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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

FACULDADE DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA

MONALISA RIBEIRO SILVA

AVALIAÇÃO DO EFEITO NEUROPROTETOR DO ÁCIDO VALPRÓICO

SOZINHO OU ASSOCIADO AO LÍTIO EM MODELO DE ISQUEMIA

GLOBAL TRANSITÓRIA EM RATOS

FORTALEZA

2016



SOZINHO OU ASSOCIADO AO LÍTIO EM MODELO DE ISQUEMIA GLOBAL

TRANSITÓRIA EM RATOS

Tese submetida à Coordenação do Curso de

Pós-Graduação em Farmacologia da

Faculdade de Medicina da Universidade

Federal do Ceará, como requisito para

obtenção do título de Doutor em

Farmacologia.

Orientador: Profª. Drª. Glauce Socorro

Barros Viana

FORTALEZA

2016



SOZINHO OU ASSOCIADO AO LÍTIO EM MODELO DE ISQUEMIA GLOBAL

TRANSITÓRIA EM RATOS

Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia da

Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para

obtenção do título de Doutor em Farmacologia.

Aprovada em: ____/_____/_____

BANCA EXAMINADORA

______________________________________________________________________

Profa. PhD. Glauce Socorro Barros Viana (Orientadora)

Universidade Federal do Ceará – UFC

______________________________________________________________________

Profa. Dra. Danielle Macêdo Gaspar


______________________________________________________________________

Profa. Dra. Francisca Cléa Florenço de Sousa


______________________________________________________________________

Prof. Dr. Giovany Michely Pinto da Cruz

Faculdade de Medicina Estácio de Juazeiro do Norte – ESTÁCIO FMJ

______________________________________________________________________

Prof. Dr. José Christian Machado Ximenes

Centro Universitário Christus - UNICHRISTUS

Jesus Cristo,

tu tens me cumulado de graça.

Eu reconheço e repito, é graça!

A ti a minha eterna gratidão.

AGRADECIMENTOS

Meus pais, Idelfonso e Zenaide, meus exemplos de luta e determinação. O sim de

vocês a Deus trouxe-me a vida. Obrigado pela educação e por acreditarem nos meus

planos. Painho, amo você! Mainha, amo você!

À minha estimada orientadora, Profª. Dra. Glauce Socorro de Barros Viana,

agradeço pelo seu “sim” que abriu portas à minha carreira acadêmica e pela confiança

investida em mim. A senhora é especial! Agradeço pelos ensinamentos, paciência,

compreensão, atenção, dedicação, amizade, pela força e vitalidade do seu exemplo.

Às queridas Kelly Rose e Vilani, que mesmo de longe, deram-me o suporte

necessário para a realização de alguns experimentos e pela amizade sincera.

Ao casal de amigos Daniel Luna e Elaine Cristina pela contribuição no trabalho

e amizade sincera.

Aos meus alunos de iniciação científica da Estácio/FMJ: Keicinha, Danieli,

Gabriel, Lucas, Jonatas, Alyne, Luís, Jéssica, Steffany e Andréia. Agradeço pela

dedicação e compromisso na realização de alguns experimentos.

Aos técnicos do laboratório de Biofisiologia da Estácio/FMJ: Viviane, Auri e

Janice, pela contribuição no trabalho e amizade.

Às amigas, Natália Bitu, Camila Nobre, Ana Luiza, Elisabeth Nobre e ao amigo

Giovany cruz pela amizade sincera e apoio nos momentos mais difíceis.

À todos da Faculdade Estácio de Medicina de Juazeiro do Norte (Estácio-FMJ),

pelo apoio e parceria fundamentais para realização desta pesquisa.

Aos funcionários do departamento de Fisiologia e Farmacologia da UFC.

À todos que de uma forma direta ou indireta contribuíram para essa minha

conquista.

Meu muito obrigada!!!

‘‘A alegria está na luta, na tentativa, no sofrimento

envolvido e não na vitória propriamente dita.’’

Mahatma Gandhi

RESUMO


SOZINHO OU ASSOCIADO AO LÍTIO EM MODELO DE ISQUEMIA

GLOBAL TRANSITÓRIA EM RATOS

Introdução/Objetivos: O acidente vascular cerebral é uma condição patológica

decorrente da oclusão ou rompimento de vasos sanguíneos precipitando uma cascata de

eventos que envolvem excitotoxicidade, inflamação, estresse oxidativo e morte celular.

O AV vem apresentando efeitos neuroprotetores em modelos animais e celulares de

doenças neurodegenerativas, incluindo acidente vascular cerebral. Com isso,

objetivamos estudar os efeitos neuroprotetores do AV associado e não ao lítio em

modelo experimental de isquemia cerebral global em ratos. Métodos: O tratamento

iniciou 1h antes da cirurgia e sete dias após com AV (25, 50 e 100 mg/kg/dia, v.o.) e

AV nas mesmas doses associando ao lítio (10 mg/kg, i.p.). Os animais foram

anestesiados com Ketamina (75 mg/kg, i.p.) e Xilazina 2% (10 m/kg, i.p.) e submetidos

à isquemia cerebral global durante 30 min e reperfusão. Após 7 dias foram realizados

os testes comportamentais, campo aberto e labirinto aquático. Em seguida, foram

eutanasiados e o corpo estriado, córtex e hipocampo foram dissecados. O corpo estriado

foi utilizado na preparação de homogenatos para dosagem de Dopamina e DOPAC em

HPLC. Homogenatos de estriado, hipocampo e córtex foram preparados para avaliar a

atividade antioxidante com dosagem de malondialdeído (MDA) e nitrito. Fatias de

hipocampo foram separadas para a imunohistoquímica (iNOS, COX-2, TNF-α, GSK-3 e

HDAC). Cortes coronais do cérebro foram utilizados para determinar o percentual da

área de dano isquêmico cerebral por disfunção mitocondrial (TTC). Resultados: O dano

isquêmico reduziu a atividade locomotora dos animais e o tratamento com AV

associado e não ao lítio reverteu este efeito; assim como a memória espacial que foi

recuperada após tratamento com AV e lítio em todas as doses utilizadas. A lesão no

corpo estriado refletiu em redução nos níveis de monoaminas e estes valores foram

aumentados com uso do AV associado e não ao lítio. Os níveis de MDA e nitrito foram

significativamente aumentados em estriado, córtex e hipocampo quando comparados ao

grupo controle. O tratamento com AV protegeu o estriado apenas na menor dose 25

mg/kg, mas no córtex e hipocampo a proteção foi efetiva em todas as doses utilizadas.

Além disso, houve uma diminuição nas células imunocoradas para iNOS, COX-2, TNF-

α, GSK-3 e HDAC nos grupos tratados com AV associado e não ao lítio em

comparação com o grupo isquemiado. O AV associado e não ao lítio reduziu a área de

infarto cerebral em todas as doses prevenindo os animais dos déficits neurológicos após

a isquemia cerebral. Conclusão: O tratamento dos animais com AV associado e não ao

lítio exerceu propriedades neuroprotetoras contra danos comportamentais e cognitivos,

neuroquímicos e histológicos, em modelo de isquemia cerebral global. Contudo, a

combinação de AV e lítio demonstrou aumentar os benefícios terapêuticos pós-dano

isquêmico. Com isso, levanta-se a possibilidade de que o co-tratamento de ácido

valpróico com lítio pode produzir efeitos sinérgicos ou mais fortes contra a morte de

células neuronais em condições neurodegenerativas.

Palavras-chave: Ácido valpróico, Lítio, Isquemia Cerebral Global, Efeitos

Neuroprotetores, Doenças Neurodegenerativas.

ABSTRACT

EVALUATION OF THE NEUROPROTECTIVE EFFECT OF VALPROIC

ACID ALONE OR ASSOCIATED WITH LITHIUM IN ISCHEMIA MODEL

GLOBAL TRANSIENT IN RATS

Introduction / Objectives: Stroke is a pathological condition resulting from occlusion

or rupture of blood vessels precipitating a cascade of events that involve excitotoxicity,

inflammation, oxidative stress and cell death. The VA has been presenting

neuroprotective effects in animal models and cell of neurodegenerative diseases,

including stroke. Thus, we aimed to study the neuroprotective effects associated VA

and not to lithium in an experimental model of global cerebral ischemia in rats.

Methods: The treatment started 1 hour before the surgery and 7 days with VA (25, 50

and 100 mg / kg / day , V.O.) and VA in the same doses associating to lithium (10 mg /

kg, i.p. ). The animals were anesthetized with ketamine (75 mg / kg, i.p.) and xylazine 2

% (10 m / kg, i.p.) and submitted to the global cerebral ischaemia and reperfusion for 30

min. After seven days were performed behavioral tests, open field and water maze.

Then, they were euthanized and striatum, cortex and hippocampus were dissected. The

striatum was used for the preparation of homogenates for dosage Dopamine and

DOPAC HPLC. Homogenates of striatum, hippocampus and cortex were prepared to

evaluate the antioxidant activity with malondialdehyde for dosage (MDA) and nitrite.

Coronal sections of the brain were used to determine the percentage of the area of

cerebral ischemic damage mitochondrial dysfunction (TTC). Hippocampal Slices were

separated for immunohistochemistry (iNOS, COX -2, TNF- α, GSK-3 e HDAC).

Results: The ischemic damage reduced the locomotor activity of animals and treatment

with associated VA and not to lithium reversed this effect; as well as memory space that

was recovered after treatment with lithium VA at all the doses used. The lesion in the

striatum reflected in a reduction in the levels of monoamines and these values were

increased with the use of associated and not to lithium VA. MDA and nitrite levels were

significantly increased in striatum, hippocampus and cortex compared with the control

group. Treatment with protected VA spline only at the lowest dose 25 mg / kg , but the

cortex and hippocampus protection was effective at all doses used. Furthermore, there

was a decrease in cells immunostained for iNOS, COX -2, TNF- α, GSK -3 and HDAC

the groups treated with associated AV and not to lithium compared to the ischemic

group. The VA and not associated with lithium reduced the cerebral infarct area at all

doses preventing the animals from neurological deficits after cerebral ischemia.

Conclusion: Treatment of animals with VA associated and not to lithium exerted

neuroprotective properties against behavioral and cognitive, neurochemical and

histological damage in global cerebral ischemia model. However, the combination of

VA and lithium show to increase post- ischemic damage therapeutic benefits. Thereby,

the possibility arises that co-treatment with lithium and valproic acid can produce

stronger or synergistic effects against neuronal cell death in neurodegenerative

conditions.

Keywords: Valproic Acid, Lithium, Cerebral Ischemia Global, Neuroprotective Effects,

Neurodegenerative Diseases.

LISTA DE FIGURAS

Figura 01. Diagrama sistemático da sinapse glutamatérgica em condições normais e em

condições isquêmicas (Adaptado de ALLEN et al., 2004).

26

Figura 2. Estrutura química do ácido valpróico. Fonte: USP 33, 2010.

29

Figura 03. Fonte: http://www.auladeanatomia.com/cardiovascular/arterias.htm

36

Figura 04: Procedimento cirúrgico, incisão medial na altura da traquéia com exposição da

carótida. Fonte: Estácio FMJ. SANTOS (2016).

41

Figura 05. Teste para avaliar a atividade locomotora no aparato do campo aberto. Aparato do

campo aberto do Laboratório de Biofisiologia e Farmacologia, Estácio FMJ. Fonte: SANTOS

(2015).

43

Figura 06. Labirinto aquático. Adaptado de Richard G. Morris (1981). Disponível em:

http://en.wikipedia.org. Acesso em: 20/01/2016.

44

Figura 07- Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado ao Li (10mg/kg, ip)

sobre a atividade locomotora de ratos no teste do campo aberto. Os valores representam a média

± EPM do número de cruzamentos durante 5 min.

52


sobre a atividade rearing de ratos no teste do campo aberto. Os valores representam a média ±

EPM do número de rearing durante 5 min.

54


sobre a atividade grooming de ratos no teste do campo aberto. Os valores representam a média

± EPM do número de grooming durante 5 min.

56

Figura 10- Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado ao Li (10mg/kg, ip) no

teste de labirinto aquático. Os valores representam a média ± EPM do número de grooming

durante 5 min.

59

http://www.auladeanatomia.com/cardiovascular/arterias.htm

Figura 11- Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) ou associado ao lítio sobre as concentrações

de DA em corpo estriado de ratos após serem submetidos à isquemia cerebral global através de

HPLC. Os valores representam a média ± EPM.

62


sobre as concentrações de DOPAC em corpo estriado de ratos após serem submetidos à

isquemia cerebral global através de HPLC. Os valores representam a média ± EPM.

63

Figura 13- Efeitos da AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado ao Li (10 mg/kg ip)

sobre os níveis de malondialdeído (MDA), utilizado como índice de peroxidação lipídica, no

corpo estriado de ratos após serem submetidos à isquemia cerebral global. Os valores

representam a média ± EPM.

66

Figura 14 - Efeitos da AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado ao lítio (10 mg/kg ip)

sobre os níveis de malondialdeído (MDA), utilizado como índice de peroxidação lipídica, no

córtex pré-frontal de ratos após serem submetidos à isquemia cerebral global. Os valores


68

Figura 15 - Efeitos da ácido valpróico (25, 50 e 100mg/kg, vo) associado ou não ao lítio (10

mg/kg ip) sobre os níveis de malondialdeído (MDA), utilizado como índice de peroxidação

lipídica, no hipocampo de ratos após serem submetidos à isquemia cerebral global. Os valores


71

Figura 16 - Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado ao lítio (10mg/kg, ip)

sobre a concentração de nitrito no corpo estriado de ratos 7 dias após serem submetidos à

isquemia cerebral global. Os valores representam a média ± EPM.

74

Figura 17 - Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado ao lítio (10mg/kg, ip)

sobre a concentração de nitrito no córtex pré-frontal de ratos 7 dias após serem submetidos à


76

Figura 18 - Efeitos do ácido valpróico (25, 50 e 100mg/kg, vo) associado ou não ao lítio

(10mg/kg, ip) sobre a concentração de nitrito no hipocampo de ratos 7 dias após serem

78

submetidos à isquemia cerebral global. Os valores representam a média ± EPM.

Figura 19 - Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para iNOS na área

CA1 hipocampal 7 dias após a isquemia em ratos tratados com AV nas doses de 50 e 100

mg/kg. Escala 200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a quantificação da densidade óptica obtida

através do programa Image J®. ANOVA de uma via seguido por Newman Keuls como teste

post hoc.

81


CA3 hipocampal 7 dias após a isquemia em ratos tratados com AV nas doses de 50 e 100

mg/kg. Escala 200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a quantificação da densidade óptica obtida


post hoc.

81


do córtex (CT) após a isquemia em ratos tratados com AV nas doses de 50 e 100 mg/kg. Escala

200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a quantificação da densidade ótica obtida através do

programa Image J®. ANOVA de uma via seguido por Newman Keuls como teste post hoc.

82

Figura 22 – Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para iNOS na área

do giro dentado (GD) após a isquemia em ratos tratados com AV nas doses de 50 e 100 mg/kg.

Escala 200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a quantificação da densidade ótica obtida através

do programa Image J®. ANOVA de uma via seguido por Newman Keuls como teste post hoc.

82

Figura 23 – Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para COX-2 na área

CA1 hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas doses de 50 e 100 mg/kg.


do programa Image J®. ANOVA de duas vias seguido por Newman Keuls como teste post hoc.

84




do programa Image J®. ANOVA de duas vias seguido por Newman Keuls como teste post hoc.

84


CT hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas doses de 50 e 100 mg/kg. Escala


programa Image J®. ANOVA de duas vias seguido por Newman Keuls como teste post hoc.

85

Figura 26 – Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para COX-2 no giro

dentado (GD) hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas doses de 50 e 100

mg/kg. Escala 200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a quantificação da densidade ótica obtida

através do programa Image J®. ANOVA de duas vias seguido por Newman Keuls como teste

post hoc.

85

Figura 27 – Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para TNF-α na área




86





87

Figura 29 – Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para TNF-α no CT

hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas doses de 50 e 100 mg/kg. Escala



87

Figura 30 – Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para TNF-α no GD

hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas doses de 50 e 100 mg/kg. Escala



88




89






90

Figura 33 – Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para TNF-α no giro

dentado (GD) hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas doses de 50 e 100

mg/kg. Escala 200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a quantificação da densidade ótica obtida


post hoc.

91

Figura 34 – Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para GSK-3 na área

CA1 hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas doses 100 mg/kg e lítio. Escala



92

Figura 35 – Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para GSK-3 no CT

hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas doses de 100 mg/kg e lítio. Escala



93

Figura 36 – Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para gsk-3 no GD

hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas doses de 100 mg/kg e lítio. Escala



93

Figura 37 – Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para HDAC na área

CA1 hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas doses de 100 mg/kg sozinho e

associado ao lítio. Escala 200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a quantificação da densidade

ótica obtida através do programa Image J®. ANOVA de uma via seguido por Newman Keuls

como teste post hoc.

95

Figura 38 – Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para HDAC no GD

hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas doses de 100 mg/kg sozinho e

96

associado ao lítio. Escala 200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a quantificação da densidade

ótica obtida através do programa Image J®. ANOVA de uma via seguido por Newman Keuls

como teste post hoc.

Figura 39 - Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) associado ou não ao lítio (10mg/kg, ip)

sobre o dano cerebral de ratos submetidos à isquemia cerebral. Os valores representam a média

± EPM. Para análise estatística foi utilizado ANOVA de uma via seguido por Newman Keuls

como teste post hoc. Valores significativos com p<0,05. a e b quando comparado ao grupo falso

operado (FO) e isquemiado (ISQ), respectivamente.

97

Figura 40 - Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) associado ou não ao lítio (10mg/kg, ip)

sobre o dano cerebral de ratos submetidos à isquemia cerebral. Os valores representam a média

± EPM. Para análise estatística foi utilizado ANOVA de uma via seguido por Newman Keuls

como teste post hoc. Valores significativos com p<0,05. a e b quando comparado ao grupo falso

operado (FO) e isquemiado (ISQ), respectivamente.

98

LISTA DE ABREVIATURAS

ACM Artéria cerebral média

ALE Atividade locomotora espontânea

ANOVA Análise de variância

ATP Adenosina trifosfato

AVE Acidente vascular encefálico

AVCi Acidente vascular encefálico isquêmico

AVP Ácido valpróico

BDNF Fator neurotrófico derivado do encéfalo

CA Corno Amon

CEPA Comissão de Ética em Pesquisa Animal

CONCEA Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal

COX-2 ciclooxigenase-2

CT Córtex cerebral

CTE Cadeia de transporte de elétrons

CXCR4 Receptor de quimioquina CXC4

DA Dopamina

DAB Diaminobenzidina

DAG Diacilglicerol

DMSO Dimetilsulfóxido

DNA Ácido desoxirribonucleico

DOPAC Ácido 3,4-diidroxifenilacético

EPM Erro padrão da média

ERK Proteína cinase regulada por sinal extracelular

EROs Espécies reativas de oxigênio

ERNs Espécies reativas de nitrogênio

FO Falso-operado

FDA Food and Drug Administration

GABA Ácido gaba-aminobutírico

GD Giro denteado

GRP78 Proteína de estresse do retículo endoplasmático

GSK-3 Glicogênio sintase quinase 3

HAT Histona acetil transferase

HDACs Histonas desacetilases

HPLC High Performance Liquid Chromatography

ICG Isquemia cerebral global

ICT Isquemia cerebral transitória

IMP Inositol monofosfatase

ISQ Isquemiados

IL-1β Interleucina-1 beta

LCR Líquido cefalorraquidiano

MDA Malondialdeído

MME Membrana mitocondrial externa

MMI Membrana mitocondrial interna

NF-kB Fator nuclear kappa b

NMDA N-Metil-D-Aspartato

NO Óxido nítrico

NOS Óxido nítrico sintase

iNOS Óxido nítrico sintase induzida

PIP2 Fosfatidilinositol 4,5 bisfosfato

PKC Proteína cinase C

RLs Radicais livres

RNA Ácido ribonucleico

SDF-1α Fator derivado de célula estromal

SNC Sistema nervoso central

TBARS Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico

TNF-α Fator de necrose tumoral-alfa

LISTA DE QUADROS

Quadro 01. Principais modelos de isquemia cerebral. 34

LISTA DE TABELAS

Tabela 01 – Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado ao Li

(10mg/kg, ip) sobre a atividade locomotora de ratos após serem submetidos à

isquemia cerebral global no teste do campo aberto.

53


(10mg/kg, ip) sobre a atividade de rearing de ratos após serem submetidos à


55


(10mg/kg, ip) sobre a atividade grooming de ratos após serem submetidos à


57


(10mg/kg, ip) no teste de labirinto aquático.

60

Tabela 05 - Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado ao lítio

sobre as concentrações de dopamina e DOPAC em corpo estriado de ratos após

serem submetidos à isquemia cerebral global através de HPLC.

64

Tabela 06 - Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado ao Li

(10 mg/kg ip) sobre os níveis de malondialdeído (MDA) utilizado como índice de

peroxidação lipídica, no estriado de ratos após serem submetidos à isquemia

cerebral global.

67

Tabela 07 - Efeitos do ácido valpróico (25, 50 e 100mg/kg, vo) associado ou não

ao lítio (10 mg/kg ip) sobre os níveis de malondialdeído (MDA), utilizado como

índice de peroxidação lipídica, no córtex de ratos após serem submetidos à

isquemia cerebral global.

69


ao lítio (10 mg/kg ip) sobre os níveis de malondialdeído (MDA), utilizado como

índice de peroxidação lipídica, no hipocampo de ratos após serem submetidos à

72

isquemia cerebral global.


ao lítio (10mg/kg, ip) sobre os níveis de nitrito no estriado de ratos 7 dias após

serem submetidos à isquemia cerebral global.

75


ao lítio (10mg/kg, ip) sobre os níveis de nitrito no córtex pré-frontal de ratos 7 dias

após serem submetidos à isquemia cerebral global.

77


ao lítio (10mg/kg, ip) sobre os níveis de nitrito no hipocampo de ratos 7 dias após


79

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 19

1.1 Acidente Vascular Cerebral (AVC) 19

1.1.1 Definição e Classificação 19

1.1.2 Epidemiologia 20

1.2 Aspectos Fisiopatológicos do Acidente Vascular Cerebral

Isquêmico

21

1.2.1 AVC Isquêmico e Neuroinflamação 21

1.2.2 Estresse oxidativo 23

1.2.3 Excitotoxicidade e Ca2+ 25

1.2.4. A mitocôndria e o AVC 27

1.3 Ácido Valpróico 28

1.3.1. Farmacologia clínica 28

1.3.2 Histonas Desacetilases (HDACs) e o Ácido valpróico como inibidor de

HDACs

30

1.3.3 Ácido Valpróico e Lítio 32

1.4 Modelos experimentais do AVC isquêmico 34

2. RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA 38

3.OBJETIVOS 39

Geral 39

Específicos 39

4. METODOLOGIA 40

4.1 Animais 40

4.2 Drogas e reagentes 40

4.3 Modelo experimental de isquemia cerebral global 40

4.4 Estudo comportamental 43

4.4.1 Teste do Campo Aberto ou “Open Field” 43

4.4.2 Teste do Labirinto Aquático (Water Maze) - Memória Espacial 44

4.4.3 Avaliação de neurotransmissores, marcadores do estresse oxidativo e

mediadores inflamatórios

45

4.4.3.1 Dissecção das áreas cerebrais 45

4.4.3.2 Determinação dos níveis de monoaminas e metabólitos através de HPLC 45

4.4.3.3 Determinação da peroxidação lipídica através da dosagem de substâncias

reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS)

47

4.4.3.4 Determinação do conteúdo de nitrito 47

4.4.3.5 Avaliação da Área de Infarto Cerebral Isquêmico - Cloreto de 2,3,5

Trifeniltetrazol (TTC)

48

4.4.3.6 Avaliação da expressão da iNOS, COX-2 e TNF-α. 49

4.5 Análise estatística 50

5. RESULTADOS 51

5.1 Testes comportamentais 51

5.1.1 Efeitos do ácido valpróico em associação e não com o lítio sobre a atividade

locomotora através do teste do campo aberto em ratos após serem submetidos à

isquemia cerebral global transitória

51

5.1.2 Efeitos do ácido valpróico em associação e não com o lítio sobre o

aprendizado e a memória espacial no teste do labirinto aquático em ratos após

serem submetidos à isquemia cerebral global

58

5.2 Resultados: Dosagem de Monoaminas através de HPLC 61

5.2.1 Efeitos do ácido valpróico associado e não ao lítio sobre os níveis de DA e

DOPAC no corpo estriado de ratos após serem submetidos à isquemia cerebral

global

61

5.3 Atividade antioxidante 65

5.3.1 Efeitos do ácido valpróico associado e não ao lítio sobre a peroxidação

lipídica (tbars) no estriado, córtex cerebral e hipocampo de ratos após serem

submetidos à isquemia cerebral global

65

5.3.2 Efeitos do ácido valpróico associado e não ao lítio sobre a concentração de

nitrito no estriado, córtex cerebral e hipocampo de ratos após serem submetidos à

isquemia cerebral global

73

5.4 Análise histológica e imunohistoquímica 80

5.4.1 Efeitos do ácido valpróico sozinho ou associado ao lítio na imunomarcação

para a enzima óxido nítrico sintase induzida (iNOS) nas áreas CA1, CA3, CT e

GD do hipocampo de ratos jovens submetidos à isquemia cerebral global

80


para enzima ciclooxigenase – 2 (COX-2) nas áreas CA1, CA3, CT e GD do

hipocampo de ratos jovens submetidos à isquemia cerebral global

83


para fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) nas áreas CA1, CA3, CT e GD do


86


para a glicogênio sintase cinase-3 (GSK-3) nas áreas CA1, CT e GD do


92


para a histona desacetilase (HDAC) nas áreas CA1 e GD do hipocampo de ratos

jovens submetidos à isquemia cerebral global

94

5.4 Efeitos do ácido valpróico associado e não ao lítio sobre o dano cerebral de

ratos após serem submetidos à isquemia cerebral global.

97

6. DISCUSSÃO 99

7. CONCLUSÕES

110

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 111

P á g i n a | 24

1. INTRODUÇÃO

1.1 Acidente Vascular Cerebral (AVC)

1.1.1 Definição e Classificação

O acidente vascular cerebral (AVC) é uma condição patológica decorrente da

oclusão ou rompimento de vasos sanguíneos, sendo caracterizado pela redução

acentuada ou ausência de suplementos orgânicos ao cérebro como oxigênio e uma série

de substratos vitais. Em geral o acidente vascular encefálico induz morte ou disfunção

de células cerebrais, bem como prejuízos neurológicos que refletem na localização e no

tamanho da área cerebral atingida. O AVC é comumente dividido em duas categorias, a

primeira e mais frequente é o AVC isquêmico ou tromboembólico, o qual se deve a uma

interrupção do suprimento sanguíneo resultante da oclusão de um vaso, a segunda

categoria é o AVC hemorrágico, o qual envolve sangramento no parênquima cerebral

ou no espaço subaracnóideo (BROUNS; DE DEYN, 2009).

O AVC isquêmico representa cerca de 80% de todos os casos registrados no

mundo, sendo desencadeado a partir da oclusão das principais artérias que levam sangue

ao encéfalo, as artérias carótidas e as artérias vertebrais, em decorrência da formação de

um trombo, refletindo em uma menor mortalidade (15 a 20%), quando comparado ao

AVC hemorrágico (BROUNS; DE DEYN, 2009). Os mecanismos que conduzem a

morte celular durante a evolução do quadro são de extrema complexidade, incluindo

neuroinflamação, excitotoxicidade, desequilíbrio iônico e estresse oxidativo (LO et al.,

2003). A integridade do cérebro depende do contínuo suprimento de sangue, de

oxigênio e glicose, de modo a atender às demandas energéticas do tecido. A cessação ou

redução intensa do fluxo sanguíneo cerebral resulta em déficits funcionais e

bioquímicos que se tornam rapidamente irreversíveis, caso o fluxo sanguíneo não seja

prontamente restaurado (BRUNO et a., 2009).

O AVC isquêmico promove uma lesão irreversível e subseqüente disfunção

neurofisiológica afetando principalmente a memória e a aprendizagem. Eventos como a

ativação de receptor de glutamato, o aumento no nível de cálcio intracelular e a

formação de espécies reativas de oxigênio (EROs) são conhecidos na patogênese da

lesão neuronal decorrentes da isquemia cerebral. O edema e a resposta inflamatória

P á g i n a | 25

exacerbam a destruição do tecido. Assim, abordagens para melhorar a lesão cerebral

induzida pela isquemia têm sido investigadas, incluindo a interferência da ação

excitatória do glutamato, prevenção da sobrecarga de cálcio intracelular e remoção das

EROs (OKABE et al., 2011).

O diagnóstico do AVC é feito por meio de uma avaliação neurológica, onde a

observação da presença de sinais clínicos é fundamental, tais como, déficits motores,

alterações na marcha e na fala. No entanto, a tomografia computadorizada (TC) do

crânio é o principal exame para o desfecho do diagnóstico e a agilidade no atendimento

permite um prognóstico diferencial na reabilitação do paciente. Fármacos como,

anticoagulantes (heparina) e antiplaquetários (ácido acetil-salicílico) são os principais

medicamentos utilizados na clínica (PERSSON et al., 2014).

Com isso, a busca por terapias bem sucedidas ainda são objetos de estudos

experimentais e clínicos em modelos animais já estabelecidos, visto que alguns estudos

mostram que drogas como ácido valpróico e lítio exibem propriedades neuroprotetoras e

podem exercer efeitos benéficos sobre a isquemia cerebral e outras doenças cerebrais.

1.1.2 Epidemiologia

De acordo com dados da Organização Mundial de Saúde (OMS, 2013), entre os

anos de 2000 e 2011, o AVC representa a segunda causa de morte em todo o mundo,

sendo responsável por cerca de seis milhões de mortes por ano. Em muitos países

latino-americanos e caribenhos, o AVC já é a primeira ou segunda causa de morte,

embora na última década, as taxas estejam em declínio (LAVADOS et al., 2007). O

Ministério da Saúde revela que o AVC é a principal causa de morte no Brasil e os dados

são crescentes. No ano de 2000 foram notificadas 84.130 mortes e em 2010 esse

número aumentou para 99.726 (SCHIMIDT, 2014).

Segundo a Associação Brasileira de AVC, o acidente vascular encefálico é a

primeira causa de morte e incapacidade no Brasil, com grande impacto econômico e

social. É a segunda causa de morte no mundo segundo dados da OMS. Atinge

aproximadamente 16 milhões de pessoas por ano, e destas 6 milhões chegam à óbito.

No Brasil ocorrem cem de 100 mil óbitos por ano devido ao AVE (LOTUFO, 2005;

WHO, 2011).

De acordo com a Sociedade Beneficente Israelita Brasileira Albert Einstein

(2011), os sintomas mais comuns do AVC são enfraquecimento, adormecimento ou

P á g i n a | 26

paralisia da face, dificuldade de falar e deglutir, alteração na visão, tontura e fortes

dores de cabeça. É freqüente em adultos, sendo uma das maiores causas de morbi-

mortalidade em todo o mundo (EINSTEIN, 2011; GILES; ROTHWELL, 2008).

No Brasil, apesar do declínio nas taxas de mortalidade, ainda é a principal causa

de morte. A incidência de AVC dobra a cada década após os 55 anos (RODGERS,

2004), ocupando posição de destaque entre a população idosa. A prevalência mundial na

população geral é estimada em 0,5% a 0,7%. Além de elevada mortalidade, a maioria

dos sobreviventes apresenta seqüelas, com limitação da atividade física e intelectual e

elevado custo social (NICOLETTI et al., 2000).

O AVC pode levar à incapacidade indivíduos em idade produtiva e isso tem um

impacto econômico relevante. Dados do Instituto Nacional de Seguridade Social

demonstram que o AVC é responsável por 40% das aposentadorias precoces no Brasil

(FALCÃO et al., 2004). Os principais fatores de risco para o AVC são dislipidemia,

hipertensão arterial, diabetes mellitus, sedentarismo, obesidade e tabagismo (ZHENG,

2014).

1.2 Aspectos Fisiopatológicos do Acidente Vascular Cerebral Isquêmico

1.2.1 AVC Isquêmico e Neuroinflamação

O AVC isquêmico, ou simplesmente, isquemia encefálica desencadeia um

evento multifatorial e de extrema complexidade em que a inflamação contribui para o

dano cerebral. Isto é evidente na circulação sistêmica como a neutrofilia, o

linfocitopenia e níveis aumentados dos monócitos. Ocorre um rápido acúmulo de

neutrófilos no cérebro e transmigração de moléculas de adesão que são associados com

a sinalização de citocinas (ROSS et al., 2007).

Muitas pesquisas têm mostrado que a inflamação se desenvolve dentro de

algumas horas após isquemia cerebral . Esta reação inflamatória envolve o acúmulo de

neutrófilos, monócitos e leucócitos no cérebro. O dano induz a produção e liberação de

citocinas, tais como TNF-α, IL-1ß, IL-6 e iNOS, por uma variedade de células, como

células endoteliais, microglia, neurônios, leucócitos, plaquetas, monócitos, macrófagos

e fibroblastos (FEUERSTEIN, 1994; HUANG, 2006; AIDA et al., 2011).

O padrão da resposta inflamatória de citocinas pode ser diferente dependendo do

tipo e da localização do dano cerebral. A região isquêmica consiste em duas partes: o

P á g i n a | 27

núcleo isquêmico e a penumbra, ambos são reconhecidos na prática clínica. Assim, a

neuroinflamação é em princípio um mecanismo de defesa destinado a neutralizar e

restaurar a estrutura e função do cérebro após o dano. A neuroinflamação pode ser vista

como um mecanismo protetor que isola o tecido cerebral danificado das áreas ilesas

destroem células afetadas e reparam a matriz extracelular (CORREALE et al., 2004).

Todas as células do cérebro participam destas respostas inflamatórias, além dos

neurônios, algumas células da neuroglia, incluindo microglia, macrófagos, astrócitos

(fibrosos e protoplasmáticos) e oligodentrócitos. Os mediadores principais da

neuroinflamação são as células gliais, constituindo 70% da população total das células

do sistema nervoso central. Assim, células da microglia mostram uma rápida resposta

que envolve a migração celular, proliferação e liberação de citocinas e fatores tróficos.

(DIAMOND et al., 1999).

Nos últimos anos as células gliais têm recebido uma atenção crescente pelo seu

papel nos eventos entre a atividade sináptica e o metabolismo da glicose

(MAGISTRETTI et al., 1999; HYDER et al., 2006). No núcleo, a ativação do NF-kB

promove a expressão gênica e media a transcrição de muitos genes envolvidos na

resposta inflamatória (por exemplo TNF-α, IL-1ß, IL-6, iNOS). De acordo com dados

de muitas revisões a neuroinflamação é um processo complexo e envolve numerosos

caminhos e moléculas bioativas que atuam no cérebro (YAMAMOTO et al., 2004).

Outra conseqüência significativa da isquemia encefálica é a inibição da

fosforilação oxidativa mitocondrial e a queda da produção de adenosina trifosfato

(ATP), ocasionando falência energética. A falta de energia celular provoca vários danos

na célula, dentre eles, a falência da bomba de sódio-potássio (Na+/ K+), o que leva a um

maior acúmulo de Na+ intracelular e perda de K+ para o meio extracelular, com

conseqüente edema celular e de suas respectivas organelas. Concomitantemente, ocorre

um aumento do influxo de Ca2+ e de Cl- para o meio intracelular. Além disso, são

observadas alterações como, massiva liberação de glutamato das vesículas sinápticas,

lipólise e acúmulo de lactato, tornando a célula acidótica (GALVÃO et al., 2005).

Modelos experimentais sugerem o envolvimento de diversas citocinas,

principalmente TNF- α e IL-6 no dano isquêmico cerebral (CARTER et al., 1993;

DIHNE et al., 2001). O TNF- α e a interleucina-1ß (IL-1ß) encontram-se elevados após

isquemia cerebral, podendo induzir uma reação inflamatória no SNC, juntamente com a

IL-6. Tais citocinas parecem modular diretamente o processo de apoptose das células no

SNC, promovendo diferenciação, proliferação e subseqüente infiltração leucocitária

P á g i n a | 28

(PULERA et al., 1998). Em adultos, tem sido demonstrada a correlação direta entre os

níveis de IL-6 e TNF-α no líquido cefalorraquidiano e o prognóstico neurológico após

isquemia cerebral aguda (VILA et al., 2000).

O TNF-α é uma citocina pleiotrópica produzida por muitos tipos de células, e

está envolvido na barreira hematoencefálica, na inflamação e em alterações vasculares

associadas à lesão cerebral (BARONE et al., 1997; AIDA et al., 2011) . O TNF-α tem

sido sugerido para estimular a angiogénese após isquemia através da expressão induzida

de genes relacionados a angiogênese (LIMB, 1996; GOUKASSIAN, 2007). É

conhecido como um forte immunomediador e citocina pró-inflamatória, a qual é

rapidamente regulado no cérebro após a lesão e está associada com necrose ou apoptose

(LIU et al., 1994). Os efeitos do TNF-α são mediados através de dois receptores, o

TNF-R1 (p55) e TNF-R2 (p75) na superfície da célula. TNF-R1 é expresso em todos os

tipos de células. Esta é uma importante sinalização para receptor de TNF-α. O TNF-R2

é expresso primariamente em células endoteliais e hematopoiéticas, responde às a forma

ligada à membrana do TNF-α, e medeia respostas biológicas limitados (WAJANT et al.,

2003). O NF-κB é um factor de transcrição essencial para controlar a expressão de

vários genes envolvidos na inflamação e a proliferação de células (BARNES et al.,

1997; GE et al., 2007).

1.2.2 Estresse oxidativo

Define-se estresse oxidativo como sendo um distúrbio no balanço entre

compostos oxidantes e antioxidantes em favor da geração excessiva de radicais livres

(RLs) ou em detrimento da velocidade de remoção desses, desencadeando reações

potencialmente deletérias em lipídeos, proteínas, RNAs e DNA. Essas reações podem

incluir: peroxidação dos ácidos graxos das membranas celulares; oxidação dos grupos

sulfidrila e inativação enzimática; inibição da síntese de ATP e consumo das reservas de

dinucleotídeos adenínicos da nicotinamida; inibição da bomba de Na+/K+ e alterações

do DNA que levam à mutagênese ou apoptose (LOH et al., 2010; SUN et al., 2009).

Os átomos e as moléculas possuem uma estrutura formada por elétrons que

normalmente ligam-se em pares. Os RLs são espécies extremamente reativas que

contêm um ou mais elétrons não pareados. Em sistemas biológicos os RLs gerados a

partir de oxigênio e nitrogênio são classificados como espécies reativas de oxigênio

(EROs) e espécies reativas de nitrogênio (ERNs) respectivamente. Tais radicais são

P á g i n a | 29

produzidos fisiologicamente devido ao metabolismo celular e são controlados por

sistemas antioxidantes enzimáticos e/ou não enzimáticos. Além disso, integram a

resposta fisiológica respondendo a estímulos nocivos como, por exemplo, agentes

infecciosos. Em concentrações baixas e moderadas participam de cascatas de

sinalização celular e, dessa maneira, modulam genes envolvidos no reparo de DNA, no

controle do ciclo celular, da resposta inflamatória e morte celular como, apoptose

(VALKO, 2007; LU et al., 2010).

A peroxidação lipídica é uma das consequências de aumento de EROs e refere-

se à deteriorização oxidativa de lipídios que contenham carbono insaturados, tais como

ácidos graxos insaturados, glicolipídeos, ésteres de colesterol e colesterol. As EROs

atacam os ácidos graxos poliinsaturados e grupamentos metil com átomos de hidrogênio

reativos, ocorrendo reações em cadeia e como resultado ocorre a produção de

malonaldeído (MDA). A peroxidação lipídica altera estrutura e permeabilidade de

membranas celulares e pode culminar com a morte celular (LÜ et al., 2010).

O estresse oxidativo representa uma dos principais responsáveis pelo dano

tecidual promovido por isquemia. O cérebro apresenta elevado consumo de oxigênio,

auto-oxidação de alguns neurotransmissores (norepinefrina e dopamina), elevados

níveis de ácidos graxos poliinsaturados, capacidade antioxidante relativamente baixa e

um limitado sistema de reparo celular que o torna particularmente suscetível ao estresse

oxidativo (LOH et al., 2010; SUN et al., 2009). A reperfusão restaura a oferta de

nutrientes, porém, por fornecer oxigênio a região em desequilíbrio metabólico, resulta

na potencialização do estresse oxidativo.

O óxido nítrico é sintetizado pela enzima óxido nítrico sintetase (iNOS) a partir

do aminoácido L-arginina, no cérebro são detectadas três isoformas dessa enzima, a

nNOS que é produzida por neurônios, a eNOS, sintetizada por células endoteliais, essas

duas isoformas apresentam-se de forma constitutiva no citoplasma e a iNOS, uma

isoforma induzida por processos patológicos que é produzida por macrófagos e células

gliais, como astrócitos e microglia (MORO et al, 2005).

O óxido nítrico está envolvido em diversos processos fisiológicos incluindo

neurotransmissão, regulação da pressão arterial, mecanismos de defesa, relaxamento da

musculatura lisa e regulação da imunidade (BERGENDI et al., 1999). Durante eventos

isquêmicos o aumento de concentração de Ca2+ citoplasmático mediada pelo glutamato

leva ao aumento da síntese do NO. Este atua dilatando vasos e, dessa maneira,

aumentando a oferta de glicose e oxigênio, mas também é capaz de reagir com o radical

P á g i n a | 30

superóxido (O2 −•) levando a danos nitrosativos (ESPEY et al., 2000). O estresse

nitrosativo promovido pelo peroxinitrito danifica proteínas, lipídeos de membrana e

DNA.

Determinadas regiões do cerebrais, como o corpo estriado, córtex e

particularmente o hipocampo são mais susceptíveis ao dano isquémico (KINDY et al.,

1992). No hipocampo, os neurônios piramidais da região CA1 sofrem morte tardia após

a lesão (KIRINO, 1982; NITATORI et al., 1995; RAO et al., 2000). Várias evidências

indicam que o estress oxidativo contribui para a morte neuronal tardia depois de

isquemia global cerebral, sugerindo que a formação de EROs participa de uma série de

eventos moleculares que vinculam a lesão isquêmica à morte celular neuronal. Assim, a

elucidação do papel do estresse oxidativo no cérebro após isquemia-reperfusão é de

grande valia. Uma melhor compreensão dos fatores que influenciam a formação de

EROs é necessária para a intervenção antioxidante eficaz e para ampliar os

conhecimentos a respeito dos mecanismos fisiopatológicos da isquemia cerebral

(KITAGAWA et al., 1990; HALL et al., 1993; OOSTVEEN et al., 1998).

1.2.3 Excitotoxicidade e Ca2+

O conceito de excitotoxicidade introduzido por Olney em 1969, foi baseado em

um conjunto de observações que incluía lesão neuronal com aplicação local de

glutamato e outros aminoácidos, como aspartato, N-metil-D-aspartato (NMDA),

homocisteína e cisteína. Uma vez que esta descrição foi publicada, outros

mediadores excitotóxicos foram delineados, incluindo catecolaminas, óxido nítrico

(NO) e espécies afins. O glutamato é o aminoácido excitatório mais abundante do

cérebro, exerce uma variedade de funções importantes (metabólica, neurotrófico, e

neurotransmissor) e é compartimentado em neurônios (FONNUM, 1984; CHOI, 1988;

IZUMI, 2006).

O termo “excitotoxidade” passou a ser empregado para indicar a

neurodegeneração mediada por aminoácidos excitatórios (OLNEY, 1969). A partir de

então, investiga-se o papel do glutamato em uma série de desordens do sistema nervoso

central (SNC). Atualmente, sabe-se que a excitotoxidade contribui para a lesão neuronal

em diversas neuropatologias, incluindo a isquemia, a epilepsia, o traumatismo crânio-

encefálico e as doenças neurodegenerativas, como a esclerose lateral amiotrófica (ELA),

P á g i n a | 31

o Mal de Parkinson e a Doença de Alzheimer (ARUNDINE & TYMIANSKI, 2003;

MATUTE et al, 2002).

Figura 01. Diagrama sistemático da sinapse glutamatérgica em condições normais e em

condições isquêmicas (Adaptado de ALLEN et al., 2004).

Um cérebro saudável tem a capacidade de absorver rapidamente o glutamato

extracelular. No entanto, sob condições em que as reservas de energia estão esgotadas,

como em hipóxia induzida por isquemia devido à despolarização celular, a liberação de

glutamato no meio extracelular, juntamente com a sua deficiente

absorção, resulta em aumentos do Ca2+ intracelular. Além disso, a interferência na

captação de cisteína (causando depleção dos níveis de glutationa celular responsáveis

para proteger contra o estresse oxidativo) resulta em lesão neuronal (BENVENISTE,

1984; CHOI, 1992).

A excitotoxicidade é um processo que induz morte neuronal amplamente

estudado e está envolvida em diversas patologias do sistema nervoso central como o

AVE (SATTLER; TYMIANSKI, 2001; DOBREK; THOR, 2011). O principal

mediador do dano excitotóxico é o íon Ca+2, um importante sinalizador celular. Em

condições fisiológicas o Ca+2 está envolvido com diversos processos celulares, incluindo

a atividade sináptica, a exocitose, a excitabilidade da membrana e o crescimento e a

diferenciação celulares (ARUNDINE & TYMIANSKI, 2003). Durante o período

isquêmico e o início da reperfusão a intensa liberação de glutamato, o acúmulo de Ca2+

citoplasmático e o aumento dos radicais livres são características da fase de

P á g i n a | 32

excitotoxicidade. O glutamato desempenha um importante papel no desenvolvimento

neuronal e em processos de aprendizagem e memória. Os níveis de glutamato nas

sinapses são regulados através de transportadores dependente de sódio localizados na

membrana plasmática de neurônios e células gliais. A concentração sináptica de

glutamato se encontra na faixa micromolar, enquanto a concentração citosólica é

aproximadamente 10 mM (LEE et al., 2000).

Diversas vias contribuem para lesão neuronal excitatória no AVC isquêmico,

com excesso de Ca2+ citosólico desempenhando um papel precipitador (HARDMAN;

LIMBIRD; GILMAN, 2012). Em decorrência da despolarização da membrana neuronal

os canais de Ca2+ dependendes de voltagem tornam-se ativos, levando à entrada desse

íon e à liberação de glutamato para o meio extracelular. Outra consequência da falência

energética decorrente da isquemia é o acúmulo citoplasmático de Na+ em astrócitos, que

promove a reversão dos transportadores de glutamato e que contribui para acúmulo

desse neurotransmissor no meio extracelular. Além disso, a diminuição da oferta de

oxigênio e glicose durante o episódio da isquemia impede a manutenção da baixa

concentração de Ca2+ intracelular pela Ca2+ ATPase (DOYLE; SIMON; STENZEL-

POORE, 2008).

1.2.4. A mitocôndria e o AVC

A mitocôndria corresponde a um compartimento intracelular essencial para

fornecer ATP através do ciclo de Krebs, cadeia de transporte de elétrons (fosforilação

oxidativa), síntese de moléculas chaves (metabolismo de aminoácidos, ácidos graxos e

esteróides) e homeostase de cálcio (CHAN, 2006; CAMPELLO E SCORRANO, 2010;

DIMAURO & SCHON, 2003).

Morfologicamente, ela é constituída por quatro compartimentos: a membrana

mitocondrial externa (MME), a membrana mitocondrial interna (MMI), o espaço

intermembranoso e a matriz mitocondrial. Na MMI está localizada a cadeia de

transporte de elétrons (CTE), a mesma dobra-se para dentro da matriz formando

invaginações denominadas, cristas mitocondriais, que aumentam significativamente a

superfície de contato da MMI e consequentemente a eficiência da CTE. As alterações

estruturais da MMI, em numerosas cristas dilatadas ou inchadas foram consistentemente

implicadas em processos associados a apoptose e como resposta ao estresse oxidativo,

em várias doenças neurodegenerativas (TRIMMER et al., 2000; MANNELLA, 2008).

P á g i n a | 33

É a única organela da célula eucariótica, além do núcleo, que possui seu

próprio DNA e maquinaria para sintetizar RNAs e proteínas. Cada mitocôndria contém

várias cópias do DNA circular na matriz, que codifica 13 proteínas que são

componentes do sistema de fosforilação oxidativa (LARSSON, 2010).

Nos neurônios, as mitocôndrias não só se distribuem no pericário, como

também migram para os longos processos neuronais, incluindo os terminais dendríticos

e axonal. Além disso, estes processos neuronais são altamente ativos na transdução da

sinalização intracelular pela liberação de neurotransmissores a partir de sinapses,

requerendo grandes quantidades de energia (CHEN & CHAN, 2006).

As mitocôndrias têm sido implicadas na patogênese de uma ampla variedade

de doenças neurológicas, onde as sinapses são conhecidas por serem o alvo principal,

incluindo a Doença de Huntington (REDDY & SHIRENDEB, 2012), a Doença de

Parkinson (FERRER et al., 2012), a Doença de Alzheimer (LEE ET al., 2012), a doença

de Batten (LUIRO et al., 2006) e várias desordens psiquiátricas (MANJI et al., 2012).

A integridade das mitocôndrias é fundamental para vida da célula. O

rompimento de tal integridade induzido por estresse celular provoca uma redução na

produção de adenosina trifosfato (ATP), danos oxidativos e liberação de várias

proteínas mitocondriais pró-apoptóticas, tais como o citocromo c e o factor de indução

de apoptose, todos os quais estão envolvidos na patogênese de numerosas disorders. A

disfunção mitocondrial também desempenha um papel fundamental na lesão isquêmica

neuronal, e manter a integridade mitocondrial contra isquemia cerebral é uma resposta

celular muito importante.

1.5 Ácido Valpróico

1.3.1. Farmacologia clínica

O ácido valproico (AV) é um fármaco empregado no tratamento de convulsões,

atuando também como estabilizador do humor no tratamento de distúrbios bipolares e

como moderador da enxaqueca. Sua descoberta deu-se em 1963 por acaso quando era

usado como veículo para outros compostos rastreados para atividade anticonvulsivante.

O uso como medicamento foi liberado nos Estados Unidos em 1978 com o nome

comercial Depakene®, sendo produzido pela Abbott Laboratories (ABBOTT, 2009).

P á g i n a | 34

Figura 2. Estrutura química do ácido valpróico. Fonte: USP 33, 2010.

No que se refere aos aspectos farmacocinéticos o ácido valpróico é um fármaco

administrado por via oral e rapidamente absorvido, visto que é transportado ligado a

proteínas plasmáticas, principalmente a albumina, restando um pequeno volume para

distribuição. Sua metabolização ocorre a princípio no fígado, mas uma pequena parcela

é excretada sem metabolização (NURGE et al., 1991).

O ácido valpróico é indicado como monoterápico em crises convulsivas de

ausência, mioclônica, parciais e tônico-clônicas. Em geral, a dose inicial é de 15 mg/Kg

sendo aumentada semanalmente até a dose máxima de 60 mg/Kg. Doses fracionadas

devem ser administradas quando ultrapassar 250 mg. Indicado na epilepsia juvenil

mioclônica, contudo alguns efeitos tóxicos sistêmicos são observados (LEVISOHN;

HOLLAND, 2007). O AV também é usado como alternativa ao lítio em pacientes

portadores de desordem bipolar; em casos de depressão; enxaqueca e convulsões febris.

(MARTINDALE, 2005). Além disso, pode ser utilizado sozinho ou combinado com

outros fármacos em convulsões causadas por tumor de cérebro (MÉLANIE et al.,

2009).

Sabe-se que o ácido valpróico exerce múltiplos efeitos farmacológicos,

incluindo a sua capacidade de aumentar a neurotransmissão do ácido gaba-

aminobutírico (GABA), seja por aumento da biossíntese do neurotransmissor ou pela

inibição da degradação, além de reduzir a neurotransmissão de glutamato no cérebro

(WINTERER, 2003; HADDAD et al, 2009). Outro mecanismo importante é a ativação

prolongada dos canais de Na+ voltagem dependente, o qual limita a deflagração de

correntes elétricas em neurônios específicos (GILMAN, 2012).

Mediante estudos experimentais o uso crônico do AV exerce efeito

neuroprotetor, inibindo o estresse oxidativo em culturas de células corticais de ratos. O

tratamento por sete dias, em ratos, inibiu a peroxidação lipídica e oxidação protéica

induzida por FeCl, sugerindo que o tratamento com AV pode proteger neurônios contra

P á g i n a | 35

o estresse oxidativo e que isto pode estar envolvido em seu mecanismo de ação (WANG

et al., 2003).

Estudos demonstraram que o AV aumenta a expressão do GRP78 (proteína de

estresse do retículo endoplasmático) e a expressão do fator Bcl-2 antiapoptótico, ambos

em córtex de ratos. O GRP78 liga cálcio e dobra proteínas lesadas, o Bcl-2 estabiliza o

potencial de membrana mitocondrial, inibe liberação de citocromo c e ambos inibem

acumulação de oxirradicais (GESSA et al., 1995; HAIM, 2006).

Em alguns casos, o AV também inibe a atividade da glicogênio sintase-quinase-

3 (GSK-3), reforçando a fosforilação de serina para ativar as vias de sinalização e

transcrição (KIM ET AL, 2005). Um estudo recente relatou que AV aumenta a

expressão de um receptor de quimiocina CXC4 (CXCR4) em células-tronco

hematopoéticas (GUL ET AL, 2009). O CXCR4 é um receptor específico de

quimiocina-a para o fator derivado de célula estromal (SDF-1α), uma molécula dotada

de uma atividade quimiotática potente evidenciado pela primeira vez em linfócitos

(RAZ, MAHABALESHWAR, 2009).

ALBRECHT 2005, mostra utilizações Off-Label do ácido valpróico como sendo

útil para diminuir a carga viral em portadores de HIV, porém a erradicação do vírus é

considerada impossível. Outras investigações evidenciaram a capacidade do AV em

inibir o crescimento de tumores por meio da indução da morte celular programada de

células tumorais e do estímulo à diferenciação celular. Todas estas características levam

a um interesse crescente na pesquisa deste fármaco (ROUTY, 2005). Existem três

medicamentos aprovados pelo Food and Drug Administration (FDA) para a terapêutica

da dependência de álcool (Acamprosato, Dissulfiram e Naltrexona), o ácido valpróico

mostrou excelentes resultados para tratamento da síndrome de abstinência do álcool e

para prevenção de recaídas. Porém, seu uso para este fim não está aprovado pelo FDA

(CASTRO; COUZI, 2006). Pesquisas recentes também mostraram que o ácido

valpróico pode ser eficaz no tratamento do mal da retina pigmentosa. (KAUSHAL,

2010).

1.3.2 Histonas Desacetilases (HDACs) e o Ácido valpróico como inibidor de HDACs

A organização da cromatina é crucial para a regulação da expressão gênica. A

acetilação e desacetilação de histonas desempenham papel importante na regulação

transcricional de células eucarióticas e são catalisadas por famílias específicas de

P á g i n a | 36

enzimas, as histonas acetil transferases (HATs) e desacetilases (HDACs)

respectivamente (KOURAKLIS & THEOCHARIS, 2002). HDACs pertencem a uma

família de enzimas que removem o resíduo acetil do aminoácido lisina presente na

extensão N-terminal do núcleo das histonas.

O balanço entre acetilação e desacetilação de histonas é um importante fator na

regulação da expressão gênica e está, então, ligado ao controle do destino celular.

Perturbações da atividade das HDACs podem estar associadas com o desenvolvimento

de acidente vascular cerebral e nesses casos os processos moleculares envolvidos com

ativação ou repressão da transcrição são possíveis alvos para terapia antiisquêmica. O

silenciamento ou inibição de HDACs tem mostrado ter um impacto no ciclo celular,

descondesação da cromatina, diferenciação celular, apoptose e angiogênese em diversos

tipos celulares (TIMMERMAN et al., 2001).

Uma vez que a inibição da atividade das HDACs reverte o silenciamento

epigenético freqüentemente observado na isquemia, diversos inibidores de HDACs

(HDIs) têm sido desenvolvidos para fins terapêuticos. Estes incluem ácidos graxos de

cadeia curta como o ácido valpróico (CAREW et al., 2008).

O ácido valpróico vem mostrando atividade neuroprotetora em níveis

terapêuticos em modelos animais e celulares. Em cultura de neurônios, AV protege

contra a excitotoxicidade induzida por glutamato (KANAI et al., 2004) e morte

neuronal dopaminérgica (ACHARYA et al., 2000). A neuroproteção relatada contra

excitotoxicidade consiste da inibição de histonas desacetilases (HDACs), um alvo do

ácido valpróico recentemente identificado (PHIEL et al., 2001).

Estudos recentes mostraram que o AV apresenta efeitos neuroprotectores em

modelos animais e celulares de doenças neurodegenerativas, incluindo acidente vascular

cerebral (CHUANG et al, 2009). Os efeitos neuroprotectores do AV ocorrem

inicialmente pela inibição de uma família de enzimas, as histonas desacetilases

(HDACs) (GÖTTLICHER et al., 2001; PHIEL et al., 2001; YU-TING et al., 2014) que

têm um papel crucial na regulação transcricional. As HDACs estão ligadas aos

processos de transcrição do DNA para a expressão gênica. A acetilação que ocorre

normalmente em uma célula neutraliza as cargas positivas na histona por transformar

aminas em amidas e diminuir a habilidade das histonas em ligarem-se ao DNA

(GIANNINI et al., 2009). As propriedades inibidoras de HDACs interferem diretamente

no metabolismo de replicação celular apresentam um potencial farmacológico do AV

ainda pouco explorado (GRIF et al., 2011).

P á g i n a | 37

A atividade neuroprotetora do ácido valpróico provavelmente seja decorrente da

inibição de HDACs, que conduz uma hiperacetilação da cromatina e resulta em

alteração da expressão gênica (REN et al., 2004). Foi sugerido que AV age por inibir a

produção de diacilglicerol (DAG), também reduz níveis de inositol, mas o PIP2

(fosfatidilinositol 4,5 bisfosfato) é aumentado, sugerindo que a hidrólise de PIP2

mediada por fosfolipase C e que forma DAG e IP3 é defeituosa na presença de AV.

Esses resultados levantam a hipótese de que o AV alivia os sintomas bipolares através

da via DAG, que regula a liberação de neurotransmissores, indicando que o AV age

neste sentido (ROBIN, 2002; SUZUMI et al., 2008).

1.3.3 Ácido Valpróico associado ao Lítio

O Ácido Valpróico e o Lítio são considerados os principais fármacos

estabilizadores do humor, utilizados para controlar as oscilações de humor

características do transtorno bipolar (RANG et al., 2012). Novas evidências sugerem

que estabilizadores de humor como AV e lítio apresentam amplas propriedades

neuroprotetoras e neurotróficas, e que isso ocorre através da inibição de histonas

desacetilases (HDACs) e da glicogénio sintase quinase 3 (GSK-3) respectivamente. A

inibição de tais enzimas provavelmente desencadeia uma cascata de eventos que leva à

neuroproteção.

O AV e o lítio apresentam ações semelhantes no que diz respeito à

neuroproteção. O lítio atua em uma série de sistemas de neurotransmissores e de

mecanismos de transmissão de sinais, tais como a hidrólise de fosfoinositol, adenilato

ciclase, proteínas G, a proteína glicogênio sintase cinase na sua isoforma 3β (GSK-3β) e

a proteína cinase C (PKC) (WANG et al., 2003). A GSK-3β está intimamente envolvida

no processo de disfunção colinérgica e morte celular na doença de Alzheimer (BIJUR et

al., 2000). Por meio de seus efeitos na GSK-3β e PKC, o lítio pode alterar também a

fosforilação de proteínas do citoesqueleto, condunzindo a mudanças de

neuroplasticidade (LENOX; HAHN, 2000).

Alguns estudos mostram os efeitos neuroprotetores característicos dos

estabilizadores do humor supracitados em diferentes situações, como no tratamento

agudo e crônico com anfetamina (FREY et al., 2006A,B), na excitotoxicidade

glutamatérgica (WANG et al., 2003; HASHIMOTO et al., 2002) e na neurotoxicidade

induzida por acúmulo do peptídeo β-amilóide (ALVAREZ ET AL., 1999). Além disso,

P á g i n a | 38

o AV e o lítio são capazes de atenuar determinadas ações neurodegenerativas, como a

peroxidação lipídica (JAKOPEC et al., 2008; SHAO et al., 2005) e o estresse oxidativo

induzido por cloreto de ferro (WANG et al., 2003).

O tratamento com lítio antagoniza a ativação de proteínas cinases ativadas por

mitógenos (MAPK), proteínas cinases ativadas por stresse (JNK) e a p38MAPK que

regula a expressão de muitas citocinas inflamatórias como o TNF-α (GARY, 2002;

CHUANG, 2004). Estudos mostram que há uma competição entre lítio e Mg2+ em

substratos que têm uma influência significativa sobre a atividade de várias enzimas e na

liberação de produtos metabólicos, em particular, são alvos importantes de lítio, da

glicogênio sintase cinase na sua isoforma 3β (GSK-3β), inositol monofosfatase (IMP), e

Akt/β-arrestina2 (Akt). Por isso, a modificação destas vias intracelulares através da

inibição enzimática é relevante para a compreensão da patogênese de determinados

distúrbios neuropsiquiátricos e neurodegenerativos (FORLENZA et al., 2014).

Alguns estudos indicam que a associação de AV e lítio têm a capacidade de

afetar a atividade transcricional, a expressão gênica, promover proliferação celular e

uma provável neurogênese no SNC (CHI-TSO CHIU, 2013). Clinicamente, a

combinação de AV e lítio tem sido utilizada para aumentar os benefícios terapêuticos ou

para o tratamento de pacientes bipolares insensíveis à monoterapia. Estes resultados

levantam a possibilidade de que o co-tratamento com AV e lítio pode produzir efeitos

sinérgicos ou mais fortes contra a morte de células neuronais em condições

neurodegenerativas (RUBINSZTEIN, 2002).

Foi demonstrado que o tratamento crônico com lítio induz a expressão de

neurotrofinas, como o BDNF (fator neurotrófico derivado do encéfalo) em cultura de

neurônios corticais de ratos (CHUANG; VAJDA, 2002). O AV apresenta ações

semelhantes as do lítio no que diz respeito à neuroproteção. Por exemplo, ambos

aumentam a atividade de ligação do DNA e a atividade dos fatores de transcrição da

família 1 de proteínas ativadoras por meio da proteína cinase regulada por sinal

extracelular (ERK). A ERK modula os efeitos de diversas neurotrofinas, incluindo a

diferenciação neuronal, sobrevivência neuronal, neuroplasticidade de longa duração e

aprendizado e memória (YUAN et al., 2001).

O ácido valpróico aumenta a expressão de genes relacionados à via da ERK

(cinases reguladas por sinais extracelulares) e de proteínas antiapoptóticas da família

das Bcl-2. Além disso, promove crescimento de neuritos, sobrevivência celular e

aumento de captação e liberação de noradrenalina (YUAN et al., 2001). Da mesma

P á g i n a | 39

forma que o lítio, o ácido valpróico, em doses terapêuticas, tem efeito inibitório sobre a

GSK-3β. A associação do ácido valpróico com o lítio tem efeitos somatórios nessa

inibição (CHEN et al., 1999; STAMBOLIC et al., 1996). Por fim, experimentos pré-

clínicos com uso de células-tronco mesenquimais tratadas com AV e lítio apresentaram

uma capacidade migratória aumentada para os locais de lesão cerebral isquêmica (TSAI

et al., 2011).

1.4 Modelos experimentais do AVC isquêmico

O desenvolvimento de modelos animais para o estudo do AVC isquêmico

representa uma ferramenta indispensável na investigação de sua fisiopatologia e no

desenvolvimento de novos fármacos para seu tratamento. O primeiro pesquisador a

propor um modelo de isquemia cerebral através da combinação de hipóxia e oclusão

unilateral da artéria carótida e, em meados de 1960 foi Seymour Levine (1960), seu

trabalho foi adaptado por Brown, Brierly e colaboradores que assim estabeleceram as

bases para o estudo do dano isquêmico cerebral em roedores (LIPTON, 1999).

O quadro abaixo mostra os principais modelos de isquemia cerebral de acordo

com a localização e se trata de um evento com reperfusão (transitório) ou sem

reperfusão (permanente) (BRAEUNINGER; KLEINSCHNITZ, 2009).

Modelos de

isquemia cerebral

Isquemia Cerebral

Etiologia Permanente ou

com reperfusão

Modelos

Global Intravascular Transitória ou

permanente

Parada cardíaca

Extravascular Transitória ou permanente Ligação das principais

artérias irrigadoras do

cérebro (carótidas e

vertebrais).

Focal Intravascular Transitória ou

permanente

Oclusão da artéria

cerebral média

Extravascular Transitória ou permanente Oclusão cirúrgica da artéria

cerebral média

Multifocal Intravascular Transitória ou

permanente

Embolização com

coágulos de sangue

ou microesferas

Quadro 01. Principais modelos de isquemia cerebral.

P á g i n a | 40

A fisiopatologia do AVC isquêmico tem sido bastante estudada em animais e os

mecanismos moleculares envolvidos na isquemia cerebral já estão bem estabelecidos

através de modelos in vivo que foram citados. As lesões isquêmicas podem sem globais

ou focais e para ambos os casos foram desenvolvidos modelos experimentais (COLLI,

NUNES, CARLOTTI, 1998; SHUAIB et al, 2011).

Os modelos de isquemia cerebral podem ser classificados como global ou focal,

dependendo da localização do dano. A isquemia global ocorre quando há falência

circulatória restringindo o suprimento sanguíneo para o cérebro e a isquemia focal

ocorre quando o fluxo de sangue é limitado em uma região cerebral específica,

geralmente causado pela oclusão de uma artéria cerebral (BRAEUNINGER;

KLEINSCHNITZ, 2009).

Os tipos de isquemia, temporária ou permanente, estão a depender de alguns

fatores importantes, como por exemplo, o tempo de duração, o tempo de reperfusão e as

artérias ocluídas no experimento (carótidas ou vertebrais) (TARDINI et al., 2003). A

presença ou ausência de reperfusão caracteriza o modelo como transitório ou

permanente (BRAEUNINGER; KLEINSCHNITZ, 2009).

A vascularização encefálica ocorre através de dois sistemas: o vértebro-basilar

(artérias vertebrais) e o carotídeo (artérias carótidas internas). Na base do crânio estas

artérias formam um polígono anastomótico, o Polígono de Willis, a partir do qual

aferem as principais artérias para vascularização cerebral. Os principais vasos de

irrigação do cérebro são as artérias carótidas e as artérias vertebrais, que se comunicam

por meio do Polígono de Willis. Trata-se de uma anastomose arterial que fornece o

suprimento sangüíneo para os hemisférios cerebrais, sendo formado pelas artérias

cerebrais anteriores e posteriores, artérias comunicantes anteriores e posteriores e pela

carótida interna (Figura 03).

P á g i n a | 41

Figura 03. Fonte: http://www.auladeanatomia.com/cardiovascular/arterias.htm

A isquemia global resulta em danos cerebrais mais comumente induzidos pela

oclusão das artérias cervicais do que pela interrupção total da circulação sanguínea. Os

principais modelos de oclusão de artérias são: oclusão de 4 vasos, onde é feita a

coagulação permanente das artérias vertebrais e posterior clampeamento das carótidas,

muito utilizado em ratos (PULSINELLI; BRIERLY; PLUM, 1982); a oclusão de 2

vasos, também realizado em ratos, em que somente as duas carótidas são clampeadas,

aliadas a redução da pressão arterial 50mmHg (SMITH; AUER; SIESJO, 1984); e a

oclusão das duas carótidas em gerbils sem redução da pressão arterial, visto que estes

animais são destituídos do polígono de Willis (KIRINO, 1982).

O modelo utilizado no presente trabalho foi o da oclusão bilateral das carótidas

com posterior reperfusão e sem redução da pressão arterial. Esse modelo pode causar

prejuízos como a morte de neurônios hipocampais com conseqüente prejuízo em testes

de memória e aprendizagem (LIPTON, 1999; MAROSI et al., 2008; WALKER;

ROSENBERG, 2009).

Atualmente os modelos mais utilizados de isquemia cerebral focal são os de

oclusão da artéria cerebral média (ACM) que pode ser realizada através do uso de um

fio intraluminal ou por meio de técnicas cirúrgicas como eletrocauterização,

clampeamento e ligadura da artéria. A eletrocauterização da ACM leva a interrupção

permanente do fluxo sanguíneo, enquanto que a ligadura e o campleamento permitem a

http://www.auladeanatomia.com/cardiovascular/arterias.htm

P á g i n a | 42

reperfusão. Existe ainda o modelo de fototrombose, no qual é induzida uma lesão

cortical do cérebro por injeção sistêmica de um corante fotossensível, como o rosa de

Bengala, e posterior irradiação focal do crânio (BACIGALUPPI et al., 2010).

P á g i n a | 43

2. RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA

A neurociência procura elucidar os mecanismos fisiológicos envolvidos nas

neuropatologias e suas pesquisas focam em agentes terapêuticos. Na isquemia cerebral,

a perfusão sanguínea ausenta-se, estimulando o cérebro a usar todo o estoque energético

que é limitado, tornando-se assim mais vulnerável a danos irreversíveis.

O Brasil encontra-se entre os dez países com maiores índices de mortalidade por

AVC. Estatísticas recentes mostram que o acidente vascular encefálico ainda é a

primeira causa de óbito. Em suas diversas formas de apresentação o AVC constitue uma

emergência neurológica. Quando o óbito não acontece, prejuízos fisiológicos são

gerados no organismo do paciente. Os acometidos costumam apresentar danos físicos,

como paresias ou plegias de um ou ambos os membros, deslizes sensoriais e da

memória, alterações visuais, na marcha e da fala, tanto na expressão, quanto na

compreensão (CAPLAN, 2000).

Embora o Brasil venha avançando na prevenção e diminuição da mortalidade

causada por AVC, as estatísticas ainda sobressaem quando comparadas aos demais

países da América Latina. Com isso, percebe-se a importância do estudo sistemático da

fisiopatologia dos mecanismos envolvidos na lesão neuronal isquêmica e de seu

tratamento com o objetivo de formular estratégias que reduzam tanto a mortalidade

como as diversas seqüelas neurológicas advindas de tal patologia (GARRITANO et al.,

2012).

O ácido valpróico é uma das mais importantes drogas utilizadas no tratamento

de epilepsia e alternativa no tratamento da doença bipolar, por isso vem sendo

explorado como importante candidato à terapia isquêmica. Na clínica, pacientes

bipolares insensíveis à monoterapia têm apresentado resposta à combinação de AV e

lítio que vêem aumentando os benefícios terapêuticos para o tratamento de patologias

relacionadas ao sistema nervoso. Estes resultados levantam a possibilidade de que o co-

tratamento com AV e lítio pode produzir efeitos sinérgicos ou mais fortes contra a

morte de células neuronais em condições neurodegenerativas (RUBINSZTEIN, 2002).

O interesse em estudar o ácido valpróico sozinho ou associado ao lótio em

modelo de isquemia global transitória é decorrente dos possíveis efeitos

antinflamatórios e neuroprotetor deste fármaco, o que nos leva a investigar o seu

mecanismo de ação como droga neuroprotetora e com potencial de utilização na clínica

com outras atividades além das que já são comprovadas.

P á g i n a | 44

3. OBJETIVOS

Geral

Avaliar o efeito neuroprotetor do ácido valpróico sozinho ou associado ao lítio,

em modelo de isquemia global transitória em ratos, através de avaliações

comportamentais, neuroquímicas e imunohistoquímicas.

Específicos

Avaliar os efeitos do ácido valpróico sozinho ou associado ao lítio em animais

isquemiados sobre:

- A atividade locomotora espontânea através do testes de campo aberto;

- A memória espacial através do teste do labirinto aquático de Morris;

- As alterações neuroquímicas no corpo estriado, através de determinações nas

concentrações de neurotransmissores, como dopamina (DA) e seu metabólito Ácido

3,4-diidroxifenilacético (DOPAC) por HPLC (High Performance Liquid

Chromatography);

- O estresse oxidativo no corpo estriado, córtex pré-frontal e hipocampo através da

dosagem de TBARS e nitrito;

- A neuroinflamação induzida pela ICG através da técnica de imunohistoquímica para

iNOS, COX-2, TNF-α, GSK-3 e HDAC no hipocampo;

- O percentual da área de dano isquêmico cerebral por disfunção mitocondrial (TTC).

P á g i n a | 45

4. METODOLOGIA

4.1 Animais:

Os experimentos foram realizados em ratos albinos da variedade Wistar (200-

250 g), provenientes do Biotério da Faculdade de Medicina de Juazeiro do Norte – FMJ

e alojados em gaiolas individuais em ambiente climatizado, à temperatura de 24±2°C,

sob condições de ciclo de claro/escuro 12h/12h com livre acesso a ração padrão (Purina

Chow) e água potável. Os animais foram tratados de acordo com a legislação vigente e

os princípios éticos da experimentação animal estabelecidos pelo CONCEA (Conselho

Nacional de Controle de Experimentação Animal). O projeto de pesquisa foi submetido

e aprovado pela Comissão de Ética em Pesquisa Animal (CEPA) da Universidade

Federal do Ceará (UFC) sob o número de registro 59/2011.

4.2 Drogas e reagentes

Nesse estudo foram utilizados o ácido valpróico (Valproato de sódio – Teuto

S/A) nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg (v.o.) e lítio (Sigma Aldrich-USA®) na dose de

10 mg/kg (i.p.), durante sete dias. Como anestésicos foram utilizados o Cloridrato de

Cetamina 5% (Vetanarcol®, Laboratórios König S.A, Argentina) e o Cloridrato de

Xilazina 2% (König, Argentina), nas doses de 75 e 10mg/kg, via intraperitoneal,

respectivamente. Todos os outros reagentes foram de grau analítico.

4.3 Modelo experimental de isquemia cerebral global

Os animais foram divididos em grupos (para avaliação comportamental n:10,

para avaliação neuroquímica e imunohistoquímica n:6) e anestesiados com Cetamina

(75 mg/kg) e Xilazina (10 mg/kg), administradas por via intraperitoneal (i.p.) e

imobilizados para serem submetidos ao modelo de isquemia cerebral global, por

oclusão bilateral das artérias carótidas comuns baseando-se no modelo proposto por

ULRICH et al., (1998).

P á g i n a | 46

Após antissepsia local e tricotomia foi feita uma incisão medial na altura da

traquéia para exposição das carótidas em ambos os lados. Com a identificação do nervo

vago e das carótidas, essas foram isoladas e clampeadas simultaneamente, utilizando

pinças buldogues e ocasionando a isquemia cerebral durante 30 minutos, seguida de

reperfusão. A incisão foi suturada e os animais alojados em gaiolas para recuperação.

Água e comida foram ofertadas ad libitum. O grupo falso-operado (FO) foi submetido

ao mesmo protocolo cirúrgico, porém não houve o clampeamento das carótidas, que

foram apenas separadas do nervo vago e isoladas.

Figura 04: Procedimento cirúrgico, incisão medial na altura da traquéia com exposição

da carótida. Fonte: Estácio FMJ. SANTOS (2016).

P á g i n a | 47

Os animais foram tratados por gavagem (vo) com ácido valpróico nas doses de

25, 50 e 100 mg / kg, sozinho ou associado ao lítio (10 mg/kg, ip) após a cirurgia

diariamente, durante 7 dias. Os animais foram distribuídos em 9 grupos:

No sétimo dia após o tratamento os ratos foram avaliados quanto à atividade

exploratória (campo aberto) e memória espacial (labirinto aquático). Realizados os

testes comportamentais os animais foram eutanasiados por decapitação em guilhotina

(Harvard, USA) e o corpo estriado, córtex pré-frontal e hipocampo foram dissecados

sob gelo. O corpo estriado foi utilizado na preparação de homogenatos para

determinação de monoaminas e metabólitos (DA e DOPAC) em HPLC (High

P á g i n a | 48

Performance Liquid Chromatography). Fatias de hipocampo foram processadas para os

testes de imunohistoquímica (TNF-α, COX-2, iNOS, GSK-3 e HDAC) e coloração com

fluoro jade. O corpo estriado, córtex pré-frontal e hipocampo foram utilizados na

preparação de homogenatos para determinação dos níveis de TBARS e nitrito; Cortes

coronais foram usados para determinar o percentual da área de dano isquêmico cerebral

por disfunção mitocondrial (TTC).

4.4 Estudo comportamental

4.4.1 Teste do Campo Aberto ou “Open Field”

O teste de campo aberto é utilizado para avaliar a atividade locomotora, déficits

motores e de ansiedade. A atividade locomotora é avaliada mediante alguns parâmetros,

como, a determinação da distância percorrida (número de cruzamentos) e

comportamentos estereotipados, rearing (exploração vertical) e grooming

(autolimpeza). O teste é sensível à disfunção motora, bem como a danos do hipocampo

e gânglios da base. Durante o teste se avalia a capacidade exploratória do animal,

durante 5 minutos, em uma arena. A arena é construída em acrílico ou madeira

(dimensões para rato: 50 x 50 cm) e possui 20 cm de altura, com piso dividido em

quatro quadrados iguais (Figura 05).

Figura 05. Teste para avaliar a atividade locomotora no aparato do campo

aberto. Aparato do campo aberto do Laboratório de Biofisiologia e Farmacologia,

Estácio FMJ. Fonte: SANTOS (2015).

P á g i n a | 49

Os animais foram avaliados no sétimo dia de tratamento pós-isquemia cerebral.

Os ratos foram gentilmente colocados na arena com as quatro patas no centro do campo

aberto e o seu comportamento foi observado por 5 minutos. Os parâmetros

comportamentais observados neste teste foram:

- Número de cruzamentos - contados todos os quadrantes cruzados pelo animal, quando

este se encontrava com as quatro patas dentro do mesmo quadrante;

- Número de rearing - postura na qual o animal fica na posição vertical, apoiado

somente pelas patas traseiras;

- Número de grooming - ato de auto-limpeza do animal.

4.4.2 Teste do Labirinto Aquático (Water Maze) - Memória Espacial

O teste do labirinto aquático avalia a memória espacial e qualquer alteração na

resposta (maior tempo para encontrar a plataforma submersa) é sugestiva de disfunção

hipocampal. Está correlacionado com a plasticidade sináptica do hipocampo e da função

do receptor NMDA. O teste utiliza uma piscina circular pintada com tinta preta (1,7m

de diâmetro e 1m altura), com água (0,59m de profundidade), à temperatura de

aproximadamente 25oC para ratos. A piscina é dividida em quatro quadrantes e contem

uma plataforma com 10 cm de diâmetro que se mantém imóvel e submersa a 0,5 cm

abaixo do nível da água. O local onde está a piscina é provido de pistas em quatro

localizações das paredes ao norte, sul, leste e oeste (figura 06).

Figura 06. Labirinto aquático. Adaptado de Richard G. Morris (1981).

Disponível em: http://en.wikipedia.org. Acesso em: 20/01/2016.

Os animais foram submetidos a dois dias de treinamento (pré-teste) e após 48

horas do último treino foi realizado o teste do labirinto aquático, correspondendo ao

P á g i n a | 50

sétimo dia de tratamento com AV. Nos treinos, cada animal foi colocado na piscina por

seis vezes em posições diferentes, tendo sido o primeiro ponto sempre a extremidade

oposta à plataforma. Os animais têm um tempo máximo de 54 segundos (“cut-off time”)

para encontrar a plataforma. Uma vez sobre a plataforma, esse permaneceu durante 10

segundos e depois foi retirado. Aquele animal que não encontrou a plataforma no tempo

máximo foi colocado na mesma por 10 segundos. Os animais permaneciam por 30

segundos fora da piscina para uma nova entrada até completado o treino. Após 48 horas

do último treino, o procedimento foi repetido com somente uma entrada para cada rato

(teste), quando então foi registrado o tempo de latência (em segundos) que cada animal

levou para encontrar a plataforma submersa.

4.4.3 Avaliação de neurotransmissores, marcadores do estresse oxidativo e mediadores

inflamatórios

4.4.3.1 Dissecção das áreas cerebrais

Os animais foram sacrificados através da decapitação com uma guilhotina

(Harvard, USA) 7 dias após a cirurgia, logo após os testes comportamentais. Os

encéfalos foram retirados rapidamente e colocados sobre papel alumínio em uma placa

de Petri com gelo. Acompanhando a fissura sagital mediana, a camada cortical cerebral

foi liberada das leptomeninges com uma pinça reta de microdissecação que divulsionou

o córtex delicadamente, expondo o corpo estriado, o córtex e o hipocampo. Todas as

áreas cerebrais citadas foram retiradas delicadamente. Após serem pesados foram

guardados no freezer a -20ºC até o preparo dos homogenatos que foram utilizados nas

análises neuroquímicas e bioquímicas. Um corte coronal na altura do hipocampo

também foi realizado para posterior análise imunohistoquímica e bioquímica.

4.4.3.2 Determinação dos níveis de monoaminas e metabólitos através de HPLC

Para determinação dos níveis de aminoácidos, foi utilizado o equipamento de

HPLC. Na cromatografia líquida clássica, um adsorvente (alumina ou sílica) é

empacotado em uma coluna e é eluído por um líquido ideal (fase móvel). Uma mistura

para ser separada é introduzida na coluna, e é carregada através da mesma por líquido

eluente. Se um composto da mistura (soluto) é adsorvido fracamente pela superfície da

fase sólida estacionária, ele atravessará a coluna mais rapidamente que um outro soluto

P á g i n a | 51

que seja mais rapidamente adsorvido. Então, a separação dos solutos é possível se

existem diferenças na adsorção pelo sólido. Os detectores eletroquímicos medem a

condutância de eluente, ou a corrente associada com a oxidação ou redução dos solutos.

Para ser capaz de detectar, no primeiro caso os solutos devem ser iônicos, e no segundo

caso os solutos devem ter a característica de serem relativamente fáceis de oxidar ou

reduzir.

Detectores eletroquímicos que medem corrente associada com a redução ou

oxidação de soluto são chamados detectores amperométricos ou colorimétricos. Neste

estudo, foi utilizado o tipo amperométrico que reage com uma quantidade muito menor

de soluto, em torno de 1 %. Todas as técnicas eletroquímicas envolvem a aplicação de

um potencial para um eletrodo (geralmente de carbono vítreo), oxidação da substância

que está sendo estudada próximo à superfície do eletrodo, seguindo a amplificação e

medida da corrente produzida. As catecolaminas são oxidadas nos grupos de anel

hidroxil para conduzir em derivado ortoquinona com a liberação de dois elétrons.

O estriado dos animais foi então utilizado para preparar os homogenatos a 10%

em ácido perclórico (HClO4). O estriado foi sonicado em 0,1 M HClO4, durante 30 s,

centrifugados a 4°C durante 30 min a 15.000 rpm, e os sobrenadantes foram filtrados

(0,2 um, Millipore). Trinta microlitros de amostra foram então injetados na coluna

(Shim-Pack CLC-ODS, 25cm) do HPLC (Shimadzu, modelo LCD-6A com detecção

eletroquímica) em fluxo de 0,6 mL/min. A fase móvel foi preparada com 0,163 M de

ácido cítrico, pH 3,0, contendo 0,02 mM de EDTA com 0,69 mM de ácido

octanossulfônico sódico (SOS), acetonitrila a 4% v/v e tetra-hidrofurano 1,7% v/v. A

Dopamina e o seu metabólito DOPAC foram eletroquimicamente detectados, utilizando

um detector amperométrico (Shimadzu, Japão), por oxidação de um eletrodo de carbono

vítreo a 0,85 V em relação ao eletrodo de referência de Ag-AgCl. As suas concentrações

foram determinadas por comparação com as médias dos padrões injetados na coluna do

HPLC. Foram utilizados padrões numa concentração final de 4 μg/ml e a partir da altura

ou área dos picos padrões as concetrações foram inseridas no programa Graphpad

Prism® 6.0 e os resultados expressos em ng/g de tecido.

P á g i n a | 52

4.4.3.3 Determinação da peroxidação lipídica através da dosagem de substâncias

reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS)

A peroxidação lipídica é uma das mais importantes expressões orgânicas do

estresse oxidativo induzido pela reatividade dos radicais livres de oxigênio. O método

mais empregado para a determinação do malonildialdeído (MDA) em amostras

biológicas é baseado na sua reação com o ácido tiobarbitúrico (TBARS). Nesta reação,

duas moléculas de TBARS reagem estequiometricamente com uma molécula de MDA

para formar uma solução de cor rosa, conforme o método de DRAPER; HADLEY

(1990).

Homogenatos das áreas cerebrais de interesse, corpo estriado, córtex e

hipocampo, foram preparados a 10% em solução de Cloreto de Potássio (KCl) 1,15%.

Uma alíquota de 250 μl do homogenetado foi misturado a 1 mL de solução de ácido

tricloroacético a 10% e acrescido de 1 mL de solução de ácido tiobarbitúrico 0,6%.

Após a agitação, essa mistura foi mantida em banho-maria fervente (95-100°C) durante

15 min. Em seguida foi resfriada em banho de gelo por alguns minutos e posteriormente

centrifugada (4000 rpm/5 min). O conteúdo de TBARS foi determinado em leitor de

Elisa a 540 nm. Os resultados foram expressos em micromol de MDA por g de tecido.

A curva padrão foi obtida mediante leitura de várias concentrações de MDA padrão

(0,6; 1,2; 2,4; 4,08; 8,16; 16,32 μmol).

4.4.3.4 Determinação do conteúdo de nitrito

Nesse protocolo o reagente de Griess [N-naftil-etilenodiamina (NEED) 0,1 %,

sulfanilamida 1 % em ácido fosfórico 5% e água destilada] revela a presença de nitrito

em uma amostra. Em condições ácidas, o nitrito reage com a sulfonilamida por uma

reação de diazotização formando um composto intermediário, o sal diazônico. Em

seguida este sal reage com o NEED 0,1 % formando um azo estável de coloração rósea

com um pico de absorbância em 560 nm. Para realização deste teste homogenatos de

corpo estriado, córtex e hipocampo (10% em tampão de Cloreto de Potássio) foram

centrifugados (12000 rpm por 10 min) e 100 μL dos sobrenadantes foram adicionados a

100 μL do reagente de Griess, permanecendo a temperatura ambiente durante 10

minutos. A curva padrão foi obtida pela pesagem de 7mg de NaNO2, dissolvidos em 10

mL de água destilada (solução-estoque-10mM) e foram realizadas as diluições em série

P á g i n a | 53

(100μM, 50μM, 25μM, 12,5μM, 6,25μM, 3,12μM, 1,56μM). Foi contruída uma

equação da reta para o cálculo das concentrações do teste e os resultados foram

expressos em μmol de nitrito/nitrato por g de tecido (GREEN et al., 1981).

4.4.3.5 Ensaios imunohistoquímicos para iNOS, COX-2, TNF-α, GSK-3 e HDAC.

A imunohistoquímica foi realizada no hipocampo para iNOS, COX-2, TNF-α,

GSK-3 e HDAC. Os animais foram sacrificados por decapitação 7 dias após a cirurgia

que promoveu a isquemia cerebral e foram feitos os cortes para confecção das lâminas.

O material selecionado foi inicialmente fixado em formol a 10% durante as primeiras

24h, seguido por uma solução alcoólica a 70% e, posteriormente, emblocado em

parafina. Cortes histológicos de 5 μm de espessura colocados sobre lâminas de vidro

próprias para imunohistoquímica. Foram feitas pelo menos duas lâminas de dois ou três

animais diferentes para cada grupo. Então, as lâminas contendo os cortes histológicos

foram deixadas em estufa histológica a 58º C por 10 minutos, em seguida o protocolo

seguiu as etapas abaixo:

1) Desparafinização em xilol e reidratação em uma série de banhos de álcool de

concentrações diferentes até a água e lavados duas vezes em água destilada por cinco

minutos cada;

2) Recuperação antigênica com tampão citrato pH 6.0 no microondas em potência

máxima por 5 minutos, com intervalos para evitar fervura; Resfriar à temperatura

ambiente e lavar 2 vezes com PBS – 5 min cada lavagem;

3) Bloqueio da peroxidase endógena com peróxido de hidrogênio 0,3%;

4) Após circular as secções com caneta específica para imunohistoquímica, seguiu-se a

incubação com os respectivos anticorpos primários, diluídos em BSA overnight em

geladeira. Todas as diluições foram realizadas de 1:100;

5) No dia seguinte retirou-se as lâminas da geladeira para voltar à temperatura ambiente

e serem lavadas com PBS;

6) Os cortes foram incubados com o anticorpo secundário por 2 horas em temperatura

ambiente;

7) Em seguida foi feita a incubação com o Complexo Avidina-Biotina (kit DAKO) por

30 min para potencialização da reação, levando à melhora na visualização;

P á g i n a | 54

8) Para revelação foi utilizada a solução cromógena de diaminobenzidina (DAB) do

mesmo kit, por aproximadamente 1 minuto. As lâminas foram lavadas para parar a

reação;

9) Então fez-se a desidratação com álcool em concentrações diferentes e a diafanização

em xilol para montagem da lamínula com Enthelan e análise utilizando o Microscópio

Óptico BX-41 com câmera acoplada.

Os dados imunohistoquímicos (fotomicrografias) foram quantificados através do

software Image J (National Institute of Health, USA). Posteriormente, esses dados

foram analisados através do GraphPad Prism® 6.0.

4.4.3.6 Avaliação da Área de Infarto Cerebral Isquêmico - Cloreto de 2,3,5

Trifeniltetrazol (TTC)

O TTC é um sal que ganha um próton da succinato desidrogenase na membrana

interna da mitocôndria. Com isso, ele é reduzido para uma forma insolúvel, o formazam,

fornecendo uma coloração avermelhada ao tecido composto por células viáveis. As

células da região de infarto não possuem mitocôndrias viáveis, desta forma, o processo

de redução não acontece, a coloração avermelhada não é gerada, permitindo a área de

infarto ser caracteristicamente detectada por uma região esbranquiçada.

Após sete dias da indução isquêmica os animais foram eutanasiados e seus

cérebros foram removidos. Conservados em salina gelada até o momento dos cortes, os

cérebros foram fatiados na espessura de 2 mm e imersos em solução de 2% de TTC à

37°C por 30 minutos. Em seguida, as fatias foram digitalizadas. As imagens foram

analisadas a partir das áreas de infarto e das áreas totais das fatias, empregando-se

cálculos das respectivas porcentagens. As imagens foram quantificadas através do

software Image J (National Institute of Health, USA). Posteriormente, esses dados

foram analisados através do GraphPad Prism® 6.0.

P á g i n a | 55

4.5 Análise estatística

Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M).

Para comparação múltipla dos parâmetros foi utilizado ANOVA de uma via e o teste de

Newman-Keuls como post hoc. Para comparação das médias entre dois grupos apenas,

foi utilizado o teste t não pareado. Em todas as análises, foi considerado estatisticamente

significante valores de p< 0,05. Para realização da análise estatística foi utilizado o

programa GraphPad Prism® 6.0.

P á g i n a | 56

5. RESULTADOS

5.1 Testes comportamentais

5.1.1 Efeitos do ácido valpróico sozinho ou associado ao lítio sobre a atividade

locomotora através do teste do campo aberto em ratos após serem submetidos à

isquemia cerebral global transitória

No teste de campo aberto os animais tratados com AV sozinho nas doses de 25,

50 e 100mg/kg tiveram um aumento significativo do número de travessias de um

quadrante para outro quando comparados ao grupo isquemiado (ISQ: 5,07±0,51; FO:

12,04±0,81a; AV25: 10,24±1,12a; AV50: 9,77±1,19b; AV100: 12,33±1,96a).

Observamos que o tratamento com AV em todas as doses citadas acima reverteu o

déficit na atividade locomotora quando comparado ao grupo controle (Figura 07).

Com relação aos animais tratados com AV associado ao lítio, o grupo

isquemiado (ISQ) apresentou uma diminuição significativa do número de travessias de

um quadrante ao outro quando comparados ao grupo falso operado (ISQ: 5,07±0,51;

FO: 12,04±0,81a). O AV associado ao lítio em todas as doses (AV25: 8,92±0,95b;

AV50: 11,0±1,45a e AV100: 11,5±1,76a) reverteram o déficit na atividade locomotora

quando comparado ao grupo isquemiado de forma semelhante, assim como no grupo

tratado apenas com lítio (9,71±0,72b). Na figura 08 de maneira similar, o AV aumentou

o número de rearings, nos grupos que foram tratados apenas com ácido valpróico nas

doses de 25 e 50mg/kg (AV25: 12,37±1,32a; AV50: 10,63±1,31a) e nos grupos em

associação com o lítio (AV25: 7,07±1,31b; AV50: 10,18±0,97a; AV100: 10,45±1,31a;

Li: 9,85±1,04a) quando comparado com o grupo isquemiado (3,89±0,49 (28). Em

relação à atividade de autolimpeza (grooming) obtivemos resultados significativos

apenas na maior dose do AV associado ao lítio quando comparado ao grupo isquemiado

(ISQ: 3,61±0,24; FO: 6,66±0,66a; AV100: 7,93±1,27a).

P á g i n a | 57

Figura 07- Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado ao Li

(10mg/kg, ip) sobre a atividade locomotora de ratos no teste do campo aberto. Os

valores representam a média ± EPM do número de cruzamentos durante 5 min.

F.O.

ISQ.

AV25

AV50

AV10

0

0

5

10

15

20

a

a

ISQ

ab

Nú

me

ro d

e c

ruzam

en

tos

/5 m

in

F.O.

ISQ.

AV25

+ L

IT

AV50

+ L

IT

AV10

0 +

LIT LIT

0

5

10

15

20

ISQ

a a

b b

a

Nú

me

ro d

e c

ruzam

en

tos

/5 m

in

P á g i n a | 58


(10mg/kg, ip) sobre a atividade locomotora de ratos após serem submetidos à


Grupos Número de cruzamentos

Falso operado (FO)

12,04±0,81 a (23)

Isquemiado (ISQ) 5,07±0,51 (27)

ISQ + Ácido Valpróico 25 mg/kg (AV25) 10,24±1,12 a (18)

ISQ + Ácido Valpróico 50 mg/kg (AV50) 9,77±1,19 b (18)


ISQ + Ácido Valpróico 25 mg/kg + Li 8,92±0,95b (13)

ISQ + Ácido Valpróico 50 mg/kg + Li 11,0±1,45 a (13)


ISQ + Lítio 10 mg/kg (Li) 9,71±0,72 b (15)

Os valores representam a média ± EPM do número de cruzamentos durante 5 min.

Para análise estatística foi utilizado ANOVA de uma via seguido por Newman

Keuls como teste post hoc. Valores significativos com p<0,01. a e p<0,05. b e

quando comparados ao grupo isquemiado (ISQ). Teste t não pareado * quando

comparados ao grupo isquemiado (ISQ).

P á g i n a | 59


(10mg/kg, ip) sobre a atividade rearing de ratos no teste do campo aberto. Os

valores representam a média ± EPM do número de rearing durante 5 min.

F.O.

ISQ.

AV25

AV50

AV10

0

0

5

10

15

20

ISQ

aa

a

Nú

mero

de

reari

ng

/5 m

in

F.O.

ISQ.

AV25

+ L

IT

AV50

+ L

IT

AV10

0 +

LIT LIT

0

5

10

15

20

a

b

ISQ

a aa

Nú

mero

de

reari

ng

/5 m

in

P á g i n a | 60


(10mg/kg, ip) sobre a atividade de rearing de ratos após serem submetidos à


Grupos Número de rearing

Falso operado (FO) 14,04±1,19 (27)


ISQ + Ácido Valpróico 25 mg/kg (AV25) 12,37±1,32a (19)

ISQ + Ácido Valpróico 50 mg/kg (AV50) 10,63±1,31a (19)

ISQ + Ácido Valpróico 100 mg/kg

(AV100)

6,10±0,89 (20)

ISQ + Ácido Valpróico 25 mg/kg + Li 7,07±1,31 b (14)



ISQ + Lítio 10 mg/kg (Li) 9,85±1,04 a (14)

Os valores representam a média ± EPM do número de rearing durante 5 min. Para

análise estatística foi utilizado ANOVA de uma via seguido por Newman Keuls

como teste post hoc. Valores significativos com p<0,1. a, p<0,01. b e p<0,05. c



P á g i n a | 61


(10mg/kg, ip) sobre a atividade grooming de ratos no teste do campo aberto. Os

valores representam a média ± EPM do número de grooming durante 5 min.

F.O.

ISQ.

AV25

AV50

AV10

0

0

5

10

15

20

a

ISQ

Nú

mero

de g

roo

min

g/5

min

F.O.

ISQ.

AV25

+ L

IT

AV50

+ L

IT

AV10

0 +

LIT LIT

0

5

10

15

20

a

a

ISQ

Nú

mero

de g

roo

min

g/5

min

P á g i n a | 62


(10mg/kg, ip) sobre a atividade grooming de ratos após serem submetidos à


Grupos Número de grooming

Falso operado (FO) 6,66±0,66a (27)


ISQ + Ácido Valpróico 25 mg/kg (AV25) 5,33±0,66 (18)



(AV100)

3,38±0,49 (18)

ISQ + Ácido Valpróico 25 mg/kg + Li 4,8±0,95 (15)


ISQ + Ácido Valpróico 100 mg/kg + Li 7,93±1,27a (15)

ISQ + Lítio 10 mg/kg (Li) 4,18±0,86 (18)

Os valores representam a média ± EPM do número de grooming durante 5 min.


Keuls como teste post hoc. Valores significativos com p<0,1. a, p<0,01. b e p<0,05. c



P á g i n a | 63

5.1.2 Efeitos do ácido valpróico sozinho ou associado com lítio sobre o aprendizado e a

memória espacial no teste do labirinto aquático em ratos após serem submetidos à

isquemia cerebral global

O teste do labirinto aquático avalia a memória espacial do animal. Durante a

avaliação da retenção da memória espacial observou-se que os animais tratados com

ácido valpróico nas doses de 50 e 100mg/kg apresentaram uma diminuição significativa

do tempo para encontrar a plataforma quando comparados ao grupo isquemiado (ISQ:

42,92±2,30; AV50: 23,71±3,48 a; AV100: 18,93±4,35 a) (Figura10).

Evidenciamos um aumento significativo no tempo que os animais do grupo

isquemiado levaram para encontrar a plataforma submersa (ISQ: 42,92±2,30) em

relação ao grupo controle falso operado (20,11±2,16a) indicando uma diminuição da

aprendizagem espacial e disfunção hipocampal. Por outro lado nos grupos tratados com

ácido valpróico e lítio em todas as doses durante sete dias (AV25: 27,13±5,13 a; AV50:

22,08±4,80a; AV100: 19,53±3,35a) inclusive os animais tratados apenas com lítio (Li:

18,94±4,25a) ocorreu uma reversão completa desse comportamento quando comparado

com o grupo ISQ (42,92±2,30), mostrando um efeito benéfico do tratamento das drogas

associadas que foram testadas sobre a memória espacial (Figura 10).

P á g i n a | 64


(10mg/kg, ip) no teste de labirinto aquático. Os valores representam a média ±

EPM do número de grooming durante 5 min.

F.O.

ISQ.

AV25

AV50

AV10

0

0

20

40

60

a a

ISQ

a

Te

mp

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lata

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F.O.

ISQ.

AV25

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AV50

+ L

IT

AV10

0 +

LIT LIT

0

20

40

60

Te

mp

o p

ara

en

co

ntr

ar

a p

lata

form

a (

s)

ISQ

aa

a a

a

P á g i n a | 65


(10mg/kg, ip) no teste de labirinto aquático.

Grupos Tempo para encontrar a

plataforma

Falso operado (FO) 20,11±2,16 a (35)





(AV100)

18,93±4,35 a (14)





Os valores representam a média ± EPM do número de grooming durante 5 min.


Keuls como teste post hoc. Valores significativos com p<0,1. a, p<0,01. b e p<0,05. c

quando comparados ao grupo isquemiado (ISQ).Teste t não pareado * quando


P á g i n a | 66

5.2 Dosagem de Monoaminas através de HPLC

5.2.1 Efeitos do ácido valpróico sozinho ou associado ao lítio sobre os níveis de DA e

DOPAC no corpo estriado de ratos após serem submetidos à isquemia cerebral global

O metabólito mais importante da dopamina (DA) no sistema nervoso central é o

ácido dihidroxifenilacético (DOPAC), o qual é indicativo da taxa de metabolização da

dopamina. Na dosagem de monoaminas através de HPLC, observou-se uma redução

significativa da dopamina no corpo estriado no grupo não tratado 7 dias após a isquemia

(1672±211,0) se comparado ao grupo falso operado (2779±221,6), assim como redução

do seu metabólito DOPAC (ISQ: 386,0±103,9; FO: 1245±157,8). Por outro lado, os

valores de DA retornaram a níveis semelhantes ao grupo FO após sete dias de

tratamento com ácido valpróico, nas doses de 50 e 100 mg/kg, visto que evidenciamos

um aumento na liberação de dopamina em relação ao grupo isquemiado (AV50:

3115±512,9; AV100: 4444±870,2; ISQ: 1672±211,0). Os níveis de DOPAC dos

animais tratados com as três doses aumentaram de forma significativa se comparado aos

animais isquemiados que não receberam tratamento (AV25: 818,4±125,8; AV50:

1084±172,3; AV100: 2177±354,8; ISQ: 386,0±103,9).

Ao analisarmos os níveis de DA e DOPAC nos grupos tratados com ácido

valpróico associado ao lítio observou-se um aumento significativo de ambos nas

dosagens utilizadas. Os valores de DA retornaram a níveis superiores ao grupo FO após

sete dias de tratamento com ácido valpróico e lítio, nas doses de 50 e 100 mg/kg em

relação ao grupo isquemiado (AV50: 5237±967,3; AV100: 6398±1234; Li:

3380±353,1; ISQ: 1484±223,0). Os níveis de DOPAC dos animais tratados com as

quatro doses também aumentaram de forma significativa quando comparados aos

animais isquemiados que não receberam tratamento (AV25: 3335±817,7; AV50:

3919±1221; AV100: 5963±1035; Li: 2925±230,8; ISQ: 618,9±95,66). Isto indica que

ocorreu recuperação da liberação da dopamina e DOPAC nos grupos tratados (tabela 05

e Figura 11).

P á g i n a | 67

Figura 11- Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) ou associado ao lítio sobre as

concentrações de DA em corpo estriado de ratos após serem submetidos à

isquemia cerebral global através de HPLC. Os valores representam a média ±

EPM.

FOIS

Q

AV25

AV50

AV10

0

0

2000

4000

6000

8000

a

ISQ

aa

DA

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g/g

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o)

FOIS

Q Li

AV25

+Li

AV50

+Li

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0

2000

4000

6000

8000

a

bc

b,c

ISQ

DA

(n

g/g

tec

ido

)

P á g i n a | 68


(10mg/kg, ip) sobre as concentrações de DOPAC em corpo estriado de ratos após

serem submetidos à isquemia cerebral global através de HPLC. Os valores


FOIS

Q

AV25

AV50

AV10

0

0

2000

4000

6000

8000

10000

ab

b

b

ISQ

DO

PA

C (

ng

/g t

ecid

o)

FOIS

Q Li

AV25

+Li

AV50

+Li

AV10

0+Li

0

2000

4000

6000

8000

10000

a

b

b

a,a,b

ISQ

DO

PA

C (

ng

/g t

ecid

o)

P á g i n a | 69

Tabela 05 - Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado ao lítio

sobre as concentrações de dopamina e DOPAC em corpo estriado de ratos após

serem submetidos à isquemia cerebral global através de HPLC.

Grupos Dopamina DOPAC

Falso operado (FO) 3309±408,3 a

(14)

1525±314,7 b

(11)

Isquemiado (ISQ) 1672±211,0 (9) 386±103,9 (5)

ISQ+Ác. Valpróico 25 mg/kg 2012±322,8 (8) 818,4±125,8 b (5)

ISQ+Ác. Valpróico 50 mg/kg 3155±497,1 a (6) 1721±354,6 b (7)

ISQ+Ác. Valpróico 100 mg/kg 3498±529,52 a

(7)

2476±311,6 a (7)

Falso operado (FO) 3285±457,6 c

(12)

2370±327,4 b (9)

Isquemiado (ISQ) 1732±314 (8) 825,2±159,9 (7)

ISQ + Ác. Valpróico 25 mg/kg + Li 3885±423,5 (9) 2925±230,8 (6)

ISQ + Ác. Valpróico 50 mg/kg + Li 3848±569,6 a

(10)

3747±830,5 a (9)

ISQ + Ác. Valpróico 100 mg/kg + Li 5529±867,9 a,b

(7)

6859±1144 a,a,b

(7)

ISQ + Lítio 10 mg/kg (Li) 5614±1007 b (7) 6494±998 b (6)

Os valores representam a média ± EPM. Para análise estatística foi utilizado

ANOVA de uma via seguido por Newman Keuls como teste post hoc. Valores

significativos com p<0,1. a e p<0,05. b quando comparado aos grupos falso

operado (FO); Test t não pareado * quando comparado ao grupo isquemiado

(ISQ).

P á g i n a | 70

5.3 Atividade antioxidante

5.3.1 Efeitos do ácido valpróico sozinho ou associado ao lítio sobre a peroxidação

lipídica (tbars) no corpo estriado, córtex pré-frontal e hipocampo de ratos após serem


Os efeitos do ácido valpróico sozinho ou associado ao lítio sobre a lesão

oxidativa ocorrida na isquemia cerebral após oclusão bilateral das artérias carótidas

foram avaliados através do teste TBARS para a dosagem das concentrações de

malondialdeído (MDA) como índice de peroxidação lipídica, com o objetivo de

identificar a neurotoxicidade induzida pela isquemia com relação ao estresse oxidativo e

a geração de radicais livres.

As concentrações de MDA no corpo estriado e córtes pré-frontal sete dias após a

isquemia cerebral global estão representadas nas figuras 13 e 14 respectivamente. Na

avaliação dos grupos que foram tratados com AV a isquemia cerebral promoveu uma

alteração no índice de peroxidação lipídica no corpo estriado observando-se um

aumento significativo dos níveis de MDA (μmol/g de tecido) quando comparado ao

grupo falso operado (FO: 432,6±20,50 a; ISQ: 1029±88,69). O tratamento com AV nas

doses de 25, 50 e 100 mg/kg reverteu esse efeito. Resultado este estatisticamente

significativo quando comparado ao grupo isquemiado (AV25: 449,6±20,82 a; AV50:

493,6,±19,76 a; AV100: 536,2±32,93 a). Nos grupos tratados com ácido valpróico em

associação com lítio também houve redução destes índices em todas as doses utilizadas

quando comparadas ao grupo isquemiado (AV25: 694,1±45,14b; AV50: 646,1±27,51b;

AV100: 413,3±60,90 a; Li: 658,5±67,37 b).

O tratamento com ácido valpróico nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg reduziu,

significantemente, o grau de peroxidação lipídica no córtex 7 dias após a isquemia

cerebral global, quando comparado ao grupo isquemiado (FO: 352,5±34,81a; ISQ:

1164±105,2; AV25: 559,2±68,86a; AV50: 465,9±44,03a; AV100: 620,9±65,74a). De

maneira semelhante obteve-se resultados siginificativos em todas as doses, pelo qual o

ácido valpróico foi administrado em associação ao lítio quando comparado ao grupo

isquemiado (AV25: 479,6±43,6 a; AV50: 602,6±52,25a; AV100: 536,1±31,71a; Li:

462,5±52,92a).

P á g i n a | 71

Figura 13- Efeitos da AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado ao Li (10

mg/kg ip) sobre os níveis de malondialdeído (MDA), utilizado como índice de

peroxidação lipídica, no corpo estriado de ratos após serem submetidos à isquemia

cerebral global. Os valores representam a média ± EPM.

FOIS

Q

AV25

AV50

AV10

0

0

500

1000

1500

aa

aa

ISQ

TB

AR

S (

mo

l M

DA

/g d

e t

ecid

o)

FOIS

Q

AV25

+Li

AV50

+Li

AV10

0+Li Li

0

500

1000

1500

ISQ

aa

bb b

TB

AR

S (

mo

l M

DA

/g d

e t

ecid

o)

P á g i n a | 72

Tabela 06- Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado ao Li (10

mg/kg ip) sobre os níveis de malondialdeído (MDA) utilizado como índice de

peroxidação lipídica, no estriado de ratos após serem submetidos à isquemia

cerebral global.

Grupos TBARS (μmol MDA/g tecido)


Isquemiado (ISQ) 1029±88,69 (5)


ISQ + Ácido Valpróico 50 mg/kg (AV50) 493,6,±19,76 a (7)


(AV100)

536,2±32,93 a (6)




ISQ + Lítio 10 mg/kg (Li) 658,5±67,37 b (6)



significativos com p<0,1. a e p<0,01. b quando comparado ao isquemiado (ISQ).

P á g i n a | 73

Figura 14 - Efeitos da AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado ao lítio (10

mg/kg ip) sobre os níveis de malondialdeído (MDA), utilizado como índice de

peroxidação lipídica, no córtex pré-frontal de ratos após serem submetidos à


FOIS

Q

AV25

AV50

AV10

0

0

500

1000

1500

ISQ

a

aa

a

TB

AR

S (

mo

l M

DA

/g d

e t

ecid

o)

FOIS

Q

AV25

+Li

AV50

+Li

AV10

0+Li

Li

0

500

1000

1500

ISQ

aa

aa a

TB

AR

S (

mo

l M

DA

/g d

e t

ecid

o)

P á g i n a | 74

Tabela 07- Efeitos do ácido valpróico (25, 50 e 100mg/kg, vo) associado ou não ao

lítio (10 mg/kg ip) sobre os níveis de malondialdeído (MDA), utilizado como índice

de peroxidação lipídica, no córtex de ratos após serem submetidos à isquemia

cerebral global.







(AV100)

620,9±65,74 a (6)







significativos com p<0,1. a quando comparado ao grupo isquemiado (ISQ).

P á g i n a | 75

A figura 15 representa as concentrações de MDA no hipocampo sete dias após a

isquemia cerebral global. Observa-se que o tratamento apenas com ácido valpróico

reduziu os níveis de MDA em todas as doses utilizada quando comparado ao grupo

falso operado e isquemiado (FO: 358,7±35,61a; ISQ: 1106±49,25; AV25: 497,7±43,89

a,b; AV50: 559,6±28,44a,b; AV100: 590,2±73,97a,b). Da mesma forma, nos grupos

tratados com AV em associação com o lítio observou-se redução significativa das

concentrações de MDA (μmol/g de tecido) quando comparado aos grupos controles

falso operado e isquemiado (AV25: 770,2±47,34a,b; AV50: 555,5±28,75 a,b; AV100:

696,7±54,96 a,b; Li: 536,6±66,41a,b).

P á g i n a | 76

Figura 15 - Efeitos da ácido valpróico (25, 50 e 100mg/kg, vo) associado ou não ao


de peroxidação lipídica, no hipocampo de ratos após serem submetidos à isquemia

cerebral global. Os valores representam a média ± EPM.

FOIS

Q

AV25

AV50

AV10

0

0

500

1000

1500

ISQ

a

a,b a,ba,b

TB

AR

S (

mo

l M

DA

/g d

e t

ecid

o)

FOIS

Q

AV25

+Li

AV50

+Li

AV10

0+Li Li

0

500

1000

1500

ISQ

a

a,b

a,b

a,b

a,b

TB

AR

S (

mo

l M

DA

/g d

e t

ecid

o)

P á g i n a | 77

Tabela 08- Efeitos do ácido valpróico (25, 50 e 100mg/kg, vo) associado ou não ao


de peroxidação lipídica, no hipocampo de ratos após serem submetidos à isquemia

cerebral global.




ISQ + Ácido Valpróico 25 mg/kg (AV25) 497,7±43,89 a,b (6)

ISQ + Ácido Valpróico 50 mg/kg (AV50) 559,6±28,44 a,b (7)


(AV100)

590,2±73,97 a,b (5)

ISQ + Ácido Valpróico 25 mg/kg + Li 770,2±47,34 a,b (6)



ISQ + Lítio 10 mg/kg (Li) 536,6±66,41 a,b (6)



significativos com p<0,01. a e b quando comparado ao grupo falso operado (FO) e

isquemiado (ISQ), respectivamente.

P á g i n a | 78

5.3.2 Efeitos do ácido valpróico sozinho ou associado ao lítio sobre a concentração de

nitrito no corpo estriado, córtex pré-frontal e hipocampo de ratos após serem


Por meio da dosagem de nitrito é possível avaliar a presença de óxido nítrico no

tecido, já que o nitrito é um de seus metabólitos, sendo assim utilizado como marcador

indireto da formação de radicais livres. A avaliação de nitrito no corpo estriado de ratos

mostrou que houve redução significativa dos níveis de nitrito nos grupos tratados com

ácido valpróico sozinho nas dos de 50 e 100 mg/kg quando comparado ao grupo

isquemiado (FO: 9,31±1,16a; ISQ: 15,98±1,33; AV25: 13,3±0,79; AV50: 10,14±0,56 b;

AV100: 10,63±0,68b). O tratamento de ácido valpróico associado ao lítio apresentou

uma redução significativa somente na dose de 100 mg/kg e no tratamento feito apenas

com o lítio quando comparado ao grupo isquemiado (AV100: 6,05±0,68a; Li:

7,25±1,14a).

Quando o tecido avaliado foi o córtex pré-frontal, nenhum dos grupos em

questão apresentou diferenças entre si quanto às concentrações de nitrito comparando-se

ao controle isquemiado.

A isquemia promoveu um aumento significativo nos níveis de nitrito no

hipocampo sete dias após serem submetidos à cirurgia quando comparados ao grupo

controle isquemiado, como pode ser observado na figura 20. O AV em todas as doses

reduziu o nível de nitrito das amostras em relação ao grupo controle isquemiado (FO:

8,42±0,48a; ISQ: 19,63±1,96; AV25: 11,40±1,02a; AV50: 8,76±0,48a; AV100:

12,12±0,88a).

Em se tratando da avaliação dos níveis de nitrito no hipocampo de ratos tratados

com ácido valpróico associado a lítio observou-se que o tratamento foi capaz de

restaurar os níveis de nitrito para valores significativos em todas as doses inclusive no

tratamento feito apenas com lítio (AV25: 12,48±1,43a; AV50: 9,37±1,26a; AV100:

10,03±0,79a; Li: 5,72±1,01a,b).

P á g i n a | 79

Figura 16 - Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado ao lítio

(10mg/kg, ip) sobre a concentração de nitrito no corpo estriado de ratos 7 dias após

serem submetidos à isquemia cerebral global. Os valores representam a média ±

EPM.

FOIS

Q

AV25

AV50

AV10

0

0

5

10

15

20

a b b

ISQ

Nit

rito

(

mo

l/g

de t

ecid

o)

FOIS

Q

AV25

+Li

AV50

+Li

AV10

0+Li Li

0

5

10

15

20

a

a

a

ISQ

Nit

rito

(

mo

l/g

de t

ecid

o)

P á g i n a | 80

Tabela 09- Efeitos do ácido valpróico (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado

ao lítio (10mg/kg, ip) sobre os níveis de nitrito no estriado de ratos 7 dias após


Grupos Concentração de Nitrito (μmol/g tecido)




ISQ + Ácido Valpróico 50 mg/kg (AV50) 10,14±0,56 b (6)


(AV100)

10,63±0,68 b (6)








isquemiado (ISQ), respectivamente. Teste t não pareado * quando comparado ao

grupo isquemiado (ISQ).

P á g i n a | 81

Figura 17 - Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado ao lítio

(10mg/kg, ip) sobre a concentração de nitrito no córtex pré-frontal de ratos 7 dias

após serem submetidos à isquemia cerebral global. Os valores representam a

média ± EPM.

FOIS

Q

AV25

AV50

AV10

0

0

5

10

15

20

ISQ

a

Nit

rito

(

mo

l/g

de t

ecid

o)

FOIS

Q

AV25

+Li

AV50

+Li

AV10

0+Li Li

0

5

10

15

20

b

ISQ

Nit

rito

(

mo

l/g

de t

ecid

o)

P á g i n a | 82

Tabela 10 - Efeitos do ácido valpróico (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado

ao lítio (10mg/kg, ip) sobre os níveis de nitrito no córtex pré-frontal de ratos 7 dias

após serem submetidos à isquemia cerebral global.


Falso operado (FO) 7,32±1,07 (7)





(AV100)

14,07±1,41 (6)




ISQ + Lítio 10 mg/kg (Li) 10,99±0,74 (7)






P á g i n a | 83

Figura 18 - Efeitos do ácido valpróico (25, 50 e 100mg/kg, vo) associado ou não ao

lítio (10mg/kg, ip) sobre a concentração de nitrito no hipocampo de ratos 7 dias

após serem submetidos à isquemia cerebral global. Os valores representam a

média ± EPM.

FOIS

Q

AV25

AV50

AV10

0

0

5

10

15

20

25

ISQ

a

a

a

a

Nit

rito

(

mo

l/g

de t

ecid

o)

FOIS

Q

AV25

+Li

AV50

+Li

AV10

0+Li Li

0

5

10

15

20

25

a

a

a a

a,b

ISQ

Nit

rito

(

mo

l/g

de t

ecid

o)

P á g i n a | 84

Tabela 11 - Efeitos do ácido valpróico (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado

ao lítio (10mg/kg, ip) sobre os níveis de nitrito no hipocampo de ratos 7 dias após








(AV100)

12,12±0,88 a (6)




ISQ + Lítio 10 mg/kg (Li) 5,72±1,01 a,b (6)






P á g i n a | 85

5.4 Análise histológica e imunohistoquímica


para a enzima óxido nítrico sintase induzida (iNOS) nas áreas CA1, CA3, CT e GD do


A lesão ocasionada pela isquemia cerebral global conduz a eventos inflamatórios

com aumento da expressão da enzima iNOS em áreas cerebrais sensíveis a este dano,

como é o caso do hipocampo. Com isso, foi avaliada de maneira qualitativa e

quantitativa a imunorreatividade para iNOS em algumas áreas hipocampais, como CA1,

CA3, CT e GD.

Observou-se através da análise quantitativa das imagens a imunohistoquímica

para iNOS em que os ratos do grupo isquemiado tiveram aumento na imunomarcação

em todas as áreas hipocampais. O tratamento com ácido valpróico nas doses de 50 e 100

mg/kg reduziu significativamente esta imunomarcação (figuras 21 a 24).

P á g i n a | 86

Figura 19 - Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para

iNOS na área CA1 hipocampal 7 dias após a isquemia em ratos tratados com AV

nas doses de 50 e 100 mg/kg. Escala 200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a

quantificação da densidade óptica obtida através do programa Image J®. ANOVA

de uma via seguido por Newman Keuls como teste post hoc.


iNOS na área CA3 hipocampal 7 dias após a isquemia em ratos tratados com AV

nas doses de 50 e 100 mg/kg. Escala 200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a

quantificação da densidade óptica obtida através do programa Image J®. ANOVA


P á g i n a | 87


iNOS na área do córtex (CT) após a isquemia em ratos tratados com AV nas doses

de 50 e 100 mg/kg. Escala 200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a quantificação da

densidade ótica obtida através do programa Image J®. ANOVA de uma via

seguido por Newman Keuls como teste post hoc.

Figura 22 – Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para

iNOS na área do giro dentado (GD) após a isquemia em ratos tratados com AV nas

doses de 50 e 100 mg/kg. Escala 200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a

quantificação da densidade ótica obtida através do programa Image J®. ANOVA


P á g i n a | 88


para enzima ciclooxigenase – 2 (COX-2) nas áreas CA1, CA3, CT e GD do


A COX é uma enzima que catalisa a síntese de prostanóides, no atual estudo a

isoforma analisada foi a forma induzível, a COX-2. Esta é rapidamente expressa em

vários tipos de células em resposta a citocinas, fatores de crescimento e moléculas pró-

inflamatórias.

Os resultados da imunohistoquímica para COX-2 em hipocampo de ratos

isquemiados sete dias após a isquemia, mostraram que o processo isquêmico aumenta o

número de células COX-2 positivas, considerando que a marcação está mais intensa

neste grupo em relação aos grupos FO. Das figuras 25 a 28, pode-se observar aumento

na imunomarcação nas áreas CA1, CA3, CT e GD em relação ao grupo ISQ. O ácido

valpróico reduziu de maneira significativa esta imunomarcação nas doses de 50 e 100

mg/kg.

P á g i n a | 89


COX-2 na área CA1 hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas



de duas vias seguido por Newman Keuls como teste post hoc.


COX-2 na área CA3 hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas




P á g i n a | 90


COX-2 na área CT hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas





COX-2 no giro dentado (GD) hipocampal após a isquemia em ratos tratados com

AV nas doses de 50 e 100 mg/kg. Escala 200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a



P á g i n a | 91


para fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) nas áreas CA1, CA3, CT e GD do


Os resultados da imunohistoquímica para TNF-α em hipocampo de ratos

isquemiados sete dias após a cirurgia, mostraram que o processo isquêmico reduz o

número de células TNF-α positivas em todas as áreas, considerando que a marcação está

mais intensa no grupo isquemiado.

É possível observar este efeito nas figuras 29 e 32, onde houve aumento na

imunomarcação, quando comparado ao grupo FO. A administração de ácido valpróico

reduziu de maneira significativa esta imunomarcação nas doses de 50 e 100 mg/kg,

como pode ser observado abaixo.


TNF-α na área CA1 hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas




P á g i n a | 92







TNF-α no CT hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas doses de

50 e 100 mg/kg. Escala 200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a quantificação da



P á g i n a | 93


TNF-α no GD hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas doses de

50 e 100 mg/kg. Escala 200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a quantificação da



P á g i n a | 94

Nossos resultados mostraram que a imunomarcação para TNF-α no hipocampo

foi mais intensa no grupo isquemiado, por outro lado quase nenhuma marcação é

encontrada no grupo falso-operado (FO). A coadministração de ácido valpróico e lítio

reduziu de maneira significativa esta imunomarcação nas doses de 50 e 100 mg/kg em

todas a áreas hipocamapais como pode ser observado abaixo, com destaque para a dose

de 50 mg/kg associada ao lítio. Esta marcação reduzida pra células que expressam TNF-

α nos grupos isquemiados tratados com AV e lítio sugere que a coadministração

melhore o processo isquêmico atuando em citocinas como o TNF-α (Figuras 33 a 36).



doses de 25, 50 e 100 mg/kg associados ao lítio. Escala 200 μm e aumento de 400x.

Ao lado, a quantificação da densidade ótica obtida através do programa Image J®.

ANOVA de uma via seguido por Newman Keuls como teste post hoc.

P á g i n a | 95



doses de 25, 50 e 100 mg/kg associados ao lítio. Escala 200 μm e aumento de 400x.



P á g i n a | 96


TNF-α no giro dentado (GD) hipocampal após a isquemia em ratos tratados com

AV nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg associados ao lítio. Escala 200 μm e aumento

de 400x. Ao lado, a quantificação da densidade ótica obtida através do programa

Image J®. ANOVA de uma via seguido por Newman Keuls como teste post hoc.

P á g i n a | 97


para a glicogênio sintase cinase-3 (GSK-3) nas áreas CA1, CT e GD do hipocampo de

ratos jovens submetidos à isquemia cerebral global

A atividade da GSK-3 modula diversos processos neuronais, incluindo a

sobrevivência, a apoptose e a dinâmica do citoesqueleto. A participação desta enzima

nos potenciais eventos neuroprotetores induzidos pelo acidente vascular encefálico

sobre células neuronais foi demonstrada uma vez que os níveis de GSK-3 apresentaram-

se aumentados em hipocampo de ratos isquemiados.

No entanto, através da análise quantitativa das imagens a imunohistoquímica

para GSK-3 o tratamento com ácido valpróico na dose de 100mg/kg e o lítio na dose de

10 mg/kg reduziu significativamente esta imunomarcação (figuras 34 a 36).


GSK-3 na área CA1 hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas

doses 100 mg/kg e lítio. Escala 200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a quantificação

da densidade ótica obtida através do programa Image J®. ANOVA de uma via


P á g i n a | 98


GSK-3 no CT hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas doses de

100 mg/kg e lítio. Escala 200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a quantificação da




gsk-3 no GD hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas doses de

100 mg/kg e lítio. Escala 200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a quantificação da



P á g i n a | 99

5.4.5 Efeitos do ácido valpróico sozinho ou associado ao lítio na

imunomarcação para a histona desacetilase (HDAC) nas áreas CA1 e GD do


A organização da cromatina é crucial para regulação da expressão gênica. Em

particular as proprieades e o posicionamento do nucleossomo influenciam na transcrição

em resposta a sinais intra e extracelulares. As HDACs são uma família de enzimas que

removem o resíduo acetil do aminoácido lisina presente na extensão N-terminal do

núcleo das histonas. Uma vez que a inibição da atividade de HDAC reverte o

silenciamento epigenético frequentemnte obervado em várias neuropatologias, divesos

inibidores de HDACs têm sido desenvolvidos para fins terapêuticos.

Nossos resultados mostraram que a imunomarcação para HDAC no hipocampo

foi intensa no grupo isquemiado, enquanto que quase nenhuma marcação é encontrada

no grupo falso-operado (FO). O tratamento com ácido valpróico na dose de 100 mg/kg,

assim como o lítio sozinho reduziu de maneira significativa esta imunomarcação em

ambas as áreas hipocampais. Esta marcação reduzida pra células que expressam HDAC

nos grupos tratados com AV e lítio sugere a inibição desta enzima resultando numa

melhora do processo (Figuras 37 e 38).

P á g i n a | 100


HDAC na área CA1 hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas

doses de 100 mg/kg sozinho e associado ao lítio. Escala 200 μm e aumento de 400x.



P á g i n a | 101


HDAC no GD hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas doses de

100 mg/kg sozinho e associado ao lítio. Escala 200 μm e aumento de 400x. Ao lado,

a quantificação da densidade ótica obtida através do programa Image J®. ANOVA


P á g i n a | 102

5.5 Efeitos do ácido valpróico sozinho ou associado ao lítio sobre o dano cerebral de

ratos após serem submetidos à isquemia cerebral global

Os animais submetidos à isquemia cerebral apresentaram um aumento

significativo da área de infarto cerebral (dano cerebral isquêmico) analisado sete dias

após a isquemia em relação aos animais falso-operados (FO: 159542±5826; ISQ:

52420±11636). Os animais tratados com ácido valpróico nas doses de 25, 50 e 100

mg/kg apresentaram uma redução significativa nesse dano cerebral (AV25:

169773±4161; AV50: 159631±7625; AV100: 191358±3946). Semelhantemente os

animais tratados com ácido valpróico associado a lítio em todas as doses também

mostraram uma relevante diminuição do dano isquêmico quando comparados ao grupo

controle isquemiado (FO: 170418±4607; ISQ: 93910±14778; AV25: 176404±5360;

AV50: 182678±6589; AV100: 182914±8774; Li: 161446±3615).

Figura 39 - Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) associado ou não ao lítio

(10mg/kg, ip) sobre o dano cerebral de ratos submetidos à isquemia cerebral. Os

valores representam a média ± EPM. Para análise estatística foi utilizado ANOVA

de uma via seguido por Newman Keuls como teste post hoc. Valores significativos

com p<0,05. a e b quando comparado ao grupo falso operado (FO) e isquemiado

(ISQ), respectivamente.

P á g i n a | 103

Figura 40 - Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) associado ou não ao lítio

(10mg/kg, ip) sobre o dano cerebral de ratos submetidos à isquemia cerebral. Os

valores representam a média ± EPM. Para análise estatística foi utilizado ANOVA

de uma via seguido por Newman Keuls como teste post hoc. Valores significativos

com p<0,05. a e b quando comparado ao grupo falso operado (FO) e isquemiado

(ISQ), respectivamente.

P á g i n a | 104

6. DISCUSSÃO

O Acidente Vascular Cerebral é a segunda causa mais comum de morte e a

principal causa de incapacidade física em adultos (BALAMI et al., 2011). Cerca de 30 a

60% dos pacientes acometidos apresentam algum grau de inaptidão física após o evento

agudo (MALMANN, 2012). Assim, torna-se cada vez mais necessário estudos que

busquem novas terapias capazes de melhorar a qualidade de vida desses pacientes.

O animal de experimentação escolhido para o estudo foi o rato Wistar albino,

macho, com peso variando entre 200 e 250g. É um mamífero que apresenta um custo

acessível para aquisição e manutenção, de fácil manuseio, elevada resistência à infecção

e ao trauma cirúrgico e com um sistema de homeostasia admirável, além de grande

semelhança, do ponto de vista da anatomia e fisiologia cerebrovasculares, com as outras

espécies inclusive a humana (TORRES, 2003).

O modelo escolhido no estudo para mimetizar a isquemia cerebral foi o da

oclusão bilateral das carótidas, que é caracterizado pela redução crítica do fluxo

sanguíneo cerebral, seguido por lesão neuronal. Esse modelo é utilizado para reproduzir

a isquemia cerebral global em humanos, visto que é uma das principais características

da parada cardíaca, o que leva a críticas alterações neurológicas ao paciente (LIM et al.,

2004).

A isquemia cerebral global em roedores é caracterizada morfologicamente por

um dano neuronal particularmente em áreas como o hipocampo, mas também no corpo

estriado e no córtex (BLOCK, 1999). O dano resultante ocorre nas células vulneráveis,

notavelmente da região CA1 e região hilar hipocampal estando freqüentemente

associada com déficits de memória (HODGES et al., 1997).

O modelo de oclusão das artérias carótidas comuns sem a indução da hipotensão

sistêmica não causa redução crítica da circulação sanguínea cerebral e de uma maneira

geral não compromete o estado energético do cérebro (GINSBERG; BUSTO, 1989).

Por conseguinte, o modelo proposto por ULRICH et al., (1998) foi escolhido e

modificado, no qual o tempo de clampeamento de ambas as artérias carótidas foi de 30

minutos, para garantir a sobrevivência dos animais, com baixa taxa de mortalidade

aguda, sendo adequado para protocolo de tratamento subcrônico.

A disfunção do sistema nervoso central e os déficits cognitivos são

consequências consistentes da isquemia/hipóxia em humanos e outros mamíferos

(HATTORI et al., 2000; MAUD, 2006) e, sendo o principal objetivo das pesquisas

P á g i n a | 105

experimentais sobre isquemia, a melhora do resultado funcional da recuperação em

humanos, o presente trabalho avaliou o efeito do ácido valpróico sobre a extensão da

lesão neuronal, disfunções neurológicas, os déficits sensório-motor bem como as

alterações na memória dos animais submetidos à isquemia cerebral global transitória

por oclusão bilateral das artérias carótidas.

Estudos in vitro apontam que o ácido valpróico, uma droga anticonvulsivante e

estabilizadora do humor, tem efeitos neuroprotetores. Ming Ren (2004) relatou que o

AV usado na dose de 300 mg/kg reduziu danos cerebrais de ratos submetidos a

isquemia cerebral focal transitória por oclusão da artéria cerebral média. O tratamento

com AV suprimiu a ativação da enzima caspase-3 no córtex cerebral, bem como

aumentou os níveis de histona H3 no córtex e no estriado de ambos os hemisférios

ipsilateral e contralateral do cérebro observados 24 e 48h após a isquemia. O aumento

observado em níveis de histonas acetiladas no córtex e no corpo estriado de ratos

isquêmicos tratados com AV sugerem que a HDAC é efetivamente inibida pela presente

droga, confirmando em estudos in vitro que o AV é um inibidor direto da HDAC

(PHIEL et al., 2001).

Ximenes (2015) relatou o efeito neuroprotetor do AV em modelo de Parkinson

induzido por 6-OHDA. O ácido valproico reverteu parcialmente as alterações

comportametais e neuroquímicas induzidas no protocolo por 6-OHDA. Estes efeitos

estão provavelmente relacionados com a atividade antiinflamatória do AV sugerindo-o

fortemente como potencial candidato para ser incluso em estudos translacionais no

tratamento de doenças neurodegenerativas como Parkinson.

O lítio é muito utilizado na psiquiatria para o tratamento de desordens mentais

graves. Atualmente, as principais indicações médicas de lítio são para curto e longo

prazo no tratamento de transtorno bipolar e como coadjuvante no tratamento de quadros

depressivos. Mais recentemente, crescentes evidências vêm indicando que os benefícios

neurobiológicos do lítio pode ir além da estabilização do humor. Em modelos

experimentias, o tratamento com lítio tem sido associado à neuroprotecção, devido aos

seus efeitos sobre os vários mecanismos de homeostase neuronal envolvidos na ativação

de respostas neurotróficas, autofagia, estresse oxidativo, inflamação, regulação da

função mitocondrial e efeitos biológicos específicos implicados na patogênese de

doenças neurodegenerativas tais como, a doença de Alzheimer e a esclerose lateral

amiotrófica (FORLENZA, 2014).

P á g i n a | 106

Nas duas últimas décadas, muitos estudos têm mostrado que o lítio tem vários

efeitos neuroprotectores. Vários mecanismos têm sido propostos para justificar tais

efeitos clínicos. Evidências de estudos pré-clínicos sugerem que a neuroproteção

induzida pelo lítio está relacionado principalmente à sua potente inibição da enzima

glicogênio sintase-quinase-3β (GSK-3β). O Lítio é conhecido por inibir diretamente

atividade da glicogénio sintase quinase-3 (GSK-3) (KLEIN E MELTON, 1996;

STAMBOLIC et al., 1996). A GSK-3 é geralmente considerada como tendo uma

função pró-apoptótica e a sua inibição resulta em uma eficaz citoproteção (BIJUR E

JOPE, 2000).

O ácido valpróico e o lítio são duas drogas essenciais usadas para o tratamento

do transtorno bipolar, atuando como estabilizadores do humor e têm sido

frequentemente utilizados em combinação para o tratamento de pacientes bipolares

resistentes a monoterapia com qualquer um dos fármacos. O AV, um inibidor da

histona-desacetilase (HDAC) e lítio, um inibidor de glicogénio-sintase-quinase-3 (GSK-

3) apresentam efeitos neuroprotectores. Estudos demonstram efeitos neuroprotetores

sinérgicos quando ambas as drogas são coadministradas. O pré-tratamento de células

granulares do cerebelo com AV ou lítio sozinhos fornece pouca ou nenhuma

neuroprotecção contra a morte celular induzida pelo glutamato. No entanto, a co-

atuação de ambas as drogas resultou no completo bloqueio de excitotoxicidade do

glutamato (YAN LENG, 2008).

LENG (2008) demonstraram efeitos neuroprotetores sinérgicos robustos

contra a excitotoxicidade do glutamato, quando o estabilizadores de humor AV e lítio

foram usados em combinação. Tais evidências mostram que a neuroproteção induzida

pelo sinergismo dos fármacos citados está correlacionada com a inibição de GSK-3

sugerindo ainda mais o potencial uso na combinação de lítio e inibidores de HDAC por

intervir na neurodegeneração induzida por glutamato.

CROCE (2014) avaliaram os efeitos neuroprotectores do cotratamento de AV

e Lítio contra a neurotoxicidade induzida por glutamato em células de neuroblastoma

SH-SY5Y e demonstraram que a neuroproteção está associada ao aumento da síntese e

expressão de RNAm do BDNF . Estes dados elucidam o mecanismo de ação dessas

duas drogas quando utilizadas em combinação no tratamento de distúrbios bipolares e

reforçam a idéia de que eles podem ser usados para a prevenção e/ou tratamento de

outras perturbações neurodegenerativas relacionadas com o glutamato .

P á g i n a | 107

No atual estudo os testes comportamentais foram iniciados sete dias após a

cirurgia de indução do AVC isquêmico, tempo para os animais recuperarem-se do

trauma cirúrgico e do estresse da oclusão bilateral das carótidas que perdurou por 30

minutos. No teste de campo aberto, mostrou-se que, após a isquemia cerebral global os

animais apresentaram não só um aumento da atividade locomotora, mas também no

comportamento de rearing em relação aos animais isquemiados que não receberam

tratamento. Estes parâmetros representam a principal resposta motora durante a

organização do comportamento exploratório horizontal e vertical (CRUSIO, 2001).

Estudos realizados por KANHERE (2013) utilizando protocolo experimental

semelhante ao nosso, mas com tempo de isquemia transitória menor (10 minutos)

mostraram resultados semelhantes no que se refere à atividade locomotora no teste de

campo aberto.

As funções neurológicas comprometidas e demonstradas no teste do campo

aberto, foram restauradas de forma significativa no grupo de animais que recebeu ácido

valpróico nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg, (v.o.) em relação ao grupo de animais

isquemiados que não receberam tratamento. Os animais que foram tratados com ácido

valpróico associado a lítio também apresentaram um aumento significativo em tais

parâmetros nas doses de 50 e 100 mg/kg, v.o., assim como o próprio lítio administrado

sozinho. Bian 2007 mostrou que e a hiperatividade e o défict de aprendizagem/memória

foram restaurados em estudos com gerbilos submetidos à isquemia global e pré-tratados

com Lítio.

Yan (2007) mostrou que o tratamento com lítio diminuiu o déficit

comportamental e funcional em ratos submentidos a isquemia cerebral global transitória

ao aumentar a atividade exploratória no teste de campo aberto em todos os parâmetros

analisados (travessias, rearing e grooming) tais dados sugerem que o lítio pode

melhorar a aprendizagem e a capacidade de memória por reduzir a morte celular por

apoptose na região CA1 do hipocampo. Além disso, Laura 2014, mostra em modelo de

mania que o AV e o lítio usados em doses superiores as nossas, revertem parcialmente a

hiperatividade induzida por D-anfetamina associando esse efeito com o aumento da

atividade HDAC em córtex pré-frontal.

As alterações na função sensoriomotora, particularmente a atividade locomotora,

são fatores que comumente podem confundir os resultados nos testes cognitivos

(HATTORI et al., 2000). Assim no teste de campo aberto objetiva também analisar se o

animal não adquiriu nenhuma disfunção motora grave como consequência da cirurgia o

P á g i n a | 108

que prejudicaria a realização dos testes de memória. Dessa forma, como obtivemos

resultados significativos da atividade exploratória vertical (rearing) do animal, os

animais não apresentaram um déficit motor severo, o que não prejudicou a realização

dos testes cognitivos.

Para avaliar as alterações na memória espacial foi utilizado o teste do labirinto

aquático previamente descrito por Morris (1984), que mostrou a necessidade de

referências externas à piscina para formar uma percepção global de localização,

dependente principalmente do hipocampo. Contudo, além do hipocampo, a memória

espacial avaliada no labirinto aquático também depende de outras regiões cerebrais

como o corpo estriado, demonstrado por Block (1999), onde a injeção de ácido

quinolínico no estriado induziu alterações no desempenho de ratos no labirinto aquático

de plataforma submersa (D’HOOGE, DE DEYNN, 2001).

Algumas evidências mostram que a isquemia cerebral global transitória em

ratos adultos é capaz de levar a graves deficiências de aprendizagem e memória

(HARTMAN et al, 2005; LANGDON et al, 2008). A memória de trabalho pode ser

definida como uma memória de curta duração para estímulos ou localizações espaciais,

sendo armazenada temporariamente, pois será utilizada para o planejamento de uma

ação futura (DUDCHENKO, 2004).

Para avaliar a memória espacial dos ratos submetidos à isquemia cerebral

global, foi realizado neste trabalho o teste do labirinto aquático 7 dias após a cirurgia. O

quadro isquêmico prejudicou significativamente a memória espacial dos animais

isquemiados, observada no teste, e este efeito foi completamente revertido após o

tratamento com ácido valpróico na dose de 25 mg/kg e em todas as doses em que foi

associado ao lítio, inclusive quanto o lítio foi administrado sozinho. Yan (2007)

mostrou que o tratamento com lítio melhora a aprendizagem e a capacidade de memória

no teste de labirinto aquático 8 dias após a isquemia cerebral. Corroborando com os

nossos resultados, Ayca (2014) evidencia que o lítio diminui os déficits de memória e

aprendizagem espaciais em ratos submentidos a isquemia cerebral global.

Aiguo (2013) avaliou a correlação entre os neurônios sobreviventes em CA1 e

o estado funcional do cérebro utilizando o labirinto de aquático para examinar a

aprendizagem envolvida entre hipocampo e memória de ratos tratados com AV (300

mg/kg) mostrando que o AV melhora graves deficiências no desempenho cognitivo

espacial induzidas por isquemia global transitória. Também existem relatos da

neuroproteção do ácido cafeico melhorando a aprendizagem e memória de ratos

P á g i n a | 109

submetidos ao teste do labirinto aquático 8 dias após sofrerem um dano cerebral

semelhante ao que este estudo relata.

Déficits cognitivos promovidos por isquemia não ocorrem apenas quando há

morte neuronal. Yamamoto et al. (2009) demonstraram que 20 minutos de isquemia por

oclusão das artérias carótidas promoveu morte neuronal em CA1 e déficit de memória e,

que ao diminuir o tempo de isquemia para 5 minutos, a morte neuronal não ocorria, mas

o déficit de memória persistia. Esse déficit foi correlacionado com a diminuição da

expressão de CaMK-II, MAP-2 e o receptor GluR1.

É sabido que condições associadas a eventos isquêmicos conduzem a uma

intensa liberação de neurotransmissores no cérebro e alterações isquêmicas no corpo

estriado, córtex e hipocampo de animais submetidos a modelos experimentais de

isquemia cerebral (PULSINELLI; DUFFY, 2004).

A dopamina regula inúmeras funções não só no cérebro, mas também fora dele.

Com isso, este neurotransmissor influencia no comportamento e na atividade motora,

contribui na aprendizagem e funções cognitivas, modula hábitos alimentares, além de

auxiliar a regulação do fluxo sanguíneo em vasos como artérias. O corpo estriado

representa o principal input dos gânglios da base e os neurônios do corpo estriado

recebem uma grande convergência de aferentes de todas as áreas do córtex, que tem um

papel integrativo e computacional crucial, levando a aquisição de ações cognitivas e

motoras (GRAYBIEL et al., 1994; WICKENS et al., 2003).

A nossa observação no sétimo dia após a isquemia cerebral mostrou níveis

restaurados de DA a valores considerados normais ao serem comparados com o grupo

falso operado em todas as doses estudadas, com exceção da menor dose que foi

utilizada de ácido valpróico. De forma semelhante, os níveis de DOPAC foram

aumentados em todas as doses analisadas após o evento isquêmico. Nossos resultados

corroboram com dados da literatura que demonstram que, em modelo de isquemia

cerebral transitória ratos pré-tratados com pentoxifilina tiveram os níveis de DA

preservados no estriado (VIANA, 2009).

Processos fisiológicos no corpo estriado sofrem influência da dopamina por

meio de vários mecanismos, incluindo a modulação de vários canais iônicos voltagem-

dependentes. Assim a DA através de sua interação com receptores D1 pode induzir

inibição reversível do potencial de ação mediado por Na+ em neurônios estriatais e

reduz a transmissão excitatória no estriado de maneira voltagem-dependente

(CALABRESI et al., 1987; SURMEIER et al., 1992). Além disso, a DA modula

P á g i n a | 110

correntes de Ca2+ ativadas por voltagem, reduzindo de modo reversível as correntes de

Ca2+ do tipo P e N e aumentando correntes do tipo L em neurônios estriatais, através de

um mecanismo mediado pela proteína quinase A (PKA). De modo oposto, a ativação de

receptores D2 suprime correntes de Ca2+ através de canais de Ca2+ do tipo L e modula

correntes de K+ (SURMEIER et al., 1995; HERNANDEZ-LOPEZ et al., 2000; LIN et

al., 1996). Algumas evidências sustentam a hipótese de que a dopamina provavelmente

exerce múltiplas ações sobre a atividade fisiológica de neurônios estriatais, tanto

inibindo quanto aumentando a atividade neuronal dependendo do grau de

despolarização da membrana e do estado fisiológico do neurônio (CALABRESI et al.,

2007).

Normalmente, diversas reações do nosso organismo envolvem a síntese de

radicais livres, principalmente espécies reativas de oxigênio, porém mecanismos

endógenos conseguem impedir danos celulares. Mas, em condições em que a produção

destas substâncias torna-se descontrolada, isso representa uma ameaça à homeostase e

pode causar danos celulares irreversíveis. Tal desequilíbrio leva a um processo

denominado estresse oxidativo (KOPPULA et al., 2012).

A lesão decorrente da isquemia cerebral permanente ou transitória desenvolve-se

a partir de uma série de eventos fisiopatológicos que progridem com o tempo e em

regiões cerebrais específicas. A redução do fluxo sanguíneo cerebral em 20% a 30%

abaixo do normal é suficiente para iniciar esses eventos (OHTAKI et al., 2005). Além

disso, as consequências da isquemia, em diferentes tecidos, dependem de sua duração e

das lesões que se desenvolvem durante o estágio de reperfusão tecidual (SILVA JR et

al., 2002).

EROs e ERNs são produzidos fisiologicamente através do metabolismo celular,

em concentrações moderadas e desempenham importantes papéis nos processos de

sinalização celular, apoptose, expressão gênica e transporte iônico. Essas moléculas são

rigidamente controladas por antioxidantes que podem agir de maneira direta, atuando

como “scavenger” (seqüestradores), ou de maneira indireta através do aumento da

expressão de enzimas antioxidantes (LU et al., 2010). Porém, o excesso desses radicais

resulta em estresse oxidativo, um processo deletério capaz de mediar danos a estruturas

celulares, como lipídeos, proteínas e DNA (VALKO et al., 2007).

Por isso investigamos os efeitos do ácido valpróico sobre o estresse oxidativo

nas seguintes áreas, corpo estriado, córtex pré-frontal e hipocampo. No presente

trabalho, a peroxidação lipídica, através da quantificação dos níveis de TBARS, foi

P á g i n a | 111

aumentada de modo significativo em cérebros de ratos que sofreram isquemia cerebral

global com relação ao grupo controle (falso operado). Esse efeito foi revertido após o

tratamento com ácido valpróico em todas as doses 7 dias pós-isquemia, no corpo

estriado. Assim como, os níveis de TBARS no córtex e no hipocampo foram

restaurados de maneira significativa em todas as doses analisadas apresentando

resultados significativos.

Um estudo conduzido por Chandrashekhar (2013) em que o protocolo

experimental de isquemia/reperfusão usado foi semelhante ao nosso, avaliou-se a

atividade neuroprotetora de Hibiscus vitifolius e mostrou que os níveis de TBARS

também reduziram quando comparados ao grupo controle. Estudos realizados com

modelo de indução de mania por administração de ketamina, tanto o ácido valpróico

como o lítio foram eficazes no controle dos níveis de TBARs, revertendo a

hiperatividade induzida (GHEDIM, 2012).

O óxido nítrico apresenta efeitos protetores durante a isquemia/reperfusão,

dilatando vasos e com isso aumentando a oferta de glicose e oxigênio, mas ao reagir

com o radical superóxido forma o íon peroxinitrito, conduzindo a efeitos deletérios no

tecido neuronal. Essa molécula é extremamente tóxica e danifica proteínas, lipídeos de

membrana e DNA. De maneira indireta podemos quantificar a produção do NO através

da dosagem de seu metabólito nitrito.

Com relação às concentrações de nitrito, indicador indireto de estresse oxidativo,

mostramos um aumento nos níveis de nitrito tanto no corpo estriado, como no

hipocampo. Estes efeitos foram revertidos pelo ácido valpróico neste protocolo

experimental O tratamento com ácido valpróico preveniu o aumento dos níveis de

nitrito no corpo estriado na dose maior e no hipocampo quando associado ao lítio nas

doses de 50 e 100 mg/kg.

Nossos resultados mostram que a isquemia cerebral global transitória induziu de

maneira significante a produção de marcadores de estresse oxidativo, com aumento da

liberação de MDA e nitrito, de maneira semelhante ao obtido no estudo de MARGAILL

et al., (2005). A morte neuronal tardia após isquemia transitória ocorre principalmente

devido à liberação de EROs e um aumento na peroxidação pode ser detectado

precocemente, logo após um quadro de isquemia/reperfusão (CHAN, 2001).

A imunomarcação para iNOS foi realizada em hipocampo sete dias após o

evento isquêmico. As áreas CA1, CA3, CT e GD foram analisadas, nas quais

observamos aumento da imunomarcação no grupo isquemiado quando comparado ao

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Chandrashekhar%20VM%5Bauth%5D

P á g i n a | 112

controle, e este aumento foi totalmente revertido nos grupos tratados com ácido

valpróico nas doses de 50 e 100 mg/kg.

As reações inflamatórias envolvidas no processo isquêmico são intensificadas

durante a reperfusão e são devidas ao grande influxo de leucócitos e neutrófilos para a

região infartada resultado da interferência de moléculas de adesão específicas e

citocinas. Estas agravam o dano tecidual pela liberação de radicais livres e produtos

citotóxicos. Entre estes o NO e prostaglandinas são dois tipos de mediadores

pleiotrópicos produzidos no local da inflamação por enzimas como a sintase do óxido

nítrico induzida (iNOS) e pelas ciclooxigenases (COX-1 e COX-2). Evidências

mostraram que tanto a COX-2, quanto a iNOS são expressas durante a isquemia

cerebral e contribuem para o dano isquêmico induzido pós-isquemia. Células

inflamatórias cerebrais residentes também se tornam ativadas na isquemia cerebral e

liberam vários mediadores inflamatórios como NO, TNF-α, IL-1β e glutamato

(CANDELARIO-JALIL; FIEBICH, 2008).

Nas áreas CA1, CA3, CT e GD foram realizadas as imunomarcações para COX-

2, 7 dias após a isquemia. No grupo isquemiado houve um aumento significativo da

coloração nas áreas analisadas, quando comparadas ao grupo falso operado. Nestas

áreas, após tratamento com ácido valpróico nas doses de 50 e 100 mg/kg, tiveram essa

imunomarcação consideravelmente reduzida.

Sabe-se que a expressão de COX-2 aumenta de modo persistente após isquemia

cerebral em vários modelos experimentais. Com isso, evidências mostraram que a

expressão para COX-2 está aumentada em neurônios na área hipocampal CA1 após a

isquemia cerebral antes da morte celular em modelo de isquemia global transitória em

ratos. Valores máximos na expressão de COX-2 foram observados 12 a 24 h pós-

isquemia em várias regiões hipocampais, mas na região CA1 a expressão de COX-2 em

neurônios foi observado até no 3º dia pós-isquemia (CANDELARIO-JALIL; FIEBICH,

2008).

Os mecanismos por trás da morte celular neuronal envolvem neuroinflamação,

excitotoxicidade, apoptose, mecanismos antioxidantes modificados e necrose. Estes

mecanismos podem ser explorados como potenciais alvos para novas potencialidades

terapêuticas. A inflamação após isquemia afeta o tecido por um período de dias a

semanas (SCHILLING et al., 2003). TNF-α é uma potente citocina pró-inflamatória que

causa dano inflamatório proeminente (IADECOLA; ANRATHER, 2011).

P á g i n a | 113

Neste estudo, também foi realizada a imunohistoquímica para TNF-α 7 dias após

a isquemia. As áreas CA1, CA3, CT e GD de animais isquemiados foram

significativamente marcadas em relação ao grupo controle. O ácido valpróico nas doses

de 50 e 100 mg/kg reduziram esta imunomarcação. De maneira semelhante bservou-se

resultados significativos na imunomarcação para TNF-α nos grupos coadministrados

com AV e lítio em todas as doses, com destaque para a maior dose (100 mg/kg + Li).

Estudos mostram que o AV reduziu a degeneração neuronal observada no corpo

estriado de ratos lesionados em protocolo de indução de Parkinson por 6-OHDA. Além

disso, o tratamento com AV diminuiu a reatividade e expressão de células do tecido

nervoso como, microglia e astrócitos, bem como imunomarcação de TNF-alfa e HDAC

(XIMENES et al., 2015).

Estudos conduzidos por SINGH (2013) mostram que ratos adultos submetidos à

oclusão bilateral das artérias carótidas comuns por um período de 15 minutos seguida de

reperfusão contínua, apresentaram um aumento significativo dos níveis de TNF-α em

homogenato cerebral. Este resultado corrobora com os do nosso estudo, no qual a

imunomarcação para TNF-α foi significativamente aumentada nos animais isquemiados

por modelo experimental semelhante. É possível que os efeitos neuroprotetores do ácido

valpróico envolvam inibições nas induções de iNOS, COX-2 e TNF-α no cérebro

isquêmico.

De maneira semelhante aos nossos resultados, XUAN (2012) demonstrou em

modelo de isquemia transitória global que o AV administrado duas vezes diariamente

na dose de 300 mg/kg preveniu a morte de neurônios em CA1 pós-isquemia, assim

como evidenciou um melhor desempenho na aprendizagem e tarefas de memória. A

neuroproteção induzida por AV, provavelmente envolve múltiplos mecanismos de ação,

incluindo a capacidade de inibir significativamente a inflamação cerebral induzida pela

isquemia a atividade de HDAC e superindução de HSP70.

A GSK-3 é altamente expressa no SNC, em neurônios as principais vias de

sinalização regulatórias da GSK-3 são a via Wnt/beta-catenina e a via PI3K/Akt

estimulando a sobrevivência e o crescimento celular. Com isso, a atividade da GSK-3

influencia diretamente ou não em diversas vias de sinalização intracelular que

controlam aspectos essenciais do funcionamento neuronal como neuroplasticidade,

neurotransmissão, metabolismo celular, crescimento neuronal, polarização e morte

neuronal além da neurogênese hipocampal (DINIZ; 2011; ALBERTS et al., 2010).

P á g i n a | 114

Evidências também apontam o envolvimento da GSK-3 em doenças

neurodegenerativas, como Alzheimer e doença de Huntingtion e em doenças

psiquiátricas, como esquizofrenia e transtorno bipolar. Portanto, a atividade da GSK-3

parece estar inversamente relacionada à viabilidade neuronal (MOLZ et al., 2011).

Nossos resultados demonstraram que os animais tratados com ácido vlapróico e lítio

tiveram níveis reduzidos de GSK-3β em relação aos controles.

Recentes estudos têm demonstrado que diversos agentes, alguns já utilizados na

terapêutica, como o ácido valpróico, atuam sobre o complexo enzimático que está

envolvido nas modificações das histonas, revertendo a alteração epigenética e

permitindo a reativação de genes supressores do tumor e/ou outros genes que são

cruciais para o funcionamento normal das células (YOO et al., 2006). O uso dos

inibidores de HDAC tem produzido resultados preliminares bastante promissores,

porém, ainda existe a necessidade de maiores estudos quanto aos seus mecanismos e

efeitos em longo prazo, visto que, somente com um completo entendimento desses

modificadores epigenéticos, será possível o desenvolvimento de terapias mais efetivas.

Nossos resultados mostraram que a imunomarcação para HDAC no

hipocampo reduziu de maneira significativa nas áreas CA1 e GD inicando que houve a

inibição desta enzima, o que resulta numa melhora do processo isquêmico. XIMENES

(2015) demonstrou em seus estudos com modelo de Parkinson induzido por 6-OHDA

que o AV reduziu a imunoreatividade para HDAC em áreas como CA1, CA3 e no

córtex temporal, sugerindo fortemente o ácido valpróico como um potencial candidato

para ser incluso em estudos translacionais para o tratamento de doenças

neurodegenerativas como Parkinson.

A extensão do dano cerebral foi determinada neste trabalho utilizando-se a técnica

de coloração com TTC, que se baseia na deposição de um complexo vermelho insolúvel

resultante da metabolização do TTC pela mitocôndria. O TTC é um sal que é reduzido

pela succinato desidrogenase na membrana interna da mitocôndria, formando um

composto denominado, formazan, pelo qual dá uma coloração avermelhada ao tecido

com células viáveis. Portanto nas regiões onde há dano mitocondrial não ocorre o

depósito de corante nas células, deixando a região pálida, sem coloração vermelha

(GOLDLUST, 1996; TUREYEN, 2005).

P á g i n a | 115

7. CONCLUSÕES

Neste estudo, mostramos que o ácido valpróico sozinho ou associado ao lítio

protegeu os animais contra danos comportamentais e cognitivos, neuroquímicos e

histológicos, em modelo de isquemia cerebral global transitória. Em alguns parâmetros

analisados o AV quando administrado sozinho mostrou um efeito dose-dependente.

Contudo, os efeitos deste fármaco foram potencializados quando coadministrado com o

lítio. Vale salientar que o lítio quando utilidado sozinho também mostrou uma atividade

relevante diante de alguns parâmetros. Os efeitos benéficos das drogas supracitadas

manifestaram-se como:

1. Reversão parcial das alterações comportamentais e cognitivas pós-isquemia,

avaliadas nos testes do campo aberto e labirinto aquático;

2. Restabelecimento das concentrações de monoaminas, observadas pós-isquemia;

3. Reversão do aumento nos níveis de peroxidação lipídica e de nitrito, demonstrados no

corpo estriado, córtex e hipocampo dos animais isquêmicos;

4. Diminuição do processo neuroinflamatório determinado pela menor imunomarcação

para iNOS, COX-2, TNF-alfa, GSK-3 e HDAC.

5. Redução do percentual da área de dano isquêmico cerebral por disfunção

mitocondrial (TTC).

Considerando que o ácido valpróico é um fármaco seguro, bem tolerado e

apresenta um largo espectro de ações neuroprotectoras, parece promissor para investigar

seus efeitos benéficos no modelo de isquemia encefálica em animais e nos ensaios

clínicos usando esta droga para tratar pacientes com AV. Concluímos que os efeitos

neuroprotetores do ácido valpróico sozinho e principalmente na co-administração com o

lítio como observados no presente trabalho no modelo de isquemia global transitória em

ratos são possivelmente resultantes de alguns fatores como uma ação antioxidante,

antiiflamatória e neuroprotora. A combinação de ácido valpróico e lítio demonstrou

aumentar os benefícios terapêuticos pós-dano isquêmico. Com isso, levanta-se a

possibilidade de que o co-tratamento do ácido valpróico com lítio pode produzir efeitos

sinérgicos ou mais fortes contra a morte de células neuronais em condições

neurodegenerativas como no acidente vascular encefálico isquêmco.

P á g i n a | 116

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