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UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
Departamento de Farmácia - Escola de Farmácia
Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas
Área de Concentração: Fármacos e Medicamentos
Sub-área: Estudo e Desenvolvimento de Medicamentos
DESENVOLVIMENTO DE PRODUTO LIOFILIZADO QUE SE TRANSFORMA EM GEL
NO TRATO GASTRINTESTINAL E PROMOVE A ABSORÇÃO DE INSULINA NA
MUCOSA DO INTESTINO
Thaïs Seixas Certo
Orientador: Prof. Dr. José Mario Barichello
Ouro Preto – Minas Gerais – Brasil
Abril de 2013
THAÏS SEIXAS CERTO
DESENVOLVIMENTO DE PRODUTO LIOFILIZADO QUE SE TRANSFORMA EM GEL NO TRATO GASTRINTESTINAL E PROMOVE A ABSORÇÃO DE INSULINA NA
MUCOSA DO INTESTINO
Ouro Preto – Minas Gerais – Brasil
Abril de 2013
Dissertação, como requisito parcial, para obter o grau de mestre em Ciências Farmacêuticas, submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Escola de Farmácia da Universidade Federal de Ouro Preto. Orientador: Prof. Dr. José Mario Barichello - UFOP
Catalogação: [email protected]
C418d Certo, Thais Seixas.
Desenvolvimento de produto liofilizado que se transforma em gel no trato gastrintestinal e promove a absorção de insulina na mucosa do intestino [manuscrito] / Thais Seixas Certo – 2013.
xi, 77 f.: il. color.; grafs.; tabs. Orientador: Prof. Dr. José Mario Barichello. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Escola de Farmácia. Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Área de concentração: Estudos e Desenvolvimento de Medicamentos.
1. Insulina- Teses. 2. Ácidos graxos - Ácido oleico - Teses. 3. Permeação - Agentes promotores - Teses. 4. Desidratação - Teses. 5. Hidratação - Teses. I. Barichello, José Mario. II. Universidade Federal de Ouro Preto. III. Título.
CDU: 615.015:612.349
Este trabalho contou com a colaboração de:
Acurácia Pharmaceutica
Mariana, Minas Gerais
Prof. Dr. Robson José de Cássia Franco Afonso
Laboratório de Cromatografia, Caracterização Molecular e Espectrometria de Massas –
LABMASSAS
DEQUI – ICEB – UFOP
Dedico este trabalho aos meus pais, irmão e amigos
que sempre me apoiaram e incentivaram para a conquista desta titulação
AGRADECIMENTOS
Agradeço aos meus pais por sempre estarem presentes na minha caminhada e apoiarem
minhas escolhas.
Ao meu irmão por ser tão amigo e companheiro.
Aos meus primos Victor, Cássio, Dê, Chris que souberam compreender a falta e foram
companheiros quando presentes.
Aos sempre amigos e conselheiros, Mari, Keilinha, Lidi, Monique e Lucas Mathias, que
compartilharam comigo anseios e conquistas.
Ao Evandro pela cumplicidade e paciência infinita.
Aos parceiros do mestrado Ana Paula Alves, Ana Paula de Battisti, Carol Licio, Karen,
Karime, Lorena, Pollyana, Shiara, Simone, Vanessa e Ricardo, que dividiram dúvidas e
conhecimentos.
Aos companheiros de bancada Débora, Gabriel, Júnia, Lucas Andrade e Mariana de Matos
por contribuírem com a minha aprendizagem.
Ao Leo, a Pati e a Mirela pela disposição em ajudar.
Ao professor Dr. José Mario Barichello, pela oportunidade e confiança depositada para condução
deste trabalho.
Aos professores da pós-graduação, por contribuírem com meu aprimoramento e pelos conselhos.
A todos que contribuíram de alguma forma para a realização deste trabalho.
À encantadora Ouro Preto pelos dias de sol e pelos nublados também.
A Deus.
“Droit devant soi on ne peut pas aller bien loin”
“Je ne connais qu’une liberté, et c’est la liberté de l’esprit”
vii
RESUMO
O objetivo desse trabalho foi desenvolver um produto liofilizado a partir de soluções aquosas
micelares de Pluronic® F-127 (F127) contendo insulina (INS) e ácido oleico (AO). Espera-se que
este produto liofilizado se transforme em gel no trato gastrintestinal e promova a absorção de INS
na mucosa do intestino. Primeiramente avaliou-se o efeito de diferentes concentrações de F127 e
AO sobre a capacidade das soluções alcançarem o estado gel a 37 °C. O perfil de liberação de INS a
partir das formulações no estado gel foi avaliado in vitro em meio de dissolução tampão fosfato pH
7,4. A partir deste estudo, ajustes nas concentrações de F127 e AO foram feitos e dois produtos
liofilizados foram desenvolvidos. A reidratação do produto liofilizado, bem como, o perfil de
liberação de INS e o tamanho médio das micelas/partículas formadas no meio de dissolução (HCl
0,1M, tampão fosfato pH7,4, solução de sais biliares 0,1 e 1,0%) foram avaliados. Na parte final do
trabalho, cápsulas liofilizadas contendo INS e AO e diferentes concentrações de F127 e sais biliares
(SB) foram desenvolvidas. A reidratação e o perfil de liberação de INS em tampão fosfato pH 7,4 a
partir dos produtos liofilizados foram avaliados. De um modo geral, levando-se em conta o menor
tamanho encontrado para as micelas/partículas nos meios de dissolução contendo SB e uma
liberação da INS mais efetiva de algumas das formulações que as contém, acredita-se que a
presença desses sais, em formulações de F127, juntamente com a presença de ácidos graxos
insaturados são potenciais candidatos à administração de INS por via oral.
Palavras chave: Insulina; Pluronic F-127; Transição sol-gel; Ácido oleico; Sais biliares; Agentes
promotores de permeação; Liberação in vitro; Liofilização; Reidratação.
viii
ABSTRACT
The purpose of this study was to develop a lyophilized product from aqueous micellar
solutions of Pluronic® F-127 (F127) containing insulin (INS) and oleic acid (OA). This product is
expected to become a gel in the gastrointestinal tract and to promote the INS absorption in the
mucosa of the intestine. Firstly, solutions containing different concentrations of F127 and OA were
prepared, and their ability to reach the gel state at 37 °C was evaluated. The INS release profile of
gelled formulations were evaluated in vitro in phosphate buffer pH 7.4. From this study, adjusts in
the concentration of F127 and OA were done and two lyophilized formulations were developed.
The rehydration of the lyophilized product, as well as the INS release profile and the average size of
the micelles/particles in the dissolution media (HCl 0.1 M, phosphate buffer pH 7,4, bile salts
solution 0,1 and 1,0%) were evaluated. Finally, freeze-dried products containing INS and OA and
different concentrations of F127 and bile salts (BS) were developed. The rehydration and the INS
release profile from the lyophilized products in phosphate buffer pH 7.4 were evaluated. In resume,
considering the smaller size of micelles/particles formed in the dissolution media containing BS and
the most effective INS release from some formulations containing them, it is believed that the
combination of BS and unsaturated fatty acids within F127 formulations are potential candidates for
improving the intestinal absorption of INS orally administered.
Keywords: Insulin; Pluronic F-127; Sol-gel transition; Oleic acid; Bile salts; Permeation enhancing
agents; In vitro release; Lyophilization; Rehydration.
ix
SÍMBOLOS E ABREVIATURAS
AO Ácido Oleico
Cols. Colaboradores
Conc. Concentração
D1 Diabetes tipo 1
D2 Diabetes tipo 2
EHL Equilíbrio hidrófilo – lipófilo
F127 Pluronic® F-127
F. Bras. V Farmacopeia Brasileira 5ª edição
FDA Food and Drugs Administration/Administração Federal de Alimentos e
Medicamentos
HCl Ácido Clorídrico
IDF International Diabetes Federation / Federação Internacional de Diabetes
INS Insulina
NaOH Hidróxido de Sódio
OE Óxido de etileno
OP Óxido de propileno
P12AO2 P representa o Pluronic® F-127 e AO o Ácido oleico, e o número seguinte à
abreviação significa a porcentagem p/p na formulação
P12SB1 P representa o Pluronic® F-127 e SB os Sais Biliares, e o número seguinte à
abreviação significa a porcentagem p/p na formulação
SB Sais Biliares
TF D, L - α – tocoferol
TGI Trato gastrointestinal
USP United States Pharmacopeia / Farmacopeia dos Estados Unidos
VO Via oral
VSC Via subcutânea
x
ÍNDICE DE TABELAS
Página
Tabela 1 Início e duração de ação aproximados das insulinas humanas e análogos
(Adaptado de Wannmacher, 2005)
20
Tabela 2 Formulações desenvolvidas, quantidades de seus constituintes e capacidade
de gelificação a 37 ºC
35
Tabela 3 P valor definido estatisticamente para avaliar a existência de diferença
significativa entre as médias de liberação de INS de cada formulação gel
39
Tabela 4 Equações das retas (Y) de regressão linear e respectivos coeficientes de
determinação (R²), definidos a partir do perfil de liberação total de insulina
após seis horas de ensaio
39
Tabela 5 Formulações desenvolvidas e variações de seus constituintes 42
Tabela 6 Meios de reidratação avaliados e os respectivos valores de pH 45
Tabela 7 Tamanho médio das micelas/partículas e índice de polidispersão obtidos a
partir da dissolução das cápsulas liofilizadas de P12AO2 e P16AO2 em
diferentes meios
54
Tabela 8 Formulações desenvolvidas e suas composições 59
xi
ÍNDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1. Análogos de Insulina. Mudança na sequência dos aminoácidos -
Adaptadas de Hirch, 2005; Pavlic-Renar e cols., 2003 (PIRES; CHACRA,
2008).
21
Figura 2. Estrutura química do Ácido Oleico 25
Figura 3. Estrutura química básica dos sais biliares colato (R = OH) e deoxicolato
(R = H)
26
Figura 4. Copolímero em bloco Pluronic® F-127 – dois blocos hidrófilos de óxido
de etileno e um bloco hidrofóbico de oxido de propileno (KABANOV et
al. 2002, adaptado em Chem Draw, 2004)
26
Figura 5. Representação esquemática dos mecanismos de associação do Pluronic®
F-127 em água (DUMORTIER et al., 2006)
27
Figura 6. Representação esquemática do preparo das formulações 30
Figura 7. Representação esquemática do procedimento utilizado no estudo de
liberação da INS
31
Figura 8. Solução de F127 a 15% em tampão fosfato pH 7,4 a 4 °C 33
Figura 9. Adição e dispersão de tocoferol na solução de F127 a 15%: (A) TF sobre
a solução de F127; (B) dispersão do TF sob agitação magnética
moderada, (C) aspecto final após completa dispersão do TF
33
Figura 10. Adição e dispersão do ácido oleico na solução de F127 a 15% contendo
tocoferol. (A) película de ácido oleico sobre a solução de F127; (B)
dispersão do ácido oleico em banho de gelo (4 ºC) e, (C) aspecto da
dispersão na temperatura de 37° C quando o estado gel é alcançado
34
Figura 11. Aspecto final da formulação de F127 a 15% contendo tocoferol, ácido
oleico e insulina no estado gel a 37 °C
34
Figura 12. Cromatograma de um padrão de INS 36
Figura 13. Curva analítica utilizada no método de quantificação de INS 36
Figura 14. Perfil de quantificação da insulina a partir de tampão fosfato pH 7,4 em
diferentes tempos (média das amostras ± desvio padrão)
37
Figura 15. Perfis de insulina liberada a partir das formulações P12AO3 e P12AO5
(média das amostras ± desvio padrão)
37
xii
Página
Figura 16. Perfil de insulina liberada a partir das formulações P15AO5 e P15AO3
(média das amostras ± desvio padrão)
38
Figura 17. Estudo de reidratação das cápsulas P12AO2 (A) e P16AO2 (B) em HCl
0,1 M no período de 60 minutos
46
Figura 18. Estudo de reidratação das cápsulas P12AO2 (A) e P16AO2 (B) em
tampão pH 7,4 no período de 60 minutos
47
Figura 19. Reidratação de cápsulas de P12AO2 (A) e P16AO2 (B) em diferentes
meios após 40 minutos
49
Figura 20. Quantidade de insulina liberada após duas horas em diferentes meios de
dissolução a partir de cápsulas liofilizadas de P12AO2 (média das
amostras ± desvio padrão)
52
Figura 21. Quantidade de insulina liberada após duas horas em diferentes meios de
dissolução a partir de cápsulas de P16AO2 liofilizadas (média das
amostras ± desvio padrão)
52
Figura 22. Reidratação de várias cápsulas liofilizadas em tampão pH 7,4 após 60
minutos
60
Figura 23. Perfil de liberação da insulina a partir de várias cápsulas liofilizadas em
tampão fosfato pH 7,4 (média ± desvio padrão)
61
SUMÁRIO Página
RESUMO vii
ABSTRACT viii
SÍMBOLOS E ABREVIATURAS ix
ÍNDICE DE TABELAS x
ÍNDICE DE FIGURAS xi
1. INTRODUÇÃO 15
2. OBJETIVOS 18
3. REVISÃO DE LITERATURA 19
CAPÍTULO 1 – DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DE FORMULAÇÕES DE
PLURONIC® F-127 CONTENDO INSULINA E ÁCIDO OLÉICO 29
1.1. Material e Métodos 30
1.1.1. Material 30
1.1.2. Preparo das formulações 30
1.1.3. Formulações com capacidade de formar gel a 37°C 31
1.1.4. Estudo in vitro de liberação da INS 31
1.1.5. Quantificação da INS por CLAE/DAD 32
1.1.6. Análise Estatística 32
1.2. Resultados e Discussão 33
1.2.1. Preparo das formulações 33
1.2.2. Formulações com capacidade de formar gel a 37°C 35
1.2.3. Estudo in vitro de liberação da INS a partir de hidrogéis de F127 e AO 35
1.3. Conclusão 40
CAPÍTULO 2 – LIOFILIZAÇÃO DE CÁPSULAS DE GELATINA CONTENDO
SOLUÇÕES DE F127, INSULINA E ÁCIDO OLÉICO E AVALIAÇÃO DO PRODUTO
LIOFILIZADO 41
2.1. Material e métodos 42
2.1.1. Material 42
2.1.2. Preparo das formulações 42
2.1.3. Processo de Liofilização 43
2.1.4. Estudo de reidratação das cápsulas liofilizadas 43
2.1.5. Estudo de liberação da INS in vitro a partir das cápsulas liofilizadas 43
Página
2.1.6. Análise do tamanho médio das micelas/partículas no meio de dissolução 44
2.1.7. Análise estatística 44
2.2. Resultados e discussão 45
2.2.1. Preparo das formulações 45
2.2.2. Estudo de reidratação das cápsulas liofilizadas 45
2.2.3. Estudo in vitro de liberação da INS a partir das cápsulas liofilizadas 50
2.2.4. Análise de tamanho médio das micelas/partículas no meio de dissolução 53
2.3. Conclusão 56
CAPITULO 3 – LIOFILIZAÇÃO DE CÁPSULAS DE GELATINA CONTENDO SOLUÇÃO
DE F127, INSULINA, ÁCIDO OLÉICO E SAIS BILIARES E AVALIAÇÃO DO PRODUTO
LIOFILIZADO 57
3.1. Material e métodos 58
3.1.1. Material 58
3.1.2. Preparo das formulações 58
3.1.3. Processo de Liofilização 58
3.1.4. Estudo de reidratação das cápsulas liofilizadas 59
3.1.5. Estudo in vitro de liberação da INS a partir das cápsulas liofilizadas 59
3.1.6. Análise estatística 59
3.2. Resultados e Discussão 60
3.2.1. Preparo das formulações 60
3.2.2. Estudo de reidratação das cápsulas liofilizadas 60
3.2.3. Estudo in vitro de liberação da INS das cápsulas liofilizadas 61
3.3 Conclusão 63
4. CONCLUSÃO FINAL 64
5. REFERÊNCIAS 66
6. ANEXOS 76
6.1. Publicações 76
15
1. INTRODUÇÃO
A descoberta da insulina (INS) em 1921 promoveu uma revolução no tratamento do Diabetes
tipo 1 (D1). A doença que era considerada fatal tornou-se uma doença metabólica crônica
controlável. As contínuas pesquisas nessa área resultaram na produção de INS humana e no
desenvolvimento de análogos de INS, além do alto grau de pureza das preparações atuais
(CORONHO et al., 2001).
Métodos não invasivos para administração de peptídeos, como a INS, na circulação sistêmica e,
consequentemente, na célula alvo ou órgão têm sido investigados, recebendo considerável atenção
da medicina e da indústria farmacêutica (BARICHELLO et al., 1999a), pois sua administração para
a circulação sistêmica geral promove a exposição de todos os tecidos a uma concentração igual de
INS, o que implica que o fígado receba apenas uma fração da dose injetada e que os músculos e
adipócitos respondam a dose injetada sem que a INS presente na circulação tenha sido monitorada
pelo fígado (SILVA et al., 2003).
Dentre as vias alternativas de administração de INS investigadas encontram-se as vias
pulmonar, oral, transdérmica, nasal, ocular e retal (SANTOS, 2000; OBACH; GUTERRES, 1999).
Entretanto, a VSC ainda continua sendo a principal via usada para o tratamento do D1 e, até o
momento, só a via pulmonar está clinicamente aprovada para substituí-la (SIEKMEIER;
SCHEUCH, 2008).
A administração via oral (VO) de INS seria a mais conveniente para obter a adesão dos
pacientes diabéticos ao tratamento, além de a passagem deste hormônio pelo fígado poder prevenir
ou limitar a hiperinsulinemia sistêmica e suas complicações, bastante comuns na aplicação
subcutânea (LEE, 1991). Porém seu alto peso molecular (~6 KDa) e sua baixa lipofilia são fatores
limitantes que carreiam a uma absorção muito baixa deste hormônio em mucosas. Este processo de
absorção através da mucosa gastrintestinal é dificultado ainda mais pela atividade proteolítica das
enzimas presentes no estômago e no intestino delgado (HOFFMAN; ZIV, 1997).
A administração de INS em mucosas sem o uso de promotores de absorção não produz
nenhuma mudança apreciável nas concentrações de INS no plasma (CALDWELL et al., 1982).
Entretanto o uso de surfactantes e ácidos biliares (ICHIKAWA et al., 1980), salicilatos
(NISHIHATA et al., 1981; LIVERSIDGE; NISHIHATA, 1985), derivados enamínicos
(NISHIHATA et al., 1985) e ácidos graxos insaturados e poli-insaturados (MORISHITA et
al.,1998; SUZUKI et al., 1998) na formulação demonstram aumentar sua absorção.
A classe dos promotores de absorção do tipo ácidos graxos tem a vantagem de serem
compostos endógenos presentes como lipídios da pele humana (LAMPE et al., 1983) e de
biomembranas (FISCHER, 1989), tendo sido também usados como agentes promotores de absorção
16
em sistemas de liberação de fármacos a nível pulmonar (WANG; HANSON, 1988) e intestinal
(MURANISHI, 1997; MORISHITA et al., 1998; SUZUKI et al., 1998). Assim como os sais
biliares (SB), que estão presentes na bile, produzida diariamente pelo fígado (DESSESSO;
JACOBSON, 2001; GUYTON; HALL, 2006) possuem a capacidade de emulsificar e solubilizar
fármacos hidrofóbicos e afetar a transferência dos hidrofílicos, melhorando sua biodisponibilidade
(MIKOV et al, 2006; CHUN et al., 2012).
A utilização de ácidos graxos insaturados, tais como ácido oleico (AO) e linoleico, como
promotores de absorção intestinal de INS em emulsões do tipo A/O/A foi demonstrado por
Morishita e cols. (1998). E os SB foram usados em estudos para aumentar a absorção da INS em
formulações a serem aplicadas via nasal (GORDON et al., 1985; DUCHATEAU et al., 1986).
Neste contexto, um sistema polimérico de interesse são os géis aquosos termo reversíveis de
Pluronic® F-127 (F127). F127 é um tensoativo não iônico cujas soluções aquosas a 20% ou mais
são líquidos micelares a baixas temperaturas, as quais se transformam em géis semirrígidos com o
aumento da temperatura acima de 25ºC (SCHMOLKA, 1991).
Sistemas poliméricos de F127 têm sido usados na liberação de fármacos para uso oftálmico
(MILLER; DONAVAN, 1982; DESAI; BLANCHARD, 1998), retal (CHOI et al.,1998; YONG et
al., 2006), parenteral (KATAKAM et al., 1997; BARICHELLO et al., 1999b, LIU et al., 2007),
transdérmico (LEE et al., 1997; SHIN et al., 1999; PILLAI; PANCHAGNULA, 2003) e nasal
(PISAL et al., 2004). F127 também tem sido usado como veículo na liberação controlada de anti-
inflamatórios (SHARMA; BHATIA, 2004), vancomicina (VEYRIES et al., 1999), lidocaína
(CHEN-CHOW; FRANK, 1981; PAAVOLA et al., 1998; RICCI et al., 2005), propanolol
(PANDIT; WANG, 1998), ceftiofur (ZHANG et al., 2002), interleucina-2 (JOHNSTON et al.,
1992), urease (PEC et al., 1992), deslorelina e GnRH (JAMES et al., 2002), hirudina recombinante
(LIU et al., 2007) e paclitaxel (NIE et al., 2011).
Estas peculiaridades do F127 combinadas às características dos ácidos graxos insaturados e
poli-insaturados resultaram num marcante efeito hipoglicêmico de INS após administração retal
(BARICHELLO et al., 1999a) e bucal (MORISHITA et al., 2001) em ratos normais, e o perfil de
liberação de INS in vitro foi reduzido (MORISHITA et al., 2001), indicando potencialidade para
tornarem-se formulações enterais de INS. Ainda, recentemente descobriu-se que a adição de ácidos
graxos, como o AO, induz a gelificação de soluções de F127 contendo menos de 20% de polímero.
Outro estudo de interesse foi o realizado por Mesiha e cols. (2002) em que formulações de
quilo artificial, contendo ácido palmítico, diferentes sais biliares e INS, foram preparadas e
administradas oralmente em coelhos. Os resultados demonstraram que a combinação de ácido
palmítico e SB promoveram maior absorção de INS, sendo o deoxicolato e o colato, os sais que
promoveram maior efeito hipoglicêmico.
17
Com base nesta descoberta e a partir dos resultados obtidos em que AO e SB interferem no
processo de liberação de INS e na absorção pela mucosa é possível desenvolver novas formulações
destes componentes em diferentes proporções, onde os agentes promotores de absorção interfiram
na liberação e absorção de INS. Os resultados encontrados podem levar a novas perspectivas para
testes farmacológicos de formulações que contenham INS, F127, AO e SB.
18
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivos gerais
O objetivo desta pesquisa foi desenvolver um produto liofilizado de INS a partir de soluções de
F127 contendo AO para administração oral.
2.2 Os objetivos específicos
• Desenvolver soluções de F127 contendo INS e AO;
• Avaliar o perfil de liberação de INS em tampão fosfato pH 7,4 a partir do estado gel de
formulações contendo diferentes conc. de F127 e AO;
• Desenvolver o produto liofilizado a partir de soluções de F127 contendo INS e AO;
• Avaliar a reidratação dos produtos liofilizados em diferentes meios de dissolução;
• Avaliar o perfil de liberação de INS a partir dos produtos liofilizados em diferentes
meios de dissolução;
• Avaliar o tamanho médio das micelas/partículas formadas nos meios de dissolução após
o processo de liberação da INS;
• Desenvolver produto liofilizado a partir de soluções de F127 contendo INS, AO e SB;
• Avaliar a reidratação dos produtos liofilizados em meio de dissolução tampão fosfato
pH 7,4;
• Avaliar o perfil de liberação de INS a partir dos produtos liofilizados em meio de
dissolução tampão fosfato pH 7,4.
19
3. REVISÃO DE LITERATURA
O diabetes é atualmente um problema importante de saúde pública tanto em países
desenvolvidos quanto em países em desenvolvimento. Os indivíduos portadores de diabetes no
Brasil correspondem a 9,7% da população nacional, sendo esse valor uma estimativa, já que o
diagnóstico requer exame de sangue, o que dificulta a realização de inquéritos. Mundialmente, a
prevalência é de 8,3% e 50% das pessoas com diabetes não são diagnosticadas (IDF, 2012).
Há estimativas de que, em 2030, a doença acometerá 12,3% da população brasileira, estando o
país entre os dez do mundo com a maior prevalência da doença em pessoas com idade entre 20 e 79
anos (WILD et al., 2004; SCHIMIDT et al., 2009; WHITING et al., 2011). Projeções globais
preveem um aumento de 51% da prevalência de diabetes na população mundial de 2011 até 2030
(IDF, 2012).
O diabetes é um dos principais causadores da insuficiência renal (25%) e cegueira no adulto
(28%), lidera as amputações (35%) e a impotência sexual, e constitui a causa mais frequente de
doenças crônicas na infância, estando associada, ainda, a arteriosclerose acelerada, a dislipidemia e
a doenças cardiovasculares. A grande maioria dos casos de diabetes pertence a duas categorias
patogenéticas, o diabetes tipo 1 (D1) e o diabetes tipo 2 (D2). O D1 apresenta deficiência absoluta
de INS, sendo, na grande maioria dos casos, essa deficiência causada por um processo autoimune.
O D1 compreende cerca de 8 a 10% dos casos de diabetes. Já o D2, que compreende a grande
maioria dos casos, é consequência de resistência insulínica associada à deficiência insulínica
(CORONHO et al., 2001).
Sintetizada e secretada pelas células β das ilhotas de Langerhans, inicialmente como um
precursor de cadeia simples, a INS é um hormônio responsável pela regulação da homeostasia da
glicose, ativando seus sistemas de transporte, sendo fígado, músculo e tecido adiposo os tecidos-
alvos. Suas ações anabólicas incluem estimular a utilização e armazenamento celular de glicose,
aminoácidos e ácidos graxos, enquanto que inibe processos catabólicos como degradação de
glicogênio, lipídeos e proteínas (GOODMAN; GILMAN, 2005).
A quantidade de glicose que pode se difundir para o interior da maioria das células do
organismo na ausência de INS, com exceção das células hepáticas e cerebrais, é muito pequena para
fornecer a porção normalmente necessária para o metabolismo energético. Sabendo-se que a glicose
é o único substrato utilizado pelo cérebro, pela retina e pelo epitélio germinativo das gônadas, a
concentração de glicose sanguínea deve-se manter em um nível suficientemente elevado para supri-
los com a energia requerida e não aumente excessivamente por poder causar desidratação celular,
perda de glicose através da urina, bem como diurese, e lesões em vasos sanguíneos (GUYTON;
HALL, 2006).
20
A descoberta da INS em 1921 promoveu uma revolução no tratamento do D1. A doença que
era considerada fatal tornou-se uma doença metabólica crônica controlável. O sucesso no uso
terapêutico de extratos de pâncreas bovino ocorreu pela primeira vez em 1922. Até 1980, insulinas
de origem animal, extraídas de pâncreas bovino e suíno, compunham as formulações disponíveis
comercialmente. Inicialmente eram muito impuras, causando reações imunológicas e variabilidades
na farmacodinâmica e farmacocinética (BORGOÑO; ZIMMAN, 2012), além de as estruturas
químicas diferirem em relação à INS humana em três e um aminoácidos, respectivamente.
As contínuas pesquisas nessa área resultaram na produção de INS humana recombinante, em
1978, e no desenvolvimento de análogos, desde 1980, além do alto grau de pureza das preparações
atuais (CORONHO et al., 2001; BORGOÑO; ZIMMAN, 2012). Mudanças estruturais na molécula
de INS (inversão, substituição ou adição de aminoácidos – Fig. 1) levaram a alterações
farmacocinéticas como absorção subcutânea mais rápida, mais rápido aumento da insulina
circulante, mais precoce início de resposta hipoglicêmica e menor duração de efeito (Tab. 1)
(WANNMACHER, 2005).
Tabela 1. Início e duração de ação aproximados das insulinas humanas e análogos (Adaptado de Wannmacher, 2005)
Preparação de insulina Início de ação Pico Duração da ação
Regular 30-60 min 2-4 h 6-10 horas
Humana inalável 5-15 min 1-2 h 6-8 horas
NPH/lenta 1-2 h 4-8h 10-20 horas
Lispro/asparte/glulisina 5-15 min 1-2h 4-6 horas
Glargina/detemir 1-2 h pouco pronunciado ~ 24 horas
A duração de ação normal é curta, de 4-8 horas, o que exige 2-4 injeções diárias para um
controle apropriado da doença (CHIEN, 1996; TREHAN; ALI, 1998). Apesar da existência de
formulações de duração prolongada, de 24-36 horas, a administração crônica parenteral causa
efeitos secundários nos locais de injeção, agravados pelo desconforto causado aos doentes, são eles
lipodistrofia, hiperinsulinemia, reações alérgicas e dor (RAMKISSOON-GANORKAR et al., 1999;
GOWTHAMARAJAN; KULKARNI, 2003), além de liberar na circulação sistêmica um excesso de
INS.
21
Figura 1. Análogos de Insulina. Mudança na sequência dos aminoácidos - Adaptadas de Hirsch, 2005; Pavlic-Renar e cols., 2003 (PIRES; CHACRA, 2008)
22
A insulinoterapia tem por objetivo a obtenção de níveis plasmáticos idênticos aos da secreção
fisiológica de indivíduos não diabéticos. As vias de administração parenteral, tais como:
subcutânea, intramuscular e intravenosa têm sido as vias de escolha para sua administração, o que
se traduz num grande inconveniente para o paciente e em algumas complicações associadas ao uso
contínuo e ao grande número de aplicações requeridas. Comparada à secreção fisiológica, a
administração subcutânea difere em dois aspectos importantes: a cinética não reproduz a rápida
elevação e declínio normais da secreção de INS em resposta à ingestão de nutrientes, e a INS
difunde-se na circulação periférica em vez de ser liberada na circulação porta; por conseguinte o
efeito direto da INS secretada sobre os processos metabólicos hepáticos é eliminado (GOODMAN;
GILMAN, 2005).
A secreção de INS é rigorosamente regulada pela interação de nutrientes, hormônios
gastrointestinais, hormônios pancreáticos e neurotransmissores autônomos. Existe também uma
relação recíproca entre as taxas de secreção de INS e glucagon, já que este estimula a
gliconeogênese e aumenta a lipólise e, em contrapartida, limita a taxa de glicólise, auxiliando no
controle da glicemia, além de estimular a liberação somatostatina que pode inibir a secreção de INS
(GOODMAN; GILMAN, 2005).
A INS fisiológica é secretada diretamente para os vasos sanguíneos que a conduzem
imediatamente para a circulação porta-hepática, agindo, portanto, primeiramente no fígado. A INS
não metabolizada passa para a circulação geral, agindo sobre os outros tecidos, principalmente
músculos e adipócitos. Em contraste, a INS injetada por VSC expõe todos os outros tecidos a
concentrações iguais de INS, chegando ao fígado apenas uma fração da dose injetada e fazendo com
que os outros tecidos tenham uma super estimulação, associadas às complicações do diabetes
(SAFFRAN et al., 1997), fracassando o controle glicêmico duradouro em pacientes. Ensaios
clínicos têm demonstrado que um percentual significativo de pacientes deixa de alcançar o controle
glicêmico devido ao não cumprimento das instruções e das inúmeras reações indesejáveis
(PAMNANI, 2008).
Visando maior conforto aos pacientes diabéticos e maior disponibilidade de INS ao fígado a
fim de aproximar do controle glicêmico fisiológico, tem-se procurado desenvolver sistemas de
liberação por outras vias de administração à subcutânea (TREHAN; ALI, 1998). Assim, nos últimos
anos, métodos não invasivos para administração de peptídeos na circulação sistêmica vêm
recebendo considerável atenção da medicina e da indústria farmacêutica (BARICHELLO et al.,
1999a). Dentre as vias mais pesquisadas estão a pulmonar, a oral, a transdérmica, a nasal, a ocular e
a retal (OBACH; GUTERRES, 1999; SANTOS, 2000).
A via pulmonar é, até o momento, a única via aprovada clinicamente para substituir a VSC. A
INS humana inalável é de ação rápida sendo indicada para o uso pré prandial em pacientes
23
portadores de D1 e D2. Muito embora a biodisponibilidade da INS administrada por esta via seja
baixa (apenas 10% da INS via subcutânea) e o tratamento ser significativamente mais oneroso do
que com a INS injetável, tal fato tem sido contrabalançado com a melhor aceitação do tratamento da
INS pela via pulmonar, o que poderia ampliar a extensão do uso da INS por pacientes D2
(reduzindo os custos de produção) e, a longo prazo, as complicações diabéticas, devido a um melhor
controle e prevenção do diabetes (SIEKMEIER; SCHEUCH, 2008).
Os pacientes portadores de D2 geralmente iniciam o tratamento medicamentoso utilizando
hipoglicemiantes orais quando a glicemia não é controlada com dieta e atividade física. Esses
medicamentos podem agir aumentando a secreção de INS ou melhorando sua ação. Classificam-se
em: sulfoniluréias, que estimulam a secreção de INS; biguanidas, que aumentam a sensibilidade à
INS; inibidores da α-glicosidase, que diminuem a digestão de alguns carboidratos; metiglinidas, que
estimulam a secreção de INS; tiazolidinadionas, que aumentam a sensibilidade à INS das células
musculares e adiposas e suprime a gliconeogênese no fígado. Caso a glicemia não seja estabilizada
com a mudança no estilo de vida e a utilização de hipoglicemiantes orais a insulinoterapia é
recomendada (BRASIL, 2009).
A VO de administração seria a mais conveniente para obter a adesão dos pacientes diabéticos a
insulinoterapia, já que a passagem deste hormônio pelo fígado pode prevenir ou limitar a
hiperinsulinemia sistêmica e seus efeitos locais causados pela administração parenteral. Porém, é a
via que apresenta o maior número de dificuldades para o desenvolvimento de formulações, em
função das múltiplas e extensas barreiras à absorção (LEE, 1991).
A biodisponibilidade oral da maioria dos peptídeos e proteínas é menor que 1% (LEE, 1991).
Isso porque as moléculas são clivadas quando em contato com enzimas proteolíticas, pepsinas no
estômago e tripsina, quimotripsina e carboxipeptidases, secretadas pelo pâncreas no lúmen do
intestino delgado (SCHILLING; MITRA, 1991), perdendo a atividade fisiológica. E a camada
epitelial que reveste o TGI possui células rigidamente ligadas, o que impede o transporte
paracelular, além de conter enzimas digestivas e ser recoberta pelo glicocálix, barreiras química e
física, respectivamente, para o transporte de proteínas (CARINO; MATHIOWITZ, 1999).
A INS é uma molécula hidrofílica, portanto possui baixo coeficiente de partição em pH 7,4, e
baixa difusão passiva (<0,2%), em especial no duodeno (SILVA et al., 2003). Em cálculo de limite
superior para a absorção oral de INS, realizado em abordagem teórica por Sinko e cols. (1993),
assumindo-a estável no TGI, a extensão máxima de absorção obtida para o duodeno foi de 1,6% e
para o íleo de 13%. Se a degradação pelas enzimas α-quimotripsina e tripsina fosse considerada, a
extensão da absorção seria inferior ou igual a 1,2%. Portanto, embora a degradação da INS seja um
fator limitante, a permeabilidade intestinal extremamente baixa é o obstáculo principal à
administração oral. O desenvolvimento de uma formulação oral que proporcione biodisponibilidade
24
de 10 a 20% de INS revolucionaria o tratamento do diabetes, mesmo que não substituísse, apenas
complementasse a terapia parenteral (SCHILLING; MITRA, 1990).
Para aumentar a biodisponibilidade oral de fármacos peptídicos, várias estratégias estão sendo
utilizadas, como inibidores das enzimas proteolíticas, promotores da absorção, modificação química
e formulações farmacêuticas específicas, como sistemas de partículas, emulsões, sistemas de
liberação específica e sistemas bioadesivos (PUTNEY, 1999), além dos hidrogéis (NAKAMURA et
al., 2004). Na escolha do método a utilizar, deve-se considerar que os peptídeos são moléculas de
elevada labilidade, que em condições físico-químicas extremas podem sofrer desnaturação ou
agregação com perda da sua atividade (PUTNEY, 1999).
A administração de INS em mucosas sem o uso de promotores de absorção não produz
nenhuma mudança apreciável nas concentrações de INS no plasma (CALDWELL et al., 1982). A
permeabilidade epitelial da mucosa para fármacos peptídicos como a INS tem sido demonstrada
aumentar quando promotores de absorção tais como surfactantes (ICHIKAWA et al., 1980), ácidos
biliares (ICHIKAWA et al., 1980; MIKOV et al., 2006), salicilatos (NISHIHATA et al., 1981;
LIVERSIDGE et al., 1985), derivados enamínicos (NISHIHATA et al., 1985) e ácidos graxos
insaturados e poli-insaturados (MORISHITA et al., 1998; SUZUKI et al., 1998; BARICHELLO et
al., 1999a) são usados.
A classe dos promotores de absorção do tipo ácidos graxos insaturados tem a vantagem de
serem compostos endógenos presentes como lipídios da pele humana (LAMPE et al., 1983) e de
biomembranas (FISCHER, 1989), tendo sido também usados como agentes promotores de absorção
em sistemas de liberação de fármacos a nível pulmonar (WANG; HANSON, 1988) e intestinal
(MURANISHI, 1997; MORISHITA et al., 1998; SUZUKI et al., 1998) por aumentarem a liberdade
motora ou a fluidez da membrana fosfolipídica (GAY et al., 1989; MURANISHI, 1990; WANG et
al., 1994) . A utilização de ácidos graxos insaturados, tais como AO (Fig. 2) e linoleico, como
promotores de absorção intestinal de INS em emulsões do tipo A/O/A foi demonstrado por
Morishita e cols. (1998). Os resultados demonstraram que estes ácidos graxos contidos em
emulsões promoveram uma maior absorção de INS, sendo esta, predominantemente maior no reto
do que no cólon e no íleo. Num trabalho posterior, também usando uma emulsão do tipo A/O/A,
Suzuki e cols. (1998) relataram que ácidos graxos poli-insaturados de cadeias longas, tais como o
ácido eicosapentaenoico (EPA, 20:5) e o ácido docosaexaenoico (DHA, 22:6), foram promotores de
absorção mais efetivos de INS que os ácidos graxos de 18C (AO, linoleico e linolênico). Além
disso, as emulsões contendo DHA, as quais demonstraram um forte efeito hipoglicêmico, causaram
menos dano as membranas do que os outros ácidos graxos insaturados.
25
Figura 2. Estrutura química do Ácido Oleico
Mais recentemente, Morishita e cols. (2000) investigaram in situ em ratos normais, o efeito
farmacológico dose-dependente de INS (0, 10, 25 e 50 UI/Kg) em emulsões A/O/A contendo 2% de
ácidos graxos poli-insaturados (DHA, EPA ou AO). Os resultados, mais uma vez confirmaram que
emulsões A/O/A contendo ácidos graxos poli-insaturados, em especial DHA, tem potencial para
tornarem-se formulações enterais para INS (MORISHITA et al., 2000).
Os SB também são compostos endógenos sintetizados pelas células hepáticas a partir do
colesterol ingerido na dieta ou durante metabolismo de gorduras. Compõem a bile na conc. de 0,06
g/mL, quando armazenada na vesícula biliar, e são secretados diariamente no duodeno na faixa de
750 mL por dia (DESSESSO; JACOBSON, 2001; GUYTON; HALL, 2006) após a alimentação,
através das contrações duodenais e ação de hormônios como gastrina e serina, além da liberação de
colecistocinina (DAVIES et al., 2002). Possuem a capacidade de emulsificar e solubilizar fármacos
hidrofóbicos, melhorando sua biodisponibilidade por aumentar a taxa de dissolução no TGI, e
podem afetar a transferência de fármacos hidrofílicos dissolvidos através da barreira de absorção,
devido a interações entre os sais e a camada de muco nas membranas celulares (MIKOV et al.,
2006; CHUN et al., 2012).
Estudos realizados por Gordon e cols. (1985) e Duchateau e cols. (1986) utilizaram SB para
aumentar a absorção da INS em formulações a serem administradas via nasal. No primeiro trabalho,
obteve-se como resultado que o deoxicolato (Fig. 3) na formulação promove maior absorção de
INS; já no segundo, obteve-se como resultado que o colato (Fig. 3) foi o sal que promoveu maior
absorção da INS por essa via. Ambos os sais, encontravam-se entre os mais hidrofóbicos usados. Os
SB têm sido extensivamente estudados como promotores de permeação de diversos fármacos, a fim
de aumentar a penetração através de várias membranas biológicas, tais como a mucosa bucal
(SHIN; KIM, 2000), intestino (FRICKER et al., 1996) e córneas (MORIMOTO et al., 1987). Como
tensoativos biológicos, os SB, bem como outros surfactantes, podem induzir alterações de
membrana que aumentam sua permeabilidade (MIKOV et al., 2006), sendo o efeito diretamente
proporcional a sua hidrofobicidade (AKARE; MARTINEZ, 2005).
OH
O
26
Figura 3. Estrutura química básica dos sais biliares colato (R = OH) e deoxicolato (R = H)
Visando a administração de fármacos por diversas vias, incluindo a retal, a oftálmica, a tópica,
a injetável e a oral, preparações contendo Pluronic® F-127 (F127) foram estudadas (DUMORTIER
et al., 2006). F127 (Fig. 4) faz parte de uma família de copolímeros anfifílicos introduzidos no final
da década de 1950 que existem no estado sólido, líquido ou pasta, dependendo da porcentagem de
óxido de etileno (OE) e óxido de propileno (OP) que constituem o copolímero (DUMORTIER et
al., 2006). Alguns polímeros desta família são descritos nas farmacopeias americana e europeia
(ROWE et al., 2005) e são apresentados sob as fórmulas comerciais Pluronic®, Synperonic®,
Tetronic®, dentre outras (KABANOV et al., 2002).
Figura 4. Copolímero em bloco Pluronic® F-127 – dois blocos hidrófilos de óxido de etileno e um bloco hidrofóbico de oxido de propileno (KABANOV et al. 2002, adaptado em Chem Draw, 2004)
HO
CH3
R
OHCH3
O-
OH3C
HO
O
O
O H
CH3
100 65 100OE OEOP
27
F127 é um tensoativo não iônico com peso molecular em torno de 12.600 Daltons (TAKÁTS et
al., 2001), o qual é constituído de segmentos de copolímeros de OE e OP sob a fórmula é OE95-105 –
OP54-60 – OE95-105. A 22 °C, seu EHL (equilíbrio hidrófilo-lipófilo) é 22 (KABANOV et al., 2002),
portanto um componente hidrofílico. A Food and Drug Administration (FDA) classificou o F127
como inerte para diversos tipos de preparações, como: intravenosas, soluções orais, suspensões,
inalatórias, oftálmicas e tópicas (ROWE et al., 2005). Uma propriedade importante deste
copolímero é que suas soluções aquosas ≥ 20% são líquidos micelares a baixas temperaturas que se
transformam em géis semirrígidos com o aumento da temperatura acima de 25ºC (SCHMOLKA,
1991). Este fenômeno de transição sol-gel dependente de temperatura deve-se a interações entre
diferentes segmentos do copolímero (DUMORTIER et al., 2006). À medida que a temperatura
aumenta a porção hidrofóbica, OP, das moléculas se agrega em micelas devido à desidratação sendo
circundado pelas porções hidrofílicas, OE (JUHASZ et al., 1989). Uma representação esquemática
deste processo é apresentada na Fig. 5.
Figura 5. Representação esquemática dos mecanismos de associação do Pluronic® F-127 em água (DUMORTIER et al., 2006)
Este fenômeno de transição sol-gel dependente da temperatura possibilita às formulações
serem aplicadas na forma de soluções, transformando-se em um gel semirrígido conforme aquece
com a temperatura do organismo. Outras características importantes destes géis são dar estabilidade
a proteínas e peptídeos incorporados em suas matrizes, com completa recuperação de sua atividade
quando o gel é dissolvido em excesso de solução tampão (STRATTON et al., 1997), e a sua
tendência de aderir a superfícies, tais como, a pele (LEE et al., 1997), e a mucosa do intestino
(CHOI et al., 1998).
Resultados positivos foram encontrados quando formulações contendo F127 e ácido delta-5-
aminolevulínico foram administradas oralmente no tratamento fotodinâmico de lesões no TGI,
devido à boa adesão da formulação ao esôfago e difusão eficiente do fármaco para a mucosa
28
(BOURRE et al., 2002). Uma absorção mais eficiente da INS em géis de F127 por iontoforese foi
observada, tanto ex-vivo quanto in-vivo, quando o ácido linoléico (um ácido graxo insaturado) está
presente na formulação (PILLAI; PANCHAGNULA, 2003).
Estas características peculiares de géis F127 combinadas a ácidos graxos insaturados
resultaram num marcante efeito hipoglicêmico de INS após administração retal (BARICHELLO et
al., 1999a) e bucal (MORISHITA et al., 2001) dos géis em ratos normais. Também foi observado
que o perfil de liberação de INS in vitro de géis F127 foi reduzido na presença de ácidos graxos
insaturados e poli-insaturados (MORISHITA et al., 2001). E em estudo realizado administrando
oralmente soluções contendo ácido palmítico, SB e INS promoveram maior absorção de INS em
coelhos, sendo o deoxicolato e o colato, os sais que promoveram maior efeito hipoglicêmico
(MESIHA et al., 2002).
CAPÍTULO 1
DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DE
FORMULAÇÕES DE PLURONIC® F-127
CONTENDO INSULINA E ÁCIDO OLEICO
30
1.1. Material e Métodos
1.1.1. Material Pluronic® F-127 (F127), D,L-α-tocoferol (TF), ácido oleico (AO) e ácido trifluoroacético
foram adquiridos da Sigma Aldrich®, EUA. Dihidrogenofosfato de potássio,
hidrogenofosfatodissódico anidro, acetonitrila grau CLAE e cloreto de sódio (NaCl) foram
adquiridos da Merck®, Alemanha. Ácido clorídrico (HCl) solução titulante foi adquirida da Synth®,
Brasil, e hidróxido de sódio (NaOH) solução titulante foi adquirida da Cromoline®, Brasil. A
insulina humana (INS) foi gentilmente cedida pela Novonordisk®, Brasil.
1.1.2 Preparo das formulações
Uma quantidade precisamente pesada de F127 foi adicionada lentamente a um Becker contendo
tampão fosfato pH 7,4 mantido sob agitação magnética moderada e em banho de gelo (4-8ºC) até
completa dispersão do polímero (BARICHELLO et al., 1999b). A solução foi então mantida em
repouso em geladeira por 12 horas. TF (agente antioxidante) foi adicionado na conc. de 0,06% p/p e
disperso sob agitação vigorosa usando agitador magnético em temperatura ambiente. Após
completa dispersão do TF, adicionou-se o AO, o qual foi disperso sob agitação vigorosa usando
agitador magnético em banho de gelo. A INS (1,0 mg/g de solução) foi dissolvida em 100μL de
HCl 0,1M e incorporada à solução de F127. O HCl foi neutralizado pela adição de 100μL de NaOH
0,1M diretamente à solução de F127. Uma representação esquemática do preparo das formulações
está ilustrada na Fig. 6.
Figura 6. Representação esquemática do preparo das formulações
Adicionar ao Tampão Fosfato pH 7,4:
1º Pluronic F-127
2º D,L -α - tocoferol
3º Ácido Oleico
4º Insulina em HCl 0,1M
5º NaOH 0,1M
31
1.1.3. Formulações com capacidade de formar gel a 37ºC
A capacidade das soluções de F127 formar gel semirrígido foi determinada usando banho-
maria a 37ºC. Transferiu-se para tubos falcon (fundo chato e tampa de rosca) 3,0g das formulações
de F127 contendo INS (1,0 mg/g de gel) e em seguida foram colocados em banho de água a 37ºC
por 10 min. A formulação que não escorresse pela parede do tubo quando invertidas em 90° foi
considerada atingir o estado gel.
1.1.4. Estudo in vitro de liberação da INS
Um modelo de dissolução sem membrana foi usado para os estudos de liberação in vitro
(BARICHELLO et al., 1999c) para as formulações que formaram gel conforme subitem 1.1.3 deste
capítulo. Primeiramente pesou-se 3,0 g de gel contendo INS (1,0 mg/g de gel) em tubos falcon de
fundo chato e estes foram deixados em banho-maria a 37°C (Banho Dubnoff 304D, Nova Ética®,
Brasil) por 10 min. Em seguida, 1,0 mL de tampão fosfato pH 7,4, também a 37°C, foi
discretamente vertido sobre o gel e os tubos recolocados no banho-maria a 37ºC. Os tubos foram
então agitados horizontalmente (100 rpm) e, de hora em hora, o sobrenadante foi completamente
removido. Um mililitro de solução tampão foi recolocado de modo a manter as mesmas condições
por um período de até 6 horas. Os dados de liberação foram expressos como a média ± desvio
padrão. Os ensaios foram realizados em replicata para estimativa do erro experimental.
Figura 7. Representação esquemática do procedimento utilizado no estudo de liberação da INS
32
1.1.5. Quantificação da INS por CLAE/DAD
A quantificação da INS nas amostras obtidas do estudo de liberação foi realizada conforme
descrito anteriormente por Barichello e cols. (1999c) usando cromatografia líquida de alta eficiência
acoplada a detector DAD (CLAE/DAD). O equipamento foi Waters Alliance 2695 acoplado a
detector de Arranjo de Diodos DAD 2996. As análises foram feitas em comprimento de onda de
214 nm (USP35-NF30, 2012). A fase móvel composta de acetonitrila, solução de ácido
trifluoroacético 0,1% e NaCl, na proporção percentual de 69:31:0,58, respectivamente, foi eluída
num fluxo de 1,0 mL/min. em coluna C18 (Phenomenex®, Luna 5µ (2) 100Å 150x4,60mm) à
temperatura de 30 ºC. O volume de injeção da amostra foi fixado em 100 µL.
Para avaliar a linearidade do método analítico utilizado, antes da análise das alíquotas do
estudo de liberação, foram feitas leituras de padrões de INS nas concentrações de 5 até 200 µg/mL.
O preparo se deu a partir da diluição de 2 mg de INS em HCl 0,1M, sendo o volume completado
para 10,0 mL com tampão fosfato pH 7,4, seguido de diluições seriadas.
1.1.6. Análise estatística
O teste não paramétrico de Mann-Whitney foi realizado para avaliar a existência de diferença
significativa entre médias da quantidade cumulada de INS liberada das formulações géis após seis
horas do ensaio de liberação. Adotou-se o intervalo de confiança de 95% e as diferenças foram
consideradas significativas quando P<0,05. O software BioEstat® (2007) foi utilizado na análise
estatística.
33
1.2. Resultados e Discussão
1.2.1. Preparo das formulações
A partir da combinação de diferentes concentrações de F127 e AO foram obtidas oito
formulações (Tabela 2). Nesta etapa não foram avaliadas formulações de F127 a 20%, pois é sabido
que esta é a menor concentração de polímero capaz de formar gel, além de os géis de F127
contendo AO já terem sido avaliados in vitro e in vivo por Barichello e cols. (1999a e 1999b).
As figuras 8, 9, 10 e 11 representam a sequência de preparo da formulação de F127 a 15%. Na
Fig. 8 é possível observar o aspecto visual de uma solução de F127 em tampão fosfato pH 7,4 a
4ºC. Na Fig. 9 está representado o processo de adição e dispersão do TF na solução. Durante o
processo de dispersão de TF, a solução inicialmente adquire um aspecto levemente leitoso (Fig. 9B)
que passa a opalescente após completa dispersão do TF (Fig. 9C).
Figura 8. Solução de F127 a 15% em tampão fosfato pH 7,4 a 4 °C
Figura 9. Adição e dispersão de tocoferol na solução de F127 a 15%: (A) TF sobre a solução de F127; (B) dispersão do TF sob agitação magnética moderada, (C) aspecto final após completa
dispersão do TF
A
B
C
34
Na Fig. 10 está representado o processo de adição e dispersão de 3% de AO na solução de F127
a 15% contendo TF. Nesta etapa, o processo de dispersão do AO é realizado em banho de gelo
(~4ºC). Em poucos minutos a dispersão adquire um aspecto leitoso característica de uma emulsão
óleo em água (O/A) (Fig. 10B). Depois de concluído o processo de dispersão do AO, a transição do
estado sol-gel é alcançada por aquecimento da dispersão a 37 ºC em banho de água (Fig. 10C). A
dispersão passa de leitosa à transparente devido à solubilização do AO disperso nas micelas que são
formadas e darão origem ao estado gel da formulação.
Figura 10. Adição e dispersão do ácido oleico na solução de F127 a 15% contendo tocoferol. (A) película de ácido oleico sobre a solução de F127; (B) dispersão do ácido oleico em banho de gelo
(4ºC) e, (C) aspecto da dispersão na temperatura de 37 °C quando o estado gel é alcançado
A
B
C
Na Fig. 11 está representado o aspecto visual da solução de F127 contendo TF, AO e INS no
estado gel a 37ºC. A insulina é solubilizada em HCl 0,1 M é adicionada a solução de F127 logo
após a dispersão do AO e em banho de gelo (~ 4 ºC). Logo após é feita a neutralização com NaOH
0,1 M.
Figura 11. Aspecto final da formulação de F127 a 15% contendo tocoferol, ácido oleico e insulina no estado gel a 37 °C
35
1.2.2. Formulações com capacidade de formar gel a 37ºC
Na Tabela 2 estão descritas as formulações desenvolvidas, as respectivas quantidades de seus
constituintes e a capacidade destas formulações alcançarem o estado gel a 37 ºC. Todas as
formulações apresentaram-se como uma mistura homogênea e estável sem separação de fases. É
importante salientar que com a redução da conc. de F127 e com o aumento da conc. de AO, as
soluções de F127 apresentaram um aspecto leitoso mais intenso.
Tabela 2. Formulações desenvolvidas, quantidades de seus constituintes e capacidade de gelificação a 37 ºC
Formulação Conc. de F127 (%p/p) Conc. de AO (%p/p) Capacidade de formar gel a 37 ºC
P5AO3 5 3 Não
P5AO5 5 5 Não
P8AO3 8 3 Não
P8AO5 8 5 Não
P12AO3 12 3 Sim
P12AO5 12 5 Sim
P15AO3 15 3 Sim
P15AO5 15 5 Sim
Onde: P e F127 = Pluronic® F127 e AO = ácido oleico
Conforme observado na Tabela 2, soluções de F127 em conc. ≥ a 12% e contendo de 3 a 5% de
AO podem formar gel semirrígido a 37 ºC. É importante salientar que antes da adição de AO,
mesmo a 37 °C, a formulação contendo 12% de F127 permanece líquida e somente após a dição de
AO observa-se a gelificação. Por outro lado, soluções de F127 em conc. ≤ a 8% e contendo de 3 a
5% de AO não tem capacidade de formar gel semirrígido a 37 ºC. É sabido que soluções de F127
em concentrações inferiores a 20% não apresentam a habilidade de formar gel semirrígido em
temperaturas superiores a 25 °C (SCHMOLKA, 1991; JONES et al., 2009). Deste modo, o efeito
do AO na indução de gelificação de soluções de F127 contendo menos de 20% é um resultado
inédito. Entretanto, esta capacidade do AO interferir no processo de gelificação parece ser limitado
a conc. de F127 não inferiores a aproximadamente 12%.
1.2.3. Estudo in vitro de liberação da INS a partir de hidrogéis de F127 e AO
O estudo in vitro de liberação da INS foi realizado em quintuplicata com as formulações que
formaram gel a 37 ºC – P12AO3, P12AO5, P15AO3 e P15AO5 – com o objetivo de avaliar o efeito
36
que as diferentes composições exercem na liberação de INS a partir das formulações géis
desenvolvidas.
A Fig. 12 representa um cromatograma de INS obtido a partir de uma solução padrão. Como
observado, o tempo de retenção nos parâmetros adotados foi próximo de 6 minutos.
Figura 12. Cromatograma de um padrão de INS
A partir das áreas dos picos obtidos pelas diferentes concentrações de padrão fez-se uma
regressão linear e definiu-se a equação da reta, a partir da qual se calculou a quantidade de INS
liberada pelas amostras. Os valores dos coeficientes de correlação linear (r2) das regressões lineares
variaram de 0,9938 a 0,9996, o que nos indica validade da regressão. A Fig. 13 representa uma
curva analítica empregada na quantificação da INS.
Figura 13. Curva analítica utilizada no método de quantificação de INS
A Fig. 14 representa a quantificação de INS solubilizada em tampão fosfato pH 7,4 sob as
mesmas condições experimentais utilizadas no estudo de liberação in vitro. Os resultados indicam
y = 124017x - 152346 R² = 0,9996
0
2000000
4000000
6000000
8000000
10000000
12000000
0 25 50 75 100
Área
Concentração (mg/mL)
37
que não houve comprometimento na quantificação da INS, já que a porcentagem permanece
constante ao longo do tempo.
Figura 14. Perfil de quantificação da insulina a partir de tampão fosfato pH 7,4 em diferentes tempos (média das amostras ± desvio padrão)
A Fig. 15 representa a quantidade cumulada de INS liberada a partir dos géis P12AO3 e
P12AO5 em um período de seis horas. Observou-se que a quantidade cumulada de INS liberada
após seis horas a partir do gel P12AO3 (27,24 ± 2,21%) foi maior comparada a quantidade
cumulada de INS liberada a partir do gel P12AO5 (11,05 ± 1,48%).
Figura 15. Perfis de insulina liberada a partir das formulações P12AO3 e P12AO5 (média das amostras ± desvio padrão)
90
95
100
105
0 1 2 3 4 5 6
Insu
lina
quan
tific
ada
(%)
Tempo (horas)
0
10
20
30
0 1 2 3 4 5 6
Insu
lina
Libe
rada
(%)
Tempo (horas)
P12AO3 P12AO5
38
A Fig. 16 representa a quantidade cumulada de INS liberada a partir dos géis obtidos das
formulações P15AO3 e P15AO5 em um período de seis horas. Os resultados demonstraram que o
gel que possui maior quantidade de AO, P15AO5 (18,62 ± 0,42%), liberou menos INS comparado
ao que possui menor quantidade de AO, P15AO3 (27,78 ± 4,35%).
Figura 16. Perfil de insulina liberada a partir das formulações P15AO5 e P15AO3 (média das amostras ± desvio padrão)
As formulações gelificadas de F127 são constituídas de grande número de micelas e canais
aquosos em que o fármaco incorporado pode ser liberado por: 1) difusão através dos canalículos
aquosos e/ou 2) erosão e dissolução da estrutura da matriz que constitui o gel. Uma maior conc. de
F127 diminui a distância entre as micelas, levando a um número maior de ligações cruzadas entre
os copolímeros vizinhos e em maior número por unidade de volume, diminuindo o calibre e
aumentando a tortuosidade dos canalículos por onde trafegará o fármaco durante sua liberação da
formulação (BHARDWAJ; BLANCHARD, 1996).
Pela análise da INS total liberada a partir de cada formulação observa-se que o efeito do AO de
reduzir a liberação de INS foi mais pronunciado na formulação contendo 12% de F127. Estudos
realizados por Morishita e cols. (2001) mostraram a redução da liberação in vitro de INS a partir de
géis de F127 a 20% contendo ácidos graxos insaturados e poli-insaturados, sendo justificada pela
redução no número e dimensões dos canais aquosos e pelo aumento da viscosidade da formulação,
interferindo nos processos de difusão do fármaco e erosão e dissolução da matriz. A análise
estatística, realizada após transformações matemáticas que demonstraram a não normalidade dos
dados, indicou a existência de diferença significativa (tabela 3) entre as médias da quantidade
cumulada de INS liberada das formulações P12AO3 e P12AO5, P15AO3 e P15AO5 e entre
0
10
20
30
0 1 2 3 4 5 6
Insu
lina
Libe
rada
(%)
Tempo (horas)
P15AO3 P15AO5
39
P12AO5 e P15AO5 após seis horas de ensaio, o que parece indicar que a variação da conc. de AO
influencia a liberação de INS nos ensaios in vitro.
Tabela 3. P valor definido estatisticamente para avaliar a existência de diferença significativa entre as médias de liberação de INS de cada formulação gel
P12AO3 P15AO5
P12AO5 0,0022 0,0411
P15AO3 0,5887 0,0022
Onde: P = Pluronic® F127 e AO = ácido oleico
A Tabela 4 apresenta as equações utilizadas para calcular as linhas de tendência linear e os
coeficientes de determinação a partir da porcentagem total de INS liberada após 6h de ensaio.
Baseado nos resultados obtidos, os coeficientes de determinação indicaram confiabilidade da
tendência e precisão da previsão.
Tabela 4. Equações das retas (Y) de regressão linear e respectivos coeficientes de determinação (R²), definidos a partir do perfil de liberação total de insulina após seis horas de ensaio
INS total liberada (%) Y R²
P12AO3 27,24 A = 4,561x + 0,211 0,999
P12AO5 11,05 A = 1,790x + 1,552 0,926
P15AO3 27,78 A = 4,604x + 0,540 0,998
P15AO5 18,62 A = 3,038x + 0,580 0,997
Onde: P = Pluronic® F127 e AO = ácido oleico
Muito embora a adição de altas concentrações de AO induza a gelificação de soluções contendo
concentrações de F127 inferiores a 20% e reduza a liberação de INS das formulações gel, estudos in
situ realizados por Morishita e cols. (2000) mostraram pequenos danos à mucosa retal e nenhum
dano ao tecido do cólon quando INS em emulsão múltipla A/O/A contendo 2% p/p de AO foi
administrada via retal, confirmando estudos histológicos prévios realizados por Suzuki e cols.
(1998). Deste modo, a conc. de AO a ser utilizada nas formulações deve ser escolhida com
precaução para evitar transtornos que possa limitar o estudo contínuo destas formulações in vitro.
40
1.3. Conclusão
Neste capítulo foi avaliada a influência da adição de AO sobre a capacidade de soluções de
F127 gelificarem em concentrações inferiores a 20% e sobre o perfil de liberação da INS a partir do
estado gel destas formulações. Os resultados obtidos neste estudo indicaram que altas concentrações
de AO (3 e 5%) induzem soluções de F127 contendo concentrações até 12% a gelificarem. O estudo
de liberação de INS a partir das formulações que gelificaram (P12AO3, P12AO5, P15AO3 e
P15AO5) demonstrou que o efeito do AO de reduzir a liberação de INS foi mais pronunciado na
formulação de F127 contendo 12%, e a análise estatística indicou haver diferença significativa entre
as quantidades de INS liberada entre P12AO3 e P12AO5, P15AO3 e P15AO5 e entre P12AO5 e
P15AO5 após seis horas de ensaio.
Como o objetivo deste trabalho é o desenvolvimento de uma formulação oral que promove a
absorção da INS na mucosa do intestino, a conc. de AO selecionada para os trabalhos posteriores
foi de 2% p/p, visto que os danos à mucosa intestinal, local de liberação e absorção do fármaco,
poderiam comprometer a utilização desta formulação in vivo. Com a alteração na conc. de AO
definiu-se duas concentrações de F127, 12 e 16%. Pressupondo-se que a primeira conc. de F127 não
gelifique e que a segunda conc. de F127 gelifique a 37 °C, o comportamento destas formulações
após liofilização será avaliado.
CAPÍTULO 2
LIOFILIZAÇÃO DE CÁPSULAS DE GELATINA
CONTENDO SOLUÇÃO DE F127, INSULINA E
ÁCIDO OLÉICO E AVALIAÇÃO DO PRODUTO
LIOFILIZADO
42
2.1. Material e Métodos
2.1.1. Material
Pluronic® F-127 (F127), D,L-α-tocoferol (TF), ácido oleico (AO), sais biliares (SB) e ácido
trifluoroacético foram adquiridos da Sigma Aldrich®, EUA. Dihidrogenofosfato de potássio,
hidrogenofosfatodissódico anidro, acetonitrila grau CLAE e cloreto de sódio (NaCl) foram
adquiridos da Merck®, Alemanha. Ácido clorídrico (HCl) foi adquirido da Synth®, Brasil, hidróxido
de sódio (NaOH) solução titulante foi adquirida da Cromoline®, Brasil, e corante Eritrosina foi
adquirida da Vetec®, Brasil. A insulina humana (INS) foi gentilmente cedida pela Novonordisk®,
Brasil, as cápsulas de gelatina dura (Catalent®, Brasil), tamanho 00, transparentes, foram
gentilmente cedidas pela Acurácia Pharmacêutica®.
2.1.2. Preparo das formulações
As formulações descritas na tabela 5 foram preparadas conforme segue: uma quantidade
precisamente pesada de F127 foi adicionada lentamente a um Becker contendo tampão fosfato pH
7,4 mantido sob agitação magnética moderada e em banho de gelo (4-8 ºC) até completa dispersão
do polímero (BARICHELLO et al., 1999b). A solução foi então mantida em repouso em geladeira
por 12 horas. TF (agente antioxidante) foi adicionado na conc. de 0,06% p/p e disperso sob agitação
vigorosa usando agitador magnético em temperatura ambiente. Após completa dispersão do TF,
adicionou-se o AO, o qual foi disperso sob agitação vigorosa usando agitador magnético em banho
de gelo. INS (1,0 mg/g de solução) foi dissolvida em 100 μL de HCl 0,1 M e incorporada à solução
de F127. O HCl foi neutralizado pela adição de 100 μL de NaOH 0,1 M diretamente à solução de
F127. Quantidade suficiente de corante eritrosina para facilitar registro fotográfico dos ensaios foi
adicionada às formulações. Uma representação esquemática do preparo das formulações foi
ilustrada na Fig. 6. Após preparo, as soluções foram acondicionadas em cápsulas e pesadas. O peso
das cápsulas foi registrado antes e depois do enchimento para determinar a quantidade real de
solução acondicionada. As cápsulas foram então submetidas ao processo de liofilização conforme
descrito no tópico seguinte.
Tabela 5. Formulações desenvolvidas e variações de seus constituintes
Formulação Conc. de F127 (%p/p) Conc. de AO (%p/p)
P12AO2 12 2
P16AO2 16 2
Onde: P e F127= Pluronic® F-127 e AO = ácido oleico
43
2.1.3. Processo de Liofilização
As cápsulas contendo as formulações foram congeladas em Freezer -80 ºC (Forma -86C ULT
Freezer, Thermo Scientific®, Brasil) por um período de 20 minutos. As cápsulas congeladas foram
então transferidas para o liofilizador L101 (Liobrás®, Brasil) e liofilizadas em temperatura de -40°C
sob vácuo por aproximadamente 20 horas, tempo determinado experimentalmente seguindo
procedimento padrão descrito por Rey e May (1999).
2.1.4. Estudo de reidratação das cápsulas liofilizadas
O estudo de reidratação das cápsulas liofilizadas foi realizado em tubos falcon de fundo chato
de 12 mL contendo 5,0 mL de meio de reidratação para manter a cápsula totalmente submersa. O
estudo foi realizado em banho Dubnoff 304D (Nova Ética®, Brasil) ajustado a 37 ºC e sob agitação
horizontal constante de 75 rpm (KREYE et al., 2012). Fotos do processo de reidratação foram
tiradas em tempos determinados e comparados entre as formulações e meios testados.
Os meios de reidratação foram escolhidos baseado no Método A utilizado no estudo de
dissolução de formas farmacêuticas de liberação retardada, descrito na Farmacopéia Brasileira 5ª
ed. (F. Bras. V), em que se preconiza a utilização de meio ácido HCl 0,1 M e de tampão pH 6,8, os
quais simulam o faixa de pH do TGI. Optou-se pela utilização de tampão fosfato pH 7,4 ao invés de
tampão pH 6,8 pelo conhecimento prévio de que a INS é solúvel e estável nestas condições
(MORISHITA et al., 2002; MORISHITA et al., 2004; BARICHELLO et al., 1999b). Para
comparação, o processo de reidratação das cápsulas liofilizada também foi avaliado em outros
meios, tais como, água ultrapura e soluções aquosas de sais biliares a 0,1 (SB 0,1%) e 1,0% (SB
1,0%).
2.1.5. Estudo de liberação da INS in vitro a partir das cápsulas liofilizadas
Para o estudo de liberação da INS, cápsulas liofilizadas de pesos conhecidos (aproximadamente
0,8 g de formulação) foram colocadas em tubos falcon de fundo chato de 12 mL contendo 5,0 mL
de meio de dissolução para manter a cápsula totalmente submersa. Os meios utilizados no estudo de
liberação da INS foram os mesmos meios empregados no estudo de reidratação das cápsulas
liofilizadas. As amostras foram mantidas por 2 horas nos meios de dissolução HCl 0,1 M, tampão
fosfato pH 7,4, solução de SB a 0,1% e 1,0% ou água ultrapura. Ao final, uma alíquota de 1 mL foi
retirada e a INS foi quantificada conforme descrito no Capítulo 1, subitem 1.1.5. O estudo de
liberação das amostras foi realizado em triplicata.
44
2.1.6. Análise do tamanho médio das micelas/partículas no meio de dissolução
Para a determinação do tamanho médio das micelas/partículas presentes no meio de dissolução
após o estudo de liberação da INS in vitro, alíquotas forma coletadas ao final do estudo e diluídas
convenientemente com água ultrapura. Estas amostras diluídas foram colocadas em cubetas de
quartzo para leitura no equipamento Nanosizer N5 Submicron Particle Size Analyser (Beckman
Coulter®, EUA). O ângulo de espalhamento incidente foi de 90˚. As leituras foram feitas em
quadruplicatas e a análise com menor coeficiente de difusão foi desprezada. Os tamanhos médios
obtidos foram comparados entre as formulações e meios de dissolução avaliados.
2.1.7. Análise estatística
Para avaliar a existência de diferença significativa entre as médias da quantidade de INS
liberada das cápsulas liofilizadas ANOVA simples com comparações múltiplas do Teste de Tukey-
Kramer, para comparar os ensaios realizados nos meios de dissolução HCl 0,1 M, tampão fosfato
pH 7,4, água ultrapura, soluções de SB 0,1 e 1,0%. O intervalo de confiança de 95% foi adotado e
as diferenças foram consideradas significativas quando P< 0,05. Os dados de liberação foram
expressos como a média ± desvio padrão. O software BioEstat® (2007) foi utilizado na avaliação
estatística.
45
2.2. Resultados e Discussão
2.2.1. Preparo das formulações
Nesta parte do trabalho, a conc. de AO foi reduzida para 2 % baseado nos resultados descritos
por Morishita e cols. (2000), em que pequenos danos à mucosa retal e nenhum dano ao tecido do
cólon foram encontrados quando INS em emulsão múltipla A/O/A contendo 2% p/p de AO foi
administrada via retal.
Por saber que a conc. de polímero na formulação interfere no processo de reidratação
(ANDERSON et al., 2001), as conc. de F127 foram ajustadas com a finalidade de se obter uma
formulação que gelificasse (P16AO2) e outra que não gelificasse (P12AO2) na temperatura de
37ºC. Após a pesagem dentro das cápsulas as formulações apresentaram-se translúcidas quando em
temperatura ambiente e após o processo de liofilização o material apresentou-se como um pó branco
pegajoso.
Na combinação, avaliou-se o comportamento de reidratação e de liberação em diferentes meios
das formulações liofilizadas contendo diferentes concentrações de F127 e a mesma conc. de AO.
2.2.2. Estudo de reidratação das cápsulas liofilizadas
Na Tabela 6 estão descritos os meios utilizados no estudo de reidratação e os respectivos
valores de pH (pHmetro PHS-3B, PHtek®, Brasil).
Tabela 6. Meios de reidratação avaliados e os respectivos valores de pH
Solução pH
HCl 0,1 M 0,80
Tampão fosfato pH 7,4 7,40
H2O ultrapura 6,80
SB 0,1 % 6,00
SB 1,0 % 6,30
Na Fig. 17 foram coletadas as fotos que registram o processo de reidratação das cápsulas
liofilizadas P12AO2 (A) e P16AO2 (B) em meio HCl 0,1 M no período de 60 minutos.
Na Fig. 17A, que apresenta o estudo de reidratação das cápsulas contendo 12% de F127, se
observa decorridos 5 min que o produto liofilizado foi quase todo reidratado dentro da cápsula,
deixando de ser esbranquiçado, como após a liofilização, e começando a apresentar aspecto gel,
sendo que o formato das cápsulas se mantém. Decorridos 15 minutos, são observadas duas massas
transparentes, uma localizada na superfície e outra no fundo do tubo, demonstrando que durante o
46
processo de reidratação do produto liofilizado, o estado gel é alcançado. Após 30 min., o meio de
reidratação se apresenta de forma homogênea caracterizando a completa reidratação/dissolução das
cápsulas liofilizadas, sendo o mesmo estado em que se apresenta o meio de reidratação no tempo de
60 min., ou ao final do estudo.
Figura 17. Estudo de reidratação das cápsulas P12AO2 (A) e P16AO2 (B) em HCl 0,1 M no período de 60 minutos
A
B
0’ 5’ 15’ 30’ 60’ Tempo (minutos)
Na Fig. 17B, que apresenta o estudo de reidratação das cápsulas contendo 16% de F127,
também foi possível observar parte do produto liofilizado já foi hidratado decorrido 5 min. do início
do ensaio, deixando de ser esbranquiçado, como após a liofilização, e apresentando aspecto gel, mas
a massa hidratada mantém o formato da cápsula. Aos 15 minutos, nota-se que o produto liofilizado
foi quase todo reidratado pelo meio HCl 0,1 M, e que a massa hidratada na forma de cápsulas deu
origem a várias massas menores dispersas na forma de gel no meio de hidratação. Após 30 min.,
ainda é possível notar a presença de bolhas de ar no meio de reidratação, as quais caracterizam a
existência de fragmentos do produto liofilizado reidratado no estado gel. Porém, no tempo de 60
min. não há mais vestígios da presença destes fragmentos neste meio de reidratação, demonstrado
que o estado gel foi completamente desfeito/dissolvido.
O estudo de reidratação é um passo importante para se conhecer as alterações na área de
superfície ocorridas na estrutura do gel de F127 ao ser liofilizado. Afinal, é durante a etapa de
47
congelamento que ocorre a formação dos cristais de gelo responsáveis pelo formato dos poros, pela
distribuição de tamanho dos poros e pela conexão entre as redes de poros da camada seca formada
pela sublimação da água (BOSS et al., 2004). Pela comparação das Fig. 17A e 17B observa-se que
a partir de 5 min. o produto liofilizado de F127 a 12% se reidrata/dissolve mais rapidamente que o
produto liofilizado de F127 a 16% em meio HCl 0,1 M. Estas diferenças foram ainda mais visíveis
após decorridos 15 e 30 min. do início do processo de reidratação, mostrando que a maior conc. de
polímero na formulação propicia uma reidratação mais lenta quando comparada a formulação de
menor conc. Este resultado evidencia que a maior conc. de polímero utilizada na preparação da
solução de F127 gera poros e conexões entre as redes de poros menores que dificultam a hidratação
do pó dentro das cápsulas (BOSS et al., 2004).
Na Fig. 18 foram coletadas as fotos que registram o processo de reidratação das cápsulas
liofilizadas P12AO2 (A) e P16AO2 (B) em meio tampão pH 7,4 no período de 60 min.
Figura 18. Estudo de reidratação das cápsulas P12AO2 (A) e P16AO2 (B) em tampão pH 7,4 no período de 60 minutos
Na Fig. 18A é apresentado o estudo de reidratação das cápsulas contendo 12 % de F127.
Decorridos 5 min. do início do estudo se observa que o produto liofilizado contido na cápsula
A
B
0’ 5’ 15’ 30’ 60’ Tempo (minutos)
48
encontra-se parcialmente reidratado, sendo possível visualizar a parte superficial mais translúcida.
Aos 15 min., o produto liofilizado contido na cápsula se encontra mais reidratado, sendo
nitidamente visível a presença de estrutura gel dentro da cápsula. Aos 30 min. se observa a
reidratação quase que completa do produto liofilizado e, de que a massa reidratada está se dividindo
e causando a perda de formato da cápsula. Aos 60 min. se observa a presença de uma pequena
estrutura/massa no estado gel, flutuando no meio de reidratação. Este comportamento comparado ao
observado em meio HCl 0,1 M demonstra uma reidratação mais lenta, que pode estar relacionada ao
pH do meio.
Na Fig. 18B é apresentado o estudo de reidratação das cápsulas liofilizadas contendo 16 % de
F127. Aos 5 min. se observa que a reidratação do produto liofilizado contido na cápsula acontece de
maneira lenta. Aos 15 min. se observou que a reidratação do produto liofilizado aumentou, mas
ainda é possível visualizar uma massa mais esbranquiçada opaca, indicando que nem todo o
material foi reidratado/gelificado. Aos 30 min. quase todo o conteúdo da cápsula foi reidratado,
sendo observada a flotação da cápsula no meio de reidratação e a perda de formato da cápsula. No
tempo final do estudo (60 min.), o gel encontra-se praticamente dissolvido e observa-se a presença
de uma pequena estrutura/massa no estado gel flutuando no meio de reidratação.
A comparação das figuras 18A e 18B demonstra que o processo de reidratação das cápsulas
liofilizadas contendo 12% e 16% de F127 em meio tampão pH 7,4 se diferem ao longo do tempo
provavelmente devido à diferença de conc. de F127 na formulação, isto é esperado uma vez que
formulações com maior conc. de F127 dissolvem a uma velocidade menor do que as de menor conc.
(ZHOU; CHU, 1987; ZHOU; CHU, 1988; HVIDT et al., 1994; ANDERSON et al., 2001). Porém
ambas as formulações aos 60 min. encontram-se em condições semelhantes, em que se observa uma
pequena massa gelificada ainda não totalmente dissolvida.
A comparação dos resultados apresentados na Fig. 17 com os resultados apresentados na Fig.
18 demonstram claramente que em meio HCl 0,1 M o processo de reidratação ocorre mais
rapidamente do que no meio tampão fosfato pH 7,4. Este comportamento pode estar relacionado ao
ponto isolétrico da gelatina que compõe a cápsula. A gelatina é uma proteína obtida por hidrólise
parcial de colágeno (MOREIRA, 2004) e extraída de forma ácida, tipo A, ou alcalina, tipo B.
Ambos os tipos são cormercializados e possuem ponto isoelétrico diferentes, o primeiro de 7,0~9,0
e o segundo de 4,8~5,2 (MALLMANN, 2010) e é nessa mesma faixa de pH que apresentam a
camada de solvatação menos organizada, portanto menos solúveis. Com base nos valores de pH dos
meios de reidratação testados descritos na Tabela 6, a expectativa é de que a gelatina solubilize com
mais facilidade no meio de reidratação HCl 0,1 M (pH 0,8) do que em meio tampão fosfato pH 7,4,
porque o valor de pH do último está muito próximo dos pontos isoelétricos da gelatina. Desta
forma, pressupôs-se que os meios de reidratação possuem um papel importante não apenas na
49
solubilidade/reidratação dos componentes do produto liofilizado contido nas cápsulas, mas também,
na solubilização/reidratação da gelatina que constitui o invólucro.
Tendo em vista que estas formulações estão sendo desenvolvidas para liberação intestinal da
INS, avaliou-se também o processo de reidratação das cápsulas liofilizadas em meios aquosos
contendo SB nas concentrações de 0,1% e 1,0%. Os resultados deste ensaio foram comparados aos
resultados obtidos em meio HCl 0,1M, tampão pH 7,4 e água ultra purificada.
A Fig. 19 apresenta as fotos do processo de reidratação das cápsulas liofilizadas contendo
P12AO2 (A) e P16AO2 (B) em diferentes meios após 40 minutos. O estudo de reidratação das
cápsulas liofilizadas contendo F127 a 12% (Fig. 19A) demonstrou que o processo de
reidratação/solubilização do produto liofilizado em água foi semelhante ao meio HCl 0,1 M,
enquanto que no tampão pH 7,4 o processo de reidratação ocorreu mais lentamente. Por outro lado,
nos meios aquosos contendo SB, o processo de reidratação foi caracterizado pelo aparecimento de
uma solução leitosa e pela presença de fragmentos da estrutura gel no meio de reidratação. O
aspecto leitoso foi mais intenso no meio de reidratação contendo SB na conc. de 1%.
Figura 19. Reidratação de cápsulas de P12AO2 (A) e P16AO2 (B) em diferentes meios após 40 minutos
A
B
H2O HCl 0,1 M pH 7,4 SB 0,1% SB 1,0%
50
O estudo de reidratação das cápsulas liofilizadas contendo F127 a 16% (Fig. 19B) demonstrou
que o processo de reidratação/solubilização do produto liofilizado em água parece ser lento e
semelhante aos meios HCl 0,1 M e tampão pH 7,4. Por outro lado, nos meios contendo SB, o
processo de reidratação foi distinto dos outros meios e dependentes da conc. de SB. No meio
contendo SB a 0,1% foi observado o surgimento de duas fases, sendo a fase inferior com aspecto
gel com uma coloração vermelha opalescente intensa, enquanto a fase superior apresentou um
aspecto leitoso esbranquiçado. No meio contendo SB a 1,0%, o meio de reidratação apresentou um
aspecto opalescente rosado alternado com massas avermelhada com aspecto característico de gel.
Os resultados apresentados na Fig. 19 demonstram claramente que não apenas o pH do meio de
reidratação, mas também a presença de agentes emulsificantes tal como os SB são parâmetros
importantes a serem considerados no processo de reidratação/solubilidade/emulsificação dos
componentes da formulação (MANADAS et al., 2002).
Os SB são compostos emulsificantes presentes no lúmen intestinal, os quais são capazes de
melhorar a biodisponibilidade de fármacos hidrofóbicos por aumentar a taxa de
solubilização/dissolução destes no trato intestinal. Como tensoativos biológicos, podem induzir
alterações de membrana que aumentam a permeabilidade de várias substâncias (MIKOV et al.,
2006). Também podem afetar a transferência de fármacos hidrofílicos dissolvidos no meio através
da barreira de absorção, devido a interações que acontecem entre os sais e a camada de muco nas
membranas celulares (MIKOV et al., 2006; CHUN et al., 2012).
Desta forma, acredita-se que sob agitação suave (75 rpm) e à temperatura de 37 ºC, os SB, por
serem responsáveis pela emulsificação de partículas de gordura in vivo que auxiliam na absorção de
ácidos graxos, monoglicerídeos, colesterol entre outros lipídeos (DAVIES et al., 2002), promovam
a emulsificação do AO disperso no produto liofilizado de F127 contido nas cápsulas, dando um
aspecto leitoso ao meio de reidratação.
2.2.3. Estudo in vitro de liberação da INS a partir das cápsulas liofilizadas
O estudo de liberação in vitro permite avaliar o efeito que a formulação e suas diferentes
composições exercem na liberação da INS, bem como o efeito do meio de liberação, e assim
adequar a formulação ao objetivo de controlar a liberação do fármaco.
A Fig. 20 representa a quantidade de INS liberada no meio de dissolução HCl 0,1 M, tampão
fosfato pH 7,4, solução aquosa de SB 0,1% e 1,0% e água ultrapura a partir das cápsulas liofilizadas
de P12AO2 após duas horas.
Conforme observado na Fig. 20, a liberação de INS a partir da cápsula liofilizada de F127 a
12% foi consideravelmente influenciada pelo meio de dissolução. A presença de SB no meio de
dissolução interferiu significantemente na liberação da INS a partir das formulações, sendo esta
51
liberação menos pronunciada no meio que apresentava a menor conc. de SB (0,1%). Para cápsulas
liofilizadas de P12AO2, a ordem decrescente de liberação de INS nos meios de dissolução testados
foi: tampão pH 7,4 (60,61 ± 8,95%); HCl 0,1 M (58,62 ± 2,92%); água (46,20 ± 4,95%); SB 1,0 %
(33,69 ± 3,94%) e SB 0,1% (15,02 ± 4,04%). A existência de diferença significativa entre as
quantidades de INS liberada nos meios de dissolução, quando houve, está representada no gráfico.
A Fig. 21 representa a quantidade de INS liberada no meio de dissolução HCl 0,1 M, tampão
fosfato pH 7,4, solução aquosa de SB 0,1% e 1,0% e água ultrapura a partir das cápsulas liofilizadas
de P16AO2 após duas horas.
Para cápsulas liofilizadas de F127 a 16% (Fig. 21), a presença de SB no meio de dissolução
também influenciou negativamente a liberação da INS, sendo que a menor conc. de SB testada
promoveu o maior controle de liberação da INS. As cápsulas de P16AO2 também seguiram a
mesma ordem decrescente de liberação de INS descrito para as cápsulas de P12AO2: tampão pH
7,4 (61,53 ± 2,31%); HCl 0,1 M (43,75 ± 8,81%); água (42,19 ± 0,78%); SB 1,0 % (37,98 ± 1,99%)
e SB 0,1% (19,05 ± 1,64%). A existência de diferença significativa entre as quantidades de INS
liberada nos meios de dissolução, quando houve, está representada no gráfico.
A comparação dos resultados descritos nas Figs. 20 e 21 mostra que, em relação ao meio de
dissolução testado, a liberação de INS ocorreu em maior quantidade no meio de dissolução tampão
pH 7,4. Com relação às formulações de cápsulas liofilizadas testadas, a comparação dos resultados
mostra que F127 a 12% liberou mais INS do que F127 a 16% em quase todos os meios, com
exceção dos meios SB 1,0% e tampão pH 7,4.
Estes resultados demonstram que o processo de liofilização e o aumento da área superficial em
contato com o meio de dissolução, mesmo diante da diferença de conc. de F127 nas formulações e
do pH do meio, favoreceu a rápida reidratação das cápsulas e de seu conteúdo, promovendo uma
liberação semelhante entre as formulações (BOSS et al., 2004). Deste modo, a presença de AO
parece não ter interferir na liberação de INS a partir das cápsulas liofilizadas, do mesmo modo que
interferiu na liberação de INS a partir das formulações gel usando o método de dissolução sem
membrana (capítulo 1).
52
Figura 20. Quantidade de insulina liberada após duas horas em diferentes meios de dissolução a partir de cápsulas liofilizadas de P12AO2 (média das amostras ± desvio padrão)
Estatística: Diferença significativa entre os valores médios de INS liberada nos diferentes meios quando comparados a: (§) água purificada (H2O); (*) solução de SB 0,1%; (#) solução de SB 1%; (ŧ) HCl 0,1 M; (ж) pH 7,4.
Figura 21. Quantidade de insulina liberada após duas horas em diferentes meios de dissolução a partir de cápsulas de P16AO2 liofilizadas (média das amostras ± desvio padrão)
Estatística: Diferença significativa entre os valores médios de INS liberada nos diferentes meios quando comparados a: (§) água purificada (H2O); (*) solução de SB 0,1%; (#) solução de SB 1%; (ŧ) HCl 0,1 M; (ж) pH 7,4.
* #
ŧ # § ж
ŧ ж
*
* #
0
20
40
60
80
100
Insu
lina
Libe
rada
(%)
HCl 0,1M SB 0,1% SB 1,0% H2O pH 7,4
* # ж
ŧ § ж
ŧ ж
* ж
ŧ * # §
0
20
40
60
80
100
Insu
lina
Libe
rada
(%)
HCl 0,1M SB 0,1% SB 1,0% H2O pH 7,4
53
Entretanto, no produto liofilizado, esta relação poderá ser alterada em virtude (1) do aumento
da área superficial exposta ao meio de dissolução, (2) da solubilidade da cápsula de gelatina no
meio de dissolução, bem como, (3) da facilidade com que o meio de dissolução penetra pelos
microporos e canalículos formados pela união dos microporos. Como a área superficial das cápsulas
de gelatina é maior que a superior do gel exposta ao meio de dissolução, a liberação da INS a partir
das cápsulas liofilizadas será mais rápida. Com relação à solubilidade da gelatina, esta irá depender
do ponto isoelétrico (tipo A em pH 7,0~9,0 e tipo B em PH 4,8~5,2) da matéria-prima usada na
produção do invólucro, pois nessa mesma faixa de pH apresentará a camada de solvatação menos
organizada, portanto menos solúveis (MOREIRA, 2004; MALLMANN, 2010). Desta forma, meios
de dissolução ácidos acarretarão uma dissolução mais rápida da gelatina do que em meios de
dissolução com pH na faixa do ponto isoelétrico da gelatina.
Dados da literatura indicam que o aumento da conc. de F127 aumenta o tamanho das micelas e
da polidispersão das mesmas, sendo que tais modificações são uma consequência das interações
entre cadeias de polioxietileno de micelas adjacentes, formando unidades multimoleculares
(ATTWOOD et al., 1985). Desta forma, o diâmetro dos microporos e dos canalículos formados
pelos microporos após o processo de liofilização dependerão principalmente da concentração de
F127 utilizada, de modo que quanto maior a conc. de F127, maior será a dificuldade do meio de
reidratação penetrar por canalículos mais estreitos e tortuosos (GILBERT et al., 1986).
Estes fatores podem, no somatório, acelerar a liberação de INS a partir de cápsulas liofilizadas
de tal modo que o aumento na taxa de difusão do fármaco e na taxa de dissolução da estrutura da
matriz liofilizada ou do gel reconstituído possa ofuscar o efeito da conc. de F127, bem como da
presença de AO, os quais foram fundamentados no controle de liberação INS em formulações no
estado gel. Desta maneira, diferença estatisticamente significativa entre as quantidades de INS
liberada a partir das cápsulas liofilizadas de F127 a 12% e 16% só foi observado no meio de
dissolução HCl 0,1 M (P = 0,0022).
2.2.4. Análise do tamanho médio das micelas/partículas no meio de dissolução
Na Tabela 7 são apresentadas as formulações, os meios de dissolução, os tamanhos médios das
micelas/partículas e o índice de polidispersão relativos às amostras coletadas ao final do estudo de
liberação da INS.
Pelo fato de a medida do tamanho ser realizada após o procedimento de dissolução das
cápsulas, diluindo-se uma quantidade do meio em água, é importante salientar que em seu conteúdo
há uma mistura de partículas, tanto das formulações em si – AO, TF, INS, F127 e cápsula de
gelatina – como dos componentes do meio de dissolução – SB – podendo estar separados ou
agregados uns aos outros.
54
Tabela 7. Tamanho médio das micelas/partículas e índice de polidispersão obtidos a partir da
dissolução das cápsulas liofilizadas de P12AO2 e P16AO2 em diferentes meios
Onde: a: tamanho médio das partículas (média + desvio padrão); b: índice de polidispersão (média + desvio padrão), n = 3.
De acordo com a Tabela 7, nota-se que os tamanhos médios das micelas/partículas presente no
meio de dissolução contendo SB 0,1% apresentaram o menor tamanho de partícula. É importante
notar que, o aumento da conc. de SB de 0,1 para 1,0 % no meio de dissolução aumentou o tamanho
médio das micelas/partículas das cápsulas liofilizadas de P12AO2 em mais de 8x e das cápsulas
liofilizadas de P16AO2 em mais de 6x. De um modo geral, o tamanho médio das micelas/partículas
observado nos meios de dissolução das cápsulas P12AO2 foram maiores do que para as cápsulas
P16AO2, sendo que ambas as formulações seguiram a ordem crescente SB 0,1%, água, SB 1,0% e
HCl 0,1 M. Para uma discussão mais completa, seria necessário o tamanho médio das
partículas/micelas em meio de dissolução tampão pH 7,4, porém problemas de ordem técnica
impediram a análise.
O tamanho das partículas/micelas é um fator inerente à permeação em membranas biológicas
(MÄLKIÄ et al., 2004). Morishita e cols. (2004) observaram que quanto menor a micropartícula de
uma matriz polímerica carreadora de INS melhor a adesão à mucosa do intestino, devido ao
aumento da área de contato e proteção contra degradação enzimática, e melhor é sua absorção no
intestino delgado, aumentando a biodisponibilidade e o efeito hipoglicêmico.
Acredita-se que a presença de SB no meio de liberação tenha auxiliado na emulsificação do
AO, levando a formação de pequenas vesículas/micelas mistas. Um mecanismo complexo e
subjacente à ação das micelas mistas envolve a redução da integridade da membrana, a facilitação
do transporte transcelular e o aumento da difusão das junções paracelulares, por aumento dos poros
da membrana intestinal e dissociação oligomérica da INS (SILVA et al., 2003).
Cápsula Meio de dissolução
Tamanho médio da partícula a (nm)
Índice de Polidispersão b
P12AO2
H2O 98,23 + 26,09 1,16 + 0,36
HCl 0,1 M 1151,77 + 146,76 1,60 + 0,22
SB 0,1% 63,93 + 3,20 0,98 + 0,04
SB 1,0% 514,45 + 53,81 1,09 + 0,10
P16AO2
H2O 38,9 0 + 1,57 0,96 + 0,22
HCl 0,1 M 713,55 + 2,89 1,38 + 0,11
SB 0,1% 41,15 + 3,86 0,96 + 0,07
SB 1,0% 252,00 + 94,46 1,75 + 0,36
55
Neste sentido, baseado nos resultados descritos e em estudos realizados previamente onde: 1) a
permeabilidade epitelial da mucosa, para fármacos peptídicos como a INS, foi demonstrada
aumentar quando promotores de absorção como ácidos graxos são utilizados (MORISHITA et al.,
1998; SUZUKI et al. 1998; BARICHELLO et al., 1999a); 2) que a adição de SB à formulação
aumenta a permeabilidade intestinal, oral, transdérmica, ocular, nasal, retal e pulmonar (MIKOV et
al., 2006) e, 3) que o efeito hipoglicêmico da INS foi demonstrado melhorar quando SB e ácidos
graxos são combinados (MESIHA et al., 1994; MESIHA et al., 2002), propôs-se estudar o efeito da
adição de SB às formulações estudadas neste capitulo por meio do estudo de reidratação e de
liberação da INS in vitro a partir de cápsulas liofilizadas.
56
2.3. Conclusão
Neste capítulo foram desenvolvidas duas formulações de F127 contendo INS e AO e avaliada a
influência do processo de liofilização sobre a reidratação do produto liofilizado, o perfil de
liberação de INS e o tamanho médio das micelas/partículas formadas no meio, utilizando diferentes
meios de dissolução.
Os resultados indicaram que a liofilização de cápsulas contendo F127, AO e INS nas
concentrações de 12 ou 16% interfere nos processos de reidratação, e consequentemente, de
liberação, pois foi durante a etapa de congelamento que ocorreu a formação de cristais de gelo
responsáveis pelo formato dos poros, pela distribuição de tamanho dos poros e pela conexão entre
as redes de poros da camada seca formada pela sublimação da água, que modificou a superfície de
contato do pó dentro das cápsulas e interferiu na hidratação.
Em relação aos meios de dissolução foi observado que o pH pode interferir no processo de
dissolução do invólucro de gelatina e, por conseguinte, interferir na velocidade de reidratação do
produto liofilizado, sendo que em pHs próximos do ponto isoelétrico, a gelatina apresenta a camada
de solvatação menos organizada, portanto menos solúveis, retardando o processo de reidratação do
produto.
A adição de agente emulsificante tal como SB, mimetizando condições do trato intestinal, não
apenas resultou em uma redução da liberação de INS das formulações liofilizadas contendo 12 e
16% de F127, como também proporcionou a formação de micelas/partículas de tamanho menor no
meio de dissolução, o qual pode ser um fator decisivo na permeação da INS através da membrana
do intestino.
Deste modo, a partir dos resultados descritos neste capítulo surgiu a ideia de desenvolver uma
formulação liofilizada contendo SB para estudo de reidratação e liberação in vitro de INS.
CAPÍTULO 3
LIOFILIZAÇÃO DE CÁPSULAS DE GELATINA
CONTENDO SOLUÇÃO DE F127, INSULINA,
ÁCIDO OLEICO E SAIS BILIARES E AVALIAÇÃO
DO PRODUTO LIOFILIZADO
58
3.1. Material e Métodos
3.1.1. Material
Pluronic® F-127 (F127), D,L-α-tocoferol (TF), ácido oleico (AO), sais biliares (SB) e ácido
trifluoroacético foram adquiridos da Sigma Aldrich®, EUA. Dihidrogenofosfato de potássio,
hidrogenofosfatodissódico anidro, acetonitrila grau CLAE e cloreto de sódio (NaCl) foram
adquiridos da Merck®, Alemanha. Ácido clorídrico (HCl) foi adquirido da Synth®, Brasil, hidróxido
de sódio (NaOH) solução titulante foi adquirida da Cromoline®, Brasil, e corante Eritrosina foi
adquirida da Vetec®, Brasil. A insulina humana (INS) foi gentilmente cedida pela Novonordisk®,
Brasil, as cápsulas de gelatina dura (Catalent®, Brasil), tamanho 00, transparentes, foram
gentilmente cedidas pela Acurácia Pharmacêutica®.
3.1.2. Preparo das formulações
As formulações descritas na Tabela 10 foram preparadas conforme segue: uma quantidade
precisamente pesada de F127 foi adicionada lentamente a um Becker contendo tampão fosfato pH
7,4 mantido sob agitação magnética moderada e em banho de gelo (4-8 ºC) até completa dispersão
do polímero (BARICHELLO et al., 1999b). A solução foi então mantida em repouso em geladeira
por 12 horas. TF (agente antioxidante) foi adicionado na conc. de 0,06% p/p e disperso sob agitação
vigorosa usando agitador magnético em temperatura ambiente. Após completa dispersão do TF, os
SB foram adicionados na conc. de 1,0% p/p até completa solubilização. O AO foi adicionado na
sequência na conc. de 2% p/p e disperso sob agitação vigorosa usando agitador magnético em
banho de gelo. A INS (1,0 mg/g de solução) foi dissolvida em 100 μL de HCl 0,1 M e incorporada à
solução de F127. O HCl foi neutralizado pela adição de 100 μL de NaOH 0,1 M diretamente à
solução de F127. Quantidade suficiente de corante eritrosina para facilitar registro fotográfico dos
ensaios foi adicionada as formulações. Uma representação esquemática do preparo das formulações
foi apresentada na Fig. 5. Após preparo, as soluções foram acondicionadas em cápsulas e pesadas.
O peso das cápsulas foi registrado antes e depois do enchimento para determinar a quantidade real
de solução acondicionada. As cápsulas foram então submetidas ao processo de liofilização
conforme descrito abaixo. Na Tabela 10 estão descritas as formulações e suas composições.
3.1.3. Processo de Liofilização
As cápsulas contendo as formulações foram congeladas em Freezer -80 ºC (Forma -86C ULT
Freezer, Thermo Scientific®, Brasil) por um período de 20 minutos. As cápsulas congeladas foram
então transferidas para o liofilizador L101 (Liobrás®, Brasil) e liofilizadas em temperatura de -40°C
59
sob vácuo por aproximadamente 20 horas, tempo determinado experimentalmente seguindo
procedimento padrão descrito por Rey e May (1999).
Tabela 8. Formulações desenvolvidas e suas composições
Formulação Conc. de F-127(%p/p) Conc. de SB (%p/p)
P12SB0 12 0
P16SB0 16 0
P20SB0 20 0
P12SB1 12 1
P16SB1 16 1
P20SB1 20 1
Onde: P ou F127 = Pluronic® F127 e SB = Sais Biliares
3.1.4. Estudo de reidratação das cápsulas liofilizadas
O estudo de reidratação das cápsulas liofilizadas foi realizado em tubos falcon de fundo chato
de 12 mL contendo 5,0 mL de meio de reidratação para manter a cápsula totalmente submersa. O
meio reidratação utilizado foi tampão pH 7,4. O estudo foi realizado em banho Dubnoff 304D
(Nova Ética®, Brasil) ajustado a 37 ºC e sob agitação horizontal constante de 75 rpm (KREYE et
al., 2012). Fotos do processo de reidratação foram tiradas aos 60 minutos e comparadas entre as
formulações.
3.1.5. Estudo in vitro de liberação da INS a partir das cápsulas liofilizadas
Para o estudo de liberação da INS, cápsulas liofilizadas de pesos conhecidos (aproximadamente
0,8 g de formulação) foram colocadas em tubos falcon de fundo chato de 12 mL contendo 5,0 mL
de meio de dissolução para manter a cápsula totalmente submersa. As amostras foram mantidas por
uma hora no meio de dissolução tampão fosfato pH 7,4. Ao final, uma alíquota de 1 mL foi retirada
e a INS foi quantificada conforme descrito no Capítulo 1, subitem 1.1.5. O estudo de liberação das
cápsulas liofilizadas foi realizado em triplicata.
3.1.6. Análise estatística
O Teste t de Student não pareado foi realizado para avaliar a existência de diferença
significativa entre médias da quantidade cumulada de INS liberada das cápsulas liofilizadas após 1
hora do ensaio de liberação. Adotou-se o intervalo de confiança de 95% e as diferenças foram
consideradas significativas para P< 0,05. Os dados de liberação foram expressos como a média ±
desvio padrão. O software BioEstat® (2007) foi utilizado na análise estatística.
60
3.2. Resultados e Discussão
3.2.1. Preparo das formulações
Assim como as formulações preparadas no capítulo 1, os géis obtidos a partir de P12SB0,
P16SB0 e P20SB0 são soluções micelares fluidas em temperaturas entre 4 e 8 °C, aumentando a
viscosidade com o aumento da temperatura até gelificação acima de 25 °C, e a coloração altera de
opaca à translúcida conforme incorporação do AO ao F127 com o aumento da temperatura.
As formulações contendo SB – P12SB1, P16SB1 e P20SB1 – são mais viscosas em
temperaturas entre 4 e 8 °C quando comparadas às formulações que não os contém, mas com o
aumento da temperatura acima de 25 °C a consistência do gel é menos rígida, sendo que a
opacidade não diminui acentuadamente.
Todas as formulações preparadas neste capítulo, após a liofilização, apresentaram o mesmo
aspecto: pó branco e pegajoso. E foram submetidas ao estudo de reidratação e liberação em tampão
pH 7,4.
3.2.2. Estudo de reidratação das cápsulas liofilizadas
A figura 22 representa o processo de reidratação das cápsulas liofilizadas em tampão pH 7,4
após 60 minutos.
Figura 22. Reidratação de várias cápsulas liofilizadas em tampão pH 7,4 após 60 minutos
P12SB0 P12SB1 P16SB0 P16SB1 P20SB0 P20SB1
Na fig. 22 é possível observar que as cápsulas liofilizadas contendo F127 a 12% e 16% sem SB
reidrataram/solubilizaram quase que por completo em meio tampão pH 7,4 após 60 min, não sendo
visualizada a presença de fragmentos no estado gel. Já as cápsulas liofilizadas contendo F127 a 20%
encontram-se em estado de reidratação, sendo observado um grande fragmento na forma gel com
pontos esbranquiçados no seu interior, indicando que nem todo o material foi reidratado. Uma
61
possível explicação seria a de que os canalículos formados na maior conc. de F127 são pequenos, e
a água, ao penetrá-los, promove a hidratação das cadeias de polietileno responsáveis pela formação
do estado gel. Se o estado gel é alcançado, o diâmetro destes canalículos irá diminuir, reduzindo
ainda mais o fluxo de água para o interior da cápsula, retardando assim o processo de reidratação do
pó na área mais central da cápsula.
Por outro lado, a reidratação das cápsulas liofilizadas contendo SB parece ocorrer mais
lentamente sendo observada a presença de material ainda não reidratado em todas as concentrações
de F127 avaliadas. Na fig. 22 se observa que o tamanho da massa não reidratada/gelificada presente
foi proporcional e independente da conc. de F127 presente. Esta observação pode ser um indicativo
de que nas cápsulas liofilizadas contendo SB o processo de reidratação envolva outros mecanismos
além da conc. de F127 presente na formulação.
3.2.3. Estudo in vitro de liberação da INS a partir das cápsulas liofilizadas
O estudo de liberação foi realizado em meio de dissolução tampão fosfato pH 7,4, escolhido
por solubilizar a INS e mantê-la estável (MORISHITA et al., 2002; MORISHITA et al., 2004;
BARICHELLO et al., 1999b). Pode-se observar o efeito da conc. de F127 na taxa de liberação de
INS, como nos ensaios de liberação realizados nos capítulos 1 deste trabalho, e a interferência da
presença de SB na formulação liofilizada.
A Fig. 23 apresenta os perfis de liberação da INS a partir de várias cápsulas liofilizadas em
tampão fosfato pH 7,4.
Figura 23. Perfil de liberação da insulina a partir de várias cápsulas liofilizadas em tampão fosfato pH 7,4 (média ± desvio padrão)
Estatística: Diferença significativa entre os valores médios de INS liberada nos diferentes meios quando comparados a: (*) P12SB0; (#) P12SB1; (ж) P16SB1; (ŧ) P20SB0; (§) P20SB1.
ŧ
∞ ŧ
∞ ŧ
* # ж ∞
ŧ
0
20
40
60
80
100
Insu
lina
Libe
rada
(%)
P12SB0 P12SB1 P16SB0 P16SB1 P20SB0 P20SB1
62
Hecht e Hoffmann (1994) relataram que um surfactante iônico como o lauril sulfato de sódio
pode suprimir a formação de micelas de F127. Mais recentemente, este fenômeno também foi
observado em presença de sais biliares (TORCELLO-GÓMEZ et al., 2013). Deste modo, a
quantidade expressiva de INS liberada a partir das cápsulas liofilizadas contendo F127 a 20% e SB,
pode ter ocorrido via supressão da capacidade de micelização das moléculas de F127 que
constituem a parede dos microporos e dos canalículos formados pela união dos microporos,
tornando o mecanismo de liberação da INS independente da conc. de F127. A não formação de
micelas também pode ter influenciado na menor reidratação das formulações contendo SB (fig. 22),
afinal isso contribui com a desorganização das moléculas no sistema micelar ,o que dificulta a
permeação de água para o interior do produto liofilizado.
Estas observações estão em acordo com os resultados do estudo de reidratação destas
formulações mencionadas no subitem anterior, visto que nem todas se encontravam no mesmo
estado de reidratação após 40 min. Do contrário, a liberação de INS a partir das cápsulas liofilizadas
sem SB será regido pela viscosidade do sistema, sendo o coeficiente de difusão do fármaco
inversamente proporcional a conc. de F127 presente nas formulações (PANDIT; WANG, 1998).
Os métodos de reidratação e liberação para as formulações preparadas neste capítulo se diferem
apenas em relação ao tempo definido para registro das fotos (40 min) e amostragem para
quantificação (60 min), pois durante os ensaios de reidratação observou-se que aos 40 min as
formulações contendo ou não SB apresentavam-se em diferentes estágios de reidratação e ao final
dos 60 min apresentavam-se pouco mais reidratadas. As formulações sem SB apresentavam-se com
aspecto gel e a parte inferior do tubo apresentava-se um pouco mais densa, devido a hidratação,
gelificação e dispersão do produto liofilizado, enquanto que as formulações contendo SB observa-se
a cápsula praticamente reidratada, mas parte do produto liofilizado ainda íntegro no fundo do tubo,
sendo a parte externa translúcida, indicando a reidratação, enquanto a parte interna ainda opaca,
indicando que ainda não está totalmente reidratada.
Esperava-se que com a menor reidratação observada, a quantidade de INS liberada fosse
inferior a partir das formulações contendo SB em relação às formulações que não contêm. Porém a
não formação de micelas indicou que a INS estava, em sua maioria, livre no meio de dissolução, por
isso observa-se uma maior liberação a partir das formulações que contêm SB.
63
3.3. Conclusão
Neste capítulo foram desenvolvidas cápsulas liofilizadas contendo INS e AO e diferentes
concentrações de F127 e SB, e avaliada a influência do processo de liofilização e da conc. de SB e
F127 sobre a reidratação do produto liofilizado e o perfil de liberação de INS em tampão fosfato pH
7,4.
Os resultados indicaram que a presença de SB retardou o processo de reidratação das cápsulas
liofilizadas contendo 12 e 16% de F127 comparado às cápsulas liofilizadas de mesma conc. de F127
que não continha SB, o que pode ser um indicativo de que outros mecanismos, além do efeito da
conc. de F127, podem estar operando no processo de reidratação das cápsulas liofilizadas contendo
SB.
Em relação ao perfil de liberação de INS em meio tampão fosfato pH 7,4 foi observado que a
presença de SB na formulação acelerou o processo de liberação de INS a partir das cápsulas
liofilizada contendo F127 a 20%, tornando o mecanismo de liberação de INS independente da conc.
de F127.
Levando-se em conta o menor tamanho encontrado para as micelas/partículas nos meios de
dissolução contendo SB e uma liberação da INS mais efetiva de algumas das formulações que as
contém, acredita-se que a presença desses sais, em formulações de P407, juntamente com a
presença de ácidos graxos insaturados são potenciais candidatos à administração de INS por via
oral.
64
4. CONCLUSÃO FINAL
Neste estudo foram avaliadas: a influência da adição de AO sobre a capacidade de soluções de
F127 gelificarem em concentrações inferiores a 20% e sobre o perfil de liberação da INS a partir
destas formulações em estado gel; a influência do processo de liofilização de soluções de F127,
contendo AO e INS, que gelificam ou não, sobre a reidratação do produto liofilizado, o perfil de
liberação de INS e o tamanho médio das micelas/partículas formadas no meio, utilizando diferentes
meios de dissolução; e a influência da adição de SB às formulações de F127 contendo AO e INS,
sobre a reidratação do produto liofilizado e o perfil de liberação de INS em tampão fosfato pH 7,4.
Os resultados obtidos indicaram que altas concentrações de AO (3 e 5%) induzem soluções de
F127 contendo concentrações até 12% a gelificarem. O estudo de liberação de INS a partir das
formulações que gelificaram (P12AO3, P12AO5, P15AO3 e P15AO5) demonstrou que o efeito do
AO de reduzir a liberação de INS foi mais pronunciado na formulação de F127 contendo 12%.
Como o principal objetivo deste trabalho é o desenvolvimento de uma formulação oral que
promove a absorção da INS na mucosa do intestino, a conc. de AO selecionada para os estudos
seguintes foi de 2% p/p, visto que os danos à mucosa intestinal, local de liberação e absorção do
fármaco, poderiam comprometer a utilização desta formulação in vivo. Com a alteração na conc. de
AO definiu-se duas concentrações de F127, 12 e 16%.
A liofilização de cápsulas contendo F127, AO e INS nas concentrações de 12 ou 16% interfere
nos processos de reidratação, e consequentemente, de liberação, pois foi durante a etapa de
congelamento que ocorreu a formação de cristais de gelo responsáveis pelo formato dos poros, pela
distribuição de tamanho dos poros e pela conexão entre as redes de poros da camada seca formada
pela sublimação da água, que modificou a superfície de contato do pó dentro das cápsulas e
interferiu na hidratação.
Em relação aos meios de dissolução foi observado que o pH pode interferir no processo de
dissolução do invólucro de gelatina e, por conseguinte, interferir na velocidade de reidratação do
produto liofilizado, sendo que em pHs próximos do ponto isoelétrico, a gelatina apresenta a camada
de solvatação menos organizada, portanto menos solúveis, retardando o processo de reidratação do
produto; e a adição de agente emulsificante tal como SB, mimetizando condições do trato intestinal,
não apenas resultou em uma redução da liberação de INS das formulações liofilizadas contendo 12
e 16% de F127, como também proporcionou a formação de micelas/partículas de tamanho menor
no meio de dissolução, o qual pode ser um fator decisivo na permeação da INS através da
membrana do intestino.
A partir destes resultados desenvolveu-se uma formulação liofilizada contendo SB para estudo
de reidratação e liberação in vitro de INS.
65
A presença de SB retardou o processo de reidratação das cápsulas liofilizadas contendo 12 e
16% de F127 comparado às cápsulas liofilizadas de mesma conc. de F127 que não continha SB, o
que pode ser um indicativo de que outros mecanismos, além do efeito da conc. de F127, podem
estar operando no processo de reidratação das cápsulas liofilizadas contendo SB.
Em relação ao perfil de liberação de INS em meio tampão fosfato pH 7,4 foi observado que a
presença de SB na formulação acelerou o processo de liberação de INS a partir das cápsulas
liofilizada contendo F127 a 20%, tornando o mecanismo de liberação de INS independente da conc.
de F127.
Levando-se em conta o menor tamanho encontrado para as micelas/partículas nos meios de
dissolução contendo SB e uma liberação da INS mais efetiva de algumas das formulações que as
contém, acredita-se que a presença desses sais, em formulações de F127, juntamente com a
presença de ácidos graxos insaturados são potenciais candidatos à administração de INS por via
oral.
66
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76
6. ANEXOS
6.1. Publicações
• SALVE, Débora A. K.; FARIA, Kenia C. S. ; CERTO, Thaïs S.; BARICHELLO, José M.
“AVALIAÇÃO DO EFEITO DE ADITIVO FARMACÊUTICO NA LIBERAÇÃO DE
INSULINA DE GÉIS DE POLOXAMERO 407”, apresentado no XIX Seminário de Iniciação
Científica – UFOP, realizado de 09 a 11 de novembro de 2011, em Ouro Preto, MG, Brasil.
• CERTO, Thaïs S.; SALVE, Débora A. K.; GOMES, Helena M.; FARIA, Kenia C. S.;
OLIVEIRA, Júnia G.; BERTOL, Charise D.; GUGEL, Luciana; LORENCETI, Geanine,
BORGHETTI, Greice S.; SOARES, Luiz A. L.; BARICHELLO, José M.“EFEITO DO ACIDO
OLEICO NA TRANSIÇÃO SOL-GEL DE SOLUÇÕES DE PLURONIC F-127”, no I Simpósio
Farmacêutico – Ensino, Pesquisa e Inovação, realizado de 30 de outubro a 3 de novembro de
2011, em Juiz de Fora, MG, Brasil.
• Júnia Graziela Oliveira; Débora Aiko Kurane de Salve; Thaïs Seixas Certo; Ana Paula de
Battisti Ribeiro; Gabriel Silva Marques Borges. “DESENVOLVIMENTO DE PRODUTO
LIOFILIZADO PARA ADMINISTRAÇÃO ORAL DA INSULINA NO TRATAMENTO DO
DIABETES” apresentado na 64ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira para o Progresso da
Ciência, realizado de 22 a 27 de julho de 2012, em São Luís do Maranhão, MA, Brasil.
• FERREIRA, Lucas A.; CERTO, T. S.; BORGES, Gabriel S. M.; SANTOS, Gabriela O.;
BARICHELLO, José M. “ESTUDO DA FLUORESCÊNCIA DE HIDROGÉIS MICELARES
DE POLOXAMERO 407 PARA USO NO TRATAMENTO DA LEISHMANIOSE
TEGUMENTAR” apresentado à 1ª Semana de Ciências Farmacêuticas, CCA-UFES, realizado
de 29 de agosto a 1º de setembro de 2012, em Alegre, ES, Brasil.
• Thaïs Seixas Certo; Júnia Graziela Oliveira; Lucas Andrade Ferreira, Gabriel Silva Marques
Borges; Charise D. Bertol; GeanineLorenceti, Greice S. Borghetti; Luiz A. L. Soares; José M.
Barichello. “EFFECT OF OLEIC ACID ON THE RELATIVE GEL VISCOSITY OF
SOLUTIONS OF PLUNORIC® F-127”, no V Simpósio Internacional de Pós Graduação e
Pesquisa - SINPOSPq, realizado de 12 a 14 de setembro de 2012, em Ribeirão Preto, SP,
Brasil.
• SANTOS, Gabriela O.; BARICHELLO, José M.; CERTO; Thaïs S.; GOMES, Helena M.;
BORGES, Gabriel S. M.; ANDRADE, Lucas F.; OLIVEIRA, Júnia G.
“DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA CLAE/UV PARA
DETERMINAÇÃO DO ÁCIDO OLÉICO EM CÁPSULAS CONTENDO PRODUTO
LIOFILIZADO DE INSULINA PARA O TRATAMENTO DO DIABETES”, apresentado no
XX Seminário de Iniciação Científica – UFOP, realizado de 07 a 09 de novembro de 2012, em
Ouro Preto, MG, Brasil .
77
• OLIVEIRA, Júnia G.; CERTO, Thaïs S.; MATOS, Mariana B.; BARICHELLO, José M.;
BORGES, Garbriel S. M.; FERRREIRA, Lucas A. “AVALIAÇÃO DO EFEITO DE SAIS
BILIARES NA RECONSTITUIÇÃO DE PRODUTO LIOFILIZADO DE INSULINA”,
apresentado no XX Seminário de Iniciação Científica – UFOP, realizado de 07 a 09 de
novembro de 2012, em Ouro Preto, MG, Brasil.
• SANTOS, Gabriela O.; BARICHELLO, José M.; CERTO; BORGES, Gabriel S. M.;
ANDRADE, Lucas F.; Thaïs S.; GOMES, Helena M.; OLIVEIRA, Júnia G.
“DESENVOLVIMENTO DE PRODUTO LIOFILIZADO QUE SE TRANSFORMA EM GEL
NO TRATO GASTRINTESTINAL E PROMOVE A ABSORÇÃO DE INSULINA NA
MUCOSA DO INTESTINO”, apresentado no XX Seminário de Iniciação Científica – UFOP,
realizado de 07 a 09 de novembro de 2012, em Ouro Preto, MG, Brasil.