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Universidade Federal de Santa Catarina Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
Centro de Ciências BiológicasPrograma de Bolsas REUNI
Florianópolis, 23 de novembro de 2010
Proteômica
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Proteômica
A palavra PROTEOMA refere-se as PROTEínas expressas por um genOMA. Conceitualmente a proteômica engloba o somatório de todo o produto gênico, isto é, todas as proteínas em uma célula ou organismo vivo, podendo caracterizar processos biológicos e permitem a descrição de mecanismos celulares.
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Proteômica é a técnica utilizada para identificar todas as proteínas expressas por um genoma em um determinado tempo/espaço com o principal objetivo de elucidar os produtos gênicos a nível protéico.
Tempo
Espaço
Núcleo
Citoplasma
Membrana
Proteômica
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Proteômica
Proteômica sistemática: mapa protéico
Tecidos
Células
Compartimentos celulares
Proteômica diferencial: faz análise das modificações a nível protéico comparativamente com proteínas de referência
Desenvolvimento
Interações entre microorganismos e hospedeiros
Tratamentos
Proteômica
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Áreas de pesquisa : Caracterização do câncer
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1999 Proteoma do cérebro de camundongo
2006 Proteoma do hipocampo de camundongo
2005 Proteoma do complexo NMDA de camundongo em resposta à fármacos
2005 Proteoma do cérebro de rato
2008 Proteoma de hipocampo de rato sob exercício
2004 Proteoma de hipocampo humano
2001 Foi proposto pela HUPO a caracterização do Proteoma humano sob condições normais e patológicas
Área de pesquisa : Neuroproteômica – Caracterização do cérebro humano
2005 Proteoma de M.P de hipocampo de camundongo
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Revistas
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Etapas metodológicas
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Tratamento do animal
Extração das proteínas
Espectrometria de massa
Digestão in gel
Focalização isoelétrica
Principais etapas metodológicas
Eletroforese em gel 2-DE
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Isolamento de proteinas
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Extração da amostra
Tampão de lise:
25 mM Tris HCl pH 7,2 10 mM CHAPS 0,5 M NaCl 5% glicerol (v/v) 1 mM PMSF
Lise mecânica da célula
Centrifugação 30 min a 12000 x g a 4º C
Proteínas nucleares
Proteínas citoplasmáticas
Proteínas membranares
Precipitado é re-extraído
SN1+ SN2
Homogenato de ptns em gelo por 20 min
Lise da célula, proteção contra proteólise e fracionamento.
Estratégias a serem tomadas: manter a amostra na menor temperatura possível e utilizar o protocolo mais simples para evitar perda protéica.
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Quantificação das proteínas com 2D Quant Kit
Solução com Íon cúprico (Cu+1)
Cu+1
Cu+1
Cu+1
Cu+1
Agente colorimétrico
Cu+1
Cu+1 480 nm
Proteínas totais
MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS : Bradford, Biureto, Lowry e Smith ou BCA.
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Limpeza da amostra com Clean up Kit
100 ug /ul de proteína
Solução precipitante
Centrifugação
Baseada na precipitação por TCA
Diversas moléculas são eliminadas:
-DNA, lipídeos
- Sais, detergentes
Pellet de Proteína pura
Ressuspensão das ptns em 250uL tampão de reihidratação:
7 M Uréia
2 M Tiuréia
2%(p/v) CHAPS
0.5% de IPG buffer pH 3-10
18 mM DTT
0,001% azul de bromofeno
MÉTODOS BCA:
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Agentes redutores: DTT
Solubilização da amostra
Agentes Caotrópicos: Uréia e Tiouréia
Agentes Surfactantes: CHAPS
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Hidratação do strip
Tiras de strip de 13 cm imobilizado com pH 3-10
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Strips foram removidos
Cerâmica IEF Strips foram posicionados
Paper Pads umedecidos
Total: 15500 V/h e 25 uA/strip
Ettan IPGphor 3 Ajuste dos eletrodos
Focalicalização isoelétrica (IEF)
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Separação das proteínas por pI
Gel poliacrilamida 12,5%
Cuba vertical Hoefer SE Ruby
Separação das ptns por massa
Proteínas separadas por pI e massa
1º DTT
2º Iodoacetamida
Coloração: Coomassie Blue G-250 por 24h
Fixação: 8% de ácido fosfórico, 50% de etanol por 1 hora
Eletroforese em gel bidimensional (2D)
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Análise simultânea de diversas proteínas. Permite comparar todas as proteínas expressas por uma célula em condições diferentes.
Separação de proteínas com eletroforese em gel 2D
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Análise das imagens no gel
Posição dos spots (Ex. modificações pós-traducionais)
Volume dos spots: permitindo uma quantificação relativa
Presença ou Ausência de spots
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Digestão in gel
Descoloração:
25 mM bicarbonato de amônio e 50% acetonitrila
Tripsinização
(entre os resíduos de lisina e arginina)
Extração de petídeos: 50% de acetonitrila e 5% trifluoroacético
Peptídeos são secos à vácuo
Estocagem a -20ºC
Excisão dos spots
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Espectrometria de massa é uma técnica que permite determinar a massa molecular de proteínas/peptídeos e a seqüência de aminoácidos.
Esta informação é utilizada para identificar a proteína comparando bases de dados de seqüência de nucleotídeos e de proteínas.
Também é utilizada para determinar o tipo e localização das modificações pós-traducionais das proteínas.
Identificação das proteínas por Espectrometria de Massa
Amostras 2-DE
Fonte de ionização
Analisador de massa
Detector
Sistema à vácuo
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Peptídios são ionizados
Os íons são dessorvidos
Peptídeos são homogenizados com pequenos compostos orgânicos
Estes compostos reagem com a matriz orgânica ácido -ciano-4-hidroxicinâmico
Espectômetro de Massa
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Os íons são acelerados alcançando alta energia cinética
Colisão dos íons ao detector
Espectômetro de Massa
As massas dos fragmentos são separadas e detectadas
As massas digeridas dos peptídeos são comparadas com uma lista de massas teóricas de peptídeos oriundas das ORFs do banco de dados do genoma de um organismo
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Espectômetro de Massa
Identificação de cada proteína do mapa proteômico
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Proteômica
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Array-based protein interaction detection
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Array-based protein interaction detection
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Protein microarrays
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