839 3,198 3,198 2,528 2,530 2,000 2,490 2,946 2,950 2,847 2,841 2,497 2,491 2,695 2,698 1,082 1,087
2,383 2,400 2,070 2,076 1,904 1,907 1,690 1,694 2,295 2,298 2,192 2,198 1,572 1,576 1,700 1,719 1,133 1,139 0,829 0,827 1,128 1,120
3,313 3,149 3,049 3,057 2,738 2,742 1,000 1,007 2,575 2,581 1,965 1,968 1,670 1,677 2,087 2,090 0,409 0,419 0,410 0,416 2,677 2,679 0,942 0,934
4,000 3,885 3,700 3,706 3,623 3,627 1,099 1,104 3,658 3,706 3,622 3,627 1,799 1,814 3,900 3,903 1,888 1,892 0,896 0,907 1,655 1,656
1,728 1,709 1,659 1,661 1,179 1,182 0,520 0,527 1,487 1,500 0,708 0,718 0,659 0,665 1,637 1,630 0,877 0,874 0,676 0,670 0,844 0,842
1,322 1,336 1,260 1,263 1,190 1,196 1,059 1,063 1,241 1,249 0,953 0,957 0,608 0,611 1,164 1,170 1,108 1,116 0,671 0,678 0,882 0,877 0,273 0,253
4,000 4,000 3,989 4,000 3,156 3,160 2,758 2,760 3,630 3,640 3,476 3,480 3,289 3,280 3,578 3,520 2,247 2,240 2,239 2,200 2,233 2,440
2,702 2,623 2,318 2,316 0,872 0,879 0,628 0,639 2,600 2,609 2,535 2,529 2,393 2,396 2,364 2,370 1,542 1,544 0,601 0,612 1,582 1,571 0,745 0,751
1,131 1,169 0,990 0,989 0,488 0,575 0,421 0,391 0,834 0,794 0,789 0,771 0,634 0,690 0,981 0,920 0,537 0,506 0,488 0,472 0,525 0,518
1,436 1,52 1,357 1,360 1,295 1,301 1,259 1,256 1,325 1,330 1,188 1,182 1,030 1,035 1,391 1,389 0,780 0,783 0,419 0,414 0,661 0,665
Itraconazol Miltefosina
CIMControle CIM CIM X 10 CIM X 50 CIMCIM X 10 CIM X 50 CIM X 10
Iodeto de Potássio
CIM CIM X 10 CIM X 50
Sensibilidade antifúngica de Sporothrix na fase filamentosa (FORMA DE BIOFILME) - BiomassaAnfotericina B
96
APÊNDICE B – RESULTADOS DE SENSIBILIDADE PLANCTÔNICA E SENSIBILIDADE BIOFILME DAS CEPAS DO
COMPLEXO Sporothrix schenckii NA FORMA LEVEDURIFORME
Concentração inibitória mínima (CIM) está em µg/mL para as drogas anfotericina B (AMB), itraconazol (ITC), miltefosina (MIL) e iodeto de potássio (KI).
AMB
Espécies CIM 100% CIM 100% CIM 80% CIM 50% CIM 100% CIM 80% CIM 50% CIM 100% CIM 80% CIM 50%
S. brasiliensis 4 2 0,5 0,25 2 1 0,5 125000 62500 31250
S. brasiliensis 2 1 0,25 0,125 2 1 0,5 125000 62500 31250
S. brasiliensis 2 4 1 0,5 4 2 1 250000 125000 62500
S. brasiliensis 0,25 1 0,5 0,125 4 2 1 250000 125000 62500
S. brasiliensis 2 0,5 0,25 0,125 4 2 1 125000 62500 31250
S. brasiliensis 0,25 1 0,5 0,25 4 2 1 250000 125000 62500
S. brasiliensis 2 1 0,5 0,25 4 2 1 125000 62500 31250
S. brasiliensis 0,5 0,5 0,25 0,125 2 1 0,5 250000 125000 62500
S. brasiliensis 2 2 0,5 0,125 2 1 0,5 125000 62500 31250
S. brasiliensis 0,5 0,25 0,125 0,0625 2 1 0,5 250000 125000 62500
S. schenckii 0,25 >16 16 2 1 0,5 0,25 125000 62500 31250
S. schenckii 1 0,5 0,25 0,125 2 1 0,5 250000 125000 62500
S. mexicana 1 1 0,25 0,125 2 1 0,5 250000 125000 62500
S. mexicana 1 0,5 0,25 0,0625 2 1 0,5 125000 62500 31250
S. mexicana 2 2 0,25 0,125 2 1 0,5 250000 125000 62500
S. mexicana 4 1 0,25 0,0312 1 0,125 0,0312 125000 62500 31250
S. globosa 0,5 2 0,25 0,125 2 1 0,25 250000 125000 62500
S. globosa 2 1 0,5 0,25 2 1 0,5 250000 125000 62500
Sensibilidade antifúngica de Sporothrix na fase filamentosa (FORMA PLANCTÔNICA)
ITC MIL KIAMB
CIM 100% CIM 100% CIM 80% CIM 50% CIM 100% CIM 80% CIM 50% CIM 100% CIM 80% CIM 50%
0,25 0,25 0,125 0,0625 1 0,5 0,25 125000 62500 31250
0,125 0,25 0,125 0,0625 0,5 0,25 0,125 125000 62500 31250
1 0,5 0,25 0,125 0,5 0,25 0,125 125000 62500 31250
0,125 0,5 0,25 0,125 2 1 0,5 125000 62500 31250
0,5 0,5 0,0625 0,0312 1 0,0625 0,0312 62500 31250 15620
0,25 0,5 0,25 0,125 0,5 0,25 0,125 125000 62500 31250
0,25 0,5 0,25 0,125 2 1 0,5 62500 31250 15620
0,5 0,5 0,125 0,0625 0,25 0,0625 0,0312 62500 31250 15620
1 0,5 0,25 0,125 1 0,5 0,25 125000 62500 31250
0,25 0,25 0,063 0,0312 1 0,5 0,125 125000 62500 31250
0,0625 0,5 0,25 0,125 0,25 0,125 0,0625 125000 62500 31250
0,0625 0,25 0,125 0,0625 0,125 0,062 0,031 125000 62500 31250
0,125 0,5 0,25 0,125 0,5 0,25 0,125 125000 62500 31250
0,5 0,25 0,125 0,0625 1 0,5 0,25 62500 31250 15620
0,5 1 0,5 0,25 1 0,5 0,25 125000 62500 31250
0,25 0,25 0,125 0,0625 0,5 0,25 0,125 125000 62500 31250
0,25 0,25 0,125 0,0625 0,25 0,125 0,0625 62500 31250 15620
0,0312 0,125 0,0625 0,0312 0,25 0,125 0,0625 62500 31250 15620
ITC MIL KI
Sensibilidade antifúngica de Sporothrix na fase leveduriforme (FORMA PLANCTÔNICA)
97
Os valores correspondem Densidade Ópitica, no comprimento 492 nm.
Os valores correspondem Densidade Ópitica, no comprimento 540 nm.
AMB
Espécies CIM 100% CIM 100% CIM 80% CIM 50% CIM 100% CIM 80% CIM 50% CIM 100% CIM 80% CIM 50%
S. brasiliensis 4 2 0,5 0,25 2 1 0,5 125000 62500 31250
S. brasiliensis 2 1 0,25 0,125 2 1 0,5 125000 62500 31250
S. brasiliensis 2 4 1 0,5 4 2 1 250000 125000 62500
S. brasiliensis 0,25 1 0,5 0,125 4 2 1 250000 125000 62500
S. brasiliensis 2 0,5 0,25 0,125 4 2 1 125000 62500 31250
S. brasiliensis 0,25 1 0,5 0,25 4 2 1 250000 125000 62500
S. brasiliensis 2 1 0,5 0,25 4 2 1 125000 62500 31250
S. brasiliensis 0,5 0,5 0,25 0,125 2 1 0,5 250000 125000 62500
S. brasiliensis 2 2 0,5 0,125 2 1 0,5 125000 62500 31250
S. brasiliensis 0,5 0,25 0,125 0,0625 2 1 0,5 250000 125000 62500
S. schenckii 0,25 >16 16 2 1 0,5 0,25 125000 62500 31250
S. schenckii 1 0,5 0,25 0,125 2 1 0,5 250000 125000 62500
S. mexicana 1 1 0,25 0,125 2 1 0,5 250000 125000 62500
S. mexicana 1 0,5 0,25 0,0625 2 1 0,5 125000 62500 31250
S. mexicana 2 2 0,25 0,125 2 1 0,5 250000 125000 62500
S. mexicana 4 1 0,25 0,0312 1 0,125 0,0312 125000 62500 31250
S. globosa 0,5 2 0,25 0,125 2 1 0,25 250000 125000 62500
S. globosa 2 1 0,5 0,25 2 1 0,5 250000 125000 62500
Sensibilidade antifúngica de Sporothrix na fase filamentosa (FORMA PLANCTÔNICA)
ITC MIL KI
0,280 0,294 0,254 0,238 0,226 0,215 0,134 0,129 0,236 0,210 0,164 0,158 0,099 0,095 0,251 0,244 0,193 0,187 0,162 0,152 0,234 0,221 0,063 0,052
0,146 0,168 0,157 0,140 0,097 0,094 0,072 0,068 0,153 0,140 0,119 0,111 0,095 0,083 0,156 0,144 0,124 0,111 0,094 0,085 0,109 0,104 0,041 0,033
0,184 0,182 0,241 0,152 0,137 0,101 0,106 0,080 0,173 0,178 0,197 0,142 0,122 0,130 0,148 0,121 0,122 0,102 0,107 0,096 0,100 0,110 0,080 0,077
0,190 0,175 0,166 0,170 0,155 0,142 0,112 0,108 0,171 0,161 0,162 0,155 0,167 0,151 0,173 0,161 0,082 0,077 0,071 0,068 0,163 0,159 0,065 0,060
0,233 0,226 0,221 0,200 0,182 0,174 0,154 0,145 0,182 0,179 0,155 0,147 0,057 0,046 0,217 0,209 0,188 0,181 0,152 0,147 0,181 0,172 0,034 0,028
0,533 0,540 0,468 0,461 0,364 0,359 0,203 0,199 0,484 0,472 0,335 0,327 0,188 0,193 0,452 0,445 0,335 0,327 0,125 0,113 0,414 0,402 0,134 0,129
0,723 0,726 0,685 0,696 0,389 0,391 0,216 0,210 0,609 0,601 0,389 0,384 0,210 0,203 0,521 0,507 0,287 0,297 0,188 0,181 0,592 0,580 0,115 0,101
0,561 0,557 0,447 0,430 0,169 0,157 0,121 0,117 0,464 0,458 0,426 0,414 0,256 0,240 0,482 0,470 0,382 0,375 0,323 0,307 0,431 0,425 0,092 0,084
0,417 0,417 0,367 0,354 0,251 0,246 0,183 0,175 0,308 0,300 0,291 0,284 0,192 0,183 0,364 0,350 0,226 0,213 0,171 0,150 0,277 0,267 0,091 0,088
0,176 0,170 0,178 0,166 0,142 0,135 0,119 0,107 0,177 0,171 0,128 0,123 0,127 0,104 0,173 0,163 0,137 0,121 0,120 0,104 0,134 0,123 0,095 0,087
0,467 0,463 0,437 0,414 0,359 0,353 0,253 0,246 0,412 0,405 0,268 0,251 0,258 0,242 0,431 0,423 0,325 0,316 0,213 0,205 0,271 0,265 0,163 0,158
0,133 0,111 0,127 0,111 0,091 0,089 0,073 0,068 0,117 0,113 0,087 0,098 0,064 0,057 0,112 0,101 0,071 0,068 0,060 0,051 0,089 0,095 0,063 0,057
0,140 0,162 0,145 0,137 0,090 0,082 0,082 0,077 0,156 0,142 0,099 0,089 0,088 0,079 0,135 0,121 0,127 0,115 0,134 0,125 0,118 0,109 0,052 0,044
0,153 0,143 0,153 0,147 0,084 0,098 0,085 0,078 0,156 0,147 0,137 0,121 0,092 0,083 0,115 0,104 0,073 0,056 0,046 0,037 0,080 0,070 0,057 0,050
0,871 0,831 0,701 0,689 0,353 0,349 0,192 0,187 0,791 0,783 0,589 0,596 0,391 0,383 0,725 0,715 0,567 0,553 0,336 0,323 0,567 0,553 0,237 0,230
0,307 0,300 0,264 0,270 0,195 0,182 0,147 0,140 0,271 0,267 0,234 0,222 0,201 0,191 0,299 0,294 0,219 0,212 0,173 0,164 0,281 0,276 0,118 0,109
0,263 0,272 0,243 0,230 0,146 0,139 0,113 0,107 0,201 0,193 0,163 0,150 0,081 0,072 0,226 0,217 0,192 0,185 0,158 0,155 0,162 0,152 0,041 0,035
0,144 0,149 0,119 0,114 0,089 0,095 0,053 0,041 0,137 0,129 0,127 0,116 0,098 0,088 0,139 0,133 0,127 0,114 0,099 0,092 0,125 0,119 0,072 0,067
CIM X 10 CIM X 50 CIMCIM X 50 CIM CIM X 10 CIM X 50 CIM
Iodeto de Potássio
Controle CIM CIM X 10
Anfotericina B
Sensibilidade antifúngica de Sporothrix na fase leveduriforme (FORMA DE BIOFILME) - atividade metabólicaItraconazol Miltefosina
CIM X 10
AMB
Espécies CIM 100% CIM 100% CIM 80% CIM 50% CIM 100% CIM 80% CIM 50% CIM 100% CIM 80% CIM 50%
S. brasiliensis 4 2 0,5 0,25 2 1 0,5 125000 62500 31250
S. brasiliensis 2 1 0,25 0,125 2 1 0,5 125000 62500 31250
S. brasiliensis 2 4 1 0,5 4 2 1 250000 125000 62500
S. brasiliensis 0,25 1 0,5 0,125 4 2 1 250000 125000 62500
S. brasiliensis 2 0,5 0,25 0,125 4 2 1 125000 62500 31250
S. brasiliensis 0,25 1 0,5 0,25 4 2 1 250000 125000 62500
S. brasiliensis 2 1 0,5 0,25 4 2 1 125000 62500 31250
S. brasiliensis 0,5 0,5 0,25 0,125 2 1 0,5 250000 125000 62500
S. brasiliensis 2 2 0,5 0,125 2 1 0,5 125000 62500 31250
S. brasiliensis 0,5 0,25 0,125 0,0625 2 1 0,5 250000 125000 62500
S. schenckii 0,25 >16 16 2 1 0,5 0,25 125000 62500 31250
S. schenckii 1 0,5 0,25 0,125 2 1 0,5 250000 125000 62500
S. mexicana 1 1 0,25 0,125 2 1 0,5 250000 125000 62500
S. mexicana 1 0,5 0,25 0,0625 2 1 0,5 125000 62500 31250
S. mexicana 2 2 0,25 0,125 2 1 0,5 250000 125000 62500
S. mexicana 4 1 0,25 0,0312 1 0,125 0,0312 125000 62500 31250
S. globosa 0,5 2 0,25 0,125 2 1 0,25 250000 125000 62500
S. globosa 2 1 0,5 0,25 2 1 0,5 250000 125000 62500
Sensibilidade antifúngica de Sporothrix na fase filamentosa (FORMA PLANCTÔNICA)
ITC MIL KI
0,563 0,620 0,515 0,509 0,410 0,402 0,257 0,248 0,499 0,491 0,317 0,308 0,277 0,243 0,348 0,355 0,321 0,319 0,226 0,219 0,442 0,450 0,186 0,172
0,786 0,846 0,682 0,677 0,271 0,269 0,216 0,204 0,723 0,710 0,291 0,286 0,225 0,204 0,644 0,636 0,287 0,294 0,158 0,155 0,388 0,392 0,248 0,237
0,679 0,663 0,482 0,475 0,351 0,309 0,287 0,285 0,505 0,570 0,441 0,409 0,367 0,360 0,598 0,588 0,456 0,388 0,250 0,237 0,470 0,471 0,326 0,357
0,393 0,403 0,375 0,366 0,263 0,251 0,175 0,167 0,377 0,386 0,385 0,362 0,287 0,299 0,347 0,330 0,297 0,283 0,132 0,111 0,299 0,306 0,121 0,115
0,803 0,869 0,699 0,686 0,599 0,594 0,371 0,359 0,709 0,702 0,367 0,351 0,369 0,351 0,769 0,761 0,678 0,660 0,547 0,535 0,584 0,577 0,301 0,293
1,213 1,235 0,986 0,979 0,826 0,820 0,621 0,600 1,175 1,163 1,094 1,089 1,054 1,053 1,057 1,040 0,953 0,930 0,420 0,404 0,893 0,881 0,754 0,722
0,664 0,687 0,571 0,567 0,499 0,493 0,463 0,446 0,583 0,561 0,553 0,540 0,482 0,473 0,638 0,615 0,571 0,554 0,332 0,324 0,510 0,507 0,670 0,223
0,889 0,896 0,845 0,839 0,584 0,571 0,531 0,527 0,785 0,776 0,541 0,536 0,479 0,473 0,764 0,750 0,638 0,625 0,221 0,214 0,654 0,634 0,198 0,170
1,377 1,375 1,143 1,115 0,859 0,853 0,795 0,784 1,027 1,018 0,899 0,894 0,781 0,757 1,014 1,004 0,736 0,729 0,653 0,647 1,079 1,087 0,578 0,592
0,545 0,588 0,526 0,538 0,485 0,493 0,345 0,323 0,463 0,459 0,417 0,408 0,389 0,391 0,526 0,516 0,278 0,261 0,142 0,136 0,447 0,436 0,356 0,334
0,858 0,843 0,756 0,731 0,577 0,561 0,347 0,340 0,728 0,714 0,657 0,646 0,575 0,561 0,691 0,680 0,457 0,400 0,246 0,230 0,565 0,544 0,298 0,281
0,317 0,313 0,288 0,296 0,188 0,180 0,131 0,123 0,280 0,299 0,301 0,284 0,241 0,230 0,319 0,306 0,167 0,145 0,122 0,101 0,126 0,117 0,068 0,060
0,388 0,411 0,317 0,308 0,251 0,240 0,229 0,220 0,391 0,384 0,368 0,356 0,326 0,308 0,327 0,316 0,296 0,284 0,265 0,256 0,200 0,196 0,089 0,092
0,229 0,292 0,237 0,240 0,201 0,219 0,200 0,206 0,267 0,253 0,201 0,190 0,162 0,138 0,265 0,245 0,179 0,175 0,145 0,138 0,175 0,156 0,143 0,107
1,545 1,463 1,357 1,339 1,189 1,173 0,981 0,978 1,458 1,474 1,169 1,158 0,801 0,797 1,281 1,263 0,999 0,993 0,763 0,752 0,957 0,963 0,625 0,617
0,380 0,397 0,382 0,377 0,297 0,276 0,237 0,218 0,376 0,385 0,193 0,183 0,157 0,148 0,353 0,322 0,235 0,221 0,098 0,082 0,299 0,291 0,173 0,155
0,962 0,958 0,789 0,797 0,739 0,742 0,518 0,500 0,874 0,864 0,720 0,732 0,662 0,654 0,826 0,665 0,657 0,643 0,422 0,454 0,747 0,739 0,367 0,355
0,412 0,421 0,421 0,404 0,337 0,362 0,253 0,250 0,432 0,412 0,372 0,346 0,361 0,342 0,423 0,408 0,374 0,367 0,271 0,262 0,326 0,317 0,132 0,100
Controle CIM CIM X 10 CIM X 50 CIM CIM X 10 CIM X 50 CIM CIM X 10 CIM X 50 CIM CIM X 10
Anfotericina B Itraconazol Miltefosina Iodeto de Potássio
Sensibilidade antifúngica de Sporothrix na fase leveduriforme (FORMA DE BIOFILME) - Biomassa
98
APÊNDICE C – ARTIGO A SER SUBMETIDO
Efeito Inibitório, in vitro, doIodeto de Potássio e da Miltefosina frente ao Biofilme do
complexo Sporothrix schenckii nas formas filamentosa e leveduriforme
Autores: Raimunda Sâmia Nogueira Brilhantea*
, Maria Lucilene Queiroz da Silvaa, Glaucia
Morgana de Melo Guedesa, Lana Glerieide Silva Garcia
a, Jonathas Sales de Oliveira
a, Juliana
Maria Maciela, José Júlio da Costa Sidrim
a, Rossana de Aguiar Cordeiro
a, Débora de Souza
Collares Maia Castelo-Brancoa, Waldemiro de Aquino Pereira-Neto
c, Zoilo Pires de
Camargoc, Marcos Fábio Gadelha Rocha
b.
aSpecialized Medical Mycology Center, Postgraduate Program in Medical Microbiology,
Department of Pathology and Legal Medicine Federal University of Ceará, Fortaleza, Ceará,
Brazil
bCollege of Veterinary Medicine, Postgraduate Program in Veterinary Sciences, State
University of Ceará, Fortaleza, Ceará, Brazil
cDepartment of Microbiology, Imunology and Parasitology, São Paulo Federal University,
São Paulo,Brazil
*Corresponding Author: R.S.N. Brilhante. Rua Barão de Canindé, 210; Montese. CEP:
60.425-540. Fortaleza, CE, Brazil. Fax: 55 85 3366-8303 E. mail: [email protected].
99
RESUMO
Sabe-se que a maior parte das infecções são ocasionadas por microrganismos associados em
biofilme e estudos demonstram que o fungo dimórfico, pertencente ao complexo Sporothrix
schenkii, agente etiológico da esporotricose, também é capaz de formar biofilme. Os micro-
organismos quando associados em biofilme, podem desenvolver resistência aos
antimicrobianos. O objetivo desde estudo foi avaliar a capacidade do complexo S. schenckiide
formar biofilme na forma leveduriforme,in vitro, assim como caracterizar a cinética de
crescimento e a sensibilidade dos biofilmes na forma filamentosa e leveduriforme ao iodeto
de potássio (KI) e à miltefosina (MIL). Foram utilizadas 18 cepas do complexo S. schenckii
(10 S. brasiliensis, 4 S. mexicana, 2 S. globosa e 2 S. schenckii stricto sensu). Para a formação
dos biofilmes leveduriformes foram utilizados inóculos na concentração de aproximadamente
1 x 106
UFC/mL em solução salina 0,9% e a maturação foi feita em meio RPMI. Para a
cinética de crescimento e a sensibilidade dos biofilmes foram realizadas as técnicas de
atividade metabólica e avaliação da biomassa. Para a sensibilidade plânctônica foi utilizada a
técnica de diluição em caldo, conforme metodologias do CLSI. E para a morfologia dos
biofilmes foram avaliadas pela microscopia óptica, MEV e confoval. O tempo de maturação
dos biofilmes leveduriformes, foram em média de 96 h. Os resultados mostraram que KI e
MIL tiveram efeito inibitório frente a todas as cepas, na forma planctônica, nas formas
filamentosa e leveduriforme. Os valores de CIM variaram de 62,5 a 250 mg/mL para KI e de
0,125 a 4 µg/mL para MIL. Em seguida testou-se as drogas frente aos biofilmes maduros de
Sporothrix spp., nas concentrações de CIM, 10xCIM e 50xCIM. A atividade metabólica e a
biomassa dos biofilmes filamentosos, foi inibida pelo KI (10xCIM) com média de 75,4%e a
MIL(50xCIM) inibiu em média,55,1%. Para os biofilmes na forma leveduriforme, a média de
inibição para KI (10 x CIM)e MIL (50 x CIM) foi de 67,7% e 51,6%, respectivamente. Este
estudo demostrou que as cepas das diversas espécies do complexo S.schenckii na forma
leveduriforme são capazes de formar biofilme in vitro, e que o iodeto de potássio e a
miltefosina possuem efeito inibitório frente aos biofilmes filamentosos e leveduriformes.
Palavras-chave:Sporothrix schenckii. Iodeto de potássio. Miltefosina. Sensibilidade.
Biofilme.
100
ANEXO A – ARTIGO PUBLICADO